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ES2922475T3 - Método para producir células epiteliales pigmentarias de la retina - Google Patents

Método para producir células epiteliales pigmentarias de la retina Download PDF

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ES2922475T3
ES2922475T3 ES16844466T ES16844466T ES2922475T3 ES 2922475 T3 ES2922475 T3 ES 2922475T3 ES 16844466 T ES16844466 T ES 16844466T ES 16844466 T ES16844466 T ES 16844466T ES 2922475 T3 ES2922475 T3 ES 2922475T3
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Satoshi Ando
Takao Kuroda
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Healios KK
Sumitomo Pharma Co Ltd
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Healios Kk
Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Healios KK
Sumitomo Pharma Co Ltd
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Abstract

La presente invención proporciona un método para producir más eficientemente células epiteliales del pigmento retinal a partir de células madre pluripotentes. El método de la presente invención para producir células del epitelio pigmentario de la retina incluye los siguientes pasos: (1) un primer paso para cultivar una célula madre pluripotente en un medio que comprende un inhibidor del receptor de FGF y/o un inhibidor de MEK durante un período de no más de 30 días, y (2) un segundo paso para cultivar la célula obtenida en el primer paso en presencia de un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y/o un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt para formar una célula del epitelio pigmentario de la retina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para producir células epiteliales pigmentarias de la retina
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para producir una célula epitelial pigmentaria de la retina (EPR) y similares.
Antecedentes de la técnica
Las células epiteliales pigmentarias de la retina son células del epitelio pigmentario que están presentes en la capa más externa de la retina y desempeñan un papel importante en el mantenimiento de las células fotorreceptoras, como la fagocitosis del segmento externo de las células fotorreceptoras y el reciclaje de sustancias visuales, y similares. La degeneración macular relacionada con la edad provocada por anomalías de las células epiteliales pigmentarias de la retina debidas al envejecimiento y similares es una enfermedad oftálmica que provoca pérdida de visión central o ceguera, y se ha deseado desarrollar un método eficaz para tratarla. Recientemente, la terapia de trasplante celular que complementa o sustituye las células epiteliales pigmentarias de la retina ha llamado mucho la atención como un método novedoso para tratar la degeneración macular relacionada con la edad, y se espera que utilice las células epiteliales pigmentarias de la retina como material de injerto para la terapia celular. Hasta la fecha, aunque se han realizado algunos informes sobre un método para inducir la diferenciación en células epiteliales pigmentarias de la retina usando células madre pluripotentes humanas (documentos 1 y 2 que no son de patente, documentos 1, 2, 3 y 4 de patente), se ha deseado un método de producción más eficaz y conveniente, ya que en la industria de la medicina regenerativa se requiere una tecnología para producir de manera estable células epiteliales pigmentarias de la retina de alta calidad en grandes cantidades.
Listado de documentos
documentos de patente
documento de patente 1: WO 2012/173207
documento de patente 2: WO 2015/053375
documento de patente 3: WO 2015/053376
documento de patente 4: EE.UU. 2013/0224156
documento que no es de patente
documento de no patente 1: Stem Cell Reports, 2(2), 205-218 (2014)
documento de no patente 2: Cell Stem Cell, 10(6), 771-785 (2012)
Resumen de la invención
Problemas por resolver por la invención
Se necesita con urgencia desarrollar un método más eficaz con el fin de producir de manera estable una gran cantidad de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre pluripotentes, cuando dichas células se usan para medicina regenerativa y similares.
Medios para resolver los problemas
En vista de las circunstancias, los presentes inventores realizaron estudios intensivos, que dieron como resultado la finalización de la presente invención.
Es decir, la presente invención se refiere a lo siguiente.
[1] Un método de producción de una célula epitelial pigmentaria de la retina que comprende las siguientes etapas:
(1) una primera etapa para cultivar una célula madre pluripotente en un medio que comprende un inhibidor del receptor de FGF y/o un inhibidor de MEK durante un período de no más de 30 días, en donde el medio no contiene un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y no contiene un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt, y
(2) una segunda etapa para cultivar la célula obtenida en la primera etapa en presencia de un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y/o un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt, y en ausencia de un inhibidor del receptor de FGF y en ausencia de un inhibidor de MEK, para formar una célula epitelial pigmentaria de la retina.
en donde el inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal es SB431542, y
en donde el inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt es CKI-7, D4476, IWR-1 -endo o IWP-2.
[2] El método de producción de acuerdo con el mencionado anteriormente [1], en donde la primera etapa se realiza en:
(a) condiciones libres de suero; y/o
(b) la ausencia de células alimentadoras.
[3] El método de producción de acuerdo con el [1] o [2] mencionados anteriormente, en donde el medio en la primera etapa comprende además un factor para mantener un estado indiferenciado, en donde el factor para mantener un estado indiferenciado es bFGF, FGF4, FGF8, TGFp1, TGFp2, Nodal, Activina A o Activina B.
[4] El método de producción de acuerdo con cualquiera de los [1] a [3] mencionados anteriormente, en donde:
(a) el inhibidor del receptor de FGF es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en PD173074 y SU5402; (b) el inhibidor de MEK es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en PD0325901, PD184352, U0126, TAK-733 y AZD-8330; y/o
(c) el inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt es CKI-7.
[5] El método de producción de acuerdo con cualquiera de los [1] a [4] mencionados anteriormente, en donde la célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente de primate o una célula madre pluripotente humana.
[6] El método de producción de acuerdo con cualquiera de los [1 ] a [5] mencionados anteriormente, en donde el medio en la primera etapa comprende además un inhibidor del receptor de BMP.
[7] El método de producción de acuerdo con el mencionado anteriormente [6], en donde el inhibidor del receptor de BMP es LDN193189.
[8] El método de producción de acuerdo con cualquiera de los [1 ] a [7] mencionados anteriormente, en donde el medio en la primera etapa comprende además un agonista de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog, en donde el agonista de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog es al menos un tipo seleccionado del grupo formado por Shh, Ihh, Purmorfamina y SAG.
[9] El método de producción de acuerdo con cualquiera de los [1 ] a [8] mencionados anteriormente, en donde el medio en la primera etapa comprende además un inhibidor de PKC.
[10] El método de producción de acuerdo con el [9] mencionado anteriormente, en donde el inhibidor de PKC es Go6983.
[11] El método de producción de acuerdo con cualquiera de los [1] a [10] mencionados anteriormente, en donde el período de cultivo en la primera etapa es un período suficiente para inducir la expresión génica de al menos uno de los factores de transcripción del campo del ojo y de no más de 30 días.
[12] El método de producción de acuerdo con cualquiera de los [11 ] mencionados anteriormente, en donde los factores de transcripción del campo del ojo son PAX6, LHX2 y SIX3.
[13] El método de producción de acuerdo con cualquiera de los [1] a [12] mencionados anteriormente, en donde el período de cultivo en la primera etapa es de 2 días - 13 días o de 4 días - 6 días.
Efecto de la invención
La presente invención ha hecho posible proporcionar un método más eficaz para producir células epiteliales pigmentarias de la retina que los métodos de inducción de diferenciación existentes. Por lo tanto, el método de la presente invención es útil en términos de producción eficaz de células epiteliales pigmentarias de la retina que pueden ser un material de injerto para terapia celular, o un reactivo o material usado para evaluar la toxicidad o la eficacia de una sustancia química y similares.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 38-42 días de cultivo que contienen células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (201B7 o 1231A3) producidas mediante un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK usando Medio AK03 ''StemFit®'' o medio Essential 8. MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM cuando se usó medio AK03 "StemFit®" ; PD0325901 0,03 pM cuando se usó medio Essential 8).
La Fig. 2 muestra (a) una fotografía, (b) una imagen microscópica de contraste de fase de bajo aumento y (c) una imagen microscópica de campo claro de gran aumento de una placa de cultivo de 6 pocillos después de 55 días de cultivo que contenía células RPE derivadas de células iPS (201B7) producidas por un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK. MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM).
La Fig. 3 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 38-42 días de cultivo que contenían células diferenciadas derivadas de células iPS (201B7 o 1231A3) producidas mediante un método de producción sin una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK usando medio AK03 "StemFit®" o medio Essential 8.
La Fig.4 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 38-42 días de cultivo que contenían células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (201B7 o 1231A3) producidas mediante un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con un inhibidor del receptor de FGF que usa medio AK03 "StemFit®", medio Essential 8 o medio StemSure hPSC A sin bFGF. FGFRi: inhibidor del receptor de FGF (PD173074 100 nM).
La Fig. 5 muestra (a) fotografía, (b) imagen microscópica de contraste de fase de bajo aumento y (c) imagen microscópica de campo claro de gran aumento de una placa de cultivo de 6 pocillos después de 55 días de cultivo que contenía células RPE derivadas de células iPS (201B7) producidas por un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con un inhibidor del receptor de FGF. FGFRi: inhibidor del receptor de FGF (PD173074 100 nM).
La Fig. 6 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 38-42 días de cultivo que contenían células diferenciadas derivadas de células iPS (201B7 o 1231A3) producidas por un método de producción sin una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF que usa medio AK03"StemFit®", medio Essential 8 o medio StemSure hPSC A sin bFGF.
La Fig. 7 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 38-47 días de cultivo que contenían células RPE derivadas de células iPS (201B7 o 1231A3) producidas mediante un método de producción que comprende una etapa para tratar con una combinación de un inhibidor de MEK y/o con un inhibidor del receptor de FGF con varios inhibidores, inhibidores de la vía de transducción de señales o agonistas de la vía de transducción de señales. A modo de comparación, también se muestran fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos que contenían células RPE derivadas de células iPS producidas mediante un método de producción sin una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK y un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK ("sin tratar" y "MEKi" en el panel superior de la figura), y fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos que contienen células RPE derivadas de células iPS producidas por un método de producción sin una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF y un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF ("sin tratar" y "FGFRi " en el panel inferior de la figura). MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM), FGFRi: inhibidor del receptor de FGF (PD173074 100 nM), BMPRi: inhibidor del receptor de BMP (LDN193189 100 nM), Shh ag: agonista de la vía de transducción de señales de Shh (SAG 30 nM), PKCi: inhibidor de PKC (Go6983 2 pM).
La Fig. 8 muestra (A) una fotografía representativa de una placa de cultivo de 6 pocillos de cada escala cuando los resultados se clasifican en una escala de 6 puntos de 0 a 5 de acuerdo con el porcentaje de células RPE en un pocillo completo, (B) un resumen de los resultados de las producciones mediante un método de producción sin una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK (sin tratar), un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK (MEKi) y métodos de producción que comprenden una etapa para tratar con una combinación de un inhibidor de MEK y varios inhibidores o inhibidores de la vía de transducción de señales (MEKi+PKCi, MEKi+PKCi+BMPRi, MEKi+FGFRi, MEKi+FGFRi+BMPRi, MEKi+FGFRi+PKCi, MEKi+FGFRi+PKCi+BMPRi), y (C) un resumen de los resultados de las producciones mediante un método de producción sin una etapa de tratamiento con un inhibidor del receptor de FGF (sin tratar), un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con un inhibidor del receptor de FGF (FGFRi) y métodos de producción que comprenden una etapa para tratar con una combinación de un inhibidor del receptor de FGF y varios inhibidores o inhibidores de la vía de transducción de señales (FGFRi+PKCi, FGFRi+PKCi+BMPRi, FGFRi+MEKi, FGFRi+MEKi+BMPRi, FGFRi+MEKi+PKCi, FGFRi+MEKi+PKCi+BMPRi). Los ejes verticales de los gráficos muestran el porcentaje de células RPE en un pocillo completo en una escala de 6 puntos. Los valores se muestran como media ± desviación estándar, n muestra el número de experimentos. MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM), FGFRi: inhibidor del receptor de FGF (PD173074 100 nM), BMPRi: inhibidor del receptor de BMP (LDN193189 100 nM), PKCi: inhibidor de PKC (Go69832 pM).
La Fig. 9 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 43 días de cultivo que contenían células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (Ff-I01 o QHJI01) producidas mediante un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor del receptor de FGF que usa medio AK03N "StemFit®" (MEKi o FGFRi). A modo de comparación, también se muestran fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 43 días de cultivo que contenían células diferenciadas derivadas de células iPS producidas mediante métodos de producción sin una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK y/o un inhibidor del receptor de FGF (sin tratar). MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM), FGFRi: inhibidor del receptor de FGF (PD173074 100 nM).
La Fig. 10 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 48 días de cultivo que contenían células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (QHJI01) producidas mediante un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor del receptor de FGF que usa medio AK03N "StemFit®" (MEKi (PD0325901) o FGFRi (PD173074)). Se examinaron los efectos de la exposición a los inhibidores durante 1 a 6 días. MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM), FGFRi: inhibidor del receptor de FGF (PD173074 100 nM).
La Fig. 11 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 37 días de cultivo que contenían células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (1231A3) producidas mediante un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK que usa medio AK03N "StemFit®" (MEKi (PD0325901)). A modo de comparación, también se muestra una fotografía de una placa de cultivo de 6 pocillos después de 37 días de cultivo que contenía células diferenciadas derivadas de células iPS producidas mediante un método de producción sin una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK (sin tratar). Se examinaron los efectos de la exposición al inhibidor durante 1 día, 3 días, 6 días y 13 días. MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM).
La Fig. 12 muestra los porcentajes de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (Ff-I01 o QHJI01), que se produjeron mediante un método de producción que comprendía una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor del receptor de FGF que usa medio AK03N "StemFit®", en un pocillo completo después de 43 días de cultivo, cuyos porcentajes son los resultantes por juicio visual de acuerdo con la Fig. 8A, y los valores de expresión (Señal) y marcas (Detección) de PAX6, LHX2 y SIX3 al finalizar la primera etapa (MEKi o FGFRi). A modo de comparación, los resultados del juicio visual de los porcentajes de células RPE en un pocillo completo de células diferenciadas derivadas de células iPS producidas mediante un método de producción sin una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK y/o inhibidor del receptor de FGF, y los valores de expresión (Señal) y marcas (Detección) de PAX6, LHX2 y SIX3 en un tiempo correspondiente a la finalización de la primera etapa (sin tratar). MEKi: inhibidor de m Ek (PD0325901 1 pM), FGFRi: inhibidor del receptor de FGF (PD173074 100 nM) .
La Fig. 13 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 36 días o 49 días de cultivo que contenían células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (QHJI01) producidas mediante un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor del receptor de FGF que usa medio AK03N "StemFit®" (MEKi (PD0325901) o FGFRi (PD173074)). A modo de comparación, también se muestran fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 49 días de cultivo que contenían células diferenciadas derivadas de células iPS producidas mediante un método de producción sin una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK y/o un inhibidor del receptor de FGF (sin tratar). Se examinaron los efectos del inhibidor de MEK en concentraciones de 0,25 pM - 4 pM, o del inhibidor del receptor de FGF en concentraciones de 25 nM - 400 nM. MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901), FGFRi: FGF inhibidor del receptor (PD173074).
La Fig. 14 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 49 días de cultivo que contenían células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (QHJI01) producidas mediante un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor del receptor de FGF que usa medio AK03N "StemFit®" (MEKi (PD0325901) o FGFRi (PD173074)). Se examinaron los efectos del número de células sembradas al comienzo de la segunda etapa (0,2 x 104- 4,0 x 104 células/cm2). MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM), FGFRi: inhibidor del receptor de FGF (PD173074 100 nM).
La Fig. 15 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 49 días o 50 días de cultivo que contenían células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (QHJI01 o 1231A3) producidas mediante un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK que usa medio AK03N "StemFit®" (MEKi (PD0325901), MEKi (PD184352), MEKi (U0126), MEKi (TAK-733) o MEKi (AZD-8330)). A modo de comparación, también se muestran fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 49 días de cultivo que contenían células diferenciadas derivadas de células iPS producidas mediante un método de producción sin una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK (sin tratar). MEKi: inhibidor de MEK (PD0325901 1 pM, PD184352 1,5 pM, 3 pM o 6 pM, U01265 pM o 10 pM, TAK-733 0,3 pM, AZD-83300,3 pM).
La Fig. 16 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 49 días de cultivo que contenían células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (QHJI01 o 1231A3) producidas mediante un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con un inhibidor del receptor de FGF que usa medio AK03N "StemFit®" (FGFRi (PD173074) o FGFRi (SU5402)). A modo de comparación, también se muestran fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 49 días de cultivo que contenían células diferenciadas derivadas de células iPS producidas mediante un método de producción sin una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF (sin tratar). FGFRi: inhibidor del receptor de FGF (PD173074 100 nM, SU54025 pM, 10 pM o 20 pM).
