ES2924186T3 - Dinucleótidos cíclicos como agonistas de STING - Google Patents

Abstract

Se describen compuestos, composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades, síndromes o trastornos que se ven afectados por la modulación de STING. Dichos compuestos están representados por la fórmula (I) como sigue: en la que R, R1B, R1C, R2B, R2C, B1, W, X, Y, Z se definen aquí. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Dinucleótidos cíclicos como agonistas de STING

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 62/451.301 presentada el 27 de enero de 2017; la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 62/454.135, presentada el 3 de febrero de 2017; y la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 62/451.351, presentada el 27 de enero de 2017.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula 2 que es agonista de STING (estimulador de genes de interferón), útil para el tratamiento de trastornos que se ven afectados por la modulación de la proteína STING. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto, y al uso de tales compuestos o composiciones farmacéuticas para el tratamiento de varias enfermedades, síndromes y trastornos. Más particularmente, la presente invención se refiere a tal compuesto o composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento varias infecciones, enfermedades, síndromes y trastornos que incluyen, pero no se limitan a , melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma, y terapia antiviral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN STING (estimulador de genes de interferón), también conocido como TMEM173, MITA, MPYS y EMS, es un receptor transmembrana localizado dentro de la célula y un sensor clave de los ácidos nucleicos citosólicos (Zhong B, et al. "The Adaptor Protein MITA Links Virus-Sensing Receptors to IRF3 Transcription Factor Activation". Immunity. 2008. vol. 29: 538-550). Estudios recientes han revelado la biología de STING y su papel en la movilización de una respuesta inmunitaria innata que da como resultado una actividad antitumoral robusta en modelos de ratón. La activación de la vía STING da como resultado la producción de interferones Tipo I (principalmente IFN-a e IFN-p) inducida a través de la vía IRF3 (factor regulador de interferón 3). Se piensa que la activación de IRF3 está mediada por TBK1 que recluta y fosforila a IRF3 formando así un homodímero de IRF3 capaz de introducirse en el núcleo para transcribir interferón tipo I y otros genes (Liu S, et al. "Phosphorylation of innate immune adaptor proteins Ma Vs , STING, and TRIF induces IRF3 activation" Science. 2015: 2630-2637). TBK1 también activa elpotenciador de la cadena ligera kappa del factor nuclear de la vía de las células B activadas que lleva la producción de citoquinas proinflamatorias (IL-1 a, IL-1p, IL-2, IL-6, TNF-a, etc.), a través del factor de transcripción oncogénico NF-kB. Además, STING activa STAT6 (transductor de señal y activador de la transcripción 6) para inducir (tipo Th2), aumentar (IL-12) o disminuir (IL-10) la producción de varias citoquinas, incluyendo las quimiocinas CCl2, CCL20 y CCL26 (Chen H, et al. "Activation of STAT6 by STING Is Critical for Antiviral Innate Immunity" Cell. 2011, vol.14: 433-446). También se ha informado que la fosforilación directa de STING en Ser366 después de la activación se produce a través de TBK1 o ULK1 (Corrales, L. et al "Direct activation of STING in the tumor microenvironment leads to potent and systemic tumor regression and immunity" Cell Reports, 2015, vol.11: 1­ 13; Konno, H. et al. "Cyclic dinucleotides trigger ULK1 (ATG1) phosphorylation of STING to prevent sustained innate immune signaling" Cell, 2013, vol. 155: 688-698).

El ligando natural que se une y activa STING guanosina monofosfato-adenosina monofosfato (2',3')cíclico (2',3-cGAMP) y la enzima responsable de su síntesis (cGAS, también conocida como C6orf150 o MB21D1) han sido elucidados proporcionando una oportunidad para modular esta vía. cGAMP es un ligando de alta afinidad para STING producido en células de mamíferos que sirve como segundo mensajero endógeno para activar la vía STING. Es un dinucleótido cíclico con un enlace 2',3' único producido por cGAS en presencia de ADN exógeno de cadena doble (por ejemplo, el liberado por bacterias, virus o protozoos invasores) o de ADN propio en mamíferos (Wu et al., 2013; Sun, L. et al. "Cyclic ^g M^p-AMP Synthase Is a Cytosolic DNA Sensor That Activates the Type I Interferon Pathway" Science, 2013, vol. 339: 786-791; Bhat N and Fitzgerald KA. "Recognition of Cytosolic DNA by cGAS and other sTING-dependent sensors". Eur J Immunol. 2014 Mar; 44(3):634-40). La activación de STING también puede producirse a través de la unión de dinucleótidos cíclicos exógenos (3',3) (c-di-GMP, c-di-AMP y 3'3'-cGAMP) que son liberados por bacterias invasoras (Zhang X, et al. "Cyclic GMP-AMP Containing Mixed Phosphodiester Linkages Is An Endogenous High-Affinity Ligand for STING" Molecular Cell, 2013, vol. 51: 226-235; Danilchanka, O and Mekalanos, JJ. "Cyclic Dinucleotides and the Innate Immune Response" Cell. 2013. vol. 154: 962-970).

La activación de la vía STING desencadena una respuesta inmunitaria que da como resultado la generación de células T asesinas específicas que pueden encoger los tumores y proporcionar una inmunidad duradera para que no vuelvan a aparecer. La sorprendente actividad antitumoral obtenida con los agonistas de STING en modelos preclínicos ha generado un alto nivel de entusiasmo por este objetivo y los compuestos de molécula pequeña que pueden modular la vía de STING tienen potencial tanto para tratar el cáncer como reducir las enfermedades autoinmunes.

La activación de la vía STING también contribuye a una respuesta antiviral. La pérdida de respuesta funcional, ya sea a nivel celular o del organismo, demuestra una incapacidad para controlar la carga viral en ausencia de STING. La activación de la vía STING desencadena una respuesta inmunitaria que da como resultado citoquinas antivirales y proinflamatorias que combaten el virus y movilizan los brazos innatos y adaptativos del sistema inmunitario. En última instancia, se desarrolla una inmunidad duradera contra el virus patógeno. La sorprendente actividad antiviral obtenida con los agonistas de STING en modelos preclínicos ha generado un alto nivel de entusiasmo por este objetivo y los compuestos de molécula pequeña que pueden modular la vía de STING tienen potencial para tratar infecciones virales crónicas, como la hepatitis B.

La infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB) es un importante problema de salud mundial que afecta a más del 5% de la población mundial (más de 350 millones de personas en todo el mundo y 1,25 millones de individuos en los Estados Unidos). A pesar de la disponibilidad de ciertas vacunas y terapias contra el VHB, la carga de la infección crónica por VHB continúa siendo un importante problema médico mundial no resuelto debido a las opciones de tratamiento subóptimas y las tasas sostenidas de nuevas infecciones en la mayor parte del mundo en desarrollo. Los tratamientos actuales se limitan a sólo dos clases de agentes: interferón alfa y análogos de nucleósidos que actúan como inhibidores de la polimerasa viral. Sin embargo, ninguna de estas terapias ofrece una cura para la enfermedad, y la resistencia a los fármacos, la baja eficacia y los problemas de tolerabilidad limitan su impacto. Las bajas tasas de curación del VHB se atribuyen, por lo menos en parte, al hecho de que es difícil lograr la supresión completa de la producción del virus con un único agente antiviral. Sin embargo, la supresión persistente del ADN del VHB retrasa la progresión de la enfermedad hepática y ayuda a prevenir el carcinoma hepatocelular. Los objetivos de la terapia actuales para los pacientes infectados por el VHB están dirigidos a reducir el ADN del VHB en suero a niveles bajos o indetectables y, en última instancia, a reducir o prevenir el desarrollo de cirrosis y carcinoma hepatocelular. Hay, por tanto, una necesidad en la técnica de agentes terapéuticos que puedan aumentar la supresión de la producción de virus y que puedan tratar, mejorar o prevenir la infección por VHB. La administración de dichos agentes terapéuticos a un paciente infectado por el VHB, ya sea como monoterapia o en combinación con otros tratamientos contra el VHB o tratamientos complementarios, puede llevar a una carga viral significativamente reducida, un pronóstico mejorado, una progresión disminuida de la enfermedad y unas tasas de seroconversión mejoradas.

Los potenciales beneficios terapéuticos de mejorar tanto la inmunidad innata como la adaptativa hacen de STING un objetivo terapéutico atractivo que demuestra una actividad impresionante por sí mismo y que también puede combinarse con otras inmunoterapias. Los agonistas de STING se han divulgado, por ejemplo en la WO 2014/179335, WO 2014/189806, WO 2015/077354, WO 2015/185565, WO 2016/120305, WO 2014/189805 y en otros lugares.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona el compuesto:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La presente divulgación también proporciona compuestos de Fórmula (I)

en donde

R es CH² u O;

R-mes hidrógeno, hidroxi o fluoro;

Ríe se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

R²B es hidrógeno, hidroxi, metoxi o fluoro;

R²C se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

Bí se selecciona del grupo que consiste de anillos b1, b2, b3, b4, b5, b6, b7 y b8

W es -O- o -NH-;

X es -O- o -NH-;

Y es -CH²-, -O- o -NH-;

Z es -CH²-, -O- o -NH-;

de tal manera que solo uno de X e Y es NH, y solo uno de W y Z es NH, en cualquier caso;

y de tal manera que cuando R es CH² y Bí se selecciona de b6 o b7, entonces R²B es distinto de fluoro o hidroxi; además, siempre que un compuesto de Fórmula (I) sea distinto de un compuesto en el que R, W, X, Y y Z son cada uno O; Rib y R²B son cada uno hidroxi; Bí es b1; y Rib y R²B son cada uno hidroxi;

o un enantiómero, diastereómero o forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y por lo menos uno de un portador farmacéuticamente aceptable, un excipiente farmacéuticamente aceptable y un diluyente farmacéuticamente aceptable.

También se divulgan procesos para preparar una composición farmacéutica que comprende, consiste de y/o consiste esencialmente de mezclar un compuesto de Fórmula (I) y un portador farmacéuticamente aceptable, un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable.

En realizaciones de la invención la composición es una forma de dosificación oral sólida.

En realizaciones de la invención la composición es un jarabe, un elixir o una suspensión.

La presente invención proporciona además el compuesto o las composiciones de la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad, síndrome o afección, en donde dicha enfermedad, síndrome o afección es cáncer o una infección viral. En realizaciones específicas de la invención la enfermedad, síndrome o afección es cáncer.

En realizaciones de la invención, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón y fibrosarcoma.

En realizaciones específicas de la invención la enfermedad, síndrome o afección es una infección viral. En realizaciones de la invención, la infección viral es hepatitis B.

La divulgación proporciona métodos para tratar o mejorar una infección viral, enfermedad, síndrome o afección en un sujeto, incluyendo un mamífero y/o un humano, usando un compuesto de Fórmula (I).

La divulgación proporciona además métodos para tratar o mejorar una infección viral, enfermedad, síndrome o afección en un sujeto, incluyendo un mamífero y/o un humano en donde la infección viral, enfermedad, síndrome o afección se ve afectada por el agonismo de STING, seleccionada del grupo que consiste de melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma y hepatitis B, usando un compuesto de Fórmula (I).

La divulgación proporciona además métodos para tratar o mejorar una infección viral, enfermedad, síndrome o afección en un sujeto, incluyendo un mamífero y/o un humano, seleccionada del grupo que consiste de melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma y hepatitis B, usando un compuesto de Fórmula (I).

La divulgación también está dirigida al uso de cualquiera de los compuestos descritos en la presente en la preparación de un medicamento en donde el medicamento se prepara para tratar una infección viral, enfermedad, síndrome o afección que se ve afectada por el agonismo de STING, seleccionada del grupo que consiste de melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma y hepatitis B, en un sujeto con necesidad de ello.

La divulgación también está dirigida al uso de cualquiera de los compuestos descritos en la presente en la preparación de un medicamento en donde el medicamento se prepara para tratar una infección viral, enfermedad, síndrome o afección seleccionada del grupo que consiste de melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma y hepatitis B, en un sujeto con necesidad de ello.

La divulgación también está dirigida a la preparación de derivados de dinucleótidos cíclicos sustituidos que actúan como agonistas selectivos de STING.

Ejemplos de la divulgación son métodos para tratar una infección viral, enfermedad, síndrome o afección modulada por STING seleccionada del grupo que consiste de melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma y hepatitis B, que comprenden administrar a un sujeto con necesidad de ello una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos o composiciones farmacéuticas descritos anteriormente.

Ejemplos de la divulgación son métodos para tratar una infección viral, enfermedad, síndrome o afección seleccionada del grupo que consiste de melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma y hepatitis B, que comprenden administrar a un sujeto con necesidad de ello una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos o composiciones farmacéuticas descritos anteriormente.

En otra realización, la divulgación está dirigida a un compuesto de Fórmula (I) para su uso en el tratamiento de una infección viral, enfermedad, síndrome o afección afectada por el agonismo de STING seleccionada del grupo que consiste de melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma y hepatitis B.

En otra realización, la divulgación está dirigida a una composición que comprende un compuesto de Fórmula (I) para el tratamiento de una infección viral, enfermedad, síndrome o afección seleccionada del grupo que consiste de melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma y hepatitis B. La invención está definida por las reivindicaciones. Las divulgaciones adicionales se proporciona con propósitos de información.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Con referencia a los sustituyentes, el término "independientemente" se refiere a la situación en la que cuando es posible más de un sustituyente, los sustituyentes pueden ser iguales o diferentes entre sí.

El término "alquilo", ya sea usado solo o como parte de un grupo sustituyente, se refiere a cadenas de carbono lineales y ramificadas que tienen de 1 a 8 átomos de carbono. Por lo tanto, los números designados de átomos de carbono (por ejemplo, C-i-s) se refieren independientemente al número de átomos de carbono en una fracción de alquilo o a la porción alquilo de un sustituyente que contiene alquilo superior. En grupos sustituyentes con múltiples grupos alquilo como (alquilo C-i^amino-, los grupos alquilo C^1-6 del dialquilamino pueden ser iguales o diferentes.

El término "alcoxi" se refiere a un grupo -O-alquilo, en donde el término "alquilo" es como se ha definido anteriormente.

Los términos "alquenilo" y "alquinilo" se refieren a cadenas de carbono lineales y ramificadas que tienen de 2 a 8 átomos de carbono, en donde una cadena de alquenilo contiene por lo menos un enlace doble y una cadena de alquinilo contiene por lo menos un enlace triple.

El término "cicloalquilo" se refiere a anillos hidrocarbonados monocíclicos o policíclicos, saturados o parcialmente saturados, de 3 a 14 átomos de carbono. Los ejemplos de tales anillos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y adamantilo.

El término "heterociclilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclico o bicíclico no aromático que tiene de 3 a 10 miembros en el anillo que incluyen por lo menos 1 átomo de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S. Incluido dentro del término heterociclilo está un anillo cíclico no aromático de 5 a 7 miembros en el que de 1 a 2 miembros son N, o un anillo cíclico no aromático de 5 a 7 miembros en el que 0, 1 o 2 miembros son N y hasta 2 miembros son O o S y por lo menos uno el miembro debe ser N, O o S; en donde, opcionalmente, el anillo contiene de 0 a 1 enlaces insaturados, y, opcionalmente, cuando el anillo tiene de 6 o 7 miembros, contiene hasta 2 enlaces insaturados. Los miembros del anillo de átomos de carbono que forman un anillo de heterociclo pueden estar completamente saturados o parcialmente saturados. El término "heterociclilo" también incluye dos grupos heterocicloalquilo monocíclicos de 5 miembros unidos para formar un anillo bicíclico. Tales grupos no se consideran completamente aromáticos y no se refieren como grupos heteroarilo. Cuando un heterociclo es bicíclico, ambos anillos del heterociclo son no aromáticos y por lo menos uno de los anillos contiene un miembro del anillo de heteroátomo. Los ejemplos de grupos heterociclo incluyen, pero no se limitan a, pirrolinilo (incluyendo 2H-pirrol, 2-pirrolinilo o 3-pirrolinilo), pirrolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo y piperazinilo. A menos que se indique lo contrario, el heterociclo está unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado una estructura estable.

El término "arilo" se refiere a un anillo monocíclico o bicíclico aromático insaturado de 6 a 10 miembros de carbono. Los ejemplos de anillos arilo incluyen fenilo y naftalenilo. El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillos aromático monocíclico o bicíclico aromático que tiene de 5 a 10 miembros en el anillo y que contiene átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente del grupo que consiste de N, O y S. Incluidos dentro del término heteroarilo están los anillos aromáticos de 5 o 6 miembros en los que el anillo consiste de átomos de carbono y tiene por lo menos un miembro de heteroátomo. Los heteroátomos adecuados incluyen nitrógeno, oxígeno y azufre. En el caso de anillos de 5 miembros, el anillo de heteroarilo contiene preferiblemente un miembro de nitrógeno, oxígeno o azufre y, además, hasta 3 nitrógenos adicionales. En el caso de anillos de 6 miembros, el anillo de heteroarilo contiene preferiblemente de 1 a 3 átomos de nitrógeno. Para el caso en el que el anillo de 6 miembros tiene 3 nitrógenos, como máximo 2 átomos de nitrógeno son adyacentes. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen furilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, indolilo, isoindolilo, benzofurilo, benzotienilo, indolazolilo, bencimidazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, benzoisoxazolilo, benzotiadiazolilo, benzotriazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo y quinazolinilo. A menos que se indique lo contrario, el heteroarilo está unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado una estructura estable.

El término “halógeno” o “halo” se refiere a átomos de flúor, cloro, bromo y yodo.

Siempre que el término "alquilo" o "arilo" o cualquiera de sus prefijos raíz aparezca en el nombre de un sustituyente (por ejemplo, arilalquilo, alquilamino), debe interpretarse que el nombre incluye las limitaciones dadas anteriormente para "alquilo" y "arilo". Los números designados de átomos de carbono (por ejemplo, C¹ -C⁶) se refieren independientemente al número de átomos de carbono en una fracción alquilo, una fracción arilo o en la porción alquilo de un sustituyente superior en el que alquilo aparece como su prefijo raíz. Para los sustituyentes alquilo y alcoxi, el número designado de átomos de carbono incluye todos los miembros independientes incluidos dentro de un intervalo dado especificado. Por ejemplo, alquilo C^1-6 incluiría metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo individualmente, así como subcombinaciones de los mismos (por ejemplo, C^1-2 , C^{1 -3} , C^1-4 , C^1-5, C^2-6, C^3-6, C^4-6, C^5-6, C^2-5, etc.).

En general, según las reglas de nomenclatura estándar usadas a lo largo de esta divulgación, la parte terminal de la cadena lateral designada se describe primero seguida por la funcionalidad adyacente hacia el punto de unión. Así, por ejemplo, un sustituyente “alquilcarbonilo C¹-C⁶” se refiere a un grupo de fórmula:

El término “R” en un estereocentro indica que el estereocentro es puramente de configuración R tal como se define en la técnica; de igual manera, el término "S" significa que el estereocentro es puramente de configuración S. Como se usan en la presente, los términos "*R" o "*S" en un estereocentro se usan para designar que el estereocentro es de configuración pura pero desconocida. Como se usa en la presente, el término "RS" se refiere a un estereocentro que existe como una mezcla de las configuraciones R- y S-. De manera similar, los términos "*RS" o "*SR" se refieren a un estereocentro que existe como una mezcla de las configuraciones R- y S- y tiene una configuración desconocida con respecto a otro estereocentro dentro de la molécula.

Los compuestos que contienen un estereocentro dibujado sin una designación de enlace estéreo son una mezcla de dos enantiómeros. Los compuestos que contienen dos estereocentros, dibujados ambos sin designaciones de enlaces estéreo, son una mezcla de cuatro diastereómeros. Los compuestos con dos estereocentros, ambos etiquetados como "RS" y dibujados con designaciones de enlace estéreo, son una mezcla de dos componentes con estereoquímica relativa tal como se dibuja. Los compuestos con dos estereocentros, ambos etiquetados como "*RS" y dibujados con designaciones de enlaces estéreo, son una mezcla de dos componentes con una estereoquímica relativa desconocida. Los estereocentros sin etiqueta dibujados sin designaciones de enlace estéreo son una mezcla de las configuraciones R- y S-. Para los estereocentros no etiquetados dibujados con designaciones de enlaces estéreo, la estereoquímica absoluta es la que se representa.

A menos que se indique lo contrario, se pretende que la definición de cualquier sustituyente o variable en una localización particular en una molécula sea independiente de sus definiciones en cualquier otra parte de esa molécula. Se entiende que los sustituyentes y los patrones de sustitución de los compuestos de la presente divulgación pueden ser seleccionados por un experto en la técnica para proporcionar compuestos que sean químicamente estables y que puedan sintetizarse fácilmente mediante técnicas conocidas en la técnica, así como aquellos métodos expuestos en la presente.

El término "sujeto" se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, más preferentemente un humano, que ha sido objeto de tratamiento, observación o experimento.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto activo o agente farmacéutico, incluyendo un compuesto de la presente invención, que provoca la respuesta biológica o medicinal en un sistema tisular, animal o humano, que está siendo buscada por un investigador, veterinario, médico u otro practicante clínico, que incluye el alivio total o parcial de los síntomas de la enfermedad, síndrome, afección o trastorno que se está tratando.

El término "composición" se refiere a un producto que incluye los ingredientes especificados en cantidades terapéuticamente eficaces, así como a cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de combinaciones de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas.

Se pretende que el término "agonista de STING" abarque un compuesto que interactúa con STING uniéndose a él e induciendo una transducción de señales en sentido descendente caracterizada por la activación de las moléculas asociadas con la función de STING. Esto incluye la fosforilación directa de STING, IRF3 y/o NF-kB y también podría incluir STAT6. La activación de la vía de STING da como resultado una producción aumentada de interferones tipo I (principalmente IFN-a e IFN-p) y expresión de genes estimulados por interferón (Chen H, et al. "Activation of STa T6 by STING Is Critical for Antiviral Innate Immunity". Cell. 2011, vol.14: 433-446; y Liu S-Y, et al. "Systematic identification of type I and type II interferon-induced antiviral factors". Proc. Natl. Acad. Sci. 2012:vol. 109 4239-4244).

El término "modulado por STING" se usa para referirse a una afección afectada por STING directamente o a través de la vía de STING, incluyendo pero no limitadas a, infecciones virales, enfermedades o afecciones como melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma e infección por hepatitis B.

Como se usa en la presente, a menos que se indique lo contrario, el término "trastorno modulado por STING" significará cualquier infección viral, enfermedad, trastorno o afección caracterizada porque por lo menos uno de sus síntomas característicos se alivia o elimina tras el tratamiento con un agonista de STING. Los ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a, melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma y hepatitis B.

Como se usa en la presente, a menos que se indique lo contrario, el término "afectar" o "afectado" (cuando se hace referencia a una infección viral, enfermedad, síndrome, afección o trastorno que se ve afectado por el agonismo de STING) incluye una reducción en la frecuencia y/o gravedad de uno o más síntomas o manifestaciones de dicha infección viral, enfermedad, síndrome, afección o trastorno; y/o incluyen la prevención del desarrollo de uno o más síntomas o manifestaciones de dicha infección viral, enfermedad, síndrome, afección o trastorno o el desarrollo de la infección viral, enfermedad, afección, síndrome o trastorno.

Los compuestos de la presente divulgación son útiles en métodos para tratar o mejorar una infección viral, enfermedad, síndrome, afección o trastorno que se ve afectado por el agonismo de STING. Tales métodos comprenden, consisten y/o consisten esencialmente en administrar a un sujeto, incluyendo un animal, un mamífero y un humano con necesidad de dicho tratamiento, mejora y/o prevención, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula (I), o un enantiómero, diastereómero, solvato o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En particular, los compuestos de Fórmula (I) o un enantiómero, diastereómero, solvato o forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos son útiles para tratar o mejorar enfermedades, síndromes, afecciones o trastornos como melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata., cáncer de pulmón, fibrosarcoma y hepatitis B.

Más particularmente, los compuestos de Fórmula (I), o un enantiómero, diastereómero, solvato o forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, son útiles para tratar o mejorar el melanoma, el cáncer de colon, el cáncer de mama, el cáncer de próstata, el cáncer de pulmón, el fibrosarcoma y la hepatitis B, que comprende administrar a un sujeto con necesidad de ello una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula (I), o un enantiómero, diastereómero, solvato o forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se define en la presente.

Algunas realizaciones divulgadas en la presente se refieren a métodos para mejorar y/o tratar una infección viral, que incluyen las infecciones provocadas por Hepadnaviridae, como el virus de la hepatitis B o VHB. Los métodos pueden incluir administrar a un sujeto al que se ha identificado que padece una infección viral una cantidad eficaz de uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que incluye uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Otras realizaciones divulgadas en la presente se refieren a un método para mejorar y/o tratar una infección viral que puede incluir poner en contacto una célula infectada con el virus con una cantidad eficaz de uno o más compuestos descritos en la presente (por ejemplo, un compuesto de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéutica que incluye uno o más compuestos descritos en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Otras realizaciones más descritas en la presente se refieren al uso de uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la fabricación de un medicamento para mejorar y/o tratar una infección viral.

Otras realizaciones más descritas en la presente se refieren a uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que incluye uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, que puede usarse para mejorar y/o tratar una infección viral. Algunas realizaciones divulgadas en la presente se refieren a un método para inhibir la replicación de un virus que puede incluir poner en contacto una célula infectada con el virus con una cantidad eficaz de uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que incluye uno o más compuestos descritos en la presente, o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Otras realizaciones descritas en la presente se refieren al uso de uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la fabricación de un medicamento para inhibir la replicación de un virus. Otras realizaciones más descritas en la presente se refieren a uno o más compuestos descritos en la presente (por ejemplo, un compuesto de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéutica que incluye uno o más compuestos descritos en la presente, o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, que puede usarse para inhibir la replicación de un virus.

En algunas realizaciones, la infección viral puede ser una infección viral por hepatitis B. Los métodos pueden incluir administrar a un sujeto al que se ha identificado que padece VHB una cantidad eficaz de uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que incluye uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Otras realizaciones divulgadas en la presente se refieren a un método para mejorar y/o tratar una infección viral que puede incluir poner en contacto una célula infectada con el VHB con una cantidad eficaz de uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que incluye uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Otras realizaciones más descritas en la presente se refieren al uso de uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la fabricación de un medicamento para mejorar y/o tratar el VHB.

Otras realizaciones más descritas en la presente se refieren a uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que incluye uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, que puede usarse para mejorar y/o tratar el VHB. Algunas realizaciones divulgadas en la presente se refieren a un método para inhibir la replicación del VHB que puede incluir poner en contacto una célula infectada con el virus con una cantidad eficaz de uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que incluye uno o más compuestos de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Otras realizaciones divulgadas en la presente se refieren al uso de uno o más compuestos de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la fabricación de un medicamento para inhibir la replicación del VHB. Otras realizaciones más descritas en la presente se refieren a uno o más compuestos de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que incluye uno o más compuestos de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, que pueden usarse para inhibir la replicación del VHB.

