ES2963673T3 - Anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano - Google Patents

Abstract

El propósito de la presente invención es proporcionar un anticuerpo que exhibe acción antagonista contra IL-33, en particular, un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano aislado o un fragmento del mismo en el que las secuencias de aminoácidos de las regiones estructurales son secuencias de aminoácidos de la línea germinal. o secuencias de aminoácidos de combinaciones de dichas secuencias de aminoácidos de la línea germinal. Por consiguiente, se identifican epítopos para una pluralidad de anticuerpos monoclonales anti-IL-33, se obtienen anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-IL-33 humanos y se introducen mutaciones en regiones determinantes de complementariedad de los anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-IL-33 humanos para especificar una región determinante de complementariedad que muestra alta afinidad por IL-33. La región determinante de complementariedad especificada se usa para obtener un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano en el que las secuencias de aminoácidos de las regiones estructurales son secuencias de aminoácidos de la línea germinal o secuencias de aminoácidos de combinaciones de dichas secuencias de aminoácidos de la línea germinal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano y a una composición farmacéutica que contiene tal anticuerpo para el tratamiento, la prevención o el alivio de enfermedades asociadas con IL-33.

Antecedentes de la técnica

La interleucina-33 (a continuación en el presente documento denominada IL-33) es una citocina de la familia de la interleucina-1, que se cree que está implicada en afecciones inflamatorias. La IL-33 se expresa constitutivamente en los núcleos de las células epiteliales y las células endoteliales vasculares, se libera durante la destrucción celular después de una lesión tisular provocada por infecciones o estrés físico o químico, y luego actúa como alarmina. También se cree que la expresión y secreción de IL-33 aumentan mediante la estimulación con lipopolisacárido o similares en algunos mecanismos. La IL-33 liberada extracelularmente se une a los receptores de IL-33 expresados en las células, siendo así capaz de activar la transducción de señales intracelulares. Los receptores de IL-33 se expresan en diversas células inmunitarias y células epiteliales, donde se produce la transducción de señales intracelulares inducida por IL-33.

Se cree que la IL-33 induce inflamación alérgica (por ejemplo, asma, dermatitis atópica, polinosis y choque anafiláctico) al inducir la producción de citocinas Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13) a partir de células Th2, mastocitos, eosinófilos, basófilos, células T citolíticas naturales (NKT) y linfocitos innatos del grupo 2, entre las células inmunitarias que expresan receptores de IL-33 (NPL 1: Tatsukuni Ohnoet al.,Allergy, 2012, vol. 67, pág.

1203). En los mastocitos y macrófagos entre las células inmunitarias que expresan receptores de IL-33, la estimulación con IL-33 induce la producción de IL-1 p, IL-6 y factor de necrosis tumoral a (TNF-a ), que se sugiere que está implicada en el desarrollo de artritis inducida por autoanticuerpos (modelo de artritis reumatoide) (NPL 2: Damo Xu etal.,Journal of Immunology, 2010, vol. 184, pág. 2620). Se sugiere que los antagonistas de IL-33 son eficaces contra la lesión renal aguda (NPL 3: Ali Akcayet al.,Journal of American Society Nephrology, 2011, vol. 22, pág. 2057). Se observa una expresión aumentada de IL-33 en diversas enfermedades inflamatorias humanas (por ejemplo, artritis reumatoide, asma, esclerosis sistémica, fibrosis tal como fibrosis hepática y fibrosis pulmonar, psoriasis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple y espondilitis anquilosante), y se cree que IL-33 está implicada en el desarrollo y mantenimiento de diversas enfermedades (NPL 4: Yasushi Matsuyamaet al.,Journal of Rheumatology, 2010, vol. 37, pág. 18; NPL 5: David Prefontaineet al.,Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, vol. 125, pág. 752; NPL 6: Koichi Yanabaet al.,Clinical Rheumatology, 2011, vol. 30, pág. 825; NPL 7: A. L. Rankinet al.,Journal of Immunology, 2010, vol. 184, pág.

1526; NPL 8: Tamar Mchedlidzeet al.,Immunity, 2013, vol. 39, pág. 357; NPL 9: Liang-An Huet al.,Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2013, vol. 14, pág. 2563; NPL 10: Luca Pastorelliet al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, pág. 8017).

A partir del conocimiento sobre la asociación de IL-33 con diversas enfermedades, en particular enfermedades inflamatorias, se han desarrollado agonistas y antagonistas de IL-33 (PTL 1 a 4). Entre los agonistas y antagonistas de IL-33, los anticuerpos contra IL-33 han estado atrayendo la atención, en vista de su especificidad y potencia. Varios anticuerpos que se han desarrollado están dirigidos a un anticuerpo murino que no especifica el epítopo del anticuerpo (PTL 1); un anticuerpo que reconoce una región que incluye el sitio de escisión de caspasa de IL-33 (residuos 155 a 198 de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias) como epítopo, basándose en los hallazgos del sitio de escisión de caspasa específico de IL-33 y los hallazgos de que la forma no escindida de IL-33 es la forma activa (PTL 2); y varios anticuerpos policlonales de cabra que están disponibles comercialmente. Un artículo con fecha del 10 de enero de 2014 en el sitio web de AnaptysBio, Inc. informa sobre su preparación exitosa de ANB020, el candidato para el desarrollo del anticuerpo terapéutico anti-IL-33, usando su plataforma patentada de tecnología de hipermutación somática (SHM-XEL) (NPL 11): Hamza Suria, “AnaptysBio announces development of novel anti-IL-33 therapeutic antibody”, [en línea], 2014, [consultado el 11 de enero de 2014], extraído de Internet: <URL: http://www.anaptysbio.com/anti-il-33/>). Murphyet al.dan a conocer que prepararon 20 tipos de anticuerpos monoclonales anti-IL-33 humanos usando un ratón Veloclmmune, es decir, un ratón transgénico para regiones variables de un gen de anticuerpo humano (PTL 5), pero no dan a conocer el epítopo de los anticuerpos. Además, las secuencias de aminoácidos de las regiones de entramado de los 20 tipos de anticuerpos monoclonales anti-IL-33 humanos son diferentes de las secuencias de la línea germinal humana en dos o más residuos de aminoácidos. Debido a tal diferencia, la administración de estos anticuerpos a seres humanos les provoca una reacción inmunitaria para inducir anticuerpos humanos antiinmunoglobulina humana (HAHA), lo que reduce indeseablemente los efectos de los anticuerpos e induce inflamación u otros efectos secundarios.

Lista de referencias

Bibliografía de patentes

PTL 1: documento WO 2005/079844

PTL 2: documento WO 2008/132709

PTL 3: documento WO 2011/031600

PTL 4: documento WO 2008/144610

PTL 5: documento WO 2014/164959

Bibliografía no de patentes

NPL 1: Tatsukuni Ohnoet al.,Allergy, 2012, vol. 67, pág. 120

NPL 2: Damo Xuet al.,Journal of Immunology, 2010, vol. 184, pág. 2620

NPL 3: Ali Akcayet al.,Journal of American Society Nephrology, 2011, vol. 22, pág. 2057

NPL 4: Yasushi Matsuyamaet al.,Journal of Rheumatology, 2010, vol. 37, pág. 18

NPL 5: David Prefontaineet al.,Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, vol. 125, pág. 752

NPL 6: Koichi Yanabaet al.,Clinical Rheumatology, 2011, vol. 30, pág. 825

NPL 7: A. L. Rankinet al.,Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, pág. 1526

NPL 8: Tamar Mchedlidzeet al.,Immunity, 2013, Vol. 39, pág. 357

NPL 9: Liang-An Huet al.,Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2013, vol. 14, pág. 2563

NPL 10: Luca Pastorelliet al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, pág. 8017

NPL 11: Hamza Suria, “AnaptysBio announces development of novel anti-IL-33 therapeutic antibody”, [en línea], 2014, [consultado el 11 de enero de 2014], extraído de Internet: <URL: http://www.anaptysbio.com/anti-il-33/> Mizutaniet al.,Immunology, 2013; 139: 205-218 dan a conocer que la IL-33 y los macrófagos alveolares desempeñan papeles esenciales en la exacerbación de la inflamación de las vías respiratorias mediada por IgE, haciendo uso de un anticuerpo anti-IL-33 de ratón.

Qiuet al.,Immunology, 2012; 138: 76-82 dan a conocer que la IL-33 contribuye a la inflamación de las vías respiratorias mediada por el humo de cigarrillo en un modelo de ratón que usa un anticuerpo anti-IL-33 de ratón.

