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ES2906333T3 - Composiciones y procedimientos para el diagnóstico y tratamiento de trastornos del sistema linfático - Google Patents

Composiciones y procedimientos para el diagnóstico y tratamiento de trastornos del sistema linfático Download PDF

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ES2906333T3
ES2906333T3 ES17847498T ES17847498T ES2906333T3 ES 2906333 T3 ES2906333 T3 ES 2906333T3 ES 17847498 T ES17847498 T ES 17847498T ES 17847498 T ES17847498 T ES 17847498T ES 2906333 T3 ES2906333 T3 ES 2906333T3
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Hakon Hakonarson
Dong Li
Lifeng Tian
Kenny Nguyen
Patrick Sleiman
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Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
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Abstract

Un procedimiento para diagnosticar una anomalía linfática en un paciente humano que comprende detectar una variante de un solo nucleótido (SNV) en uno o más de PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF en un ácido nucleico en una muestra biológica aislada obtenida del paciente; donde la presencia de dicha SNV es indicativa de una anomalía linfática y donde la SNV se selecciona de a) c.3481A>G:p.S1161G en PIK3R4; b) c.1393-7C>T en PIK3R6; c) c.6818A>G:p.P2273L en mTOR; y d) c.640T>C:p.S214P en ARAF.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos para el diagnóstico y tratamiento de trastornos del sistema linfático
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se relaciona con los campos de la genética, la medicina personalizada y las malformaciones del sistema linfático. Más específicamente, la invención proporciona nuevas dianas genéticas y regímenes de tratamiento terapéutico para mejorar los síntomas asociados con la linfangiomatosis y otras anomalías linfáticas generalizadas (GLA).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El sistema linfático juega un papel fundamental en el mantenimiento de la circulación de fluidos corporales, la defensa del cuerpo contra las enfermedades y la absorción de grasas alimenticias en el intestino delgado (1). Las anomalías linfáticas complejas se caracterizan por la formación anormal de vasos linfáticos y el crecimiento excesivo de tejido. Los pacientes a menudo presentan síntomas superpuestos que pueden conducir a una enfermedad pulmonar grave (2, 3). Los ejemplos de anomalías linfáticas incluyen anomalía linfática generalizada (GLA), linfangiectasia y quilotórax (derrames pericárdicos, pleurales o peritoneales). La investigación sobre anomalías linfáticas complejas se ha visto obstaculizada por la inconsistencia en la clasificación y nomenclatura debido a un desafío significativo en el diagnóstico (3-6). Aunque la etiología genética molecular de las anomalías linfáticas complejas no se conoce bien, las malformaciones congénitas del sistema linfático parecen tener una etiología genética subyacente relacionada (7-9). De hecho, se han identificado mutaciones tanto de la línea germinal como somáticas en genes que convergen en las vías de PI3K/mTOR y Ras/MAPK (1, 8).
Se ha demostrado que la disgregación o aberraciones de las vías de señalización de PI3K/mTOR y Ras/MAPK alteran la expansión y remodelación normales durante la construcción de una red linfática madura, donde tales alteraciones están asociadas con una enfermedad linfática. En pacientes con malformaciones linfáticas que conforman un síndrome, como el síndrome de Proteus (OMIM 176920), el síndrome de CLOVES (OMIM 612918) y síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber (OMIM 149000) (9-11), se identificaron mutaciones de ganancia de función en AKT1 y PIK3CA, que producen una diana de actividad del complejo de rapamicina 1 (mTORC1). Las mutaciones en KRAS, HRAS, RAF1, PTPN11, SOS1 y RASA1, que dan como resultado una actividad desregulada de la vía de RAS, causan linfedema o linfangiectasia en el síndrome de Noonan (OMIM 163950), el síndrome de Costello (OMIM 218040), el síndrome de malformación capilar cardiofaciocutánea (OMIM 115150) y síndrome de malformación arteriovenosa (CM-MAV) (OMIM 608354) (12-17).
A pesar de estos conocimientos, faltan biomarcadores genéticos para su uso en la identificación de pacientes con trastornos linfáticos y anomalías linfáticas, como linfangiomatosis / linfangiectasia (LAM), anomalía linfática generalizada (GLA) y quilotórax, al igual que los tratamientos que se dirigen a los marcadores genéticos asociados con estos trastornos.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Se analizaron a miembros de una familia de tres generaciones mediante secuenciación del exoma (ES) en busca de mutaciones novedosas en la línea germinal, ya que seis individuos de la familia se vieron afectados por anomalías linfáticas, incluso GLA, y estasis venosa significativa Se identificó una mutación heterocigótica de la línea germinal en EPHB4.Los estudios de desactivación de EPHB4 en el pez cebra confirmaron que EPHB4 desempeña un papel en el desarrollo y ramificación de los vasos linfáticos, un procedimiento que involucra la señalización de mTOR.
Se secuenció una cohorte de 13 familias con diagnóstico de GLA o linfangiectasia, todas las cuales tenían al menos un miembro de la familia con quilotórax. Se identificó una variante homocigota en PIK3R6, que codifica la subunidad reguladora del complejo PI3K, una mutación heterocigótica en MTOR, una mutación heterocigótica en PIK3R4, y una mutación de ganancia de función de novo recurrente en ARAF, que está involucrada en la vía de Ras/MAPK, un interactor de la vía de mTOR.
En consecuencia, en un aspecto, se proporciona un procedimiento para diagnosticar una anomalía linfática en un paciente humano. Un procedimiento ejemplar comprende obtener una muestra biológica que comprende ácido nucleico del paciente, analizar el ácido nucleico para determinar si i) está presente una variante de un solo nucleótido (SNV) en uno o más de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF o ii) si está presente una SNV en desequilibrio de ligamiento con una SNV en uno o más de EPHB4 , PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF; y diagnosticar al paciente una anomalía linfática si está presente una SNV de i) o ii). En otro aspecto, un procedimiento para diagnosticar una anomalía linfática en un paciente humano implica obtener información de la secuencia del genotipo de un paciente humano, ensayar el ácido nucleico para determinar si i) está presente una variante de un solo nucleótido (SNV) en uno o más de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF o ii) si está presente una SNV en desequilibrio de ligamiento con una SNV en uno o más de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF; y diagnosticar al paciente una anomalía linfática si está presente una SNV de i) o ii).
También se proporciona un procedimiento para tratar una anomalía linfática en un paciente humano. Un procedimiento ejemplar comprende obtener una muestra biológica que comprende ácido nucleico del paciente; ensayar el ácido nucleico para determinar si i) está presente una variante de un solo nucleótido (SANV) en uno o más de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF o ii) está presente una SNV en desequilibrio de ligamiento con una SNV en uno o más de EPHB4 , PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF; y administrar uno o más agentes adecuados para el tratamiento de dicha anomalía linfática al paciente que se ha identificado que tiene una o más SNV de i) o ii), tratar así la anomalía linfática. En una realización alternativa de este procedimiento, la información del genotipo se obtiene de un paciente y se ensaya para determinar si i) está presente una variante de un solo nucleótido (SNV) en uno o más de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF o ii) está presente una SNV en desequilibrio de ligamiento con una SNV en uno o más de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF; y administrar uno o más agentes adecuados para el tratamiento de dicha anomalía linfática al paciente identificado por tener una o más SNV de i) o ii), tratando así la anomalía linfática. En una realización alternativa de este procedimiento, la información del genotipo se obtiene de un paciente.
En ciertas realizaciones, la anomalía linfática se caracteriza por la formación anormal de vasos linfáticos y/o crecimiento excesivo de tejido. En otras realizaciones, la anomalía linfática es linfangiomatosis (LAM). En otra realización, la anomalía linfática es anomalía linfática generalizada (GLA). La anomalía linfática puede caracterizarse por quilotórax, incluidos derrames pericárdicos, pleurales o peritoneales.
Los procedimientos de diagnóstico pueden comprender además generar un informe que identifique la SNV después de la detección en la muestra biológica. Los procedimientos de tratamiento descritos anteriormente pueden comprender además generar un informe que identifique el o los tratamientos sugeridos para la anomalía linfática con base en la SNV identificada en el procedimiento.
En aun otra realización, los procedimientos de diagnóstico descritos en esta solicitud pueden comprender además administrar una cantidad efectiva de uno o más agentes adecuados para tratar dicha anomalía linfática en el paciente diagnosticado.
En determinadas realizaciones de los procedimientos de tratamiento, el agente que se administrará a pacientes que albergan una o más SNV asociadas a anomalías linfáticas se selecciona de entre uno o más inhibidores de mTOR, uno o más inhibidores de PIK3K, uno o más inhibidores de MEK/ERK y una combinación de uno o más de cualquiera de dichos inhibidores. En otras realizaciones, los agentes o dichos inhibidores se enumeran en las Tablas 1 y 2. En algunas realizaciones, cuando el agente es un inhibidor de mTor, se administra rapamicina y o BEZ-235 (dactolisib). En determinadas realizaciones, el uno o más inhibidores de mTOR, uno o más inhibidores de PIK3K, y/o uno o más inhibidores de MEK/ERK tienen una CI50 de menos de 100 pM, menos de 10 pM, menos de 1 pM, menos de 100 nM, menos de 10 nM o menos de InM.
En otro aspecto, el agente que inhibe la señalización de mTOR también tiene actividad biológica adicional. Estos incluyen, sin limitación, inhibición de PI3K, inhibición de la proteína de unión a FK506, inhibición de ADN-PK, inhibición de p110 o inhibición de p70S6K. En algunas realizaciones, el paciente tiene una, dos, tres, cuatro o cinco SNV en cada uno de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF. En algunas realizaciones, el paciente no tiene una SNV en EPHB4. En algunas realizaciones, el paciente no tiene una SNV en PIK3R4. En algunas realizaciones, el paciente no tiene una SNV en PIK3R6. En algunas realizaciones, el paciente no tiene una SNV en mTOR. En algunas realizaciones, el paciente no tiene una SNV en ARAF.
En algunas realizaciones, los agentes enumerados en las Tablas 1 y 2 se usan en combinación. Estas combinaciones incluyen, sin limitación, a) Ridaforolimus y Trametinib; b) Ridaforolimus y Selumetinib o Cobimetinib; c) BEZ235 y Selumetinib; d) Omipalisib y Selumetinib o Trametinib; e) Everolimus y Trametinib o Selumetinib; f) Sirolimus, Ridaforolimus y Selumetinib; g) Sirolimus, Ridaforolimus y Trametinib; h) Torkinib y Trametinib; i) BEZ235, Torkinib y Trametinib; y j) Sirolimus y Gedatolisib y Trametinib. En otras realizaciones, el tratamiento comprende además la administración de quimioterapia sistémica, interferón alfa, radioterapia, y/o cirugía.
En algunas realizaciones, la SNV se selecciona de c.2334+1G>C en EPHB4; c.3481A>G:p.S1 161G en PIK3R4; c.1393-7C>T en PIK3R6; c.6818A>G:p.P2273L en mTOR; y c.640T>C:p.S214P en ARAF.
En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende la detección de c.2334+1G>C en EPHB4. En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende además tratar a dicho paciente con uno o más agentes seleccionados entre uno o más inhibidores de mTor, uno o más inhibidores de PI3K y uno o más inhibidores de MEK/ERK. En otras realizaciones, los agentes se seleccionan de las Tablas 1-2, mejorando así una o más de la estructura linfática, disminuyendo los derrames pleurales quilosos, mejorando la función respiratoria, permitiendo el ajuste gradual del uso de medicación concomitante o aumentando la supervivencia.
En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende detectar c.2334+1G>C en EPHB4 y administrar al menos uno o más inhibidores de mTor, uno o más inhibidores de PI3K y uno o más inhibidores de MEK/ERK solos o en combinación. En otras realizaciones, el agente se selecciona de las Tablas 1-2, mejorando así una o más de la estructura linfática, disminuyendo los derrames pleurales quilosos, mejorando la función respiratoria, permitiendo el ajuste gradual del uso de medicación concomitante o aumentando la supervivencia.
En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende la detección de c.3481A>G:p.S1161G en PIK3R4. En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende además tratar a dicho paciente con uno o más inhibidores de mTor, uno o más inhibidores de PI3K y uno o más inhibidores de MEK/ERK solos o en combinación. En otras realizaciones, los agentes se seleccionan de las Tablas 1-2, mejorando así una o más de la estructura linfática, disminuyendo los derrames pleurales quilosos, mejorando la función respiratoria, permitiendo el ajuste gradual del uso de medicación concomitante o aumentando la supervivencia.
En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende detectar c.3481A>G:p.S1161G en PIK3R4 y administrar al menos uno o más inhibidores de mTor, uno o más inhibidores de PI3K y uno o más inhibidores de MEK/ERK solos o en combinación. En otras realizaciones, al menos un agente se selecciona de las Tablas 1-2 para administración, mejorando así una o más de la estructura linfática, disminuyendo los derrames pleurales quilosos, mejorando la función respiratoria, permitiendo el ajuste gradual del uso de medicación concomitante o aumentando la supervivencia.
En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende la detección de c.1393-7C>T en PIK3R6. En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende además tratar a dicho paciente con uno o más inhibidores de mTor, uno o más inhibidores de PI3K y uno o más inhibidores de MEK/ERK solos o en combinación. En otras realizaciones, los agentes se seleccionan de las Tablas 1-2, mejorando así una o más de la estructura linfática, disminuyendo los derrames pleurales quilosos, mejorando la función respiratoria, permitiendo el ajuste gradual del uso de medicación concomitante o aumentando la supervivencia.
En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende detectar c.1393- 7C> en PIK3R6 y administrar uno o más inhibidores de mTor, uno o más inhibidores de PI3k y uno o más inhibidores de MEK/ERK solos o en combinación. En otras realizaciones, se administra al menos un agente de las Tablas 1-2, mejorando así una o más de la estructura linfática, disminuyendo los derrames pleurales quilosos, mejorando la función respiratoria, permitiendo el ajuste gradual del uso de medicación concomitante o aumentando la supervivencia.
En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende la detección de c.6818A>G:p.P2273L en mTOR. En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende además tratar a dicho paciente con uno o más inhibidores de mTor, uno o más inhibidores de PI3K y uno o más inhibidores de MEK/ERK solos o en combinación. En otras realizaciones, se administran agentes de las Tablas 1-2, mejorando así una o más de la estructura linfática, disminuyendo los derrames pleurales quilosos, mejorando la función respiratoria, permitiendo el ajuste gradual del uso de medicación concomitante o aumentando la supervivencia.
En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende detectar c.6818A>G:p.P2273L en mTOR y administrar al menos uno o más inhibidores de mTor, uno o más inhibidores de PI3K y uno o más inhibidores de MEK/ERK solos o en combinación. En otras realizaciones, se administra al menos un agente de las Tablas 1-2, mejorando así una o más de la estructura linfática, disminuyendo los derrames pleurales quilosos, mejorando la función respiratoria, permitiendo el ajuste gradual del uso de medicación concomitante o aumentando la supervivencia.
En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende la detección de c.640T>C:p.S214P en ARAF. En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende además tratar a dicho paciente con uno o más inhibidores de mTor, uno o más inhibidores de PI3K y uno o más inhibidores de MEK/ERK solos o en combinación. En otras realizaciones, se administran agentes de las Tablas 1-2, mejorando así una o más de la estructura linfática, disminuyendo los derrames pleurales quilosos, mejorando la función respiratoria, permitiendo el ajuste gradual del uso de medicación concomitante o aumentando la supervivencia.
En algunas realizaciones, el procedimiento de diagnóstico comprende detectar c.640T>C:p.S214P en ARAF y administrar al menos uno o más inhibidores de mTor, uno o más inhibidores de PI3K y uno o más inhibidores de MEK/ERK solos o en combinación. En otras realizaciones, se administra al menos un agente de las Tablas 1-2, mejorando así una o más de la estructura linfática, disminuyendo los derrames pleurales quilosos, mejorando la función respiratoria, permitiendo el ajuste gradual del uso de medicación concomitante o aumentando la supervivencia. En un sujeto que tiene una SNV en ARAF, el agente es un inhibidor de ERK/MEK. Los inhibidores de ERK/MEK adecuados para tratamiento incluyen, sin limitación, Selumetinib (AZD6244). PD0325901, Trametinib (GSK1120212), PD184352 (CI-1040), Pimasertib (AS-703026), TAK-733, AZD8330, Binimetinib (MEK162, ARRY-162, ARRY-438162), SL-327, Refametinib (RDEA119, Bay 86-9766), y Cobimetinib (GDC-0973, RG7420).
En algunas realizaciones, la etapa de analizar el ácido nucleico para determinar si está presente una variante de un solo nucleótido (SNV) en uno o más de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF comprende además la etapa de analizar una muestra de polinucleótido para determinar la presencia de dicha SNV mediante la realización de un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en detección de hibridación específica, medición del tamaño del alelo, análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción, análisis de hibridación específica del alelo, reacción de extensión del cebador de base única y secuenciación de un polinucleótido amplificado.
En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende ADN.
En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende ARN.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que comprenden dicha o dichas SNV se obtienen de una célula aislada del paciente humano.
En algunas realizaciones, un vector aislado codifica un ácido nucleico con una SNV, donde la SNV se selecciona de c.2334+1G>C en EPHB4; c.3481A>G:p.S1161G en PIK3R4; c.1393-7C>T en PIK3R6; c.6818A>G:p.P2273L en mTOR; y c.640T>C:p.S214P en ARAF
En algunas realizaciones, una cédula hospedadora comprende un vector aislado que codifica un ácido nucleico con una SNV. En algunas realizaciones, un animal transgénico comprende una cédula hospedadora. En algunas realizaciones, el animal transgénico es un ratón o un pez cebra.
En algunas realizaciones, un procedimiento de cribado de los efectos de un agente comprende poner en contacto una cédula hospedadora o un animal transgénico con uno o más de un inhibidor de mTor, uno o más inhibidores de PI3K y uno o más inhibidores de MEK/ERK solos o en combinación, o se incluye un agente de las Tablas 1-2. En algunas realizaciones, el efecto de un agente que se criba es el rescate inferior o el rescate ramificado en el pez cebra. En algunas realizaciones, el efecto de un agente que se criba es la fosforilación de mTOR.