La Fig. 17 muestra fotografías de placas de cultivo de 12 pocillos después de 43 días de cultivo que contenían células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (QHJI01) producidas por cultivo en presencia de un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y/o un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt en la segunda etapa después de la primera etapa que usa medio AK03N "StemFit®" que contenía un inhibidor de MEK (NODALi+WNTi, NODALi o WNTi). Se examinaron los efectos inductores de la diferenciación de la exposición a un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal o un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt solo en la segunda etapa. NODALi: inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal (SB431542 5 pM), WNTi: inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt (CKI-73 pM).
La Fig. 18 muestra los porcentajes de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (201B7) que se produjeron mediante un método de producción que comprendía una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK y un inhibidor del receptor de BMP que usa medio AK03N "StemFit®", en un pocilio completo después de 39 días de cultivo, cuyos porcentajes son los que resultan por juicio visual de acuerdo con la Fig. 8A (superior en la figura, MEKi durante 6 días BMPRi durante 1 día o MEKi durante 6 días BMPRi durante 6 días), y los resultados de la comparación de los niveles de expresión de los marcadores del epitelio pigmentario de la retina, BEST 1 y MITF, y un marcador en la etapa temprana de formación del ojo, RAX, después de 39 días de cultivo mediante un método de RT-PCR en tiempo real (inferior en la figura, porcentaje de células RPE en un pocillo completo ("3" y "5" de una escala de 6 puntos)). A modo de comparación, también se muestran los resultados del juicio visual de los porcentajes de células RPE en un pocillo completo de células diferenciadas derivadas de células iPS producidas por un método de producción sin una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK y/o un inhibidor del receptor de BMP después de 39 días de cultivo (superior en la figura, "sin tratar"), y niveles de expresión de BEST1, MITF y RAX (inferior en la figura, porcentaje de células RPE en un pocillo completo ("1" de una escala de 6 puntos). Se normalizó el nivel de expresión génica en cada muestra con el nivel de expresión de GAPDH, y se muestra como una cantidad relativa cuando el nivel de expresión en células iPS cultivadas en condiciones para mantener el estado indiferenciado se define como 1 para la comparación de los niveles de expresión de BEST1, MITF o RAX (inferior en el figura, "sin diferenciar").
La Fig. 19 muestra fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 43 días de cultivo que contenían células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) derivadas de células iPS (1231A3) producidas mediante un método de producción que comprende una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor del receptor de FGF que usa medio AK03N "StemFit® (a la derecha en la figura, MEKi (PD0325901), FGFRi (PD173074)), y los resultados de confirmación de la expresión de los marcadores del epitelio pigmentario retiniano RPE65, BEST1 y CRALBP, y un control endógeno de GAPDH después de 43 días de cultivo mediante método de RT-PCR (a la izquierda en la figura, MEKi (PD0325901), FGFRi(PD173074)). A modo de comparación, también se muestran fotografías de placas de cultivo de 6 pocillos después de 43 días de cultivo que contenían células diferenciadas derivadas de células iPS producidas mediante un método de producción sin una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK y/o un inhibidor del receptor de FGF (a la derecha en la figura, sin tratar), y los resultados de RT-PCR para RPE65, BEST1, CRALBP y GAPDH (a la izquierda en la figura, sin tratar). Se usaron RPE primarias humanas como control positivo (a la izquierda en la figura, hRPE), y se usaron células iPS cultivadas en condiciones para mantener un estado indiferenciado como un control negativo (a la izquierda en la figura, iPSC no diferenciadas) para el método RT-PCR.
Descripción de las realizaciones
1. Definición
En la presente invención, "célula madre pluripotente" significa una célula que tiene capacidad de autorrenovación y pluripotencia, una célula madre capaz de ser cultivada in vitro y tener una capacidad de diferenciarse en todos los linajes celulares que pertenecen a tres capas germinales (ectodermo, mesodermo, endodermo) (pluripotencia).
Los ejemplos de células madre pluripotentes incluyen células madre embrionarias (células ES), células madre pluripotentes inducidas (células iPS) y similares. Las células madre pluripotentes a usar en la presente invención son células madre pluripotentes de mamíferos, preferiblemente células madre pluripotentes de roedores o primates, más preferiblemente células madre pluripotentes humanas. Como mamíferos en esta memoria se pueden mencionar, primates tales como humanos, monos y similares, roedores tales como ratón, rata, hámster, conejillo de indias y similares, y otros caninos, gatos, cerdos, bovinos, caprinos, caballos, ovejas, conejos y similares.
Las células madre embrionarias se pueden producir, por ejemplo, cultivando una masa celular interna presente en el embrión no humano en etapa de blastocisto antes de la implantación en una célula alimentadora o en un medio que contiene LIF. Citados solo como referencia, los métodos específicos de producción de células madre embrionarias se describen, por ejemplo, en WO 96/22362, WO 02/101057, EE.UU. 5.843.780, EE.UU. 6.200.806, EE.UU. 6.280.718 y similares. Las células madre embrionarias están disponibles en determinadas organizaciones, o se puede comprar un producto comercialmente disponible. Citadas solo como referencia, las células madre embrionarias humanas, KhES-1, KhES-2 y KhES-3, están disponibles en el Instituto de Ciencias Médicas Fronterizas de la Universidad de Kyoto. La célula EB5, que es una célula madre embrionaria de ratón, está disponible en la Agencia Administrativa Incorporada RIKEN, y la línea celular D3, que es una célula madre embrionaria de ratón, está disponible en ATCC.
La célula ES de transferencia nuclear (célula ntES), que es una de las células ES, se puede establecer a partir de un clon de embrión no humano producido mediante el trasplante del núcleo de una célula somática en un óvulo no humano enucleado.
La "célula madre pluripotente inducida" es una célula inducida para tener pluripotencia mediante la reprogramación de una célula somática a través de un método conocido y similares. Específicamente, se puede mencionar una célula inducida para tener pluripotencia mediante la reprogramación de células somáticas tales como fibroblastos, células de la piel, células mononucleares de sangre periférica y similares mediante la introducción de cualquier combinación de una pluralidad de factores de reprogramación seleccionados de genes tales como Oct3/4, Sox2, Klf4 , Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb y similares. Los ejemplos de combinación preferible de factores de reprogramación pueden incluir (1) Oct3/4, Sox2, Klf4 y Myc (c-Myc o L-Myc), y (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 y L-Myc (Stem Cells, 2013; 31:458-466).
Las células madre pluripotentes inducidas se establecieron por primera vez por Yamanaka y cois. en célula de ratón en 2006 (Cell, 2006, 126(4), págs. 663-676) y también se establecieron en fibroblastos humanos en 2007 (Cell, 2007, 131(5) págs. 861-872; Science, 2007, 318(5858) págs. 1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) págs.101-106). Posteriormente se han realizado varias mejoras en el método de inducción de células madre pluripotentes inducidas y se describe, por ejemplo, un método de producción específico de una célula madre pluripotente inducida en ratón en Cell, 2006, Ago. 25; 126(4): 663-76, y se describe el de una célula madre pluripotente inducida humana en Cell 2007, Nov. 30; 131 (5): 861 -72 y similares.
Además del método de producción basado en la reprogramación directa mediante expresión génica, también se pueden obtener células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas mediante la adición de un compuesto y similares (Science, 2013, 341, págs. 651-654).
También es posible obtener células madre pluripotentes inducidas establecidas y, por ejemplo, las líneas celulares pluripotentes inducidas humanas establecidas por la Universidad de Kyoto, como las células 201B7, las células 201B7-Ff, las células 253G1, las células 253G4, las células 1201C1, las células 1205D1, las células 1210B2 o, las células 1231A3 y similares están disponibles en la Universidad de Kyoto e iPS Academia Japan, Inc. Como la célula madre pluripotente inducida establecida, por ejemplo, las células Ff-I01 y las células Ff-I14 y las células QHJI01 establecidas por la Universidad de Kyoto están disponibles en la Universidad de Kyoto.
Si bien no está particularmente limitada la célula somática usada para obtener células madre pluripotentes inducidas, se pueden mencionar específicamente fibroblastos, células de linaje sanguíneo (p. ej., células mononucleares de sangre periférica o células T, células derivadas de sangre del cordón umbilical) y similares. Como fibroblastos, se pueden mencionar los derivados de la dermis y similares.
No están particularmente limitados los medios para la expresión génica cuando la célula madre pluripotente inducida se produce por reprogramación mediante la expresión de varios tipos de factores de reprogramación. Se puede usar un método de transferencia de genes o un método de inyección directa de proteína, que son bien conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos específicos del método de transferencia de genes mencionado anteriormente incluyen un método de infección que usa un vector de virus (p. ej., vector de retrovirus, vector de lentivirus, vector de Sendaivirus, vector de adenovirus, vector de virus adenoasociado), un método de fosfato de calcio, método de lipofección, método de RetroNectin, método de electroporación, que usa cada uno un vector de plásmido (p. ej., vector de plásmido, vector episomal) o un vector de ARN, y similares.
Una célula madre pluripotente inducida se puede producir en presencia de una célula alimentadora o en ausencia de células alimentadoras (libre de alimentadoras). Cuando se produce una célula madre pluripotente inducida en presencia de una célula alimentadora, la célula madre pluripotente inducida se puede producir mediante un método conocido en presencia de un factor para mantener el estado indiferenciado. Mientras que no está particularmente limitado un medio a usar para producir una célula madre pluripotente inducida en ausencia de células alimentadoras, se puede usar un medio de mantenimiento conocido para células madre embrionarias y/o células madre pluripotentes inducidas, y un medio para establecer células madre pluripotentes inducidas libre de alimentadoras. Los ejemplos del medio para establecer una célula madre pluripotente inducida en condiciones libres de alimentadoras pueden incluir medios libres de alimentadoras, como el medio Essential 8 (medio E8), el medio Essential 6, el medio TeSR, el medio mTeSR, el medio mTeSR-E8, el medio Stabilized Essential 8, StemFit (registro de marca) y similares. Cuando se produce una célula madre pluripotente inducida, por ejemplo, se puede producir mediante la transferencia de genes de 4 factores de Oct3/4, Sox2, Klf4 y Myc a una célula somática mediante el uso de un vector de Sendaivirus en ausencia de células alimentadoras.
La célula madre pluripotente a usar en la presente invención es preferiblemente una célula madre pluripotente inducida de roedores o primates, más preferiblemente una célula madre pluripotente inducida humana.
Si bien los expertos en la técnica pueden realizar un cultivo de mantenimiento o un cultivo de expansión de células madre pluripotentes mediante un método bien conocido, las células madre pluripotentes se someten preferiblemente a un cultivo de mantenimiento o cultivo de expansión en condiciones libres de suero y en ausencia de células alimentadoras a partir de los aspectos de la seguridad de la producción de células de injerto y similares.
Las células madre pluripotentes genéticamente modificadas se pueden producir usando, por ejemplo, una técnica de recombinación homóloga. Los ejemplos del gen en el cromosoma a modificar incluyen un gen marcador celular, un gen de antígeno de histocompatibilidad, un gen relacionado con una enfermedad debida a un trastorno de la célula epitelial pigmentaria, etc. Se puede modificar un gen diana en el cromosoma usando los métodos descritos en Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press en Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995); etc.
Para ser específicos, por ejemplo, se aísla el ADN genómico que comprende el gen diana que se va a modificar (p. ej., gen marcador celular, gen del antígeno de histocompatibilidad, gen relacionado con la enfermedad, etc.), y se produce un vector de direccionamiento usado para la recombinación homóloga del gen diana usando el ADN genómico aislado. El vector de direccionamiento producido se introduce en las células madre y se seleccionan las células que mostraron una recombinación homologa entre el gen diana y el vector de direccionamiento, por lo que se pueden producir células madre que tengan el gen modificado en el cromosoma.
Los ejemplos del método para aislar ADN genómico que comprende el gen diana incluyen métodos conocidos descritos en Molecular Cloning, S Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) etc. El ADN genómico que comprende el gen diana también se puede aislar usando un sistema de cribado de librerías de ADN genómico (fabricado por Genome Systems), kits Universal GenomeWalker (fabricado por CLONTECH), etc. También se puede usar un polinucleótido que codifica la proteína diana en lugar del ADN genómico. El polinucleótido se puede obtener amplificando el polinucleótido correspondiente por el método PCR.
Se puede realizar la producción del vector de direccionamiento usado para la recombinación homóloga del gen diana y la selección eficaz de un recombinante homólogo de acuerdo con los métodos descritos en Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press en Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995); etc. Como vector de direccionamiento, se puede usar cualquier tipo de reemplazamiento o tipo de inserción. Como método de selección, se pueden usar métodos tales como selección positiva, selección de promotores, selección negativa, selección poliA, etc.
Los ejemplos de un método para seleccionar el recombinante homólogo deseado de las líneas celulares seleccionadas incluyen el método de hibridación de Southern, el método de PCR, etc. para el ADN genómico.
El "factor de transcripción del campo ocular" en la presente invención es un gen expresado en la región del campo ocular en una etapa temprana de desarrollo, y se han identificado ET(Tbx3), Rx1(Rax), Pax6, Six3, Lhx2, Tlx(Nr2e1), Optx2( Six6) y similares. Estos factores de transcripción del campo ocular se pueden usar como marcadores de la etapa temprana de formación del ojo.
La "célula epitelial pigmentaria de la retina" en la presente invención quiere decir una célula epitelial presente en el exterior de los tejidos neurales de la retina en la retina in vivo. Los expertos en la materia pueden confirmar fácilmente si la célula es una célula epitelial pigmentaria de la retina basándose, por ejemplo, en la expresión de marcadores celulares (RPE65, Mitf, CRALBP, Me RTK, BEST1, etc.), presencia de gránulos de melanina (marrón-negro), estrecha unión intercelular, característica poligonal, morfología celular similar a un adoquín y similares. Se puede confirmar fácilmente si la célula tiene una función de célula epitelial pigmentaria de la retina por la capacidad secretora de citoquinas tales como VEGF y PEDF y similares.
"Cultivo en suspensión" se refiere al cultivo en condiciones para mantener un estado en el que las células o los agregados celulares están suspendidos en un medio de cultivo. Es decir, el cultivo se realiza en condiciones en las que no se forma una fuerte unión célula-sustrato entre una célula o un agregado celular y un recipiente de cultivo y similares.
El "cultivo de adhesión" se refiere al cultivo en condiciones en las que una célula o un agregado celular se adhiere a un material de recipiente de cultivo y similares. En este caso, la adhesión de la célula significa que se forma una fuerte unión célula-sustrato entre una célula o un agregado celular y el material del recipiente de cultivo. Es decir, el cultivo de adhesión se refiere al cultivo en condiciones en las que se forma una fuerte unión célula-sustrato entre una célula o un agregado celular y un material de recipiente de cultivo y similares.
En un agregado celular en cultivo en suspensión, se forma una adhesión célula-célula plana. En los agregados celulares en cultivo en suspensión, apenas se forma una unión célula-sustrato con un recipiente de cultivo y similares y, aunque se forme, su contribución es pequeña. En un agregado celular en cultivo en suspensión, puede estar presente una unión célula-sustrato endógena dentro del agregado, pero difícilmente se forma una unión célula-sustrato con un recipiente de cultivo y similares e, incluso si se forma, su contribución es pequeña. La adhesión célula-célula plana (unión plana) significa que una célula se une a otra célula a través de planos. Más particularmente, la adhesión célula-célula plana significa que, por ejemplo, no menos del 1 %, preferiblemente no menos del 3 %, más preferiblemente no menos del 5 %, del área superficial de una célula se adhiere a la superficie de otra célula. La superficie de una célula se puede observar mediante la tinción con un reactivo (p. ej., DiI) que tiñe las membranas, la tinción inmunológica de las moléculas de adhesión celular (p. ej., E-cadherina y N-cadherina).
No está particularmente limitado un recipiente de cultivo usado para el cultivo de adhesión siempre que se pueda realizar un "cultivo de adhesión" y los expertos en la técnica puedan seleccionar adecuadamente un recipiente de cultivo adecuado de acuerdo con la escala del cultivo, las condiciones de cultivo y el período de cultivo. Los ejemplos de tales recipientes de cultivo incluyen matraces de cultivo de tejidos, placas de cultivo, placas de cultivo de tejidos, placas múltiples, microplacas, placas de micropocillos, placas múltiples, placas de pocillos múltiples, portaobjetos de cámara, cuenco, tubos, bandejas, bolsas de cultivo, microtransportadores, perlas, matraces giratorios y botellas giratorias. Para permitir el cultivo por adhesión, estos recipientes de cultivo son preferiblemente adhesivos a las células. Los recipientes de cultivo con adhesivo celular incluyen recipientes de cultivo cuyas superficies han sido tratadas artificialmente para mejorar la adhesividad celular y, específicamente, se puede mencionar un recipiente de cultivo cuyo interior está recubierto con un agente de recubrimiento. Los ejemplos del agente de recubrimiento incluyen matriz extracelular tal como laminina [que incluye laminina a5p1 y1 (en adelante, laminina 511), laminina a1 p1 y1 (en adelante, laminina 111) y similares, y el fragmento de laminina (laminina 511E8, etc.)], entactina, colágeno, gelatina, vitronectina, Synthemax (Corning Incorporated), Matrigel y similares, o polímeros tales como polilisina, poliornitina y similares, y similares. T ambién es posible usar un recipiente de cultivo cuya superficie se procese mediante un tratamiento de carga eléctrica positiva y similares. Más preferiblemente, se usa un recipiente de cultivo recubierto con laminina 511E8 ya que se puede realizar una inducción estable y eficaz de células epiteliales pigmentarias de la retina (WO 2015/053375). Como laminina 511E8, se puede usar un producto comercialmente disponible (p. ej., iMatrix-511, Nippi).