Sumario de la invención

Problema técnico

La asociación de IL-33 con algunas enfermedades se ha aclarado y en los últimos años se ha requerido el desarrollo de un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 que tenga un efecto antagonista contra IL-33. La acción del anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 está estrechamente relacionada con la región de un epítopo al que se unirá el anticuerpo. Dado que la IL-33 se libera extracelularmente durante la destrucción celular, es probable que la IL-33 sea escindida por enzimas proteolíticas lisosómicas, que pueden producir la denominada IL-33 madura y muchos fragmentos derivados de la IL-33 madura y que tienen la actividad de IL-33. Si los fragmentos incluyen un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos, un anticuerpo monoclonal que puede unirse al epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos de IL-33 es más ventajoso que un anticuerpo monoclonal que puede unirse a un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos discontinuos, porque el primero puede unirse firmemente a la secuencia de aminoácidos continuos de uno de los fragmentos e inhibe la unión entre el fragmento y los receptores de IL-33. Sin embargo, sigue siendo difícil identificar un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos de este tipo para la producción de un anticuerpo monoclonal anti-IL-33 que tenga un efecto antagonista deseado.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 que puede unirse a un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos de IL-33 muestra preferiblemente baja antigenicidad cuando se administra a un ser humano o similar. Un anticuerpo humano muestra preferiblemente baja antigenicidad cuando se administra a un ser humano y tiene regiones de entramado que comprenden secuencias de aminoácidos de regiones de entramado de una línea germinal humana o secuencias de aminoácidos que consisten en una combinación de las mismas. Sin embargo, cuando la plataforma SHM-XEL o similar se aplica a un anticuerpo humano contenido en una biblioteca de genes de anticuerpos humanos, la mutación de la secuencia de aminoácidos se produce no sólo en las regiones determinantes de complementariedad sino también en las regiones de entramado. Además, si un ratón transgénico inducido con un gen de un anticuerpo humano se inmuniza con una proteína IL-33 humana para preparar un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano, no puede evitarse la mutación en las secuencias de aminoácidos de las regiones de entramado del anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33. Por consiguiente, sigue siendo difícil preparar un anticuerpo monoclonal humano anti-IL-33 aislado que incluya regiones de entramado que comprenden secuencias de aminoácidos de regiones de entramado de una línea germinal humana o secuencias de aminoácidos que consisten en una combinación de las mismas.

Solución al problema

Los inventores, que han realizado extensos estudios para resolver los problemas, descubrieron que un anticuerpo que puede unirse firmemente al epítopo tradicionalmente considerado como el epítopo preferido, es decir, el epítopo presente en una secuencia que abarca las posiciones 155 a 198 de IL-33, tiene poco efecto antagonista y que un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos presente en una secuencia que abarca las posiciones 101 a 154 ó 199 a 270 de IL-33, en particular las posiciones 111 a 130, 131 a 150, 231 a 250 ó 251 a 270, es significativo en vista del efecto antagonista de un anticuerpo que puede unirse al epítopo, y lograron la presente invención.

Los inventores también han aislado un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de una biblioteca de anticuerpos humanos y han introducido mutaciones sólo en sus regiones determinantes de complementariedad para identificar las regiones determinantes de complementariedad que logran una capacidad de unión y propiedades físicas excelentes. Como resultado, los inventores han obtenido con éxito un anticuerpo humano que tiene regiones de entramado que consisten en secuencias de aminoácidos sin ninguna mutación en comparación con las secuencias de aminoácidos de las regiones de entramado de la línea germinal y puede unirse a la IL-33 humana para neutralizar sus funciones. La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a:

Un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano aislado, en el que la combinación de las respectivas secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena ligera y cadena pesada es la combinación representada por V1 tal como sigue:

[Tabla 1]

Tabla 1. Las siguientes SEQ ID NO. muestran las SEQ ID NO. en la lista de secuencias

[Tabla 2]

Tabla 2. Las siguientes SEQ ID NO. muestran las SEQ ID NO. en la lista de secuencias

ÍTabla 31

Tabla 3. Las siguientes SEQ ID NO. muestran las SEQ ID NO. en la lista de secuencias

Efectos ventajosos de la invención

Dado que el anticuerpo monoclonal de la presente invención puede unirse a un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos, el anticuerpo monoclonal muestra fácilmente su efecto neutralizante uniéndose a una secuencia de aminoácidos continuos, incluso en el caso en el que IL-33 se escinde en fragmentos.

Es menos probable que el anticuerpo monoclonal de la presente invención induzca anticuerpos humanos antiinmunoglobulina humana (HAHA) en sus regiones de entramado y/o regiones determinantes de complementariedad cuando se administra a un sujeto humano. Los anticuerpos pueden ejercer un efecto neutralizante prolongado de IL-33in vivo,a menos que sean inhibidos por HAHA. Además, los anticuerpos se usan de manera segura, a menos que la inflamación sea provocada por la unión con HAHA. El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede unirse a IL-33 humana para neutralizar sus funciones y, por tanto, es aplicable a nuevos productos farmacéuticos para el diagnóstico, la prevención, el tratamiento o el alivio de enfermedades asociadas con IL-33.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra cada dominio y sitio de escisión de la proteína IL-33.

La figura 2 muestra la actividad de unión de cada uno de los anticuerpos a una proteína IL-33 humana (residuos 112 a 270) y cada uno de los fragmentos peptídicos parciales de los mismos (PEP11 a PEP26).

La figura 3 muestra el modelo conformacional de un complejo de IL-33 humana madura (residuos 117 a 270) (mostrada como “S117-T270” en la figura 3) y ST2 humana (hST2).

La figura 4 muestra una parte del modelo conformacional de la figura 3 que ilustra ST2 humana y una conformación parcial del epítopo PEP12 de IL-33 humana (correspondiente a las posiciones 117 a 130 de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias y está representada por “S117-N130” en la figura 4; a continuación en el presente documento, otros epítopos se representan de la misma manera).

La figura 5 muestra una parte del modelo conformacional de la figura 3 que ilustra sólo el epítopo PEP14 de IL-33 humana y ST2 humana.

La figura 6 muestra una parte del modelo conformacional de la figura 3 que ilustra sólo el epítopo PEP24 de IL33 humana y ST2 humana.

La figura 7 muestra una parte del modelo conformacional de la figura 3 que ilustra sólo el epítopo PEP26 de IL-33 humana y ST2 humana.

La figura 8 muestra los efectos de un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano denominado A25-3H04 sobre la inflamación inducida por la administración intraperitoneal de IL-33 humana, basándose en marcadores inflamatorios (peso del bazo, concentración sérica de IL-5, recuento de eosinófilos en sangre, recuento de basófilos en sangre, recuento de neutrófilos en sangre, concentración sérica de IgA y concentración sérica de IgE).

La figura 9 muestra los efectos de los anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-IL-33 humanos denominados A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02 y A26-1F02 sobre la inflamación inducida por la administración intraperitoneal de IL-33 humana, basándose en marcadores inflamatorios (peso del bazo, recuento de eosinófilos en sangre, recuento de basófilos en sangre, recuento de neutrófilos en sangre, concentración sérica de IgA y concentración sérica de IgE).

La figura 10 muestra variaciones en la concentración plasmática de cada uno de los anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-IL-33 humanos (A23-1A05, A25-3H04, A26-1F02, A10-1C04 y A25-2C02) en ratones.

La figura 11 muestra variaciones en la concentración sérica de cada uno de los anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-IL-33 humanos (A10-1C04 y A23-1A05) en monos.

Descripción de realizaciones

Las definiciones de los términos usados en el presente documento se proporcionan a continuación para una mejor comprensión de la invención.

[Epítopo]

Tal como se usa en el presente documento, el término “epítopo” se refiere a la parte de un antígeno reconocida por un anticuerpo. Tal como se usa en el presente documento, el término “epítopo” se refiere a una secuencia de aminoácidos continuos necesaria para el reconocimiento del anticuerpo.

[Unión]

Tal como se usa en el presente documento, “unión” de un anticuerpo monoclonal a un epítopo se refiere a la formación de un complejo mediante la unión entre el anticuerpo y el péptido que es un epítopo. Los ejemplos de la unión entre un anticuerpo monoclonal y el epítopo incluyen, pero no se limitan a, enlaces iónicos, de hidrógeno, hidrófobos y de van der Waals. La capacidad de unión de un anticuerpo monoclonal a un epítopo puede analizarse, por ejemplo, usando barrido de matriz de péptidos o tecnología KinExA descrita en la memoria descriptiva.