En algunas realizaciones, un procedimiento para identificar un agente que altera la señalización celular, comprende proporcionar células que expresan al menos un ácido nucleico que comprende al menos una SNV como se describió anteriormente, proporcionar células que expresan las secuencias afines naturales que carecen de la SNV; poner en contacto ambas poblaciones de células con un agente de prueba; y
analizar si dicho agente altera la señalización celular de las células que albergan el ácido nucleico que contiene la SNV en relación con las células que carecen de dicha SNV.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Estudio genealógico de la Familia-1 y patrón cosegregante de la mutación de EPHB4 . Los círculos abiertos denotan hembras no afectadas y los cuadrados abiertos denotan machos no afectados; las figuras sólidas indican sujetos afectados. Los genotipos de EPHB4 se anotan debajo del símbolo para cada sujeto del cual había ADN disponible para la prueba.
Figura 2. Un diagrama esquemático del papel que juega EPHB4 en el desarrollo de los vasos.
Figuras 3A y 3B:La mutación de EPHB4 conduce a la cinasa EPHB4 inactiva. En la Figura 3A, las células 293T se transfectaron transitoriamente conEPHB4 natural solo,EPHB4mutante solo, o las mezclas natural y mutante en las proporciones indicadas. Los lisados se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron para fosfotirosina (pTyr, parte superior) o EPHB4 (parte inferior). En la Figura 3B, las células A375 se transfectaron conEPHB4 natural, EPHB4mutante o se dejaron sin transfectar. Las células se estimularon con Efrina B2 Fc unida a placa o IgG1 humana como control. Las células se lisaron y las proteínas transfectadas se inmunoprecipitaron. Las inmunoprecipitaciones se transfirieron para fosfotirosina (arriba) o EPHB4 (medio). Los lisados de células enteras se transfirieron para EPHB4 para demostrar la misma expresión (parte inferior).
Figura 4. Un gel que muestra el ADNc desactivado de EPHB4 en pez cebra usando el morfolino para exón 13 a los 2 dpf (días posfertilización) a diferentes concentraciones de carga. El exón 13 tiene 216 pares de bases. C = control (sin morfolino).
Figuras 5A-5H. La desactivación de ephb4a induce la expansión dependiente de la señalización de mTOR del plexo vascular inferior y los vasos mal orientados en la vasculatura intersomítica. La desactivación de ephb4a mediada por morfolino (Figura 5B) induce la expansión y fusión de la vasculatura inferior a los 2,5 dpf (puntas de flecha) en comparación con el control (Figura 5A). La Figura 5C muestra que a los 4dpf el sistema vascular del pez cebra consiste en vasos sanguíneos intersomíticos que se proyectan en dirección dorsoventral (flecha) así como vasos linfáticos más delgados (puntas de flecha). La línea paracordal linfática corre horizontalmente a lo largo del tronco (punta de flecha hacia abajo) mientras que los vasos linfáticos intersegmentarios se proyectan hacia abajo (punta de flecha hacia arriba). La Figura 5D muestra que la desactivación de ephb4a induce vasos mal orientados que se asemejan a vasos sanguíneos (flechas) y vasos linfáticos (puntas de flecha). (Las figuras 5C y 5D se combinan a partir de 2 exploraciones confocales vecinas). La figura 5E muestra que se detectan defectos en el plexo inferior en el 52% de las larvas inyectadas con morfolino de ephb4aa los 2,5 dpf, y la vasculatura incorrectamente ramificada está presente en el 46% el día 4. La rapamicina puede reducir significativamente el número de animales con defecto a los 2,5 dpf (Figura 5F) y los 4 dpf (Figura 5G). La Figura 5H muestra que BEZ-235 rescata de manera similar el defecto de ramificación el día 4.
Figuras 6A-6F. La desactivación de pik3r6 induce vasos intersomíticos ramificados incorrectamente dependientes de la señalización de mTOR. Las figuras 6A (control) y 6B (morfolino de pik3r6) muestran que la desactivación de pik3r6 mediada por morfolino induce una ramificación incorrecta de los vasos que se asemejan a los vasos sanguíneos (flechas) y vasos linfáticos (puntas de flecha) (los paneles se fusionan de 2 exploraciones confocales vecinas). Los defectos de los vasos del tronco podrían ser inducidos por morfolinos que se dirigen al exón 4 (Figura 6C) y al exón 13 (Figura 6D). Tanto la rapamicina (Figura 6E) como BEZ-235 (Figura 6f ) redujeron significativamente el número de larvas con defectos en los vasos.
Figuras 7A-7D. La desactivación de pik3r4 mediada por morfolino induce vasos intersomíticos orientados incorrectamente. Las larvas de control inyectadas muestran una arquitectura de vasos normal a los 4 dpf (Figura 7A), mientras que la desactivación de pik3r4 induce una ramificación incorrecta en los vasos que se asemejan a los vasos sanguíneos (puntas de flecha) o linfáticos (flechas) (Figuras 7B-7C). La figura 7D muestra que los defectos se detectaron solo en 5% de las larvas inyectadas con control, pero en el 16% de las larvas inyectadas con morfolino de pik3r4.
Figuras 8A-8B. La mTORC1 hiperactiva contribuye a los fenotipos ramificados incorrectamente y los inhibidores de mTOR rescatan el fenotipo. La Figura 8A muestra que los lisados de larvas de pez cebra tratados con morfolino de PIK3R6 o morfolino de control, y no tratados o tratados con rapamicina o BEZ235, se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron para fósforo-mTOR S2448 o fósforo-p70S6K T389. La transferencia para beta-actina se utilizó como control de carga. La Figura 8B muestra que los lisados de larvas de pez cebra tratados con morfolino de EPHB4 o morfolino de control, y no tratados o tratados con rapamicina, se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron para fósforo-mTOR S2448 o fósforo-p70S6K T389. La transferencia para beta-actina se utilizó como control de carga.
Figura 9. Análisis de inmunoelectrotransferencia de las células HEK293T naturales o células mutantes de EPHB4 mediante edición de genes. Las células que contienen la mutación que altera el splicing de EPHB4 mostraron niveles más altos de P-p70S6K que las células naturales. La transferencia para beta-actina se utilizó como control de carga.
Figura 10. Mutante de mTOR P2273L muestra un aumento de la actividad de la proteína cinasa. Análisis de inmunoelectrotransferencia de las células HeLa transfectadas con vector con epítopo FLAG, mTOR natural y mutante de P2273L-mTOR. La activación se refleja por el aumento de la fosforilación de p70S6K. ev = vector vacío. La transferencia para beta-actina se utilizó como control de carga.
Figuras 11A a 11L. La mutación de ARAF S214P aumentó la actividad de las MAPK, y la sobreexpresión del mutante de ARAF humano en el pez cebra dio como resultado defectos en la vasculatura. (Figura 11A) Se transfectaron lisados celulares de células HEK293T con ARAF natural con epítopo FLAG o mutante de S214P-ARAF. La inmunoprecipitación se realizó usando el anticuerpo anti-FLAG (M2), seguido de inmunoelectrotransferencia usando los anticuerpos indicados. Se analizaron alícuotas de los lisados celulares mediante inmunoelectrotransferencia. La activación se vio reflejada mediante un aumento de la fosforilación de las ERK a través de la asociación alterada con las proteínas 14-3-3. (Figura 11B) Tg(fli1:ARAF-V2a-mCherry) La línea se generó utilizando el kit de puerta de acceso Tol2. Brevemente, se inyectó ADNc de ARAF natural o mutante de S214P humano con un plásmido donante de transposón que contenía la construcción Tol2 con un promotor de relleno. La expresión de mosaico transitoria fue visualizada por mCherry ligada a ARAF mediante un sitio de escisión de la proteína V2a autocatalítica. (Figura 11C y Figura 11D) Expresión de vasos inferiores agrandados inducidos por ARAF humana. (Figura 11E) El defecto de los vasos inferiores agrandados se detectó en el 21% de la expresión transgénica de ARAF S214P humana pero no natural a los 2 dpf (***P < 0,001). (Figura 11F y Figura 11G) La rapamicina inhibidora de mTORC1 (Figura 11F) y BEZ235 dirigidos tanto a PI3K como a mTORC1 (Figura 11G) no tuvieron ningún efecto terapéutico sobre el pez cebra transgénico transitorio (ns, no significativo). (Figura 11H, Figura 11I y Figura 11J) Fármacos inhibidores de MEK, U0126 (Figura 11H, ** P < 0,01), cobimetinib (figura 11I, ** P < 0,01) y selumetinib (Figura 11J, *** P < 0,001), redujeron significativamente el número de larvas con expansión y fusión de la vasculatura inferior a los 2 dpf. (Figura 11L y Figura 11K) Se descubrió que la expresión transgénica de ARAF S214P humana en el pez cebra afecta gravemente la formación normal dorso/ventral de vasos (Figura 11L), mientras que la expresión de ARAF natural no tuvo efecto (Figura 11K).
Figura 12. La mutación A-RafS214P asociada a LGA alteró las propiedades migratorias de las células endoteliales._La migración celular se determinó utilizando cámaras Millipore T ranswell. Las células Hy926 que expresan A-Raf natural o A-Raf-S214P (300 pl, 2 * 105 células/ml) se sembraron en las cámaras superiores de las placas Transwell y se añadieron 400 pl de DMEM con FBS al 10% a las cámaras inferiores. A continuación, las placas se colocaron en una incubadora a 37 ° C con CO2 al 5% durante 24 horas. Después de la incubación, las células restantes en la cámara superior se retiraron con cuidado y la membrana Transwell se fijó con PFA al 4% y se tiñeron con cristal violeta al 0,5%. La cantidad de cristal violeta se determinó por densidad óptica después del tratamiento con solución SDS al 1%. Los datos sugieren que selumetinib puede restaurar parcialmente la angiogénesis.
RESUMEN DE LAS SECUENCIAS
La siguiente tabla de SEQ ID proporciona información sobre las secuencias utilizadas en esta aplicación.
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DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Se realizó la secuenciación del exoma completo en muestras de ADN obtenidas de una familia de tres generaciones, tres de las cuales estaban afectadas por anomalías linfáticas, para identificar la base genética de esta enfermedad rara previamente inexplicable. Se examinaron todas las mutaciones con cambio de sentido, sin sentido, que alteran el splicing y de codificación que coincidían con el modelo de herencia autosómico dominante de la familia. Los resultados se filtraron para excluir variantes sinónimas, variantes con frecuencia de alelos menores (MAF) mayor que 0,5%, y variantes previamente identificadas en controles. Los candidatos relevantes fueron analizados más a fondo. Como resultado, se identificó una sustitución de un solo par de bases, c.2334+1G>C, que da como resultado una mutación en el sitio de splicing dentro del gen EPHB4 como una mutación causal. Se analizaron muestras de pacientes adicionales diagnosticados con anomalías linfáticas y se identificaron SNV causantes de enfermedades adicionales: una mutación sin sentido en PIK3R3, una mutación de splicing en PIK3R6, una mutación sin sentido en MTOR y una mutación de un sitio de fosforilación conservado en ARAF.
Estas SNV novedosas relacionadas con anomalías linfáticas son c.2334+1G>C en EPHB4, c.3481A>G:p.S1 161G en PIK3R4, c.1393-7C>T en PIK3R6, c.6818A>G:p.P2273L en mTOR, y c.640T>C:p.S214P en ARAF. Las SNV de c.2334+1G>C en EPHB4, c.3481A>G:p.S1 161G en PIK3R4, c.1393-7C>T en PIK3R6, c.6818A>G:p.P2273L en mTOR, y c.640T>C:p.S214P en ARAF pueden denominarse «SNV relacionadas con anomalías linfáticas» o «mutaciones asociadas con anomalías linfáticas» en esta solicitud.
Por lo tanto, la presente descripción abarca procedimientos para diagnosticar anomalías linfáticas donde un paciente es diagnosticado con anomalías linfáticas si tiene al menos una SNV en EPHB4, PIK3R3, PIK3R6 y mTOR en comparación con un control negativo, o tiene al menos una SNV en desequilibrio de ligamiento con al menos una SNV en EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF. La descripción también abarca procedimientos para tratar anomalías linfáticas en pacientes que tienen al menos una SNV en EPHB4, PIK3R3, PIK3R6 y mTOR con al menos un inhibidor de mTOR, al menos un inhibidor de PIK3K, y/o al menos un inhibidor de MEK (por ejemplo, al menos un agente enumerado en las Tablas 1-2).
A continuación, se hará referencia en detalle a algunas realizaciones ejemplares de la invención, algunos de cuyos ejemplos se ilustran en los dibujos adjuntos. Si bien la invención se describirá junto con las realizaciones ilustradas, se entenderá que no pretenden limitar la invención a tales realizaciones. Por el contrario, la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Antes de describir las presentes enseñanzas en detalle, se entenderá que la descripción no se limita a composiciones específicas o etapas de procedimiento, ya que pueden variar. También se debe tener en cuenta que, como se usan en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares «un», «una» y «el/la» incluyen las referencias plurales a menos que el contenido dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a «un conjugado» incluye una pluralidad de conjugados y la referencia a «una célula» incluye una pluralidad de células y similares.
Se apreciará que hay un «aproximadamente» implícito antes de las temperaturas, concentraciones, tiempos, etc. tratados en la presente descripción, de modo que las desviaciones leves e insustanciales están dentro del alcance de las presentes enseñanzas en esta solicitud. Además, el uso de «comprenden», «comprende», «que comprende», «contienen», «contiene», «que contiene», «incluye», «incluyen» y «que incluye» no pretende ser limitante. Se entiende que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son meramente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de las enseñanzas.
A menos que se indique específicamente en la memoria descriptiva anterior, las realizaciones en la memoria descriptiva que mencionan «que comprenden» varios componentes también se contemplan como «que consisten en» o «que consisten esencialmente en» los componentes enumerados; las realizaciones en la memoria descriptiva que mencionan «que consisten en» varios componentes también se contemplan como «que comprenden» o «que consisten esencialmente en» los componentes enumerados; y las realizaciones en la memoria descriptiva que mencionan «que consisten esencialmente en» varios componentes también se contemplan como «que consisten en» o «comprenden» los componentes enumerados (esta intercambiabilidad no se aplica al uso de estos términos en las reivindicaciones).
Los encabezados de sección utilizados en esta invención son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia descrita en forma alguna. En el caso de que la bibliografía contradiga cualquier término definido en esta memoria descriptiva, prevalecerá esta memoria descriptiva. Si bien las presentes enseñanzas se describen junto con varias realizaciones, no se pretende que las presentes enseñanzas se limiten a tales realizaciones. Por el contrario, las presentes enseñanzas abarcan diversas alternativas, modificaciones y equivalentes, como apreciarán los expertos en la técnica.
Además, un compuesto «seleccionado del grupo que consiste en» se refiere a uno o más de los compuestos de la lista que sigue, incluidas las mezclas (es decir, combinaciones) de dos o más de los compuestos. Según la presente invención, una molécula aislada o biológicamente pura es un compuesto que se ha eliminado de su medio natural. Como tal, «aislado» y «biológicamente puro» no reflejan necesariamente el grado en el que se ha purificado el compuesto. Un compuesto aislado se puede obtener de su fuente natural, se puede producir utilizando técnicas sintéticas de laboratorio o se puede producir mediante cualquier vía de síntesis química.
«Anomalía linfática» se refiere a una enfermedad o trastorno caracterizado por la formación anormal de vasos linfáticos y crecimiento excesivo de tejido. Los ejemplos no limitantes de anomalías linfáticas incluyen «linfangiomatosis» o «linfangiectasia» (denominadas colectivamente en esta solicitud como LAM), linfangiomas, anomalía linfática generalizada (GLA) y quilotórax, linfangioma generalizado, angiomatosis quística sistémica, linfangiectasias múltiples, malformación linfática generalizada, malformación linfática difusa, LAM kaposiforme y enfermedad de Gorham-Stout (GSD), un trastorno vascular raro de origen linfático caracterizado por osteólisis ósea progresiva.
Clínicamente, los linfangiomas se clasifican en varios tipos. Estos incluyen (1) Simplex, que está formado por canales linfáticos de paredes delgadas y de tamaño capilar. Este tipo suele afectar la piel (linfangioma circunscrito); (2) linfangioma quístico (o higroma quístico): puede variar en tamaño desde unos pocos milímetros hasta varios centímetros, visto a una edad temprana, comúnmente en el cuello o la axila; (3) cavernoso: este tipo está formado por canales linfáticos dilatados, a menudo con capas adventicias fibrosas. Este es el tipo que generalmente afecta los órganos del tórax, el abdomen y los huesos. Cada uno de estos linfangiomas queda incluido en la invención.
Una «variación de un solo nucleótido (SNV)» se refiere a una posición en el ADN genómico donde hay una sola base que difiere de la base habitual en esa posición. Una SNV es similar a una SNP excepto que una SNP generalmente se refiere a una SNV que ocurre con cierta frecuencia (por ejemplo, ocurre en más de un cierto porcentaje de la población), mientras que una SNV no proporciona información de frecuencia. Se han catalogado millones de SNV en el genoma humano. Algunas SNV son variaciones normales del genoma, mientras que otras SNV se asocian a enfermedades.
Una «SNV asociada a anomalías linfáticas o un marcador específico» es una SNV que se asocia con un mayor riesgo de desarrollar una anomalía linfática y no se encuentra en pacientes que no tienen esta enfermedad. Tales marcadores pueden incluir, entre otros, ácidos nucleicos, proteínas codificadas por ellos u otras moléculas pequeñas.
La expresión «alteración genética», como se usa en esta solicitud, se refiere a un cambio de la secuencia de referencia o natural de una o más moléculas de ácido nucleico. Las alteraciones genéticas incluyen, sin limitación, SNV y SNP, variaciones en el número de copias (CNV), sustituciones de pares de bases, adiciones y deleciones de al menos un nucleótido de una molécula de ácido nucleico de una secuencia conocida.
