FI102181B - Menetelmä ICAM-1 (solujen välisen kiinnikemolekyylin) saamiseksi oleel lisesti puhtaassa muodossa - Google Patents

Description

102181

Menetelmä ICAM-1 (solujen välisen kiinnikemolyylin) saamiseksi oleellisesti puhtaassa muodossa - Förfarande för att erhälla ICAM-1 (intermolekulära adhesionsmolekyler) i väsentligen ren form 5

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää ICAM-1:n (solujen välinen kiinnikemolekyyli-1) saamiseksi oleellisesti puhtaassa, funktionaalisesti aktiivisessa muodossa, ja joka 10 oleellisesti ei sisällä yleensä ihmisen ICAM-1:n liittyviä, luonnossa esiintyviä proteiineja.

Valkosolujen on käytettävä kiinnittymään solusubstraattei-hin puolustaakseen oikealla tavalla isäntää vieraita hyök-15 kääjiä kuten bakteereita tai viruksia vastaan. Erinomaisen katsauksen puolustusjärjestelmästä esittää Eisen, H.W. ("Microbiology", 3. painos, Harper & Row, Filadelfia, PA,1980, ss. 290 - 295 ja 381 - 418). Niiden on käytettävä kiinnittymään endoteelisoluihin kyetäkseen siirtymään ve-20 renkierrosta käynnissä olevan tulehduksen esiintymiskoh-tiin. Lisäksi niiden tulee kiinnittyä antigeenin käsittäviin soluihin, jotta normaali spesifinen immuunivaste voisi tapahtua, ja lopuksi niiden tulee kiinnittyä tarkoituksenmukaisiin kohdesoluihin, jotta viruksen tartuttamissa 25 soluissa tai kasvainsoluissa voisi tapahtua lyysi.

Vast'ikään tällaisten kiinnittymisien välitykseen osallistuvia valkosolupintamolekyylejä tunnistettiin käyttäen hybridoomateknologiaa. Suppeasti ottaen, tunnistettiin 30 ihmisen T-solujen vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita *' (Davignon, D., et ai. . Proc .Natl. Acad. Sei . USA 78 (1981) ; 4535 - 4539) sekä hiiren pernasoluja (Springer, T., et ‘ ai. . Eur. J. Immunol. 9 (1979) 301 - 306) , jotka sitoutuivat valkosolupintoihin ja inhiboivat edellä kuvattuja kiinni-35 tysliitteisiä funktioita (Springer, T., et ai.. Fed. Proc.

44 (1985) 2660 - 2663). Näiden vasta-aineiden tunnistamat molekyylit nimitettiin Mac-l:ksi ja imusolufunktioliittei-seksi antigeeniksi 1 (LFA-1). Mac-1 on heterodimeeri, jota 102181 2 esiintyy syöjäsolu-, jyvässolupinnoilla sekä suurien jy-väsimusolujen pinnoilla. LFA-1 on heterodimeeri, jota esiintyy useimmilla imusoluilla (Springer, T.A. et ai.. Immunol.Rev. 68 (1982) 111 - 135). Nämä kaksi molekyyliä, 5 sekä kolmas molekyyli, pl50,95 (jonka kudosjakauma on samankaltainen kuin Mac-l:n), osallistuvat solukiinnitty-miseen (Keizer, G., et ai.. Eur.J. Immunol. 15 (1985) 1142 - 1147).

10 Edellä kuvattujen valkosolumolekyylien todettiin kuuluvan sukulaisglykoproteiinien ryhmään (Sanchez-Madrid, F. et ai.. J.Exper.Med. 158 (1983) 1785 - 1803; Keizer, G. D. et ai.. Eur.J.Immunol. 15 (1985) 1142 - 1147) . Tämä glykoproteiiniryhmä koostuu heterodimeereistä, joissa on 15 yksi alfa-ketju ja yksi beeta-ketju. Vaikka näiden antigeenien alfa-ketjut poikkeavat toisistaan, beeta-ketju todettiin erittäin säilyväksi (Sanchez-Madrid, F., et ai.. J.Exper.Med. 158 (1983) 1785 - 1803). Glykoproteiiniryhmän (jota toisinaan kutsutaan "CD18:ksi") beeta-ketjun mole-20 kyylipainoksi todettiin 95 kd:tä, kun taas alfa-ketjujen todettiin vaihtelevan 150 kd:stä 180 kd:hen (Springer, T.,

Ted.Proc. 44 (1985) 2660 - 2663). Vaikka membraaniproteii-nien alfa-alayksiköt eivät jää beeta-yksiköiden keskinäistä laajaa homologiaa, analysoimalla tarkasti glykoproteii-25 nien alfa-alayksiköitä on ilmennyt, että niiden välillä on huomattavia yhtäläisyyksiä. Katsauksia LFA-1-sukuisten glykoproteiinien alfa- ja beeta-alayksiköiden samankaltaisuuksista esittävät Sanchez-Madrid, F., et ai.. (J.Exper.

Med. 158 (1983) 586 - 602; J.Exper.Med 158 (1983) 1785 -30 1803.

; On tunnistettu ryhmä yksilöitä, jotka eivät kykene ilmen tämään normaaleja määriä mitään tämän kiinnikeproteiini-ryhmän jäsentä valkosolujensa solupinnoilla (Anderson, 35 D.C. et ai., Fed.Proc. 44 (1985) 2671 - 2677: Anderson, D.C., et ai.. J.Infect.Dis. 152 (1985) 668 - 689). Näiden potilaiden imusolut osoittivat in vitro samankaltaisia puutteita, kuin normaalit kanssahenkilöt, joiden LFA-1- 102181 3 ryhmämolekyylejä vastustivat vasta-aineet. Edelleen nämä yksilöt eivät kyenneet tuottamaan normaalia immuunivastetta, koska heidän solunsa eivät kyenneet kiinnittymään so-lusubstraatteihin (Anderson, D.C. et ai.. Fed.Proc. 44 5 (1985) 2671 - 2677; Anderson, D.C. et ai.. J,Infect.Dis.

152 (1985) 668 - 689) . Nämä tiedot osoittavat, että immuunireaktiot heikentyvät, kun imusolut eivät kykene kiinnittymään normaalilla tavalla LFA-l-ryhmän funktionaalisten kiinnikemolekyylien puuttumisen johdosta.

10 Täten yhteenvetona, imusolujen kyky ylläpitää eläimen terveyttä ja elinkelpoisuutta edellyttää, että imusolut kykenevät kiinnittymään toisiin soluihin (kuten endoteeliso-luihin). Tämän kiinnittymisen on todettu edellyttävän 15 solu-solukontaktja, joihin liittyy spesifisiä reseptorimo-lekyylejä, joita esiintyy imusolujen solupinnoilla. Nämä reseptorit mahdollistavat imusolun kiinnittymisen muihin imusoluin tai endoteelisoluihin ja muihi ei-verisuoniso-luihin. Solupinnan reseptorimolekyylit on todettu toisiaan 20 hyvin likeisesti muistuttavaksi. Henkilöt, joiden imusoluilta puuttuvat nämä solupintareseptorimolekyylit, potevat kroonisia ja toistuvia tulehduksia, sekä muita kliinisiä oireita, mukaan lukien puutteelliset vasta-ainevas-teet.

25 ·· Koska imusolukiinnittyminen liittyy prosessiin, jolla vie- raskudos tunnistetaan ja hylätään, tämän prosessin ymmärtämisellä on huomattava merkitys elinsiirtojen, kudossiirtojen, yliherkkyyden ja kasvainopin aloilla.

30

Keksintö käsittää siis menetelmän ICAM-l:n saamiseksi oleellisesti puhtaassa muodossa, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää seuraavat vaiheet: (1) ICAM-1 liuotetaan ICAM-l:n ilmentävien solujen mem-35 braaneista liukoisen ICAM-1-valmisteen muodostamiseksi; (b) tämä liukoinen ICAM-1-valmiste viedään affiniteetti-matriisiin, joka sanottu matriisi sisältää ICAM-1:een sitoutumaan kykenevän immobilisoidun vasta-aineen; 102181 4 (c) sanotun ICAM-l:n annetaan sitoutua vasta-aineeseen sanotussa affiniteettimatriisissa ; (d) matriisista poistetaan kaikki yhdisteet, jotka eivät kykene sitoutumaan vasta-aineeseen käyttämällä eluointi- 5 puskuria, jonka pH on korkeintaan 11; ja (e) ICAM-1 otetaan talteen oleellisesti puhtaassa, funk-tionaalisesti aktiivisessa muodossa, eluoimalla ICAM-l matriisista pH-arvossa 12,5 tai oleellisesti 12,5, jota seuraa eluaatin välitön neutralointi.

10

Kuviossa 1 esitetään diagrammin muodossa normaalin solun ja solun, jolta LFA-1 puuttuu, välinen kiinnittyminen.

15 Kuviossa 2 esitetään diagrammina normaali/normaalisolu- kiinnitysprosessi.

Kuviossa 3 esitetään soluaggregaation kinetiikkaa 50 ng:n/ml PMA:ta puuttuessa (X) tai läsnäol-20 lessa (O).

Kuviossa 4 esitetään LFA-1'- ja LFA-l+-solujen koaggre- gaatio. EBV:llä transformoituja soluja (104) , jotka oli leimattu karboksifluoreseiinidiase- 25 taatilla, kuvion mukaisesti, sekoitettiin 105 kpl:seen ei-leimattuja autologisia soluja (umpinaiset pylväät) ja JY-soluja (avoimen pylväät) PMA:n läsnäollessa. 1,5 tunnin kuluttua leimatut solut, aggregaateissa tai vapaina, 30 * 102181 5 laskettiin käyttäen esimerkin 2 kvalitatiivista määritystä. Leimattujen solujen prosentuaalinen osuus aggregaateissa on merkitty. Esitetään yksi edustava koe kahdesta suoritetusta.

Kuviossa 5 esitetään ICAM-l:n ja LFA-l:n immuunisaostus JY-soluista. JY-solujen Triton X-100 -lysaatteja (vyöhykkeet 1 ja 2) tai verrokkilyysipuskuria (vyöhykkeet 3 ja 4) immuunisaostettiin vasta-aineella, joka kykenee sitoutumaan ICAM-l:een (vyöhykkeet 1 ja 3), tai vasta-aineilla, jotka kykenevät sitoutumaan LFA-l:een (vyöhykkeet 2 ja 4). Paneelissa A on esitetty tulokset pelkistävissä olosuhteissa; paneelissa B on esitetty tulokset, jotka saatiin ei-pelkistävissä olosuhteissa. Molekyylipainostandardit ajettiin vyöhykkeessä S.

Kuviossa 6 esitetään IL-1- ja gamma-interferonivaikutuksien ICÄM-1-ilmennykseen ihmisen ihon sidekudosmuodos-tusoluilla kinetiikka. Ihmisen ihon sidekudosmuo-dostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x 104 solua/ 0,32 cm2/kuoppa. IL-l:tä (10 U/ml, umpinaiset ympyrät) tai yhdistelmä-gamma-interferonia (10 U/ml, avoimet neliöt) lisättiin, minkä jälkeen merkittynä ajankohtana määritysseos jäähdytettiin 4 ®C:seen ja suoritettiin epäsuoran sitoutumisen määritys. Standardipoikkeama ei ylittänyt 10 %:ia.

Kuviossa 7 esitetään IL-1- ja gamma-interferonivaikutuksien ICAM-l:een pitoisuusriippuvuus. Ihmisen ihon « sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x 104 solua/0,32 cm2/kuoppa. IL-2:ta (avoimet ympyrät), yhdistelmä-humaani-IL-1:tä (avoimet neliöt), yhdistelmä-hiiri-IL-1:tä (umpinaiset neliöt), yhdistelmä-humaani-gamma-interferonia 102181 6 (umpinaiset ympyrät) ja yhdistelmä-beetainterferonia (avoimet kolmiot) lisättiin merkittynä laimennoksena ja seoksia inkuboitiin 4 tunnin ajan (IL-1) tai 16 tunnin ajan (beeta- ja gamma-interferoni). Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja nelinkertaisista määrityksistä; standardipoikkeama ei ylittänyt 10 %:ia.

Kuviossa 8 esitetään ICAM-l-cDNA:n nukleotidi- ja aminohappo-sekvenssi. Ensimmäinen ÄTG on asemassa 58. Trans-latoidut sekvenssit, jotka vastaavat ICAM-1-trypsiinipeptidejä, on alleviivattu. Hydrofobinen oletettu signaalipeptidi ja vastaavasti transmemb-raanisekvenssit on alleviivattu voimakkaasti. N-kytkentäglykosylaatiokohdat on merkitty laatikkoon. Polyadenylaatiosignaali AATAAA asemassa 2976 on merkitty yläpuolisella viivalla. HL-60-cDNA-kloonin sekvenssi on esitetty. Endoteelisolu-cDNA sekventoi-tiin lähes koko pituudeltaan ja siinä esiintyi vain vähäisiä poikkeamia.

Kuviossa 9 esitetään ICAM-l-homologia-alueet ja suhde immuno-globuliinisupergeeniryhmään. (A) 5 homologisen alueen rinnakkainasetus (Dl-5). Kaksi rinnakkain asettunutta jäännöstä tai useampi rinnakkain asettunut jäännös on merkitty laatikolla. Jäännökset, jotka olivat säilyneet kaksi kertaa tai useamman kerran NCAM-alueilla, sekä jäännökset, jotka olivat säilyneet C2- ja Cl-sarja-alueilla, asetettiin ICAM-l:n sisäisten toistojen rinnalle. Ennakoitujen beeta-säikeiden sijainti ICAM-1-alueella on merkitty tankoviivoin ja pienillä kirjaimilla rinnakkainasetuksen päällä, ja beeta-säikeiden tunnettu sijainti immunoglobuliini-C-alueilla on merkitty tankoviivoilla ja rinnak- 102181 7 kainasetuksen alapuolisin suurin kirjaimin. Oletetun disulfidisillan asema ICÄM-l-alueella on merkitty S- S. (B-D) Proteiinialueiden, jotka ovat ICAM-1-alueisiin nähden homologisia, rinnakkainasettelu; proteiinit asetettiin alustavasti rinnakkain suorittamalla haku NBRF-tietokannoissa FASTP-ohjelmaa käyttäen. Proteiinisekvenssit ovat MAG, NCAM, T-solureseptori-alfa-alayksikkö-V-alue, IgM-myy-ketju ja ai fa-l-B-glykoproteiini.

Kuviossa 10 on esitetty diagrammina ICAM-l:n ja MAG:n sekundaarirakenteiden vertailu.

Kuviossa 11 esitetään LFA-l-positiivisia EBV-transformoituja B-varhaisimusolusoluja, jotka sitoutuvat ICAM-l:een tasomembraaneissa.

Kuviossa 12 esitetään LFA-l-positiivisia T-varhaisimusoluja ja T-lymfomasoluja sitoutumassa ICAM-l:een muoviin sidotuissa rakkuloissa.

Kuviossa 13 esitetään JY-B-varhaisimusolun sitoutumisen ICAM-l:een estyminen muoviin sidotuissa rakkuloissa esikäsiteltäessä solut tai rakkulat monoklonaali-silla vasta-aineilla.

Kuviossa 14 esitetään lämpötilan vaikutus T-varhaisimusolujen sitoutumiseen ICAM-l:een muoviin sidotuissa rakkuloissa.

; Kuviossa 15 esitetään kaksivalenssisten kationien tarve T- varhaisimusolujen sitoutumiselle ICAM-l:een muoviin sidotuissa rakkuloisssa.

102181 8

Kuviossa 16 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena T-soluliitteisen antigeenin OKT3 tunnistukseen. "OKT3” merkitsee antigeenin lisäystä.

Kuviossa 17 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena ei-spesifisen T-solumitogeenin, konkavalliini-A:n, tunnistukseen. "CONA" merkitsee konkanaval1iini-A:n lisäystä.

Kuviossa 18 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena avaimenreikä-maljakotilohemo-syaniiniantigeenin tunnistukseen. Avaimenreikä-mal jakotilohemosyaniinin lisäys soluihin on merkitty "KLH".

Kuviossa 19 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena jäykkäkouristustoksoidianti-geenin tunnistukseen. Jäykkäkouristustoksoidi-antigeenin lisäys soluihin on merkitty "AGN".

Kuviossa 20 on esitetty monoklonaalisten vasta-aineiden RR1/1, R6.5, LB2 ja CL203 sitoutuminen ICAM-l-deleetio-mutantteihin.

Kuviossa 21 esitetään ICAM-l-deleetiomutanttien sitoutuminen LFA-l:een.

Kuviossa 22 esitetään ICAM-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden RR1/1, R6.5, LB2 ja CL203 tunnistamat epitoopit.

102181 9

Kuviossa 23 esitetään ICAM-l-alue-2-mutanttien sitoutumis-kapasiteetti LFA-l:een.

Kuviossa 24 esitetään ICAM-l-alue-3-mutanttien sitoutumis-kapasiteetti LFA-l:een.

Kuviossa 25 esitetään ICAM-l-alue-l-mutanttien sitoutumis-kapasiteetti LFA-l:een.

Kuviossa 26 esitetään ICAM-aminopää-alueiden rinnakkainasetus.

Tämän keksinnön yksi näkökohta koskee LFA-l:n luontaisen sitoutumisligandin löytymistä. Molekyylejä, kuten LFA-l-ryhmän molekyylejä, jotka osallistuvat solukiinnitysprosessiin, kutsutaan "kiinnikemolekyyleiksi".

Tämän keksinnön mukaista luontaista sitoutumisligandia kutsutaan nimellä "solujen välinen kiinnikemolekyyli-1" tai "ICAM-l". ICAM-1 on 76 - 97 kd:n glykoproteiini. ICAM-1- ei ole heterodimeeri. Esillä oleva keksintö koskee ICAM-1:tä ja sen "funktionaalisia johdannaisia". ICAM-l:n "funktionaalinen johdannainen" on yhdiste, jolla on biologista aktiivisuutta (joko funktionaalista tai rakenteellista), joka on oleellisesti samanlaista kuin ICAM-l:n biologinen aktiivisuus. Ilmaisun "funktionaaliset johdannaiset" piiriin tarkoitetaan kuuluviksi molekyylin "fragmentit", "variantit", "analogit" tai "kemialliset johdannaiset". Molekyylin, kuten ICAM-l:n, "framentilla" tarkoitetaan molekyylien mitä tahansa polypeptidialaryhmää. Erityisen edullisia ovat ICAM-l:n fragmentit, joilla on ICAM-1-aktiivisuutta ja jotka ovat liukoisia (eli eivät ole sidottuja membraaniin). Molekyylin, kuten ICAM-l:n, "variantilla" tarkoitetaan molekyyliä, joka on rakenteeltaan ja funktioltaan oleellisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen fragmentti. Molekyylin sanotaan olevan "oleellisesti saman 102181 10 lainen” kuin jokin toinen molekyyli, jos kyseisten kahden molekyylin rakenteet ovat oleellisesti samanlaiset tai jos kummallakin molekyylillä on samanlainen biologinen aktiivisuus. Täten edellyttäen, että kahdella molekyylillä on samanlainen aktiivisuus, niitä pidetään toistensa variantteina ilmaisun tässä käytetyssä merkityksessä silloinkin, jos yhden molekyyleistä rakennetta ei esiinny toisessa, tai jos aminohappojäännössekvenssit eivät ole identtiset. Molekyylin kuten ICAM-l:n "analogilla" tarkoitetaan molekyyliä, joka on funktioltaan oleellisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen fragmentti. Tässä käytettynä molekyyliä kutsutaan toisen molekyylin "kemialliseksi johdannaiseksi", jos se sisältää ylimääräisiä kemiallisia ryhmiä, jotka eivät normaalisti kuulu molekyyliin. Tällaiset ryhmät voivat parantaa molekyylin liukoisuutta, imeytymistä, biologista puoliintumis-ikää jne. Ryhmät voivat vaihtoehtoisesti alentaa molekyylin myrkyllisyyttä, poistaa tai heikentää molekyylin mahdollista epätoivottavaa sivuvaikutusta jne. Tällaisia vaikutuksia tuottamaan kykeneviä ryhmä julkistetaan käsikirjassa Remingtons Pharmaceutical Sciences. 1980. "Toksiinijohdan-nais"-molekyylit muodostavat "kemiallisten johdannaisten" erityisluokan. "Toksiinijohdannais”-molekyyli on molekyyli (kuten ICAM-1 tai vasta-aine), joka sisältää toksiiniryhmän. Tällaisen molekyylin sitoutuminen soluun tuo toksiiniryhmän lähelle solua ja edistää siten solun kuolemista. Voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa toksiiniryhmää; kuitenkin edullisesti käytetään sellaisia toksiineja kuten esimerkiksi risiinitoksiini, difteriatoksiini, radioisotooppitoksiinit, membraaniväylän muodostavat toksiinit jne. Menettelyitä tällaisten ryhmien kytkemiseksi molekyyliin tunnetaan alalla hyvin.

Antigeenimolekyylit kuten ICAM-1 tai LFA-l-ryhmämolekyylit ilmentyvät luontaisesti imusolujen pinnalla. Täten jos tällaisia soluja viedään sopivaan eläimeen, esimerkiksi 102181 11 vatsaonteloon ruiskuttamalla jne., seurauksena on vasta-aineiden muodostuminen, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een tai LFA-l-ryhmämolekyyleihin. Haluttaessa tällaisesta eläimestä voidaan ottaa seerumia ja käyttää sitä lähteenä polyklonaalis-ten vasta-aineiden saamiseksi, jotka kykenevät sitoutumaan näihin molekyyleihin. Edullisesti kuitenkin tällaisista eläimistä otetaan pernasoluja, jotka fuusioidaan myeloomaso-lulinjaan, minkä jälkeen näiden fuusiosolujen annetaan muodostaa hybridoomasolu, joka erittää monoklonaalisiä vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een tai johonkin LFÄ-1-ryhmämolekyyliin.

Edellä kuvatun mukaisesti saadut hybridoomasolut voidaan seuloa erilaisilla menetelmillä haluttujen hybridoomasolujen tunnistamiseksi, jotka erittävät vasta-ainetta, joka kykenee sitoutumaan joko ICAM-l:een tai johonkin LFA-l-ryhmämolekyy-liin. Edullisessa seulontamäärityksessä tällaiset molekyylit tunnistetaan niiden kyvystä inhiboida Epstein-Barrin viruksella transformoitujen solujen aggregaatiota. Vasta-aineet, jotka kykenevät inhiboimaan tällaista aggregaatiota, seulotaan sitten edelleen sen määrittämiseksi, inhiboivatko ne mainittua aggregaatiota sitoutumalla ICAM-l:een vai LFÄ-l-ryhmämolekyyliin. Tällaisessa seulonnassa voidaan käyttää mitä tahansa keinoa ICAM-l:n erottamiseksi LFA-l-ryhmämolekyyleistä. Täten esimerkiksi vasta-aineen sitomaa antigeeniä voidaan analysoida esimerkiksi immuunisaostamalla ja polyakryyliamidigeelielektrofo-reettisesti. Jos sidottu antigeeni kuuluu LFA-l-ryhmämolekyyleihin, immuunisaostettu antigeeni todetaan dimeeriksi, kun taas jos sitoutunut antigeeni on ICAM-1, vain yksi molekyyli-painolaji on immuunisaostunut. Vaihtoehtoisesti on mahdollista erottaa ne vasta-aineet, jotka sitoutuvat LFA-l-ryhmämolekyyleihin, niistä, jotka sitoutuvat ICAM-l:een, seulomalla vasta-aineen kyvyn suhteen sitoutua sellaisiin soluihin, kuten jyväs-solut, jotka ilmentävät LFÄ-l:n, mutta eivät ICAM-l:tä. Vasta-aineen (jonka tiedetään inhiboivan solu-aggregaatiota) kyky 102181 12 sitoutua jyvässoluihin merkitsee, että vasta-aine kykenee sitoutumaan LFA-l:een. Tällaisen sitoutumisen puuttuminen merkitsee vasta-ainetta, joka tunnistaa ICAM-l:n. Vasta-aineen kyky sitoutua soluun kuten jyvässoluun voidaan todeta alan keskimääräistenkin taitajien tavanomaisesti käyttämin keinoin. Tällaisia keinoja ovat immuunimääritykset, solu-agglutinaatio, suodatinsitoutumistutkimukset, vasta-ainesaostus jne.

Tämän keksinnön mukaiset aggregaatio-vastaiset vasta-aineet voidaan vaihtoehtoisesti tunnistaa mittaamalla niiden kyky sitoutua differentiaalisesti soluihin, jotka ilmentävät ICÄM-l:n (kuten aktivoituihin endoteelisoluihin), ja niiden kyvyttömyys sitoutua soluihin, jotka eivät ilmennä ICAM-l:tä. Alan keskimääräisetkin taitajat havainnevat vaikeuksitta, että edeltäviä määrityksiä voidaan modifoida, tai ne voidaan suorittaa erilaisessa keskinäisessä järjestyksessä, jolloin saadaan lukuisia erilaisia mahdollisia seulontamäärityksiä, joista kullakin kyetään tunnistamaan tai erottamaan toisistaan ICAM-l:een LFA-l-ryhmämolekyy1 in asemesta sitoutumaan kykeneviä vasta-aineita.

Esillä olevan keksinnön mukaiset tulehdusvastaiset aineet voidaan saada luontaisilla prosesseilla (kuten esimerkiksi indusoimalla eläin, kasvi, sieni, bakteeri jne., tuottamaan ICAM-l:n ei-immunoglobuliini-antagonistia, tai indusoimalla eläin tuottamaan polyklonaalisia vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutumaan ICÄM-l:een); synteettisillä menetelmillä (kuten esimerkiksi käyttäen Merrifield-menetelmää polypeptidien syntetisoimiseksi ICAM-l:n, ICAM-l:n funktionaalisten , johdannaisten tai ICAM-l:n proteiini-antagonistien (joko immunoglobuliini- tai ei-immunoglobuliini-) edelleen syntetisoimiseksi; hybridoomateknologisesti (kuten esimerkiksi ICAM-l:een sitoutumaan kykenevien monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi); tai yhdistelmä-DNA-teknisesti (kuten esimerkiksi esillä olevan keksinnön mukaisten tulehdusvastais- 102181 13 ten aineiden tuottamiseksi erilaisissa isännissä (eli hiivassa, bakteereissa, sienissä, nisäkässoluviljelmissä jne.) tai yhdistelmäplasmidi- tai virusvektoreista. Käytettävän menetelmän valinta riippuu sellaisista tekijöistä kuten kätevyys, haluttu saanto, jne. Välttämättä ei tarvitse käyttää vain yhtä edellä kuvattua menetelmää, prosessia tai tekniikkaa nimenomaisen tulehdusvastaisen aineen tuottamiseksi; edellä kuvattuja prosesseja, menetelmiä ja tekniikoita voidaan yhdistää jonkin nimenomaisen tulehdusvastaisen aineen saamiseksi.

A. LFA-1:n sitoutumisoarin (ICAM-1) tunnistus 1. LFA-l-riippuvaisen aggregaation määrityksiä

Monet Epstein-Barr-viruksella transformoidut solut osoittavat aggregaatiota. Tätä aggregaatiota voidaan tehostaa forbolies-terien läsnäololla. Tällaisen homotyyppisen aggregaation (eli aggregaation, johon liittyy vain yksi solutyyppi) todettiin salpautuvan LFA-l-vastaisi1 la vasta-ainella (Rothlein, R., et ai., J.Exper.Med. 163 (1986) 1132 - 1149), joka viite sisällytetään tähän viitteeksi. Täten LFA-l-riippuvaisen sitoutumisen laajuus voidaan määrittää määrittämällä spontaanin tai forboli-esteririippuvaisen aggregaattimuodostuksen laajuus.

LFA-l-riippuvaista aggregaatiota häiritsevä aine voidaan tunnistaa käyttämällä määritystä, jolla kyetään määrittämään, häiritseekö aine Epstein-Barr-viruksella transformoitujen solujen spontaania vai forboliesteririippuvaista aggregaatiota. Tällaisessa määrityksessä voidaan käyttää useimpia Epstein-Barr-virus-transformoituja soluja, kunhan solut kykenevät ilmentämään LFA-l-reseptorimolekyylin. Tällaisia soluja voidaan valmistaa Springerin, T.A., et ai.. J.Exper.Med. 160 (1984) 1901 - 1918, joka viite sisällytetään tähän viitteeksi, tekniikalla. Vaikka mitä tahansa tällaista solua voidaan 14 •C2'81 käyttää esillä olevan keksinnön mukaisessa LFA-l-riippuvaisen sitoutumisen määrityksessä, edullisesti käytetään JY-solulinjasoluja (Terhost, C.T., et ai .. Proc.Nat 1.Acad.Sei. USA 73 (1976) 910). Soluja voidaan inkuboida missä tahansa sopivassa kasvualustassa; kuitenkin edullisimmin soluja viljellään RPMI 1640 -kasvualustassa, jota on täydennetty 10 %:lla vasi-kansikiöseerumia ja 50 mikrogrammal1a/ml gentamysiiniä (Gibco Laboratories, NY). Soluja tulisi viljellä olosuhteissa, jotka sopivat nisäkässolulisäännytykseen (eli yleensä 37 °C:n lämpötilassa, ilmakehässä, jossa on 5 % C02:ta, 95 %:n suhteellisessa ilman kosteudessa jne.).

2. LFÄ-1 sitoutuu ICAM-l:een

On tunnistettu henkilöitä, joiden imusoluista puuttuu LFA-1-reseptorimolekyyliryhmä (Anderson, D.C., et ai.. Fed.Proc. 44 (1985) 2671 - 2677; Anderson, D.C., et ai ., J.Infect.Dis. 152 (1985) 668 - 689). Tällaisten yksilöiden sanotaan kärsivän valkosolukiinnitysvajauksesta (LAD). Tällaisten yksilöiden EBV-transformoidut solut eivät kykene aggregoitumaan, eivät spontaanisti eivätkä forboliesterien läsnäollessa edellä kuvatussa aggregaatiomäärityksessä. Kun tällaisia soluja sekoitetaan LFA-l:n ilmentäviin soluihin, todettiin aggregaatio (Rothlein, R., et ai.. J.Exper.Med. 163 (1986) 1132 - 1149) (kuvio 1). Merkittävää on, että näitä aggregaatteja ei muodostunut, jos näitä soluja inkuboitiin LFA-l-vastaisten vasta-aineiden läsnäollessa. Täten vaikka aggregaatio edellytti LFÄ-1:tä, LFA-l-vajäiden solujen kyky muodostaa aggregaatteja LFA-l-pitoisten solujen kanssa osoitti, että LFA-l:n sitoutu-mispari ei ole LFA-1, vaan paremminkin aiemmin tuntemattomaksi jäänyt solukiinnikemolekyyli. Kuviossa 1 esitetään solukiinnit-tymisen mekanismi.

102181 15 B. Solujen välinen kiinnikemolekyyli-1 (ICAM-1)

Uusi solujen välinen kiinnikemolekyyli ICAM-1 tunnistettiin ja osittain karakterisoitiin ensin Rothleinin, R., et ai., 3.Immunol. 137 (1986) 1270 - 1274, joka viite sisällytetään tähän viitteeksi, menettelyn mukaan. ICAM-l-molekyylin toteamiseksi valmistettiin monoklonaalisia vasta-aineita hiirien pernasoluista, kun hiiriä oli immunoitu soluilla, jotka olivat peräisin yksilöistä, joiden LFA-1-ilmennys oli geneettisesti puutteellinen. Saadut vasta-aineet seulottiin niiden kyvyn suhteen inhiboida LFA-1:n ilmentävien solujen aggregaatiota (kuvio 2). Yksityiskohtaisesti ottaen, ICAM-l-molekyylin toteamiseksi hiiriä immunoitiin EBV-transformoiduilla B-soluilla, jotka oli saatu LAD-potilaista, jotka eivät ilmennä LFA-l-antigeenia. Näistä eläimistä poistettiin sitten pernasolut, jotka fuusioitiin myeloomasoluihin ja annettiin monoklonaalisia vasta-aineita tuottavien hybridoomasolujen muodostua. EBV-transformoituja B-soluja, jotka olivat peräisin normaaleista yksilöistä, jotka ilmentävät LFA-l:n, inkuboitiin sitten hybridoomasolun tuottaman monoklonaalisen vasta-aineen läsnäollessa mahdollisen monoklonaalisen vasta-aineen tunnistamiseksi, joka kykenisi inhiboimaan EBV-transformoitujen B-solujen forboliesterivälitteisen, LFA-l-riippuvaisen spontaanin aggregaation. Koska hybridoomasolut saatiin soluista, jotka eivät olleet koskaan "tutustuneet" LFA-l-antigeeniin, LFÄ-l:n vastaista monoklonaalista vasta-ainetta ei muodostunut. Täten mikä tahansa vasta-aine, jonka todetaan inhiboivan aggregaatiota, kykenee välttämättä sitoutumaan antigeeniin, joka vaikkakaan ei ole LFA-1 osallistuu LFA-l-kiinnitysprosessiin. Vaikka voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää tällaisten monoklonaalisten vasta-aineiden saamiseksi, edullisesti ICAM-l:een sitoutuvia monoklonaalisia vasta-aineita hankitaan immunoimalla BALB/c-hiiriä käyttäen teitä ja aikatauluja, joita kuvaavat Rothlein, R., et ai. (J.Immunol. 137 (1986) 1270 -1274), Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ääreisveren Ιό 1C2181 yksitumasolujen kanssa, jotka ovat peräisin yksilöistä, joilta puuttuu LFA-1. Tällaisia soluja julkistavat Springer, T.A., et ai. (J.Exper.Med. 160 (1984) 1901 - 1918).

