ES2931330T3

ES2931330T3 - Métodos y composiciones para la preparación de aerosoles

Info

Publication number: ES2931330T3
Application number: ES19152522T
Authority: ES
Inventors: Erik Depla; Mauro Sergi; Peter Casteels
Original assignee: Ablynx NV
Current assignee: Ablynx NV
Priority date: 2010-02-11
Filing date: 2011-02-11
Publication date: 2022-12-28
Anticipated expiration: 2031-02-11
Also published as: CN102753148B; EP3501499A1; WO2011098552A3; CY1122634T1; JP2016193923A; HUE044292T2; US20170333344A1; HRP20191071T1; US11007146B2; CN102753148A; ES2738114T3; HK1222128A1; SI2533761T1; CA2787718A1; PT3501499T; US9713589B2; JP6283064B2; CA2787718C; EP2533761B1; US20210346287A1

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para la preparación de un aerosol. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en los que la cantidad de formación de agregados se reduce significativamente. La invención proporciona además aerosoles preparados mediante los métodos de la invención, así como composiciones para uso en los métodos de la invención. La invención se refiere además a métodos para la preparación de tales composiciones, a recipientes, kits y sistemas de suministro de aerosol que comprenden tales composiciones ya usos de las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para la preparación de aerosoles

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos para la preparación de un aerosol. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el que la cantidad de formación de agregados está reducida significativamente. La invención proporciona además aerosoles preparados mediante los métodos de la invención, así como composiciones para su uso en los métodos de la invención.

La invención se refiere además a métodos para las preparaciones de tales composiciones, y a sistemas de administración de aerosol que comprenden tales composiciones y a usos de los mismos.

Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención quedarán claros a partir de la descripción adicional en el presente documento.

TÉCNICA ANTERIOR

Los dominios variables únicos de inmunoglobulina (tal como se describen adicionalmente en el presente documento) están caracterizados por la formación del sitio de unión a antígeno mediante un dominio variable único, que no requiere interacción con un dominio adicional (por ejemplo, en forma de interacción VH/VL) para el reconocimiento de antígenos. Se han descrito dominios variables únicos de inmunoglobulina frente a una amplia gama de diferentes objetivos (documentos WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/040153, WO 06/122825, WO 07/104529, WO 08/020079, WO 08/074839, WO 08/071447, WO 08/074840, WO 08/074867, WO 08/077945, WO 08/101985, WO 08/142164, WO 09/068625, WO 08/142165, WO 09/068627) que podrían ser candidatos para el desarrollo de fármacos. Se han descrito dominios variables únicos de inmunoglobulina frente a la subunidad p19 de IL-23 que bloquean la interacción de IL-23 con su receptor, por ejemplo, en el documento WO 09/068627. Se han descrito dominios variables únicos de inmunoglobulina frente a la proteína F del virus sincitial respiratorio humano (VRSh) que pueden neutralizar el VRSh, por ejemplo, en el documento WO 09/147248.

La mayoría de los dominios variables únicos de inmunoglobulina en desarrollo preclínico o clínico se han administrado por vía parenteral (es decir mediante administración intravenosa o subcutánea) y se han descrito formulaciones estables para estos métodos de administración (véanse, por ejemplo, la solicitud PCT n ° PCT/EP2010/062972 (presentada el 3 de septiembre de 2010) basada en la solicitud provisional estadounidense n ° US 61/275.816 (presentada el 3 de septiembre de 2009) y la solicitud PCT n ° PCT/EP2010/062975 (presentada el 3 de septiembre de 2010) basada en la solicitud provisional estadounidense n ° US 61/284.502 presentada por Ablynx N.V. el 18 de diciembre de 2009). Sin embargo, estos métodos de administración tienen una aceptación por los pacientes bastante baja y existe una necesidad de modos de administración alternativos, más convenientes (sin agujas), que puedan realizarse fácilmente por los propios pacientes.

Un posible método alternativo es la administración del dominio variable único de inmunoglobulina a través de los pulmones. La administración farmacológica pulmonar puede conseguirse mediante inhalación, por vía oral y/o por vía nasal. Los ejemplos de dispositivos farmacéuticos para la administración pulmonar incluyen inhaladores de dosis medida (MDI), inhaladores de polvo seco (DPI) y nebulizadores. Tradicionalmente, los nebulizadores se han clasificado en dos tipos principales: dispositivos de chorro de aire (neumáticos) y ultrasónicos. Recientemente se ha comercializado un tercer tipo, nebulizadores de malla vibratoria (Newman y Gee-Turner, 2005, J. Appl. Ther. Res. 5: 29-33).

El nebulizador es una primera elección lógica para el desarrollo de un fármaco a base de proteína farmacéutica para la administración pulmonar ya que la mayoría de las proteínas están purificadas y almacenadas como concentrado acuoso. Sin embargo, la estabilidad de las disoluciones acuosas en almacenamiento puede no traducirse en estabilidad durante la nebulización y la proteína puede desnaturalizarse mediante varios mecanismos incluyendo secado, cizallamiento y efectos superficiales (Charm y Wong, 1970, Biotechnol. Bioeng 12: 1103-1109; Andrews, 1991, Biochem. Soc. Trans, 272S 19). Por ejemplo, se ha mostrado que la nebulización indujo la pérdida de actividad enzimática de lactato deshidrogenasa (LDH) y dio como resultado agregación, que consistía principalmente en la formación de dímeros, y la degradación de factor estimulante de granulocitos humano recombinante (G-CSF) (Niven y Brain, 1994, Int. J. Pharm., 104: 73-85).

El documento WO 04/041867 describe métodos y composiciones para la administración pulmonar de dominio variables único de inmunoglobulina. En el documento WO 09/074634 se describen métodos de administración pulmonar directa de anticuerpos de dominio, y composiciones de anticuerpo de dominio particulares adecuadas para la administración pulmonar directa. Más específicamente, se describen composiciones que comprenden un polipéptido de anticuerpo de dominio y un tampón que contiene del 2% a aproximadamente el 10% de PEG1000 y el 1,2% de sacarosa (p/v). Estas composiciones de anticuerpo de dominio parecen tener una viscosidad que permite la producción de suficientes gotitas con el tamaño correcto para la administración a un sujeto mediante administración pulmonar local directa. Ninguno de los documentos anteriores describe o discute la reducción de la formación de agregados y/o la mejora de la estabilidad durante la administración pulmonar de dominios variables únicos de inmunoglobulina. Sigue habiendo una necesidad de métodos y composiciones adicionales para la administración de dominios variables únicos de inmunoglobulina intactos y funcionales por la vía pulmonar.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método (también denominado “método de la invención” o “métodos de la invención”) para la preparación de un aerosol (también denominado “aerosol de la invención”; tal como se define adicionalmente en el presente documento) de dominios variables únicos de inmunoglobulina con niveles de agregación de bajos a indetectables y/o sin una pérdida significativa de actividad biológica y/o potencia de los dominios variables únicos de inmunoglobulina. El método de la invención comprende la etapa de atomizar una composición (también denominada “composición de la invención” o “composiciones de la invención” ; tal como se define adicionalmente en el presente documento) que comprende un portador acuoso y un polipéptido (también denominado “polipéptido de la invención” o “polipéptidos de la invención”; tal como se define adicionalmente en el presente documento) que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 1 mg/ml a 200 mg/ml. Se ha demostrado en la presente invención que la presencia de ciertos elementos en la composición que debe atomizarse (“composición de la invención”) y/o el uso de sistemas de administración de aerosol seleccionados reduce significativamente (y de manera inesperada) la cantidad de formación de agregados en el material atomizado y, en consecuencia, la pérdida de actividad biológica y/o potencia de los polipéptidos de la invención presentes en el material atomizado. Se ha mostrado que la cantidad de formación de agregados puede reducirse hasta el 6% o menos, el 5% o menos, tal como el 4% o menos, el 3% o menos, el 2% o menos, o incluso el 1% o menos. La reducción en la formación de agregados fue inesperada, en ausencia de tensioactivo.

La presencia del polipéptido de la invención en la composición de la invención a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, también redujo significativamente la cantidad de formación de agregados en el material atomizado. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el que la cantidad de formación de agregados es del 6% o menor, el 5% o menor, tal como el 4% o menor, el 3% o menor, el 2% o menor, o incluso el 1% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, comprendiendo dicho método la etapa de atomizar una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina, en el que el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición de la invención a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más.

La presencia del polipéptido de la invención en la composición de la invención a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, redujo significativamente la cantidad de formación de agregados en el material atomizado en ausencia de un tensioactivo. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el que la cantidad de formación de agregados es del 6% o menor, el 5% o menor, tal como el 4% o menor, el 3% o menor, el 2% o menor, o incluso el 1% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, comprendiendo dicho método la etapa de atomizar una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, en el que la composición no comprende un tensioactivo.

En un aspecto preferido, el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml o más, 70 mg/ml o más, 80 mg/ml o incluso más. En un aspecto lo más preferido, el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 50 mg/ml. La reducción en formación de agregados a concentraciones mayores (por ejemplo, una relación inversa entre la concentración y la formación de agregados), tal como a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, fue inesperada.

El uso de un sistema de administración de aerosol particular, es decir el nebulizador de malla vibratoria, para atomizar la composición de la invención también redujo significativamente la cantidad de formación de agregados en el material atomizado. Por consiguiente, en aún otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el que la cantidad de formación de agregados es del 6% o menor, el 5% o menor, tal como el 4% o menor, el 3% o menor, el 2% o menor, o incluso el 1% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, comprendiendo dicho método la etapa de atomizar una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 1 mg/ml a 200 mg/ml, en el que la composición se atomiza en un nebulizador de malla vibratoria. La reducción en formación de agregados usando un nebulizador de malla vibratoria fue inesperada.

El método de la invención es preferiblemente capaz de producir un aerosol que tiene un diámetro de la mediana volumétrica de entre 1 y 10 pm, preferiblemente entre 1 y 7 pm, lo más preferiblemente entre 1 y 5 pm, tal como alrededor de 3, 3,5 o 4 pm.

La invención se refiere a un aerosol que comprende gotitas de líquido que pueden obtenerse atomizando una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina, en el que la cantidad de formación de agregados en el material atomizado es del 6% o menor, el 5% o menor, tal como el 4% o menor, el 3% o menor, el 2% o menor, o incluso el 1% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, en el que el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, y en el que la composición no comprende un tensioactivo.

En un aspecto preferido, el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml o más, 70 mg/ml o más, 80 mg/ml, o incluso más. En un aspecto lo más preferido, el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 50 mg/ml.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un aerosol que comprende gotitas de líquido que pueden obtenerse atomizando una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 1 mg/ml a 200 mg/ml, en el que la cantidad de formación de agregados es del 6% o menor, el 5% o menor, tal como el 4% o menor, el 3% o menor, el 2% o menor, o incluso el 1% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, en el que la composición se atomiza en un nebulizador de malla vibratoria.

La invención se refiere también a una composición (“composición de la invención” o “composiciones de la invención”) adecuada para su uso en el método de la invención y/o adecuada para la preparación del aerosol de la invención.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a una composición adecuada para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el que la cantidad de formación de agregados es del 6% o menor, el 5% o menor, tal como el 4% o menor, el 3% o menor, el 2% o menor, o incluso el 1% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, en el que el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, y en el que la composición no comprende un tensioactivo.

En un aspecto preferido, el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml o más, 70 mg/ml o más, 80 mg/ml o incluso más. En un aspecto lo más preferido, el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 50 mg/ml.

El polipéptido (también denominado “polipéptido de la invención” o “polipéptidos de la invención”) comprende o esencialmente consiste en uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina (tal como se define en el presente documento). En un aspecto, el polipéptido de la invención comprende o esencialmente consiste en un dominio variable único de inmunoglobulina. En otro aspecto, el polipéptido de la invención comprende o esencialmente consiste en dos o más dominios variables únicos de inmunoglobulina, tal como dos o tres. En otro aspecto, el polipéptido de la invención se une específicamente a VRSh o IL-23. En otro aspecto, el polipéptido de la invención se selecciona de una de SEQ ID NO: 1,2 y 3.

La invención se refiere también a métodos para la preparación de la composición de la invención. Los métodos comprenden al menos la etapa de concentrar el polipéptido e intercambiarlo por el tampón seleccionado.

En otro aspecto, en el método para la preparación de una composición de la invención el polipéptido se concentra hasta una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más.

En el método para la preparación de una composición de la invención el polipéptido se concentra hasta una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, y no se añade ningún tensioactivo.

En un aspecto preferido, el polipéptido se concentra hasta una concentración de 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml o más, 70 mg/ml o más, 80 mg/ml, o incluso más. En un aspecto lo más preferido, el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 50 mg/ml.

La invención proporciona además el uso de los métodos, el aerosol y las composiciones de la invención. Los métodos, el aerosol y las composiciones de la invención son para su uso en la administración a un sujeto humano a través de un nebulizador de malla vibratoria.

También se proporcionan sistemas de administración de aerosol. El sistema de administración de aerosol debe comprender al menos un recipiente y un generador de aerosol conectado al recipiente, en el que el recipiente comprende una composición de la invención. El sistema de administración de aerosol es un nebulizador de malla vibratoria.

Las composiciones, y los sistemas de administración de aerosol, se usan en la profilaxis y/o terapia, tal como para la prevención y/o el tratamiento de una o más enfermedades y/o trastornos tales como enfermedades y/o trastornos respiratorios (por ejemplo, infección por VRSh). En un aspecto, la enfermedad y/o el trastorno tratado es infección por VRSh. Según la invención, la composición se administra a través de un nebulizador de malla vibratoria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Comparación de temperaturas de fusión (Tm) de VRS434 en presencia de diferentes agentes de tamponamiento con manitol como agente de osmolaridad. Las mediciones se realizaron por medio de ensayo de desplazamiento térmico (TSA) a 0,1 mg/ml.

Figura 2. Porcentaje (%) de picos previos medido mediante el análisis de SE-HPLC de VRS434 nebulizado a 5 mg/ml por medio del nebulizador de malla Omron en presencia de diferentes composiciones de tampón/excipiente (se usaron glicina y manitol a una concentración de 0,3 M, NaCl at 0,15 M).

Figura 3: Porcentaje (%) de picos previos medido mediante el análisis de SE-HPLC de VRS434 nebulizado a 5 mg/ml por medio del nebulizador de malla Omron en presencia de diferentes composiciones de tampón/excipiente con Tween 80 y/o PEG1000.

Figura 4. Representación de la formación de picos previos a partir de datos de análisis de SE-HPLC, tras la nebulización de disoluciones 5 mg/ml de VRS434 por medio del nebulizador Akita2 Apixneb™ (un nebulizador de malla vibratoria) (nebulizado) en comparación con el material no nebulizado (REF).

Figura 5. Representación de la recuperación de proteína a partir de datos de análisis de SE-HPLC, tras la nebulización de disoluciones 5 mg/ml de VRS434 por medio del nebulizador Akita2 Apixneb™ (un nebulizador de malla vibratoria) en comparación con el material de referencia no nebulizado.

Figura 6. Representación de la formación de picos previos a partir de datos de análisis de SE-HPLC, tras la nebulización de disoluciones 5, 25 y 50 mg/ml de VRS434 por medio del nebulizador Akita2 Apixneb™ (un nebulizador de malla vibratoria).

Figura 7. Representación de la formación de picos previos a partir de datos de análisis de SE-HPLC, tras la nebulización de disoluciones 5, 25 y 50 mg/ml de VRS434 por medio del nebulizador de chorro Akita® (un nebulizador de chorro).