[Anticuerpo]

El término “anticuerpo” se usa en el presente documento en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales que muestran la especificidad de unión deseada. El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo humano.

[Anticuerpo monoclonal]

Entre los anticuerpos de la presente invención, “anticuerpo monoclonal” se refiere a una población de anticuerpos producidos a partir de un único clon (es decir, la población incluye especies moleculares sustancialmente únicas) con respecto a una secuencia de aminoácidos diseñada. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos multiespecíficos y anticuerpos artificiales, y formas funcionalmente modificadas de los mismos, y anticuerpos conjugados que contienen cualquiera de tales anticuerpos, y fragmentos de tales anticuerpos. El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede producirse mediante cualquier método conocido incluyendo, por ejemplo, técnicas de hibridoma, presentación en fagos e ingeniería genética.

[Anticuerpo quimérico]

El término “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que contiene cadenas ligeras y/o cadenas pesadas que se componen de regiones variables de un animal no humano y regiones constantes de un ser humano. [Anticuerpo humanizado]

El término “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que se compone de regiones variables que consisten en regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo no humano y regiones de entramado de un anticuerpo humano; y regiones constantes de un anticuerpo humano.

[Anticuerpo humano]

El término “anticuerpo humano” se refiere a un anticuerpo en el que tanto la cadena ligera como la pesada derivan de ser humano. El anticuerpo humano incluye los siguientes isotipos con diferentes regiones constantes de cadena pesada: IgG (incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) que tiene cadenas pesadas y; IgM que tiene cadenas pesadas |i ; IgA que tiene cadenas pesadas a (incluyendo IgA1 e IgA2); IgD que tiene cadenas pesadas 8; e IgE que tiene cadenas pesadas g. En principio, cada molécula de anticuerpo humano tiene cadenas ligeras k o X.

[Anticuerpo multiespecífico]

El término “anticuerpo multiespecífico” se refiere a un anticuerpo asimétrico que tiene dos o más sitios de reconocimiento de antígeno independientes y tiene especificidad por dos o más antígenos diferentes. Los ejemplos de anticuerpo multiespecífico incluyen anticuerpos biespecíficos con especificidad por dos antígenos y anticuerpos triespecíficos con especificidad por tres antígenos. Uno o más de los antígenos reconocidos por el anticuerpo multiespecífico de la presente invención son una molécula de IL-33.

[Anticuerpo artificial]

“Anticuerpo artificial” se refiere, por ejemplo, a armazones proteicos, que no tienen la estructura de un anticuerpo, pero tienen una función como la de un anticuerpo. Los ejemplos de armazones proteicos aplicables incluyen dominios Kunitz de inhibidores de serina proteasa humana; dominios extracelulares de fibronectina humana; anquirina; y lipocalina. Puede producirse un armazón proteico que puede unirse al epítopo de la presente invención modificando la secuencia del sitio de unión a la diana en el armazón (Clifford Mintzet al.,BioProcess International, 2013, vol. 11(2), págs. 40-48).

[Anticuerpo funcionalmente modificado]

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo funcionalmente modificado” se refiere a un anticuerpo que está regulado por sus funciones o propiedades, excepto por la función de unión al antígeno, tal como la función citotóxica, la función de activación del complemento y la semivida en sangre, modificando principalmente aminoácidos o cadenas de azúcar en regiones Fc de un anticuerpo.

[Anticuerpo conjugado]

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo conjugado” se refiere a un anticuerpo que está conjugado con una molécula funcional que no es anticuerpo, tal como polímeros no peptídicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG); materiales radiactivos; toxinas; compuestos de bajo peso molecular; citocinas; albúmina; y enzimas mediante cualquier procedimiento químico o de ingeniería genética.

[Fragmento]

Tal como se usa en el presente documento, el término “fragmento de anticuerpo” se refiere a una proteína que comprende una parte de un anticuerpo y puede unirse a un antígeno. Los ejemplos del fragmento de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos F(ab')<2>, fragmentos Fab' y fragmentos scFv.

Estos fragmentos de anticuerpo pueden conjugarse con moléculas funcionales que no son anticuerpos, tales como polímeros no peptídicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG); materiales radiactivos; toxinas; compuestos de bajo peso molecular; citocinas; albúmina; y enzimas mediante cualquier procedimiento químico o de ingeniería genética.

[IL-33]

IL-33 es una citocina de la familia de IL-1. La IL-33 humana consiste en 270 aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias. IL-33 comprende un dominio de unión a cromatina N-terminal, un dominio de citocina similar a IL-1 C-terminal que tiene 12 cadenas p y que tiene un peso molecular de 18 kDa, sitios de escisión de catepsina G ubicados en las posiciones 95 y 109, un sitio de escisión de elastasa ubicado en la posición 99 y un sitio de escisión de caspasa ubicado en la posición 178 (figura 1). Se cree que, durante la necrosis celular, la IL-33 es escindida por enzimas, tales como la elastasa, la catepsina G y la proteinasa 3, que se derivan del lisosoma, etc., en diversos fragmentos que incluyen IL-33 madura, tal como IL-33 (residuos 95 a 270) (“IL-33 (residuos 95 a 270)” representa el fragmento de IL-33 representado por la secuencia de aminoácidos en las posiciones 95 a 270 del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias; otros fragmentos se representan de la misma manera), IL-33 (residuos 99 a 270), IL-33 (residuos 109 a 270) e IL-33 (residuos 112 a 270), y funciona como una citocina. En el caso de muerte celular apoptótica, la IL-33 se escinde en la posición 178, mediante caspasa activada durante la apoptosis, en formas inactivadas de IL-33, tales como IL-33 (residuos 179 a 270).

Una vez que la IL-33 se libera extracelularmente como citocina, se une a los receptores de IL-33 y funciona como un inductor de la transducción de señales intracelulares en las células que expresan el receptor de IL-33. La transducción de señales inducida por IL-33 se produce a través de rutas incluyendo, pero sin limitarse a, las rutas de NF-<k>B y MAPKK y, finalmente, induce la producción de diversas citocinas, quimiocinas y mediadores inflamatorios. Los ejemplos de citocinas inducidas por IL-33 incluyen TNF-a , IL-1 p, IFN-y, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13. En particular, se induce la producción de IFN-y, IL-5, IL-6 e IL-13. Los ejemplos de quimiocinas inducidas por IL-33 incluyen CXCL2, CC<l>2, CCL3, CCL6,<c>C<l>17 y CCL24. Los ejemplos de mediadores inflamatorios inducidos por IL-33 incluyen PGD2 y LTB4. Las citocinas, las quimiocinas y los mediadores inflamatorios inducidos por IL-33 participan en la migración, la producción de citocinas y la desgranulación de las células inmunitarias y provocan inflamación. En la presente invención, IL-33 puede ser IL-33 de longitud completa o cualquier fragmento activo de IL-33, y también puede ser cualquier derivado o variante de los mismos, siempre que puedan unirse a un receptor de IL-33 descrito a continuación y lograr su efecto. IL-33 puede ser IL-33 humana o IL-33 derivada de cualquier otro organismo. Entre las IL-33, se prefiere la IL-33 humana representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias.

El receptor de IL-33 al que se une la IL-33 es un complejo heterodimérico que se compone de ST2 e IL-1RAcP (proteína accesoria del receptor de IL-1). El receptor de IL-33 contiene el sitio de unión que reconoce específicamente la IL-33 en el dominio extracelular de ST2. El receptor de IL-33 se expresa en células incluyendo, pero sin limitarse a, diversas células inmunitarias (tales como células Th2, mastocitos, eosinófilos, basófilos, macrófagos, células dendríticas, células NK, células NKT, linfocitos innatos del grupo 2 (células auxiliares naturales), nuocitos y células Ih2 (células auxiliares innatas de tipo 2)) y células epiteliales.

[Enfermedades asociadas con IL-33]

Tal como se usa en el presente documento, el término “enfermedad asociada con IL-33” se refiere a enfermedades provocadas por una liberación extracelular excesiva de IL-33. Las enfermedades asociadas con IL-33 pueden prevenirse, tratarse o aliviarse con un agente que puede inhibir las funciones de IL-33. Las enfermedades asociadas con IL-33 incluyen, por ejemplo, asma, dermatitis atópica, polinosis, choque anafiláctico, sinusitis (incluyendo sinusitis eosinofílica), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, artritis, lupus eritematoso sistémico, pénfigo, penfigoide, esclerodermia, espondilitis anquilosante, fibrosis hepática (incluyendo cirrosis biliar primaria), fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), lesión renal aguda, vasculitis y cáncer.