También se divulga un compuesto de Fórmula (I)

en donde

R es CH² u O;

R-mes hidrógeno, hidroxi o fluoro;

R-ic se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

R²B es hidrógeno, hidroxi, metoxi o fluoro;

R²C se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

B¹ se selecciona del grupo que consiste de los anillos b1, b2, b3, b4, b5, b6, y b8

W es -O- o -NH-;

X es -O- o -NH-;

Y es -CH²-, -O- o -NH-;

Z es -CH²-, -O- o -NH-;

de tal manera que solo uno de X e Y es NH, y solo uno de W y Z es NH, en cualquier caso;

y de tal manera que cuando R es CH² y B¹ es b6, entonces R²B es distinto de fluoro o hidroxi;

además, siempre que un compuesto de Fórmula (I) sea distinto de un compuesto en el que R, W, X, Y y Z son cada uno O; Rib y R²B son cada uno hidroxi; B¹ es b1; y Rib y R²B son cada uno hidroxi;

o un enantiómero, diastereómero o forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se divulga un compuesto de Fórmula (I)

en donde

R es CH² u O;

R-mes hidrógeno, hidroxi o fluoro;

Ríe se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

R²B es hidrógeno, hidroxi, metoxi o fluoro;

R²C se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

Bí se selecciona del grupo que consiste de los anillos b1, b2, b3, b4, b6, y b8

W es -O-;

X es -O- o -NH-;

Y es -CH²-, -O- o -NH-;

Z es -CH²-, -O- o -NH-;

de tal manera que solo uno de X e Y es NH en cualquier caso;

y de tal manera que cuando R es CH² y B¹ es b6, entonces R²B es distinto de fluoro o hidroxi;

además, siempre que un compuesto de Fórmula (I) sea distinto de un compuesto en el que R, W, X, Y y Z son cada uno O; R-m y R²B son cada uno hidroxi; B¹ es b1; y R-m y R²B son cada uno hidroxi;

o un enantiómero, diastereómero o forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se divulga un compuesto de Fórmula (I)

en donde

R es CH² u O;

R-mes hidrógeno, hidroxi o fluoro;

Ríe se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

R²B es hidrógeno, hidroxi, metoxi o fluoro;

R²C se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

B¹ es b6

W es -O-;

X es -O- o -NH-;

Y es -CH²-, -O- o -NH-;

Z es -CH²-, -O- o -NH-;

de tal manera que solo uno de X e Y es NH en cualquier caso;

y de tal manera que cuando R es CH² y Bí es b6, entonces R²B es distinto de fluoro o hidroxi;

o un enantiómero, diastereómero o forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se divulga un compuesto de Fórmula (I)

en donde

R es CH² u O;

R-mes hidrógeno, hidroxi o fluoro;

Ríe se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

R²B es hidrógeno, hidroxi, metoxi o fluoro;

R²C se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

Bí se selecciona del grupo que consiste de los anillos b1, b2, b3, b4, b6, y b8

de tal manera que solo uno de X e Y es NH en cualquier caso;

y de tal manera que cuando R es CH² y Bí es b6, entonces R²B es distinto de fluoro o hidroxi; o un enantiómero, diastereómero o forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se divulga un compuesto de Fórmula (I)

en donde

R es CH² u O;

R-mes hidrógeno, hidroxi o fluoro;

Ríe se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

R²B es hidrógeno, hidroxi, metoxi o fluoro;

R²C se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

Bí es b6

Wes-NH-;

X es -O- o -NH-;

Y es -CH²-, -O- o -NH-;

Z es -CH²-, -O- o -NH-;

de tal manera que solo uno de X e Y es NH en cualquier caso;

y de tal manera que cuando R es CH² y Bí es b6, entonces R²B es distinto de fluoro o hidroxi;

o un enantiómero, diastereómero o forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se divulga un compuesto de Fórmula (I)

en donde

R es CH² u O;

RiBes hidrógeno, hidroxi o fluoro;

Ric se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

R²B es hidrógeno, hidroxi, metoxi o fluoro;

R²C se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

Bí se selecciona del grupo que consiste de los anillos b1, b2, b3, b4, b5, b6, y b8

W es -O- o -NH-;

X es -O- o -NH-;

Y es -CH²-, -O- o -NH-;

Z es -CH²-, -O- o -NH-;

de tal manera que solo uno de X e Y es NH, y solo uno de W y Z es NH, en cualquier caso;

y de tal manera que cuando B¹ es b6, entonces R²B es distinto de fluoro o hidroxi;

o un enantiómero, diastereómero o forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se divulga un compuesto de Fórmula (I)

en donde

R es CH²;

R-mes hidrógeno, hidroxi o fluoro;

R-^ic se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

R²B es hidrógeno, hidroxi, metoxi o fluoro;

R²C se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

B¹ se selecciona del grupo que consiste de los anillos b1, b2, b3, b4, b5, b6, y b8

W es -O-;

X es -O-;

Y es -CH²- o -O-;

Z es -CH²- o -O-;

de tal manera que cuando B¹ es b6, entonces R²B es distinto de fluoro o hidroxi;

o un enantiómero, diastereómero o forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se divulga un compuesto de Fórmula (I)

en donde

R es O;

R-mes hidrógeno, hidroxi o fluoro;

Ríe se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

R²B es hidrógeno, hidroxi, metoxi o fluoro;

R²C se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, tiol y BH³-;

Bí se selecciona del grupo que consiste de los anillos b1, b2, b3, b4, b5, b6, y b8

W es -O- o -NH-;

X es -O- o -NH-;

Y es -CH²-, -O- o -NH-;

Z es -CH²-, -O- o -NH-;

de tal manera que solo uno de X e Y es NH, y solo uno de W y Z es NH, en cualquier caso;

además, siempre que un compuesto de Fórmula (I) sea distinto de un compuesto en donde R, W, X, Y y Z son cada uno O; Rib y R²B son cada uno hidroxi; Bí es b1; y Rib y R²B son cada o un enantiómero, diastereómero o forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La presente divulgación incluyen un compuesto de Fórmula (la), en donde W, X, Y y Z son cada uno O, como se define en la presente, o un enantiómero, diastereómero, solvato o una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el los sustituyentes seleccionados de una o más de las variables definidas en la presente (por ejemplo, R, Rib, Ríe, R²B, R²C y Bí) se seleccionan independientemente para ser cualquier sustituyente individual o cualquier subconjunto de sustituyentes de los ejemplificados en la lista en la Tabla í, a continuación en la que el compuesto 2 es un compuesto de la invención. Los compuestos í y 3-í3 no son compuestos de la invención

í5

Tabla 1

(continuación)

(continuación)

También se divulga un compuesto de Fórmula (Ib), en donde R es O, como se define en la presente, o un enantiómero, diastereómero, solvato o una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde los sustituyentes seleccionados de una o más de las variables definidas en la presente (por ejemplo, R-m, R-^ic, R²B, R²C, W, X, Y, Z y Bi) se seleccionan independientemente para que sean cualquier sustituyente individual o cualquier subconjunto de sustituyentes de los ejemplificados en la lista de la Tabla 2, a continuación. Los compuestos 14-33 no son compuestos de la invención.

Tabla 2

continuación

También se divulga un compuesto de Fórmula (I), seleccionado de los compuestos 1 a 33,

o una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Para uso en medicina, las sales de compuestos de Fórmula (I), como el compuesto 2 de la invención, se refieren a “sales farmacéuticamente aceptables” no tóxicas. Sin embargo, otras sales pueden ser útiles en la preparación de compuestos de Fórmula (I) o de sus formas de sal farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas de compuestos de Fórmula (I) incluyen sales de adición de ácido que pueden, por ejemplo, formarse mezclando una solución del compuesto con una solución de un ácido farmacéuticamente aceptable como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico o ácido fosfórico. Además, cuando los compuestos de Fórmula (I) portan una fracción ácida, las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas de los mismos pueden incluir sales de metales alcalinos como sales de sodio o potasio; sales de metales alcalinotérreos como sales de calcio o magnesio; y sales formadas con ligandos orgánicos adecuados como sales de amonio cuaternario. Por tanto, las sales farmacéuticamente aceptables representativas incluyen acetato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bisulfato, bitartrato, borato, bromuro, edetato de calcio, camsilato, carbonato, cloruro, clavulanato, citrato, diclorhidrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromhidrato, clorhidrato, hidroxinaftoato, yoduro, isotionato, lactato, lactobionato, laurato, malato, maleato, mandelato, mesilato, metilbromuro, metilnitrato, metilsulfato, mucato, napsilato, nitrato, sal de N-metilglucamina amonio, oleato, pamoato (embonato), palmitato, pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, sulfato, subacetato, succinato, tanato, tartrato, teoclato, tosilato, trietioduro y valerato.

Los ácidos y bases representativos que pueden usarse en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos que incluyen ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético, aminoácidos acilados, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido L-aspártico, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido (+)-canfórico, ácido canforsulfónico, ácido (+)-(1S)-alcanfor-10-sulfónico, ácido cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclámico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxi-etanosulfónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido glucoheptónico, ácido D-glucónico , ácido D-glucorónico, ácido L-glutámico, ácido a-oxoglutárico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido bromhídrico, ácido clorhídrico, ácido (+)-L-láctico, ácido (±)-DL-láctico, ácido lactobiónico , ácido maleico, ácido (-)-L-málico, ácido malónico, ácido (±)-DL-mandélico, ácido metanosulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido naftaleno-1,5-disulfónico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido nicotínico, ácido nítrico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido fosfórico, ácido L-piroglutámico, ácido salicílico, ácido 4-amino-salicílico, ácido sebaico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido sulfúrico, ácido tánico, ácido (+)-L-tartárico, ácido tiociánico, ácido p-toluenosulfónico y ácido undecilénico; y bases que incluyen amoníaco, L-arginina, benetamina, benzatina, hidróxido de calcio, colina, deanol, dietanolamina, dietilamina, 2-(dietilamino)-etanol, etanolamina, etilendiamina, N-metilglucamina, hidrabamina, 1H-imidazol, L-lisina, hidróxido de magnesio, 4-(2-hidroxietil)-morfolina, piperazina, hidróxido de potasio, 1-(2-hidroxietil)-pirrolidina, hidróxido de sodio, trietanolamina, trometamina e hidróxido de zinc.

También se divulgan profármacos de compuestos de Fórmula (I). En general, tales profármacos serán derivados funcionales de los compuestos que son fácilmente convertibles in vivo en el compuesto requerido. Por tanto, en los métodos de tratamiento o prevención de la presente divulgación, el término "administrar" abarca el tratamiento o la prevención de varias enfermedades, afecciones, síndromes y trastornos descritos con el compuesto divulgado específicamente o con un compuesto que puede no estar específicamente divulgado, pero que se convierte en el compuesto especificado in vivo después de la administración a un paciente. Los procedimientos convencionales para la selección y preparación de derivados de profármacos adecuados se describen, por ejemplo, en "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985.

Cuando los compuestos de acuerdo con esta divulgación tienen por lo menos un centro quiral, en consecuencia pueden existir como enantiómeros. Cuando los compuestos poseen dos o más centros quirales, pueden existir adicionalmente como diastereoisómeros. Debe entenderse que todos estos isómeros y mezclas de los mismos están incluidos dentro del alcance de la presente invención. Además, algunas de las formas cristalinas de los compuestos pueden existir como polimorfos y, como tal, se pretende que se incluyan en la presente divulgación. Además, algunos de los compuestos pueden formar solvatos con agua (es decir, hidratos) o solventes orgánicos comunes, y también se pretende que tales solvatos estén incluidos dentro del alcance de esta divulgación. El experto en la técnica entenderá que el término compuesto, como se usa en la presente, incluye compuestos solvatados de Fórmula (I).

Cuando los procesos para la preparación de los compuestos de acuerdo con la divulgación dan lugar a una mezcla de estereoisómeros, estos isómeros pueden separarse mediante técnicas convencionales como cromatografía preparativa. Los compuestos pueden prepararse en forma racémica, o los enantiómeros individuales pueden prepararse mediante síntesis enantioespecífica o mediante resolución. Los compuestos pueden, por ejemplo, resolverse en sus enantiómeros componentes mediante técnicas estándar como la formación de pares diastereoisómeros mediante la formación de sales con un ácido ópticamente activo como el ácido (-)-di-p-toluoil-dtartárico y/o el ácido (+)-di-p-toluoil-1-tartárico seguido de cristalización fraccionada y regeneración de la base libre. Los compuestos también pueden resolverse mediante la formación de ésteres diastereoméricos o amidas, seguido de separación cromatográfica y eliminación del auxiliar quiral. Alternativamente, los compuestos pueden resolverse usando una columna de HPLC quiral.

La presente divulgación está dirigida a una composición, incluyendo una composición farmacéutica, que comprende, consiste de y/o consiste esencialmente del enantiómero (+) de un compuesto de Fórmula (I) en donde dicha composición está sustancialmente libre del isómero (-) de dicho compuesto. En el presente contexto, sustancialmente libre significa menos de aproximadamente el 25%, preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 5%, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente el 2% e incluso más preferiblemente menos de aproximadamente el 1% del isómero (-) calculado como

(masa (+)- enantiómero) , ^

% (+) - enantiómero -------------- =----- --------- -------------------—--------- .--------- - x 100

(masa (+) - enantiómero) (masa(-) - enantiómero)

La presente divulgación proporciona una composición, incluyendo una composición farmacéutica, que comprende, consiste de y consiste esencialmente del enantiómero (-) de un compuesto de Fórmula (I) en donde dicha composición está sustancialmente libre del isómero (+) de dicho compuesto. En el presente contexto, sustancialmente libre de significa menos de aproximadamente el 25%, preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 5%, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente el 2% e incluso más preferiblemente menos de aproximadamente el 1% del isómero (+) calculado como

_{% (- ) - enantiómero =} (masa ( - ) - enantiómero)

■x 100

(masa (+) - enantiómero) (masa(~) - enantiómero)

Durante cualquiera de los procesos para la preparación de los compuestos de la presente divulgación, puede ser necesario y/o deseable proteger los grupos sensibles o reactivos en cualquiera de las moléculas implicadas. Esto puede lograrse por medio de grupos protectores convencionales como los descritos en Protective Groups in Organic Chemistry, Segunda Edición, J.F.W. McOmie, Plenum Press, 1973; T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991; y T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Tercera Edición, John Wiley & Sons, 1999. Los grupos protectores pueden eliminarse en una etapa posterior conveniente usando métodos conocidos en la técnica.

Incluso aunque los compuestos de la presente divulgación (incluyendo sus sales farmacéuticamente aceptables y solvatos farmacéuticamente aceptables) pueden administrarse solos, generalmente se administrarán mezclados con un portador farmacéuticamente aceptable, un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable seleccionados con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica o veterinaria estándar. Por tanto, aspectos particulares de la presente divulgación están dirigidos a composiciones farmacéuticas y veterinarias que comprenden compuestos de Fórmula (I) y por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable, un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable.

A modo de ejemplo, en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación, los compuestos de Fórmula (I) pueden mezclarse con cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante y combinaciones de los mismos adecuado.

Las formas de dosificación orales sólidas como comprimidos o cápsulas que contienen los compuestos de la presente invención pueden administrarse en por lo menos una forma de dosificación a la vez, según sea apropiado. También es posible administrar los compuestos en formulaciones de liberación sostenida.

Las formas orales adicionales en las que pueden administrarse los presentes compuestos inventivos incluyen elixires, soluciones, jarabes y suspensiones; cada uno de los cuales conteniendo opcionalmente agentes aromatizantes y colorantes.

Alternativamente, los compuestos de Fórmula (I) pueden administrarse por inhalación (intratraqueal o intranasal) o en forma de supositorio o pesario, o pueden aplicarse tópicamente en forma de loción, solución, crema, pomada o polvo para espolvorear. Por ejemplo, pueden incorporarse en una crema que comprende, consiste y/o consiste esencialmente de una emulsión acuosa de polietilenglicoles o parafina líquida. También pueden incorporarse, a una concentración de entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 10% en peso de la crema, en una pomada que comprende, consiste y/o consiste esencialmente de una base de cera o parafina blanda junto con cualquier estabilizante y conservantes según se requiera. Un medio alternativo de administración incluye la administración transdérmica usando un parche para la piel o transdérmico.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación (así como los compuestos de la presente divulgación solos) también pueden inyectarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía intracavernosa, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica o intratecal. En este caso, las composiciones también incluirán por lo menos uno de un portador adecuado, un excipiente adecuado y un diluyente adecuado.

Para la administración parenteral, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se usan mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales y monosacáridos para hacer que la solución sea isotónica con la sangre.

Además de las vías de administración descritas anteriormente para el tratamiento del cáncer, las composiciones farmacéuticas pueden adaptarse para la administración mediante inyección intratumoral o peritumoral. La activación del sistema inmunitario de esta manera para matar tumores en un sitio remoto se conoce comúnmente como efecto abscopal y se ha demostrado en animales con múltiples modalidades terapéuticas (van der Jeught, et al., Oncotarget, 2015, 6(3), 1359-1381). Una ventaja adicional de la administración local, intratumoral o peritumoral es la capacidad de lograr una eficacia equivalente a dosis mucho más bajas, minimizando o eliminando por tanto los eventos adversos que pueden observarse con dosis mucho más altas (Marabelle, A., et al., Clinical Cancer Research, 2014, 20(7), 1747-1756).

Para la administración bucal o sublingual, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en forma de comprimidos o pastillas para chupar, que pueden formularse de manera convencional.

A modo de ejemplo adicional, las composiciones farmacéuticas que contienen por lo menos uno de los compuestos de Fórmula (I) como ingrediente activo pueden prepararse mezclando el o los compuestos con un portador farmacéuticamente aceptable, un diluyente farmacéuticamente aceptable y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable de acuerdo con las técnicas convencionales de preparación de compuestos farmacéuticos. El portador, el excipiente y el diluyente pueden adoptar una amplia variedad de formas dependiendo de la vía de administración deseada (por ejemplo, oral, parenteral, etc.). Así, para preparaciones orales líquidas como suspensiones, jarabes, elixires y soluciones los portadores, excipientes y diluyentes adecuados incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes aromatizantes, conservantes, estabilizantes, agentes colorantes y similares; para preparaciones orales sólidas como polvos, cápsulas y comprimidos los portadores, excipientes y diluyentes adecuados incluyen almidones, azúcares, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares. Las preparaciones orales sólidas también pueden recubrirse opcionalmente con sustancias como azúcares, o recubrirse entéricamente para modular el sitio principal de absorción y disgregación. Para la administración parenteral, el portador, el excipiente y el diluyente habitualmente incluirán agua estéril, y pueden añadirse otros ingredientes para aumentar la solubilidad y la conservación de la composición. También pueden prepararse suspensiones o soluciones inyectables utilizando portadores acuosos junto con aditivos apropiados como solubilizantes y conservantes.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula (I) o una composición farmacéutica del mismo incluye un intervalo de dosificación de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 3000 mg, o cualquier cantidad particular o intervalo de la misma, en particular de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 1000 mg, o cualquier cantidad particular o intervalo de la misma, o, más particularmente, de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 250 mg, o cualquier cantidad particular o intervalo de la misma, de ingrediente activo en un régimen de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces al día para un humano medio (70 kg); aunque es evidente para un experto en la técnica que la cantidad terapéuticamente eficaz para un compuesto de Fórmula (I) variará según las enfermedades, síndromes, afecciones y trastornos que se estén tratando.

Para la administración oral, una composición farmacéutica se proporciona preferiblemente en forma de comprimidos que contienen aproximadamente 1,0, aproximadamente 10, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250 y aproximadamente 500 miligramos de un compuesto de Fórmula (I).

Ventajosamente, un compuesto de Fórmula (I) puede administrarse en una única dosis diaria, o la dosificación diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres y cuatro veces al día.

Las dosificaciones óptimas de un compuesto de Fórmula (I) a administrar pueden determinarse fácilmente y variarán con el compuesto particular usado, el modo de administración, la concentración de la preparación y el avance de la enfermedad, síndrome, afección o trastorno. Además, los factores asociados con el sujeto particular que se está tratando, incluyendo el sexo, la edad, el peso, la dieta y el momento de la administración del sujeto, darán como resultado la necesidad de ajustar la dosis para lograr un nivel terapéutico apropiado y el efecto terapéutico deseado. Las dosificaciones anteriores son, por tanto, ejemplares del caso medio. Puede haber, por supuesto, casos individuales en los que se requieran intervalos de dosificación más altos o más bajos.

Los compuestos de Fórmula (I) pueden administrarse en cualquiera de las composiciones y regímenes de dosificación anteriores o por medio de las composiciones y regímenes de dosificación establecidos en la técnica siempre que se requiera el uso de un compuesto de Fórmula (I) para un sujeto con necesidad de ello.

Como agonistas de la proteína STING, los compuestos de Fórmula (I) son útiles en métodos para tratar o prevenir una infección viral, enfermedad, síndrome, afección o trastorno en un sujeto, incluyendo un animal, un mamífero y un humano en el que el la infección viral, la enfermedad, el síndrome, la afección o el trastorno se ven afectados por la modulación, incluyendo el agonismo, de la proteína STING. Tales métodos comprenden, consisten y/o consisten esencialmente en administrar a un sujeto, incluyendo un animal, un mamífero y un humano, que necesita dicho tratamiento o prevención, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, sal o solvato de Fórmula (I).

La presente divulgación se refiere a un compuesto de Fórmula (I), o una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para el uso en el tratamiento del cáncer y enfermedades y afecciones del cáncer, o una infección viral.

Los ejemplos de enfermedades y afecciones cancerosas para las que los compuestos de Fórmula (I), o sales farmacéuticamente aceptables o solvatos de los mismos, pueden tener efectos antitumorales potencialmente beneficiosos incluyen, pero no se limitan a, cánceres de pulmón, hueso, páncreas, piel, cabeza, cuello, útero, ovarios, estómago, colon, mama, esófago, intestino delgado, intestino, sistema endocrino, glándula tiroides, glándula paratiroides, glándula suprarrenal, uretra, próstata, pene, testículos, uréter, vejiga, riñón o hígado; cáncer de recto; cáncer de la región anal; carcinomas de las trompas de Falopio, endometrio, cuello uterino, vagina, vulva, pelvis renal, célula renal; sarcoma de tejido blando; mixoma; rabdomioma; fibroma; lipoma; teratoma; colangiocarcinoma; hepatoblastoma; angiosarcoma; hemagioma; hepatoma; fibrosarcoma; condrosarcoma; mieloma; leucemia crónica o aguda; linfomas linfocíticos; linfoma primario del SNC; neoplasias del SNC; tumores del eje espinal; carcinomas de células escamosas; sarcoma sinovial; mesoteliomas pleurales malignos; glioma de tronco encefálico; adenoma pituitario; adenoma bronquial; hanlartoma condromatoso; inesotelioma; enfermedad de Hodgkin o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. Convenientemente, la presente divulgación se refiere a un método para tratar o disminuir la gravedad de cánceres seleccionados del grupo que consiste de cerebro (gliomas), glioblastomas, astrocitomas, glioblastoma multiforme, síndrome de Bannayan-Zonana, enfermedad de Cowden, enfermedad de Lhermitte-Duclos, tumor de Wilm, sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma, ependimoma, meduloblastoma, cabeza y cuello, riñón, hígado, melanoma, ovario, páncreas, adenocarcinoma, madenocarcinoma ductal, carcinoma adenoescamoso, carcinoma de células acinares, glucagonoma, insulinoma, próstata, sarcoma, osteosarcoma, tumor de células gigantes del hueso, tiroides, leucemia linfoblástica de células T, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia neutrofílica crónica, leucemia linfoblástica aguda de células T, plasmocitoma, leucemia inmunoblástica de células grandes, leucemia de células del manto, mieloma múltiple, leucemia megacarioblástica, mieloma múltiple, leucemia megacariocítica aguda, leucemia promielocítica, eritroleucemia, linfoma maligno, linfoma de hodgkin, linfoma no hodgkin, linfoma de células T linfoblásticas, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, neuroblastoma, cáncer de vejiga, cáncer urotelial, cáncer de vulva, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer renal, mesotelioma, cáncer de esófago, cáncer de glándulas salivales, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer nasofarángico, cáncer bucal, cáncer de boca, GIST (tumor del estroma gastrointestinal) y cáncer testicular.

La presente divulgación proporciona un compuesto de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno afectado por el agonismo de STING seleccionado del grupo que consiste de melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, fibrosarcoma y hepatitis B.

Los compuestos divulgados de Fórmula (I) pueden ser útiles en combinación con uno o más compuestos adicionales útiles para tratar la infección por VHB. Estos compuestos adicionales pueden comprender otros compuestos divulgados y/o compuestos que se sabe que tratan, previenen o reducen los síntomas o efectos de la infección por VHB. Tales compuestos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la polimerasa del VHB, interferones, inhibidores de la entrada viral, inhibidores de la maduración viral, moduladores del ensamblaje de la cápside descritos en la bibliografía, inhibidores de la transcriptasa inversa, agentes inmunomoduladores, agonistas de TLR y otros agentes con mecanismos distintos o desconocidos que afectan el ciclo de vida del VHB o que afectan a las consecuencias de la infección por VHB.

En ejemplos no limitativos, los compuestos divulgados pueden usarse en combinación con uno o más fármacos (o una sal del mismo) seleccionados del grupo que comprende:

Inhibidores de la transcriptasa inversa del VHB e inhibidores de la ADN y la ARN polimerasa incluyendo, pero no limitados a, lamivudina (3TC, Zeffix, Heptovir, Epivir y Epivir-VHB), entecavir (Baraclude, Entavir), adefovir dipivoxil (Hepsara, Preveon, bis- POM PMEA), tenofovir disoproxil fumarato (Viread, TDF o PMPA); interferones que incluyen, pero no se limitan a, interferón alfa (IFN-a), interferón beta (IFN-p), interferón lambda (IFN-A) e interferón gamma (IFN-y);

inhibidores de la entrada viral;

inhibidores de la maduración viral;

moduladores de ensamblaje de la cápside como, pero no limitados a, BAY 41-4109;

inhibidores de la transcriptasa inversa;

agentes inmunomoduladores como agonistas de TLR; y

agentes de mecanismos distintos o desconocidos, como, pero no limitados a, AT-61 ((E)-N-(1-cloro-3-oxo-1-fenil-3-(piperidin-1-il)prop-1-en-2-il)benzamida), AT-130 ((E)-N-(1-bromo-1-(2-metoxifenil)-3-oxo-3-(piperidin-1-il)prop-1- en-2-il)-4-nitrobenzamida), y análogos de los mismos.

En una realización, el agente terapéutico adicional es un interferón. El término "interferón" o "IFN" se refiere a cualquier miembro de la familia de proteínas específicas de especies altamente homólogas que inhiben la replicación viral y la proliferación celular y modulan la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, los interferones humanos se agrupan en tres clases: Tipo I, que incluye interferón-alfa (IFN-a), interferón-beta (IFN-p) e interferón-omega (IFN-w), Tipo II, que incluye interferón-gamma (IFN-y), y Tipo III, que incluye interferón-lambda (IFN-A). Las formas recombinantes de interferones que se han desarrollado y están comercialmente disponibles están abarcadas por el término "interferón" como se usa en la presente. Los subtipos de interferones, como los interferones mutados o modificados químicamente, también están abarcados por el término "interferón" como se usa en la presente. Los interferones químicamente modificados pueden incluir interferones pegilados e interferones glicosilados. Los ejemplos de interferones también incluyen, pero no se limitan a, interferón-alfa-2a, interferón-alfa-2b, interferón-alfanl, interferón-beta-Ia, interferón-beta-Ib, interferón-lamda-1, interferón-lamda-2 e interferón-lamda-3. Los ejemplos de interferones pegilados incluyen interferón-alfa-2a pegilado e interferón alfa-2b pegilado.

Por consiguiente, en una realización, los compuestos de Fórmula (I) pueden administrarse en combinación con un interferón seleccionado del grupo que consiste de interferón alfa (IFN-a), interferón beta (IFN-p), interferón lambda (IFN-A), e interferón gamma (IFN-^y). En una realización específica, el interferón es interferón-alfa-2a, interferón-alfa-2b o interferón-alfa-nl. En otra realización específica, el interferón-alfa-2a o interferón-alfa-2b está pegilado. En una realización preferida, el interferón-alfa-2a es interferón-alfa-2a pegilado (PEGASYS). En otra realización, el agente terapéutico adicional se selecciona de terapias inmunomoduladoras o inmunoestimuladoras, que incluyen agentes biológicos que pertenecen a la clase de interferón.

Además, el agente terapéutico adicional puede ser un agente que altera la función de otra u otras proteínas virales esenciales o proteínas huésped requeridas para la replicación o persistencia del VHB.

En otra realización, el agente terapéutico adicional es un agente antiviral que bloquea la entrada o maduración viral o se dirige a la polimerasa del VHB como inhibidores de polimerasa nucleosídica o nucleotídica o no nucleos(t)ídica. En una realización adicional de la terapia de combinación, el inhibidor de la transcriptasa inversa o el inhibidor de la ADN o ARN polimerasa es zidovudina, didanosina, zalcitabina, ddA, estavudina, lamivudina, abacavir, emtricitabina, entecavir, apricitabina, atevirapina, ribavirina, aciclovir, famciclovir, valaciclovir, ganciclovir, valganciclovir, tenofovir, adefovir, PMPA, cidofovir, efavirenz, nevirapina, delavirdina o etravirina.

En una realización, el agente terapéutico adicional es un agente inmunomodulador que induce una respuesta inmunitaria natural limitada que lleva a la inducción de respuestas inmunitarias contra virus no relacionados. En otras palabras, el agente inmunomodulador puede efectuar la maduración de las células presentadoras de antígenos, la proliferación de células T y la liberación de citoquinas (por ejemplo, IL-12, IL-18, IFN-alfa, -beta y -gamma y TNF-alfa, entre otros).

En una realización adicional, el agente terapéutico adicional es un modulador de TLR o un agonista de TLR, como un agonista de TLR-7 o un agonista de TLR-9. En una realización adicional de la terapia de combinación, el agonista de TLR-7 se selecciona del grupo que consiste de SM360320 (9-bencil-8-hidroxi-2-(2-metoxi-etoxi)adenina) y AZD 8848 ([3-({[3-(6-amino-2-butoxi-8-oxo-7,8-dihidro-9H-purin-9-il)propil][3-(4-morfolinil)propil]amino}metil)fenil]acetato de metilo).

En cualquiera de los métodos proporcionados en la presente, el método puede comprender además administrar al individuo por lo menos una vacuna contra el VHB, un inhibidor nucleósido del VHB, un interferón o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la vacuna contra el VHB es por lo menos una de RECOMBIVAX HB, ENGERIX-B, ELOVAC B, GENEVAC-B o SHANVAC B.

En una realización, los métodos descritos en la presente comprenden además administrar por lo menos un agente terapéutico adicional seleccionado del grupo que consiste de análogos de nucleótidos/nucleósidos, inhibidores de entrada, inhibidores de fusión y cualquier combinación de estos u otros mecanismos antivirales.

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para tratar una infección por VHB en un individuo con necesidad de ello, que comprende reducir la carga viral del VHB administrando al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto divulgado solo o en combinación con un inhibidor de la transcriptasa inversa; y administrar además al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una vacuna contra el VHB. El inhibidor de la transcriptasa inversa puede ser por lo menos uno de zidovudina, didanosina, zalcitabina, ddA, estavudina, lamivudina, abacavir, emtricitabina, entecavir, apricitabina, atevirapina, ribavirina, aciclovir, famciclovir, valaciclovir, ganciclovir, valganciclovir, tenofovir, adefovir, PMPA, cidofovir, efavirenz, nevirapina, delavirdina o etravirina.

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para tratar una infección por VHB en un individuo con necesidad de ello, que comprende reducir la carga viral del VHB administrando al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto divulgado solo o en combinación con un oligonucleótido o agente de interferencia del ARN que se dirige a los ácidos nucleicos del VHB; y administrar además al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de vacuna contra el VHB. El oligonucleótido antisentido o el agente de interferencia de ARN posee suficiente complementariedad con los ácidos nucleicos objetivo del VHB para inhibir la replicación del genoma viral, la transcripción de los ARN virales o la traducción de proteínas virales.

En otra realización, el compuesto divulgado y el por lo menos un agente terapéutico adicional se formulan conjuntamente. En aún otra realización, el compuesto divulgado y el por lo menos un agente terapéutico adicional se administran conjuntamente. Para cualquier terapia de combinación descrita en la presente, puede calcularse el efecto sinérgico, por ejemplo, usando métodos adecuados como la ecuación sigmoidea-Emax (Holford & Scheiner, 19981, Clin. Pharmacokinet. ⁶ : 429-453), la ecuación de aditividad de Loewe (Loewe & Muischnek, 1926, Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326) y la ecuación del efecto mediano (Chou & Talalay, 1984, Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55). Cada ecuación mencionada anteriormente puede aplicarse a datos experimentales para generar un gráfico correspondiente para ayudar a evaluar los efectos de la combinación de fármacos. Los gráficos correspondientes asociados con las ecuaciones mencionadas anteriormente son la curva de concentración-efectoe, la curva de isobolograma y la curva de índice de combinación, respectivamente.

