ES2927829T3 - Composición de bacterias del ácido láctico para preparar productos alimenticios fermentados con dulzor natural y sabor aumentados - Google Patents
Composición de bacterias del ácido láctico para preparar productos alimenticios fermentados con dulzor natural y sabor aumentados Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a una composición para producir un producto lácteo fermentado que comprende (i) al menos una cepa de Streptococcus thermophilus (St), en donde la cepa St es fermentadora de galactosa, en donde la cepa porta una mutación en la secuencia de ADN del gen glcK que codifica una proteína glucoquinasa, donde la mutación inactiva la proteína glucoquinasa o tiene un efecto negativo sobre la expresión del gen, y (ii) al menos un Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb), siendo la cepa Lb deficiente en lactosa y capaz de metabolizar un carbohidrato sin lactosa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composición de bacterias del ácido láctico para preparar productos alimenticios fermentados con dulzor natural y sabor aumentados
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición según la reivindicación 1 para producir un producto lácteo fermentado que comprende al menos una cepa de Streptococcus thermophilus (St), en donde la cepa de St fermenta galactosa, en donde la cepa porta una mutación en la secuencia de ADN del gen glcK que codifica una proteína glucoquinasa, en donde la mutación inactiva la proteína glucoquinasa o tiene un efecto negativo en la expresión del gen, y (ii) al menos una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb), en donde la cepa de Lb es deficiente en lactosa y capaz de metabolizar glucosa. Tal composición se usa para producir productos lácteos fermentados con un dulzor aumentado.
Antecedentes de la invención
Los productos lácteos fermentados puros se reconocen por un sabor agrio o ácido como resultado de la conversión de lactosa a ácido láctico por las bacterias del ácido láctico durante la fermentación. Por tanto, con frecuencia se endulzan mediante la adición de fruta, miel, azúcar o edulcorantes artificiales para satisfacer el deseo del cliente para un producto de sabor más dulce.
La industria alimentaria tiene una demanda cada vez más alta para productos alimenticios de sabor dulce bajos en calorías con el fin de ayudar a superar los problemas de sobrepeso y obesidad que se han vuelto tan prevalentes en los últimos 20 años. El dulzor, habitualmente considerado una sensación agradable, se produce por la presencia de azúcares y unas pocas otras sustancias. La percepción de los azúcares es muy diferente. Usando sacarosa como una referencia de 100, el dulzor de la lactosa es 16, de la galactosa 32 y de la glucosa 74 (Godshall (1988). Food Technology 42(11):71-78). Por tanto, la glucosa se percibe más de 4 veces más dulce que la lactosa mientras aún tiene aproximadamente el mismo nivel de calorías.
El azúcar en productos alimenticios fermentados se sustituye con frecuencia con edulcorantes tal como aspartamo, acesulfamo K, sucralosa y sacarina que pueden proporcionar el dulzor con una menor ingesta de calorías. Sin embargo, el uso de edulcorantes artificiales puede producir un sabor extraño y varios estudios que indican que el consumo de edulcorantes artificiales está relacionado con desventajas, tal como hambre creciente, alergias, cáncer, etc., han contribuido a la preferencia del consumidor para productos lácteos fermentados que solo contienen edulcorantes naturales o, preferiblemente, no contienen edulcorante añadido.
Por tanto, hay un reto especial en desarrollar productos lácteos fermentados donde el dulzor natural (interno) es alto.
La acidez de productos lácteos fermentados depende en gran parte en las bacterias del ácido láctico presentes y los parámetros de proceso usados para preparar el producto lácteo fermentado.
La fermentación del disacárido lactosa está muy estudiada en las bacterias del ácido láctico porque es la principal fuente de carbono en la leche. En muchas especies, la lactosa es cortada por p-galactosidasa en glucosa y galactosa después de la absorción. La glucosa es fosforilada por la glucoquinasa a glucosa-6-fosfato y fermentada a través de la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (glucolisis) por la mayoría de las bacterias del ácido láctico (Figura 1).
Streptococcus thermophilus es una de las bacterias del ácido láctico más ampliamente usadas para la fermentación de leche termofílica comercial donde el organismo normalmente se usa como parte de un cultivo iniciador mixto, el otro componente es un Lactobacillus sp., por ejemplo, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus para yogur o Lactobacillus helveticus para queso de tipo suizo.
La definición legal de yogur en muchos países requiere Streptococcus thermophilus junto a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Ambas especies generan cantidades deseables de acetaldehído, un componente de sabor importante en el yogur.
La lactosa y la sacarosa se fermentan más fácilmente por Streptococcus thermophilus que sus monosacáridos componentes. En presencia de exceso de galactosa solo la porción de glucosa de la molécula de lactosa se fermenta y la galactosa se acumula en productos lácteos fermentados cuando se usa Streptococcus thermophilus. En yogur en donde las altas concentraciones de ácido limitan la fermentación, la galactosa libre permanece mientras la galactosa libre producida en las primeras fases de la fabricación de queso suizo es posteriormente fermentada por Lactobacillus helveticus.
Sin embargo, se han descrito cepas que fermentan galactosa de tanto de Streptococcus thermophilus como Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus por varios investigadores (Hutkins et al. (1986) J. Dairy Sci. 69(1):1-8;
Vaillancourt et al. (2002) J. Bacteriol. 184(3); 785-793) y en el documento WO 2011/026863 (Chr. Hansen) se describe un método para obtener cepas de Streptococcus thermophilus que fermentan galactosa.
Con el fin de cumplir los requisitos de la industria alimentaria, se ha vuelto relevante proponer nuevas cepas, en particular cepas de Streptococcus thermophilus y cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, que proporcionen dulzor más natural sin calorías extra directamente en el producto fermentado (dulzor interno) por excreción de glucosa.
Pool et al. (2006. Metabolic Engineering 8(5); 456-464) divulga una cepa de Lactococcus lactis en la que el metabolismo de glucosa está completamente desbaratado por deleción de los genes que codifican glucoquinasa, EII(man/glc) y el recientemente descubierto glucosa-PTS EII(cel). El método de construcción es recombinación genética para la generación de todas las mutaciones y la cepa resultante es por consiguiente un organismo genéticamente modificado (OGM) que actualmente no se puede usar en productos alimenticios.
Thompson et al. (1985. J Bacteriol. 162(1); 217-223) estudiaron el metabolismo de lactosa en Streptococcus lactis (hoy renombrada Lactococcus lactis). En este trabajo se usó 2-desoxiglucosa para obtener un mutante en el sistema manosa-PTS. Posteriormente, este mutante se mutagenizó usando mutagénesis por UV seguido por cribado para colonias negativas en glucosa por réplica en placas. De esta manera se aisló un doble mutante (manosa PTS y glucoquinasa). Este doble mutante se usó para estudiar los mecanismos implicados en la regulación de la fermentación de lactosa por organismos “iniciadores”. Estos mutantes tienen varias desventajas en comparación con su cepa parental que los hace inapropiados para inclusión en un cultivo iniciador comercial. El rendimiento celular de los mutantes era la mitad que el de la cepa parental por mol de lactosa fermentado y el tiempo de duplicación estaba significativamente aumentado en los mutantes cuando se hicieron crecer en lactosa. Asimismo, el rendimiento de ácido láctico era la mitad que el de la cepa parental por mol de lactosa fermentado. El comportamiento de estas cepas en leche no se analizó, pero se anticipa que la velocidad de acidificación estaría significativamente reducida.
Además, Lactococcus lactis en general no se elige para la producción de acetaldehído y no contribuye al cumplimiento de los requisitos para la definición legal de yogur.
Chervaux et al. (2000. Appl. And Environ. Microbiol., 66, 5306-5311), estudiaron la fisiología de cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en un medio novedoso químicamente definido y aislaron mutantes resistentes a 2-desoxiglucosa que eran deficientes en la fermentación de glucosa. Se observaron varios fenotipos diferentes y se describieron efectos específicos de cepa.
El documento WO2013/160413 divulga cepas de Streptococcus thermophilus y cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus con propiedades aumentadas para dulzor natural de productos alimenticios y para disminuir el contenido de lactosa de leche fermentada, y un método de cribado y aislamiento de tales cepas.
El documento WO2015/193449 divulga un método para producir un producto lácteo fermentado con una concentración muy baja de lactosa usando una combinación de lactasa y bacterias del ácido láctico con una deficiencia en el metabolismo de glucosa.
El documento WO2015/193459 divulga un método para producir un producto lácteo fermentado con un nivel reducido de posacidificación, en donde una forma de realización usa una mezcla de cuatro cepas de bacterias del ácido láctico con una deficiencia en el metabolismo de glucosa, y en donde otra forma de realización usa una mezcla de cepas de bacterias del ácido láctico deficientes en lactosa.
El objeto de la presente invención es proporcionar una composición para producir un producto lácteo fermentado que comprende al menos una cepa de Streptococcus thermophilus deficiente en glucosa, fermentadora de galactosa y al menos una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus fermentadora de glucosa, deficiente en lactosa, en donde la composición produce un producto lácteo fermentado con un sabor mejorado.
Compendio de la invención
Este objeto se logra con la presente invención, que se dirige a una composición para producir un producto lácteo fermentado que comprende (i) al menos una cepa de Streptococcus thermophilus (St), en donde la cepa de St es fermentadora de galactosa, en donde la cepa porta una mutación en la secuencia de ADN del gen glcK que codifica una proteína glucoquinasa, en donde la mutación inactiva la proteína glucoquinasa o tiene un efecto negativo en la expresión del gen, y (ii) al menos una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb), en donde la cepa de Lb es deficiente en lactosa y capaz de metabolizar glucosa.
Se sabe bien que para cultivos iniciadores convencionales para producir productos lácteos fermentados que comprenden una cepa de Streptococcus thermophilus y una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, hay un riesgo de formación de sabores extraños indeseados, tal como aminoácidos libres, por ejemplo, ácido glutámico. Se sabe bien además que los sabores extraños se forman por la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, y que el nivel de sabores extraños formados depende del nivel de crecimiento de dicha cepa, que varía dependiendo
de un número de factores, tal como el nivel de inoculación de la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, el tipo de medio de crecimiento y las condiciones de crecimiento de la fermentación, así como la cepa específica de Streptococcus thermophilus y la cepa específica de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus usadas en el cultivo iniciador. Se ha encontrado ahora que para cultivos iniciadores para producir un producto lácteo fermentado con dulzor aumentado que comprende al menos una cepa de Streptococcus thermophilus deficiente en glucosa y al menos una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, la formación de sabores extraños no deseados está un alto nivel particular. Esto es consistente con el hecho de que en tales cultivos iniciadores la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus crece a un recuento de células alto particular.
Se ha encontrado sorprendentemente que el problema de los sabores extraños usando cultivos iniciadores con una cepa de Streptococcus thermophilus deficiente en glucosa se resuelve usando una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente en lactosa, positiva en glucosa. Además, se ha encontrado que dicha cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente en lactosa usada en la composición de la invención no produce ninguna posacidificación. Por último, se ha encontrado que dicha cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente en lactosa en combinación con cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa produce un recuento de células muy alto en comparación con cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus convencionales, es decir, positivas en lactosa, positivas en glucosa.
