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ES2902866T3 - Uso de cepas de streptococcus thermophilus deficientes en glucosa en un proceso para producir productos lácteos fermentados - Google Patents

Uso de cepas de streptococcus thermophilus deficientes en glucosa en un proceso para producir productos lácteos fermentados Download PDF

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ES2902866T3
ES2902866T3 ES17712792T ES17712792T ES2902866T3 ES 2902866 T3 ES2902866 T3 ES 2902866T3 ES 17712792 T ES17712792 T ES 17712792T ES 17712792 T ES17712792 T ES 17712792T ES 2902866 T3 ES2902866 T3 ES 2902866T3
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ES
Spain
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streptococcus thermophilus
lactobacillus
glucose
deposited
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Nanna Christensen
Tina Hoegholm
Pia Frost Jensen
Claus Svane
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Chr Hansen AS
Original Assignee
Chr Hansen AS
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Publication date
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Abstract

El uso de una cepa de Streptococcus thermophilus con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa para mejorar el crecimiento de una cepa de Lactobacillus en un proceso para producir un producto lácteo fermentado, en donde la cepa de Lactobacillus se selecciona del grupo que consiste en Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus paracasei, y en donde en el inicio de la fermentación la proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus es de al menos 50.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de cepas de streptococcus thermophilus deficientes en glucosa en un proceso para producir productos lácteos fermentados
Campo de invención
La presente invención se refiere al uso de cepas de bacterias Streptococcus thermophilus con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa en combinación con una cepa de Lactobacillus seleccionada del grupo que consiste en Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus paracasei en un proceso para producir un producto lácteo fermentado.
Antecedentes de la invención
Streptococcus thermophilus es una de las bacterias del ácido láctico más ampliamente usadas para la fermentación láctea termofílica comercial donde el organismo se usa normalmente como parte de un cultivo iniciador mixto, el otro componente que es un Lactobacillus sp., por ejemplo, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus para yogur o Lactobacillus helveticus para queso de tipo suizo.
El documento EP-A1-2 957 180 en una realización describe un método de producción de un producto lácteo fermentado usando una combinación de un cultivo iniciador deficiente en glucosa y una lactasa convencional con el objetivo de reducir el contenido de lactosa y el nivel de post acidificación en el producto lácteo fermentado.
El documento WO2013/160413 describe una cepa de Streptococcus thermophilus que fermenta la galactosa, en donde la cepa porta una mutación en la secuencia de ADN del gen glcK que codifica una proteína glucoquinasa, en donde la mutación inactiva la proteína glucoquinasa o tiene un efecto negativo sobre la expresión del gen. En una realización específica, la cepa de Streptococcus thermophilus también porta una mutación que reduce el transporte de glucosa dentro de la célula, por ejemplo, una mutación en un gen que codifica un componente de un transportador de glucosa, en donde la mutación inactiva el transportador de glucosa o tiene un efecto negativo sobre la expresión del gen. El documento WO2013/160413 también describe cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficientes en glucosa. Cuando se usa en un proceso para producir un producto lácteo fermentado, las cepas de Streptococcus thermophilus excretan glucosa para proporcionar productos lácteos fermentados con una dulzura natural (interna) sin calorías adicionales, dulzura aumentada y niveles reducidos de lactosa.
Sieuwerts et al., Applied and Environmental Microbiology, agosto de 2008, páginas 4997-5007, describe un estudio de revisión de las interacciones microbianas en la fermentación del yogur y enseña que cuando las especies Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus se cultivan en cultivo compartido, se estimula el crecimiento de ambas especies. Además, Sieuwerts enseña que Streptococcus thermophilus dota a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus con factores estimulantes del crecimiento, tales como ácido fórmico, ácido pirúvico y ácido fólico.
La definición legal de yogur en muchos países requiere Streptococcus thermophilus junto con Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Ambas especies generan cantidades deseables de acetaldehído, que además de la acidez es un componente de sabor importante en el yogur.
En algunos tipos de productos lácteos fermentados que contienen Streptococcus thermophilus junto con una cepa de Lactobacillus, se desea obtener un alto nivel de la cepa de Lactobacillus. También, en algunos países, la definición legal de tales tipos de productos lácteos fermentados requiere que la cepa de Lactobacillus esté presente en el producto en un nivel de por encima de 1,0E06 UFC/ml. Para tales productos lácteos fermentados, es un problema técnico general que el nivel de células de Lactobacillus obtenido a la finalización de la fermentación no es tan alto como se desea. La presente invención se refiere a la producción de un producto lácteo fermentado usando Streptococcus thermophilus junto con una cepa de Lactobacillus, en donde se puede obtener un nivel aumentado de células de Lactobacillus a la finalización de la fermentación.
Compendio de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención está dirigida al uso de una cepa de Streptococcus thermophilus con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa para mejorar el crecimiento de una cepa de Lactobacillus seleccionada del grupo que consiste en Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus paracasei en un proceso para producir un producto lácteo fermentado, en donde en el inicio de la fermentación la proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus es de al menos 50.
La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo experimental de que las cepas de Streptococcus thermophilus con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa son capaces de impulsar el crecimiento de cepas de bacterias del ácido láctico del género Lactobacillus.
De este modo, el uso de la invención ha proporcionado la posibilidad de obtener un nivel aumentado de células de Lactobacillus a la finalización de la fermentación o, alternativamente, usando una mezcla de cultivo iniciador con una cantidad reducida de células de bacterias Lactobacillus.
Además, cuando se usa en un proceso para producir un producto lácteo fermentado las cepas de Streptococcus thermophilus con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa tienen la capacidad de excretar glucosa para dotar a los productos lácteos fermentados con un dulzor natural (interno) sin calorías adicionales, dulzor aumentado y niveles de lactosa disminuidos. De este modo, según la presente invención es posible producir productos lácteos fermentados con una combinación de un nivel aumentado de células de bacterias Lactobacillus y un nivel aumentado de dulzura natural.
La presente invención se refiere además a una composición que comprende una cepa de Streptococcus thermophilus con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa y una cepa de Lactobacillus, en donde la cepa de Lactobacillus se selecciona del grupo que consiste en Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus paracasei, y en donde la proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus es de al menos 50.
Además, la presente invención se refiere a un proceso para producir un producto lácteo fermentado que comprende inocular y fermentar un sustrato lácteo con la composición de la invención.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Como se usa en la presente memoria, el término “bacteria del ácido láctico” designa una bacteria grampositiva, microaerófila o anaeróbica, que fermenta azúcares con la producción de ácidos que incluyen ácido láctico como el ácido predominantemente producido, ácido acético y ácido propiónico. Las bacterias del ácido láctico industrialmente más útiles se encuentran dentro del orden “Lactobacillales” que incluye Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. y Propionibacterium spp. Las bacterias del ácido láctico, incluyendo bacterias de la especie Lactobacillus sp. y Streptococcus thermophilus, normalmente se suministran a la industria láctea o bien como cultivos congelados o liofilizados para la propagación de iniciadores a granel o bien como cultivos denominados “Inoculación Directa a Cuba” (DVS). Los cultivos DVS están destinados a la inoculación directa en un recipiente de fermentación o cuba para la producción de un producto lácteo, tal como un producto lácteo fermentado. En general, se hace referencia a tales cultivos como “cultivos iniciadores” o “iniciadores”.
Los términos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” se han de interpretar como términos abiertos (es decir, que significa “que incluye, pero no se limita a”) a menos que se señale de otro modo.