En una realización de cualquiera de los métodos de administración de terapias de combinación proporcionadas en la presente, el método puede comprender además monitorizar o detectar la carga viral del VHB del sujeto, en donde el método se lleva a cabo durante un período de tiempo que incluye hasta el momento en que el virus VHB es indetectable

Las abreviaturas usadas en la presente memoria descriptiva, particularmente los esquemas y ejemplos, son las siguientes:

ACN acetonitrilo

AcOH ácido acético glacial

ADDP dipiperidida azodicarboxílica

ac. acuoso

Bn o Bzl bencilo

BINAP ² ,² '-bis(difenilfosfino)-^{1 ,1} -binaftilo

Boc terc-butiloxicarbonilo

conc. concentrado

dba dibencilidenacetona

DBU 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno

DCC N,N'-diciclohexil-carbodiimida

DCE ¹ ,² -dicloroetano

DCM diclorometano

DEAD azodicarboxilato de dietilo

DIBAL hidruro de diisobutilaluminio

DIPEAo DIEA diisopropil-etilamina

DMA dimetilanilina

DMAP 4-dimetilaminopiridina

DME dimetoxietano

DMF N,N-dimetilformamida

DMSO dimetilsulfóxido

DMT 4,4'-dimetoxitritilo

DPPA difenilfosforilazida

dppf ^{1 ,1} '-bis(difenilfosfino)ferroceno

EA acetato de etilo

EDCI 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida

ESI ionización por electropulverización

EtOAc o EA acetato de etilo

EtOH etanol

GCMS cromatografía de gases-espectrometría de masas h o hr(s) hora u horas

HEK riñón embrionario humano

HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento

LAH hidruro de litio y aluminio

LDA diisopropilamida de litio

LHMDS bis(trimetilsilil)amida de litio

MEK metiletilcetona

MeOH metanol

MHz megahercios

min minuto o minutos

MS espectrometría de masas

Ms metanosulfonilo

NBS N-bromosuccinimida

NIS N-yodosuccinimida

NMM N-metilmorfolina

NMP N-metilpirrolidona

NMR resonancia magnética nuclear

PCC clorocromato de piridinio

PE éter de petróleo

RP fase inversa

ta o TA temperatura ambiente

Rt tiempo de retención

Seg segundo o segundos

SEM-Cl cloruro de ² -(trimetilsilil)etoximetilo

TBAF fluoruro de tetrabutilamonio

TBDMS t-butildimetilsililo

TBP fosfato de tributilo

TEA o Et³N trietilamina

TFA ácido trifluoroacético

THF tetrahidrofurano

TIPS triisopropilsililo

TLC cromatografía de capa fina

TMS tetrametilsilano

Ts 4-toluenosulfonilo

Ejemplos específicos

El esquema de reacción ilustrado en el Ejemplo de referencia 1 describe una ruta posible para la preparación del compuesto ¹ , y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ejemplo de referencia 1

Compuesto 1

Paso 1: Preparación del compuesto 1f

A una solución del compuesto 1e (Journal of Heterocycle Chemistry 1993, 30: 1213-1220) (5 g, 14,7 mmol) en piridina (80,0 ml) se le añadió TMSCl (9,61 g, 88,4 mmol) a 0° C. La mezcla de reacción se agitó a 0° C durante 0,5 h. Se añadió gota a gota cloruro de benzoílo (2,49 g, 17,7 mmol) a 0° C. Después de 5 min, la mezcla se calentó hasta ta y se agitó a 25° C durante 1,5 h. La mezcla se diluyó con agua (5 ml) a 0° C y se añadió gota a gota NH³.H²O (25%, 7, 5 ml). Luego, la mezcla de la reacción se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH = 50:1 a 5:1) para proporcionar el compuesto 1f (1,05 g, 1,08 mmol) como un sólido blanco.

1H NMR (400 MHz, DMSO d⁶ ) ⁸ 10.86 (s, 1H), 8.59 (d, J=4.8 Hz, 1H), 8.04 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.76-7.37 (m, 2H), 7.65-7.61 (m, 1H), 7.56-7.53 (m, 2H), 5.28 (d, J=^{6 .8} Hz, 1H), 5.12 (d, J=4.8 Hz, 1H), 5.07-5.02 (m, 2H), 4.30­ 4.25 (m, 1H), 4.06-4.05 (m, 1H), 3.94-3.93 (m, 1H), 3.39 (bar, 2H); 13C NMR (400 MHz, DMSO d⁶ ) ⁸ 165.7, 144.0, 136.4, 133.7, 132.9, 132.1, 128.5, 128.0, 126.9, 125.8, 117.6, 86.0, 74.8, 73.2, 71.2, 61.6; ESI-MS m/z 371 (M+1)+. Paso 2: Preparación del compuesto 1g

A una solución del compuesto 1f (550 mg, 1,485 mmol) en DMF (10,0 ml) se le añadió bis(trifluorometanosulfonato) de di-terc-butilsilanodiilo (1,31 g, 2,97 mmol) a 0° C. La mezcla de la reacción se agitó a 0° C durante 1 h. Se añadió 1H-imidazol (505,49 mg, 7,42 mmol) en una porción a 0° C. Después de 5 min, la mezcla se agitó a 25° C durante 30 min. La mezcla se diluyó con DCM (30 ml) y se lavó con agua/salmuera = 1/1 (20 ml x 2) y salmuera (20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc = 10/1 a 1/1) para proporcionar el compuesto 1g (670 mg, 1,281 mmol) como una espuma blanca.

1H NMR (400 MHz, CDCla) 9.49 (s, 1H), 8.09-7.96 (m, 2H), 7.90-7.84 (m, 1H), 7.84-7.78 (m, 1H), 7.67-7.47 (m, 4H), 5.34-5.23 (m, 1H), 4.57 (d, J=5.2 Hz, 1H), 4.49 (dd, J=5.2, 9.2 Hz, 1H), 4.16-4.06 (m, 1H), 4.03-3.92 (m, 2H), 1.06 (d, J=0.8 Hz, 18H); ESI-MS m/z 511.2 (M+1)+.

Paso 3: Preparación del compuesto 1h

A una solución del compuesto 1g (2,53 g, 4,95 mmol) en DMF (50 ml) se le añadió imidazol (2,024 g, 29,72 mmol) y terc-butilclorodimetilsilano (2,24 g, 14,86 mmol) a 0° C. La mezcla se agitó a 60° C durante 12 h. La mezcla se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con NaHCO³ (50 ml), agua (50 ml) y salmuera (50 ml). La capa orgánica se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc = 10/1 a 3/1) para proporcionar el compuesto 3 (2,86 g, 4,577 mmol) como un sólido blanco.

¹H NMR (400 MHz, CDCh) 9.47 (s, 1H), 8.02 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.93-7.75 (m, 2H), 7.68-7.45 (m, 4H), 5.17 (s, 1H), 4.66 (d, J=5.0 Hz, 1H), 4.45 (dd, J=5.3, 9.3 Hz, 1H), 4.21-4.15 (m, 1H), 3.92 (dd, J=5.3, 9.8 Hz, 1H), 3.85 (t, J=9.8 Hz, 1H), 1.05 (d, J=2.5 Hz, 18H), 0.92 (s, 9H), 0.15 (d, J=7.5 Hz, ⁶ H); ESI-MS m/z 625.7 (M+1)+.

Paso 4: Preparación del compuesto 1i

Se diluyó cuidadosamente hidrofluoruro de piridina (1,65 ml, 18,306 mmol) con piridina (12 ml) y luego se añadió gota a gota a una solución del compuesto 1h (2,86 g, 4,57 mmol) en THF (45 ml) a 0° C. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 5 min. La mezcla de la reacción se inactivó mediante la adición de piridina (12 ml) y se diluyó con CH²Cl² (50 ml), se lavó con salmuera (50 ml x 2), se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc =10/1 a 0/1) para dar el compuesto 1i (2,04 g, 4,21 mmol) como un sólido blanco.

¹H NMR (400 MHz, CDCh) 9.52 (s, 1H), 8.29 (d, J=4.5 Hz, 1H), 8.04 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.77 (d, J=4.5 Hz, 1H), 7.64-7.58 (m, 2H), 7.57-7.49 (m, 2H), 5.09 (d, J=8.0 Hz, 1H), 4.51 (dd, J=5.5, 8.0 Hz, 1H), 4.30-4.16 (m, 2H), 4.04-3.85 (m, 2H), 3.49 (s, 1H), 2.82 (d, J=2.5 Hz, 1H), 2.19 (br, s, 1H), 0.83 (s, 9H), -0.12 (s, 3H), -0.27 (s, 3H). ESI-MS m/z 485.1 (M+1)+.

Paso 5: Preparación del compuesto 1j

A una solución del compuesto 1i (1,84 g, 3,797 mmol) en piridina (20 ml) se le añadió DMTrCl (1,93 g, 5,695 mmol) a 25° C. La mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 12 h. La mezcla de la reacción se inactivó mediante la adición de MeOH (2,0 ml), se diluyó con EA (100 ml) y se lavó con salmuera (50 ml x 3), se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida hasta dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc = 10/1 a 1/1) para dar el compuesto 1j (1,35 g, 1,715 mmol) como una espuma blanca.

¹H NMR (400 MHz, CDCla) 9.47 (s, 1H), 8.35 (d, J=4.4 Hz, 1H), 8.03 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.65-7.57 (m, 2H), 7.56-7.49 (m, 2H), 7.41 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.34-7.20 (m, 9H), 7.04 (d, J=5.0 Hz, 1H), 6.85-6.78 (m, 4H), 5.09 (d, J=8.5 Hz, 1H), 4.76 (dd, J=5.5, 8.5 Hz, 1H), 4.44 (d, J=5.0 Hz, 1H), 4.27 (d, J=1.5 Hz, 1H), 3.78 (d, J=2.0 Hz, ⁶ H), 3.50 (d, J=2.0 Hz, 2H), 2.88 (d, J=1.5 Hz, 1H), 0.84 (s, 9H), -0.14 (s, 3H), -0.31 (s, 3H); ESI-MS m/z 787.3 (M+1)+. Paso ⁶ : Preparación del compuesto 1l

A una solución del compuesto 1j (600 mg, 0,762 mmol) en THF (6,0 ml) se le añadió N,N-diisopropiletilamina (591,2 mg, 4,57 mmol) y N,N-diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo (541,333 mg, 2,28 mmol) a 0° C. Luego, la mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 2 h.

A una solución del compuesto 1j (930 mg, 1,18 mmol) en THF (10,0 ml) se le añadió N,N-diisopropiletilamina (916,37 mg, 7,09 mmol) y N,N-diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo (839,06 mg, 3,54 mmol) a 0° C. Luego, la mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 2 h. La mezcla de la reacción se combinó con la primera reacción y la mezcla combinada se inactivó mediante la adición de MeOH (5 ml) y se diluyó con EA (50 ml). La capa orgánica se lavó con NaHCO³ (20 ml) y salmuera (20 ml), se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc = 10/1 a 3/1) para proporcionar el compuesto 1l (1,76 g, 1,78 mmol) como un aceite amarillo.

³¹P NMR (162 MHz, CDCls) 151.467 (s, 1P), 148.337 (s, 1P); ESI-MS m/z 904.4 (M-(N(iPr)²+OH))+.

Paso 7: Preparación del compuesto 1m

A una solución del compuesto 1l (1,76 g, 1,783 mmol) en CH³CN (10,0 ml) y agua (64,236 ul, 3,56 mmol) se añadió trifluoroacetato de piridinio (413,16 mg, 2,14 mmol). Después de 5 min, se añadió terc-butilamina (10,0 ml) y la mezcla de la reacción se agitó durante 15 min a temperatura ambiente. La mezcla se concentró a presión reducida para dar una espuma blanca. El residuo se disolvió en CH³CN (10,0 ml) y se concentró para proporcionar una espuma, y este proceso se repitió una vez más para dar el compuesto 1m (1,82 g, bruto) como una espuma blanca, que se usó para el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso ⁸ : Preparación del compuesto 1n

A una solución del compuesto 1m (1,82 g, bruto) en CH²Ch (24 ml) se le añadió agua (385,3 mg, 21,387 mmol), seguido de ácido dicloroacético al ⁶ % en CH²Ch (24 ml). La mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 30 min. Se añadió piridina (10 ml) para inactivar la reacción y la mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 30 min. En ese momento, la mezcla de la reacción se concentró a presión reducida para dar un residuo, que se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (CH²Ch/MeOH = 100/1 a 5/1) para proporcionar el compuesto 1n (910 mg, 1,66 mmol) como una espuma blanca.

¹H NMR (400 MHz, CD³OD) 8.85 (d, J=4.6 Hz, 1H), 8.11 (d, J=7.3 Hz, 2H), 7.83 (s, 1H), 7.73-7.61 (m, 2H), 7.61-7.51 (m, 2H), 6.19 (s, 1H), 6.00 (s, 1H), 5.26 (d, J=9.0 Hz, 1H), 4.74 (dd, J=5.0, 10.5 Hz, 1H), 4.61 (dd, J=5.2, 8.7 Hz, 1H), 4.33 (s, 1H), 3.96-3.88 (m, 1H), 3.84-3.75 (m, 1H), 0.76 (s, 9H), -0.09 (s, 3H), -0.39 (s, 3H); ESI-MS m/z 549.1 (M+1)+.

Paso 9: Preparación del compuesto 1p

Se agitó una solución del compuesto 1n (910 mg, 1,659 mmol) y tamices moleculares 4Á en acetonitrilo seco (30 ml) a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 3 min. Se añadió perclorato de 1H-imidazol (5,14 g, 30,52 mmol). Después de 10 min, se añadió (2R,3R,4R,5R)-5-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-4-((tercbutildimetilsilil)oxi)-2-(2-isobutiramido-6-oxo-1H-purin-9(6H)-il)tetrahidrofuran-3-il (2-cianoetil)diisopropilfosforamidita, 1o (1,77 g, 1,825 mmol) en MeCN (15 ml) a 25° C. la mezcla se agitó a 25° C durante 50 min. La mezcla de la reacción (0,03687 M en MeCN, 45 ml) se usó para el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso 10: Preparación del compuesto 1q

A una solución del compuesto 1p (0,03687 M en MeCN, 45 ml) se le añadió hidroperóxido de terc-butilo (1,510 ml, 8,303 mmol) a 25° C. La mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante ¹ h. La mezcla de la reacción se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa (neutra, columna: Waters Xbridge 150x25 504; fase móvil: agua (NH⁴HCO³ 10 mM)-ACN, B%: 33%-53%, 25 ml/min, Tiempo de gradiente: ⁸ min) para proporcionar el compuesto 1q (602 mg, 0,532 mmol) como un sólido blanco.31

³¹P NMR (162 MHz, CD³OD) 4.05 (s, 1P), 3.92 (s, 1P), -2.20 (s, 1P), -2.98 (s, 1P); ESI-MS m/z 1131.1 (M+1)+.

Paso 11: Preparación del compuesto 1r

A una solución del compuesto 1q (600 mg, 0,53 mmol) y tamices moleculares 4Á en piridina (150 ml) se le añadió DMOCP (293,669 mg, 1,591 mmol) a 25° C. La mezcla se agitó a 25° C durante 1 H. La mezcla de la reacción (0,00353 M en Py, 150 ml) se usó para el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso 12: Preparación del compuesto 1s

A una solución del compuesto 1r (0,00353 M en Py, 150 ml) se le añadió agua (95,48 mg, 5,30 mmol) y I2 (672,594 mg, 2,65 mmol, 5,0 eq) a 25° C. La mezcla se agitó a 25° C durante 1 h. La reacción se inactivó con Na²SO³ acuoso (50 ml). La mezcla se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (columna: Agela Durashell C18 150x25 5 pM; fase móvil: agua (10 mM NH⁴HCO³)-CH³CN del 35% al 55%, caudal: 25 ml/ min) para proporcionar el compuesto 1s (285 mg, 0,25 mmol) como un sólido blanco.

ESI-MS m/z 1130.1 (M+1)+.

Paso 13: Preparación del compuesto 1t

Se agitó el compuesto 1s (120 mg, 0,106 mmol) en MeNH² (33% en EtOH, 10 ml) a 25° C durante 16 h. La mezcla de la reacción se concentró a presión reducida para dar el compuesto 1t bruto (125 mg) como un sólido amarillo, que se usó para el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso 14: Preparación del compuesto 1, sal de trietilamonio

A una solución del compuesto 1t (125 mg, bruto) en Py (5 ml) se le añadió Et³N (1,402 g, 13,86 mmol) y trihidrofluoruro de trietilamina (1,117 g, 6,929 mmol, 50,0 eq) a 25° C. La mezcla de la reacción se agitó a 50° C durante 12 h. La mezcla se disolvió en THF (3 ml) y se añadió isopropoxitrimetilsilano (3,66 g, 27,71 mmol) a 25° C y se agitó durante 12 h. La mezcla se concentró a presión reducida para dar un residuo (108 mg, bruto) como un sólido marrón, recogido como lote 1.

A una solución del compuesto 1t (183 mg, bruto) en Py (6 ml) se le añadió trietilamina (2,05 g, 20,29 mmol) y trihidrofluoruro de trietilamina (1,63 g, 10,145 mmol) a 25° C. La mezcla de la reacción se agitó a 50° C durante 12 h. La mezcla se disolvió en THF (5 ml) y se añadió isopropoxitrimetilsilano (5,36 g, 40,58 mmol) a 25° C y se agitó durante 12 h. La mezcla se concentró a presión reducida para dar un residuo como lote 2. El lote 2 se combinó con el lote 1 y se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (columna: Agela Durashell C18150x255 pM; fase móvil: agua (0,05% de hidróxido de amoníaco v/v)-ACN del 0% al 15%, caudal: 35 ml/min) para proporcionar el compuesto 1, sal de trietilamonio (125 mg, 0,186 mmol) como un sólido blanco. ¹H NMR (400 M^hz , D²O) 7.77 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.50-7.16 (m, 2H), 5.86 (d, J=7.5 Hz, 1H), 5.74 (s, 1H), 5.13 (s, 1H), 4.90 (s, 1H), 4.54-4.42 (m, 2H), 4.32 (br s, 1H), 4.21 (br, d, J=8.5 Hz, 4H), 3.87 (d, J=11.5 Hz, 1H); ESI-MS m/z 674.0 (M+1)+.

Paso 15: Preparación del compuesto 1, sal de sodio

El compuesto 1, sal de trietilamonio, se secó a vacío alto para dar un sólido blanco (125 mg). Se añadió Dowex 50Wx8, 200-400 (forma H, 10 ml) a un vaso de precipitados (para 125 mg del compuesto 1, sal de trietilamonio) y se lavó con agua desionizada (2x). Luego a la resina se le añadió H²SO⁴ al 15% en H²O desionizada (50 ml) y la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H² SO⁴ al 15% en H²O desionizada y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 CV), y luego con H²O desionizada hasta que se volvió neutra. La resina se transfirió de nuevo al vaso de precipitados y se añadió NaOH al 15% en solución de H²O desionizada (50 ml) y la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en H²O desionizada (por lo menos 4 CV), y luego con H²O desionizada hasta que se volvió neutra (por lo menos 4 CV). El compuesto 1, sal de trietilamonio, se disolvió en H²O desionizada (125 mg en 10 ml), se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con H²O desionizada. La sal de sodio convertida se eluyó en las primeras fracciones. detectado por TLC (UV). El producto se liofilizó para dar el compuesto 1, sal de sodio (85 mg, 0,117 mmol) como un sólido blanco. ¹H NMR (400 MHz, CD³OD) 8.01 (s, 1H), 7.74 (d, J=5.0 Hz, 2H), 7.26 (s, 1H), 6.02 (br d, J=8.5 Hz, 1H), 5.28 (s, 1H), 5.10 (s, 1H), 4.62 (t, J=4.3 Hz, 1H), 4.56 (d, J=3.5 Hz, 1H), 4.45-3.99 (m, 6H), 3.86 (d, J=11.5 Hz, 1H); ³¹P NMR (162 MHz, CD³OD) 0.63 (s, 1P), -2.91 (s, 1P); ESI-MS m/z 673.9 (M+1)+.

Ejemplo 2

C om puesto 2

Compuesto 2, sal de amonio

Paso 1: Preparación del compuesto 2j

A una solución de 2i (WO2013179289) (2 g, 5,39 mmol) en DMF (20 ml) se le añadió gota a gota bis(trifluorometanosulfonato) de di-terc-butilsilanodiilo (2,61 g, 5,92 mmol) a 0° C en N². Después de 1 h, se añadió imidazol (458,32 mg, 6,73 mmol) en una porción a 0° C. Después de 5 min, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 25 min. La mezcla se diluyó con CH²Ch (100 ml) y se lavó con agua. La capa orgánica se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se recristalizó en CH³CN y CH²Ch para dar el compuesto 2j (2,1 g, 4,10 mmol, bruto) como un sólido blanco.

Paso 2: Preparación del compuesto 2k

Se agitó una solución de 2j (2,1 g, 4,10 mmol), imidazol (2,24 g, 32,84 mmol) y TBSC1 (2,78 g, 18,47 mmol) en DMF (20 ml) a 60° C durante 3 h. La mezcla se inactivó con agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua, se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (CH²Ch: MeOH = 20:1) para proporcionar el compuesto 2k (2,22 g, 3,54 mmol) como un sólido blanco.

Paso 3: Preparación del compuesto 2l

Se agitó una solución de 2k (2,52 g, 4,03 mmol) en CH²Ch (30 ml) a 0° C. A la mezcla se le añadió fluoruro de piridinio (1,64 ml, 18,15 mmol) y la reacción se agitó a ta durante ⁸ H. La mezcla se inactivó con agua y se extrajo con CH²Cl². La capa orgánica se lavó con agua, se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (CH2Ch: MeOH = 10:1) para proporcionar el compuesto 2l (1,60 g, 3,3 mmol) como un sólido blanco.

Paso 4: Preparación del compuesto 2m

Se agitó una solución de 2l (2,34 g, 4,81 mmol) en piridina (23 ml) a temperatura ambiente, a la que se le añadió 4,4'-(cloro(fenil)metileno)bis(metoxibenceno) (3,26 g, 9,62 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se inactivó con agua y se extrajo con C^Ch. La capa orgánica se lavó con agua, se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (CH²Ch: MeOH = 10:1) para proporcionar 2m (3,59 g, 4,56 mmol) como un sólido amarillo.

Paso 5: Preparación del compuesto 2n

A una solución de 2m (500 mg, 0,64 mmol) y DIPEA (246,0 mg, 1,90 mmol) en THF (1,56 ml) se le añadió 3-((cloro(diisopropilamino)fosfino)oxi)propanonitrilo (450,5 mg, 1,90 mmol) a 15° C. La mezcla se agitó ata durante 1 h. Se añadió agua a la mezcla y la mezcla se extrajo con CH²Cl². Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (éter de petróleo:EtoAc=¹ :² ) para proporcionar el compuesto 2n (498 mg, 0,55 mmol) como un aceite amarillo. ¹H NMR (400 MHz, CDCh) 10.28 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.42-8.33 (m, 2H), 7.93-7.77 (m, ⁶ H), 7.66 (t, J=8.4 Hz, 4H), 7.59 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.52-7.43 (m, 1H), 7.11 (d, J=8.4 Hz, 4H), 5.55-5.40 (m, 1H), 5.41-5.35 (m, 1H), 5.09 (s, 1H), 4.62 (s, 1H), 4.59-4.36 (m, 2H), 4.05 (s, ⁶ H), 3.87­ 3.81 (m, 1H), 3.57-3.53 (m, 1H), 3.01-2.90 (m, 2H), 1.03 (s, 9H), 0.31 (s, 3H), 0.00 (s, 3H); ESI-MS m/z 927.8 (M+Na)+.

Paso 6: Preparación del compuesto 2o

A una solución de 2n (813 mg, 0,898 mmol) en agua y acetonitrilo se le añadió trifluoroacetato de piridinio (208,18 mg, 1,078 mmol) a temperatura ambiente. Se añadió t-butilamina (3,44 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 20 min. La mezcla se concentró para proporcionar el producto 2o bruto (836,39 mg, 0,898 mmol, bruto) como un sólido amarillo, que se coevaporó con C ^C h (3x) y se usó directamente para el paso siguiente.

Paso 7: Preparación del compuesto 2p

A una solución de 2o (836,39 mg, 0,898 mmol) en agua y CH²Ch se le añadió ácido dicloroacético (407,149 mg, 3,158 mmol) a temperatura ambiente durante 0,5 h. Se añadió piridina (0,145 ml, 1,80 mmol). Después de 10 min, la mezcla se concentró y el residuo resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, CH²Ch:MeOH=1:0 a 5:1) para proporcionar el compuesto 2p (467,2 mg, 0,744 mmol) como un sólido blanco.

Paso 8: Preparación del compuesto 2r

Se agitó una solución de 2p (467,2 mg, 0,744 mmol) y tamices moleculares 4Á (0,5 g) en CH³CN (27 ml) a temperatura ambiente en atmósfera de argón durante 3 min. Se añadió perclorato de imidazol (2,51 g, 14,89 mmol). Después de 10 min, se añadió (2R,3R,4R,5R)-5-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2-(2-isobutiramido-6-oxo-1H-purin-9(6H)-il)tetrahidrofuran-3-il(2-cianoetil)diisopropilfosforamidita, 1o (866,53 mg, 0,89 mmol) en CH³CN. La mezcla se agitó a 26° C durante 1 hora. Se añadió hidroperóxido de terc-butilo (0,74 ml, 3,72 mmol). La mezcla final se agitó a 26° C durante 1 hora. La mezcla se concentró y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa para proporcionar 2 fracciones del producto deseado 2r (62,7 mg, 0,054 mmol y 99,4 mg, 0,076 mmol) como un sólido blanco. ESI-MS m/z 1132.7 (M+H)+.

Paso 9: Preparación del compuesto 2t

A una solución de 2r (99,4 mg, 0,088 mmol) y tamices moleculares 4Á en piridina (43 ml) se le añadió DMOCP (48,61 mg, 0,263 mmol) a temperatura ambiente en atmósfera de argón. La mezcla se agitó a 26° C durante 1 h. Se añadieron agua (15,81 mg, 0,87 mmol) e I² (111,41 mg, 0,44 mmol). La mezcla de la reacción se agitó a 26° C durante 1 hora. La reacción se inactivó con una solución de Na²SO³ (sat.). La mezcla se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un producto bruto que se purificó por HPLC preparativa de fase inversa para dar el compuesto 2t (50 mg, 0,044 mmol) como un sólido blanco. ESI-MS m/z 1130.4 (M+H)+.

Paso 10: Preparación del compuesto 2u y el compuesto 2v

Se trató el compuesto 2t (50 mg, 0,044 mmol) con una solución de MeNH² en EtOH (33%, 20 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de la reacción se concentró a presión reducida para dar los compuestos 2u y 2v (40 mg, 0,044 mmol), que se usaron para el paso siguiente sin purificación. ESI-MS m/z compuesto 2u 903.3; compuesto 2v 917.2 (M+H)+.

Paso 11: Preparación del compuesto 2

A una solución de los compuestos 2u y 2v (40 mg, 0,044 mmol) en piridina (1,95 ml) se le añadió trietilamina (537,20 mg, 5,31 mmol) y fluoruro de trietiliamonio (427,92 mg, 2,65 mmol). La mezcla se agitó a 50° C durante 10 h. Se añadió isopropoxitrimetilsilano (1,76 g, 13,27 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se concentró y el residuo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa para proporcionar la sal de amonio del compuesto 2 (11,7 mg, 0,017 mmol), cada una como un sólido blanco. Compuesto 2: ¹H NMR (400 MHz, D²O) 8.12-7.95 (m, 3H), 5.92 (d, J=8.4 Hz, 1H), 5.47 (d, J=3.6 Hz, 1H), 5.27 (d, J=5.2 Hz, 1H), 4.98­ 4.81 (m, 1H), 4.59-4.44 (m, 2H), 4.37 (s, 1H), 4.31-4.15 (m, 3H), 4.14-4.07 (m, 1H), 4.02 (br d, J=10.4 Hz, 1H), 3.12 (d, J=4.4 Hz, 3H).

Paso 12: Preparación de la sal de sodio del compuesto 2

Se añadió un volumen de 10 ml de Dowex 50Wx 8, 200-400 (forma H) a un vaso de precipitados (para 11,7 mg de sal de amonio del compuesto 2) y se lavó con H²O DI (2x). Luego a la resina se le añadió H²SO⁴ al 15% en H²O DI (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en H²O DI y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 CV), y luego con H²O DI hasta que se volvió neutra. La resina se volvió a transferir al vaso de precipitados y se añadió NaOH al 15% en solución de H²O DI (50 ml), y la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en H²O DI (por lo menos 4 CV), y luego con H ² O hasta que se volvió neutra (por lo menos 4 CV). Se disolvió A en agua DI (11,7 mg en 5 ml), se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con H²O DI. El compuesto 7 se eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para dar la sal sódica del compuesto 2 (8,8 mg, 0,012 mmol) como un sólido blanco. ¹H Nm R (400 MHz, D²O) 8.06 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 5.90 (d, J=8.4 Hz, 1H), 5.47 (d, J=4.0 Hz, 1H), 5.27 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.58-4.50 (m, 1H), 4.36 (s, 1H), 4.29-4.22 (m, 2H), 4.29-4.22 (m, 1H), 4.17 (s, 1H), 4.14-4.08 (m, 1H), 4.03 (d, J=12.0 Hz, 1H), 3.10 (s, 3H); ³¹P NMR (162 MHz, D²O) -1.13, -1.75; ESI-MS m/z ^{688 .8} (M+H)+.

El esquema de reacción ilustrado en el Ejemplo 3 de referencia describe una ruta posible para la preparación del compuesto 3, y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ejemplo de referencia 3

Compuesto 3

Compuesto 3, sal de amonio

Compuesto 3, sal de amonio Compuesto 3, sal de sodio El esquema de reacción ilustrado en el Ejemplo de referencia 4 describe una ruta posible para la preparación del compuesto 4, y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ejemplo de referencia 4

Ejemplo de referencia 5

Paso 1: Preparación del compuesto 5b

A una solución del compuesto 5a (10,0 g, 33,64 mmol) en piridina (250 ml) se le añadió gota a gota TMSCI (18,27 g, 168,20 mmol) a 0° C; después de agitar a 15° C durante 1 h, se añadió gota a gota cloruro de isobutirilo (4,30 g, 40,37 mmol) a 15° C. Después de agitar a 15° C durante 2 h, la mezcla se inactivó con H²O (50 ml) a 0° C y se añadió NH³.H²O (50 ml) a 0° C. Después de 10 min, la mezcla se agitó a 15° C durante 0,5 h. Se repitió el procedimiento anterior (escala de 20 g del compuesto 5a) y se combinaron las dos mezclas de reacción. Luego, las mezclas se concentraron a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (DCM/MeOH = 100/1 a 10/1) para proporcionar el compuesto 5b (25,5 g) como un sólido blanco.