Es muy sorprendente que sea posible evitar la formación de sabores extraños a partir de una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente en lactosa, positiva en glucosa y evitar la posacidificación en vista del hecho de que la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus es positiva en glucosa y está presente en un producto lácteo fermentado que contiene glucosa, donde en teoría la cepa sería capaz de seguir creciendo durante el almacenamiento del producto lácteo fermentado.
Además, es incluso más sorprendente que sea posible evitar la formación de sabores extraños a partir de la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y evitar la posacidificación mientras al mismo tiempo se obtienen recuentos de células altos de la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, porque habitualmente se habría esperado que tanto los sabores extraños como la posacidificación resultaran del crecimiento de la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
Sin querer estar vinculados por ninguna teoría, se cree que los efectos sorprendentes de la presente invención se deben a diferencias en el metabolismo de la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente en lactosa de la invención en comparación con Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus positiva en lactosa convencional.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática del catabolismo de lactosa en Streptococcus thermophilus. GlcK, glucoquinasa; LacS transportador de lactosa; LacZ, p-galactosidasa; GalM, mutarrotasa; GalK, galactoquinasa; GalT, galactosa-1-fosfato uridiltransferasa; GalE, UDP-glucosa 4 epimerasa; GalIP, glactosa-1-fosfato.
Divulgación detallada de la invención
Definiciones
Como se usa en el presente documento, el término “bacteria del ácido láctico” designa una bacteria gram positiva, microaerófila o anaerobia, que fermenta azúcares con la producción de ácidos incluyendo ácido láctico como el ácido predominantemente producido, ácido acético y ácido propiónico. Las bacterias del ácido láctico industrialmente más útiles se encuentran en el orden “Lactobacillales” que incluye Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. y Propionibacterium spp. Las bacterias del ácido láctico, incluyendo bacterias de las especies Lactobacillus sp. y Streptococcus thermophilus, normalmente se suministran a la industria láctea como cultivos congelados o liofilizados para propagación iniciadora a granel o así denominada cultivos de “conjunto de tanque directo” (DVS), pretendidos para la inoculación directa en un recipiente o tanque de fermentación para la producción de un producto lácteo, tal como un producto lácteo fermentado. Tales cultivos en general se denominan “cultivos iniciadores” o “iniciadores”.
El uso de los términos “un” y “una” y “el” y “la” y referentes similares en el contexto de describir la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se deben interpretar que cubren tanto el singular como el plural, a menos que el contexto indique otra cosa en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto. Los términos “comprender”, “tener”, “incluir” y “contener” se deben interpretar como términos abiertos (es decir, que significan “incluyendo, pero no limitado a,”) a menos que se indique otra cosa. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento solamente se pretende que sirva como un método abreviado de referirse individualmente a cada valor separado que está dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la especificación como si se enumerara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en el presente documento o de otra manera se contradiga claramente por el contexto. El uso de cualquiera de los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, “tal como”) proporcionado en
el presente documento, se pretende solamente para iluminar mejor la invención y no supone una limitación en el ámbito de la invención a menos que se reivindique de otra manera. Ninguna redacción en la especificación se debe considerar como que indica ningún elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.
En relación con la presente invención, la expresión “aumentar el dulzor” significa un aumento en dulzor en comparación al dulzor producido por una cepa madre que no porta una mutación en la secuencia de ADN del gen glcK que codifica una proteína glucoquinasa, en donde la mutación inactiva la proteína glucoquinasa o tiene un efecto negativo en la expresión del gen.
La expresión “UFC” significa unidades formadoras de colonias.
Cepas de Streptococcus thermophilus de la composición de la invención
La presente invención no prevé ninguna cepa mutante de Streptococcus thermophilus como tal. En algunos países, la definición legal de yogur requiere la presencia tanto de Streptococcus thermophilus como de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Ambas especies generan cantidades deseables de acetaldehído, un importante componente del sabor en yogur.
También se puede preparar queso, tal como mozzarella y queso de pizza, así como feta usando tanto Streptococcus thermophilus como Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (H0ier et al. (2010) en The Technology of Cheese making, 2a Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192).
Con el fin de cumplir los requisitos de la industria alimentaria, se ha vuelto deseable desarrollar nuevas cepas, en particular cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y cepas de Streptococcus thermophilus, que producen más dulzor natural directamente en el producto fermentado (dulzor interno) sin contribuir calorías extra.
Streptococcus thermophilus es una de las bacterias del ácido láctico más ampliamente usadas para fermentación de leche comercial donde el organismo normalmente se usa como parte un cultivo iniciador mixto, el otro componente es Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus para yogur y Lactobacillus helveticus para queso de tipo suizo.
Solo la porción de glucosa de la molécula de lactosa se fermenta por Streptococcus thermophilus y la galactosa se acumula en productos lácteos fermentados cuando se usa Streptococcus thermophilus. En el yogur, donde altas concentraciones de ácido limitan la fermentación, la galactosa libre permanece mientras que la galactosa libre producida en las primeras etapas de la fabricación del queso suizo se fermenta posteriormente por Lactobacillus helveticus. Lactococcus lactis encontrado en muchos cultivos iniciadores usados para la fabricación de queso también es capaz de consumir la galactosa producida por Streptococcus thermophilus.
Con el fin de asegurar cepas de Streptococcus thermophilus con un rendimiento de crecimiento tan óptimo como sea posible, los presentes inventores han expuesto cepas fermentadoras de galactosa de Streptococcus thermophilus al agente selectivo 2-desoxiglucosa. Típicamente, los mutantes resistentes a 2-desoxiglucosa tienen mutaciones en el gen que codifica la glucoquinasa y en genes que codifican el transportador de glucosa. El mutante aislado, CHCC16731, que son resistentes a 2-desoxiglucosa tienen una mutación en su gen de glucoquinasa (glcK). Además de una mutación en el gen de glucoquinasa, CHCC16731 y CHCC19216 tienen ambos una mutación que significa que la glucosa secretada no se transporta de vuelta a las células otra vez.
Sorprendentemente, tales mutantes solos son todavía totalmente capaces de acidificar leche, aunque el tiempo de acidificación a pH 5 se retrasa en 2-5 horas. Por tanto, son como tal, útiles en aplicaciones de leche fermentada y han conservado la capacidad de las cepas madre de acidificar la leche que es característica del yogur. Además, se encontró que los mutantes excretaban un alto nivel de glucosa, cuando leche de grado B al 9,5% con sacarosa al 0,05% se inoculó con los mutantes y se fermentó a 40°C durante al menos 20 horas. Al mismo tiempo, niveles muy bajos de lactosa permanecen en la leche fermentada. Por tanto, el uso de tales cepas para producir productos lácteos fermentados puede tener una importancia para personas con intolerancia a la lactosa.
Por consiguiente, la leche fermentada final tiene un índice de dulzor interno aumentado calculado como se describe por Godshall (1988. Food Technology 42(11):71-78).
Según la presente invención, la cepa de Streptococcus thermophilus es una cepa mutante que fermenta galactosa de Streptococcus thermophilus, en donde la cepa mutante porta una mutación en la secuencia de ADN del gen glcK que codifica una proteína glucoquinasa, en donde la mutación inactiva la proteína glucoquinasa codificada o tiene un efecto negativo en la expresión del gen, en donde la capacidad de fermentar galactosa se determina como se divulga en la descripción y en donde la mutación reduce la actividad de la proteína glucoquinasa con al menos el 50% y en donde la actividad glucoquinasa se determina como se indica en la descripción.
Los métodos para medir el nivel de actividad glucoquinasa o el nivel de expresión del gen glucoquinasa son fácilmente conocidos (Porter et al. (1982) Biochim. Biophys. Acta, 709;178-186) e incluyen ensayos enzimáticos con kits
comercialmente disponibles y transcriptomómica o PCR cuantitativa usando materiales que están fácilmente disponibles.
En una forma de realización preferida, la cepa de Streptococcus thermophilus empleada en la composición de la invención es resistente a 2-desoxiglucosa. Una “cepa” bacteriana como se usa en el presente documento se refiere a una bacteria que permanece genéticamente sin cambiar cuando se hace crecer o multiplica. Se incluye una multiplicidad de bacterias idénticas.
El término “cepas de Streptococcus thermophilus que fermentan galactosa” como se usa en el presente documento se refiere a cepas de Streptococcus thermophilus que son capaces de crecimiento en medio M17 galactosa al 2%. Las cepas de Streptococcus thermophilus que fermentan galactosa se definen en el presente documento como cepas de Streptococcus thermophilus que disminuyen el pH del caldo M17 que contiene galactosa al 2% como único hidrato de carbono a 5,5 o menos cuando se inocula de un cultivo nocturno al 1% y se incuba durante 24 horas a 37°C.
El término “ la mutación inactiva la proteína glucoquinasa” como se usa en el presente documento se refiere a una mutación que produce una “proteína glucoquinasa inactivada”, una proteína glucoquinasa que, si está presente en una célula, no es capaz de ejercer su función normal, así como mutaciones que previenen la formación de la proteína glucoquinasa o producen degradación de la proteína glucoquinasa.
En particular, una proteína glucoquinasa inactivada es una proteína que comparada con una proteína glucoquinasa funcional no es capaz de facilitar la fosforilación de glucosa a glucosa-6-fosfato o facilita la fosforilación de glucosa a glucosa-6-fosfato a una velocidad significativamente reducida. El gen que codifica tal proteína glucoquinasa inactivada comparado con el gen que codifica una proteína glucoquinasa funcional comprende una mutación en el marco abierto de lectura (ORF) del gen, en donde dicha mutación puede incluir, pero no está limitada a, una deleción, una mutación de cambio de fase de lectura, introducción de un codón de terminación o una mutación que produce una sustitución de aminoácidos, que cambia las propiedades funcionales de la proteína, o una mutación del promotor que reduce o suprime la transcripción o traducción del gen.
La mutación reduce la actividad (la tasa de fosforilación de glucosa a glucosa-6-fosfato) de la proteína glucoquinasa con al menos el 50%, tal como al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 90%.
La actividad glucoquinasa se determina por los ensayos enzimáticos de glucoquinasa descritos por Pool et al. (2006. Metabolic Engineering 8;456-464).
El término “proteína glucoquinasa funcional” como se usa en el presente documento se refiere a una proteína glucoquinasa que, si está presente en una célula, facilita la fosforilación de glucosa a glucosa-6-fosfato. En particular, una proteína glucoquinasa funcional puede estar codificada por un gen que comprende un ORF que tiene una secuencia correspondiente a la posición 1-966 en SEQ ID NO. 1 o una secuencia que tiene al menos el 85% de identidad, tal como al menos el 90% de identidad, tal como al menos el 95% de identidad, tal como al menos el 98% de identidad, tal como al menos el 99% de identidad, a la secuencia correspondiente a la posición 1-966 en SEQ ID NO. 1.