Figura 8. Tamaño de gotitas promedio (expresado como diámetro de la mediana volumétrica (VMD, Volume Median Diameter)) medido mediante difracción láser tras la nebulización de disoluciones de VRS434 con diferentes concentraciones de proteína y en presencia de diferentes composiciones de tampón/excipiente por medio del nebulizador Akita2 Apixneb™. La etiqueta en el eje X se refiere al código de producto y la composición asociada indicada en la tabla 8.

Figura 9. Zoom en la región de referencia de cromatogramas de SE-HPLC de VRS434 en fosfato 10 mM NaCl 0,13 M pH 7,0 (A) sin Tween 80 a 50 mg/ml, (B) con el 0,04% de Tween 80 a 50 mg/ml, (C) sin Tween 80 a 5 mg/ml, (D) con el 0,04% de Tween 80 a 5 mg/ml. La Figura indica los picos previos correspondientes a todas las formas multiméricas como “total de picos previos” y el pico previo correspondiente a especies de alto peso molecular (o pico previo 1) como “especies HMW”. La diferencia en el tiempo de retención entre los cromatogramas (A) y (B) y los cromatogramas (C) y (D) puede explicarse porque (A) y (B) se ejecutan a 0,15 ml/min y (C) y (D) a 0,2 ml/min.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A menos que se indique o se define lo contrario, todos los términos usados tienen su significado usual en la técnica, que estará claro para el experto en la técnica. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales estándar, tales como Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2a ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987); Lewin, “Genes II”, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., (1985); Old et al., “Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering”, 2a edición, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., “ Immunology” (6a ed.), Mosby/Elsevier, Edimburgo (2001); Roitt et al., Roitt’s Essential Immunology, 10a ed. Blackwell Publishing, R.U. (2001); y Janeway et al., “Immunobiology” (6a ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, Nueva York (2005), así como a la técnica anterior general citada en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aislado” en el contexto de un polipéptido se refiere a un polipéptido que está sustancialmente libre de material celular o proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que se deriva, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de un polipéptido en las que el polipéptido está separado de componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de manera recombinante. Por tanto, un polipéptido que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de un polipéptido que tiene menos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10% o el 5% (en peso seco) de proteína, polipéptido, péptido o anticuerpo heterólogos (también denominado una “proteína contaminante”). Cuando el polipéptido se produce de manera recombinante, también puede estar sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, el 10% o el 5% del volumen de la preparación de polipéptido. Cuando el polipéptido se produce mediante síntesis química, preferiblemente está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, está separado de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis del polipéptido. Por consiguiente, tales preparaciones de un polipéptido tienen menos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10%, el 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del polipéptido de interés. En una realización específica, un polipéptido “aislado” se purifica mediante un proceso de purificación de múltiples etapas que comprende dos etapas de cromatografía (por ejemplo, intercambio catiónico e intercambio aniónico), una etapa de ultrafiltración 100K, seguido de una etapa de intercambio de tampón y de concentración en el modo de ultrafiltración/diafiltración.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “sujeto” y “paciente” se usan de manera intercambiable. Tal como se usan en el presente documento, los términos “sujeto” y “sujetos” hacen referencia a un animal, preferiblemente un mamífero que incluye un no primate (por ejemplo, una vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata y ratón) y un primate (por ejemplo, un mono, tal como un macaco cangrejero, chimpancé, babuino y un humano), y más preferiblemente un humano. En una cierta realización, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un humano, con una o más enfermedades o trastornos. En otra realización, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un humano, que corre el riesgo de desarrollar una o más enfermedades y/o trastornos.

La frase “farmacéuticamente aceptable” tal como se usa en el presente documento significa aprobado por una agencia regulatoria del gobierno federal o el gobierno de un estado, o listado en la Farmacopea Estadounidense, la Farmacopea Europea u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más particularmente en humanos. En este sentido, debe ser compatible con los otros componentes de la formulación y no provocar un efecto perjudicial inaceptable en el sujeto. Se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del juicio médico sensato, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, proporcional con una relación de beneficio/riesgo razonable.

Según la Farmacopea Europea, una disolución se considera “isotónica” si tiene una osmolalidad de 290 ± 30 mOsm/kg. La isotonicidad puede medirse mediante, por ejemplo, un osmómetro de presión de vapor o de tipo de congelación de hielo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad efectiva” se refiere a la cantidad de un agente (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico) que es suficiente para reducir y/o aliviar la gravedad y/o duración de una o más enfermedades y/o trastornos.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “agente terapéutico” y “agentes terapéuticos” hacen referencia a cualquier agente que pueda usarse en la prevención, el tratamiento y/o la gestión de una o más enfermedades y/o trastornos. En el contexto de la presente invención, el término “agente terapéutico” se refiere a un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina. En ciertas otras realizaciones, el término “agente terapéutico” se refiere a un agente distinto del polipéptido de la invención que puede usarse en la composición.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a la cantidad de un agente terapéutico (por ejemplo, un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina), que es suficiente para reducir la gravedad de una o más enfermedades y/o trastornos.

El término “excipiente” tal como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia inerte que se usa comúnmente como diluyente, vehículo, conservante, aglutinante o agente estabilizante para fármacos que confiere una propiedad física beneficiosa a una formulación, tal como estabilidad de proteína aumentada, solubilidad de proteína aumentada y/o viscosidad disminuida. Los ejemplos de excipientes incluyen, pero no se limitan a, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica), aminoácidos (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, glicina), tensioactivos (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS), polisorbatos tales como Tween 20 y Tween 80, poloxámeros tales como Pluronics, y otros tensioactivos no iónicos tales como poli(etilenglicol) (PEG)), sacáridos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, maltosa y trehalosa), polioles (por ejemplo, manitol y sorbitol), ácidos grasos y fosfolípidos (por ejemplo, alquilsulfonatos y caprilato). Para información adicional relativa a excipientes, véase Remington’s Pharmaceutical Sciences (de Joseph P. Remington, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA).

El término “dominio variable” se refiere a la parte o dominio de una molécula de inmunoglobulina o anticuerpo que es parcial o totalmente responsable de la unión a antígeno. El término “dominio variable único”, define moléculas en las que el sitio de unión a antígeno está presente sobre, y formado por, un dominio de inmunoglobulina único. Esto distingue los dominios variables únicos de inmunoglobulinas “convencionales” o sus fragmentos, en los que dos dominios de inmunoglobulina, en particular dos “dominios variables” interaccionan para formar un sitio de unión a antígeno. Normalmente, en inmunoglobulinas convencionales, un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) interaccionan para formar un sitio de unión a antígeno. En este caso, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) tanto de VH como de VL contribuirán al sitio de unión a antígeno, es decir un total de 6 CDR estarán implicadas en la formación de sitio de unión a antígeno.

Por el contrario, el sitio de unión de un dominio variable único de inmunoglobulina se forma mediante un dominio VH o VL único. Por tanto, el sitio de unión a antígeno de un dominio variable único de inmunoglobulina se forma mediante no más de tres CDR. El término “dominio variable único de inmunoglobulina” sí comprende fragmentos de inmunoglobulinas convencionales en las que el sitio de unión a antígeno está formado por un dominio variable único.

Generalmente, los dominios variables únicos de inmunoglobulina serán secuencias de aminoácidos que consisten esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente); o cualquier fragmento adecuado de una secuencia de aminoácidos de este tipo (que contendrá entonces habitualmente al menos algunos de los residuos de aminoácido que forman al menos una de las CDR). Tales dominios variables únicos de inmunoglobulina y fragmentos son lo más preferiblemente de modo que comprenden un pliegue de inmunoglobulina o son capaces de formar, en condiciones adecuadas, un pliegue de inmunoglobulina. Como tal, el dominio variable único de inmunoglobulina puede, por ejemplo, comprender una secuencia de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia VL) o un fragmento adecuado de la misma; o una secuencia de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia V^ho secuencia V^hh) o un fragmento adecuado de la misma; siempre que sea capaz de formar una unidad de unión a antígeno única (es decir una unidad de unión a antígeno funcional que esencialmente consiste en el dominio variable único de inmunoglobulina, de modo que el dominio de unión a antígeno único no necesita interaccionar con otro dominio variable para formar una unidad de unión a antígeno funcional, tal como es, por ejemplo, el caso para los dominios variables que están presentes en, por ejemplo, anticuerpos convencionales y fragmentos scFv que necesitan interaccionar con otro dominio variable - por ejemplo, a través de una interacción VH/VL - para formar un dominio de unión a antígeno funcional).

En un aspecto de la invención, los dominios variables únicos de inmunoglobulina son secuencias de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia V^l), o secuencias de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia V^h); más específicamente, los dominios variables únicos pueden ser secuencias de dominio variable de cadena pesada que se derivan de un anticuerpo tetracatenario convencional o secuencias de dominio variable de cadena pesada que se derivan de un anticuerpo de cadena pesada.

El dominio variable único de inmunoglobulina puede ser un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para su uso como anticuerpo de dominio), un anticuerpo de dominio único (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para su uso como anticuerpo de dominio único), un “dAb” (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para su uso como dAb) o un Nanobody® (tal como se define en el presente documento, y que incluye, pero no se limita a, una secuencia V^hh) [Nota: Nanobody® y Nanobodies® son marcas comerciales registradas de Ablynx N.V.]; otros dominios variables únicos de inmunoglobulina, o cualquier fragmento adecuado de uno cualquiera de los mismos. Para una descripción general de anticuerpos de dominio (único), se hace referencia también a la técnica anterior citada en el presente documento, así como al documento EP 0368 684. Para el término “dAb”, se hace referencia, por ejemplo, a Ward etal. 1989 (Nature 341: 544-546), a Holt etal. 2003 (Trends Biotechnol.

21: 484-490); así como a, por ejemplo, los documentos WO 04/068820, ^wO 06/030220, WO 06/003388 y otras solicitudes de patente publicadas de Domantis Ltd. También debe observarse que, aunque son menos preferidos en el contexto de la presente invención porque no son de origen de mamífero, los dominios variables únicos de inmunoglobulina pueden derivarse de ciertas especies de tiburón (por ejemplo, los denominados “dominios IgNAR”, véase, por ejemplo, el documento WO 05/18629).

En particular, los polipéptidos de la invención pueden comprender uno o más Nanobodies o un fragmento adecuado de los mismos. Para una descripción adicional de V^hhy Nanobodies, se hace referencia al artículo de revisión de Muyldermans 2001 (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302; así como a las siguientes solicitudes de patente, que se mencionan como técnica anterior general: WO 94/04678, WO9504079 y WO9634103 de the Vrije Universiteit Brussel; WO9425591, WO9937681, WO0040968, WO0043507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1 134 231 y WO 02/48193 de Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 y WO 03/055527 de the Vlaams lnstituut voor Biotechnologie (VIB); W o 03/050531 de Algonomics N.V. y Ablynx N.V.; WO 01/90190 de the National Research Council of Canada; WO 03/025020 (= EP 1433793) de the Institute of Antibodies; así como WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 y WO 06/122825, de Ablynx N.V. y las solicitudes de patente publicadas adicionalmente de Ablynx N.V. También se hace referencia a la técnica anterior adicional mencionada en estas solicitudes, y en particular a la lista de referencias mencionada en las páginas 41-43 de la solicitud internacional WO 06/040153. Tal como se describe en estas referencias, los Nanobodies (en particular las secuencias V^hhy Nanobodies parcialmente humanizados) pueden estar en particular caracterizados por la presencia de uno o más “residuos distintivos" en una o más de las secuencias de entramado. Una descripción adicional de los Nanobodies, incluyendo la humanización y/o camelización de Nanobodies, así como otras modificaciones, partes o fragmentos, derivados o “fusiones de Nanobody”, constructos multivalentes (incluyendo algunos ejemplos no limitativos de secuencias ligadoras) y diferentes modificaciones para aumentar la semivida de los Nanobodies y sus preparaciones puede encontrarse, por ejemplo, en los documentos WO 08/101985 y WO 08/142164.

El número total de residuos de aminoácido en un Nanobody puede estar en la región de 110-120, es preferiblemente de 112-115 y es lo más preferiblemente de 113. Sin embargo, debe indicarse que partes, fragmentos, análogos o derivados (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) de un Nanobody no están limitados particularmente en cuanto a su longitud y/o tamaño, siempre que tales partes, fragmentos, análogos o derivados cumplan los requisitos adicionales esbozados en el presente documento y también sean preferiblemente adecuados para los propósitos descritos en el presente documento.

Por tanto, en el significado de la presente invención, el término “dominio variable único de inmunoglobulina” comprende polipéptidos que se derivan de una fuente no humana, preferiblemente un camélido, preferiblemente un anticuerpo de cadena pesada de camélido. Pueden estar humanizados, tal como se describió previamente. Además, el término comprende polipéptidos derivados de fuentes no de camélido, por ejemplo, de ratón o humano, que se han “camelizado”, tal como se describió previamente.

El término “dominio variable único de inmunoglobulina” también abarca dominios variables de diferente origen, que comprende dominios variables de ratón, rata, conejo, burro, humano y camélido; así como dominios variables totalmente humanos, humanizados o quiméricos. Por ejemplo, la invención comprende dominios variables de camélido y dominios variables de camélido humanizados, o dominios variables camelizados, por ejemplo, dAb camelizado tal como se describe por Ward et al (véanse, por ejemplo, el documento WO 94/04678 y Davies y Riechmann (1994, FEBS Lett. 339: 285-290) y (1996, Protein Eng.9: 531-537)). Además, la invención comprende dominios variables fusionados, por ejemplo, constructos multivalentes y/o multiespecíficos (para polipéptidos multivalentes y multiespecíficos que contienen uno o más dominios V^hhy su preparación, también se hace referencia a Conrath et al.

2001 (J. Biol. Chem. 276: 7346-7350) así como a, por ejemplo, los documentos WO 96/34103 y WO 99/23221).

Los dominios variables únicos de inmunoglobulina proporcionados por la invención están preferiblemente en forma esencialmente aislada (tal como se define en el presente documento), o forman parte de un polipéptido (también denominado “polipéptido de la invención”), que puede comprender o esencialmente consistir en uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina y que pueden comprender además opcionalmente una o más secuencias de aminoácidos adicionales (todas ligadas opcionalmente por medio de uno o más ligadores adecuados). Por ejemplo, y sin limitación, el uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina pueden usarse como unidad de unión en un polipéptido de este tipo, que puede contener opcionalmente una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden servir como unidad de unión (es decir frente a una o más otras dianas), para proporcionar un polipéptido monovalente, multivalente o multiespecífico de la invención, respectivamente tal como, por ejemplo, se describe en los documentos WO 08/101985, WO 08/142164, WO 09/068625, WO 09/068627 y WO 08/020079. Una proteína o polipéptido de este tipo también puede estar en forma esencialmente aislada (tal como se define en el presente documento) y los métodos, aerosoles y composiciones de la presente invención ser aplicables igualmente a dominios variables únicos de inmunoglobulina y a polipéptidos que comprenden uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina.