Edullisessa menetelmässä vasta-aineiden muodostamiseksi ja toteamiseksi, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een, hiiriä immunoidaan joko EBV-transformoidui11 a B-soluilla, jotka ilmentävät sekä ICAM-l:n että LFA-1:n, tai edullisemmin TNF-aktivoidui1 la endoteelisoluilla, jotka ilmentävät ICAM-l:n mutta eivät LFA-l:tä. Edullisimmassa menetelmässä hybridooma-solujen muodostamiseksi, jotka tuottavat ICAM-l-vastaisia vasta-aineita, BALB/c-hiiri immunoitiin toisiaan seuraten JY-soluilla sekä differentioiduilla U937-soluilla (ATCC CRL-1593). Tällaisista eläimistä poistetaan pernasolut, jotka fuusioidaan myeloomasoluihin, ja annetaan vasta-ainetta tuottavien hybri-doomasolujen muodostua. Vasta-aineet seulotaan niiden kyvyn suhteen inhiboida EBV-transformoidun solulinjan LFA-1-riippuvaista, forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, kuten JY-solujen, jotka ilmentävät sekä LFA-l-reseptorin että ICAM-l:n. Kuten esittäneet Rothlein, R., et ai .. (J. Immunol. 137 (1987) 1270 - 1274), tällaista aggregaatiota inhiboimaan kykeneviä vasta-aineita testataan sitten niiden kyvyn suhteen inhiboida jonkin solulinjan forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, kuten SKW3:n (Dustin, M., et ai.. J.Exper.Med. 165 (1987) 672 - 692), jonka kykyä spontaanisti aggregoitua forboliesterin läsnäollessa inhiboi vasta-aine, joka kykenee sitoutumaan LFA-l:een, mutta eivät inhiboi ICAM-l-vastaiset vasta-aineet. Vasta-aineet, jotka kykenevät inhiboimaan solujen kuten JY-solujen forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, mutta eivät kykene inhiboimaan solujen kuten SKW3-solujen forboliesteri-indusoitua : aggregaatiota, ovat todennäköisesti ICAM-l-vastaisia vasta- aineita. Vaihtoehtoisesti vasta-aineet, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een, voidaan tunnistaa seulomalla vasta-aineiden suhteen, jotka kykenevät inhiboimaan LFA-1-riippuvaisen aggregaation LFÄ:n ilmentävissä soluissa (kuten 102181 17 JY-soluissa), mutta eivät kykene sitoutumaan soluihin, jotka ilmentävät LFA-l:n mutta vain vähän tai ei lainkaan ICAM-1:tä (kuten normaalit jyvässolut) tai kykenevät sitoutumaan soluihin, jotka ilmentävät ICAM-l:n mutta eivät LFA-l:tä (kuten TNF-aktivoidut endoteelisolut). Toinen vaihtoehto on immuuni-saostus soluista, jotka ilmentävät ICAM-l:n, LFA-l:n tai molemmat käyttäen vasta-aineita, jotka inhiboivat solujen, kuten JY-solujen, LFA-l-riippuvaista aggregaatiota, jolloin SDS-PAGE:lla tai vastaavalla menetelmällä määritetään vasta-aineen saostaman molekyylin joitakin molekyyliominaisuuksia.

Jos ominaisuus on sama kuin ICAM-l:n vastaava, vasta-aine voidaan olettaa ICÄM-l-vastaiseksi vasta-aineeksi.

Käyttäen edellä kuvatulla tavalla valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita ICAM-l-solupintamolekyyli puhdistettiin ja karakterisoitiin. ICAM-1 puhdistettiin ihmissoluista ja -kudoksesta käyttäen monoklonaalivasta-aine-affiniteetti-kromatografiaa. Tällaisessa menetelmässä ICAM-1:n kanssa reagoiva monoklonaalinen vasta-aine kytketään inerttiin koionnimatriisiin. Tällaisen kytkennän saamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää; kuitenkin edullisesti käytetään Oettgenin, H.C., et ai., J.Biol.Chem. 259 (1984) 12034, menetelmää. Kun solulysaatti käytetään matriisin läpi, läsnä olevat ICAM-l-molekyylit adsorboituvat ja jäävät matriisiin. Muuttamalla kolonnin pH:ta tai ionipitoisuutta sitoutuneet ICAM-1-molekyylit voidaan eluoida kolonnista.

Vaikka mitä tahansa sopivaa matriisia voidaan käyttää, edullisesti matriisimateriaalina käytetään Sepharose-geeliä (Pharmacia). Kolonnimatriisien muodostaminen ja niiden käyttö proteiinin puhdistamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja.

Alan keskimääräistenkin taitajien hallitsemalla tavalla edellä kuvattuja määrityksiä voidaan käyttää yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka kykenevät heikentämään tai inhiboimaan solukiin-nittymisen nopeutta tai laajuutta.

18 1C2161 ICAM-1 on solupintaglykoproteiini , joka ilmentyy ei-verta-muodostavilla soluilla, kuten verisuonten endoteelisolut, kateenkorva-epiteelisolut, tietyt muut epiteelisolut ja sidekudosmuodostussolut, ja vertamuodostavilla soluilla kuten | kudossyöjäsolut, mitogeenistimuloidut T-imusolu-emosolut, ja [ imusolmukkeen itukeskus-B-solut ja hermosolun tuojahaarakeso- · luilla risoissa, imusolmukkeissa ja Peyerin imusolmukkeissa. ’ ICAM-1 ilmentyy voimakkaasti verisuonen endoteelisoluilla T-solu-alueilla imusolmukkeissa ja risoissa, jotka osoittavat reaktiivista liikakasvua. ICAM-1 ilmentyy alhaisina määrinä ääreisveren imusoluissa. Joidenkin myelomonosyyttisolulinjojen forboliesteri-stimuloitu differentiaatio lisää voimakkaasti ICAM-l-ilmennystä. Täten ICÄM-1 ilmentyy ensisijaisesti tulehduskohdissa, eikä ilmenny yleensä "hiljaisissa" soluissa.

ICAM-1-ilmennys ihon sidekudosmuodostussoluilla kasvaa kolminkertaisesta viisinkertaiseksi sekä interleukiini-I:n että gamma-interferonin vaikutuksesta tasoilla 10 U/ml neljän ja vastaavasti 10 tunnin aikana. Induktio riippuu proteiini- ja mRNA-synteesistä ja on takautuva.

ICAM-1 osoittaa molekyylipainoheterogeniaa eri solutyypeissä, jolloin molekyylipaino on 97 kd:tä sidekudosmuodostussoluilla, j 114 kd:tä myelomonosyyttisolulinjalla U937, ja 90 kd:tä B-varhaisimusolulla JY. ICAM-1:n biosynteesiin on todettu liittyvän noin 73 kd:n solunsisäisen prekursorin. Tunikamysii-nillä (joka inhiboi glykosylaatiota) käsittelemällä saatavan ei-N-glykosyloidun muodon molekyylipaino on 55 kd:tä.

Forboliesterillä stimuloiduista U937-soluista tai sidekudos-muodostussoluista eristetyn ICAM-1:n pääasiallinen tuote on sama ja sen molekyylipaino on 60 kd:tä kemiallisen deglykosy-laation jälkeen. ICAM-l-monoklonaalivasta-aineet häiritsevät fytohemagglutiniini-emosolujen kiinnittymistä solulinjoihin, joilta puuttuu LFA-1. Esikäsittelemällä sidekudosmuodostusso-luja, mutta ei imusoluja, monoklonaalisilla vasta-aineilla, k r f 102181 19 jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een, estetään imusolu-sidekudosmuodostussolukiinnittyminen. Esikäsittelemällä ' t imusoluja/ mutta ei sidekudosmuodostussoluja, LPA-l-vastaisilla j vasta-aineilla on todettu niinikään saatavan imusolu-sidekudos- ' muodostussolukiinnittymisen inhibitio. | ! ICAM-l on täten CD18-kompleksin sitoutumisligandi valkosoluilla. Se on indusoitavissa sidekudosmuodostussoluilla ja endotee-lisoluilla in vitro tulehdusvälittäjillä kuten IL-l:llä/ gatnma-interferonilla ja kasvainnekroositekijäi 1ä aikavälillä, joka sopii imusolujen suodattumiseen tulehdusvauriokohtiin in vivo (Dustin, M.L., et ai.. J. Immunol. 137 (1986) 245 - 254; Prober, J.S., et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 1893 - 1896). Edelleen ICAM-l ilmentyy ei-vertamuodostavilla soluilla, kuten verisuonten endoteelisoluilla, kateenkorvan epiteelisoluilla, muilla epiteelisoluilla ja sidekudosmuodostussoluilla ja vertamuodostavilla soluilla kuten kudossyöjäsoluilla, mitogeenistimuloiduilla T-imusolu-emosoluilla ja imusolmukkeen itukeskus-B-soluilla ja hermosolun tuojahaarakesoluilla risoissa, imusolmukkeissa ja Peyerin imusolmukkeissa (Dustin, M.L., et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254). ICAM-l ilmentyy keratinosyyteillä hyvänlaatuisissa tulehdusvaurioissa kuten j yliherkkyysihottuma, ihon jäkälätauti, tulehdustautiin liittyvä ! ihottuma, nokkosrokko ja rakkulasairaus. Allergisissa ihoreaktioissa, jotka oli aiheutettu sivelemällä potilaan iholle hapteenia, jolle tämä on yliherkkä, ilmeni myös voimakas ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä. Toisaalta myrkylliset iholaastarit iholla eivät aikaansaaneet ICAM-l-ilmennystä keratinosyyteillä. ICAM-l:tä esiintyy keratinosyyteillä, jotka on saatu kudosnäytteistä, jotka ovat peräisin erilaisiin ihohäiriötiloihin liittyvistä ihovaurioista, ja ICAM-ilmennys ; indusoituu yliherkkyyslaastarikoevaurioissa, kun taas keratinosyytit myrkkylaastarikoevaurioissa eivät ilmentäneet ICAM-l:tä.

20 1C2181 ICAM-1 on täten solusubstraatti, johon imusolut voivat kiinnittyä, jolloin imusolut voivat migroitua tulehduskohtiin ja/tai suorittaa erilaisia efektorifunktioita, jotka myötävaikuttavat tähän tulehdukseen. Tällaisia funktioita ovat vasta-ainetuotanto, viruksen tartuttamien kohdesolujen lyysi jne. Tässä käytettynä ilmaisulla "tulehdus” tarkoitetaan sekä spesifisen että ei-spesifisen puolustusjärjestelmän reaktioita. Tässä käytettynä ilmaisulla "spesifinen puolustusjärjestelmä" tarkoitetaan immuunijärjestelmän osaa, joka reagoi spesifisten antigeenien läsnäoloon. Tulehduksen sanotaan olevan seurausta spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, jos tulehduksen aiheuttaa, tai sitä välittää, tai siihen liittyy spesifisen puolustusjärjestelmän reaktio. Esimerkkejä tulehduksesta, joka on seurausta spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, ovat vaste antigeeneille, kuten rubella-virukselle, autoimmuunisairaudet, viivästyneen tyypin T-soluvälitteinen yliherkkyysvaste (kuten esimerkiksi yksilöillä, joiden Mantaux-koe on "positiivinen"), jne.

"Ei-spesifinen puolustusjärjestelmäreaktio" on vaste, jota välittävät valkosolut, joilta puuttuu immunologinen muisti. Tällaisia soluja ovat jyvässolut ja syöjäsolut. Tässä käytettynä tulehduksen sanotaan olevan seurausta ei-spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, jos tulehduksen aiheuttaa, sitä välittää tai siihen liittyy ei-spesifisen puolustusjärjestelmän reaktio. Esimerkkejä tulehduksesta, jotka ovat ainakin osittain seurausta ei-spesifisen puolustusjärjestelmän reaktiosta, ovat tulehdus, joka liittyy tiloihin kuten: täysikasvuisen hengityksen vajaatoiminta (ARDS) tai monielinvauriot, jotka seuraavat verenmyrkytystä tai ulkoista tapaturmaa; sydänlihaksen tai muun kudoksen reperfuusiovaurio; akuutti munuais-kerästen tulehdus; reaktiivinen niveltulehdus; ihotaudit, joihin liittyy akuutteja tulehduksellisia komponentteja; akuutti märkäinen aivokalvontulehdus tai muu keskushermoston tulehdustila; lämpövaurio; hemodialyysi; leukafereesi; 102181 21 haavainen paksusuolen tulehdus; Crohnin sairaus; kuoliota aiheuttava suolistotulehdus; jyvässolu-transfuusioon liittyvät oireyhtymät; ja sytokiini-indusoitu myrkyllisyys.

Tämän keksinnön mukaan funktionaalisia ICAM-1-johdannaisia, ja erityisesti sellaiset johdannaiset, jotka käsittävät ICÄM-l:n fragmentteja tai mutanttivariantteja, joissa on alueet 1, 2 ja 3, voidaan käyttää tällaisten ei-spesifisen puolustusjärjestelmän reaktioiden hoidossa tai terapiassa. Edullisempia tällaiseen hoitoon tai terapiaan ovat ICAM-l-fragmentit tai -mutant-tivariantit, jotka sisältävät ICAM-1:n alueen 2. Edullisimpia tällaiseen hoitoon tai terapiaan ovat ICAM-l-fragmentit tai -mutanttivariantit, jotka sisältävät ICAM-1:n alueen 1.

Lisäksi esillä oleva keksintö tarkastelee ICAM-l:n ja sen funktionaalisten johdannaisten käyttöä astman hoidossa.

C. ICAM-l-qeenin kloonausta ICAM-l-geenin kloonaamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa lukuisista menettelyistä. Yhdessä tällaisessa menetelmässä analysoidaan kuljetinvektorikirjasto, joka koostuu cDNA-inserteistä (jotka on saatu ICAM-l:n ilmentävästä solusta), insertin läsnäolon suhteen, joka sisältää ICAM-l-geenin.

Tällainen analyysi voidaan suorittaa transfektoimalla soluja vektorilla ja määrittämällä sitten ICAM-l-ilmennys. Edullisen menetelmän mukaan tämän geenin kloonaamiseksi määritetään ICAM-1-molekyylin aminohapposekvenssi. Tämän tehtävän suorittamiseksi ICAM-l-proteiini voidaan puhdistaa ja analysoida automaattisella sekventoijalla. Vaihtoehtoisesti molekyyli voidaan fragmentoida syaanibromidi1 la, tai proteaaseilla kuten papaiinilla, kymotrypsiinillä tai trypsiinillä (Oike, Y., et ai.. J.Biol.Chem. 257 (1982) 9751 - 9758; Liu, C., et ai..

Int.J. Pent. Protein Res. 21 (1983) 209 - 215). Vaikka on mahdollista määrittää ICAM-1:n aminohapposekvenssi kokonai- 102181 22 suudessaan, edullisesti määritetään molekyylin peptidifrag-menttien sekvenssi. Jos peptidit ovat pituudeltaan yli 10 aminohappoa, sekvenssi-informaatio on yleensä riittävä jonkin geenin kuten ICAM-l-geenin kloonaamiseksi.

Aminohappojäännöksien sekvenssi peptidissä merkitään tässä joko käyttämällä niistä yleisesti käytettyä 3-kirjaimista merkintää tai niiden 1-kirjain merkintää. Luettelo näistä 3- ja 1-kirjainmerkinnöistä voidaan etsiä käsikirjoista, kuten Biochemistry. Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY, 1970. Kun tällainen sekvenssi on merkitty pystysuoraan, tarkoitetaan aminopään jäännöksen sijaitsevan luettelossa ylimpänä, ja peptidin karboksyylipään jäännöksen luettelossa alimpana. Vastaavasti kun merkintä on vaakasuorassa, tarkoitetaan aminopään olevan vasemmalla ja karboksyylipään puolestaan oikealla viimeisenä. Peptidin käsittämät aminohappojäännökset voidaan erottaa väliviivoilla. Näiden väliviivojen tarkoitus on yksinomaan selkeyttää sekvenssimerkinnän ulkoasua. Pelkästään havainnollistavana esimerkkinä aminohapposekvenssi, joka on merkitty: -Gly-Ala-Ser-Phe- tarkoittaa, että Ala-jäännös on kytketty Gly:n karboksyyliryh-mään, ja että Ser-jäännös on kytketty Ala-jäännöksen karboksyy-liryhmään ja Phe-jäännöksen aminoryhmään. Merkintä ilmoittaa edelleen, että aminohapposekvenssi sisältää tetrapeptidin Gly-ALa-Ser-Phe. Merkinnän tarkoitus ei ole rajata aminohapposekvenssiä· tähän yhteen tetrapeptidiin, vaan sen tarkoituksena on käsittää (1) tetrapeptidi, jossa yksi tai useampi aminohappo-jäännös on kytketty joko amino- tai karboksyylipäätyyn, (2) tetrapeptidi, jossa yksi tai useampi aminohappojäännös on kytketty sekä amino- että karboksyylipäätyyn, (3) tetrapeptidi, joka ei käsitä ylimääräisiä aminohappojäännöksiä.

Sitten kun yksi tai useampi sopiva peptidi fragmentti on sekventoitu, tarkastellaan niitä koodittamaan kykeneviä DNA- 102181 23 sekvenssejä. Geneettisen koodin degeneraattiluonteen johdosta jonkin tietyn aminohapon koodittamiseen voidaan käyttää useampaa kuin yhtä kodonia (Watson, Molecular Biology of the Gene. 3. painos, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977, ss. 356 - 357). Peptidifragmentteja analysoidaan aminohapposekvenssien tunnistamiseksi, joita kykenevät koodittamaan oligonukleo-tidit, joiden degeneraatti-aste on alhaisin. Tämä suoritetaan edullisesti tunnistamalla sekvenssejä, jotka sisältävät aminohappoja, joita koodittaa vain yksi ainoa kodoni. Vaikka toisinaan tällaisia aminohapposekvenssejä voi koodittaa vain yksi oligonukleotidi, useimmiten aminohapposekvenssin kykenee koodittamaan useampi kuin yksi samankaltaisten oiigonukleoti-dien sarjasta. Tärkeätä on, että kun sarjan kaikki jäsenet sisältävät oligonukleotideja, jotka kykenevät koodittamaan peptidifragmentin, ja täten sisältävät mahdollisesti saman nukleotidisekvenssin kuin geeni, joka koodittaa peptidifrag-menttia, vain yksi sarjan jäsen sisältää nukleotidisekvenssin, joka on identtinen tämän geenin nukleotidisekvenssiin nähden. Koska tämä jäsen esiintyy sarjassa, ja kykenee hybridoitumaan DNA than jopa sajan muiden jäsenien läsnäollessa, on mahdollista käyttää ei-fraktioitua oligonukleotidisarjaa samalla tavalla kuin käytettäisiin yksittäistä oiigonukleotidia peptidiä koodittavan geenin kloonaamiseksi.

Edellä kuvattuun nähden täysin analogisesti voidaan käyttää oiigonukleotidia (tai oligonukleotidisarjaa), jonka nukleoti-disekvenssi komplementoi oligonukleotidisekvenssiä, tai sek-venssisarjaa, joka kykenee koodittamaan peptidifragmentin.

Sopiva oligonukleotidi, tai sopivia oiigonukleotidideja, joka kykene/jotka kykenevät koodittamaan ICAM-l-geenifragmentin, (tai joka kykenee kömpiementoimaan tällaista oligonukleotidia, tai oligonukleotidisarjaa) tunnistetaan (käyttäen edellä kuvattua menettelyä), syntetisoidaan ja hybridoidaan alalla hyvin tunnettuun tapaan DNA:hän tai edullisemmin cDNA-valmis- 102181 24 teeseen, joka on saatu ihmissoluista, jotka kykenevät ilmentämään ICAM-l-geenisekvenssejä. Nukleiinihappohybridoin-titekniikoita julkistavat Maniatis, T., et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Coldspring Harbor, NY, 1982, ja Haymes, B.D., et al., Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC, 1985, jotka viitteet liitetään tähän viitteiksi. Käytetty DNA- tai cDNA-lähde on edullisesti rikastettu ICAM-l-sekvenssien suhteen. Tällainen rikastuminen voidaan helpoimmin saada cDNA:sta, joka on saatu uuttamalla RNA soluista, joita on viljelty olosuhteissa, jotka indusoivat ICAM-l-synteesiä (kuten U937, jota kasvatetaan forboliesterin läsnäollessa, jne.).

Edellä kuvatuilla tai niiden kaltaisilla tekniikoilla on menestyksekkäästi kyetty kloonaamaan ihmisen aldehydidehydro-genaasigeenejä (Hsu, L.C., et ai.. Proc.NatlAcad.Sei. OSA 82 (1985) 3771 - 3775), fibronektiinigeeni (Suzuki, S., et ai..

Eur.J.Mol.Biol.Oraan.J. 4 (1985) 2519 - 2524), ihmisen estro-geenireseptorigeeni (Walter, P., et ai.. Proc.Natl.Acad.Sei.

USA 82 (1985) 7889 - 7893), kudostyyppi-plasminogeeniaktivaat-torigeeni (Pennica, D., et ai .. Nature 301 (1983) 214 - 221) ja ihmisen istukan alkalisen fosfataasin komplementti-DNA (Kam, W., et ai.. Proc.Natl.Acad.Sei. USA 82 (1985) 8715 - 8719).

Edullisen vaihtoehtoisen tavan mukaan ICAM-l-geenin kloonaamiseksi valmistetaan ilmennysvektorikirjasto kloonaamalla DNA tai edullisemmin cDNA ICAM-l:n ilmentämään kykenevästä solusta ilmennysvektoriin. Sitten kirjasto seulotaan jäseniensä suhteen, jotka kykenevät ilmentämään proteiinin, joka sitoutuu ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen, ja jolla on sellainen nuk-leotidisekvenssi, että se kykenee koodittamaan polypeptidejä, joilla on sama aminohapposekvenssi kuin ICAM-l:llä tai ICAM-1-fragmentei11a.

Kloonattu ICAM-l-geeni, joka on saatu edellä kuvatuilla 102181 25 menetelmillä, voidaan toiminnallisesti kytkeä ilmennysvek-toriin, ja viedä bakteerisoluihin tai eukaryoottisiin soluihin ICÄM-l-proteiiinin tuottamiseksi. Tekniikoita tällaisia suorituksia silmälläpitäen julkistavat Maniatis, T. , et al_i_, supra, ja ne ovat alalla hyvin tunnettuja.

D. LFA-l-riippuvaisen aaareaaation määrityksien käyttöjä

Edellä kuvattua määritystä, jolla kyetään mittaamaan LFA-1-riippuvaista aggregaatiota, voidaan käyttää aineiden tunnistamiseksi, jotka toimivat antagonisteina inhiboiden LFA-l-riippuvaisen aggregaation astetta. Tällaiset antagonistit voivat toimia häiritsemällä LFA-l:n tai ICAM-l:n kykyä välittää aggregaatiota. Täten tällaisia aineita ovat immunoglobuliinit kuten vasta-aine, joka kykenee sitoutumaan joko LFA-l:een tai ICAM-l:een. Lisäksi ei-immunoglobuliini- (eli kemiallisia) aineita voidaan tutkia käyttäen edellä kuvattu määritystä sen määrittämiseksi, ovatko ne LFA-l-aggragaation antagonisteja.

E. ICAM-l-reseptoriproteiineihin sitoutumaan kykenevien vasta-aineiden kävttöiä I. Tulehdusvastaiset aineet CD18-kompleksijäsenien vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet inhiboivat valkosolujen monia kiinnitysriippuvaisia funktioita, mukaanlukien sitoutuminen endoteeliin (Haskard, D., et ai., J. Immunol. 137 (1986) 2901 - 2906), homotyyppiset kiinnittymiset (Rothlein, R., et ai., J.Exp.Med. 163 (1986) 1132 -1149), antigeeni- ja mitogeeni-indusoitu imusolujen lisääntyminen (Davignon, D., et ai.. Proc.Natl.Acad.Sei. OSA 78 (1981) 4535 - 4539), vasta-ainemuodostus (Fischer, A., et ai., J.Immunol. 136 (1986) 3198 - 3203), ja kaikkien valkosolujen efektorifunktiot kuten sytotoksinen lyysiaktiivisuus T-soluilla (Krensky, A.M., et ai.. J.Immunol. 132 (1984) 2180 - 2182), 102181 26 syöjäsoluilla (Strassman, G., et ai .. J. Immunol. 13 6 (1986) 4328 - 4333), ja kaikilla soluilla, jotka osallistuvat vasta-aineriippuvaisiin solusytotoksisuusreaktioihin (Kohl, S., et ai. , J.Immunol. 133 (1984) 2972 - 2978). Kaikissa edeltävissä funktioissa vasta-aineet inhiboivat valkosolun kykyä kiinnittyä sopivaan solusubstraattiin, mikä puolestaan inhiboi lopputulosta .

Kuten edellä esitetty ICMA-l-molekyylien sitoutuminen LFA-1-ryhmämolekyyleihin on ensiarvoisen merkityksellistä solukiin-nittymisessä. Kiinnitysprosessin välityksellä imusolut kykenevät jatkuvasti tarkkailemaan eläintä vieraiden antigeenien läsnäolon varalta. Vaikka nämä prosessit ovat normaalisti toivottavia, ne voivat niinikään aiheuttaa elinsiirrehyljintää, kudossiirrehyljintää ja monia autoimmuunisairauksia. Täten mikä tahansa keino, jolla kyettäisiin heikentämään tai inhiboimaan solukiinnitystä, olisi erittäin toivottava elinsiirre-, kudossiirrevastaanottajille sekä autoimmuunipoti1 ai 11 e.

ICAM-l:een sitoutumaan kykenevät monoklonaaliset vasta-aineet sopivat erittäin hyvin tulehdusvastaisiksi aineiksi nisäkäskoh-teessa. Merkittävästi tällaiset aineet poikkeavat yleisistä tulehdusvastaisista aineita sikäli, että ne kykenevät selektiivisesti inhiboimaan kiinnittymistä, eivätkä tuota muita sivuvaikutuksia, kuten myrkyllisyys munuaisille, joita tavataan tavanomaisilla aineilla. ICAM-l:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisiä vasta-aineita voidaan tämän vuoksi käyttää estämässä elin- tai kudoshyljintää ja autoimmuunivasteiden modifioimiseksi pelkäämättä tällaisia sivuvaikutuksia nisäkäs-kohteessa .

Merkittävästi, käyttämällä ICAM-l:n tunnistamaan kykeneviä monoklonaalisiä vasta-aineita kyetään mahdollisesti suorittamaan elinsiirtoja jopa HLA-ei-yhteensopivien yksilöiden välillä.

102181 27 2. Viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktion suppressorit

Koska ICAM-1-mo1ekyy1i t ilmentyvät valtaosin tulehduskohdissa, kuten kohdissa, joissa esiintyy viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktio, ICAM-l-molekyyleihin sitoutumaan kykenevillä (erityisesti monoklonaalisilla) vasta-aineilla on terapeuttisia käyttömahdollisuuksia tällaisten reaktioiden heikentämiseksi tai eliminoimiseksi. Tätä terapeuttista käyttömahdollisuutta voidaan hyödyntää jommallakummalla kahdesta tavasta. Ensinnäkin koostumusta, joka sisältää ICAM-l-vastaista monoklonaalista vasta-ainetta, voidaan antaa potilaalle, jolla on viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktio. Esimerkkiksi tällaisia koostumuksia voidaan antaa yksilölle, joka on joutunut kosketuksiin antigeenien kuten myrkkymuratin, myrkkytammen jne., kanssa.

Toisessa suoritusmuodossa ICAM-l:een sitoutumaan kykenevää monoklonaalista vasta-ainetta annetaan potilaalle yhdessä antigeenin kanssa myöhemmän tulehdusreaktion estämiseksi. Täten antamalla ICAM-l:een sitoutuvan monoklonaalisen vasta-aineen ohella antigeeniä voidaan tilapäisesti saada yksilö sietämään myöhempää altistusta tuolle antigeenille.

3. Terapia kroonisille tulehdussairauksille

Koska LAD-potilaat, joilta puuttuu LFA-1, eivät tuota tuleh-dusvastetta, arvellaan, että LFA-l:n luontaisen ligandin, ICAM-l:n, antagonismi niinikään estää tulehdusvasteen. ICAM-1-vastaisten vasta-aineiden kyky inhiboida tulehdusta on perusta niiden terapeuttiselle käytölle kroonisten tulehdussairauksien ja autoimmuunisairauksien hoidossa, kuten punahukka, autoimmuuni-kilpirauhastulehdus, kokeellinen aivojen ja selkäytimen yliherkkyystulehdus (EAE), multippeliskleroosi, Reynaudin oireyhtymän tietyt muodot, nivelreuma, jne. Tällaisia vasta-aineita voidaan käyttää terapiana myös hilsetystaudin hoidossa. Yleensä ottaen ICAM-l:een sitoutumaan kykenveiä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää sellaisten sairauksien hoidossa, 102181 28 joita tällä hetkellä hoidetaan steroiditerapialla.

4. Diagnostisia ja prognostisia käyttöjä

Koska ICAM-1 ilmentyy pääasiassa tulehduskohdissa, ICAM-l:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisiä vasta-aineita voidaan käyttää keinona tartunta- ja tulehduskohdan kuvantamiseksi tai visualisoimiseksi potilaassa. Tällaisessa käytössä monoklonaaliset vasta-aineet leimataan todettavalla leimalla, käyttäen radioisotooppeja, affiniteettileimoja (kuten biotiini, avidii-ni, jne.), fluoroivia leimoja, paramagneettisia atomeja jne. Menettelyt tällaisen leimaamisen suorittamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja. Vasta-aineiden kliinistä käyttöä diagnostisessa kuvantamisessa tarkastelevat Grossman, H.B.,

UrolCl in.North Amer. 13 (1986) 465 - 474; Unger, E.C., et ai., Invest.Radioi. 20 (1985) 693 - 700, ja Khaw, B.A., et ai.,

Science 209 (1980) 295 - 297.

Tulehduksen läsnäolo voidaan niinikään todeta käyttämällä sitoutumisligandeja, kuten mRNA, cDNA tai DNA, joka sitoutuu ICAM-l-geenisekvensseihin, tai ICAM-l-mRNA-sekvensseihin, ICAM-l:n ilmentävissä soluissa. Tekniikoita tällaisten hybridointi-määrityksien suorittamiseksi kuvaavat Maniatis, T. (supra).

Tällaisten todettavalla leimalla leimattujen vasta-aineiden sijaintipaikan toteaminen merkitsee tulehduskohtaa tai kasvainkehitystä. Yhdessä suoritusmuodossa tämä tulehduksen etsintä suoritetaan ottamalla kudos- tai verinäytteitä ja inkuboimalla tällaisia näytteitä todettavalla leimalla lei-. mattujen vasta-aineiden läsnäollessa. Edullisessa suoritus muodossa tämä tekniikka toteutetaan ei-invasiivisella tavalla käyttäen magneettikuvannusta, fluorografiaa jne. Tällaista diagnostista koetta voidaan käyttää elinsiirrevastaanottajien tarkkailemiseksi mahdollisen kudoshyljinnän varhaisten merkkien varalta. Tällaisia määrityksiä voidaan suorittaa samoin 102181 29 pyrittäessä määrittämään potilaan taipumus nivelreumaan tai muihin kroonisiin tulehdussairauksiin.

5. Apuaine antigeenisen materiaalin antamiseksi terapeuttisessa tai diagnostisessa tarkoituksessa

Immuunivasteet terapeuttisille tai diagnostisille aineille kuten esimerkiksi nautainsuliini, interferoni, kudostyypin plasminogeeniaktivaattori tai hiiren monoklonaaliset vasta-aineet, heikentävät huomattavasti tällaisten aineiden terapeuttista tai diagnostista arvoa ja voivat itse asiassa aiheutta sairauksia kuten seerumisairauden. Tällaista tilannetta voidaan helpottaa käyttämällä tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita. Tässä suoritusmuodossa tällaisia vasta-aineita annettaisiin yhdessä terapeuttisen tai diagnostisen aineen kanssa. Vasta-aineita lisäämällä estetään vastaanottajaa tunnistamasta ainetta, jolloin vastaanottajaa estetään käynnistämästä sen vastaista immuunivastetta. Seurauksena tällaisen immuunivasteen puuttumisesta potilaalle voidaan antaa enemmän terapeuttista tai diagnostista ainetta.

F. Solujen välisen kiinnikemolekvvli-1:n (ICAM-1) käyttöjä ICAM-1 on LFA-l:n sitoutumispari. Sellaisena ICAM-l:tä tai sen funktionaalisia johdannaisia voidaan käyttää vastavuoroisesti vaihdettavasti LFA-l:een sitoutumaan kykenevien vasta-aineiden kanssa sairauden hoidossa. Täten liukoisessa muodossa tällaisia molekyylejä voidaan käyttää tulehduksen, elinhyljinnän, siirre-hyljinnän, jne., estämiseksi. ICAM-l:tä tai sen funktionaalisia johdannaisia voidaan käyttää vastaavalla tavalla ICAM-vastaisina vasta-aineina terapeuttisten tai diagnostisten aineiden immunogeenisyyden alentamiseksi.

ICAM-1:tä, sen funktionaalisia johdannaisia ja sen antagonisteja voidaan käyttää ICAM-l:n tai LFA-l:n pinnoillaan ilmen 102181 30 tävien kasvainsolujen etäispesäkemuodostuksen tai lisääntymisen salpaamiseksi. Tällaisen päämäärän saavuttamiseksi voidaan käyttää lukuisia menetelmiä. Esimerkiksi vertamuodostavien solujen migraatio edellyttää LFA-l-ICAM-l-sitoutumista.

Tällaisen sitoutumisen antagonistit estävät siksi tämän migraation ja salpaavat etäispesäkkeiden muodostumisen valkosolulinjojen kasvainsoluista. Vaihtoehtoisesti potilaalle voidaan antaa toksiinijohdannaismolekyylejä, jotka kykenevät sitoutumaan joko ICAM-l:een tai LFA-l-ryhmämolekyyliin.

Tällaisten toksiinijohdannaismolekyylien sitoutuessa kasvainsoluihin, jotka ilmentävät ICAM-l:n tai LFA-1-ryhmämolekyylin, toksiinin läsnäolo tappaa kasvainsolun estäen siten kasvaimen kasvun.