El porcentaje de identidad de dos secuencias se puede determinar usando algoritmos matemáticos, tal como el algoritmo de Karlin y Altschul (1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87;2264), el algoritmo modificado descrito en Karlin y Altschul (1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90;5873-5877); el algoritmo de Myers y Miller (1988. CABIOS 4;11-17); el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970. J. Mol. Biol. 48;443-453); y el algoritmo de Pearson y Lipman (1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85;2444-2448). También está disponible software informático para la determinación de identidad de secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos basado en estos algoritmos matemáticos. Por ejemplo, la comparación de secuencias de nucleótidos se puede realizar con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12. La comparación de secuencias de aminoácidos se puede realizar con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3. Para los restantes parámetros de los programas BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto.
En muchos países el uso de organismos genéticamente modificados (OGM) para productos lácteos fermentados no está aceptado. La presente invención, en su lugar, proporciona composiciones que comprenden cepas mutantes naturales o inducidas que pueden proporcionar una acumulación deseable de glucosa en el producto lácteo fermentado.
Por tanto, en una forma de realización muy preferida de la presente invención la composición comprende una cepa mutante que es un mutante natural o un mutante inducido.
Una “bacteria mutante” o una “cepa mutante” como se usa en el presente documento se refiere a una bacteria mutante natural (espontánea, natural) o una bacteria mutante inducida que comprende una o más mutaciones en su genoma (ADN) que están ausentes en el ADN de tipo salvaje. Un “mutante inducido” es una bacteria donde la mutación se indujo por tratamiento humano, tal como tratamiento con mutágenos químicos, radiación UV o gamma, etc. En
contraste, un “mutante espontáneo” o “mutante natural” no ha sido mutagenizado por el hombre. Las bacterias mutantes son en el presente documento no OGM (organismo no genéticamente modificado), es decir, no modificados por tecnología de ADN recombinante.
“Cepa de tipo salvaje” se refiere a la forma no mutada de una bacteria, como se encuentra en la naturaleza.
Términos tales como “cepas con una propiedad edulcorante”, “cepas que pueden proporcionar una acumulación deseable de glucosa en el producto lácteo fermentado” y “cepas con propiedades aumentadas para el endulzamiento natural de productos alimenticios” se usan de forma intercambiable en el presente documento para caracterizar un aspecto ventajoso de usar las cepas empleadas en la presente invención en productos lácteos fermentados.
En una forma de realización preferida, la cepa mutante de Streptococcus thermophilus empleada en la invención aumenta la cantidad de glucosa en leche de grado B al 9,5% a al menos 5 mg/ml cuando se inocula en la leche de grado B al 9,5% a una concentración de 106-107 UFC/ml y se hace crecer a 40°C durante al menos 20 horas.
En otra forma de realización preferida, la cepa mutante de Streptococcus thermophilus empleada en la invención aumenta la cantidad de glucosa en leche de grado B al 9,5% con sacarosa al 0,05% a al menos 5 mg/ml cuando se inocula en la leche de grado B al 9,5% con sacarosa al 0,05% a una concentración de 106-107 UFC/ml y se hace crecer a 40°C durante al menos 20 horas.
En el presente contexto, la leche de grado B al 9,5% es leche hervida hecha con leche en polvo desnatada con baja grasa reconstituida a un nivel de materia seca del 9,5% y pasteurizada a 99°C durante 30 min seguido por enfriar a 40°C.
En formas de realización más preferidas de la invención la cepa mutante empleada en la invención produce un aumento en la cantidad de glucosa de al menos 6 mg/ml, tal como al menos 7 mg/ml, tal como al menos 8 mg/ml, tal como al menos 9 mg/ml, tal como al menos 10 mg/ml, tal como al menos 11 mg/ml, tal como al menos 12 mg/ml, tal como al menos 13 mg/ml, tal como al menos 14 mg/ml, tal como al menos 15 mg/ml, tal como al menos 20 mg/ml, tal como al menos 25 mg/ml.
En otra forma de realización de la invención la cepa mutante de Streptococcus thermophilus empleada en la invención es resistente a 2-desoxiglucosa.
El término “resistente a 2-desoxiglucosa” en el presente documento se define en que una cepa bacteriana mutante particular tiene la capacidad de crecer a una colonia cuando se siembra en estrías en una placa de medio M17 que contiene 2-desoxiglucosa 20 mM después de incubación a 40°C durante 20 horas. La presencia de 2-desoxiglucosa en el medio de cultivo prevendrá el crecimiento de cepas no mutadas mientras el crecimiento de las cepas mutadas no está afectado o no afectado significativamente. Las cepas no mutadas que se pueden usar como cepas de referencia sensibles en la evaluación de resistencia preferiblemente incluyen las cepas CHCC14994 y CHCC11976.
Las cepas mutantes de Streptococcus thermophilus empleadas en la invención excretan glucosa a la leche cuando leche de grado B al 9,5% se inocula con 106-107 UFC/ml de una cepa de Streptococcus thermophilus según la invención y se fermenta con las cepas de Streptococcus thermophilus según la invención a 40°C durante al menos 20 horas. Preferiblemente, tales cepas mutantes solas excretarán al menos glucosa 5 mg/ml a leche de grado B cuando leche de grado B al 9,5% se inocula con 106-107 UFC/ml de una cepa de Streptococcus thermophilus según la invención y se fermenta con las de cepas de Streptococcus thermophilus a 40°C durante al menos 20 horas. Las cepas son todavía totalmente capaces de acidificar leche, aunque el tiempo de acidificación a pH 5 se retrasa en 2-5 horas. La leche fermentada final contiene menos de 15 mg/ml de lactosa en la leche fermentada. La leche fermentada final, por consiguiente, tiene un mayor índice de dulzor interno de aproximadamente 2 veces o más.
En aun otra forma de realización, la cepa mutante según la invención se puede caracterizar por su patrón de crecimiento. Esto se ilustra por el hallazgo de que la velocidad de crecimiento de la cepa mutante es mayor en medio M17 galactosa al 2% que en medio M17 glucosa al 2%. La velocidad de crecimiento se mide como la progresión en densidad óptica del cultivo en crecimiento exponencial a 600 nanómetros (DO600) con el tiempo.
En una forma de realización preferida, la velocidad de crecimiento es al menos el 5% mayor, tal como al menos el 10% mayor, tal como al menos el 15% mayor, tal como al menos el 20% mayor, en medio M17 galactosa al 2% que en medio M17 glucosa al 2%.
Mutación en el gen glcK
En una forma de realización preferida la mutación produce la sustitución del codón que codifica glicina con el codón que codifica arginina en la posición 249 en SEQ ID NO. 2. Preferiblemente la mutación en el gen glcK produce la sustitución de una G con una A en la posición 745 en SEQ ID NO. 1. La cepa CHCC16731 tiene tal mutación.
En una forma de realización preferida la mutación produce la sustitución del codón que codifica serina con el codón que codifica prolina en la posición 72 en SEQ ID NO. 2 (no mostrado). Preferiblemente la mutación en el gen glcK produce la sustitución de una T con una C en la posición 214 en SEQ ID NO. 1 (no mostrado).
En otra forma de realización preferida la mutación produce la sustitución del codón que codifica treonina con el codón que codifica isoleucina en la posición 141 en SEQ ID NO. 2 (no mostrado).
Preferiblemente la mutación en el gen glcK produce la sustitución de una C con una T en la posición 422 en SEQ ID NO. 1 (no mostrado).
Se debe enfatizar que el gen glcK de un Streptococcus thermophilus se puede inactivar por otros tipos de mutaciones en otros sitios del gen glcK.
Mutación que reduce el transporte de glucosa en la célula
En una forma de realización preferida la cepa de Streptococcus thermophilus porta una mutación que reduce el transporte de glucosa a la célula.
El término “una mutación que reduce el transporte de glucosa a la célula” como se usa en el presente documento se refiere a una mutación en un gen que codifica una proteína implicada en el transporte de glucosa que produce una acumulación de glucosa en el entorno de la célula.
El nivel de glucosa en el medio de cultivo de una cepa de Streptococcus thermophilus se puede medir fácilmente por métodos que conoce el experto en la materia también cuando el medio de cultivo es un sustrato de leche.
En formas de realización preferidas, la mutación reduce el transporte de glucosa a la célula con al menos el 50%, tal como al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 90%.
El transporte de glucosa a la célula se puede determinar por el ensayo de absorción de glucosa descrito por Cochu et al. (2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432).
Preferiblemente, la cepa de Streptococcus thermophilus porta una mutación en un gen que codifica un componente de un transportador de glucosa, en donde la mutación inactiva la proteína transportadora de glucosa o tiene un efecto negativo en la expresión del gen.
El componente puede ser cualquier componente de una proteína transportadora de glucosa que es crítica para el transporte de glucosa. Por ejemplo, se contempla que la inactivación de cualquier componente del PTS glucosa/manosa en Streptococcus thermophilus producirá la inactivación de la función transportadora de glucosa.
El término “la mutación inactiva el transportador de glucosa” como se usa en el presente documento se refiere a una mutación que produce un “transportador de glucosa inactivado”, una proteína transportadora de glucosa que, si está presente en una célula, no es capaz de ejercer su función normal, así como mutaciones que previenen la formación de la proteína transportadora de glucosa o producen degradación de la proteína transportadora de glucosa.
En particular, una proteína transportadora de glucosa inactivada es una proteína que comparada con una proteína transportadora de glucosa funcional no es capaz de facilitar el transporte de glucosa a través de una membrana plasmática o facilita el transporte de glucosa a través de una membrana plasmática a una tasa significativamente reducida. El gen que codifica tal proteína transportadora de glucosa inactivada comparado con el gen que codifica una proteína transportadora de glucosa funcional comprende una mutación en el marco abierto de lectura (ORF) del gen, en donde dicha mutación puede incluir, pero no está limitada a, una deleción, un cambio de fase de lectura, introducción de un codón de terminación o una mutación que produce una sustitución de aminoácidos, que cambia las propiedades funcionales de la proteína, o una mutación del promotor que reduce o elimina la transcripción o traducción del gen.
En formas de realización preferidas la mutación reduce la actividad (la velocidad de transporte de glucosa) de la proteína transportadora de glucosa en al menos el 50%, tal como al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 90%.
La actividad del transportador de glucosa se puede determinar por el ensayo de absorción de glucosa descrito por Cochu et al. (2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432).
El término “proteína transportadora de glucosa funcional” como se usa en el presente documento se refiere a una proteína transportadora de glucosa que, si está presente, facilita el transporte de glucosa a través de una membrana plasmática.
En una forma de realización preferida de la invención la cepa de Streptococcus thermophilus empleada en la invención porta una mutación en la secuencia de ADN del gen manN que codifica la proteína IIDMan del sistema fosfotransferasa de glucosa/manosa, en donde la mutación inactiva la proteína IIDMan o tiene un efecto negativo en la expresión del gen.