Según la invención, el término “dominio variable único de inmunoglobulina” puede comprender constructos que comprenden dos o más unidades de unión a antígeno en forma de dominio variable único de inmunoglobulina, tal como se esbozó anteriormente. Por ejemplo, dos (o más) dominios variables únicos de inmunoglobulina con la misma o diferente especificidad de antígeno pueden ligarse para formar, por ejemplo, un constructo bivalente, trivalente o multivalente. Al combinar dominios variables únicos de inmunoglobulina de dos o más especificidades, pueden formarse constructos biespecíficos, triespecíficos, etc. Por ejemplo, un dominio variable único de inmunoglobulina según la invención puede comprender o esencialmente consistir en dos o tres dominios variables únicos de inmunoglobulina idénticos, o dos dominios variables únicos de inmunoglobulina dirigidos frente a una diana A, y un dominio variable único de inmunoglobulina frente a una diana B. Tales constructos y modificaciones de los mismos, que el experto en la técnica puede concebir fácilmente, están todos abarcados por el término “dominio variable único de inmunoglobulina” tal como se usa en el presente documento y también se denominan “polipéptido de la invención” o “polipéptidos de la invención”.

Tal como se describe además en el párrafo m) en la página 53 del documento WO 08/020079, una secuencia de aminoácidos (tal como un Nanobody, un anticuerpo, un polipéptido de la invención, o generalmente una proteína o polipéptido de unión a antígeno o un fragmento del mismo) que puede unirse (específicamente) a, que tiene afinidad por y/o que tiene especificidad para un determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína específico (o para al menos una parte, fragmento o epítopo del mismo) se dice que es “frente a” o está “dirigida frente a” dicho determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína.

Un “aerosol” tal como se usa en el presente documento se refiere a una suspensión de líquido en forma de partículas finas dispersadas en un gas (es decir una niebla o pulverización fina que contiene partículas diminutas). Tal como se usa en el presente documento, el término “partícula” se refiere a líquidos, por ejemplo, gotitas. Los aerosoles farmacéuticos para la administración de los polipéptidos de la invención a los pulmones pueden inhalarse a través de la boca y/o a través de la nariz. En la administración pulmonar, se considera necesaria la generación de partículas menores de aproximadamente 5 o 6 micrómetros para conseguir deposición como la fracción de partículas finas (FPF) (es decir en los bronquiolos respiratorios y la región alveolar) (O’Caliaghan y Barry, 1997, Thorax 52: S31-S44). El tamaño de partícula en un aerosol puede expresarse como diámetro de la mediana volumétrica (VMD). El “diámetro de la mediana volumétrica” se define como el diámetro de partícula geométrico de un aerosol, en el que el 50% del volumen de aerosol es mayor que este valor y el 50% es menor que este valor. El “diámetro aerodinámico de la mediana másica (MMAD, Mass Median Aerodynamic Diameter)" se define como el diámetro aerodinámico medio geométrico, en el que el 50% de las partículas en peso será menor que este valor y el 50% será mayor que este valor. Cuando la densidad de las partículas de aerosol es de 1 g/cm3, el VMD y el MMAD son equivalentes. El aerosol de la presente invención tiene preferiblemente un diámetro de la mediana volumétrica entre 1 y 10 pm, preferiblemente entre 1 y 7 pm, lo más preferiblemente entre 1 y 5 pm, tal como alrededor de 3, 3,5 o 4 pm.

“Aerosolización” tal como se usa en la presente invención significa la producción de un aerosol mediante la transformación de una composición de la invención en partículas pequeñas o gotitas. Esto se hace habitualmente a través de un sistema de administración de aerosol (tal como se define adicionalmente).

En el contexto de la presente invención, el término “atomizar” y “atomización” significa la producción de gotitas mediante la alteración (mecánica) de un líquido a granel. Las gotitas producidas constituirán la niebla o pulverización fina que forma el aerosol.

Los términos “nebulizador” y “nebulización” tal como se usan en la presente invención se refieren a la conversión de un líquido en una niebla o pulverización fina mediante un nebulizador (tal como se define adicionalmente en el presente documento).

Los términos “material atomizado” o “material aerosolizado” es el material (tal como la composición que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina) que ha pasado por el proceso de aerosolización. Este material todavía puede estar en forma de un aerosol (tal como se define en el presente documento). También puede ser que este material se haya transformado de vuelta a un líquido a granel que se ha recogido combinando las diferentes gotitas presentes en el aerosol.

Los términos “estabilidad” y “estable” tal como se usan en el presente documento hacen referencia a la resistencia a la agregación del polipéptido de la invención que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina tras la atomización de la composición que comprende dicho polipéptido. Aparte de esto y/o además, las composiciones “estables” de la invención conservan la actividad biológica tras la atomización. La estabilidad de dicho polipéptido puede evaluarse mediante grados de agregación, tal como se mide, por ejemplo, mediante SE-HPLC, recuento de partículas subvisibles, ultracentrifugación analítica, dispersión de luz dinámica, medición de la relación DO320/DO280, dispersión de luz elástica, etc., y/o mediante el % de actividad biológica (tal como se mide, por ejemplo, mediante ELISA, Biacore, etc.) en comparación con una composiciones de referencia que no se ha atomizado.

“Agregación” o “formación de agregados” tal como se usa en la presente invención significa el desarrollo de agregados. En el contexto de la presente invención, un “agregado” incluye cualquier partícula que consista en más de una subunidad idéntica (o monómero) del polipéptido de la invención, incluyendo también oligómeros, tales como, por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros y similares. Los agregados pueden ser de diferentes tamaños, incluyendo agregados de alto peso molecular, así como agregados de bajo peso molecular. Tal como se usa en el presente documento, los agregados de alto peso molecular (abreviado como HMW) consisten habitualmente en más de cuatro unidades monoméricas, tales como pentámeros; los agregados de bajo peso molecular consisten habitualmente en cuatro o menos unidades monoméricas, tales como dímeros, trímeros y/o tetrámeros.

La frase “niveles de agregación de bajos a indetectables” tal como se usa en el presente documento se refiere a muestras contienen no más del 7%, no más del 6%, no más del 5%, no más del 4%, no más del 3%, no más del 2%, no más del 1% o no más del 0,5% de agregación en peso de proteína.

En los métodos, los aerosoles y las composiciones de la invención, menos del 6%, menos del 5%, incluso más preferiblemente menos del 4%, menos del 3%, menos del 2% o lo más preferiblemente menos del 1% del polipéptido de la invención forma agregados (tal como se define en el presente documento) durante la atomización. La formación de agregados en el material atomizado puede evaluarse mediante diversos métodos analíticos y/o inmunológicos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC), recuento de partículas subvisibles, ultracentrifugación analítica (AUC), dispersión de luz dinámica (DLS), dispersión de luz estática (SLS), dispersión de luz elástica, DO320/DO280, espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), dicroismo circular (CD), técnicas de despliegue de proteínas inducido por urea, fluorescencia de triptófano intrínseca y/o técnicas de calorimetría diferencial de barrido. La distribución de tamaño molecular y las cantidades relativas de polipéptido de la invención e impurezas de proteína pueden determinarse mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC). Los métodos de SE-HPLC se conocen por el experto en la técnica y también se describen en la sección de ejemplos.

En una ultracentrífuga analítica, una muestra que está centrifugándose puede monitorizarse en tiempo real a través de un sistema de detección óptico, usando absorción de luz ultravioleta y/o sistema sensible al índice de refracción óptico de interferencia. Esto permite al operador observar la evolución de la concentración de muestra frente al perfil del eje de rotación como resultado del campo centrífugo aplicado. Con la instrumentación moderna, estas observaciones se digitalizan electrónicamente y se almacenan para un análisis matemático adicional. Comúnmente se realizan dos clases de experimentes en estos instrumentos: experimentos de velocidad de sedimentación y experimentos de equilibrio de sedimentación.

Los experimentos de velocidad de sedimentación pretenden interpretar todo el transcurso de tiempo de la sedimentación, e informar sobre la forma y la masa molar de las macromoléculas disueltas, así como su distribución de tamaño (Perez-Ramirez y Steckert, 2005, Therapeutic Proteins: Methods and Protocols. C.M. Smales y D.C. James, Eds. vol. 308: 301-318. Humana Press Inc, Totowa, NJ, EE. UU.). La resolución de tamaño de este método aumenta con el cuadrado de los radios de partícula, y ajustando la velocidad del rotor del experimento pueden cubrirse intervalos de tamaño de desde 100 Da hasta 10 GDa. Los experimentos de velocidad de sedimentación también pueden usarse para estudiar equilibrios químicos reversibles entre especies macromoleculares, o bien monitorizando el número y la masa molar de complejos macromoleculares, obteniendo información sobre la composición de los complejos a partir de análisis de múltiples señales que explotan las diferencias en cada señal espectroscópica de los componentes, o siguiendo la dependencia de la composición de las tasas de sedimentación del sistema macromolecular, tal como se describen en la teoría de Gilbert-Jenkins.

Los experimentos de equilibrio de sedimentación están relacionados solo con el estado estacionario final del experimento, en el que la sedimentación se equilibra mediante difusión en oposición a los gradientes de concentración, dando como resultado un perfil de concentración independiente del tiempo. Las distribuciones de equilibrio de sedimentación en el campo centrífugo están caracterizadas por distribuciones de Boltzmann. Este experimento es insensible a la forma de la macromolécula, e informa directamente sobre la masa molar de las macromoléculas y, para mezclas que reaccionan químicamente, sobre constantes de equilibrio químico.

Las clases de información que pueden obtenerse de una ultracentrífuga analítica incluyen la forma gruesa de macromoléculas, los cambios conformacionales en macromoléculas, y las distribuciones de tamaño de muestras macromoleculares. Para macromoléculas, tales como proteínas, que existen en equilibrio químico con diferentes complejos no covalentes, pueden estudiarse el número y la estequiometría de subunidades de los complejos y las constantes de equilibrio (véase también Scott D.J., Harding S.E. y Rowe A.J. Analytical Ultracentrifugation Techniques and Methods, RSC Publishing).

La dispersión de luz dinámica (conocida también como espectroscopía de correlación de fotones o dispersión de luz cuasielástica) es una técnica en física, que puede usarse para determinar el perfil de distribución de tamaño de pequeñas partículas en disolución. Cuando un rayo de luz pasa a través de una dispersión coloidal, las partículas o gotitas dispersan algo de la luz en todas las direcciones. Cuando las partículas son muy pequeñas en comparación con la longitud de onda de la luz, la intensidad de la luz dispersada es uniforme en todas las direcciones (dispersión de Rayleigh); para partículas más grandes (por encima de aproximadamente 250 nm de diámetro), la intensidad es dependiente del ángulo (dispersión de Mie). Si la luz es coherente y monocromática, tal como de un láser, por ejemplo, es posible observar fluctuaciones dependientes del tiempo en la intensidad dispersada usando un detector adecuado tal como un fotomultiplicador capaz de funcionar en modo de recuento de fotones.

Estas fluctuaciones surgen del hecho de que las partículas son suficientemente pequeñas como para experimentar movimiento térmico aleatorio (browniano) y por tanto la distancia entre las mismas varía constantemente. La interferencia constructiva y destructiva de luz dispersada por partículas contiguas dentro de la zona iluminada da lugar a la fluctuación de intensidad en el plano del detector que, como surge de movimiento de partículas, contiene información sobre este movimiento. Por tanto, el análisis de la dependencia del tiempo de la fluctuación de la intensidad puede dar el coeficiente de difusión de las partículas a partir del cual, por medio de la ecuación de Stokes Einstein, conociendo la viscosidad del medio, puede calcularse el radio o diámetro hidrodinámico de las partículas (véase también Berne B. J. y Pecora R. Dynamic Light Scattering With Applications to Chemistry, Biology and Physics, Dover Publications).

La agregación también puede medirse mediante el instrumento PAMAS SVSS-C (Small Volume Syringe System-C) (PArtikelMess- und AnalyseSysteme GMBH), que es un analizador de la distribución de tamaño de partícula para fluidos poco viscosos. Usa el principio de la ocultación de luz para detectar partículas subvisibles en el intervalo de tamaño de 1 gm - 200 gm. Los criterios de validación/límites especificados de la Farmacopea Europea (EP<2.9.19 Contaminación por partículas: partículas subvisibles) para parentales de volumen pequeño y grande se definen mediante los recuentos totales por recipiente:

- Para partículas > 10 gm, no más de 6000 recuentos por recipiente

- Para partículas > 25 pm, no más de 600 recuentos por recipiente

La relación de DO320/DO280 es también una medida de la turbidez o la presencia de partículas en la muestra. En un aspecto preferido, la relación de DO320/DO280 de la composición de la invención debe ser de 0,05 o menor, preferiblemente de 0,01 o menor, tal como de 0,005 o menor.

La tendencia a la formación de agregados de un polipéptido en un cierto aerosol también puede medirse mediante la dispersión de luz elástica. La dispersión de luz elástica puede medirse en un espectrofluorómetro (por ejemplo, longitud de onda de excitación y emisión 500 nm) mediante desnaturalización inducida por temperatura tal como se mide, por ejemplo, a un ángulo de 90°. Preferiblemente, la dispersión máxima permanecerá dentro del límite de detección de absorción. La dispersión debe ser de 1000 abs o menor, preferiblemente 750 abs o menor, tal como 500 abs o menor.

El contenido de proteína de los polipéptidos recuperados de la invención en el material atomizado puede, por ejemplo, detectarse mediante SE-HPLC o mediante métodos espectrofotométricos.

Se ha observado una formación de agregados significativamente reducida de los polipéptidos de la invención tras la atomización de composiciones que contienen el polipéptido de la invención a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más; y cuando se usó un nebulizador de malla vibratoria para la atomización de la composición.

La presente invención se refiere a un método para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el que la cantidad de formación de agregados es del 6% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, comprendiendo dicho método la etapa de atomizar una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, en el que la composición no comprende un tensioactivo; y la composición se atomiza en un nebulizador de malla vibratoria.

Aparte de esto y/o además, en los métodos, los aerosoles y las composiciones de la invención, se ha observado de poca a ninguna pérdida de potencia y/o actividad biológica de los polipéptidos de la invención en el material atomizado.

La potencia y/o actividad biológica de un producto biológico describe la habilidad o capacidad específica de dicho producto biológico para conseguir un efecto biológico definido. Los términos “actividad biológica” o “actividades biológica” tal como se usa en el presente documento se refiere a actividades de dominio variable único de inmunoglobulina, que incluyen, pero no se limitan a, capacidades de unión específicas del dominio variable único de inmunoglobulina a la diana de interés tal como se mide mediante diversos ensayos inmunológicos, que incluyen, pero no se limitan a, ELISA y/o mediante resonancia por plasmones superficiales (Biacore). En una realización, tras la atomización de la composición de la invención, los dominios variables únicos de inmunoglobulina presentes en el material atomizado conservan al menos el 50%, preferiblemente al menos el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98% o incluso el 99% o más de la capacidad para unirse específicamente a la diana de interés en comparación con una composición de referencia (que no se ha atomizado), tal como se mide mediante un ensayo inmunológico conocido para un experto en la técnica o descrito en el presente documento. Por ejemplo, un ensayo basado en ELISA puede usarse para comparar las capacidades del dominio variable único de inmunoglobulina para unirse específicamente a su diana tras la atomización de dicho dominio variable único de inmunoglobulina y sin atomización de dicho dominio variable único de inmunoglobulina.

La potencia y actividades biológicas de los polipéptidos de la invención pueden evaluarse mediante diversos ensayos que incluyen cualquier ensayo in vitro, ensayo basado en células, ensayo in vivo y/o modelo animal adecuado en sí conocido, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad o trastorno específico implicado. Los ensayos in vitro adecuados estarán claros para el experto en la técnica, e incluyen, por ejemplo, ELISA; ensayo de unión FACS; Biacore; ensayo de unión de competición (AlphaScreen®, Perkin Elmer, Massachusetts, EE. UU.; FMAT). Por ejemplo, SEQ ID NO: 2 y 3 interaccionan con la proteína F de VRSh y bloquean la interacción de la proteína F con su receptor. SEQ ID NO: 1 interacciona con IL-23 y bloquea la interacción de este ligando con su receptor. La potencia de SEQ ID NO: 1, 2 y 3 para bloquear la respectiva interacción ligando/receptor puede determinarse, por ejemplo, mediante ELISA, Biacore, AlphaScreen®.