«Ligamiento» describe la tendencia de genes, alelos, loci o marcadores genéticos que se heredarán juntos como resultado de su ubicación en el mismo cromosoma, y se mide por la recombinación porcentual (también llamada fracción de recombinación, o 0) entre los dos genes, alelos, loci o marcadores genéticos. Cuanto más cerca estén físicamente dos loci en el cromosoma, menor será la fracción de recombinación. Normalmente, cuando se prueba un sitio polimórfico dentro de un gen causante de enfermedad para determinar su vinculación con la enfermedad, la fracción de recombinación será cero, lo que indica que la enfermedad y el gen causante de la enfermedad siempre son coheredados. En casos raros, cuando un gen abarca un segmento muy grande del genoma, es posible observar la recombinación entre sitios polimórficos en un extremo del gen y mutaciones causales en el otro. Sin embargo, si la mutación causante es el polimorfismo que se está probando para determinar su vinculación con la enfermedad, no se observará recombinación.
«Centimorgan» es una unidad de distancia genética que significa el ligamiento entre dos marcadores genéticos, alelos, genes o loci, correspondiente a una probabilidad de recombinación entre los dos marcadores o loci del 1% para cualquier evento meiótico.
«Desequilibrio de ligamiento» o «asociación alélica» significa la asociación preferencial de un alelo, locus, gen o marcador genético particular con un alelo, locus, gen o marcador genético específico en una ubicación cromosómica cercana con más frecuencia de lo esperado por casualidad para cualquier frecuencia de alelo particular en la población.
El término «matriz sólida», como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier formato, como esferas, micropartículas, una micromatriz, la superficie de un pocillo de microtitulación o un tubo de ensayo, una tira reactiva o un filtro. El material de la matriz puede ser poliestireno, celulosa, látex, nitrocelulosa, nailon, poliacrilamida, dextrano o agarosa. Una matriz sólida puede comprender ácidos nucleicos inmovilizados sobre ella de manera que no se puedan eliminar de la matriz en solución.
«Ácido nucleico diana», como se usa en esta solicitud, se refiere a una región previamente definida de un ácido nucleico presente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos en la que la región natural definida contiene al menos una variación de nucleótidos conocida, que puede asociarse o no con una anomalía linfática. La molécula de ácido nucleico puede aislarse de una fuente natural mediante clonación de ADNc o hibridación sustractiva o sintetizarse manualmente. La molécula de ácido nucleico se puede sintetizar manualmente mediante el procedimiento sintético de triéster o utilizando un sintetizador de ADN automático.
Con respecto a los ácidos nucleicos utilizados en la invención, el término «ácido nucleico aislado» cuando se aplica al ADN, se refiere a una molécula de ADN que está separada de las secuencias con las que es inmediatamente contigua (en las direcciones 5 'y 3') en el genoma natural del organismo del que se deriva. Por ejemplo, el «ácido nucleico aislado» puede comprender una molécula de ADN insertada en un vector, tal como un vector plasmídico o viral, o integrada en el ADN genómico de un procariota o eucariota. Una «molécula de ácido nucleico aislada» también puede comprender una molécula de ADNc. Una molécula de ácido nucleico aislada insertada en un vector también se denomina en ocasiones en esta solicitud como molécula de ácido nucleico recombinante.
Con respecto a las moléculas de ARN, el término «ácido nucleico aislado» se refiere principalmente a una molécula de ARN codificada por una molécula de ADN aislada como se definió anteriormente. Alternativamente, el término puede referirse a una molécula de ARN que ha sido suficientemente separada de las moléculas de ARN con las que estaría asociada en su estado natural (es decir, en células o tejidos), de modo que exista en una forma «sustancialmente pura».
El uso del término «enriquecido» en referencia al ácido nucleico significa que la secuencia específica de ADN o ARN constituye una fracción significativamente mayor (de 2 a 5 veces) del ADN o ARN total presente en las células o la solución de interés que en las células normales o en las células de las que se tomó la secuencia. Esto podría ser causado por una persona mediante reducción preferencial en la cantidad de otro ADN o ARN presente, o por un aumento preferencial en la cantidad de la secuencia específica de ADN o ARN, o por una combinación de los dos. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que «enriquecido» no implica que no haya otras secuencias de ADN o ARN presentes, solo que la cantidad relativa de la secuencia de interés se ha incrementado significativamente.
También es ventajoso para algunos propósitos que una secuencia de nucleótidos esté en forma purificada. El término «purificado» en referencia al ácido nucleico no requiere pureza absoluta (tal como una preparación homogénea); en cambio, representa una indicación de que la secuencia es relativamente más pura que en el entorno natural.
El término «complementario» describe dos nucleótidos que pueden formar múltiples interacciones favorables entre sí. Por ejemplo, la adenina es complementaria a la timina ya que pueden formar dos enlaces de hidrógeno. De manera similar, la guanina y la citosina son complementarias ya que pueden formar tres enlaces de hidrógeno. Así, si una secuencia de ácido nucleico contiene la siguiente secuencia de bases: timina, adenina, guanina y citosina, un «complemento» de esta molécula de ácido nucleico sería una molécula que contiene adenina en lugar de timina, timina en lugar de adenina, citosina en lugar de guanina y guanina en lugar de citosina. Debido a que el complemento puede contener una secuencia de ácido nucleico que forma interacciones óptimas con la molécula de ácido nucleico original, tal complemento puede unirse con alta afinidad a su molécula original.
Con respecto a los ácidos nucleicos monocatenarios, en particular los oligonucleótidos, el término «específicamente hibridante» se refiere a la asociación entre dos moléculas de nucleótidos monocatenarios de secuencia suficientemente complementaria como para permitir tal hibridación en condiciones predeterminadas generalmente utilizadas en la técnica (a veces, denominada «sustancialmente complementaria»). En particular, el término se refiere a la hibridación de un oligonucleótido con una secuencia sustancialmente complementaria contenida dentro de una molécula de ADN o ARN monocatenario con la exclusión sustancial de la hibridación del oligonucleótido con ácidos nucleicos monocatenarios de secuencia no complementaria. Por ejemplo, la hibridación específica puede referirse a una secuencia que hibrida con cualquier ácido nucleico marcador específico de anomalía linfática, pero no hibrida con otros nucleótidos. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, los marcadores específicos de anomalías linfáticas que se muestran en las Tablas contenidas en esta solicitud. Las condiciones apropiadas que permiten la hibridación específica de moléculas de ácido nucleico monocatenario de complementariedad variable son bien conocidas en la técnica.
Por ejemplo, a continuación se expone una fórmula común para calcular las condiciones de astringencia necesarias para lograr la hibridación entre moléculas de ácido nucleico de una homología de secuencia específica según se establece a continuación (Sambrook y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989):
Tm= 81,5 ° C 16,6Log [Na+] 0,41(%G+C) - 0,63 (%formamida) - 600/#bp de un dúplex
como una ilustración de la fórmula anterior, mediante el uso de [Na+] = [0,368] y formamida al 50%, con un contenido de GC del 42% y un tamaño de sonda promedio de 200 bases, la Tm es 57°C. La Tm de un dúplex de ADN disminuye de 1 a 1,5 ° C con cada 1% de disminución de la homología. Por tanto, las dianas con más de aproximadamente el 75% de identidad de secuencia se observarían usando una temperatura de hibridación de 42°C. La astringencia de la hibridación y el lavado dependen principalmente de la concentración de sal y la temperatura de las soluciones. En general, para maximizar la velocidad de hibridación de la sonda con su diana, la hibridación se lleva a cabo normalmente a condiciones de sal y temperatura que son de 20-25°C por debajo de la Tm calculada del híbrido. Las condiciones de lavado deben ser lo más astringentes posible para el grado de identidad de la sonda para la diana. En general, las condiciones de lavado se seleccionan para estar aproximadamente 12-20°C por debajo de la Tm del híbrido. Con respecto a la presente invención, una hibridación de astringencia moderada se define como astringencia en 6X SSC, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5% y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42°C y lavado en 2X SSC y SDS al 0,5% a 55°C durante 15 minutos. La hibridación de astringencia alta se define como hibridación en 6X SSC, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5% y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42°C y lavado en 1X SSC y SDS al 0,5% a 65°C durante 15 minutos. Una hibridación de astringencia muy alta se define como hibridación en 6X SSC, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5% y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42°C y lavado en 0,1X SSC y SDS al 0,5% a 65°C durante 15 minutos.
El término «oligonucleótido», como se usa en esta solicitud, se define como una molécula de ácido nucleico compuesta por dos o más ribo o desoxirribonucleótidos, preferiblemente más de tres. El tamaño exacto del oligonucleótido dependerá de varios factores y de la aplicación y el uso particulares del oligonucleótido. Los oligonucleótidos, que incluyen sondas y cebadores, pueden tener cualquier longitud desde 3 nucleótidos hasta la longitud completa de la molécula de ácido nucleico, e incluir explícitamente cada número posible de ácidos nucleicos contiguos desde 3 hasta la longitud completa del polinucleótido. Preferiblemente, los oligonucleótidos tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos de longitud, más preferiblemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud.
El término «sonda», como se usa en esta solicitud, se refiere a un oligonucleótido, polinucleótido o ácido nucleico, ya sea ARN o ADN, ya sea de origen natural como en un hidrolizado de enzima de restricción purificado o producido sintéticamente, que es capaz de hibridar o hibridar específicamente con un ácido nucleico con secuencias complementarias a la sonda. Una sonda puede ser mono o bicatenaria. La longitud exacta de la sonda dependerá de muchos factores, incluida la temperatura, la fuente de la sonda y el uso del procedimiento. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, la sonda de oligonucleótidos (en ciertos casos, ácidos nucleicos asociados con un número rs específico asociado con un polimorfismo de un solo nucleótido disponible en la base de datos dbSNP) normalmente contiene 15-25, 15 -35, 20-50 o 100 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos, siempre que el sitio de la SNV esté incluido en la sonda. Las sondas en esta solicitud se seleccionan para que sean complementarias a diferentes cadenas de una secuencia de ácido nucleico diana particular. Esto significa que las sondas deben ser suficientemente complementarias para poder «hibridar específicamente» o hibridar con sus respectivas cadenas diana en un conjunto de condiciones predeterminadas. Por lo tanto, la secuencia de la sonda no necesita reflejar la secuencia complementaria exacta de la diana. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario puede unirse al extremo 5 'o 3' de la sonda, siendo el resto de la secuencia de la sonda complementaria a la cadena diana. Alternativamente, se pueden intercalar bases no complementarias o secuencias más largas en la sonda, siempre que la secuencia de la sonda tenga suficiente complementariedad con la secuencia del ácido nucleico diana para hibridar con ella específicamente.
El término «cebador», como se usa en esta solicitud, se refiere a un oligonucleótido, ya sea ARN o ADN, ya sea monocatenario o bicatenario, derivado de un sistema biológico, generado por digestión con enzimas de restricción o producido sintéticamente que, cuando se coloca en el entorno adecuado, es capaz de actuar funcionalmente como un iniciador de la síntesis de ácido nucleico dependiente de plantilla. Cuando se presenta con una plantilla de ácido nucleico apropiada, precursores de nucleósido trifosfato adecuados de ácidos nucleicos, una enzima polimerasa, cofactores adecuados y condiciones tales como una temperatura y pH adecuados, el cebador puede extenderse en su extremo 3' mediante la adición de nucleótidos mediante la acción de una polimerasa o actividad similar para producir un producto de extensión de cebador. La imprimación puede variar en longitud dependiendo de las condiciones particulares y el requisito de la aplicación. Por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico, el cebador oligonucleotídico tiene normalmente 15-25, 15-40, 20-50, etc. o más nucleótidos de longitud. El cebador debe ser lo suficientemente complementario con la plantilla deseada como para cebar la síntesis del producto de extensión deseado, es decir, para poder hibridar con la cadena plantilla deseada de una manera suficiente como para proporcionar el resto hidroxilo 3' del cebador en una yuxtaposición apropiada para su uso en el inicio de la síntesis por una polimerasa o enzima similar. No es necesario que la secuencia del cebador represente un complemento exacto de la plantilla deseada. Por ejemplo, se puede unir una secuencia de nucleótidos no complementaria al extremo 5' de un cebador que de otro modo sería complementario. Alternativamente, las bases no complementarias se pueden intercalar dentro de la secuencia del cebador oligonucleotídico, siempre que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena plantilla deseada para proporcionar funcionalmente un complejo plantilla-cebador para la síntesis del producto de extensión.
Se ha descrito la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en las patentes estadounidenses núms. 4.683.195, 4.800.195 y 4.965.188.
Un «ARNip» se refiere a una molécula involucrada en el procedimiento de interferencia del ARN para un silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia o desactivación de genes al proporcionar ARN interferentes pequeños (ARNip) que tienen homología con la secuencia del gen diana. Los ARN de interferencia pequeños (ARNip) pueden sintetizarse in vitro o generarse mediante la escisión de la ribonucleasa III a partir de ARNbc más largo y son los mediadores de la degradación del ARNm específico de secuencia. Preferiblemente, las moléculas de ARNip se pueden sintetizar químicamente utilizando ribonucleósido fosforamiditas protegidas adecuadamente y un sintetizador de ADN/ARN convencional. El ARNip se puede sintetizar como dos moléculas de ARN complementarias separadas o como una sola molécula de ARN con dos regiones complementarias. Los proveedores comerciales de moléculas de ARN sintético o reactivos de síntesis incluyen Applied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.), Proligo (Hamburgo, Alemania), Dharmacon Research (Lafayette, Colorado, EE. UU.), Pierce Chemical (parte de Perbio Science, Rockford, Ill. ., EE. Uu .), Glen Research (Sterling, Va., EE. UU.), ChemGenes (Ashland, Mass., EE. UU.) y Cruachem (Glasgow, Reino Unido). Las construcciones de ARNip específicas para inhibir el ARNm de linfangiomatosis, por ejemplo, pueden tener entre 15 y 35 nucleótidos de longitud y, más normalmente, aproximadamente 21 nucleótidos de longitud.
El término «vector» se refiere a una molécula de ácido nucleico circular monocatenario o bicatenario que puede infectarse, transfectarse o transformarse en células y replicarse de forma independiente o dentro del genoma de la cédula hospedadora. Se puede cortar una molécula circular de ácido nucleico bicatenario y, por tanto, linealizarla tras el tratamiento con enzimas de restricción. Una variedad de vectores, enzimas de restricción y el conocimiento de las secuencias de nucleótidos que son la diana de las enzimas de restricción están fácilmente a disposición de los expertos en la técnica, e incluyen cualquier replicón, como un plásmido, cósmido, bácmido, fago o virus, al cual se puede unir otra secuencia o elemento genético (ya sea ADN o ARN) para provocar la replicación de la secuencia o elemento unido. Se puede insertar una molécula de ácido nucleico en un vector cortando el vector con enzimas de restricción y uniendo las dos piezas. Cuando se clona una región genética que contiene una duplicación o una deleción, el experto en la técnica es muy consciente de que en el procedimiento de clonación se emplearían secuencias flanqueantes secuencia arriba y secuencia abajo de la región afectada de una longitud adecuada (por ejemplo, entre 50-100 o más nucleótidos). Tales vectores tendrían utilidad, por ejemplo, en líneas celulares para estudiar los efectos que tales alteraciones tienen sobre las proteínas codificadas.
Hay muchas técnicas disponibles para los expertos en la técnica para facilitar la transformación, transfección o transducción de la construcción de expresión en un organismo procariota o eucariota. Los términos «transformación», «transfección» y «transducción» se refieren a procedimientos para insertar un ácido nucleico y/o una construcción de expresión en una célula u organismo hospedador. Estos procedimientos implican una variedad de técnicas, como tratar las células con altas concentraciones de sal, un campo eléctrico o detergente, para hacer que la pared o membrana externa de la cédula hospedadora sea permeable a las moléculas de ácido nucleico de interés, microinyección, fusión de PEG y similares.
La expresión «elemento promotor» describe una secuencia de nucleótidos que se incorpora a un vector que, una vez dentro de una célula apropiada, puede facilitar el factor de transcripción y/o la unión de polimerasa y posterior transcripción de partes del ADN del vector en el ARNm. En una realización, el elemento promotor precede al extremo 5' de la molécula de ácido nucleico marcador específico de anomalía linfática, de modo que este último se transcriba en el ARNm. La maquinaria de la cédula hospedadora a continuación traduce el ARNm en un polipéptido. Los elementos promotores pueden impulsar la expresión constitutiva o inducible de una región codificante de interés.
Los expertos en la técnica reconocerán que un vector de ácido nucleico puede contener elementos de ácido nucleico distintos del elemento promotor y el ácido nucleico que codifica el marcador específico de anomalía linfática. Estos otros elementos de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, orígenes de replicación, sitios de unión ribosómica, secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas de resistencia a fármacos o enzimas metabólicas de aminoácidos, y secuencias de ácido nucleico que codifican señales de secreción, señales de localización o señales útiles para purificación de polipéptidos.
Un «replicón» es cualquier elemento genético, por ejemplo, un plásmido, cósmido, bácmido, plastidio, fago o virus, que es capaz de replicarse en gran parte bajo su propio control. Un replicón puede ser ARN o ADN y puede ser monocatenario o bicatenario.
Un «operón de expresión» se refiere a un segmento de ácido nucleico que puede poseer secuencias de control de transcripción y traducción, tales como promotores, potenciadores, señales de inicio de traducción (por ejemplo, codones ATG o AUG), señales de poliadenilación, terminadores, y similares, y que facilitan la expresión de una secuencia codificante de polipéptidos en una célula u organismo hospedador.
Como se usa en esta solicitud, los términos «indicador», «sistema indicador», «gen indicador» o «producto del gen informador» significarán un sistema genético operativo en el que un ácido nucleico comprende un gen que codifica un producto que cuando se expresa produce una señal indicadora que se puede medir fácilmente, por ejemplo, mediante ensayo biológico, inmunoensayo, radioinmunoensayo o mediante procedimientos colorimétricos, fluorogénicos, quimioluminiscentes u otros. El ácido nucleico puede ser ARN o ADN, lineal o circular, mono o bicatenario, con polaridad antisentido o sentido, y está operativamente vinculado a los elementos de control necesarios para la expresión del producto del gen indicador. Los elementos de control requeridos variarán según la naturaleza del sistema indicador y si el gen indicador está en forma de ADN o ARN, pero pueden incluir, entre otros, elementos tales como promotores, potenciadores, secuencias de control de traducción, señales de poli A adición, señales de terminación de la transcripción y similares.