CHCC16731 tiene un cambio de prolina a treonina en la posición 79 del gen manN que codifica la proteína IIDMan del sistema fosfotransferasa de glucosa/manosa. Preferiblemente, la mutación en el gen ManN produce la sustitución de una A con una C en la posición 235 en SEQ ID NO. 3.
Por tanto, en una forma de realización preferida la cepa de Streptococcus thermophilus empleada en la invención porta una mutación en la secuencia de ADN del gen manN que codifica la proteína IIDMan del sistema fosfotransferasa de glucosa/manosa, en donde la mutación produce la sustitución de treonina a prolina en la posición 79 de SEQ ID NO. 4.
En otra forma de realización preferida de la invención la cepa de Streptococcus thermophilus empleada en la invención porta una mutación en la secuencia de ADN del gen manN que codifica la proteína IICMan del sistema fosfotransferasa de glucosa/manosa, en donde la mutación inactiva la proteína IICMan o tiene un efecto negativo en la expresión del gen.
En una forma de realización preferida específica la mutación produce la sustitución del codón que codifica ácido glutámico con un codón de terminación en la posición 209 de SEQ ID NO. 6 de la proteína NCMan del sistema fosfotransferasa de glucosa/manosa (no mostrado). Preferiblemente, la mutación produce la sustitución de una G con una T en la posición 625 de SEQ ID NO. 5 (no mostrado).
Cepas de Streptococcus thermophilus preferidas empleadas en composiciones de la invención
En una forma de realización preferida de la composición de la invención la cepa de Streptococcus thermophilus se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC19216 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el No. de registro DSM 32227, la cepa Streptococcus thermophilus CHCC16731 se ha depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 4 de junio, 2014 con el número de registro DSM 28889, la cepa Streptococcus thermophilus CHCC15757 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de registro DSM 25850, una cepa Streptococcus thermophilus CHCC15887 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de registro DSM 25851, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC16404 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de registro DSM 26722, y una cepa mutante derivada de las mismas, en donde la cepa mutante se obtiene usando una de las cepas depositadas como material de partida, y en donde elmutante ha retenido o mejorado más la propiedad texturizante y la propiedad de secretar glucosa de dicha cepa depositada.
En el presente contexto, el término “cepa mutante” se debe entender como cepas derivadas de sus cepas madre empleadas en la invención por medio de, por ejemplo, ingeniería genética, radiación y/o tratamiento químico. Las “cepas derivadas de las mismas” son mutantes funcionalmente equivalentes, es decir, mutantes que tienen sustancialmente las mimas propiedades, o mejoradas, que su cepa madre. Especialmente, el término “cepas mutantes” se refiere a cepas obtenidas sometiendo una cepa empleada en la invención a cualquier tratamiento de mutagenización convencionalmente usado con un mutágeno químico tal como sulfonato de etano metano (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV, o a un mutante espontáneo. Un mutante se puede haber sometido a varios tratamientos de mutagenización (un único tratamiento se debe entender como una etapa de mutagenización seguido por una etapa de cribado/selección), pero actualmente se prefiriere que se lleven a cabo no más de 20, o no más de 10 o no más de 5 tratamientos (o etapas de cribado/selección). En un mutante menos el 1%, menos del 0,1%, menos el 0,01%, menos del 0,001%, o incluso menos el 0,0001% de los nucleótidos en el genoma bacteriano se han sustituido con otro nucleótido, o delecionado, comparado con la cepa madre.
Método de obtener una cepa de Streptococcus thermophilus edulcorante
Los métodos para obtener cepas edulcorantes de Streptococcus thermophilus no están abarcados por la presente invención y se presentan para fines ilustrativos solo.
La cepa inicial usada para desarrollar una cepa edulcorante de Streptococcus thermophilus es una cepa texturizante de Streptococcus thermophilus, que se puede obtener como se describe en otro lugar en esta especificación.
En una forma de realización preferida tal cepa inicial texturizante se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC11342 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el No. de registro DSM 22932, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC11976 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el No. de registro DSM 22934, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC12339 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el No. de registro DSM 24090, y cepas derivadas de las mismas. Alternativamente, la cepa inicial
usada para desarrollar una cepa edulcorante de Streptococcus thermophilus es una cepa no texturizante de Streptococcus thermophilus, en cuyo caso la propiedad texturizante se introduce en la cepa edulcorante de Streptococcus thermophilus una vez producida, es decir, la cepa edulcorante se usa como una cepa inicial en el método para obtener una cepa texturizante descrito en otra parte en esta especificación.
La primera etapa del método de obtener una cepa edulcorante de Streptococcus thermophilus es proporcionar una cepa positiva en galactosa, es decir, una cepa que sea capaz de usar galactosa como una fuente de hidratos de carbono. Las cepas positivas en galactosa se pueden obtener por un método que comprende la etapa de sembrar en estrías las bacterias que se van a ensayar en placas de agar, tal como placas de agar M17 que contienen una cierta concentración, tal como el 2%, de galactosa (única fuente de hidratos de carbono) e identificar colonias capaces de crecer en las placas.
Se usa 2-desoxiglucosa y una determinación del patrón de crecimiento de las bacterias en medio M17 galactosa al 2% comparado con medio M17 glucosa al 2% para la selección de bacterias que tienen una mutación en el gen de glucoquinasa (glcK).
Un método de cribado y aislamiento de una cepa de Streptococcus thermophilus con un gen glcK mutado comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar una cepa madre de Streptococcus thermophilus que fermenta galactosa;
b) seleccionar y aislar de un conjunto de cepas de Streptococcus thermophilus mutantes derivadas de la cepa madre un conjunto de cepas de Streptococcus thermophilus mutantes que son resistentes a 2-desoxiglucosa; y c) seleccionar y aislar del conjunto de cepas de Streptococcus thermophilus mutantes que son resistentes a 2-desoxiglucosa una cepa de Streptococcus thermophilus mutante si la velocidad de crecimiento de la cepa de Streptococcus thermophilus mutante es mayor en medio M17 galactosa al 2% que en medio M17 glucosa al 2%.
El término “resistente a 2-desoxiglucosa” en el presente documento se define en que una cepa bacteriana mutada particular tiene la capacidad de crecer a una colonia cuando se siembra en estrías en una placa de medio M17 que contiene lactosa al 2% o galactosa al 2% y que contiene 2-desoxiglucosa 20 mM después de incubación a 40°C durante 20 horas. La presencia de 2-desoxiglucosa en el medio de cultivo prevendrá el crecimiento de cepas no mutadas mientras el crecimiento de las cepas mutadas no está afectado o no afectado significativamente. Las cepas no mutadas que se pueden usar como cepas de referencia sensibles en la evaluación de resistencia incluyen la cepa CHCC11976.
En una forma de realización el método además comprende la etapa a1) someter la cepa madre a mutagenización, tal como someter la cepa madre a un mutágeno químico y/o físico.
En otra forma de realización, el método además comprende una etapa d) seleccionar y aislar de un conjunto de cepas de Streptococcus thermophilus resistentes a 2-desoxiglucosa derivadas de la cepa de Streptococcus thermophilus seleccionada en la etapa c) una cepa de Streptococcus thermophilus si la velocidad de crecimiento de la cepa de Streptococcus thermophilus es alta en medio M17 sacarosa al 2%, pero cero o al menos reducida al 0-50% comparada con la velocidad de crecimiento de la cepa madre en medio M l7 glucosa al 2%.
Las cepas madre de Streptococcus thermophilus que fermentan galactosa son capaces de crecimiento en medio M17 galactosa al 2% y se definen en el presente documento en que tienen la capacidad de disminuir el pH en caldo M17 que contiene galactosa al 2% como único hidrato de carbono a 5,5 o menos cuando se inocula de un cultivo nocturno al 1% y se incuba durante 24 horas a 37°C. Tales cepas positivas en galactosa se han descrito en el documento WO2011/026863 (Chr. Hansen AS) y el documento WO2011/092300 (Chr. Hansen AS).
En el presente contexto, el término “cepas derivadas de las mismas” se debe entender como cepas derivadas, o cepas que se pueden derivar de cepas madre de Streptococcus thermophilus texturizantes o que fermentan galactosa texturizantes por medio de, por ejemplo, manipulación genética, radiación y/o tratamiento químico. Las “cepas derivadas de las mismas” también pueden ser mutantes espontáneos. Las “cepas derivadas de las mismas” son mutantes funcionalmente equivalentes, es decir, mutantes que tienen sustancialmente las mismas propiedades, o mejoradas (por ejemplo, respecto a textura o fermentación de galactosa) que su cepa madre. Especialmente, el término “cepas derivadas de las mismas” se refiere a cepas obtenidas al someter una cepa de la invención a cualquier tratamiento de mutagenización convencionalmente usado incluyendo tratamiento con un mutágeno químico tal como sulfonato de etano metano (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV, o a un mutante espontáneo. Un mutante se puede haber sometido a varios tratamientos de mutagenización (un único tratamiento se debe entender como una etapa de mutagenización seguido por una etapa de cribado/selección), pero actualmente se prefiere que se lleven a cabo no más de 20, o no más de 10 o no más de 5 tratamientos (o etapas de cribado/selección). En un mutante menos el 1%, menos del 0,1%, menos el 0,01%, menos del 0,001%, o incluso menos el 0,0001% de los nucleótidos en el genoma bacteriano se han sustituido con otro nucleótido, o delecionado, comparado con la cepa madre.
En la presente invención la expresión “gen glcK que codifica una glucoquinasa” significa cualquier secuencia de ADN de un Streptococcus thermophilus que codifica una proteína que tiene actividad glucoquinasa, incluyendo la glucoquinasa específica codificada por la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1. Una glucoquinasa cataliza la reacción que convierte glucosa en glucosa-6-fosfato, cf. Fig. 1.
Cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus de la composición de la invención
La presente invención no prevé ninguna cepa mutante de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus como tal.
Los términos “deficiencia en metabolismo de lactosa” y “deficiente en lactosa” se usan en el contexto de la presente invención para caracterizar LAB que o bien parcial o totalmente perdieron la capacidad de usar lactosa como una fuente para crecimiento celular o mantener la viabilidad celular. Los LAB respectivos son capaces de metabolizar glucosa.
Puesto que este hidrato de carbono no está presente de forma natural en la leche en suficientes cantidades para soportar la fermentación por mutantes deficientes en lactosa, es necesario añadirlo a la leche.
Se pueden caracterizar LAB deficientes y parcialmente deficientes en lactosa como colonias blancas en un medio que contiene lactosa y X-Gal.
En relación con la presente invención el término “X-Gal” significa 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galacto-piranósido, que es un sustrato cromógeno para beta-galactosidasa, que hidroliza X-Gal a galactosa incolora y 5-bromo-4-cloroindolilo, que espontáneamente dimeriza para formar un pigmento azul.
La cepa deficiente en lactosa es capaz de metabolizar glucosa.