Por ejemplo, en una realización, el análisis cinético Biacore usa tecnología de resonancia por plasmones superficiales (SPR) para monitorizar interacciones macromoleculares en tiempo real y se usa para determinar las tasas de unión y disociación de polipéptidos de la composición de la invención a su diana. El análisis cinético Biacore comprende analizar la unión y disociación de la diana de chips con polipéptidos inmovilizados de la invención sobre su superficie. Un estudio cinético Biacore típico implica la inyección de 250 pl de reactivo de polipéptido a concentración variable en tampón de solución salina tamponada con HEPES (HBS) que contiene el 0,005% de Tween 20 en una superficie de chip sensor, sobre la que se ha inmovilizado el antígeno. En el sistema BIAcore 3000, el ligando está inmovilizado en dextrano carboximetilado sobre una superficie de oro, mientras que la segunda pareja (analito) se captura a medida que fluye por la superficie de ligando inmovilizado. Los ligandos inmovilizados son de manera notable resilientes y mantienen su actividad biológica. Los analitos unidos pueden separarse del ligando inmovilizado sin afectar a su actividad para permitir muchos ciclos de unión y regeneración en la misma superficie inmovilizada. La interacción se detecta en tiempo real por medio de SPR y a alta sensibilidad. Dado que la misma afinidad puede reflejar diferentes tasas de unión y tasas de disociación, este instrumento destaca sobre la mayoría de los otros métodos de medición de afinidad porque mide las tasas de unión (ka) y tasas de disociación (kd). También son factibles experimentos de determinación de la concentración.

En los métodos, los aerosoles y las composiciones de la invención, se ha observado poca o ninguna pérdida de potencia y/o actividad biológica de los polipéptidos de la invención en el material atomizado, tal como se evalúa mediante diversos ensayos inmunológicos que incluyen, por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) y resonancia por plasmones superficiales, que miden la capacidad del polipéptido para unirse específicamente a su antígeno. Tras la atomización, los polipéptidos presentes en la composición de la presente invención conservan más del 80%, más del 85%, más del 90%, más del 95%, más del 98%, más del 99% o incluso más del 99,5% de sus actividades biológicas iniciales (por ejemplo, la capacidad para unirse a IL-23, VRSh) de los polipéptidos antes de la atomización.

En una realización específica de la invención, los polipéptidos se unen a IL-23. Tras la atomización de la composición de la presente invención que comprende dichos polipéptidos de unión a IL-23, al menos el 80% (al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) de los polipéptidos conservan su actividad de unión a IL-23.

En otra realización específica, los polipéptidos se unen a VRSh. Tras la atomización de la composición de la presente invención que comprende dichos polipéptidos de unión a VRSh, al menos el 80% (al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) de los polipéptidos de la invención conservan su actividad de unión a VRSh.

Otros modelos in vitro e in vivo adecuados para determinar la potencia y/o actividad biológica de los polipéptidos presentes en el material atomizado estarán claros para el experto en la técnica y dependerán de la enfermedad y/o trastorno previsto que deba prevenirse y/o tratarse. Modelos animales adecuados para someter a prueba la potencia y/o actividad biológica de SEQ ID NO: 1 se describe, por ejemplo, en los documentos WO 09/068627 y WO 09/147248. La potencia y/o actividad biológica de SEQ ID NO: 2 para neutralizar VRSh puede determinarse, por ejemplo, in vitro, por ejemplo, en un ensayo de microneutralización de VRSh (véase, por ejemplo, el documento WO 09/147248) e, in vivo, por ejemplo, en el modelo de rata algodonera para estudios sobre VRS (Murphy et al., 1988, Virus Res. 11: 1 15).

Se ha observado de poca a ninguna pérdida de potencia de los polipéptidos de la invención tras la atomización de composiciones que contienen el polipéptido de la invención a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más; y cuando se usó un nebulizador de malla vibratoria para la atomización de la composición.

En todavía otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el que se conserva más del 80%, más del 85%, más del 90%, más del 95%, más del 98%, más del 99% o más del 99,5% de la actividad biológica inicial del dominio variable de inmunoglobulina, comprendiendo dicho método la etapa de atomizar una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, en el que la composición no comprende un tensioactivo; y la composición se atomiza en un nebulizador de malla vibratoria.

Por consiguiente, en el material atomizado obtenido en el método de la invención preferiblemente:

- menos del 6%, menos del 5%, incluso más preferiblemente menos del 4%, menos del 3%, menos del 2% o lo más preferiblemente menos del 1% del polipéptido de la invención forma agregados (tal como se define en el presente documento);

- al menos el 80% (al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) del polipéptido de la invención conserva su actividad de unión (por ejemplo, tal como se evalúa mediante ELISA y/o Biacore) a al menos una de (preferiblemente todas) sus dianas.

El polipéptido que comprende o esencialmente consiste en uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina para su uso en los métodos y composiciones de la invención puede ser terapéutico o profiláctico, y puede ser útil en el tratamiento y/o la gestión de una o más enfermedades. En un aspecto específico, el polipéptido comprende o esencialmente consiste en un dominio variable único de inmunoglobulina. En otro aspecto, el polipéptido comprende o esencialmente consiste en al menos dos dominios variables únicos de inmunoglobulina. En otro aspecto específico, el polipéptido comprende o esencialmente consiste en al menos tres dominios variables únicos de inmunoglobulina.

El polipéptido que comprende o esencialmente consiste en uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina para su uso en los métodos y composiciones de la invención puede reconocer cualquier diana y preferiblemente una diana que está asociada con una o más enfermedades. En un aspecto, el polipéptido de la invención reconoce una diana que está asociada con una o más enfermedades respiratorias. En otro aspecto, el polipéptido reconoce específicamente VRSh. En otro aspecto, el polipéptido reconoce específicamente IL-23. En un aspecto preferido, los dominios variables únicos de inmunoglobulina usados en el polipéptido de la invención se seleccionan de los documentos WO 09/068627 (tal como, por ejemplo, SEQ ID NO 2578, 2584 y/o 2585 del documento WO 09/068627), WO 2010/139808 (tal como, por ejemplo, SEQ iD NO: 142 del documento US 61/265,014) y WO 08/028977 (tal como, por ejemplo, SEQ I^dNO: 62 del documento WO 08/028977). Polipéptidos preferidos de la invención también pueden seleccionarse de SEQ ID NO: 1,2 y 3.

La concentración de polipéptido de la invención presente en la composición de la invención es de desde 1 hasta 200 mg/ml, en la que el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 25 mg/ml, tal como aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 40 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 65 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ ml, aproximadamente 90 mg/ml o aproximadamente 100 mg/ml o más. En determinadas realizaciones, la concentración de polipéptido de la invención puede ser de 110 mg/ml o más, 120 mg/ml o más, 130 mg/ml o más, 140 mg/ml o más, 150 mg/ml o más o incluso 200 mg/ml. Los presentes inventores han mostrado que composiciones que comprenden el polipéptido de la invención en cantidades de 25 mg/ml o más, o 50 mg/ml o incluso más, muestran formación de agregados reducida significativa tras la aerosolización en comparación con composiciones con una concentración de polipéptido que es menor de 25 mg/ml. Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se refiere a un método para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el que la cantidad de formación de agregados es del 6% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, comprendiendo dicho método la etapa de atomizar una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina, en el que el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más. La invención se refiere también a un aerosol que comprende gotitas de líquido que pueden obtenerse atomizando una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina, en el que la cantidad de formación de agregados en el aerosol es del 6% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, y en el que el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos está presente en la composición a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más. En un aspecto particular, la concentración de polipéptido de la invención en la composición de la invención es de 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml o más, 70 mg/ml o más, 80 mg/ml o incluso más. La invención se refiere además a una composición de este tipo adecuada para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina, en la que la cantidad de formación de agregados es del 6% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, comprendiendo dicha composición un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina, en la que el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos está presente en la composición a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más. Además, la cantidad relativa de agregados de alto peso molecular se aumentó en el material atomizado de estas composiciones en presencia de un tensioactivo.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el que la cantidad de formación de agregados es del 6% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, comprendiendo dicho método la etapa de atomizar una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, en el que la composición no comprende un tensioactivo. La invención se refiere también a un aerosol que comprende gotitas de líquido que pueden obtenerse atomizando una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, en el que la cantidad de formación de agregados en el aerosol es del 6% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, y en el que la composición no comprende un tensioactivo. La invención se refiere además a una composición de este tipo adecuada para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en la que la cantidad de formación de agregados es del 6% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, comprendiendo dicha composición un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más, en la que la composición no comprende un tensioactivo.

Un tensioactivo se refiere a un agente surfactante que comprende una parte hidrófoba y una parte hidrófila. En un aspecto preferido, el tensioactivo es no iónico. Ciertos tensioactivos no iónicos a modo de ejemplo incluyen (sin ser limitativos) alcohol graso, polisorbatos, incluyendo sin ser limitativos, polisorbato 80 (Tween 80) y polisorbato 20 (Tween 20), Triton X-100, copolímero de polioxipropileno-polioxietileno (Pluronic®), y nonilfenoxipolietoxiletanol (NP-40). Otros tensioactivos que pueden usarse en la composición de la invención incluyen (sin ser limitativos) fosfoglicéridos, tales como fosfatidilcolinas (lecitina), tal como el tensioactivo que se produce de manera natural, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). Otros tensioactivos a modo de ejemplo incluyen difosfatidilglicerol (DPPG), hexadecanol, polioxietileno-9-lauril éter, un ácido graso surfactante, tal como ácido palmítico o ácido oleico, trioleato de sorbitano (Span 85), glicocolato, surfactina, un poloxámero, un éster de ácido graso de sorbitano tal como trioleato de sorbitano, tiloxapol y un fosfolípido. En un aspecto específico, el tensioactivo se selecciona de Tween 20, Tween 80 o un poloxámero. Otros compuestos tales como polietilenglicol (PEG) tienen propiedades similares a los tensioactivos ya que actúan sobre la interfase aire-agua.

El portador comprendido en la composición de la invención es preferiblemente un portador acuoso tal como, por ejemplo, agua destilada, agua MilliQ o agua para inyección (WFI, Water for Injection). El pH de la composición de la invención generalmente no debería ser igual al punto isoeléctrico del polipéptido particular de la invención presente en la composición y puede oscilar entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 7,5, o entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,5, preferiblemente entre aproximadamente 6,5 y 7,5, lo más preferiblemente entre aproximadamente 6,5 y 7,0, tal como pH 6,0, pH 6,5 o pH7,0, en particular pH 7,0.

La composición puede tamponarse mediante cualquier tampón que sea aceptable para productos farmacéuticos. Los tampones preferidos para su uso en la composición de la invención incluyen (sin ser limitativos) PBS, tampón fosfato, TrisHCl, tampón histidina y tampón citrato, tal como, por ejemplo, histidina pH 6,0-6,5, tampón fosfato pH 7,0, TrisHCl pH 7,5 y tampón citrato/tampón fosfato pH 6,5, en particular tampón fosfato (NaH2PO4/Na2HPO4) pH 7,0.

La concentración del tampón presente en la composición de la invención puede oscilar entre 1 mM y 100 mM, 5 mM y 100 mM, 5 mM y 75 mM, 5 mM y 50 mM, 10 mM y 50 mM,. En un aspecto específico, la concentración de tampón en las composiciones de la invención es de 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM o 100 mM. Preferiblemente, la concentración es de entre 10 y 50 mM, tal como 10 mM o 50 mM, en particular 10 mM.

Un experto en la técnica entenderá que la composición de la invención puede ser isotónica o ligeramente hipotónica con sangre humana, es decir la composición de la invención tiene esencialmente la misma presión osmótica o una ligeramente menor que la sangre humana. Tal composición isotónica o ligeramente hipotónica tiene generalmente una presión osmótica de desde aproximadamente 240 mOSm/kg hasta aproximadamente 320 mOSm/kg, tal como aproximadamente 240 mOSm/kg o mayor, 250 mOSm/kg o mayor o 260 mOSm/kg o mayor.

La tonicidad de una composición puede ajustarse mediante el uso de modificadores de la tonicidad. “Modificadores de la tonicidad” son aquellas sustancias inertes farmacéuticamente aceptables que pueden añadirse a la composición para proporcionar una isotonicidad de la composición. Un modificador de la tonicidad preferido en la composición de la invención son excipientes. Los excipientes preferidos para su uso en la composición de la invención pueden seleccionarse de azúcares, polioles, tensioactivos y sales. En un aspecto, la osmolalidad de la composición de la invención se ajusta mediante la adición de un azúcar/poliol o una sal inorgánica. Los azúcares/polioles pueden incluir (sin ser limitativos) sacarosa y lactosa, así como derivados de azúcar que incluyen alcoholes sacáricos y ácidos sacáricos. Los polioles y alcoholes sacáricos pueden incluir (sin ser limitativos) manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol. Otros azúcares a modo de ejemplo incluyen (sin ser limitativos) trehalosa, glicina, maltosa, rafinosa, etc. La concentración de este excipiente puede oscilar entre aproximadamente el 1% y el 10% (p:v), preferiblemente entre aproximadamente el 2,5% y el 10% (p:v), más preferiblemente entre aproximadamente el 5% y el 10% (p:v), tal como, por ejemplo, el 5% (p:v), el 7,5% (p:v), el 8% o el 10% (p:v). Sin ser limitativas, las sales inorgánicas para ajustar la osmolalidad de la composición de la invención incluyen NaCl, KCl, CaCl²y MgCl², en particular NaCl. La concentración de sal inorgánica puede oscilar entre 10 mM y 200 mM, 10 mM y 150 mM, 50 mM y 150 mM, 100 mM y 150 mM, o 100 mM y 120 mM. En un aspecto específico, la concentración de sal (preferiblemente NaCl) que puede incluirse en las formulaciones de la invención puede ser de aproximadamente 10 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 75 mM, aproximadamente 100 mM, aproximadamente 110 mM, aproximadamente 120 mM, aproximadamente 130 mM, aproximadamente 150 mM o aproximadamente 200 mM.

Un ejemplo de una composición preferida de la invención con estas características comprende tampón fosfato 10 mM (NaH2PO4/Na2HPO4) pH 7,0 y NaCl 130 mM. Por consiguiente, en un aspecto, la composición de la invención comprende tampón fosfato 10 mM (NaH2PO4/Na2HPO4) pH 7,0, NaCl 130 mM y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina tal como se describió anteriormente. En un aspecto particular, la composición de la invención comprende tampón fosfato 10 mM (NaH2PO4/Na2HPO4) pH 7,0, NaCl 130 mM y el polipéptido con SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la composición de la invención comprende tampón fosfato 10 mM (NaH2PO4/Na2HPO4) pH 7,0, NaCl 130 mM y el polipéptido con SEQ ID NO: 2 a una concentración de 20 mg/ml o más, tal como, por ejemplo, a una concentración de 25 mg/ml o más, o a una concentración de 50 mg/ml o incluso más preferiblemente a una concentración de 50 mg/ml.

