NO318763B1 - Fremgangsmate for bestemmelse av bakterier fra slekten Salmonella i en prove. - Google Patents

Description

OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for anrikning og bestemmelse av Salmonella fira en prøve, så som en prøve av et rått eller bearbeidet matvare- og for-produkt.

GENERELL BAKGRUNN

Forurensning med bakterier av arter som tilhører slekten Salmonella, i det følgende referert til som Salmonella, av rå og bearbeidede matvarer er et hovedproblem i matvare- og forindustrien. Siden Salmonella er allesteds nærværende, vil forurensningskildene være tallrike med komplekse overføringsveier.

Alle Salmonella er potensielt patogene for mennesker, dyr eller begge. De fleste serotyper viser liten verts-spesifisitet og kan etter inntak forårsake salmonellose, en mage-tarmsykdom, hos mennesker.

Selv om de vanligvis er milde og selvbegrensende med bedring i løpet av noen få dager,

kan infeksjoner av Salmonella forårsake alvorlige komplikasjoner blant barn, eldre og personer med underliggende sykdommer, ettersom infeksjonen sprer seg fra tarmkanalen til andre systemer i kroppen og kan føre til alvorlig sykdom eller endog død.

Et annet hyppig problem er de immunologiske responser på bakterieendotoksinene, som

kan føre til overfølsomhetsreaksjoner av umiddelbar type (type 1) så vel som av forsinket type (type IV, cellemediert type) hypersensitivitet.

De Smet et al. (1986) beskriver en konvensjonell metode for detektering av Salmonella hvori nevnte metode innbefatter et for-anrikningstrinn og et anrikningstrinn ved anvendelse av en pH-verdi i disse to trinnene som ikke er over 5,6. Det beskrives videre et overføringstrinn som resulterer i en stor fortynning.

Swaminathan et al. (1978) beskriver anvendelse av et membran filter for å konsen-trere Salmonella fra den primære selektive anrikningen før selektiv migrering for å øke utbytte. Den selektive anrikningen ble etterfulgt av en selektiv migrering for å øke utbytte.

EP-A-0-214-340 beskriver en metode for detektering av tilstedeværelse av en bestemt motil organisme, så som Salmonella, i en prøve. Metoden omfatter inokulering av et selektivt anrikningsmedium inneholdende minst et chemotaktisk tiltrekningsmiddel med en prøve inneholdende den motile organismen som skal bli detektert og en eller flere motile konkurrenter. Ved inkubasjon metaboliserer den motile organismen det chemo-taktiske tiltrekningsmiddelet og muliggjør at organismen flyttes inn i motilitets-mediet hvor det reagerer med antistoffer spesifikke for organismen.

For å kontrollere forurensningen av matvarer i industrien er det sterkt behov for hurtige og pålitelige måter til å påvise Salmonella i rå så vel som bearbeidede matvarer og for. De konvensjonelle metoder for analyse av slike matvarer på Salmonella vil vanligvis omfatte trinn for en ikke selektiv anrikning i f.eks. bufret peptonvann, etterfulgt av selektiv anrikning i substrater som letter veksten av Salmonella og inhiberer veksten av andre bakterier, og påfølgende utplating på agarmedier som er selektive og/eller indikative for Salmonella. En slik fremgangsmåte er omstendelig og tidkrevende og krever vanligvis 3-5 dager for å gi et sannsynlig resultat.

I løpet av årene er det blitt foreslått flere metodikker for en akselerert påvisning av Salmonella i matvarer. Eksempler på disse omfatter enzym-immunoassay (EIA) (Beumer et al., 1991; Notermans og Wernars, 1991; Emswiler-Rose et al., 1991; D'Aoust og Sewell, 1988b), immunodiffusjon (D'Aoust og Sewell, 1988a; Bailey et al., 1991), en lateks-agglutinerings-assay (D'Aoustet al., 1987) en hydrofob gitter-membran filterings-assay (Entis, 1986), en selektiv bevegelighetsanriksningsteknikk (Holbrook et al., 1986) og ledningsevneteknikker (Smith et al., 1989). Til tross for det faktum at disse nye teknikker gir raskere resultater (42-48 timer) enn tradisjonelle fremgangsmåter, har de fått bare liten aksept i matvareindustrien. Dette reflekterer at det er et behov i industrien for fremgangs-måter som ytterligere akselererer og forenkler påvisningen av Salmonella i matvarer og for.

Det er således et klart behov for en fremgangsmåte for hurtig påvisning av Salmonella. En slik fremgangsmåte bør være følsom, spesifikk og pålitelig. En frem-gangsmåte som feks. er i stand til å påvise så lite som 1 Salmonella pr. 25 g prøve i løpet av 24 timer, mens prosentsatsen av falske positiver er mindre enn 10% og prosentsatsen av sanne positiver er minst 80% sammenlignet med en standard dyrkingsprotokoll ville være ønskelig.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for bestemmelse av bakterier tilhørende slekten Salmonella i en prøve, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter en anrikningsrfemgangsmåte som omfatter enten

1) overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, idet vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, tetrationat og/eller en annen selektiv substans forskjellig fra selenitt blir tilsatt til eller dannet i mediet før, samtidig med eller etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 38°C i et tidsrom mellom 10 minutter og 8 timer etter overføringen av prøven (for-anrikningsperiode) og temperaturen av blandingen deretter økes til 39-43°C og blandingen holdes ved den økte temperatur på 39-43°C i et tidsrom etter økningen av temperaturen (anrikningsperiode), slik at summen av

tidsrommene for foranrikningsperioden og anrikningsperioden er mellom 10-48 timer, eller 2) overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, idet vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, og vekstmediet med prøven holdes ved en temperatur på 39-42,5°C, tetrationat og/eller en annen selektiv substans forskjellig fra selenitt blir tilsatt til eller dannet i mediet før, samtidig med eller høyst 8 timer etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på 39-42,5°C i et tidsrom på mellom 10-48 timer fra overføringen (anrikningsperiode),

og deretter gjennomføring av en bestemmelse for å identifisere og/eller kvantifisere Salmonella som er tilstede i anrikningsmediet etter formeringen, idet bestemmelsen omfatter et analysetrinn som er basert på identifisering og/eller kvantifisering av et målmolekyl eller en molekylær interaksjon som involverer et målmolekyl og som er forskjellige fra tradisjonelle agarutplatingsteknikker,

idet betingelsene ved anrikningsfremgangsmåten blir slik tilpasset til bestemmelsen at en

test 1

omfattende anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen hvori det selektive anrikningsmedium er blitt inokulert med en stamme av Salmonella til en start-konsentrasjon på ca. 15 celler/ml og 10% vilkårlig utvalgt oppmalt rått kjøtt er blitt tilsatt til anrikningsmediet ved begynnelsen av anrikningsperioden og den resulterende blanding er blitt holdt ved temperaturen eller temperaturene for anrikningsperioden

vil frembringe, i bestemmelsen, et positivt resultat i minst 90% av alle tilfeller når det testes et panel av vilkårlig valgte Salmonella serotyper, og en test 2

omfattende anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen hvori det selektive anrikningsmedium er blitt inokulert ved begynnelsen av anrikningsperioden med en stamme av en av ikke-Sa/mone/Za-artene

Citrobacter freundii,

Escherichia coli, og

Enterobacter cloacae,

til en startkonsentrasjon derav på ca. 100 celler/ml, og det selektive anriknings-medium er i alt vesentlig fritt for mikro-organismer forskjellige fra den inokulerte \ kke- Salmonella-stamme, og den resulterende blanding er blitt holdt ved temperaturen eller temperaturene for anrikningsperioden

vil gi opphav til en prosentsats av falske positiver i analysen på høyst 15% innenfor hver art når det testes et panel på 20 stammer vilkårlig valgt fra ikke-Sa/mø/ie/tø-artene.

Det er videre beskrevet en fremgangsmåte for bestemmelse av bakterier tilhørende slekten Salmonella i en prøve, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter

en anrikningsrfemgangsmåte som omfatter overføring av prøven til et vandig vekst-medium for Salmonella idet vekstmediet er bufret hl en pH mellom 6,7 og 7,3, og tetrationat blir tilsatt til eller dannet i mediet før, samtidig med eller høyst 3 timer etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på ca. 36-39°C for et tidsrom mellom 15-30 timer etter overføringen av prøven (anrikningsperiode),

og deretter gjennomføring av en bestemmelse for å identifisere og/eller kvantifisere Salmonella som er tilstede i anrikningsmediet etter formeringen, idet bestemmelsen omfatter et analysetrinn som har en varighet på høyst 7 timer og som er basert på identifisering og/eller kvantifisering av et målmolekyl eller en molekylær interaksjon som involverer et målmolekyl og som er forskjellig fra tradisjonelle agar-utplatingsteknikker,

idet summen av tiden for anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen har en varighet på høyst 40 timer og betingelsene ved anrikningsfremgangsmåten er slik tilpasset til bestemmelsen at test 1 som definert i krav 1 vil frembringe, i bestemmelsen, et positivt resultat i minst 90% av alle tilfeller når det testes et panel av vilkårlig valgte Salmonella serotyper, og at test 2 som definert i krav 1 vil gi opphav til en prosentsats av falske positiver i analysen på høyst 15% innenfor hver art når det testes et panel av 20 stammer vilkårlig valgt fra ikke-iSa/mo«e//a-artene.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for bestemmelse av bakterier tilhørende slekten Salmonella i en prøve, kjennetegnet ved at den omfatter gjennomføring av en anriknings-

fremgangsmåte som omfatter enten

a) overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, hvor vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3 og inneholder i alt vesentlig ingen bakterievekstinhiberende

substans, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 39,0°C i et

tidsrom på minst 1 minutt (foranrikningsperiode), og deretter

økning av blandingens temperatur til 39,5-43°C og eventuelt tilsetning av novobiocin

og/eller en annen selektiv substans forskjellig fra selenitt

og blandingen holdes ved den økte temperatur på 39,5-43°C i et tidsrom fra

temperamrøkningen selektiv (anrikningsperiode), eller

b) overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, hvor vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, og novobiocin og/eller en annen selektiv substans forskjellig

fra selenitt blir tilsatt til mediet før, samtidig med eller etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 39,0°C i et tidsrom på minst 0,5 time fra overføringen eller tilsetningen av novobiocin eller en annen selektiv substans

forskjellig fra selenitt, den av disse som er sist (foranrikningsperiode), og deretter

økning av blandingens temperatur til 30,5-43°C og eventuelt tilsetning av novobiocin eller

en annen selektiv substans forskjellig fra selenitt

og blandingen holdes ved den økte temperatur på 39,5-43°C i et tidsrom fra

temperaturøkningen (selektiv anrikningsperiode),

og deretter gjennomføring av en bestemmelse for å identifisere og/eller kvantifisere Salmonella som er tilstede i anrikningsmediet etter formeringen, idet summen av tids-rommene for foranrikningsperioden og den selektive anrikningsperiode er mellom 10-48 timer og betingelsene for anrikningsprosedyren er så tilpasset til bestemmelsen at test 1 som definert i krav 1, vil produsere, i bestemmelsen, et positivt resultat i minst 90% av alle tilfellene når et panel av tilfeldig valgte Salmonella serotyper testes, og at test 2 som definert i krav 1, vil gi opphav til en prosentandel av falske positive resultater i analysen på opp til 15% innenfor hver art når et panel av 20 stammer tilfeldig valgt fra den ikke-Sa/mø/ie/Za-arten blir testet.

Det er også beskrevet en fremgangsmåte for bestemmelse av bakterier tilhørende slekten Salmonella i en prøve, kjennetegnet ved at den omfatter gjennomføring av en anrikningsfremgangsmåte som omfatter

overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, hvor vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, novobiocin blir tilsatt til mediet før, samtidig med eller etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 39,0°C i et tidsrom mellom 15-30 timer fra overføringen, idet tilsetningen av novobiocin eller en annen eventuell selektiv substans forskjellig fra selenitt, den av disse som kommer sist (anrikningsperiode),

og deretter gjennomføring av en bestemmelse som har en varighet på høyst 7 timer for å identifisere og/eller kvantifisere Salmonella som er tilstede i anrikningsmediet etter formeringen,

idet summen av tiden for anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen har en varighet på høyst 40 timer og betingelsene for anrikningsprosedyren er så tilpasset til bestemmelsen at test 1

som definert i krav 1, vil produsere, i bestemmelsen, et positivt resultat i minst 90% av alle tilfellene når et panel av tilfeldig valgte Salmonella serotyper testes, og at test 2 som definert i krav 1, vil gi opphav til en prosentandel av falske positive resultater i analysen på opp til 15% innenfor hver art når et panel av 20 stammer tilfeldig valgt fra den ikke-Sa/møne/Za-arten blir testet.

Det er følgelig overraskende blitt funnet av oppfinnerne at primær anrikning av en prøve av rå matvare i et bufret Salmonella-selektivt medium ved 37°C-43°C i et tidsrom så kort som 19 timer, vil være en effektiv måte til anrikning av Salmonella tilstede i den opprinnelige prøve, på en måte som sikrer at en ELISA gjennomført på de anrikede prøver er høyst spesifikk og minst så følsom som standard dyrkingsmetodene for påvisning av Salmonella i prøver av råprodukter.