El ácido nucleico introducido puede o no estar integrado (vinculado covalentemente) en el ácido nucleico de la célula u organismo receptor. En células de bacterias, levaduras, plantas y mamíferos, por ejemplo, el ácido nucleico introducido puede mantenerse como un elemento episomal o replicón independiente, tal como un plásmido. Como alternativa, el ácido nucleico introducido puede integrarse en el ácido nucleico de la célula u organismo receptor y mantenerse de forma estable en esa célula u organismo y a continuación transmitirse adicionalmente o heredarse por células de la progenie u organismos de la célula u organismo receptor. Por último, el ácido nucleico introducido puede existir en la célula receptora u organismo hospedador solo de forma transitoria.
La expresión «gen marcador seleccionable» se refiere a un gen que cuando se expresa confiere un fenotipo seleccionable, tal como resistencia a antibióticos, en una célula transformada.
La expresión «ligado de forma operativa» significa que se colocan las secuencias de regulación necesarias para la expresión de la secuencia codificante en la molécula de ADN en las posiciones adecuadas respecto a la secuencia codificante para producir la expresión de la secuencia codificante. Esta misma definición se aplica a veces a la disposición de unidades de transcripción y otros elementos de control de transcripción (por ejemplo, potenciadores) en un vector de expresión.
Los términos «organismo recombinante» u «organismo transgénico» se refieren a organismos que tienen una nueva combinación de genes o moléculas de ácido nucleico. Puede introducirse una nueva combinación de genes o moléculas de ácido nucleico en un organismo utilizando una amplia gama de técnicas de manipulación de ácidos nucleicos disponibles para los expertos en la técnica. El término «organismo» se refiere a cualquier ser vivo compuesto por al menos una célula. Un organismo puede ser tan simple como una célula eucariota o tan complejo como un mamífero. Por lo tanto, la expresión «un organismo recombinante» abarca una célula recombinante, así como un organismo eucariota y procariota. Los organismos transgénicos ejemplares incluyen el pez cebra o los ratones.
La expresión «proteína aislada» o «proteína aislada y purificada» se usa a veces en esta solicitud. Esta expresión se refiere principalmente a una proteína producida por la expresión de una molécula de ácido nucleico aislada. Alternativamente, esta expresión puede referirse a una proteína que ha sido suficientemente separada de otras proteínas con las que estaría asociada de forma natural, de modo de existir en forma «sustancialmente pura». «Aislado» no pretende excluir mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos o materiales, o la presencia de impurezas que no interfieran con la actividad fundamental y que puedan estar presentes, por ejemplo, debido a una purificación incompleta, adición de estabilizadores, o combinación con, por ejemplo, preparaciones inmunogénicas o preparaciones farmacéuticamente aceptables.
Un «par de unión específico» comprende un miembro de unión específico (sbm) y un compañero de fijación (bp) que tienen una especificidad particular entre sí y que en condiciones normales se unen entre sí con preferencia a otras moléculas. Ejemplos de pares de unión específicos son antígenos y anticuerpos, ligandos y receptores y secuencias de nucleótidos complementarias. El experto en la técnica conoce muchos otros ejemplos. Además, la expresión «par de unión específico» también es aplicable cuando uno o ambos del miembro de unión específico y el compañero de fijación comprenden una parte de una molécula grande. En realizaciones en las que el par de unión específico comprende secuencias de ácido nucleico, tendrán una longitud para hibridar entre sí en las condiciones del ensayo, preferiblemente de más de 10 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de más de 15 o 20 nucleótidos de longitud.
«Muestra» o «muestra del paciente» o «muestra biológica» generalmente se refiere a una muestra que puede analizarse para una molécula particular, preferiblemente una molécula marcadora específica de anomalía linfática, como un marcador que se muestra en las tablas proporcionadas a continuación. Las muestras pueden incluir, de modo no taxativo, células, fluidos corporales, incluida sangre, suero, plasma, orina, linfa, saliva, lágrimas, fluido pleural y similares.
La «información de la secuencia del genotipo» generalmente se refiere a cualquier información relacionada con la secuencia del ADN o ARN de un sujeto. La información de la secuencia del genotipo comprende el genoma completo, la secuenciación del exoma completo, la secuenciación del exoma o la secuenciación dirigida de áreas de interés dentro del genoma de un sujeto. La información de la secuencia del genotipo también puede incluir la generación de datos sobre la presencia o ausencia de SNV específicas, tales como las que se encuentran en esta solicitud asociadas con anomalías linfáticas. Además, la información de la secuencia del genotipo incluiría el uso de sondas para detectar la presencia y/o expresión de una o más SNV asociadas a anomalías linfáticas. Los ejemplos de cómo se pueden usar las sondas para obtener información de la secuencia del genotipo incluyen, de modo no taxativo: (1)hibridación insitu; (2) hibridación del sur (3) hibridación del norte; y (4) reacciones de amplificación variadas como las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR).
Los términos «agente» y «compuesto de prueba» se usan indistintamente en esta solicitud e indican un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos como células o tejidos de bacterias, plantas, hongos o animales (particularmente de mamíferos). Las macromoléculas biológicas incluyen ARNip, ARNhp, oligonucleótidos antisentido, péptidos, complejos de péptidos/ADN, y cualquier molécula basada en ácido nucleico que exhiba la capacidad de modular la actividad de los ácidos nucleicos que contienen SNV descritos en esta solicitud o sus proteínas codificadas. Los agentes ejemplares incluyen al menos un inhibidor de mTOR, al menos un inhibidor de PIK3K, y/o al menos un inhibidor de MEK. Los agentes ejemplares también incluyen los enumerados en las Tablas 1-2. Se evalúa la actividad biológica potencial de los agentes mediante su inclusión en los ensayos de selección descritos a continuación en esta solicitud.
El término «tratamiento», como se usa en esta solicitud, cubre cualquier administración o aplicación de un agente terapéutico para una enfermedad en un mamífero, incluido un ser humano, e incluye inhibir la enfermedad o la evolución de la enfermedad, inhibir o ralentizar la enfermedad o su evolución, detener su desarrollo, aliviar la enfermedad total o parcialmente, impedir la aparición de la enfermedad, o impedir la reaparición de los síntomas de la enfermedad. Los tratamientos ejemplares incluyen la administración de al menos un inhibidor de mTOR, al menos un inhibidor de PIK3K, y/o al menos un inhibidor de MEK (por ejemplo, al menos uno de los agentes enumerados en las Tablas 1-2) a dosis eficaces.
Los términos «inhibición» o «inhibir» se refieren a una disminución o cese de cualquier evento (como la unión de ligando de proteína) o a una disminución o cese de cualquier característica fenotípica o a la disminución o cese en la incidencia, grado o probabilidad de esa característica. «Reducir» o «inhibir» es disminuir, reducir o detener una actividad, función, y/o cantidad en comparación con una referencia. No es necesario que la inhibición o reducción sea completa. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, «reducir» o «inhibir» se refiere a la capacidad de provocar una disminución global del 20% o más. En otra realización, «reducir» o «inhibir» se refiere a la capacidad de provocar una disminución global del 50% o más. En aun otra realización, «reducir» o «inhibir» se refiere a la capacidad de provocar una disminución global del 75%, 85%, 90%, 95% o más.
El término «inhibidor» se refiere a un agente que ralentiza o previene una reacción química, vía de señalización u otro procedimiento, o que reduce la actividad de un reactivo, catalizador o enzima particular.
Los términos «sujeto» y «paciente» se usan indistintamente para significar un mamífero, incluido un ser humano.
El término «mTOR» se refiere a la diana de mamífero de rapamicina codificada por mTOR. mTOR puede asociarse en complejos con otras proteínas para permitir funciones celulares críticas. El término "mTORC" se refiere a la diana de mamífero del complejo 1 de rapamicina, también conocida como diana mecanicista del complejo 1 de rapamicina, que es un complejo proteico que funciona para activar la traducción de proteínas. Por ejemplo, mTORC1 comprende mTOR, proteína asociada a la regulación de mTOR (Raptor), letal para mamíferos con la proteína 8 SEC13 (MLST8), PRAS40 y DEPTOR. En otro ejemplo, el complejo mTORC2 comprende mTOR, compañero de mTOR insensible a rapamicina (RICTOR), GpL, proteína de interacción de proteína cinasa activada por estrés de mamíferos 1 (mSIN1), Protor 1/2, DEPTOR, TTI1 y TEL2. Cualquier complejo de proteínas que comprenda mTOR puede denominarse en esta solicitud mTORC. El término "señalización de mTOR" se referiría a la actividad de mTOR, mTORC1 y MTORC2, junto con otras proteínas que se sabe que interactúan en complejos con estas proteínas.
El término «inhibidor de mTORC» se refiere a una clase de agentes que inhiben el objetivo mecanicista de la rapamicina (mTOR), que es una proteína cinasa específica de serina/treonina que pertenece a la familia de cinasas relacionadas con fosfatidilinositol-3 cinasas (PI3K) (PIKK). mTOR regula el metabolismo, el crecimiento y la proliferación celular mediante la formación y señalización a través de dos complejos de proteínas, mTORC1 y mTORC2. Los inhibidores de mTOR más establecidos se denominan rapálogos (rapamicina y sus análogos). Se enumeran varios rapálogos en las Tablas 1 y 2.
El término «PIK3K» o «PI3K» se utilizan indistintamente en esta solicitud para referirse a fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-cinasa (también llamada fosfatidilinositido 3-cinasas, fosfatidilinositol-3-cinasas, PI 3-cinasas, PI (3 ) Ks, PI-3Ks. PI3K (s)) son una familia de enzimas implicadas en funciones celulares como el crecimiento celular, proliferación, diferenciación, motilidad, supervivencia y tráfico intracelular, que a su vez están implicadas en el cáncer. Las PI3K son enzimas transductoras de señales que regulan las enzimas intracelulares capaces de fosforilar el grupo hidroxilo de 3 posiciones del anillo de inositol del fosfatidilinositol (PtdIns).
La expresión «inhibidor de PIK3K» o «inhibidor de PI3K» se refiere a una clase de agentes que funciona inhibiendo una o más de las enzimas fosfoinositoide 3-cinasas, que son parte de la vía de PI3K/AKT/mTOR, una vía de señalización importante para muchas funciones celulares como el control del crecimiento, el metabolismo y el inicio de la traducción. Dentro de esta vía hay muchos componentes, cuya inhibición puede dar como resultado la supresión del tumor. Estos medicamentos contra el cáncer son ejemplos de terapia dirigida. Hay varias clases e isoformas diferentes de PI3K. Las PI3K de clase 1 tienen una subunidad catalítica conocida como p110, con cuatro tipos (isoformas): p110 alfa, p110 beta, p110 gamma y p110 delta.
El término «MEK» se refiere a la vía de MAPK/ERK (también conocida como vía de Ras-Raf-MEK-ERK) que comprende una cadena de proteínas en la célula que comunican una señal de un receptor en la superficie de la célula al ADN en el núcleo de la célula. La señal comienza cuando una molécula de señalización se une al receptor en la superficie celular y termina cuando el ADN en el núcleo expresa una proteína y produce algún cambio en la célula, como la división celular. La vía incluye muchas proteínas, incluida MAPK (proteínas cinasas activadas por mitógenos, originalmente llamadas ERK, cinasas reguladas por señales extracelulares), que se comunican agregando grupos fosfato a una proteína vecina, que actúa como un interruptor de encendido o apagado.
La expresión «inhibidor de MEK» o «inhibidor de MEK/ERK» se refiere a un agente que inhibe las enzimas proteína cinasa activadas por mitógenos MEK1, MEK2, y/o ERK. Pueden usarse para afectar la vía MAPK/ERK que a menudo es hiperactiva en algunos cánceres. La expresión «señalización celular» comprendería la señalización de mTOR así como cualquier otro procedimiento de la vía de transducción de señales que gobierne la homeostasis o la actividad de las células.
Diagnóstico de pacientes con anomalías linfáticas
En algunas realizaciones, se diagnostica a los pacientes con anomalías linfáticas con base en la presencia de una SNV después de obtener información sobre la secuencia del genotipo de una muestra biológica obtenida de un paciente. En algunas realizaciones, se diagnostica a los pacientes con anomalías linfáticas con base en la detección de la presencia de una o más SNV en un gen seleccionado de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF, o una SNV en desequilibrio de ligamiento con una SNV en un gen seleccionado de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF asociado con anomalía linfática. después de obtener información sobre la secuencia del genotipo de una muestra biológica obtenida de un paciente. En algunas realizaciones, esta una o más SNV en un gen seleccionado de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF es c.2334+1G>C en EPHB4; c.3481A>G:p.S1161G en PIK3R4; c.1393-7C>T en PIK3R6; c.6818A>G:p.P2273L en mTOR; o c.640T>C:p.S214P en ARAF.
En algunas realizaciones, se puede generar un informe que identifica las SNV presentes en un sujeto particular a partir de datos experimentales. En algunas realizaciones, se puede generar un informe que identifica el o los tratamientos sugeridos para la anomalía linfática con base en los datos de las SNV identificadas usando información de secuencia de genotipo.
En algunas realizaciones, el diagnóstico se basa en la detección de la presencia de una o más SNV en un gen seleccionado de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF, o una SNV en desequilibrio de ligamiento con una SNV en un gen seleccionado de EPHB4, PIK3R4 , PIK3R6, mTOR y ARAF, después de obtener la información de la secuencia del genotipo de una muestra biológica obtenida de un paciente que guía la elección del tratamiento para el paciente. En algunas realizaciones, el diagnóstico se basa en la detección de la presencia de una o más SNV en un gen seleccionado de EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF, o una SNV en desequilibrio de ligamiento con una SNV en un gen seleccionado de EPHB4, PIK3R4 , PIK3R6, mTOR y ARAF, después de obtener la información de la secuencia del genotipo de una muestra biológica obtenida de un paciente que no guía ni afecta la elección del tratamiento para el paciente.
En algunas realizaciones, el diagnóstico de una anomalía linfática se realiza únicamente en función de la presentación clínica, los resultados de la exploración, y/o la historia familiar. En algunas realizaciones, el diagnóstico de una anomalía linfática se realiza sin someter a prueba la información de la secuencia genética. En algunas realizaciones, el diagnóstico de una anomalía linfática se realiza con base en la presentación clínica junto con la información de la secuencia genética.
Las SNV relacionadas con anomalías linfáticas descritas en esta invención pueden usarse de varias formas para diagnosticar anomalías linfáticas.
Por ejemplo, los ácidos nucleicos que comprenden SNV asociados a anomalías linfáticas pueden usarse como sondas para detectar la presencia y/o expresión de marcadores específicos de anomalías linfáticas. Los procedimientos en los que se pueden utilizar ácidos nucleicos marcadores asociados a anomalías linfáticas como sondas para tales ensayos incluyen, de modo no taxativo: (1)hibridación insitu; (2) hibridación del sur (3) hibridación del norte; y (4) reacciones de amplificación variadas como las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR).
Además, los ensayos para detectar SNV asociadas a anomalías linfáticas, o las proteínas codificadas por estas, pueden realizarse en cualquier tipo de muestra biológica, incluidos, entre otros, fluidos corporales (incluida sangre, orina, suero, lavado gástrico), cualquier tipo de célula (como células cerebrales, glóbulos blancos, células mononucleares) o tejido corporal.
Los ácidos nucleicos que contienen SNV asociadas a anomalías linfáticas, los vectores que expresan las mismas, las proteínas marcadoras que contienen SNV asociadas a anomalías linfáticas y los anticuerpos marcadores específicos de anomalías antilinfáticas se pueden utilizar para detectar SNV asociadas a anomalías linfáticas en tejidos corporales, células o líquido y alteran la expresión de la proteína marcadora que contiene SNV asociada a anomalías linfáticas con el fin de detectar y diagnosticar anomalías linfáticas.
Quedan abarcados los procedimientos para detectar y/o diagnosticar anomalías linfáticas basadas en SNV asociadas a anomalías linfáticas. El procedimiento puede comprender detectar SNV asociadas a anomalías linfáticas, la SNV asociada a anomalías linfáticas que contiene ácido nucleico en la muestra se amplificará inicialmente, por ejemplo, usando PCR, para aumentar la cantidad de plantillas en comparación con otras secuencias presentes en la muestra. Esto permite que las secuencias diana se detecten con un alto grado de sensibilidad si están presentes en la muestra. Esta etapa inicial puede evitarse utilizando técnicas de matriz altamente sensibles que son cada vez más importantes en la técnica.
Alternativamente, las nuevas tecnologías de detección pueden superar esta limitación y permitir el análisis de muestras pequeñas que contienen tan solo 1 pg de ARN total. Al utilizar la tecnología de dispersión de luz por resonancia (RLS), a diferencia de las técnicas tradicionales de fluorescencia, las lecturas múltiples pueden detectar cantidades bajas de ARNm utilizando dianas hibridadas marcadas con biotina y anticuerpos antibiotina. Otra alternativa a la amplificación por PCR implica la tecnología de guía de ondas planas (PWG) para aumentar las relaciones señal a ruido y reducir la interferencia de fondo. Ambas técnicas son comercializadas por Qiagen Inc. (EE. UU.).
Por tanto, puede usarse cualquiera de las técnicas mencionadas anteriormente para detectar o cuantificar la expresión del marcador de SNV asociada a anomalías linfáticas y, en consecuencia, para diagnosticar anomalías linfáticas o un riesgo de desarrollo de las mismas.
Tratamiento de pacientes con anomalías linfáticas
La elucidación del papel que desempeñan las SNV asociadas a anomalías linfáticas descritas en esta solicitud en la modulación del fenotipo de anomalía linfática facilita la reutilización de tratamientos existentes y el desarrollo de nuevos tratamientos, útiles para el tratamiento de anomalías linfáticas. En algunas realizaciones, la invención comprende administrar uno o más inhibidores de mTOR, uno o más inhibidores de PIK3K, y/o uno o más inhibidores de MEK (por ejemplo, uno o más de los agentes de las Tablas 1-2) a un paciente que tiene una anomalía linfática.
En algunas realizaciones, se ha diagnosticado al paciente una anomalía linfática que tratar en función de síntomas y antecedentes familiares positivos de anomalías linfáticas. En algunas realizaciones, se utiliza una variedad de tecnologías de exploración, tales como radiografía de película simple, exploración ósea, tomografía computarizada, formación de imágenes por resonancia magnética y linfogammagrafía junto con la presentación clínica para diagnosticar una anomalía linfática. En algunas realizaciones, se realiza una biopsia para diagnosticar una anomalía linfática. En algunas realizaciones, se diagnostica una anomalía linfática con base en el crecimiento excesivo de los vasos linfáticos. En algunas realizaciones, se diagnostica una anomalía linfática con base en la formación anormal de vasos linfáticos. En algunas realizaciones, se diagnostica una anomalía linfática basada en quilotórax, incluidos derrames pericárdicos, pleurales o peritoneales.