No está particularmente limitado el recipiente de cultivo a usar cuando se realiza el cultivo en suspensión siempre que permita el "cultivo en suspensión" y los expertos en la materia puedan determinarlo adecuadamente. Los ejemplos de tales recipientes de cultivo incluyen matraz, matraz de cultivo de tejido, placa, placa de Petri, placa de cultivo de tejido, multiplaca, microplaca, placa de micropocillos, microporo, multiplaca, placa de multipocillos, portaobjetos de cámara, cuenco, tubo, bandeja, bolsa de cultivo, matraz giratorio, botella giratoria y así sucesivamente. Para permitir el cultivo en suspensión, estos recipientes de cultivo no son preferiblemente adhesivos celulares. Los recipientes de cultivo que no se adhieren a las células incluyen recipientes de cultivo cuyas superficies no se han sometido a un tratamiento artificial para mejorar la adhesividad celular (p. ej., tratamiento de recubrimiento con matriz extracelular como laminina, entactina, colágeno, gelatina, etc., y similares, o con polímeros tales como polilisina, poliornitina, etc. y similares o procesamiento superficial tal como tratamiento de carga eléctrica positiva y similares), y similares. Como recipiente de cultivo no adhesivo celular, se pueden usar recipientes de cultivo cuyas superficies hayan sido tratadas artificialmente para disminuir la adhesividad a las células (p. ej., tratamiento superhidrofílico con polímero MPC y similares, tratamiento de baja adsorción de proteínas, etc.) y similares.
El medio para usar para cultivar células en la presente invención se puede preparar a partir de un medio usado generalmente para cultivar células animales como medio basal. Los ejemplos del medio basal comercialmente disponibles incluyen medios que se pueden usar para cultivar células animales como medio BME, medio BGJb, medio CMRL 1066, medio Glasgow MEM (GMEM), medio MEM mejorado con opción de zinc, medio iMd M, medio Medium 199, medio Eagle MEM, medio aMEM, medio DMEM, medio F-12, medio Dm EM/F-12, medio IMDM/F12, medio Ham, medio RPMI 1640, medio de Fischer y similares. Se puede usar un solo medio o una combinación de dos o más tipos de estos, pero el medio no se limita a ello.
"Medio de suero" significa un medio que contiene suero sin ajustar o sin purificar. Aunque se puede usar un suero derivado de cualquier animal, se puede usar preferiblemente un suero derivado de mamíferos tales como bovinos, humanos y similares. Cuando se realiza un cultivo con el objetivo de autotrasplante, también se puede usar el suero del propio paciente.
La concentración del suero no está particularmente limitada siempre que pueda inducir eficazmente la diferenciación de las células epiteliales pigmentarias de la retina. Por ejemplo, se puede ajustar adecuadamente en el intervalo de aproximadamente 0,5 % - 30 % (v/v). La concentración puede ser constante o se puede cambiar en etapas.
El "medio libre de suero" significa un medio que no contiene un suero sin ajustar o sin purificar. Un medio que contiene componentes derivados de sangre purificados y componentes derivados de tejidos animales (p. ej., factor de crecimiento) también se incluye en el medio libre de suero a menos que contenga suero sin ajustar o sin purificar.
Las "condiciones libres de suero" significan condiciones sin suero sin ajustar o sin purificar, específicamente, condiciones que usan un medio libre de suero.
El medio libre de suero puede contener un reemplazo de suero. Los ejemplos del reemplazo de suero incluyen uno que contiene de manera apropiada albúmina, transferrina, ácido graso, precursor de colágeno, oligoelemento, 2-mercaptoetanol o 3' tiolglicerol, o equivalentes de estos, etc., y así sucesivamente. Dicho reemplazo de suero se puede preparar, por ejemplo, mediante el método descrito en WO 98/30679. El reemplazo de suero puede ser un producto comercialmente disponible. Los ejemplos de tales reemplazos de suero comercialmente disponibles incluyen suero de Reemplazo Knockout™ (Life Technologies, en lo sucesivo a veces se indicará como KSR), Concentrado de Lípidos Químicamente Definido (fabricado por Life Technologies) y Glutamax™ (fabricado por Life Technologies), B27 (fabricado por Life Technologies), N2 (fabricado por Life Technologies).
Para evitar una preparación complicada, se puede usar como tal medio libre de suero un medio libre de suero con una cantidad apropiada añadida (p. ej., de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 30 %, preferiblemente de aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 %) de KSR comercialmente disponible (fabricado por Life Technologies) (p. ej., medio MEM Glasgow añadido con KSR en el intervalo de concentración mencionado anteriormente).
El medio a usar puede contener adecuadamente un ácido graso o lípido, un aminoácido (p. ej., aminoácidos no esenciales), una vitamina, un factor de crecimiento, una citoquina, un antioxidante, 2-mercaptoetanol, ácido pirúvico, un agente tamponador, sales inorgánicas, etc.
El medio para usar contiene opcionalmente, además de los mencionados anteriormente, un inhibidor de ROCK (quinasa formadora de hélice superenrollada asociada a Rho /quinasa asociada a Rho) para suprimir la muerte celular (apoptosis) de las células madre pluripotentes. Como inhibidor de ROCK, se pueden mencionar Y-27632, Fasudil o H-1152. La concentración del inhibidor de ROCK se puede establecer apropiadamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede establecer dentro de un intervalo de concentración que muestre una actividad inhibidora de ROCK correspondiente a aproximadamente 50 nM - 200 pM de Y-27632.
Para evitar la contaminación con un componente químicamente indefinido, un medio a ser es preferiblemente un medio cuyos componentes están químicamente definidos (Medio Químicamente Definido; CDM).
El cultivo se realiza preferiblemente en condiciones libres de xeno. El "libre de xeno" significa condiciones que eliminan componentes (proteínas, etc.) derivados de especies diferentes a la de la célula a cultivar.
El "medio que contiene la sustancia X" y "en presencia de la sustancia X" se refieren a un medio suplementado con una sustancia exógena X o un medio que contiene una sustancia exógena X, o en presencia de una sustancia exógena X. Es decir, cuando las células presentes en el medio expresan, secretan o producen endógenamente la sustancia X, la sustancia X endógena se distingue de la sustancia X exógena, y se entiende que un medio libre de sustancia X exógena queda fuera de la categoría de "medio que contiene la sustancia X", incluso cuando contiene la sustancia X endógena.
Por ejemplo, un "medio que contiene un agonista de la vía de transducción de señales de FGF" es un medio suplementado con un agonista de la vía de transducción de señales de FGF exógeno o un medio que contiene un agonista de la vía de transducción de señales de FGF exógeno.
Una "célula alimentadora" se refiere a una célula distinta de una célula madre pluripotente que coexiste cuando se cultiva la célula madre. Ejemplos de células alimentadoras usadas para cultivar células madre pluripotentes mientras mantienen un estado indiferenciado incluyen fibroblastos de ratón (MEF), fibroblastos humanos, células SNL y similares. Como células alimentadoras, son preferibles las células alimentadoras que se sometieron a un tratamiento de supresión del crecimiento. Los ejemplos del tratamiento de supresión del crecimiento incluyen el tratamiento con un inhibidor del crecimiento (p. ej., mitomicina C), radiación gamma y similares. Las células alimentadoras usadas para cultivar células madre pluripotentes mientras mantienen el estado indiferenciado contribuyen al mantenimiento del estado de indiferenciación de las células madre pluripotentes mediante la secreción de un factor humoral (preferiblemente factor para mantener el estado indiferenciado) o la producción de un armazón para la adhesión celular (sustrato extracelular).
En la presente invención, en ausencia de células alimentadoras (libres de alimentadoras) significa cultivar en ausencia de células alimentadoras. Como la ausencia de una célula alimentadora, por ejemplo, se pueden mencionar las condiciones de no adición de una célula alimentadora o sustancialmente libres de una célula alimentadora (p. ej., la proporción del número de células alimentadoras en relación con el número total de células no es más del 3%).
2. Método de producción de células epiteliales pigmentarias de la retina.
El método de producción de la presente invención es un método para producir células epiteliales pigmentarias de la retina, que comprende las siguientes etapas (1) -(2):
(1) una primera etapa para cultivar células madre pluripotentes en un medio que contiene un inhibidor del receptor de FGF y/o un inhibidor de MEK durante un período de no más de 30 días, en donde el medio no contiene un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y no contiene un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt, y
(2) una segunda etapa para cultivar las células obtenidas en la primera etapa en presencia de un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y/o un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt, y en ausencia de un inhibidor del receptor de FGF y en ausencia de un inhibidor de MEK, para formar células epiteliales pigmentarias de la retina;
en donde el inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal es SB431542, y
en donde el inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt se selecciona del grupo que consiste en CKI-7, D4476, IWR-1-endo o IWP-2.
(1) La primera etapa
Como una célula madre pluripotente preferible en la primera etapa, se pueden mencionar células madre pluripotentes inducidas, más preferiblemente células madre pluripotentes inducidas humanas. El método de producción de células madre pluripotentes inducidas no está particularmente limitado, y se pueden producir mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica como se mencionó anteriormente. También es deseable realizar una etapa para preparar células madre pluripotentes inducidas (es decir, una etapa de reprogramación de células somáticas para establecer células madre pluripotentes) en condiciones libres de alimentadoras.
Las células madre pluripotentes generalmente se someten a la primera etapa después del cultivo de mantenimiento o del cultivo de expansión. El cultivo de mantenimiento o cultivo de expansión de células madre pluripotentes se puede realizar mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica, preferiblemente en ausencia de células alimentadoras. Aunque el cultivo de mantenimiento y expansión de células madre pluripotentes se puede realizar mediante cultivo por adhesión o cultivo en suspensión, se realiza preferiblemente mediante cultivo por adhesión.
El cultivo de mantenimiento o cultivo de expansión de células madre pluripotentes en ausencia de células alimentadoras se puede realizar en un medio que contiene un factor para mantener el estado indiferenciado. El factor para mantener el estado indiferenciado es una sustancia que tiene una acción para suprimir la diferenciación de células madre pluripotentes. Generalmente es un factor para mantener el estado indiferenciado derivado de un mamífero. Dado que el factor para mantener el estado indiferenciado puede tener reactividad cruzada entre especies de mamíferos, también se puede usar un factor para mantener el estado indiferenciado de cualquier mamífero siempre que se pueda mantener el estado indiferenciado de las células madre pluripotentes a cultivar. Preferiblemente, se usa un factor para mantener el estado indiferenciado de un mamífero de la misma especie que las células a cultivar.
Los ejemplos del factor para mantener el estado indiferenciado ampliamente usado por los expertos en la técnica incluyen un agonista de la vía de transducción de señales de FGF, un agonista de la vía de transducción de señales de la familia TGFp y similares en el caso de células madre pluripotentes cebadas (p. ej., células ES humanas , células iPS humanas). Como agonista de la vía de transducción de señales de FGF, se pueden mencionar específicamente los factores de crecimiento de fibroblastos (p. ej., bFGF, FGF4, FGF8). Como agonista de la vía de transducción de señales de la familia TGFp, se pueden mencionar un agonista de la vía de transducción de señales de TGFp (p. ej., TGFp1, TGFp2), un agonista de la vía de transducción de señales de Nodal/Activina (p. ej., Nodal, Activina A, Activina B). Cuando se cultivan células madre pluripotentes humanas (células ES humanas, células iPS humanas), el factor para mantener el estado indiferenciado es preferiblemente bFGF.
La concentración del factor de mantenimiento del estado indiferenciado en el medio a usar en el cultivo de mantenimiento o cultivo de expansión de células madre pluripotentes es una concentración capaz de mantener el estado indiferenciado de las células madre pluripotentes a cultivar, y se puede determinar de manera apropiada por los expertos en la técnica. Por ejemplo, específicamente, cuando se usa bFGF como factor para mantener el estado indiferenciado, la concentración del mismo es generalmente aproximadamente de 4 - 500 ng/ml, preferiblemente de 10 - 200 ng/ml, más preferiblemente aproximadamente de 30 - 150 ng/ml.
Como medio que contiene un factor para mantener el estado indiferenciado (que en adelante se indicará algunas veces como medio libre de alimentadoras), también se puede usar, según sea apropiado, un medio comercialmente disponible como medio para células madre. Por ejemplo, están comercialmente disponibles Essential 8 (fabricado por Life Technologies), hESF9 (Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Sep 9; 105(36):13409-14), S-medium (fabricado por DS Pharma Biomedical), StemPro (fabricado por Life Technologies), mTeSR1 (fabricado por STEMCELL Technologies), mTeSR2 (fabricado por STEMCELL Technologies), TeSR-E8 (fabricado por STEMCELL Technologies) y similares . Además de estos, se puede mencionar StemFit® (fabricado por Ajinomoto Co., Inc.) como un medio libre de alimentadoras en desarrollo. Usando estos medios, se pueden realizar cultivos de mantenimiento o cultivos de expansión de células madre pluripotentes.
Cuando se recuperan las células madre pluripotentes que se sometieron a cultivo de mantenimiento o cultivo de expansión, se preparan las células madre pluripotentes dispersas mediante una operación de dispersión. Una operación de dispersión de las células madre pluripotentes puede contener un tratamiento de dispersión mecánica, un tratamiento de solución de la dispersión celular y un tratamiento de adición de agente de protección celular. Estos tratamientos se pueden realizar en combinación. Preferiblemente, se realiza un tratamiento de solución de la dispersión celular simultáneamente con un tratamiento de adición del agente de protección celular y luego se realiza un tratamiento de dispersión mecánica.
Como agente protector celular a usar para el tratamiento de adición del agente de protección celular, se pueden mencionar heparina, suero o reemplazo de suero. Además, para suprimir la muerte celular inducida por la dispersión (particularmente, la muerte celular de células madre pluripotentes humanas), se puede añadir un inhibidor de ROCK durante la dispersión. Como inhibidor de ROCK, se pueden mencionar Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152 y similares.
Como solución de dispersión celular que se usará para el tratamiento de dispersión celular, se puede mencionar una solución que contenga enzimas como tripsina, colagenasa, hialuronidasa, elastasa, pronasa, DNasa, papaína, etc., y un agente quelante como ácido etilendiaminotetraacético, etc. También se puede usar una solución de dispersión de células comercialmente disponible como TrypLE Select (fabricada por Life Technologies) y TrypLE Express (fabricada por Life Technologies).
Como método de tratamiento de dispersión mecánica, se puede mencionar un tratamiento de pipeteo o raspado con un raspador.
Las células madre pluripotentes dispersas se pueden sembrar en un nuevo recipiente de cultivo y someterse a la primera etapa.
Para suprimir la muerte celular inducida por la dispersión (particularmente, la muerte celular de células madre pluripotentes humanas), las células madre pluripotentes se pueden sembrar en un nuevo recipiente de cultivo, el cultivo de mantenimiento se puede realizar continuamente en presencia de un inhibidor de ROCK, y la primera etapa podrá iniciarse posteriormente. Si bien el período de tratamiento con un inhibidor de ROCK no está particularmente limitado siempre que se pueda suprimir la muerte celular inducida por la dispersión, generalmente es de aproximadamente 12 a 24 horas.
La concentración de las células madre pluripotentes cuando se inicia la primera etapa se puede establecer apropiadamente por los expertos en la técnica. En cultivo de adhesión es, por ejemplo, de 1,0x102 células/cm2 a 1x106 células/cm2, preferiblemente de 2,0x102 células/cm2 a 2x105 células/cm2, más preferiblemente de 5x102 células/cm2 a 1x105 células/cm2 o de 1x103 células/cm2 a 1x104 células/cm2.
Para evitar la contaminación con un componente químicamente indefinido, un medio a usar en la primera etapa es preferiblemente un medio cuyos componentes estén químicamente definidos.
Un medio para usar en la primera etapa puede ser un medio de suero o un medio libre de suero. Para evitar la contaminación con un componente químicamente indefinido, es preferible un medio libre de suero.