Det er videre som angitt blitt funnet at en primær anrikning av en prøve av bearbeidende matvareprodukter (endog i et ikke selektivt medium) etterfulgt, etter et tids-rom, av en forhøyelse av temperaturen fra ca. 37°C til 40oC-43°C er en effektiv måte til anrikning av Salmonella som er tilstede i den opprinnelige prøve på en måte som sikrer at en ELISA gjennomført på de anrikede prøver etter 19 timer er høyst spesifikk og er minst like følsom som standard dyrkingsmetodene for påvisning av Salmonella i prøver av bearbeidede produkter.

Den påvisning som gjennomføres etter anrikningen kan foregå etter en selektiv postanrikning for å fortynne matvarekomponentene som muligens kunne interferere ikke-spesifikt i de påfølgende analyser. For å kompensere fortynningen av Salmonella gjennomføres postanrikningen vanligvis i et tidsrom i området fra ca. 2 til ca. 6 timer ved en temperatur i området fra ca. 40°C-43°C. Nærmere bestemt vil varigheten av etter-anirkningen fordelaktig være i området fra ca. 2,0-4,5 timer, fortrinnsvis i området fra 2,5-3,5 timer, og mest fortrinnsvis vil varigheten av etteranrikningen være ca. 3 timer. Hvorvidt en slik selektiv etteranrikning burde gjennomføres, beror hovedsakelig på egenskapene ved den analyse som anvendes i bestemmelsestrinnet: I tilfelle analysen er i alt vesentlig ufølsom for anderledes interfererende eller endog kryssreagerende substanser i den analyserte prøve, er det intet behov for en slik etteranrikning.

Oppfinnelsen er basert på ovenfor nevnte og andre funn, og anvender en strategi hvor Salmonella blir utsatt for en selektiv anrikning så snart cellene er klare for dette. Hovedfilosofien bak dette er å inhibere konkurrerende mikroflora, slik at overvekst av Salmonella med denne mikroflora blir motvirket, også med hensyn til evnen som konkurrerende mikroflora har til å bli påvist i bestemmelsen. Selv om motvirking av overveksten av Salmonella ved strategien ifølge den foreliggende oppfinnelse også i noen utstrekning vil legge et seleksjonstrykk på Salmonella, vil den balanserte selektivitet som anvendes ifølge denne oppfinnelse ikke desto mindre være i betydelig favør av Salmonella med hensyn til å oppnå en heldig påvisning av eventuell Salmonella i en prøve, slik det vil fremgå av følgende beskrivelse og dokumentasjon.

Uttrykt på en annen måte er den foreliggende oppfinnelse primært basert på ideen om å tilpasse anrikningsfremgangsmåten til bestemmelsesrfemgangsmåten, heller enn å tilpasse bestemmelsesrfemgangsmåten til en klassisk anrikningsfremgangsmåte, idet sistnevnte er den vanlige måte. Spesielle trekk ifølge denne oppfinnelse er basert på de oppdagelser at ved å kombinere den selektive substans tetrationat med en forhøyet inkuberings-temperatur,

oppnås en spesielt høy sensitivitet og spesifisitet med hensyn til påvisning av Salmonella,

spesielt i råprodukter, og

ved å kombinere anvendelsen av det antibiotiske middel novobiocin med en forhøyet inkuberingstemperatur oppnås tilsvarende utmerkede resultater, spesielt i bearbeidede produkter.

Sammenfattet tilveiebringer denne oppfinnelse nye fremgangsmåter som tillater påvisning av Salmonella i løpet av 24 timer med svært høy grad av sensitivitet og spesifisitet.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

I det følgende er gitt flere definisjoner av begreper som anvendes heri:

Ifølge et trekk vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for bestemmelse av bakterier tilhørende slekten Salmonella i en prøve, spesielt en rå prøve, idet fremgangs-måten omfatter en av de tre anrikningsfremgangsmåter l)-3) forklart nedenfor, og en bestemmelse for å identifisere og/eller kvantifisere Salmonella som er tilstede i anrikningsmediet etter formeringen, idet bestemmelsen omfatter et analysetrinn som er basert på identifikasjon og/eller kvantifisering av et mål-molekyl eller en molekylær interaksjon som involverer et målmolekyl og som er forskjellig fra tradisjonelle agar-utplatingsteknikker som definert heri. Eksempler på analyser basert på identifikasjon og/eller kvantifisering av et målmolekyl eller en molekylær interaksjon som involverer et mål-molekyl er: analyser som involverer en immunologisk reaksjon, så som en immunoassay, f.eks. en Radio Immune Assay (RIA), en Enzyme Immun Assay (EIA), en Enzyme Linked Immune Sorbent Assay (ELISA), en fluorescence Antibody technique (FA), en immunoassay omfattende anvendelse av liposomer, miceller eller liposom-lignende partikler i bestemmelsesfasen, en analyse som involverer immunimmobilisering, en analyse som involverer immunagglutinering så som lateksagglutinering; analyser hvori bestemmelsestrinnet omfatter en DNA/DNA-hybridise-ringsassay, en RNA/RNA-hydbridiseringsassay eller en DNA/RNA-hybridiseirngsassay; analyser hvori bestemmelsestrinnet omfatter en polymerasekjedereaksjon (PCR) eller lignende in vitro nukleinsyre-multiplikasjonstrinn; og analyser hvori bestemmelses-trinnet omfatter anvendelse av peptidnukleinsyrer (PNA; kfr. Nielsen P E et al., 1991).

Ifølge denne oppfinnelse er det en fordel å begrense varigheten av analysetrinnet. Normalt bør analysen ha en varighet på høyst 7 timer, men kortere varighet blir foretrukket, så som høyst 6, 5, 4, 3, 2 og 1 timer.

Andre interessante typer av bestemmelsestrinn er oppført i det følgende: bestemmelsestrinn omfattende anvendelse av lektiner eller lignende analyse omfattende

reseptorbinding;

bestemmelsestrinn omfattende anvendelse av bakteriofager (hvorav bakteriofagen Felix 01

er en spesielt interessant mulighet);

bestemmelsensrrinn omfattende en metabolsk omdanning av Salmonella i en substans som fører til en forandring i den elektriske motstand eller impedans av det medium som inne-

holder Salmonella og hvori påvisningen av Salmonella gjennom-føres ved å måle denne

forandring;

bestemmelsestrinn omfattende en analyse for evnen til Salmonella til å migrere på eller

gjennom en agar-matriks;

bestemmelsestrinn omfattende en analyse som involverer et filtreringstrinn, hvori bakteriene blir adskilt fra mediet og holdes tilbake på et filer (her er en analyse som

involverer en hydrofob grid-membranfilterfremgangsmåte (HGMF) særlig interessant); bestemmelsestrinn omfattende en analyse som involverer en radiometrisk metode; og bestemmelsestrinn omfattende en analyse som involverer en kromatografisk separasjon.

Særlige utførelser av slike analyser er i høy grad beskrevet i de referanser som er oppført på side 2 i denne beskrivelse.

Et stort antall slike analyser er kjent i teknologien. I eksempeldelen er det beskrevet anvendelse av en ELISA assy, men det skal forstås at et slikt valg er av begrenset viktighet ved utførelse av denne oppfinnelse. F.eks. vil analyser som involverer hybridisering mellom nukleinsyrer også være svært interessante kandidater, ettersom slike analyser kan finstilles til svært høy grad av arts-spesifisitet så vel som av stamme-spesifisitet. Slike analyser kan dessuten være mindre følsomme for interferens fra andre bakterier eller substanser, og således redusere behovet for en selektiv etteranrikning og derved forenkle fremgangsmåtene ifølge denne oppfinnelse.

Det skal forstås at de ovenfor nevnte analyser danner en del av "bestemmelses-trinnet" hvormed heri menes den fase av fremgangsmåten hvori bestemmelsen av Salmonella finner sted.

Med betegnelsen "bestemmelse" menes den kvantitative eller kvalitative fastsettelse av tilstedeværelsen av Salmonella i en prøve. Ofte vil en kvalitativ fastsettelse være målet for fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse, ettersom det viktigste ofte vil være utelukkende å fastslå tilstedeværelsen eller fraværet av Salmonella. I situasjoner hvor det tolereres enten en viss begrenset forurensning eller en kvantitativ bestemmelse i seg selv er interessant (f.eks. når det bestemmes nivået av Salmonella i en prøve fra et dyr eller menneske) kan bestemmelsen imidlertid være kvantitativ. I sistnevnte tilfelle er det vanligvis nødvendig å sammenligne med en ytre standard inneholdende en kjent mengde Salmonella, idet standarden blir behandlet på en måte som er parallell med den for prøven.

Den anvendte analyse kan være en hvilken som helst beleilig

analyse for bestemmelse av tilstedeværelsen av Salmonella. Analysen er imidlertid ikke en "tradisjonell agar-utplatingsteknikk" som anvendt i mange standard protokoller for påvisning av Salmonella, f.eks. den utplatingsteknikk som er beskrevet i ISO 6579.

En analyse kan være utsatt for interferens som skriver seg fra ikke spesifikke inter-aksjoner mellom substanser som inneholdes i den opprinnelige prøve og komponenter i analysen. Slik interferens kan gi opphav til falske positive resultater så vel som falske negative resultater.

Det skal forstås at problemene forårsaket av slike interfererende substanser, stammer fra det faktum at begynnelseskonsentrasjonen av ikke mikrobiologisk materiale i det primære anrikningsmedium er høy, og vil holde seg slik gjennom hele den primære anrikning, mens den opprinnelige tetthet av mikroorganismer både Salmonella og andre vanligvis er ganske lav. En anrikningsfremgangsmåte ifølge denne oppfinnelse vil således ikke ha noen effekt på den iboende interferens av substanser som allerede er tilstede, mens anrikningsfremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse vil eliminere eller i betydelig grad redusere interferens fra kryssreagerende mikroorganismer.

Når den anvendes heri skal betegnelsen "kryssreaktivitet" referere til den karakteristiske evne hos ikke Salmonella bakterier eller molekyler som skriver seg fra ikke Salmonella bakterier til å fremkalle et falskt positivt resultat eller signal. Følgelig vil en "kryssreagerende mikroorganisme" utvise kryssreaktivitet eller "kryssreagere". Det skal forstås at kryssreaktivitet er et resultat av tilstedeværelsen av et felles trekk ved den kryss-reagerende substans/mikroorganisme og den Salmonella som det analyseres for. Kryssreaktivitet bør derfor adskilles fra ikke spesifikke fenomener så som ikke spesifikke interaksjoner mellom substanser og komponenter i en analyse.

I tillegg til en analyse kan bestemmelsestrinnet derfor omfatte en "postanrikning" hvorved det menes en selektiv anrikning som gjennomføres ved å overføre materiale fra den primære anrikning til et volum av et selektivt anrikningsmedium for å fortynne substanser i det primære anrikningsmedium som ellers kunne interferere i analysen. Som nevnt ovenfor vil nødvendigheten av en postanrikning være høyst avhengig av den anvendte type av analyse, og det er hovedsakelig når det anvendes analyser som er gjenstand for de ovenfor nevnte ikke spesifikke interaksjoner at en postanrikning vil vise seg å være verdifull.

I denne sammenheng skal betegnelsen "signal" referere til det målbare utbytte av en analyse som tester for tilstedeværelsen av en valgt karakteristikk for Salmonella. Nevnte karakteristikk kan være et hvilket som helst biologisk eller kjemisk trekk som atskiller Salmonella fra andre mikroorganismer i den prøve som analyseres for tilstedeværelse av Salmonella, så som DNA-fragmenter, RNA-fragmenter, antigendeterminanter, enzymer, reseptorer og andre makromolekyler.

I den foreliggende sammenheng skal betegnelsen "cut-off- verdi" referere til det minimale signal fra en analyse som blir ansett som et positivt signal. I eksperimentene som gjennomføres ved anvendelse av ELIS A-2 teknikken defineres denne cut-off-verdi som to ganger det signal som oppnås når det analyseres en i alt vesentlig Salmonella-fri prøve bestående av WASH, mens cut-off-verdien i eksperimentene som anvender ELISA-1 teknikken defineres som en prosentsats av en vel definert standard prøve av Salmonella

(for detaljer, kfr. eksempeldelen).

Følgelig skal, i denne sammenheng betegnelsen "positivt signal", dvs. et endelig eller sannsynlig resultat som fastslår at prøven inneholder Salmonella, bety et signal over en valgt cut-off-verdi, og betegnelsen "negativt signal", dvs. et endelig eller sannsynlig resultat som fastslår at prøven ikke inneholder Salmonella, skal betegne et signal under cut-off-verdien.

Et "sant positivt signal" eller resultat defineres heri som et positivt signal eller resultat som kan bekreftes ved dyrking fra mediet av den primære anrikning som resulterte i det positive signal. Dyrkingen kan gjennomføres som beskrevet i eksempel 5 heri.

Et "falskt positivt" signal eller resultat defineres heri som et positivt signal eller resultat som ikke kan bekreftes ved dyrking fra mediet av den primære anrikning som resulterte i det positive signal i bestemmelsen. Dyrkingen kan gjennomføres f.eks. som beskrevet i eksempel 5 heri. Tilsvarende defineres et "falskt negativt" signal eller resultat som et negativt signal eller resultat som ikke kan bekreftes som negativt ved dyrking fra mediet av den primære anrikning som resulterte i det negative signal i bestemmelsen.