Otros portadores farmacéuticamente aceptables también pueden usarse en una formulación de la presente solicitud. La frase “portador farmacéuticamente aceptable” tal como se usa en el presente documento significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante, implicado en portar o transportar el agente (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico). Cada portador tiene que ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; glicoles, tal como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agentes de tamponamiento, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; agua libre de pirógeno; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; disoluciones de tampón fosfato; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

Las composiciones de la presente invención están caracterizadas por proporcionar una alta estabilidad térmica a los polipéptidos de la invención. La estabilidad térmica puede evaluarse, por ejemplo, determinando la temperatura de fusión, por ejemplo, Tm. Las técnicas adecuadas para determinar la temperatura de fusión se conocen e incluyen, por ejemplo, un ensayo de desplazamiento térmico (TSA), por ejemplo, tal como se describe en el presente documento. Más específicamente, las composiciones de la presente invención conducen a un aumento de Tm para los polipéptidos de la invención tal como se determina mediante TSA en comparación con otras formulaciones. Este efecto se ejemplifica en la tabla 3 de la sección experimental.

Según la presente invención, las composiciones de la invención tienen una influencia positiva sobre la Tm a lo largo de un amplio intervalo de valores de pH, por ejemplo, entre 5,5 y 6,5 para tampón citrato, y entre 7,0 y 7,5 para tampón fosfato. El efecto más ventajoso sobre la Tm puede observarse para tampón fosfato a pH de 7,0 a 7,5, en particular 7,0±0,2.

Tal como se evidencia mediante la sección experimental de esta descripción, Tm tal como se determina mediante TSA sirve como indicador valioso de la estabilidad de los polipéptidos de la invención. Una Tm creciente indica una estabilidad aumentada también en otros parámetros fisicoquímicos, y por tanto puede indicar realizaciones particularmente preferibles de la invención.

Los métodos generales para producir los dominios variables únicos de inmunoglobulina y/o polipéptidos presentes en la composición de la invención son conocidos para el experto en la técnica y/o se han descrito en la técnica. Los dominios variables únicos de inmunoglobulina y/o polipéptidos pueden producirse en cualquier huésped conocido por el experto en la técnica. Por ejemplo, pero sin ser limitativos, los dominios variables únicos de inmunoglobulina y/o polipéptidos pueden producirse en huéspedes procariotas entre los que está E. coli o huéspedes eucariotas, por ejemplo, un huésped eucariota seleccionado de células de insecto, células de mamífero, y huéspedes eucariotas inferiores que comprenden levaduras tales como Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, preferiblemente Pichia pastoris. La producción de dominios variables únicos de inmunoglobulina en procariotas y huéspedes eucariotas inferiores tal como Pichia pastoris se ha descrito, por ejemplo, en los documentos WO 94/04678, W o 94/25591 y WO 08/142164. Se hace referencia explícitamente a los contenidos de estas solicitudes en relación con técnicas y métodos de cultivo generales, incluyendo medios y condiciones adecuados.

El experto en la técnica también puede concebir constructos genéticos adecuados para la expresión de los polipéptidos de la invención en diferentes huéspedes basándose en la presente solicitud y el conocimiento general común. La presente invención se refiere también a condiciones y constructos genéticos descritos en la técnica, por ejemplo, los métodos de cultivo generales, plásmidos, promotores y secuencias líder descritos en los documentos WO 94/25591, WO 08/020079, Gasser et al. 2006 (Biotechnol. Bioeng. 94: 535); Gasser et al. 2007 (Appl. Environ. Microbiol. 73: 6499); o Damasceno et al. 2007 (Microbiol. Biotechnol. 74: 381).

Más particularmente, el método para la expresión y/o producción de un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina al menos comprende las etapas de:

a) cultivar un huésped o célula huésped en condiciones que son tales que dicho huésped o célula huésped se multiplicará;

b) mantener dicho huésped o célula huésped en condiciones que son tales que dicho huésped o célula huésped expresa y/o produce el polipéptido;

c) aislar y/o purificar el polipéptido secretado del medio.

Para producir/obtener la expresión del polipéptido, la célula huésped transformada u organismo huésped transformado puede generalmente almacenarse, mantenerse y/o cultivarse en condiciones tales que el polipéptido (deseado) se expresa/produce. Las condiciones adecuadas estarán claras para el experto en la técnica y dependerán habitualmente de la célula huésped/organismo huésped usado, así como de los elementos regulatorios que controlan la expresión de la secuencia (relevante) de nucleótidos. De nuevo, se hace referencia a los manuales y las solicitudes de patente mencionados anteriormente.

Generalmente, las condiciones adecuadas pueden incluir el uso de un medio adecuado, la presencia de una fuente adecuada de alimento y/o nutrientes adecuados, el uso de una temperatura adecuada, y opcionalmente la presencia de un factor o compuesto de inducción adecuado (por ejemplo, cuando las secuencias de nucleótidos de la invención están bajo el control de un promotor inducible); todo lo cual puede seleccionarse por el experto en la técnica. De nuevo, en tales condiciones, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden expresarse de una manera constitutiva, de una manera transitoria o solo cuando se induzcan de manera adecuada.

El polipéptido de la invención puede entonces aislarse de la célula huésped/organismo huésped y/o del medio en el que dicha célula huésped u organismo huésped se cultivó, usando técnicas de aislamiento y/o purificación de proteínas en sí conocidas, tal como técnicas de cromatografía y/o electroforesis (preparativas), técnicas de precipitación diferencial, técnicas de afinidad (por ejemplo, usando una secuencia de aminoácidos escindible, específica, fusionada con el polipéptido de la invención) y/o técnicas inmunológicas preparativas (es decir usando anticuerpos frente al polipéptido que debe aislarse).

En la presente invención, el huésped puede retirarse del medio de cultivo mediante medios rutinarios. Por ejemplo, el huésped puede retirarse mediante centrifugación o filtración. La disolución obtenida mediante la retirada del huésped del medio de cultivo se denomina también sobrenadante de cultivo, o sobrenadante de cultivo clarificado. Los polipéptidos de la invención pueden purificarse del sobrenadante de cultivo mediante métodos estándar. Los métodos estándar incluyen, pero no se limitan a, métodos cromatográficos, incluyendo cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad. Estos métodos pueden realizarse solos o en combinación con otros métodos de purificación, por ejemplo, precipitación o electroforesis en gel. El experto en la técnica puede concebir combinaciones adecuadas de métodos de purificación para los polipéptidos de la invención basándose en el conocimiento general común. Para ejemplos específicos, se hace referencia a la técnica citada en el presente documento.

En una realización a modo de ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden purificarse del sobrenadante de cultivo mediante una combinación de cromatografía de afinidad sobre proteína A, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. La referencia a cualquier “etapa de purificación”, incluye, pero no se limita a, estos métodos particulares.

Más específicamente, los polipéptidos de la invención pueden purificarse del sobrenadante de cultivo usando un proceso en el que el sobrenadante clarificado (obtenido mediante centrifugación) se captura en cualquier combinación de columnas seleccionadas de (sin ser limitativas) resina de cromatografía de afinidad tal como resina de proteína A, cromatografía de intercambio catiónico (CIEC) o una cromatografía de intercambio aniónico (AIEC) usando, por ejemplo, Poros 50HS (POROS), SOURCE 30S o SOURCE 15S (GE Healthcare), SP Sepharose (^gE Healthcare), Capto S (GE Healthcare), Capto MMC (GE Healthcare) o Poros 50H^q(POROS), ^sO^uRCE 30Q o ^sO^uRCE 15Q (GE Healthcare), Q Sepharose (GE Healthcare), Capto Q y DEAE Sepharose (GE Healthcare), cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC) usando, por ejemplo, Superdex 75 o Superdex 200 (GE Healthcare), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) usando, por ejemplo, octilo, butilsefarosa o equivalentes, incluyendo opcionalmente también una etapa de filtración de flujo tangencial (TFF). Cualquier combinación de columnas puede usarse para la purificación de los polipéptidos de la invención, tal como, por ejemplo, resina de proteína A seguida de cromatografía de intercambio catiónico o dos etapas de cromatografía de intercambio catiónico.

La presente invención también proporciona métodos para preparar las composiciones de la invención que comprenden los polipéptidos de la invención. Más particularmente, la presente invención proporciona métodos para preparar composiciones de tales polipéptidos, comprendiendo dichos métodos concentrar una fracción que contiene el polipéptido purificado hasta la concentración de polipéptido final usando, por ejemplo, una membrana semipermeable con un punto de corte de peso molecular (MW) apropiado (por ejemplo, un punto de corte de 5 kD para dominios variables únicos; un punto de corte de 10 kD para polipéptidos bivalentes que comprenden dos dominios variables únicos; o un punto de corte de 15 kD para polipéptidos trivalentes que comprenden tres dominios variables únicos) y diafiltrar y/o ultrafiltrar para intercambiar el tampón y concentrar adicionalmente la fracción de polipéptido en el tampón seleccionado usando la misma membrana.

El tensioactivo (por ejemplo, Tween 20, Tween 80 o poloxámero) puede añadirse tras la etapa de diafiltración/ultrafiltración final a una concentración en el intervalo entre el 0% y el 1%, preferiblemente entre el 0,001% y el 0,1%, o entre el 0,01% y el 0,1% tal como aproximadamente el 0,001%, el 0,005%, el 0,01%, el 0,02%, el 0,04%, el 0,05%, el 0,08%, el 0,1%, el 0,5% o el 1% de la composición, preferiblemente del 0,04% al 0,08%, en particular el 0,04%. Según la invención, la composición no comprende un tensioactivo.

La composición de la presente invención puede esterilizarse mediante diversos métodos de esterilización, incluyendo filtración estéril, radiación, etc. En una realización específica, la composición de polipéptido se esteriliza mediante filtración con un filtro de 0,2 micras esterilizado previamente.

Preferiblemente, la composición de la presente invención se suministra en un recipiente sellado herméticamente. Las composiciones líquidas pueden comprender una cantidad de entre 1 ml y 20 ml, de manera preferible aproximadamente 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml o 20 ml.

La composición de la presente invención puede prepararse como formas de dosificación unitarias preparando un vial que contiene una alícuota de la composición para un uso de una vez. Por ejemplo, una dosificación unitaria de composición líquida por vial puede contener 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml o 20 ml de la composición. Las formas de dosificación unitarias farmacéuticas deben ser adecuadas para la administración pulmonar del polipéptido mediante aerosol.

La cantidad de una composición de la presente invención que será efectiva en la prevención, el tratamiento y/o la gestión de una cierta enfermedad o trastorno puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar ampliamente conocidas en la técnica o descritas en el presente documento. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelos animales o in vitro. Para las composiciones del polipéptido, abarcadas por la invención, la dosificación administrada a un paciente puede calcularse adicionalmente usando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por la dosis que debe administrarse en mg/kg. También puede ser útil para los cálculos de dosis el porcentaje de la dosis aplicada que alcanza el pulmón y/o el porcentaje de la dosis aplicada que alcanza la circulación sistémica (dependiendo de la enfermedad que debe prevenirse y/o tratarse y la ubicación en el cuerpo de la actividad profiláctica y/o terapéutica del agente).

El volumen requerido (en ml) que debe darse se determina entonces tomando la dosis en mg requerida dividida entre la concentración de la composición de polipéptido. El volumen requerido calculado final se obtendrá juntando los contenidos de tantos viales como sean necesarios.

La presente invención también abarca un producto farmacéutico empaquetado y etiquetado acabado. Este artículo de fabricación o kit incluye la forma de dosificación unitaria apropiada en un recipiente o receptáculo apropiado tal como un vial de vidrio u otro recipiente que esté sellado herméticamente. La forma de dosificación unitaria debe ser adecuada para la administración pulmonar mediante aerosol. Preferiblemente, el artículo de fabricación o kit comprende además instrucciones sobre cómo usar la composición en un sistema de administración de aerosol. Las instrucciones pueden contener además material informativo que aconseja al médico, técnico o paciente sobre cómo prevenir o tratar de manera apropiada la enfermedad o trastorno en cuestión. En otras palabras, el artículo de fabricación incluye medios de instrucción que indican o sugieren un régimen de dosificación para su uso en el sistema de administración de aerosol incluyendo, pero sin limitarse a, dosis reales, procedimientos de monitorización y otras información de monitorización.

Como con cualquier producto farmacéutico, el material de embalaje y recipiente están diseñados para proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y el envío.

Las composiciones de la presente invención deben ser adecuadas para la administración del polipéptido de la invención mediante administración pulmonar, es decir aerosolización. Por consiguiente, las composiciones de la presente invención deben ser adecuadas para su uso en un sistema de administración de aerosol (tal como se define adicionalmente en el presente documento). La composición de la invención se usa para la administración a un sujeto humano mediante nebulización, es decir en un nebulizador de malla vibratoria.

La presente invención también proporciona sistemas de administración de aerosol que pueden usarse en el método de la invención (para la preparación de un aerosol) y/o para la administración de las composiciones de la invención mediante aerosolización. El sistema de administración de aerosol de la invención puede comprender un recipiente que comprende la composición de la invención y un generador de aerosol conectado al mismo. El generador de aerosol está construido y dispuesto para generar un aerosol de la composición de la invención. Sin ser limitativos, los generados de aerosol incluyen nebulizadores, bombas mecánicas y recipientes presurizados.

En un aspecto, que no se reivindica, el sistema de administración de aerosol puede incluir un recipiente presurizado que contiene la composición de la invención. El recipiente presurizado tiene normalmente un actuador conectado a una válvula dosificadora de modo que la activación del actuador provoca que una cantidad predeterminada de la composición dentro del recipiente se dispense desde el recipiente en forma de un aerosol. Los recipientes presurizados de este tipo se conocen ampliamente en la técnica, tal como inhaladores de dosis medida accionados por propelente (pMDI o simplemente MDI). Los MDI incluyen normalmente un actuador, una válvula dosificadora y un recipiente presurizado que contiene una suspensión o disolución de fármaco micronizado, propelente licuado y tensioactivo (por ejemplo, ácido oleico, trioleato de sorbitano, lecitina). Los inhaladores de dosis medida presurizados (pMDI) son el inhalador más usado comúnmente en todo el mundo. El aerosol se crea cuando una válvula se abre (habitualmente presionando hacia abajo el cartucho de propelente), permitiendo que el propelente líquido se pulverice fuera de un cartucho. Normalmente, un fármaco o producto terapéutico está contenido en pequeñas partículas (habitualmente unas pocas micras de diámetro) suspendidas en el propelente líquido, pero en algunas formulaciones el fármaco o producto terapéutico puede estar disuelto en el propelente. El propelente se evapora rápidamente a medida que el aerosol abandona el dispositivo, dando como resultado partículas de fármaco o producto terapéutico pequeñas que se inhalan. Los propelentes usados en tales pMDI incluyen, pero no se limitan a, hidrofluoroalcanos (HFA). Históricamente, estos MDI usaban normalmente clorofluorocarbonos (CFC) como propelentes, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano y diclorotetrafluorometano. Propelentes más nuevos pueden incluir 1,1,1,2-tetrafluoroetano y 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano. También pueden emplearse otros disolventes o excipientes con pMDI, tales como etanol, ácido ascórbico, metabisulfato de sodio, glicerina, clorobutanol y cloruro de cetilpiridio. Tales pMDI pueden incluir además dispositivos accesorios tales como, por ejemplo, separadores, cámaras de retención y otras modificaciones.