[Región de entramado]

El término “región de entramado” se refiere a la parte en regiones variables de una molécula de inmunoglobulina distintas de las regiones determinantes de complementariedad. Cada cadena ligera y pesada tiene cuatro regiones de entramado (regiones de entramado 1, 2, 3 y 4). En el presente documento, las regiones de entramado de las moléculas de inmunoglobulina se enumeran según el sistema de numeración de Kabat (Kabatet al.,1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., NIH, EE.UU.).

[Línea germinal]

El término “línea germinal” se refiere a un grupo de células germinales tales como espermatozoides y óvulos, y se refiere a la línea germinal humana, a menos que se indique lo contrario. Los genes de inmunoglobulinas de las células germinales no contienen mutaciones, a diferencia de los de las células B que expresan anticuerpos. Por consiguiente, el término “secuencia(s) de aminoácidos de la(s) región/regiones estructural(es) de la línea germinal” se refiere a secuencia(s) de aminoácidos sin ninguna mutación en comparación con la(s) secuencia(s) de aminoácidos de la(s) región/regiones estructural(es) de inmunoglobulina. El término “una combinación de secuencias de aminoácidos de regiones de entramado de líneas germinales” indica que una o más de las cuatro regiones de entramado tienen una secuencia de aminoácidos de una región de entramado de una línea germinal diferente. El gen que codifica para regiones variables de cadena ligera de la inmunoglobulina humana se divide en segmento V<k>y segmento J<k>en la cadena<k>; y segmento VX y segmento JX en la cadenaX.Las regiones de entramado 1 a 3 están presentes en los segmentos V<k>y VX, y la región de entramado 4 está presente en los segmentos J<k>y JX. El gen de las regiones variables de cadena pesada de la inmunoglobulina humana se divide en segmento Vh , segmento DH y segmento JH. Las regiones de entramado 1 a 3 están presentes en el segmento VH y la región de entramado 4 está presente en el segmento JH. Las secuencias de aminoácidos de la línea germinal de cada segmento V<k>, VX, VH, J<k>, JX y JH de inmunoglobulina humana se muestran en la tabla 4.

[Tabla 4-1]

Tabla 4. Las siguientes SEQ ID NO. muestran las SEQ ID NO. en la lista de secuencias

[Tabla 4-2]

[Tabla 4-3]

[Tabla 4-4]

[Anticuerpo monoclonal humano]

El término “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a un anticuerpo monoclonal que contiene regiones variables y constantes de la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En la presente invención, el anticuerpo monoclonal humano puede ser un anticuerpo recombinante generado reemplazando sus regiones variables parcial o totalmente por regiones variables de cualquier otro anticuerpo monoclonal humano. El anticuerpo recombinante puede generarse mediante recombinación en los límites entre las regiones de entramado y las regiones determinantes de complementariedad, para evitar influencias no deseadas sobre la capacidad de unión del anticuerpo. El anticuerpo recombinante también puede generarse mediante recombinación de las regiones de entramado 1 a 4 respectivamente con las regiones de entramado 1 a 4 de cualquier otro anticuerpo monoclonal humano, para evitar un aumento no deseado de la inmunogenicidad. El anticuerpo monoclonal humano de la presente invención puede ser una variante de un anticuerpo monoclonal humano. Para reducir la inmunogenicidad mientras se mantiene o mejora su capacidad de unión con el antígeno, el anticuerpo monoclonal humano incluye preferiblemente secuencias de aminoácidos de la región determinante de complementariedad con mutación y secuencias de aminoácidos de la región de entramado de la línea germinal sin mutación.

[Aislado]

El término anticuerpo “aislado” se refiere a un anticuerpo identificado y separado y/o recuperado de un componente en su entorno natural. Los componentes contaminantes en sus entornos naturales son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo e incluyen enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En general, puede obtenerse un anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación, y un anticuerpo purificado mediante al menos una etapa de purificación de este tipo se denomina “anticuerpo aislado”.

[Neutralización]

Tal como se usa en el presente documento, el término “neutralización” se refiere a una acción de unirse a una diana de interés e inhibir una de sus funciones. Específicamente, el término “anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33” se refiere a un anticuerpo monoclonal que inhibe la actividad biológica inducida por el polipéptido IL-33 mediante la unión con IL-33. La actividad biológica que va a inhibirse de IL-33 incluye, pero no se limita a, la producción de citocinas inducidas por IL-33 tales como IL-6. Los indicadores de la actividad biológica de IL-33 pueden evaluarse mediante uno o más de los análisisin vitrooin vivoconocidos en la técnica. El término “anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano” se refiere a un anticuerpo monoclonal humano que puede unirse a IL-33 para inhibir una de sus funciones.

[Antagonista]

Tal como se usa en el presente documento, el término “antagonista” es un término genérico para materiales que tienen un efecto neutralizante sobre una diana de interés. Específicamente, “antagonista de iL-33” se refiere a un material que puede unirse a IL-33 para inhibir una de sus funciones, por ejemplo, anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-IL-33.

[Región determinante de complementariedad]

El término “regiones determinantes de complementariedad” se refiere a las regiones que forman el sitio de unión al antígeno en regiones variables de una molécula de inmunoglobulina. También se las denomina “regiones hipervariables”, que indican las partes con una variabilidad particularmente grande en las secuencias de aminoácidos entre diferentes moléculas de inmunoglobulina. Las cadenas ligera y pesada contienen respectivamente tres regiones determinantes de complementariedad (regiones determinantes de complementariedad 1, 2 y 3). En la presente invención, las regiones determinantes de complementariedad de las moléculas de inmunoglobulina se enumeran según el sistema de numeración de Kabat (Kabatet al.,1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., NIH, EE.UU.).

[Competencia]

Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo que “compite” con un anticuerpo monoclonal indica que la presencia del anticuerpo monoclonal disminuye significativamente la unión de un anticuerpo con IL-33, tal como se mide mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) tal como se describe en la memoria descriptiva.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 que compite” abarca anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos multiespecíficos y anticuerpos artificiales, y formas funcionalmente modificadas de los mismos, anticuerpos conjugados que contienen cualquiera de tales anticuerpos, y fragmentos de tales anticuerpos.

Las realizaciones de la presente invención se explican a continuación. Las siguientes realizaciones son ilustrativas y no deben interpretarse como limitativas de la presente invención.

El anticuerpo monoclonal puede unirse a un epítopo de IL-33. Dado que el anticuerpo monoclonal que puede unirse al epítopo puede neutralizar la actividad de IL-33 humana, el epítopo tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos de las posiciones 101 a 154, más preferiblemente 131 a 150 (PEP14), de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias. IL-33 a menudo se escinde durante la liberación extracelular. Si se forma un epítopo a partir de residuos de aminoácidos que se separan en la secuencia primaria de IL-33 basándose en el plegamiento de la proteína, la escisión de IL-33 afecta al plegamiento de la proteína y deleciona los residuos de aminoácidos separados del epítopo, lo que puede dar como resultado una reducción significativa de la afinidad del anticuerpo con los fragmentos resultantes. Por este motivo, el epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal anti-IL-33 es preferiblemente una secuencia de aminoácidos continuos.

Para lograr el efecto neutralizante del anticuerpo monoclonal que puede unirse a un epítopo, se requiere, por ejemplo, inhibir la unión de IL-33 con receptores de IL-33. Por tanto, el epítopo está presente preferiblemente no sólo en la superficie de la proteína IL-33 sino también muy cerca de los receptores de IL-33. Los inventores han realizado modelado conformacional basado en los datos de la estructura cristalográfica en NPL 11, para identificar los aminoácidos que contienen el átomo de IL-33 ubicado a la distancia atómica de 5 A o menos de un átomo componente del receptor de IL-33, cuando los dos átomos están en la proximidad más cercana (es decir, átomo interfacial), tal como se describe a continuación en los ejemplos. Los ejemplos del aminoácido que contiene el átomo interfacial incluyen P118 (“P118” representa el residuo de prolina en la posición 118 de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias; a continuación en el presente documento, los residuos de aminoácidos se representan de la misma manera), I119, T120, Y122, L123, R124, S125, L126, S127, Y129 y N130 de PEP12; D131, Q132, S133, T135, A137, L138, E139, S142, Y143, E144, I145, Y146, E148, D149 y L150 de PEP14; D244, N245 y H246 de PEP24; y K266, L267, S268 y E269 de PEP26. Un epítopo funcional que se une específicamente a un anticuerpo monoclonal que puede neutralizar la IL-33 incluye preferiblemente el aminoácido que contiene el átomo interfacial. Se cree que el efecto neutralizante de un anticuerpo monoclonal que puede unirse específicamente a un epítopo funcional depende del número y la posición conformacional de los átomos interfaciales contenidos en el epítopo funcional, pero no se pretende que quede limitado por la teoría. El anticuerpo monoclonal se dirige a un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos incluida en las posiciones 101 a 154 de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias y consiste en una secuencia de aminoácidos continuos de las posiciones 131 a 150 (PEP14) de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias. El anticuerpo monoclonal se dirige al epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos de las posiciones 138 a 147 ó 139 a 147 de S<e>Q ID N<o>: 226 en la lista de secuencias.