Betegnelsen "prøven" som anvendt heri definerer en hvilken som helst prøve tatt fra en hvilken som helst kilde som mistenkes for å ha Salmonella. Prøver som skal under-kastes fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse kan således skrive seg fra kilder så som rå og bearbeidede produkter som definert nedenfor, men også fra kilder så som avføring, magesaft, urin, blod, lymfe, ryggmarksvæske, biopsier og andre prøver tatt fra dyr, innbefattet mennesker. En annen viktig gruppe av prøver er prøver av miljøopprinnelse: støv, swaps, avfall osv.

Med betegnelsen "produkt" menes alle slags prøver som er undersøkt for tilstede-værelse av Salmonella, mens betegnelsen "bearbeidet produkt" defineres som et produkt, f.eks. en matvare eller et for, som er blitt utsatt for hvilken som helst slags bearbeiding unntatt frysing som kan føre til subletal skade av Salmonella (f.eks. oppvarming, tørking, røyking, surgjøring) og som typisk inneholder mindre enn 5 vekt% råmateriale som definert nedenfor. Betegnelsen "råprodukt" eller råmateriale er således et produkt som ikke er blitt underkastet den ovennevnte bearbeiding. Et råprodukt inneholder typisk

minst 5 vekt% rått kjøtt og/eller fisk, og/eller

minst 5 vekt% rå egg, og/eller

minst 5 vekt% rå melk, og/eller

minst 5 vekt% rå grønnsaker og/eller frukt, og/eller

minst 5 vekt% av en miljøprøve valgt f.eks. fra kloakk, og avføring.

Anrikningsfremgangsmåte 1) skal først diskuteres. Denne anriknings-rfemgangsmåte omfatter overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, idet vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, og tetrationat og/eller en annen selektiv substans er tilsatt til eller dannet i mediet før, samtidig med eller etter overføringen og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 38°C i et tidsrom etter overføringen av prøven (preanrikningsperiode) og temperaturen av blandingen deretter økes til 39-43°C og blandingen holdes ved den økte temperatur på 39-43°C i et tidsrom etter temperaturøkningen (anrikningsperioden). Anrikningsrfemgangsmåte 1) karakteri-seres ved anvendelse av en selektiv substans, spesielt tetrationat.

Vekstmediet som anvendes i anrikningsfremgangsmåten ovenfor og i de andre anrikningsfremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelse er et medium inneholdende basalt assimilerbare næringskilder, mikronæringsmidler og essensielle vekstfaktorer. Mediet bør ha et osmotisk trykk tilpasset for dyrking av Salmonella og bør være bufret til en pH i området fra 6,7 til 7,3. Det foretrekkes at mediet er fritt for eller i alt vesentlig fritt for sukker, eller, dersom mediet ikke inneholder sukkere, at deres konsentrasjon er slik tilpasset til mediets bufferkapasitet at mediets pH ikke vil bringes utenfor det ovennevnte område på grunn av syredannelse som resultat av fermentering av sukrene, i det minste innenfor de første 10-12 timer. Et utmerket medium som tilfredsstiller disse kriterier er bufret pepton-ann (BPW)-

I den foreliggende sammenheng betegner uttrykket "anrikning" ganske enkelt dyrking i et vandig vekstmedium for Salmonella som letter formeringen av Salmonella, mens "preanrikning" betegner en foregående dyrking ved en temperatur som er lavere enn temperaturene under den påfølgende anrikning. En "primær anrikning" er i alt vesentlig den første dyrking i et vandig vekstmedium for Salmonella som finner sted i løpet av de første 15-30 timer.

Hovedstrategien ved anrikningsfremgangsmåte 1) er å anvende en selektiv substans i et tidligere trinn av fremgangsmåten, og derved eksponere ikke-Salmonella for inhiberende tilstander så snart som mulig, og samtidig tilpasse konsentrasjonen av den selektive substans og andre betingelser, innbefattet temperaturen, slik at bare lite inhibering av Salmonella vil forekomme, og deretter, når Salmonella har tilpasset seg til betingelsene, gjøre de selektive betingelser mer stringente ved å øke temperaturen, hvorved Salmonella vil vise god veksthastighet sammenlignet med mange ikke-Salmonella, og i tillegg vil ikke-Salmonella ha tendens til å gi færre falske positive på grunn av mindre utvikling av f.eks. flagella som kunne interferere i f.eks. en senere ELISA bestemmelse. Mens pre-anrikningsperioden kan ha en lengde i området 10 minutter til 8 timer, er den normalt i området fra 0,5 time til 7 timer og ofte i området fra 1 time til 6,5 timer, så som i området fra 2 timer til 6 timer, spesielt fra 3 timer til 5 timer. En foretrukket lengde av pre-anrikningsperioden er ca. 4 timer.

I anrikningsfremgangsmåten ovenfor (og i den andre anrikningsfremgangsmåte beskrevet heri) er det mulig å danne den selektive substans i vekstmediet på et visst punkt etter at anrikningen har begynt. En slik dannelse av selektiv substans er ifølge denne oppfinnelse fortrinnsvis i alt vesentlig momentan, men kan være en gradientlignende prosess, hvor konsentrasjonen av den selektive substans øker langsomt. Når den selektive substans er tetrationat, gjennomføres dannelsen av tetrationat ved å holde tiosulfat i mediet og senere tilsette jod for derved å oppnå tetrationat i mediet.

"Selektive prinsipper" når de anvendes heri er midlet til å lette veksten av Salmonella i forhold til veksten av de fleste andre mikroorganismer (ikke-Salmonella) i et vandig vekstmedium, dvs. at et selektivt prinsipp kan være en substans (selektiv substans) som, når den tilsettes til et Salmonella vekstmedium i tilstrekkelig mengde vil inhibere veksten av Salmonella i en betydelig mindre grad enn de fleste andre mikroorganismer, eller et selektivt prinsipp kan være justering av en fysisk parameter, f.eks. temperatur, til en verdi som inhiberer veksten av Salmonella i en betydelig mindre grad enn de fleste andre mikro-organismer. Et selektivt prinsipp betegner videre et middel som sikrer at en valgt analyse for påvisning av tilstedeværelsen av Salmonella gjennomført etter en anrikning som gjør anvendelse av et selektivt prinsipp, i alt vesentlig ikke vil være påvirket av tilstedeværelsen i den opprinnelige prøve av annerledes kryssreagerende mikroorganismer eller molekyler.

Følgelig skal "selektiv anrikning" betegne en anrikningsfremgangsmåte som gjør bruk av et selektivt prinsipp, og følgelig vil en "ikke-selektiv anrikning" være en anrikningsfremgangsmåte som ikke gjør bruk av selektive prinsipper.

Det vil bli forstått at andre mikroorganismer meget vel kan være tilstede i den analyserte prøve og endog i høyere konsentrasjoner enn den Salmonella som det testes for, men at disse mikroorganismer ikke interfererer med den valgte analyse, fordi deres kryss-reaktivitet er undertrykket som en konsekvens av anrikningsfremgangsmåten.

Ved en "primær selektiv anrikning" menes en primær anrikning som omgjøres til en selektiv anrikning innenfor de første 8 timer av den primære anrikning.

Ifølge det som er forklart ovenfor skal betegnelsene "anriknings-substrat", "anrikningsmedium", "primær anriknings-substrat", "primært anrikningsmedium", "selektivt anriknings-substrat", "selektivt anrikningsmedium", "primært selektivt anriknings-substrat" og "primært selektivt anrikningsmedium" betegne substrater eller medier som anvendes for de tilsvarende anrikninger.

Det skal forstås at en primær selektiv anrikning har som sitt hovedformål å tilveie-bringe tilstrekkelige mengder av Salmonella for å gjennomføre en bestemmelse for tilstede-værelsen av Salmonella som vil føre til et positivt signal i en analyse, dersom eventuell Salmonella var tilstede i den opprinnelige prøve. En anrikningsfremgangsmåte bør derfor evalueres med hensyn til sin evne til å anrike en opprinnelig liten konsentrasjon av Salmonella til en endelig tilstrekkelig høy konsentrasjon av Salmonella for å gjennomføre en heldig analyse. Sensitiviteten av en kombinert fremgangsmåte omfattende en anrikningsfremgangsmåte og en bestemmelse for Salmonella er således avhengig av effektiviteten av anrikningen så vel som følsomheten av den anvendte bestemmelse.

Betegnelsen "følsomhet" som anvendt heri, defineres som evnen til en fremgangs-måte til å påvise Salmonella, dersom den er tilstede, i den opprinnelige prøve. Dersom det angis at en frem-gangsmåte har en bedre følsomhet enn en standard protokoll betyr det at fremgangsmåten statistisk vil finne flere sanne positive resultater enn standard protokollen ved testing av et stort antall vilkårlige prøver.

Varigheten av anrikningsperioden er vanligvis tilpasset slik at summen av pre-anrikningsperioden og anrikningsperioden er i området 10-48 timer, fortrinnsvis 15-30 timer, spesielt 17-24 timer, hvorved eventuell Salmonella i prøven vanligvis vil være multiplisert til et akseptabelt nivå, mens den samlede varighet av anriknings-rfemgangsmåten samtidig er tilfredsstillende kort. Det skal forstås at der hvor pre-anrikning og anrikningsperioder er diskutert heri, skal de angitte perioder være den samlede tid under de aktuelle betingelser; selv om det normalt ikke foretrekkes kan pre-anriknings- eller anrikningsperioden avbrytes, f.eks. ved tilsetning eller dannelse av en selektiv substans eller av andre grunner.

Kombinasjonen av en egnet konsentrasjon av tetrationat og en temperatur i området 39-43°C gjør det således mulig å oppnå på den ene side en utmerket vekst av Salmonella og på den annen side en svært betydelig undertrykkelse av kryssreaksjoner fra ikke-Salmonella som ville føre til falske positiver. Selv om konsentrasjonen av tetrationat i blandingen i prinsippet kan være i området ca. 5-50 mM eller endog utenfor dette område, vil konsentra-sjonen av tetrationat normalt være i området ca. 7-35 mM, vanligvis i området ca. 9-30 mM og fortrinnsvis i området ca. 11-28 mM, slik som i området ca. 13-26 mM, f.eks. ca. 14-25 mM, fortrinnsvis i området ca. 15-23 mM og i mange tilfeller fortrinnsvis i området ca. 16-22 mM, spesielt i området ca. 17-21 mM så som ca. 18-20 mM. Den mest foretrukne konsentrasjon av tetrationat er ca. 19 mM. Som angitt ovenfor vil den bestemte konsentrasjon som skal velges i en særlig situasjon, særlig avhengig av temperaturen og tilstedeværelsen av eventuelle andre selektive substanser. Som et interessant supplement til tetrationat kan tilsettes novobiocin for å undertrykke Proteus og mange Gram-positive bakterier. Den optimale mengde av novobiocin er ca. 2,5 fig/ml. Som en retningslinje vil den fore-trukne temperatur innenfor området 39-43°C normalt være mellom 40 og 42°C under i alle fall en betydelig del av anrikningsperioden, spesielt i området mellom 40,5 og 41,5°C, mest fortrinnsvis 41°C.

Selv om mediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3 ved begynnelsen av anrikningsfremgangsmåten, kan det ikke utelukkes at i spesielle tilfeller, f.eks. når det arbeides med prøver av potensielt sur pH så som rå melkeprodukter, vil pH ikke holde seg i dette område under hele anrikningsfremgangsmåten, selv om det vanligvis foretrekkes at det er tilstrekkelig bufferkapasitet tilstede til å holde pH innenfor dette område. Innenfor det angitte område er det foretrukket å holde pH i underområdet mellom 6,7 og 7,3, spesielt akkurat omkring 7,0.

Fortrinnsvis vil tetrationatet eller en annen selektiv substans, så som novobiocin, være tilstede 1 mediet før tilsetningen av prøven til mediet. I tilfelle tetrationat skal det bemerkes at denne substans vanligvis fremstilles in situ ved tilsetning av jod til mediet, hvorved jod vil omsettes med tiosulfat som på forhånd er blitt tilsatt til mediet. Det skal imidlertid forstås at selv om det vanligvis ikke foretrekkes, kan tetrationat og/eller en annen selektiv substans tilsettes til eller dannes i mediet på et tidspunkt etter tilsetningen av prøven til mediet. I et slikt tilfelle vil tilsetningen eller dannelsen av den selektive substans vanligvis finne sted høyst 4 timer etter overføringen, hensiktsmessig høyst 2 timer etter overføringen, fortrinnsvis høyst 1 time etter overføringen eller mest fortrinnsvis høyst 1C minutter etter overføringen.

Mens selenitt, så som natriumhydrogenselenitt (i det følgende betegnet selenitt), er en vanligvis anvendt selektiv substans i Salmonella-anrikning, innbefattet standard protokollen, f.eks. AOAC, er selenitt ikke en foretrukket substans i den foreliggende sammenheng, spesielt fordi det har tendens til å gi problemer med falske positiver. Av denne grunn blir det foretrukket at ingen selenitt er tilstede i anrikningsmediet, eller at eventuell tilstedeværelse av selenitt er begrenset til en konsentrasjon som tilsvarer selenitt-konsentrasjonen i en løsning inneholdende høyst 0,5% vekt/volum natriumhydrogen-selenitt.