La tecnología de aerosolización Sonik LDI (Drug Delivery Technology, Montville, NJ, EE. UU.) se usa principalmente para la administración de medicaciones líquidas y ocasionalmente polvos. La boquilla propietaria se acciona mediante gas comprimido, normalmente dióxido de carbono (CO²), para administración ráfagas consistentes de medicación con cada actuación del dispositivo. Después de que el gas comprimido salga del chorro primario de la boquilla Sonik LDI, se forma una cadena de ondas de choque de compresión y refracción reflejadas. La boquilla introduce medicación líquida en la cadena de ondas de choque dentro de una cámara de choque para producir una ráfaga consistente y de alta calidad de aerosol. Tras la salida de la boquilla Sonik LDI, la corriente de aerosol/gas se fuerza hacia abajo a través de una cámara de amplificación, donde procesos de aerosolización secundarios provocan un aumento de partículas respirables y una disminución de spray residual. Se usa CO²como propelente de accionamiento, principalmente porque es barato y pueden almacenarse fácilmente en cartuchos desechables compactos. A diferencia de los MDI, la tecnología de aerosolización Sonik LDI no mezcla el propelente y la medicación hasta el momento de la aerosolización. Este enfoque retardado permite que la medición líquida (o en polvo) se almacene en blísteres sellados y facilita la carga de desarrollo de estabilidad de formulación. Esta tecnología puede adaptarse a varias configuraciones: cámaras de retención de aerosol actuadas por la respiración, entrada oral directa de baja velocidad compacta, medicaciones de dosis unitaria preempaquetadas y dispositivos de depósito llenados por el paciente o médico.

En otro aspecto de la invención, el sistema de administración de aerosol puede ser un nebulizador. Solo los nebulizadores de malla vibratoria son según la invención. Los nebulizadores producen una niebla de gotitas de líquido que contienen fármaco para su inhalación. “Nebulización”, tal como se usa en la presente invención, significa la conversión de un líquido a un spray fino. Los nebulizadores mezclan medicina con aire comprimido para crear una niebla fina que el paciente respira a través de una mascarilla o boquilla. Para niños, la nebulización es una de las maneras más fáciles y más efectivas de administrar medicina a los pulmones. Usando mascarillas dimensionadas de manera apropiada que se adaptan a los lactantes, o boquillas para niños más mayores y adultos, los pacientes simplemente respiran normalmente hasta que se ha inhalado toda la medicina. Otra ventaja de la nebulización, particularmente para niños jóvenes, es que no requiere ninguna técnica especial para llevar la medicina al interior de los pulmones.

Los nebulizadores se clasifican habitualmente en dos tipos: nebulizadores ultrasónicos y nebulizadores de chorro. Los nebulizadores de chorro de aire para la atomización se consideran portátiles debido a la disponibilidad de bombas de aire comprimidas pequeñas, pero son sistemas relativamente grandes e inconvenientes. Los nebulizadores ultrasónicos tienen la ventaja de ser más portátiles porque generalmente no requieren una fuente de aire comprimido.

Los nebulizadores de chorro de aire convierten líquido en aerosoles por medio de un gas a alta velocidad que pasa a través de una boquilla “venturi” estrecha. El fluido en el depósito de nebulizador se extrae hacia arriba por un tubo de alimentación y emerge como filamentos finos que colapsan para dar gotitas de aerosol debido a la tensión superficial. Deflectores dentro del nebulizador eliminan las gotitas más grandes. El tamaño de gotita en la corriente de aire está influido por la presión de aire comprimido. Los diámetros de la mediana másica oscilan normalmente entre 2 y 5 pm con presiones de aire de 20 a 30 psig. Los ejemplos de nebulizadores de chorro incluyen (sin ser limitativos) Pari LC Jet Plus (PARI Gmbh, Grafelingen, Alemania), Hudson T Up-draft II (Hudson RCI, Kernen, Alemania), Raindrop ^{(Puritan Bennett, Boulder, CO, EE.}U^u.).

Los nebulizadores ultrasónicos generan aerosoles usando ondas ultrasónicas de alta frecuencia (es decir, de 100 kHz y superior) concentradas en la cámara de líquido mediante un cristal piezoeléctrico cerámico que vibra mecánicamente tras estimulación (Dennis et al., 1992, J. Med. Eng; Tech. 16: 63-68; O’Doherty et al., 1992, Am. Rev. Respir. Dis. 146: 383-88). Una fuente de fluido se produce en la interfase aire-fluido. Se generan pequeñas gotitas desde las regiones inferiores de la fuente al tiempo que se generan gotitas grandes desde el vértice. En algunos casos, un propulsor sopla las partículas fuera del nebulizador o el aerosol se inhala directamente por el paciente. El nebulizador ultrasónico es capaz de una producción mayor que el nebulizador de chorro de aire y por este motivo se usa frecuentemente en la terapia farmacológica de aerosol. Los ejemplos de nebulizadores ultrasónicos incluyen (sin ser limitativos) Mabis Mist II (Allergy Asthma Technology LLC), DeVilbiss Compressor Nebulizer Systems, DeVilbiss Reusable Jet Nebulizers (DeVilbiss Healthcare, Somerset, Pensilvania, EE. UU.), Kun-88 (K-Sonic, Taipéi, Taiwán), SUN 345 (Siemens, Elema AB, Solna, Suecia).

En los nebulizadores tanto de chorro de aire como ultrasónicos, deflectores en el nebulizador atrapan y recirculan las gotitas de aerosol grandes (primarias), al tiempo que las gotitas pequeñas (secundarias) se liberan para su inhalación. En cualquier tipo de nebulizador, el fármaco está contenido habitualmente en disolución en el líquido en el nebulizador y así las gotitas que se producen contienen fármaco en disolución.

Los nebulizadores ultrasónicos generalmente son inadecuados para la administración de suspensiones (Taylor y McCallion, 2002, en: Swarbrick, Boylan (Eds.), Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 2a ed. Marcel Dekker, Inc., Nueva York, págs. 2840-2847) y liposomas (Elhissi y Taylor, 2005, J. Drug Deliv. Sci. Technol. 15: 261-265), y debido a la generación de calor durante la atomización pueden degradar sustancias lábiles tales como proteínas (Niven et., 1995, Pharm. Res. 12: 53-59).

Los nebulizadores de malla vibratoria pueden superar los inconvenientes de los nebulizadores de chorro de aire y ultrasónicos. Los dispositivos de malla vibratoria emplean placas perforadas que vibran con el fin de generar el aerosol. La activación del elemento vibratorio para hacer vibrar la placa de apertura provoca que la composición de la invención se extraiga a través de la pluralidad de aberturas para crear un aerosol de baja velocidad con un intervalo definido de tamaños de gotita (es decir partícula). Estos nebulizadores no calientan el fluido durante la atomización y se ha mostrado que son adecuados para la administración de suspensiones (Fink, y Simmons, 2004. Chest 126: 816S), y estructuras delicadas tales como liposomas (Wagner, 2006, J. Liposome Res. 16: 113-125) y ácidos nucleicos (Lentz, 2006, J. Aerosol Med. 19: 372-384). Los nebulizadores de malla vibratoria se dividen en dispositivos de malla que vibran de manera pasiva y activa (Newman, 2005, J. Appl. Ther. Res. 5: 29-33). Los dispositivos de malla que vibran de manera pasiva (por ejemplo, el nebulizador Omron MicroAir NE-U22) emplean una placa perforada que tiene hasta 6000 agujeros de tamaño micrométrico. Un cristal piezoeléctrico vibratorio unido a un cuerno transductor induce vibraciones “pasivas” en la placa perforada situada delante del mismo, dando como resultado la extrusión de fluido a través de los agujeros y la generación del aerosol. Los dispositivos de malla que vibran de manera activa (por ejemplo, el nebulizador Aeroneb Pro) pueden emplear un sistema de “microbomba” que comprende un generador de aerosol que consiste en una placa con hasta 1000 aberturas en forma de cúpula y un elemento vibratorio que se contrae y expande con la aplicación de una corriente eléctrica. Esto da como resultado movimientos hacia arriba y hacia abajo de la malla de unos pocos micrómetros, extruyendo el fluido y generando el aerosol. Otros ejemplos de nebulizadores de malla vibratoria incluyen eFlow® (PARI GmbH, Grafelingen, Alemania; véase también el documento US 5.586.550), Aeroneb® (Aerogen, Inc., Sunnyvale, California; véanse también los documentos US 5.586.550; US 5.938.117; US 6.014.970; US 6.085.740; US 6.205.999).

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se refiere a un método para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina, en el que la cantidad de formación de agregados es del 6% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, comprendiendo dicho método la etapa de atomizar una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 1 mg/ml a 200 mg/ml, en el que la composición se atomiza en un nebulizador de malla vibratoria. La invención se refiere también a un aerosol que comprende gotitas de líquido que pueden obtenerse atomizando una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 1 mg/ml a 200 mg/ml, en el que la cantidad de formación de agregados en el aerosol es del 6% o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, y en el que la composición se atomiza en un nebulizador de malla vibratoria. La invención se refiere además a un nebulizador de malla vibratoria que comprende un recipiente y un generador de aerosol conectado al recipiente, en el que el recipiente comprende una composición de la invención.

Las composiciones, y los sistemas de administración de aerosol, de la presente invención pueden administrarse a un sujeto para prevenir, tratar y/o gestionar una o más enfermedades y/o trastornos específicos, tal como una o más enfermedades y/o trastornos respiratorios.

Las enfermedades y/o trastornos respiratorios que pueden tratarse, suprimirse o prevenirse usando las composiciones, los recipientes, los sistemas de administración de aerosol, las dosificaciones unitarias farmacéuticas y/o los kits de la invención pueden incluir inflamación pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, neumonía, neumonitis por hipersensibilidad, infiltrado pulmonar con eosinofilia, enfermedad pulmonar ambiental, neumonía, bronquiectasia, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria, tromboembolia pulmonar, trastornos de la pleura, trastornos del mediastino, trastornos del diafragma, hipoventilación, hiperventilación, apnea del sueño, síndrome de dificultad respiratoria aguda, mesotelioma, sarcoma, rechazo de injerto, enfermedad de injerto frente a huésped, cáncer de pulmón, rinitis alérgica, alergia, asbestosis, aspergiloma, aspergilosis, bronquiectasia, bronquitis crónica, enfisema, neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad neumocócica invasiva, gripe, micobacterias no tuberculosas, efusión pleural, neumoconiosis, neumocitosis, neumonía, actinomicosis pulmonar, proteinosis alveolar pulmonar, carbunco pulmonar, edema pulmonar, émbolo pulmonar, inflamación pulmonar, histiocitosis X pulmonar, hipertensión pulmonar, nocardiosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, enfermedad venooclusiva pulmonar, enfermedad pulmonar reumatoide, sarcoidosis, granulomatosis de Wegener y carcinoma pulmonar de células no pequeñas. En un aspecto específico, las composiciones, y los sistemas de administración de aerosol, de la presente invención se administran a un sujeto para prevenir, tratar y/o gestionar infecciones pulmonares víricas y más particularmente infecciones por VRSh.

En otro aspecto, que no se reivindica, las composiciones, los recipientes, los sistemas de administración de aerosol, las dosificaciones unitarias farmacéuticas y/o los kits de la invención se usan para la administración sistémica de un polipéptido de la invención mediante administración pulmonar mediante aerosolización. Por consiguiente, las composiciones, los recipientes, los sistemas de administración de aerosol, las dosificaciones unitarias farmacéuticas y/o los kits de la presente invención pueden administrarse a un sujeto para prevenir, tratar y/o gestionar cualquier enfermedad y/o trastorno asociado con la diana a la que se une específicamente el polipéptido de la invención (presente en la composición, el recipiente, el sistema de administración de aerosol, la dosificación unitaria farmacéutica y/o el kit). Por ejemplo, sin ser limitativo, la composición, el recipiente, el sistema de administración de aerosol, la dosificación unitaria farmacéutica y/o el kit puede usarse para prevenir, tratar y/o gestionar enfermedades y/o trastornos asociados con citocinas heterodiméricas y sus receptores incluyendo inflamación y trastornos inflamatorios tales como enfermedades del intestino (colitis, enfermedad de Crohn, IBD), enfermedades infecciosas, psoriasis, cáncer, enfermedades autoinmunitarias (tal como MS), carcoidis, rechazo de trasplante, fibrosis quística, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, artritis reumatoide, infección vírica, inmunodeficiencia variable común.

También están abarcados dentro del alcance de la presente invención las composiciones y los sistemas de administración de aerosol de la invención para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una o más enfermedades y/o trastornos tal como se describió anteriormente.

Las composiciones, y los sistemas de administración de aerosol, de la presente invención también pueden utilizarse ventajosamente en combinación con una o más de otras terapias (por ejemplo, uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos), preferiblemente terapias útiles en la prevención, el tratamiento y/o la gestión de la (misma u otra) enfermedad y/o trastorno. Los agentes terapéuticos o profilácticos incluyen, pero no se limitan a, moléculas pequeñas, fármacos sintéticos, péptidos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos (por ejemplo, nucleótidos de ADN y ARN incluyendo, pero sin limitarse a, secuencias de nucleótidos antisentido, triples hélices, ARNi, y secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas, polipéptidos o péptidos biológicamente activos), anticuerpos, otros dominios variables únicos de inmunoglobulina, moléculas inorgánicas sintéticas o naturales, agentes miméticos, y moléculas orgánicas sintéticas o naturales. Cualquier terapia (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) que se conozca que es útil, o que se ha usado o está usándose actualmente para la prevención, el tratamiento y/o la gestión de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno específico, puede usarse en combinación con las composiciones de la presente invención según la invención descrita en el presente documento.

Una composición de la invención puede administrarse a un mamífero, preferiblemente un humano, simultáneamente con una o más de otras terapias (por ejemplo, uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos). El término “simultáneamente” no está limitado a la administración de agentes profilácticos o terapéuticos/terapias a exactamente el mismo tiempo, sino que más bien quiere decir que la composición de la invención y el otro agente/terapia se administran a un mamífero en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo de modo que el polipéptido contenido en la composición pueda actuar conjuntamente con el otro agente/terapia para proporcionar un beneficio aumentado a si se administrasen de otro modo. Por ejemplo, la composición de la invención y el uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos pueden administrarse al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en diferentes puntos de tiempo; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, deben administrarse de manera suficientemente cercana en el tiempo para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado.

Cuando se usan en combinación con otras terapias (por ejemplo, agentes profilácticos y/o terapéuticos), las composiciones de la invención y la otra terapia pueden actuar de manera aditiva o sinérgica. La invención contempla la administración de una composición de la invención en combinación con otras terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) mediante las mismas o diferentes vías de administración, por ejemplo, pulmonar y parenteral.

EJEMPLOS (los ejemplos de formulaciones que comprenden un tensioactivo son con fin ilustrativo)

Ejemplo 1: Administración por nebulizador de Nanobody P23IL0075

23IL0075 (SEQ ID NO: 1; EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSLPASGNIFNLLTIAWYRQAPGKG RELVATINSGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKKTLYLQMNSLRPEDTAVYYCQTSGSGSPNFWGQGTLVTVSSGGGG SGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTIS RDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGRTLSSYAMGWFRQAPGKGREFVARISQGGTAIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAKD PSPYYRGSAYLLSGSYDSWGQGTLVTVSS) se ha descrito como SEQ ID NO: 2622 en el documento WO 2009/068627. 231L0075 consiste en tres dominios variables humanizados de un llama de cadena pesada: 119A3v16 y 81A12v5 que se unen a diferentes epítopos de IL23 p19, y ALB8 que se une a HSA. Las subunidades en ambos Nanobodies están fusionadas cabeza a cola con un ligador 9G/S.