En algunas realizaciones, el paciente con una anomalía linfática que tratar ha sido diagnosticado según los procedimientos de diagnóstico descritos en esta solicitud.
En algunas realizaciones, uno o más inhibidores de mTOR, uno o más inhibidores de PIK3K, y/o uno o más inhibidores de MEK (por ejemplo, uno o más de los agentes de las Tablas 1-2) son útiles en la preparación de un medicamento para tratar anomalías linfáticas. El uno o más agentes pueden formularse con un excipiente, vehículo, tampón, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables conocidos por los expertos en la técnica. Tales materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material puede depender de la vía de administración, por ejemplo, vía oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, aerosolizada, intramuscular e intraperitoneal.Pueden usarse sistemas in vitro u organismos transgénicos que comprenden mutaciones asociadas a anomalías linfáticas para seleccionar un agente particular para el tratamiento de seres humanos.
Los agentes útiles para el tratamiento incluyen, de modo no taxativo, los agentes de las Tablas 1 y 2. Algunos agentes se enumeran tanto en la Tabla 1 como en la 2, y al hecho de que no se enumeren en ambas tablas no debe adjudicársele ningún significado.
Tabla 1
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ambos complejos mTOR con >10- y selectividad 100 veces • Nat Chem Biol, 2013, 9(11 ):708-14 mayor para mTOR que PI3K6 o PI3Ka/p/Y,
respectivamente. • Autophagy, 2012, 8(6):903-14 Tacrolimus Tacrolimus (FK506) es una lactona macrólido de 23 • Biomed Pharmacother, 2013, (FK506) miembros, reduce la actividad de la peptidil-prolil 67(6):469-73
isomerasa en las células T al unirse a la inmunofilina
FKBP12 (proteína de unión FK506) creando un nuevo • Universidad de Cantabria, 2012, complejo. Garcia Diaz
• Biochim Biophys Acta, 2012, 1833(3):652-62
Selumetinib Selumetinib (AZD6244) es un inhibidor de MEK1 potente y • Nature, 2012, 487(7408):505-9 (AZD6244) altamente selectivo con una CI50 de 14 nM en ensayos sin
células, también inhibe la fosforilación de ERK1/2 con una • Nature, 2010, 468(7326):968-72 CI50 de 10 nM, sin inhibición de p38a, MKK6, EGFR,
ErbB2, ERK2, B-Raf, etc. • Nature, 2016, 10.1038/nature19347
PD0325901 PD0325901 es un inhibidor de MEK selectivo y no • Nature, 2015, 10.1038/nature14413 competitivo con ATP con una CI50 de 0,33 nM en ensayos
sin células, aproximadamente 500 veces más potente que • Nature, 2015, 517(7534):391-5
Figure imgf000017_0001
CI-1040 en la fosforilación de ERK1 y ERK2. Fase 2 • Cell, 2015, 160(1-2):161-76
Trametinib Trametinib (GSK1120212) es un inhibidor de MEK1/2 muy • Nature, 2015, 517(7534):391-5 (GSK1120212) específico y potente con una CI50 de 0,92 nM/1,8 nM en
ensayos sin células, sin inhibición de las actividades cinasa •Nature, 2014, 510(7504):283-7 de c-Raf, B-Raf, ERK1/2. • Nature, 2014, 508(7494): 118-22
PD184352 (CI- PD184352 (CI-1040) es un inhibidor de MEK1/2 no •Science, 2011, 331(6019):912-6 1040) competitivo con ATP con una CI50 de 17 nM en ensayos
basados en células, 100 veces más selectivo para MEK1/2 • Nat Genet, 2011, 44(2): 133-9 que para MEK5. Fase 2 • Cancer Cell, 2016, 10.1016/j .ccell.2016.01.006
Pimasertib Pimasertib (AS-703026) es un inhibidor alostérico
(AS-703026) altamente selectivo, potente, no competitivo con ATP de • Nat Commun, 2015, 6:6683 FASEB J, 2014, 10.1096/fj. 13-247924 MEK1/2 con una CI50 de 5 nM-2 pM en líneas celulares Oncotarget, 2016, 7(4):4265-78 MM. Fase 2
TAK-733 TAK-733 es un inhibidor del sitio alostérico de MEK potente • Nat Commun, 2016, 7:13701
y selectivo para MEK1 con una CI50 de 3,2 nM, inactivo
para Abl1, AKT3, c-RAF, CamK1, CDK2, c-Met, etc. • Oncotarget, 2014, 5(20):9609-18
• Mol Cancer Ther, 2014, 13(2):353-63
AZD8330 AZD8330 es un inhibidor de MEK 1/2 novedoso, selectivo •Cell, 2012, 32(34):4034-42
y competitivo con ATP con una CI50 de 7 nM.
• Oncotarget, 2016, 7(13): 16273-81
Binimetin Binimetinib (MEK 162, ARRY-162, ARRY-438162) es un • Stem Cells, 2015,
(MEK162 potente inhibidor de MEK1/2 con una CI50 de 12 nM en un 10.1002/stem.1990
ARRY-16 ensayo sin células.
ARRY-43 • Mol Oncol, 2014, 8(3):544-54 162) • Tumour Biol, 2015, 10.1007/sl3277-015-3244-2
SL-327 SL327 es un inhibidor selectivo para MEK1/2 con una CI50
de 0,18 pM / 0,22 pM, sin actividad hacia Erk1, MKK3, • Psychopharmacology (Berl). 2011 MKK4, c-JUN, PKC, PKA o CamKII; capaz de Jul;216():63-73.
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transportarse a través de la barrera hematoencefálica.
Refametinib Refametinib (RDEA119, Bay 86-9766) es un inhibidor • J Neurosci, 2012, 32(14):4887-900 (RDEA119, potente, no competitivo con ATP y altamente selectivo de
Bay 86-9766) MEK1 y MEK2 con una CI50 de 19 nM y 47 nM, • EBioMedicine, 2017, 15:90-99 respectivamente. • Am J Cancer Res, 2016,
6(10):2235-2251
Cobimetinib Cobimetinib (GDC-0973, RG7420) es un inhibidor de •Cancer Discov, 2015,
(GDC-0973, MEK1 potente y altamente selectivo con una CI50 de 4,2 10.1158/2159-8290.CD-15-0913
Figure imgf000018_0001
La Tabla 2 proporciona agentes que pueden usarse solos o en combinación con cualquiera de los agentes en la Tabla 1 o en la Tabla 2 para tratar anomalías linfáticas.
Tabla 2
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Para tratar a un individuo que tiene una anomalía linfática, o para aliviar un signo o síntoma de la enfermedad, se pueden administrar agentes adecuados dirigidos a los genes descritos en esta solicitud en combinación para proporcionar un beneficio terapéutico al paciente. Tales agentes deben administrarse en una dosis efectiva.
Una vez que la o las alteraciones genéticas se identifican, se diseña el tratamiento para modular las vías biológicas y de señalización afectadas por el gen alterado. Por ejemplo, los inhibidores de mTOR pueden usarse solos o en combinación con inhibidores de mTOR adicionales. De manera similar, los inhibidores de PIK3K se pueden usar solos o en combinación con cualquiera de los inhibidores de PIK3K enumerados anteriormente. En los casos donde sea deseable inhibir las vías de MAPK (MEK1/MEK2) y ERK, los inhibidores de MEK pueden usarse solos o en combinación con otros inhibidores de MEK/ERK. En determinadas realizaciones, el tratamiento implica la administración de un inhibidor de mTOR junto con un inhibidor de PIK3K. En otras realizaciones, se combinan los inhibidores de mTOR y MEK/ERK para proporcionar un beneficio terapéutico al paciente. En otro enfoque, los inhibidores de PIK3K y MEK/ERK se combinan para mejorar los síntomas de la enfermedad. Para la mutación específica de ganancia de función de ARAF descrita en esta solicitud, un tratamiento efectivo comprende la administración de un inhibidor de MEK/ERK. Los tratamientos combinatorios descritos anteriormente pueden actuar de forma aditiva. En otras realizaciones, los agentes combinados actúan de forma sinérgica para aliviar los síntomas.
En primer lugar, se puede obtener una muestra biológica y/o la información de genotipado de un paciente. La información genética obtenida de los ácidos nucleicos presentes en la muestra se evaluaría entonces para determinar la presencia o ausencia de la SNV asociada a anomalías linfáticas, por ejemplo. La presencia de estas mutaciones que indican la presencia de un riesgo de anomalía linfática o enfermedad, junto con la identificación simultánea de los genes afectados, proporciona al médico una guía sobre qué agentes terapéuticos son apropiados. La dosis o dosis totales de tratamiento (cuando se van a modular dos o más dianas) se pueden administrar a un sujeto como una dosis única o se pueden administrar usando un protocolo de tratamiento fraccionado, en el que se administran dosis múltiples/separadas durante un período de tiempo más prolongado, por ejemplo, durante el período de un día para permitir la administración de una dosis diaria o durante un período de tiempo más largo para administrar una dosis durante un período de tiempo deseado. Un experto en la técnica sabría que la cantidad de agente de anomalía linfática requerida para obtener una dosis efectiva en un sujeto depende de muchos factores, que incluyen la edad, el peso y la salud general del sujeto, así como la vía de administración y el número de tratamientos que se administrarán. En vista de estos factores, el experto en la técnica ajustaría la dosis particular para obtener una dosis efectiva para tratar a un individuo que tiene una anomalía linfática.
La dosis efectiva del o los agentes terapéuticos para anomalías linfáticas dependerá del modo de administración y del peso del individuo que se tratará. Las dosis descritas en esta solicitud son generalmente las de un adulto medio, pero pueden ajustarse para el tratamiento de niños. La dosis variará generalmente de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 1000 mg.
En un individuo que padece una anomalía linfática en particular, una forma más grave de la enfermedad, la administración de agentes terapéuticos para anomalías linfáticas puede ser particularmente útil cuando se administra en combinación, por ejemplo, con un agente convencional para tratar tal enfermedad. El experto en la técnica administraría uno o más agentes terapéuticos para anomalías linfáticas, solos o en combinación, y controlaría la eficacia de dicho tratamiento utilizando procedimientos de rutina tales como determinación de la función pulmonar, intestinal, tiroidea o inflamatoria, ensayos radiológicos o inmunológicos o, cuando se indique, procedimientos histopatológicos. Otros agentes para el tratamiento de anomalías linfáticas incluyen quimioterapia sistémica, tratamiento con interferón alfa, radioterapia o cirugía para aliviar los síntomas subyacentes a la enfermedad.
La administración de la preparación farmacéutica se realiza preferiblemente en una «cantidad efectiva», que es suficiente para mostrar beneficio al individuo. Esta cantidad previene, alivia, mitiga o reduce de otro modo la gravedad de los síntomas de anomalías linfáticas en un paciente. El tratamiento de pacientes con anomalía linfática con una cantidad efectiva de un inhibidor de mTOR, un inhibidor de PIK3K, y/o un inhibidor de MEK (por ejemplo, un agente de las Tablas 1-2) puede producir mejoras en la estructura linfática, disminución de los derrames pleurales quilosos, mejora de la función respiratoria, disminución del uso de medicación concomitante o aumento de la supervivencia.
Las composiciones parenterales se pueden formular en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Forma de dosificación unitaria, tal como se utiliza en esta invención, se refiere a una unidad físicamente discreta de la preparación farmacéutica adecuada para el paciente que se somete a tratamiento. Cada dosis debe contener una cantidad de principio activo calculada para producir el efecto deseado en asociación con el vehículo farmacéutico seleccionado. Los expertos en la técnica conocen bien los procedimientos para determinar la unidad de dosificación apropiada.
Las unidades de dosificación pueden aumentarse o disminuirse proporcionalmente según el peso del paciente. Las concentraciones apropiadas para el alivio de una afección patológica particular pueden determinarse mediante cálculos de la curva de concentración de dosis, como se conoce en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas que son útiles en la invención se pueden administrar sistémicamente en formulaciones parenterales, orales sólidas y líquidas, subcutáneamente, intradérmicamente, intramuscularmente, sublingualmente, tópicamente, auricularmente (OTIC), oralmente, conjuntivalmente, cutáneamente, dentalmente, electroosmóticamente, endocervicalmente, a través del seno o tráquea, enteralmente, epiduralmente, vía infiltración, intersticialmente, intraabdominalmente, intraarterialmente, intraarticularmente, intrabiliarmente, intrabronquialmente, intrabursalmente, intracardiacamente, intracartilaginamente, intracaudalmente, intracavernosamente, intracavitariamente, intracerebralmente, intradérmicamente, intralinfáticamente, intrapericárdicamente, intraperitonealmente, nasalmente, percutáneamente, respiratoriamente, oftálmicamente, en supositorio, en aerosol, tópicamente u otras vías de administración conocidas. Además del o los agentes útiles para tratar una anomalía linfática, las composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables y otros ingredientes conocidos por potenciar y facilitar la administración de fármacos. Por tanto, tales composiciones pueden contener opcionalmente otros componentes, tales como adyuvantes, por ejemplo, suspensiones acuosas de hidróxidos de aluminio y magnesio, y/o otros vehículos farmacéuticamente aceptables, como solución salina. También se pueden usar otras posibles formulaciones, como nanopartículas, liposomas, eritrocitos resellados y sistemas de base inmunológica para proporcionar/administrar el agente apropiado para un paciente según la invención. El uso de nanopartículas para administrar tales agentes, así como los portadores de péptidos permeables a la membrana celular que se pueden usar, se describen en Crombez y col., Biochemical Society Transactions v35:p44 (2007).
La administración del o los agentes útiles para tratar una anomalía linfática puede realizarse después de detectar o cuantificar con éxito la expresión del marcador de SNV asociada a anomalías linfáticas y, en consecuencia, diagnosticar una anomalía linfática o un riesgo de desarrollo de la misma. La detección o cuantificación de la expresión del marcador de SNV asociada a anomalías linfáticas puede guiar la selección del agente específico utilizado para el tratamiento. La detección o cuantificación de la expresión del marcador de SNV asociada a anomalías linfáticas puede indicar que un tratamiento particular no es apropiado para un sujeto determinado.
En otras realizaciones, el tratamiento de una anomalía linfática puede realizarse con base en el diagnóstico clínico de la enfermedad y el tratamiento puede iniciarse en ausencia de detección o cuantificación de la información de la secuencia genética. En otras realizaciones, el tratamiento para una anomalía linfática puede realizarse con base en el diagnóstico clínico de la enfermedad y el tratamiento puede iniciarse en ausencia de detección o cuantificación de la expresión del marcador de SNV asociada a anomalías linfáticas.
En otras realizaciones, el tratamiento para una anomalía linfática puede realizarse con base en el diagnóstico clínico de la enfermedad y el tratamiento puede iniciarse cuando la expresión del marcador SNV asociado a anomalías linfáticas no difiere de los controles.
En algunas realizaciones, el tratamiento se administra en pacientes que no tienen una SNV en EPHB4, PIK3R4, PIK3R6, mTOR o ARAF.
En algunas realizaciones, se administran dos o más agentes de las Tablas 1-2. En algunas realizaciones, se administran tres o más agentes de las Tablas 1-2.
En algunas realizaciones, el o los agentes que se administran tienen un perfil de inhibición de mTOR, mTORC1 y mTORC2. La actividad de mTOR, mTORC1 y mTORC2 puede denominarse «señalización de mTOR». La inhibición de mTOR, mTORC1 y mTORC2 puede denominarse inhibición de la señalización de mTOR. En algunas realizaciones, este o estos agentes con un perfil de inhibición de mTOR, mTORCI o mTORC2 no se incluyen en las Tablas 1-2, pero tienen un perfil de inhibición in vitro o sin células de mTOR, mTORC1 o mTORC2. En algunas realizaciones, el inhibidor de la señalización de mTOR, el inhibidor de mTOR, el inhibidor de mTORC1 o el inhibidor de mTORC2 tiene una CI50 de menos de 100 pM, menos de 10 pM, menos de 1 pM, menos de 100 nM, menos de 10 nM o menos de InM.
En algunas realizaciones, el o los agentes son selectivos para la inhibición de mTOR, mTORC1, y/o mTORC2 sobre otras dianas. En algunas realizaciones, el o los agentes no son selectivos para la inhibición de mTOR, mTORC1 y/o mTORC2 sobre otras dianas. En algunas realizaciones, el o los agentes inhiben mTOR, mTORC1, y/o mTORC2 y también tienen otros efectos biológicos medibles.
En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de mTOR competitivo con ATP. En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de mTOR que no es competitivo con ATP. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor dual de mTORC1/C2.
En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de la fosfoinositido 3-cinasa (PI3K). En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de PI3K y mTOR, mTORC1 o mTORC2. En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibitor de PI3K sin inhibición de mTOR, mTORC1 o mTORC2. En algunas realizaciones, el inhibidor de PI3K tiene una CI50 de menos de 100 pM, menos de 10 pM, menos de 1 pM, menos de 100 nM, menos de 10 nM o menos de InM.
En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de peptidil-prolil cis-trans isomerasa, el producto génico de FKB12. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de la unión de FK506. En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de peptidil-prolil cis-trans isomerasa o el producto génico de FKB12 y mTOR, mTORC1 o mTORC2. En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de peptidil-prolil cis-trans isomerasa o el producto génico de FKB12 sin inhibición de mTOR, mTORC1 o mTORC2. En algunas realizaciones, el inhibidor de peptidil-prolil cis-trans isomerasa o el producto génico de FKB12 tiene una CI50 de menos de 100 pM, menos de 10 pM, menos de 1 pM, menos de 100 nM, menos de 10 nM o menos de InM.
En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de la proteína cinasa activada por ADN (ADN-PK). En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de ADN-PK y mTOR, mTORC1 o mTORC2. En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de ADN-PK sin inhibición de mTOR, mTORC1 o mTORC2. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADN-PK tiene una CI50 de menos de 100pM, menos de 10pM, menos de 1pM, menos de 100nM, menos de 10nM o menos de InM.