Et viktig trekk ved en kombinert primær selektiv anrikning og påfølgende bestemmelse for tilstedeværelse av Salmonella er spesifisiteten; det vil bli forstått at en slik kombinert frem-gangsmåte kan gi opphav til positive resultater som ikke kan tilskrives tilstedeværelsen av Salmonella. En fremgangsmåte lik fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse bør således også evalueres med hensyn til sin evne å unngå falske positive resultater. Betingelsene ved anrikningsfremgangsmåten blir således tilpasset til bestemmelsen, slik at det oppnås en bestemmelse med høy kvalitet.

Når den anvendes heri skal betegnelsen "spesifisitet" referere til evnen som en fremgangsmåt har til å unngå å gi falske positive resultater eller signaler. Det skal forstås at en fremgangsmåte som gir et lavt antall falske positive resultater eller signaler, er en fremgangsmåte med en høy grad av spesifisitet.

For å assistere med tilpasningen er det utviklet et sett enkle og reproduserbare tester. To av disse tester anvender lett tilgjengelige standard renkulturer som er tilgjenge-lige fra nasjonale samlinger, så som ATCC: Test 1) er en test for fremgangsmåten evne til å påvise Salmonella og gjennomføres ved å utføre den ovenfor diskuterte anriknings- og bestemmelsesfremgangsmåte hvori det selektive anrikningsmedium er blitt inokulert med en stamme av Salmonella til en start-konsentrasjon på ca. 15 celler/ml og 10% vilkårlig utvalgt og oppmalt rått kjøtt er blitt tilsatt til anrikningsmediet ved begynnelsen av anrikningsperioden, og den resulterende blanding er blitt holdt ved temperaturen eller temperaturene for anrikningsperioden, og testen ansees som godkjent dersom den vil frembringe, i bestemmelsen, et positivt resultat i minst 90% av alle tilfeller ved testing av et panel av vilkårlig valgte Salmonella serotyper.

Test 2) er en test for fremgangsmåtens evne til å unngå falske positiver, og gjennomføres ved å utføre ovenfor diskuterte anrikningsfremgangsmåte og bestemmelsen hvori det selektive anrikningsmedium er blitt inokulert ved begynnelsen av anrikningsperioden med en stamme av en av ikke-Salmonella-artene

Citrobacter freundii,

Escherichia coli, og

Enterobacter cloacae,

til en utgangskonsentrasjon derav på ca. 100 celler/ml, idet det selektive anrikningsmedium er i alt vesentlig fritt for mikro-organismer forskjellige fra den inokulerte ikke-Salmonella-stamme, og den resulterende blanding er blitt holdt ved temperaturen eller temperaturene for anrikningsperioden, og testen ansees som godkjent når prosentsatsen av falske positiver i analysen er høyst 15% innenfor hver art ved testing av et panel av 20 stammer vilkårlig valgt fra ikke-Salmonella-artene.

Det skal forstås at dersom et spesielt arrangement ikke vil passere en eller begge av testene, vil en fagperson på dette område forstå hvordan han kan finjustere betingelsene ved anrikningen til betingelsene for bestemmelsen, f.eks. ved å øke anrikningstemperaturen og/eller konsentrasjonen av den selektive substans og/eller nedsette pre-anrikningstiden i tilfelle test 2) gir opphav til altfor mange falske positiver, og ved f.eks. å redusere stringensen av selektive prinsipper for å unngå falske negativer i test 1).

Selv om et minimum av sanne positiver i test 1) er 90%, blir det foretrukket at dette tall er høyere, så som 92% eller 95% eller bedre 97% eller endog opp til 99,5% eller bedre 99,9% i test 1)-

Dessuten bør test 2 resultere i ikke mer enn 15% falske positiver, fortrinnsvis 12% eller 10% eller mer fortrinnsvis 7% eller 5% og endog ned til 1% eller 0,5%.

En mer definitiv test omfatter en kalibrering av fremgangsmåten og arrangementet mot standard protokollen enn NMKL nr. 71 (Nordic Committee on Food Analysis method no. 71, 1991,4. utgave), med de unntak at RVS som definert heri blir anvendt istedenfor RV som definert heri og RVS blir inkubert ved 42°C og at XLD som definert heri også anvendes som utplatingsmedium, på en slik måte at bestemmelsen resulterer i minst 80% sanne positive resultater som definert heri sammenlignet med standard protokollen, og gir opphav til høyst 10% falske positive resultater som definert heri når det testes 100 prøver av oppmalt kjøtt (test 3), og vekten av prøvekolleksjonen som skal testes i hver av de to fremgangsmåter er 25 g, og de 100 prøver tilveiebringes fira 10 forskjellige utsalg, som hvert leverer 10 forskjellige prøver, idet 20 av de fremskaffede prøver er blitt inokulert med ca. 15 Salmonella typhimurium celler pr. prøve og 20 av de fremskaffede prøver er blitt inokulert med ca. 15 Salmonella enterititis celler pr. prøve.

I en slik kalibrering kan minimumskravet være 80% sanne positiver ved fremgangs-måten ifølge denne oppfinnelse sammenlignet med standard protokollen, men målet vil ofre være høyere så som 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% og endog 100% eller endog flere sanne positiver. Med hensyn til antallet falske positiver vil det maksimalt akseptable nivå vanligvis være 10%, men målet vil være lavere prosentsatser så som 8%, 5%, 3%, 2% og 1% eller endog 0%.

En av fordelene med fremgangsmåten ifølge denne forbindelse er at den reduserer den totale påvisningstid, sammenlignet med standard protokollen. Summen av anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsestrinnet vil normalt være høyst 56 timer (så som høyst 48 timer, 40 timer, 34 timer, 32 timer, 28 timer), men mer realistiske utførelser vil vanligvis gi resultater i løpet av 24 timer eller endog i løpet av 22 eller 20 timer.

Fremgangsmåten beskrevet ovenfor anvendes fortrinnsvis til bestemmelse av Salmonella i prøver som er forskjellige fra bearbeidede produkter, dvs. rå produkter som definert ovenfor.

Anrikningsrfemgangsmåte 2) skal nå beskrives. Denne fremgangsmåte involverer overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, idet vekstmediet bufres til en pH mellom 6,7 og 7,3, og vekstmediet med prøven holdes ved en temperatur på 39-42,5°C, og tetrationat og/eller en annen selektiv substans blir tilsatt til eller dannet i mediet før, samtidig med eller høyst 8 timer etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på 39-42,5°C i et tidsrom fra overføringen (anrikningsperiode).

Strategien for denne anrikningsrfemgangsmåte er å anvende temperaturen som den viktigste selektive parameter helt fra starten av anrikningsfremgangsmåten, mens tetrationat og/eller en annen selektiv substans blir tilsatt i tilpassede mengder fortrinnsvis så snart som praktisk mulig. Med hensyn til detaljer angående denne strategi, dens koordinering med bestemmelsen og testene 1) - 3), gjøres det referanse til diskusjonen ovenfor av anrikningsfremgangsmåte 1) og til kravene. En viktig variant i anriknings-rfemgangsmåte 2) er imidlertid hvor det tilsettes novobiocin til mediet som den eneste selektive substans før, samtidig med eller etter overføringen av prøven, idet mengden av novobiocin i dette tilfelle er i området fra ca. 1 til 100 jig/ml, særlig 1-20 /ig/ml, spesielt

2-13 /ig/ml. I dette tilfelle vil anrikningstemperaturen fortrinnsvis være i området 40-42°C.

Endelig omfatter anrikningsrfemgangsmåte 3) å overføre prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, idet vekstmediet blir bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, og tetrationat blir tilsatt til eller dannet i mediet før, samtidig med eller høyst 3 timer etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på ca. 36,0- 39,0°C i et tidsrom etter overføringen av prøven (anrikningsperiode). Også med hensyn til denne fremgangsmåte vil diskusjonen gitt ovenfor vedrørende fremgangsmåte 1) være relevant i den hensiktsmessige utstrekning, med de viktige unntak at fremgangsmåte 3) gir de beste resultater når temperaturen holdes i området 36-39°C og at tetrationat bør tilsettes eller dannes i løpet av ca. 1 time, fortrinnsvis i løpet av 5 minutter, fra tilsetningen av prøven.

Mens alle variantene ovenfor er overveiende egnet i forbindelse med rå prøver, vil et annet viktig trekk ifølge denne oppfinnelse vedrøre en fremgangsmåte for anrikning og bestemmelse av Salmonella spesielt i bearbeidende produkter. Dette trekk, som vil bli diskutert i det følgende, omfatter gjennomføring av en anrikningsfremgangsmåte som omfatter enten

a) overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, idet vekstmediet blir bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3 og inneholder i alt vesentlig ingen bakteriell vekst-

inhiberende substans, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 39,0°C

et tidsrom på minst 1 minutt (preanrikningsperiode), og deretter

økning av blandingens temperatur til 39,5-43°C og eventuelt tilsetning av novobiocin og/eller en annen selektiv substans, og

blandingen holdes ved den økte temperatur på 39,5-43°C i et tidsrom fra temperatur-økningen (selektiv anrikningsperiode), eller b) overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, idet vekstmediet blir bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, og novobiocin og/eller en annen selektiv substans blir tilsatt til mediet

før, samtidig med eller etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 39,0°C i et tidsrom fra overføringen eller tilsetningen av novobiocin eller en annen selektiv substans, hvilken som helst som er senest (pre-anriknings-periode), og deretter

økning av blandingens temperatur til 39,5-43°C og eventuelt tilsetning av novobiocin eller en annen selektiv substans,

og blandingen holdes ved den økte temperatur på 39,5-43°C i et tidsrom fra temperaturøkningen (selektiv anrikningsperiode), eller

c) overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, idet vekstmediet blir bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, og novobiocin blir tilsatt til mediet før, samtidig med eller etter

overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 39,0°C i et tidsrom fra overføringen eller tilsetningen av novobiocin eller en annen selektiv substans, hvilken som helst som er senere (anrikningsperiode),

og deretter gjennomføring av en bestemmelse for å identifisere og/eller kvantifisere Salmonella som er tilstede i anrikningsmediet etter formeringen.

Strategien bak dette trekk ifølge oppfinnelsen er i prinsippet den samme som strategien bak det først nevnte trekk, det er at prøven bør underkastes selektive prinsipper så snart som Salmonella er klar derfor, men det foreliggende trekk tar spesielt hensyn til at Salmonella i en bearbeidet prøve er subletalt skadet og må gjenopplives hensiktsmessig før den kan underkastes noen som helst uttalt selektivitet.

Anrikningsfremgangsmåtene ifølge dette trekk av oppfinnelsen blir antatt å være unike og fordelaktige, ikke bare i forbindelse med en analysebestemmelse som definert ovenfor til hvilken de er perfekt adobterbare, men også ganske generelt som anrikningsfremgangsmåter i sin egen rett som kan anvendes i kombinasjon med de konvensjonelle selektive anrikningsmedier (så som RV og TTB som definert nedenfor) så vel som med konvensjonell agarutplating. For de fleste formål omfatter imidlertid bestemmelsen fortrinnsvis et analysetrinn som er basert på identifikasjon og/eller kvantifisering av et målmolekyl eller en molekylær interaksjon som involverer et målmolekyl, og hvilket analysetrinn er forskjellig fra agarutplating som definert heri, konferer diskusjonen i forbindelse med aspektet spesielt vedrørende rå produkter.

Betingelsene for hver av anrikningsfremgangsmåtene blir fortrinnsvis tilpasset slik til bestemmelsen at

en test (test 4) omfattende anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen hvori det vandige vekstmedium er blitt inokulert med varmebehandlede celler av en Salmonella-stamme til en startkonsentrasjon på ca. 1000 varmebehandlede celler pr. ml og 5% ikke-fett tørrmelk er blitt tilsatt til mediet ved begynnelsen av anrikningsfremgangsmåten vil frembringe, i bestemmelsen, et positivt resultat i 90% av alle tilfeller når det testes et panel av vilkårlig

valgte Salmonella serotyper, og

en test (test 5) omfattende anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen, hvori det vandige vekstmedium er blitt inokulert med en stamme av en av ikke-Salmonella-artene Citrobacter freundii,

Escherichia coli, og

Enterobacter cloacae,

til en startkonsentrasjon derav på ca. 100 celler/ml ved begynnelsen av anrikningsfremgangsmåten vil gi opphav til en prosentsats av falske positiver i bestemmelsen på høyst 25% innenfor hver art av et panel av 20 vilkårlig valgte arter av ikke-Salmonella-stammene.

Varmebehandlingen av cellene nevnt ovenfor bør gjennomføres i vann ved 51°C inneholdende 0,85% NaCl i 10 minutter.