G. ICAM-l-riippuvaisen kiinnittymisen ei-immunoglobuliini antagonistien kävttöiä ICAM-l-riippuvainen kiinnittyminen voidaan estää ei-immunogl o-buliini-antagonisteilla, jotka kykenevät sitoutumaan joko ICAM-l:een tai LFÄ-l:een. Yksi esimerkki ICAM-l:n ei-immunoglobulii-ni-antagonistista on LFÄ-1. Esimerkki ei-immunoglobuliini-antagonistista, joka sitoutuu LFA-l:een, on ICAM-1. Käyttämällä edellä kuvattuja määrityksiä voidaan tunnistaa ja puhdistaa muita ei-immunoglobuliini-antagonisteja. ICAM-l-riippuvaisen kiinnittymisen ei-immunoglobuliini-antagonisteja voidaan käyttää samassa tarkoituksessa kuin LFA-l-vastaisia vasta-aineita tai ICAM-l-vastaisia vasta-aineita.

H. Tämän keksinnön mukaisten koostumuksien antaminen ICAM-1:n terapeuttiset vaikutukset voidaan saada antamalla potilaalle ICAM-l-molekyyliä kokonaisuudessaan, tai sen mitä tahansa terapeuttisesti aktiivista peptidifragmenttia.

ICAM-1 ja sen funktionaaliset johdannaiset voidaan saada joko 102181 31 synteettisesti, käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa tai proteolyyttisesti. ICAM-l:n terapeuttisia etuja voidaan lisätä käyttämällä ICAM-l:n funktionaalisia johdannaisia, joihin on lisätty ylimääräisiä aminohappojäännöksiä kytkemisen kantajaan helpottamiseksi tai ICÄM-l:n aktiivisuuden tehostamiseksi.

Tämän keksinnön piiriin tarkoitetaan edelleen kuuluvaksi ICAM-l:n funktionaaliset johdannaiset, joista puuttuvat tietyt aminohappojäännökset, tai jotka sisältävät muutettuja aminohappo jäännöksiä, kunhan tällaiset johdannaiset osoittavat kykyä vaikuttaa solukiinnitykseen.

Sekä esillä olevan keksinnön mukaisten vasta-aineiden että tässä julkistetun ICAM-l-molekyylin sanotaan ’’oleellisesti ei sisältävän luontaisia epäpuhtauksia", jos niitä sisältävät valmisteet ovat oleellisesti vapaita materiaaleista, joiden yhteydessä näitä tuotteita normaalisti ja luontaisesti esiintyy.

Kyseiseen keksintöön kuuluvat vasta-aineet, ja niiden biologisesti aktiiviset fragmentit (riippumatta siitä, ovatko ne polyklonaalisia vai monoklonaalisia), jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een. Tällaisia vasta-aineita voidaan tuottaa joko eläimessä, tai kudosvi1jelmässä tai yhdistelmä-DNA-teknisesti.

Annettaessa potilaalle vasta-aineita, tai niiden fragmentteja, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een, tai annettaessa ICAM-l:tä (tai sen fragmenttia, varianttia tai johdannaista) vastaanottavalle potilaalle annetun aineen annostus vaihtelee ·_ riippuen tekijöistä kuten potilaan ikä, paino, pituus, sukupuoli, yleinen terveydentila, aiempi sairaushistoria jne. Yleensä ottaen on toivottavaa antaa vastaanottajalle vasta-aine-annotus, joka on noin 1 pg/kg - 10 mg/kg (potilaan ruumiinpainoa), vaikka voidaan antaa alempiakin tai korkeampiakin annostuksia. Annettaessa potilaalle ICÄM-l-molekyy1 ejä 102181 32 tai niiden funktionaalisia johdannaisia, edullisesti tällaisia molekyylejä annetaan annostus, joka samoin on noin 1 pg/kg - 10 mg/kg (potilaan ruumiinpainoa), vaikka voidaan antaa alempiakin tai korkeampiakin annostuksia. Kuten alla esitetään terapeuttisesti tehokasta annosta voidaan alentaa, jos LFA-l-vastaisen vasta-aineen ohella annetaan ICÄM-l-vastaista vasta-ainetta. Tässä käytettynä yhdistettä sanotaan annettavan toisen yhdisteen ohella, jos näiden kahden yhdisteen antaminen suoritetaan ajallisesti niin lähellä toisiaan, että kumpaakin yhdistettä voidaan todeta samanaikaisesti potilaan seerumista.

Sekä ICAM-l:een sitoutumaan kykenevää vasta-ainetta että itse ICAM-l:tä voidaan antaa potilaille laskimonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihonalaisesti, ruoansulatuskanavan kautta tai sen ulkopuolisesti. Annettaessa vasta-aine tai ICAM-1 ruiskuttamalla antaminen voidaan suorittaa jatkuvan neste-siirron välityksellä tai kerta- tai moniannoksena.

Kyseisen keksinnön mukaisia tulehdusvastaisia aineita on tarkoitus antaa vastaanottaville kohteille määrä, joka on riittävä tukahduttamaan tulehduksen. Määrän sanotaa olevan riittävä "tukahduttamaan" tulehduksen, jos aineen annostus, antotie jne. ovat riittävät heikentämään tai estämään tulehduksen.

ICAM-l-vastainen vasta-aine tai sen fragmentti voidaan antaa joko yksinään tai yhdistettynä yhteen tai useampaan immuunivastetta heikentävään aineeseen (erityisesti elin- tai kudossiirrevastaanottajal1 e). Tällainen yksi tai useampi yhdiste voidaan antaa "ennaltaehkäisevässä" tai "terapeuttisessa" tarkoituksessa. Annettaessa yhtä tai useampaa immuunivastetta heikentävää yhdistettä ennaltaehkäisevästi ne annetaan ennen minkään tulehdusvasteen tai -oireen ilmenemistä (esimerkiksi ennen, samanaikaisesti kuin, sen jälkeen kun suoritetaan elin- tai kudossiirto mutta ennen kuin ilmenee 102181 33 oireita kudoshyljinnästä). Yhden tai useamman yhdisteen ennaltaehkäisevän antamisen tehtävänä on estää tai heikentää mahdollista myöhempää tulehdusvastetta (kuten esimerkiksi siirretyn elimen tai kudoksen hyljintää, jne.)· Kun yhtä tai useampaa immuunivastetta heikentävää yhdistettä annetaan terapeuttisesti, se/ne annetaan samanaikaisesti kuin (tai pian sen jälkeen kun) varsinainen tulehdusoire (kuten esimerkiksi elimen tai kudoksen hyljintä) käynnistyy (tai on käynnistynyt). Yhden tai useamman yhdisteen terapeuttisen annon tehtävänä on heikentää mahdollista tosiasiallista tulehdusta (kuten esimerkiksi siirretyn elimen tai kudoksen hyljintä). Esillä olevan keksinnön mukaisia tulehdusvastaisia aineita voidaan täten antaa joko ennen tulehduksen käynnistymistä (kuten ennakoidun tulehduksen tukahduttamiseksi) tai tulehduksen käynnistymisen jälkeen.

Koostumuksen sanotaan olevan "farmakologisesti hyväksyttävä”, jos vastaanottava potilas voi sietää sen annon. Tällaista ainetta sanotaan annettavan "terapeuttisesti tehokas määrä", jos annettu määrä on fysiologisesti merkittävä. Aine on fysiologisesti merkittävä, jos seurauksena sen läsnäolosta todetaan muutos vastaanottavan potilaan fysiologiassa.

Esillä olevan keksinnön mukaiset vasta-aine ja ICAM-1-molekyylit voidaan koostaa tunnetuilla menetelmillä farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostumuksien valmistamiseksi, jolloin näitä materiaaleja, tai niiden funktionaalisia johdannaisia, yhdistetään) seokseksi farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan. Sopivia kantajia ja niiden koostamista, mukaanlukien muut humaaniproteiinit, . ·' esim. humaaniseerumia1bumiini, kuvataan esimerkiksi käsikirjassa "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. painos, Osol, A., toim. Mack, Easton PA, 1980. Farmaseuttisesti hyväksyttävän koostumuksen muodostamiseksi, joka soveltuu tehokkaaseen antoon, tällainen koostumus sisältää tehokkaan 102181 34 määrän ICAM-vastaista vasta-ainetta tai ICAM-l-molekyyliä, tai niiden jotain funktionaalista johdannaista, yhdessä sopivan määrän kantajaa kanssa.

Muita farmaseuttisia menetelmiä voidaan käyttää vaikutuksen keston kontrolloimiseksi. Kontrolloidun vapautumisen valmisteita voidaan saada käyttämällä polymeerejä ICAM-1-vastaisen vasta-aineen tai ICAM-l:n, tai niiden funktionaalisten johdannaisten, kömpieksoimiseksi tai absorboimiseksi. Kontrolloituun vapautumiseen voidaan päästä valitsemalla tarkoituksenmukaisia makromolekyylejä (esimerkiksi polyesterit, polyaminohapot, polyvinyylipyrrolidoni, etyleenivinyyliase-taatti, metyyliselluloosa, karboksimetyylisel1 uioosa, tai protamiinisulfaatti) ja makromolekyylien pitoisuuksia sekä menetelmiä niiden sisällyttämiseksi vapautumisen kontrolloimiseksi. Toinen mahdollinen menetelmä vaikutuksen keston säätelemiseksi käytettäessä kontrolloidun vapautumisen valmisteita on sisällyttää ICAM-l-vastainen vasta-aine tai ICÄM-l-molekyylejä, tai niiden funktionaalisia johdannaisia, polymeerimateriaalihiukkasiin, jolloin materiaaleina tulevat kyseeseen polyesterit, polymaminohapot, hydrogeelit, poly(maitohappo) tai etyleenivinyyliasetaattikopolymeerit. Vaihtoehtoisesti sen sijaan että nämä aineet sisällytettäisiin polymeerihiukkasiin, on mahdollista sulkea nämä materiaalit mikrokapseleihin, jotka on valmistettu esimerkiksi koaservaa-tiotekniikoi1la tai rajapintapolymeroinnilla, esimerkiksi hydroksimetyyliselluloosa- tai gelatiini-mikrokapseleihin ja vastaavasti poly(metyylimetasylaatti)mikrokapseleihin, tai kolloidisiin lääkekuljetusjärjestelmiin, esimerkiksi liposo-meihin, albumiinimikropalloihin, mikroemulsioihin, nanohiuk-kasiin ja nanokapseleihin tai makroemulsioihin. Tällaisia tekniikoita julkistetaan käsikirjassa "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1980.

Kuvattuamme nyt keksintöä yleisesti se tulee ymmärrettävämmäksi 102181 35 tutustumalla seuraaviin esimerkkeihin, jotka esitetään havainnoilistamismielessä, jolloin niiden tarkoituksena ei ole rajoittaa esillä olevaa keksintöä, ellei siten nimenomaan mainittu.

ESIMERKKI 1

Nisäkässolujen viljely

Yleensä ottaen esillä olevan keksinnön mukaisia EBV-transformoituja soluja ja hybridoomasoluja säilytettiin RPMI 1640 -kasvualustassa, jota oli täydennetty pitoisuudella 20 mM L-glutamiinia, 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä ja 10 %:lla nautasikiö- (tai vasikansikiö-) seerumia. Soluja viljeltiin 37 °C:ssa 5 % hiilidioksidia käsittävässä ilmakehässä 95 %:n ilman suhteellisessa kosteudessa.

Epstein-3arr-virus- (EBV-) transformanttien saamiseksi 106 kpl:ta T-soluja, joista oli poistettu ääreisveren yksituma-solut, millilitraa kohden RPMI 1640-kasvualustaa, jota oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia (FCS) ja 50 mikrogrammal la/ml gentamysiiniä, inkuboitiin 16 tunnin ajan B95-8-solujen EBV-pitoisella supernatantilla (Thorley-Lawson, D.A., et ai.. J.Exper.Med. 146 (1977) 495). 0,2 ml:n solu-eriä sijoitettiin 10 mikrotiitterilevykuoppaan. Kasvualustaa korvattiin RPMI 1640-kasvualustalla (jota oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia ja 50 mikrogrammal1a/ml gentamysiiniä) kunnes havaittiin solukasvua. Soluja kasvoi useimmissa kuopissa ja niitä lisäännytettiin samassa kasvualustassa. Fytohemagglutiniini- (PHA-) emosoluja sijoitettiin pitoisuu-deksi 106 solua/ml RPMI 1640 -kasvualustaan (jota oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia), joka sisälsi 1:800 laimennoksena PHA-P:tä (Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI). PHA-solulinjoja lisäännytettiin interleukiini-2:1 la (IL-2:lla) käsitellyssä kasvualustassa ja käsiteltiin viikoittain PHArlla (Cantrell, D.A., et ai.. J.Exper.Med. 158 (1983) 1895).

102181 36

Edeltävän menettelyn julkisti Springer, T., et ai., J.Exper.Med. 160 (1984) 1901 - 1918, joka viite sisällytetään tähän viitteeksi. Edeltävällä menettelyllä saadut solut seulotaan sitten LFA-l-vastaisilla vasta-aineilla sen määrittämiseksi, ilmentävätkö ne LFA-l-antigeenin. Tällaisia vasta-aineita julkistavat Sanchez-Madrid, F., et ai..

J.Exper.Med. 158 (1983) 1785.

ESIMERKKI 2

Soluaggregaation ja -kiinnityksen määrityksiä

Solukiinnityksen asteen määrittämiseksi käytettiin aggregaa-tiomäärityksiä. Näissä määrityksissä käytetyt solulinjat pestiin kahdesti RPMI 1640 -kasvualustalla, joka käsitti pitoisuuden 5 mM Hepes-puskuria (Sigma Chemical, Co., St.

Louis), ja uudelleenlietettiin pitoisuudeksi 2 x 106 solua/ml. Tasapohjaisiin, 96 kuopan mikrotiitterilevyihin (n:o 3596,

Costar, Cambridge, MA) lisättiin 50 mikrolitraa sopivaa monoklonaalivasta-ainesupernatanttia tai 50 mikrolitraa täydellistä kasvualustaa, joka sisälsi tai ei sisältänyt puhdistettuja monoklonaalisiä vasta-aineita, 50 mikrolitraa täydellistä kasvualustaa, joka sisälsi 200 ng/ml forboliesteri forbolimyristaattiasetaattia (PMA), ja 100 mikrolitraa soluja pitoisuudeksi 2 x 10® solua/ml täydellistä kasvualustaa.

Tällöin loppupitoisuudeksi tuli 50 ng/ml PMArta ja 2 x 105 solua/kuoppa. Solujen annettiin laskeutua vapaasti, jolloin aggregaatio-aste arvosteltiin eri ajankohtina. Arvot vaih-telivat välillä 0 - 5+, jolloin 0 merkitsi, että oleellisesti lainkaan soluja ei ollut rykelmissä; 1+ merkitsi, että alle 10 % soluista oli aggregaateissa; 2+ merkitsi, että alle 50 % soluista oli aggregoitunut; 3+ merkitsi, että solut olivat 100-%:isesti pienissä, irtonaisissa rykelmissä; 4+ merkitsi, että solut olivat 100-%:isesti aggregoituneet suuremmiksi rykelmiksi; ja 5+ merkitsi, että solut olivat 100-%:isesti suurissa, hyvin tiiviissä rykelmissä. Kvantitatiivisemman arvion 102181 37 saamiseksi solukiinnityksestä reagensseja ja soluja lisättiin 5 ml:n polystyreeniputkiin samassa järjestyksessä kuin edellä. Putket asetettiin telineessä kiertoravistelijaan 37 °C:seen. Putkia ravisteltiin tunnin ajan noin 200 kierr./min kierrosno-peudella, minkä jälkeen 10 mikrolitraa solususpensiota sijoitettiin hemosytometriin ja kvantitoitiin vapaiden solujen lukumäärä. Aggregaatio-% laskettiin seuraavasta yhtälöstä: vapaiden solujen lukumäärä aggregaatio-% = 100 x (1 - -----------------------------) käytettyjen solun lukumäärä Käytettyjen solujen lukumäärä edellisessä kaavassa on solujen lukumäärä millilitrassa verrokkiputkisisältöä, joka sisälsi vain soluja ja täydellistä kasvualustaa ja jota ei inkuboitu. Vapaiden solujen lukumäärä edeltävässä yhtälössä on sama kuin ei-aggregoitujen solujen lukumäärä millilitrassa kokeessa käytettyä putkisisältöä. Edeltäviä menettelyitä on kuvannut Rothlein, R., et ai., J.Exper.Med. 163 (1986) 1132 - 1149.

ESIMERKKI 3 LFA-1-riippuvainen solu-aggregaatio

Esimerkissä 2 kuvattua kvalitatiivista aggregaatiota mittaava määritys suoritettiin käyttäen Epstein-Barr-transformoitua solulinjaa JY. Lisättäessä PMA:ta kasvualustaan mikrotiitte-rilevyillä todettiin solu-aggregaatiota. Ajankuluvideonauhoi-tukset osoittivat, että JY-solut mikrotiitterilevyjen pohjalla olivat liikkuvia ja osoittivat aktiivista membraanin rypistymistä ja valejalkaliikettä. Naapurussolujen valejalkojen välinen kontakti johti usein solu-solukiinnittymiseen. Jos kiinnittyminen oli pitävä, solukontaktialue siirtyi uropodiin. Kontakti pystyttiin säilyttämään huolimatta kiivaasta solulii-kehdinnästä ja solujen vedosta vastakkaisiin suuntiin. PMArlla käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen solujen välinen pääasiallinen ero vaikutti olevan näiden kontaktien stabiilisuudessa kontak 102181 38 tien kerran muodostuttua. PMA:11a muodostui solurykelmiä, jotka kasvoivat kooltaan sitä mukaa kun lisää soluja kiinnittyi niiden äärilaitamille.

Toisena keinona kiinnityksen mittaamiseksi käytettiin esimerkissä 2 kuvattua kvantitatiivista määritystä. Solususpensioita ravistettiin 200 kierr./min kierrosnopeudel1 a 2 tunnin ajan, minkä jälkeen ne siirrettiin hemosytometriin ja laskettiin sellaisten solujen lukumäärä, jotka eivät olleet aggregaateissa. PMA:n puuttuessa 42 % (SD = 20 %, N = 6) JY-soluista oli aggregaateissa 2 tunnin kuluttua, kun taas JY-soluista, joita oli inkuboitu identtisissä olosuhteissa 50 ng:lla/ml PMA:ta, 87 % (SD = 8 %, N = 6) oli aggregaateissa. Aggregaation kineettisissä tutkimuksissa ilmeni, että PMA tehosti aggregaation nopeutta ja laajuutta kaikkina testattuina ajankohtina (kuvio 3).

ESIMERKKI 4

Solujen aggregaation inhibitio käyttäen LFA-l-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita LFA-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksien PMA-indusoituun soluaggregaatioon tutkimiseksi näitä vasta-aineita lisättiin soluihin, joita inkuboitiin kuten esimerkin 2 mukaisessa kvalitatiivisessa aggregaatiomäärityksessä. Monoklonaalisten vasta-aineiden todettiin inhiboivan soluaggregaattien muodostusta PMA:n sekä läsnäollessa että toisaalta puuttuessa. Monoklonaalisten vasta-aineiden LFA-l-alfa-ketjun vastaiset sekä F(ab')2- että Fab'-fragmentit kykenivät inhiboimaan soluaggregaatiota. Kun oleellisesti 100 % soluista muodosti aggregaatteja LFA-l-vastaisen vasta-aineen puuttuessa, alle 20 %:n soluista todettiin olevan aggregaateissa vasta-ainetta käytettäessä. Tämän kokeen tuloksia kuvaavat Rothlein, R., et ai. (J.Exper.Med. 163 (1986) 1132 - 1149).

102181 39 ESIMERKKI 5

Soluaggregaatio edellyttää LFA-l-reseptorin läsnäoloa EBV-transformoituja varhaisimusoluja valmistettiin potilaista kuten kuvattu esimerkissä 1. Tällaiset solut seulottiin mono-klonaalisia vasta-aineita vastaan, jotka kykenevät tunnistamaan LFA-1:n, ja LFA-1:n todettiin puuttuvan soluilta.

Käytettiin esimerkissä 2 kuvattua kvalitatiivista aggregaatio-määritystä käyttäen edellä kuvattuja soluja, joista puuttuu LFA-1. Tällaiset solut eivät spontaanisti aggregoituneet edes PMA:n läsnäollessa.

ESIMERKKI 6 ICAM-l:n löytäminen

Esimerkin 5 solut, joista puuttuu LFA-1, leimattiin karboksi-fluoreseiinidiasetaati1 la (Patarroyo, M., et ai., Cell.Immunol .

63 (1981) 237 - 248). Leimattuja soluja sekoitettiin suhteessa 1:10 autologisiin soluihin tai JY-soluihin ja määritettiin aggregaateissa olevien fluoreseiinilla leimattujen solujen prosentuaalinen osuus Rothleinin, R., et ai., J.Exper.Med. 163 (1986) 1132 - 1149, menetelmän mukaan. Solujen, joista puuttui LFA-1, todettiin kykenevän ko-aggregoitumaan LFA-l:n ilmentävien solujen kanssa (kuvio 4).

Sen määrittämiseksi, oliko LFA-1:llä merkitystä vain aggregaat-timuodosLuksessa vai (myös) niiden ylläpidossa, edellä kuvattuihin ennaltamuodostettuihin aggregaatteihin lisättiin LFA-; l:een sitoutumaan kykeneviä vasta-aineita. Vasta-ainelisäyksen todettiin voimakkaasti rikkovan valmista aggregaattia. Ajanku-luvideonauhoitus vahvisti, että monoklonaalisten vasta-aineiden lisääminen valmiisiin aggregaatteihin alkoi aiheuttaa rikkoontumista 2 tunnin kuluessa (taulukko 1). LFA-l-vastaisten mono-klonaalisten vasta-aineiden lisäämisen jälkeen valejalkaliikeh- 102181 40 dintä ja muutokset yksittäisten solujen aggregaateissa muodossa jatkuivat muuttumattomina. Yksittäisiä soluja erkani vähän kerrallaan aggregaatin laidalta; 8 tunnin kuluttua solut olivat valtaosin hajautuneet. Videoajankulunauhoituksen mukaan ennaltamuodostettujen aggregaattien rikkoontuminen LFA-1-monoklonaalivasta-aineiden toimesta vaikutti ekvivalenttiselta aggregaatioprosessi1 le LFA-l-monoklonaalivasta-aineen puuttuessa ajassa taaksepäin.

TAULUKKO 1 LFA-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kyky rikkoa ennaltamuodostettuja PMA-indusoituja JY-soluaggregaatteja

Aggregaatiolukema

^ ia h T

*-oe 2 ha -mAb «Ab 1 4+ 4+ l+b

2 3+ 4+ 1+C

3 5+ 5+ l+d

Aggregaatio kvalitatiivisessa mikrotiitterilevymäärityksessä arvioitiin visuaalisesti. Kun LFA-l-vastaista vasta-ainetta oli läsnä koko määritysaikajakson, aggregaatio oli alle 1+.

aAggregaation määrä juuri ennen monoklonaalivasta-ainelisäystä ajankohtana 2 tuntia.

bTSl/18 + TSi/22 cTSi/18 dTSl/22 102181 41 ESIMERKKI 7 LFA-l-riippuvaisen aggregaation kaksivaienssisten ionien tarve LFA-l-riippuvaiset kiinnitykset sytotoksisten T-solujen ja kohteiden välillä edellyttävät magnesiumin läsnäoloa (Martz, E., J.Cell.Biol. 84 (1980) 584 - 598). PMA-indusoidun JY-solu-aggregaation riippuvuutta kaksivalenssisesta kationista testattiin. JY-solut eivät aggregoituneet (käytettäessä esimerkin 2 määritystä) kasvualustassa, joka ei sisältänyt kalsium- tai magnesiumioneja. Kaksivalenssisen magnesiumin lisääminen tuki aggregaatiota niinkin alhaisena ionipitoisuutena kuin 0,3 mM. Pelkästään kalsiumionien lisäämisellä oli vähäinen vaikutus. Kalsiumionien todettiin kuitenkin lisäävän magnesiumionien kykyä tukea PMA-indutoisua aggregaatiota. Kun kasvualustaan lisättiin pitoisuus 1,25 mM kalsiumioneja, niin alhaisten magnesiumionipitoisuuksien kuin 0,02 mM todettiin tukevan aggregaatiota. Nämä tulokset osoittavat, että solujen LFA-1-riippuvainen aggregaatio edellyttää magnesiumioneja ja että kalsiumionit, vaikkakin yksinään riittämättömiä, voivat vaikuttaa synergisesti magnesiumionien kanssa aggregaatiota edistäen.

ESIMERKKI 8

Hybridoomasolujen eristys, jotka kykenevät ilmentämään ICAM-l-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita ICAM-l:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita eristettiin Rothleinin, R., et ai .. J. Immunol, 137 (1986) • 1270 - 1274, menetelmän mukaan, jolloin mainittu viite on sisällytetty tähän viitteeksi. Täten 3 BALB/c-hiirtä immunoi-tiin vatsaontelonsisäisesti EBV-transformoiduilla ääreisveri-yksitumasoluilla, jotka oli saatu yksilöstä, jolta puuttui LFA-1 (Springer, T.A., et ai., J.Exper.Med. 160 (184) 1901).

Kussakin immunoinnissa käytettiin noin 107 solua kohden 102181 42 millilitraa RPMI 1640 -kasvualustaa. Immunointiruiskeet annettiin 45, 29 ja 4 päivää ennen kuin hiiristä otettiin pernasoluja haluttujen hybridoomasolulinjojen tuottamiseksi. Päivänä 3 ennen pernasolujen ottoa hiirille annettiin vielä 107 solua 0,15 ml:ssa kasvualustaa (laskimonsisäisesti).

Edellä kuvatuista eläimistä eristetyt pernasolut fuusioitiin P3X73Ag8.653-myeloomasoluihin suhteessa 4:1 Galfren, G., et ai .. Nature 266 (1977) 550, menettelyn mukaan. Näytteitä saaduista hybridoomasoluista sijoitettiin 96 kuopan mikrotiitterilevyille. Hybridoomasupernatantit seulottiin aggregaatio-inhibition suhteen ja yksi inhiboiva hybridooma (testatusta 600 kuopasta) kloonattiin ja aiakloonattiin käyttäen rajaavan laimentamisen tekniikkaa. Tämä alaklooni nimettiin RR1/1.1.1:ksi (tästäeteenpäin merkitty "RRl/l").

Monoklonaalisen vasta-aineen RRl/l todettiin toistettavalla tavalla inhiboivan LFA-l:n ilmentävän solulinjan JY PMA:lla stimuloitua aggregaatiota. RRl/l-monoklonaalivasta-aine inhiboi aggregaatiota samanasteisesti, tai hieman vähemmän, kuin jotkut LFA-l-alfa-/-beeta-alayksiköiden vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet. Sitä vastoin HLA:n, joka ilmentyy runsaasti JY-soluilla, vastaiset verrokkimonoklonaalivasta-aineet eivät inhiboineet aggregaatiota. Monoklonaalisen vasta-aineen RRl/l sitoma antigeeni määritellään solujen väliseksi kiinnikemole-kyyli-l:ksi (ICAM-1).

ESIMERKKI 9 ICAii-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö ICAM-l-molekyyIin karakterisoimiseksi ICAM-1:n luonteen määrittämiseksi ja erityisesti sen määrittämiseksi, poikkesiko ICAM-1 LFA-l:stä, soiuproteiineja immuuni-saostettiin käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta RRl/l. Immuunisaostus suoritettiin Rothleinin, R., et ai. (J. Immunol.

102181 43 137 (1986) 1270 - 1274) menetelmän mukaan. JY-soluihin tuotettiin lyysi niiden pitoisuudessa 5 x 107 solua/ml liuoksessa, jossa oli 1 % Triton X-100 -valmistetta, 0,14 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, ja juuri ennen käyttöä lisättävä 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, käyttäen 0,2 yksikköä/ml trypsiini-inhibiittoria aprotiini (lyysipuskurissa) 20 minuutin ajan 4 °C:ssa. Lysaatteja sentrifugoitiin 10 000 x g:ssä 10 minuutin ajan, minkä jälkeen ne esikirkastettiin lisäämällä 50-%:isena suspensiona 50 mikrolitraa CNBr-aktivoitua, glysiinillä sammutettua Sepharose C1-4B -geeliä, jolloin käsittelyaika oli 1 tunti 4 °C:ssa. Yksi millilitra lysaattia immuunisaostettiin lisäämällä 20 mikrolitraa 50-%:ista suspensiota, jossa oli monoklonaalista vasta-ainetta RR1/1 kytkettynä Sepharose C1-4B-hartsiin (1 mg/ml), jolloin käsittelyaika oli yön yli 4 °C:ssa (Springer, T.A., et ai., J.Exper.Med. 160 (1984) 1901).

Sepharoseen sidottu monoklonaalinen vasta-aine valmistettiin käyttäen Sepharose Cl-4B:n CNBr-aktivointia karbonaattipusku-rissa Marchin, S., et ai. (Anal.Biochem. 60 (1974) 149) menetelmän mukaan. Pestyillä immuunisakoilla suoritettiin SDS-PAGE ja hopeavärjäys Morrisseyn, J.H., Anal.Biochem. 117 (1981) 307, menettelyn mukaan.

Kun proteineja oli eluoitu SDS-näytepuskuri11 a (Ho, M.K., et ai., J.Biol.Chem. 258 (1983) 636=, 100 °C:ssa, näytteet jaettiin puoliksi ja niillä suoritettiin elektroforeesiajo (SDS-8 % PAGE) pelkistävissä (kuvio 5A) tai ei-pelkistävissä (kuvio 5B) olosuhteissa. Nauhat, joiden molekyylipaino on 50 kd:tä ja 25 kd:tä, vastaavat immunoglobuliinien monoklonaali-vasta-aine-Sepharosesta raskasta ja kevyttä ketjua (kuvio 5A, vyöhyke 3). Havaittiin myös vaihtelevia määriä muita nauhoja 25 - 50 kd -painoalueella, mutta niitä ei esiintynyt sakoisssa, jotka olivat peräisin karvaisista leukemiasoluista, joista saatiin vain 90 kd:n molekyylipainonauha. LFA-l:n 177 kd:n alfa-alayksikön ja 95 kd:n beeta-alayksikön todettiin migroituvan eri tavalla kuin ICAM-1 sekä pelkistävissä (kuvio 102181 44 5A, vyöhyke 2) että ei-pelkistävissä (kuvio 5B, vyöhyke 2) olosuhteissa.

Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 vaikutuksen PHÄ-varhais-imusolu-aggregaatioon määrittämiseksi käytettiin esimerkissä 2 kuvattua kvantitatiivista aggregaatiomääritystä. Täten T-soluemosoluja stimuloitiin 4 päivän ajan PHA:lla, minkä jälkeen ne pestiin perusteellisesti ja kasvatettiin sitten 6 päivän ajan IL-2:lla käsitellyssä kasvualustassa. PHA:n todettiin sisäistyvän tämän 6 päivän mittaisen viljelyn aikana, ja se ei myötävaikuttanut aggregaatiomääritykseen. Kolmessa eri määrityksessä erilaisilla T-soluemosoluvalmisteilla ICAM-1-monoklo-naalivasta-aineet inhiboivat aggregaatiota toistettavalla tavalla (taulukko 2).

102181 45 TAULUKKO 2 PMA-stimuloidun PHA-varhaisimusoluaggregaation inhibitio RRl/l-monoklonaalivasta-aineella» % %

Koe PMA MAb Aggregaatio inhibitio b lc - Verrokki g + Verrokki 51 0 + HLA-A^B 58 -14d + LFA-l-'alf a 31 39 + ICAM-1 31 39 2e - Verrokki >' 10 + Verrokki 78 0 + LFA-l-^beta 17 78 . + ICAM-1 50 36 3f - — 7 + Verrokki 70 + HLA-Α,Β 80 -14 + LFA-3 83 -19 + LFA-l-alfa 2 97 + LFA-l-beta 3 96 + ICAM-1 34 51 «PHA-indusoitujen varhaisimusolujen aggregaatio, jota stimuloitiin 50 ng:lla/ml PMA:ta, kvantitoitiin epäsuorasti laskemalla mikroskoopin avulla ei-aggregoitujen solujen lukumäärä kuten kuvattu esimerkissä 2.

bInhibitio-% verrattuna soluihin, joita käsiteltiin PMA:11a ja X63-monoklonaalivasta-aineella.

«Aggregaatio mitattiin tunnin kuluttua siitä, kun oli samanai-, kaisesti lisätty monoklonaalinen vasta-aine ja PMA. Soluja ravisteltiin 175 kierr./min kierrosnopeudella.

^Negatiivinen luku merkitsee aggregaation prosentuaalista tehostumista.

102181 46 •Aggregaatio mitattiin tunnin kuluttua siitä, kun oli samanaikaisesti lisätty monoklonaalinen vasta-aine ja PMA.

Soluja pelletoitiin 200 x g:ssä 1 min ajan, niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 15 minuutin ajan, minkä jälkeen ne uudelleenlietet-tiin varovaisesti ja ravisteltiin 45 minuutin ajan 100 kierr./ min kierrosnopeudella.

^Soluja esikäsiteltiin PMA:lla 4 tunnin ajan 37 °C:ssa. Sitten kun monoklonaalinen vasta-aine oli lisätty, putkien sisältöä inkuboitiin 37 °C:ssa ravistelematta 20 minuutin ajan ja sitten ravistellen 100 minuutin ajan 75 kierr./min kierrosnopeudella.

LFA-1-monoklonaalivasta-aineet olivat toistettavalla tavalla voimakkaammin inhiboivia kuin ICAM-1-monoklonaalivasta-aineet, kun taas HLA A -, B - ja LFA-3-monoklonaalivasta-ainei1 la ei ollut vaikutusta. Nämä tulokset osoittavat, että testatuista monoklonaalisistä vasta-aineista vain LFA-l:een tai ICAM-l:een sitoutumaan kykenevät kykenivät estämään solukiinnitystä.

ESIMERKKI 10 ICAM-l-vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen valmistus Immunointi BALB/c-hiiri immunoitiin vatsaontelonsisäisesti (i.p.) ruiskuttamalla 0,5 ml:n erinä 2 x 107 JY-solua RPMI-kasvualustassa 103 ja 24 päivää ennen fuusiota. Päivinä 4 ja 3 ennen fuusiota hiiriä immunoitiin ί.ρ. 107 PMA-differentioidulla U937-solulla 0,5 ml:ssa RPMI-kasvualustaa.