Una “cepa” bacteriana, como se usa en la presente memoria, se refiere a una bacteria que permanece genéticamente sin cambios cuando se cultiva o se multiplica. Se incluye una multiplicidad de bacterias idénticas. El término “cepas de Streptococcus thermophilus que fermentan la galactosa”, como se usa en la presente memoria, se refiere a cepas de Streptococcus thermophilus que son capaces de crecer en medio M17 2% de galactosa. Las cepas de Streptococcus thermophilus que fermentan la galactosa se definen en la presente memoria como cepas de Streptococcus thermophilus que reducen el pH del caldo M17 que contiene 2% de galactosa como único carbohidrato a 5,5 o menor cuando se inocula a partir de un cultivo nocturno al 1% y se incuba durante 24 horas a 37°C.
El término “la mutación inactiva la proteína glucoquinasa” como se usa en la presente memoria se refiere a una mutación que da como resultado una “proteína glucoquinasa inactivada”, una proteína glucoquinasa que, si está presente en una célula, no es capaz de ejercer su función normal, así como mutaciones que impiden la formación de la proteína glucoquinasa o dan como resultado la degradación de la proteína glucoquinasa. En particular, una proteína glucoquinasa inactivada es una proteína que, en comparación con una proteína glucoquinasa funcional, no es capaz de facilitar la fosforilación de glucosa a glucosa-6-fosfato o facilita la fosforilación de glucosa a glucosasfosfato a una velocidad significativamente reducida. El gen que codifica tal proteína glucoquinasa inactivada en comparación con el gen que codifica una proteína glucoquinasa funcional comprende una mutación en el marco de lectura abierto (ORF) del gen, en donde dicha mutación puede incluir, pero no se limita a, una supresión, una mutación de cambio de marco, la introducción de un codón de terminación o una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácidos, que cambia las propiedades funcionales de la proteína, o una mutación promotora que reduce o anula la transcripción o traducción del gen.
El término “proteína glucoquinasa funcional” como se usa en la presente memoria se refiere a una proteína glucoquinasa que, si está presente en una célula, facilita la fosforilación de glucosa a glucosa-6-fosfato. En particular, se puede codificar una proteína glucoquinasa funcional por un gen que comprende un ORF que tiene una secuencia correspondiente a la posición 1-966 en el ID de SEQ N° 1 o una secuencia que tiene al menos un 85% de identidad, tal como al menos un 90% de identidad, tal como al menos un 95% de identidad, tal como al menos un 98% de identidad, tal como al menos un 99% de identidad, con la secuencia correspondiente a la posición 1 -966 del ID de SEQ N° 1.
El porcentaje de identidad de dos secuencias se puede determinar usando algoritmos matemáticos, tales como el algoritmo de Karlin y Altschul (1990. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87; 2264), el algoritmo modificado descrito en Karlin y Altschul (1993. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90; 5873-5877); el algoritmo de Myers y Miller (1988, CABIOS 4; 11-17); el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970. J. Mol. Biol. 48; 443-453); y algoritmo de Pearson y Lipman (1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448). También está disponible un software informático para la determinación de la identidad de la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos basado en estos algoritmos matemáticos. Por ejemplo, la comparación de secuencias de nucleótidos se puede realizar con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12. La comparación de secuencias de aminoácidos se puede realizar con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3. Para el resto de parámetros de los programas BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto.
Una “bacteria mutante” o una “cepa mutante” como se usa en la presente memoria se refiere a una bacteria mutante natural (espontánea, de origen natural) o una bacteria mutante inducida que comprende una o más mutaciones en su genoma (ADN) que están ausentes en el ADN de tipo salvaje. Una “mutante inducida” es una bacteria donde la mutación fue inducida por un tratamiento humano, tal como tratamiento con mutágenos químicos, radiación UV o gamma, etc. En contraste, un “mutante espontáneo” o “mutante de origen natural” no ha sido mutagenizado por el hombre. Las bacterias mutantes son en la presente memoria, no OGM (organismo no modificado genéticamente), es decir, no modificado por tecnología de ADN recombinante.
“Cepa de tipo salvaje” se refiere a la forma no mutada de una bacteria, como se encuentra en la naturaleza.
Términos tales como “cepas con propiedades edulcorantes”, “cepas que pueden proporcionar una acumulación deseable de glucosa en el producto lácteo fermentado” y “cepas con propiedades mejoradas para el endulzado natural de productos alimenticios” se usan de manera intercambiable en la presente memoria para caracterizar un aspecto ventajoso del uso de las cepas de la presente invención en la fermentación de productos lácteos.
El término “resistente a 2-desoxiglucosa” en la presente memoria en relación con Streptococcus thermophilus se define por el hecho de que una cepa bacteriana mutada particular tiene la capacidad de crecer hasta formar una colonia cuando se raya sobre una placa de medio M17 que contiene 2-desoxiglucosa 20 mM después de la incubación a 40°C durante 20 horas. La presencia de 2-desoxigluxcosa en el medio de cultivo evitará el crecimiento de cepas no mutadas mientras que el crecimiento de las cepas mutadas no se ve afectado o no se ve afectado de manera significativa. Las cepas no mutadas que se pueden usar como cepas de referencia sensibles en la evaluación de la resistencia incluyen preferiblemente las cepas CHCC14994 y CHCC11976.
El término “una mutación que reduce el transporte de glucosa dentro de la célula”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una mutación en un gen que codifica una proteína involucrada en el transporte de glucosa que da como resultado una acumulación de glucosa en el entorno de la célula. El nivel de glucosa en el medio de cultivo de una cepa de Streptococcus thermophilus se puede medir fácilmente mediante métodos conocidos por los expertos.
El término “la mutación inactiva el transportador de glucosa” como se usa en la presente memoria se refiere a una mutación que da como resultado un “transportador de glucosa inactivado”, una proteína transportadora de glucosa que, si está presente en una célula, no es capaz de ejercer su función normal, así como mutaciones que impiden la formación de la proteína transportadora de glucosa o dan como resultado la degradación de la proteína transportadora de glucosa.
El término “proteína transportadora de glucosa funcional” como se usa en la presente memoria se refiere a una proteína transportadora de glucosa que, si está presente en una célula, facilita el transporte de glucosa a través de la membrana de plasma.
En el presente contexto, el término “cepas derivadas de las mismas” se debería entender como cepas derivadas o cepas que se pueden derivar de una cepa (o su cepa madre) de la invención por medio de, por ejemplo, ingeniería genética, radiación y/o tratamiento químico. Las “cepas derivadas de las mismas” también pueden ser mutantes de origen espontáneo. Se prefiere que las “cepas derivadas de las mismas” sean mutantes funcionalmente equivalentes, por ejemplo, mutantes que tienen propiedades sustancialmente iguales o mejoradas (por ejemplo, con respecto a la excreción de glucosa) que su cepa madre. Especialmente, el término “cepas derivadas de las mismas” se refiere a cepas obtenidas sometiendo una cepa de la invención a cualquier tratamiento de mutagenización usado convencionalmente, incluyendo tratamiento con un mutágeno químico tal como etano metanosulfonato (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV, o un mutante de origen espontáneo. Un mutante puede haber sido sometido a varios tratamientos de mutagenización (un único tratamiento se debería entender como un paso de mutagenización seguido de un paso de cribado/selección), pero actualmente se prefiere que se lleven a cabo no más de 20, o no más de 10, o no más de 5, tratamientos (o pasos de cribado/selección). En un mutante actualmente preferido menos del 1%, menos del 0,1%, menos del 0,01%, menos del 0,001% o incluso menos del 0,0001% de los nucleótidos en el genoma bacteriano se han sustituido con otro nucleótido, o suprimido, en comparación con la cepa madre.