Også i dette trekk gjennomføres en kalibrering mot en standard dyrkingsprotokoll, NMKL nr. 71 (Nordic Committee on Food Analysis method no. 71,1991, fjerde utgave), på en slik måte at bestemmelsen resulterer i minst 80% sanne positive resultater sammen-lignet med standard protokollen, og gir opphav til høyst 10% falske positive resultater som definert heri når det testes (test 6) tilsammen 50 prøver av 50 g melkepulver vilkårlig valgt med hensyn til sats og type, idet hver prøve blir oppdelt i et sett av to deler å 25 g, og en del av hvert sett blir underkastet som prøve til en fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelse for anrikning og bestemmelse spesielt av Salmonella i bearbeidede produkter, og den andre del av hvert sett blir underkastet som prøve til standard dyrkingsprotokollen, og 25 av de 50 sett på 25 g deler blir forsterket på følgende måte: en 25 g del av settet, underkastet standard dyrkingsprotokollen, blir supplementert ved tilsetning, ved begynnelsen av anrikningsfremgangsmåten av protokollen, 0,1-1 g ikke-fett tørrmelk inneholdende ca. 5 CFU Salmonella panama eller Salmonella typhimurium til

det vandige vekst-medium anvendt i protokollen,

den andre 25 g del av settet, underkastet en fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelse for anrikning og bestemmelse spesielt av Salmonella i bearbeidede produkter, blir supple-

mentert ved tilsetning, ved begynnelsen av anrikningsfremgangsmåten, 0,1-1 g ikke-fett tørrmelk inneholdende ca. 5 CFU Salmonella panama eller Salmonella typhimurium til det vandige vekstmedium.

"CFU" (Colony forming units: kolonidannende enheter) bestemmes ved anvendelse av en konvensjonell fortynnings- og utplatingsteknikk.

Med hensyn til de resultater som tilsiktes i testene 4)-6), gjelder de samme betraktninger som er diskutert ovenfor i forbindelse med det aspekt som spesielt gjelder rå produkter, med det unntak at test S generelt er noe mindre stringent enn den tilsvarende test 2 diskutert ovenfor, slik som det vil fremgå fra de relevante krav.

I variant a) eller variant b), er preanrikningsperioden normalt minst 0,5 time, så som 1-10 timer, fortrinnsvis 1-8 timer, spesielt 2-6 timer, så som 3-5 timer og mest fortrinnsvis 3,5-4,5 timer. En særlig foretrukket varighet av preanrikningsperioden er ca. 3 timer.

Med hensyn til den samlede anrikningsperiode, varigheten av bestemmelsestrinnet og karakteren av analysene, gjelder de samme betraktninger som diskutert ovenfor.

I alle aspekter ovenfor vil prøven bli fremstilt ifølge de reguleringer som gjelder i hvilket som helst spesielt land for det spesielle produktområde som prøven tilhører. Prøvefremstillingen kan således omfatte maling, findeling, homogenisering osv. ifølge vel kjente standard fremgangsmåter.

EKSEMPLER

Materialer og metoder

Ettersom Salmonella må bestemmes i konsentrasjoner så lave som én bakterie i 25 g matvarer er det nødvendig å gjennomføre en anrikning av prøven før ELISA-analysen.

Den anvendte anrikningsfremgangsmåte i eksemplene består av en selektiv primær anrikning 15-30 timer ifølge prinsippene beskrevet ovenfor, og en etteranrikning i modifisert M-substrat i noen av eksemplene som en del av bestemmelsestrinnet for å fortynne matvarekomponenter som muligens kunne interferere i de påfølgende analyser. For å kompensere for fortynningen av Salmonella blir etteranrikningen vanligvis gjennomført i et tidsrom i området ca. 2 til ca. 6 timer ved en temperatur i temperaturområdet fra 40°C til 43°C. Modifiseringen av M-substratet består av tilsetning av enten tetrationat eller novobiocin.

Den samlede anrikningsfremgangsmåte kan således gjennomføres på tilsammen ca. 15 til 36 timer.

Følgende medier ble anvendt i eksperimentene beskrevet i eksemplene nedenfor:

API-20E system: Bio Mérieux 20100.

BGA: Brilliantgrønn agar (Merck 7273/Oxoid CM 329).

BP W: Bufret peptonvann

(Gibco 152-03812/OxoidCM501).

Konjugat 1: Salmonella monoklonalt antistoff konjugert til enzymet

j8-galaktosidase (2 /ig/ml)

Konjugat 2: Salmonella polyklonalt antistoff konjugert til biotin.

AV-GAL: Streptavidin konjugert til /3-galaktosidase (Zymed) fortynnet

2000 ganger i 1% bovint serum albumin.

H-serum: Flerverdig H-serum (Difco 2406).

LIA: Lysin jem agar (Difco 0849).

MB: M-Broth (Difco 0940).

MBN: M-Broth supplementert med novobiocin (Sigma N 1628,10 fig/ml). O-serum: Flerverdig O-serum (Difco 2264).

ONPG substrat: 0-nitrofenyl-j3-D-galaktopyranosid (Sigma N 1127)

fremstilt som beskrevet av Cowan, 1974.

Partikkel sol. 2.: Immunosfærer (Dynabead® (et registrert varemerke eiet av Dynal,

Norge), 2,0 mg/ml) belagt med monoklonale antistoffer rettet mot et

Salmonella vanlig flagellært antigen.

Partikkel sol. 1.: Immunosfærer (Dynabead® (et registrert varemerke eiet av Dynal,

Norge), 0,6 mg/ml) belagt med monoklonale antistoffer rettet mot et

Salmonella vanlig flagellært antigen.

RV-substrat: Rappaport-Vassiliadis substrat (Merck 7700).

RVS substrat: Rappaport-Vassiliadis substrat (Oxoid CM 866).

RM:Rått medium: BP W supplementert med 17 g/l NaS2C>3 (Merck 6516) hvorav en del

er omdannet til tetrationat ved tilsetning av 19 ml/l jodløsning. Jod-løsning: 6 g jod (Merck 4761) + 5 g KJ (Merck 5043) + 20 ml H20.

STOP: Glycin-buffer, 0,1 M, pH 10,5.

SUB: 4-metylumbelliferyl-|3-galaktosid, 100 fiM, 1 mM MgCl2 i 0,7%

dimetylformamid.

TSI: Trippel-sukker-jem (Difco 0265).

TTB: Tetrationat buljong (Difco 0104).

WASH: PBS (fosfonat-bufret saltløsning) + 0,1% Triton-Xl 00, pH 7,4.

XLD: Xylose-lysin-desoksycholat-agar (Gibco 152-05600/Oxoid CM 469). Lysin-buljon: 2 g L-lysin (Merck 5700) oppløst i 10 ml H20 og tilsatt til 200 ml

Decarboxylase Base Moeller (Difco 0890).

Jernsulfitt: Agar medium fremstilt som beskrevet av anonym, 1980.

MX4: MB supplementert med 17 g/l Na-S203 (Merck 6516) hvorav en del

er omdannet til tetrationat ved tilsetning av 20 /il/ml jodløsning.

Alle anrikede prøver ble bestemt ved anvendelse av en ELISA-teknikk (Enzyme Linked Immune Sorbent Assay) på et automatisert analyseapparat. Eksemplene 3-8 ble gjennomført ved anvendelse av EiaFoss® Analyzer, et instrument konstruert av Foss Electric, Danmark, for automatisert ELISA-analyse, mens eksperimentene i eksempel 1 og 2 ble gjennomført ved anvendelse av en utviklings-modell av det samme instrument.

ELISA-1:

Denne ELISA-analyse er basert på "sandwich-teknikken" ved anvendelse av to forskjellige monoklonale antistoffer rettet mot Salmonella antigenene. Antistoffene reagerer svakt med den native flagella, men kraftig med et varmebehandlet ekstrakt av Salmonella. De anrikede prøver blir derfor varmebehandlet ved 100°C i 15 minutter som beskrevet i detalj i eksempel 1 før gjennomføring av ELISA. Denne varmebehandling dreper/inaktiverer Salmonella og andre patogene bakterier. ELISA er i stand til å påvise IO<5> celler/ml. Anrikningen blir tilpasset til å sikre at antallet av Salmonella er minst IO<5> pr. ml når anrikningen er fullstendig.

Den automatiserte ELISA-analyse på EiaFoss® Analyzer tar ca. 75 minutter, men kan gjennomføres manuelt, og kan beskrives som følger: Et prøverør med WASH (negativ kontroll) og et prøverør med 500 fil kalibrator (en varmebehandlet suspensjon av Salmonella typhimurium fortynnet til en konsen-trasjon på ca. IO<6> celler/ ml) plasseres i en prøveskål sammen med prøverør inne-holdende 500 fil

varmebehandlede prøver.

Prøvene varmes opp til 35°C og analysen starter.

90 /il partikkel sol. 1 tilsettes til hver prøve og inkuberes i 12,5 minutter. Salmonella antigener tilstede i prøven vil reagere med antistoff og danne immun-komplekser på overflaten av immunosfærene. Det samlede overflateareal av mikrokulene er svært stort, og dette tillater at det finner sted en hurtig og effektiv binding mellom antistoffer og

antigener.

Ubundet materiale vaskes bort med WASH mens immunosfærene beholdes i siden av

prøverøret med magnetisk kraft.

130 fil konjugat 1 tilsettes deretter og inkuberes i 12,5 minutter. Det konjugerte antistoff binder seg til immunosfære-antigenkomplekset. Dette skaper en "sandwich" med Salmonella

antigener som fylling.

Ubundet merket antistoff vaskes bort med WASH.

200 fil SUB tilsettes og inkuberes i 12,5 minutter. Enzymet bundet til partiklene vil spalte substratet til bl.a. 4-metylumbelliferyl, en fluorescerende forbindelse som måles med en

fluorescensdektektor (eksitasjon 365 nm, emisjon 450 nm).

Enzymreaksjonen stanses ved tilsetning av 200 /il STOP. Konsentrasjonen av 4-metylumbelliferyl måles nå av detektoren, og konsentrasjonen er proporsjonal med mengden av Salmonella antigen tilstede i prøven. Fluorescenssignalet for den enkelte prøve sammenlignes med en cut-off-verdi, definert som 25% av kalibrator-signalet. Prøver med et signal høyere enn eller lik cut-off-verdien blir ansett som positive. Prøver med et signal under cut-off-verdien betraktes som negative.

ELISA-2:

Denne ELISA-analyse er også basert på "sandwich-teknikken", ved anvendelse av to forskjellige antistoffer (et monoklonalt og et polyklonalt) mot Salmonella antigenene. Antistoffene reagerer også svakt med den native flagella, men kraftig med et varmebehandlet ekstrakt av Salmonella. De anrikede prøver blir derfor varmebehandlet ved 100°C i 15 minutter som beskrevet i detalj i eksempel 1 før gjennomføring av ELISA. Denne varmebehandling dreper/inaktiverer Salmonella og andre patogene bakterier.

ELISA er i stand til å påvise IO<6> celler/ml.

Denne ELISA-analyse kan beskrives som følger:

Et prøverør med WASH (negativ kontroll) og et prøverør med 500 /il positiv kontroll (en renset løsning av Salmonella typhimurium flagellin fortynnet til en konsentrasjon tilsvarende en flagellinkonsentrasjon i en suspensjon på ca. IO<6> celler/ml) plasseres i en

prøveskål sammen med prøverør inneholdende 500 /il varmebehandlede prøver.

60 fil partikkel sol. 2 som også inneholder 63 /ig/ml konjugat 2 blir tilsatt til hver prøve og inkubert i 25 minutter. Salmonella antigener tilstede i prøven vil reagere med antistoff og danne immunkomplekser på overflaten av immunosfærene. Det biotinkonjugerte antistoff binder seg samtidig til immunosfære-antigenkomplekset. Dette skaper en "sandwich" med Salmonella antigener som fylling. Det totale arealet av mikrosfærene er svært stort, og

dette tillater at det foregår en hurtig og effektiv binding mellom antistoffer og antigener. Ubundet materiale vaskes bort med WASH mens immunosfærene beholdes i siden av

prøverøret med magnetkraft.

100 ul AV-GAL blir deretter tilsatt og inkubert i 20 minutter. AV-GAL binder seg til

immunosfære-antigen-antistoffkomplekset.

Ubundet AV-GAL vaskes bort med WASH.

230 fil SUB tilsettes og inkuberes i 8 minutter. Enzymet bundet til partiklene vil spalte substratet til bl.a. 4-metylumbelliferyl, en fluorescerende forbindelse som måles med en

fluorescensdektektor (eksitasjon 365 nm, emisjon 450 nm).

Enzymreaksjonen stanses ved tilsetning av 230 fil STOP. Konsentrasjonen av 4-metylumbelliferyl måles nå med detektoren, og konsentrasjonen er proporsjonal med mengden av Salmonella antigen tilstede i prøve. Fluorescenssignalet for den enkelte prøve sammenlignes med en cut-off-verdi, definert som to ganger signalet for den negative kontroll. Prøver med et signal høyere enn eller lik cut-off-verdien blir ansett som positive. Prøver med et signal under cut-off-verdien blir ansett som negative.

Antistoffene som anvendes i den ovenfor beskrevne ELISA-analyse kan tilveie-bringes ved fremgangsmåter kjent for en fagperson på dette område.