El medio usado en la primera etapa contiene opcionalmente un inhibidor de ROCK (quinasa formadora de hélice superenrollada asociada a Rho /quinasa asociada a Rho) para suprimir la muerte celular (apoptosis). Como inhibidor de ROCK, se pueden mencionar Y-27632, Fasudil o H-1152. Solo se puede usar un tipo de inhibidor de ROCK o se pueden usar dos o más tipos de estos en combinación. Si bien la concentración del inhibidor de ROCK se puede establecer de manera apropiada por los expertos en la técnica, por ejemplo, se puede establecer dentro del intervalo de concentración que muestra una actividad inhibidora de ROCK correspondiente a aproximadamente de 50 nM - 200 pM de Y-27632.
El cultivo en la primera etapa se puede realizar en presencia de una célula alimentadora. Para evitar la contaminación de componentes químicamente indefinidos, el cultivo se realiza preferiblemente en condiciones libres de una célula alimentadora.
El medio usado en la primera etapa puede contener o no un factor extraño para mantener el estado indiferenciado independientemente de si se cultiva en ausencia de células alimentadoras o en presencia de una célula alimentadora. La primera etapa en la presente invención se realiza más preferiblemente en un medio que contenga un factor para mantener el estado indiferenciado y en ausencia de células alimentadoras. El factor para mantener el estado indiferenciado no está particularmente limitado siempre que sea una sustancia que tenga una acción para suprimir la diferenciación de células madre pluripotentes. Preferiblemente, contiene un agonista de la vía de transducción de señales de FGF, más preferiblemente bFGF.
La concentración del factor para mantener el estado indiferenciado en el medio a usar en la primera etapa puede estar en el intervalo de concentración del factor para mantener el estado indiferenciado usado para el cultivo de mantenimiento o cultivo de expansión de células madre pluripotentes. Por ejemplo, cuando se usa bFGF como factor para mantener el estado indiferenciado en ausencia de células alimentadoras, la concentración de este es generalmente de aproximadamente 4 - 500 ng/ml, preferiblemente de 10 - 200 ng/ml, más preferiblemente de aproximadamente 30 - 150 ng/ml.
El medio para usar en la primera etapa contiene un inhibidor del receptor de FGF y/o un inhibidor de MEK. El medio puede contener un componente adicional (p. ej., cualquier agonista o inhibidor de la vía de transducción de señales) siempre que la eficacia de producción de las células epiteliales pigmentarias de la retina mediante el método de producción de la presente invención no disminuya notablemente (p. ej., el mismo nivel que o no más que el nivel de eficacia sin la primera etapa). Por ejemplo, el medio puede contener además un inhibidor del receptor de BMP, un agonista de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog o un inhibidor de PKC solo o en combinación con cualquiera de los siguientes (1) -(4): (1) inhibidor del receptor de BMP y agonista de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog, (2) inhibidor del receptor de BMP e inhibidor de PKC, (3) agonista de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog e inhibidor de PKC, (4) inhibidor del receptor de BMP, agonista de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog e inhibidor de PKC.
El inhibidor del receptor de FGF no está particularmente limitado siempre que sea una sustancia capaz de suprimir la transducción de señales mediada por FGF, y puede ser cualquier proteína, ácido nucleico y compuesto de bajo peso molecular. FGF en esta memoria forma una familia que contiene al menos 22 especies. Como receptor de FGF representativo, se pueden mencionar FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 y similares, y el inhibidor del receptor de FGF es una sustancia que inhibe uno, una pluralidad o todos ellos. Los ejemplos de la sustancia incluyen, pero no se limitan a, una sustancia que actúa directamente sobre el FGF o el receptor del FGF (p. ej., anticuerpo, aptámero, etc.), una sustancia que suprime la expresión de un gen que codifica el FGF o el receptor del FGF (p. ej., oligonucleótido antisentido , siRNA, etc.), una sustancia que inhibe la unión del receptor de FGF y FGF (p. ej., receptor de FGF soluble, antagonista de FGF, etc.), una sustancia que inhibe la actividad fisiológica causada por la transducción de señales por el receptor de FGF [por ejemplo, compuestos de bajo peso molecular tales como PD173074 (N-[2-[[4-(Dietilamino)butil]amino]-6-(3,5-dimetoxifenil)pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-N'-(1,1-dimetiletil)urea), SU5402 (ácido 2-[(1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-ilideno)metil]-4-metil-1H-pirrol-3-propanoico) y similares] que inhiben la actividad de tirosina quinasa del receptor de FGF por competición con el ATP. Solo se puede usar un tipo de sustancia o se pueden usar dos o más tipos de esta en combinación. PD173074 y SU5402 son conocidos inhibidores del receptor de FGF, y se puede obtener un producto comercialmente disponible y similar según sea el caso. Como inhibidor del receptor de FGF, se prefiere, por ejemplo, PD173074 o SU5402.
La concentración del inhibidor del receptor de FGF contenido en el medio no está particularmente limitada siempre que las células epiteliales pigmentarias de la retina se puedan producir mediante el método de la presente invención, y los expertos en la técnica puedan determinarla adecuadamente de acuerdo con el tipo de inhibidor del receptor de FGF. Por ejemplo, la concentración del inhibidor del receptor de FGF está en un intervalo de concentración que muestra una actividad inhibidora del receptor de FGF correspondiente a 1 - 1000 nM, preferiblemente a 10 - 500 nM, más preferiblemente a 25 nM - 400 nM, particularmente preferiblemente a 30 - 300 nM, de PD173074. Por ejemplo, se puede mencionar un intervalo de concentración de 0,1 a 500 pM, preferiblemente de 1 a 100 pM, más preferiblemente de 5 a 20 pM, de SU5402. La concentración puede ser constante durante la primera etapa o se puede variar en etapas siempre que las células epiteliales pigmentarias de la retina se puedan producir mediante el método de la presente invención.
El inhibidor de MEK no está particularmente limitado siempre que sea una sustancia que inhiba la expresión o actividad de la familia MEK, y puede ser cualquier proteína, ácido nucleico y compuesto de bajo peso molecular. Como familia de MEK representativa, se pueden mencionar MEK1, MEK2, MEK3 y similares, y el inhibidor de MEK es una sustancia que inhibe la expresión o actividad de una, una pluralidad o todas estas familias de MEK. Los ejemplos de la sustancia incluyen, pero no se limitan a, una sustancia que suprime la expresión de un gen que codifica varios MEK (p. ej., oligonucleótido antisentido, siRNA, etc.), una sustancia que inhibe la actividad enzimática de varios MEK [compuestos de bajo peso molecular como PD0325901 (N-[(2R)-2,3-Dihidroxipropoxi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-benzamida), PD184352 ((2-[(2-cloro-4-yodofenil)amino]-N-ciclopropilmetoxi)-3,4-difluorobenzamida), PD98059 (2'-amino-3'-metoxiflavona), U0126 (1,4-diamino-2,3-diciano-1,4-bis[2-aminofeniltio]butadieno), MEK162 (5-[(4-Bromo-2-fluorofenil)amino]-4-fluoro-N-(2-hidroxietoxi)-1 -metil-1 H-bencimidazol-6-carboxamida), SL327 (a-[Amino[(4-aminofenil)tio]metileno]-2-(trifluorometil)bencenoacetonitrilo), TAK-733 ((R)-3-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-5-(2-fluoro-4-yodofenilamino)-8-metilpirido [2,3-d] pirimidina-4,7(3H, 8H)-diona) o Az D-8330 (2-(2-fluoro-4-yodofenilamino)-N-(2-hidroxietoxi)-1,5-dimetil-6-oxo-1,6-dihidropiridina-3-carboxamida) y similares] y similares. Solo se puede usar un tipo de sustancia o se pueden usar dos o más tipos de esta en combinación. PD0325901, PD184352, PD98059, U0126, MEK162, SL327, TAK-733 y AZD-8330 son inhibidores de MEK conocidos, y se puede obtener un producto comercialmente disponible y similares según sea apropiado. Como inhibidor de MEK, se prefiere, por ejemplo, PD0325901, PD184352, U0126, TAK-733 o AZD-8330.
La concentración del inhibidor de MEK contenido en el medio no está particularmente limitada siempre que las células epiteliales pigmentarias de la retina de los mamíferos se puedan producir mediante el método de la presente invención, y los expertos en la materia puedan determinarla de manera apropiada de acuerdo con el tipo de inhibidor de MEK. Por ejemplo, la concentración del inhibidor de MEK está en un intervalo de concentración que muestra una actividad inhibidora de MEK correspondiente a 0,001 - 10 pM, preferiblemente a 0,005 - 5 pM, más preferiblemente a 0,1 - 4 pM, más preferiblemente a 0,25 - 4 pM, particularmente preferiblemente a 0,25 - 2 pM, de PD0325901. Por ejemplo, se puede mencionar un intervalo de concentración de 0,01 - 20 pM, preferiblemente de 0,1 - 10 pM, más preferiblemente de 1,5 - 6 pM, de PD184352. La concentración puede ser constante durante la primera etapa o se puede variar en etapas siempre que las células epiteliales pigmentarias de la retina se puedan producir mediante el método de la presente invención.
El inhibidor del receptor de BMP no está particularmente limitado siempre que sea una sustancia capaz de suprimir la transducción de señales mediada por BMP, y puede ser cualquier proteína, ácido nucleico y compuesto de bajo peso molecular. Como representativos se pueden mencionar BMP, BMP2, BMP4, BMP7, GDF7 y similares. El receptor de BMP (BMPR) en esta memoria está presente como un heterodímero del receptor TIPO I (ALK (quinasa similar al receptor de activina)-1, ALK-2, ALK-3, ALK-6) y el receptor TIPO II (ActRII, BMPRII). Los ejemplos del inhibidor del receptor de BMP incluyen, pero no se limitan a, una sustancia que actúa directamente sobre BMP o el receptor de BMP (p. ej., anticuerpo, aptámero, etc.), una sustancia que suprime la expresión de un gen que codifica BMP o receptor de BMP (p. ej., oligonucleótido antisentido, siRNA, etc.), una sustancia que inhibe la unión del receptor de BMP y BMP (p. ej., receptor de BMP soluble, antagonista de BMP, etc.), una sustancia que inhibe la actividad fisiológica causada por la transducción de señales por el receptor de BMP [compuestos de bajo peso molecular como LDN193189 (4-[6-(4-Piperazin-1 -ilfenil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]quinolina) o Dorsomorfina (6-[4-[2-(1 -Piperidinil)etoxi]fenil]-3-(4-piridinil)-pirazolo[1,5-a]pirimidina) y similares, y similares] y similares. Solo se puede usar un tipo de sustancia o se pueden usar dos o más tipos de esta en combinación. LDN193189 y Dorsomorfina son inhibidores conocidos del receptor BMP TIPO I, y se puede obtener un producto comercialmente disponible y similares según sea apropiado. Como inhibidor del receptor de BMP, se prefiere, por ejemplo, LDN193189.
Un agonista de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (en lo sucesivo, a veces denominado Shh) es una sustancia capaz de potenciar la transducción de señales mediada por Shh, y puede ser cualquier proteína, ácido nucleico o compuesto de bajo peso molecular. Los ejemplos del agonista de la vía de transducción de señales de Shh incluyen, pero no se limitan a, proteínas que pertenecen a la familia Hedgehog (p. ej., Shh e Ihh), receptor de Shh, agonista del receptor de Shh [compuestos de bajo peso molecular como Purmorfamina (9-Cyclohexyl -N-[4-(4-morfolinil)fenil]-2-(1-naftaleniloxi)-9H-purin-6-amina), o SAG (agonista suavizado; N-metil-N'-(3-piridinilbencil)- N'-(3-clorobenzo[b]tiofeno-2-carbonil)-1,4-diaminociclohexano) y similares, y similares] y similares. Solo se puede usar un tipo de sustancia o se pueden usar dos o más tipos de esta en combinación. Purmorfamina y SAG son agonistas conocidos de la vía de transducción de señales de Shh, y se puede obtener un producto comercialmente disponible y similares según sea apropiado. Como agonista de la vía de transducción de señales de Shh, se prefiere, por ejemplo, SAG.
El inhibidor de PKC no está particularmente limitado siempre que sea una sustancia capaz de inhibir la expresión o la actividad de la proteína quinasa C (PKC), y puede ser cualquier proteína, ácido nucleico y compuesto de bajo peso molecular. PKC en esta memoria es una familia de proteínas constituida por al menos 10 tipos de isoenzimas, y el inhibidor de PKC es una sustancia que inhibe la expresión o actividad de una, una pluralidad o todas estas familias de PKC. Los ejemplos de la sustancia incluyen, pero no se limitan a, una sustancia que suprime la expresión de un gen que codifica PKC (p. ej., oligonucleótido antisentido, siRNA, etc.), una sustancia que inhibe la actividad enzimática de PKC [por ejemplo, compuestos de bajo peso molecular como Go6983 (3-[1 -[3-(Dimetilamino)propil]-5-metoxi-1 H-indol-3-il]-4-(1 H-indol-3-il)-1 H-pirrol-2, 5-dione) y similares, y similares] y similares. Solo se puede usar un tipo de sustancia o se pueden usar dos o más tipos de esta en combinación. Go6983 es un inhibidor de PKC conocido, y se puede obtener un producto comercialmente disponible y similares según sea apropiado. Como inhibidor de PKC, se prefiere, por ejemplo, Go6983.
La concentración del inhibidor del receptor de BMP, el agonista de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog y el inhibidor de PKC contenido en el medio se pueden determinar adecuadamente por los expertos en la técnica para que se encuentre dentro de un intervalo capaz de producir células epiteliales pigmentarias de la retina mediante el método de la presente invención. Por ejemplo, la concentración del inhibidor del receptor de BMP está en un intervalo de concentración que muestra una actividad inhibidora del receptor de BMP correspondiente a 1 - 1000 nM, preferiblemente 10 - 500 nM, más preferiblemente 30 - 300 nM, de LDN193189. La concentración del agonista de la vía de transducción de señales de Shh está en un intervalo de concentración que muestra una acción de transducción de señales de Shh correspondiente a 1 - 2000 nM, preferiblemente 3 - 1000 nM, más preferiblemente 10 - 500 nM, de SAG. La concentración del inhibidor de PKC es un intervalo de concentración que muestra una actividad inhibidora de PKC correspondiente a 0,05 - 20 pM, preferiblemente a 0,2 - 10 pM, más preferiblemente a 0,5 - 5 pM, de Go6983.
La concentración puede ser constante durante la primera etapa o se puede variar en etapas siempre que las células epiteliales pigmentarias de la retina se puedan producir mediante el método de la presente invención.
En la primera etapa, las células madre pluripotentes se pueden cultivar en cualquier condición de cultivo en suspensión y cultivo de adhesión, preferiblemente cultivo de adhesión.
El recipiente de cultivo a usar para el cultivo por adhesión de células madre pluripotentes no está particularmente limitado siempre que permita el cultivo por adhesión de células. Se trata preferiblemente de un recipiente de cultivo con adhesivo celular. Como recipiente de cultivo con adhesivo celular, se puede usar un recipiente de cultivo tratado artificialmente para mejorar la adhesividad celular y, específicamente, se puede mencionar el recipiente de cultivo mencionado anteriormente cuyo interior está recubierto con un agente de recubrimiento. Los ejemplos de un agente de recubrimiento preferible incluyen matriz extracelular tal como laminina [que incluye laminina a5p1 y1 (laminina 511), laminina a1 p1 y1 (laminina 111) y similares y el fragmento de laminina (laminina 511E8, etc.)], entactina, colágeno, gelatina, vitronectina, Synthemax (Corning Incorporated), Matrigel y similares, y similares o polímeros tales como polilisina, poliornitina y similares, y similares, siendo más preferida la laminina 511E8 (WO 2015/053375). La laminina 511E8 puede ser un producto comercialmente disponible (p. ej., iMatrix-511, Nippi).
El recipiente de cultivo a usar para el cultivo en suspensión de células madre pluripotentes no está particularmente limitado siempre que permita el cultivo de células en suspensión. Es preferiblemente no adhesivo celular.
Se pueden determinar apropiadamente las condiciones de cultivo, como la temperatura de cultivo y la concentración de CO2 en la primera etapa. Aunque la temperatura de cultivo no está particularmente limitada, es, por ejemplo, de aproximadamente 30°C a 40°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 es, por ejemplo, del 1% al 10%, preferiblemente del 5%.
El medio se puede cambiar en medio de la primera etapa. El método de intercambio de medio no está particularmente limitado, y la cantidad total del medio original se puede intercambiar con un medio nuevo o se puede intercambiar solo una parte del medio original con un medio nuevo. Cuando se intercambia una parte del medio original con un medio nuevo, se calculan primero las concentraciones finales de las sustancias (inhibidor de MEK, inhibidor del receptor de FGF, etc.) contenidas en la primera etapa, y luego se prepara un medio nuevo que contiene las sustancias en las concentraciones correspondientes a la proporción del medio a intercambiar y se intercambia con el medio. Las concentraciones finales de las sustancias contenidas en la primera etapa se pueden cambiar durante el cultivo.