U937-soluien differentiaatio U937-soluja (ATCC CRL-1593) differentioitiin inkuboimalla niitä pitoisuutena 5 x 105/ml RPMIrssä, joka sisälsi 10 % nautasikiö-seerumia, 1 %:n glutamiinia ja 50 mikrogrammaa/ml gentamysiiniä 102181 47 (täydellinen kasvualusta), joka sisälsi 2 ng/ml forboli-12-myristaattiasetaattia (PMA), steriilissä polypropyleenias-tiassa. Tämän inkuboinnin 3. päivänä puolet kasvualustat!la-vuudesta poistettiin ja korvattiin tuoreella täydellisellä ja PMA:ta sisältävällä kasvualustalla. Päivänä 4 solut poistettiin, pestiin ja valmisteltiin immunointia silmälläpitäen.

Fuusio

Immunoiduista hiiristä saadut pernasolut fuusioitiin P3x63 Ag8.653 -myeloomasoluihin suhteessa 4:1 Galfren et ai., (Nature 266 (1977) 550) mukaan. Fuusioinnin jälkeen solut maljoitettiin 96 kuopan tasapohjaisiin mikrotiitterilevyihin pitoisuudeksi 10* pernasolua/kuoppa.

ICAM-l-vastaisina positiivisten solujen valinta

Viikon kuluttua 50 mikrolitraa supernatanttia seulottiin esimerkin 2 mukaisessa kvalitatiivisessa määrityksessä käyttäen sekä JY- että SKW3-soluja aggregoituvina solulinjoina. Solut supernatanteista, jotka inhiboivat JY-solu-aggregaatiota mutta eivät SKW3-solu-aggregaatiota, valittiin ja kloonattiin 2 kertaan käyttäen rajaavan laimentamisen menetelmää.

Tällä kokeella saatiin tunnistetuksi ja sittemmin kloonattiin kolme erillistä hybridoomasolulinjaa, jotka tuottivat ICAM-1-vastaisia monoklonaalisiä vasta-aineita. Näiden hybridoomasolu-linjojen tuottamat vasta-aineet olivat IgG2a, IgG2b ja vastaavasti IgM. Hybridoomasolulinja, joka tuotti ICAM-l-vastaista vasta-ainetta IgG2a, nimettiin nimellä R6'5'D6'E9'B2 . Edullisen hybridoomasolulinjän tuottama vasta-aine nimettiin nimellä R6'5'D6'E9'B2 (tässä nimellä "R6-5-D6").

102181 48 ESIMERKKI 11 ICAM-l:n ilmennys ja säätely ICAM-l:n ilmentymisen mittaamiseksi kehitettiin radio-immuunimääritys. Tässä määrityksessä puhdistettua RRl/l:tä jodattiin käyttäen jodogeenia, jonka spesifinen aktiivisuus oli 10 mikrocurie-yksikköä/mikrogramma. Endoteelisoluja kasvatettiin 96 kuopan levyillä ja käsiteltiin kuten kuvattu kullekin kokeelle. Maljat jäähdytettiin 4 °C:seen sijoittamalla ne kylmähuoneeseen 0,5-1 tunniksi, eikä (siis) välittömästi jäihin. Solu-yksikerrokset pestiin 3x kylmällä täydellisellä kasvualustalla ja inkuboitiin sitten 30 minuutin ajan 4 °C:ssa 125I-RR1/1:1lä. Solu-yksikerrokset pestiin sittten 3x täydellisellä kasvualustalla. Sitoutunut 3-251 vapautettiin käyttäen 0,1 N natriumhydroksidiliuosta ja laskettiin. X25I-RRl/l:n spesifinen aktiivisuus säädettiin käyttäen ei-1eimattua RRl/l:tä lineaarisen signaalin saamiseksi tässä tutkimuksessa tavatuilla antigeenitiheyksi1lä. Ei-spesifinen sitoutuminen määritettiin lOOOx ylimäärän ei-leimattua RRl/l:tä läsnäollessa ja saatu arvo vähennettiin kokonaissitoutumisesta spesifisen sitoutumisen saamiseksi.

ICAM-l-ilmennys, edellä kuvatulla radioimmuunimäärityksellä mitattuna, kasvaa ihmisen napalaskimon endoteelisolui11 a (HUVEC) ja ihmisen alaraajan iholaskimon endoteelisolui11 a (HSVEC) IL-l:n, TNF:n, LPS:n ja IFN-gamman vaikutuksesta (taulukko 3). Alaraajan iholaskimon endoteelisoluja käytettiin tässä tutkimuksessa napalaskimon endoteelisoluilla saatujen tuloksien varmistamiseksi viljellyissä suuren laskimon endoteel isol uissa , jotka oli saatu täysikasvuisen henkilön kudoksesta. ICAM-l:n perusilmennys on 2x korkeampi alaraajan iholaskimon endoteelisoluilla kuin napalaskimon endoteelisoluilla. Altistettaessa napalaskimon endoteelisolut yhdistelmä-IL-l-alfalle, -IL-l-beetal1 e ja -TNF-gammal1 e ICAM-l-ilmennys kasvoi 10 - 20 kertaisesti. IL-l-aifa, TNF ja LPS olivat te- 102181 49 hokkainunat indusorit ja IL-1 oli vähemmän tehokas painosta laskettuna ja myös vasteen kyllästyspitoisuuksina (taulukko 3). IL-l-beeta pitoisuutena 100 ng/ml lisäsi ICAM-1-ilmennystä 9-kertaisesti HUVEC-soluilla ja 7,3-kertaisesti HSVEC-soluilla, jolloin puolimaksimaalinen kasvu saatiin pitoisuudella 15 ng/ml. rTNF pitoisuutena 50 ng/ml lisäsi ICAM-l-ilmennystä 16-kertaisesti HUVEC-soluilla ja 11-kertaisesti HSVEC-soluilla, jolloin puolimaksimaalinen vaikutus saatiin pitoisuudella 0,5 ng/ml. Interferoni-gamma tuotti merkittävän kasvun ICAM-1-ilmennykseen, joka oli 5,2-kertainen HUVEC-solui1 la tai 3,5-kertainen HSVEC-soluilla, pitoisuudessa 10 000 U/ml. LPS:n vaikutus pitoisuutena 10 mikrogrammaa/ml oli samaa suuruusluokkaa kuin rTNF:n. Näiden välittäjien yhdistäminen pareittain johti additiivisiin tai additiivista hieman alhaisempiin vaikutuksiin ICAM-l-ilmennykseen (taulukko 3). Ristititraa-malla rTNF rIL-l-beetalla tai rlFN-gammalla ei saatu syner-gismiä näiden optimin alapuolisten tai optimaalisten pitoisuuksien välille.

Koska LPS nosti ICAM-l-ilmennystä endoteelisoluilla pitoisuuksina, joita joskus esiintyy kasvualustassa, mahdollisuutta, että perus-ICAM-l-ilmennys johtuisi LPS:stä, tutkittiin. Testattaessa useampia seerumieriä todettiin, että alhaisen endotoksiinipitoisuuden käsittävä seerumi antoi 25 % alhaisemman ICAM-l-pohjailmennyksen. Kaikki tässä ilmoitetut tulokset oli saatu endoteelisoluilla, joita kasvatettiin alhaisen endotoksiinipitoisuuden käsittävässä seerumissa. Kuitenkin lisäämällä LPS:ää neutraloivaa antibioottia poly-myksiini-B pitoisuutena 10 mikrogrammaa/ml ICAM-l-ilmennys laski enää vain 25 % (taulukko 3). ICAM-l-ilmennyksen kasvuun IL-1r11ä tai TNFrllä käsiteltäessä ei vaikuttanut 10 mikro-gramman/ml polymyksiini-B:tä läsnäolo, mikä sopii yhteen näiden valmisteiden käsittämien alhaisten endotoksiinitasojen kanssa (taulukko 3).

102181 50 TAULUKKO 3 ICAM-l-vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet ' f 125j , spesifisesti sidottu

Tila (16 h) HUVEC HSVEC ’(tuike/min.) verrokki 603 + 11 - 1132 + 31 100 ng/ml rIL-1 beta 5680 + 633 9x 8320 +766 7.3x 50 ng/ml rIL-l-alfa 9910 + 538 16x 50 ng/ml rTNF alfa 9650 + 1500 16x 12690 ±657 11.2x 10 fig/ml LPS 9530 + 512 16x 10459 + 388 9.2x 10 ng/ml rlFN gamma 3120 + 308 5.2x 4002 + 664 3.5x rIL-1 beta + rTNF 1469 + 1410 24x 16269 + 660 14x rIL-1 beta + LPS 13986 + 761 . 23x 10870 + 805 lOx rIL-1 beta + rlFN gamma 7849 + 601 13x 8401 +~390 7.4x rTNF + LPS 15364 + 1241 24x 1614Γ+ 1272 14x rTNF + rlFN gamma 13480 + 1189 22x 13238 + 761 12x LPS + IFN gamma 10206 + 320 17x 10987 + 668 lOx polymytsiini B(10ug/ml) 480+23 polymytsiini B + rIL-1 5390% 97 llx polymytsiini. B + rTNF 9785 + 389 20x 1 /zg/ml,LPS 7598 + 432 13x polymytsiini B + LPS 510 + 44 l.lx ICAM-1-ilmennyksen säätäminen ylöspäin HVEC- ja HUVEC-soluilla HUVEC- tai HSVEC-soiuja maljoitettiin 96 kuopan levyille suhteessa 1:3 yhteenkasvaneesta solu-yksikerroksesta ja annettiin kasvaa yhteen. Sitten soluja käsiteltiin mainituilla materiaaleilla tai kasvualustalla 16 tunnin ajan, minkä jälkeen suoritettiin RIA-määritys kuten menetelmien yhteydessä esitetty. Kaikki määrityslukemat ovat 4-kertaisista rinnakkaismäärityksistä.

102181 51 ESIMERKKI 12 ICAM-l:n interleukini-1- ja gamma-interferoni-induktion kinetiikka

Interleukiini-1:n ja gamma-interferonin vaikutuksien ICAM-1-ilmennykseen ihon sidekudosmuodostussoluilla kinetiikkaa tutkittiin käyttäen vuohen 2-251-1 eimattua anti-hiiri-IgG-vasta-aine-sitoutumismääritystä, Dustin, M.L., et ai.

(J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254; joka viite sisällytetään tähän viitteeksi). Tämän sitoutumismäärityksen suorittamiseksi ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin 96 kuopan mikrotiitterilevyllä tiheyteen 2 - 8 x 104 solua/kuoppa (0,32 cm2). Solut pestiin kahdesti RPMI 1640 -kasvualustalla, jota oli täydennetty kuten kuvattu esimerkissä 1. Solut pestiin vielä kerran Hankin tasapainoitetulla suolaliuoksella (H8SS), jossa oli pitoisuudet 10 mM Hepes, 0,05 % NaN3, ja 10 % lämpöinaktivoitua nautasikiöseerumia. Pesu tällä sitoutumis-puskurilla suoritettiin 4 °C:ssa. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 mikrolitraa edellä kuvattua sitoutumispuskuria ja 50 mikro-litraa sopivaa hybridoomasupernatanttia, jolloin negatiivisena ja positiivisena verrokkina käytettiin X63:ea ja vastaavasti W6/32:ta. Kuoppien sisältöä inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 °C:ssa samalla kevyesti ravistellen, minkä jälkeen kuopat pestiin kahdesti sitoutumispuskurilla ja toista vasta-ainetta, vuohen 125I-leimattua anti-hiiri-IgG:tä, lisättiin pitoisuus 50 nCi/100 mikrolitraa. Vuohen 2-251-leimattu hiirivastainer. vasta-aine valmistettiin käyttäen Iodogen-valmistetta (Pierce) Frakerin, P.J. et ai. (Biochem.Biophvs.Res.Commun. 80 (1978) 849) menetelmän mukaan. 30 minuutin 4 °C:ssa kuluttua solut pestiin kahdesti 200 mikrolitralla sitoutumispuskuria ja solukerros tehtiin liukoiseksi lisäämällä 100 mikrolitraa 0,1 N natriumhydroksidiliuosta. Tämä ja 100 mikrolitran pesuerä laskettiin Beckmanin malli 5500 gamma-laskijalla. Sitoutuneet spesifiset tuikkeet/min laskettiin kaavasta [tuiketta/min monoklonaalivasta-aineella] - [tuiketta/min X63:lla]. Kaikki 102181 52 vaiheet, mukaan lukien indusointi spesifisillä reagensseilla, suoritettiin 4-kertaisin rinnakkaismäärityksin.

Interleukiini-1:n, jonka puoliintumisaika ICAM-l-induktiossa on 2 tuntia, vaikutus oli nopeampi kuin gamma-interferonin, jonka puoliintumisaika on 3,75 tuntia (kuvio 6). Aikakäyrä paluussa ICAM-l-lepotasoille vaikutti riippuvan solusyklistä tai solu-kasvunopeudesta. Lepotilassa olevissa soluissa interleukiini-l:n ja gamma-interferonin vaikutukset ovat stabiileja 2-3 päivän ajan, kun taas log-faasiviljelmissä ICAM-l-ilmennys pysyttelee lähellä pohjatasoa 2 päivää näiden indusorien poistamisen jälkeen.

Kuviossa 7 on esitetty annos-vastekuvaajät ICAM-1-induktiolle yhdistelmä-hiiri- ja yhdistelmä-humaani-interleukiini-1:1lä ja yhdistelmä-humaani-gamma-interferonilla. Gamma-interferonilla ja interleukiini-1:llä todettiin olevat samankaltaiset pitoi-suusriippuvuudet, jolloin vaikutukset pitoisuudessa 1 ng/ml olivat lähes identtiset. Humaani- ja hiiri-yhdistelmä-inter-leukiini-1:1lä oli niinikään samankaltaiset kuvaajat, mutta ne ovat paljon vähemmän tehokkaita kuin humaani-interleukiini-1-valmisteet ICAM-l-ilmennyksen indusoinnissa.

Sykioheksamidi, joka inhiboi proteiinisynteesiä, ja aktinomy-siini-D, joka inhiboi mRNA-synteesiä, tuhoavat sekä interleukiini-1 :n että gamma-interferonin vaikutukset ICAM-l-ilmen-nykseen sidekudosmuodostussoluilla (taulukko 4). Lisäksi tunikamysiini, joka inhiboi N-kytkenteistä glykosylaatiota, inhiboi interleukiini-1:n vaikutusta vain 43 %:lla. Nämä tulokset osoittavat, että proteiini- ja mRNA-synteesi, mutta ei N-kytkenteinen glykosylaatio, ovat edellytyksiä interleukiini-1- ja gamma-interferoni-stimuloiduille ICAM-l-ilmennyksen nousuille.

102181 53 TAULUKKO 4

Sykloheksimidin, aktinomysiini-D:n ja tunikamysiinin vaikutukset ICAM-l-induktioon IL-l:llä ja gamma-IFN: 1 lä ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluilla*

~Vuohen 125I-anti-hiiri-IgG

spesifinen sitoutuminen (tuike/ _ min.

Käsittely_anti-ICAM-1 TiTtT-HLA-A.B.C

Verrokki (4 h) 1524 + 140 11928 + 600 + sykloheksimidi 1513 + 210 10678 + 471 + aktinomysiini D 1590 + 46 12276 + 608 + tunikamysiini 1461 + 176 12340 + 940 IL 1 (10 U/ml) (4 h) 4264 + 249 12155 + 510 + sykloheksimidi 1619 + 381 12676 + 446 + aktinomysiini D 1613 + 88 12294 + 123 + tunikamysiini 3084 + 113 13434 + 661 IFN-y (10 U/ml) (18 h) 4659 + 109 23675 ± 500 + sykloheksimidi 1461 + 59 10675 + 800 + aktinomysiini D 1326 + 186 12089 + 550 •Ihmisen sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x 104 solua/0,32 cm2 kuoppa. Käsittelyt suoritettiin 50 mikrolitran lopputilavuudessa, joka sisälsi mainitut reagenssit. Sykloheksimidiä, aktinomysiini-D:tä ja tunikamysiinia lisättiin pitoisuus 20 mikrogrammaa/ml, 10 mikro-M ja vastaavasti 2 mikrogrammaa/ml sytokiinien kanssa samanaikaisesti. Kaikki lukemat ovat keskiarvoja 4-kertaisista rinnakkaismäärityksistä, +/- SD.

102181 54 ESIMERKKI 13 ICAM-1:n kudosjakauma

Kudosopilliset tutkimukset suoritettiin käyttäen jäädytettyä humaani-elinkudosta ICÄM-l:n jakauman määrittämiseksi kateen-korvassa, imusolmukkeissa, suolessa, ihossa, munuaisissa ja maksassa. Tällaisen analyysin suorittamiseksi normaaleista ihmiskudoksista peräisin olevia jäädytettyjä kudosleikkeitä (paksuus 4 mikrometriä) kiinnitettiin asetonissa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen ne värjättiin monoklonaaliset la vasta-aineella RR1/1 immunoperoksidaasitekniikaa käyttäen, jolloin suorituksessa käytettiin avidiini-biotiinikompleksimenetelmää (Vector Laboratories, Burlingame, CÄ), jota kuvaavat Cerf-Bensussan, N., et ai . (J.Immunol. 130 (1983) 2615). Vasta-aineella inkuboinnin jälkeen leikkeitä inkuboitiin toisiaan seuraten biotinyloidulla hevosen anti-hiiri-IgG:1lä ja avidiini-biotinyloiduilla peroksidaasikomplekseilla. Leikkeet kastettiin lopuksi liuokseen, jossa oli 3-amino-9-etyylikar-batsolia (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) värireaktion kehittämiseksi. Leikkeitä kiinnitettiin sitten 4-prosenttisessa formaldehydi liuoksessa 5 minuutin ajan, minkä jälkeen ne vastavärjättiin hematosykliini1lä. Verrokkeina käytettiin leikkeitä, joita inkuboitiin ei-sukulaismonoklo-naaiivasta-aineilla RRl/l-vasta-aineen asemesta.

ICAM-l:n jakauma todettiin hyvin samanlaiseksi kuin pääasiallisen kudosyhteensopivuuskompleksin (MHC) luokka-II-antigeenien. Suurin osa verisuonista (sekä pienistä että suurista) kaikissa kudoksissa osoitti endoteelisolujen värjääntymistä ICAM-l-vasta-aineella. Verisuonten endoteelivärjäys oli voimakkaampaa follikkelien välisillä (parakortikaali-) alueilla imusolmukkeissa, risoissa ja Peyerin imusolmukkeissa kuin munuaisten, maksan ja normaalin ihon verisuonissa. Maksassa värjäys oli valtaosin rajoittunut hiussuonipoukamavuorisolui-hin; maksasolut ja endoteelisolut valtaosan portti 1askimoista 102181 55 ja -valtimoista seinämissä eivät olleet värjääntyneet.

Rateenkorvaytimessä havaittiin suurien solujen diffuusia värjääntymistä ja dendriittinen värjäyskuvio. Korteksissa värjäyskuvio oli paikallinen ja ja pääasiassa dendriittinen. Kateenkorvasolut eivät värjääntyneet. Ääreisimukudoksessa sekundaaristen imurakkuloiden imusolmuke-itusolut olivat voimakkaasti värjääntyneet. Joissain imurakkuloissa värjäys-kuvio oli valtaosin dendriittinen, jolloin imusolujen näkyvää värjääntymistä ei ollut todettavissa. Havaittiin myös solujen heikkoa värjääntymistä vaippavyöhykkeellä. Lisäksi sytoplas-majatkeita käsittävät dendriittisolut (interdigitaatio-retikulosolut) ja pieni osuus imusoluista follikkelien välisillä tai parakortikaali-alueilla värjääntyivät ICAM-l:n sitovalla vasta-aineella.

Syöjäsoluja muistuttavat solut värjääntyivät imusolmukkeissa ja ohutsuolen keskikerroksessa. Useimpien tutkittujen elimien peruskudokseen hajaantuneet sidekudosmuodostussolujen kaltaiset (kierteen muotoiset) solut ja dendriittisolut värjääntyivät ICAM-l:n sitovalla vasta-aineella. Värjääntymistä ei havaittu Langerhans/indeterminanttisoluissa orvaskedessä. Värjääntymistä ei havaittu sileälihaskudoksessa.

Epiteelisolujen värjääntymistä todettiin toistettavalla tavalla risojen limakalvossa. Vaikka maksasolut, sappitiehytepiteeli, suolen epiteelisolut ja putkimaiset epiteelisolut munuaisissa eivät värjääntyneet useimmissa tapauksissa, normaalimuruaisku-• dosleikkeet, jotka oli saatu munuaissolusyöpäliitteisestä *. munuaisenpoistonäytteestä, osoittivat monien proksimaali- putkisolujen ICAM-l-värjääntymistä. Nämä putkiepiteelisolut värjääntyivät myös HLÄ-DR-vastaisella sitoutumisvasta-aineella.

Yhteenvetona ICÄM-1 ilmentyy ei-vertamuodostavilla soluilla kuten verisuonten endoteelisolut ja vertamuodostavilla soluilla 102181 56 kuten kudoksen syöjäsolut ja mitogeeni-stimuloidut T-imusolu-emosolut. ICAM-l:n todettiin ilmentyvän alhaisina pitoisuuksina ääreisveren imusoluilla.

ESIMERKKI 14 ICAM-l:n puhdistaminen monoklonaalivasta-aine-affiniteettikromatografialla

Puhdistuksen vleiskaavio ICAM-1 puhdistettiin humaanisoluista tai -kudoksesta käyttäen monoklonaalivasta-aine-affiniteettikromatografiaa. Monoklonaa-linen vasta-aine, RR1/1, joka reagoi ICAM-1:n kanssa, puhdistettiin ensin ja kytkettiin sitten inerttiin kolonnimatriisiin. Tätä vasta-ainetta kuvaavat Rothlein, R., et ai .. J. Immunol.

137 (1986) 1270 - 1274, ja Dustin, M.L., et ai. (J.Immunol. 137 (1986) 245). ICAM-1 liuotettiin solumembraaneista tuottamalla soluihin lyysi ei-ionisessa pesuaineessa, Triton X-100, lähellä neutraalia olevassa pH:ssa. Liuenneen ICAM-l:n sisältävä solu-lysaatti käytettiin sitten esikolonneissa, joiden tehtävänä oli poistaa materiaaleja, jotka sitoutuvat ei-spesifisesti kolonni-matriisimateriaaliin, ja sitten monoklonaalivasta-ainekolonni-matriisin läpi, jotta ICAM-1 saattoi sitoutua vasta-aineeseen. Sitten vasta-ainekolonni pestiin sarjalla pesuaine-pesupusku-reita, joiden pH kasvoi aina 11,0:aan. Näiden pesujen aikana ICAM-1 pysyi sitoutuneena vasta-ainematriisiin, kun taas ei-sitoutuvia ja heikosti sitoutuneita epäpuhtauksia poistui. Sitoutunut ICAM-1 eluoitiin sitten spesifisesti kolonnista käyttämällä pesuainepuskuria, jonka pH oli 12,5.

Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 puhdistaminen ja kovalentti kytkeminen Sepharose C1-4B -geeliin ICAM-l-vastainen monoklonaalinen vasta-aine RR1/1 puhdistettiin hybridooman käsittävien hiirien vatsaontelonesteestä tai hybri- 102181 57 doomaviljelmäsupernatan-teista tavanomaisilla tekniikoilla ammoniumsulfaatilla seostamalla ja käyttämällä proteiini-A-affiniteettikromatografiaa (Ey, et ai.. Immunochem. 15 (1978) 429). Puhdistettu IgG, tai rotan IgG:tä (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO) kytkettiin kovalentisti Sepharose C1-4B -geeliin (Pharmacia, Upsala, Ruotsi) käyttäen muunnosta Marchin et ai. (Anal.Biochem. 60 (1974) 149) menetelmästä. Lyhyesti, Sepharose C1-4B pestiin tislatulla vedellä, aktivoitiin käyttäen 40 mg/ml CNBr:ää 5 M kaliumvetyfosfaattiliuoksessa (pH noin 12) 5 minuutin ajan ja pestiin sitten perusteellisesti 0,1 mM kloorivetyhapolla 4 °C:ssa. Suodatettu aktivoitu Sepharose uudelleenlietettiin vastaavaan tilavuuteen puhdistettua vasta-ainetta (2 - 10 mg/ml 0,1 M natriumvetykarbonaattiliuoksessa, 0,1 M NaCl). Lietettä inkuboitiin 18 tunnin ajan 4 °C:ssa pyörittäen kevyesti ympäri. Sitten supernatantista tutkittiin ei-sitoutuneen vasta-aineen läsnäolo mittaamalla absorbanssi 280 nm:n aallonpituudella, ja aktivoidun Sepharosen jäljellä olevat reaktiiviset keskukset kyllästettiin lisäämällä glysiiniä pitoisuuteen 0,05 M. Kytkentäteho oli tavallisesti > 90 %.

Ihmisen pernasta valmistettujen membraanien liuottaminen pesuaineella

Kaikki operaatiot suoritettiin 4 °C:ssa. Jäädytetyt ihmisen pernat (200 g:n fragmentteina), jotka oli saatu karvainen solu-leukemiaa potevista potilaista, sulatettiin jäissä 200 ml:ssa Tris-suolaiiuosta (50 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH 7,4, 4 °C), jossa oli pitoisuus 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), 0,2 U/ml aprotiinia ja 5 mM jodoasetamidia. Kudos leikeltiin pieniksi palasiksi ja homogenoitiin 4 °C:ssa Tekmar-tehohomogenisaattorissa. Tilavuus täytettiin sitten 300 ml:ksi lisäämällä Tris-suolaliuosta ja lisättiin 100 ml 10-%:ista Tween 40 - (polyoksietyleenisorbitaanimonopalmitaatti-) liuosta Tris-suolaliuoksessa, jolloin Tween 40 -valmisteen loppupitoi- 58 102181 suudeksi tuli 2,5 %. ,

Membraanien valmistamiseksi homogenaattia uutettiin käyttäen kolmea iskua Dounce-, tai edullisemmin Teflon Potter Elvejhem -homogenisaattorissa, minkä jälkeen sentrifugoitiin 1000 x g:ssä 15 minuutin ajan. Supernatantti otettiin talteen ja pellettiä uutettiin toistamiseen 200 ml :11a 2,5-%:ista Tween 40 -liuosta Tris-suolaliuoksessa. Seosta sentrifugoitiin 1000 x g:ssä 15 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantit kummastakin uutosta yhdistettiin ja niitä sentrifugoitiin 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan membraanien pel1etoimiseksi. Membraanit pestiin uudelleen-liettämällä 200 ml:aan Tris-suolaliuosta sentrifugoiden 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Membraanipelletti uudelleenlietettiin 200 ml:aan Tris-suolaliuosta ja homogenoitiin moottorikäyttöisessä homogenisaattorissa käyttäen Teflon-survinta, kunnes liete oli tasaisen samea. Sitten tilavuus täytettiin 900 mlrksi lisäämällä Tris-suolaliuosta ja lisättiin N-lauroyylisarkosii-nia loppupitoisuuteen 1 %. Seosta sekoitettiin 4 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen ei-liukoinen materiaali pesuaine-lysaatissa poistettiin sentrifugoimalla 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Sitten supernatanttiin lisättiin Triton X-100-valmistetta loppupitoisuuteen 2 % ja lysaattia sekoitettiin 4 °C:ssa 1 tunnin ajan.

JY-B-varhaisimusoluIen pesuaine-1iuotus EBV-transformoitua B-varhaisimusolulinjaa JY kasvatettiin RPMI 1640 -kasvualustassa, joka sisälsi pitoisuudet 10 % vasikansi-kiöseerumia (FCS) ja 10 mM Hepes, solutiheyteen noin 0,8 -1,0 x 10« solua/ml. ICÄM-l:n solupintailmennyksen lisäämiseksi lisättiin forboli-12-myristaatti-13-asetaattia (PMA:ta) pitoisuuteen 25 ng/ml 8-12 tunniksi ennen kuin solut otettiin talteen. Viljelmiin lisättiin tällöin myös natriumvanadaattia (50 mikro-M). Solut pelletoitiin sentrifugoimalla 500 x g:ssä 10 minuutin ajan ja pestiin sitten kahdesti Hankin tasapainoi- 59 102181 tetulla suolaliuoksella (HBSS) uudelleenliettämällä ja sentrifugoimalla. Soluihin (noin 5 g 5 litrassa viljelmää) tuotettiin lyysi 50 ml:ssa lyysipuskuria (0;14 NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0, 1 % Triton X-100, 0,2 U/ml aprotiini, 1 mM PMSF, 50 mikro-M natriumvanadaatti) sekoittamalla 4 °C:ssa 30 minuutin ajan. Ei-lyysin läpikäyneet tumat ja ei-liukoinen jäte sentrifugoitiin eroon 10 000 x g:ssä 15 minuutissa, minkä jälkeen supernatanttia sentrifugoitiin 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan ja suodos suodatettiin Whatmanin 3 mm:n suodatinpaperin läpi.

ICAM-l:n affiniteettikromatoorafia silmälläpitäen rakennetutkimuksia ICAM-l:n puhdistamiseksi suuressa mittakaavassa rakennetutkimuksissa käytettäväksi käytettiin kolonnia, jossa oli 10 ml RRl/l-Sepharose C1-4B -geeliä (kytkentä 2,5 mg vasta-ainetta/ ml geeliä) ja kahta esikolonnia, joissa oli 10 ml CNBr-aktivoitua, glysiinillä sammutettua Sepharose C1-4B -geeliä ja rotta-IgG:tä kytkettynä Sepharose C1-4B -geeliin (2 mg/ml). Kolonnit kytkettiin sarjaksi ja esipestiin 10 koi onnitilavuudella lyysipuskuria, 10 kolonnitilavuudella pH 12,5 -puskuria (50 mM trietyyliamiini, 0,1 % Triton X-100, pH 12,5, 4 °C), minkä jälkeen niitä tasapainoitettiin 10 kolonnitilavuudella lyysipuskuria. Yksi litra ihmispernan pesuainelysaattia panostettiin virtausnopeudella 0,5 - 1,0 ml/min. Kahta esikolonnia käytettiin ei-spesifisesti sitoutuneen materiaalin poistamiseksi lysaatista ennen sen käyttämistä RRl/l-Sepharose-kolon-nissa.

Panostuksen jälkeen koi onni, jossa oli RRl/l-Sepharose ja siihen sitoutunut ICAM-1, pestiin toisiaan seuraten virtausnopeudella 1 ml/min vähintään 5 kolonnitilavuudella kutakin seuraavaa liuosta: 1) lyysipuskuri, 2) 20 mM Tris, pH 8,0/0,14 M NaCl/0,1 % Triton X-100, 3) 20 mM glysiini, pH 10,0/0,1 % 102181 60

Triton X-100, ja 4) 50 mM trietyyliamiini, pH 11,0/0,1 % Triton X-100. Kaikki pesupuskurit sisälsivät pitoisuuden 1 mM PMSF ja 0,2 O/ml aprotiinia. Pesun jälkeen jäljelle jäänyt sitoutunut ICAM-1 eluoitiin 5 kolonnitilavuudella eluointipuskuria (50 mM trietyyliamiini/0,1 % Triton X-100/pH 12,5, 4 °C) virtausnopeudella 1 ml/3 min. Eluoitu ICÄM-1 kerättiin 1 ml:n fraktioina ja neutraloitiin välittömästi lisäämällä 0,1 ml liuosta 1 M Tris, pH 6,7. ICAM-l:tä sisältävät fraktiot identifioitiin suorittamalla SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi 10 mikrolitran erille (Springer et ai., J.Exp.Med. 160 (1984) 1901), ja sen jälkeen hopeavärjäys (Morrissey, J.H., Anal.Biochem. 117 (1981) 307). Näissä olosuhteissa valtaosa ICAM-l:stä eluoitui noin 1 kolonnitilavuudessa ja sen puhtausaste oli yli 90 % hopealla värjätyistä elektroferogrammeista arvioiden (pääasiallinen epäpuhtaus oli pieni määrä IgG:tä, joka oli vuotanut affini-teettimatriisista). ICAM-l:tä sisältävät fraktiot yhdistettiin ja niitä konsentroitiin noin 20-kertaisesti käyttäen Centricon-30-mikrokonsentraattoreita (Amicon, Danvers, MA). Puhdistettu ICAM-1 kvantitoitiin suorittamalla Lowryn proteiinimääritys etanolilla saostetusta poolinäytteestä: 200 g:sta ihmisen pernaa saatiin tuotettua noin 500 mikrogrammaa puhdasta ICAM-1: tä.

Noin 200 mikrogrammalla puhdistettua ICAM-1:tä suoritettiin toinen puhdistusvaihe käyttäen preparatiivista SDS-polyakryy-liamidigeelielektroforeesia. ICAM-l:tä vastaava nauha tehtiin näkyväksi liottamalla geeliä 1 M kaliumkloridiliuoksessa. ICAM-l:n sisältävä geeli-alue leikattiin sitten irti ja sillä suoritettiin elektroeluutio Hunkapillerin et ai., Meth.Enzvmol. 91 (1983) 227 - 236, menetelmän mukaan. Puhdistetun proteiinin puhtausaste oli > 98 % SDS-PAGE:n ja hopeavärjäyksen nojalla pääteltynä.