El término “resistente a la 2-desoxiglucosa” en relación con una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se define por que una cepa bacteriana particular tiene la capacidad de crecer hasta una colonia después de la incubación a 40°C durante 20 horas cuando se raya en una placa de medio MRS-IM que contiene 2% de lactosa y 2-desoxiglucosa 20 mM. La presencia de 2-desoxiglucosa en el medio de cultivo evitará el crecimiento de cepas no resistentes mientras que el crecimiento de cepas resistentes no se ve afectado o no se ve afectado significativamente. Las cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus no resistentes que pueden usar como cepas de referencia sensibles en la evaluación de la resistencia incluyen las cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC759 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número de acceso DSM 26419 y CHCC10019, que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número de acceso Ds M 19252.
El término “deficiente en glucosa” se usa en el contexto de la presente invención para caracterizar LAB que han perdido o bien parcial o bien completamente la capacidad de usar glucosa como fuente para el crecimiento celular o para mantener la viabilidad celular. Una respectiva deficiencia en el metabolismo de la glucosa, por ejemplo, se puede causar por una mutación en un gen que inhibe o que inactiva la expresión o actividad de la proteína glucoquinasa o la proteína transportadora de glucosa. LAB con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa se puede caracterizar como que aumenta la concentración de glucosa en un medio de cultivo, cuando se cultivan en lactosa como fuente de carbohidratos. El aumento de glucosa se causa por la secreción de glucosa de los LAB deficientes en glucosa. El aumento de la concentración de glucosa en un medio de cultivo se puede determinar mediante análisis de HPLC, por ejemplo, usando una columna Dionex CarboPac PA 203*150 mm (Thermo Fisher Scientific, número de producto 060142).
El término “positiva en glucosa” se usa en el contexto de la presente invención para caracterizar LAB que han mantenido o bien parcial o bien completamente la capacidad de usar la glucosa como fuente para el crecimiento celular o para mantener la viabilidad celular.
El término “género” significa género tal como se define en el siguiente sitio web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi
En conexión con las cepas del género Lactobacillus, el término “UFC” significa unidades formadoras de colonias que se determina por crecimiento (formar una colonia) en una placa de agar MRS incubada en condiciones anaeróbicas a 37 °C durante 3 días. El agar MRS tiene la siguiente composición (g/l):
Proteosa Peptona Bacto N° 3: 10,0
Extracto de Ternera Bacto: 10,0
Extracto de Levadura Bacto: 5,0
Dextrosa: 20,0
Complejo de Monooleato de Sorbitán: 1,0
Citrato de Amonio: 2,0
Acetato de Sodio: 5,0
Sulfato de Magnesio: 0,1
Sulfato de Manganeso: 0,05
Dibasis de Fosfato de Potasio: 2,0
Agar Bacto: 15,0
Agua Milli-Q: 1000 ml.
El pH se ajusta a 5,4 o 6,5: el pH se ajusta a 6,5 para L. rhamnosus, L. casei y L. paracasei. Para todas las demás especies de Lactobacillus, el pH se ajusta a 5,4. En particular, el pH se ajusta a 5,4 para L. delbrueckii subsp. bulgaricus; L. acidophilus y L. helveticus. El pH se ajusta a 6,5 para L. rhamnosus, L. casei y L. paracasei. En conexión con Streptococcus thermophilus, el término “UFC” significa unidades formadoras de colonias que se determinan por crecimiento (formar una colonia) en una placa de agar M17 incubada en condiciones aeróbicas a 37 °C durante 3 días. El agar M17 tiene la siguiente composición (g/l):
Triptona: 2,5 g
Digerido péptico de carne: 2,5 g
Digerido papaico de harina de soja: 5,0 g
Extracto de levadura: 2,5 g
Extracto de carne: 5,0 g
Lactosa: 5,0 g
Glicerofosfato de sodio: 19,0 g
Sulfato de magnesio, 7 H2O: 0,25 g
Ácido ascórbico: 0,5 g
Agar: 15,0 g
Agua Milli-Q: 1000 ml.
El pH se ajusta al pH final 7,1 ± 0,2 (25°C)
La expresión “proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus" significa el recuento de células de la cepa de Streptococcus thermophilus en UFC/g contenida en la composición dividida por el recuento de células de la cepa de Lactobacillus en UFC/g contenida en la composición. Si está presente en la composición más de una cepa de Streptococcus thermophilus, el citado recuento de células es la suma de todas las bacterias Streptococcus thermophilus presentes. Si está presente en la composición más de una cepa de Lactobacillus, el citado recuento de células es la suma de todas las bacterias Lactobacillus presentes. El término “X.YEZZ” significa X.Yx10zz.
Cepa de Streptococcus thermophilus en el uso según la invención
En una realización particular del uso de la invención, la cepa de Streptococcus thermophilus fermenta la galactosa y porta una mutación en la secuencia de ADN del gen glcK que codifica una proteína glucoquinasa, en donde la mutación inactiva la proteína glucoquinasa o tiene un efecto negativo en la expresión del gen. Los métodos para medir el nivel de actividad de la glucoquinasa o el nivel de expresión del gen de la glucoquinasa son fácilmente conocidos (Porter et al. (1982) Biochim. Biophys. Acta, 709; 178-186) e incluyen ensayos enzimáticos con kits disponibles comercialmente y transcriptómica o PCR cuantitativa usando materiales que están fácilmente disponibles.
En realizaciones preferidas, la mutación reduce la actividad (la tasa de fosforilación de glucosa a glucosa-6-fosfato) de la proteína glucoquinasa con al menos un 50%, tal como al menos un 60%, tal como al menos un 70%, tal como al menos un 80%, tal como al menos un 90%.
La actividad de la glucoquinasa se puede determinar mediante los ensayos enzimáticos de glucoquinasa que se describen por Pool et al. (2006. Metabolic Engineering 8; 456-464).
Las cepas que fermentan la galactosa se pueden obtener mediante el método descrito en el documento WO 2011/026863.
En una realización particular del uso de la invención, la cepa de Streptococcus thermophilus porta una mutación que reduce el transporte de glucosa dentro de la célula. En una realización específica, la cepa de Streptococcus thermophilus porta una mutación en un gen que codifica un componente de un transportador de glucosa, en donde la mutación inactiva el transportador de glucosa o tiene un efecto negativo sobre la expresión del gen. En una realización más específica, la cepa de Streptococcus thermophilus porta una mutación en la secuencia de ADN del gen manM que codifica la proteína IICMan del sistema fosfotransferasa de glucosa/manosa, en donde la mutación inactiva la proteína IICMan o tiene un efecto negativo sobre la expresión del gen. También se describe en la presente memoria con propósitos ilustrativos, pero que no forma parte de la invención, una cepa de Streptococcus thermophilus que porta una mutación en la secuencia de ADN del gen manN que codifica la proteína IIDMan del sistema fosfotransferasa de glucosa/manosa, en donde la mutación inactiva la proteína IIDMan o tiene un efecto negativo sobre la expresión del gen.
En realizaciones preferidas, la mutación reduce el transporte de glucosa dentro de la célula con al menos un 50%, tal como al menos un 60%, tal como al menos un 70%, tal como al menos un 80%, tal como al menos un 90%. El transporte de glucosa dentro de la célula se puede determinar mediante el ensayo de absorción de glucosa que se describe por Cochu et al. (2003. Appl Environ Microbiol 69 (9); 5423 - 5432).