Mientras que la herramienta usada para la operación de intercambio de medio no está particularmente limitada, por ejemplo, se pueden mencionar una pipeta, una micropipeta, una micropipeta multicanal, un dispensador continuo y similares. Por ejemplo, cuando se usa una placa de 96 pocillos como recipiente de cultivo, se puede usar una Pipetman multicanal.
El número de días de la primera etapa no está particularmente limitado siempre que esté dentro del período en el que las células producidas por exposición de las células madre pluripotentes al inhibidor del receptor de FGF y/o al inhibidor de MEK mencionado anteriormente y similares mantengan la potencia de diferenciación en células epiteliales pigmentarias de la retina. Las células madre pluripotentes de la primera etapa se cultivan durante un período no superior a 30 días. El período puede variar de acuerdo con la línea de células madre pluripotentes a usar y similares. Generalmente no es menos de 2 días, preferiblemente no menos de 3 días, más preferiblemente no menos de 4 días. En la primera etapa, las células madre pluripotentes se cultivan más preferiblemente durante 2 días - 13 días o 2 días - 6 días, más preferiblemente 4 días - 6 días.
También se puede determinar el número de días de la primera etapa usando, como índice, un marcador particular expresado en las células madre pluripotentes tratadas con el inhibidor del receptor de FGF y/o el inhibidor de MEK anteriormente mencionados. Específicamente, por ejemplo, el cultivo de la primera etapa se realiza durante un período suficiente para inducir la expresión de marcadores en la etapa temprana de formación del ojo como PAX6 (Paired box protein 6), LHX2 (LIM homeobox 2) y SIX3 (SIX homeobox 3) y similares, específicamente, al menos un gen de los factores de transcripción del campo ocular, y luego se puede realizar la segunda etapa. Es decir, los ejemplos del "período que no exceda los 30 días" en la primera etapa incluyen "un período suficiente para inducir la expresión de al menos un marcador en la etapa temprana de formación del ojo, específicamente, el factor de transcripción del campo ocular y de no más de 30 días" y "un período suficiente para inducir la expresión génica de al menos uno de PAX6, LHX2 y SIX3 y de no más de 30 días". En estas realizaciones, el límite superior del período de cultivo es, por ejemplo, un período que no excede los 30 días, un período que no excede los 13 días o un período que no excede los 6 días o similar.
Se puede determinar si un determinado período de cultivo en determinadas condiciones de cultivo es "un período suficiente para inducir la expresión de al menos un marcador en la etapa inicial de la formación del ojo, específicamente, el factor de transcripción del campo ocular" o "un período suficiente para inducir la expresión génica de al menos uno de PAX6, LHX2 y SIX3" confirmando si la expresión de al menos uno de estos genes se puede detectar de manera significativa en comparación con el control no tratado, en una población celular después del cultivo durante el período bajo las condiciones. Los expertos en la técnica pueden detectar la expresión de estos genes a través de un método como Northern blot, RT-PCR, microarray y similares.
PAX6, LHX2 y SIX3 son genes que codifican un factor de transcripción del campo ocular expresado en la región del campo ocular en una etapa temprana de desarrollo y respectivamente especificados como N.° de acceso de Genbank: NM_001127612, N.° de acceso de Genbank: NM_004789, N.° de acceso de Genbank: NM_005413 como genes humanos. Estos genes en otras especies animales tales como ratones y similares se pueden especificar fácilmente por los expertos en la técnica y se pueden especificar, por ejemplo, a partir de secuencias de bases de genes citados en http://www.ncbi.nlm. nih.gov.
Un método de producción de células epiteliales pigmentarias de la retina puede incluir las siguientes etapas.
(1) una primera etapa para cultivar una célula madre pluripotente en un medio que comprende un inhibidor del receptor de FGF y/o un inhibidor de MEK durante un período suficiente para inducir la expresión génica de al menos un factor de transcripción del campo ocular, y
(2) una segunda etapa para cultivar la célula obtenida en la primera etapa en presencia de un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y/o un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt para formar una célula epitelial pigmentaria de la retina.
Un método de producción de células epiteliales pigmentarias de la retina puede incluir las siguientes etapas.
(1) una primera etapa para cultivar una célula madre pluripotente en un medio que comprende un inhibidor del receptor de FGF y/o un inhibidor de MEK durante un período suficiente para inducir la expresión génica de al menos uno de PAX6, LHX2 y SIX3, y
(2) una segunda etapa para cultivar la célula obtenida en la primera etapa en presencia de un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y/o un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt para formar una célula epitelial pigmentaria de la retina.
Cuando la primera etapa se realiza mediante cultivo de adhesión, las células también se pueden recuperar disociando las células del recipiente de cultivo.
No está particularmente limitado un método para disociar las células del recipiente de cultivo siempre que se conozca de manera general como un método para disociar células. Se puede usar una solución de disociación celular que contenga enzimas tales como tripsina y similares. Además, también se puede usar una solución de disociación celular disponible comercialmente [TrypLE select (Life Technologies) y similares]. Las células disociadas y recuperadas generalmente se lavan con PBS (solución salina tamponada con fosfato) y/o un medio usado en la segunda etapa, y luego se usa en la segunda etapa.
Las células obtenidas en la primera etapa pueden pasarse (cultivo de mantenimiento), almacenarse como producto intermedio para la producción de células epiteliales pigmentarias de la retina o someterse a otro tratamiento siempre que se mantenga su estado de diferenciación y supervivencia. No está particularmente limitado un método para crioconservar las células obtenidas en la primera etapa siempre que se conozca generalmente como un método para crioconservar células. Por ejemplo, las células obtenidas en la primera etapa pueden suspenderse en un medio que contenga un agente crioprotector como DMSO o glicerina y similares y crioconservarse. Además, también se puede usar una solución de crioconservación de células disponible comercialmente [StemCellBanker (Zenoaq)].
(2) La segunda etapa
A continuación se explica la segunda etapa en la que se cultivan las células obtenidas en la primera etapa en presencia de un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y/o un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt para formar una célula epitelial pigmentaria de la retina.
La concentración de las células cuando se inicia la segunda etapa se puede establecer apropiadamente por los expertos en la técnica. Es, por ejemplo, de 1,0x102 células/cm2 a 2x106 células/cm2, preferiblemente de 3x102 células/cm2 a 1x106 células/cm2, más preferiblemente de 1x103 células/cm2 a 2x105 células/cm2, más preferiblemente de 2x103 a células/cm2 a 4x104 células/cm2, en el caso del cultivo de adhesión.
El medio que se va a usar en la segunda etapa no está particularmente limitado siempre que sea como se describe en la sección de definición anteriormente mencionada. El medio que se va a usar en la segunda etapa puede ser un medio que contenga suero o un medio libre de suero. Para evitar la contaminación de componentes químicamente indefinidos, en la presente invención se usa preferiblemente un medio libre de suero. Para evitar una preparación complicada, por ejemplo, se puede usar un medio libre de suero suplementado con una cantidad adecuada de un reemplazo de suero comercialmente disponible, como KSR, etc. (p. ej., medio MEM de Glasgow suplementado con KSR en un intervalo de concentración de 0,5 % a 30 %).
El medio que se va a usar en la segunda etapa puede contener opcionalmente un inhibidor de ROCK (quinasa formadora de hélice superenrollada asociada a Rho /quinasa asociada a Rho) para suprimir la muerte celular (apoptosis). Como inhibidor de ROCK, se pueden mencionar Y-27632, Fasudil o H-1152. La concentración del inhibidor de ROCK se puede establecer apropiadamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede configurar dentro del intervalo de concentración que muestra una actividad inhibidora de ROCK correspondiente a aproximadamente 50 nM - 200 pM de Y-27632.
Un inhibidor de la vía de transducción de señales de Nodal puede suprimir la transducción de señales mediada por Nodal, y puede ser cualquier proteína, ácido nucleico y compuesto de bajo peso molecular. La señal mediada por Nodal se transduce a través de un receptor de Nodal. El receptor de Nodal está presente como un heterodímero del receptor TIPO I (ALK (quinasa similar al receptor de activina)-4, ALK-5, ALK-7) y el receptor TIPO II (ActRII). Los ejemplos del inhibidor de la vía de transducción de señales de Nodal incluyen, pero no se limitan a, una sustancia que actúa directamente sobre Nodal o el receptor de Nodal (anticuerpo anti-Nodal, anticuerpo anti-receptor de Nodal, etc.), una sustancia que suprime la expresión de un gen que codifica Nodal o el receptor de Nodal (p. ej., oligonucleótido antisentido, siRNA, etc.), una sustancia que inhibe la unión del receptor de Nodal a Nodal (Lefty-A, Lefty-B, Lefty-1, Lefty-2, receptor de Nodal soluble, etc.), un sustancia que inhibe la actividad fisiológica causada por la transducción de señales por el receptor de Nodal [compuestos de bajo peso molecular como SB-431542 (SB431542) (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-il)-5-(piridin-2-il)-1H-imidazol-2-il]benzamida) que inhibe la actividad quinasa del receptor TIPO I por competición con ATP y similares, y similares] y similares. SB-431542 es un conocido inhibidor de la señal Nodal y está disponible de forma apropiada como un producto comercialmente disponible y similares. El inhibidor de la señal Nodal usado en el método de producción de la invención es SB-431542.
Un inhibidor de la vía de transducción de señales de Wnt puede suprimir la transducción de señales mediada por Wnt y puede ser cualquier proteína, ácido nucleico, compuesto de bajo peso molecular y similares. La señal mediada por Wnt se transduce a través de un receptor de Wnt presente como un heterodímero de Frizzled (Fz) y LRP5/6 (proteína 5/6 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad). Los ejemplos del inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt incluyen, pero no se limitan a, una sustancia que actúa directamente sobre Wnt o el receptor de Wnt (anticuerpo anti-Wnt, anticuerpo anti-receptor de Wnt, etc.), una sustancia que suprime la expresión del gen que codifica Wnt o el receptor de Wnt (p. ej., oligonucleótido antisentido, siRNA, etc.), una sustancia que inhibe la unión del receptor de Wnt a Wnt (receptor de Wnt soluble, receptor de Wnt negativo dominante, etc., antagonista de Wnt, Dkk1, proteína Cerberus, etc.), una sustancia que inhibe la actividad fisiológica causada por la transducción de señales por el receptor de Wnt [compuestos de bajo peso molecular como los inhibidores de la caseína quinasa I CKI-7 (N-(2-aminoetil)-5-cloroisoquinolina-8-sulfonamida) y D4476 (4-[4-(2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il]benzamida), IWR-1-endo (IWR1e) (4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-hexahidro-1,3-dioxo-4,7-metano-2H-isoindol-2-il]-N-8-quinolinil-benzamida) que estabiliza el complejo de destrucción de p-catenina al inhibir el recambio metabólico de la Axina, y IWP-2 (N-(6-Metil-2-benzotiazolil)-2-[(3,4,6,7-tetrahidro-4-oxo-3-feniltieno[3,2-d]pirimidin-2-il)tio]acetamida) que inactiva la proteína puercoespín (Porcupine) (Porcn) como una O-aciltransferasa unida a la membrana (MBOAT) y suprime la palmitoilación de la proteína Wnt y similares, y similares] y similares. CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2 y similares son conocidos inhibidores de la señal de Wnt, y los productos comercialmente disponibles y similares están disponibles según corresponda. El inhibidor de la señal de Wnt usado en el método de producción de la invención es CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e) o IWP-2. Un inhibidor de señal de Wnt preferible es CKI-7.
En la segunda etapa, el inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal o el inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt se pueden usar solos pero, preferiblemente, se usan en combinación.
Las concentraciones del inhibidor de la vía de transducción de señales de Nodal y del inhibidor de la vía de transducción de señales de Wnt contenidas en el medio se pueden determinar apropiadamente por los expertos en la técnica para que se encuentren dentro de un intervalo capaz de producir células epiteliales pigmentarias de la retina mediante el método de la presente invención. Por ejemplo, cuando se usa SB-431542 como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal, la concentración de este es generalmente de 0,01 a 50 pM, preferiblemente de 0,1 a 10 pM, más preferiblemente de 5 pM; cuando se usa CKI-7 como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt, la concentración de este es generalmente de 0,01 a 30 pM, preferiblemente de 0,1 a 30 pM, más preferiblemente de 3 pM.
La concentración puede ser constante durante la segunda etapa o se puede variar en etapas siempre que las células epiteliales pigmentarias de la retina puedan producirse mediante el método de la presente invención.
El cultivo en la segunda etapa se puede realizar bajo cualquier condición de cultivo en suspensión y cultivo por adhesión, preferiblemente cultivo por adhesión.
Si bien no está particularmente limitado un recipiente de cultivo usado para el cultivo por adhesión en la segunda etapa siempre que se pueda realizar el cultivo por adhesión de células, es preferible un recipiente de cultivo con adhesión celular. Como recipiente de cultivo con adhesión celular, se pueden usar recipientes de cultivo tratados artificialmente para mejorar la adhesividad celular y, específicamente, se puede mencionar el recipiente de cultivo mencionado anteriormente cuyo interior está recubierto con un agente de recubrimiento. Los ejemplos preferibles del agente de recubrimiento incluyen matriz extracelular tal como laminina [que incluye laminina a5p1Y1 (laminina 511), laminina a1 p1 y1 (laminina 111) y similares, y el fragmento de laminina (laminina 511E8, etc.)], entactina, colágeno, gelatina, vitronectina, Synthemax (Corning Incorporated), Matrigel y similares, o polímeros tales como polilisina, poliornitina y similares, y similares. Más preferida es laminina 511E8 (WO 2015/053375). Como laminina 511E8, se puede usar un producto comercialmente disponible (p. ej., iMatrix-511, Nippi).
El recipiente de cultivo a usar para el cultivo en suspensión en la segunda etapa no está particularmente limitado siempre que permita el cultivo de células en suspensión. Es preferiblemente no adhesivo celular.
Se pueden determinar apropiadamente las condiciones de cultivo como temperatura de cultivo, la concentración de CO2 y así sucesivamente en la segunda etapa. La temperatura de cultivo es, por ejemplo, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 es, por ejemplo, del 1% al 10%, preferiblemente del 5%.
El medio se puede cambiar según corresponda en medio de la segunda etapa. El método de intercambio de medio no está particularmente limitado, y puede intercambiarse la cantidad total del medio original con un medio nuevo o puede intercambiarse solo una parte del medio original con un medio nuevo. Cuando una parte del medio original se intercambia con un medio nuevo, primero se calculan las concentraciones finales de las sustancias (inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal, inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt, KSR, etc.) contenidas en la segunda etapa y luego puede prepararse e intercambiarse con el medio un medio nuevo que contenga las sustancias a las concentraciones correspondientes a la proporción del medio a intercambiar. Las concentraciones finales de las sustancias contenidas en la segunda etapa pueden cambiar durante el cultivo.
Mientras que la herramienta usada para la operación de cambio de medio no está particularmente limitada, por ejemplo, se pueden mencionar una pipeta, una micropipeta, una micropipeta multicanal, un dispensador continuo y similares. Por ejemplo, cuando se usa una placa de 96 pocillos como recipiente de cultivo, se puede usar una pipeta multicanal.
No está particularmente limitado un período de cultivo de la segunda etapa siempre que sea un período capaz de inducir células epiteliales pigmentarias de la retina de interés. Como un ejemplo de tal período de cultivo, las células del epitelio pigmentario de la retina se pueden producir generalmente en los días 14 - 40 contando desde el comienzo de la segunda etapa.
Los expertos en la técnica pueden confirmar la generación de células epiteliales pigmentarias de la retina basándose en la expresión de un marcador celular (RPE65 (células epiteliales pigmentarias de la retina), Mitf (células epiteliales pigmentarias de la retina) BEST1 (células epiteliales pigmentarias de la retina), CRALBP (células epiteliales pigmentas de la retina) y similares), presencia de gránulos de melanina (marrón-negro), unión estrecha intercelular, morfología celular característica poligonal o similar a un adoquín y similares, y también se puede determinar el período de cultivo confirmándolos.
Después de completar la segunda etapa, es preferible intercambiar el medio con un medio de mantenimiento para células epiteliales pigmentarias de la retina (en lo sucesivo, algunas veces se indicará como medio de mantenimiento RPE) y seguir cultivando el mismo. Como resultado, se puede observar más claramente una población de células depositadas con colorante de melanina y una población de células planas poligonales adheridas a la lámina basal. El cultivo en un medio de mantenimiento de RPE no está limitado siempre que se pueda formar una colonia de células epiteliales pigmentarias de la retina. Por ejemplo, las células se cultivan adicionalmente durante aproximadamente 5 - 20 días mientras se intercambia la cantidad total del medio con una frecuencia de no menos de una vez cada 3 días.