En una forma de realización particular de la composición de la invención, la cepa de Lb se selecciona del grupo que consiste en la cepa depositada con DMSZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 12-06-2014 con el número de registro DSM 28910, y una cepa mutante derivada de DSM 28910, en donde la cepa mutante además se caracteriza como que tiene la capacidad de generar colonias blancas en un medio que contiene lactosa y X-Gal.
Las cepas deficientes en lactosa se pueden obtener de una cepa madre positiva en lactosa por mutación. Las cepas deficientes en lactosa se seleccionaron después de la mutagénesis con UV como colonias blancas (que indica un fenotipo deficiente en lactosa) en un medio adecuado, por ejemplo, placas de agar MRS con lactosa al 1% y X-Gal 200 mg/ml. Las cepas positivas en lactosa poseen actividad p-galactosidasa, y las colonias de la cepa positiva en lactosa aparecen azules debido a la actividad de la p-galactosidasa. Como cepa madre positiva en lactosa para producir una cepa defiende en lactosa, se puede usar la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC10019 depositada para el documento WO2011/000879 con DMSZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, el 03-04-2007 con el número de registro DSM 19252.
Composición
La presente invención además se refiere a una composición definida en la reivindicación 1 que comprende de 104 a 1012 UFC (unidades formadoras de colonia)/g de la cepa de Streptococcus thermophilus, tal como 105 a 1011 UFC/g, tal como 106 a 1010 UFC/g, tal como 107 a 109 UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus.
En una forma de realización preferida, la cepa de Streptococcus thermophilus de la composición es incapaz de acidificar leche de grado B al 9,5%, definido como producir un descenso en pH de menos de 1,0 cuando leche de grado B al 9,5% se inocula con 106-107 UFC/ml de la cepa de Streptococcus thermophilus y se incuba durante 14 horas a 40°C, y la composición comprende además una cantidad de un compuesto, que puede desencadenar la acidificación de la leche de grado B al 9,5% por la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC16404 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el No. de registro DSM 26722, definido cono producir una disminución de pH de 1,0 o más cuando leche de grado B al 9,5% se inocula con 106-107 UFC/ml de la cepa de Streptococcus thermophilus y se incuba durante 14 horas a 40°C.
Preferiblemente, el compuesto es sacarosa.
Preferiblemente, la cantidad de sacarosa es desde el 0,000001% al 2%, tal como desde el 0,00001% al 0,2%, tal como desde el 0,0001% al 0,1%, tal como desde el 0,001% al 0,05%.
La composición como se expone en la reivindicación 1 preferiblemente además comprende de 104 a 1012 UFC/g de la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, tal como 105 a 1011 UFC/g, tal como 106 a 1010 UFC/g, tal como 107 a 109 UFC/g de la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
En una forma de realización particular de la invención, la composición según la reivindicación 1 contiene al menos dos cepas de St, preferiblemente al menos tres cepas de St, y más preferiblemente tres cepas de St. En una forma de realización particular de la invención, la composición según la reivindicación 1 no contiene más de tres cepas de Lb, preferiblemente no más de dos cepas de Lb, y más preferiblemente una cepa de Lb.
En una forma de realización particular de la invención, la composición de la reivindicación 1 contiene al menos una cepa de St seleccionada del grupo que consiste en la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC16731 se ha depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 4 de junio, 2014 con el número de registro DSM 28889, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC15757 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de registro DSM 25850, y la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC16404 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el No. de registro DSM 26722, y la cepa de Lb depositada con DMSZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, el 12-06-2014 con el número de registro DSM 28910.
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, y otras bacterias del ácido láctico se usan comúnmente como cultivos iniciadores que sirven un fin tecnológico en la producción de varios alimentos, tal como en la industria láctea, tal como productos lácteos fermentados. Por tanto, en otra forma de realización preferida la composición es adecuada como un cultivo iniciador.
Los cultivos iniciadores se pueden proporcionar como cultivos iniciadores congelados o secos además de cultivos iniciadores líquidos. Por tanto, en aun otra forma de realización preferida la composición está en forma congelada, liofilizada o líquida.
Como se divulga en el documento WO 2005/003327, es beneficioso añadir ciertos agentes crioprotectores a un cultivo iniciador. Por tanto, una composición de cultivo iniciador según la presente invención puede comprender uno o más agente(s) crioprotector(es) seleccionado(s) del grupo que consiste en inosina-5'-monofosfato (IMP), adenosina-5'-monofosfato (AMP), guanosina-5'-monofosfato (GMP), uranosina-5'-monofosfato (UMP), citidina-5'-monofosfato (CMP), adenina, guanina, uracilo, citosina, adenosina, guanosina, uridina, citidina, hipoxantina, xantina, hipoxantina, orotidina, timidina, inosina y un derivado de tales compuestos.
Método para producir un producto lácteo fermentado
La invención se dirige además a un método de producir un producto lácteo fermentado que comprende inocular y fermentar un sustrato de leche con la composición según la presente invención.
El término “leche” se debe entender como la secreción láctea obtenida al ordeñar cualquier mamífero, tal como una vaca, una oveja, una cabra, un búfalo o un camello. En una forma de realización preferida, la leche es leche de vaca.
El término “sustrato de leche” puede ser cualquier material de leche crudo y/o procesado que se pueda someter a fermentación según el método de la invención. Por tanto, sustratos de leche útiles incluyen, pero no están limitados a, soluciones/suspensiones de cualquier leche o producto de tipo leche que comprende proteína, tal como leche entera o baja en grasa, leche desnatada, suero de mantequilla, leche en polvo reconstituida, leche condensada, leche deshidratada, suero, permeado de suero, lactosa, líquido madre de cristalización de lactosa, concentrado de proteína de suero, o nata. Obviamente, el sustrato de leche se puede originar de cualquier mamífero, por ejemplo, ser leche de mamífero sustancialmente pura, o leche en polvo reconstituida.
Preferiblemente, al menos parte de la proteína en el sustrato de leche es proteínas naturales de la leche, tal como caseína o proteína de suero. Sin embargo, parte de la proteína pueden ser proteínas que no son naturales en la leche.
Antes de la fermentación, el sustrato de leche se puede homogeneizar y pasteurizar según métodos conocidos en la técnica.
“Homogeneizar” como se usa en el presente documento significa mezcla intensiva para obtener una suspensión o emulsión soluble. Si la homogeneización se realiza antes de la fermentación, se puede realizar de modo que se rompa la grasa de la leche en tamaños menores de modo que ya no se separe de la leche. Esto se puede lograr forzando la leche a alta presión a través de orificios pequeños.
“Pasteurizar” como se usa en el presente documento significa tratamiento del sustrato de leche para reducir o eliminar la presencia de organismos vivos, tal como microorganismos. Preferiblemente, la pasteurización se logra manteniendo una temperatura especificada durante un periodo de tiempo especificado. La temperatura especificada habitualmente se obtiene calentando. La temperatura y duración se pueden seleccionar con el fin de destruir o inactivar ciertas bacterias, tal como bacterias dañinas. Puede seguir una etapa de enfriamiento rápida.
“Fermentación” en los métodos de la presente invención significa la conversión de hidratos de carbono en alcoholes o ácidos a través de la acción de un microorganismo. Preferiblemente, la fermentación en los métodos de la invención comprende la conversión de lactosa a ácido láctico.
Los procesos de fermentación que se van a usar en la producción de productos lácteos fermentados son bien conocidos y el experto en la materia sabrá cómo seleccionar las condiciones de proceso adecuadas, tal como temperatura, oxígeno, cantidad y características de microorganismo(s) y tiempo de proceso. Obviamente, las condiciones de fermentación se seleccionan de modo que apoyen el logro de la presente invención, es decir, obtener un producto lácteo en forma sólida o líquida (producto lácteo fermentado).
El término “producto lácteo fermentado” como se usa en el presente documento se refiere a un alimento o producto alimenticio en donde la preparación del alimento o producto alimenticio implica fermentación de un sustrato de leche con una bacteria del ácido láctico. “Producto lácteo fermentado” como se usa en el presente documento incluye, pero no está limitado a, productos tal como productos lácteos fermentados termofílicos, por ejemplo, yogur, productos lácteos fermentados mesofílicos, por ejemplo, nata agria y suero de mantequilla, así como suero fermentado.
El término “termófilo” en el presente documento se refiere a microorganismo que prosperan mejor a temperaturas por encima de 35°C. Las bacterias termofílicas industrialmente más útiles incluyen Streptococcus spp. y Lactobacillus spp. El término “fermentación termofílica” en el presente documento se refiere a fermentación a una temperatura por encima de aproximadamente 35°C, tal como entre aproximadamente 35°C hasta aproximadamente 45°C. El término “producto lácteo fermentado termofílico” se refiere a productos lácteos fermentados preparados por fermentación termofílica de un cultivo iniciador termofílico e incluye tales productos lácteos fermentados como yogur firme, yogur batido y yogur líquido, por ejemplo, Yakult.
El término “mesófilo” en el presente documento se refiere a microorganismo que prosperan mejor a temperaturas moderadas (15°C-35°C). Las bacterias mesofílicas industrialmente más útiles incluyen Lactococcus spp. y Leuconostoc spp. El término “fermentación mesofílica” en el presente documento se refiere a fermentación a una temperatura entre aproximadamente 22°C y aproximadamente 35°C. El término “producto lácteo fermentado mesofílico” se refiere a productos lácteos fermentados preparados por fermentación mesofílica de un cultivo iniciador mesofílico e incluye tales productos lácteos fermentados como suero de mantequilla, leche agria, leche fermentada, smetana, nata agria, kéfir y queso fresco, tal como quark, tvarog y queso crema.
En una forma de realización preferida la concentración de células de Streptococcus thermophilus inoculadas es de 104 a 109 UFC de células de Streptococcus thermophilus por ml de sustrato de leche, tal como de 104 UFC a 108 UFC de células de Streptococcus thermophilus por ml de sustrato de leche.
En otra forma de realización preferida del método de la invención la cepa de Streptococcus thermophilus es incapaz de acidificar la leche de tipo B al 9,5%, definido como producir un descenso en pH de menos de 1,0 cuando leche de grado B al 9,5% se inocula con 106-107 UFC/ml de la cepa de Streptococcus thermophilus y se incuba durante 14 horas a 40°C, y al sustrato de leche se añade una cantidad de un compuesto, eficaz para desencadenar la acidificación de la leche de grado B al 9,5% por la cepa de Streptococcus thermophilus, definido cono producir una disminución de pH de 1,0 o más cuando leche de grado B al 9,5% se inocula con 106-107 UFC/ml de la cepa de Streptococcus thermophilus y se incuba durante 14 horas a 40°C.
Preferiblemente, el compuesto es sacarosa.
Preferiblemente, la cantidad de sacarosa es desde el 0,000001% al 2%, tal como desde el 0,00001% al 0,2%, tal como desde el 0,0001% al 0,1%, tal como desde el 0,001% al 0,05%.
En otra forma de realización preferida el producto lácteo fermentado es un yogur o un queso.
Los ejemplos de quesos que se preparan por fermentación con Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus incluyen mozzarella y queso de pizza (H0 ier et al. (2010) en The Technology of Cheesemaking, 2a Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192).