En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de la fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-cinasa, también conocida como p110. En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de una o más subunidades de p110 (a, p, y, 6, etc.). En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de p110 y mTOR, mTORC1 o mTORC2. En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de p110 sin inhibición de mTOR, mTORC1 o mTORC2. En algunas realizaciones, el inhibidor de p110 tiene una CI50 de menos de 100pM, menos de 10pM, menos de 1pM, menos de 100nM, menos de 10nM o menos de InM.
En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de la cinasa P70S6 (P70S6K). En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de P70S6K y mTOR, mTORC1 o mTORC2. En algunas realizaciones, el o los agentes son un inhibidor de P70S6K sin inhibición de mTOR, mTORC1 o mTORC2. En algunas realizaciones, el inhibidor de P70S6K tiene una CI50 de menos de 100pM, menos de 10pM, menos de 1pM, menos de 100nM, menos de 10nM o menos de InM.
En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de MEK1/2 que inhibe las enzimas de proteína cinasa activadas por mitógenos MEK1 y/o MEK2. Pueden usarse para afectar la vía de MAPK/ERK que con frecuencia se muestra hiperactiva en algunos cánceres y otros trastornos.
En algunas realizaciones, el o los agentes son rapamicina o BEZ-235 (dactolisib). La rapamicina, un inhibidor de mTOR, también se conoce como sirolimus. BEZ-235, también conocido como dactolisib o NVP-BEZ235, es un compuesto con actividad conocida contra p110, PI3K y mTOR.
En algunas realizaciones, el agente que se administrará en los procedimientos de tratamiento se selecciona de rapamicina (Sirolimus), Everolimus (RAD001), AZD8055, Temsirolimus (CCI-779, NSC 683864), KU-0063794, MHY1485, BEZ235 (NVP-BEZ235, Dactolisib), PI-103, Torkinib (PP242), Tacrolimus (FK506), Ridaforolimus (Deforolimus, MK-8669), INK 128 (MLN0128), Voxtalisib (SAR245409, XL765), Torin 1, Omipalisib (GSK2126458, GSK458), OSI-027, PF-04691502, Apitolisib (GDC-0980, RG7422), GSK1059615, Gedatolisib (PF-05212384, PKI-587), WYE-354, AZD2014, Torin 2, WYE-125132 (WYE-132), PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, Zotarolimus (ABT-578), Tacrolimus (FK506), BGT226 (NVP-BGT226), Palomid 529 (P529) y ácido crisofánico.
En algunas realizaciones, el agente que se administrará es un inhibidor de MEK seleccionado de Selumetinib (AZD6244). PD0325901, Trametinib (GSK1120212), PD184352 (CI-1040), Pimasertib (AS-703026), TAK-733, AZD8330, Binimetinib (MEK162, ARRY-162, ARRY-438162), SL-327, Refametinib (RDEA119, Bay 86-9766), y Cobimetinib (GDC-0973, RG7420).
Las combinaciones de los agentes descritos anteriormente deben ser eficaces para el tratamiento de anomalías linfáticas. Las siguientes combinaciones pueden actuar de forma aditiva o sinérgica para tratar LAM. En determinadas realizaciones, las combinaciones para la administración se seleccionan de 1) Ridaforolimus y Trametinib; 2) Ridaforolimus y Selumetinib o Cobimetinib; 3) BEZ235 y Selumetinib; 4) Omipalisib y Selumetinib o Trametinib; 5) Everolimus y Trametinib o Selumetinib; 6) Sirolimus, Ridaforolimus y Selumetinib; 7) Sirolimus, Ridaforolimus y Trametinib; 8) Torkinib y Trametinib; 9) BEZ235, Torkinib y Trametinib; y 10) Sirolimus y Gedatolisib y Trametinib.
En algunas realizaciones, el tratamiento con uno o más agentes enumerados en esta solicitud se usa en combinación con uno o más de quimioterapia sistémica, interferón alfa, radioterapia y/o cirugía.
Procedimientos para identificar reactivos terapéuticos útiles
Dado que las SNV identificadas en esta solicitud se han asociado con la etiología de la anomalía linfática, los procedimientos para identificar agentes que modulan la actividad de los genes y sus productos codificados que contienen tales SNV deberían dar como resultado la generación de agentes terapéuticos eficaces para el tratamiento de esta afección.
Las regiones cromosómicas descritas en esta solicitud contienen regiones codificantes de proteínas que proporcionan dianas adecuadas para el diseño racional de agentes terapéuticos que modulan su actividad. Las pequeñas moléculas de péptidos correspondientes a estas regiones pueden usarse con ventaja en el diseño de agentes terapéuticos que modulan efectivamente la actividad de las proteínas codificadas.
El modelado molecular debería facilitar la identificación de moléculas orgánicas específicas con capacidad para unirse al sitio activo de las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos que contienen SNV según la conformación o los residuos de aminoácidos claves necesarios para su funcionamiento. Se utilizará un enfoque de química combinatoria para identificar moléculas con mayor actividad y a continuación se desarrollarán iteraciones de estas moléculas para ciclos posteriores de cribado. En determinadas realizaciones, los fármacos candidatos pueden seleccionarse a partir de grandes bibliotecas de compuestos naturales o sintéticos. Un ejemplo es una biblioteca de compuestos aprobada por la FDA que puede ser utilizada por seres humanos. Además, las bibliotecas de compuestos son comercializadas por varias compañías que incluyen, pero no se limitan a, Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, Reino Unido), Comgenex (Princeton, Nueva Jersey), Microsource (Nueva Milford, CT), Aldrich (Milwaukee, WI), AKos Consulting and Solutions GmbH (Basel, Suiza), Ambinter (París, Francia), Asinex (Moscú, Rusia), Aurora (Graz, Austria), BioFocus DPI, Suiza, Bionet (Camelford, UK), ChemBridge, (San Diego, CA), ChemDiv, (San Diego, CA), Chemical Block Lt, (Moscú, Rusia), ChemStar (Moscú, Rusia), Exclusive Chemistry, Ltd (Obninsk, Rusia), Enamine (Kiev, Ucrania), Evotec (Hamburgo, Alemania), Indofine (Hillsborough, Nueva Jersey), Interbioscreen (Moscú, Rusia), Interchim (Montlucon, Francia), Life Chemicals, Inc. (Orange, CT), Microchemistry Ltd. (Moscú, Rusia), Otava, (Toronto, ON), PharmEx Ltd. (Moscú, Rusia), Princeton Biomolecular (Monmouth Junction, Nueva Jersey), Scientific Exchange (Centre Ossipee, NH), Specs (Delft, Países Bajos), TimTec ( Newark, Delaware), Toronto Research Corp. (North York Ontario), UkrOrgSynthesis (Kiev, Ucrania), Vitas-M, (Moscú, Rusia), Instituto Zelinsky, (Moscú, Rusia) y Bicoll (Shanghái, China).
Las bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales se comercializan o pueden prepararse fácilmente mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se propone que los compuestos aislados de fuentes naturales, tales como animales, bacterias, hongos, fuentes vegetales, incluidas hojas y cortezas, y muestras marinas se puedan ensayar como candidatos para determinar la presencia de agentes farmacéuticos potencialmente útiles. Se entenderá que los agentes farmacéuticos que se seleccionarán también podrían derivarse o sintetizarse a partir de composiciones químicas o compuestos artificiales. Se pueden utilizar varias bibliotecas comerciales en los cribados.
Los polipéptidos o fragmentos empleados en los ensayos de cribado de fármacos pueden estar libres en solución, fijados a un soporte sólido o dentro de una célula. Un procedimiento de selección de fármacos utiliza células hospedadoras eucariotas o procariotas que se transforman de forma estable con polinucleótidos recombinantes que expresan el polipéptido o fragmento, preferiblemente en ensayos de unión competitiva. Tales células, ya sea en forma viable o fija, pueden usarse para ensayos de unión estándar. Se puede determinar, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido o fragmento y el agente que está siendo sometido a prueba, o examinar el grado en que el agente que se está probando interfiere con la formación de un complejo entre el polipéptido o fragmento y un sustrato conocido.
Otra técnica para el cribado de fármacos implica el uso de líneas celulares eucariotas hospedadoras, células (como células endoteliales) o modelos animales completos (por ejemplo, ratones transgénicos o pez cebra) que tienen un gen asociado a anomalías linfáticas no funcional o alterado. En algunos casos, el organismo transgénico comprende células que tienen una mutación de c.2334+1G>C en EPHB4; c.3481A>G:p.S1161G en PIK3R4; c.1393-7C>T en PIK3R6; c.6818A>G:p.P2273L en mTOR; o y c.640T>C:p.S214P en ARAF. Estas líneas de células hospedadoras, células o animales transgénicos son defectuosas a nivel de polipéptido. Las líneas o células de la cédula hospedadora se cultivan en presencia del compuesto farmacológico. Por ejemplo, en un modelo de pez cebra, se puede evaluar el rescate de la estructura del vaso inferior y/o D/V. Además, puede evaluarse la inducción de fosforilación por mTOR en una línea de células hospedadoras.
Un ejemplo de procedimiento de cribado de fármacos sería un procedimiento para identificar un agente que altera la señalización celular, como un agente enumerado en las Tablas 1-2. Este procedimiento comprendería proporcionar células que expresen al menos un ácido nucleico que comprenda al menos una SNV asociada a anomalías linfáticas; proporcionar células que expresan las secuencias afines naturales correspondientes a la SNV asociada a anomalías linfáticas; poner en contacto las células que expresan al menos una SNV asociada a anomalías linfáticas y las células que expresan la secuencia natural afín con un agente de prueba; y analizar si dicho agente altera la señalización celular.
Las células hospedadoras que expresan las SNV asociadas a anomalías linfáticas de la presente invención o los fragmentos funcionales de las mismas proporcionan un sistema en el que se criban compuestos o agentes posibles para determinar la capacidad de modular el desarrollo de anomalías linfáticas. Por tanto, en una realización, las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para crear líneas celulares recombinantes para usar en ensayos para identificar agentes que modulan aspectos de la señalización aberrante de mTOR asociada con anomalías linfáticas y formación de vasos aberrantes. También se proporcionan en esta solicitud procedimientos para cribar compuestos capaces de modular la función de proteínas codificadas por ácidos nucleicos que contienen SNV.
Otra estrategia implica el uso de bibliotecas de expresión de fagos diseñadas para expresar fragmentos de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos que contienen SNV en la superficie del fago. A continuación, tales bibliotecas se ponen en contacto con una biblioteca de química combinatoria en condiciones donde se puede detectar la afinidad de unión entre el péptido expresado y los componentes de la biblioteca química. Las patentes estadounidenses 6.057.098 y 5.965.456 proporcionan procedimientos y aparatos para llevar a cabo tales ensayos.
En otro aspecto, que no forma parte de la invención, la disponibilidad de ácidos nucleicos alterados asociados a anomalías linfáticas permite la producción de cepas de ratones de laboratorio que portan los ácidos nucleicos alterados. Estos ácidos nucleicos alterados asociados a anomalías linfáticas pueden ser c.2334+1G>C en EPHB4; c.3481A>G:p.S1161G en PIK3R4; c.1393-7C>T en PIK3R6; c.6818A>G:p.P2273L en mTOR; y/o c.640T>C:p.S214P en ARAF. Los ratones transgénicos que expresan las mutaciones asociadas a anomalías linfáticas proporcionan un sistema modelo en el que examinar el papel de la proteína codificada por el ácido nucleico mutado en el desarrollo y evolución hacia anomalías linfáticas. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para introducir transgenes en ratones de laboratorio. Tres procedimientos comunes incluyen: 1. integración de vectores retrovirales que codifican el gen extraño de interés en un embrión temprano; 2. inyección de ADN en el pronúcleo de un óvulo recién fertilizado; y 3. incorporación de células madre embrionarias manipuladas genéticamente en un embrión temprano. La producción de los ratones transgénicos descritos anteriormente facilitará la elucidación molecular del papel que juega una proteína diana en varios procedimientos asociados con los fenotipos de anomalías linfáticas. Tales ratones proporcionan una herramienta de cribado in vivo para estudiar fármacos terapéuticos putativos en un modelo animal completo, pero no están incluidos en la presente invención.
El término «animal» se usa en esta solicitud para incluir todos los animales vertebrados, excepto los humanos. También incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, que incluyen las etapas embrionaria y fetal. Un «animal transgénico» es cualquier animal que contiene una o más células que portan información genética alterada o recibida, directa o indirectamente, por manipulación genética deliberada a nivel subcelular, como por recombinación dirigida o microinyección o infección con virus recombinante. El término «animal transgénico» no pretende abarcar el cruzamiento clásico o la fertilización in vitro, sino que más bien incluye animales en los que una o más células son alteradas o reciben una molécula de ADN recombinante. Esta molécula puede dirigirse específicamente a un locus genético definido, integrarse aleatoriamente dentro de un cromosoma o puede ser ADN de replicación extracromosómica. El término «animal transgénico de la línea de células germinales» se refiere a un animal transgénico en el que la alteración genética o la información genética se introdujo en una célula de la línea germinal, lo que confiere la capacidad de transferir la información genética a la descendencia. Si tal descendencia, de hecho, posee parte o toda esa alteración o información genética, entonces también son animales transgénicos.
La alteración de la información genética puede ser ajena a la especie de animal a la que pertenece el receptor, o solo al receptor individual en particular, o puede ser información genética que ya posea el receptor. En el último caso, el gen alterado o introducido puede expresarse de manera diferente al gen nativo. Tal información genética alterada o extraña abarcaría la introducción de secuencias de nucleótidos asociadas a anomalías linfáticas alteradas.
El ADN utilizado para alterar un gen diana puede obtenerse mediante una amplia variedad de técnicas que incluyen, de modo no taxativo, aislamiento de fuentes genómicas, preparación de ADNc a partir de plantillas de ARNm aislados, síntesis directa o una combinación de las mismas.
Un tipo de célula diana para la introducción de transgenes es la célula madre embrionaria (ME). Las células ME pueden obtenerse a partir de la preimplantación de embriones cultivados in vitro (Evans y col., (1981) Nature 292:154-156; Bradley y col., (1984) Nature 309:255-258; Gossler y col., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83:9065-9069). Los transgenes se pueden introducir de forma efectiva en las células ME mediante técnicas estándar como la transfección de ADN o mediante la transducción mediada por retrovirus. Las células ME transformadas resultantes pueden combinarse posteriormente con blastocistos de un animal no humano. Las células madre embrionarias introducidas posteriormente colonizan el embrión y contribuyen a la línea germinal del animal quimérico resultante.
Una estrategia al problema de determinar las contribuciones de genes individuales y sus productos de expresión es usar genes aislados asociados a anomalías linfáticas que contienen mutaciones como casetes de inserción para inactivar selectivamente un gen natural en células ME totipotentes (como las descritas anteriormente ) y a continuación generar ratones transgénicos. El uso de células ME dirigidas a genes en la generación de ratones transgénicos dirigidos a genes se describió y se reseña en otra parte (Frohman y col., (1989) Cell 56:145-147; Bradley y col., (1992) Bio/Technology 10:534-539).
Hay técnicas disponibles para inactivar o alterar cualquier región genética a una mutación deseada mediante el uso de recombinación homóloga dirigida para insertar cambios específicos en los alelos cromosómicos. Sin embargo, en comparación con la recombinación extracromosómica homóloga, que ocurre con una frecuencia cercana al 100%, se informó originalmente que la recombinación homóloga plásmido-cromosoma solo se detectó a frecuencias entre 10'6 y 10'3. Las interacciones plásmido-cromosoma no homólogas ocurren con mayor frecuencia a niveles de 105veces a 102veces más que la inserción homóloga comparable.
Para superar esta baja proporción de recombinación dirigida en células ME murinas, se han desarrollado varias estrategias para detectar o seleccionar recombinantes homólogos raros. Una estrategia para detectar eventos de alteración homóloga usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para cribar grupos de células transformantes en busca de inserción homóloga, seguido de cribado de clones individuales. Alternativamente, se ha desarrollado una estrategia de selección genética positiva en el que se construye un gen marcador que solo estará activo si se produce una inserción homóloga, lo que permite que estos recombinantes se seleccionen directamente. Una de las estrategias más poderosas desarrolladas para seleccionar recombinantes homólogos es el procedimiento de selección positivanegativa (PNS) desarrollado para genes para los que no existe una selección directa de la alteración. El procedimiento PNS es más efectivo para dirigir genes que no se expresan a niveles elevados porque el gen marcador tiene su propio promotor. Los recombinantes no homólogos se seleccionan contra el uso del gen de la timidina cinasa del virus del Herpes Simplex (HSV-TK) y la selección contra su inserción no homóloga con medicamentos eficaces contra el herpes como ganciclovir (GANC) o (1- (2-desoxi-2-fluoro-B-D arabinofluranosil) -5-yodouracilo, (FIAU). Mediante esta contraselección, se puede aumentar el número de recombinantes homólogos en los transformantes supervivientes. La utilización de ácido nucleico mutado asociado a anomalías linfáticas como un casete de inserción dirigido proporciona un medio para detectar una inserción exitosa tal como se visualiza, por ejemplo, mediante la adquisición de inmunorreactividad a un anticuerpo inmunológicamente específico para el polipéptido codificado por el ácido nucleico EPHB4 y, por lo tanto, facilita el cribado/selección de células ME con el genotipo deseado.
Un animal con inserción génica es aquel en el que el gen murino endógeno, por ejemplo, ha sido reemplazado por un gen asociado a anomalías linfáticas humanas. Tales animales con inserción génica proporcionan un sistema modelo ideal para estudiar el desarrollo de anomalías linfáticas.
La expresión de un ácido nucleico mutado asociado a una anomalía linfática, un fragmento del mismo o una proteína de fusión asociada a una anomalía linfática puede dirigirse de una «manera específica de tejido» o de una «manera específica de tipo celular» utilizando un vector en el que las secuencias de ácido nucleico que codifican todo o una parte del ácido nucleico asociado a anomalías linfáticas están operativamente ligados a secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores y/o potenciadores) que dirigen la expresión de la proteína codificada en un tejido o tipo celular particular. Tales elementos reguladores se pueden utilizar de forma ventajosa para aplicaciones tanto in vitro como in vivo. Los promotores para dirigir proteínas específicas de tejido son bien conocidos en la técnica y se describen en esta solicitud. Alternativamente, el transgén puede estar bajo el control de un promotor inducible que puede funcionar de una manera específica de tejido o de «cuerpo completo».