Los inventores han estudiado la secuencia de aminoácidos mínima requerida para el epítopo, usando dos anticuerpos monoclonales diferentes que se unen a PEP14, y han determinado las secuencias de aminoácidos continuos de las posiciones 138 a 147 y 139 a 147 de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias como la secuencia mínima para el epítopo de IL-33. Por consiguiente, hay un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos de las posiciones 138 a 147 ó 139 a 147 de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias.

La unión de un anticuerpo monoclonal al epítopo puede confirmarse mediante un método generalmente practicado en la técnica, tal como ELISA, inmunoprecipitación, resonancia de plasmón superficial (SPR) y tecnología KinExA. Por ejemplo, si se somete a prueba un anticuerpo monoclonal usando los péptidos epitópicos de la presente invención en barrido de matriz de péptidos basado en el procedimiento de SPR, tal como se describe en los ejemplos en la memoria descriptiva, la unión del anticuerpo monoclonal al epítopo puede determinarse basándose en aumentos significativos en los valores de UR. El análisis mediante la tecnología KinExA descrita en la memoria descriptiva en los ejemplos puede determinar una constante de disociación (Kd). La constante de disociación contra un péptido epitópico es preferiblemente baja y es preferiblemente de 10 |iM o menos, 1 |iM o menos, 100 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 100 pM o menos, o 10 pM o menos.

Otra realización de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de la presente invención que puede unirse a un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos incluida en las posiciones 101 a 154 de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias. La invención también se refiere a un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano para el tratamiento, la prevención o el alivio de una enfermedad asociada con IL-33, siendo la enfermedad una enfermedad inflamatoria.

Los ejemplos no limitativos de la enfermedad asociada con IL-33 incluyen asma, dermatitis atópica, urticaria, polinosis, choque anafiláctico, sinusitis (incluyendo sinusitis eosinofílica), encefalomielitis alérgica, síndrome hipereosinofílico, polimialgia reumática, enfermedades cardíacas reumáticas, esclerosis múltiple, artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis juvenil, artritis psoriásica, artrosis deformante y síndrome de Reiter), lupus eritematoso sistémico (incluyendo lupus discoide), pénfigo, penfigoide, psoriasis, espondilitis anquilosante, hepatitis (por ejemplo, hepatitis autoinmunitaria y hepatitis crónica activa), enfermedades inflamatorias del intestino (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y enteropatía sensible al gluten), síndrome de Sjogren, anemia hemolítica autoinmunitaria, enfermedades oculares inflamatorias autoinmunitarias, trombocitopenia neonatal autoinmunitaria, neutropenia autoinmunitaria, ooforitis y orquitis autoinmunitarias, trombocitopenia autoinmunitaria, tiroiditis autoinmunitaria, miositis múltiple, dermatomiositis, miastenia grave, resistencia a los agonistas adrenérgicos, alopecia areata (alopecia greata), síndrome antifosfolipídico, enfermedades autoinmunitarias suprarrenales (por ejemplo, enfermedad autoinmunitaria de Addison), dermatitis celiaca, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmunitaria (SFCDI), enfermedad de aglutininas frías, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis (por ejemplo, nefropatía por IgA), enfermedad de Graves, hipertiroidismo (es decir, tiroiditis de Hashimoto), púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), enfermedad mixta del tejido conjuntivo, diabetes mellitus tipo 1 o inmunomediada, anemia perniciosa, policondritis, síndrome poliglandular, síndrome del hombre rígido, vitíligo, sarcoidosis, poliendocrinopatía, otras endocrinopatías, arterioesclerosis, fibrosis hepática (por ejemplo, cirrosis biliar primaria), fibrosis pulmonar (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), esclerodermia (incluyendo el síndrome CREST y el fenómeno de Raynaud), nefritis tubulointersticial, enfermedad por depósitos densos, lesión renal aguda, miocarditis, miocardiopatía, neuritis (por ejemplo, síndrome de Guillain-Barré), poliarteritis nudosa, síndrome de cardiotomía, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía por IgA, liquen plano, enfermedad de Meniere, síndrome post-infarto de miocardio (post-IM), uveítis, oftalmía por uveítis, vasculitis, agammaglobulinemia primaria, cáncer (por ejemplo, tumor cerebral, cáncer de laringe, cáncer de labio y boca, cáncer de hipofaringe, cáncer de tiroides, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, carcinoma corticosuprarrenal, cáncer de las vías biliares, cáncer de vesícula biliar, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer testicular, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, tumor de Ewing, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, melanoma, mesotelioma y mieloma múltiple), infecciones resistentes al aclaramiento por el sistema inmunitario (por ejemplo, síndrome respiratorio agudo grave (SARS)), tormenta letal de citocinas asociada con infección de gripe virulenta y septicemia. La enfermedad asociada con IL-33 es preferiblemente asma, dermatitis atópica, polinosis, choque anafiláctico, sinusitis (incluyendo sinusitis eosinofílica), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, artritis, lupus eritematoso sistémico, pénfigo, penfigoide, esclerodermia, espondilitis anquilosante, fibrosis hepática (incluyendo cirrosis biliar primaria), fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), lesión renal aguda, vasculitis y cáncer.

Aunque no forma parte de la invención, se da a conocer un inhibidor de la expresión contra una citocina, una quimiocina o un mediador inflamatorio, que comprende un anticuerpo monoclonal que puede unirse a un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos incluida en las posiciones 101 a 154 ó 199 a 270 de SeQ ID NO: 226 en la lista de secuencias.

Aunque no forma parte de la invención, la citocina que va a inhibirse mediante el inhibidor de la expresión es una citocina inducida por IL-33.

Aunque no forma parte de la invención, se da a conocer un epítopo al que se une un anticuerpo monoclonal anti-IL-33. El epítopo se dirige a una secuencia que consiste en de seis a veinte aminoácidos necesaria para el reconocimiento por parte del anticuerpo. El epítopo puede contener además aminoácidos muy próximos, o bien en la secuencia o bien en la estructura tridimensional, a aminoácidos en la secuencia determinada, por lo que puede formarse otro epítopo. Sin embargo, el epítopo preferiblemente no contiene aminoácidos discontinuos. La secuencia de aminoácidos continuos del epítopo consiste en al menos cinco, preferiblemente al menos seis, más preferiblemente al menos siete, más preferiblemente al menos ocho, aún más preferiblemente al menos nueve aminoácidos. La secuencia de aminoácidos continuos consiste en al menos 10, más preferiblemente 15, aún más preferiblemente al menos 20 aminoácidos, para lograr una antigenicidad más suficiente. Por otro lado, si el epítopo contiene una secuencia excesivamente larga, sin embargo, puede contener dos o más sitios reconocidos por un anticuerpo, lo que puede interferir con la producción o selección de anticuerpos que tienen un efecto neutralizante deseado. Por este motivo, la secuencia del epítopo tiene una longitud de preferiblemente 30 aminoácidos o menos, más preferiblemente 20 aminoácidos o menos, aún más preferiblemente 15 aminoácidos o menos, para garantizar que muestra el efecto neutralizante deseado por parte del anticuerpo que puede unirse al epítopo de la presente invención. El número de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos continuos incluida en el epítopo se selecciona de, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20.

El epítopo puede tener una o varias mutaciones de aminoácidos, es decir, sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, a menos que las mutaciones cambien la antigenicidad. El número de mutaciones introducidas es preferiblemente de cinco o menos, más preferiblemente tres o menos, lo más preferiblemente una. El epítopo también puede modificarse, por ejemplo, con cadenas de azúcar de la proteína original y modificación terminal. El epítopo puede consistir en una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 97 %, aún más preferiblemente al menos el 98 %, lo más preferiblemente el 99 %, con respecto a la secuencia de aminoácidos continuos especificada en la presente invención, a menos que la antigenicidad se vea afectada. El péptido epitópico puede etiquetarse con histidina o biotina, etc., cuando se usa como cebo, y puede unirse a una proteína transportadora tal como KLH, cuando se usa como vacuna.