Preferiblemente el producto lácteo fermentado es un yogur.
En el presente contexto, un cultivo iniciador de yogur es un cultivo bacteriano que comprende al menos una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y al menos una cepa de Streptococcus thermophilus. Según esto, el término “yogur” se refiere a un producto lácteo fermentado obtenible al inocular y fermentar leche con una composición que comprende una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y una cepa de Streptococcus thermophilus.
Producto lácteo fermentado
La presente invención además se refiere a un producto lácteo fermentado que comprende la composición según la invención.
En otra forma de realización preferida el producto lácteo fermentado puede ser un yogur, un queso, nata agria y suero de mantequilla, así como suero fermentado. Preferiblemente, el producto lácteo fermentado es un yogur.
Uso de la composición de la invención
Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de la composición según la invención para la preparación de un producto lácteo fermentado.
Se describen a continuación formas de realización de la presente invención, a modo de ejemplos no limitantes.
Lista de secuencias
SEQ ID NO. 1 muestra la secuencia de ADN del gen de glucoquinasa mutado de la cepa CHCC16731.
SEQ ID NO.2 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO. 1.
SEQ ID NO.3 muestra la secuencia de ADN del gen ManN mutado de la cepa CHCC16731.
SEQ ID NO.4 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO. 3.
SEQ ID NO.5 muestra la secuencia de ADN del gen ManN (sin mutar) de la cepa CHCC16731.
SEQ ID NO. 6 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO. 5.
Ejemplos
Materiales y métodos
Medio:
Para Streptococcus thermophilus, el medio es el medio M17 que conocen los expertos en la materia.
El medio agar M17 tiene la siguiente composición por litro de H2O:
agar, 12,75 g
ácido ascórbico, 0,5 g
peptona de caseína (tríptica), 2,5 g
p-glicerofosfato disódico pentahidrato, 19 g
sulfato de magnesio hidrato, 0,25 g
extracto de carne, 5 g
peptona de carne (péptica), 2,5 g
peptona de soja (papaínica), 5 g
extracto de levadura, 2,5 g
pH final 7,1 ± 0,2 (25°C)
y el caldo M17 tiene la siguiente composición por litro de H2O:
ácido ascórbico, 0,5 g
sulfato de magnesio, 0,25 g
extracto de carne, 5 g
peptona de carne (péptica), 2,5 g
glicerofosfato de sodio, 19 g
peptona de soja (papaínica), 5 g
triptona, 2,5 g
extracto de levadura, 2,5 g
pH final 7,1 ± 0,2 (25°C)
Las fuentes de carbono añadidas son lactosa 20 g/l, glucosa 20 g/l o galactosa 20 g/l estériles.
Como sabe el experto en la materia, el medio M17 es un medio que se considera que es adecuado para el crecimiento de Streptococcus thermophilus. Además, como entiende el experto en la materia, en el presente contexto, un concentrado de M17 se puede suministrar de diferentes suministradores e independientemente del suministrador específico se obtendrá (en una incertidumbre de medida estándar) el mismo resultado relevante en el presente documento de resistencia a 2-desoxiglucosa para una célula de interés relevante en el presente documento.
El medio usado para cultivar Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus era medio MRS-IM. Se usó MRS-IM en forma de o bien placas de agar o caldo.
El medio agar MRS-IM tenía la siguiente composición por litro de H2O:
Triptona Oxoid L 42 10,0 g
Extracto de levadura Oxoid L 21 5,0 g
Tween 80 Merck nr 8.22187 1,0 g
K2HPO4 Merck nr 105104 2,6 g
Acetato de Na Merck nr 106267 5,0 g
Hidrogenocitrato de diamonio Merck nr 101154 2,0 g
MgSO4, 7 H2O Merck nr 105882 0,2 g
MnSO4, H2O Merck nr 105941 0,05 g
Agar SO-BI-GEL 13,0 g
El pH se ajustó después de autoclavar a 6,9 ± 0,1 a 25°C.
El caldo MRS-IM usado en los ejemplos posteriores para cultivos líquidos tenía la siguiente composición por litro de H2O:
Triptona Oxoid L 42 10,0 g
Extracto de levadura Oxoid L 21 5,0 g
Tween 80 Merck nr 8.22187 1,0 g
K2HPO4 Merck nr 105104 2,6 g
Acetato de Na Merck nr 106267 5,0 g
Hidrogenocitrato de diamonio Merck nr 101154 2,0 g
MgSO4, 7 H2O Merck nr 105882 0,2 g
MnSO4, H2O Merck nr 105941 0,05 g
El pH se ajustó después de autoclavar a 6,9 ± 0,1 a 25°C. Las fuentes de carbono, lactosa 20 g/l o glucosa 20 g/l, primero se esterilizaron por filtración y después se añadieron al caldo autoclavado.
El medio MRS-IM anterior se puede variar a algún grado sin afectar la capacidad del medio de soportar el crecimiento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Además, como entenderá el experto en la materia, un concentrado de MRS-IM o los varios componentes descritos anteriormente se pueden obtener de diferentes suministradores y usar para la preparación de medio MRS-IM. Estos medios se usarán asimismo en los ejemplos posteriores, en particular, en el ensayo de selección de resistencia a 2-desoxiglucosa.
Cepas madre
Streptococcus thermophilus CHCC11976 (cepa que fermenta galactosa con una mutación en el gen GalK como se describe en el documento WO 2011/026863).
Streptococcus thermophilus CHCC12339 (resistente a fagos y texturizante como se describe en el documento WO2011/092300).
Streptococcus thermophilus CHCC18948 (mutante que fermenta galactosa de CGCC12339 con una mutación en el gen GalK).
Cepas resistentes a 2-desoxiglucosa
Streptococcus thermophilus CHCC16165 (mutante resistente a 2-desoxiglucosa de CHCC11976) Streptococcus thermophilus CHCC16731 (mutante edulcorante y texturizante de CHCC16165)
Streptococcus thermophilus CHCC19216 (mutante edulcorante y texturizante de CHCC18948).
Ejemplo 1: Uso de 2-desoxiglucosa para aislar un mutante de glucosa quinasa de Streptococcus thermophilus CHCC11976 con excreción aumentada de glucosa (Ejemplo no según la invención y presentado para fines ilustrativos solo)
Con el fin de aislar mutantes de la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC11976, células derivadas del crecimiento de una única colonia se inocularon en 10 ml de caldo M17 que contenía lactosa al 2% y se hicieron crecer durante la noche a 40°C.
Al día siguiente, las cepas se sembraron en diluciones en serie en placas de agar M17 que contenían galactosa al 2% y una concentración de 2-desoxiglucosa de 20 mM (CHCC11976) y se incubó durante 20 horas a 40°C. Las colonias resistentes primero se volvieron a sembrar en estrías en el mismo tipo de placas de agar en que se habían seleccionado. Los supervivientes se usaron para inocular caldo M17 reciente que contenía o bien lactosa al 2%, galactosa al 2% o glucosa al 2% y se midió el crecimiento.
A partir de esto, se identificó un número de mutantes que eran capaces de crecer más rápido en galactosa que en glucosa como se resume en el ejemplo 2. Uno de tales mutantes era CHCC16165.
Ejemplo 2: Patrón de crecimiento del mutante con resistencia a 2-desoxiglucosa (Ejemplo no según la invención y presentado para fines ilustrativos solo)
Para asegurar la selección de mutantes resistentes a 2-desoxiglucosa que pueden crecer en galactosa, se usaron dos cepas que se seleccionaron de una colección de cepas que fermentan galactosa. Mientras estas cepas que fermentan galactosa todavía crecen al menos el 10% más rápido en fase exponencial en caldo M17 glucosa al 2% que en caldo M17 galactosa al 2%, el mutante resistente de 2-desoxiglucosa derivado de CHCC11976, es decir, CHCC16165, por otra parte, se caracterizan por crecimiento más rápido en fase exponencial en caldo M17 galactosa al 2% que en caldo M17 glucosa al 2%. El crecimiento en fase exponencial se mide en el presente documento como la progresión en densidad óptica del cultivo que crece exponencialmente a 600 nanómetros (DO600) con el tiempo a 40°C.
Como sabe el experto en la materia, puede variar de especie a especie cuándo el cultivo está en crecimiento exponencial. El experto en la materia sabrá cómo determinar el crecimiento en fase exponencial, por ejemplo, entre DO6000,1 -1,0.
La densidad óptica del cultivo (DO) se mide en un espectrofotómetro.
Conclusión:
Basado en el patrón de crecimiento del mutante con resistencia a 2-desoxiglucosa de este ejemplo 2 -para una cepa de interés específica (por ejemplo, una de un producto comercial relevante)- el experto en la materia puede ensayar rutinariamente si esta cepa de interés específica tiene el patrón de crecimiento relevante del presente documento que es una propiedad de los mutantes seleccionados.
Ejemplo 3: Selección de un mutante que hiperfermenta lactosa y secreta glucosa de Streptococcus thermophilus CHCC16165
Con el fin de aislar un mutante que hiperfermenta lactosa y secreta glucosa de la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC16165, células derivadas del crecimiento de una única colonia se inocularon en 10 ml de caldo M17 que contenía galactosa al 2% y se hicieron crecer durante la noche a 40°C.
Al día siguiente, la cepa se sembró en diluciones en serie en placas de agar M17 que contenían sacarosa al 2% y una concentración de 2-desoxiglucosa de 40 mM y se incubó durante 20 horas a 40°C. Se cogieron 10 colonias aleatorias de la placa y se usaron para inocular caldo M17 reciente que contenía sacarosa al 2% y se incubó durante la noche a 40°C. Los mutantes de CHCC16165 se transfirieron a medio M17 reciente que contenía sacarosa al 2%.
Ejemplo 4. Análisis de hidratos de carbono de leche fermentada. (Ejemplo no según la invención y presentado para fines ilustrativos solo)
Los mutantes obtenidos en el ejemplo 3 y la cepa CHCC16165 se hicieron crecer en leche de grado B al 9,6% que contenía sacarosa al 0,01%. Después de la acidificación, la leche acidificada con CHCC16165 tenía una concentración de lactosa de 14,9, una concentración de galactosa de 8,4 y una concentración de glucosa de 5,7. En comparación la leche acidificada con el mutante con mejor rendimiento de CHCC16165 tenía una concentración de lactosa de 9,3, una concentración de galactosa de 10,5 y una concentración de glucosa de 9,9. Dicho mejor mutante de CHCC16165 se designó CHCC16731 y se sometió a ensayos adicionales en la fermentación de leche cuando se usa en combinación con cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16159 y CHCC16160 (descritas en el documento WO2013/160413).
Cultivos nocturnos de CHCC16165 y CHCC16731 en combinación con cada una de CHCC16159 y CHCC16160 se añadieron a muestras de 200 ml de leche de grado B y se acidificó a 40°C.