Paso 2: Preparación del compuesto 5c

A una solución del compuesto 5b (24,5 g, 66,69 mmol) en piridina (500 ml) se le añadió cloruro de dimetoxitritilo (24,85 g, 73,36 mmol) a ⁰ ° C. Después de agitar a 25° C durante ² h, la solución se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se diluyó con acetato de etilo (500 ml) y se lavó con agua (300 ml x 3). La capa orgánica se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se combinó con otro lote (generado a partir de una escala de 2 g del compuesto 5b) y se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (DCM/MeOH=100/1 a 10/1) para proporcionar el compuesto 5c (30,0 g) como un sólido amarillo. LCMS: m/z 670.2 [M+H]+.

Paso 3: Preparación del compuesto 1o

A una solución del compuesto 5c (1 g, 1,49 mmol) en THF (20 ml) se le añadió N-etil-N-isopropilpropan-2-amina (1,16 g, 8,96 mmol) y 3-((cloro(diisopropilamino)- fosfino)oxi)propanonitrilo (1,11 g, 4,48 mmol, 3 eq.) a 0° C. Después de agitar durante 2 h a 25° C, la mezcla de la reacción se inactivó añadiendo agua (30 ml) y se diluyó con acetato de etilo (30ml). La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (20 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y se concentraron bajo presión para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida

(DCM/EA =10/1 a 2/1) para proporcionar el compuesto 1o (0,99 g) como un sólido blanco. LCMS:ESI-MS: m/z 787.4 [M+H]+.

Paso 4: Preparación del compuesto 5d

A una solución del compuesto 1o (0,99 g, 1,14 mmol) en acetonitrilo (7 ml) se le añadió agua (0,041 g, 2,28 mmol) y trifluoroacetato de piridinio (0,263 g, 1,37 mmol). Se añadió terc-butilamina (7 ml) y la mezcla de la reacción se agitó durante 15 min a 25° C. Luego, la mezcla se concentró a presión reducida para dar una espuma. La espuma se disolvió en CH³CN (^{10 ,0} ml), se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto 5d (0,925 g) como una espuma blanca que se usó en el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso 5: Preparación del compuesto 5e

A una solución del compuesto 5d (0,925 g, 1,14 mmol) en diclorometano (20 ml) y agua (0,205 g, 11,38 mmol) se le añadió ácido 2,2-dicloroacético (20 ml, ⁶ % en DCM). Después de agitar a 25° C durante 20 min, la mezcla se inactivó con piridina (3 ml) y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (DCM/MeOH = 10/1 a 5/1) para proporcionar el compuesto 5e (0,43 g, 0,84 mmol) como una espuma blanca. LC-MS: ESI-MS: m/z 432.2 [M H]+.

Paso ⁶ : Preparación del compuesto 5g

A una solución del compuesto 5f (4 g, 10,83 mmol) en piridina (40 ml) se le añadió 4,4'-(cloro(fenil)metilen)bis(metoxibenceno) (4,4 g, 12,99 mmol) a 25° C. Después de agitar a 25° C durante 2 h, la mezcla de la reacción se inactivó con metanol (5 ml) y luego se concentró a presión reducida para producir un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (DCM/MeOH = 50/1 a 20/1) para dar el compuesto 5g (6,3 g) como una espuma amarilla. LCMS:ESI-MS: m/z 672.3 [M H]+.

Paso 7: Preparación del compuesto 5h

A una solución del compuesto 5g (0,5 g, 0,74 mmol) en N,N-dimetilformamida ^{( 8} ml) se le añadió tercbutilclorodimetilsilano (0,17 g, 1,12 mmol) y 1H-imidazol (0,15 g, 2,23 mmol) a 25° C. Después de agitar a 25° C durante 12 h, la mezcla de la reacción se inactivó con metanol (2 ml) y se diluyó con acetato de etilo (40 ml); la capa orgánica se lavó sucesivamente con H²O ^{( 20} ml x ² ), salmuera ^{( 20} ml), se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (DCM/MeOH = 50/1 a 10/1) para proporcionar el compuesto 5h (0,14 g) como un aceite amarillo. LCMS:ESI-MS: m/z 786.8 [M H]+.

Paso ⁸ : Preparación del compuesto 5i

A una solución del compuesto 5h (0,5 g, 0,64 mmol) en THF (9 ml) se le añadió a 0° C N-etil-N-isopropilpropan-2-amina (0,49 g, 3,82 mmol) y 3-((cloro (diisopropil-amino)fosfino)oxi)propanonitrilo (0,45 g, 1,91 mmol). Después de agitar durante 12 horas a 25° C, la mezcla de la reacción se inactivó con MeOH (3 ml), se diluyó con acetato de etilo (30 ml) y agua (30 ml). La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (20 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se secaron sucesivamente sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y concentraron bajo presión para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (DCM/EA =10/1 a 1/1) para proporcionar el compuesto 5i (0,48 g, 0,49 mmol) como un sólido blanco. LCMS:ESI-MS: m/z 903.5 [MH-iPr²]+. Paso 9: Preparación del compuesto 5j

A una solución del compuesto 5e (0,25 g, 0,49 mmol) en acetonitrilo (10 ml) se le añadieron tamices moleculares 4A; la mezcla resultante se agitó a 25° C durante 10 min. Se añadió perclorato de IH-imidazol (0,42 g, 2,45 mmol) y la mezcla se agitó durante otros 10 min a 25° C. Se añadió el compuesto 5i (0,48 g, 0,49 mmol) y la mezcla se agitó a 25° C durante 1 h. Luego se añadió N,N-dimetil-N'-(5-sulfaniliden-1,2,4-ditiazol-3-il)-metanimidamida (DDTT) (0,5 g, 2,45 mmol) y la mezcla se agitó a 25° C durante otra hora. La mezcla de la reacción se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (DCM/metanol = 10/1 a 3/1) para proporcionar el compuesto 5j (0,42 g) como un sólido blanco.

Paso 10: Preparación del compuesto 5k

A una solución del compuesto 5j (0,42 g, 0,31 mmol) en diclorometano (20 ml) y agua (0,056 g, 3,115 mmol, 10 eq.) se le añadió ácido 2,2-dicloroacético (⁶ % en DCM, 20 ml). Después de agitar a 25° C durante 20 min, la mezcla se inactivó con piridina (3 ml), luego se concentró a presión reducida para producir un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (DCM/MeOH = 10/1 a 2/1) para proporcionar el compuesto 5k (0,29 g) como un sólido blanco. LCMS:ESI-MS: m/z= 1046.5[M+1]+;

Paso 11: Preparación del compuesto 5l y 5m

A una solución del compuesto 5k (0,34 g, 0,32 mmol) en piridina (80 ml) se le añadió 2-óxido de 2-cloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioxafosfinano (0,18 g, 0,97 mmol); la mezcla resultante se agitó a 25° C durante 1 h. Luego se añadió 1,1 -dióxido de 3H-benzo[c][1,2]ditiol-3-ona (0,325 g, 1,62 mmol) y la mezcla se agitó a 25° C durante 1 h. La reacción de la mezcla se concentró a presión baja; el residuo se purificó por HPLC preparativa (Columna: Agela DuraShell 150 mm x 25 mm x 5 pm; agua (NH⁴HCO³10 mM) v/v) (A) - CH³CN (B); del 37% al 67% de B; Caudal: 25 ml/min) para obtener dos fracciones que incluyen una mezcla de análogos 5m (46 mg) y 5l (59 mg) como sólidos blancos. Luego, cada fracción se llevó a cabo por separado. LCMS:ESI-MS: m/z 1060,3 [M+H]+. (compuesto 5m); LCMS:ESI-MS: m/z 1060,4 [M+H]+. (compuesto 5l).

Paso 12: Preparación del compuesto 5o

Se trató el compuesto 5m (80 mg, 0,075 mmol) con metanamina ⁽⁸ ml, 35% en EtOH); después de agitar a 25° C durante 12 h, la mezcla de la reacción se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto 5o (62,8 mg) que se usó en el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso 13: Preparación de los compuestos 5 y 6

A una solución del compuesto 5o (62,8 mg, 0,075 mmol) en piridina ⁽⁸ ml), se le añadió trietilamina (0,46 g, 4,53 mmol) y trihidrofluoruro de trietilamina (0,37 g, 2,26 mmol); la mezcla resultante se agitó a 50° C durante 10 h. Se añadió isopropoxitrimetilsilano (0,99 g, 7,55 mmol) a 15° C y la mezcla se agitó durante otras 2 h. La mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se purificó por HPLC preparativa (Columna: Agela DuraShell 150 mm x 25 mm x 5pm; agua (hidróxido amónico al 0,05% v/v) (A) - CH³CN (B); del ¹% al 16% de B; Caudal: 25 ml/min) para proporcionar la sal de amonio del compuesto 5 (27 mg) y la sal de amonio del compuesto 6 (11 mg) como sólidos blancos. LCMS:ESI-MS: m/z 718.8 [M+H]+. (compuesto 5); LCMS: ESI-MS: m/z 718.8 [M+H]+. (compuesto 6).

Paso 14: Preparación de sal de sodio de 5

Se añadió un volumen de 20 ml de Dowex 50Wx ⁸ , 200-400 (forma H) a un vaso de precipitados (para 58 mg del compuesto 5) y se lavó con H²O DI (2x). Luego se añadió a la resina H²SO⁴ al 15% en H²O DI (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en H²O DI y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 volúmenes de columna), y luego con H²O DI hasta que se volvió neutra. La resina se transfirió de nuevo al vaso de precipitados y se añadió NaOH al 15% en solución de H²O (50 ml); la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en H²O (por lo menos 4 volúmenes de columna) y luego con H²O hasta que se volvió neutra (por lo menos 4 volúmenes de columna). La sal de amonio del compuesto 5 se disolvió en agua DI (58 mg en 5 ml), se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua DI. 5 se eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para proporcionar la sal de sodio del compuesto 5 (55,1 mg) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, D²O) 6=8.39 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 5.98 (d, J=8.5 Hz, 1H), 5.50 (ddd, J=4.3, 8.7, 12.9 Hz, 1H), 5.09-5.02 (m, 1H), 4.91 (q, J=7.4 Hz, 1H), 4.74 (dd, J=4.8, 6.3 Hz, 1H), 4.58 (br s, 1H), 4.32 (d, J=4.3 Hz, 1H), 4.30­ 4.17 (m, 3H), 4.05-3.97 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 2.82-2.68 (m, 2H), 1.93-1.82 (m, 1H); 31P NMR (162 MHz, D²O) 6=57.599, 54.556; LCMS:ESI-MS: m/z 718.8 [M+H]+.

Paso 15: Preparación de sal de sodio de 6

Se añadió un volumen de ⁸ ml de Dowex 50W x ⁸ , 200-400 (forma H) a un vaso de precipitados (para 22 mg del compuesto 6) y se lavó con H²O DI (2x). Luego se añadió a la resina H²SO⁴ al 15% en H²O DI (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en H²O DI y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 volúmenes de columna), y luego con H²O DI hasta que se volvió neutra. La resina se transfirió de nuevo al vaso de precipitados y se añadió NaOH al 15% en solución de H²O (50 ml); la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en H²O (por lo menos 4 volúmenes de columna) y luego con H²O hasta que se volvió neutra (por lo menos 4 volúmenes de columna). La sal de amonio del compuesto 6 se disolvió en agua DI (39 mg en 5 ml), se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua DI. 6 se eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para proporcionar la sal de sodio del compuesto 6 (10,1 mg) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, D²O) 8=8.47 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 5.95 (d, J=8.5 Hz, 1H), 5.77 (ddd, J=4.3, 8.4, 12.7 Hz, 1H), 5.13-5.05 (m, 1H), 4.97-4.90 (m, 1H), 4.58 (br s, 1H), 4.53 (t, J=3.9 Hz, 1H), 4.47-4.38 (m, 1H), 4.29 (d, J=4.5 Hz, 1H), 4.24 (td, J=5.4, 10.6 Hz, 1H), 4.12 (br d, J=12.3 Hz, 1H), 4.05 (br d, J=10.3 Hz, 1H), 3.62 (s, 3H), 2.91-2.69 (m, 2H), 2.17-2.01 (m, 1H); 31P NMR (162 MHz, D²O) 8=55.896, 54.936; LCMS:ESI-MS: m/z 718.8 [M+H]+.

Ejemplo de referencia 5a

Paso 1: Preparación del compuesto 5p

Se trató el compuesto 5l (60 mg, 0,057 mmol) con metanamina ^{( 6} ml, 35% en EtOH); después de agitar a 25° C durante 12 h, la mezcla de la reacción se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto 5p (47,14 mg) que se usó para el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso 2: Preparación de los compuestos 7 y 8

A una solución del compuesto 5p (47,14 mg, 0,06 mmol) en piridina (5 ml), se le añadió trietilamina (0,34 g, 3,4 mmol) y trihidrofluoruro de trietilamina (0,27 g, 1,7 mmol); la mezcla resultante se agitó a 50° C durante 10 h. Se añadió isopropoxitrimetilsilano (0,75 g, 5,66 mmol) a 15° C y la mezcla se agitó durante otras 2 h. La mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se purificó por HPLC preparativa (Columna: Agela DuraShell 150 mm x 25 mm x 5 |jm; agua (0,05% hidróxido amónico v/v) (A) - CH³CN (B); del 1% al 16% de B; Caudal: 25 ml/min) para proporcionar la sal de amonio del compuesto 7 ^{( 8} mg) y la sal de amonio del compuesto 8 (19 mg) como sólidos blancos. LCMS:ESI-MS: m/z 718.8 [M+H]+. (compuesto 8); LCMS: ESI-MS: m/z 718.8 [M+H]+. (compuesto 7).

Paso 3: Preparación de sal de sodio de 7

Se añadió un volumen de ⁸ ml de Dowex 50W x ⁸ , 200-400 (forma H) a un vaso de precipitados (para 20 mg del compuesto 7) y se lavó con H²O DI (2x). Luego se añadió a la resina H²SO⁴ al 15% en H²O DI (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en H²O DI y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 volúmenes de columna), y luego con H²O DI hasta que se volvió neutra. La resina se transfirió de nuevo al vaso de precipitados y se añadió NaOH al 15% en solución de H²O (50 ml); la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en H²O (por lo menos 4 volúmenes de columna) y luego con H²O hasta que se volvió neutra (por lo menos 4 volúmenes de columna). La sal de amonio del compuesto 7 se disolvió en agua DI (39 mg en 5 ml), se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua DI. 7 se eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para proporcionar la sal de sodio del compuesto 7 (15,5 mg) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, D²O) 8=8.32 (s, 1H), 8.25 (s, 2H), 6.00 (d, J=8.5 Hz, 1H), 5.57-5.42 (m, 1H), 4.98-4.83 (m, 3H), 4.63 (br s, 1H), 4.44 (d, J=4.0 Hz, 1H), 4.24 (br s, 2H), 4.14 (br d, J=5.0 Hz, 2H), 3.62 (s, 3H), 2.85-2.64 (m, 2H), 2.04-1.91 (m, 1H); 31P NMR (162 MHz, D²O) ⁸ 54.121, 52.853; ESI-MS: m/z 718.8 [M+H]+.

Paso 4: Preparación de sal de sodio de 8

Se añadió un volumen de ⁸ ml de Dowex 50W x ⁸ , 200-400 (forma H) a un vaso de precipitados (para 39 mg del compuesto 8) y se lavó con H²O DI (2x). Luego se añadió a la resina H²SO⁴ al 15% en H²O DI (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en H²O DI y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 volúmenes de columna), y luego con H²O DI hasta que se volvió neutra. La resina se transfirió de nuevo al vaso de precipitados y se añadió NaOH al 15% en solución de H²O (50 ml); la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en H²O (por lo menos 4 volúmenes de columna) y luego con H²O hasta que se volvió neutra (por lo menos 4 volúmenes de columna). La sal de amonio del compuesto 8 se disolvió en agua DI (39 mg en 5 ml), se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua DI. 8 se eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para proporcionar la sal de sodio del compuesto 8 (25,8 mg) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, D²O) 8=8.21 (d, J=2.3 Hz, 2H), 7.91 (s, 1H), 5.90 (d, J=^{8 .8} Hz, 1H), 5.83-5.74 (m, 1H), 5.01 (dt, J=4.1, 8.1 Hz, 1H), 4.88-4.83 (m, 1H), 4.59 (br s, 1H), 4.49-4.38 (m, 2H), 4.32 (d, J=4.3 Hz, 1H), 4.28-4.20 (m, 1H), 4.14-4.04 (m, 2H), 3.60 (s, 3H), 2.89-2.70 (m, 2H), 2.13-2.03 (m, 1H); 31P NMR (162 MHz, D²O) 8=54.483, 52.291; LCMS: ESI-MS: m/z 718.8 [M+H]+.

Ejemplo de referencia ⁶

Paso 1: Preparación del producto intermedio 3f

Se disolvieron diol 3e ([1834500-45-6], 27,2 g, 40,6 mmol) e imidazol (8,3 g, 121,7 mmol) en DCM (600 ml), seguido de la adición de cloruro de terc-butildimetilsililo (10,4 g, 69,0 mmol)). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas, después de lo cual se vertió en NaHCO³ acuoso y se extrajo con DCM. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y se evaporaron a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna de sílice (gradiente de elución: 0-50% de EtOAc en éter de petróleo) para dar una mezcla del producto intermedio 1b y su isómero 3'-hidroxilo protegido (no se muestra la estructura) (25 g en total, rendimiento: 79%). Esta mezcla regioisomérica se separó mediante HPLC preparativa de fase inversa (fase estacionaria: Phenomenex Synergi, 10 pm Max-RP, 250 x 50 mm; fase móvil: H²O (A) - MeCN (B); elución isocrática: 92% de B, caudal: 110 ml/min) para dar el producto intermedio puro 3f como el primer isómero eluido (12 g, rendimiento: 37%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶ ) ⁸ ppm -0.42 (s, 3H), -0.21 (s, 3H), 0.62 (s, 9H), 1.89-2.02 (m, 1H), 2.17-2.30 (m, 2H), 3.07-3.15 (m, 1H), 3.15-3.23 (m, 1H), 3.73 (s, ⁶ H), 3.83-3.90 (m, 1H), 4.41 (dd, J=⁸.⁸ , 5.3 Hz, 1H), 4.45 (d, J=5.3 Hz, 1H), 5.03-5.15 (m, 1H), 6.64 (d, J=3.5 Hz, 1H), 6.91 (d, J=^{8 .8} Hz, 4H), 7.23 (t, J=7.5 Hz, 1H), 7.27-7.38 (m, ⁶ H), 7.45 (d, J=7.1 Hz, 2H), 7.49 (d, J=3.5 Hz, 1H), 7.54 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.63 (t, J=7.1 Hz, 1H), 8.06 (d, J=7.1 Hz, 2H), 8.48 (s, 1H), 11.05 (br s, 1H); ESI-MS: m/z 785.3 [M+H]+

Paso 2: Preparación del producto intermedio 6a

Se añadieron 2 g de 4Á MS activado a una solución del producto intermedio 3f (2,5 g, 3,2 mmol) en piridina (12,5 ml) y 1,4-dioxano (35 ml), la mezcla de la reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió una solución de 2-cloro-4H-1,3,2-benzodioxafosforin-4-ona (1,26 g, 6,2 mmol) en 1,4-dioxano seco (2,5 ml) y se continuó agitando durante 30 min. La mezcla de la reacción se inactivó añadiendo 15 ml de una mezcla 1/1 de agua y piridina, seguido de una cantidad extra de agua (50 ml). La mezcla obtenida se filtró y se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHCO3 acuoso, se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío para dar el producto intermedio bruto 6a como un sólido blanco (3,3 g). El producto bruto se usó como tal en el paso siguiente sin purificación.

ESI-MS: m/z 849.2 [M+H]+

Paso 3: Preparación del producto intermedio 6b

A una solución del producto intermedio bruto 6a (6,5 g, 5,7 mmol) en DCM (80 ml) se le añadió H²O (1,0 ml, 56,7 mmol) y ácido dicloroacético (1,46 g, 11,3 mmol). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió una cantidad extra de ácido dicloroacético (472 pl, 5,7 mmol) y se continuó agitando durante 20 min. La reacción se inactivó mediante la adición de terc-butilamina (26 ml, 248,1 mmol) y se concentró al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de sílice (gradiente de elución: MeOH al 0-30% en DCM) para dar el producto intermedio 1d como un sólido blanco (3 g, rendimiento: 82%). El producto intermedio 6b se convirtió en la correspondiente sal de terc-butilamonio agitándolo como una solución en DCM (30 ml) durante ¹ hora en presencia de terc-butilamina, seguido de concentración a presión reducida y secado a alto vacío. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶ ) ⁸ ppm -0.4 (s, 3H), -0.1 (s, 3H), 0.6 (s, 9H), 1.3 (s, 9H), 1.7-1.8 (m, 1H), 2.2 (dt, J=12.9, ^8.6 Hz, 1H), 2.3-2.4 (m, 1H), 3.5-3.6 (m, 2H), 4.2-4.4 (m, 2H), 5.1-5.2 (m, 1H), 5.8 (br s, 1H), 6.7 (d, J=583.9 Hz, 1H), 6.7 (d, J=3.7 Hz, 1H), 7.5 (t, J=7.7 Hz, 2H), 7.6-7.7 (m, 2H), 8.0 (br s, 3H), 8.1 (d, J=7.3 Hz, 2H), 8.5 (s, 1H), 11.0 (br s, 1H); ESI-MS: m/z 547.0 [M+H]+.

Paso 4: Preparación del producto intermedio 6c

Se añadió perclorato de 1H-imidazolio (IMP, 2,4 g, 14,0 mmol) a una solución del producto intermedio 6b (500 mg, 0,81 mmol) en MeCN anhidro (23 ml) bajo nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 10 min, tras lo cual se obtuvo una solución de 5'-O-(4,4-dimetoxitritil)-N2-isobutiril-3'-O-metilguanosina-2'-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita) ([179479-04-0], 1,4 g, 1,56 mmol) en MeCN anhidro (2 ml). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, se añadió tBuOOH (5,5 M en decano, 0,71 ml, 3,9 mmol) y se continuó agitando durante 1 hora. La mezcla de la reacción se filtró y se concentró a presión reducida para dar un aceite incoloro que se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (fase estacionaria: Waters XBridge, 5 pm, 150 x 25 mm; fase móvil: H²O (A) - MeCN (B); elución en gradiente: 18%-48% de B en A, caudal: 25 ml/min) para proporcionar el producto intermedio 6c (250 mg, rendimiento: 31%). ESI-MS: m/z 515.4 [(M+H)/2]+.

Paso 5: Preparación del producto intermedio 6d

Se añadió DMOCP (52 mg, 0,29 mmol) a una solución del producto intermedio 6c (100 mg, 0,095 mmol) en piridina (60 ml), la mezcla de la reacción se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. Se añadieron agua (17 mg, 0,95 mmol) e I2 (120 mg, 0,48 mmol) y se continuó agitando durante 1 hora. La reacción se inactivó con Na²SO³ acuoso ^{( 8} ml), se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa (fase estacionaria: Waters XBridge, 5 pm, 150 x 25 mm; fase móvil: bicarbonato amónico acuoso 10 mM (A) - MeCN (B); gradiente de elución 17-47% de B en A; caudal: 25 ml/min) para dar el producto intermedio If (250 mg, 0,238 mmol) como un sólido blanco. Se repitió el procedimiento anterior usando una escala similar para generar una cantidad total de 100 mg (rendimiento: 46%) del producto intermedio 6d. ESI-MS: m/z 1027,4 [M+H]+.

Paso ⁶ : Preparación del compuesto 9

El producto intermedio 6d (100 mg, 0,97 mmol) se agitó en una solución de metilamina al 33% en etanol (40 ml) a temperatura ambiente durante ⁶ horas, después de lo cual la mezcla de la reacción se concentró a presión reducida. Este procedimiento se repitió en una escala de ⁶⁸ mg. La cantidad total de producto bruto obtenido se disolvió en piridina ^{( 8} ml), seguido de la adición de trietilamina (1,1 g, 10,5 mmol) y trihidrofluoruro de trietilamina (847 mg, 5,25 mmol). La mezcla de la reacción se agitó a 50° C durante 12 horas, después de lo cual se enfrió a temperatura ambiente; Se añadió isopropoxitrimetilsilano (2,8 g, 21,0 mmol) y se continuó agitando durante otras 12 horas. El residuo obtenido después de la concentración a presión reducida se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (Fase estacionaria: Agela Durashell C18, 5 pm, 15o x 25 mm; Fase móvil: 0,05% de hidróxido de amoníaco acuoso (A) - MeCN (B); gradiente de elución: 0-15% de B en A, caudal: 35 ml/min) para dar el compuesto 9 como la sal de amonio (60 mg, 50%). La conversión en la sal de sodio del compuesto 9 se realizó por elución de una solución acuosa sobre una columna compactada con resina en forma de Na+ Dowex® 50WX8. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶ ) ⁸ ppm 1.28-1.41 (m, 1H), 2.22-2.39 (m, 2H), 3.49 (s, 3H), 3.55-3.65 (m, 1H), 3.75 (br d, J=11.4 Hz, 1H), 3.90-4.00 (m, 1H), 4.03 (d, J=4.1 Hz, 1H), 4.14 (br s, 1H), 4.36 (dd, J=10.0, 3.9 Hz, 1H), 4.76-4.84 (m, 1H), 4.90 (q, J=9.5 Hz, 1H), 5.35 (td, J=9.2, 4.1 Hz, 1H), 5.81 (d, J=8.5 Hz, 1H), 6.57 (br s, 2H), 6.65 (d, J=3.3 Hz, 1H), 7.37 (d, J=3.3 Hz, 1H), 7.65 (br s, 2H), 7.98 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 10.73 (s, 1H); 31P NMR (162 MHz, DMSO-d⁶ ) ⁸ ppm 0.83 (s, 1P), 1.63 (s, 1P); ESI-MS: m/z 685.9 [M+H]+.

Ejemplo de referencia 7

Paso 1: Preparación del producto intermedio 7a

A la sal de terc-butilamonio del producto intermedio 6b (700 mg, 1,13 mmol) y tamices moleculares activados se le añadió una solución de MeCN de Activador 42 ([175205-09-1], 9,9 ml de una solución 0,25 M, 2,49 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 75 min bajo nitrógeno, después de lo cual se añadió una solución de 5'-O-(4,4-dimetoxitritil)-N2-isobutiril-3'-O-metilguanosina-2'-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita) 1o (1,28 g en MeCN anhidro (9 ml), 1,4 mmol, solución secada sobre tamices moleculares antes de su uso). La mezcla de la reacción se agitó durante 1 hora seguido de la adición de una porción extra de 1o (248 mg en MeCN, 0,282 mmol, solución secada en tamices moleculares antes de su uso), después de una hora adicional de agitación, se añadió una tercera porción de 5'-O-(4,4-dimetoxitritil)-N2-isobutiril-3-O-metilguanosina-2'-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita) (98 mg en MeCN, 0,113 mmol, solución secada sobre tamices moleculares antes de su uso). Se continuó agitando durante una hora, después de lo cual la mezcla de la reacción se concentró a presión reducida. Se añadió piridina (10 ml), seguido de la adición de disulfuro de fenilacetilo (PADS, 854 mg, 2,82 mmol), la mezcla se agitó durante 1 hora. Los tamices moleculares se retiraron por filtración y se lavaron con DCM, el filtrado se concentró y el residuo resultante se coevaporó con MeCN. El producto bruto 7a se usó como tal en el paso siguiente. ESI-MS: m/z 672,8 [M-H]-.

Paso 2: Preparación del producto intermedio 7b

Se añadieron agua (204 pl, 11,3 mmol), trietilsilano (1,8 ml, 11,3 mmol) y ácido dicloroacético (370 pl, 4,5 mmol) a una solución del producto intermedio bruto 7a en DCM (10 ml). La mezcla de la reacción se agitó durante 1 hora, seguido de inactivación con piridina (457, 5,6 mmol) y concentración a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna de sílice (elución en gradiente: MeOH al 5-20% en DCM) para dar el producto intermedio 7b (700 mg, pureza del 75%, rendimiento: 44%). ESI-MS: m/z 1045.3 [M+H]+.

Paso 3: Preparación del producto intermedio 7c

Se añadió DMOCP (1,1 g, 6,0 mmol) a una solución del producto intermedio 7b (625 mg, 0,60 mmol) en piridina (22 ml), la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 90 minutos. Luego, se añadieron agua (78 mg, (59,8 mmol) y 3H-1,2-benzoditiol-3-ona (503 mg, 3,0 mmol) y se continuó agitando durante 40 minutos. La reacción se inactivó mediante la adición de salmuera y se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHCO3 acuoso, se secaron con MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar el producto intermedio bruto 7c que se usó como tal en el paso siguiente. ESI-MS: m/z 1059.3 [M H]+.

Paso 4: Preparación de los compuestos diastereoisoméricos 10 a 13

Se agitó el producto intermedio bruto 7c en una solución de metilamina al 33% en etanol (30 ml) a 50° C durante 4 horas. El residuo obtenido tras la concentración a presión reducida se disolvió en una mezcla de trietilamina (4,2 ml) y piridina (4,8 ml), a la que se añadió trihidrofluoruro de trietilamina (2,5 ml, 14,9 mmol). La mezcla de la reacción resultante se agitó a 50° C durante 3 horas y posteriormente se enfrió a temperatura ambiente, seguido de la adición de isopropoxitrimetilsilano (3,2 ml, 17,9 mmol), la agitación se continuó durante una hora. Luego, se añadió agua y la fase acuosa resultante se lavó con EtOAc y se liofilizó. Se añadió metanol al liofilizado oleoso dando como resultado la precipitación de los diastereoisómeros brutos 10 a 13. La purificación por HPLC preparativa de fase inversa (fase estacionaria: XBridge C18 OBD, 5 pm, 250 x 30 mm; fase móvil: bicarbonato de amonio acuoso al 0,25% (A) - MeCN (B); elución en gradiente: 0-15% de B en A durante 45 min, caudal: 30 ml/min) dio los cuatro diastereoisómeros: compuesto 10 (20 mg, rendimiento: 4,5% del producto intermedio 7b), compuesto 11 (18 mg, rendimiento: 4% del producto intermedio 7b), compuesto 12 (44 mg, rendimiento: 10% del producto intermedio 7b) y compuesto 13 (60 mg, rendimiento: 13,5% del producto intermedio 7b). Todos se convirtieron en la sal de sodio correspondiente por elución de una solución acuosa sobre una columna compactada con resina con forma de Na+ Amberlite IR. Compuesto 101H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 6 ppm 1.31­ 1.43 (m, 1H), 2.26 (dt, J=13.2, 9.1 Hz, 1H), 2.36-2.48 (m, 1H), 3.50 (s, 3H), 3.57 (m, J=10.6 Hz, 1H), 3.76-3.91 (m, 2H), 4.01-4.14 (m, 2H), 4.18 (d, J=4.1 Hz, 1H), 4.37 (ddd, J=8.8, 4.1, 2.4 Hz, 1H), 4.90 (q, J=9.0 Hz, 1H), 5.00 (dt, J=10.2, 3.7 Hz, 1H), 5.33 (ddd, J=12.2, 8.8, 3.9 Hz, 1H), 5.60 (d, J=2.9 Hz, 1H), 5.81 (d, J=9.0 Hz, 1H), 6.37 (br s, 2H), 6.55 (d, J=3.3 Hz, 1H), 6.87 (br s, 2H), 7.23 (d, J=3.7 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 10.64 (br s, 1H); 31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) 6 ppm 53.49 (s, 1P), 55.64 (s, 1P); ESI-MS: m/z 717.1 [M+H]+.