El “porcentaje (%) de identidad de secuencia” relacionado con una secuencia polipeptídica de referencia identificada en el presente documento se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos que se incluyen en una secuencia candidata y son idénticos con los residuos de aminoácidos en una secuencia polipeptídica de referencia específica, después de alinear los secuencias e introduciendo huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse usando diversos métodos dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, un software informático disponible públicamente, tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR, Inc.). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima en las secuencias de longitud completa que van a compararse. Sin embargo, para los fines descritos en el presente documento, los valores porcentuales de identidad de secuencia de aminoácidos se determinan mediante comparación por pares usando el programa informático de comparación de secuencias BLAST. En una circunstancia en la que se usa el programa BLAST para comparar secuencias de aminoácidos, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A determinada con respecto a una secuencia de aminoácidos B determinada se calcula tal como sigue:

Fracción X/Y x 100

donde X es el número de residuos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias BLAST en su alineación de las secuencias A y B, e Y es el número total de residuos de aminoácidos en la secuencia B. Se apreciará que esa diferencia de longitud entre las secuencias de aminoácidos A y B da como resultado una diferencia en el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia A con respecto a la secuencia B y el de la secuencia B con respecto a la secuencia A. Todos los valores de porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos descritos en el presente documento se determinan basándose en el programa informático BLAST tal como acaba de describirse anteriormente, a menos que se indique lo contrario.

El epítopo se dirige a un epítopo funcional al que se une específicamente un anticuerpo neutralizante anti-IL-33. Por tanto, puede obtenerse eficazmente un nuevo anticuerpo que tiene un efecto antagonista contra IL-33 mediante el epítopo funcional. Específicamente, puede obtenerse un anticuerpo monoclonal que tiene el efecto antagonista seleccionando anticuerpos monoclonales contra IL-33 de longitud completa o<i>L-33 madura para identificar aquellos que pueden unirse al epítopo funcional de la invención. Por consiguiente, hay una divulgación que se refiere a un método de selección de un anticuerpo que tiene un efecto antagonista usando el epítopo funcional de IL-33. Más específicamente, si se concentra un clon de anticuerpo que tiene un efecto antagonista contra IL-33 a partir de una biblioteca de anticuerpos sin tratamiento previo mediante una técnica de presentación en fagos, primero se realiza la selección de la biblioteca usando una proteína IL-33 madura o de longitud completa como cebo, se enriquecen los clones de los anticuerpos que se unen a uno o más de diversos epítopos en la superficie de IL-33 y luego se someten a la selección de la biblioteca usando los péptidos epitópicos funcionales como cebo. Un método de este tipo proporciona una selección eficiente de un anticuerpo que puede unirse específicamente al epítopo funcional y que tiene un efecto antagonista contra IL-33.

En los ejemplos, los inventores sometieron a prueba anticuerpos monoclonales que se había confirmado que se unían a epítopos de 20 residuos de aminoácidos de longitud para analizar su actividad antagonista contra iL-33 a diferentes concentraciones de anticuerpo, para determinar epítopos adecuados para la producción o selección de un anticuerpo que tiene el efecto antagonista. Los resultados muestran que los anticuerpos que se unen a un epítopo seleccionado del grupo que consiste en las posiciones 111 a 130 (PEP12), 131 a 150 (PEP14), 231 a 250 (PEP24) y 251 a 271 (PEP26) de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias mostraron claramente un aumento dependiente de la concentración en su efecto antagonista. Los resultados demuestran que tales epítopos son epítopos funcionales adecuados para la producción o selección de un anticuerpo que tiene un efecto antagonista.

El epítopo puede producirse mediante cualquier técnica de síntesis de péptidos practicada habitualmente en la técnica. Puede usarse un epítopo preparado y purificado para la inmunización de animales o para la producción de anticuerpos contra el epítopo. Alternativamente, puede aplicarse un epítopo purificado a una técnica de presentación en fagos para la producción o selección de un anticuerpo monoclonal que pueda unirse al epítopo. El epítopo también puede usarse como vacuna cuando se usa en combinación con un adyuvante.

El anticuerpo monoclonal puede unirse a un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos incluida en una secuencia que abarca las posiciones 101 a 154 de SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias. Los ejemplos del anticuerpo monoclonal incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos multiespecíficos y anticuerpos artificiales; y formas funcionalmente modificadas de los mismos, anticuerpos conjugados de los mismos, y fragmentos de los mismos. El anticuerpo monoclonal de la presente invención es un anticuerpo humano. El anticuerpo monoclonal puede producirse mediante una variedad de procedimientos conocidos incluyendo, por ejemplo, técnicas de hibridoma, presentación en fagos e ingeniería genética.

En la técnica del hibridoma, se inmuniza un animal, en particular una rata o un ratón, con un inmunógeno, y se recogen células B de su bazo o ganglio linfático y luego se fusionan con células inmortalizadas, por ejemplo, células de mieloma, para formar células de hibridoma. Las células de hibridoma se analizan para identificar el hibridoma que produce un anticuerpo que tiene la capacidad de unión deseada, y el anticuerpo deseado puede producirse con el hibridoma analizado. Puede obtenerse un anticuerpo humano a partir de un ratón transgénico inducido con un gen para el anticuerpo humano. El anticuerpo monoclonal de interés se obtiene a partir de las células de hibridoma, por ejemplo, cultivando las células de hibridoma según un método ordinario y luego recogiendo el sobrenadante de cultivo; o administrando las células de hibridoma a un mamífero que sea compatible con las células de hibridoma para su proliferación y luego recogiendo el líquido ascítico. El primer método es adecuado para la producción de anticuerpos con alta pureza y el segundo método es adecuado para la producción de anticuerpos a gran escala. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante cualquier técnica conocida, por ejemplo, según la descripción en Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc., capítulo 2.

En la técnica de presentación en fagos, los fagos seleccionados de cualquier biblioteca de anticuerpos en fagos se analizan usando un inmunógeno de interés para seleccionar los fagos que tienen la capacidad de unión deseada al inmunógeno. Luego se aísla o determina la secuencia contenida en los fagos seleccionados y correspondiente al anticuerpo, y se construye un vector de expresión que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo monoclonal basándose en la información de secuencia determinada o secuencia aislada. Luego, el vector de expresión se transfecta en una línea celular y la línea celular se cultiva para producir el anticuerpo monoclonal. Puede producirse un anticuerpo humano con la capacidad de unión deseada con una biblioteca de anticuerpos humanos como biblioteca de anticuerpos en fagos.

En las técnicas de ingeniería genética, puede prepararse un anticuerpo recombinante introduciendo una mutación en una secuencia correspondiente a regiones determinantes de complementariedad (CDR) o cualquier otra secuencia dentro de la secuencia génica que codifica para el anticuerpo, incorporando la secuencia resultante en un vector de expresión y luego transformando el vector de expresión en una célula huésped (véase, por ejemplo, Borrebaeck C. A. K. y Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990).

En la presente invención, también pueden usarse anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos multiespecíficos y miméticos de anticuerpos artificiales, por ejemplo, con el fin de reducir la xenoantigenicidad en seres humanos o añadir otra función. Tales anticuerpos pueden producirse mediante cualquier método conocido.

Puede producirse un anticuerpo quimérico ligando un ADN que codifica para regiones variables de un anticuerpo no humano con un ADN que codifica para regiones constantes de un anticuerpo humano, incorporando el ADN resultante en un vector de expresión, que luego se transforma en una célula huésped para la expresión del anticuerpo de interés (véanse los documentos EP 125023 y WO 92/19759). Los anticuerpos quiméricos útiles para la presente invención pueden producirse mediante una técnica conocida de este tipo.

Puede producirse un anticuerpo humanizado ligando un ADN que codifica para regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo no humano con un ADN que codifica para las demás regiones de un anticuerpo humano e incorporando el ADN resultante en un vector de expresión, que luego se transforma en una célula huésped para la expresión del anticuerpo de interés.