102181 61 ICAM-l:n affiniteettipuhdistus funktionaalisia tutkimuksia silmälläpitäen ICAM-l:tä käytettäväksi funktionaalisissa kokeissa puhdistettiin JY-solujen pesuainelysaateista edellä kuvatun mukaisesti, mutta pienemmässä mittakaavassa (1 ml:n kolonni, jossa RR1/1-Sepharosea), ja käyttäen seuraavia modifikaatioita. Kaikki liuokset sisälsivät pitoisuuden 50 mikro-M natriumvanadaattia. Kun kolonni oli pesty pH 11,0 -puskurilla, jossa oli 0,1 % Triton X-100 -valmistetta, kolonni pestiin jälleen viidellä kolonnitilavuudella samaa puskuria, joka sisälsi 1 %:n n-oktyyli-beeta-D-glukopyranosidia (oktyyliglukosidi) 0,1 %:n Triton X-100 -valmistetta asemesta. Oktyyliglukosidipesuaine korvaa ICAM-l:een sitoutuneen Triton X-100 -valmisteen ja vastoin kuin Triton X-100, se voidaan sittemmin poistaa dialysoimalla. ICAM-1 eluoitiin sitten pH 12,5 -puskurilla, jossa oli 1 % oktyyliglukosidia 0,1 %:n Triton X-100-valmis-tetta asemesta, minkä jälkeen se analysoitiin ja konsentroitiin kuten edellä kuvattu.

ESIMERKKI 15

Puhdistetun ICAM-1:n ominaisuudet

Ihmisen pernasta puhdistettu ICAM-1 migroituu SDS-polyakryy-liamidigeeleissä leveänä nauhana, jonka Mr on 72 000 - 91 000. JY-soluista puhdistettu ICAM-1 migroituu myös leveänä nauhana, jonka Mr on 76 500 - 97 000. Nämä Mr-arvot ovat eri soluläh-teistä immuunisaostetul1 e ICAM-l:lle ilmoitetulla alueella:

Mr = 90 000 JY-soluille, 114 000 myelomonosyyttisolulinjal1 e U937, ja 97 000 sidekudosmuodostussolui 11 e (Dustin et ai., J.Immunol. 137 (1986) 245). Tämä laaja M*-alue on katsottu johtuvaksi voimakkaasta mutta vaihtelevästä glykosylaatioas-teesta. Ei-glykosyloidun prekursorin Mr on 55 000 (Dustin et. ai.). Joko JY-soluista tai ihmisen pernasta puhdistetulla proteiinilla on tallella sen antigeeniaktiivisuus, minkä 102181 62 osoittavat sen kyky sitoutua uudelleen alkuperäiseen affini-teettikolonniin ja immuunisaostuminen RRl/l-Sepharose-geelissä ja SDS-polyakryyliamidielektroforeesi.

ICAM-l-peptidifragmenttien tuottamiseksi noin 200 mikrogrammaa pelkistettiin käyttäen seosta 2 mM ditiotreitoli/2 % SDS, minkä jälkeen alkyloitiin käyttäen 5 mM jodietikkahappoa. Proteiini saostettiin etanolilla ja uudelleenliuotettiin liuokseen 0,1 M NH4CO3/0,1 mM CaCl2/0,l % Zwittergent 3-14 (Calbiochem), minkä jälkeen sitä pilkottiin pitoisuudella 1 % w/w trypsiiniä 37 °C:ssa 4 tunnin ajan, minkä jälkeen pilkottiin edelleen 1 %:lla trypsiiniä 12 tunnin ajan 37 °C:ssa. Trypsiinipeptidit puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC:11ä käyttäen 0,4 x 15 cm:n C4-koionnia (Vydac). Peptidit eluoitiin käyttäen lineaarista gradienttia 0 % - 60 % asetonitriili/0,l-%:inen trifluorietik-kahappo. Valituilla peptideillä suoritettiin sekvenssianalyysi kaasufaasi-mikrosekventori1 la (Applied Biosystems). Tästä tutkimuksesta saatu sekvenssi-informaatio on esitetty taulukossa 5.

102181 63 TAULUKKO 5 ICAM-l-trvpsiinipeptidien aminohapposekvenssit Amino- Peptidi jfSnnÄU ~ 50a 50b 46a 46b X 45 K AA J U 0 Ml

1 [T/V] A (V/A) E V S LE ALV L

2 F SQ PEFNLGLTL/E

3 L IT ALPPDSGL P/(G)

4 T SF AA TL VI P

SV LP P P VR LE G/Y

6 Y G L LNTPVT N/L

7 P WP PVYQTP (N) 8 T P I I T/I G G C P/V (Q) 9 S F G (G) L - L S K (E) 10 E E (Q) - D E T (0)

11 A S D/P K S L S

12 G/S V V P F F C

13 A T DQSED

14 G V W V/L A - Q

15 I K T P

16 SK

17 A

18 P

19 X

20 Q

21 L

( ) = sekvenssi, jonka todennäköisyys on alhainen.

[ ] = sekvenssi, jonka todennäköisyys on hyvin alhainen.

/ = merkitsee epäselvyyttä sekvenssissä; todennäköisin aminohappo on merkitty ensimmäiseksi, a = runsaasti esiintyvä peptidi b = vähän esiintyvä peptidi 102181 64 ESIMERKKI 16 ICAM-l-geenin kloonaus ICAM-l-geeni voidaan kloonata käyttäen mitä tahansa lukuisista eri menettelyistä. Esimerkiksi aminohapposekvenssi-informaatiota, joka saatiin sekventoimalla ICAM-l-trypsiinifragment-teja (taulukko 5), voidaan käyttää oligonukleotidisekvenssin identifioimiseksi, joka vastaisi ICÄM-l-geeniä. Vaihtoehtoisesti ICAM-l-geeni voidaan kloonata käyttäen ICAM-l-vastaista vasta-ainetta ICAM-l:tä tuottavien kloonien tunnistamiseksi.

ICAM-l-geenin kloonaaminen käyttämällä oligonukleotidikoettimia Geneettistä koodia (Watson, J.D., Molecular Biology of the Gene. 3. painos, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977) hyödyntäen voidaan tunnistaa yksi tai useampi erilainen oiigonukleotidi, joista kukin kykenee koodittamaan ICAM-1-trypsiinipeptidejä. Todennäköisyyttä sille, että tietty oiigonukleotidi on todella tosiasiallinen ICAM-l:tä koodittava sekvenssi, voidaan arvioida tarkastelemalla epänormaali emäsparimuodostus -suhteita ja tiheyttä, jolla tiettyä kodonia tosiasiallisesti käytetään (tietyn aminohapon koodittamiseksi) eukaryoottisissa soluissa. Tällaisia "kodonikäytäntösääntöjä” julkistavat Lathe, R., et ai., J.Molec.Biol. 183 (1985) 1 - 12. Käyttämällä Lathen "kodonikäytäntösääntöjä" tunnistetaan yksittäinen oligonukleotidi, tai oiigonukleotidisarja, joka sisältää teoreettisen "todennäköisimmän" nukleotidisekvenssin (eli nukleotidisekvenssin, jonka runsaus on alhaisin), joka kykenee koodittamaan ICAM-l-trypsiinipeptidisekvenssejä.

Oiigonukleotidia, tai oiigonukleotidisarjaa, joka sisältää teoreettisen "todennäköisimmän" sekvenssin, joka kykenee koodittamaan ICAM-l-fragmentteja, käytetään kömpiementoivan oiigonukleotidin tai oiigonukleotidisarjän sekvenssin tunnistamiseksi, joka kykenee hybridoitumaan "todennäköisimpään" sekvenssiin, tai sekvenssisarjaan. Tällaisen kömpiementoivan 102181 65 sekvenssin sisältävää oligonukleotidia voidaan käyttää koettimena ICAM-l-geenin tunnistamiseksi ja eristämiseksi (Maniatis, T., et ai .. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982.

Kuten kuvattu osassa C, edellä, on mahdollista kloonata ICÄM-1-geeni eukaryoottisista DNA-valmisteista, joiden arvellaan sisältävän tämän geenin. ICAM-l-proteiinia koodittavan geenin tunnistamiseksi ja kloonaamiseksi DNA-kirjasto seulotaan sen kyvyn suhteen hybridoitua edellä kuvattuihin oligonukleotidi-koettimiin. Koska on todennäköistä, että normaali diploidinen solu käsittää ICAM-l-geenistä vain kaksi kopiota, ja koska on mahdollista, että ICAM-l-geeniin saattaa sisältyä suuria ei-transkriboituvia välisekvenssejä (introneja), joita ei haluta kloonata, edullisesti ICAM-l:tä koodittavat sekvenssit eristetään cDNA-kirjastosta, joka on valmistettu mieluummin ICAM-l:tä tuottavan solun mRNA:sta kuin genomi-DNA:sta. Sopiva DNA- tai cDNA-valmiste pilkotaan entsymaattisesti tai rikotaan umpimähkään ja ligatoidaan yhdistelmävektoreihin. Sen jälkeen mitataan näiden yhdistelmävektoreiden kyky hybridoitua edellä kuvattuihin oligonukleotidikoettimiin. Menettelyitä hybridoinnin suorittamiseksi esitetään esimerkiksi julkaisuissa Maniatis, T., Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982, tai Haymes, B.T., et al., Nucleic Acid Hybridization - A Practical Approach. IRL Press, Oxford, UK, 1985. Tällaiseen hybridoitumiseen kykeneviä vektoreita analysoidaan sitten niiden sisältämien ICAM-1-sekvenssien määrän ja laadun määrittämiseksi. Vain tilastollisten näkökohtien nojalla jokin geeni, kuten ICAM-l-molekyy-lin koodittava geeni, voitaisiin yksikäsitteisesti tunnistaa (hybridointiseulonnalla) käyttäen vain 18 oligonukleotidia sisältävää oligonukleotidikoetinta.

Täten yhteenvetona ICAM-l-peptidisekvenssien tosiasiallinen tunnistus mahdollistaa teoreettisen "todennäköisimmän" DNA- 102181 66 sekvenssin, tai tällaisten sekvenssien sarjan, joka kykenee koodittamaan tällaisen peptidin, tunnistuksen. Rakentamalla oligonukleotidi, joka kömpiementoi tätä teoreettista sekvenssiä (tai rakentamalla oligonukleotidisarja, joka komplementoi "todennäköisimpien" oiigonukleotidien sarjaa), saadaan DNA-molekyyli (tai DNA-molekyylisarja), joka kykenee toimimaan koettimena ICAM-l-geenin tunnistamiseksi ja eristämiseksi.

Käyttäen taulukon 5 mukaisia ICAM-l-peptidisekvenssejä oligonukleotidin, jolla on "todennäköisin" sekvenssi, sekvenssi, joka kykenee koodittamaan AA- ja J-peptidejä, tunnistettiin (taulukko 6 ja vastaavasti 7). Näitä sekvenssejä kömpiementoivia oligonukleotideja syntetisoitiin ja puhdistettiin käytettäviksi koettimina ICAM-l-geenisekvenssien eristämiseksi. Sopivia koon suhteen valikoituja cDNA-kirjastoja muodostettiin poly(A)+-RNA:sta, joka oli peräisin PMA:lla indusoiduista HL-60-soluista tai PS-stimuloiduista napalaskimo-endoteelisoluista. Koon suhteen valikoitu cDNA-kirjasto valmistettiin käyttäen poly(A)+-RNA:ta, joka oli saatu PMA-indusoi-duista HL-60-soluista, Gublerin, O., et ai. (Gene 25 (1983) 263 - 269) ja Corbin, A., et ai. (EMBO J. 6 (1987) 4023 -4028), jotka viitteet sisällytetään tähän viitteiksi, menetelmän mukaan.

Koon suhteen valikoitu cDNA-kirjasto valmistettiin käyttäen poly(A)+-RNA:ta, joka oli peräisin napalaskimo-endoteeliso-luista, joita oli stimuloitu 4 tunnin ajan PSrllä, 5 mikro-grammaa/ml. RNA uutettiin homogenoimalla solut 4 M guanidi-niumisotiosyanaatissa ja uitrasentrifugoimal1 a supernatantti CsCl-gradienttia käyttäen (Chirgwin, J.M., et ai.. Biochem. 18 (1979) 5294 - 5299). Poly(A)+-RNA eristettiin kokonais-RNA-lajiseoksesta käyttämällä oligo-(dT)-selluloosakromatografiaa (tyyppi 3, Collaborative Research) (Aviv, H., et ai.,

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 69 (1972) 1408 - 1412).

TAULUKKO 6 67 102181

Oligonukleotidi, joka kömpiementoi todennäköisintä nukleotidisekvenssiä, joka kykenee koodittamaan ICAM-1-AA-peptidin ICAM-l-AA- Todennököisin.AA- Komplemen- nohappo- peptidin koodit- toiva.sek- laannös. tava sekvenssi_venssi 5' 3'

162 Glu G C

A T

G C

163 Leu C G

T A

G C

164 Asp G C

A T

C G

165 Leu C G

T A

G C

166 Arg C G

G C

G C

167 Pro C G

C G

C G

168 Gin C G

A T

G C

169 Gly G C

G C

C G

170 Leu C G

T A

G C

171 Glu G C

A T

G C

172 Leu C G

T A

G C

173 Ph e T A

T A

T A

174 Glu G C

A T

G C

3' 5' / 68 102181 TAULUKKO 6 (jatk.) ICAM-ami- ICAM-1-AA- Todennököisin.AA- Komplemen- nohappo- peptidin koodit- toiva.sek- jäännös peptiux tava sekvenssi venssi

175 Asn A T

A T

C G

176 Thr A T

C G

C G

177 Ser U A

C G

A

3' 5' i ; i 102181 69 TAULUKKO 7

Oligonukleotidi, joka kömpiementoi todennäköisintä nukleotidisekvenssiä, joka kykenee koodittamaan ICAM-1-J-peptidin ICAM-1-AA- Todeunököisin.AA- Komplemen-nohappo- peptidi peptidin koodit- toiva.sek- jaannos pcpi-mx_tava sekvenssi_venssi _ 5' 3'

19 Vai G C

T A

G C

20 Thr A T

C G

C G

21 Cys T A

G C

C G

22 Ser T A

C G

C G

23 Thr A T

C G

C G

24 Ser T A

C G

C G

25 Cys T A

G C

T A

26 Asp G C

AT C G

27 Gin C G

A T

G C

28 Pro C G

C G

C G

29 lys A T

at 3' 5' 102181 70

Ensimmäinen cDNA-säie syntetisoitiin käyttäen 8 mikrogrammaa poly(A)+-RNA:ta, linnun myeloblastoosi-virus-käänteistransk-riptaasia (Life Sciences) ja oiigo(dT)-aluketta. DNA-RNA-hybridi pilkottiin RN-aasi-H:11a (BRL) ja toinen säie syntetisoitiin käyttäen DNA-polymeraasi-I:tä (New England Biolabs). Tuote metyloitiin EcoRI-metylaasilla (New England Biolabs), ja tasaiseksi saatetut päät ligatoitiin EcoRI-liittäjiin (New England Biolabs), minkä jälkeen pilkottiin EcoRI:llä ja valikoitiin koon mukaan alhaisen sulamispisteen omaavassa agaroosigeelissä. Kooltaan suuremmat cDNA:t kuin 500 ep:tä ligatoitiin lambda-gtlO:een, jota oli edeltäpäin pilkottu EcoRI:llä ja defosforyloitu (Stratagene). Ligatointituote pakattiin sitten (Stratagene-kulta).

Sitten napalaskimo-endoteelisolu- ja HL-60-cDNÄ-kirjastoja maljoitettiin pitoisuudeksi 20 000 pmy/150 mm:n malja. Yhdistelmä-DNA siirrettiin kaksinkertaisin rinnakkaismääri-tyksin nitroselluloosasuodattimille, denaturoitiin käyttäen 0,5 M NaOH/1,5 NaCl -liuosta, neutraloitiin lisäämällä 1 M Tris-puskuria, pH 7,5/1,5 M NaCl, ja paistettiin 80 °C:ssa 2 tunnin ajan (Benton, W.D., et ai.. Science 196 (1977) 180 - 182). Suodattimet esihybridoitiin ja sitten hybridoitiin 5XSSC:ssä, joka sisälsi 5X Denhardtin liuosta, 50 mM NaPCU ja 1 mikro-gramman/ml lohensperma-DNA:ta. Esihydridointi suoritettiin 45 °C:ssa ja sen annettiin kestää 1 tunnin.

Hybridoinnissa käytettiin 32 ep:n ( 5-TTGGGCTGGTCACAG-GAGGTGGAGCAGGTGAC) tai 47 ep:n (5'-GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGG GGCCGCAGGTCCAGCTC) ei-tieto-oligonukleotideja, joiden rakenne perustui edellä kuvatulla tavalla ICÄM-l-trypsiinipeptidiin J ja vastaavasti AA (taulukko 7 ja 6) (Lathe, R., J.Molec.Biol.

183 (1985) 1 - 12). 01igonukleotidien päät leimattiin gamma-(32P)ATP:1lä käyttäen T4-polynukleotidikinaasia ja valmistajan (New England Biolabs) suosittelemia olosuhteita. Suodattimia hybridoitiin yön yli, minkä jälkeen niitä pestiin kahdesti 102181 71 2XSSC/0,1 % SDS -liuoksella 30 minuutin ajan 45 °C:ssa. Fagit eristettiin niistä pesäkkeistä, joissa oli tapahtunut hybri-doitumista, minkä jälkeen niitä puhdistettiin maljoittamal1 a ja seulomalla useaan kertaan.

ICAM-l-aeenin kloonaaminen käyttämällä ICAM-l-vastaista vasta-ainetta ICAM-l-geeni voidaan vaihtoehtoisesti kloonata käyttämällä ICAM-l-vastaista vasta-ainetta. DNA:ta, tai edullisemmin cDNAtta, uutetaan ja puhdistetaan ICAM-l:n ilmentämään kykenevästä solusta. Puhdistettu cDNA fragmentoidaan (rikkomalla, endonukleaaseilla pilkkomalla, jne.) DNA- tai cDNA-fragmenttipoolin saamiseksi. Tämän poolin DNA- tai cDNA-fragmentit kloonataan sitten ilmennysvektoriin ilmennysvekto-rigenomikirjaston tuottamiseksi, jonka jäsenistä kukin sisältää yksittäisen kloonatun DNA- tai cDNA-fragmentin.

ESIMERKKI 17 cDNA-kloonien analysointi

Positiivisista klooneista saatu fagi-DNA pilkottiin EcoRI:llä ja sitä tutkittiin Southernin analysilla käyttäen yhden kloonin cDNA:ta koettimena. Ristihybridoituvat maksimikoon omaavat cDNA-insertit alakloonattiin plasmidivektorin pGEM4Z (Promega) EcoRI-keskukseen. cDNA:n kummankin suunnan mukaan suuntautuneena sisältävät HL-60-alakloonit tuhottiin pilkkomalla eksonukleaasi-III:1 la (Henikoff, S., Gene 28 (1984) 351 - 359) valmistajan (Erase-a-Base, Promega) suosituksia noudattaen. Asteittain tuhotut cDNA:t kloonattiin sitten ja niille suoritettiin dideoksinukleotidiketjupääsekventointi (Sanger, F., et ai.. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74 (1977) 5463 - 5467) valmistajan (Sequenase, U.S. Biochemical) ohjeiden mukaan. HL-60-cDNA:n 5'-ja koodialueet sekventoitiin täydellisesti kummastakin säikeestä ja 3'-alue sekventoitiin noin 70-%:isesti kummastakin 102181 72 säikeestä. Edustava endoteeli-cDNA sekventoitiin lähes koko pituudeltaan ”haulikko,,-kloonaamalla 4 ep:n tunnistusrestrik-tioentsyymifragmentteja.

Määritettiin yhden HL-60- ja yhden endoteelisolu-cDNA:n cDNA-sekvenssi (kuvio 8). 3023 ep:n sekvenssi sisältää lyhyen 5'-ei-translatoituvan alueen ja 1,3 ep:n 3'-ei-translatoituvan alueen, jolloin asemassa 2966 sijaitsee konsensus-polyadeny-laatiosignaali. Pisin avoin lukualue alkaa ensimmäisestä ATG-kodonista asemassa 58 ja päättyy TGA-lopetuskolmikkoon asemassa 1653. Koska translatoitu aminohapposekvenssi ja kahdeksasta (8) eri trypsiinipeptidistä, kaikkiaan 91 aminohappoa (alleviivattu kuviossa 8), määritetyt sekvenssit olivat samankaltaiset, varmistui, että oli eristetty autenttisia ICAM-l-cDNA-klooneja. ICAM-l-trypsiinipeptidien aminohapposekvenssit on esitetty taulukossa 8.

TAULUKKO 8 ICAM-l-trypsiinipeptidien aminohapposekvenssejä

Peptidi Jäännäkset Sekvenssi

J 14-29 XGSVLVTCSTSCOQPK

U 30-39 L L G I E T P L (P) (K)

50 78-85 (T) F L T V Y X T

X 89-95 V E L A P L P

AA 161-182 X ELDLRPQGIE --

LFEXTS A P X Q L

K 232-246 LNPTVTYGXDSFSAK

45 282-295 S F P A P N V (T/I) L X K P Q (V/L) — merkitsee, että sekvenssi jatkuu seuraavalla rivillä; alleviivattuja sekvenssejä käytettiin oiigonukleotidikoettimien valmistuksessa.

102181 73

Hydrofobisuusanalyysin (Kyte, J., et ai., J.Molec.Biol. 157 (1982) 105 - 132) tuloksien mukaan läsnä on 27 jäännöksen signaalisekvenssi. +l-glutamiinin sijoitus sopii siihen, ettemme onnistuneet saamaan N-pääsekvenssiä kolmelle eri ICAM-1-proteiinivalmisteelle; glutamiini mahdollisesti syklisoituu pyroglutamiinihapoksi, jolloin muodostuu salvattu N-pää. Translatoitu sekvenssi 1 - 453 on voittopuolisesti hydrofii-linen, jolloin sen jälkeen seuraa 24 jäännöksen hydrofobinen oletettu membraanin läpäisevä alue. Tätä membraanin läpäisevää aluetta seuraa välittömästi useita varauksen käsittäviä jäännöksiä, jotka sijoittuvat 27 alueen oletetulle sytoplasma-alueelle.

Kypsälle polypeptidiketjulle ennustettu koko on 55 219 daltonia, mikä sopii oikein hyvin deglykosyloidulle ICAM-l:lle saatuun kokoon 55 000 (Dustin, M.L., et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254). Ennustetaan 8 N-kytkenteistä glykosylaatio-keskusta. Asparagiinin puuttuminen trypsiinipeptidisekvens-seistä kahdessa näistä keskuksista varmistaa niiden glykosy-laation ja solunulkoisen orientaation. Jos korkean mannoosipi-toisuuden käsittävän N-kytkenteisen hiilihydraatin kooksi oletetaan 2500 daltonia, ICAM-l-prekursorin kokoennusteeksi saadaan 75 000 daltonia verrattuna havaittuun 73 000 daltoniin (Dustin, M.L., et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254). Kun korkean mannoosipitoisuuden käsittävä tuote on muutettu kompleksiseksi hiilihydraatiksi, kypsän ICAM-l-glykoproteiinin koko on 76 - 114 kd:tä, solutyypin mukaan (Dustin, M.L., et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254). Täten ICAM-1 on voimakkaasti glykosyloitu, mutta muutoin tyypillinen integraa-linen membraaniproteiini.

102181 74 ESIMERKKI 18 ICAM-1 on immunoglobuliinisupergeeniryhmän integriiniä sitova jäsen ICÄM-l:n sisäiset toistot asetettiin rinnan käyttäen Microgenie-proteiinisuuntausohjelmaa (Queen, C., et ai.,

Nucl.Acid Res. 12 (1984) 581 - 599), ja tulosta tarkasteltiin. ICAM-1 astettiin IgM:n, N-CAM:in ja MAG:in rinnalle käyttäen Microgenie- ja ALIGN-ohjelmaa (Dayhoff, M.O., et ai.. Meth.Enzymol. 91 (1983) 524 - 545). Neljässä proteiinisekvens-sitietokannassa, joita ylläpitää laitos the National Biomedical Research Foundation, suoritettiin atk-haut proteiinisekvenssi-yhtäläisyyksiä etsien Williamsin ja Pearsonin FASTP-ohjelmaa käyttäen (Lipman, D.J., et ai., Science 227 (1985) 1435 -1439).

Koska ICAM-1 on integriini-igandi sen kuuluminen immunoglobu-liinisupergeeniryhmään oli odottamatonta. Kuitenkin tarkastelemalla ICAM-l-sekvenssiä todetaan, että se täyttää kaikki kriteerit, jotka asetetaan immunoglobuliinisupergeeniryhmään kuulumiselle. Näitä kriteerejä puolestaan käsitellään alla.

ICAM-1:n solunulkoinen alue kokonaisuudessaan koostuu 5 homologisesta immunoglobuliinin kaltaisesta alueesta, jotka esitetään rinnakkain kuviossa 9A. Alueet 1-4 ovat pituudeltaan 88, 97, 99 ja vastaavasti 99 jäännöstä, ja edustavat siten tyypillistä Ig-aluekokoa; alue 5 on typistynyt 68 jäännökseen. Suoritettaessa atk-haku NBRF-tietokannassa FASTP-ohjelmalla todettiin merkittäviä homologioita immunoglobuliinisupergeeni-ryhmän jäseniin, mukaanlukien IgM- ja IgG-C-alueet, T-solure-septori-alfa-alayksikön vaihtuva alue ja ai fa-l-beeta-glyko-proteiini (kuvio 9B - D).

Edeltävää informaatiota käyttäen ICAM-1:n aminohapposekvenssiä verrattiin muiden immunoglobuliinisupergeeniryhmän jäsenien 102181 75 aminohapposekvensseihin.

Toisistaan erotetaan kolmen tyyppisiä Ig-superryhmäalueita, V,

Cl ja C2. Sekä V- että C-alueet koostuvat kahdesta beeta-levystä, jotka kytkee toisiinsa alueensisäinen disulfidisidos; V-alueet sisältävät 9 anti-paralleeli-beeta-säi'että, jolloin C-alueet puolestaan sisältävät 7. Pysyvät alueet jaettiin ryhmiksi Cl ja C2 kuviossa 9A esitettyjen tyypillisten jäännöksien nojalla. Cl-ryhmään kuuluu antigeenitunnistukseen liittyviä proteiineja. C2-ryhmään kuuluu useita Fc-reseptoreita ja proteiineja, jotka liittyvät solukiinnitykseen, mukaanlukien CD2, LFA-3, MAG ja NCAM. ICAM-l-alueiden todettiin olevan erittäin voimakkaasti homologisia C2-ryhmän alueisiin nähden, mikä osoitti ICAM-l:n tähän ryhmään; tämä heijastuu voimakkaampana samankaltaisuutena säilyviin jäännöksiin C2- kuin Cl-alueilla kuten esitetty beeta-säikeille B - F kuviossa 9.

Samoin ICAM-l-alueet asettuivat huomattavasti paremmin C2-alueiden beeta-säikeiden A ja G rinnalle kuin näiden säikeiden V- ja Cl-alueilla rinnalle, jolloin saatiin hyvä rinnanasetus kautta C2-alueen koko mitan. Rinnanasetukset C2-alueiden NCÄMrsta, MAG:sta ja alfa-l-beeta-glykoproteiinista kanssa on esitetty kuvioissa 9B ja 9C; samankaltaisuus vaihteli 28 %:sta 33 %:iin. Rinnanasetukset T-solureseptori-V-alfan kanssa, 27 %:n samankaltaisuus, ja IgM-C:n alue-3:n kanssa, 34 %:n samankaltaisuus, on niinikään esitetty (kuviot 9B, 9D).

Yksi immunoglobuliinialueiden tärkeimmistä ominaisuuksista ovat disulfidikytkenteiset kysteiinit, jotka yhdistävät sillalla B-ja F-beeta-säikeet, mikä stabiloi beeta-levyn "sanduich"-muotoon; ICAM-l:ssä kysteiinit säilyvät kaikissa tapauksissa lukuunottamatta alueen 4 säi’että f, jossa esiintyy leusiini, • ’ joka on mahdollisesti kääntynyt "sandwich,,-rakennetta kohden ja voi mahdollisesti stabiloida kontaktin, kuten esitetty joillekin muille V- ja C2-ryhmäalueille. Kysteiinien väliset etäisyydet (43, 50, 52 ja 37 jäännöstä) ovat kuten kuvattu C2- ! 76 102181 ryhmäl1 e.

Ketjunsisäisten disulfidisidoksien läsnäolon ICAM-l:ssä tutkimiseksi endoteelisolu-ICAM-1:1lä suoritettiin SDS-PAGE pelkistävissä ja toisaalta ei-pelkistävissä oiosuhteissa. Endoteelisolu-ICAM-1:tä käytettiin, koska se osoittaa vähemmän glykosylaatio-heterogeniaa kuin JY- tai karvainen solu -perna-ICAM-1 ja koska siinä Mr-siirtymät ovat herkempiä. ICAM-l:tä puhdistettiin siten 16 tunnin LPSrllä (5 mikrogrammaa/ml) stimuloiduista napalaskimo-endoteelisoluviljelmistä immuno-affiniteettikromatografisesti kuten edellä kuvattu. Asetonilla saostettu ICAM-1 uudelleenlietettiin näytepuskuriin (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680 - 685) käyttäen 0,25 % 2-merkaptoetanolia tai pitoisuutta 25 mM jodoasetamidi ja lämmitettiin 100 °C:seen 5 minuutiksi. Näytteillä suoritettiin SDS-PAGE 4670 -ajo ja hopeavärjäys 4613. Endoteelisolu-ICAM-1:n näennäinen Mr oli 100 kd:tä pelkistävissä olosuhteissa ja 96 kd:tä ei-pelkistävissä olosuhteissa, mikä viittaa voimakkaasti ketjunsisäisten disulfidien läsnäoloon natiivissa ICAM-l:ssä.

Käyttämällä primaarisekvenssiä sekundaarirakenteen ennustamiseksi (Chou, P.Y., et ai.. Biochem. 13 (1974) 211 - 245) todettiin 7 ennakoitua beeta-säi'että kussakin ICAM-1-alueessa, merkittyinä a - g kuviossa 9A ylhäällä, mikä täysin vastaa ennustetta immunoglobuliinialueesta ja vastaa säikeiden A - H asemia immunoglobuliineissa (kuvio 9A, alhaalla).

Alueelta 5 puuttuvat A- ja C-säikeet, mutta koska nämä muodostivat levyjen reunat, levyt voivat silti edelleen muodostua, mahdollisesti siten, että säie D asettuu säikeen C paikalle, kuten esitetty joillekin muille C2-alueille; jolloin karakteristinen disulfidisidos B- ja F-säikeiden välillä jäisi ennalleen. Täten kriteerit, jotka koskevat aluekokoa, sekvens-sihomologiaa, säilyviä kysteiinejä, jotka muodostavat oletetun alueensisäisen disulfidisidoksen, disulfidisidoksien läsnäoloa ja ennustettua beeta-levyrakennetta, on kaikki täytetty silmäl- 102181 77 läpitäen ICAM-l:n lukemista immunoglobuliinisupergeeniryhmään.

ICAM-l:n todettiin voimakkaimmin homologiseksi C2-sarjan glykoproteiineihin NCAM ja MAG nähden. Tämä on erityisen kiinnostavaa, koska sekä NCAM että MAG välittävät solu-solukiinnitystä. NCAM on tärkeä hermosolu-hermosolu- ja hermo-lihasvuorovaikutuksissa (Cunningham, B.A., et ai. . Science 236 (1987) 799 - 806), kun taas MAG on merkityksellinen hermosolu-oligodendrosyytti- ja oiigodendrosyytti-oligodendrosyyttivuo-rovaikutuksissa myelinaation aikana (Poltorak, M., et ai.. J.Cell.Biol. 105 (1987) 1893 - 1899). NCAM:n ja MAG:n solupintailmennys tulee kehityksen myötä säädellyksi hermoston muodostuksen ja vastaavasti myelinaation aikana analogisesti ICAM-l:n säädeltyyn induktioon tulehduksen aikana nähden (Springer, T.A., et ai .. Ann.Rev.Immunol. 5 (1987) 223 - 252). ICAM-1, NCAM (Cunnigham, B.A., et ai., Science 236 (1987) 799 -806) ja MAG (Salzer, J.L., et ai. . J.Cell.Biol. 104. (1987) 957 - 965) ovat samankaltaisia yleisrakenteeltaan sekä homologisia, koska kukin on integraalinen membraaniglykopro-teiini, joka koostuu viidestä C2-alueesta, jotka muodostavat N-pään solunulkoisen alueen, vaikka NCAM:ssa jonkin verran ylimääräistä ei-Ig-kaltaista sekvenssiä esiintyy viimeisen C2-alueen ja transmembraanialueen välissä. ICAM-1 asettuu koko pituudeltaan mukaanlukien transmembraani- ja sytoplasma-alueet MAG:n rinnalle, jolloin samankaltaisuus on 21 %; sama samankal-taisuus-% todetaan verrattaessa ICAM-1:n ja NCAM-l:n viittä aluetta. Kuviossa 10 on esitetty diagrammina ICAM-1:n ja MAG:n sekundaarirakenteet. Vertaamalla aluekohtaisesti todetaan, että ICAM-1- ja NCAM-molekyylien sisäisten alueiden välisen homolo-gian aste (x +/- s.d.; 21 +/- 2,8 % ja vastaavasti 18,6 +/- 3,8 %) vastaa homologiatasoa verrattaessa ICAM-l-alueita NCAM-ja MAG-alueisiin (20,4 +/- 3,7 ja vastaavasti 21,9 +/- 2,7). Vaikka löytyy todisteita siitä, että NCAM:n C-pää-alueil1 a tapahtuu vaihtoehtoista silmukoitumista (Cunnigham, B.A, et ai.. Science 236 (1987) 799 - 806; Barthels, D., et ai..

102181 78 EMBO J. 6 (19871 907 - 914), kuten myös MAG:n (Lai, C., et ai..

Proc.Nat 1. Acad. Sei . USA 84 (1987) 4377 - 4341), mitään todisteita tästä ei ole löydetty sekventoitaessa endoteeli- tai HL-60-ICAM-l-klooneja tai tutkittaessa ICAM-l-proteiinirunkoa ja -prekursoria eri solutyypeissä (Dustin, M.L., et ai..

J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254).