Preferiblemente, la cepa de Streptococcus thermophilus porta una mutación en un gen que codifica un componente de un transportador de glucosa, en donde la mutación inactiva la proteína transportadora de glucosa o tiene un efecto negativo sobre la expresión del gen.
El componente puede ser cualquier componente de una proteína transportadora de glucosa que sea crítico para el transporte de glucosa. Por ejemplo, se contempla que la inactivación de cualquier componente del sistema fosfotransferasa de glucosa/manosa en Streptococcus thermophilus dará como resultado la inactivación de la función transportadora de glucosa.
En particular, una proteína transportadora de glucosa inactivada es una proteína que en comparación con una proteína transportadora de glucosa funcional, no es capaz de facilitar el transporte de glucosa a través de la membrana de plasma ni facilita el transporte de glucosa a través de la membrana de plasma a una tasa significativamente reducida. El gen que codifica tal proteína transportadora de glucosa inactivada en comparación con el gen que codifica una proteína transportadora de glucosa funcional comprende una mutación en el marco de lectura abierto (ORF) del gen, en donde dicha mutación puede incluir, pero no se limita a, una supresión, una mutación por desplazamiento del marco, la introducción de un codón de terminación o una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácidos, que cambia las propiedades funcionales de la proteína, o una mutación promotora que reduce o anula la transcripción o traducción del gen.
En realizaciones preferidas, la mutación reduce la actividad (la tasa de transporte de glucosa) de la proteína transportadora de glucosa en al menos un 50%, tal como al menos un 60%, tal como al menos un 70%, tal como al menos un 80%, tal como al menos el 90%.
La actividad del transportador de glucosa se puede determinar mediante el ensayo de absorción de glucosa que se describe por Cochu et al. (2003. Appl Environ Microbiol 69 (9); 5423-5432).
En una realización particular del uso de la invención, la cepa de Streptococcus thermophilus aumenta la cantidad de glucosa en la leche B al 9,5% hasta al menos 5 mg/ml cuando se inocula en la leche B al 9,5% a una concentración de 1,0E06-1,0E07 UFC/ml y se cultiva a 40°C durante 20 horas.
En una realización particular del uso de la invención, la cepa de Streptococcus thermophilus aumenta la cantidad de glucosa en la leche B al 9,5% con una glucosa al 0,05% hasta al menos 5 mg/ml cuando se inocula en la leche B al 9,5% con glucosa al 0,05% en una concentración de 1,0E06-1,0E07 UFC/ml y se cultiva a 40°C durante 20 horas. En el presente contexto, la leche B al 9,5% es leche tratada térmicamente elaborada con leche desnatada en polvo baja en grasa reconstituida hasta un nivel de materia seca del 9,5% y pasteurizada a 99°C durante 30 minutos seguido de enfriamiento a 40°C.
En realizaciones más preferidas de la invención, la cepa mutante conduce a un aumento en la cantidad de glucosa a al menos 6 mg/ml, tal como al menos 7 mg/ml, tal como al menos 8 mg/ml, tal como al menos 9 mg/ml, tal como al menos 10 mg/ml, tal como al menos 11 mg/ml, tal como al menos 12 mg/ml, tal como al menos 13 mg/ml, tal como al menos 14 mg/ml, tal como al menos 15 mg/ml, tal como al menos 20 mg/ml, tal como al menos 25 mg/ml.
En una realización particular del uso de la invención, la cepa de Streptococcus thermophilus se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC15757 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 25850, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC15887 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 25851, la Streptococcus thermophilus CHCC16404 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 26722, la Streptococcus thermophilus CHCC16731 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 28889, la Streptococcus thermophilus CHCC19216 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 32227 y una cepa mutante derivada de las mismas, en donde la cepa mutante se obtiene usando una de las cepas depositadas como material de partida, y en donde la mutante ha retenido o mejorado además la propiedad de fermentación de la lactosa y/o la propiedad de secreción de la glucosa de dicha cepa depositada.
En una realización muy preferida de la presente invención, la cepa mutante es una mutante de origen natural o mutante inducida.
En otra realización de la invención, la cepa mutante de Streptococcus thermophilus es resistente a 2-desoxiglucosa. Cepa de Lactobacillus en el uso según la invención
La cepa de bacterias Lactobacillus en el uso de la invención se selecciona del grupo que consiste en Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus paracasei.
En una realización particular, la cepa de bacterias Lactobacillus en el uso de la invención es Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus es una bacteria del ácido láctico que se emplea con frecuencia para fermentación comercial de la leche donde el organismo se usa normalmente como parte de un cultivo iniciador mixto.
En una realización de la invención, la cepa de bacterias Lactobacillus es deficiente en glucosa. En una realización alternativa de la invención, la cepa de bacterias Lactobacillus de la invención es positiva en glucosa.
En particular, la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus es una cepa que es resistente a la 2-desoxiglucosa. En una realización particular de la invención, la cepa de Lactobacillus es Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, en donde la cepa es resistente a 2-desoxiglucosa y en donde la cepa aumenta la cantidad de glucosa en la leche B al 9,5% en al menos 5 mg/ml cuando se inocula dentro de la leche B al 9,5% en una concentración de 1,0E06-1,0E07 UFC/ml y se cultiva a 40°C durante al menos 20 horas.
En una realización particular de la invención, la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16159 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número de acceso DSM26420, la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16160 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número de acceso DSM26421 y una cepa mutante derivada de las mismas, en donde la cepa mutante se obtiene usando una de las cepas depositadas como material de partida, y en donde la mutante ha retenido o mejorado aún más la propiedad de fermentación de la lactosa y/o la propiedad de secreción de la glucosa de dicha cepa depositada. .
En otra realización particular de la invención, la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC4351 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número de acceso DSM22586 y una cepa mutante derivada de la misma, en donde la cepa mutante se obtiene usando una de las cepas depositadas como material de partida.
En una realización particular de la invención, la cepa de Lactobacillus paracasei se selecciona del grupo que consiste en la cepa CHCC2115 que se depositó en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de acceso DSM 19465, y una cepa mutante derivada de la misma, en donde la cepa mutante se obtiene usando una de las cepas depositadas como material de partida.
También se describe en la presente memoria con propósitos ilustrativos, pero que no forma parte de la invención, la cepa de Lactobacillus acidophilus seleccionada del grupo que consiste en la cepa CHCC2169 que se ha depositado como DSM13241 en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, y una cepa mutante derivada de la misma, en donde la cepa mutante se obtiene usando una de las cepas depositadas como material de partida.
Productos lácteos fermentados producidos en el uso según la invención
El término “leche” se ha de entender como la secreción láctea que se obtiene ordeñando cualquier mamífero, tal como una vaca, una oveja, una cabra, un búfalo o un camello. En una realización preferida, la leche es leche de vaca.
El término “sustrato lácteo” puede ser cualquier material lácteo crudo y/o procesado que se pueda someter a fermentación según el método de la invención. De este modo, los sustratos lácteos útiles incluyen, pero no se limitan a, soluciones/suspensiones de cualquier leche o productos similares a la leche que comprendan proteínas, tales como leche entera o con bajo contenido en grasa, leche desnatada, suero de mantequilla, leche en polvo reconstituida, leche condensada, leche en polvo, suero de leche, permeado de suero de leche, lactosa, líquido madre de cristalización de lactosa, concentrado de proteína de suero o crema. Obviamente, el sustrato lácteo puede provenir de cualquier mamífero, por ejemplo, siendo leche de mamífero sustancialmente pura o leche en polvo reconstituida.