La secuencia de ácido nucleico que codifica el mutante asociado a anomalías linfáticas puede estar operativamente ligada a una variedad de secuencias promotoras diferentes para expresión en animales transgénicos. Tales promotores incluyen, de modo no taxativo, un promotor del gen priónico tal como un promotor Thy-1 de hámster o ratón; un promotor PGK; o un promotor CMV para la expresión de transgenes en tipos celulares deseados.
Los procedimientos de uso para los ratones transgénicos se describen en esta solicitud, pero no forman parte de la invención. Los ratones transgénicos en los que se ha introducido un ácido nucleico que contiene el ácido nucleico mutado asociado a anomalías linfáticas o su proteína codificada son útiles, por ejemplo, para desarrollar procedimientos de cribado para cribar agentes terapéuticos para identificar aquellos capaces de modular el desarrollo de anomalías linfáticas.
Productos y kits de detección
Se describen composiciones o productos que son útiles para detectar SNV de anomalías linfáticas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que contienen SNV asociadas a anomalías linfáticas, los vectores que expresan los mismos, las proteínas marcadoras que contienen SNV asociadas a anomalías linfáticas y los anticuerpos marcadores específicos de anomalías linfáticas son productos capaces de detectar SNV c.2334+1G>C en EPHB4, c.3481A>G:p.S1 161G en PIK3R4, c.1393-7C>T en PIK3R6, c.6818A>G:p.P2273L en mTOR, o c.640T>C:p.S214P en ARAF. También se describen sondas de ácido nucleico que tienen una longitud y características suficientes para detectar SNV c.2334+1G>C en EPHB4, c.3481A>G:p.S1161G en PIK3R4, c.1393-7C>T en PIK3R6, c.6818A>G:p.P2273L en mTOR, o c.640T>C:p.S214P en ARAF. Los productos de detección pueden marcarse de manera que puedan detectarse.
Cualquier producto útil para detectar las SNV asociadas a anomalías linfáticas se puede incorporar a un kit. Cualquier producto útil en el tratamiento de anomalías linfáticas se puede incorporar a un kit. Se describen kits que contienen tales productos terapéuticos y de detección. El kit puede contener uno o más de un polinucleótido marcador específico de SNV asociado a anomalías linfáticas o uno o una colección de tales marcadores inmovilizados en un soporte sólido, chip de gen, un oligonucleótido, un polipéptido, un péptido, un anticuerpo, un marcador, un indicador, un vehículo farmacéuticamente aceptable, un vehículo fisiológicamente aceptable, instrucciones de uso, un recipiente, un recipiente para administración, un sustrato de ensayo o cualquier combinación de los mismos.
Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar determinadas realizaciones de la invención. Estos no pretenden limitar la invención en forma alguna.
EJEMPLO I
Para identificar la base genética de LAM/GLA, se realizó una secuenciación del exoma completo (ES) en muestras de ADN obtenidas de miembros de la familia de tres generaciones de una familia que comprende seis individuos afectados por formas heterogéneas de anomalías linfáticas. Los familiares afectados presentaban diferentes anomalías linfáticas, incluida una estasis venosa significativa en combinación con enfermedad linfática. El estudio genealógico demostró un modelo de herencia autosómico dominante, como se muestra en la Figura 1.
El probando de la familia 1 es un hombre de 24 años con antecedentes permanentes de enfermedad linfática compleja que se manifiesta principalmente como un quilotórax del lado derecho. El diagnóstico de linfangiomatosis pulmonar fue previamente confirmado por evidencia histopatológica en una biopsia pulmonar abierta a los 4 meses de edad. Un linfangiograma no mostró válvulas linfáticas normales. Se encontró flujo linfático retrógrado, que incluía sospecha de flujo hacia (en lugar de fuera) de los pulmones. Hubo una proliferación de canales linfáticos en el retroperitoneo alrededor de la columna y en los pulmones. Los canales linfáticos eran disfuncionales y el flujo era anormal después de la inyección de gadolinio en los ganglios linfáticos. Hubo realce en T2 del árbol peribronquial bilateralmente, lo que sugiere edema y canales linfáticos que rodean las vías respiratorias, los linfáticos peribronquiales. También se encontró evidencia de fibrosis en la base del pulmón derecho, donde previamente había existido un quilotórax. Se destacan sus antecedentes familiares por los defectos linfáticos en su madre, tío y tías maternos, así como en el abuelo materno. Todos los miembros de la familia afectados tienen cambios venosos, aunque existe un grado variable de afectación linfática en algunos miembros de la familia.
La secuenciación exómica se realizó en el probando (es decir, los individuos afectados) y la hermana sana, ambos padres, la tía materna no afectada y el abuelo materno afectado, quienes proporcionaron los datos de referencia más efectivos. Se examinaron todas las mutaciones con cambio de sentido, sin sentido, que alteran el splicing y de codificación que coincidían con el modelo de herencia autosómico dominante de la familia. Los resultados se filtraron para excluir variantes sinónimas, variantes con frecuencia de alelos menores (MAF) mayor que 0,5%, y variantes previamente identificadas en controles por nuestra base de datos interna de variantes de exoma. Se presentó a los candidatos relevantes para la curación manual.
Como resultado, se identificó una sustitución de un solo par de bases, c.2334+1G>C, que da como resultado una mutación en el sitio de splicing dentro del gen EPHB4 como una mutación causal. La cosegregación de la mutación con el fenotipo fue confirmada por secuenciación de Sanger, que demostró la presencia de la variante de splicing heterocigoto en los seis individuos afectados y la ausencia de la mutación en siete miembros de la familia no afectados. Un solo asterisco en la Figura 1 indica un individuo que dio positivo en esta mutación causal, mientras que un asterisco doble indica un individuo que dio negativo en la mutación.
EPHB4 se expresa en las válvulas de los vasos colectores linfáticos, y los individuos afectados en el probando tienen linfangiografía que demuestra un flujo retrógrado que sugiere la ausencia o disfunción de las válvulas. La mutación c.2334+1G>C estuvo ausente del Proyecto 1000 Genomas, COSMIC, ESP6500SI y la publicación ExAC 61.000 exomas v0.3. La secuencia de ARN con biopsias de piel obtenida del probando principal demostró que la mutación que altera el splicing de EPHB4 crea un donante de splicing críptico que provoca la retención de los 12 pb del intrón y conduce a la inserción de 4 aminoácidos sin desplazamiento de marco en el bucle catalítico altamente conservado del dominio de proteína cinasa, que también fue confirmado por secuenciación estándar de Sanger (datos no mostrados). La RT-PCR confirmó dos bandas en las líneas celulares linfoblastoides (LCL) transformadas con EBV generadas a partir del probando y la madre y mostró que la piel de los controles no afectados tenía un nivel de expresión más alto para el tipo natural de EPHB4 (datos no mostrados). La inmunotransferencia de proteínas para EPHB4 en familiares sanos y LCL derivadas del paciente mostró una banda de tamaño predicho (120 kD) en todas las muestras, con una banda más prominente en los controles (fecha no mostrada).
EPHB4 codifica el receptor 4 de efrina tipo B, que es un receptor de tirosina cinasa y reconoce la efrina B2 (EFNB2) como un ligando específico. Anteriormente, se ha demostrado que la vía de EFNB2/EPHB4 afecta la determinación del destino de las células venosas y linfáticas. La Figura 2 proporciona una descripción esquemática de las vías de señalización que dan lugar al fenotipo arterial, el fenotipo venoso y el fenotipo linfático, y destaca el papel de EPHB4 en el desarrollo del fenotipo venoso.
EJEMPLO II
Se secuenciaron diez familias adicionales que llevaron a la identificación de 3 genes adicionales causantes de enfermedades. La primera fue una mutación sin sentido en la subunidad reguladora 4 de fosfoinositido-3-cinasa (PIK3R4), la segunda fue una mutación de splicing homocigota en la subunidad reguladora 6 de fosfoinositido-3-cinasa (PIK3R6), y una tercera fue una mutación sin sentido en mTOR. PIK3R4, PIK3R6, MTOR y EPHB4a están relacionados porque convergen en la misma vía fisiológica de PI3K/AKT/mTOR. Por tanto, esta vía proporciona un objetivo ideal para opciones terapéuticas que pueden tener eficacia para el tratamiento de anomalías linfáticas.
La Tabla 3 proporciona un resumen de estos datos. La familia con la mutación descrita anteriormente en EPHB4 en c.2334+1G>C fue designada como familia-1. Para la familia-2, la secuenciación exónica reveló una variante homocigótica, c. 1393-7C>T, en PIK3R6 en el probando con ambos padres heterocigotos.PIK3R6 codifica la subunidad reguladora (p84) que se empareja con la subunidad catalítica p110 para formar un complejo Clase IB PI3K. Para las familias 3 y 4, se identificó una mutación sin sentido muy rara, c.6818A>G:p.P2273L, enMTOR, y una nueva mutación sin sentido, c.3481A>G:p.S1161G, enPIR3R4,respectivamente. En las familias 5 y 6, se identificó una mutación de ARAF recurrente, c.640T>C:p.S214P, en el sitio de fosforilación conservado, lo que supuestamente daría como resultado una ganancia de función porque la fosforilación del residuo S214 es responsable de la regulación del protooncogén A-RAF (ARAF). El modo de herencia se caracterizó como autosómico dominante (AD) o autosómico recesivo (AR), como se indica en la Tabla 3.
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EJEMPLO III
Los estudios in vivo con pez cebra de las cuatro mutaciones humanas identificadas confirmaron que eran relevantes en las anomalías linfáticas.
Para determinar si la mutación en c.2334+1G>C en EPHB4 afecta la actividad catalítica del producto génico, se generaron construcciones de expresión que contenían las versiones naturales y mutantes de EPHB4. Se obtuvo un plásmido que contenía la secuencia codificante de EPHB4 de GE Dharmacon (n.° de cat. MHS6278-202833446, Lafayette, CO). La inserción de 12 pares de bases descubierta se realizó mediante el kit de mutagénesis Quikchange II (Agilent, Santa Clara, CA) utilizando los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. La secuencia codificante se amplificó mediante PCR utilizando el cebador directo SEQ ID NO: 3 y el cebador inverso SEQ ID NO: 4 y ligados en los sitios EcoRI y NotI de pBabe+CMV Puro. Se insertó un epítopo FLAG en la secuencia codificante después del péptido señal mediante el kit de mutagénesis Q5 (NEB, Ipswich, MA) usando el cebador directo SEQ ID NO: 5 y el cebador inverso SEQ ID NO: 6. Todas las secuencias fueron confirmadas por secuenciación de Sanger.
Las células HEK239T y la línea celular de melanoma A375 se obtuvieron de ATCC (Manassas, Virginia). Las transfecciones se realizaron utilizando Fugene HD (Promega, Madison, WI), con 3 pg de ADN y 9 pl del reactivo de transfección, según los protocolos del fabricante. Para la estimulación de células transfectadas con Ephrin-B2-Fc, se recubrieron placas de 6 pocillos (no tratadas con cultivo de tejidos, Thermo Scientific) durante la noche a 37 ° C con Ephrin-B2-Fc (n.° de cat. 7397-EB, R & D Systems) o IgG1, kappa de plasma de mieloma humano (n.° de cat. 15154, Sigma) en 5 pg/mL en solución de carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6). Las placas se lavaron con PBS, se bloquearon con BSA al 1% en PBS durante 30 minutos a 4 °C y se lavaron de nuevo con PBS. Las células transfectadas se retiraron de sus placas usando EDTA 10 mM en DMEM, se lavaron y se resuspendieron en DMEM sin suero y se añadieron a las placas revestidas. Las placas se colocaron a 4 °C durante 15 minutos y se movieron a 37 °C durante 20 minutos, después de lo cual se lisaron las células. Cuando se indica, las inmunoprecipitaciones (IP) de FLAG se realizaron usando Gel de afinidad Anti-FLAG M2 (n.° de cat. A2220, Sigma, St. Louis, MO). Se procesaron IP y lisados en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris y se transfirieron con anti-fosfotirosina - 4G10-Biotina (n.° de cat. 16-103, EMD Millipore, Billerica MA) y anti-EPHB4 (n.° de cat. AF3038, R & D Systems, Minneapolis, Mn ).
La transfección de EPHB4 natural en células 293T dio como resultado la fosforilación de tirosina constitutiva de la proteína (Figura 3A, Tyr fosforilada (pTyr) en el panel superior y EPHB4 total en el panel inferior). En contraste, se detectó una fosforilación de tirosina dramáticamente menor con la transfección del mutante. Como se describió previamente para una mutación diferente de EPHB4 en hidropesía fetal, la transfección de mezclas de proteínas mutantes y naturales dio como resultado una fosforilación reducida, aproximadamente en proporción a la cantidad de proteína mutante transfectada. Véase Martin-Almedina S, y col. J Clin Invest 126:3080-3088 (2016). La transfección de EPHB4 mutante en la línea celular de melanoma A375 (Figura 3B) dio como resultado una fosforilación mucho menos constitutiva en comparación con la transfección de EPHB4 natural (comparando la señal con transferencia de pTyr frente a EPHB4 después de inmunoprecipitación de FLAG o lisados de células completas). La estimulación de las células transfectadas con Efrina-B2, el ligando de EPHB4, dio como resultado la inducción de la fosforilación de la EPHB4 natural, pero no la EPHB4 mutante (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la inserción de 4 aminoácidos causada por la mutación que altera el splicing afecta gravemente la actividad cinasa de EPHB4 mutante y que la presencia del mutante puede afectar la fosforilación de la proteína natural.
Para evaluar las consecuencias funcionales de la variante EPHB4, se adoptó una estrategia de desactivación de ARNm utilizando oligonucleótidos antisentido morfolino en pez cebra que inhiben la misma unión de splicing del exón 13 que se identificó en los pacientes mediante el uso de la línea tg(fli1:GFP). La secuencia de morfolino dirigida al exón 13 fue CGAGAGCAGTATTTACCAGTGAGCT (SEQ ID NO: 15) y se usó a una concentración de 0,8 mM. Para pik3r6 ex4 del, la concentración utilizada fue de 0,25 mM y para pik3r6 ex13 del, la concentración fue de 0,5 mM. El análisis de RT-PCR mostró una desactivación eficiente de aproximadamente66% (Figura 4).
Se observó una fusión de vasos y una expansión general en el plexo vascular inferior a los 2,5 días posfertilización (dpf) (comparando el control en la Figura 5a con el morfolino tratado en la Figura 5B), que se cuantificó en Figura 5E (marcado como «defecto inferior»), en aproximadamente el 52% de las larvas a las que se inyectó morfolino (4 experimentos con 225 animales, P < 0,0006). Además, se observó un exceso de ramificación lateral y aberrante de los vasos intersomíticos a los 4 días posfertilización (dpf) en aproximadamente el 46% de las larvas inyectadas (Figura 5C [control] y Figura 5D [tratadas con morfolino]). La Figura 5E muestra la cuantificación (rotulada como "ramificación incorrecta", 6 experimentos, 259 animales, P < 3,9E-08). La morfología y la ramificación lateral muestran que estas ramas aberrantes tienen carácter linfático. La amplificación del ADNc de ephb4a derivado de los Morphants (MO) reveló que dirigirse específicamente al exón 13 dio como resultado un splicing aberrante con tanto una inserción pequeña como una más grande. La secuenciación de Sanger mostró que la banda más pequeña era una inserción en marco de 30 pb (que codifica VNTALVLSIL), mientras que la banda más grande se debió a la retención del intrón entre los exones 13 y 14, lo que presumiblemente dio como resultado un codón de parada prematuro.
Para validar los datos del morfolino, se adquirió una línea mutante que portaba una mutación de punto ephb4asal1431 originalmente descubierta por el Instituto Sanger con la estrategia de tilling (véase Kettleborough RN, y col., Nature 496:494-497 (2013)). Sin embargo, un cruce interno de transportadores mutantes con el fondo de tg(fli1:GFP) no mostró un defecto en el plexo inferior o una ramificación incorrecta de los vasos intersomíticos. Potencialmente, un segundo gen ephb4 en el pez cebra, ephb4b, podría compensar la ausencia total de ephb4a. De hecho, la inyección de un morfolino de ephb4b dirigido a la unión de splicing del exón 13 dio como resultado la fusión y expansión del plexo inferior a las 54 horas posfertilización (hpf). A concentraciones más altas, alrededor del 70% de estas larvas también desarrolló ramificaciones incorrectas a los 4 dpf (datos no mostrados). Es importante destacar que estos fenotipos no se indujeron cuando el morfolino solo se dirige a ephb4b en larvas naturales (datos no mostrados).
Se ha sugerido que mTORC1 es una vía de señalización importante para el desarrollo linfático (véase Sun y col., Nature 496:494-497 (2015)). Por tanto, los peces cebra expuestos a oligonucleótidos antisentido de morfolino para inhibir la misma unión de splicing del exón 13 de EPHB4 se trataron con inhibidores de mTORC1, rapamicina (1 pM) y BEZ-235 (100 nM). El tratamiento con rapamicina de 24 hpf a 56 hpf mostró un rescate significativo de los defectos en el plexo vascular inferior del 44% (control, sin tratamiento) al 29% (6 experimentos, 321 animales, P < 0,01), como se muestra en la Figura 5F. La rapamicina también rescató la ramificación incorrecta del vaso intersomítico al tratar de 2,5 dpf a 4 dpf (47% [control, sin tratamiento] frente a 20%) (Figura 5G, 6 experimentos, 136 animales, P < 0,00007). BEZ-235 también rescató la ramificación incorrecta del 45% (control) al 15% (Figura 5H, 2 experimentos, 41 animales, P < 0,037).
Por lo tanto, los datos del pez cebra confirmaron el papel de EPHB4 en el desarrollo adecuado del sistema linfático. Estos datos apoyan que una mutación en EPHB4, como c.2334+1G>C predice el fenotipo de anomalía linfática como se ve en el estudio genealógico de pacientes humanos.