Et polyklonalt antistoff mot Salmonella kan fremstilles f.eks. ved immunisering av kaniner med rensede flagella etter en standardisert immuniseringsfremgangsmåte. Det tappes blod fra kaninene og serum isoleres og renses også ved anvendelse av standard teknikk. Antistoffene renses videre ved absorbsjon av anti-serum omfattende polyklonale antistoffer ved anvendelse av rensede flagella fra en kryssreagerende Citrobacter freundii

Det kan fremstilles et monoklonalt antistoff ifølge standard monoklonalt antistoff-teknikk ved anvendelse av Salmonella flagellin som immunogen (for informasjon om monoklonale antistoffer, kfr. bl.a. Kohler & Millstein, 1975).

EKSEMPEL 1

Primær selektiv anrikning og bestemmelse av Salmonella

i forsterkede prøver av oppmalt kjøtt

To porsjoner av 1 g av en Salmonella-fri prøve av oppmalt kjøtt ble overført til to prøverør hvert inneholdende 10 ml av RM. En over natten kultur (37°C) av Salmonella ble fortynnet 10<5 >ganger i en 0,85% NaCl-løsning, som resulterte i en sluttkonsentrasjon av Salmonella på ca. 3xl0<3 >celler/ml. 50 pil av denne cellesuspensjon ble tilsatt til et av de ovenfor nevnte prøverør, hvilket ga opphav til et gjennomsnittlig initialt celletall på 15 celler/ml. Begge prøverør ble inkubert i 24 timer ved 41°C.

Etter anrikning ble prøverørene oppvarmet i kokende vann i 15 minutter. Etter avkjøling ble de varmebehandlede suspensjoner underkastet en ELISA-2-analyse.

Tilsammen 34 prøver av oppmalt kjøtt ble testet som beskrevet ovenfor (forurensningsmønstret er angitt i tabell 1). Alle 34 for-sterkede prøver viste positiv reaksjon i ELISA-2-analysen, og ingen av de ikke-forurensede kjøttprøver ble funnet positive.

Fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse for anrikning av Salmonella fra rå matvareprøver har således evne til spesifikt å anrike Salmonella fra en konsentrasjon på

ca. 15 celler/ml til over det nivå som tilsvarer cut-off-verdien for ELISA-2 som er ca.

IO<6> celler/ml.

EKSEMPEL 2

Temperaturavhengighet av fremgangsmåten ifølge eksempel 1

25 prøver av oppmalt kjøtt ble testet på lignende måte som i testen i eksempel 1, med det unnta at den primære selektive anrikning ble gjennomført også ved 37°C og 43°C. Programmet for forurensningen av kjøttprøvene var som oppført i tabell 2.

Som det klart kan sees ut fra resultatene ovenfor synes temperaturoptimum således å være ca. 41°C.

For ytterligere å undersøke temperaturavhengigheten av denne fremgangsmåte, ble

9 prøver av oppmalt kjøtt testet som ovenfor ved temperaturer på 39°C, 40°C, 41°C og 42°C. Programmet for inokulering var som det kan leses ut av tabell 4:

Som det klart kan sees er fremgangsmåten ifølge eksempel 1 svært følsom og høyst spesifikk i hele området 39°C-42°C.

EKSEMPEL 3

Selektivitet av den primære selektive anrikning for Salmonella

fra rå og bearbeidede produkter

25 forskjellige Salmonella-stammer og 11 forskjellige ikke-Salmonella-stammer ble anriket under ikke-selektive betingelser i MB (37°C, 18 timer), varmebehandlet i 15 minutter ved 100°C og deretter seriefortynnet 10 ganger til 10.000 gangers fortynning. De 11 ikke-Salmonella-stammer ble utvalgt fra 100 stammer nært beslektet med Salmonella, og alle viste (i et tidligere eksperiment) svak til sterk kryssreaktivitet i ELISA-1 mens de gjenværende 89 stammer ikke gjorde det. De fortynnede suspensjoner ble underkastet ELISA-1. Resultatene er vist i tabell 6:

Som det fremgår fra tabellene 6 og 7 er anrikningen ifølge denne oppfinnelse således i stand til å fjerne eventuell kryssreaktivitet for 10 av de 11 ikke-Salmonella-stammer som kryssreagerte når de ble anriket ikke-selektivt. Og som det kan sees ble Salmonella i mye mindre grad påvirket av den selektive primære selektive anrikning.

De samme stammer av Salmonella og ikke-Salmonella ble også underkastet ELISA-1 etter en primær selektiv anrikning som er spesielt egnet for anrikning av bearbeidede produkter:

Ca. 30 celler/ml ble tilsatt til et prøverør inneholdende 10 ml av BPW supplementert med 2,5 pig/ml novobiocin. Prøverøret ble deretter inkubert ved 37°C i 4 timer. Umiddelbart deretter ble prøverøret ytterligere inkubert ved 41°C i 15 timer. Deretter ble 0,5 ml anriket suspensjon overført til 10 ml MBN som deretter ble inkubert i 3 timer ved 42°C. MBN ble varmebehandlet, fortynnet og ELISA-1 testet som beskrevet ovenfor i dette eksempel.

Som det fremgår ved sammenligning av tabellene 6 og 8 vil anrikningen ifølge denne oppfinnelse således være i stand til å fjerne eventuell kryssreaktivitet for 9 av de 11 ikke-Salmonella-stammer som kryssreagerte når de ble anriket ikke selektivt. Imidlertid ble Salmonella påvirket i mye lavere grad ved den selektive primære selektive anrikning.

EKSEMPEL 4

Sammenligning av en standard dyrkingsfremgangsmåte og den primære

selektive anrikning og bestemmelse av Salmonella i rå produkter

Tilsammen 54 rå prøver (f.eks. broilere, oppmalt kjøtt, eggehvite og eggeplomme) ble undersøkt på tilstedeværelse av Salmonella ved anvendelse av en standard dyrkingsprotokoll som anvendes ved anrikningsfremgangsmåtene foreslått av Nordic Committee on Food Analysis (NMKL nr. 71) med det viktige unntak at RV ble inkubert ved 42,5°C istedenfor ved 41,5°C: En prøve på 25 g ble blandet med 225 ml BPW i sterile mageposer og homogenisert for hånd i 15-20 sekunder. Posene ble inkubert ved 37°C ± 1°C i 18-24 timer. En porsjon på 0,1 ml ble overført til 10 ml RV buljong og inkubert i vannbad ved 42,5 ± 0,2°C i 20-24 timer. Av den anrikede RV buljong ble en løkkefull strøket ut på BGA. Agarplatene ble inkubert ved 37 ± 1 °C og inspisert etter 18-24 timer og kontrollert på nytt etter 48 timer. Dersom de var tilgjengelige ble 4-6 mistenkelige kolonier fra hver plate inokulert i TSI, jernsulfittagar, lysinbuljong, ONPG-buljong og endelig bekreftet serologisk ved agglutinering med flerverdig O- og H-serum. Fremdeles tvilsomme isolater ble ytterligere identifisert ved anvendelse av API-20E-systemet.

De 54 prøver ble testet i parallell ved anvendelse av en fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelse: En prøve på 25 g ble blandet og homogenisert som beskrevet for standard dyrkingsfremgangsmåten beskrevet ovenfor. De rå produkter ble blandet med 225 ml av RM supplementert med 1,5 jig/ml novobiocin. RM med rå prøver ble inkubert i vannbad ved 41,5 0,2°C i 19-24 timer. Prøvene ble etteranriket i 3 timer i MBN og testet ved anvendelse av ELISA-1-teknikken beskrevet i eksempel 3 ovenfor. Positive prøver ble veriifsert ved overføring av 0,1

ml fra RM til 10 ml RV buljong som ble inkubert i vannbad ved 42,5 ± 0,2°C i 20-24 timer.

Fra RV buljongen ble en løkkefull strøket ut på BGA, som ble inkubert ved 37 ± 1°C i 18-24 timer. Mistenkelige kolonier (en til tre fra hver skål) ble inokulert i TSI og LIA og bekreftet serologisk med flerverdig O- og H-serum. Fremdeles tvil-somme isolater ble ytterligere identifisert ved anvendelse av API-20E-systemet. Når en ELISA-1 positiv prøve ikke kunne verifiseres ved fremgangsmåten ovenfor, ble det også forsøkt isolering av Salmonella ved anvendelse av TTB som selektiv anrikningsbuljong. Fra RM ble 1 ml overført til 10 ml TTB og inkubert ved 42,5°C i 18-24 timer, etterfulgt av subkultivering på BGA og XLD. Mistenkelige kolonier ble undersøkt som beskrevet ovenfor.

Resultatene er gjengitt i tabell 9:

Den kombinerte fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen er følgelig minst like følsom til påvisning av Salmonella som standard dyrkingsmetoden. Ingen falske positiver ble observert ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hvilket viser at den primære selektive anrikningsfremgangsmåte er høyst spesifikk.

EKSEMPEL 5

Primær selektiv anrikning og bestemmelse av Salmonella i naturlig forurensede prøver av kjøtt og benmel og tørket blodalbumin ved anvendelse av fremgangsmåte Ml

Tilsammen 60 prøver omfattende 45 prøver av kjøtt og benmel og 15 prøver av tørket blodalbumin ble undersøkt på tilstedeværelsen av Salmonella som følger:

Ml:

Fra hver prøve ble en 10 g porsjon overført til 160 ml BPW. BP W med prøven ble inkubert ved 37°C i 4 timer. Deretter ble temperaturen justert til 41°C, og inkuberingen fortsatt i 15 timer. Fra hver anrikningsbuljong ble det overført en porsjon på 0,5 ml til 10 ml av MBN og inkubert ved 42°C i 3 timer. MBN ble deretter oppvarmet i kokende vann i 15 minutter og avkjølt under springvann før gjennomføring av en ELISA-l-assay. ELISA positive prøver ble verifisert ved overføring av 0,1 ml fra den primære anrikningsbuljong (BPW) til 10 ml RV buljong og 1,0 ml til 10 ml TTB. Rørene inneholdende RV og TTB ble inkubert ved 43°C i 20-24 timer. Fra RV og TTB ble en løkkefull strøket ut på BGA og XLD som ble inkubert ved 37°C i 18-24 timer. Mistenkelige kolonier ble inokulert i TSI og LIA og bekreftet serologisk med flerverdig O-serum og H-serum. Fremdeles mistenkelige isolater ble ytterligere identifisert ved anvendelse av API-20E-systemet.

Videre ble prøvene undersøkt ved anvendelse av en standard dyrkingsprotokoll:

Standard protokoll:

10 g fra hver prøve ble overført til 160 ml BPW og inkubert ved 37°C i 18-24 timer. Deretter ble porsjoner på 0,1 ml og 1,0 ml av anrikningsbuljongen overført til henholdsvis 10 ml RV buljong og 1,0 ml til 10 ml TTB. Rørene inneholdende RV og TTB ble inkubert ved 43°C i 20-24 timer. Fra RV og TTB ble en løkkefull strøket ut på BGA og XLD som ble inkubert ved 37°C i 18-24 timer. Mistenkelige kolonier ble inokulert i TSI og LIA og bekreftet serologisk med flerverdig O-serum og H-serum. Fremdeles mistenkelige isolater ble ytterligere identifisert med anvendelse av API-20E-systemet.

Resultatene er gjengitt i tabell 10:

Som det fremgår av tabellen ovenfor er fremgangsmåte Ml mer effektiv til påvisning av Salmonella i de undersøkte prøver av bearbeidede produkter enn standard dyrkingsprotokollen. Det er bemerkelsesverdig at ingen falske positiver er blitt observert ved anvendelse av Ml.

Selektiviteten som innføres ved å heve temperaturen forbedrer således Salmonella-påvisningen ved anvendelse av ELISA-teknikken så vel som ved anvendelse av en tradisjonell utplatingsteknikk (dvs. dyrkingsprotokollen for bekreftelse).

EKSEMPEL 6

Temperaturavhengighet for Ml fremgangsmåten i eksempel 5

63 bearbeidede mat- og forprøver ble testet på lignende måte som Ml i eksempel 5, med de unntak at den primære selektive anrikning også ble gjennomført ved 40°C og 42°C, RVS ble anvendt istedenfor RV og inkubert ved 42°C og TTB ble også inkubert ved 42°C. 18 av de testede prøver var forstoffer hvori Salmonella tidligere var blitt isolert. De gjenværende 45 prøver, omfattende 9 prøver av forvellede grønnsaker, 7 prøver av kakao, 5 prøver av for for kjæledyr, 4 prøver av kreps, 9 prøver av ferdigmåltider, 9 prøver av supper og 2 prøver av tørket kokosnøtt, var tidligere ikke undersøkt. Resultatene er gjengitt i tabell 11:

Ml anrikningsfremgangsmåten er således jevnt effektiv med hensyn til å påvise Salmonella i bearbeidede produkter i temperaturområde fra 40°C til 42°C. Som i eksempel 5 er ingen falske positiver blitt observert.