ICAM-1 toimii LFA-l:n ligandina imusoluvuorovaikutuksissa lukuisilla eri solutyypeillä. Imusolut sitoutuvat ICAM-l:een, joka on sisäistynyt keinotekoisiin membraanikaksikerroksiin, ja tämä edellyttää LFA-1:n läsnäoloa imusoluilla, mikä osoittaa suoraan LFA-1:n vuorovaikutuksen ICAM-l:n kanssa (Marlin, S.D., et ai.. Cell 51 (1987) 813 - 819). LFA-1 on valkosoluintegriini eikä sillä ole mitään immunoglobuliinin kaltaisia piirteitä. Valkosoluintegriinit käsittävät yhden integriinialaluokan. Muut kaksi alaluokkaa välittävät solu-matriisivuorovaikutuksia ja tunnistavat sekvenssin RGD 1igandeissaan, joita ovat fibronek-tiini, vitronektiini, kollageeni ja fibrinogeeni (Hynes, R.O., Cell 48 (1987) 549 - 554; Ruoslahti, E., et ai.. Science 238 (1987) 491 - 497). Valkosoluintegriinit ilmentyvät vain valkosoluilla, ja osallistuvat solu-soluvuorovaikutuksiin, jolloin ainoat tunnetut ligandit ovat ICAM-1 ja iC3b, joka on kömpiementtikomponentti-C3-fragmentti, joka ei osoita mitään immunoglobuliinin kaltaisia piirteitä ja jonka tunnistaa Mac-1 (Kishimoto, T.K., et ai .. Leukocyte Typing III; McMichael, M. (toim.), Springer-Verlag, New York (1987); Springer, T.A., et ai.. Ann.Rev.Immunol. 5 (1987) 223 - 252; Anderson, D.C., et ai.. Ann.Rev.Med. 38 (1987) 175 - 194). Sekventointianalyysin perusteella saatuja LFA-l:n mahdollisesti tunnistamia ICAM-1-sekvenssiin kuuluvia peptidejä on esitetty taulukossa 9.

102181 79 TAULUKKO 9 I CAM-1-sekvenssiin sisältyviä peptidejä, jotka LFA-1 mahdollisesti tunnistaa -L-R-G-E-K-E-L- -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P- -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E- -P-R-G-G-S- -P-G-N-N-R-K- -Q-E-D-S-Q-P-M- -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S- -R-R-O-H-H-G-A-N-F-S- -D-L-R-P-Q-G-l-E- ICAM-1 on ensimmäinen esimerkki immunoglobuliinisupergeeni-ryhmäjäsenestä, joka sitoutuu integriiniin. Vaikka molemmat nämä ryhmät esittävät tärkeää osaa solukiinnityksessä, niiden välisen vuorovaikutuksen toteaminen oli odottamatonta. Sitä vastoin vuorovaikutukset immunoglobuliinigeenisuperryhmän puitteissa ovat varsin tavallisia. On varsin mahdollista, että myöhemmin löydetään lisää esimerkkejä integriini- ja immuno-globoliiniryhmien välisistä vuorovaikutuksista. LFA-1 tunnistaa ICAM-l:stä poikkeavan ligandin (Springer, T.A., et ai..

Ann.Rev.Immunol. 5 (1987) 223 - 252) ja valkosoluintegriini Mac-1 tunnistaa C3bi:stä poikkeavan ligandin neutrofiili-neutrofii1ikiinnityksessä (Anderson, D.C., et ai.. Ann.Rev.Med.

38 (1987) 175 - 194). Lisäksi puhdistetut MAG:tä sisältävät rakkulat sitoutuvat MAG-pitoisiin hermoviejähaarakkeisiin, joten MAG:n on kyettävä heterofii1iseen vuorovaikutukseen . jonkin nimenomaisen reseptorin kanssa (Poltorak, M., et ai..

J.Cell.Biol. 105 (1987) 1893 - 1899).

NCAM:n osuuden hermosolu-hermosolu- ja hermosolu-lihassoluvuo-rovaikutuksissa on esitetty johtuvan homofiilisistä NCAM-NCAM- 102181 80 vuorovaikutuksista (Cunnigham, B.A., et ai.. Science 236 (1987) 799 - 806). MAG:n tärkeä rooli Schwannin solujen, jotka ympäröivät hermosolujen pitkää haaraketta myeliinitupen muodostuksen aikana, viereisten käänteiden välisissä vuorovaikutuksissa johtuu mahdollisesti vuorovaikutuksesta jonkin nimenomaisen reseptorin kanssa, tai homofiilisistä MAG-MAG-vuorovaikutuk-sista. Homologia NCAM:iin nähden ja alue-aluevuorovaikutuksien taajaan toistuva esiintyminen immunoglobuliinisupergeeniryh-mässä nostaa esiin mahdollisuuden, että ICAM-1 mahdollisesti osallistuu homofii1 isiin vuorovaikutuksiin sekä ICAM-l-LFA-1-heterofii1 isiin vuorovaikutuksiin. Kuitenkin B-varhaisimuso-lujen, jotka kanssailmentävät samanlaisia LFÄ-1- ja ICAM-1-tiheyksia, sitoutuminen ICAM-l:een keinotekoisissa faaseissa tai solu-yksikerroksissa voidaan estää täysin esikäsittelemäl1ä B-varhaisimusoluja LFA-l-MAb:1lä, kun taas kiinnitykseen ei vaikuta B-varhaisimusolujen esikäsittely ICAM-l-MAb:llä. Esi-käsittelemällä yksikerrosta ICAM-l-MAb:1lä tuhotaan sitoutuminen täysin (Dustin, M.L., et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 245 -254; Marlin, S.D., et ai.. Cell 51 (1987) 813 - 819). Nämä löydökset osoittavat, että jos ICAM-l-homofiilivuorovaikutuk-sia lainkaan esiintyy, niiden täytyy olla heikompia kuin heterofiiliset LFA-1-vuorovaikutukset.

Mahdollisuus, että valkosoluintegriinit tunnistavat ligandeja pohjimmaltaan täysin erilaisella tavalla, sopii 180 jäännöksen sekvenssin läsnäoloon niiden ai fa-alyksiköissä, jolla sekvenssillä saattaa olla merkitystä 1igandisitoutumisessa ja jota ei esiinny RGD:n tunnistavissa integriineissä (Corbi, A., et ai, EMBO J. 6 (1987) 4023 - 4028). Vaikka Mac-l:n on esitetty tunnistavan iC3b-5086:ssa esiintyvän RGD-sekvenssin, ICAM-1:een ei sisälly RGD-sekvenssiä (kuvio 8). Tämä sopii yhteen fibro-nektiinipeptidin GRGDSP ja verrokkipeptidin GRGESP kyvyttömyyden kanssa inhiboida ICAM-l-LFA-l-kiinnitystä (Marlin, S.D., et ai .. Cell 51 (1987) 813 - 819). Kuitenkin sukulaissekvenssit kuten PRGGS ja RGEKE esiintyvät ICAM-l:ssä alueilla, joiden 102181 81 ennustetaan muodostavat silmukan alueen 2 beeta-säikeiden a ja b väliin ja vastaavasti alueen 2 säikeiden c ja d väliin (kuvio 9) ja jotka täten ovat saatavilla tunnistusta varten. Kiinnostavaa on, että homologinen MÄG-molekyyli sisältää RGD-sekvens-sin alueiden 1 ja 2 välillä (Poltorak, M., et ai .. J. Cel1.Biol.

105 (1987) 1893 - 1899; Salzer, J.L., et ai .. J.Cell.Biol. 104 (1987) 957 - 965).

ESIMERKKI 19

Southern- ja Northern-blot-määritykset

Southernin blot-määritykset suoritettiin käyttäen 5 mikrogrammaa genomi-DNA:ta, joka oli uutettu kolmesta solulinjasta: BL2, Burkittin lymfomasolulinja (lahja Dr. Gilbert Lenoirilta); JY ja Er-LCL, jotka ovat EBV-transformoituja B-varhaisimusolusolu-linjoja.

DNA:t pilkottiin 5X valmistajan (New England Biolabs) suosittelemalla määrällä BamHI:tä ja EcoRI:tä. Pilkkomistuotteilla suoritettiin elektroforeesiajo 0,8-%:isessa agaroosigeelissä, minkä jälkeen DNA:t siirrettiin nylonkalvoi le (Zeta Probe,

BioRad). Suodatin esihybridoitiin ja sitten hybridoitiin noudatten vakiomenettelyitä käyttäen ICAM-cDNA:ta, joka oli peräisin HL-60:stä ja leimattu alfa-(32P)dX?P:eillä satunnaisalukemuodostusta käyttäen (Boehringer Mannheim). Northern-blot-määritykset suoritettiin käyttäen 20 mikrogrammaa kokonais-RNA:ta tai 6 mikrogrammaa poly(A)^-RNA:ta. RNA denaturoitiin ja sillä suoritettiin elektroforeesi-ajo 1 % agaroosi-formaldehydigeelissä, minkä jälkeen tuotteet siirrettiin sähköisesti Zeta Probe -kalvolle. Suodattimia esihybridoitiin ja sitten hybridoitiin kuten aiemmin kuvattu (Staunton, D.E., et ai.. EMBO J. 6 (1987) 3695 - 3701) käyttäen HL-60-cDNA-koetinta, joka käsitti 32P-1eimattuja oligonukleoti-dikoettimia (kuvattu edellä).

102181 82

Southernin blot-määrityksissä käyttäen 3 ep:n cDNA-koetinta ja genomi-DNA:ta, joka oli pilkottu BamHIrllä ja EcoRI:llä, esiintyi yksittäinen pääasiallinen hybridoituva fragmentti, ( jonka koko oli 20 ja vastaavasti 8 ep:tä, mikä viittaa yksittäiseen geeniin ja siihen, että suurin osa kooditiedosta sisältyy 8 ep:n palaseen. Kolmen eri solulinjan blot-määrityk-sissä ei ilmennyt mitään restriktiofragmenttipolymorfiaan viittaavaa.

ESIMERKKI 20 ICAM-l-geenin ilmennys "Ilmennysvektori" on vektori, joka (johtuen sopivien transkriptio- ja/tai translaatiosäätösekvenssien läsnäolosta) kykenee ilmentämään DNA- tai (cDNA-) molekyylin, joka on kloonattu vektoriin, ja siten tuottamaan polypeptidin tai proteiinin. Kloonatut sekvenssit ilmentyvät, kun ilmennys-vektori viedään sopivaan isäntäsoluun. Jos käytetään proka-ryoottista ilmennysvektoria, sopiva isäntäsolu olisi mikä tahansa prokaryoottinen solu, joka kykenee ilmentämään kloonattuja sekvenssejä. Vastaavasti jos käytetään euka-ryoottista ilmennysvektoria, sopiva isäntäsolu olisi mikä tahansa eukaryoottinen solu, joka kykenee ilmentämään kloonattuja sekvenssejä. Tärkeätä on, että koska eukaryoottinen DNA saattaa sisältää välisekvenssejä ja koska prokaryoottiset solut eivät kykene oikealla tavalla prosessoimaan tällaisia sekvenssejä, edullisesti käytetään cDNA:ta, joka on peräisin solusta, joka kykenee ilmentämään ICAM-l:n, prokaryoottinen genomi-ilmennysvektorikirjaston muodostamiseksi. Menettelyitä cDNA:n valmistamiseksi ja genomikirjaston tuottamiseksi julkistavat Maniatis, T., et ai. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982)).

Edellä kuvatun ilmennysvektorigenomikirjaston avulla muodos- 102181 83 tetaan isäntäsolupankki (jolloin jokainen solu sisältää kirjaston yhden jäsenen). Ilmennysvektori voidaan viedä isäntäsoluun millä tahansa lukuisista eri tavoista (eli transformoimalla, transfektoimalla, protoplastifuusiolla, elektroporaatiolla jne.). Ilmennysvektoripitoisten solujen muodostamaa pankkia lisäännytetään kloonaamalla ja sen jäsenet määritetään yksittäin (immuunimääritystä käyttäen) sen määrittämiseksi, tuottavatko ne proteiinia, joka kykenee sitoutumaan ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen.

Niiden solujen ilmennysvektoreita, jotka tuottavat ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen sitoutumaan kykenevää proteiinia, analysoidaan sitten edelleen sen määrittämiseksi, ilmentävätkö ne (ja siten sisältävät mainitun) ICAM-l-geenin kokonaisuudessaan, ilmentävätkö ne (ja siten sisältävät) vain ICAM-l-geeni-fragmentin, vai ilmentävätkö ne (ja siten sisältävät) geenin, jonka tuote, vaikkakin immunologisesti ICAM-l-sukuinen, ei ole ICAM-1. Vaikka tällainen analyysi voidaan suoritta millä tahansa kätevällä tavalla, edullisesti määritetään ilmennysvek-toriin kloonatun DNA- tai cDNA-fragmentin nukleotidisekvenssi. Näitä nukleotidisekvenssejä tutkitaan sitten sen määrittämiseksi, kykenevätkö ne koodittamaan polypeptidejä, joilla on sama aminohapposekvenssi kuin ICAM-1:n trypsiinipilkkomisfrag-menteilla (taulukko 5).

Ilmennysvektori, joka sisältää ICAM-l-geeniä koodattavan DNA-tai cDNA-molekyylin, voidaan siten tunnistaa (i) kyvystä ohjata proteiinin ilmennystä, joka kykenee sitoutumaan ICAM-l-vastai-seen vasta-aineeseen; ja (ii) nukleotidisekvenssin läsnäolosta, joka kykenee koodittamaan kutakin ICAM-1-trypsiinifragmenttia. Tällaisen ilmennysvektoriin kloonattu DNA-molekyyli voidaan poistaa ilmennysvektorista ja eristää puhtaana.

102181 84 ESIMERKKI 21

Puhdistetun ICAM-l:n funktionaalisia aktiivisuuksia

Soluissa ICAM-1 toimii normaalisti pintaproteiinina, joka liittyy solumembraaniin. Tämän vuoksi puhdistetun ICAM-1:n funktiota tutkittiin sen jälkeen, kun molekyyli oli rekonstruoitu keinotekoisiin lipidimembraaneihin (liposomeihin tai rakkuloihin) liuottamalla proteiini pesuaineeseen liuotettuihin lipideihin, minkä jälkeen pesuaine poistettiin dialysoi-malla. ICAM-1, joka oli puhdistettu JY-soluista ja eluoitu pesuaine-oktyyliglukosidiin kuten edellä kuvattu, rekonsti-tuoitiin rakkuloihin, ja ICAM-1:n sisältävät rakkulat fuusioitiin lasipäälilevyihin tai muovisiin viljelykuoppiin, jotta proteiiniin sitoutuvat solut kyettäisiin toteamaan.

Tasomembraanien ia muoviin sidottujen rakkuloiden valmistus

Rakkuloita valmistettiin Gayn et ai. (J. Immunol. 136 (1986) 2026) menetelmällä. Lyhyesti, munafosfatidyylikoliinia ja kolesterolia liuotettiin kloroformiin ja sekoitettiin moolisuhteessa 7:2. Lipidiseos kuivattiin ohueksi kalvoksi pyörittämällä typpikaasuvirrassa ja sitä kylmäkuivattiin sitten tunnin ajan viimeistenkin kloroformijäämien poistamiseksi. Lipidikalvo liuotettiin sitten liuokseen 1 % oktyyliglukosi-di/0,14 M NaCl/20 mM Tris (pH 7,2) 1oppupitoisuuteen 0,1 mM fosfatidyylikoliini. Noin 10 mikrogrammaa puhdistettua ICAM-l:tä tai humaani-glykoforiinia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) verrokkimembraaniglykoproteiinina lisättiin kohden kutakin millilitraa liuotettuja lipidejä. Proteiini-lipidi-pesuaine-liuosta dialysoitiin sitten 4 °C:ssa käyttäen 3 vaihtoa ja 200 tilavuutta liuosta 20 mM Tris/0,14 M NaCl, pH 7,2, ja yhtä vaihtoa HBSS:ää.

Tasomembraaneja valmistettiin Brianin et ai..

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81 (1984) 6159, menetelmällä.

102181 85

Lasipäälilevyjä (halkaisija 11 mm) keitettiin 15 minuutin ajan 1:6 laimennoksessa 7X pesuaineliuosta (Linbro), minkä jälkeen niitä pestiin yön yli tislatussa vedessä ja liotettiin sitten 70-%:isessa etanoli1iuoksessa sekä kuivattiin ilmassa. 80 mikrolitran pisara rakkulaliuosta, joka sisälsi joko ICAM-l:tä tai glykoforiinia, sijoitettiin kuoppien pohjalle 24 kuopan rykelmälevylle, ja valmistetut lasilevyt asetettiin varovaisesti niiden päälle. Noin 20 - 30 minuutin inkuboinnin huoneenlämpötilassa jälkeen kuopat täytettiin HBSSrllä ja päälilevyt käännettiin, jolloin tasomembraani tuli ylöspäin. Kuoppia pestiin sitten runsaalla määrällä HBSStää ei-sitoutu-neiden rakkuloiden poistamiseksi. Tasomembraanipintaa varottiin altistamasta ilmalle.

Lasipintoihin fuusioiduilla tasomembraanei11 a suoritettujen kokeiden puitteissa ICAM-l:tä sisältävien rakkuloiden todettiin sitoutuvan suoraan monikuoppa-kudosvi1jelylevyjen muovipintaan ja säilyttävän funktionaalisen aktiivisuutensa, minkä osoitti spesifinen solusitoutuminen. Tällaisia rakkuloita kutsutaan tästä eteenpäin "muoviin sidotuiksi rakkuloiksi" (PBV), koska muoviin sidottujen lipidirakkuloiden luonnetta ei ole selvitetty. Muoviin sidotut rakkulat valmistettiin lisäämällä 30 mikrolitraa rakkulasuspensiota suoraan kuoppien pohjalle 96 kuopan kudosviljelmälevyillä (Falcon), minkä jälkeen levyjä inkuboitiin ja kuopat pestiin kuten kuvattu tasomembraanei11 e.

Solukiinnitysmääritykset

Solukiinnitysmääritykset tasomembraaneja tai muoviin sidottuja rakkuloita käyttäen suoritettiin oleellisessa mielessä samalla tavalla lukuunottamatta, että soluluvut ja tilavuudet PBV-määrityksissä olivat 1/5 tasomembraanimäärityksissä käytetyistä.

T-imusoluja normaaleista verrokeista ja potilaasta, joka poti 102181 86 valkosolukiinitysvajausta (LAD) eikä siis kyennyt ilmentämään LFÄ-l:tä (Anderson, D.C., et ai.. J.Infect.Dis. 152 (1985) 668), valmistettiin viljelemällä ääreisveren yksitumasoluja 1 mikrogrammalla/ml konkanaval1iini-A:ta (Con-A) RPMI 1640-kasvualustassa, jota oli täydennetty 20 %:lla FCS:tä, pitoisuutena 5 x 105/ml 3 päivän ajan. Sitten solut pestiin kahdesti RPMIrllä ja kerran 5 mM metyyli-alfa-D-mannopyrano-sidiliuolsella 1ektiinijäämän poistamiseksi solupinnalta. Solut kasvatettiin RPMI/20 % FCS:ssä, joka sisälsi 1 ng:n/ml yhdis-telmä-IL-2:ta, ja niitä käytettiin 10. - 22. päivänä kasvatuksen aloittamisesta.

Solusitoutumisen tasomembraaneihin tai PBVrhen toteamiseksi Con-A-emosoluja, T-lymfoma-SKW3-soluja ja EBV-transformoituja B-varhaisimusolusolulinja-JY-soluja (LFA-l-positiivinen) ja LFA-l-vajaan varhaisimusolulinjän (BBN) soluja (jotka oli saatu potilaasta 1, Springer, T.A., et ai.. J.Exper.Med. 160 (1986) 1901 - 1918) leimattiin radioaktiivisesti inkuboimalla 1 x 107 solua 1 ml kohden RPMI-1640/10 % FCS:ää 100 mikrocurie-yksiköllä Na5lCr04:ää tunnin ajan 37 °C:ssa, minkä jälkeen ne pestiin 4 kertaan RPMI 1640 -kasvualustalla ei-sisäistyneen leiman poistamiseksi. Monoklonaalivasta-ainekokeissa soluja tai muoviin sidottuja rakkuloita esikäsiteltiin 20 mikrogrammal-la/ml puhdistettua vasta-ainetta RPMI-1640/10 % FCS:ssä 4 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen niitä pestiin 4 kertaan ei-sitoutuneen vasta-aineen poistamiseksi. Kokeissa, joissa tutkittiiin kaksivalenssisten kationien vaikutuksia solusitou-tumiseen, solut pestiin vain kerran HBSS:llä, joka ei sisältänyt Ca2+-, Mg2+-ioneja mutta sisälsi 10 % dialysoitua FCS:ää, ja CaCl:ää ja MgClrää lisättiin merkittyihin pitoisuuksiin. Kaikissa kokeissa soluja ja tasomembraaneja tai PBV:tä esita-sapainoitettiin sopivassa lämpötilassa (4 °C, 22 °C, tai 37 °C) sopivassa määrityspuskurissa).

Solusitoutumisen puhdistettuun ICAM-l:een mittaamiseksi 5lCr- 102181 87 leimattuja soluja (2 x 10* EBV-transformanttia tasomembraani-määrityksissä; 1 x 105 EBV-transformanttia tai SKW3-solua, 2 x 15* Con-A-emosolua PBV-määrityksissä) sentrifugoitiin 2 minuutin ajan 25 x g:ssä tasomembraaneihin tai PBV:hen, minkä jälkeen inkuboitiin 4 °C:ssa, 22 °C:ssa tai 37 «>C:ssa tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen ei-sitoutuneet solut poistettiin suorittamalla 8 kierrosta, joilla täytettiin ja imettiin pois puskuri, joka oli tasapainoitettu sopivaan lämpötilaan. Sitoutuneet solut kvantitoitiin liuottamalla kuoppasisäl1öt liuoksella 0,1 N NaOH/1 % Triton X-100, ja laskemalla gamma-laskijassa. Prosentuaalinen solusitoutuminen määritettiin jakamalla tuikkeet/min sitoutuneista soluista käytetyllä soluliitteisellä tuiketta/min -arvolla. Tasomembraanikokeissa käytettyjä tuikkeita/min -arvoa korjattiin siten, että otettiin huomiooon päälilevyjen pinta-alan suhde viljelykuoppien pinta-alaan.

Näissä määrityksissä EBV-transformoidut B-varhaisimusolut, SKW3-T-lymfomasolut ja Con-A-T-imusoluemosolut sitoutuivat spesifisesti ICAM-l:een keinotekoisilla membraanei11 a (kuviot 11 ja 12). Sitoutuminen oli spesifinen, koska solut sitoutuivat hyvin huonosti verrokkitasomembraaneihin tai rakkuloihin, jotka sisälsivät ekvivalenttisia määriä toista humaanisolupintaglyko-proteiinia, glykoforiinia. Lisäksi LFÄ-l-positiiviset EBV-transf ormantit ja Con-A-emosolut sitoutuivat, kun taas niiden LFA-l-negatiiviset vastineet eivät sitoutuneet mainittavassa määrin, mikä osoittaa, että sitoutuminen oli riippuvaista LFA-l:n läsnäolosta soluilla.

Sekä solusitoutumisen spesifisyys että riippuvuus solu-LFA-l:stä vahvistettiin monoklonaalisilla vasta-aineilla suoritetuissa salpauskokeissa (kuvio 13). JY-solujen sitoutuminen pystyttiin estämään 97-%:isesti kun ICAM-l-pitoiset PBV:t esikäsiteltiin ICAM-l-vastaisella monoklonaalisel1 a vasta-aineella RR1/1. Esikäsittelemällä soluja samalla vasta-aineella oli vähäinen vaikutus. Sitä vastoin LFA-l-vastainen monoklonaa- 102181 88 linen vasta-ainen TS1/18 esti sitoutumisen 96-%:isesti, mutta vain silloin kun solut, ei PBV, esikäsiteltiin. Verrokkivasta-aineella T2/9, joka reagoi LFA-3:n kanssa (toinen imusolupinta-antigeeni), ei ollut merkittävää inhiboivaa vaikutusta, kun joko solut tai PBV oli esikäsitelty. Tämä koe osoittaa, että keinomembraaneissa itse ICAM-1, eikä jokin vähäinen epäpuhtaus, välittää havaittua solukiinnittymistä ja että kiinnittyminen on riippuvainen LFA-l:n läsnäolosta sitovalla solulla.

Solujen sitoutuminen ICAM-l:een keinomembraanei11 a osoitti niinikään kahta muuta LFA-l-riippuvaisen kiinnitysjärjestelmän ominaisuutta: lämpötilariippuvuus ja kaksivalenssisten kationien tarve. Kuten esitetty kuviossa 14, Con-A-emosolut sitoutuivat ICAM-l:een PBVreissä erittäin tehokkaasti 37<>C:ssa, osittain 22 °C:ssa ja hyvin heikosti 4 °C:ssa. Kuten esitetty kuviossa 15, sitoutuminen oli täysin riippuvainen kaksivalenssisten kationien läsnäolosta. Fysiologisissa pitoisuuksissa Mg2+ yksinään oli riittävä maksimaaliselle solusitoutumiselle, kun taas Ca2+ yksinään aikaansai hyvin alhaisia sitoutumista-soja. Kuitenkin maksimaalinen sitoutuminen saatiin Mg2+:lla 1/10:na normaalista pitoisuudesta kun siihen oli yhdistetty Ca2+:aa, jonka vaikutus oli synergistinen.

Yhteenvetona solusitoutumisen puhdistettuun ICAM-1reen, joka on sisällytetty keinomembraaneihin, spesifisyys, monoklonaalisi1 la vasta-aineilla saatu spesifinen inhibitio ja lämpötilariippuvuus sekä riippuvuus kaksivaienssisista kationeista osoittavat, että ICAM-1 on LFÄ-l-riippuvaisen kiinnitys järjestelmän spesifinen ligandi.

ESIMERKKI 22 ICAM-1:n ja HLA-DR:n ilmennys yliherkkyys- ja myrkky1aastarikoereaktioissa

Viiden normaalin yksilön iho-otoksia tutkittiin niiden ICAM-1- 102181 89 ja HLA-DR-ilmennyksen osalta. Todettiin, että kun endoteeli-solut joissain verisuonissa tavallisesti ilmensivät ICAM-1:n, ICAM-1 ei ilmentynyt normaalista ihosta otetuilla keratinosyy-teillä. HLA-DR-värjääntymistä ei todettu yhdelläkään keratoni-syytillä, joka peräisin oli normaali-ihonäytteestä. Sitten tutkittiin ICÄM-1- ja luokka-II-antigeenien ilmennyksen kinetiikkaa soluilla, jotka oli saatu yliherkkyys- tai myrkkyvaikutusihovaurionäytteistä. Todettiin, että puolella kuudesta tutkitusta yksilöstä oli keratinosyyttejä, jotka ilmensivät ICAM-l:n, neljän tunnin kuluttua hapteenin levittämisestä (taulukko 10). ICÄM-l:n keratinosyyteillään ilmentävien yksilöiden prosentuaalinen osuus kasvoi altistusajan hapteenille funktiona, jolloin myös keratinosyyttiä kohden värjääntymisintensiteetti - joka osoitti ICAM-l-ilmennyksen lisääntymistä - kasvoi ajankohtaan 48 tuntia asti. Itse asiassa tänä ajankohtana tietty osuus keratinosyyteistä kaikissa kudosnäytteissä värjääntyi positiivisesti ICAM-1:llä. Ajankohtana 72 tuntia (24 tuntia sen jälkeen kun hapteeni oli poistettu) 7 kahdeksasta yksilöstä ilmensi edelleen ICAM-l:n keratinosyyteillään, jolloin kuitenkin ICAM-l:n ilmennys yhdellä yksilöllä poistui ajankohtien 48 ja 72 tuntia välillä.

90 102181 TAULUKKO 10 ICAM-1- ja HLA-DR-induktion kinetiikka keratinosyyteillä yliherkkyys1aastarikoenäytteistä

Aika laasta- Kudos- rin asetuk- näytteitä ICAM-1 HLA-DR ICAM-1& sen jälkeen (kpl) vain vain (h)

Normaali iho 5000

Yliherkkyys-laastarikoe 4 6 3a 0 0 8 9 3 0 0 24 8 7 0 0 48° 8 5 0 3 72 8 6 0 1 »Näytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt. bKaikki laastarit poistettiin tänä ajankohtana.

Kudosopil1isesti ICAM-l-värjääntymiskuvio keratinosyyteillä kudosnäytteistä, jotka otettiin neljän tunnin kuluttua hapteenin levittämisestä, oli tavallisesti pieninä rykelminä. Ajankohtana 48 tuntia ICAM-1 ilmentyi valtaosan keratinosyy-teistä pinnalla, jolloin minkäänlaista eroa ei havaittu vaurion keski- ja äärialueiden välillä. Värjääntymisen intensiteetti aleni keratinosyyttien lähestyessä ihon sarveiskerrosta. Tämä todettiin sekä vaurioiden keski- että äärialueilta otetuissa kudosnäytteissä. Samoin tänä ajankohtana laastarikoe oli positiivinen (vuotamista, punoitusta ja rakkuloita). ICAM-l-iImen-nyksessä ei havaittu mitään eroa käytettäessä herkillä yksilöillä eri hapteeneja. Keratinosyyttien ohella ICAM-1 ilmentyi 102181 91 myös joillakin yksitumasoluilla ja endoteelisoluilla vaurio-kohdassa.

HLA-DR-ilmennys keratinosyyteillä yliherkkyysihovaurioissa oli vähemmän yleistä kuin ICAM-l:n. Yhdelläkään tutkituista yksilöistä ei ollut vaurioita, joissa keratinosyytit värjääntyivät positiivisesti HLA-DR:lle, aina ajankohtaan 24 tuntia asti hapteenin käyttämisestä. Itse asiassa vain neljässä kudosnäytteessä oli keratinosyyttejä, jotka ilmensivät HLA-DR:n, eikä yhdessäkään kudosnäytteessä ollut keratinosyyttejä, jotka olisivat positiivisia HLA-DR:lle mutta eivät ICAM-l:lle (taulukko 10).

Vastoin kuin yliherkkyyslaastarikoevauriossa, myrkkylaastari-koevauriossa, joka oli indusoitu krotoniöljyllä tai natrium-lauryylisulfaatilla, esiintyi keratinosyyttejä, jotka osoittivat vain vähän, jos ollenkaan ICAM-l:tä pinnoillaan kaikkina testattuina ajankohtina (taulukko 11). Itse asiassa 48 tunnin kuluttua laastarin asettamisesta, joka ajankohta oli optimaalinen ICAM-l-ilmennykselle yliherkkyyslaastarikoeyksilöillä, vain yhdellä 14 myrkkylaastarikoehenkilöstä oli ICAM-l:n ilmentäviä keratinosyyttejä vaurioissaan. Samoin vastoin kuin yliherkkyyslaastarikoenäytteissä, myrkkylaastarikoevaurioissa keratinosyyteillä ei ilmentynyt lainkaan HLA-DR:ää.

Nämä tulokset osoittavat, että ICAM-1 ilmentyy immuunipohjäisessä tulehduksessa mutta ei myrkkypohjäisessä tulehduksessa, ja täten ICAM-l-ilmennystä voidaan käyttää immuunipohjäisen ja myrkkypohjäisen tulehduksen erottamiseksi toisistaan, kuten akuutin munuaisten toiminnan heikkenemisen munuaissiirtopoti-.· laissa tunnistamiseksi, koska on vaikeata määrätä, johtuuko toiminnan heikkeneminen hyljinnästä tai immuunivastetta heikentävän terapeuttisen aineen myrkkyvaikutuksista munuaiseen. Ottamalla kudosnäyte ja määrittämällä ICAM-1-ilmennyksen ylös-säätö voidaan erottaa toisistaan immuunipohjäinen hyljintä ja 102181 92 ei-immuunipohjäinen myrkkyreaktio.

TAULUKKO 11 ICAM-1- ja HLA-DR-induktion kinetiikka keratinosyytei1lä myrkkylaastarikoenäytteistä

Aika laas- Kudos- tarin ase- näytteitä tuksen jäi- (kpl) ICAM-1 HLA-DR I CAM -1 &

keen (h) vain vain HLA-OR

4 4 0 0 0 8 3 la o 0 24. 3 10 0 48b 14 1 o 0 ^2 3 1 o g «Näytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt. bKaikki laastarit poistettiin tänä ajankohtana.

ESIMERKKI 23 ICAM-1- ja HLA-DR-ilmennys hyvänlaatuisissa ihosairauksissa

Soluista, jotka oli otettu eri tyyppisiä ihon tulehdussairauksia potevien potilaiden ihovaurionäytteistä, tutkittiin niiden ICAM-1- ja HLA-DR-ilmennys. Osa keratinosyyteistä näytteissä, jotka olivat peräisin yliherkkyyskosketusihottumasta, rakkula-ihottuman kaltaisesta ihottumasta/rakkulaihottumasta ja ihon punajäkälätaudista, ilmensivät ICAM-1:n. Ihon punajäkälätau-tinäytteet osoittivat voimakkainta värjääntymistä, jolloin kuvio oli samankaltainen tai jopa voimakkaampi kuin se, joka havaittiin 48 tunnin yliherkkyyslaastarikoenäytteillä (taulukko 12). Yhtäpitävästi tuloksien kanssa, jotka saatiin yliherkkyys- 102181 93 laastarikokeessa, intensiivisin ICAM-l-värjääntyminen todettiin kohdissa, joissa oli tapahtunut voimakasta yksitumasoluvuota-mista. Lisäksi 8 tutkituista 11 punajäkälätautinäytteestä oli positiivista HLA-DR-ilmennyksel1 e keratinosyytei11ä.

ICAM-l-iImennys keratinosyyteillä, jotka oli saatu tulehdus-ihottumaa tai nokkosrokkoa potevien potilaiden kudosnäytteistä, oli vähemmän ilmeinen. Vain neljällä tutkituista 7 potilaasta, joilla oli jompikumpi näistä sairauksista, oli keratinosyyt-tejä, jotka ilmensivät ICAM-l:n vauriokohdassa. HLA-DR-ilmennystä tavattiin vain yhdellä potilaalla ja se esiintyi ICAM-l:n yhteydessä.