A continuación, se desarrollaron dos cepas de morfolino contra pik3r6, ambas dirigidas a un sitio donante de splicing con una en el exón 4 y la otra en el exón 13, cubriendo la misma región ortóloga que se identificó en el paciente. Ninguno de estos morfolinos indujo un fenotipo en el plexo vascular inferior, pero ambos causaron una ramificación incorrecta grave de los vasos intersomíticos. Las deleciones del exón 4 (Figura 6B) provocan un fenotipo más grave que la deleción del exón 13. (Figuras 6A-D, ex 4: 55% de morfolino inyectado, 7 experimentos, 210 animales, P < 1,13E-07; ex13: 47%, 3 experimentos, 70 animales P < 0,0016).
Además, se examinó si la rapamicina y BEZ-235 también podían inhibir el fenotipo de ramificación incorrecta inducido por el morfolino del exón 4 de pik3r6. De hecho, ambos fármacos demostraron que podían revertir el procedimiento funcional que da como resultado la normalización vascular. La rapamicina redujo el número de animales con ramas aberrantes del 47% al 21% (Figura 6E, 4 experimentos, 190 animales, P < 0,003). BEZ-235 redujo la ramificación incorrecta de animales del 56% al 23% (Figura 6F, 4 experimentos, 103 animales, P< 0,008).
Para investigar si pik3r4 tiene influencia sobre el desarrollo linfático en el pez cebra, se diseñó un morfolino contra el sitio de unión de splicing del exón 3. El morfolino indujo una ramificación incorrecta en el 16% de las larvas inyectadas que afectaron los vasos sanguíneos intersomíticos o los vasos linfáticos (según evaluación por morfología y posición del vaso) en comparación con el control que tenía un 5% de ramificación incorrecta (Figuras 7A-7D; 2 experimentos; 198 animales; P < 0,05).
Para determinar los efectos bioquímicos causados por los morfolinos de PIK3R6 y EPHB4, se lisaron múltiples larvas de pez cebra entre 4,5 y 5 dpf, y los lisados se analizaron para la señalización de mTORC1 mediante inmunoelectrotransferencia. Se lisaron secciones de tronco de larvas de pez cebra 4,5-5 dpf en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) suplementado con inhibidores de proteasa (comprimidos de cóctel de inhibidor de proteasa completo, Roche, Mannheim, Alemania). Se separaron aproximadamente 5 microgramos de proteína en geles Bis-Tris al 4-12% de NuPAGE procesados con tampón de migración MOPS SDS (Life Technologies, Carlsbad, CA). La inmunoelectrotransferencia se realizó utilizando los siguientes anticuerpos: p-p70 S6 cinasa T389 (n.° de cat.
9205S, Cell Signalling, Danvers, MA), Phospho-mTOR Ser2448 (n.° de cat. 5536P, Cell Signalling), HIF1 (n.° de cat. LS-C287203, LSBio , Seattle, WA), beta-actina (n.° de cat. AC-15, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Tanto los MO de PIK3R6 (Figura 8A) como los de EPHB4 (Figura 8B) mostraron la señalización de mTORC1 activada detectada por la fosforilación tanto de mTOR como de su diana p70S6K secuencia abajo. Se inhibió la activación de mTORC1 por cualquier morfolino mediante tratamiento de las larvas en desarrollo con rapamicina. La activación por el morfolino de PIK3R6 también fue inhibida por BEZ235, un inhibidor dual de PI-3-cinasa y mTOR. Además, se desarrolló un modelo celular para la mutación de EPHB4utilizando CRISPR. La región del exón 12 a 14 del ADNc de EPHB4 se amplificó mediante PCR y se secuenció directamente para confirmar la inserción génica. El vector pSpCas9(BB)-2A-Puro que contiene la secuencia diana específica para el locus de EPHB4 (gRNA-EPHB4) se cotransfectó con oligonucleótidos de donante monocatenario (ssODN) en células 293T usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 según las instrucciones del fabricante. ssODN contiene un emparejamiento incorrecto de una sola base con la secuencia genómica para recrear la mutación de EPHB4 y 4 o 3 cambios sinónimos o no codificantes, respectivamente. pSpCas9 (BB) -2A-Puro (PX459) V2.0 se adquirió en Addgene (Plásmido n.° de ID 62988). Los ARN guía (ARNg) utilizados en este estudio (SEQ iD NO:7 para EPHB4) están presente inmediatamente corriente arriba de un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) y se diseñaron utilizando el diseñador de ARNg de MIT (http://crispr.mit.edu/). Para el ensamblaje de ARNg, un par de oligos sintetizados para cada sitio de dirección con la siguiente secuencia (hEPHB4-F = SEQ ID NO: 8, hEPHB4-R = SEQ ID NO: 9, hPIK3R6-F = SEQ ID NO: 10, hPIK3R6-R = SEQ ID NO: 11) se hibridaron y pegaron en pSpCas9 (BB) -2A-Puro usando el sitio de la enzima de restricción Bbsl (NEB, Ipswich, MA). Los ssODN sintetizados (180 bases, SEQ ID NO: 12) se adquirieron de IDT.
Después de la transfección de los reactivos de CRISPR, la inmunoelectrotransferencia de las células editadas con genes con la mutación que altera el splicing de EPHB4 mostró niveles más altos de fosforilación de p70S6K (P-p70S6K) en comparación con el de las células naturales (Figura 9).
También se encontró que la expresión de mTOR aumentaba significativamente en las células HeLa transfectadas con ADNc de mTOR natural o mutado. Se obtuvo un vector de expresión de mamífero (pcDNA3-FLAG mTOR natural) que contenía el ADNc de mTOR natural humano con un epítopo FLAG en el extremo amínico (n.° de ID 26603) de Addgene. Este vector de expresión que lleva el ADNc de mTOR natural se usó para generar el mTOR P2273L mutante con un kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (NEB, Ipswich, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores se diseñaron utilizando un programa de diseño de cebadores mutagénicos específico de plantilla. Las secuencias del cebador fueron SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14.
Las células HeLa se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron a 37 °C en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS). Las células HeLa se transfectaron transitoriamente con un vector vacío (ev), vectores de expresión de mTOR natural (wt, en inglés) o P2273L muíante utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 según las instrucciones del fabricante (Invitrogen Life Technologies, CA). El medio se cambió 24 h después de la transfección. 36-48 horas después de la transfección, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo y se lisaron en hielo usando un tampón de lisis celular congelado recién preparado que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, p-glicerofosfato 50 mM, glicerol al 10% (p/v), NP-40 al 1% (p/v), EDTA ImM, NaVO42 mM y un cóctel inhibidor de proteínas sin EDTA completo (Roche Applied Science, Mannheim Alemania) a 20 pl por ml de tampón de lisis. Los lisados celulares se recogieron en un tubo de microcentifugación de 1,5 mL homogeneizado por vórtex y se incubaron en hielo durante 5 minutos. Los lisado celulares se centrifugaron a continuación a 12.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Se recogieron los sobrenadantes y se midieron las concentraciones de proteínas usando un kit de ensayo de proteínas Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA). Este lisado celular se utilizó para inmunoelectrotransferencia. La inmunoelectrotransferencia se realizó usando 10-30 pg de lisados celulares resueltos en SDS/PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF (Millipore Co., Bedford, MA). La membrana estaba bloqueada con leche descremada/TBS al 5% que contenía Tween 20 (TBST) al 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación se cortó la membrana según los pesos moleculares. Las membranas se incubaron 1h a temperatura ambiente (RT) o durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios, incluidos los anticuerpos anti-EPHB4, anti-fosfop70S6K (n.° de cat .9234, tecnología de señalización celular, Danvers, MA), anti-FLAG (n.° de cat. 2972, Tecnología de señalización celular, Danvers MA) o anti-p-actina (n.° de cat. sc-1616R, Santa Cruz Biotechnology). Después de lavar cuatro veces con TBST, las transferencias se incubaron con los respectivos anticuerpos secundarios anticonejo o antirratón conjugados con HRP (n.° de cat. sc-2004 y n.° c-2005, Santa Cruz Biotechnology) durante 1 hora a RT. Después de lavar con TBST, se detectaron bandas de proteína en la membrana con reactivos de reacción de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Thermo Scientific, Waltham, MA) y se expusieron a películas de rayos X.
El mTOR mutante, P2273L, dio como resultado una mayor fosforilación de p70S6K (P-p70S6K), en comparación con mTOR natural o vector vacío (e.v.) (Figura 10), indicativo de una señalización mejorada y coherente con una mutación de ganancia de función.
Se han realizado experimentos para evaluar la mutación de ARAF c.640T>C:p.S214P como se describe en el Ejemplo II. Se generaron células endoteliales que expresan ARAF humana natural o S214P mutante y se incubaron con dosis crecientes de inhibidor de ERK (1-100 nm) en medio de FBS al 5%. Usando estas líneas celulares, se determinó que la mutación de ARAF S214P altera la angiogénesis y disminuye la capacidad de migración de las células endoteliales (véanse las Figuras 11A y 12).
Se investigó la expresión en mosaico transgénico de la ARAF humana natural o S214P mutante en pez cebra (11B-L). La expresión de vasos inferiores agrandados inducida por ARAF humana y el defecto de los vasos inferiores agrandados se detectó en el 21% de la expresión transgénica de ARAF S214P humana, pero no natural a los 2 dpf (*** p < 0,001) (Figura 11C-E). Se detecta un rescate parcial en la formación y migración del tubo después del tratamiento con inhibidores de MEK (por ejemplo, U0126, cobimetinib, 1-10 pM en agua de mar fisiológica y selumetinib 50-100 pM en agua de mar fisiológica). Véanse las Figuras 11F-L y 12. También se generaron células endoteliales que expresan EPHB4 natural, mutante de EPHB4-Dex13 o mutante de inserción EPHB4-12bp. Las mutaciones de Ephb4 no parecieron alterar la formación de tubos de estas líneas celulares (datos no mostrados).
EJEMPLO IV
Tratamiento de un paciente con mutación de ARAF con inhibidor de ERK:
Se descubrió que un niño de 12 años con GLA grave que había necesitado múltiples cirugías para que le drenara y cauterizara el pecho tenía la mutación de ARAF descrita anteriormente. Anteriormente había sido tratado con rapamicina durante seis meses sin efectos y seguía teniendo un quilo progresivo que necesitaba cirugía. Posteriormente necesitó varias cirugías de tórax y se estaba quedando sin opciones cuando se identificó la mutación de ARAF y se autorizó el tratamiento con un inhibidor de ERK. Posteriormente, se le empezó a administrar Trametinib (el único inhibidor de MEK aprobado en niños y con efectos comparables a los de selumetinib y cobimetinib), 1 mg al día y seguimiento mensual para respuesta. Su prueba de función pulmonar, que mostró enfermedades pulmonares restrictivas graves antes, mejoró en general en un 45% (FVC, FEV1) después de un mes de tratamiento con trametinib. No tuvo efectos secundarios por el tratamiento con trametinib, excepto posiblemente algo de sequedad de piel alrededor de las muñecas. También se sentía bien, tenía menos disnea y comía mejor después del tratamiento con trametinib. Después del tratamiento, pudo subir un tramo de escaleras sin detenerse y lanzar aros afuera, nada de lo cual podía hacer antes. Después del tratamiento, su pulso de oxígeno fue normal, el más bajo se registró en la mañana (95%) y no tuvo que usar oxígeno. Su tomografía computarizada de tórax se mantuvo esencialmente sin cambios después de dos meses de tratamiento, lo que sugiere que su enfermedad no había progresado (las pruebas de función pulmonar son mucho más sensibles para medir la respuesta al tratamiento que las medidas radiográficas). En conjunto, esto prueba que trametinib detuvo la evolución de la enfermedad de GLA (por ejemplo, mejoró la función pulmonar y la saturación de oxígeno, y alivió la necesidad de oxígeno complementario), lo que sugiere que el tratamiento con inhibidor de ERK puede ser beneficioso para los pacientes con mutaciones de GLA y ARAF y potencialmente para los pacientes con mutaciones que afectan la función de ERK.
Por lo tanto, los datos presentados en esta solicitud identifican una nueva mutación que altera el splicing en EPHB4 que se identificó por primera vez en seis pacientes con anomalías linfáticas complejas, incluida GLA y estasis venosa, y dio como resultado un aumento de la actividad de mTORCI. Esta mutación de c.2334+1G>C en EPHB4 conduce a una inserción sin desplazamiento del marco en el dominio de la proteína cinasa, que participa en la fosforilación en la señalización directa.
Los datos funcionales validan la patogenicidad de c.2334+1G>C en la mutación de EPHB4 y muestran que la inserción disminuye el estado de fosforilación de la proteína EPHB4. El modelado de la mutación de EPHB4 que altera el splicing en el pez cebra dio como resultado una ramificación incorrecta de los vasos y deformidades en el desarrollo de los vasos linfáticos, lo que indica posibles defectos de diferenciación tanto en los vasos sanguíneos como en los linfáticos y que imita las presentaciones de los pacientes de la Familia-1. Sorprendentemente, los fármacos que inhiben la señalización de mTOR pudieron rescatar este fenotipo de ramificación incorrecta.
Además, múltiples mutaciones de la línea germinal en PIK3R6, MTOR y PIK3R4 que convergen en la vía de PI3K/mTOR y los datos funcionales respaldan la capacidad de estas mutaciones para causar defectos inferiores y ramificaciones incorrectas en el pez cebra. Por lo tanto, los hallazgos de apoyo presentados aquí sugieren que las mutaciones en PIK3R6, MTOR y PIK3R4 también desempeñan funciones no redundantes en el procedimiento de linfangiogénesis.
También se encontró una mutación de ARAF recurrente en el sitio de fosforilación conservado con un presunto efecto de ganancia de función. La activación de ARAF, a su vez, regula al alza el dedo anular y el dominio similar a FYVE que contiene la proteína ubiquitina ligasa E3 (RFFL), lo que lleva a la poliubiquitilación y desestabilización de prolina rica 5 como (PRR5L), un componente de mTORC2 y supresor de la fosforilación de la proteína cinasa C (PKC) para lograr la activación persistente de PKC que conduce al procrecimiento y la promigración de células. Por lo tanto, también existe una base mecanicista para que la mutación en ARAF tenga un papel causal en el desarrollo de anomalías linfáticas. En particular, el tratamiento de un paciente con una mutación en ARAF con un inhibidor de ERK mejoró con éxito los síntomas de la enfermedad.
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Aunque algunas de las realizaciones preferidas de la presente invención se han descrito y ejemplificado específicamente arriba, no se pretende que la invención se limite a tales realizaciones. Se pueden realizar varias modificaciones a lo que antecede sin apartarse del alcance de la presente invención, según lo establecido en las siguientes reivindicaciones.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para diagnosticar una anomalía linfática en un paciente humano que comprende detectar una variante de un solo nucleótido (SNV) en uno o más de PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF en un ácido nucleico en una muestra biológica aislada obtenida del paciente;
donde la presencia de dicha SNV es indicativa de una anomalía linfática y donde la SNV se selecciona de a) c.3481A>G:p.S1161G en PIK3R4;
b) c.1393-7C>T en PIK3R6;
c) c.6818A>G:p.P2273L en mTOR; y
d) c.640T>C:p.S214P en ARAF.
2. Un agente seleccionado del grupo que consiste en inhibidores de mTOR, inhibidores de PIK3K, inhibidores de MEK/ERK, y una combinación de uno o más de cualquiera de dichos inhibidores para su uso en el tratamiento de una anomalía linfática en un paciente humano, donde dicho paciente tiene una variante de un solo nucleótido (SNV) en uno o más de PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF según se determina ensayando el ácido nucleico del paciente aislado para determinar la presencia de cualquiera de dichas SNV, donde la SNV se selecciona de a) c.3481A>G:p.S1161G en PIK3R4;
b) c.1393-7C>T en PIK3R6;
c) c.6818A>G:p.P2273L en mTOR; y
d) c.640T>C:p.S214P en ARAF.
3. El agente para su uso según la reivindicación 2, donde dichos uno o más agentes o uno o más inhibidores se seleccionan de los agentes enumerados en las Tablas 1 y/o 2.
4. El procedimiento según la reivindicación 1 o el agente para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde la anomalía linfática se caracteriza por la formación anormal de vasos linfáticos y/o crecimiento excesivo de tejido.
5. El procedimiento según la reivindicación 1 o el agente para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde la anomalía linfática es linfangiomatosis (LAM).
6. El procedimiento según la reivindicación 1 o el agente para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde la anomalía linfática es anomalía linfática generalizada (GLA).
7. El procedimiento según la reivindicación 1 o el agente para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde la anomalía linfática se caracteriza por derrames quilosos, incluidos quilotórax, derrames pleurales o peritoneales.
8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 7, o el agente para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde el paciente tiene 2, 3 o 4 de dichas SNV en cualquier combinación.
9. El procedimiento según la reivindicación 1, donde la etapa de detectar en el ácido nucleico una variante de un solo nucleótido (SNV) en uno o más de PIK3R4, PIK3R6, mTOR y ARAF comprende además la etapa de analizar una muestra de polinucleótido para detectar dicha SNV mediante la realización de un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en detección de hibridación específica, medición del tamaño del alelo, análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción, análisis de hibridación específica del alelo, reacción de extensión del cebador de base única y secuenciación de un polinucleótido amplificado.
10. El procedimiento según la reivindicación 1, donde la muestra biológica comprende ADN y/o ARN.
11. El agente para su uso según la reivindicación 2, donde dicho inhibidor de MEK/ERK se selecciona de Selumetinib (AZD6244), PD0325901, Trametinib (GSK1120212), PD184352 (CI-1040), Pimasertib (AS-703026), TAK-733, AZD8330, Binimetinib (MEK162, ARRY-162, ARRY-438162), SL-327, Refametinib (RDEA119, Bay 86-9766), y Cobimetinib (GDC-0973, RG7420).
12. El agente para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 y 11, donde la combinación de uno o más de cualquiera de dichos inhibidores se selecciona del grupo que consiste en
a) Ridaforolimus y Trametinib;
b) Ridaforolimus y Selumetinib o Cobimetinib; c) BEZ235 y Selumetinib;
d) Omipalisib y Selumetinib o Trametinib; e) Everolimus y Trametinib o Selumetinib; f) Sirolimus, Ridaforolimus y Selumetinib; g) Sirolimus, Ridaforolimus y Trametinib; h) Torkinib y Trametinib;
i) BEZ235, Torkinib y Trametinib; y
j) Sirolimus y Gedatolisib y Trametinib.
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