EKSEMPEL 7

Primær selektiv anrikning og bestemmelse av Salmonella i naturlig forurensede prøver av kjøtt og benmel og tørket blodalbumin ved anvendelse av fremgangsmåtene M2 og M3

Tilsammen 89 forprøver hvorav noen få ble rapportert av leverandøren å være forurenset med Salmonella, ble undersøkt på tilstedeværelse av Salmonella som følger:

M2:

Fra hver prøve ble en 10 g porsjon overført til 160 ml BPW supplementert med 2,5 ftg/ml novobiocin og ble inkubert ved 37°C i 4 timer. Deretter ble temperaturen justert til 41 °C og inkuberingen fortsatt i 15 timer. Fra hver anrikningsbuljong ble det overført en porsjon på 0,5 ml til 10 ml av MX4 og etteranriket ved 41°C i 4 timer. MX4 ble deretter oppvarmet i kokende vann i 15 minutter og avkjølt under springvann før gjennomføring av en ELISA-1-assay. ELISA positive prøver ble verifisert ved overføring av 0,1 ml fra den primære anrikningsbuljong (BPW) til 10 ml RVS buljong og 1,0 ml til 10 ml TTB. Rørene inneholdende RVS og TTB ble inkubert ved henholdsvis 42°C og 43°C, i 20-24 timer. Fra RVS og TTB ble en løkkefull strøket ut på BGA og XLD som ble inkubert ved 37°C i 18-24 timer. Mistenkelige kolonier ble inokulert i TSI og LIA og bekreftet serologisk med flerverdig O-serum og H-serum. Fremdeles mistenkelige isolater ble ytterligere identifisert ved anvendelse av API-20E-systemet.

M3:

En lignende modus operandi som i M2 ble anvendt for en annen sats av de samme prøver, med det unntak at inkuberingstemperaturen ble hevet til 43°C istedenfor 41°C. Til slutt ble prøvene undersøkt ved anvendelse av en standard dyrkingsprotokoll: 10 g fra hver prøve ble overført til 160 ml BPW og inkubert ved 37°C i 18-24 timer. Deretter ble porsjoner på 0,1 ml og 1,0 ml av anrikningsbuljongen overført til henholdsvis 10 ml RVS buljong og 1,0 ml til 10 ml TTB. Rørene inneholdende RVS og TTB ble inkubert ved henholdsvis 42°C og 43°C, i 20-24 timer. Fra RVS og TTB ble en løkkefull strøket ut på BGA og XLD som ble inkubert ved 37°C i 18-24 timer. Mistenkelige kolonier ble inokulert i TSI og LIA og bekreftet serologisk med flerverdig O-serum og H-serum. Fremdeles tvilsomme isolater ble ytterligere identifisert ved anvendelse av API-20E-systemet.

Resultatene er gjengitt i tabell 12:

Fremgangsmåten M2 påviser Salmonella i 50% flere prøver enn standard protokollen. Ved å øke temperatumivået til 43°C (M3) istedenfor 41 °C (M2) reduseres antallet positive prøver til et nivå som kan sammenlignes med nivået i standard protokollen. Imidlertid påvises falske positive prøver ved anvendelse av M2, mens bare en falsk positiv blir påvist ved M3. Den økte

inkuberingstemperatur resulterer således i øket selektivitet, men nedsatt følsomhet.

EKSEMPEL 8

Primær selektiv anrikning og bestemmelse av Salmonella

i forsterkede prøver av krydder

Tilsammen 8 prøver av krydder (pepper, curry, paprika, sennepspulver, tandoori) ble undersøkt som følger: To porsjoner av 6,25 g av hver krydderprøve ble overført til to kolber hver inneholdende 200 ml av BPW supplementert med 2,5 pig/ml novobiocin. Til en av porsjonene ble tilsatt en kapsel inneholdende melkepulver forurenset med ca. 5 CFU (kolonidannende enheter) Salmonella panama (kapslene ble levert fra the National Institute of Public Health and Environmental Protection, Bildhoven, Nederland). Alle kolber ble inkubert ved 37°C i 4 timer, hvoretter inkuberingen ble fortsatt i 15 timer ved 41°C. Deretter ble 1 ml overført til 10 ml MBN og inkubert i 3 timer ved 42°C og deretter varmebehandlet i kokende vann i 50 minutter. Etter avkjøling ble prøvene underkastet ELISA-1. Alle prøver, både ELISA positiver og negativer ble verifisert ved overføring av 0,1 ml fra den primære anrikningsbuljong BPW til 10 ml RVS buljong. Rørene ble inkubert ved 42°C i 20-24 timer. En løkkefull ble strøket ut på BGA og XLD som ble inkubert ved 37°C i 18-24 timer. Mistenkelige kolonier ble inokulert i TSI og LIA og bekreftet serologisk med flerverdig O-serum og H-serum. Fremdeles mistenkelige isolater ble ytterligere identifisert ved anvendelse av API-20E-systemet.

Resultatene er gitt i tabell 13:

Som konklusjon vil fremgangsmåten påvise Salmonella panama i 7 av 8 forsterkede prøver av krydder. I den gjenværende forsterkede prøve kunne Salmonella ikke påvises hverken ved ELISA eller ved bekreftelsesrfemgangsmåten. Det er imidlertid ikke uforståelig at dette viser at kapslen ikke inneholdt Salmonella. En av de ikke-inokulerte prøver (12,5%) ga et falskt positivt resultat ved ELISA.

REFERANSER

Anonymous, 1980, Determination of the number of sulphite-reducing clostridia in foods. Nordic committee on food analysis, Helsinki. Method no. 56.

Beumer R R, Brinkman E, Rombouts F M, 1991, Int. J. Food Microbiol. 12, sider 363-374.

Cowan S T, 1974, Cowan and Steel's Manual for the identification of medical bacteria. Cambridge University Press, Cambridge, 2. utgave, side 153.

D'Aoust J-Y, Sewell A M, 1988a, J. Food Protect. 51, sider 853-856.

D'Aoust J-Y, Sewell A M, 1988b, J. Food Protect. 51, sider 538-541.

D'Aoust J-Y, Sewell A M, Greco P, 1991, J. Food Protect. 54, sider 725-730.

Emswiler-Rose B, Gehle W D, Johnston R W, Okrend A, Moran A, Bennett B., 1991,

J. Food Sei. 49, sider 1018-1020.

Entis P, 1986, Membrane filtration systems. In: Pierson M D and Stem N J (Eds.), Foodborne Microorganisms and their toxins: Developing methodology. Marcel Dekker, New York, NY, and Basel, sider 91-106.

Hadfield S Q, Lane A, Mcillmurray M B, 1987, J. Immun. Met. 97, sider 153-158.

Holbrook R, Anderson J M, Baird-Parker A C, Dodds L M, Sawhney D, Stuchbury S H, Swaine D, 1989, Lett: Appl. Microbiol. 8, sider 139-142.

Kohler & Millstein, Nature 256, 1975, side 495.

Nielsen P E et al., 1991, Science 254, sider 1497-1500.

Notermans S. Werrmars K, 1991, In. J. Food Microbiol. 12, sider 91-102.

Smith P J, Boardman A, Shutt P C, 1989, J. Appl. Bacteriol. 67, sider 575-588.

Vassiliadis P, 1983, J. Appl. Bacteriol. 54, sider 69-76.

Wolcott M J, 1991, J. Food Protect. 54, sider 387-401.

Claims (51)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av bakterier tilhørende slekten Salmonella i en prøve, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter en anrikningsfremgangsmåte som omfatter enten

1) overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, idet vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, tetrationat og/eller en annen selektiv substans forskjellig fra selenitt blir tilsatt til eller dannet i mediet før, samtidig med eller etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 38°C i et tidsrom mellom 10 minutter og 8 timer etter overføringen av prøven (foranrikningsperiode) og temperaturen av blandingen deretter økes til 39-43°C og blandingen holdes ved den økte temperatur på 39-43°C i et tidsrom etter økningen av temperaturen (anrikningsperiode), slik at summen av tidsrommene for foranrikningsperioden og anrikningsperioden er mellom 10-48 timer, eller

2) overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, idet vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, og vekstmediet med prøven holdes ved en temperatur på 39-42,S°C, tetrationat og/eller en annen selektiv substans forskjellig fra selenitt blir tilsatt til eller dannet i mediet før, samtidig med eller høyst 8 timer etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på 39-42,5°C i et tidsrom på mellom 10-48 timer fra overføringen (anrikningsperiode), og deretter gjennomføring av en bestemmelse for å identifisere og/eller kvantifisere Salmonella som er tilstede i anrikningsmediet etter formeringen, idet bestemmelsen omfatter et analysetrinn som er basert på identifisering og/eller kvantifisering av et målmolekyl eller en molekylær interaksjon som involverer et målmolekyl og som er forskjellige fra tradisjonelle agarutplatingsteknikker, idet betingelsene ved anrikningsfremgangsmåten blir slik tilpasset til bestemmelsen at en test (test 1) omfattende anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen hvori det selektive anriknings-medium er blitt inokulert med en stamme av Salmonella til en startkonsentrasjon på ca. 15 celler/ml og 10% vilkårlig utvalgt oppmalt rått kjøtt er blitt tilsatt til anrikningsmediet ved begynnelsen av anrikningsperioden og den resulterende blanding er blitt holdt ved temperaturen eller temperaturene for anrikningsperioden vil frembringe, i bestemmelsen, et positivt resultat i minst 90% av alle tilfeller når det testes et panel av vilkårlig valgte Salmonella serotyper, og en test 2 omfattende anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen hvori det selektive anriknings-medium er blitt inokulert ved begynnelsen av anrikningsperioden med en stamme av en av ikke-5a/mø/!e//a-artene Citrobacter freundii, Escherichia coli, og Enterobacter cloacae, til en startkonsentrasjon derav på ca. 100 celler/ml, og det selektive anrikningsmedium er i alt vesentlig fritt for mikro-organismer forskjellige fra den inokulerte ikke- Salmonella-stamme, og den resulterende blanding er blitt holdt ved temperaturen eller temperaturene for anrikningsperioden vil gi opphav til en prosentsats av falske positiver i analysen på høyst 15% innenfor hver art når det testes et panel på 20 stammer vilkårlig valgt fra ikke- Salmonella- artene.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at temperaturen til anrikningsperioden er i området mellom 40 og 42°C, fortrinnsvis mellom 40,5 og 41,5°C

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at tetrationatet og/ eller en annen selektiv substans forskjellig fra selenitt blir tilsatt til eller dannet i mediet høyst 4 timer, så som høyst 2 timer, i høyden 1 time, og i høyden 10 minutter etter overføringen.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, variant 2), karakterisert ved at den eneste selektive substans som blir tilsatt til eller dannet i mediet før, samtidig med eller etter overføringen er novobiocin.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at konsentrasjonen av novobiocin i den resulterende blanding er i området ca. 1 til 100 ptg/ml, så som i området ca. 1 til 20 og 2 til 13/ig/ml.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3, variant 1), karakterisert ved at varigheten av foranrikningsperioden er i området 0,5-7 timer, så som i området 1-6,5 timer, 2-6 timer og 3-5 timer, og fortrinnsvis er varigheten ca. 4 timer.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at summen av tiden for anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsestrinnet har en varighet på høyst 56 timer, så som en varighet på høyst 48 timer, 40 timer, 34 timer, 32 timer, 28 timer, 24 timer, 22 timer og 20 timer.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at varigheten av anrikningsperioden eller, med hensyn til variant 1), summen av foranrikningsperioden og anrikningsperioden, er 15-30 timer, så som 17-24 timer.

9. Fremgangsmåte for bestemmelse av bakterier tilhørende slekten Salmonella i en prøve, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter en anrikningsfremgangsmåte som omfatter overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, idet vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, og tetrationat blir tilsatt til eller dannet i mediet før, samtidig med eller høyst 3 timer etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på ca. 36-39°C for et tidsrom mellom 15-30 timer etter overføringen av prøven (anrikningsperiode), og deretter gjennomføring av en bestemmelse for å identifisere og/eller kvantifisere Salmonella som er tilstede i anrikningsmediet etter formeringen, idet bestemmelsen omfatter et analysetrinn som har en varighet på høyst 7 timer og som er basert på identifisering og/eller kvantifisering av et målmolekyl eller en molekylær interaksjon som involverer et målmolekyl og som er forskjellig fra tradisjonelle agar-utplatingsteknikker, idet summen av tiden for anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen har en varighet på høyst 40 timer og betingelsene ved anrikningsfremgangsmåten er slik tilpasset til bestemmelsen at test 1 som definert i krav 1 vil frembringe, i bestemmelsen, et positivt resultat i minst 90% av alle tilfeller når det testes et panel av vilkårlig valgte Salmonella serotyper, og at test 2 som definert i krav 1 vil gi opphav til en prosentsats av falske positiver i analysen på høyst 15% innenfor hver art når det testes et panel av 20 stammer vilkårlig valgt fra ikke- Salmonella- artene.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at summen av tiden for anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsestrinnet har en varighet på høyst 34 timer, så som en varighet på høyst 32 timer, 28 timer, 24 timer, 22 timer og 20 timer.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9 eller 10, karakterisert ved at varigheten av anrikningsperioden er 17-24 timer.

1 2. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 9-11, karakterisert ved at temperaturen av anrikningsperioden er i området mellom 36°C og 39°C

13. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 9-12, karakterisert ved at tetrationatet blir tilsatt til eller dannet i mediet høyst 1 time etter overføringen, så som etter høyst 5 minutter.

14. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert v e d at den er kalibrert mot standardprotokollen NMKL nr. 71 (Nordic Committee on Food Analysis method no. 71,1991, fjerde utgave, 17. opptrykk), med de unntak at det anvendes Oxoid CM 866 Rappaport-Vassiliadis buljong (RVS) istedenfor Merck 7700 Rappaport-Vassiliadis buljong (RV) og RVS blir inkubert ved 42°C og at Gibco 152-05600/Oxoid CM 469 Xylose-lysin-desoksycholat-agar (XLD) også anvendes som utplatingsmedium, på en slik måte at bestemmelsen resulterer i minst 80% sanne positive resultater sammenlignet med standard protokollen, og gir opphav til høyst 10% falske positive resultater når det testes 100 prøver av oppmalt kjøtt (test 3), og vekten av prøveporsjonen som skal testes i hver av de to fremgangsmåter er 25 g, og de 100 prøver tilveiebringes fra 10 forskjellige utsalgssteder, som hvert leverer 10 forskjellige prøver, og 20 av de fremskaffede prøver er blitt inokulert med ca. 15 Salmonella typhimurium celler pr. prøve og 20 av de fremskaffede prøver er blitt inokulert med ca. 15 Salmonella enterititis celler pr. prøve.

15. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at prøven er forskjellig fra et bearbeidet produkt.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14 eller 15, karakterisert ved at bestemmelsen gir opphav til minst 85% sanne positive resultater sammenlignet med standard protokollen i test 3, så som minst 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% og 100% sanne positive resultater.

17. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 14-16, karakterisert ved at bestemmelsen gir opphav til høyst 8% falske positive resultater i test 3, så som høyst 5%, 3%, 2% og 1% falske positive resultater.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at bestemmelsen gir opphav til 0 falske positive resultater i test 3.

19. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at bestemmelsen gir opphav til minst 92% sanne positive resultater i alle tilfeller av test 1, så som minst 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% og 99,9% sanne positive resultater.

20. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at bestemmelsen gir opphav til høyst 12% falske positive resultater i test 2, så som høyst 10%, 7%, 5%, 3%, 2%, 1% og 0,5% falske positive resultater.

21. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at konsentrasjonen av tetrationat i den resulterende blanding er i området ca. 5-40 mM, så som i området ca. 7-35 mM, 9-30 mM, 11-28 mM, 13-26 mM, 14-25 mM, 15-23 mM, 16-22 mM, 17-21 mM og 18-20 mM.

22. Fremgangsmåte for bestemmelse av bakterier tilhørende slekten Salmonella i en prøve, karakterisert ved at den omfatter gjennomføring av en anrikningsfremgangsmåte som omfatter enten a) overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, hvor vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3 og inneholder i alt vesentlig ingen bakterie-vekst-inhiberende substans, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 39,0°C i et tidsrom på minst 1 minutt (foranrikningsperiode), og deretter økning av blandingens temperatur til 39,5-43°C og eventuelt tilsetning av novobiocin og/eller en annen selektiv substans forskjellig fra selenitt og blandingen holdes ved den økte temperatur på 39,5-43°C i et tidsrom fra temperaturøkningen selektiv (anrikningsperiode), eller b) overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, hvor vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, og novobiocin og/eller en annen selektiv substans forskjellig fra selenitt blir tilsatt til mediet før, samtidig med eller etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 39,0°C i et tidsrom på minst 0,5 time fra overføringen eller tilsetningen av novobiocin eller en annen selektiv substans forskjellig fra selenitt, den av disse som er sist (foranrikningsperiode), og deretter økning av blandingens temperatur til 30,5-43°C og eventuelt tilsetning av novobiocin eller en annen selektiv substans forskjellig fra selenitt og blandingen holdes ved den økte temperatur på 39,5-43°C i et tidsrom fra temperaturøkningen (selektiv anrikningsperiode), og deretter gjennomføring av en bestemmelse for å identifisere og/eller kvantifisere Salmonella som er tilstede i anrikningsmediet etter formeringen, idet summen av tidsrommene for for-anrikningsperioden og den selektive anrikningsperiode er mellom 10-48 timer og betingelsene for anrikningsprosedyren er så tilpasset til bestemmelsen at test 1 som definert i krav 1, vil produsere, i bestemmelsen, et positivt resultat i minst 90% av alle tilfellene når et panel av tilfeldig valgte Salmonella serotyper testes, og at test 2 som definert i krav 1, vil gi opphav til en prosentandel av falske positive resultater i analysen på opp til 15% innenfor hver art når et panel av 20 stammer tilfeldig valgt fra den ikke-Salmonella- arten blir testet.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at varigheten av for-anrikningsperioden er minst 0,5 time, så som 1-10 timer, 1-8 timer, 2-6 timer, 3-5 timer og 3,5-4,5 timer, og fortrinnsvis er varigheten ca. 4 timer.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 22 eller 23, karakterisert ved at summen av tiden for anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsestrinnet har en varighet på høyst 56 timer, så som en varighet på høyst 48 timer, 40 timer, 32 timer, 28 timer, 24 timer, 22 timer og 20 timer.

25. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 22-24, karakterisert ved at varigheten av summen av foranrikningsperioden og den selektive anrikningsperiode er 15-30 timer, så som 17-24 timer.

26. Fremgangsmåte for bestemmelse av bakterier tilhørende slekten Salmonella i en prøve, karakterisert ved at den omfatter gjennomføring av en anrikningsfremgangsmåte som omfatter overføring av prøven til et vandig vekstmedium for Salmonella, hvor vekstmediet er bufret til en pH mellom 6,7 og 7,3, novobiocin blir tilsatt til mediet før, samtidig med eller etter overføringen, og den resulterende blanding holdes ved en temperatur på høyst 39,0°C i et tidsrom mellom 15-30 timer fra overføringen, idet tilsetningen av novobiocin eller en annen eventuell selektiv substans forskjellig fra selenitt, den av disse som kommer sist (anrikningsperiode), og deretter gjennomføring av en bestemmelse som har en varighet på høyst 7 timer for å identifisere og/eller kvantifisere Salmonella som er tilstede i anrikningsmediet etter formeringen, idet summen av tiden for anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen har en varighet på høyst 40 timer og betingelsene for anrikningsprosedyren er så tilpasset til bestemmelsen at test 1 som definert i krav 1, vil produsere, i bestemmelsen, et positivt resultat i minst 90% av alle tilfellene når et panel av tilfeldig valgte Salmonella serotyper testes, og at test 2 som definert i krav 1, vil gi opphav til en prosentandel av falske positive resultater i analysen på opp til 15% innenfor hver art når et panel av 20 stammer tilfeldig valgt fra den ikke-Sa/møne/Za-arten blir testet.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at summen av tiden for anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsestrinnet har en varighet på høyst 32 timer, så som en varighet på høyst 28 timer, 24 timer, 22 timer og 20 timer.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 26 eller 27, karakterisert ved at varigheten av anrikningsperioden er 17-24 timer.

29. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 26-28, karakterisert ved at bestemmelsen omfatter et analysetrinn som er basert på identifisering og/eller kvantifisering av et målmolekyl eller en molekylær interaksjon som involverer et målmolekyl og hvilket analysetrinn er forskjellig fra agarutplating.

30. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 26-29, karakterisert ved at betingelsene ved anrikningsfremgangsmåten er slik tilpasset til bestemmelsen at en test 4 omfattende anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen hvori det vandige vekstmedium er blitt inokulert med varmebehandlede celler av en stamme av Salmonella til en startkonsentrasjon på ca. 1000 varmebehandlede celler/ml og 5% fettfri tørrmelk er blitt tilsatt til mediet ved begyn-nelsen av anrikningsfremgangsmåten vil frembringe, i bestemmelsen, et positivt resultat i 90% av alle tilfeller når det testes et panel av vilkårlig valgte Salmonella serotyper, og en test 5 omfattende anrikningsfremgangsmåten og bestemmelsen, hvori det vandige vekstmedium er blitt inokulert med en stamme av en av ikke- Salmonella-artene Citrobacter freundii, Escherichia coli, og Enterobacter cloacae, til en startkonsentrasjon derav på ca. 100 celler/ml ved begynnelsen av anrikningsfremgangsmåten vil gi opphav til en prosentsats av falske positiver i bestemmelsen på høyst 25% innenfor hver art av et panel av 20 vilkårlig valgte arter av ikke-5a/mo/ie//a-stammene.

31. Fremgangsmåtene ifølge hvilket som helst av kravene 26-30, karakterisert ved at den er kalibrert mot standard dyrkingsprotokollen NMKL nr.

71 (Nordic Committee on Food Analysis method nr. 71,1991, fjerde utgave, 17. opptrykk) på en slik måte at bestemmelsen resulterer i minst 80% sanne positive resultater sammen-lignet med standard protokollen, og gir opphav til høyst 10% falske positive resultater når det testes (test 6) tilsammen 50 prøver av 50 g melkepulver vilkårlig valgt med hensyn til sats og type, idet hver prøve er oppdelt i et sett av to deler av 25 g, og en del av hvert sett som prøve blir underkastet fremgangsmåten ifølge hvilket som helst av kravene 21-25 og den andre del av hvert sett som prøve blir underkastet standard dyrkingsprotokollen, og 25 av de 50 sett av 25 g deler er forsterket på følgende måte: en 25 g del av settet, underkastet standard dyrkingsprotokollen, blir supplementert ved tilsetning, ved begynnelsen av anrikningsfremgangsmåten av protokolen, 0,1-1 g fettfri tørrmelk inneholdende ca. 5 CFU Salmonella panama eller Salmonella typhimurium til det vandige vekstmediet anvendt i protokollen, den andre 25 g del av settet, underkastet fremgangsmåten ifølge hvilket som helst av kravene 21-25, blir supplementert ved tilsetning, ved begynnelsen av anrikningsfremgangsmåten, 0,1-1 g fettfri tørrmelk inneholdende ca. 5 CFU Salmonella panama eller Salmonella typhimurium til det vandige vekstmedium.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 31, karakterisert ved at bestemmelsen gir opphav til minst 85% sanne positive resultater sammenlignet med standard protokollen i test 6, så som minst 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% og 100% sanne positive resultater.

33. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 31-32, karakterisert ved at bestemmelsen gir opphav til høyst 8% falske positive resultater i test 6, så som høyst 5%, 3%, 2% og 1% falske positive resultater.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33, karakterisert ved at bestemmelsen gir opphav til 0 falske positive resultater i test 6.

35. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 26-34, karakterisert ved at bestemmelsen gir opphav til minst 92% sanne positive resultater i alle tilfeller av test 4, så som minst 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% og 99,9% sanne positive resultater.

36. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 26-35, karakterisert ved at bestemmelsen gir opphav til høyst 20% falske positive resultater i test 5, så som høyst 15%, 10%, 6%, 3%, 2%, 1%, 0,5%.

37. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 26-35, karakterisert ved at prøven er et bearbeidet produkt.

38. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet omfatter en immunologisk reaksjon.

39. Fremgangsmåte ifølge krav 38, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet omfatter en analyse valgt fra gruppen bestående av en immunanalyse, så som en Radio Immune Assay (RIA), en Enzym Immune Assay (EIA), en Enzyme Linked Immune Sorben Assay (ELISA), en Fluorescence Antibody technique (FA), og en immunanalyse omfattende anvendelse av liposomer, miceller eller liposom-lignende partikler i påvismngsfasen; en analyse som involverer immunimmobilisering; en analyse som involverer immunagglutinering så som lateksagglutinering; en DNA/DNA-hydbridiserings-assay; en RNA/RNA-hybridiserings-assay; og en DNA/RNA-hybridiserings-assay.

40. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-37, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet omfatter en polymerasekjedereaksjon (PCR).

41. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-37, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet omfatter anvendelse av peptidnukleinsyrer (PNA).

42. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-37, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet omfatter anvendelse av lektiner.

43. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 -37, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet omfatter anvendelse av bakteriofager, så som bakteriofagen Felix 01.

44. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-37, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet omfatter en metabolsk omdanning ved Salmonella av en substans som resulterer i en forandring i den elektriske motstand eller impedans av mediet inneholdende Salmonella og hvori påvisningen av Salmonella gjennomføres ved å måle denne forandring.

45. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 -37, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet omfatter en analyse for evnen til Salmonella til å migrere på eller gjennom en agarmatriks.

46. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-37, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet omfatter en analyse som involverer et filtreringstrinn, hvori bakterien adskilles fra mediet og holdes tilbake på et filter, så som en analyse som involverer en hydrofob nettmembran filtermetode (HGMF).

47. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-37, karakterisert ved at besternmelsestrinnet omfatter en analyse som involverer en radiometrisk fremgangsmåte.

48. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 -37, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet omfatter en analyse som involverer en kromatografisk separasjon.

49. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet involverer en selektiv etteranrikning.

50. Fremgangsmåte ifølge krav 49, karakterisert ved at den selektive etteranrikning har en varighet på 2-6 timer, så som en varighet på 2,0-4,5 timer, 2.5-3,5 timer, og fortrinnsvis ca. 3 timer.

51. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det vandige vekstmedium for Salmonella har en konsentrasjon av selenitt tilsvarende høyst selenitt-konsentrasjonen i en 0,5% vekt/volum natriumhydrogenselenitt-ljøsning, fortrinnsvis en selenitt-konsentrasjon på 0% vekt/volum.