Compuesto 11: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 6 ppm 1.31-1.42 (m, 1H), 2.22 (dt, J=13.3, 8.7 Hz, 1H), 2.52­ 2.60 (m, 1H), 3.53 (s, 3H), 3.71-3.80 (m, 2H), 3.83-3.90 (m, 2H), 4.12 (br q, J=2.0 Hz, 1H), 4.31 (d, J=3.7 Hz, 1H), 4.41 (dd, J=8.0, 4.7 Hz, 1H), 4.82 (dt, J=9.0, 4.1 Hz, 1H), 4.92 (q, J=9.0 Hz, 1H), 5.32 (ddd, J=11.0, 9.4, 4.1 Hz, 1H), 5.45 (br s, 1H), 5.81 (d, J=9.0 Hz, 1H), 6.45 (br s, 2H), 6.59 (d, J=3.7 Hz, 1H), 7.05 (br s, 2H), 7.29 (d, J=3.3 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 10.56 (s, 1H); 31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) 6 ppm 54.03 (s, 1P), 56.86 (s, 1P); ESI-MS: m/z 717.1 [M+H]+.

Compuesto 12: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 6 ppm 1.21-1.33 (m, 1H), 2.20-2.39 (m, 2H), 3.50 (s, 3H), 3.46-3.53 (m, 1H), 3.65 (br d, J=11.0 Hz, 1H), 3.92 (d, J=4.4 Hz, 1H), 3.99 (br t, J=11.0 Hz, 1H), 4.11-4.26 (m, 2H), 4.34 (dd, J=10.5, 3.9 Hz, 1H), 4.92 (q, J=9.9 Hz, 1H), 5.23 (dd, J=8.8, 3.7 Hz, 1H), 5.36 (ddd, J=12.7, 8.7, 4.3 Hz, 1H), 5.81 (d, J=9.0 Hz, 1H), 6.46 (br s, 2H), 6.65 (d, J=3.5 Hz, 1H), 7.34 (d, J=3.5 Hz, 1H), 7.31 (br s, 2H), 8.08 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 10.56 (s, 1H); 31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) 6 ppm 56.36 (s, 1P), 59.35 (s, 1P); ESI-MS: m/z 717.1 [M+H]+.

Compuesto 13: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 6 ppm 1.32 (br t, J=8.8 Hz, 1H), 2.24-2.41 (m, 2H), 3.52 (s, 3H), 3.49-3.59 (m, 1H), 3.68 (br d, J=11.4 Hz, 1H), 3.85 (q, J=11.0 Hz, 1H), 3.93-4.05 (m, 2H), 4.95 (br s, 1H), 4.36 (dd, J=9.8, 4.1 Hz, 1H), 4.97 (dd, J=8.6, 4.1 Hz, 1H), 4.93 (q, J=9.0 Hz, 1H), 5.36-5.50 (m, 1H), 5.80 (d, J=9.0 Hz, 1H), 6.49 (br s, 2H), 6.74 (d, J=3.7 Hz, 1H), 7.50 (d, J=3.7 Hz, 1H), 7.83 (br s, 2H), 8.01 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 10.57 (s, 1H); 31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) 6 ppm 54.46 (s, 1P), 58.63 (s, 1P), 58.66 (s, 1P); ESI-MS: m/z 717.1 [M+H]+.

El esquema de reacción ilustrado en el Ejemplo de referencia 8 describe una ruta posible para la preparación del compuesto 14 y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ejemplo de referencia 8

El esquema de reacción ilustrado en el Ejemplo de referencia 9 describe una ruta posible para la preparación del compuesto 15 y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ejemplo de referencia 9

El esquema de reacción ilustrado en el Ejemplo de referencia 10 describe una ruta posible para la preparación del compuesto 16 y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ejemplo de referencia 10

Compuesto 16, sal de trietilamomo Compuesto 16, sal de sodio Ejemplo de referencia 11

Compuesto 17, sal de amonio

Paso 1: Preparación del compuesto 11b

A una solución del compuesto 11a (4,1 g, 16,383 mmol, 1,0 eq) en piridina (50 ml) se le añadió 4-dimetilaminopiridina (0,4 g, 3,277 mmol, 0,2 eq) y cloruro de terc-butildimetilsililo (3,704 g, 24,575 mmol, 1,5 eq) a 25° C. Luego, la mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 12 h. El solvente se concentró a presión reducida para dar un residuo que se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (DCM/MeOH = 50/1 a 10/1) para dar el compuesto 11b (2,86 g, 48% de rendimiento) como un sólido blanco. 1H n Mr (400 MHz, CD³OD) 8.32 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 6.47 (dd, J=5.2, 7.2 Hz, 1H), 4.31-4.18 (m, 2H), 4.06-3.96 (m, 1H), 3.94-3.84 (m, 1H), 3.18-3.06 (m, 1H), 2.80-2.70 (m, 1H), 0.85 (s, 9H), 0.03 (d, J=9.6 Hz, 6H); ESI-MS m/z 365.1 [M+1]+.

Paso 2: Preparación del compuesto 11c

A una solución del compuesto 11b (3,5 g, 9,602 mmol, 1,0 eq) en agua/THF (v/v 2/1, 150 ml) se le añadió carbonato de sodio (1,348 g, 12,482 mmol 1,3 eq) y cloruro de benciloxicarbonilo (2,129 g, 12,482 mmol, 1,3 equiv.). La mezcla se agitó a 25° C durante 24 h. La mezcla de la reacción se inactivó mediante la adición de NH⁴Cl (ac.), luego se diluyó con EtOAc (50 ml). La porción orgánica se lavó con agua (50 ml), salmuera (50 ml), se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (éter de petróleo/EtOAc =10/1 a EtOAc) para proporcionar el compuesto 11c (2,72 g, 57% de rendimiento) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, CDCh) 8.34 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.43-7.29 (m, 5H), 6.42 (t, J=5.8 Hz, 1H), 5.62 (s, 2H), 5.19-4.99 (m, 3H), 4.53 (t, J=6.0 Hz, 1H), 4.04 (s, 1H), 3.99-3.77 (m, 2H), 2.86-2.73 (m, 1H), 2.60-2.44 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.09 (s, 6H); ESI-MS m/z 521.1 [M+Na]+.

Paso 3: Preparación del compuesto 11d

A una solución del compuesto 11c (2,7 g, 5,415 mmol, 1,0 eq) en piridina (30 ml) se le añadió cloruro de benzoílo (1,142 g, 8,122 mmol, 1,5 eq) a 25° C. La mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 12 h. La mezcla de la reacción se inactivó mediante la adición de agua (5 ml), luego se añadió NH⁴OH (5 ml). La mezcla se agitó a 25° C durante 1 hora. La mezcla de la reacción se diluyó con EtOAc (100 ml), se lavó con agua (50 ml), salmuera (50 ml), se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (éter de petróleo/EtOAc = 10/1 a EtOAc) para proporcionar el compuesto 11d (2,42 g, 74% de rendimiento) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, CDCla) 9.03 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.02 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.66-7.57 (m, 1H), 7.56-7.47 (m, 2H), 7.42-7.30 (m, 5H), 6.62-6.37 (m, 1H), 5.24-4.98 (m, 3H), 4.55 (t, J=6.0 Hz, 1H), 4.24-4.03 (m, 1H), 4.02-3.76 (m, 2H), 2.97-2.73 (m, 1H), 2.70-2.46 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.09 (s, 6H); ESI-MS m/z 603.2 [M+1]+.

Paso 4: Preparación del compuesto 11e

A una solución del compuesto 11d (2,4 g, 3,982 mmol, 1,0 eq) en THF (20 ml) se le añadió fluoruro de tetrabutilamonio (1 M en THF, 19,91 ml, 19,909 mmol, 5,0 eq) a 25° C. la mezcla se agitó a 25° C durante 2 h. La mezcla de la reacción se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se disolvió en EtOAc (50 ml), se lavó con agua (50 ml), salmuera (50 ml), se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (acetona/EtOAc = 3/1 a 1/1) para proporcionar el compuesto 11e (1,89 g, 97% de rendimiento) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, CD³OD) 8.72 (s, 2H), 8.09 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.78-7.47 (m, 3H), 7.44-7.20 (m, 5H), 6.53 (t, J=5.6 Hz, 1H), 5.11 (s, 2H), 4.60 (s, 1H), 4.14-3.99 (m, 1H), 3.94-3.64 (m, 2H), 2.91 (m, 1H), 2.67-2.47 (m, 1H); LCMS: ESI-MS m/z 489.1 [M+1]+.

Paso 5: Preparaci n del compuesto 11

A una solución del compuesto 11e (1,4 g, 2,866 mmol, 1,0 eq) en piridina (20 ml) se le añadió cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (1,457 g, 4,299 mmol, 1,5 eq) a 25° C. La mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 2 h. La mezcla de la reacción se inactivó mediante la adición de MeOH (5 ml) y la mezcla se agitó durante 30 min. La mezcla se diluyó con EA (50 ml), se lavó con agua (50 ml), salmuera (50 ml), se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (éter de petróleo/EtOAc = 10/1 a EtOAc) para proporcionar el compuesto 11f (2,03 g, 89% de rendimiento) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, CDCh) 8.97 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.02 (d, J=7.2 Hz, 2H), 7.67-7.58 (m, 1H), 7.58-7.48 (m, 2H), 7.45-7.14 (m, 15H), 6.78 (m, 4H), 6.44 (s, 1H), 5.10 (s, 2H), 4.94 (s, 1H), 4.59 (s, 1H), 3.76 (s, 6H), 3.45 (s, 2H), 3.11-2.94 (m, 1H), 2.62 (s, 1H); ESI-MS m/z 791.2 [M+1]+.

Paso 6: Preparación del compuesto 11g

A una solución del compuesto 11f (2,03 g, 2,567 mmol, 1,0 equiv.) en MeOH (200 ml) se le añadió Pd/C al 10% (2,0 g) en atmósfera de argón. Luego, la mezcla de la reacción se reemplazó con una atmósfera de hidrógeno (3x). La mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 18 h (50 psi). La mezcla de la reacción se filtró y la torta del filtro se lavó con MeOH (100 ml x 3). La capa orgánica se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM/MeOH = 100/1 a 10/1) para proporcionar el compuesto 11g (1,24 g, 74% de rendimiento) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, CDCla) 9.10 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.00 (d, J=7.2 Hz, 2H), 7.57 (m, 1H), 7.54-7.46 (m, 2H), 7.42-7.33 (m, 2H), 7.30-7.15 (m, 8H), 6.78 (d, J=8.4 Hz, 4H), 6.42 (dd, J=3.6, 6.8 Hz, 1H), 3.91-3.80 (m, 2H), 3.75 (s, 6H), 3.40 (m, 2H), 2.82 (m, 1H), 2.45-2.30 (m, 1H); LCMS: ESI-MS m/z 657.2 [M+1]+.

Paso 7: Preparación del compuesto 11h

A una solución del compuesto 8k (16,50 g, 46,698 mmol, 1,00 eq) en piridina (200 ml) se le añadió 4,4'-(cloro(fenil)metileno)bis(metoxibenceno) (23,734 g, 70,048 mmol, 1,50 eq) a 25° C. La mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante la noche. La mezcla de la reacción se inactivó con metanol (10 ml) y luego se concentró para proporcionar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (DCM/MeOH = 50/1 a 10/1) para proporcionar el compuesto 11h (23,9 g, 78% de rendimiento) como un sólido amarillo. LCMS: ESI-MS: m/z 656.1 [M+H]+.

Paso 8: Preparación del compuesto 11i

A una solución del compuesto 11h (23,9 g, 36,450 mmol, 1,00 eq) en N,N-dimetilformamida (120 ml) se le añadió terc-butilclorodimetilsilano (8,241 g, 54,675 mmol, 1,50 eq) y 1H-imidazol (6,204 g, 91,124 mmol, 2,50 eq) a 25° C. La mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante la noche. La mezcla de la reacción se inactivó con metanol (5 ml) y se concentró para proporcionar un residuo. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (agua (0,225% de ácido fórmico-CH³CN) para proporcionar el compuesto 11i (6,7 g, 24% de rendimiento) como un sólido amarillo. LCMS: ESI-MS: m/z 770.3 [M+ H]+.

Paso 9: Preparación del compuesto 11j

A una solución del compuesto 11i (5,000 g, 6,494 mmol, 1,00 eq) en 1,4-dioxano (50 ml) se le añadió DMAP (79,334 mg, 0,649 mmol, 0,1 eq), N,N'-metanodiilidendiciclohexanamina (4,020 g, 19,482 mmol, 3 eq) y ácido 4-oxopentanoico (1,508 g, 12,988 mmol, 2,0 eq) a 25° C. La mezcla se agitó a 25° C durante 3 h. La mezcla de la reacción se filtró y la torta del filtro se lavó con EtOAc (30 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para dar un residuo. El residuo se disolvió en EtOAc (100 ml), se lavó con agua (50 ml), salmuera (50 ml), se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (DCM/MeOH = 100/1 a 10/1) para proporcionar el compuesto 11j (5,1 g, 90% de rendimiento) como una espuma blanca. LCMS: ESI-MS: m/z 868.4 [M+H]+.

Paso 10: Preparación del compuesto 11k

A una solución del compuesto 11j (5,1 g, 5,875 mmol, 1,00 equiv.) en DCM (12 ml) se le añadió ácido 2,2,2-trifluoroacético (300 ul) y trietilsilano (6 ml). La mezcla se agitó a 25° C durante 10 min. La mezcla de la reacción se inactivó con una solución saturada de NaHCO3 ⁽²⁰ ml) y luego se diluyó con DCM (30 ml x 3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (30 ml), se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (DCM/MeOH = 50/1 a 10/1) para proporcionar el compuesto 11k (3,1 g, 93% de rendimiento) como un sólido amarillo. 1H NMR (400 MHz, CDCh) 12.11 (s, 1H), 11.64 (s, 1H), 8.42-8.22 (m, 1H), 6.00 (d, J=6.8 Hz, 1H), 5.74 (s, 1H), 5.54 (dd, J=5.0, 6.7 Hz, 1H), 5.26 (t, J=5.2 Hz, 1H), 4.55 (dd, J=2.4, 4.9 Hz, 1H), 3.98 (br d, J=2.4 Hz, 1H), 3.67 (td, J=4.9, 11.9 Hz, 1H), 3.61-3.51 (m, 1H), 2.77 (spt, J=6.8 Hz, 1H), 2.70-2.60 (m, 2H), 2.02 (s, 3H), 1.11 (d, J=6.6 Hz, 6H), 0.89 (s, 9H), 0.10 (s, 3H), 0.06 (s, 3H).

Paso 11: Preparación del compuesto 11l

A una solución del compuesto 11k (3,1 g, 5,480 mmol, 1,00 eq) en THF (40 ml) se le añadió N-etil-N-isopropilpropan-2-amina (4,250 g, 32,880 mmol, 6,0 eq) y 3-((cloro(diisopropilamino)fosfino)oxi)propanonitrilo (3,891 g, 16,440 mmol, 3,0 eq) a 0° C. La mezcla se agitó a 0° C durante 2 h. La mezcla de la reacción se inactivó mediante la adición de MeOH (3 ml), luego se diluyó con EA (50 ml). La capa orgánica se lavó con NaHCO3 (40 ml) y salmuera (40 ml), se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (DCM/EtOAc = 10/1 a 1/1) para proporcionar el compuesto 111 (3,1 g, 74% de rendimiento) como un aceite incoloro. LCMS: ESI-MS: m/z 683.1 [M-N(iPr)2+18]+. Paso 12: Preparación del compuesto 11m

A una solución del compuesto 11l (2,1 g, 2,742 mmol, 1,0 eq) en acetonitrilo (16 ml) se le añadió una solución de 1H-tetrazol (0,45 M) en acetonitrilo/agua (9/1, 18/2 ml) a 25° C. La solución se agitó a 25° C durante 2 h. La mezcla de la reacción se enfrió a 0° C, se diluyó con acetato de etilo (50 ml), se lavó sucesivamente con agua fría (20 ml), bicarbonato de sodio al 5% frío (20 ml), agua fría (20 ml), se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar el compuesto 11m (1,62 g, 87% de rendimiento) como un aceite incoloro.

31P NMR (162 MHz, CDCla) 11.43 (s, 1P), 7.10 (s, 1P); LCMS: ESI-MS m/z 683.1 [M+1]+.

Paso 13: Preparación del compuesto 11n

Se añadió una solución del compuesto 11g (1,2 g, 1,827 mmol, 1,0 eq) en una mezcla de acetonitrilo/diclorometano/tetraclorometano (1/1/1, 30 ml) y trietilamina (900 uL) a un matraz sellado que contenía el compuesto 11m (1,62 g, 2,375 mmol, 1,3 equiv.). La solución resultante se agitó a 25° C durante 2 h. La mezcla de la reacción se concentró hasta la sequedad a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (DCM/MeOH = 100/1 a 100/2) para proporcionar el compuesto 11n (1,21 g, 50% de rendimiento) como una espuma blanca. 31P NMR (162 MHz, CD³OD) 9.13 (s, 1P), 8.73 (s, 1P); LCMS: ESI-MS m/z 1337.5 [M+1]+.

Paso 14: Preparación del compuesto 11o

A una solución del compuesto 11n (1,1 g, 0,822 mmol, 1,0 eq) en MeCN (30 ml) se le añadió acetato de hidrazina (757,462 mg, 8,225 mmol, 10,0 eq) a 25° C. La mezcla de la reacción se agitó a 25° C. durante 2 h. Luego, la mezcla de la reacción se diluyó con EA (50 ml), se lavó con agua (50 ml) y salmuera (30 ml), se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (DCM/MeOH = 100/1 a 100/5) para proporcionar el compuesto 11o (833 mg, 82% de rendimiento) como un sólido blanco. LCMS: ESI-MS m/z 1261.2 [M+23]+.

Paso 14: Preparación del compuesto 11p

A una solución del compuesto 11o (653 mg, 0,527 mmol, 1,0 eq) y tamices moleculares 4Á en 1,4-dioxano (9,0 ml) y piridina (3,0 ml) se le añadió una solución de 2-cloro-4H-1, 3,2-benzodioxafosforin-4-ona (160,068 mg, 0,790 mmol, 1,5 eq) en 1,4-dioxano (5 ml). La mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 30 min. La mezcla de la reacción se inactivó mediante la adición de agua/piridina (1/1, 5 ml) y la mezcla resultante se vertió en una solución de NaHCO3 (20 ml). La mezcla se extrajo con EtOAc (30 x 3 ml) y las capas se repartieron. Los extractos de EtOAc combinados se concentraron hasta la sequedad a presión reducida para dar el compuesto 11p (723 mg, bruto) como una espuma incolora, que se usó en el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso 15: Preparación del compuesto 11q

A una solución del compuesto 11p (723 mg, bruto) en DCM (5 ml) se le añadió agua y DCA (6% en DCM, 5 ml). La mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 30 min. La mezcla de la reacción se inactivó mediante la adición de piridina (3 ml) con agitación durante 10 min. La mezcla de la reacción se concentró hasta la sequedad a presión reducida para proporcionar un residuo. El residuo resultante se purificó mediante HPLC preparativa (columna: Waters Xbridge 150 x 255u; fase móvil: agua (NH⁴HCO³10 mM)-ACN del 22% al 42%, caudal: 25 ml/min, tiempo de gradiente: 8 min) para proporcionar el compuesto 11q (197 mg, 35% de rendimiento en dos pasos) como un sólido blanco. 31P NMR (162 MHz, D²O) 9.23 (s, 1P), 8.62 (s, 1P), 4.48 (s, 1P); LCMS: ESI-MS m/z 1001.5 [M+1]+.

Paso 16: Preparación del compuesto 11r

A una solución del compuesto 11q (197 mg, 0,197 mmol, 1,0 eq) y tamices moleculares 4Á en piridina (60 ml) se le añadió 2-óxido de 2-cloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioxafosfinano (127,131 mg, 0,689 mmol, 3,5 eq) a 25° C. La mezcla de la reacción se agitó a 25° C durante 1 h. La mezcla de la reacción (0,00328 M en Py, 60 ml), que contenía el compuesto 11r, se usó para el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso 17: Preparación del compuesto 11s

Se inactivó una solución del compuesto 11r (0,00328 M en Py, 60 ml) mediante la adición de agua (36,49 mg, 1,97 mmol, 10,0 eq), luego se añadió I² (250 mg, 0,985 mmol, 5,0 eq) a la solución. La mezcla se agitó a 25° C durante 1 h. Luego, esta mezcla se inactivó mediante la adición de una solución acuosa de Na²SO³ (2 ml), se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (columna: Waters Xbridge 150*255u; fase móvil: agua (NH⁴HCO³10 mM)-ACN del 28% al 48%, caudal: 25 ml/min, tiempo de gradiente: 8 min) para proporcionar el compuesto 11a (68 mg, 35% de rendimiento en dos pasos) como un sólido blanco. LCMS: ESI-MS m/z 999.1 [M+1]+.

Paso 18: Preparación del compuesto 11t

Se agitó el compuesto 11s (35 mg, 0,035 mmol, 1,0 eq) en una solución de MeNH² (33% en EtOH, 2 ml) a 25° C durante 12 h. La mezcla de la reacción se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto 11t (bruto, 32 mg) como un sólido amarillo.

Paso 18: Preparación del compuesto 17

A una solución del compuesto 11t (32 mg, bruto) en piridina (2 ml) se le añadió trietilamina (209,805 mg, 2,073 mmol, 50 eq) y trihidrofluoruro de trietilamina (167,124 mg, 1,037 mmol, 25 eq) a 25° C. la mezcla de la reacción se agitó a 50° C durante 12 h. A la mezcla de la reacción se le añadió THF (1 ml) e isopropoxitrimetilsilano (548,516 mg, 4,147 mmol, 100 eq) a 25° C y la mezcla se agitó durante 12 h. La mezcla se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó por HPLC preparativa (columna: Agela Durashell C18150*255u; fase móvil: agua (0,05% hidróxido amónico v/v)-ACN del 0% al 15%, caudal: 35 ml/min, Gradiente Tiempo: 10 min) para proporcionar el compuesto 17 como una sal de amonio (9,5 mg, 35% de rendimiento en dos pasos) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, D²O) 8.66-7.98 (m, 2H), 7.83 (s, 1H), 6.24 (s, 1H), 6.04-5.50 (m, 2H), 4.60 (s, 1H), 4.42-3.93 (m, 7H), 2.76 (s, 1H), 2.44 (s, 1H); 31P NMR (162 MHz, D²O) 7.62 (s, 1P), 7.49 (s, 1P), -3.40 (s, 1P). Paso 19: Preparación de la sal de sodio del compuesto 17

Se añadió un volumen de 5 ml de Dowex 50W x 8, 200-400 (forma H) a un vaso de precipitados (para 9,5 mg de sal de amonio del compuesto 17) y se lavó con agua desionizada (2x). Luego, a la resina se le añadió H²SO⁴ al 15% en agua DI (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en agua DI y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 CV), y luego con agua DI hasta pH neutro. La resina se volvió a transferir al vaso de precipitados y se añadió una solución acuosa de NaOH al 15% (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH acuoso al 15% (por lo menos 4 CV), y luego con agua hasta pH neutro (por lo menos 4 CV). La sal de amonio del compuesto 17 se disolvió en agua DI (9,5 mg en 2 ml), se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua DI. Un producto eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para proporcionar la sal de sodio del compuesto 17 (7,4 mg, 98% de pureza, 71,819% de rendimiento) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, D²O) 8.31 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 6.32 (d, J=6.4 Hz, 1H), 5.95 (d, J=8.0 Hz, 1H), 5.69 (m, 1H), 4.66 (d, J=4.0 Hz, 1H), 4.40-4.31 (m, 2H), 4.24-4.06 (m, 5H), 2.89-2.84 (m, 1H), 2.51-2.46 (m, 1H); 31P NMR (162 MHz, D²O) 7.56 (s, 1P), -1.86 (s, 1P); LCMS: ESI-MS m/z 657.8 [M+1]+.

Ejemplo de referencia 12

Comp 18 sal de tr ie tilam on io

Paso 1: Preparación del compuesto 12b

A una solución del compuesto 12a (7,8 g, 29,187 mmol) y DMAP (2,995 g, 24,517 mmol) en piridina (240 ml) se le añadió TrCl (27,665 g, 99,236 mmol). Después de calentar la mezcla de la reacción a 80° C durante 5 h, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se inactivó con EtOH (150 ml). La mezcla de la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM:EA=0/1~1:1) para dar el compuesto 12b como un sólido blanco (10,45 g, 13,899 mmol). ESI-MS: m/z 774.1 [M+Na]+.

Paso 2: Preparación del compuesto 12c

Se disolvieron el compuesto 12b (11,5 g, 15,295 mmol) y DMAP (4,671 g, 38,238 mmol) en piridina (300 ml). Esta solución se enfrió a 0° C y se añadió gota a gota una solución de anhídrido tríflico (20,672 ml, 122,362 mmol). La mezcla de la reacción se mantuvo a 0° C durante 30 min y luego se dejó calentar a temperatura ambiente durante un período de 3 h. La mezcla de la reacción se diluyó con CH²Cl² (500 ml) y se extrajo con agua (300 ml a 0° C). Los solventes se eliminaron a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (éter de petróleo (PE)/EtOAc=1:0-1:1) para dar el compuesto 12c como un sólido amorfo blanco (11 g, 10,827 mmol). ESI-MS: m/z 1037.8 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CDCh) 7.89 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.39-7.29 (m, 12H), 7.28-7.17 (m, 18H), 6.98 (s, 1H), 6.45 (t, J=5.2 Hz, 1H), 6.21 (d, J=6.0 Hz, 1H), 5.86-5.81 (m, 1H), 4.48 (q, J=3.6 Hz, 1H), 3.69 (dd, J=4.3, 11.2 Hz, 1H), 3.36 (dd, J=4.0, 11.2 Hz, 1H).

Paso 3: Preparación del compuesto 12d

Se disolvió el compuesto 12c (9,5 g, 9,350 mmol) en tolueno (200 ml) que contenía nitrito de tetrabutilamonio (21,579 g, 74,804 mmol) y agua (26 ml). Después de agitar vigorosamente la mezcla de la reacción durante 40 h, la mezcla se extrajo con t-BuOCH³ (200 ml) y agua (2 x 100 ml). Luego, las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida para dar el producto bruto. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (PE/EtOAc=1:0~2:1) para dar el compuesto 12d como un sólido amorfo blanco (3,87 g, 5,274 mmol). ESI-MS: m/z 756.0 [M+Na]+.

Paso 4: Preparación del compuesto 12e

Se calentó a reflujo (100° C) durante 1 h una mezcla del compuesto 12d (3,87 g, 5,274 mmol), NH⁴Cl (0,564 g, 10,547 mmol), NaN³ (2,1 g, 32,303 mmol), DMF (16 ml) y agua (2,4 ml). Luego, la mezcla de la reacción se extrajo con CH²O² (100 ml) y agua (100 ml). La capa orgánica se lavó con agua (3 x 100 ml), se secó con Na²SO⁴ anhidro, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (PE/EtOAc 1:0~3:1) para dar el compuesto 12e como un sólido amorfo blanco (2,86 g, 3,681 mmol), además del otro isómero (500 mg, 0,245 mmol). ESI-MS: m/z 799.1 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CDCla) 8.00 (d, J=9.3 Hz, 2H), 7.33 (dt, J=1.5, 7.2 Hz, 12H), 7.26-7.17 (m, 18H), 7.05 (s, 1H), 6.05 (d, J=5.2 Hz, 1H), 5.53 (br d, J=8.8 Hz, 1H), 4.58-4.49 (m, 1H), 4.43 (t, J=6.0 Hz, 1H), 3.91-3.83 (m, 1H), 3.49-3.39 (m, 1H), 3.27 (dd, J=4.3, 10.5 Hz, 1H).

Paso 5: Preparación del compuesto 12f

Se añadió gota a gota una solución de DAST (3,798 g, 23,561 mmol) a una solución de 12e (2,86 g, 3,681 mmol) en tolueno (50 ml) y piridina (5,359 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 min, la mezcla de la reacción se calentó a 80° C durante 1 h y luego se diluyó con EtOAc (70 ml). La capa orgánica se lavó sucesivamente con NaHCO³ acuoso al 7% (100 ml), agua (100 ml), se secó con Na²SO⁴ anhidro, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (PE/EtOAc=1:0-5:1) para proporcionar el compuesto 12f como un sólido amorfo amarillento (2,24 g, 2,876 mmol). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 7.97 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.40-7.30 (m, 14H), 7.25-7.17 (m, 16H), 6.11 (d, J=19.6 Hz, 1H), 5.93-5.76 (m, 1H), 4.79-4.68 (m, 1H), 4.29-4.22 (m, 1H), 3.57 (dd, J=3.0, 10.9 Hz, 1H), 3.33 (dd, J=4.0, 11.0 Hz, 1H).

Paso 6: Preparación del compuesto 12g

A una solución del compuesto 12f (1,7 g, 2,183 mmol) en DCM a 0° C se le añadió TFA, Et³SiH y DCM (24 ml). Después de agitar la solución a 25° C durante 2 h, la mezcla de la reacción se inactivó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 (30 ml), se diluyó con DCM (20 ml) y se extrajo con DCM (50 ml x 2). Luego, las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH = 1:0 a 10:1) para dar el compuesto 12g como un sólido blanco (440 mg, 1,495 mmol). ESI-MS: m/z=295.0 [M+1]+.