Un anticuerpo multiespecífico se refiere a un anticuerpo asimétrico que tiene dos o más sitios de reconocimiento de antígeno independientes y tiene especificidad por dos o más antígenos diferentes. Un anticuerpo multiespecífico tal como un anticuerpo biespecífico puede producirse mediante cualquier técnica de ingeniería genética basándose en las regiones de unión al antígeno de dos o más anticuerpos monoclonales. Tales técnicas de ingeniería genética ya se han establecido en la técnica. Por ejemplo, puede obtenerse un anticuerpo biespecífico deseado uniendo regiones de unión al antígeno de dos anticuerpos monoclonales diferentes en tándem según el método DVD-Ig (Wuet al.,Nature Biotechnology 25(11), 1290(2007)), o modificando la región Fc de un anticuerpo para combinar cadenas pesadas de dos anticuerpos diferentes que pueden unirse a antígenos diferentes según el método ART-Ig (Kitazawaet al.,Nature Medicine 18(10), 1570(2012)).

“Anticuerpo artificial” se refiere a, por ejemplo, armazones proteicos, que no tienen la estructura de un anticuerpo, pero tienen una función como la de un anticuerpo. Los ejemplos de armazones proteicos aplicables incluyen dominios Kunitz de inhibidores de serina proteasa humana; dominios extracelulares de fibronectina humana; anquirina; y lipocalina. Puede producirse un armazón proteico que puede unirse al epítopo modificando la secuencia del sitio de unión a la diana en el armazón (PTL 4; Clifford Mintzet al.BioProcess International, 2013, vol. 11(2), págs. 40-48).

El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede modificarse en su secuencia de aminoácidos o estructura de cadenas de azúcar en regiones Fc para regular sus funciones o propiedades, excepto la función de unión al antígeno, tal como la función citotóxica, la función de activación del complemento y la semivida en sangre (Strohl, Current Opinion in Biotechnology, 2009, vol. 20, pág. 685). Un anticuerpo funcionalmente modificado de este tipo puede prepararse, por ejemplo, mediante un método descrito a continuación. Un anticuerpo monoclonal producido en células huésped CHO inactivadas para el gen de a 1,6-fucosiltransferasa (FUT8) tiene un contenido reducido de fucosa en las cadenas de azúcar, lo que da como resultado una mayor función citotóxica, mientras que un anticuerpo producido en células huésped<c>H<o>transfectadas con el gen FUT8 tiene una menor función citotóxica (documentos WO 2005/035586, WO 2002/31140 y WO 00/61739). La función de activación del complemento del anticuerpo puede regularse mediante la modificación de su región Fc mediante cambios en los residuos de aminoácidos (patentes estadounidenses n.os 6737056, 7297775 y 7317091). La semivida en sangre del anticuerpo puede prolongarse con una variante de la región Fc que tenga una mayor capacidad de unión a FcRn, uno de los receptores de Fc (Shuhei Hashiguchiet al.,SEIKAGAKU (The Journal of Biochemistry), 2010, vol. 82(8), pág. 710). Tales anticuerpos funcionalmente modificados pueden producirse mediante técnicas de ingeniería genética.

El anticuerpo monoclonal usado en la presente invención puede ser un anticuerpo conjugado producido uniendo un anticuerpo a cualquiera de diversas moléculas, tales como polímeros no peptídicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG); materiales radiactivos; y toxinas. Un anticuerpo conjugado de este tipo puede producirse mediante modificación química del anticuerpo obtenido. Ya se han establecido en la técnica métodos para la modificación química. Tales anticuerpos conjugados también están abarcados en el anticuerpo monoclonal de la presente invención (D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies, 1998 T.J. International Ltd., Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer, 1998 Marcel Dekker Inc.; Chariet al.,Cancer Res., 1992, vol. 152:127; Liuet al.,Proc Natl Acad Sci USA, 1996, vol. 93:8681).

Según la presente invención, además de los anticuerpos de longitud completa descritos anteriormente, el anticuerpo también abarca fragmentos de anticuerpos monoclonales y cualquier forma modificada de los mismos, siempre que tengan capacidad de unión a un epítopo de interés y ejerzan actividad antagonista. Los ejemplos del fragmento de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos F(ab')<2>, fragmentos Fab' y fragmentos Fv monocatenarios (scFv), que contienen las regiones Fv de las cadenas H y L conectadas mediante un ligador adecuado. Estos fragmentos de anticuerpos pueden estar unidos a moléculas funcionales que no son anticuerpos, tales como polímeros no peptídicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG); materiales radiactivos; toxinas; compuestos de bajo peso molecular; citocinas; albúmina; y enzimas.

El sistema de producción para preparar anticuerpos monoclonales puede ser cualquiera de los sistemas de producciónin vitroein vivo.El sistema de producciónin vitroincluye el sistema de producción que usa células eucariotas, por ejemplo, células animales, células vegetales o células fúngicas; y el sistema de producción que usa células procariotas, por ejemplo, células bacterianas tales comoEscherichia coliyBacillus subtilis.Las células aplicables incluyen células animales, en particular células de mamíferos, por ejemplo, células usadas generalmente, tales como células CHO, COS, de mieloma, BHK, HeLa y Vero; células de insectos; y células vegetales. El sistema de producciónin vivoincluye sistemas de producción en animales o plantas. Los ejemplos del sistema de producción en animales incluyen los de mamíferos e insectos. Los ejemplos de mamíferos aplicables incluyen cabras, porcinos, ovinos, ratones y bovinos (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Los ejemplos de insectos aplicables incluyen gusanos de seda. Los ejemplos de plantas aplicables incluyen el tabaco.

Si el anticuerpo monoclonal se produce en un sistema de producciónin vitrooin vivotal como se describió anteriormente, el ADN que codifica para la cadena pesada (cadena H) y el ADN que codifica para la cadena ligera (cadena L) pueden incorporarse en vectores de expresión independientes para cotransformar el huésped, o pueden incorporarse juntos en un único vector de expresión para transformar el huésped (véase el documento WO 94/11523).

El anticuerpo monoclonal así producido puede purificarse hasta homogeneidad. Los anticuerpos monoclonales pueden separarse y purificarse mediante cualquier método habitualmente usado para la separación y purificación de proteínas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden separarse y purificarse seleccionando o combinando adecuadamente métodos e instrumentos incluyendo, pero sin limitarse a, columnas cromatográficas para cromatografía de afinidad, filtración, ultrafiltración, precipitación de sales, diálisis, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y enfoque isoeléctrico (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Las columnas usadas en cromatografía de afinidad incluyen columnas de proteína A y columnas de proteína G. Los ejemplos de la columna de proteína A incluyen las columnas Hyper D, POROS y Sepharose F. F. (Amersham Biosciences).

El anticuerpo monoclonal que puede unirse a un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos continuos incluida en las posiciones 101 a 154 de SEQ ID<n>O: 226 en la lista de secuencias es un anticuerpo humano, en vista de la baja antigenicidad que puede mostrar cuando se administra a un ser humano. Entre los anticuerpos humanos, se prefieren aquellos en los que las secuencias de aminoácidos de las regiones de entramado corresponden a secuencias de aminoácidos de regiones de entramado de una línea germinal humana o una combinación de secuencias de aminoácidos de las mismas. Por tanto, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano en el que las secuencias de aminoácidos de las regiones de entramado corresponden a secuencias de aminoácidos de regiones de entramado de una línea germinal humana o una combinación de secuencias de aminoácidos de las mismas.

Dado que las regiones de entramado de la región variable de un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de este tipo comprenden secuencias de aminoácidos de regiones de entramado de la línea germinal humana o una combinación de secuencias de aminoácidos de las mismas, un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de este tipo se caracteriza por una inmunogenicidad nula o significativamente baja provocada por estas regiones, y también por poder unirse a IL-33 para inhibir sus funciones. Por tanto, cuando el anticuerpo se usa como producto farmacéutico, es poco probable que induzca anticuerpos humanos anti-inmunoglobulina humana (HAHA), por lo que puede evitar su aclaramientoin vivo.Como resultado, el anticuerpo de la invención puede lograr un efecto neutralizante prolongado de IL-33 y es seguro porque no provoca inflamación inducida por la unión con HAHA.

Las secuencias de aminoácidos de las regiones de entramado de cadena ligera y cadena pesada de la línea germinal humana son tal como se dan a conocer en el presente documento.

Las regiones de entramado tienen las siguientes secuencias de aminoácidos: la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 1 de cadena ligera son los residuos 1 a 22 de SEQ ID NO: 317 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 2 de cadena ligera son los residuos 36 a 50 de SEQ ID NO: 317 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 3 de cadena ligera son los residuos 58 a 89 de SEQ ID NO: 317 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 4 de cadena ligera son los residuos 3 a 12 de SEQ ID NO: 401 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 1 de cadena pesada son los residuos 1 a 30 de SEQ ID NO: 367 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 2 de cadena pesada son los residuos 36 a 49 de SEQ ID NO: 367 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 3 de cadena pesada son los residuos 67 a 98 de SEQ ID NO: 367 en la lista de secuencias; y la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 4 de cadena pesada son los residuos 5 a 15 de SEQ ID NO: 407 en la lista de secuencias.