Endoteelisolut ja osa yksitumasoluvuodosta kaikista tutkituista hyvänlaatuisista ihon tulehdussairauksista ilmensivät ICAM-l:n vaihtelevissä määrin.

94 102181 TAULUKKO 12 ICAM-l:n ja HLA-DR:n ilmennys keratinosyytei11ä,jotka ovat peräisin hyvänlaatuisista ihosairauksista

Diagnoosi Tapauksia ICAM-1 HLA-DR ICAM-1&

(kpl) vain' väin HLA-DR

Yliherkkyys- kontakti-ihot- - -*a n 2 tuma a o m "Punajäkälä- jj 3 0 8 tauti

Rakkulaihottuman kalainen/rakku- 220 0 laihottuma

Tulehdusihottuma 320°

Nokkosrokko 410 1 »Näytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt.

ESIMERKKI 24 ICAM-l:n ilmennys keratinosyytei11ä, jotka ovat peräisin hilsetystauti-ihovaurioista ICAM-l-ilmennystä ihonäytteissä, jotka olivat viidestä hilse-tystautia potevasta potilaasta, tutkittiin ennen PUVA-hoidon käynnistämistä ja ajoittain hoitojakson aikana. Näytteitä otettiin 5 potilaasta, jotka sairastivat kudosopillisesti vahvistettuna tavanomaista hiIsetystautia. Näytteet otettiin sarjana ennen PUVA-hoidon aloittamista ja sen aikana ilmoitettuna ajankohtana. PUVAraa annettiin 3-4 kertaa viikossa. Näytteet otettiin viideltä potilaalta hi 1setystautipesäkkeiden 102181 95 äärialueilta, minkä ohella näytteitä otettiin kliinisesti normaalista ihosta neljältä näistä potilaista.

Vastaotetut ihokudosnäytteet jäädytettiin ja varastoitiin nestetyppeen. Kuuden mikronin kryostaattiviipaleitä kuivattiin ilmassa yön yli huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen niitä kiinnitettiin asetonissa 10 minuutin ajan ja sitten joko värjättiin välittömästi tai käärittiin alumiinikalvoon ja varastoitiin -80 °C:seen värjäämiseen asti.

Värjääminen suoritettiin seuraavasti. Viipaleita inkuboitiin monoklonaalisilla vasta-ainella ja värjättiin kolmivaiheisella immunoperoksidaasimenetelmällä (Stein, H., et ai.. Adv.Cancer Res. 42 (1984) 67 - 147) käyttäen diaminobentsidiini-vety-peroksidi-substraattia. Positiivisina verrokkeina ICAM-1 ja HLÄ-DR-värjääntymiselle käytettiin risoja ja imusolmukkeita Negatiivisina verrokkeina toimivat primaarivasta-aineen puuttuessa värjätyt kudosnäytteet.

HLA-DR:n vastaiset monokonaaliset vasta-aineet hankittiin Becton Dickinson -valmistajalta (Mountainview, Kalifornia). Monoklonaalinen ICAM-1-vastainen vasta-aine oli R6-5-D6. Peroksidaasikonjugoitu kaniinin anti-hiiri-Ig ja peroksidaa-sikonjugoitu sian anti-kaniini-Ig hankittiin Dakapatts-valmis-tajalta, Kööpenhamina, Tanska. Diaminobentsidiini-tetrahydro-kloridi hankittiin Sigma-valmistajalta (St. Louis, MO).

Tutkimuksen tulokset osoittavat, että endoteelisolut joissain verisuonissa ilmentävät ICAM-1:n sekä sairaassa että normaalissa ihossa, mutta värjäyksen intensiteetti ja ICAM-1:n ilmentävien verisuonien lukumäärä oli kasvanut hilsetystauti-ihovaurioissa. Lisäksi ICAM-1:n ilmennyskuvio keratinosyytei1-lä, jotka olivat hoitamattomista hilsetystauti-ihovaurioista viidestä potilaasta, vaihteli vain hyvin pienien solurykelmien värjääntymisestä moniin värjääntyneisiin keratinosyytteihin.

102181 96 PUVA-hoidon aikana ICAM-l-ilmennys kahdella potilaista (potilaat 2 ja 3) osoitti merkittävää vähenemistä, joka edelsi tai tapahtui samanaikaisesti kuin kliininen toipuminen (taulukko 13). Potilailla 1, 4 ja 5 oli laskuja ja nousuja ICAM-l-ilmen-nyksessä PUVA-hoidon aikana, jotka korreloivat kliinisiin toipumisiin ja vastaavasti uudelleensairastumisiin. ICAM-1-ilmennystä ei esiintynyt normaalista ihosta saaduilla keratino-syyteillä ennen PUVA-hoitoa tai sen jälkeen. Tämä osoittaa, että PUVA ei indusoi ICAM-l:tä normaalin ihon keratinosyy-teillä.

Huomion arvoinen oli havinto, että yksitumasoluvuodon tiheys korreloi ICAM-l-ilmennyksen määrään keratinosyyteillä. Tämä koski sekä yksitumasolujen määrän laskua vaurioissa PUVA-hoidon aikana, jolloin myös ICAM-l-ilmennys heikkeni, sekä yksitumasolujen lukumäärän kasvuun PUVA-hoidon aikana, jolloin ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä oli selvempi. Endoteelisolut ja ihon yksitumasolut olivat niinikään ICAM-l-positiivisia. Kliinisesti normaalissa ihossa ICAM-l-ilmennys rajoittui endoteelisoluihin, jolloin keratinosyytit eivät 1eimaantuneet.

HLA-DR:n ilmennys keratinosyyteillä vaihteli. Ei löytynyt yhtään HLA-DR-positiivista kudosnäytettä, joka ei ollut myös ICAM-l-positiivinen.

Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että ennen hoitoa ICAM-1-ilmennys on ilmeistä keratinosyytei11ä ja korreloi tiheään yksitumasoluvuotoon. PUVA-hoidon aikana todetaan selvä ICAM-1-värjääntymisen lasku samanaikaisesti, kun tapahtuu kliinistä paranemista. Kudosopi11isesti ihovuoto niinikään väheni. Kun kliininen uudelleensairastuminen hoidon aikana oli ilmeinen, ICAM-l-ilmennys keratinosyytei11ä kasvoi, kuten kasvoi myös ihovuodon tiheys. Kun hoidon aikana havaitiin kliinistä toipumista, tapahtui samanaikaisesti keratinosyyttien ICAM-1-värjääntymisessä alenemista kuten myös ihovuodossa laskua.

102181 97 Täten ICAM-l-ilmennys keratinosyytei1lä korreloi ihon yksitu-masoluvuodon tiheyteen. Nämä tulokset osoittavat, että kliinisenä vasteena PUVA-hoitoon tapahtui selvä lasku ICAM-1-ilmennnyksessä keratinosyytei11ä samanaikaisesti, kun tapahtui kohtuullisempi vähennys yksitumasolujen määrässä. Tämä osoittaa, että ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä on vastuussa ihovuodon käynnistämisestä ja ylläpidosta ja että PUVA-hoito säätää alaspäin ICAM-l:tä, mikä puolestaan heikentää ihovuotoa ja tulehdusvastetta. Tulokset osoittavat myös, että HLA-DR-ilmennys keratinosyyteillä vaihteli PUVA-hoidon aikana.

ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä hilsetystautiin liittyvissä vaurioissa korreloi vaurion kliiniseen vakavuuteen sekä ihon-vuodon määrään. Täten ICAM-1 esittää keskeistä osaa hilsetys-taudissa, jolloin sen ilmennyksen ja/tai vuorovaikutuksen CD18-kompleksin yksitumasolujen kanssa inhiboinnista tullaan saamaan tämän sairauden tehokas hoito. Lisäksi ICAM-1-ilmennyksen tarkkailusta keratinosyyteillä tullaan saamaan tehokas apuväline hilsetystaudin diagnoosiin ja prognoosiin, sekä terapian etenemisen arviointiin.

98 102181 TAULUKKO 13 ICAM-1-ilmennys keratinosyyteil lä hilsetystautivaurioissa (PS) ja kliinisesti normaalissa ihossa (N) ajan funktiona ennen PUVA-hoidon aloittamista ja sen aikana

Ajankohta ' Potilas n:o ennen PUVA- . 5

hoitoa tai 1 L J

sen aikana ps ps N PS N PS N PS N

0 + + -++-++- ++T - 1 päivä + 1 viikko + + -- -++- +- o 2 viikkoa ++ +-+-+- 3 viikkoa ++ * o 4 viikkoa ++ + - ++ * * 5-6 viikkoa - - - o 7 viikkoa (++) (+) +++ - * * 10 viikkoa (+) +++ Paljon positiivisia keratinosyyttejä ++ Kohtuullisesti positiivisia keratinosyyttejä + Paikallisesti positiivisia keratinosyyttejä (+) Hajaantuneesti vain hyvin vähän positiivisia keratinosyyttejä

Ei positiivista värjääntymistä * Kliininen toipuminen o Kliininen uudel1eensairastuminen 102181 99 ESIMERKKI 25 ICAM-l:n ja HLA-DR:n ilmennys pahanlaatuisissa ihosairauksissa

Vauriokohtiin hyvänlaatuisissa ihosairauksissa verrattuna ICAM-1-ilmennys keratinosyyteillä pahanlaatuisissa ihovauriokohdissa oli huomattavasti vaihtelevampi (taulukko 14). Tutkituista 23:sta ihon T-solulymfomasta ICAM-l-positiivisia keratinosyyt-tejä todettiin vain 14 tapauksessa. Keratinosyyteillä, jotka olivat peräisin mycosis fungoides -vaurionäytteistä, oli taipumus menettää ICAM-l-ilmennyksensä taudin jatkovaiheissa. Kuitenkin ICAM-1-ilmennystä todettiin vaihtelevässä osuudessa yksitumasoluvuotoa useimmista ihon T-solulymfomavaurioista. Tutkituista jäljellä olevista lymfomista neljällä kahdeksasta oli ICAM-l:n ilmentäviä keratinosyyttejä. Tutkituista 29 potilaasta, joilla oli pahanlaatuisia ihosairauksia, viidellä oli keratinosyyttejä, jotka ilmensivät HLA-DR:n ilmentämättä ICAM-l:tä (taulukko 14).

1 00 102181 TAULUKKO 14 ICAM-l:n ja HLA-DR:n ilmennys keratinosyyteillä, jotka olivat peräisin pahanlaatuisista ihosairauksista

Tapauksia ICAM-1 HLA-DR ICAM-1&

Diagnoosi (kpl) vain vain HLA-DR

CTCL, MFI 8 la 0 4 CTCL, MFII-111 10 1 2 5 CTCL, SS 3102 CTCL, suuri solu 2 0 2 0 CBCL 2 0 0 1

Ihon leukemia 3 11 1

Histiosytoosi-X 1000 «Näytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt.

ESIMERKKI 26 ICAM-l-vastaisten vasta-aineiden vaikutus ihmisen ääreisveren yksitumasolujen lisääntymiseen

Ihmisen ääreisveren yksitumasolut indusoituvat lisääntymään antigeeni- tai mitogeeniläsnäolon ja -tunnistuksen seurauksena. Tietyt molekyylit, kuten mitogeeni konkanavalliini-A, tai T-soluihin sitoutuva vasta-aine OKT3, aiheuttavat ääreisveren " yksitumasolujen ei-spesifistä lisääntymistä.

Ihmisen ääreisveren yksitumasolut ovat heterogeenisiä siinä mielessä, että ne koostuvat solu-alapopulaatioista, jotka kykenevät tunnistamaan spesifisiä antigeenejä. Kun ääreisveren 102181 101 yksitumasolu, joka kykenee tunnistamaan tietyn spesifisen antigeenin, tapaa tuon antigeenin, vastaavan yksitumasolu-alapopulaation lisääntyminen indusoituu. Jäykkäkouristus-toksiini ja avaimenreikä-maljakotilohemosyaaniini ovat esimerkkejä antigeeneistä, jotka ääreisveren yksitumasolu-alapopulaatiot tunnistavat, mutta joita kaikki ääreisveren yksitumasolut eivät tunnista kerkistyneissä yksilöissä.

Tutkittiin ICAM-l-vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen R6-5-D6 kykyä estää ihmisen ääreisveren yksitumasolujen lisäänty-misvasteet järjestelmissä, joiden tiedetään edellyttävän solu-soi ukiinnityksiä.

Ääreisveren yksitumasoluja puhdistettiin Ficol1-Paque-(Pharmacia) gradientteja käyttäen valmistajan ohjeiden mukaan. Rajafaasi otettiin talteen ja solut pestiin kolmeen kertaan RPMI 1640 -kasvualustalla, minkä jälkeen niitä viljeltiin tasapohjaisilla 96 kuopan mikrotiitterilevyillä pitoisuutena 10® solua/ml RPMI 1640 -kasvualustassa, jota oli täydennetty 10 %:lla nautasikiöseerumia, pitoisuudella 2 mM glutamiini ja gentamysiinilla (50 mikrogrammaa/ml).

Antigeeni, joko T-solumitogeeni, konkanaval1iini-A (0,25 mikrogrammaa/ml); T-soluja sitova vasta-aine, OKT3 (0,001 mikrogrammaa/ml); avaimenreikä-maljakoti1o-hemosyaniini (10 g/ml) tai jäykkäkouristustoksiini (1:100 laimennos lähteestä) lisättiin soluihin, joita viljeltiin kuten edellä kuvattu joko ICAM-vastaisen vasta-aineen (R6-5-D6; loppupitoisuus 5 g/ml) läsnäollessa tai vastaavasti puuttuessa. Soluja viljeltiin 3,5 päivän ajan (konkanavalliini-A-koe), 2,5 päivän ajan (OKT3-koe) \ tai 5,5 päivän ajan (avaimenreikä-maljakotilo-hemosyaniini- . ' sekä jäykkäkouristustoksiinikokeet), minkä jälkeen kokeet päätettiin.

18 tuntia ennen kokeen päättämistä viljelmiin lisättiin 2,5 102181 102 mikrocurie-yksikköä 3H-tymidiiniä. Solujakaantuminen määritettiin mittaamalla tymidiinin siirtyminen ääreisveren yksitumasolujen DNAthan. Siirtynyt tymidiini kerättiin ja laskettiin nestetuikelaskijassa (Merluzzi et ai.. J. Immunol.

139 (1987) 166 - 168). Näiden kokeiden tulokset on esitetty kuviossa 16 (konkanavalliini-A-koe), kuviossa 17 (OKT3-koe), kuviossa 18 (avaimenreikä-maljakotilo-hemosyaniinikoe) ja kuviossa 19 (jäykkäkouristustoksiinikoe).

Todettiin, että ICAM-l-vastainen vasta-aine inhiboi lisään-tymisvasteita ei-spesifisel1 e T-solumitogeenille, Con-A; ei-spesifiselle T-soluliitteiselle antigeenille, OKT-3; ja spesifisille antigeeneille, avaimenreikä-maljakotilo-hemosyaniini ja jäykkäkouristustoksiini; yksitximasoluissa. Inhibitio ICÄM-l-vastaisella vasta-aineella oli verrattavissa inhibitioon LFA-l-vastaisella vasta-aineella, mikä viittaa siihen, että ICAM-1 on LFA-l:n funktionaalinen ligandi ja että ICÄM-l-antagonismi inhiboi spesifisen puolustusjärjestelmän vasteita.

ESIMERKKI 27 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus sekaimusolureaktioon

Kuten edellä esitetty, ICAM-1 on välttämätön tehokkaille soluvuorovaikutuksi11 e immuunivasteissa, joita välittää LFA-1-riippuvainen solukiinnitys. ICAM-1:n induktio immuunivasteiden yhteydessä tai tulehdussairaudessa mahdollistaa valkosolujen vuorovaikutuksen toistensa sekä endoteelisolujen kanssa.

Kun kahdesta ei-sukulaisyksilöstä peräisin olevia imusoluja viljellään toistensa läsnäollessa, havaitaan imusolujen emosolumuodostusta ja solujakaantumista. Tämä vaste - yhden imusolupopulaation vaste toisen imusolupopulaation läsnäoloon -tunnetaan sekaimusolureaktiona (MLR), ja se on analoginen 102181 103 imusolujen vasteeseen mitogeenia lisättäessä (Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, Klein, J., John Wiley & Sons, NY, 1982, ss. 453 - 458).

Suoritettiin kokeita ICÄM-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksen humaani-MLR:ään määrittämiseksi. Nämä kokeet suoritettiin seuraavasti. Ääreisverta otettiin normaaleista terveistä luovuttajista laskimosta punktoimalla. Veri kerättiin hepariinilla käsiteltyihin koeputkiin, joissa sitä laimennettiin 1:1 huoneenlämpötilassa Puck’s G - (Gibco) tasapainoitetulla suolaliuoksella (BSS). Veriseos (20 ml) asetettiin kerrokseksi 15 ml:lie Ficol1/Hypaque-tiheysgra-dienttia (Pharmacia, tiheys = 1,078, huoneenlämpötilassa) ja sentri£ugoitiin 1000 x g:ssä 20 minuutin ajan. Rajafaasi otettiin sitten talteen ja pestiin 3X Puck's G -valmisteella. Solut laskettiin hemasytometrissä ja uudelleenlietettiin RPMI 1640 -kasvualustaan (Gibco), joka sisälsi 0,5 % gentamysiiniä, pitoisuuden 1 mM L-glutamiinia (Gibco) ja 5 % lämpöinaktivoitua (56 °C, 30 min.) humaani-AB-seerumia (Flow Laboratories) (johon kasvualustaan tästä eteenpäin viitataan "RPMI-kasvualustana").

Näissä kokeissa käytettiin hiiren ICAM-l-vastaista vasta-ainetta (R6-5-D6). Kaikkia monoklonaalisia vasta-aineita (jotka valmistettiin vatsaontelonesteestä Jackson ImmunoResearch Laboratories -laboratoriossa, Boston, MA) käytettiin puhdistettuina IgG-valmisteina.

Ääreisveren yksitumasoluja (PBMC) viljeltiin kasvualustassa pitoisuutena 6,25 x 10* solua/ml Linbron pyöreäpohjaisilla mikrotiitterilevyillä (# 76-013-05). Toisesta luovuttajasta saatuja stimulaattorisoluja säteilytettiin 1000 R:llä, minkä jälkeen niitä viljeltiin vastesolujen kanssa samana pitoisuutena. Viljelmän kokonaistilavuus oli 0,2 ml. Verrokkeina toimivat vastesolut yksinään sekä stimulaattorisolut yksinään. Viljelymaljoja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 % C02:ta sisältävässä 1 04 102181 kostutetussa ilmakehässä 5 päivän ajan. Kuoppia sykäytettiin 0,5 mikrocurie-yksikön pitoisuudella tritioitua tymidiiniä (3HT) (New England Nuclear) viljelyn 18 viimeisen tunnin aikana. Joissain tapauksissa suoritettiin kaksisuuntainen MLR. Menettelyjärjestys oli sama lukuunottamatta, että toisen luovuttajan soluja ei inaktivoitu sätei1yttämällä.

Solut otettiin talteen lasikuitusuodattimille käyttäen automaattista näytekerääjää (Skatron, Norja), minkä jälkeen ne huuhdottiin vedellä ja metanolilla. Suodattimia kuivattiin uunissa, minkä jälkeen ne laskettiin Aquasol-nesteessä Beckmanin (LS-3801) nestetuikelaskijalla. Tulokset ilmaistaan keskimääräisenä tuiketta/min-arvona +/- s.d. kuudesta eri viljelmästä.

Taulukosta 15 ilmenee, että puhdistetut ICAM-l-vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet inhiboivat MLR:ää annosriippuvaisella tavalla, jolloin merkittävää suppressiota ilmeni pitoisuudella 20 ng/ml. Puhdistetulla hiiri-IgG:1lä oli vain vähäinen tai ei lainkaan suppressiivista vaikutusta. MLR:n suppressiota ICAM-l-vastaisella monoklonaalisel1 a vasta-aineella tapahtuu, kun vasta-aine lisätään viljelyn ensimmäisten 24 tunnin aikana (taulukko 16).

105 102181 TAULUKKO 15 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus yksisuuntaiseen imusolureaktioon

Stimulaatto- 3HT-siirtyminen

Vastesolut risolut^ Vasta-ainec (tuiketta/min.) 445d ± 143 + - 148 + 17 + - - 698+72 + + - 42,626 ± 1,579 + + mlgG (10.0 M9) 36,882 + 1,823 (14X) + + mlgG ( 0.4 M9) 35,500 ♦ 1,383 (17X) + + mlgG ( 0.02 Mg) 42,815 ± 1,246 ( OS) + + R6-5-D6 (10.0 flg) 8,250 ± 520 (811) + + R6-5-D6 ( 0.4 Mg) 16,142 ± 858 (62S) + + R6-5-D6 ( 0.03 M9) 28,844 ± 1,780 (32S) 1 ns 1U2181 TAULUKKO 16 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen 1isäysajankohta 3 H-siirtyminen

Ra Sb Lis'äysC' (tuiketta/min. )

Kasvualustan tai vasta-aineen lisäysaj ankohta___ Päivä 0_Päivä 1_Päivä 2 - kasvualusta 205d ± 14 476 ± 132 247 ± 75 " + kasvualusta 189 ± 16 nde nd + " kasvualusta 1,860 ± 615 nd nd + + kasvualusta 41,063 + 2,940 45,955 ± 2,947 50,943 ± 3,072 + + R6-5-D6 17,781 ± 1,293 38,409 ± 1,681 47,308 ± 2,089 (57%)f (16%) (7%) •Vastesoluja 6,25 x 105 k?l/ml »Stimulaattorisoluja 6,25 x 105 kpl/ml, säteilytetty 1000 R:llä cKasvualustaa tai ICÄM-l-vastaista puhdistettua monoklonaalista vasta-ainetta (R6-5-D6) pitoisuutena 10 mikrogrammaa/ml lisättiin päivästä 0 24 tunnin välein. dKeskiarvo */- s.d. 4-6 viljelmästä; •nd = ei määritetty fProsentuaalinen inhibitio 102181 107

Yhteenvetona ICAM-l-vastaisen vasta-aineen kyky inhiboida MLR:ää osoittaa, että ICAM-l-vastaisilla monoklonaalisillä vasta-aineilla on terapeuttista käyttöä akuutissa siirre-hyljinnässä. ICAM-l-vastaisilla monoklonaalisi11 a vasta-aineilla on niinikään terapeuttista käyttöä liittyvissä immuuni(järjestelmä)välitteisissä häiriöissä, jotka ovat riippuvaisia LFA-1/ICAM-l-säätöisistä solu-soluvuorovai-kutuksista.

Tässä kuvatut kokeet osoittavat, että ICAM-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden lisääminen inhiboi sekaimusolureaktiota (MLR), kun ne lisättiin reaktion ensimmäisten 24 tunnin kuluessa. Lisäksi ICAM-1 säätyy ylöspäin ihmisen ääreisveren monosyyteissä in vitro -viljelyssä.

Lisäksi todettiin, että ICAM-1 ei ilmenny lepotilassa olevilla ihmisen ääreisveren imusoluilla tai monosyyteillä. ICAM-1 säätyy ylös yksinään viljellyillä monosyyteillä sekä soluilla, joita viljellään yhdessä ei-sukulaisluovuttajasolujen kanssa, sekaimusolureaktiossa, jolloin mittaukset suoritetaan käyttäen tavanomaisia virtaussytometria-analyyseja. Tätä ICAM-1:n ylössäätöä monosyyteillä voidaan käyttää tulehdusindikaatto-rina; erityisesti, jos ICAM-1 ilmentyy tuoreilla monosyyteillä, jotka ovat peräisin yksilöistä, jotka potevat akuuttia tai kroonista tulehdusta.

ICAM-l:n spesifisyys aktivoiduille monosyytei11 e ja ICAM-l-vastaisen vasta-aineen kyky inhiboida MLR:ää viittaavat siihen, että ICAM-l-vastaisilla monoklonaalisi11 a vasta-aineilla on diagnostisia ja terapeuttisia käyttömahdollisuuksia akuutin siirrehyljinnän ja liittyvien immuuni(järjestelmä)välitteisten häiriöiden yhteydessä, jotka edellyttävät solu-soluvuorovaiku-tuksia.

1 08 102181 ESIMERKKI 23 ICAM-l-vastaisten ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden yhteisannon synergiavaikutukset

Kuten esitetty esimerkissä 27, MLR:ää inhiboi ICAM-l-vastainen vasta-aine. MLR:ää voi inhiboida myös LFA-l-vastainen vasta-aine. Sen määrittämiseksi, onko ICAM-l-vastaisten ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden yhteisannolIa tehostava, eli synergistinen vaikutus, suoritettiin MLR-määritys (kuten kuvattu esimerkissä 27) eri pitoisuuksien näitä kahta vasta-ainetta läsnäollessa.

Tässä MLR-kokeessa ilmeni, että ICAM-l-vastaisen vasta-aineen ja LFÄ-i-vastaisen vasta-aineen yhdistelmä - pitoisuuksina, joissa kumpikaan vasta-aine yksinään ei erityisesti inhiboi MLRrää - oli merkittävästi tehokkaampi MLR-vasteen inhiboin-nissa (taulukko 17). Tämä tulos osoittaa, että terapioilla, joissa lisäksi annetaan ICAM-l-vastaista vasta-ainetta (tai niiden fragmentteja) ja LFA-l-vastaista vasta-ainetta (tai niiden fragmentteja), on kapasiteettia tuottaa tehokkaampi tulehdusvastainen hoito. Tällaista tehostettua terapiaa käyttämällä voidaan antaa alhaisempia vasta-aine-annoksia, kuin mitkä muutoin olisivat terapeuttisesti tehokkaita, millä on merkitystä olosuhteissa, joissa yksittäisten vasta-aineiden korkeat pitoisuudet indusoivat anti-idiotyyppivasteen.

10218'ι 109 TAULUKKO 17

Vaihtelevien anti-ICAM-1- ja anti-LFA-1- (R3.1-) annoksien vaikutus sekaimusolureaktioon

Inhibitio-%

Pitoisuus (ug/ml)

Anti-ICAM-1 (R6-5-D6) ' Anti-LFA-1 0 .004 .02 .1 .5 2.5 0.0 0 7 31 54 59 70 0.0008 1 7 28 48 62 71 0.004 0 13 30 50 64 72 ' 0.02 29 38 64 75 84 86 0.1 92.5 90 91 92 92 92 0.5 93 90 90 92 93 91 ESIMERKKI 29

Optimaalisen alittavien anti-ICAM-1-annoksien ja muiden immuunivastetta heikentävien aineiden yhdistetyn annon additiiviset vaikutukset MLR:ään

Kuten esitetty esimerkissä 28, MLR:ää inhiboivat ICÄM-1-vastaisten ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden yhdistelmät. Sen määrittämiseksi, olisiko myös anti-ICAM-1:n ja muiden immuunivastetta heikentävien aineiden [kuten deksametasoni, atsatio-priini, syklosporiini-A ja steroidit (kuten esimerkiksi prednisoni jne.)] yhteisannolla tehostuneita vaikutuksia, suoritettiin MLR-määrityksiä käyttäen optimaalista alhaisempina pitoisuuksina (eli pitoisuuksina, jotka ovat alhaisempia kuin -102181 110 se optimaalinen pitoisuus, jona ainetta yksinään annettaisiin kohteelle) R6-5-D6:ta yhdessä muiden immuunivastetta heikentävien aineiden kanssa, jolloin menettelysuoritus oli kuten esimerkissä 27.

Tulokset osoittavat, että R6-5-D6:n inhiboivat vaikutukset ovat vähintäänkin additiivisia suboptimaalisten annoksien deksame-tasonia (taulukko 18), atsatiopriinia (taulukko 19) ja syklo-sporiini-A:ta (taulukko 20) inhibitiovaikutuksiin. Tämä viittaa siihen, että ICAM-l-vastaisilla vasta-aineilla voi olla vaikutusta pyrittäessä alentamaan tunnettujen immuunivastetta heikentävien aineiden välttämättömiä annoksia, jolloin näiden myrkylliset sivuvaikutukset vähenevät. Käytettäessä ICAM-1-vastaistä vasta-ainetta (tai sen fragmenttia) tällaiseen immunivasteheikennykseen pääsemiseksi, on mahdollista yhdistää vasta-aineen (tai sen fragmentin) antaminen joko yhteen ylimääräiseen immuunivastetta heikentävään aineeseen tai useamman kuin yhden immuunivastetta heikentävän aineen yhdistelmään.

Anti-ICAM-1:n ja deksametasonin vaikutus humaani-MLR:ään 111 102181 TAULUKKO 18 3

Inhibiittori H-siirto _ , (tuiketta/ Inhibitio-%

Ryhmä (ng(/ml) .

mm.)

Kasvualusta _ ,c-

Stimulaattorit (S) .

Vastetuottajat (R) . ^ R x s . 34*199 R x S R6-5-06 (8) 26,224 23 R x S Dex (50) 14,158 59 R x S R6-5-D6 (8) + Dex (50) 7,759 77

Dex: deksametasoni TAULUKKO 19

Anti-ICAM-1:n ja atsatiopriinin vaikutus humaani-MLR:ään 1 1 2 102181

Inhibiittori 3H-siirto

Ryhmä , , (tuiketta/ Inhibition _(ng(ml) min.)_

Kasvulusta . 78

Stimulattorit tS) * 174

Vastettuottajat (R) ' R x S ‘ *3’-'0 R x S R6-5-D6 (8) 44,374 11 R x S Atsatiopriini (1) 42,710 1·ι R x S R6-5-D6 (8) +' Atsatiopriini 34,246 3 1 _UJ_

Anti-ICAM-1:n ja syklosporiini-A:n vaikutus humaani-MLR:ään 113 102181 TAULUKKO 20 ^H-siirto

Rvhmä Inhibiittori (tuiketta/ Inhibitio-% ,_(ng/ml)_min. )_.__

Kasvualusta

Stimulattorit (S) ’ 2Qg *

Vastetuottajat (R) . gg7 R x S - 31,540 R x S R6-5-D6 (8) 26,282 17 R x S CyA (10) 23,617 25 R x S R6-5-D6 (8) + CyA (10) 19,204 39

CyA: syklosporiini-A

ESIMERKKI 30 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus saman lajin toisesta yksilöstä siirrettyjen elimien hyljinnän tukahduttamisessa ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutuksen osoittamiseksi siirretyn allogeenisen elimen hyljinnän tukahduttamisessa Cynomolgus-apinoihin siirrettiin munuaisia toisesta saman lajin yksilöstä menetelmän mukaan, jota ovat kuvanneet Cosimi et ai. (Transplant.Proc. 13 (1981) 499 - 503) sillä modifikaatiolla, että nukutusaineina käytettiin valiumia ja ketamiinia.

Täten munuaisensiirto suoritettiin oleellisesti seuraavasti. Heterotrooppisia munuaissiirtoja suoritettiin 3-5 kg:n painoisille Cynomolgus-apinoille, oleellisesti kuten kuvannut Marquet (Marquet et ai.. Medical Primatoloqy, osa II, Basel, 114 102181

Karger, 1972, s. 125), kun apinat oli ensin nukutettu valiumilla ja ketamiinilla. Luovuttajan munuaissuoniin rakennettiin yhdyshaarat, joissa toisen rakenteen pää oli yhdistetty toisen sivuun, aortta- tai onttolaskimopalaseen, käyttäen 7-0 Prolene -ommelta. Luovuttajan virtsanjohdin spatuloitiin ja istutettiin virtsarakkoon ekstravesikaalisen lähestymistavan mukaan (Taguchi, Y., et ai.. Dausset et ai. (toim.): Advances in Transplantation. Baltimore, Williams & Wilkins, 1968, s. 393) Munuaisfunktiota arvioitiin viikoittain tai kahdesti viikossa määrittämällä seerumikreatiniini. Lisäksi otettiin tajaan siirrenäytteitä kudosopillista tarkastelua varten ja kaikille kokeessa kuolleille vastaanottajille suoritettiin täydelliset ruumiinavaukset. Useimmissa vastaanottajissa suoritettiin molemminpuolinen munuaispoisto siirtoajankohtana ja myöhemmän virtsamyrkytyksestä johtuvan kuoleman ajankohta katsottiin siirreselviämisen loppuajankohdaksi.

Joissain vastaanottajissa siirtoajankohtana suoritettiin yksipuolinen natiivi munuaisen poisto ja vastapuolinen virtsarakkosidonta. Kun tapahtui siirteen hylkimistä, autologisen virtsanjohtimen ommel poistettiin, jolloin seurauksena oli normaalin munuaisfunktion palautuminen ja mahdollisuus jatkaa vastaanottaja-eläimen immunologista tarkkailua.

Monoklonaalista vasta-ainetta R6-5-D6 annettiin päivittäin 12 päivän ajan alkaen kaksi päivää ennen siirtoa annoksena 1-2 mg/kg/päivä. Seerumin kreatiniinitasot määritettiin ajoittain hyljinnän tarkkailemiseksi. ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus samasta lajista saadun munuaisen hyljintään immuunijärjestelmän toimesta on esitetty taulukossa 21.

115 102181 TAULUKKO 21 R6-5-D6:n aktiivisuus saman lajin yksilöstä siirretyn munuaisen selviytymiseen suojatoimenpiteitä käytettäessä Cynomolgus-apinassa»

Apina R6-5-D6-annos (mg/kg) klsitSlyf jokeen

Verrokki 1 g

Verrokki 2 . H

Verrokki 3 .

Verrokki 4 _ jq

Verrokki 5 g

Verrokki 6 M15 1.0 20 M19 1.0 7b H17 1.0 30 M25 1.5 29 M23 1.0 llc M27 2.0 34 M7 0.5 22

Mil 0.5 25 M10 0.5 22 M8 0.5 26d »Apinoille annettiin R6-5-D6:ta 12 perättäisenä päivänä alkaen 2 päivää ennen siirtoa.

bKuolinsyy tuntematon; todisteita piilevästä malariasta löytyi. «Kuolinsyy munuaiskuolio.

dEläin oli edelleen elossa 15. elokuuta 1988.