P23IL0075 se sometió a prueba en el nebulizador de bolsillo de Omron MicroAIR que pertenece a los nebulizadores de malla vibratoria. En el dispositivo, P231L0075 se sometió a prueba a 4 mg/ml con una gama de tampones de diferente formulación. La estabilidad de las muestras al proceso de nebulización se sometió a prueba comparando muestras antes y después de la nebulización usando cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC).

P23IL0075 se sometió a prueba en tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) el 0,01% de Tween80, PBS el 0,04% de Tween80, histidina 10 mM pH6 el 10% de sacarosa el 0,01% de Tween 80 e histidina 10 mM pH6 el 10% del sacarosa el 0,04% de Tween 80. Se nebulizaron 0,5 ml de cada disolución usando el nebulizador de bolsillo de Omron MicroAIR. Se inyectaron 5 microlitros de muestras de proteína sobre la columna de SE-HPLC (TSKgel G2000SWXL). La separación de proteína en SE-HPLC se realizó a 0,2 ml/min durante 70 minutos. Se usó Na2HPO43,25 mM NaH2PO46,75 mM arginina HCl 0,3M NaN3 al 0,005% pH6 como fase móvil. La detección de material proteínico de elución se llevó a cabo mediante detección en línea mediante UV (abs. 280 nm).

Los resultados en la tabla 1 muestran que los perfiles de SE-HPLC tras la nebulización para las cuatro formulaciones diferentes sometidas a prueba presentaban un pico previo ligeramente aumentado en comparación con las muestras de referencia e indican un aumento menor en la cantidad relativa de agregados solubles. La recuperación de la proteína tras la nebulización se calculó a partir del área de pico total de muestra nebulizada en relación con la de referencia. Los resultados en la tabla 1 muestran que las muestras nebulizadas formuladas en histidina/sacarosa tienen una cantidad comparable de P23IL0075 a la del material de entrada. Esto sugiere que el material no experimenta una degradación o fragmentación significativa con la nebulización.

Tween-80 aumentó la recuperación y estabiliza P23IL0075 frente a la agregación y degradación de una manera dependiente de la dosis. La recuperación de Nanobody P23IL0075 tras la nebulización era del 100% en la formulación de histidina/sacarosa que contenía el 0,04% de Tween-80 y se observó la menor cantidad de agregados solubles (3%). En una formulación similar que contenía solo el 0,01% de Tween-80, la recuperación de P23IL0075 tras la nebulización era del 90% y el porcentaje de agregados solubles del 4,8%. Estos datos indican que Tween-80 tiene un efecto estabilizante frente a la agregación tras la nebulización de una manera dependiente de la concentración.

Tabla 1 Resumen de los datos de análisis de SE-HPLC de P23IL0075 a 4 mg/ml en tampones de diferente formulación, tras la nebulización en un nebulizador de bolsillo de Omron MicroAIR en comparación con las muestras

Ejemplo 2: Efecto de diferentes dispositivos nebulizadores y concentraciones de proteína sobre la nebulización de Nanobody VRS420

VRS 420 tiene la siguiente secuencia: e v q l v e s g g g l v q a g g s l s is c a a s g g s l s n y v l g w f r q

APGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTiSRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYiYDWSYD

YWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKERE

FVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTiSRDNAKNTGYLQMNSlAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGT

QVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAIN

WRGDITiGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS (SEQ ID NO: 3).

VRS 420 se sometió a prueba en los nebulizadores AKITA^®JET y AKITA²APIXNEB^™(Activaero) que pertenecen a los nebulizadores de chorro y de malla, respectivamente. En los dispositivos, VRS 420 se sometió a prueba a diferente concentraciones (aproximadamente 1, 5 y 20 mg/ml) en tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS). La estabilidad de las muestras al proceso de nebulización se sometió a prueba comparando muestras antes y después de la nebulización usando cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC).

Cada disolución se nebulizó tal como sigue: el nebulizador se cargó con 500 gl de líquido y el material nebulizado se recogió en un tubo de polipropileno de 50 ml. Se analizaron 10 gg de cada muestra antes y después de la nebulización por medio de SE-HPLC usando un TSK Gel SuperSW3000 (tasa de flujo 0,15 ml/min, tiempo de ejecución 35 minutos, fase móvil KH²PO⁴3,9 mM Na²HPO⁴6,1 mM NaCl 0,4 M pH 7,0; la detección se fijó a 280 nm).

Se observó que la nebulización, por medio de nebulizador de malla o de chorro, induce formas multiméricas discretas de VRS420, visibles como picos previos cuando se analizaba por medio de SE-HPLC. La tabla 2 notifica los datos de integraciones del análisis de SE-HPLC de muestras después de la nebulización; en particular se muestran las cantidades relativas de picos previos en datos de SE-HPLC (% de oligómeros) de diferentes concentraciones de VRS420 (5,32 mg/ml y 22,90 mg/ml) nebulizadas usando un nebulizado de chorro (AKITA^®JET) o de malla (AKITA²APIXNEB^™).

A partir de estos resultados, está claro que la cantidad de formas multiméricas era mucho más pronunciada cuando se usaba un nebulizador de chorro (hasta el 45% de picos previos) en comparación con un nebulizador de malla; además la formación de estos subproductos era menos pronunciada cuando se nebulizaban disoluciones que contenían una mayor concentración de proteína. Específicamente, cuando se nebulizaba una disolución de VRS 420 a la concentración de aproximadamente 20 mg/ml en PBS por medio de un nebulizador de malla, la cantidad relativa de picos previos visibles mediante análisis de SE-HPLC en el aerosol era de como máximo el 2%.

Tabla 2 Porcentaje de oligómeros (a partir de datos de SE-HPLC) en VRS420 nebulizado usando diferentes i i i n liz r if r n n n r i n r ín

Ejemplo 3: Efecto de diferentes combinaciones de tampón/excipiente sobre la nebulización de Nanobody VRS434

VRS434 (SEQ ID NO: 2; DVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAA INWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTV SSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAI NWRGDI TIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVE GRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS) se ha descrito como SEQ ID NO: 142 en el documento WO 2010/139808. VRS434 consiste en tres dominios variables de un anticuerpo llama de cadena pesada. Las subunidades en ambos Nanobodies estaban fusionadas cabeza a cola con un ligador 15G/S.

La estabilidad de VRS434 se analizó en primer lugar en composiciones de tampón/excipiente que muestran un intervalo de pH de desde pH 3,8 hasta 7,0 midiendo la temperatura de fusión (Tm) de VRS434 en las diferentes composiciones. Este parámetro, que define una temperatura a la que el 50% de la proteína en disolución es desplegada, se mide por medio de calorimetría diferencial de barrido (DSC) o ensayo de desplazamiento térmico (TSA).

Para los experimentos de DSC, todas las muestras se llevaron a una concentración de 0,5 mg/ml en los tampones que debían someterse a prueba. Las muestras (400 pl) se aplicaron a una placa de 96 pocillos y los ajustes de DSC eran tal como sigue: concentración de proteína final 0,5 mg/ml; temperatura inicial 35°C; temperatura final 95°C; tasa de barrido 1°C/min.; tasa de enfriamiento: EXP; modo de realimentación: ninguno; periodo de filtración 4; termostato previo al barrido: 10 min.; termostato posterior al barrido: 0 min. Cada análisis incluía también dos ejecuciones de tampón para establecer referencias estables. Los termogramas se obtuvieron tras restar la referencia.

Los resultados de DSC indicaron que los valores de Tm eran superiores a pH neutros (véase la tabla 3).

Tabla 3 Determinación de Tm por medio de DSC de VRS 434 (0,5 mg/ml) en diferentes composiciones de tam ón/exci iente concentración de tam ón 20 mM

A continuación se analizó la estabilidad de VRS434 en composiciones de tampón/excipiente seleccionadas en un intervalo de pH de 6,0 a 7,5 (véase la Figura 1; todos los tampones indicados contenían adicionalmente manitol 0,3 M) midiendo la temperatura de fusión (Tm) de VRS434 en los diferentes tampones por medio de ensayo de desplazamiento térmico (TSA).

El ensayo de desplazamiento térmico (TSA) puede realizarse de una manera de alto rendimiento (placa de 96 pocilios) en un dispositivo Q-PCR para evaluar el efecto del tampón (par), la fuerza iónica, el pH y los excipientes sobre la estabilidad térmica de las proteínas. El ensayo da como resultado un valor de Tm que es indicativo de la estabilidad térmica en los tampones sometidos a prueba. Brevemente, el ensayo sigue los cambios de señal de un tinte fluorescente, tal como Sypro Orange, mientras la proteína experimenta despliegue térmico. Cuando se añade Sypro Orange a una disolución de proteína plegada de manera apropiada, se expone en un entorno acuoso y se señal de fluorescencia se extingue. Cuando la temperatura aumenta, la proteína experimenta despliegue térmico y expone su región de núcleo hidrófoba. Sypro Orange se une entonces a las regiones hidrófobas y deja de extinguirse, lo que da como resultado el aumento de la señal de fluorescencia. El ensayo se realizó en disoluciones que contenían el tampón que debía someterse a prueba, la muestra de proteína a 0,1 mg/ml y 10x Sypro Orange. El programa consistía en las siguientes etapas: calentar hasta 37°C a una tasa de rampa de 4,4°C/s y mantener durante 10s; calentar hasta 90°C a una tasa de rampa continua de 0,01°C/s (66 adquisiciones por °C); y enfriar hasta 37°C a una tasa de rampa de 2,2°C/s y mantener durante 10s.

Además, se analizó adicionalmente el efecto de diferentes composiciones de tampón/excipiente sobre la estabilidad de VRS434 tras la nebulización mediante SE-HPLC.

Se nebulizaron disoluciones 5 mg/ml de Nanobody VRS434 por medio del nebulizador de malla portátil de Omron MicroAir en presencia de diferentes excipientes. Entonces se analizaron las muestras antes y después de la nebulización por medio de cromatografía de exclusión por tamaño.

Brevemente, VRS434 se formuló a 5 mg/ml en los siguientes tampones: fosfato de sodio 10 mM pH 7,0, fosfato de sodio 50 mM pH 7,0, fosfato 10 mM pH 7,5, fosfato 50 mM pH 7,5, TRIS 10 mM pH 7,5, TRIS 50 mM pH 7,5, citrato/fosfato 10 mM pH 6,5, citrato/fosfato 50 mM pH 6,5. A cada disolución se le añadió también, como agente de osmolaridad, glicina o manitol hasta una concentración final de 0,3 M, o cloruro de sodio hasta una concentración final de 0,15 M (véanse la tabla 4 y la Figura 2). Cada disolución se nebulizó tal como sigue: el nebulizador se cargó con 500 gl de líquido y el material nebulizado se recogió en un tubo de polipropileno de 50 ml. Se analizaron 10 gg de cada muestra antes y después de la nebulización por medio de SE-HPLC usando un TSK Gel SuperSW3000 (tasa de flujo 0,15 ml/min, tiempo de ejecución 35 minutos, fase móvil KH²PO⁴3,9 mM Na²HPO⁴6,1 mM NaCl 0,4 M pH 7,0; la detección se fijó a 280 nm).

La tabla 4 notifica los datos de integración del análisis de SE-HPLC de muestras antes y después de la nebulización; en particular se muestran las cantidades relativas de picos previos y posteriores, así como el pico principal de producto. Se ha observado que la nebulización, por medio de nebulizador de malla o de chorro, induce formas multiméricas discretas de VRS434, probablemente debido a la exposición de las moléculas a la interfase aire-agua durante el proceso de aerosolización. La cantidad total de picos previos representa la formación de tales formas multiméricas. La columna de recuperación total notifica el porcentaje de material recuperado tras la nebulización basándose en la relación de área total después y antes de la nebulización.

A partir de estos resultados, está claro que la cantidad de formas multiméricas está por encima del 10% en la mayoría de las condiciones sometidas a prueba; unas pocas composiciones de tampón/excipiente conducen a una multimerización menor, tal como, por ejemplo, fosfato de sodio 10 mM pH 7,0 / NaCl 0,15 M, fosfato 50 mM pH 7,5 / NaCl 0,15 M, TRIS 10 mM pH 7,5 / glicina 0,3 M, TRIS 50 mM pH 7,5 / glicina 0,3 M, citrato/fosfato 50 mM pH 6,5 / NaCl 0,15 M. En términos de recuperación de proteína, todas las combinaciones que contenían TRIS tienen un mejor comportamiento.

Tabla 4 Resumen de los datos de análisis de SE-HPLC de VRS434 a 5 mg/ml en tampones de diferente formulación, tras la nebulización por medio del nebulizador de bolsillo de Omron MicroAIR (nebulizado) en com aración con el material no nebulizado REF

Ejemplo 4: Efecto de tensioactivos y composiciones de tampón/excipiente seleccionadas sobre la nebulización de Nanobody VRS434

Se nebulizaron disoluciones 5 mg/ml de Nanobody VRS434 por medio del nebulizador de malla portátil de Omron MicroAir en presencia de tensioactivos y tampones seleccionados. Entonces se analizaron las muestras antes y después de la nebulización por medio de cromatografía de exclusión por tamaño.

En una primera serie de experimentos, VRS434 se formuló a 5 mg/ml en los siguientes tampones: NaCl al 0,9% (solución salina), TRIS 10 mM pH 7,5 / glicina 0,3 M, fosfato de sodio 10 mM pH 7,5 / NaCl 0,15 M, citrato/fosfato 50 mM pH 6,5 / NaCl 0,15 M. En una segunda serie de experimentos, VRS434 se formuló a 5 mg/ml en los siguientes tampones: NaCl al 0,9% (solución salina), PBS, fosfato de sodio 10 mM pH 7,0 / NaCl 0,14 M, fosfato de sodio 10 mM pH 7,5 / NaCl 0,145 M, citrato/fosfato 10 mM pH 6,5 / NaCl 0,133 M. Cada una de estas condiciones de tampón se sometió a prueba sin o con la adición del 0,04% de polisorbato 80 (Tween 80) y/o el 0,02% de polietilenglicol (PEG) 1000. Cada disolución se nebulizó tal como sigue: el nebulizador se cargó con 500 pl de líquido y el material nebulizado se recogió en un tubo de polipropileno de 50 ml. Se analizaron 10 pg de cada muestra antes y después de la nebulización por medio de SE-HPLC usando un TSK Gel SuperSW3000 (tasa de flujo 0,15 ml/min, tiempo de ejecución 35 minutos, fase móvil KH²PO⁴3,9 mM Na²HPO⁴6,1 mM NaCl 0,4 M pH 7,0; la detección se fijó a 280 nm).

La tabla 5 notifica los datos de integraciones del análisis de SE-HPLC de muestras de la primera serie de experimentos antes y después de la nebulización; en particular se muestran las cantidades relativas de picos previos y posteriores, así como el pico principal de producto. La cantidad total de picos previos representa la formación de formas multiméricas. La columna de recuperación total notifica el porcentaje de material recuperado tras la nebulización basándose en la relación del área total después y antes de la nebulización. La Figura 3 muestra el porcentaje de picos previos medido mediante el análisis de SE-HPLC de muestras de la segunda serie de experimentos después de la nebulización.

A partir de los resultados notificados, el efecto beneficioso sobre la reducción de la cantidad de material multimérico tras la nebulización está claro tanto para Tween 80 como para PEG 1000. En el caso de solución salina y disoluciones de citrato/fosfato 50 mM pH 6,5 / NaCl 0,15 M, Tween 80 parece tener un mejor comportamiento. Por otro lado, PEG 1000 parece aumentar siempre la recuperación de proteína después de la nebulización.