Paso 7: Preparación del compuesto 12h

A una solución del compuesto 12g (440 mg, 1,196 mmol) en piridina se añadió clorotrimetilsilano a temperatura ambiente. Después de 2 h, la mezcla se enfrió a 0° C y se añadió gota a gota BzCl. Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 h, la mezcla de la reacción se enfrió en un baño de hielo y se inactivó con agua a 0° C. Luego se añadió NH⁴OH y la mezcla de la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Luego, la mezcla se diluyó con DCM (50 ml) y se extrajo con DCM (20 ml). Luego, las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron sobre NaSO⁴, se filtraron y el filtrado se concentró. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM/MeOH: 1/0 a 10/1) para proporcionar el compuesto 12h como un sólido amarillo (372 mg). ESI-MS: m/z=399.1 [M+1]+.

Paso 8: Preparación del compuesto 12i

Se agitó una solución del compuesto 12h (372 mg, 0,934 mmol) y MS 4Á (3 g) en CH³CN (30 ml) a temperatura ambiente en atmósfera de N² durante 3 min. Se añadió 1H-tetrazol (12,451 ml, 5,603 mmol). Después de 10 min, se añadió una solución del compuesto 1o en CH³CN (5 ml) (ChemGenes Corporation) (1,268 g, 1,307 mmol). La mezcla se agitó a 26° C durante 1 h. Luego se añadió hidroperóxido de t-butilo (0,934 ml, 4,669 mmol). Después de agitar a 26° C durante 1 h, la mezcla se filtró y el filtrado se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH = 1:0 a 10:1) para dar el compuesto 12i como un sólido amarillo (1,15 g). ESI-MS: m/z=1283.7 [M+1]+.

Paso 9: Preparación del compuesto 12j

A una solución del compuesto 12i (1,15 g, 0,896 mmol) en agua y DCM se le añadió ácido dicloroacético (406,140 mg, 8,961 mmol) a temperatura ambiente. Luego se añadió trietilsilano (5 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 48 h, se añadió piridina (0,289 ml, 3,584 mmol). Después de agitar durante 10 min, la mezcla se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH=10:1) para proporcionar el compuesto 12j como un sólido blanco (607 mg). ESI-MS: m/z=981.4[M+1]+; 1H NMR (400 MHz, CDCL³) 8.76 (d, J=8 Hz, 1H), 8.36 (s, 1H), 8.12-7.96 (m, 3H), 7.64-7.57 (m, 1H), 7.55-7.47 (m, 2H), 6.39-6.20 (m, 1H), 6.02-5.95 (m, 1H), 4.77-4.62 (m, 1H), 4.47 (br s, 1H), 4.43-4.29 (m, 1H), 4.28-4.16 (m, 2H), 4.15-4.06 (m, 2H), 4.15-4.06 (m, 1H), 4.15-4.06 (m, 1H), 4.05-3.96 (m, 1H), 3.96-3.87 (m, 1H), 3.67 (br t, J=12.0 Hz, 1H), 3.47-3.37 (m, 1H), 2.73-2.58 (m, 3H), 1.28-1.13 (m, 7H), 0.88 (d, J=14 Hz, 9H), 0.12-0.04 (m, 6H).

Paso 10: Preparación del compuesto 12k

A una solución del compuesto 12j (607 mg, 0,619 mmol), 1H-tetrazol (1,031 ml, 0,464 mmol), LiCl (131,162 mg, 3,094 mmol) y MS 4Á en DCM (68 ml) se le añadió dimetil diisopropilfosforamidita (125,54 mg, 0,650 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 72 h, la mezcla se filtró y purificó mediante HPLC preparativa (columna: Phenomenex Gemini C18250*50 10u; fase móvil: agua (NH⁴HCO³10 mM)-ACN del 28% al 58%, caudal: 22 ml/min) para proporcionar el compuesto 12k como un sólido blanco (160 mg). ESI-MS: m/z=978.2 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, CD³OD) 8.81 (s, 1H), 8.30-8.21 (m, 3H), 8.06 (s, 1H), 7.75-7.65 (m, 3H), 6.53 (d, J=17.2 Hz, 1H), 6.24 (d, J=8.4 Hz, 1H), 5.46-5.28 (m, 1H), 5.08-4.97 (m, 1H), 5.02 (dt, J=3.8, 8.4 Hz, 1H), 4.76 (d, J=3.2 Hz, 1H), 4.51-4.36 (m, 2H), 4.29-4.18 (m, 1H), 3.86 (d, J=11.2 Hz, 3H), 2.80-2.69 (m, 1H), 1.28-1.24 (m, 6H), 1.00 (s, 9H), 0.32 (s, 3H), 0.27-0.24 (m, 3H).

Paso 11: Preparación del compuesto 12l

A una solución del compuesto 12k (160 mg, 0,164 mmol) en EtOH (10 ml) se le añadió NH⁴OH concentrado (10 ml) mientras se agitaba. Después de agitar la mezcla de la reacción a 50° C durante 2 días, se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto 12l como un sólido bruto blanco (125 mg). El producto bruto se usó en el paso siguiente sin purificación adicional. ESI-MS: m/z=790.5 [M+1]+.

Paso 12: Preparación de la sal de trietilamonio del compuesto 18

Se agitó una solución del compuesto 12l (125 mg, 0,158 mmol), trietilamina (961,056 mg, 9,498 mmol) y fluoruro de trietilamonio (765,545, 4,749 mmol) en piridina (4 ml) a 50° C durante 5 h. Luego se añadió a la mezcla de la reacción isopropoxitrimetilsilano (3,141 g, 23,744 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se concentró y el residuo se purificó por HPLC preparativa (columna: Agela Durashell C18 150*25 5u; fase móvil: agua (10 mM NH⁴HCO³)-CH³CN del 0% al 15%, caudal: 35 ml/min) para proporcionar el compuesto 5 como su sal de trietilamonio (70 mg, 0,080 mmol) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, D²O) 8.54-7.99 (m, 2H), 7.78 (br s, 1H), 6.25 (br s, 1H), 5.90-5.80 (m, 1H), 5.85 (br s, 1H), 5.71 (br s, 1H), 5.32­ 5.03 (m, 1H), 4.55 (br s, 1H), 4.32-4.01 (m, 6H), 3.94 (br s, 1H). 31P NMR (162 MHz, D²O) 6.42 (br s, 1P), -3.47 (br s, 1P).

Paso 13: Preparación de la sal de sodio detrietilo del compuesto 18

Se añadió un volumen de 70 ml de Dowex 50Wx 8, 200-400 (forma H) a un vaso de precipitados (para 70 mg de sal de trietilamonio del compuesto 18) que luego se lavó con agua desionizada (2x). Se añadió a la resina un volumen de H²SO⁴ al 15% en agua desionizada (100 ml), y la mezcla se agitó durante 15 min, luego se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en agua desionizada y se lavó sucesivamente con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 volúmenes de columna) y luego con agua desionizada hasta que la resina tuvo un pH neutro. La resina se volvió a transferir al vaso de precipitados y se añadió una solución de NaOH al 15% en agua desionizada (100 ml). La mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en agua desionizada (por lo menos 4 volúmenes de columna), y luego con agua hasta pH neutro (por lo menos 4 volúmenes de columna). La sal de trietilamonio del compuesto 18 se disolvió en agua desionizada (70 mg en 50 ml), luego se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua DI. El compuesto 18 eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para dar la sal de sodio de trietilo del compuesto 18 (49,9 mg, 0,068 mmol). ESI-MS: m/z=675.8 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, D²O) 8.39-8.06 (m, 2H), 7.78 (s, 1H), 6.28 (d, J=13.6 Hz, 1H), 5.86 (d, J=0.0 Hz, 1H), 5.69 (s, 1H), 5.35-5.08 (m, 1H), 4.56 (d, J=4.5 Hz, 1H), 4.33-4.06 (m, 6H), 3.99 (d, J=10.4 Hz, 1H). 19F NMR (376 MHz, D²O) -200.54 (s, 1F). 31P NMR (162 MHz, D²O) 6.48 (s, 1P), -2.71 (s, 1P).

El esquema de reacción ilustrado en el Ejemplo de referencia 13 describe una ruta posible para la preparación del compuesto 19 y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ejemplo de referencia 13

El esquema de reacción ilustrado en el Ejemplo de referencia 14 describe una ruta posible para la preparación del compuesto 20 y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ejemplo de referencia 14

El esquema de reacción ilustrado en el Ejemplo de referencia 15 describe una ruta posible para la preparación del compuesto 21 y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ejemplo de referencia 15

El esquema de reacción ilustrado en el Ejemplo de referencia 16 describe una ruta posible para la preparación del compuesto 22 y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ejemplo de referencia 16

Compuesto 22, sal de amonio

El esquema de reacción ilustrado en el Ejemplo de referencia 17 describe una ruta posible para la preparación del compuesto 23 y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ejemplo de referencia 17

Compuesto 23, sal de amonio Compuesto 23, sal de sodio Ejemplo de referencia 18

Paso 1: Preparación del compuesto 15g

Se coevaporó 3'-fluoroguanosina, compuesto 15f (2,0 g, 7,01 mmol) con tolueno anhidro (3 x 20 ml), luego se suspendió en piridina anhidra (35 ml). A esto se le añadió clorotrimetilsilano (8,0 ml, 63,09 mmol) a 0° C. Después de agitar la mezcla de la reacción a ta durante 2 h, la reacción se enfrió a 0° C. Luego se añadió cloruro de isobutirilo (1,46 ml, 14,02 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 h, la mezcla de la reacción se enfrió a 0° C, luego se añadieron agua (15 ml) y NH3 ac. (15 ml). La mezcla de la reacción se agitó durante 30 min, luego se evaporó hasta la sequedad para proporcionar un residuo bruto que se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (N 0-20% MeOH en CH2Cl2, v/v) para proporcionar el compuesto 15g (1,8 g) como un sólido blanco. LCMS: m/z 355.95 (M+1)+.

Paso 2: Preparación del compuesto 18a

Se coevaporó 3'-fluoro-N-isobutiril guanosina, 15g (830 mg, 2,35 mmol) con tolueno anhidro (2 x 20 ml) y se disolvió en DMF anhidro (14 ml). Se añadieron trifenilfosfina (925 mg, 3,52 mmol), NaN³ (458 mg, 7,05 mmol), yoduro de tetrabutilamonio (173 mg, 0,470 mmol) y CBr⁴ (1,16 g, 3,52 mmol) a temperatura ambiente. Después de agitar la mezcla de la reacción durante la noche a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se evaporó hasta la sequedad y la mezcla de la reacción bruta resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (0-20% de MeOH en DCM, v/v) para proporcionar el compuesto 18a (780 mg) como un polvo sólido blanco. ESI-MS: m/z 381.00 [M+H]+.

Paso 3: Preparación del compuesto 18c

Se agitó una solución del compuesto 18a (800 mg, 2,10 mmol), polvo de tamices moleculares 4Á (3g) y perclorato de 1H-imidazol (3,52 g, 21,0 mmol) en CH³CN seco (80ml) a temperatura ambiente en una atmósfera de Ar(g) durante 10 min. Se añadió Amidita 18b (disponible comercialmente, 2,1 g, 2,10 mmol) en CH³CN seco (10 ml). Después de agitar la mezcla de la reacción a temperatura ambiente durante 50 min, se añadió hidroperóxido de tercbutilo (5,5 M, 1,90 ml, 10,5 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó durante 1 h. La mezcla de la reacción se diluyó con EtOAc (150 ml), se lavó con NaHCO3 sat. ac. (1x30 ml) y NaCl sat. ac. (1 x 30 ml), y la fase orgánica se evaporó hasta la sequedad a presión reducida. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (MeOH al 0-15% en CH2Cl2 v/v) para proporcionar el dímero 18c (2,1 g) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z 1283.30 [M+H]+.

Paso 4: Preparación del compuesto 18d

Se disolvió el compuesto 18c (1,1 g, 0,86 mmol) en CH2Cl2 seco (24 ml). A la mezcla se le añadió trietilsilano (0,7 ml, 5,14 mmol) y ácido dicloroacético (0,43 ml, 5,14 mmol). Después de agitar la mezcla de la reacción durante 35 min, la mezcla se inactivó con piridina (0,83 ml, 10,28 mmol) y se evaporó hasta la sequedad. El producto bruto resultante se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (20-80% de acetona en CH²Cl², v/v) para proporcionar el dímero 18d (0,75 g) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z 981.15 [M+H]+.

Pasos 5 y 6: Preparación del compuesto 18f

El compuesto 18d (570 mg, 0,581 mmol) se coevaporó con tolueno anhidro (2 x 20 ml) y se disolvió en CH³CN anhidro (10 ml). Se añadieron polvo de tamices moleculares de 4Á (2 g) y tetrazol (8 ml, 3,48 mmol, 0,45 M en CH³CN), y se burbujeó Ar(g) en la mezcla de la reacción durante 2 min, luego se dejó agitar durante 10 min. ta. Se añadió dimetil-N,N-diisopropilfosforamidita (0,3 ml, 1,16 mmol). Después de agitar la mezcla de la reacción durante 1 h a ta, la mezcla de la reacción se filtró y el filtrado se diluyó con EtOAc (150 ml), luego se lavó secuencialmente con NaHCܳ sat. ac. (1 x 30 ml) y NaCl sat. ac. (1 x 30 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO⁴ (agitando durante 10 min), se filtró y el filtrado se concentró hasta la sequedad bajo presión reducida. El compuesto bruto 18e se usó en el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso ⁶ : se disolvió el compuesto 18e (0,581 mmol) en piridina anhidra (25 ml) y se añadió LiCl (150 mg, 3,48 mmol). Después de agitar la mezcla de la reacción a 50° C durante 5,5 h, la mezcla de la reacción se diluyó con EtOAc (300 ml) y se lavó con agua (1 x 25 ml). La fase acuosa se volvió a extraer con EtOAc (1 x 30 ml). Las fases orgánicas combinadas se concentraron hasta la sequedad y se purificaron mediante cromatografía en columna ultrarrápida (MeOH al 0-15% en CH²Ch v/v) para proporcionar el compuesto 18f (150 mg) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z 1031.15 [M+H]+.

Paso 7: Preparación del compuesto 18g

El compuesto 18f (125 mg, 0,121 mmol) se disolvió en NH³:EtOH acuoso ^{( 8} ml, 3:1, v/v). Después de agitar la reacción durante 20 h a 55° C, la mezcla se concentró hasta la sequedad. El precipitado resultante se purificó por HPLC preparativa (fase móvil: Tampón A: TEAA 50 mM en agua, Tampón B: TEAA 50 mM en CH³CN de un gradiente del 25-65% en 20 min) para proporcionar el compuesto 18g (58 mg) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z 790.25 [M+H]+.

Paso ⁸ : Preparación del compuesto 24

Se disolvió el compuesto 18g (12 mg, 0,021 mmol) en N,N-dimetilformamida (1 ml). A esto se le añadió fluoruro de tetrabutilamonio (0,15 ml, TBAF 1M en THF). Después de agitar la reacción durante 2 h a ta, la mezcla de la reacción se concentró hasta la sequedad y se purificó por HPLC preparativa (fase móvil: tampón A: TEAA 50 mM en agua, tampón B: TEAA 50 mM en CH³CN del 0-25% de gradiente en 20 min) para proporcionar el compuesto 24 (2,5 mg) como su sal TEA. ESI-S: m/z 674.1 [M-1]- .

Paso 9: Preparación de la sal de sodio del compuesto 24

Se añadió un volumen de 3 ml de Dowex 50W x ⁸ , 200-400 (forma H) a un vaso de precipitados (para 2,5 mg de la sal TEA del compuesto 24) y se lavó con agua desionizada (2x). A la resina se le añadió H²SO⁴ al 15% en agua desionizada (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en agua desionizada y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 CV), y luego con agua desionizada hasta pH neutro. La resina se volvió a transferir al vaso de precipitados y se añadió solución acuosa de NaOH al 15% (50 ml), y la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con solución acuosa de NaOH al 15% (por lo menos 4 CV), y luego con agua hasta pH neutro (por lo menos 4 CV). La sal de TEA del compuesto 24 (2,5 mg) se disolvió en agua desionizada (2 ml) y se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua desionizada. El compuesto se eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para dar el compuesto sal de Na4 objetivo (2,0 mg) como una espuma blanca. 1H NMR (400 MHz, D²O,) ⁸ 8.23 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.95 (d, J=8.4 Hz, 1H), 5.42-5.58 (m, 1H), 5.12 (d, J=4 Hz, 0.5H), 5.01 (d, J=4 Hz, 0.5H), 4.62-4.70 (m, 1H), 4.50-4.58 (m, 0.5H), 4.46­ 4.51 (m, 0.5H), 4.40-4.43 (m, 1H), 4.30-4.40 (m, 2H), 3.92-4.02 (m, 1H), 3.15-3.25 (m, 2H); 31P NMR (162 MHz, D²O): ⁸ 7.95, -2.76; 19F NMR (379 MHz, D²O): ⁸ -195.59 (quinteto); ESI-MS: m/z 674.1 [M-1]-.

Ejemplo de referencia 19

Paso 1: Preparación del compuesto 8b

A una solución del compuesto 8a (5,0 g, 18,57 mmol) en piridina (100 ml) se le añadió clorotrimetilsilano (18,16 g, 167,14 mmol) a temperatura ambiente. Después de 1,5 h, se añadió gota a gota a temperatura ambiente cloruro de benzoílo (7,83 g, 55,71 mmol). La mezcla final se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla se inactivó con agua (50 ml) a 0° C y se añadió gota a gota NH³-H²O (5o ml) a 0° C. La mezcla de la reacción se concentró y purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM /MeOH=10/1) para dar el compuesto 8b (5,2 g) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, CD³OD and DMSO-d6) ⁸ 8.73 (d, J=0.8 Hz, 2H), 8.09-8.02 (m, 2H), 7.68-7.65 (m, 1H), 7.59-7.55 (m, 2H), 6.47-6.42 (m, 1H), 5.56-5.41 (m, 1H), 4.71-4.64 (m, 1H), 4.17-4.15 (m, 1H), 3.98-3.94 (m, 1H), 3.81-3.77 (m, 1H).

Paso 2: Preparación del compuesto 17b

El compuesto 8b (1 g, 2,68 mmol) se coevaporó con tolueno anhidro (2 x 20 ml) y se disolvió en DMF anhidro (16 ml). Se añadieron a temperatura ambiente trifenilfosfina (1,05 g, 4,02 mmol), NaN³ (650 mg, 10,00 mmol), yoduro de tetrabutilamonio (197,87 mg, 0,54 mmol), tetrabromuro de carbono (1,33 g, 4,02 mmol). Después de agitar durante la noche a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se evaporó hasta la sequedad y el residuo resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice (DCM/MeOH=10/1) para dar el compuesto 17b (890 mg) como un polvo sólido blanco.

Paso 3: Preparación del compuesto 19b

A una solución del compuesto 19a (5,0 g, 16,82 mmol) en piridina (72 ml) se le añadió clorotrimetilsilano (16,45 g, 151,38 mmol) a temperatura ambiente. Después de 1,5 h, se añadió gota a gota a temperatura ambiente cloruro de isobutirilo (5,38 g, 50,46 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 h, la mezcla de la reacción se inactivó con agua (50 ml) a 0° C y se añadió gota a gota NH³-H²O (50 ml) a 0° C. La mezcla de la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM/MeOH = 10/1) para dar el compuesto 19b (5,28 g) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z 368.1 [M+1]+.

Paso 4: Preparación del compuesto 19c

A una solución del compuesto 19b (1 g, 2,72 mmol) y 1H-imidazol (315,04 mg, 4,63 mmol) en DMF (15 ml) se le añadió TBSCl (656,46 mg, 4,36 mmol) a 0° C. Después de agitar durante 4 h a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se inactivó con MeOH (27 ml) y se concentró hasta obtener un residuo. El residuo se disolvió en DCM (35 ml), se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM/MeOH=20/1) para proporcionar el compuesto 12c (1,19 g) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z 482.2 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, CDCla) ⁶ 8.02 (d, J=5.6 Hz, 1H), 5.76 (d, J=4.4 Hz, 1H), 4.55 (t, J=4.4 Hz, 1H), 4.13 (d, J=3.2 Hz, 1H), 3.93-3.80 (m, 2H), 3.72 (d, J=9.6 Hz, 1H), 3.37 (s, 3H), 1.16 (d, J=^{6 .8} Hz, ⁶ H), 0.81 (s, 9H), 0.00 (d, J=2.4 Hz, ⁶ H).

Paso 5: Preparación del compuesto 19d

A una solución del compuesto 19c (1,19 g, 2,47 mmol) en Py (12 ml) se le añadió 4,4'-(cloro(fenil)metileno) bis(metoxibenceno) (1,67 g, 4,94 mmol) y DMAP (0,33 g, 2,72 mmol), a temperatura ambiente. Después de agitar a 50° C durante la noche, la mezcla de la reacción se inactivó con agua y se extrajo con diclorometano. Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con agua, se secaron (Na²SO⁴) y se filtraron, y se concentró el filtrado. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (diclorometano:metanol = 20:1) para proporcionar el compuesto 19d (1,37 g) como un sólido blanco. ESI-MS-: m/z=784.5 [M+1]+.

Paso ⁶ : Preparación del compuesto 19e

A una solución del compuesto 19d (1,37 g, 1,75 mmol) en THF (5 ml) se le añadió fluoruro de tetrabutilamonio (7,86 ml, 7,86 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 h, la mezcla de la reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con agua. Luego, las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera, se filtraron y se concentraron hasta obtener un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH = 20:1) para dar el compuesto 19e (1,01 g) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z=670.1 [M+1]+.

Paso 7: Preparación del compuesto 19f

A una solución del compuesto 19e (500 mg, 0,75 mmol) y DIPEA (289,469 mg, 2,240 mmol) en THF (1,88 ml) se le añadió 3-((cloro(diisopropilamino)fosfanil)oxi)propanonitrilo (530,10 mg, 2,240 mmol) a 15° C. Después de agitar a temperatura ambiente durante ¹ h, se añadió agua a la mezcla de la reacción y luego la mezcla se extrajo con diclorometano. Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera, se filtraron y se concentraron hasta obtener un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (éter de petróleo:acetato de etilo = 1:2) para dar el compuesto 19f (411 mg). ESI-MS: m/z=787.1 [M-N(Pi)²]+.

Paso ⁸ : Preparación del compuesto 19g

Se agitó una solución del compuesto 17b (134,428 mg, 0,337 mmol) y tamices moleculares de 4Á (2 g) en CH³CN (10 ml) se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de argón durante 3 min. Se añadió 1H-tetrazol (4,499 ml, 2,025 mmol). Después de 10 min, se añadió a temperatura ambiente una solución del compuesto 19f (411 mg, 0,472 mmol) en CH³CN (3,44 ml). Después de agitar a 26° C durante 1 h, se añadió hidroperóxido de terc-butilo (0,337 ml, 1,687 mmol) a la mezcla de la reacción. Después de agitar a 26° C durante 1 h, la mezcla se concentró para proporcionar el compuesto 19g, que se usó para el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso 9: Preparación del compuesto 19h

A una solución del compuesto 19g (239,55 mg, 0,202 mmol) en agua y diclorometano, se le añadió ácido dicloroacético (91,769 mg, 0,712 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 h, se añadió trietilsilano (2 ml) a la mezcla de la reacción. Luego se añadió piridina (0,033 ml, 0,41 mmol). Después de agitar durante ¹⁰ min a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH=10:1) para proporcionar el compuesto 19h (136,8 mg) como un sólido amarillo claro. ESI-MS: m/z=881.2 [M+1]+.

Paso 10: Preparación del compuesto 19i

Se agitó una solución del compuesto 19h (136,8 mg, 0,155 mmol), 1H-tetrazol (0,259 ml, 0,116 mmol), LiCl (32,926 mg, 0,777 mmol) y tamices moleculares 4Á en DCM (17,1 ml) a ta durante 2 h. Se añadió dimetildiisopropilfosforamidita (31,513 mg, 0,163 mmol). Después de agitar a ta durante la noche, la mezcla de la reacción se filtró, concentró y purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa (Columna: Phenomenex Gemini C18250 x 50 10 |jm; Condición: agua (NH⁴HCO³10 mM) (A) - CH³CN (B); Comienzo B: 16; Fin B: 46; Caudal: 22 ml/min) para proporcionar el compuesto 19i (40,1 mg) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z 878.3= [M+1]+.

Paso 11: Preparación del compuesto 25

Se agitó una solución del compuesto 19i (10 mg, 0,011 mmol) en metanamina en EtOH ^{( 6} ml) a 50° C durante 1 día. Luego, la mezcla de la reacción se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa (Columna: DuraShell 150 x 25 mm 5 mm; Condición: agua (NH⁴HCO³ 10 mM) (A) - CH³CN (B); Inicio B: 0; Final B: 15; Caudal: 35 ml/min) para proporcionar el compuesto 25, sal de amonio (1,5 mg) como un sólido blanco. 31P NMR (162 MHz, D²O) ⁸ 7.69, -1.28.

Paso 12: Preparación del compuesto 25

Se añadió un volumen de Dowex (50Wx ⁸ , 200-400, forma H) (99 ml) a un vaso de precipitados (para 74,9 mg de sal de amonio del compuesto 25) y se lavó con agua desionizada (2x). A la resina se le añadió H²SO⁴ al 15% en agua desionizada (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en agua desionizada y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 volúmenes de columna (CV)), y luego con agua desionizada hasta que tuvo un pH neutro. La resina se volvió a transferir al vaso de precipitados y se añadió una solución de NaOH al 15% en agua desionizada (50 ml), y la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en agua desionizada (por lo menos 4 CV), y luego con agua hasta pH neutro (por lo menos 4 CV). La sal de amonio del compuesto 25 se disolvió en agua desionizada (74,9 mg en 25 ml), se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua desionizada. El compuesto 25 eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para proporcionar la sal de sodio del compuesto 25 (63,0 mg). ESI-MS: m/z=689.9 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, D²O) ⁸ 8.08-8.05 (m, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.37-7.36

(m, 1H), 6.41-6.33 (m, 1H), 5.88 (d, J=8.0 Hz, 1H), 5.64 (d, J=4.4 Hz, 1H), 5.44-5.27 (m, 2H), 4.48 (d, J=2.4 Hz, 1H), 4.38-4.30 (m, 2H), 4.20-4.11 (m, 2H), 3.50 (s, 3H), 3.46 (d, J=13.6 Hz, 1H), 3.22-3.18 (m, 1H); 19F NMR (376 MHz, D²O) -196.87 (s, 1F); 31P NMR (162 MHz, D²O) 7.80 (s, 1P), -1.22 (s, 1P).

Ejemplo de referencia 20

Paso 1: Preparación de 20b

A una solución de 20a (1 g, 1,49 mmol) en THF (3,8 ml) y DIPEA (0,58 g, 4,48 mmol) se le añadió 3-((doro(diisopropilamino)fosfino)oxi)propanonitrilo (1,06 g, 4,48 mmol) a temperatura ambiente. Después de agitar la mezcla de la reacción a ta durante 1,5 h, se añadió agua. La capa orgánica se extrajo con DCM (50 ml), se lavó con salmuera y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH=1:0-20:1) para dar 20b (1,35 g) como un sólido incoloro. ESI-MS: m/z=787.2 [M-83]+; 31P NMR (162 MHz, CDCla) 150.71 (s, 1P), 150.48 (s, 1P), 14.18 (s, 1P).

Paso 2: Preparación de 20c

Se agitó una solución de 12h (700 mg, 1,76 mmol) en CH³CN (50 ml) y tamices moleculares 4A (7 g) a temperatura ambiente en atmósfera de N² durante 3 min. Luego se añadió 1H-tetrazol (23,43 ml, 10,54 mmol). Después de agitar durante 10 min, se añadió una solución de 20b (2,06 g, 2,37 mmol) en CH³CN (20 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h seguido de la adición de N,N-dimetil-N'-(3-tioxo-3H-1,2,4-ditiazol-5-il) formimidamida (DDTT, 1,81 g, 8,79 milimoles). Después de agitar durante 1 h a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH = 1:0 a 10:1) para dar 13c como un sólido amarillo (2,1 g). ESI-MS: m/z=1199.5 [M+1]+.

Paso 3: Preparación de 20d

A una solución de 20c (2,1 g) en agua (315,49 mg, 17,51 mmol) y DCM (60 ml) se le añadió ácido dicloroacético (790,316 mg, 6,129 mmol) a temperatura ambiente. Se añadió EtaSiH (12 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 48 h. Se añadió piridina (0,56 ml, 7,0 mmol). Después de agitar durante 10 min, la mezcla de la reacción se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH=1:0~10:1) para proporcionarr 20d como un sólido blanco (901 mg). ESI-MS: m/z=897.3 [M+1]+.

Paso 4: Preparación de 20e

A una solución de 20d (500 mg, 0,56 mmol) en DCM (60 ml) se le añadieron tamices moleculares 4A (5 g), 1H-tetrazol (0,93 ml, 0,42 mmol), LiCl (118,18 mg, 2,79 mmol) seguido de dimetildiisopropilfosforamidita (113,12 mg, 0,58 mmol). Después de agitar la mezcla de la reacción durante 72 h a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y se concentró a presión reducida para obtener 20e bruto (495 mg) que se usó directamente en el paso siguiente sin purificación adicional. ESI-MS: m/z=947.3 [M+1]+.

Paso 5: Preparación de Comp. 26 y Comp. 27

A una solución de 20e (495 mg, bruto) en EtOH (12 ml) se le añadió NH³ H²O (12 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar la mezcla de la reacción a 50° C durante 3 días, la mezcla se filtró y purificó por HPLC preparativa de fase inversa (columna: Agela DuraShell 150 mm x 25 mm x 504; fase móvil: agua (NH⁴HCO³10 mM)-ACN del 1% al 16%, caudal: 25 ml/min) para proporcionar 26 y 27 brutos como un sólido blanco (220 mg). 1H NMR (400 MHz, D²O) ⁸ 8.29 (br s, 1H), 8.13 (br s, 1H), 7.70 (br s, 1H), 6.25 (br d, J=11.8 Hz, 1H), 5.92-5.70 (m, 2H), 5.24­ 4.99 (m, 1H), 4.43-4.26 (m, 3H), 4.20 (br d, J=10.8 Hz, 2H), 4.06 (br s, 3H), 3.49 (s, 2H), 3.56-3.45 (m, 1H); 19F NMR (376 MHz, D²O) -75.65 (s, 1F), -199.98 (br s, 1F); 31P NMR (162 MHz, D²O) 51.33 (br s, 1P), 6.49 (br s, 1P).