Preferiblemente, al menos parte de la proteína en el sustrato lácteo son proteínas de origen natural en la leche, tales como caseína o proteína de suero. No obstante, parte de la proteína puede ser proteínas que no son de origen natural en la leche.
Antes de la fermentación, el sustrato lácteo se puede homogeneizar y pasteurizar según métodos conocidos en la técnica.
“Homogeneizar”, como se usa en la presente memoria, significa mezclar intensivamente para obtener una suspensión o emulsión soluble. Si la homogeneización se realiza antes de la fermentación, se puede realizar para descomponer la grasa de la leche en tamaños más pequeños para que ya no se separe de la leche. Esto se puede lograr forzando la leche a alta presión a través de pequeños orificios.
“Pasteurizar”, como se usa en la presente memoria, significa el tratamiento del sustrato lácteo para reducir o eliminar la presencia de organismos vivos, tales como microorganismos. Preferiblemente, la pasteurización se logra manteniendo una temperatura especificada durante un período de tiempo especificado. La temperatura especificada normalmente se alcanza mediante calentamiento. La temperatura y la duración se pueden seleccionar con el fin de matar o inactivar ciertas bacterias, tales como las bacterias dañinas. Puede seguirse un paso de enfriamiento rápido. “Fermentación” en los métodos de la presente invención significa la conversión de carbohidratos en alcoholes o ácidos a través del metabolismo de un microorganismo.
Preferiblemente, la fermentación en los métodos de la invención comprende la conversión de lactosa en ácido láctico.
Los procesos de fermentación a ser usados en la producción de productos lácteos fermentados son bien conocidos y los expertos en la técnica sabrán cómo seleccionar las condiciones de proceso adecuadas, tales como temperatura, oxígeno, cantidad y características de microorganismos y tiempo de proceso. Obviamente, las condiciones de fermentación se seleccionan para soportar el logro de la presente invención, es decir, para obtener un producto lácteo en forma sólida o líquida (producto lácteo fermentado).
El término “producto lácteo fermentado”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un alimento o producto alimenticio en donde la preparación del alimento o producto alimenticio implica la fermentación de un sustrato lácteo con bacterias de ácido láctico. “Producto lácteo fermentado”, como se usa en la presente memoria, incluye, pero no se limita a, productos tales como yogur y queso.
Ejemplos de quesos que se preparan por fermentación con Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus incluyen Mozzarella y queso de pizza (H0ier et al. (2010) en The Technology of Cheesemaking, 2a Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192).
Preferiblemente, el producto lácteo fermentado es un yogur.
En el presente contexto, un cultivo iniciador de yogur es un cultivo bacteriano que comprende al menos una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y al menos una cepa de Streptococcus thermophilus. De acuerdo con el presente, el término “yogur” se refiere a un producto lácteo fermentado que se puede obtener inoculando y fermentando leche con una composición que comprende una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y una cepa de Streptococcus thermophilus.
Uso según la invención
En el uso según la invención de una cepa de Streptococcus thermophilus con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa para mejorar el crecimiento de una cepa de Lactobacillus en un proceso para producir un producto lácteo fermentado, la proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a uFc/g de la cepa de Lactobacillus se selecciona que sea de al menos 50 al comienzo de la fermentación.
En particular, la proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus es preferible de 5o a 400, más preferiblemente de 80 a 300 y lo más preferiblemente de 100 a 200.
En una segunda realización del uso de una cepa de Streptococcus thermophilus con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa para mejorar el crecimiento de una cepa de Lactobacillus en un proceso para producir un producto lácteo fermentado, la proporción de la cepa de Streptococcus thermophilus a la cepa de Lactobacillus se selecciona que esté en un nivel reducido y, por lo tanto, se obtiene un nivel convencional de la cepa de Lactobacillus en el producto lácteo fermentado. En particular, al inicio de la fermentación la proporción de UFc/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus es al menos 50, preferiblemente al menos 80, más preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 150, más preferiblemente al menos 200, más preferiblemente al menos 250, más preferiblemente al menos 300, más preferiblemente al menos 350, más preferiblemente al menos 400, más preferiblemente al menos 450, más preferiblemente al menos 500, más preferiblemente al menos 550, más preferiblemente al menos 600, más preferiblemente al menos 650, más preferiblemente al menos 700, más preferiblemente al menos 750, más preferiblemente al menos 800, más preferiblemente al menos 850, más preferiblemente al menos 900 y lo más preferiblemente al menos 950. En este caso, la proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus está por debajo de 2000, más preferiblemente por debajo de 1800, más preferiblemente por debajo de 1600, más preferiblemente por debajo de 1400, más preferiblemente por debajo de 1200 y lo más preferiblemente por debajo de 1000.
En una realización particular del uso de la invención, la cepa de Streptococcus thermophilus aumenta la cantidad de la cepa de Lactobacillus a al menos 5,0E06 UFC/g en el producto lácteo fermentado al final de la fermentación cuando se inocula dentro de un sustrato lácteo en una concentración de 1,0E07-1,0E08 UFC/g en el sustrato lácteo y se cultiva a 43°C hasta que el pH alcance 4,55, en donde el sustrato lácteo es una mezcla de leche fresca desnatada con un contenido de grasa del 0,1%, leche fresca semidesnatada con un contenido de materia grasa del 1,5% y leche desnatada en polvo, y en donde el sustrato lácteo contiene 4,7% de proteína y 1,0% de grasa, y 0,05% de sacarosa.
Composición de la invención
La presente invención se refiere además a una composición que comprende una cepa de Streptococcus thermophilus con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa y una cepa de Lactobacillus, en donde la cepa de Lactobacillus se selecciona del grupo que consiste en Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus paracasei, y en donde la proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus es de al menos 50.
La composición de la invención se basa en el sorprendente hallazgo experimental de que las cepas de Streptococcus thermophilus con deficiencia en el metabolismo de la glucosa son capaces de impulsar el crecimiento de cepas de bacterias de ácido láctico del género Lactobacillus, y que, por lo tanto, es posible llevar a cabo fermentaciones de leche con una mezcla de cultivos iniciadores que tengan un nivel reducido de la cepa de Lactobacillus en relación con la cepa de Streptococcus thermophilus y todavía obtener un nivel aceptable de la cepa de Lactobacillus a la finalización de la fermentación.
En una realización particular de la composición de la invención, la proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus es al menos 80, preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 150, más preferiblemente al menos 200, más preferiblemente al menos 250, más preferiblemente al menos 300, más preferiblemente al menos 350, más preferiblemente al menos 400, más preferiblemente al menos 450, más preferiblemente al menos 500, más preferiblemente al menos 550, más preferiblemente al menos 600, más preferiblemente al menos 650, más preferiblemente al menos 700, más preferiblemente al menos 750, más preferiblemente al menos 800, más preferiblemente al menos 850, más preferiblemente al menos 900 y lo más preferiblemente al menos 950.
En una realización particular de la composición de la invención, la proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus está por debajo de 2000, más preferiblemente por debajo de 1800, más preferiblemente por debajo de 1600, más preferiblemente por debajo de 1400, más preferiblemente por debajo de 1200 y lo más preferiblemente por debajo de 1000.
En una realización particular, la composición de la invención comprende de 1,0E04 a 1,0E12 UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus, tal como de 1,0E05 a 1,0E11 UFC/g, tal como de 1,0E06 a 1,0E10 UFC/g, o tal como de 1,0E07 a 1,0E09 UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus.