Los resultados fueron como se enumera en la tabla 1:
Como se demostrará de los resultados en la tabla 1, CHCC16731 es capaz de eliminar casi toda la lactosa de la leche. Además, CHCC16731 produce y secreta altos niveles tanto de galactosa como de glucosa en la leche. Considerando que la sacarosa es una referencia de 100, y el dulzor de la lactosa es 16, el dulzor de la galactosa es 32 y el dulzor de la glucosa es 74,3, el producto lácteo fermentado con CHCC16731 tiene un dulzor muy aumentado.
Ejemplo 5. Producción de mutante positivo en galactosa de Streptococcus thermophilus CHCC12339. (Ejemplo no según la invención y presentado para fines ilustrativos solo)
Se hizo crecer Streptococcus thermophilus CHCC12339 durante la noche en M17 que contenía lactosa al 2% a 40°C. Un cultivo nocturno se sembró (100 j l ) en una placa de M17 que contenía galactosa al 2% y se incubó a 40°C de forma anaerobia. Aparecen 22 colonias en las placas de M17 que contiene galactosa al 2%. 16 de estas se vuelven a sembrar en estrías en el mismo tipo de placas, y 8 de estas se transfieren a M17 líquido que contiene galactosa al 2%, todas las cuales producen crecimiento, y 4 de estos cultivos se congelan. 2 de los cultivos congelados se extienden en placas de M17 que contienen galactosa al 2% y 2-desoxiglucosa 40 mM, y para cada cultivo 8 de las colonias resultantes se seleccionaron. Los 16 mutantes de 2-desoxiglucosa se transfirieron a M17 líquido que contenía lactosa al 2% y galactosa al 2% y se hicieron crecer durante la noche a 40°C, después de lo cual los mutantes se hicieron crecer en M17 líquido que contenía galactosa al 2% durante 3 noches y la producción de galactosa y glucosa se midió y siguió a lo largo del crecimiento. Basado en la producción de galactosa y glucosa 7 cultivos se seleccionaron para ensayo de acidificación de leche añadiendo 2 ml de cultivo a 200 ml de leche de grado B al 9,5% que contenía sacarosa al 0,05%. 3 mutantes tienen perfiles de acidificación que se parecen al de la cepa madre CHCC12339, y esos 3 mutantes se siembran en estrías para separar colonias y se incuba durante 48horas. Posteriormente, las colonias se transfieren a M17 líquido que contiene galactosa al 2% y el crecimiento para los 3 mutantes se ensaya frente a CHCC12339. El mutante que tiene el mayor crecimiento se selecciona y purifica una vez más por siembra en estrías para separar colonias 3 veces para producir una cepa positiva en galactosa nombrada CHCC18948 (variante positiva en galactosa de CHCC12339).
Ejemplo 6. Producción de un mutante de 2-desoxiglucosa de Streptococcus thermophilus CHCC18948 con excreción aumentada de glucosa. (Ejemplo no según la invención y presentado para fines ilustrativos solo)
100 j l del cultivo CHCC18948 se extienden en placas de M17 que contienen galactosa al 2% y 2-desoxiglucosa 20 mM o 40 mM y se incuba durante la noche a 40°C. Se seleccionan 8 colonias de las placas de 20 mM y 8 colonias de las placas de 40 mM y se hacen crecer en M17 líquido que contiene galactosa al 2% y 2-oxiglucosa 20 mM. Los cultivos resultantes se congelan y se vuelven a sembrar en estrías, y 12 de las colonias resultantes se inician en medio M17 y se usan para acidificar leche de grado B. Se inocula el 1% de un cultivo nocturno del mutante de 2-desoxiglucosa en 200 ml de leche de grado B al 9,5% que contiene sacarosa al 0,05% y se acidifica a 40°C. Todos los 12 mutantes de 2-desoxiglucosa de CHCC18948 produjeron productos lácteos fermentados con bajas concentraciones de lactosa y altas concentraciones de galactosa y glucosa. Se seleccionaron 7 mutantes para volver a ensayar solos y ensayar junto con cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16159 (descritas en el documento WO2013/160413). De nuevo el 1% de un cultivo nocturno del mutante de 2-desoxiglucosa se inocula en 200 ml de leche de grado B al 9,5% que contiene sacarosa al 0,05% y se acidifica a 40°C.
Los resultados se dan en la tabla 2:
Los tres mejores mutantes son los mutantes 2, 3 y 12, y se volvieron a ensayar en leche de grado B que contiene sacarosa al 0,05% solas y en combinación con cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16159, CHCC16160 y CHCC16161 (descritas en el documento WO2013/160413).
Los resultados se dan en la tabla 3:
Basado en los datos anteriores se seleccionó CHCC18948-Mutante 3 como el mejor mutante y se designó CHCC19216. Como se demostrará de los datos anteriores CHCC19216 es capaz de eliminar caso toda la lactosa de la leche. Además, CHCC19216 produce y secreta altos niveles tanto de galactosa como glucosa en la leche. Considerando que la sacarosa es una referencia de 100, y el dulzor de la lactosa es 16, el dulzor de la galactosa es 32 y el dulzor de la glucosa es 74,3, el producto lácteo fermentado producido con CHCC19216 tiene un dulzor muy aumentado.
Ejemplo 7. Propiedad texturizante de CHCC16731 y CHCC19216 (Ejemplo no según la invención y presentado para fines ilustrativos solo)
La propiedad texturizante de las cepas CHCC16731 y CHCC19216 se ensayó por medida de la tensión cortante mediante el uso del siguiente ensayo:
Siete días después de la incubación, la leche fermentada se llevó a 13°C y se agitó suavemente por medio de una varilla equipada con un disco perforado hasta homogeneidad de la muestra. Las propiedades reológicas de la muestra se evaluaron en un reómetro (Anton Paar Physica ASC/DSR301 Rheometer (automuestreo), Anton Paar® GmbH, Austria) usando los siguientes ajustes:
Tiempo de espera (para reconstruir a alguna estructura original)
5 minutos sin oscilación o rotación
Oscilación (para medir G' y G” para cálculo de G*)
Y = 0,3%, frecuencia (f) = [0.5...8] Hz
6 puntos de medida durante 60 s (uno cada 10 s)
Rotación (para medir la tensión cortante a 300 1/s etc.)
Y = [0,2707-300] 1/s y y = [275-0,2707] 1/s
21 puntos de medida durante 210 s (uno cada 10 s) hasta 300 1/s y
21 puntos de medida durante 210 s (uno cada 10 s) hasta 0,2707 1/s
Para análisis adicionales se eligió la tensión cortante a 300 1/s.
Las cepas CHCC16731 y CHCC19216 en las mezclas enumeradas en la tabla 4 se usaron para acidificar muestras de 200 ml de leche de grado B al 9,5% usando un inóculo del 0,024% hasta que el pH alcanzó 4,55.
Los resultados se dan en la tabla 4:
Lb: L. delbruecki spp. Bulgaricus cepa CHCC16159.
St: Streptococcus thermophilus.
Como se demostrará de los resultados, las cepas CHCC16731 y CHCC19216 cuando se usan como único S. thermophilus en la mezcla de cultivo, producen un producto lácteo fermentado con una tensión cortante de 41,3 Pa y 51,5 Pa, respectivamente. Cuando se usan en combinación las cepas CHCC16731 y CHCC19216 producen un producto lácteo fermentado con una tensión cortante de 43,3 Pa.
Este nivel de tensión cortante es alto en comparación con cepas edulcorantes convencionales como se divulga en, por ejemplo, el documento WO2013/160413.
Ejemplo 8. Sabor y crecimiento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) para composición de cultivo de la invención comparado con cultivo con Lb positivo en glucosa, positivo en lactosa
Plan experimental
Tabla 5: Composición de cultivos ensayados
El cultivo de la invención está compuesto de tres Streptococcus thermophilus (St) deficientes en glucosa y un Lb deficiente en lactosa. El cultivo 2 (cultivo comparativo) está compuesto de tres St deficientes en glucosa y un Lb positivo en glucosa, positivo en lactosa (convencional).
Los dos cultivos con la composición indicada en la tabla 5 se prepararon y usaron como cultivo iniciador en una fermentación para producir yogur a 43°C hasta que se alcanzó un pH diana de 4,55. Los dos cultivos se compararon con respecto a sabor, crecimiento de Lb, posacidificación, hidratos de carbono y reología.
Base de leche
La base de leche contenía el 4,5% de proteína, el 1,0% de grasa y el 0,1% de sacarosa.
Se mezclaron leche con el 0,5% de grasa y leche con el 1,5% de grasa con el fin de alcanzar un contenido del 1% de grasa en la base de leche final y se añadió el 0,1% de sacarosa. Los niveles de proteína se ajustaron al 4,5% usando leche desnatada en polvo (SMP). La hidratación tuvo lugar a 6°C durante 2 horas. Después de ello, la leche se homogeneizó a 200/50 baros a 65°C y se pasteurizó a 95°C durante 5 minutos.
Parámetros de producción de yogur
El pH durante la fermentación se midió en línea usando Intap. Cuando los yogures alcanzaron pH 4,55 el gel se rompió usando una varilla con un disco perforado. El gel se trató después en una unidad de postratamiento (PTU) a 2 baros a 25°C, se rellenaron vasos de yogur de 120 ml y se almacenó a 6°C durante 28 días.
Medida de la tensión cortante
Se usó el método descrito en el ejemplo 7 con la excepción de que las muestras no se agitaron con una varilla equipada con un disco perforado, puesto que el gel ya se había roto durante el tratamiento PTU para obtener homogeneidad de las muestras.
Medida de unidades formadoras de colonias
Se usó M17 como medio selectivo para St. Se usó MRSlac (MRS lactosa al 8%) como medio selectivo para Lb. Se hizo una serie de diluciones de 10X de los yogures. Cada dilución se sembró en placas de agar de M17 y MRSlac, respectivamente y se incubó de forma anaerobia a 37°C durante 2 días. Después de ello, se contaron las unidades formadoras de colonias.
Acidificación
Al cultivo 1 le llevó 10,8 horas alcanzar un pH de 4,55. Al cultivo 2 le llevó 12,1 horas alcanzar un pH de 4,55.
Posacidificación
Tabla 6: Posacidificación
Crecimiento de Lb
Tabla 7: Crecimiento de cultivo (unidades formadoras de colonias (UFC)) al final de la fermentación
Como se demostrará de la tabla 7 el recuento de células de Lb del cultivo de la invención era mucho mayor que el recuento de Lb del cultivo comparativo con un Lb convencional, es decir, un Lb positivo en glucosa positivo en lactosa. Por tanto, la combinación de St deficiente en glucosa y Lb deficiente en lactosa produce un mayor nivel de Lb al final de la fermentación.
Reología
El cultivo 1 tiene una tensión cortante al final de la fermentación a 300 1/s de 41,1 Pa.
El cultivo 2 tiene una tensión cortante al final de la fermentación a 300 1/s de 27,31 Pa.