Paso ⁶ : Preparación de Comp. 26 y Comp. 27

La mezcla anterior de comp. 26 y comp. 27 se purificó por HPLC preparativa en fase inversa (columna: Phenomenex Synergi C18 150x30 mmx4 um; fase móvil: agua (NH⁴HCO³10 mM)-ACN del 0% al 15%, caudal: 25 ml/min) para proporcionar sal de amonio de 26 (16,3 mg) y sal de amonio de 27 (50,1 mg) como sólidos blancos.

Paso 7: Preparación de sal de sodio 26

Se añadió un volumen de 20 ml de Dowex 50Wx ⁸ , 200-400 (forma H) a un vaso de precipitados (para 16,3 mg de 26) y se lavó con agua desionizada (2x). A la resina se le añadió H²SO⁴ al 15% en agua desionizada (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en agua desionizada y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 volúmenes de columna (CV)), y luego con agua desionizada hasta que tuvo un pH neutro. La resina se volvió a transferir al vaso de precipitados y se añadió una solución de NaOH al 15% en agua desionizada (50 ml), y la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en agua desionizada (por lo menos 4 CV), y luego con agua hasta pH neutro (por lo menos 4 CV). La sal de amonio del compuesto 26 se disolvió en agua desionizada (16,3 mg en 20 ml), se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua desionizada. El compuesto 26 se eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para dar la sal de sodio del compuesto 26 (8,5 mg). ESI-MS: m/z=705.8; 1H NMR (400 MHz, D²O) ⁸ 8.50 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 6.35 (d, J=13.6 Hz, 1H), 5.94-5.80 (m, 2H), 5.33-5.10 (m, 1H), 4.45-4.35 (m, 2H), 4.30-4.13 (m, 4H), 4.09-4.01 (m, 2H), 3.51 (s, 3H); 19F NMR (377 MHz, D²O) 6-200.69 (s, 1F); 31P NMR (162 MHz, D²O) ⁸ 53.89 (s, 1P), 6.60 (s, 1P).

Paso ⁸ : Preparación de sal de sodio de 27

Se añadió un volumen de 50 ml de Dowex 50Wx ⁸ , 200-400 (forma H) a un vaso de precipitados (para 50,1 mg de 27) y se lavó con agua desionizada (2x). A la resina se le añadió H²SO⁴ al 15% en agua desionizada (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en agua desionizada y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 volúmenes de columna (CV)), y luego con agua desionizada hasta que tuvo un pH neutro. La resina se volvió a transferir al vaso de precipitados y se añadió una solución de NaOH al 15% en agua desionizada (50 ml), y la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en agua desionizada (por lo menos 4 CV), y luego con agua hasta pH neutro (por lo menos 4 CV). La sal de amonio del compuesto 27 se disolvió en agua desionizada (50,1 mg en 50 ml), se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua desionizada. El compuesto 27 se eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para dar la sal de sodio del compuesto 27 (29 mg). ESI-MS: m/z=705.8; 1H NMR (400 MHz, D²O) ⁸ 8.25-8.11 (m, 2H), 7.80 (s, 1H), 6.30 (d, J=13.8 Hz, 1H), 5.85-5.73 (m, 2H), 5.33-5.12 (m, 1H), 4.51-4.42 (m, 2H), 4.33-4.26 (m, 2H), 4.22-4.11 (m, 2H), 4.09­ 4.00 (m, 2H), 3.50 (s, 3H); 19F NMR (377 MHz, D²O) 6-200.70 (s, 1F); 31P NMR (162 MHz, D²O) ⁸ 51.87 (s, 1P), 6.53 (s, 1P).

Ejemplo de referencia 21

Compuestos 28, 29, 30 y 31

Paso 1: Preparación de 21a

A una solución de 12h (500 mg, 1,22 mmol) en piridina ^{( 6} ml) se le añadió DMTrCI (0,638 g, 1,88 mmol) a temperatura ambiente. Después de agitar la mezcla de la reacción durante 4 h a temperatura ambiente, se diluyó con CH²Cl² (30 ml) y se inactivó con agua. La mezcla de la reacción se extrajo con CH²Cl² (20 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (CH²Cb: MeOH = 1:0 a 10:1) para dar 21a como un sólido amarillo (933 mg). 1H NMR (400 MHz, CLOROFORMO-d) 69.10 (s, 1H), 8.82-8.75 (m, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.66-8.57 (m, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.04 (d, J=7.3 Hz, 2H), 7.72-7.59 (m, 2H), 7.58-7.50 (m, 1H), 7.58­ 7.50 (m, 1H), 7.36 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.26-7.23 (m, 4H), 6.80 (d, J=8.3 Hz, 4H), 6.26 (dd, J=1.6, 18.4 Hz, 1H), 5.99­ 5.82 (m, 1H), 4.76-4.65 (m, 1H), 4.35-4.29 (m, 1H), 3.67-3.57 (m, 1H), 3.37 (dd, J=3.6, 11.2 Hz, 1H); ESI-MS: m/z=701.1 [M+1]+.

Paso 2: Preparación de 21b

Una mezcla de 21a (933 mg, 1,105 mmol) con Pd/C (2,606 g, 2,210 mmol) como catalizador en EtOAc (130 ml) se hidrogenó a temperatura ambiente (presión atmosférica). Después de 2 h, el catalizador se eliminó por filtración y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (CH²Ch: MeOH = 1:0 a 10:1) para proporcionar 21b como un sólido blanco (712 mg). 1H NMR (400 MHz, CLOROFORMO-d) 69.07 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.07­ 7.99 (m, 2H), 7.65-7.58 (m, 1H), 7.56-7.50 (m, 2H), 7.41-7.36 (m, 2H), 7.30 (d, J=1.2 Hz, 2H), 7.28-7.27 (m, 2H), 7.25-7.17 (m, 2H), 6.82-6.77 (m, 4H), 6.30 (d, J=18 Hz, 1H), 5.51-5.34 (m, 1H), 4.13-4.00 (m, 2H), 3.64-3.56 (m, 1H), 3.44 (dd, J=3.6, 10.8 Hz, 1H); ESI-MS: m/z=675.1 [M+1]+.

Paso 3: Preparación de 21c

Se destiló azeotrópicamente una mezcla de 21b (300 mg, 0,445 mmol) y 5-bencilmercaptotetrazol (BMT) (213,69 mg, 1,11 mmol) con acetonitrilo tres veces y se disolvió en DMF anhidro (20 ml). Se añadió gota a gota una solución de 19f (1,54 g, 1,78 mmol) en DMF (4 ml) a ta en N² y la mezcla de la reacción se agitó a ta durante 1 hora. Se añadieron a la mezcla de la reacción hidruro de xantano (133,60 mg, 0,89 mmol) y piridina (140,68 mg, 1,78 mmol). Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, se añadió una solución acuosa saturada de NaHCO³ (20 ml) y la mezcla se extrajo con CH²Cl² (50 ml). Luego, las capas orgánicas se combinaron y se lavaron sucesivamente con NaHCO³ acuoso saturado (30 ml), salmuera (50 ml), luego se secaron sobre Na²SO⁴⁴ , se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (CH²Ch/MeOH = I/O a 10/1) para proporcionar 21c (510 mg) como un aceite amarillo. ESI-MS: m/z=1174.3 [M+1]+.

Paso 4: Preparación de 21d

A una solución de 21c (3,1 g) en agua (476,03 mg, 26,42 mmol) y CH²CI² (100 ml) se le añadió ácido dicloroacético (1,19 g, 9,248 mmol, ⁶ % en DCM) a temperatura ambiente, seguido de trietilsilano (20ml). Después de agitar a ta durante 24 h, se añadió piridina (0,85 ml). Después de agitar durante 10 min, la mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (CH²Ch:MeOH = 1:0 a 10:1) para dar como un sólido amarillo (1,247 g). 1H NMR (400 MHz, CD³OD) 68.67 (d, J=2.4 Hz, 1H), 8.64 (d, J=4.2 Hz, 1H), 8.19-8.14 (m, 1H), 8.12-8.03 (m, 1H), 8.12-8.03 (m, 3H), 7.68-7.61 (m, 1H), 7.59­ 7.51 (m, 2H), 6.39 (dd, J=11.8, 18.0 Hz, 1H), 5.91-5.83 (m, 1H), 5.91-5.83 (m, 1H), 5.62-5.38 (m, 1H), 4.71-4.51 (m, 2H), 4.44-4.11 (m, ⁸ H), 4.09-3.96 (m, 2H), 3.85-3.73 (m, 1H), 3.85-3.73 (m, 1H), 3.34 (s, 1H), 1.22-1.17 (m, 7H); ESI-MS: m/z=1174.3 [M+1]+.

Paso 5: Preparación de 21e

Se coevaporó el compuesto 21d (370 mg, 0,425 mmol) con una mezcla de tolueno anhidro: acetonitrilo (1:1, v/v, 3 x 10 ml). Luegon, el residuo resultante se disolvió en CH³CN/THF (35 ml, v/v = 7:3), seguido de la adición de tamices moleculares 4Á (4 g) y tetrazol (7,55 ml, 0,45 M en CH³CN). Después de agitar a 25° C durante 0,5 h, se añadió a la solución anterior 3-((bis(diisopropilamino)fosfino)oxi)propanonitrilo (204,91 mg, 0,68 mmol) en CH³CN (10 ml). La mezcla se agitó a 25° C durante 2 h y se añadió tetrazol adicional (1,88 ml, 0,45 M en CH³CN) a la solución anterior. Después de agitar la mezcla a 25° C durante 0,5 h, se añadió a la solución DDTT (436,20 mg, 2,14 mmol). Después de agitar la mezcla a 25° C durante 1,5 h, la mezcla de la reacción se filtró, se concentró a presión reducida y se purificó con un segundo lote mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (CH²Cl²: MeOH=10:1) para dar 21e (436 mg).

Paso ⁶ : Preparación de 28 a 31

A una solución de 21e (463 mg, 0,46 mmol) en EtOH (20 ml) se añadió NH³.H²O (20 ml). Después de agitar la solución resultante a 50° C durante 2 días, la mezcla se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto 27 como una mezcla de diastereoisómeros. A continuación, el compuesto 27 se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna: Agela Durashell C18 150 x25 5 pM; fase móvil: agua (0,05% de hidróxido amónico v/v) - CH³CN del 0% al 13%, caudal: 35 ml/min) para obtener un producto bruto que se volvió a purificar mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna: Agela Durashell C18 150 x 255 pM; fase móvil: agua (0,05% de hidróxido de amoniaco v/v) - ACN del 0% al 10%, caudal: 35 ml/min) para proporcionar los compuestos 28 (10,6 mg), 29 (13,6 mg), 30 (8,3 mg) y 31 (5,5 mg) como sólidos blancos (sales de amonio). LCMS para 28 a 31 - ESI-MS: m/z=721.7 [M+1]+.

Paso 7: Preparación de 28, sal de sodio

Se añadió un volumen de 15 ml de Dowex 50Wx ⁸ , 200-400 (forma H) a un vaso de precipitados (para 10,6 mg de sal de amonio 15) y se lavó con agua desionizada (2x). A la resina se le añadió H²SO⁴ al 15% en agua desionizada (50 ml), la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en agua desionizada y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 volúmenes de columna (CV)), y luego con agua desionizada hasta que tuvo un pH neutro. La resina se volvió a transferir al vaso de precipitados y se añadió una solución de NaOH al 15% en agua desionizada (50 ml), y la mezcla se agitó durante 15 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en agua desionizada (por lo menos 4 CV), y luego con agua hasta pH neutro (por lo menos 4 CV). La sal de amonio del compuesto 15 se disolvió en agua desionizada (10,6 mg en 15 ml), se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua desionizada. El producto deseado se eluyó en las primeras fracciones detectadas por TLC (UV). El producto se liofilizó para dar sal de sodio 28 (9,2 mg) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z=721.7 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, D²O) 8.42 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 6.34 (d, J=14.3 Hz, 1H), 5.83 (d, J=^8.8 Hz, 1H), 5.70-5.47 (m, 2H), 4.48 (br d, J=2.3 Hz, 1H), 4.51-4.46 (m, 1H), 4.39 (br d, J=11.8 Hz, 1H), 4.27-4.18 (m, 3H), 4.12-4.03 (m, 3H), 3.49 (s, 3H); 19F NMR (376 MHz, D²O) -122.38 (br s, 1F), -199.72 (br s, 1F); 31P NMR (162 MHz, D²O) 55.75 (br s, 1P), 53.63 (s, 1P).

Paso ⁸ : Preparación de 29, sal de sodio

El compuesto 29, sal de sodio (12 mg) se preparó como un sólido blanco siguiendo el mismo procedimiento que en el paso 7 (preparación de 28, sal de sodio); ESI-MS: m/z=721.7 [M+1]+; 11-1 NMR (400 MHz, D²O) 8.46 (br s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 6.32 (d, J=13.8 Hz, 1H), 5.90-5.78 (m, 2H), 5.30-5.11 (m, 1H), 4.47 (br s, 1H), 4.43­ 4.35 (m, 1H), 4.32-4.18 (m, 4H), 4.08-3.95 (m, 2H), 3.49 (s, 3H); 19F NMR (376 MHz, D²O) -122.77 (br s, 1F), -199.68 (br s, 1F); 31P NMR (162 MHz, D²O) 56.01 (s, 1P), 53.31 (br s, 1P).

Paso 9: Preparación de 30, sal de sodio

El compuesto 30, sal de sodio (7,2 mg) se preparó como un sólido blanco siguiendo el mismo procedimiento que en el paso 7 (preparación de 28, sal de sodio). ESI-MS: m/z=721.7 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, D²O) 8.17 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 6.34-6.26 (m, 1H), 5.82 (d, J=^8.8 Hz, 1H), 5.67-5.44 (m, 2H), 4.51 (br s, 1H), 4.46-4.38 (m, 1H), 4.34 (br d, J=4.3 Hz, 1H), 4.24 (br d, J=10.5 Hz, 1H), 4.16-3.99 (m, 4H), 3.47 (s, 3H); 19F NMR (376 MHz, D²O) -122.35 (s, 1F), -199.36 (br s, 1F); 31P NMR (162 MHz, D²O) 56.00-55.06 (m, 1P), 51.89 (s, 1P).

Paso 10: Preparación de 31, sal de sodio

El compuesto 31, sal de sodio (4,5 mg) se preparó como un sólido blanco siguiendo el mismo procedimiento que en el paso 7 (preparación de 28, sal de sodio). ESI-MS: m/z=721.7 [M+1]+; H NMR (400 MHz, D²O) 8.16 (d, J=3.0 Hz, 2H), 7.77 (s, 1H), 6.29 (d, J=13.8 Hz, 1H), 5.81-5.76 (m, 1H), 5.73-5.65 (m, 1H), 5.35-5.17 (m, 1H), 4.50 (br s, 1H), 4.43 (br d, J=12.0 Hz, 1H), 4.35-4.22 (m, 4H), 4.08 (dd, J=3.3, 11.8 Hz, 1H), 3.97 (dd, J=2.4, 11.9 Hz, 1H), 3.46 (s, 3H); 19F NMR (376 MHz, D²O) -122.24 (s, 1F), -199.92 (s, 1F); 31P NMR (162 MHz, D²O) 55.73 (s, 1P), 51.80 (s, 1P).

Ejemplo de referencia 22

Paso 1: Preparación del compuesto 8b

A una solución del compuesto 8a (30 g, 111,428 mmol) en piridina (400 ml) se le añadió gota a gota TMSCl (84,85 ml, 668,57 mmol) a ta. Después de agitar la mezcla durante 40 min, se añadió gota a gota cloruro de benzoílo (46,99 g, 334,28 mmol) a ta. Después de agitar a temperatura ambiente durante la noche, la mezcla se filtró y el filtrado se inactivó con agua (120 ml) a 0° C, seguido de la adición de NH³.H²O (120 ml), gota a gota, a 0° C. agitando la mezcla a 15° C durante 0,5 h, la mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se diluyó con acetato de etilo (600 ml). El sólido se recogió por filtración para proporcionar 8b (70 g) que se usó directamente para el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso 2: Preparación del compuesto 8c

A una solución del compuesto 8b (30 g, 80,35 mmol) en piridina (250 ml) se le añadió cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (54,45 g, 160,71 mmol). Después de agitar a ta durante 3 h, se añadió EtOAc (1 l) y la mezcla se filtró. La capa orgánica se lavó sucesivamente con salmuera (300 ml x 3), se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (MeOH en DCM = del 0% al 5%) para dar el compuesto 8c (31,2 g) como un sólido blanco. ESl-MS: m/z 676.3 [M H]+.

Paso 3: Preparación del compuesto 8d

A una solución del compuesto 8c (31,2 g, 46,17 mmol) y 1H-imidazol (9,43 g, 138,52 mmol) en DMF (500 ml) se lw añadió terc-butilclorodimetilsilano (13,92 g, 92,35 mmol) a temperatura ambiente en N². Después de agitar la mezcla de la reacción a ta durante 3 h, la mezcla se inactivó con agua (1000 ml) y se extrajo con EtOAc (400 ml x 3). Luego, las capas orgánicas combinadas se secaron sucesivamente sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y el filtrado se concentró para dar el producto bruto como un aceite amarillo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (MeOH en DCM = del 0% al 5%) para dar 8d (29 g) como un sólido amarillo. ESl-MS: m/z 790.4 [M+H]+.

Paso 4: Preparación del compuesto 8e

A una solución del compuesto 8d (29 g, 36,71 mmol) en DCM (160 ml) se le añadió DCM (320 ml) seguido de TFA ^{( 8} ml) y EtaSiH (32 ml) a 0° C. Después de agitar durante 0,5 h a 0° C y luego a 25° C durante 4 h, la mezcla de la reacción se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (MeOH en DCM = del 0% al 5%) para dar 8e (11,5 g, 21,60 mmol) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z 488.2 [M+H]+.

Paso 5: Preparación del compuesto 8f

A una solución del compuesto 8e (11,5 g, 23,58 mmol) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (19,46 g, 94,34 mmol) en DMSO (80 ml) se le añadió piridina (2,65 g, 33,49 mmol) y trifluoroacético (2,01 g, 17,69 mmol) a 25° C. Después de agitar la mezcla a 25° C durante 17 h, la mezcla de la reacción se diluyó con EtOAc (400 ml) y agua (200 ml). La capa orgánica se lavó sucesivamente con salmuera ^{( 100} ml x ² ), se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para dar 8f (11,45 g, 23,58 mmol) que se usó para el paso siguiente sin ninguna purificación adicional. ESI-MS: m/z 518.1 [M+33]+.

Paso ⁶ : Preparación del compuesto 22b

A una solución del compuesto 22a (6,39 g, 27,52 mmol) en THF (75 ml) se le añadió NaH al 60% (1,43 g, 35,78 mmol) a 0° C. Después de agitar la mezcla a 0° C durante 0,5 h, se le añadió gota a gota una solución del compuesto 8f (11,45 g, 23,58 mmol) en THF (75 ml) a 0° C. Después de agitar a 0° C durante 1 h y luego a 25° C durante ² h, la mezcla de la reacción se diluyó con NH⁴Cl acuoso saturado ^{( 100} ml) y se extrajo con EtOAc (150 ml x 2). Luego, las capas orgánicas se combinaron y se lavaron sucesivamente con salmuera (130 ml), se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (MeOH en DCM = del 0% al 5%) para dar 22b (6,1 g) como un sólido amarillo. ESI-MS: m/z 592.1 [M+H]+.

Paso 7: Preparación del compuesto 22c

Se agitó una solución del compuesto 22b (1,1 g, 1,86 mmol) y óxido de platino (IV) (0,33 g, 1,48 mmol) en EtOH (30 ml) a temperatura ambiente durante la noche en atmósfera de hidrógeno (15 Psi). Luego, la mezcla se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM/MeOH = 20/1) para dar 22c (0,8 g) como un sólido amarillo. ESI-MS: m/z 594.1 [M+H]+.

Paso ⁸ : Preparación del compuesto 22d

Se añadió solución de LiBr en THF (30,32 ml, 0,5 M en THF) a 22c (3 g, 5,05 mmol) a 25° C. Después de agitar la mezcla a 50° C durante 48 h, se añadieron CH³CN (30 ml), agua (60 ml) y HCl acuoso 1 M (10 ml). Luego, la mezcla se liofilizó. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (MeOH en DCM = del 0% a l15%) para dar 22d (2,4 g) como un sólido amarillo. ESI-MS: m/z=580.1 [M+1]+.

Paso 9: Preparación del compuesto 22e

Se destiló azeotrópicamente una mezcla del compuesto 22d (1,8 g, 3,105 mmol) y el compuesto 20a (2,49 g, 3,72 mmol) con 30 ml de piridina seca (3x). La mezcla resultante se diluyó con DCM/THF anhidro (80 ml, 1:1, v/v) seguido de la adición de tamices moleculares 4Á (200 mg), NMI (3,06 g, 37,26 mmol) y TPSCl (2,82 g, 9,31 milimoles). La solución resultante se agitó a 25° C durante 48 h en atmósfera de nitrógeno. La reacción se inactivó con una solución acuosa saturada de NaHCO³ (100 ml) y se filtró. El filtrado se extrajo con DCM (80 ml x 3); luego se combinaron las capas orgánicas, se secaron sobre MgSO⁴ anhidro, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (MeOH en DCM = del 0% al 10%) para dar el producto bruto como un sólido amarillo (3 g). El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa (Columna: Phenomenex Gemini 250 x 50 mm x 10 pm; Condición: H²O (NH⁴HCO³ 10 mM)(A) - CH³CN (B); Inicio B: 55; Final B: 85; Caudal: 110 ml/min) para dar 22e (1,01 g) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z 1231.7 [M+H]+. 1H NMR (CD3CNd³ , 400 MHz) ⁶ 11.73-12.00 (m, 1H), 9.69 (br s, 1H), 9.34 (br s, 1H), 8.53 (br s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.81-7.94 (m, 2H), 7.70 (d, J=9.3 Hz, 1H), 7.36-7.53 (m, 3H), 7.24 (br d, J=7.7 Hz, 2H), 7.01­ 7.15 (m, 7H), 6.60-6.69 (m, 4H), 5.97-6.16 (m, 1H), 5.79-5.88 (m, 1H), 5.24-5.56 (m, 2H), 4.46-4.68 (m, 1H), 3.99­ 4.11 (m, 2H), 3.81-3.97 (m, 1H), 3.59 (s, ⁶ H), 3.39 (s, 1H), 3.34-3.37 (m, 1H), 3.36 (s, 1H), 3.27 (s, 1H), 3.17 (s, 3H), 2.36-2.55 (m, 1H), 0.91-1.01 (m, ⁶ H), 0.77-0.82 (m, 9H), -0.12-0.08 ppm (m, ⁶ H).

Paso 10: Preparación del compuesto 22f

A una solución del compuesto 22e (400 mg, 0,325 mmol) en THF (4 ml) se le añadió TBAF 1M en THF (0,975 ml, 0,975 mmol) a 25° C. La mezcla se agitó a 25° C durante 2 h y luego se diluyó con acetato de etilo (20 ml) y agua (15 ml). La mezcla se extrajo con acetato de etilo (20 ml x 2). Luego, las capas orgánicas se combinaron y se lavaron sucesivamente con salmuera (50 ml), se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (MeOH en DCM = del 0% al 5%) para proporcionar 22f (325 mg) como un sólido amarillo. ESI-MS: m/z 1117.3 [M+H]+.

Paso 11: Preparación del compuesto 22g

A una solución del compuesto 22f (325 mg, 0,29 mmol) en DCM (4 ml) se le añadió agua (52,37 mg, 2,93 mmol) y DCA al ⁶ % en DCM (4 ml). La mezcla se agitó a 25° C durante 1 h. Luego se añadió a la mezcla piridina hasta que la mezcla de la reacción roja se volvió incolora. La reacción de la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (MeOH en DCM = del 0% al 15%) para dar 22g (180 mg) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z 815.1 [M+H]+.

Paso 12: Preparación del compuesto 22i

A una solución del compuesto 22g (180 mg, 0,22 mmol) en CH³CN/THF (21,6 ml, v/v=1:1) se le añadió tamiz molecular 4Á (500 mg) y tetrazol (3,96 ml, 0,45 M en CH³CN). Después de agitar la mezcla de la reacción a 25° C durante 0,5 h, se le añadió gota a gota 3-((bis(diisopropilamino)-fosfanil)oxi)propanonitrilo (133,18 mg, 0,44 mmol) en CH³CN (1,8 ml). Después de agitar la mezcla a 25° C durante 2 h, a la solución anterior se le añadió tetrazol adicional (1 ml, 0,45 M en CH³CN). La mezcla se agitó a 25° C durante 0,5 h para dar el compuesto 22h. Luego, se añadió reactivo de Beaucage (1,1 -dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona, 221,19 mg, 1,105 mmol). La mezcla se agitó a 25° C durante 0,5 h y luego se filtró. El filtrado se concentró a presión reducida para dar 22i (250 mg bruto) ESI-MS: m/z 946.3 [M+H]+.

Paso 13: Preparación del compuesto 32

A una solución del compuesto 22i (80 mg, 0,085 mmol) en EtOH (5 ml) se le añadió NH³.H²O (5 ml). Después de agitar la mezcla a 50° C durante 48 h, la mezcla de la reacción se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna: Synergi 4 pM, Hydro RP, 250 mm x 30 mm, Fase móvil: Tampón A: Acetato de trietilamonio 50 mM en H²O; Tampón B: Acetato de trietilamonio 50 mM en CH³CN, gradiente: 0-30% de B durante 30 min, caudal de 24 ml/min) y seguido de una segunda purificación mediante HPLC preparativa de fase inversa (Kinetex 5 pm, 100 A; 250 x 21,2 mm Tampón A: 0,1% de ácido fórmico en tampón de H²O B: ácido fórmico al 0,1% en MeCN; Caudal: 15 ml/min, gradiente 0-30% de tampón B en 30 min) para proporcionar el compuesto 32 (6,9 mg) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z: 703.00 [M-1]-. ESI-MS: m/z 705.10 [M+H]+.

Preparación del compuesto 32, sal de sodio

Se añadió Dowex 50W x ⁸ , 200-400 (5 ml, forma H) a un vaso de precipitados y se lavó con agua desionizada (30 ml). A la resina se le añadió H²SO⁴ al 15% en agua desionizada y la mezcla se agitó suavemente durante 5 min y luego se decantó (30 ml). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en agua desionizada y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 volúmenes de columna), y luego se lavó con agua desionizada hasta que se volvió neutra. La resina se devolvió al vaso de precipitados, se añadió una solución de NaOH al 15% en agua desionizada y la mezcla se agitó suavemente durante 5 min y se decantó (1x). La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en agua (por lo menos 4 volúmenes. de columna) y luego con agua desionizada hasta que se volvió neutra. La sal de trietilamonio del compuesto 32 (6,9 mg) se disolvió en una cantidad mínima de agua desionizada, se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua desionizada. Las fracciones se agruparon y liofilizaron para proporcionar la sal de sodio del compuesto 32 (6,1 mg) como un sólido blanco (contiene alrededor del ²⁰ % de impurezas u otros isómeros con el mismo peso molecular - datos analíticos del producto principal). 1H NMR (400 MHz, D²O) ⁸ 8.08 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 6.22 (d, 1H), 5.79-5.85 (m, 1H), 5.53-5.70 (m, 1H), 4.73-5.13 (m, 3H), 4.45-4.50 (m, 1H), 4.21-4.35 (m, 1H), 3.40-4.19 (m, 4H), 3.45 (s, 3H), 1.78-1.90 (m, 2H), 1.60-1.70 (m, 2H); 31P NMR (162 MHz, D²O) ⁸ 54.66 (PS peak), 25.13 (1.0, Phosphonate); 19F NMR (379 MHz, D²O) 6-199.48 (m); ESI-MS: m/z: ESI-MS:703.00 [M-1]-. ESI-MS: m/z 705.10 [M+H]+.

Ejemplo de referencia 23

Paso 1: Preparación de 23a

A una solución del compuesto 19c (1 g, 2,02 mmol) en DCM (20 ml) se le añadió peryodinano de Dess-Martin (1,45 g, 3,43 mmol) bajo N². Después de agitar la mezcla de la reacción a temperatura ambiente durante 16 h, se añadió NaHCO³ acuoso saturado (20 ml) que contenía Na²S²O³ (3 g) y la mezcla se agitó durante 0,5 h. La capa orgánica se separó y se lavó con NaHCO³ acuoso saturado (20 ml). Luego, las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (eluyente en gradiente: EtOAc/éter de petróleo de 0/100 a 1/0) para dar 23a (1 g) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z=498.1 [M+H²O]+

Paso 2: Preparación de 23b

A una solución enfriada previamente a 0° C de 23a en etanol (10 ml) se le añadió NaBH⁴ (0,14 g, 3,63 mmol). La mezcla de la reacción se agitó a 0° C durante 10 min, luego a ta durante 30 min y luego se diluyó con EtOAc (20 ml) y salmuera (10 ml). La capa acuosa se extrajo con EtOAc (10 ml). Luego, las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (eluyente en gradiente: EtOAc/éter de petróleo de 0/100 a 1/1) para dar 23b (300 mg) y se recuperó 23a (200 mg) como sólidos blancos. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶ ) ⁶ ppm 12.07 (s, 1H) 11.71 (s, 1H) 8.00 (s, 1H) 6.06 (d, J=4.85 Hz, 1H) 5.85 (d, J=5.29 Hz, 1H) 4.24­ 4.34 (m, 1H) 3.76-3.93 (m, 4H) 3.40 (s, 3H) 2.76 (quin, J=6.84 Hz, 1H) 1.12 (d, J=6.84 Hz, ⁶ H) 0.90 (s, 9H) 0.04-0.13 (m, ⁶ H); ESI-MS: m/z=482.1 [M+1]+.