En particular, la cepa de Streptococcus thermophilus de la composición de la invención es una cepa de Streptococcus thermophilus como se ha descrito anteriormente en relación con el uso de la invención. En particular, la cepa de Lactobacillus de la composición de la invención es una cepa de Lactobacillus como se ha descrito anteriormente en relación con el uso de la invención.
En una composición preferida de la presente invención, la cepa de Streptococcus thermophilus se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC15757 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 25850, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC15887 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 25851, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC16404 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 26722, la Streptococcus thermophilus CHCC16731 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 28889, la Streptococcus thermophilus CHCC19216 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 32227 y una cepa mutante derivada de las mismas, en donde la cepa mutante se obtiene usando una de las cepas depositadas como material de partida, y en donde la mutante ha retenido o mejorado aún más la propiedad de fermentación de la lactosa y/o la propiedad de secreción de la glucosa de dicha cepa depositada.
En una realización de la invención, la cepa de bacterias Lactobacillus es deficiente en glucosa. En una realización alternativa de la invención, la cepa de bacterias Lactobacillus es positiva en glucosa.
En una composición preferida de la presente invención, la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16159 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 26420, la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16160 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 26421, y una cepa mutante derivada de las mismas, en donde la cepa mutante se obtiene usando una de las cepas depositadas como material de partida, y en donde la mutante ha retenido o mejorado aún más la propiedad de fermentación de la lactosa y/o la propiedad de secreción de la glucosa de dicha cepa depositada.
En otra realización particular de la composición de la invención, la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC4351 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número de acceso DSM22586 y una cepa mutante derivada de la misma, en donde la cepa mutante se obtiene usando una de las cepas depositadas como material de partida, y en donde la mutante ha retenido o mejorado aún más la propiedad de fermentación de la glucosa de dicha cepa depositada.
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus y otras bacterias del ácido láctico se usan comúnmente como cultivos iniciadores sirviendo a un propósito tecnológico en la producción de diversos alimentos, tal como en la industria láctea, tales como productos lácteos fermentados. De este modo, en otra realización preferida, la composición es adecuada como cultivo iniciador.
Los cultivos iniciadores se pueden proporcionar como cultivos iniciadores congelados o secos además de cultivos iniciadores líquidos. De este modo, en otra realización preferida más, la composición está en forma congelada, liofilizada o líquida.
Como se describe en el documento WO2005/003327, es beneficioso añadir ciertos agentes crioprotectores a un cultivo iniciador. De este modo, una composición de cultivo iniciador según la presente invención puede comprender uno o más agentes crioprotectores seleccionados del grupo que consiste en inosina-5'-monofosfato (IMP), adenosina-5'-monofosfato (AMP), guanosina-5'-monofosfato (GMP), uranosina-5'-monofosfato (UMP), citidina-5'-monofosfato (CMP), adenina, guanina, uracilo, citosina, adenosina, guanosina, uridina, citidina, hipoxantina, xantina, hipoxantina, orotidina, timidina, inosina y un derivado de cualquiera de tales compuestos.
Proceso para producir un producto lácteo fermentado
La presente invención se refiere además a un proceso para producir un producto lácteo fermentado que comprende inocular y fermentar un sustrato lácteo con la composición de la invención.
Las realizaciones de la presente invención se describen a continuación.
Ejemplos
Materiales y métodos
Medio agar para recuento de células de cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
La UFC se determinó por crecimiento (formar una colonia) en una placa de agar MRS incubada en condiciones anaeróbicas a 37 °C durante 3 días. El agar MRS tiene la siguiente composición (g/l):
Proteosa Peptona Bacto N° 3: 10,0
Extracto de Ternera Bacto: 10,0
Extracto de Levadura Bacto: 5,0
Dextrosa: 20,0
Complejo de Monooleato de Sorbitán: 1,0
Citrato de Amonio: 2,0
Acetato de Sodio: 5,0
Sulfato de Magnesio: 0,1
Sulfato de Manganeso: 0,05
Dibasis de Fosfato de Potasio: 2,0
Agar Bacto: 15,0
Agua Milli-Q: 1000 ml.
El pH se ajusta a 5,4.
Medio agar para recuento de células de cepas de Streptococcus thermophilus
Para Streptococcus thermophilus, el medio usado es el medio M17 conocido por los expertos en la técnica. Las bacterias se cultivaron en condiciones aeróbicas a 37 °C durante 3 días.
El medio agar M17 tiene la siguiente composición (g/l):
Triptona: 2,5 g
Digerido péptico de carne: 2,5 g
Digerido papaico de harina de soja: 5,0 g
Extracto de levadura: 2,5 g
Extracto de carne: 5,0 g
Lactosa: 5,0 g
Glicerofosfato de sodio: 19,0 g
Sulfato de magnesio, 7 H2O: 0,25 g
Ácido ascórbico: 0,5 g
Agar: 15,0 g
Agua Milli-Q: 1000 ml.
El pH se ajusta al pH final 7,1 ± 0,2 (25°C)
Ejemplo 1: Efecto de cepas de Streptococcus thermophilus deficiente en glucosa sobre el crecimiento de cepas de Lactobacillus en la fermentación de la leche.
Un total de 4 mezclas de cepas de bacterias diferentes, cada una compuesta por una serie de cepas de Streptococcus thermophilus y cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se probaron en el proceso de producción de yogur a partir de un sustrato lácteo con el fin de determinar el efecto de las cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa sobre el crecimiento de cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Dos mezclas según el uso de la invención estaban compuestas por una mezcla de cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa en combinación o bien con una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente en glucosa o bien una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus positiva en glucosa. Para su comparación, 2 mezclas estaban compuestas por una mezcla de cepas de Streptococcus thermophilus positivas en glucosa en combinación o bien con una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente en glucosa o bien una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus positiva en glucosa. Los componentes y la composición de las 4 mezclas surgen a partir de la Tabla 1.
Tabla 1: Composición y crecimiento de mezclas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus positiva en glucosa o deficiente en glucosa (las Mezclas 1 y 2 son según la presente invención, mientras que las Mezclas 3 y 4 no son según la presente invención).
Figure imgf000012_0001
Glu(-): Deficiente en glucosa
Glu(+): Positiva en glucosa
St: Streptococcus thermophilus
Lb: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
El nivel de inoculación de cultivo total fue de 0,018% en peso (g/ml). El sustrato lácteo usado fue una mezcla de leche fresca desnatada (0,1% de grasa), leche fresca semidesnatada (1,5% de grasa), leche desnatada en polvo de Lactalis y ProMilk 802 de Ingredia (Aislado de proteína soluble en leche). El sustrato lácteo final contenía 4,7% de proteína y 1,0% de grasa y 0,05% de sacarosa. La fermentación de la leche se llevó a cabo en recipientes de 200 ml a una temperatura de 43 °C hasta que se alcanzó un pH final de 4,55.
La Tabla 1 también enumera para cada una de las Mezclas 1-4 la proporción de la suma de los recuentos de células de Streptococcus thermophilus al recuento de células de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus al inicio de la fermentación, así como el recuento de células (UFC/g) para Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus al final de la fermentación. Los resultados enumerados en la Tabla 1 son un promedio de una determinación repetida.
Las dos fermentaciones que usaron cepas de Streptococcus thermophilus positivas en glucosa dieron como resultado recuentos de células de 1,20E06 y 1,57E06 para L. delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente en glucosa y positiva en glucosa, respectivamente. El uso de cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa aumentó el nivel a 5,69E07 y 6,75E08 para L. delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente en glucosa y L. delbrueckii subsp. bulgaricus positiva en glucosa, respectivamente. De este modo, el uso de cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa tuvo un efecto de impulso significativo sobre el crecimiento de L. delbrueckii subsp. bulgaricus tanto deficiente en glucosa como positiva en glucosa.