Como medio de mantenimiento para las células epiteliales pigmentarias de la retina se pueden usar , por ejemplo, los descritas en IOVS, Marzo 2004, Vol. 45, N.°. 3, Masatoshi Haruta, y cols., IOVS, Noviembre 2011, Vol. 52, N.°. 12, Okamoto y Takahashi, J. Cell Science 122 (17), Fumitaka Osakada, y cols., IOVS, Febrero 2008, Vol. 49, N.°. 2, Gamm, y cols., que están constituidos por un medio basal, un suero y/o un suero de sustitución, y otros componentes.
El medio basal no está particularmente limitado siempre que sea como se describe en la sección de definición mencionada anteriormente. Como suero, se puede usar un suero derivado de un mamífero tal como bovino, humano y similares. Se puede usar un reemplazo de suero, y es particularmente preferible B27, que es un reemplazo de suero para células nerviosas, desde el punto de vista de la gestión de calidad de la célula de interés. Los ejemplos de otros componentes incluyen L-glutamina, penicilina sódica, sulfato de estreptomicina y similares.
Se puede obtener una célula epitelial pigmentaria de la retina de alta pureza mediante una operación de concentración o purificación después de completar la segunda etapa. El método de concentración o purificación no está particularmente limitado siempre que se conozca generalmente como un método de concentración/purificación de células y, por ejemplo, se pueden usar métodos como la filtración (p. ej., WO 2015/053376), centrifugación, separación por perfusión, separación por citometría de flujo, separación por trampa mediante transportador inmovilizado con anticuerpo y similares.
El método de producción de la presente invención puede contener una etapa para amplificar las células epiteliales pigmentarias de la retina después de completar la segunda etapa. Por ejemplo, las células epiteliales pigmentarias de la retina se pueden expandir mediante el método descrito en WO 2015/053375. De acuerdo con el método de expansión descrito en WO 2015/053375, las células insuficientes en la inducción de la diferenciación que están contenidas en las células cultivadas y similares se pueden eliminar por selección, y se pueden reducir relativamente los subproductos distintos de las células epiteliales pigmentarias de la retina. Por lo tanto, la etapa de expansión también puede ser una etapa de purificación de las células epiteliales pigmentarias de la retina.
Cuando las células epiteliales pigmentarias de la retina se producen mediante cultivo en suspensión en la segunda etapa, las células epiteliales pigmentarias de la retina se pueden recuperar como células individuales y se pueden utilizar después de prepararlas como una suspensión.
Cuando las células epiteliales pigmentarias de la retina se producen mediante cultivo de adhesión en la segunda etapa, las células epiteliales pigmentarias de la retina se pueden adherir entre sí para formar una estructura similar a una lámina. Por lo tanto, se puede producir una lámina de células epiteliales pigmentarias de la retina que se puede trasplantar a los pacientes. La lámina de células epiteliales pigmentarias de la retina es particularmente útil como población celular para ser usada como fármaco terapéutico de trasplante de células para el tratamiento de enfermedades de la retina. También es posible disociar las células epiteliales pigmentarias de la retina producidas por cultivo de adhesión mediante el método mencionado anteriormente, recuperar las células epiteliales pigmentarias de la retina como células individuales independientes y suspenderlas en un disolvente acuoso fisiológico (solución salina, tampón, medio libre de suero, etc.) para dar una suspensión.
3. Toxicidad, método de evaluación de la eficacia
Las células epiteliales pigmentarias de la retina producidas por el método de producción de la presente invención se pueden utilizar como una célula modelo normal o de enfermedad para la detección y evaluación de la eficacia de fármacos terapéuticos para enfermedades de la retina y fármacos terapéuticos para enfermedades de otras complicaciones como la diabetes y similares, o fármaco profiláctico de las mismas, prueba de seguridad de sustancias químicas y similares, prueba de estrés, prueba de toxicidad, prueba de efectos secundarios, prueba de infección/contaminación. Por otro lado, también se pueden utilizar para estudios de toxicidad, pruebas de toxicidad y similares de fototoxicidad exclusiva de las células retinales, excitotoxicidad retinal y similares. El método de evaluación de las mismas incluye pruebas de estimulación y toxicidad tales como evaluación de apoptosis y similares, así como pruebas para evaluar la influencia en la diferenciación normal de células progenitoras en células epiteliales pigmentarias de la retina y fotorreceptores (RT-PCR de varios marcadores genéticos, análisis de expresión de proteínas por ELISA de citoquinas, prueba de capacidad fagocítica y similares), prueba de toxicidad de fototoxicidad y similares, potencial eléctrico retiniano e impedancia transepitelial sobre la función visual, prueba de citotoxicidad causada por reacción autoinmune y similares. Como material celular para estas pruebas, se pueden usar no solo células epiteliales pigmentarias de la retina sino también células progenitoras de estas y, por ejemplo, se puede proporcionar una placa sobre la que se adhieren las células por siembra, una suspensión celular, una lámina o un compacto de las mismas. Se pueden usar como prueba de extrapolación de pruebas en humanos y animales.
4. Composición farmacéutica
Se puede producir una composición farmacéutica que contiene una cantidad eficaz de células epiteliales pigmentarias de la retina mediante el método de producción de la presente invención.
La composición farmacéutica contiene una cantidad eficaz de células epiteliales pigmentarias de la retina producidas mediante el método de producción de la presente invención y un transportador farmacéuticamente aceptable.
Como un transportador farmacéuticamente aceptable, se puede usar un disolvente acuoso fisiológico (solución salina, tampón, medio libre de suero, etc.). Cuando sea necesario, en una terapia de trasplante, un medicamento que contiene un tejido o células a trasplantar puede contener conservantes, estabilizadores, agentes reductores, agentes isotonizantes y similares usados convencionalmente.
Se puede producir una composición farmacéutica como una suspensión suspendiendo las células epiteliales pigmentarias de la retina producidas por el método de producción de la presente invención en un disolvente acuoso fisiológico apropiado. Cuando sea necesario, se puede añadir a la composición un crioconservante, crioconservarse con nitrógeno líquido y similares, descongelarse cuando está en uso, lavarse con tampón y usarse para una terapia de trasplante.
Las células epiteliales pigmentarias de la retina obtenidas por el método de producción de la presente invención también se pueden cortar en un tamaño apropiado con pinzas y similares para dar una preparación de lámina.
Las células obtenidas mediante el método de producción de la presente invención también se pueden someter a cultivo de adhesión en la segunda etapa para la inducción de diferenciación para generar células en forma de una lámina para proporcionar una preparación de lámina.
La composición farmacéutica puede ser útil como un fármaco terapéutico para una enfermedad basada en (causada por) un trastorno de células epiteliales pigmentarias de la retina.
5. Fármaco terapéutico y método de tratamiento para enfermedades de la retina.
Las células epitelio pigmentario de la retina (incluidas las células epiteliales pigmentarias de la retina que se sometieron a la operación de concentración y amplificación mencionada anteriormente y similares) producidas por el método de producción de la presente invención se pueden usar como un fármaco terapéutico de trasplante de células para ser trasplantado en forma de una suspensión o lámina para organismos vivos para el tratamiento de enfermedades de la retina. La enfermedad retiniana en esta memoria es una enfermedad oftálmica relacionada con la retina y también incluye complicaciones con otras enfermedades tales como diabetes y similares. La enfermedad retiniana incluye, por ejemplo, enfermedades basadas en trastornos de las células epiteliales pigmentarias de la retina, tales como degeneración macular relacionada con la edad, desnaturalización del pigmento de la retina, retinopatía diabética o desprendimiento de retina y similares. Es decir, las células epiteliales pigmentarias de la retina producidas mediante el método de producción de la presente invención se pueden usar para suplementar de células epiteliales pigmentarias de la retina el sitio dañado en los pacientes.
En la terapia de trasplante, el rechazo debido a la diferencia en los antígenos de histocompatibilidad a menudo plantea un problema. El problema se puede resolver usando células madre pluripotentes (p. ej., células madre pluripotentes inducidas) establecidas a partir de células somáticas de otros que sean inmunológicamente compatibles con el receptor (p. ej., compatibles en parte o en su totalidad con el tipo de HLA y el tipo de MHC), o células madre pluripotentes (p. ej., células madre pluripotentes inducidas) establecidas a partir de las células somáticas del receptor del trasplante.
Es decir, como células madre pluripotentes en el método, se producen células epiteliales pigmentarias de la retina alogénicas o tejidos que las contienen a partir de células madre pluripotentes establecidas a partir de células somáticas de otras personas cuya inmunidad es compatible con la del receptor, y se trasplantan al receptor. Alternativamente, las células madre pluripotentes (p. ej., células madre pluripotentes inducidas) establecidas a partir de las células somáticas del receptor se usan para producir una célula epitelial pigmentaria de la retina, que es inmunológicamente propia para el receptor, o un tejido que las contiene y se trasplanta al receptor.
Ejemplos
La presente invención se explica en detalle a continuación con referencia a los Ejemplos, que no deben interpretarse como limitados a los mismos.
En los siguientes Ejemplos y Ejemplos Comparativos, se usaron células iPS (201B7, Universidad de Kyoto) derivadas de fibroblastos dérmicos humanos y células iPS (1231A3, Ff-I01, QHJI01) derivadas de células mononucleares derivadas de sangre periférica humana establecidas por la Universidad de Kyoto a partir de ePMBC® de Cellular Technology Limited.
Ejemplo 1: Producción altamente eficaz de células epiteliales pigmentarias de la retina, que incluye la etapa de tratamiento con inhibidor de MEK y el uso de células iPS humanas
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea 201B7 y línea 1231A3) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep.
2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue "medio AK03 StemFit® (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03) o medio Essential 8 (Life Technologies).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo se trataron para mantener el estado indiferenciado con TrypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de TrypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 1,2 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en medio AK03 o medio Essential 8 que contiene un inhibidor de ROCK [Y-27632 10 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra, se añadió PD0325901 (SIGMA) como inhibidor de MEK al medio AK03 a una concentración final de 1 pM o medio Essential 8 a una concentración final de 0,03 pM (comienzo de la primera etapa) y las células se expusieron al mismo durante 6 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo cuando se usó medio AK03 y a 5,0 x 105 células cuando se usó el medio Essential 8 y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). El primer día de cultivo, se añadió medio AK03 o medio Essential 8 con Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal, y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales de Wnt; a partir de 2 a 5 días de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries , Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado a KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 6 a 9 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 10 a 13 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 14 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml estreptomicina]. La cantidad total del medio se intercambió todos los días.
La placa de cultivo se observó desde los 38 hasta los 42 días de cultivo. Como resultado, cuando se usaron ambos medios, el medio AK03 y el medio Essential 8, se pudo confirmar la aparición de una población de células marrónnegras en un área amplia en ambas líneas, la línea 201B7 y la línea 1231A3 (Fig. 1). Por observación microscópica, las células mostraron características típicas de las células RPE, como una morfología de color marrón-negro, poligonal, similar a un adoquín (Fig. 2).
Ejemplo Comparativo 1: Producción de células epiteliales del pigmento retinal sin incluir la etapa de tratamiento con inhibidor de MEK y usando células iPS humanas
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea 201B7 y línea 1231A3) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep.
2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03 "StemFit® (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03) o medio Essential 8 (Life Technologies).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) sin incluir una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK se realizó de la siguiente manera. Las células iPS se trataron con TrypLE select 0,5x para mantener el estado indiferenciado, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo cuando se usó medio AK03 y a 5,0 x 105 células cuando se usó medio Essential 8, y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. El primer día de cultivo, se añadió medio AK03 o medio Essential 8 con Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 10 pM) como inhibidor de ROCK, SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal, y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; a partir de 2 a 5 días de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries , Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 6 a 9 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 10 a 13 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 14 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se intercambió todos los días.
La placa de cultivo se observó desde los 38 hasta los 42 días de cultivo. Como resultado, solo se pudo confirmar que unas pocas células mostraban las características típicas de las células RPE, como una morfología similar a un adoquín, poligonal, marrón-negra (Fig. 3).
Ejemplo 2: Producción altamente eficaz de células epiteliales pigmentarias de la retina que incluye la etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF y el uso de células iPS humanas
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea 201B7 y línea 1231A3) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep.
2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03 “StemFit®” (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03) o medio Essential 8 (Life Technologies).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo se trataron con TrypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de TrypLE select (Life Technologies)) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM para mantener el estado indiferenciado, se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocilios recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 1,2 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en medio AK03 o medio Essential 8 que contiene un inhibidor de ROCK [Y-27632 10 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra, se añadió PD173074 (SIGMA) como inhibidor del receptor de FGF al medio AK03 o al medio Essential 8 a una concentración final de 100 nM (inicio de la primera etapa), y las células se expusieron durante 6 días (finalización de la primera etapa). Para estudiar el efecto del inhibidor del receptor de FGF en un medio libre de un factor para mantener el estado indiferenciado (bFGF), se usó Medio StemSure hPSC A (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (en adelante StemSure Medio hPSC A w/o bFGF) sin bFGF añadido. Es decir, se añadió PD173074 (SIGMA) como un inhibidor del receptor de FGF a Medio StemSure hPSC A sin bFGF a una concentración final de 100 nM (comienzo de la primera etapa), y las células se expusieron durante 6 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo cuando se usó medio AK03 o medio StemSure hPSC A sin bFGF y a 5,0 x 105 células cuando se usó el medio Essential 8, y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). El primer día de cultivo, se usó medio AK03, medio Essential 8 o medio StemSure hPSC A sin bFGF adicionado con Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 10 pM) como inhibidor de ROCK, SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal, y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; a partir de 2 a 5 días de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 pM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries , Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 6 a 9 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 10 a 13 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 14 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se intercambió todos los días.
La placa de cultivo se observó desde los 38 hasta los 42 días de cultivo. Como resultado, cuando se usó el medio AK03, el medio Essential 8 o el medio StemSure hPSC A sin bFGF, se pudo confirmar la aparición de una población de células marrón-negras en un área amplia en la línea 201B7 y/o la línea 1231A3 (Fig. 4). Por observación microscópica, las células mostraron características típicas de las células RPE, como una morfología similar a un adoquín, poligonal, de color marrón-negro (Fig. 5).
Ejemplo Comparativo 2: Producción de células epiteliales pigmentarias de la retina sin incluir la etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF y que usa células iPS humanas
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea 201B7 y línea 1231A3) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep.
2014 En 8; 4: 3594". Se usó medio AK03 “StemFit®” (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03) o medio Essential 8 (Life Technologies).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) sin incluir una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF se realizó como sigue. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado o las células iPS cultivadas en medio StemSure hPSC A w/o bFGF (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) se trataron durante 6 días con TrypLE select 0,5x, se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en una sola pipeteando, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo cuando se usó medio AK03 o medio StemSure hPSC A sin bFGF y a 5,0 x 105 células cuando se usó el medio Essential 8, y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. El primer día de cultivo, se usó medio AK03, medio Essential 8 o medio StemSure hPSC A sin bFGF adicionado con Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 10 pM) como inhibidor de ROCK, SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal, y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; a partir de 2 a 5 días de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries , Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 6 a 9 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 10 a 13 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 14 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se intercambió todos los días.
La placa de cultivo se observó desde los 38 hasta los 42 días de cultivo. Como resultado, solo se pudo confirmar que unas pocas células mostraban las características típicas de las células RPE, como una morfología similar a un adoquín, poligonal, marrón-negra (Fig. 6).
Ejemplo 3: Producción altamente eficaz de células epiteliales pigmentarias de la retina que incluye la etapa de tratamiento combinado con inhibidor de MEK y/o inhibidor del receptor de FGF y varios inhibidores, inhibidor de la vía de transducción de señales o agonista de la vía de transducción de señales y que usa células iPS humanas
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea 201B7 y línea 1231A3) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep.
2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03 "StemFit®" (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento combinado con inhibidor de MEK y/o inhibidor del receptor de FGF y varios inhibidores, inhibidor de la vía de transducción de señales o agonista de la vía de transducción de señales se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con T rypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 1,2 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio AK03 que contenía un inhibidor de ROCK [Y-27632 10 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra celular, se añadieron al medio (comienzo de la primera etapa) PD0325901 (SIGMA) (concentración final 1 pM) como un inhibidor de MEK, PD173074 (SIGMA) (concentración final 100 nM) como un inhibidor del receptor de FGF, LDN193189 (STEMGEn T) (concentración final 100 nM) como un inhibidor del receptor de BMP, SAG (Enzo Life Sciences) (concentración final 30 nM) como un agonista de la vía de transducción de señales Shh, y Go6983 (SIGMA) (concentración final 2 pM) como un inhibidor de PKC en la combinación que se muestra en la Fig. 7, y las células se expusieron al mismo durante 6 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). El primer día de cultivo, al medio AK03 se le añadió Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 10 pM) como inhibidor de ROCK, SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal, y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; a partir de 2 a 5 días de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries , Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 6 a 9 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 10 a 13 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 14 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se intercambió todos los días. Simultáneamente, el experimento también se realizó en las condiciones del Ejemplo 1 que contiene una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK, el Ejemplo comparativo 1 que no contiene una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK, el Ejemplo 2 que contiene una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF y el Ejemplo comparativo 2 que no contiene una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF.