Paso 3: Preparación de 23c

A una solución del compuesto 23b (120 mg, 0,22 mmol) en piridina (4 ml) y DIEA (87,96 mg, 0,68 mmol) se le añadió cloruro de difenilcarbamilo (105,11 mg, 0,45 mmol). Después de agitar a 25° C durante 1 h, la mezcla de la reacción se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (eluyente en gradiente: EtOAc/éter de petróleo de 0/100 a 1/0) para dar 23c (110 mg) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, CDCh-d) ⁶ ppm 8.32 (s, 1H) 7.96 (s, 1H) 7.31-7.51 (m, ⁸ H) 7.25 (br s, 2H) 6.21 (d, J=3.01 Hz, 1H) 4.90 (d, J=9.54 Hz, 1H) 4.37 (br d, J=9.03 Hz, 1H) 4.14 (d, J=2.26 Hz, 1H) 3.98 (s, 1H) 3.94 (d, J=3.01 Hz, 1H) 3.92-3.99 (m, 1H) 3.82 (dd, J=11.17, 2.38 Hz, 1H) 3.50 (s, 3H) 2.93 (br s, 1H) 1.27 (d, J=6.78 Hz, ⁶ H) 0.93 (s, 9H) 0.14 (s, ⁶ H); ESI-MS: m/z=699.6 [M+Na]+.

Paso 4: Preparación de 23d

A una solución del compuesto 23c (200 mg, 0,28 mmol) en piridina (5 ml) se le añadió Tf²O (606,11 mg, 2,14 mmol) a 0° C. Después de agitar a 0-5° C durante 3 h, la mezcla de la reacción se diluyó con DCM (10 ml) y se lavó con salmuera (5 ml x 1). Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con DCM (10 ml x 2). Luego, las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (eluyente en gradiente: EtOAc/éter de petróleo de 0/100 a 1/1) para dar 23d (250 mg) como un sólido blanco. ESI-MS: m/z=831.2 [M+Na]+.

Paso 5: Preparación de 23e

A una solución del compuesto 23d (610 mg, 0,75 mmol) en DMF (15 ml) se le añadió azida sódica (814 mg, 7,06 mmol). Después de agitar a 25° C durante 16 horas, la mezcla se diluyó con DCM (100 ml) y se lavó con NaHCO³ acuoso saturado (50 ml) y salmuera (50 ml). Luego, las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo oleoso se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (eluyente en gradiente: EtOAc/éter de petróleo de 0/100 a 1/00 para dar 23e (500 mg) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶ ) ⁶ ppm 12.12 (s, 1H) 11.68 (s, 1H) 8.21 (s, 1H) 5.91 (d, J=4.63 Hz, 1H) 4.87 (t, J=4.96 Hz, 1H) 4.26 (br t, J=5.07 Hz, 1H) 4.08 (br d, J=4.41 Hz, 1H) 3.86 (br dd, J=11.47, 4.19 Hz, 1H) 3.71-3.81 (m, 1H) 3.46 (s, 3H) 2.77-2.82 (m, 1H) 1.12 (d, J=6.84 Hz, ⁶ H) 0.87 (s, 9H) 0.06 (s, ⁶ H); ESI-MS: m/z=507.2 [M+1]+.

Paso ⁶ : Preparación de 23f

A una solución del compuesto 23e (450 mg, 0,84 mmol) en THF (10 ml) se le añadió TBAF (1,52 ml, 1,52 mmol, 1 M en THF) a 0° C. Después de agitar a temperatura ambiente durante 4 h, la mezcla se concentró a presión reducida para dar un aceite. El aceite se disolvió en DMCM (50 ml) y se lavó con salmuera (20 ml). Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con CDM (20 ml x 2). Luego, las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (eluyente en gradiente: DCM/MeOH de 1/0 a 100/7) para dar 23f (220 mg) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, CDCh-d) ⁶ ppm 12.13 (br s, 1H) 8.57 (br s, 1H) 7.81 (s, 1H) 5.84 (d, J=7.72 Hz, 1H) 5.08 (br s, 1H) 4.59 (dd, J=7.50, 5.29 Hz, 1H) 4.33 (d, J=1.76 Hz, 1H) 4.20 (dd, J=5.29, 1.98 Hz, 1H) 4.03 (dd, J=12.46, 2.09 Hz, 1H) 3.76 (br s, 1H) 3.56 (s, 3H) 2.61-2.76 (m, 1H) 1.27-1.35 (m, ⁶ H); ESI-MS: m/z=415.0 [M+Na]+

Paso 7: Preparación de 23h

Se agitó a temperatura ambiente una solución del compuesto 23f (220 mg, 0,56 mmol) y tamices moleculares 4Á (3 g) en CH³CN (18 ml) en atmósfera de N² durante 3 min. Se añadió gota a gota 1H-tetrazol (7,48 ml, 3,36 mmol, 0,45 M en CH³CN). Después de agitar durante 10 min, se añadió gota a gota una solución de compuesto 23g en CH³CN (4 ml). Después de agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h, se añadió hidroperóxido de terc-butilo (0,56 ml, 2,80 mmol, 5 M en decano). Después de agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h, la mezcla se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (eluyente en gradiente: DCM:MeOH = 1:0 a 10:1) para dar 23h (950 mg, producto bruto) como un sólido blanco que se usó directamente para el paso siguiente sin ninguna purificación adicional. ESI-MS: m/z=1183.5 [M+1]+

Paso ⁸ : Preparación de 23i

A una solución del compuesto 23h (950 mg, producto bruto) en DCM (15 ml) y agua (68,83 mg, 3,82 mmol) se le añadió ácido dicloroacético (172,57 mg, 1,33 mmol) a temperatura ambiente seguido de la adición de trietilsilano (3,5 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 h, se añadió piridina (121 mg, 1,53 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 min, luego se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (eluyente en gradiente: DCM:MeOH = 1:0 a 10:1) para dar 23i (570 mg) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, CDaOD-d4) ⁶ ppm 8.57-8.74 (m, 2H) 8.04­ 8.16 (m, 3H) 7.66 (d, J=6.61 Hz, 1H) 7.53-7.61 (m, 2H) 6.38-6.53 (m, 1H) 5.90-6.06 (m, 1H) 4.53 (br d, J=5.51 Hz, 2H) 4.40-4.46 (m, 1H) 4.31-4.40 (m, 4H) 3.92 (br d, J=13.23 Hz, 1H) 3.73-3.83 (m, 1H) 3.58 (d, J=11.69 Hz, 3H) 2.70-2.79 (m, 1H) 1.21 (dd, J=6.84, 2.43 Hz, ⁶ H); ESI-MS: m/z=881.4 [M+1]+

Paso 9: Preparación de 23j

A una solución del compuesto 23i (470 mg, 0,39 mmol), 1H-tetrazol (0,66 ml, 0,3 mmol, 0,45M en CH³CN), LiCl (84,23 mg, 1,98 mmol) y tamices moleculares 4Á(2 g) en DCM (60 ml) se le añadió N,N-diisopropilfosforamidita de dimetilo (94,50 mg, 0,48 mmol). La mezcla de la reacción se agitó durante 72 ha temperatura ambiente, se filtró y se concentró a presión reducida para dar 23j (400 mg, producto bruto) como un sólido blanco que se usó directamente para el paso siguiente sin purificación adicional. ESI-MS: m/z=931.1 [M+1]

Paso 10: Preparación del compuesto 33

A una solución del compuesto 23j (400 mg, producto bruto) en EtOH (15 ml) se le añadió NH³.H²O (15 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar a 50° C durante 3 días, la mezcla de la reacción se filtró y el filtrado se concentró hasta la sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna: Synergi 4 pM, Hydro RP, 250 mm x 30 mm, Fase móvil: Tampón A: Acetato de trietilamonio 50 mM en H²O; Tampón B: Acetato de trietilamonio 50 mM en CH³CN, gradiente: 0-30% de B durante 30 min, caudal 24 ml/min) para dar el compuesto 33 (24,5 mg). El compuesto 33 se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa de fase inversa (Synergi 4 pM, Hydro RP, 250 mm x 30 mm, Tampón A: ácido fórmico al 0,1% en tampón de H²O B: ácido fórmico al 0,1% en MeCN; Caudal: 15 ml/min, gradiente 0-30% de tampón B en 30 min) para proporcionar la sal de trietilamonio del compuesto 33 (16,3 mg).

Intercambio de sal de sodio del compuesto 33:

Se añadió Dowex 50W x ⁸ , 200-400 (5 ml, forma H) a un vaso de precipitados y se lavó con agua desionizada (30 ml). A la resina se le añadió H²SO⁴ al 15% en agua desionizada, la mezcla se agitó suavemente durante 5 min y se decantó (30 ml). La resina se transfirió a una columna con H²SO⁴ al 15% en agua desionizada y se lavó con H²SO⁴ al 15% (por lo menos 4 volúmenes de columna), y luego con agua desionizada hasta que la resina fue neutra. La resina se volvió a transferir al vaso de precipitados, se añadió una solución de NaOH al 15% en agua desionizada y la mezcla se agitó suavemente durante 5 min y luego se decantó. La resina se transfirió a la columna y se lavó con NaOH al 15% en agua (por lo menos 4 volúmenes de columna) y luego con agua desionizada hasta que se volvió neutra. La sal de trietilamonio del compuesto 33 (16,3 mg) se disolvió en una cantidad mínima de agua desionizada, se añadió a la parte superior de la columna y se eluyó con agua desionizada. Las fracciones se agruparon y liofilizaron para proporcionar la sal de sodio del compuesto 33 (15,4 mg) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, D²O) ⁶ ppm 8.21 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 6.22 (d, 1H), 5.49 (d, 1H), 5.20-5.36 (d, 1H), 4.88 (d, 1H), 4.30-4.37 (m, 3H), 4.06-4.12 (m, 2H), 3.80-3.90 (m, 2H), 3.42 (s, 3H); 31P NMR (162 MHz, D²O): ⁶ 4.23 (amidate), -1.32 (phosphate); 19F NMR (379 MHz, D²O): ⁶ -201.958 (m); ESI-MS: m/z: ESI-MS: m/z: 687.70 [M-1]-ESI-MS: m/z 690.10 [M+H]+.

Ejemplos biológicos

Ensayos in vitro

Ensayo de unión STING SPA

El ensayo de unión STING SPA humano mide el desplazamiento de 2',3'cGAMP marcado con tritio (cíclico (guanosina-(2'->5')-monofosfato-adenosina-(3'->5')-monofosfato) a la proteína STING biotinilada Se expresó una versión soluble de STING recombinante en E. coli que carece de los cuatro dominios transmembrana y contiene los residuos 139-379 de Q86WV6 con una R en la posición 232 (H232R). En base a la frecuencia alélica del 58% de la población, se considera que el H232R es de tipo salvaje (Yi, et. al., "Single Nucleotide Polymorphisms of Human STING can affect innate immune response to cyclic dinucleotides" PLOS ONE. 2013, 8(10), e77846). El constructo de STING tiene una etiqueta HIS N-terminal, seguida de un sitio de escisión de proteasa TEV y una etiqueta AVI para permitir la biotinilación dirigida por biotina ligasa BirA (Beckett et al., A minimal peptide substrate in biotin holoenzyme synthetase-catalyzed biotinylation. (1999) Protein Science 8, 921-929). La etiqueta HIS se escinde después de la purificación y antes de la biotinilación.

El ensayo se realizó en placas de 1536 pocillos en un volumen total de 8 pl por pocillo mediante la adición de [3H]-2'3'-^cG^a M^p 8 nM y proteína biotina-STING 40 nM en tampón de ensayo [HEpES 25 mM (Corning 25 -060-C1) pH 7,5, NaCl 150 mM (Sigma S5150), 0,5 mg/ml de BSA (Gibco 15260-037), Tween-20 al 0,001% (Sigma P7949), agua de grado molecular (Corning 46-000-CM)]. Los compuestos de prueba (80 nl) se añadieron con un dispensador acústico (EDC Biosystems) en DMSO al 100% para una concentración de ensayo final de DMSO al 1%. Las placas se centrifugaron durante 1 min y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron perlas de poliestireno estreptavidina SPA (2 pl) (PerkinElmer RPNQ0306) y las placas se sellaron y centrifugaron durante 1 min a temperatura ambiente. Las placas se adaptaron a la oscuridad durante 2 h y se leyeron en un ViewLux (Perkin Elmer) durante 12 min por placa. Una curva de unión de saturación para [3 H]-2'3'-cGAMP mostró una K ^d de 3,6 ± 0,3 nM para unirse a STING, comparable a los valores informados para el ligando natural (Zhang et al., Cyclic GMP-AMP que contiene enlaces mixtos de fosfodiéster es un alto contenido endógeno). -ligando de afinidad por STING.

Otros ligandos naturales, incluyendo el di-GMP cíclico, también devolvieron valores en este ensayo dentro del intervalo esperado. El compuesto de referencia es cGAMP y los resultados se informan como porcentaje de inhibición y valores de IC⁵⁰. La unión a STING de ratón usó un constructo similar al descrito anteriormente que contenía los residuos 138-378 de Q3TBT3.

Ensayo de unión STING humano de longitud completa

Se expresó STING humano de los residuos 1-379 de Q86WV6 con una R en la posición 232 (H232R) con una etiqueta 6HIS N-terminal seguida de una etiqueta FLAG, un sitio de escisión de proteasa TEV y una etiqueta AVI para biotinilación en células HEK293-EXPI. Se prepararon membranas purificadas a partir de estas células y se confirmó y cuantificó la expresión de STING mediante inmunotransferencia. Las membranas que contenían STING se combinaron con el compuesto de prueba en una placa de ensayo Greiner de 384 pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora en el mismo tampón de ensayo usado para el ensayo de unión STING SPA. Luego, se añadió [3H]-2'3'-cGAMP y las placas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Las reacciones se transfirieron a una placa de filtro Pall 5073 prelavada y cada pocillo se lavó 3 veces con 50 pl de tampón de ensayo. Las placas de filtro se secaron a 50° C durante 1 hora. A cada pocillo, se añadieron 10 pl de fluido de centelleo Microscint y las placas se sellaron y leyeron en un TopCount (Perkin Elmer) durante 1 min por pocillo. Ensayo de unión STING SPR

Los compuestos se analizaron en un instrumento S200 biacore SPR (GE Healthcare). La proteína STING truncada producida por E. coli se inmovilizó en un chip de estreptavidina serie S a través de la captura de biotina (GE Healthcare N°BR100531). Los compuestos se seleccionaron a diluciones 1:2 desde 100 uM hasta 0,195 uM en tampón de procesamiento (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, P20 al 0,005%, TECEP 1 mM). Las evaluaciones cinéticas y de afinidad en estado estacionario se llevaron a cabo usando un modelo de unión 1:1 (el STING se trató como un dímero). Los parámetros de ejecución fueron los siguientes: 60 s encendido, 300 s apagado para los compuestos IFM, di-GMP cíclico (60 s encendido/60 s apagado), isómero de tiol 1 (60 s encendido/300 s apagado) y cGAMP (60 s encendido/1200 s apagado) con un caudal de 50 pl/min y recogida de datos a 40 Hz a 25° C.

Ensayo de informador de células humanas de STING

El agonismo de la vía STING humana se evalúa en células THP1-ISG (Invivogen, N° de cat. thp-isg) derivadas de la línea celular de monocitos THP1 humanos mediante la integración estable de un constructo informador de SEAP inducible por el factor regulador de interferón (IRF). Las células THP1-Blue ISG expresan un gen informador de fosfatasa alcalina embrionaria (SEAP) secretado bajo el control de un promotor mínimo ISG54 junto con cinco elementos de respuesta estimulados por interferón (IFN). Como resultado, las células THP1-Blue ISG permiten monitorizar la activación de IRF determinando la actividad de SEAP. Los niveles de SEAP inducidos por IRF en el sobrenadante del cultivo celular se evalúan fácilmente con medio de detección de fosfatasa alcalina, un reactivo de detección de SEAP. Estas células son resistentes a Zeocin. Se usó 2'3' cGAMP como control positivo en este ensayo. Para ejecutar el ensayo, se dispensaron 60.000 células en 30 pl/pocillo de una placa de 384 pocillos tratada con cultivo tisular de fondo opaco blanco.

Los compuestos de prueba se añadieron en un volumen de 10 pl (1% de concentración final de DMSO). Los compuestos se preparan inicialmente en DMSO al 100%, se colocaron en una placa de dilución intermedia y luego se diluyen en medios antes de la transferencia. El ensayo se incubó durante 24 h a 37° C, CO² al 5%, luego las placas se centrifugaron a 1200 rpm (120 x g) durante 5 min. Después de la incubación final, se añadieron 90 j l de sustrato de medio de detección de fosfatasa alcalina a cada pocillo de una nueva placa transparente de 384 pocillos y se transfirieron ¹⁰ j l del sobrenadante celular de la placa de ensayo a la nueva placa de medio de detección de fosfatasa alcalina usando un Biomek FX y se mezcló 4 veces. Las placas se incubaron a TA durante 20 min y luego se determinó la absorbancia a 655 nm en el Tecan Safire2.

Ensayo informador de células de ratón de STING

El agonismo de la ruta STING de ratón se evalúa en células RAW Lucia (Invivogen, N° de cat. rawl-isg) derivadas de la línea celular de macrófagos RAW-264.7 de ratón mediante la integración estable de un constructo informador de luciferasa Lucia inducible por interferón. Las células RAW Lucia expresan un gen informador de luciferasa secretado bajo el control de un promotor mínimo ISG54 junto con cinco elementos de respuesta estimulados por interferón (IFN). Como resultado, las células RAW Lucia permiten monitorizar la activación de IRF determinando la actividad de la luciferasa. Los niveles de luciferasa inducida por IRF en el sobrenadante del cultivo celular se evalúan fácilmente con QUANTI-Luc™, un reactivo de detección de luciferasa. Estas células son resistentes a Zeocin. Se usa 2'3' cGAMP como control positivo en este ensayo. Para ejecutar el ensayo, se dispensaron 100.000 células en 90 jl/pocillo de una olaca de 96 pocillos tratada con cultivo de tejido de fondo plano trasparente. Los compuestos de prueba se añadieron en un volumen de 10 jl. El ensayo se incubó durante 24 y 48 horas a 37° C, CO² al 5%. Después de la incubación, se transfirieron 204 células del sobrenadante de la placa de ensayo a una nueva placa blanca de 96 pocillos y se añadieron 50 ul de sustrato QUANTI-Luc. La placa se incubó, con agitación, a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego se leyó la luminiscencia en un EnVision 2104 con un tiempo de integración de ^{0 ,1} s.

Ensayo de inducción de interferón-p humano

Se usan células THP1-Blue ISG para medir la secreción de IFN-p en el sobrenadante del cultivo después de la activación de la vía STING. Para realizar el ensayo, se recubrieron placas MultiArray de 96 pocillos (Mesoscale Discovery) con anticuerpos de captura anti-IFN-p. Después de una hora de incubación, las placas se lavaron y se mezclaron 50 j l de sobrenadante de las placas de ensayo con informador de células humanas de STING o estándares de IFN-p con 20 j l de anticuerpo de detección conjugado con Sulfotag en las placas recubiertas. Las placas se incubaron, se agitaron durante 2 h, se lavaron y se aplicó tampón de lectura. La electroquimioluminiscencia se midió en el SectorImager.

Evaluación de la vía de señalización celular de STING

Se midió el agonismo de la vía STING en células THP1 BLUE ISG mediante transferencia Western de fosfo-STING (S366), fosfo-TBK1 (S172) y fosfo-IRF3 (S396). Brevemente, se mezclaron 5 millones de células en 90 j l de tampón de nucleofección con 10 j l de compuestos de prueba. Estas mezclas se sometieron a electroporación usando el programa V-001 en un Amaxa Nucleofector (Lonza). Las células se transfirieron a placas de 12 pocillos con medio fresco y se dejaron recuperar durante una hora a 37° C, CO² al 5%. Luego, las células se lavaron en HBSS frío y se lisaron en tampón RIPA. Las muestras se normalizaron con proteína total y se diluyeron en tampón de muestra ProteinSimple o tampón de carga LDS. Las muestras se desnaturalizaron con calor a 95° C durante 5 min, luego se usó PeggySue (ProteinSimple) para medir el fosfo- y STING total e IRF3 mientras que se usó el sistema NuPAGE (Invitrogen) para medir TBK¹. Los datos se analizaron usando el software Compass o Licor Odyssey, respectivamente.

Actividad en vivo de STING

Para todos los estudios, se obtuvieron ratones Balb/c hembra de Charles River Labs (Wilmington, MA) y se usaron cuando tenían ^{6 - 8} semanas de edad y pesaban aproximadamente 20 g. Se permitió que todos los animales se aclimatasen y se recuperasen de cualquier estrés relacionado con el envío durante un mínimo de 5 días antes del uso experimental. Se proporcionó agua clorada por ósmosis inversa y alimento irradiado (Laboratory Autoclavable Rodent Diet 5010, Lab Diet) a voluntad, y los animales se mantuvieron en un ciclo de luz y oscuridad de 12 h. Las jaulas y las camas se esterilizaron en autoclave antes de su uso y se cambiaron semanalmente. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales de Janssen R & D, Spring House, ^pA. Cada grupo experimental contenía ⁸ ratones. Se determinó la eficacia in vivo en un modelo de tumor CT26 de ratón implantando 500.000 células tumorales de carcinoma de colon CT26 subcutáneamente en ratones Balb/c y dejando que los tumores se estableciesen a 100-300 mm3. Los compuestos se inyectaron por vía intratumoral formulados en solución salina tamponada con fosfato en un volumen de ^{0 ,1} ml por inyección. A los ratones se les administraron 0,05 mg cada tres días para un total de tres dosis. La eficacia se midió como el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (TGI) calculado por la reducción del tamaño del volumen del tumor tratado (T) sobre el volumen del tumor de control (C) de acuerdo con la siguiente fórmula: ((C-T)/(C))*100 cuando todos los animales de control todavía estaban en estudio. Las curaciones se definieron como el número de animales sin tumor medible detectado 10 veces de duplicación del volumen tumoral (TVDT) después de que se administrase la última dosis. Los datos resultantes se presentan en la Tabla 3, en la que el compuesto 2 es un compuesto de la invención.

T l .

ND: No realizado

Determinación de actividad in vivo

La actividad puede evaluarse en modelos animales implantando células MC38 en ratones C57BL/6 o células CT26 en el costado derecho de ratones Balb/c y permitiendo que los tumores se establezcan hasta un tamaño de aproximadamente 100-200 mm3. Los tumores pueden inyectarse con vehículo (PBS o HBSS) o compuestos de prueba por vía intratumoral en un volumen de ¹⁰⁰ ul por inyección.

Cada grupo de tratamiento puede tener 7-8 ratones y los tratamientos pueden administrarse cada tres días para un total de 3 dosis (q3dx3). El tamaño del tumor se puede medir con un calibre y el peso estimado del tumor puede calcularse usando la siguiente fórmula: peso del tumor = w²(l)/2 donde w=anchura y 1=largo en milímetros. La eficacia puede determinarse tanto por el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) como por el número de "curaciones" en cada grupo. El % de TGI puede calcularse como el porcentaje de reducción en el tamaño del volumen del tumor tratado (T) sobre el volumen del tumor de control (C) de acuerdo con la siguiente fórmula ((C-T)/(C-tamaño inicial))*100 cuando todos los animales de control todavía estaban en estudio. Las curaciones pueden definirse como el número de animales sin tumor medible detectado ¹⁰ veces de duplicación del volumen tumoral (TVDT) después de que se haya administrado la última dosis.

Ejemplo biológico 2

Ensayo de inducción de citoquinas de PBMC humanas primarias de STING

El agonismo de la vía STING humana se evalúa en células mononucleares primarias de sangre periférica humanas (PBMC) primarias derivadas de sangre completa humana. Se coloca en capas 1 pinta (aproximadamente 420 ml) de sangre fresca de donante (AllCells Inc., Alameda, CA) sobre medio de separación de linfocitos (1,077­ 1,080 g/ml, Corning, Manassas, VA), luego se centrifuga a 500 g durante 20 min a TA sin aplicar descanso. Las PBMC recogidas en la interfase entre el suero y el medio de separación de linfocitos se recogen, se lavan y luego se cuentan. Las PBMC están compuestas por subtipos de linfocitos y monocitos, como células B, células T, etc., y estos subtipos se han caracterizado en la bibliografía para expresar diferentes niveles de la proteína STING. En respuesta a los agonistas de STING, como 2'3'-cGAMP, estas células se activan y son inducidas a expresar una variedad de citoquinas proinflamatorias y antivirales. Además, tras la estimulación con agonistas de STING, estas células regulan por incremento los marcadores de activación. Los niveles de inducción de citoquinas pueden medirse mediante una variedad de métodos que incluyen ELISA, Luminex y MSD. Los niveles de regulación por incremento del marcador de activación pueden medirse mediante citometría de flujo.

Para ejecutar el ensayo, se dispensaron 1.000.000 de células en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo tisular de fondo plano, a 225 pl/pocillo. Los compuestos de prueba se añadieron en un volumen de 25 pl a una concentración de 10x. Algunos compuestos se solubilizaron en DMSO al 100% y la concentración final de DMSO en los cultivos que recibieron estos compuestos fue del 1%. El ensayo se incubó durante 48 h a 37° C, 5% de CO². Se recogieron 200 pl de sobrenadantes sin alterar las células en el fondo de la placa, luego se congelaron a -20° C hasta el momento de la medición con Luminex. Los ensayos Luminex se realizaron usando G-CSF, IFNa2, IFNy, IL-1b, IL-⁶ , IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p'70), TNFa del kit de ensayo de panel de perlas magnéticas de citoquina humana/quimiocina-Inmunología Multiplex de MILLIPLEX MAP y analito IFNp1 del kit de panel de perlas magnéticas de citoquina humana/quimiocina IV de MILLIPLEX MAP (EMD Millipore, Billerica, MA), siguiendo el protocolo del fabricante. La inducción de citoquinas se midió usando un instrumento Luminex FlexMAP 3D® (Luminex Corporation, Radnor, PA). El análisis de los datos de Luminex recopilados se realizó usando el software MILLIPLEX Analyst (EMD Millipore).

Supresión del virus HBV en células PHH usando medios acondicionados de PBMC humanas primarias activadas por STING

Los hepatocitos humanos primarios pueden infectarse con el virus de la hepatitis B y, durante una infección establecida, producirán proteínas virales como HBsAg y HBeAg que pueden detectarse mediante ELISA. El tratamiento terapéutico con compuestos como entecavir puede suprimir la reproducción del VHB, lo que puede medirse por una producción de proteínas virales disminuida. Se dispensaron (N° de células) 4x105 células/pocillo de hepatocitos humanos primarios (BioReclamation, Westbury, NY) en 500 pl/pocillo de placas de 24 pocillos de fondo plano, tratadas con cultivo de tejido. 24 h más tarde, las células se infectaron con 30-75 moi de HBV. Al día siguiente, las PHH se lavaron 3 veces y se añadió medio de mantenimiento fresco a las células. Concurrentemente, se aislaron PBMC como se ha descrito anteriormente. Para estimular las PBMC, se dispensaron 10.000.000 células en placas de 24 pocillos tratadas con cultivo de tejidos de fondo plano a 400 pl/pocillo. Los compuestos de prueba se añadieron en un volumen de 100 pl y luego los cultivos se incubaron durante 48 h a 37° C, 5% de CO². Se recogieron los sobrenadantes. Se midió la regulación por incremento del marcador de activación de las células usando citometría de flujo. Brevemente, las células se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos a CD56, CD19, CD3, CD⁸ a, CD14, CD69, CD54, CD161, CD4 y CD80. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo Attune NxT (Thermo Fisher, Carlsbad, CA).

De los cultivos de PBMC estimulados, se reservó una parte del sobrenadante para la detección de citoquinas por Luminex, como se ha descrito anteriormente. El resto del sobrenadante se dividió por la mitad y se almacenó una alícuota a 4° C para su uso en el día ⁸ del ensayo. La otra alícuota de sobrenadante se diluyó 1:1 con medio PHH 2x y luego se añadió a las células PHH infectadas con d4. Después de 96 h, se cambió el medio gastado y se añadió sobrenadante a una dilución de 1:1 con medio PHH 2x. En este punto, se realizó una medición intermedia de HBsAg usando un kit ELISA de HBsAg (Wantai Bio-pharm, Beijing, China). Después de 96 h, se recogieron los medios y se midió el HBsAg.

Tabla ^{4 :} Veces de inducción de citoquinas en cultivos de PBMC estimulados con compuestos de CDN. Las veces de inducción se calculan midiendo las concentraciones de la citoquina inducida después de 48 h por aproximadamente 20 pM de compuesto, luego dividiendo por los niveles de valor de referencia de producción de citoquinas de las células incubadas con PBS. Los datos son la media de múltiples donantes en tres experimentos. nt = no probado.

T l 4.

Tabla 5: Veces inducción de citoquinas en cultivos de PBMC estimulados con concentraciones más altas de compuestos de CDN. La veces de inducción se calcula midiendo las concentraciones de la citoquina inducida después de 48 h de la concentración indicada del compuesto, luego dividiendo por los niveles del valor de referencia de producción de citoquina de las células incubadas con PBS. Los datos son la media de múltiples donantes en tres experimentos. nt = no probado.

T l .

Tabla 6. Los medios acondicionados de PBMC estimuladas con CDN pueden suprimir la carga viral de las células PHH infectadas con VHB. Las PBMC se estimularon con la CDN indicada a 20, 4, 0,8 pM durante 48 h. Los sobrenadantes se mezclaron con medio fresco en una proporción de 1:1, luego se añadieron a células PHH infectadas con HBV. La producción de HBsAg se midió ⁸ días después. Los datos son una media de dos donantes independientes.

T l .

Tabla 7. CDN activa PBMC. Las PBMC se estimularon con 20 pM de CDN durante 48 h. Las células se evaluaron mediante citometría de flujo para la regulación por incremento de CD54 en los monocitos. Las veces de aumento en la Intensidad Media de Fluorescencia se calculó con respecto a los niveles en las células en reposo. Los datos son una media de dos donantes independientes.

T l 7.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. El compuesto:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la reivindicación 1 y por lo menos uno de un portador farmacéuticamente aceptable, un excipiente farmacéuticamente aceptable, y un diluyente farmacéuticamente aceptable.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en donde la composición es una forma de dosificación oral sólida.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en donde la composición es un jarabe, un elixir o una suspensión.

5. El compuesto de la reivindicación 1, o las composiciones de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para su uso en el tratamiento de una enfermedad, síndrome, o afección, en donde dicha enfermedad, síndrome o afección es cáncer o una infección viral.

⁶. El compuesto o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha enfermedad, síndrome o afección es cáncer.

7. El compuesto o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación ⁶ , en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste de melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, y fibrosarcoma.

⁸. El compuesto o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha enfermedad, síndrome, o afección es una infección viral.

9. El compuesto o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación ⁸ , en donde la infección viral es hepatitis B.