Ejemplo 2: Efecto de cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa sobre el crecimiento de cepas de Lactobacillus en la fermentación de la leche usando niveles iniciales bajos de células de Lactobacillus.
Las mezclas de cepas de bacterias en diferentes proporciones de una mezcla de cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa a una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus positiva en glucosa se probaron en un proceso de producción de yogur a partir de un sustrato lácteo para determinar el efecto de las cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa sobre el crecimiento de cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. La composición de dichas mezclas y las citadas proporciones diferentes surgen a partir de la Tabla 2.
El sustrato lácteo usado fue una mezcla de leche fresca desnatada (0,1% de grasa), leche fresca semidesnatada (1,5% de grasa), leche desnatada en polvo de Lactalis y ProMilk 802 de Ingredia (Aislado de proteína soluble en leche). El sustrato lácteo final contenía 4,7% de proteína y 1,0% de grasa, y 0,05% de sacarosa. La fermentación de la leche se llevó a cabo en recipientes de 200 ml a una temperatura de 43 °C hasta que se alcanzó un pH final de 4,55.
Tabla 2: Crecimiento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en presencia de Streptococcus thermophilus deficiente en glucosa en diferentes proporciones
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Glu(-): Deficiente en glucosa
Glu(+): Positiva en glucosa
St: Streptococcus thermophilus
Lb: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Se llevaron a cabo dos pruebas A y B para obtener una determinación doble e independiente. En cada prueba A y B, se llevaron a cabo determinaciones repetidas para cada mezcla, y se determinó el recuento de células (UFC/g) al final de la fermentación. Los resultados surgirán a partir de la Tabla 2. Como surgirá a partir de los resultados, el recuento de células para Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus al final de la fermentación estuvo en un nivel muy alto, es decir, entre 6,7E07 y 2,1E08, para todas las mezclas. Además, la reducción del nivel de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en relación con la suma de las cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa en las mezclas usadas para la inoculación tuvo muy poco efecto en el recuento de células de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus al final de la fermentación para la mayoría de las mezclas. De este modo, para las proporciones de Streptococcus thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus de 119,32 a 373,20, el recuento de células Lb después de la fermentación estuvo en el mismo nivel alto de entre 1,4E08 y 2,1E08. Para proporciones de St a Lb de 500,14 a 1515.66, el recuento de células Lb después de la fermentación estuvo en un nivel ligeramente más bajo de entre 6,7E07 y 1,6E08, que es un nivel sorprendentemente alto considerando el nivel extremadamente bajo de Lb en la mezcla de inoculación. Además, el citado nivel de recuento de células Lb obtenido después de la fermentación de entre 6,7E07 y 1,6E08 es significativamente más alto que el nivel obtenido con cepas positivas en glucosa, véase el Ejemplo comparativo 3.
De este modo, el presente experimento ha demostrado que las cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa aumentan el crecimiento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en un alto grado e independientemente del nivel inicial de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
Ejemplo comparativo 3: Efecto de cepas de Streptococcus thermophilus positivas en glucosa sobre el crecimiento de cepas de Lactobacillus en la fermentación de leche usando recuentos bajos de células de Lactobacillus.
Con el propósito de comparación con los resultados del Ejemplo 2, mezclas de cepas de bacterias en proporciones diferentes de una mezcla de cepas de Streptococcus thermophilus positivas en glucosa a una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus positiva en glucosa se probaron en un proceso de producción de yogur a partir de un sustrato lácteo con el fin de determinar el efecto de las cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa en el crecimiento de cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. La composición de dichas mezclas y las citadas proporciones diferentes surgen a partir de la Tabla 3.
Las fermentaciones se llevaron a cabo usando el mismo proceso y condiciones que se especifican en el Ejemplo 2. Tabla 3 Crecimiento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en presencia de Streptococcus thermophilus positiva en glucosa en diferentes proporciones
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000015_0001
Glu(-): Deficiente en glucosa
Glu(+): Positiva en glucosa
St: Streptococcus thermophilus
Lb: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Se llevaron a cabo dos pruebas A y B para obtener una determinación doble e independiente. En cada prueba A y B, se llevaron a cabo determinaciones repetidas para cada mezcla, y se determinó el recuento de células (UFC/g) al final de la fermentación. Los resultados surgirán a partir de la Tabla 3. Como surgirá a partir de los resultados, el recuento de células para Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus al final de la fermentación tuvo un nivel moderado de entre 2,1E06 y 1,6E07. Además, los niveles bajos de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en relación con la suma de las cepas de Streptococcus thermophilus positivas en glucosa en las mezclas usadas para la inoculación aparentemente causa una reducción significativamente más fuerte en el recuento de células para Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus obtenido al final de la fermentación que en el caso de las cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa, véase el Ejemplo 2. De este modo, los resultados de los presentes experimentos confirman que las cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa aumentan el crecimiento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus significativamente en comparación con las cepas de Streptococcus thermophilus positivas en glucosa.
Ejemplo 4: Efecto de las cepas de Streptococcus thermophilus deficientes en glucosa en el crecimiento de cepas de Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus paracasei en la fermentación de la leche.
Composición de cultivos de inoculación
Tabla 4: Composición de mezclas de cultivos de referencia (no según la presente invención).
Figure imgf000016_0001
La: Lactobacillus acidophilus, LA-5, CHCC2169.
Lc: Lactobacillus paracasei, LC-01, CHCC2115.
Glu(+): Positiva en glucosa
St: Streptococcus thermophilus
Lb: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Mezcla de St 1 contiene dos cepas de St positivas en glucosa.
Mezcla de St 2 contiene tres cepas de St positivas en glucosa.
Tabla 5: Composición de mezclas de cultivos según la presente invención
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000017_0001
La: Lactobacillus acidophilus, LA-5, CHCC2169.
Lc: Lactobacillus paracasei, LC-01, CHCC2115.
Glu(-): Deficiente en glucosa
St: Streptococcus thermophilus
Lb: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Mezcla de St 3 contiene tres cepas de St deficientes en glucosa.
Se añadió un 0,05% de sacarosa a todas las fermentaciones usando St deficiente en glucosa.
Análisis
1. Curvas de acidificación durante la fermentación (no mostradas)
2. Recuento de células al final de la fermentación
3. Día 1: pH y recuento celular. Almacenamiento a 6 °C
4. Día 14: pH y recuento celular. Almacenamiento a 6 °C
5. Día 28: pH y recuento celular. Almacenamiento a 6 °C
6. Día 42: pH y recuento celular. Almacenamiento a 6 °C
Las curvas de acidificación se midieron mediante un sistema Cinac (de Alliance Instruments, una marca de la empresa AMS).
Todas las fermentaciones se llevaron a cabo en dos repeticiones.
Las fermentaciones se llevaron a cabo en leche B al 9,5% (sustrato lácteo).
Los recuentos de células se llevaron a cabo mediante placa en placas de Petri usando medio de agar estandarizado adaptado para el crecimiento de la cepa de Lactobacillus acidophilus y la cepa de Lactobacillus paracasei. Se usó el método descrito anteriormente en Métodos y materiales para las cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
Resultados post-acidificación
Tabla 6: pH para mezclas de cultivos de referencia
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000018_0001
Tabla 7: pH de mezclas de cultivos según la presente invención
Figure imgf000018_0002
Resultados de recuentos de células
Tabla 8: Recuento de células para mezclas de cultivos de referencia
Figure imgf000018_0003
Figure imgf000019_0001
ND: Sin datos
Tabla 9: Recuento de células para mezclas de cultivos según la presente invención.