La placa de cultivo se observó desde los 38 hasta los 47 días de cultivo. Como resultado, se encontró que solo unas pocas células mostraban características típicas de las células RPE tales como una morfología similar a un adoquín, poligonal, de color marrón-negro en las condiciones del Ejemplo Comparativo 1 y del Ejemplo Comparativo 2 (Fig. 7, sin tratar). Por el contrario, en las condiciones de producción del Ejemplo 1 que contiene una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK, las condiciones de producción del Ejemplo 2 que contienen una etapa de tratamiento con un inhibidor del receptor de FGF y las condiciones de producción que contienen una etapa de tratamiento combinado de un inhibidor de MEK y/o un inhibidor del receptor de FGF, y varios inhibidores, un inhibidor de la vía de transducción de señales o un agonista de la vía de transducción de señales, se pudo confirmar la aparición de células RPE que muestran características típicas de las células RPE, como una morfología marrón-negra, poligonal, similar a un adoquín (Fig. 7). La proporción de las células RPE en el pocillo completo se juzgó mediante observación visual y se realizó la clasificación en 6 grados de 0 a 5 de acuerdo con la proporción (Fig. 8A). En todas las condiciones de tratamiento de combinación de compuestos que se muestran en las Figs. 8B y 8C, se pudo confirmar la aparición de células RPE en una proporción más alta que en condiciones sin tratar (Figs. 8B y 8C).
Ejemplo 4: Producción altamente eficaz de células epiteliales pigmentarias de la retina, que incluye la etapa de tratamiento con inhibidor de MEK o inhibidor del receptor de FGF y que usa células iPS humanas Ff-I01, QHJI01
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea Ff-I01 y línea QHJI01) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep.
2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03N "StemFit®" (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03N).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor del receptor de FGF se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con T rypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de T rypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo , se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 |ug/cm2) a 2,0 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio AK03N que contiene un inhibidor de ROCK [Y-27632 10 |uM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones a 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra, se añadió al medio AK03N PD0325901 (SlGMA) (concentración final 1 |uM) como inhibidor de MEK o PD173074 (SlGMA) (concentración final 100 nM) como inhibidor del receptor de FGF (comienzo de la primera etapa) y las células se expusieron al mismo durante 6 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 |ug/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). Del día 1 al día 4 de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SlGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SlGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-glutamina 2 |uM (SlGMA), 100 U/ml de penicilina-100 |ug/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 |uM) , SB-431542 (Wako Pure Chemical lndustries, Ltd.) (concentración final 5 |uM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal, y CKl-7 (SlGMA) (concentración final 3 |uM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; a partir de 5 a 8 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 |uM), SB-431542 (concentración final 5 |uM), CKl-7 (concentración final 3 |uM); a partir de 9 a 12 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 |uM), SB-431542 (concentración final 5 |uM), CKl-7 (concentración final 3 |uM); a partir de 13 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SlGMA), F12 al 29% (SlGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 |ug/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se intercambió todos los días. Simultáneamente, el experimento también se realizó en las condiciones del Ejemplo comparativo 1 que no contenía una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK (siempre que el medio AK03 fuera cambiado a medio AK03N) y el Ejemplo comparativo 2 que no contenía una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF (siempre que el medio AK03 fuera cambiado a medio AK03N).
La placa de cultivo se observó el día 43 de cultivo. Como resultado, casi no se encontró ninguna célula que mostrara las características típicas de las células RPE tales como una morfología similar a un adoquín, poligonal, de color marrónnegro en las condiciones del Ejemplo Comparativo 1 y del Ejemplo Comparativo 2 (Fig.9, sin tratar). Por otro lado, cuando se exponen al inhibidor de m Ek y al inhibidor del receptor de FGF, se pudo confirmar la aparición de una población de células marrón-negras en un área amplia en ambas líneas, la línea Ff-l01 y la línea QHJl01 (Fig. 9, MEKi, FGFRi).
Ejemplo 5: Consideración del número de días de exposición de cada inhibidor en la etapa de tratamiento con inhibidor de MEK o inhibidor del receptor de FGF
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea QHJl01) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep. 2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03N "StemFit®" (Ajinomoto Co., lnc.) (en adelante medio AK03N).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor del receptor de FGF se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con T rypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de T rypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 |ug/cm2) a 2,0 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio AK03N que contiene un inhibidor de ROCK [Y-27632 10 |uM (Wako Pure Chemical lndustries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra, 2 días después, 3 días después, 4 días después, 5 días después o 6 días después, se añadió al medio AK03N (comienzo de la primera etapa) PD0325901 (SlGMA) (concentración final 1 |uM) como inhibidor de MEK o PD173074 (SlGMA) (concentración final 100 nM) como inhibidor del receptor de FGF, y las células se expusieron durante 6 días, 5 días, 4 días, 3 días, 2 días o 1 día (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 |ug/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). Del día 1 al día 4 de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SlGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 |uM (SlGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical lndustries, Ltd.), L-glutamina 2 mM (SlGMA), 100 U/ml de penicilina-100 |ug/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 |uM) , SB-431542 (Wako Pure Chemical lndustries, Ltd.) (concentración final 5 |uM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal, y CKl-7 (SlGMA) (concentración final 3 |uM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; a partir de 5 a 8 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 |uM), SB-431542 (concentración final 5 |uM), CKl-7 (concentración final 3 |uM); a partir de 9 a 12 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 13 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se intercambió todos los días.
La placa de cultivo se observó el día 48 de cultivo. Como resultado, en ambos tratamientos con el inhibidor de MEK y el inhibidor del receptor de FGF, las poblaciones de células marrón-negras aumentaron con la exposición durante no menos de 2 días, y la proporción de células que desarrollaron color en el pocillo completo aumentó a medida que aumentaba el número de días de exposición aumentó hasta los 6 días de exposición (Fig. 10). En particular, se observó un aumento notable en la población de células marrón-negras en 4 días - 6 días de exposición.
Ejemplo 6: Consideración del período de exposición del inhibidor de MEK en la etapa de tratamiento con el inhibidor de MEK
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea 1231A3) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep. 2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03 "StemFit®" (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con TrypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de TrypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo , se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 1,2 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio AK03 que contenía un inhibidor de ROCK [Y-27632 10 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra, 4 o 6 días después, se añadió PD0325901 (SIGMA) (concentración final 1 pM) como un inhibidor de MEK al medio AK03 (comienzo de la primera etapa) y las células se expusieron durante 6 días, 3 días o 1 día (finalización de la primera etapa). Además, las células expuestas al inhibidor de MEK durante 6 días se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 0,8 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron adicionalmente durante 7 días en medio AK03 que contenía Y-27632 (concentración final 10 pM) y PD0325901 (concentración final 1 pM) en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 , en donde las células se expusieron al inhibidor de MEK durante 13 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con T rypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 1,2 x 106 células por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). El día 1 de cultivo, se añadió al medio AK03 Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales nodales y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales de Wnt; a partir de 2 a 5 días de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 pM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries , Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] añadido con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 6 a 9 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 10 a 13 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 14 a 30 días de cultivo se usó un medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se intercambió todos los días. Simultáneamente, también se produjeron células RPE bajo las condiciones del Ejemplo Comparativo 1 que no contenían una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK.
La placa de cultivo se observó el día 37 de cultivo. Como resultado, casi no se encontró ninguna célula que mostrara las características típicas de las células RPE, como una morfología similar a un adoquín, poligonal, marrón-negra, en las condiciones del Ejemplo comparativo 1 y la exposición al inhibidor de MEK durante un día (Fig. 11, sin tratar, MEKi 1 día). Por otro lado, se podría confirmar la aparición de una población de células marrón-negras en un área amplia a través de la exposición al inhibidor de MEK durante 3 días y 6 días (Fig. 11, MEKi 3 días, 6 días), y también se confirmó de manera similar la suficiente aparición de la población de células coloreadas por exposición durante 13 días (Fig. 11, MEKi 13 días).
Ejemplo 7: Expresión génica al finalizar la etapa de tratamiento con inhibidor de MEK o inhibidor del receptor de FGF
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea Ff-I01 y línea QHJI01) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep.
2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03N "StemFit®" (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03N).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor del receptor de FGF se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con T rypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de T rypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio AK03N que contenía un inhibidor de ROCK [Y-27632 10 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra o 4 días después, se añadió al medio AK03N PD0325901 (SIGMA) (concentración final 1 pM) como un inhibidor de MEK o PD173074 (SIGMA) (concentración final 100 nM) como un inhibidor del receptor de FGF (inicio de la primera etapa), y las células se expusieron durante 6 días o 3 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con T rypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, las células distintas de las que se transfirieron a la segunda etapa se usaron para la extracción de ARN como muestra para microarray, las células a transferir a la segunda etapa se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubiertos con iMatrix-511 (0.5 pg/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). El día 1 de cultivo, se usó medio AK03 adicionado con Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt, o un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 pM (SIGMA), 0,1 mM 2-mercaptoetanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 u/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y- 27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM). Cuando se usó el medio AK03 (que contenía Y-27632, SB-431542 y c Ki-7) el día 1 de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) a partir de 2 a 5 días de cultivo; a partir de 6 a 9 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 10 a 13 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 14 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. Cuando se usó un medio basal (que contenía KSR al 20%, Y-27632, SB-431542 y CKI-7) el día 1 de cultivo, a partir de 2 a 4 días de cultivo, se usó un medio basal adicionado con KSR al 20% (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 5 a 8 días de cultivo se usó un medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 9 a 12 días de cultivo se usó un medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de los 13 a los 30 días de cultivo se usó un medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo se usó medio de mantenimiento RPE. La cantidad total del medio se intercambió todos los días. Simultáneamente, se realizó la recuperación de la muestra para microarrays y la producción de células RPE también en las condiciones del Ejemplo comparativo 1 que no contenía una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK (el medio AK03 se cambió por medio AK03N).
Se usó el kit RNeasy Mini (QIAGEN) para la extracción de ARN, y se realizó el análisis de microarrays con GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix). Para el análisis de microarray, se utilizó el análisis confiado por KURABO INDUSTRIES LTD.
En base a las imágenes observadas de las placas de cultivo en el día 43 de cultivo y de acuerdo con la Fig. 8A, los resultados de la proporción determinada de células RPE en el pocillo completo por observación visual (puntuado en 6 grados de 0 a 5 según la proporción de RPE) y los valores de expresión (Señal) y marca (Detección) de los marcadores en la etapa temprana de la formación del ojo PAX6, LHX2, SIX3 al completar la primera etapa, que son los resultados del análisis de microarrays, se resumen en la Tabla (Fig. 12 ). La marca expresa la confiabilidad del valor de la expresión, P significa alta confiabilidad y A significa baja confiabilidad. A partir de estos resultados, se encontró una correlación entre la proporción de células RPE en el pocillo completo y los valores de expresión de PAX6, LHX2 y SIX3 al completar la primera etapa. Por lo tanto, se encontró que el tiempo de transición a la segunda etapa se puede determinar en función de la expresión de estos genes.
Ejemplo 8: Consideración de varias concentraciones de inhibidor en la etapa de tratamiento con inhibidor de MEK o con inhibidor del receptor de FGF
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea QHJI01) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep. 2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03N "StemFit®" (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03N).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor del receptor de FGF se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con T rypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de T rypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio AK03N que contenía un inhibidor de ROCK [Y-27632 10 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra, se añadieron PD0325901 (SIGMA) a una concentración final de 0,25 pM, 0,5 pM, 1 pM, 2 pM o 4 pM como inhibidor de MEK y PD173074 (SIGMA) a una concentración final de 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM o 400 nM como inhibidor del receptor de FGF al medio AK03N (comienzo de la primera etapa) y las células se expusieron al mismo durante 6 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). Del día 1 al día 4 de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; a partir de 5 a 8 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 9 a 12 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 13 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se intercambió todos los días. Simultáneamente, la producción de células RPE también se realizó en las condiciones del Ejemplo comparativo 1 que no contenía una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK (el medio AK03 se cambió a medio AK03N) y las condiciones del Ejemplo comparativo 2 que no contenía una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF (el medio AK03 se cambió a medio AK03N).
La placa de cultivo se observó el día 36 y el día 49 de cultivo. Como resultado, casi no se encontró ninguna célula que mostrara las características típicas de las células RPE tales como una morfología similar a un adoquín, poligonal, de color marrón-negro en las condiciones del Ejemplo Comparativo 1 y del Ejemplo Comparativo 2 (Fig. 13, sin tratar). Por otro lado, se pudo confirmar la aparición de una población de células marrón-negras en un área amplia en todas las concentraciones de inhibidor de MEK (0,25 - 4 pM) y las concentraciones de inhibidor del receptor de FGF (25 -400 nM) estudiadas (Fig. 13, MEKi: 0,25 - 4 pM, FGFRi: 25 - 400 nM).
Ejemplo 9: Consideración del número de células sembradas en la transición de la primera etapa a la segunda etapa
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea QHJI01) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep. 2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03N "StemFit®" (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03N).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o con un inhibidor del receptor de FGF se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con TrypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de TrypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en medio AK03N que contenía un inhibidor de Ro Ck [Y-27632 10 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra, se añadió al medio AK03N (inicio de la primera etapa) PD0325901 (SIGMA) (concentración final 1 pM) como inhibidor de MEK o PD173074 (SIGMA) (concentración final 100 nM) como inhibidor del receptor de Fg F (comienzo de la primera etapa) y las células se expusieron durante 6 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo y se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 0,2, 0,4, 0,6, 1,0, 2,0 o 4,0 x 105 células (0,2, 0,4, 0,6, 1,0, 2,0 o 4,0 x 104 células/cm2) por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). Del día 1 al día 4 de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; a partir de 5 a 8 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 9 a 12 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 13 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F1229% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se cambió todos los días.
La placa de cultivo se observó el día 49 de cultivo. Como resultado, se pudo confirmar la aparición de una población de células marrón-negras en un área amplia en todos los números de células sembradas (0,2, 0,4, 0,6, 1,0, 2,0 o 4,0 x 104 células/cm2) estudiados (Fig. 14).
Ejemplo 10: Consideración de los inhibidores de MEK PD184352, U0126,TAK-7331, AZD-8330 en la primera etapa
El cultivo de mantenimiento no diferenciado de células iPS humanas (línea QHJI01 y línea 1231A3) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep. 2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03N "StemFit®" (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03N).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con TrypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de TrypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo , se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio AK03N que contenía un inhibidor de ROCK [Y-2763210 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra, se añadieron PD0325901 (SIGMA) (concentración final 1 pM), PD184352 (SIGMA) (concentración final 1,5 pM, 3 pM, 6 pM), U0126 (SIGMA) (concentración final 5 pM, 10 pM), TAK -7331 (Selleck) (concentración final 0,3 pM) o AZD-8330 (Selleck) (concentración final 0,3 pM) como inhibidor de MEK al medio AK03N (comienzo de la primera etapa) y las células se expusieron durante 6 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). Del día 1 al día 4 de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; a partir de 5 a 8 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 9 a 12 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 13 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se cambió todos los días. Simultáneamente, también se produjeron células RPE en las condiciones del Ejemplo comparativo 1 que no contenían una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK (el medio AK03 se cambió por medio AK03N).
La placa de cultivo se observó el día 49 y el día 50 de cultivo. Como resultado, casi no se encontró ninguna célula que mostrara las características típicas de las células RPE tales como una morfología similar a un adoquín, poligonal, de color marrón-negro en las condiciones del Ejemplo Comparativo 1 (Fig. 15, sin tratar). Por otro lado, se pudo confirmar la aparición de una población de células marrón-negras en un área amplia en todos los inhibidores de MEK (PD0325901, PD184352, U0126, TAK-7331, AZD-8330) estudiados (Fig. 15, PD0325901, PD184352, U0126, TAK-733, AZD-8330).
Ejemplo 11: Consideración del inhibidor del receptor de FGF SU5402 en la primera etapa
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de células iPS humanas (línea QHJI01 y línea 1231A3) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep.