Hidratos de carbono
Tabla 8: Nivel de hidratos de carbono al final de la fermentación
Sabor
El sabor se evaluó mediante evaluación por un panel de cata. El cultivo 1 no tenía ningún sabor extraño.
Ejemplo 9. Sabor y crecimiento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) para composición de cultivo de la invención comparado con cultivo con Lb deficiente en glucosa
Plan experimental
Tabla 9: Composición de los cultivos ensayados
El cultivo de la invención está compuesto de tres St deficientes en glucosa y un Lb deficiente en lactosa. El cultivo 2 (cultivo comparativo) está compuesto de tres St deficientes en glucosa y un Lb deficiente en glucosa, positivo en lactosa.
Los dos cultivos con la composición indicada en la tabla 9 se prepararon y usaron como cultivo iniciador en una fermentación para producir yogur a 43°C hasta que se alcanzó un pH diana de 4,55. Los dos cultivos se compararon con respecto a sabor (nivel de aminoácidos), componentes orgánicos volátiles, hidratos de carbono y reología.
Base de leche
Se usaron dos bases de leche ajustadas con leche desnatada en polvo (SMP) o proteína de suero (WP) y contenían el 4,5% de proteína, el 1,0% de grasa y el 0,1% de sacarosa. Se mezclaron leche con el 0,5% de grasa y leche con el 1,5% de grasa con el fin de alcanzar un contenido del 1% de grasa en la base de leche final y se añadió el 0,1% de sacarosa. Los niveles de proteína se ajustaron al 4,5% usando SMP o WP. La hidratación tuvo lugar a 6°C durante 2 horas. Después de ello, la leche se homogeneizó a 200/50 baros a 65°C y se pasteurizó a 95°C durante 5 minutos. Parámetros de producción de yogur
El pH durante la fermentación se midió en línea en los biberones usando CINAC. Cuando los yogures alcanzaron pH 4,55 el gel se rompió y homogenizó usando una varilla con un disco perforado. Después de ello, el yogur se almacenó en biberones.
Medida de la tensión cortante
Se usó el método descrito en el ejemplo 7.
Reología
El cultivo 1 en base de leche con SMP tiene una tensión cortante al final de la fermentación a 300 1/s de 46,2 Pa. El cultivo 1 en base de leche con WP tiene una tensión cortante al final de la fermentación a 300 1/s de 39,6 Pa. El cultivo 2 en base de leche con SMP tiene una tensión cortante al final de la fermentación a 300 1/s de 42,0 Pa. El cultivo 2 en base de leche con WP tiene una tensión cortante al final de la fermentación a 300 1/s de 38,4 Pa. Como se mostrará de los resultados, el cultivo 1 tiene una mayor tensión cortante en comparación con el cultivo 2. Posacidificación
Tabla 10: Posacidificación
Crecimiento de Lb
Tabla 11: Crecimiento de cultivo (unidades formadoras de colonias (UFC)) al final de la fermentación
Como se demostrará de la tabla 11 el recuento de células de Lb del cultivo de la invención era mucho menor que el recuento de Lb del cultivo comparativo con un Lb deficiente en glucosa, positivo en lactosa.
Hidratos de carbono
Tabla 12: Nivel de hidratos de carbono al final de la fermentación
Aminoácidos
Tabla 13: Nivel de aminoácidos
Las muestras que contenían el Lb negativo en glucosa (cultivos 2) tienen una mayor cantidad de TFFA, que señala hacia mayor actividad proteolítica, que a su vez puede producir sabores desagradables.
Además, los yogures que contienen el Lb negativo en glucosa contienen una mayor cantidad de ácido glutámico que es conocido por dar sabores extraños descritos como 'a caldo'.
La valina, un aminoácido amargo, también está presente en mayores cantidades en los yogures que contienen Lb negativo en glucosa.
Compuestos orgánicos volátiles (VOC)
Un perfil de VOC puede dar indicaciones para el perfil de sabor de una muestra.
Se han medido 51 compuesto orgánicos volátiles diferentes. Para el cultivo 1 en base de leche con WP, la cantidad de compuesto orgánico volátil era menor para 44 de los 51 compuestos (86%) e comparación con el cultivo 2 en base de leche con WP. Para el cultivo 1 en base de leche con WP, la cantidad de compuesto orgánico volátil era menor para 34 de los 51 compuestos (67%) e comparación con el cultivo 2 en base de leche con WP. En conclusión, los cultivos de la invención tenían un contenido significativamente menor de compuestos orgánicos volátiles (vistos como un grupo de compuestos) en comparación con los cultivos comparativos.
Ejemplo 10. Crecimiento y posacidificación de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) para composición de cultivo de la invención
Plan experimental
Tabla 14: Composición del cultivo ensayado
El cultivo con la composición indicada en la tabla 14 se preparó y usó como cultivo iniciador en una fermentación para producir yogur a 43°C hasta que se alcanzó un pH diana de 4,55. El cultivo se inoculó a un nivel del 0,01%, el 0,02% y el 0,03%. El yogur producido se almacenó a 5°C, 13°C y 25°C. El cultivo se ensayó con respecto a crecimiento de St y Lb y posacidificación.
Bases de leche
Tabla 15: Composición de las bases de leche 1 y 2.
Tabla 16: Composición de la base de leche 3.
Posacidificación
Tabla 17: Posacidificación
Como se demostrará de la tabla 17, el nivel de posacidificación es muy bajo para todos los niveles de inoculación y temperaturas de almacenamiento ensayadas, incluyendo las mayores temperaturas de almacenamiento de 13°C y 25°C, donde el nivel de crecimiento de Lb y por tanto la posacidificación es alta para la mayoría de los cultivos iniciadores convencionales.
Crecimiento de Lb y St
Tabla 18: Crecimiento de Lb y St
Como se demostrará de la tabla 18, para todos los niveles de inoculación, el recuento de células de Lb estaba a un alto nivel al final de la fermentación.
Ejemplo 11. Crecimiento, posacidificación y análisis de hidratos de carbono de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) para composiciones de cultivo de la invención comparadas con cultivos iniciadores convencionales.
Plan experimental
Tabla 19: Composición de los cultivos ensayados
Los cultivos con las composiciones indicadas en la tabla 19 se prepararon y usaron como cultivo iniciador en una fermentación para producir yogur a 43°C hasta que se alcanzó un pH diana de 4,55. El cultivo se inoculó a un nivel
del 0,02%. El yogur producido se almacenó a 5°C y 13°C. Los cultivos se ensayaron con respecto a crecimiento de St y Lb, posacidificación y análisis de hidratos de carbono.
YoFlex Premium 1.0 y Yoflex YF-L901 son cultivos comerciales, convencionales que comprenden St y Ln positivos en lactosa y positivos en glucosa.
Base de leche
Tabla 20: Composición de la base de leche 1
Posacidificación
Tabla 21: Posacidificación
Como se demostrará de la tabla 21 los cultivos de la invención tienen un bajo nivel de posacidificación, que está al mismo nivel que los cultivos iniciadores convencionales.
Crecimiento de Lb y St
Tabla 22: Crecimiento de Lb y St
Como se demostrará de la tabla 22, el recuento de células de Lb para los cultivos de la invención estaba a un nivel mayor al final de la fermentación que los cultivos convencionales.
Análisis de hidratos de carbono
Tabla 23: Nivel de hidratos de carbono al final de la fermentación
LOD: Límite de detección
Todas las determinaciones de hidratos de carbono se hicieron en duplicado, y la tabla 23 enumera el valor medio de las dos determinaciones. Las determinaciones se llevaron a cabo después de 7 días de almacenamiento del yogur. Como se demostrará de la tabla 23, los cultivos de la invención produjeron glucosa a un alto nivel, y después de 7 días de almacenamiento la glucosa estaba presente a un nivel de aprox. 8 mg/ml.
Depósitos y soluciones expertas
El solicitante pide que una muestra de los microorganismos depositados indicados a continuación esté disponible solo a un experto, hasta la fecha en la que se conceda la patente.
La cepa de Streptococcus thermophilus CHCC11342 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 8 de septiembre 2009 con el No. de registro DSM 22932.
Claims (10)
- REIVINDICACIONESi. Composición para producir un producto lácteo fermentado que comprende:(i) al menos una cepa de Streptococcus thermophilus (St), en donde la cepa de St fermenta galactosa, en donde la cepa porta una mutación en la secuencia de ADN del gen glcK que codifica una proteína glucoquinasa, en donde la mutación inactiva la proteína glucoquinasa o tiene un efecto negativo en la expresión del gen, en donde la capacidad de fermentar galactosa se determina como se divulga en la descripción y en donde la mutación reduce la actividad de la proteína glucoquinasa con al menos el 50% y en donde la actividad glucoquinasa se determina como se indica en la descripción, y(ii) al menos una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb), en donde la cepa de Lb es deficiente en lactosa y capaz de metabolizar glucosa, en donde la deficiencia en lactosa se determina a través de la capacidad de la cepa de Lb de formar colonias blancas en un medio que contiene lactosa y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galacto-piranósido (X-Gal).
- 2. La composición según la reivindicación 1, en donde la cepa de St es resistente a 2-desoxiglucosa.
- 3. La composición según la reivindicación 1 o 2, en donde la cepa de St porta una mutación que reduce el transporte de glucosa a la célula.
- 4. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la cepa de St aumenta la cantidad de glucosa en leche de grado B al 9,5% a al menos 5 mg/ml cuando se inocula en la leche de grado B al 9,5% a una concentración de 106-107 UFC/ml y se hace crecer a 40°C durante 20 horas.
- 5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la cepa de St aumenta la cantidad de glucosa en leche de grado B al 9,5% con sacarosa al 0,05% a al menos 5 mg/ml cuando se inocula en la leche de grado B al 9,5% con sacarosa al 0,05% a una concentración de 106-107 UFC/ml y se hace crecer a 40°C durante 20 horas.
- 6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la cepa de Lb se selecciona del grupo que consiste en la cepa depositada con la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7b, D-38124 Braunschweig, el 12-06-2014 con el no. de registro DSM 28910, y una cepa mutante funcionalmente equivalente derivada de DSM 28910, en donde menos del 1% de los nucleótidos en el genoma bacteriano se han sustituido con otro nucleótido, o delecionado, comparado con la cepa madre.
- 7. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la cepa de St se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC19216 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el No. de registro DSM 32227, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC16731 que se ha depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 4 de junio 2014 con el No. de registro DSM 28889, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC15757 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el No. de registro DSM 25850, una cepa de Streptococcus thermophilus CHCC15887 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el No. de registro DSM 25851, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC16404 que se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el No. de registro DSM 26722, y una cepa mutante derivada de las mismas, en donde la cepa mutante es un mutante funcionalmente equivalente de las cepas depositadas y en donde menos del 1% de los nucleótidos en el genoma bacteriano se han sustituido con otro nucleótido, o delecionado, comparado con la cepa madre.
- 8. Un método para producir un producto lácteo fermentado que comprende inocular y fermentar un sustrato de leche con la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
- 9. Un producto lácteo fermentado que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
- 10. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un producto lácteo fermentado.
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