Ejemplo 5: Efecto de diferentes concentraciones de polisorbato (Tween) 80 sobre la nebulización de Nanobody VRS434

Se nebulizaron disoluciones 5 mg/ml de Nanobody VRS434 por medio del nebulizador de malla Akita Apixneb (Activaero) en presencia de tensioactivos y tampones seleccionados. Entonces se analizaron las muestras antes y después de la nebulización por medio de cromatografía de exclusión por tamaño.

Brevemente, VRS 434 se formuló a 5 mg/ml en fosfato de sodio 10 mM pH 7,5 / NaCl 0,14 M en presencia de diferentes concentraciones de Tween 80 (0, el 0,005%, el 0,01%, el 0,02%, el 0,04%, el 0,08%). Cada disolución se nebulizó tal como sigue: el nebulizador se cargó con 500 pl de líquido y el material nebulizado se recogió en un tubo de polipropileno de 50 ml; cada condición de formulación se sometió a prueba por triplicado. Se analizaron 10 pg de cada muestra antes y después de la nebulización por medio de SE-HPLC usando un TSK Gel SuperSW3000 (tasa de flujo 0,15 ml/min, tiempo de ejecución 35 minutos, fase móvil KH²PO⁴3,9 mM Na²HPÜ⁴6,1 mM NaCl 0,4 M pH 7,0; la detección se fijó a 280 nm).

La Figura 4 notifica la cantidad relativa de picos previos obtenida de análisis de SE-HPLC de muestras antes y después de la nebulización. La cantidad total de picos previos representa la formación de formas multiméricas. La Figura 5 muestra el efecto de Tween 80 sobre la recuperación total de proteína basándose en análisis de SE-HPLC de muestras antes y después de la nebulización.

A partir de los datos obtenidos puede concluirse que la cantidad relativa de formas multiméricas tras la nebulización por medio de un nebulizador de malla depende de la concentración de detergente (específicamente Tween 80) en la disolución de partida. El uso del 0,08% Tween 80 da lugar a el menor porcentaje de picos previos (Figura 4) y la mayor recuperación de área (Figura 5). La mayor recuperación de proteína se obtiene con disoluciones de nebulización que contienen el 0,08% o el 0,04% de Tween 80.

Ejemplo 6: Efecto de diferentes concentraciones de polietilenglicol (PEG) 1000 y Pluronic F68 (poloxámero 188; Lutrol F68) sobre la nebulización de Nanobody VRS434

Brevemente, VRS434 se formuló a 5 mg/ml en fosfato de sodio 10 mM pH 7,0 / NaCl 0,13 M en presencia de diferentes concentraciones de PEG 1000 (el 0,02%, el 0,04%) o Pluronic F68 (el 0,001%, el 0,02%, el 0,04%). Cada disolución se nebulizó tal como sigue: el nebulizador se cargó con 500 pl de líquido y el material nebulizado se recogió en un tubo de polipropileno de 50 ml; se analizaron 10 pg de cada muestra antes y después de la nebulización por medio de SE-HPLC usando un TSK Gel SuperSW3000 (tasa de flujo 0,15 ml/min, tiempo de ejecución 35 minutos, fase móvil KH²PO⁴3,9 mM Na²HPO⁴6,1 mM NaCl 0,4 M pH 7,0; la detección se fijó a 280 nm).

La tabla 6 notifica los datos de integración de análisis de SE-HPLC de muestras antes y después de la nebulización; en particular se muestran las cantidades relativas de picos previos, así como el pico principal de producto. La cantidad total de picos previos representa la formación de formas multiméricas. La columna de recuperación total notifica el porcentaje de material recuperado la nebulización basándose en la relación del área total después y antes de la nebulización. Como referencia se notifican datos de un experimento previo realizado en las mismas condiciones experimentales, usando una disolución de VRS434 en fosfato de sodio 10 mM pH 7,0 / NaCl 0,14 M, sin la adición de tensioactivos.

Los datos muestran claramente el papel beneficioso de PEG 1000 a la concentración del 0,04% y especialmente de Pluronic F-68 a la concentración del 0,04% a la hora de reducir la formación de formas multiméricas tras la nebulización por medio de un nebulizador de malla. Los mismos excipientes también permiten una mayor recuperación de material tras el mismo proceso.

Tabla 6. Resumen de los datos de análisis de SE-HPLC de disoluciones 5 mg/ml de VRS434 con diferentes excipientes tras la nebulización por medio del nebulizador Akita Apixneb (nebulizado) en comparación con el material no nebulizado REF .

Ejemplo 7: Efecto de polietilenglicol (PEG) 1000, Pluronic F68 (poloxámero 188; Lutrol F68) y polisorbato (Tween) 80 sobre la nebulización de Nanobody VRS434 por medio de un nebulizador de chorro.

Se nebulizaron disoluciones 5 mg/ml de Nanobody VRS434 por medio del nebulizador de chorro AkitaJet (Activaero) en presencia de tensioactivos seleccionados. Entonces se analizaron las muestras antes y después de la nebulización por medio de cromatografía de exclusión por tamaño.

Brevemente, VRS434 se formuló a 5 mg/ml en fosfato de sodio 10 mM pH 7,0 / NaCl 0,13 M en presencia de PEG 1000 (el 0,04%), Pluronic F68 (el 0,04%) o Tween 80 (el 0,04%, el 0,08%). Cada disolución se nebulizó tal como sigue: el nebulizador se cargó con 2 ml de líquido y el material nebulizado se recogió por medio de un borboteador que contenía 30 ml de PBS; tras la nebulización la disolución se recogió del borboteador y se diluyó hasta 50 ml; la concentración de proteína se determinó por medio de medición de DO280 y se analizaron 10 pg de cada muestra antes y después de la nebulización por medio de SE-HPLC usando un TSK Gel SuperSW3000 (tasa de flujo 0,15 ml/min, tiempo de ejecución 35 minutos, fase móvil KH²PO⁴3,9 mM Na²HPO⁴6,1 mM NaCl 0,4 M pH 7,0; la detección se fijó a 280 nm).

La tabla 7 notifica los resultados de datos de integración de análisis de SE-HPLC de muestras antes y después de la nebulización; en particular se muestran las cantidades relativas de picos previos, así como la pureza de producto (pico principal). La cantidad total de picos previos representa la formación de formas multiméricas.

Parece que PEG 1000 a la concentración del 0,04% y Pluronic F-68 a la concentración del 0,04% reducen la formación de formas multiméricas tras la nebulización también en el caso de nebulización por medio de un nebulizador de chorro, pero no de manera relevante. El uso de Tween 80 parece ser más eficiente para este propósito; el uso de una concentración de tensioactivo mayor (el 0,08% en lugar del 0,04%) no conduce a una disminución importante en la formación de formas de peso molecular mayor (picos previos).

Tabla 7. Resumen de los datos de análisis de SE-HPLC de disoluciones 5 mg/ml de VRS434 con diferentes excipientes tras la nebulización por medio del nebulizador AkitaJet (nebulizado) en comparación con el material no nebulizado REF .

Ejemplo 8: Efecto de la concentración de proteína sobre la nebulización de Nanobody VRS434

Se nebulizaron disoluciones de Nanobody VRS434 a 3 concentraciones diferentes por medio del nebulizador de malla Akita Apixneb (Activaero) en presencia de tampones seleccionados y Tween 80 como tensioactivos. Entonces se analizaron las muestras antes y después de la nebulización por medio de cromatografía de exclusión por tamaño.

Brevemente, VRS434 se formuló a 5 mg/ml, 25 mg/ml y 50 mg/ml en solución salina (NaCl al 0,9%) o en PBS (solución salina tamponada con fosfato), con o sin la presencia del 0,04% de Tween 80.

Cada disolución se nebulizó tal como sigue: el nebulizador se cargó con 500 pl de líquido y el material nebulizado se recogió en un tubo de polipropileno de 50 ml; se analizaron 10 pg de cada muestra antes y después de la nebulización por medio de SE-HPLC usando un TSK Gel SuperSW3000 (tasa de flujo 0,15 ml/min, tiempo de ejecución 35 minutos, fase móvil KH²PO⁴3,9 mM Na²HPÜ⁴6,1 mM NaCl 0,4 M pH 7,0; la detección se fijó a 280 nm).

La Figura 6 notifica la cantidad relativa de picos previos obtenidos de análisis de SE-HPLC de muestras después de la nebulización. La cantidad total de picos previos representa la formación de formas multiméricas. Está claro cómo la formación de formas multiméricas de VRS434 está inversamente relacionada con la concentración de la proteína. A mayores concentraciones de proteína (25 y 50 mg/ml) el efecto del tampón y del tensioactivo sobre la formación multímeros parece insignificante.

Ejemplo 9: Efecto de la concentración de proteína sobre la nebulización de Nanobody VRS434 por medio de un nebulizador de chorro.

Se nebulizaron disoluciones de Nanobody VRS434 a 3 concentraciones diferentes por medio del nebulizador de chorro AkitaJet (Activaero) en presencia de tampones seleccionados y Tween 80 como tensioactivo. Entonces se analizaron las muestras antes y después de la nebulización por medio de cromatografía de exclusión por tamaño.

Brevemente, VRS 434 se formuló a 5 mg/ml, 25 mg/ml y 50 mg/ml en fosfato de sodio 10 mM (NaH²PO^4/Na²HPO⁴) NaCl 0,13 M pH 7,0 o en PBS (solución salina tamponada con fosfato), con o sin la presencia del 0,04% de Tween 80.

Cada disolución se nebulizó tal como sigue: el nebulizador se cargó con 2 ml de líquido y el material nebulizado se recogió por medio de un borboteador que contenía 30 ml de PBS; tras la nebulización la disolución se recogió del borboteador y se diluyó hasta 50 ml; la concentración de proteína se determinó por medio de medición de DO280 y se analizaron 10 pg de cada muestra antes y después de la nebulización por medio de SE-HPLC usando un TSK Gel SuperSW3000 (tasa de flujo 0,15 ml/min, tiempo de ejecución 35 minutos, fase móvil KH²PO⁴3,9 mM Na²HPO⁴6,1 mM NaCl 0,4 M pH 7,0; la detección se fijó a 280 nm).

La Figura 7 notifica la cantidad relativa de picos previos obtenidos de análisis de SE-HPLC de muestras antes y después de la nebulización. La cantidad total de picos previos representa la formación de formas multiméricas.

El efecto de Tween 80 a la hora de reducir el porcentaje de especies multiméricas es más relevante solo a una concentración baja del Nanobody (5 mg/ml).

Ejemplo 10: Efecto de tampones seleccionados sobre el tamaño de gotita de aerosol de Nanobody VRS434.

Los tampones seleccionados eran NaH²PO⁴/Na²HPO⁴10 mM pH 7,0 NaCl 0,13 M con o sin Tween80 al 0,04% (p:v); y tampón PBS con o sin Tween80 al 0,04% (p:v). La composición de PBS era Na2HPO4 10,14 mM, KH2PO4 1,76 mM, KCl 2,67 mM y NaCl 136,9 mM con pH 7,8. La concentración de NaCl se ajustó a 0,13 M (en lugar de 0,14 M en experimentos anteriores) con el fin de garantizar una disolución isotónica (aproximadamente 290 mOsm/kg).

Muestras de VRS 434 formuladas tal como se describe en la tabla 8 se sometieron a experimentos de nebulización con el dispositivo nebulizador Akita²Apixneb, con el fin de determinar el tamaño de gotita promedio (Figura 8). El nebulizador usa una membrana con un tamaño de malla de 4 pm, así que debería conseguirse un tamaño de partícula de 4 pm o menos tras la nebulización.

A partir de los datos notificados en la Figura 8, parece que el tamaño de gotita (diámetro de la mediana volumétrica o VMD, medido mediante difracción láser) es reproducible en diferentes formulaciones y es adecuado para una administración a los pulmones profundos (aproximadamente 4 gm, 3,8 gm para formulaciones a la concentración de 50 mg/ml).

Tabla 8 Descri ción de códi o de muestras com osición concentración

Ejemplo 11: Efecto de la concentración proteína sobre el peso molecular de agregados formados en el material nebulizado de Nanobody VRS434.

Se realizaron experimentos de nebulización adicionales (por triplicado) en disolución de VRS 434 a la concentración de 5 y 50 mg/ml, formulada en NaH2PO4/Na2HPÜ4 10 mM pH 7,0 NaCl 0,13M, con las siguientes concentraciones de tensioactivo: 0, el 0,02% p/v y el 0,04% p/v.

Cada muestra se nebulizó como en los experimentos previos, con la excepción del procedimiento de recogida, que se realizó usando un recipiente de vidrio (botella de 100 ml).

El análisis de SE-HPLC de las muestras tras la nebulización permite cuantificar la cantidad relativa de formas multiméricas (picos previos) de VRS 434 (véase la tabla 9).

No podía verse una influencia significativa de Tween 80 sobre el porcentaje de formas multiméricas tras la nebulización cuando el Nanobody estaba a una concentración de 50 mg/ml. A la concentración inferior (5 mg/ml), la presencia de Tween 80 (el 0,02% y el 0,04% p/v) redujo a la mitad el porcentaje de total picos previos en el material nebulizado.

Analizando en detalle los cromatogramas de SE-HPLC, fue posible determinar también la cantidad relativa de especies de alto peso molecular (HMW) en la región de picos previos (véanse la tabla 9 y la Figura 9); los agregados HMW de VRS434 corresponden a agregados detectados en cromatografía de exclusión por tamaño que tienen un peso molecular de más de aproximadamente 200 kDa. Los resultados muestran claramente que a 50 mg/ml se forman menos especies HMW en formulaciones sin Tween 80. A 5 mg/ml no se observó ninguna diferencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1 Método para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el que la cantidad de formación de agregados es del 6% en peso de proteína o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, comprendiendo dicho método la etapa de atomizar una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 1 mg/ml a 200 mg/ml, en el que:

- el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 25 mg/ml o más;

- la composición no comprende un tensioactivo; y

- la composición se atomiza en un nebulizador de malla vibratoria.
2. - Aerosol que comprende gotitas de líquido que pueden obtenerse atomizando una composición que comprende un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 1 mg/ml a 200 mg/ml, en el que la cantidad de formación de agregados en el aerosol es del 6% en peso de proteína o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, y en el que: - el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 25 mg/ml o más;

- la composición no comprende un tensioactivo; y

- la composición se atomiza en un nebulizador de malla vibratoria.
3. - Un sistema de administración de aerosol que es un nebulizador de malla vibratoria que comprende un recipiente, un generador de aerosol conectado al recipiente, en el que el recipiente comprende una composición adecuada para la preparación de un aerosol de dominios variables únicos de inmunoglobulina en el que la cantidad de formación de agregados es del 6% en peso de proteína o menor, el % de formación de agregados tal como se determina mediante SE-HPLC, comprendiendo dicha composición un portador acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina a una concentración de 1 mg/ml a 200 mg/ml, en el que:

- el polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina está presente en la composición a una concentración de 25 mg/ml o más; y

- la composición no comprende un tensioactivo.
4. - El sistema de administración de aerosol o nebulizador según la reivindicación 3 para su uso en terapia.
5. - El sistema de administración de aerosol o nebulizador para su uso según la reivindicación 4, en el que la terapia es el tratamiento de una enfermedad respiratoria.