Figure imgf000019_0002
ND: Sin datos
Discusión de resultados
La mezcla de cultivo 1 de la invención se compara con las referencias 1 y 3.
La mezcla de cultivo 2 de la invención se compara con las referencias 2 y 4.
La mezcla de cultivo 3 de la invención se compara con las referencias 5 y 7.
La mezcla de cultivo 4 de la invención se compara con las referencias 6 y 8.
Como surgirá a partir de las Tablas 8 y 9, la mezcla de Streptococcus thermophilus deficiente en glucosa (mezcla de St 3 de las Tablas 8 y 9) mejoró el recuento de células (ver Día 3) tanto de la cepa de Lactobacillus acidophilus como de la cepa de Lactobacillus paracasei (ver Día 1). El recuento de células se mejora tanto para un nivel bajo como uno alto de la cepa de Lactobacillus acidophilus o la cepa de Lactobacillus paracasei en la mezcla de cultivo inoculada en el sustrato lácteo. La mejora en el recuento de células tuvo un orden de magnitud de órdenes logarítmicos de alrededor de medio a alrededor de uno y medio.
Depósitos y soluciones de expertos
La cepa de Streptococcus thermophilus CHCC19216 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 8 de diciembre de 2015 con el número de acceso DSM 32227.
La cepa de Streptococcus thermophilus CHCC16731 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 4 de junio de 2014 con el número de acceso DSM 28889.
La cepa de Streptococcus thermophilus CHCC15757 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 3 de abril de 2012 con el número de acceso DSM 25850
La cepa de Streptococcus thermophilus CHCC15887 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 3 de abril de 2012 con el número de acceso DSM 25851
La cepa de Streptococcus thermophilus CHCC16404 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 12 de diciembre de 2012 con el número de acceso DSM 26722.
La cepa de Streptococcus thermophilus CHCC14994 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 3 de abril de 2012 con el número de acceso DSM 25838.
La cepa de Streptococcus thermophilus CHCC11976 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 8 de septiembre de 2009 con el número de acceso DSM 22934.
La cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC759 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 6 de septiembre de 2012 con el número de acceso DSM 26419.
La cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC10019 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 3 de abril de 2007 con el número de acceso DSM 19252.
La cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16159 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 6 de septiembre de 2012 con el número de acceso DSM 26420.
La cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16160 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 6 de septiembre de 2012 con el número de acceso DSM 26421.
La cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC4351 se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 19 de mayo de 2009 con el número de acceso DSM 22586.
La cepa de Lactobacillus acidophilus La-5, CHCC2169, se ha depositado como DSM13241 el 30-09-2003 en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Maschroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig. La cepa de Lactobacillus paracasei CHCC2115, LC-01, se depositó en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig. Alemania, el 27 de junio de 2007 con el número de acceso DSM 19465.
Los depósitos se hicieron según el tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con los propósitos del procedimiento de patentes.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. El uso de una cepa de Streptococcus thermophilus con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa para mejorar el crecimiento de una cepa de Lactobacillus en un proceso para producir un producto lácteo fermentado, en donde la cepa de Lactobacillus se selecciona del grupo que consiste en Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus paracasei, y en donde en el inicio de la fermentación la proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus es de al menos 50.
2. El uso según la reivindicación 1, en donde la cepa de Streptococcus thermophilus fermenta la galactosa y porta una mutación en la secuencia de ADN del gen glcK que codifica una proteína glucoquinasa, en donde la mutación inactiva la proteína glucoquinasa o tiene un efecto negativo sobre la expresión del gen.
3. El uso según la reivindicación 1o 2, en donde la cepa de Streptococcus thermophilus porta una mutación que reduce el transporte de glucosa dentro de la célula.
4. El uso según la reivindicación 3, en donde la cepa de Streptococcus thermophilus porta una mutación en un gen que codifica un componente de un transportador de glucosa, en donde la mutación inactiva el transportador de glucosa o tiene un efecto negativo sobre la expresión del gen.
5. El uso según la reivindicación 4, en donde la cepa de Streptococcus thermophilus porta una mutación en la secuencia de ADN del gen manM que codifica la proteína IICMan del sistema fosfotransferasa de glucosa/manosa, en donde la mutación inactiva la proteína IICMan o tiene un efecto negativo sobre la expresión del gen.
6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cepa de Streptococcus thermophilus aumenta la cantidad de glucosa en la leche B al 9,5% a al menos 5 mg/ml cuando se inocula en la leche B al 9,5% a una concentración de 1,0E06-1,0E07 UFC/ml y se cultiva a 40°C durante 20 horas, en donde la leche B al 9,5% es leche tratada térmicamente hecha con leche desnatada en polvo reconstituida con bajo contenido de grasa hasta un nivel de materia seca del 9,5% y pasteurizada a 99°C durante 30 minutos seguido de enfriamiento a 40°C.
7. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cepa de Streptococcus thermophilus se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC15757 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 25850, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC15887 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 25851, la cepa de Streptococcus thermophilus CHCC16404 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 26722, la Streptococcus thermophilus CHCC16731 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 28889, la Streptococcus thermophilus CHCC19216 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 32227 y una cepa mutante derivada de las mismas, en donde la cepa mutante se obtiene usando una de las cepas depositadas como material de partida, y en donde la mutante ha retenido o mejorado aún más la propiedad de fermentación de la lactosa y/o la propiedad de secreción de la glucosa de dicha cepa depositada.
8. El uso según la reivindicación 1, en donde la cepa de Lactobacillus es una cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16159 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 26420, la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16160 que se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de acceso DSM 26421, y una cepa mutante derivada de las mismas, en donde la cepa mutante se obtiene usando una de las cepas depositadas como material de partida, y en donde la mutante ha retenido o mejorado aún más la propiedad de fermentación de la lactosa y/o la propiedad de secreción de la glucosa de dicha cepa depositada.
10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la cepa de Streptococcus thermophilus aumenta la cantidad de la cepa de Lactobacillus a al menos 5,0E06 UFC/g en el producto lácteo fermentado al final de la fermentación cuando se inocula en un sustrato lácteo a una concentración de 1,0E07-1,0E08 UFC/g en el sustrato lácteo y se cultiva a 43°C hasta que el pH alcanza 4,55, en donde el sustrato lácteo es una mezcla de leche fresca desnatada con un contenido de grasa del 0,1%, leche fresca semidesnatada con un contenido de grasa del 1,5% y leche desnatada en polvo, y en donde el sustrato lácteo contiene un 4,7% de proteína y un 1,0% de grasa, y un 0,05% de sacarosa.
11. Una composición que comprende una cepa de Streptococcus thermophilus con una deficiencia en el metabolismo de la glucosa y una cepa de Lactobacillus, en donde la cepa de Lactobacillus se selecciona del grupo que consiste en Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus paracasei, y en donde la proporción de UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus a UFC/g de la cepa de Lactobacillus es de al menos 50.
12. Una composición según la reivindicación 11 que comprende de 1,0E04 a 1,0E12 UFC/g de la cepa de Streptococcus thermophilus.
13. Un proceso para producir un producto lácteo fermentado que comprende inocular y fermentar un sustrato lácteo con la composición de cualquiera de las reivindicaciones 11-12.
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