Tulokset osoittavat, että R6-5-D6 pidensi tehokkaasti apinoiden elinikää, joihin oli siirretty munuainen saman lajin toisesta yksilöstä.

102181 116 ESIMERKKI 31 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus siirrettyjen elimien akuutin hyljinnän tukahduttamisessa

Sen osoittamiseksi, että ICAM-l-vastainen vasta-aine on tehokas siirrehyljinnän akuutissa mallissa, R6-5-D6:ta testattiin myös terapeuttisessa tai akuutissa munuaisenhyljintämallissa. Tässä mallissa apinan munuaisia siirrettiin (käyttäen esimerkissä 30 kuvattua menettelyjärjestelyä), ja niille annettiin toimenpide-ajankohdan molemmin puolin 15 mg/kg syklosporiini-A:ta (CyA) i.m. kunnes päästiin stabiiliin munuaisfunktioon. Sitten CyA-annosta alennettiin kahdesti viikossa 2,5 mg:n/kg välein, kunnes hyjintää ilmeni, minkä osoitti veren kreatiniinitasojen nousu. Tällöin R6-5-D6:ta annettiin 10 päivän ajan ja eloon-jäänti-aikaa tarkkailtiin. Tärkeätä on huomata, että tässä menettelyjärjestelyssä CyA-annos pysyy suboptimaalisena, koska se ei muutu sen jälkeen, kun akuutti hyijintävaihe on käynnistynyt. Tässä mallissa kudosopilliset verrokit (N=5), joilla ei käytetä vasta-ainesuojaa, selviävät 5-14 päivän ajan hyijintävaiheen käynnistymisestä. Tähän mennessä kuusi eläintä on testattu käyttäen R6-5-D6:ta tämä menettelyjärjestelyn mukaan (taulukko 22). Kaksi näistä eläimistä on edelleen elossa (M12, 31 päivää; ja M5, 47 päivää laskettuna R6-5-D6:n annosta). Kaksi eläintä eli 38 ja vastaavasti 55 päivää R6-5-D6-terapian käynnistämisestä ja kaksi eläimistä kuoli muista syistä kuin akuutin hyljinnän seurauksena (yksi eläin kuoli CyA-myrkkyvaikutuksiin ja toinen kuoli, kun sille annettiin nukutuksessa R6-5-D6:ta). Tämä malli muistuttaa (edellisiä) likeisemmin kliinistä tilannetta, jossa R6-5-D6:ta alunperin annettaisiin.

117 TAULUKKO 22 102181 R6-5-D6-aktiivisuus saman lajin toisesta yksilöstä siirretyn munuaisen selviämisen pidentämisessä terapeuttisissa menettelyjärjestelyissä Cynomolgus-apinassa» . Selviämispäivä

Apina Hyljintävaihe päivänä0 käsittelyn jälkeen 14-98 5-14 M24 41 38 M21 34 4d H3 41 55 M9 12 11® M12 37 >31f MS 26 >47f »Apinoille annettiin 1-2 mg/kg R6-5-D6:ta 10 perättäisenä päivänä hyljinnän alkamisesta laskettuna. bPäivä, jona kreatiniinitasot kohosivat seurauksena CyA-annostuksen alentamisesta ja jona R6-5-D6-hoito aloitettiin. cViisi eläintä testattiin käyttäen edellä kuvattua terapeuttista menettelyjärjestelyä lukuunottamatta/ ettei käytetty suojaterapiaa. "Selviämispäiviä käsittelyn jälkeen” on seiviämispäivien lukumäärä laskettuna kreatiniinitasojen kohoamisen alkamisesta.

<*Eläin kuoli nukutuksessa; kreatiniinitasot olivat alhaiset. •Eläin kuoli CyA-myrkkyvaikutuksiin; kreatiniinitasot olivat alhaiset.

*Eläin oli edelleen elossa 15. elokuuta 1988.

118 102181 ESIMERKKI 32

Typistettyjen ICAM-1-johdannaisten geneettinen rakentaminen ja ilmennys

Luontaisessa tilassaan ICAM-1 on solumembraaniin sitoutunut proteiini, joka sisältää viidestä immunoglobuliinin kaltaisesta alueesta koostuvan solunulkoisen alueen, transmembraanialueen ja sytoplasma-alueen. Halusimme rakentaa ICAM-l:n funktionaalisia johdannaisia, joista puuttuu transmembraanialue ja/tai sytoplasma-alue, liukoisen, erittyvän ICAM-l-muodon saamiseksi. Nämä funktionaaliset johdannaiset rakennettiin ICAM-l-geenin oligonukleotidi-ohjatulia mutatoinilla, minkä jälkeen mutant-tigeeni ilmennettiin transfektoimalla se apinasoluihin.

ICAM-l-geenimutantteja, jotka käsittivät aminohapposubsti-tuutioita ja/tai typistettyjä johdannaisia, muodostettiin Kunkelin, T., (Proc.Natl.Acad.Sei. USA 82 (19851 488 - 492) menetelmän mukaan. ICAM-l-cDNA valmistettiin kuten edellä kuvattu ja sitä pilkottiin restriktioendonukleaaseilla Sali ja Kpnl, minkä jälkeen saatu 1,8 ep:n DNA-fragmentti alakloonat-tiin plasmidivektoriin CDM8 (Seed, B., et ai. Proc.Natl.Acad.

Sei. USA 84 (1987) 3365 - 3369). Tällä pCD1.8C:ksi nimetyllä rakenteella transformoitiin sitten E. coli dut-,unq--kanta.

Transformanteista saatiin talteen yksisäikeinen urasiilipi-toinen templaatti käyttämällä avustajafagi R408 - (StratageneR) tartutusta. Sitten muodostettiin mutantti-ICAM-l-cDNA-säikeitä alustamalla toisen säikeen synteesi oligonukleotidilla, joka sisälsi ei-yhteensopivia emäspareja, ja transformoimalla sitten unq+-isäntä (MC1061/P3) saadulla heterodupleksilla. Mutantit eristettiin seulomalla juuri muodostettujen, mutanttioligonuk-leotidin mukanaan tuomien endonukleaasirestriktiokeskuksien suhteen. Mutantti-ICAM-l-proteiini ilmennettiin transfektoi-malla Cos-7-soluja mutantti-DNA:1 la eukaryoottisessa ilmennys-vektorissa CDM8 käyttäen DEAE-dekstraanivakiomenettelyitä (Selden, R.F., et ai .. Current Protocols in Molecular Biology 102181 119 (Ausubel, F.M., et ai.. toim.), ss. 9.2.1.-9.2.6. (1987).

Valmistettiin typistetty ICAM-1:n funktionaalinen johdannainen, josta puuttuivat transmembraani- ja sytoplasma-alueet, mutta joka sisälsi kaikki viisi immunoglobuliinin kaltaista aluetta käsittävän solunulkoisen alueen. 30 ep:n mutanttioligonukleo-tidia (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) käyttäen muutettiin aminohappojen tyrosiini (Y) ja glutamiinihappo (E) kodonit asemissa 452 ja vastaavasti 453 fenyylialaniiniksi (F) ja translaation lopetuskodoniksi (TAG). Hutantti eristettiin yksittäisen Xbal-restriktiokeskuksensa nojalla ja nimettiin ,,Y452E/F,TAG".

Mutanttiproteiinin ilmentämiseksi COS-soluja transfektoitiin kolmella mutanttialakloonilla ("2, #7 ja #8). Kolmen päivän kuluttua transfektoinnista näillä kolmella mutanttialakloonilla viljelmäsupernatantteja ja solulysaattia analysoitiin immuuni-saostamalla ICAM-l-vastaisella monoklonaalisella vasta-aineella RR1/1 ja SDS-PAGE:11a. ICAM-1 saostettiin mutantti-alaklooneilla #2 ja #8 transfektoitujen solujen viljelmäsuper-natanteista, mutta ei näiden solujen pesuainelysaateista.

Viljelmäsupernatantista todetun ICAM-1:n molekyylipaino oli noin 6 kd:tä alhaisempi kuin ICAM-l:n membraanimuodon, mikä sopii mutantti-DNA:1le ennakoituun kokoon. Täten tämä ICAM-l:n funktionaalinen johdannainen erittyy liukoisena proteiinina.

Sitä vastoin ICAM-1 ei immuunisaostunut natiivilla ICAM-1:llä transfektoitujen solujen verrokkivi1jelmäsupernatanteista, mikä osoittaa, että ICAM-1:n membraanimuoto ei erity Cos-soluista. Lisäksi ICAM-1:tä ei immuunisaostunut negatiivisena verrokkina toimineiden valetransfektoitujen solujen sen paremmin viljelmäsupernatanteista kuin solulysaateistakaan.

Transfektoitujen solujen erittämä typistetty ICAM-1 puhdistettiin immunoaffiniteettikromatografisesti ICAM-1:lie spesifisellä vasta-aineella (R6-5-D6), minkä jälkeen sen funktionsa- 120 10218'.

lista aktiivisuutta testattiin solusitoutumismäärityksellä. Valmisteita, jotka sisälsivät natiivia ICAM-l:tä tai typistettyä, erittyvää muotoa, puhdistettiin pesuaineoktyyligluko-sidin läsnäollessa, minkä jälkeen niitä laimennettiin loppu-pitoisuuteen 0,25 % oktyyliglukosidia (joka pitoisuus alittaa pesuaineen kriittisen misellipitoisuuden). Näiden ICAM-1-valmisteiden annettiin sitoutua muovisten, 96 kuopan kuoppa-levyjen (Nunc) kuoppapintoihin kiinteään faasiin sidotun ICAM-l:n saamiseksi. Ei-sitoutunut materiaali pestiin pois, minkä jälkeen todettiin, että noin 75 - 80 % ja vastaavasti 83 - 88 % SKW-3-soluista, jotka käsittivät solupinnoi11 aan LFA-l:n, sitoutui spesifisesti ICAM-l:n natiiviin ja typistettyyn muotoon. Nämä tulokset osoittavat, että ICAM-l:n erittyvällä, typistetyllä ja liukoisella funktionaalisella johdannaisella oli tallella sekä immunologinen reaktiivisuus että kyky välittää ICAM-l-riippuvaista kiinnittymistä, jotka ominaisuudet ovat karakteristisia natiiville ICAM-l:lle.

Funktionaalinen ICAM-1-johdannainen, josta puuttuu vain sytoplasma-alue, valmistettiin samankaltaisilla menetelmillä. Aminohapon 476 (Y) vaihtamiseksi TAG-translaatiolopetuskodo-niksi käytettiin 25 ep:n oligonukleotidia (TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA). Mutantti nimettiin "Y476/TAG". Immuunisaosta-malla ja suorittamalla SDS-PAGE Cos-soluilla, jotka oli trans-fektoitu mutantilla, todettiin ICÄM-l:n membraaniin sitoutunut muoto, jonka molekyylipaino oli noin 3 kd:tä alhaisempi kuin natiivin ICAM-l:n. Mutantilla transfektoitujen Cos-solujen epäsuoralla immunofluresenssilla todettiin samankaltainen täplikäs värjääntymiskuvio kuin LPS:llä stimuloiduilla humaani-endoteelisoluilla ilmennetyn natiivin ICAM-l:n. Lopuksi mu-tantti-DNA:1 la transfektoidut solut sitoutuivat spesifisesti puhdistettuun LFA-l:een muovipinnoilla samaan tapaan kuin natiivilla ICAM-l-DNA:11 a transfektoidut Cos-solut (taulukko 23) .

102181 121 TAULUKKO 23 ICAM-l:n tai funktionaalisen ICAM-1-johdannaisen ilmentävien solujen kyky sitoutua LFA-l:een LFA-l:een sitoutuvien, ICAM-1:n ilmentävien solujen %-osuus, kun läsnä on:_ TRANSFEKTOI NT I Ei vasta-ainetta RR1/1

Vale- 0 0

Natiivi ICAM-1 20 0 Y*76/TAG 20 0 ESIMERKKI 33 ICAM-1:n funktionaalisten alueiden kartoitus ICAM-1:tä tutkittaessa ilmeni, että molekyyli käsittää 7 aluetta. Näistä alueista viisi on solunulkoista (jolloin lähinnä solupintaa on alue 1 ja kauimpana solupinnasta on alue 1), yksi alue on transmembraanialue ja edelleen yksi alue on sytoplasma-alue (eli on solun sisällä). Sen määrittämiseksi, mitkä alueet myötävaikuttavat ICAM-1:n kykyyn sitoutua LFA-l:een, voidaan käyttää epitooppikartoitustutkimuksia.

Tällaisten kokeiden suorittamiseksi valmistetaan erilaisia deleetiomutantteja, joiden kyky sitoutua LFA-l:een karakterisoidaan. Vaihtoehtoisesti tutkimukset voidaan suorittaa käyttäen ICAM-vastaista vasta-ainetta, jonka tiedetään häiritsevän ICAM-1:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Esimerkkejä tällaisista sopivista vasta-aineista ovat RRl/1 (Rothlein, R., et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 1270 - 1274); R6.5 (Springer, T.A., et ai.. US-hakemusjulkaisu sarjan:o 07/250,446), LB-2 (Clark, E.A., et ai. . Leukocyte Typing I. A. Bernard, et ai toim., Springer-Verlag, 1984, ss. 339 - 346) tai CL203 102181 122 (Staunton, D.E., et ai.. Cell 56 (1989) 849 - 853).

ICAM-l-deleetiomutantteja voidaan muodostaa millä tahansa lukuisista eri tavoista. Edullisesti tällaisia mutantteja muodostetaan kuitenkain paikkaohjautuvalla mutatoinnilla tai muutoin yhdistelmägeeniteknisesti (kuten rakentamalla ICAM-l:n ilmentäviä geenisekvenssejä, joista tiettyjä proteiinialueita koodittavat sekvenssit on eliminoitu. Menettelyt, jotka soveltuvat tällaisten mutanttien tuottamiseen, ovat alalla hyvin tunnettuja. Tällaisia menettelyitä käyttäen valmistettiin kolme ICAM-l-deleetiomutanttia. Ensimmäisestä mutantista puuttuvat aminohappojäännökset F185 - P284 (eli alue 3 on deletoitu). Toisesta mutantista puuttuvat aminohappojäännökset P284 - R451 (eli alueiden 4 ja 5 deleetio). Kolmannesta mutantista puuttuvat Y476:n jälkeiset aminohappojäännökset (eli sytoplasma-alueen deleetio). Näiden tutkimusten tuloksista ilmenee, että alueet 1, 2 ja 3 liittyvät pääasiassa ICAM-l:n ja ICAM-l-vastaisen vasta-aineen tai LFA-1:n välisiin vuorovaikutuksiin.

ESIMERKKI 34 ICAM-l:ssä suoritettujen mutatointien vaikutus LFA-1-sitoutumiseen ICAM-l:n kyvyn olla vuorovaikutuksessa ja sitoutua LFA-1:een välittävät ICAM-1-aminohappojäännökset, jotka sijaitsevat ICAM-1-molekyylin alueilla 1 (kuviot 8, 9 ja 10). Tällaisiin vuorovaikutuksiin myötävaikuttavat kuitenkin ICAM-l:n alueilla 2 ja 3 sijaitsevat aminohapot. Täten esillä olevan keksinnön mukaisiin edullisiin funktionaalisiin johdannaisiin lukeutuvat liukoiset ICAM-1-molekyylitragmentit, jotka sisältävät ICAM-1-alueet 1, 2 ja 3. Edullisempia ovat liukoiset ICAM-l-molekyy-lifragmentit, jotka sisältävät ICAM-l-alueet 1 ja 2. Edullisimpia ovat liukoiset ICAM-l-molekyylifragmentit, jotka sisältävät ICAM-l:n alueen 1. ICAM-l:n ja LFA-l:n väliseen 123 102181 vuorovaikutukseen osallistuvat useat aminohappojäännökset ensimmäiseltä ICÄM-l-alueelta. Näiden aminohappojen korvaaminen muilla aminohapoilla muuttaa ICAM-l:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Nämä aminohappojäännökset ja mainitut substituutiot on esitetty kuviossa 25. Kuviossa 25 esitetään myös tällaisten mutatointien vaikutukset saadun mutantti-ICAM-l-molekyylin kykyyn sitoutua LFA-l:een. Kuvioissa 23 - 25 jäännökset on merkitty aminohappojen yksikirjainkoodilla, jota seuraa jäännöksen asema ICAM-l-molekyyIissä. Täten esimerkiksi "E90" tarkoittaa glutamiinihappojäännöstä ICAM-l:n asemassa 90. Vastaavasti ”E90V" tarkoittaa dipeptidiä, joka koostuu glutamiinihappojäännöksestä asemassa 90 ja väliini jäännöksestä asemassa 91. Substituutiosekvenssi on merkitty vinoviivan ("/") oikealle puolelle. ICAM-l:n jäännökset V4, R13, Q27, Q58 ja D60S61 osallistuvat LFA-l-sitoutumiseen.

Näiden aminohappojen korvaaminen muutti ICAM-l:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Esimerkiksi korvaamalla V4 G:llä saadaan mutantti-ICÄM-l-molekyyli, joka kykenee huonommin sitoutumaan LFA-l:een (kuvio 25). Korvaamalla ICAM-l:n R13-jäännös E:11ä saadaan mutanttimolekyyli, jolla on huomattavasti vähemmän kykyä sitoutua LFA-l:een (kuvio 25). Korvaamalla ICAM-l:n Q58-jäännös H:11a saadaan mutanttimolekyyli, jolla on oleellisesti normaali kyky sitoutua LFA-l:een (kuvio 25). Korvaamalla ICAM-l:n D60S-jäännökset KL:llä saadaan mutanttimolekyy1i, jolla on oleellisesti vähemmän kykyä sitoutua LFÄ-l:een (kuvio 25).

Toisen alueen glykosylaatiokeskukset liittyvät niinikään LFA-l-sitoutumiseen (kuvio 23). Korvaamalla N103 K:11a, tai A155N SV:llä, saadaan mutantti-ICAM-l-molekyyli, joka oleellisesti ei kykene sitoutumaan LFA-l:een. Sitä vastoin glykosylaatiokes-kuksen N175 korvaaminen A:11a ei ilmeisesti oleellisesti vaikuttanut mutantti-ICAM-1:n kykyyn sitoutua LFA-l:een.

Kolmannen ICAM-l-alueen mutaatiot eivät sanottavasti muuttaneet 1 24 102181 ICAM-l:n LFA-l-sitoutumista (kuvio 24).

ESIMERKKI 35 ICAM-l-multimeerejä, joiden biologinen puoliintumisaika-affiniteetti ja "seiviämiskyky" ovat kasvaneet

Rakennetaan kimeerisiä molekyylejä, joissa ICAM-l:n alueet 1 ja 2 ovat kiinnittyneet immunoglobuliinin raskaan ketjun sarana-alueelle. Edullisissa rakenteissa ICAM-l:n alueen 2 C-pää on kiinnitetty immunoglobuliinin raskas ketju -geenisegmenttiin, joka on sarana-alueeseen nähden välittömästi N-pään puolella, jolloin segmentin jousto voi siirtyä sarana-alueeseen. ICAM-1-alueet 1 ja 2 korvaavat täten vasta-aineen Fab-fragmentin. Kiinnittämällä rakenne IgG-luokan raskaisiin ketjuihin ja eläinsoluissa sitten tuottamalla saadaan kimeerinen molekyyli. Tuotettaessa molekyylejä, jotka sisältävät IgA:sta tai IgM:stä peräisin olevia raskaita ketjuja, saadaan molekyylejä, joiden multimeria-aste on korkeampi, jolloin ne sisältävät 2-12 ICAM-l-molekyyliä. Yhteisi Imaisemalla J-ketjugeeni eläinsoluissa, jotka tuottavat kimeerisiä ICAM-l-raskasketjumole-kyylejä, saadaan kootuksi oikealla tavalla IgA- ja IgM-multimeerejä, jolloin saadaan pääasiassa IgA-molekyylejä, jotka sisältävät 4-6 ICAM-l-molekyyliä, ja IgM-molekyylejä, jotka sisältävät noin 10 ICAM-l-molekyyliä. Näillä kimeerisillä molekyyleillä saattaa olla useita hyviä puolia. Ensinnäkin Ig-molekyylit on suunniteltu pitkäikäisiksi verenkierrossa, mikä mahdollisesti nostaa biologista puoliintumisaikaa.

Lisäksi näiden rakennettujen molekyylien multimeeriluonne sallii niiden olla vuorovaikutuksessa korkeammalla affiniteetilla nuhaviruksen sekä solupinta-LFA-1:n kanssa, terapiayh-teydestä riippuen, jolloin se yhdistelmäproteiinimäärä, joka on annettava tehokkaan annoksen saamiseksi, laskee voimakkaasti. IgA ja IgM ovat erittäin glykosyloituja molekyylejä, joita normaalisti esiintyy 1imakalvoeritteissä esimerkiksi nenässä.

102181 125

Niiden erittäin hydrofiilinen luonne edistää niiden sitomien bakteerien ja viruksien pysymistä limakalvolla, jolloin viimemainittujen kiinnittyminen soluihin sekä epiteelisolumemb-raaniesteen läpäisy estyvät. Täten niiden terapeuttinen teho on mahdollisesti kasvanut. IgM ja erityisesti IgA ovat stabiileja limakalvoympäristöissä ja ne voivat nostaa ICAM-l-rakenteiden stabiilisuutta. Jos tällaista funktionaalista ICAM-1-johdannaista annetaan verenkiertoon, tämä mahdollisesti niinikään kasvattaa biologista puoliintumisaikaa. IgA ei kiinnitä komplementtia ja olisi täten ihanteellinen sovellutuksissa, joissa mainittu olisi kohtalokasta. Jos halutaan IgG-H-ketjukimeerejä, voitaisiin mutatoida komplementin kiinnitykseen sekä Fc-reseptorivuorovaikutuksiin osallistuvia alueita.

ESIMERKKI 36 ICAM-1-mutanttien muodostus Oligonukleotidiohiattu mutatointi ICAM-l-cDNA:n koodialue 1,8 ep:n SaiI-Kpnl-fragmentissa alakloonattiin ilmennysvektoriin CDMB (Seed, B., et ai.. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84 (1987) 3365 - 3369). Kunkelin, T., fProc.Natl.Acad.Sci. USA 82 (1985) 488 - 492) menetelmän ja Stauntonin, D., et ai.. (Staunton, D.E., et ai.. Cell 52 (1988) 925 - 933) modifikaatioiden mukaan tämän rakenteen (pCD1.8) avulla muodostettiin yksisäikeinen urasiilipitoinen templaatti käytettäväksi oligonukleotidiohjatussa mutatoinnissa.

Suupeasti, pCD1.8:lla transformoitiin E. coli -kanta XS127. Yksittäisiä pesäkkeitä kasvatettiin 1 ml:ssa Luria-liemi- (LB-) kasvualustaa (Difco), joka sisälsi 13 mikrogrammaa/ml ampisil-liinia ja 8 mikrogrammaa/ml tetrasykliiniä, lähelle kyllästys-pistettä. 100 mikrolitraan viljelmää tartutettiin R408-avusta-jafagi (Stratagene) monikerta- (10) tartutuksena (MOI), minkä jälkeen lisättiin 10 ml LB-kasvualustaa, joka sisälsi ampisil- 102181 126 liinia ja tetrasykliiniä, ja kasvatettiin 16 tunnin ajan 37 °C:ssa. Viljelmää sentrifugoitiin 10 000 kierr./min kierros-nopeudella 1 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantti suodatettiin 0,22 mikro-m:n suodattimella ja fagisuspensiolla tartutettiin E. coli -kanta BW313/P3, joka maljoitettiin sitten LB-agar-kasvualusta- (Difco) maljapinnoille, jolloin kasvualustaa oli täydennetty ampisilliinilla ja tetrasykliinillä. Pesäkkeet noukittiin ja niitä kasvatettiin 1 ml:ssa LB-kasvualustaa, jossa oli ampisilliinia ja tetrasykliiniä, lähelle kyllästyspistettä, minkä jälkeen viljelmiin tartutettiin avustajafagi MOI 10 -tartutuksena. Sitten viljelytilavuus nostettiin 250 mlrksi ja soluja viljeltiin yön yli. Yksisäikei-nen DNA eristettiin vakioilisella fagiuutolla.

Mutanttioligonukleotidit fosforyloitiin ja niitä käytettiin pCDl.8-templaatin ohella toisen säikeen synteesireaktiossa (Staunton, D., et ai .. Cell 52 (1988) 925 - 933).

Transfektointi COS-soluja siirrostettiin 10 cm:n kudosviljelmämaljoihin sellainen määrä, että viljelmä olisi 50-%:isesti yhteenkasvanut 16 - 24 tunnissa. Sitten COS-solut pestiin kerran TBS:llä ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 4 ml :11a RPMI:tä, joka sisälsi 10 % seerumia (Collaborative), 5 mikrogrammaa/ml klorokiinia, 3 mikrogrammaa mutanttiplasmidia ja 200 mikrogrammaa DEAE-dekstraanisulfaattia. Sitten solut pestiin 10 % DMSO/PBS:llä ja sen jälkeen PBS:llä, minkä jälkeen niitä viljeltiin 16 tunnin ajan kasvualustassa. Kasvualusta korvattiin tuoreella kasvualustalla ja ajankohtana 48 tuntia tartutuksesta COS-solut lietettiin trypsiini/EDTA- (Gibco) käsittelyllä ja jaettiin 2, 10 cm:n maljoihin sekä 24 kuopan kudosviljelmälevyille HRV-sitoutumista varten. Ajankohtana 72 tuntia solut otettiin talteen 10 cm:n maljoista käyttäen 5 mM EDTA/HBSS:ää ja niitä käsiteltiin silmälläpitäen kiinnittämistä LFA-l-päällysteiseen 127 Ί Γ ° Λ Γ· 1

i L . u· I

muoviin ja immunofluoresenssimääritystä.

LFA-1:n ia HRV:n sitoutuminen LFA-1 puhdistettiin SKW-3-lysaateista immunoaffiniteettikroma-tografisesti TS2/4-LFA-l-MAb-Sepharose -geelissä ja eluoitiin pH:ssa 11,5 2 mM MgCl2:n ja 1 %:n oktyyliglukosidia läsnäollessa. LFA-1 (10 mikrogrammaa/200 mikrolitraa/6 cm:n malja) sidottiin bakteriologisiin petrimaljoihin laimentamalla pitoisuuteen 0,1 % oktyyliglukosidia PBS:ssä (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos), joka sisälsi 2 mM MgCl2, ja inkuboi-malla yön yli 4 °C:ssa. Maljat salvattiin l-%:isella BSA-liuoksella (nautaseerumialbumiini-) ja varastoitiin PBS:ssä, joka sisälsi pitoisuudet 2 mM MgCl2, 0,2 % BSA:ta, 0,025 % atsidia ja 50 mikrogrammaa/ml gentamysiiniä.

5lCr-leimattuja COS-soluja PBSrssä, joka sisälsi 5 % FCS:ää (vasikansikiöseerumia), 2 mM MgCl2, 0,025 % atsidia (puskuri), inkuboitiin lisäten 5 mikrogrammaa/ml RRl/l:tä ja R6.5:tä, tai mainittua lisäystä suorittamatta, LFA-l-päällysteisillä mikrotiitterilevyillä 25 °C:ssa 1 tunnin ajan. Ei-kiinnittyneet solut poistettiin pesemällä 3 kertaan puskurilla. Kiinnittyneet solut eluoitiin lisäämällä EDTA:ta pitoisuuteen 10 mM ja suoritettiin gamma-1askenta.

* TULOKSET

On tunnistettu ICAM-l-vastaisia vasta-aineita kuten RR1/1, R6.5, LB-2 tai CL203. Jos nämä vasta-aineet kykenevät estämään ICAM-l-funktion, ne väittämättä kykenevät sitoutumaan johonkin tiettyyn kohtaan ICAM-l-molekyylissä, joka on tärkeä myös ICAM-1-funktiolle. Täten valmistamlla edellä kuvattuja ICAM-1-deleetiomutantteja ja määrittämällä, missä määrin ICAM-1-vastaiset vasta-aineet kykenevät sitoutumaan deleetioon, voidaan määrittää, ovatko deletoidut alueet tärkeitä 102181 128 funktiolle.

ICAM-1 on integraalinen membraaniproteiini, jonka solunulkoisen alueen ennustetaan koostuvan viidestä Ig:n kaltaisesta C-alueesta. LFA-l-sitoutumiseen osallistuvien alueiden tunnistamiseksi alue 3 ja alueet 4 ja 5 (karboksyylipää) deletoitiin oligonukleotidiohjattua mutatointia käyttäen, minkä jälkeen ne ilmennettiin COS-soluissa ja suoritettiin funktionaalisia kokeita. Lisäksi sytoplasma-alue kokonaisuudessaan deletoitiin sen mahdollisen vaikutuksen ICAM-l-vuorovaikutuksiin todentamiseksi. Kuten ennakoitu sytoplasma-alue deleetio, Y476/*, ei osoittanut RR1/1-, R6.5-, LB-2- ja CL203-reaktiivisuuden menetystä, kun puolestaan alueen 3, F185 - R451, deleetion seurauksena CL203-reaktiivisuus vastaavasti laski (kuvio 20). Täten CL203-epitooppi sijaitsee ilmeisesti alueella 4 kun taas RR1/1, R6.5 ja LB-2 vaikuttavat sijaitsevan 2 aminopää-alueella.

Kaikki 3 deleetiomutanttia osoittavat villityypin LFA-1-kiinnitystasoja (kuvio 21). Aminohapposubstituutioita muodostettiin myös alueiden 1, 2 ja 3 ennakoituihin beeta-käänteisiin, rakenteet ilmennettiin COS-soluissa ja niiden funktionaalisuutta testattiin. R6.5-epitooppi paikannettiin täten sekvenssiin E111GCA alueessa 2, ja siihen saattaa niinikään liittyä E39 alueella 1, kun taas RR1/1 ja LB-2 kumpikin ovat riippuvaisia R13:sta alueella 1 (kuvio 22).

Lisäksi RRl/l-sitoutumista alentavat mutaatiot sekvenssissä D71GQS. Mutaatioiden seurauksena, jotka eliminoivat N-kytkentäglykosylaatiokeskuksia N103:ssa ja N165:ssä, RRl/l:n, R6.5:n ja LB-2:n LFA-l-HRV-sitoutuminen laskee. Nämä mutaatiot ilmeisesti vaikuttavat prosessointiin siten, että muodostuu ICAM-1-dimeerejä.

Muiden mutaatioiden alueilla 2 tai 3 seurauksena LFA-1-kiinnitys ei muuttunut (kuviot 23 ja 24). Alueen 1 aminohapot 129 1C21E1 R13 ja D60 kumpikin osallistuvat LEA-1-sitoutumiseen (kuvio 25).

Täten LFA-l:n ja HRV:n sitoutuminen vaikuttaa olevan ICAM-l:n Ig-kaltäisen alueen aminopään funktio. Kuviossa 26 esitetään ICAM-aminopää-alueiden rinnakkainasettelu.

Vaikka keksintöä on kuvattu liittyen sen spesifisiin suoritusmuotoihin, tulee huomata, että siihen voidaan tehdä muita modifikaatioita, jolloin tämän hakemuksen tarkoituksena on kattaa keksinnön kaikki muunnokset, käytöt tai sovellutukset, jotka yleensä ottaen noudattavat keksinnön periaatteita ja poikkeavat tästä julkaisusta tavalla, joka pysyttelee keksinnön koskeman alan tunnetun tai tavanomaisen käytännön puitteissa ja johon voidaan soveltaa tässä edellä esitettyjä oleellisia ominaispiirteitä oheisten patenttivaatimuksien kattaman alueen puitteissa.

Claims (1)

102181 1 30 Patenttivaatimus Menetelmä ICAM-l:n (solujen välinen kiinnikemolekyyli) saamiseksi oleellisesti puhtaassa, funktionaalisesti ak-5 tiivisessa muodossa, ja joka oleellisesti ei sisällä yleensä ihmisen ICAM-l:n liittyviä, luonnossa esiintyviä proteiineja, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (1) ICAM-1 liuotetaan ICAM-l:n ilmentävien solujen mem-10 braaneista liukoisen ICAM-l-valmisteen muodostamiseksi; (b) tämä liukoinen ICAM-l-valmiste viedään affiniteetti-matriisiin, joka sanottu matriisi sisältää ICAM-1reen sitoutumaan kykenevän immobilisoidun vasta-aineen; (c) sanotun ICAM-1:n annetaan sitoutua vasta-aineeseen 15 sanotussa affiniteettimatriisissa; (d) matriisista poistetaan kaikki yhdisteet, jotka eivät kykene sitoutumaan vasta-aineeseen käyttämällä eluointi-puskuria, jonka pH on korkeintaan 11; ja (e) ICAM-1 otetaan talteen oleellisesti puhtaassa, funk-20 tionaalisesti aktiivisessa muodossa, eluoimalla ICAM-1 matriisista pH-arvossa 12,5 tai oleellisesti 12,5, jota seuraa eluaatin välitön neutralointi. 102181 Förfarande för att erhälla ICAM-1 (interraolekylär adhe-sionsmolekyl) i väsentligen ren, funktionellt aktiv form, 5 och som väsentligen inte innehäller i allmänhet till human ICAM-1 anslutande, i naturen förekommande proteiner, kän-netecknad därav, att det omfattar följande steg: (1) ICAM-1 solubiliseras frän membraner av celler, som expresserar ICAM-1 för att bilda ett solubiliserat ICAM-1-10 preparat; (b) detta solubiliserade ICAM-l-preparat förs tili en af-finitetsmatris, vilken nämnda matris innehäller immobili-serade antikroppar, som förmär binda vid ICAM-1; (c) nämnda ICAM-1 fär binda vid antikropparna i nämnda 15 affinitetsmatris; (d) ur matrisen avlägsnas alla föreningar, som inte förmär binda vid antikropparna, genom att använda en eluerings-buffert med ett pH pä upp tili 11; och (e) ICAM-1 tillvaratas i väsentligen ren, funktionellt 20 aktiv form, genom att eluera ICAM-1 ur matrisen vid ett pH-värde av 12,5 eller väsentligen 12,5, varefter följer omedelbar neutralisering av eluatet.