2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03N "StemFit®" (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03N).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con TrypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de TrypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio AK03N que contenía un inhibidor de ROCK [Y-27632 10 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra, se añadieron al medio AK03N PD173074 (SIg Ma ) (concentración final 100 nM) o SU5402 (SIGMA) (concentración final 5 pM, 10 pM, 20 pM) como inhibidor del receptor de FGF (comienzo de la primera etapa) y las células se expusieron durante 6 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). Del día 1 al día 4 de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; a partir de 5 a 8 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 9 a 12 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM), CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 13 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se cambió todos los días. Simultáneamente, también se produjeron células RPE en las condiciones del Ejemplo Comparativo 2 que no contenían una etapa de tratamiento con inhibidor del receptor de FGF (el medio AK03 se cambió por medio AK03N).
La placa de cultivo se observó el día 49 de cultivo. Como resultado, casi no se encontró ninguna célula que mostrara las características típicas de las células RPE tales como una morfología similar a un adoquín, poligonal, de color marrón-negro en las condiciones del Ejemplo Comparativo 2 (Fig. 16, sin tratar). Por otro lado, se pudo confirmar la aparición de una población de células pardas-negras en un área amplia en todos los inhibidores del receptor de FGF (PD173074, SU5402) estudiados (Fig. 16, PD173074, SU5402).
Ejemplo 12: Consideración del efecto de inducción de diferenciación de la exposición al inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y al inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt solos en la segunda etapa
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea QHJI01) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep. 2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03N "StemFit®" (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03N).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con TrypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de TrypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio AK03N que contenía un inhibidor de ROCK [Y-2763210 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra, se añadieron PD0325901 (SIGMA) (concentración final 1 pM) como inhibidor de MEK al medio AK03N (inicio de la primera etapa) y las células se expusieron durante 6 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 12 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 0,8 x 105 células por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). En la segunda etapa, se usaron los siguientes 3 tipos de medios. Del día 1 al día 12 de cultivo, se usaron un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 10 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt (Fig. 17, NODALi WNTi), el medio basal adicionado con KSR al 10 %, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM) (Fig. 17, NODALi), o el medio basal adicionado con KSR al 10 %, Y-27632 (concentración final 10 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM) (Fig. 17, WNTi). De los 13 a los 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se cambió todos los días.
La placa de cultivo se observó el día 43 de cultivo. Como resultado, se podría confirmar la aparición de células que muestran el mismo nivel de características típicas de las células RPE, como una morfología similar a un adoquín, poligonal, marrón-negro, en ambas condiciones de tratamiento con el inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y con el inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt (NODALi+WNTi) y se confirmaron las condiciones del tratamiento con agente único del inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal (NODALi) (Fig. 17, NODALi+WNTi, NODALi). Mediante un tratamiento con un solo agente del inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt (WNTi), el área marrón-negra disminuyó en el pocillo completo; sin embargo, se pudo confirmar la aparición de un número suficiente de células que mostraban las características típicas de las células RPE (Fig. 17, WNTi). A partir de los resultados anteriores, se podría confirmar que es suficiente la presencia del inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal o del inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt en la segunda etapa.
Ejemplo 13: Relación entre la proporción de áreas de células marrón-negras en el pocillo completo y la expresión del gen marcador de células epiteliales pigmentarias de la retina
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea 201B7) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep. 2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03 "StemFit®" (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK y un inhibidor del receptor de BMP se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con TrypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de TrypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 gg/cm2) a 1,2 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en un medio AK03 que contenía un inhibidor de ROCK [Y-27632 10 gM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Cuando el inhibidor de m Ek se iba a exponer durante 6 días y el inhibidor del receptor de BMP se iba a exponer durante 1 día, se añadió PD0325901 (SIGMA) (concentración final de 1 gM) como un inhibidor de MEK al medio AK03 al día siguiente de la siembra (comienzo de la primera etapa), y se añadió al medio AK036 días después de la siembra LDN193189 (STEMGENT) (concentración final 100 nM) como un inhibidor del receptor de BMP, por lo que las células se expusieron al inhibidor de MEK y al inhibidor del receptor de BMP durante 6 días y 1 día, respectivamente (finalización de la primera etapa). Cuando tanto el inhibidor de MEK como el inhibidor del receptor de BMP iban a ser expuestos durante 6 días, se añadieron PD0325901 (concentración final de 1 gM) y LDN193189 (concentración final de 100 nM) al medio AK03 al día siguiente de la siembra (comienzo de la primera etapa) y las células se expusieron durante 6 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 gg/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). El día 1 de cultivo, se usó medio AK03 adicionado con Y-27632 (concentración final 10 gM), SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 gM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 gM); a partir de 2 a 5 días de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries , Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 gg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 gM), SB-431542 (concentración final 5 gM) y CKI-7 (concentración final 3 gM); a partir de 6 a 9 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 gM), SB-431542 (concentración final 5 gM), CKI-7 (concentración final 3 gM); a partir de 10 a 13 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 gM), SB-431542 (concentración final 5 gM), CKI-7 (concentración final 3 gM); a partir de 14 a 30 días de cultivo se usó un medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 gg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se cambió todos los días. Simultáneamente, también se produjeron células RPE en las condiciones del Ejemplo Comparativo 1 que no contenían una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK.
Después de la observación el día 39 de cultivo, se recogieron las células, se extrajo el ARN y se realizó RT-PCR en tiempo real. Se usó el kit RNeasy Mini (QIAGEN) para la extracción de ARN y el kit QuantiTect Probe RT-PCR (QIAGEN) para la RT-PCR en tiempo real. Los cebadores y sondas para BEST1 (Hs00188249_m1), MITF (Hs01117294_m1), RAX (Hs00429459_m1), GAPDH (Hs02758991_g1) se adquirieron de Applied Biosystems. Los niveles de expresión de BEST1, MITF y RAX de cada muestra se normalizaron con el nivel de expresión de GAPDH y se representaron como un valor relativo al nivel de expresión de las células iPS (indiferenciadas) cultivadas en condiciones para mantener el estado indiferenciado como 1.
Basándose en las imágenes observadas de las placas de cultivo el día 39 de cultivo y de acuerdo con la Fig. 8A, se determinó mediante observación visual la proporción de células RPE en el pocillo completo. Como resultado, la condición sin tratar fue "1", la exposición de 6 días al inhibidor de MEK 1 día de inhibidor de receptor de BMP fue "3", y la exposición de 6 días a inhibidor de MEK 6 días de inhibidor de receptor de BMP fue "5" (Fig. 18, lado superior, fotografía celular). Se compararon los niveles de expresión de BEST1, MITF como marcadores de células epiteliales pigmentarias de la retina y RAX como marcador de la etapa temprana de formación del ojo mediante un método de RT-PCR en tiempo real entre estas muestras y la muestra de células iPS (indiferenciadas) en cultivo continuo para mantener el estado indiferenciado. Como resultado, se encontró una correlación entre el área de las células marrón-negras y los niveles de expresión de los genes marcadores descritos anteriormente (Fig. 18, lado inferior, gráfico). A partir de los resultados anteriores, se sugirió que las células marrón-negras expresaban el gen marcador de células epiteliales pigmentarias de la retina y el gen marcador de la etapa temprana de formación del ojo. Además, también se verificó la producción de células RPE mediante este método de producción comprobando estos niveles de expresión génica.
Ejemplo 14: Confirmación de la expresión del gen marcador de la célula RPE producida por el método de producción que incluye la etapa de tratamiento con inhibidor de MEK o con inhibidor del receptor de FGF
El cultivo para mantener el estado indiferenciado de las células iPS humanas (línea 1231A3) en condiciones libres de alimentadoras se realizó de acuerdo con el método descrito en "Nakagawa, M. y cols., Sci. Rep. 2014 En 8; 4: 3594". El medio usado fue medio AK03N "StemFit®" (Ajinomoto Co., Inc.) (en adelante medio AK03N).
La producción de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) que incluye una etapa de tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor del receptor de FGF se realizó de la siguiente manera. Las células iPS en cultivo para mantener el estado indiferenciado se trataron con T rypLE select 0,5x (mezcla de cantidades iguales de T rypLE select (Life Technologies) y EDTA/PBS(-) 0,5 mM), se disociaron usando un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (Nippi) (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 104 células por 1 pocillo y se cultivaron en medio AK03N que contenía un inhibidor de ROCK [Y-27632 10 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2. Al día siguiente de la siembra, se añadió al medio AK03N (inicio de la primera etapa) PD0325901 (SIGMA) (concentración final 1 pM) como inhibidor de MEK o PD173074 (SIGMA) (concentración final 100 nM) como inhibidor del receptor de FGF (comienzo de la primera etapa) y las células se expusieron durante 6 días (finalización de la primera etapa). A partir de entonces, las células se trataron con TrypLE select 0,5x, se disociaron con un raspador de células, se dispersaron en células individuales mediante pipeteo, se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con iMatrix-511 (0,5 pg/cm2) a 2,0 x 105 células por 1 pocillo y se cultivaron en condiciones de 37 °C, 5 % de CO2 (inicio de la segunda etapa). Del día 1 al día 4 de cultivo, se usó un medio basal [medio GMEM (SIGMA), solución de aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-glutamina 2 mM (SIGMA), 100 U/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies)] adicionado con KSR al 20 % (Life Technologies), Y-27632 (concentración final 10 pM) , SB-431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (concentración final 5 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y CKI-7 (SIGMA) (concentración final 3 pM) como inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; a partir de 5 a 8 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 15%, Y-27632 (concentración final 10 pM), SB-431542 (concentración final 5 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 9 a 12 días de cultivo, el medio basal adicionado con KSR al 10%, Y-27632 (concentración final 10 pM), s B-431542 (concentración final 5 pM) y CKI-7 (concentración final 3 pM); a partir de 13 a 30 días de cultivo se usó el medio basal adicionado con KSR al 10% solo; y a partir de los 31 días de cultivo, se usó medio de mantenimiento RPE [DMEM al 67% bajo en glucosa (SIGMA), F12 al 29% (SIGMA), suplemento B-27 al 1,9% (Life Technologies), L-glutamina 1,9 mM, 96 U/ml de penicilina-96 pg/ml de estreptomicina]. La cantidad total del medio se cambió todos los días. Simultáneamente, el experimento también se realizó en las condiciones del Ejemplo Comparativo 1 que no contenían una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK (el medio AK03 se cambió por medio AK03N).
Después de la observación el día 43 de cultivo, se recogieron las células, se extrajo el ARN y se realizó RT-PCR. Se usó el kit RNeasy Micro (QIAGEN) para la extracción de ARN, y se usaron Oligo (dT)12-18 Primer (Invitrogen) y SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) para la reacción de transcripción inversa, y se usó Blend Taq-Plus-(TOYOBO) para la PCR. Las secuencias de los cebadores de RPE65, BEST1, CRLBP, GAPDH se describen a continuación. RPE65-F: TCCCCAATACAACTGCCACT (SEC ID N.2: 1), RPE65-R: CCTTGGCATTCAGAATCAGG (SEC ID N.2: 2), BEST1-F: TAGAACCATCAGCGCCGTC (SEC ID N.2: 3), BEST1-R: TGAGTGTAGTGTGTATGTTGG (SEC ID N.2: 4), CRALBP-F: GAGGGTGCAAGAGAAGGACA (SEQ ID N.2: 5), CRALBP-R: TGCAGAAGCCATTGATTTGA (SEQ ID N.2: 6), GAPDH-F: ACCACAGTCCATGCCATCAC (SEQ ID N.2: 7), GAPDH-R: TCCACCACCCTGTTGCTGTA (SEQ ID N.° : 8). El número de ciclos de la reacción de PCR fue de 30 ciclos para RPE65, BEST1, GAPDH y 35 ciclos para CRALBP. Los productos de PCR se detectaron como una sola banda mediante electroforesis en gel de agarosa cerca de 369 pb para RPE65, cerca de 261 pb para BEST 1, cerca de 341 pb para CRALBP y cerca de 452 pb para GAPDH. Como control positivo, se usaron RPE humanas primarias (hRPE) y, como control negativo, se usaron células iPS (iPSC indiferenciadas) cultivadas en condiciones para mantener el estado indiferenciado.
La placa de cultivo se observó el día 43 de cultivo. Como resultado, solo se pudo confirmar que unas pocas células mostraban las características típicas de las células EPR, como una morfología similar a un adoquín, poligonal, marrónnegra, en las condiciones del Ejemplo Comparativo 1 (Fig. 19, lado derecho, fotografía de células, sin tratar). Por otro lado, cuando se expusieron al inhibidor de MEK y al inhibidor del receptor de FGF, se pudo confirmar la aparición de una población de células marrón-negras en un área amplia (Fig. 19, lado derecho, fotografía celular, MEKi, FGFRi). Como resultado de la RT-PCR, las bandas de los marcadores de células epiteliales pigmentarias de la retina RPE65, BEST1, CRALBP eran muy finas en las condiciones del Ejemplo Comparativo 1 (Fig. 19, lado izquierdo, patrón electroforético, sin tratar). Por otro lado, se pudieron confirmar bandas claras en las muestras expuestas al inhibidor de MEK y al inhibidor del receptor de FGF (Fig. 19, lado izquierdo, patrón electroforético, MEKi, FGFRi). A partir de los resultados anteriores, también se verificó la producción altamente eficaz de células RPE mediante el método de producción que incluye una etapa de tratamiento con inhibidor de MEK e inhibidor del receptor de FGF al verificar estos niveles de expresión génica.
Aplicabilidad industrial
El método de producción de la presente invención permite la producción altamente eficaz de células epiteliales pigmentarias de la retina a partir de células madre pluripotentes.
Listado de secuencias
<110> Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. HEALIOS K.K.
<120> Método para producir células epiteliales pigmentarias de la retina <130> 092513
<150> JP 2015-176896
<151 > 08-09-2015
<160>8
<170> Patente En versión 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador directo para RPE65
<400> 1
tccccaatac aactgccact 20
<210 > 2
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador inverso para RPE65
<400> 2
ccttggcatt cagaatcagg 20
<210 > 3
<211 > 19
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador directo para BEST1
<400> 3
tagaaccatc agcgccgtc 19
<210 > 4
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador inverso para BEST1
<400> 4
tgagtgtagt gtgtatgttg g 21
<210 > 5
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador directo para CRALBP
<400>5
gagggtgcaa gagaaggaca 20
<210 > 6
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador inverso para CRALBP
<400> 6
tgcagaagcc attgatttga 20
<210 > 7
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador directo para GAPDH
<400> 7
accacagtcc atgccatcac 20
<210 > 8
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador inverso para GAPDH
<400> 8
tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método de producción de una célula epitelial pigmentaria de la retina que comprende las siguientes etapas:
(1) una primera etapa para cultivar una célula madre pluripotente en un medio que comprende un inhibidor del receptor de FGF y/o un inhibidor de MEK durante un período de no más de 30 días, en donde el medio no contiene un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y no contiene un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt; y
(2) una segunda etapa para cultivar la célula obtenida en la primera etapa en presencia de un inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal y/o un inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt, y en ausencia de un inhibidor del receptor de FGF y en ausencia de un inhibidor de MEK, para formar una célula epitelial pigmentaria de la retina;
en donde el inhibidor de la vía de transducción de señales Nodal es SB431542, y
en donde el inhibidor de la vía de transducción de señales Wnt es CKI-7, D4476, IWR-1 -endo o IWP-2.
2. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera etapa se realiza en:
(a) condiciones libres de suero; y/o
(b) la ausencia de células alimentadoras.
3. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el medio en la primera etapa comprende además un factor para mantener un estado indiferenciado, en donde el factor para mantener un estado indiferenciado es bFGF, FGF4, FGF8, TGFp1, TGFp2, Nodal, Activina A o Activina B.
4. El método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde:
(a) el inhibidor del receptor de FGF es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en PD173074 y SU5402;
(b) el inhibidor de MEK es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en PD0325901, PD184352, U0126, TAK-733 y AZD-8330; y/o
(c) el inhibidor de la vía de transducción de señales de Wnt es CKI-7.
5. El método de producción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente de primate o una célula madre pluripotente humana.
6. El método de producción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el medio en la primera etapa es un medio que comprende además un inhibidor del receptor de BMP.
7. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el inhibidor del receptor de BMP es LDN193189.
8. El método de producción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el medio en la primera etapa comprende además un agonista de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog, en donde el agonista de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en Shh , Ihh, Purmorfamina y SAG.
9. El método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el medio en la primera etapa comprende además un inhibidor de PKC.
10. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el inhibidor de PKC es Go6983.
11. El método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el período de cultivo en la primera etapa es un período suficiente para inducir la expresión génica de al menos uno de los factores de transcripción del campo ocular y de no más de 30 días.
12. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 11, en donde los factores de transcripción del campo ocular son PAX6, LHX2 y SIX3.
13. El método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el período de cultivo en la primera etapa es de 2 días a 13 días o de 4 días a 6 días.
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