En el presente documento se da a conocer un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano aislado, en el que las secuencias de aminoácidos de una región determinante de complementariedad 1 de cadena ligera (LCDR1), una región determinante de complementariedad 2 de cadena ligera (LCDR2), una región determinante de complementariedad 3 de la cadena ligera (LCDR3), una región determinante de complementariedad 1 de cadena pesada (HCDR1), una región determinante de complementariedad 2 de cadena pesada (HCDR2) y una región determinante de complementariedad 3 de cadena pesada (HCDR3) corresponden a la combinación de secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de complementariedad representadas por C1 a C30 en la tabla 1.

Los anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-IL-33 humanos que tienen la combinación de regiones determinantes de complementariedad representadas por C1 a C30 mostradas en la tabla 1 tienen capacidad de unión y actividad neutralizante, en particular a la IL-33 madura que puede unirse a un receptor de IL-33 para ejercer actividad, por ejemplo, IL-33 (residuos 95 a 270), IL-33 (residuos 99 a 270), IL-33 (residuos 109 a 270) e<i>L-33 (residuos 112 a 270), entre las IL-33. Los anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-IL-33 humanos que tienen la combinación de regiones determinantes de complementariedad representadas por C1 a C30 mostradas en la tabla 1 tienen capacidad de unión a IL-33 (residuos 131 a 150).

La combinación de secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad proporciona una capacidad de unión y/o propiedades físicas mejoradas del anticuerpo. En una realización particularmente preferida, el límite superior de la constante de velocidad de disociación (koff) contra la IL-33 humana es de aproximadamente 3,5 x 10'5/s o menos, más preferiblemente de aproximadamente 2,0 * 10'5/s o menos, más preferiblemente de 1,5 * 10'5/s o menos, aún más preferiblemente de aproximadamente 1,0 * 10'5/s o menos, y el límite inferior de la constante de velocidad de disociación es, pero sin limitarse a, de 10'7/s o más, más preferiblemente de 10'6/s o más, más preferiblemente de aproximadamente 5 * 10'6/s o más.

Entre los anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-IL-33 humanos, los más preferidos son aquellos que tienen una baja constante de disociación (Kd) contra la IL-33 humana. El límite superior de la constante de disociación (Kd) es de 10'9 M o menos, más preferiblemente de 10'10 M o menos, aún más preferiblemente de 10'12 M o menos, por ejemplo. El límite inferior de la constante de velocidad de disociación es, pero sin limitarse a, preferiblemente de 10'14 M o más, más preferiblemente de 10'13 M o más.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención inhibe la producción de IL-6 a partir de HUVEC estimuladas con IL-33. En particular, son más preferidos los anticuerpos con mayor efecto inhibidor. Específicamente, en una realización preferida de la presente invención, se prefiere el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano que alcanza una tasa (tasa de inhibición) de inhibición de la producción de IL-6 a partir de HUVEC estimuladas con 100 ng/ml de IL-33, tal como se describe a continuación en el ejemplo 10, de aproximadamente el 50 % o mayor, más preferiblemente de aproximadamente el 70 % o mayor, aún más preferiblemente de aproximadamente el 90 % o mayor.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención inhibe la producción de IL-5, IL-6 y/o IL-13 por células KU-812 estimuladas con IL-33. En particular, son más preferidos los anticuerpos con mayor efecto inhibidor. Específicamente, en una realización preferida de la presente invención, se prefiere el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano que alcanza una tasa (tasa de inhibición) de inhibición de la producción de IL-5, IL-6 y/o IL-13 por células KU-812 estimuladas con 100 ng/ml de IL-33, tal como se describe a continuación en el ejemplo 11, de aproximadamente el 30 % o mayor, más preferiblemente de aproximadamente el 50 % o mayor, aún más preferiblemente de aproximadamente el 70 % o mayor.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención inhibe la producción de IFN-y por células mononucleares de sangre periférica humanas estimuladas con IL-33. En particular, son más preferidos los anticuerpos con mayor efecto inhibidor. Específicamente, en una realización preferida de la presente invención, se prefiere el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano que alcanza una tasa de inhibición de la producción de IFN-y por células mononucleares de sangre periférica humanas estimuladas con 10 ng/ml de IL-33, tal como se describe a continuación en el ejemplo 12, de aproximadamente el 80 % o mayor, más preferiblemente de aproximadamente el 90 % o mayor, aún más preferiblemente de aproximadamente el 95 % o mayor.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención inhibe la inflamación inducida por la administración de IL-33 humana a un ratón. En particular, son más preferidos los anticuerpos con mayor efecto antiinflamatorio. Específicamente, en una realización preferida de la presente invención, se prefiere la administración intraperitoneal diaria de 10 mg/kg del anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano durante siete días, que alcanza la tasa de inhibición de los aumentos en el peso del bazo, la concentración sérica de IgA, la concentración sérica de IgE, el recuento de neutrófilos en sangre, el recuento de basófilos en sangre, el recuento de eosinófilos en sangre y/o la concentración sérica de IL-5, inducidos por la administración continua de IL-33 humana durante siete días en una cantidad de 0,4 |ig/individuo, de aproximadamente el 30 % o mayor, más preferiblemente de aproximadamente el 50 % o mayor, aún más preferiblemente de aproximadamente el 80 % o mayor, tal como se describe a continuación en el ejemplo 13.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención tiene preferiblemente excelentes propiedades físicas. En particular, el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano preferiblemente no muestra una distribución de tamaño de partícula bimodal y muestra una propiedad de agregación significativamente baja en la evaluación mediante dispersión dinámica de luz. El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la invención tiene preferiblemente un alto parámetro de interacción (kD), que es un indicador de estabilidad coloidal. Por ejemplo, el parámetro de interacción es preferiblemente de -12,4 ml/g o mayor, más preferiblemente de -10 ml/g o mayor, aún más preferiblemente de -8,5 ml/g o mayor.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención tiene preferiblemente una estabilidad termodinámica excelente. Por ejemplo, un anticuerpo preferido muestra una estabilidad termodinámica de manera que el estado plegado del dominio de inmunoglobulina desaparece a una temperatura (Tm) de 65 °C o mayor, preferiblemente de 68 °C o mayor, más preferiblemente de 70 °C o mayor, aún más preferiblemente de 73 °C o mayor.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención tiene preferiblemente una alta estabilidad del anticuerpo. La estabilidad del anticuerpo puede medirse mediante cualquier método común, por ejemplo, prueba de estabilidad de conservación o prueba de oxidación forzada. En una realización preferida de la presente invención, las moléculas de anticuerpo tienen una razón de monómeros del 90 % o mayor, más preferiblemente del 95 % o mayor, y tienen una actividad de unión a la proteína IL-33 humana del 95 % o mayor, más preferiblemente del 99 % o mayor, después de la prueba de estabilidad de conservación a una temperatura de 40 °C durante cuatro semanas, tal como se describe a continuación en el ejemplo 21.

Tal como se describe en el ejemplo 22, el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención tiene preferiblemente una actividad de unión del 80 % o mayor, más preferiblemente del 85 % o mayor, aún más preferiblemente del 90 % o mayor a la proteína IL-33 humana, después de la oxidación forzada con disolución de peróxido de hidrógeno al 1 % a una temperatura de 37 °C durante 24 horas.

En vista de los puntos anteriores, el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano tiene regiones determinantes de complementariedad que tienen respectivamente secuencias de aminoácidos según una combinación específica (C1 en la tabla 1).

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano identificado mediante la combinación de las secuencias de aminoácidos de las respectivas regiones determinantes de complementariedad tiene secuencias de aminoácidos de regiones de entramado en las regiones variables tal como se define en el presente documento.

Las secuencias de aminoácidos de las regiones de entramado tienen las siguientes secuencias de aminoácidos: la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 1 de cadena ligera son los residuos 1 a 22 de SEQ ID NO: 317 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 2 de cadena ligera son los residuos 36 a 50 de SEQ ID NO: 317 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 3 de cadena ligera son los residuos 58 a 89 de SEQ ID NO: 317 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 4 de cadena ligera son los residuos 3 a 12 de SEQ ID NO: 401 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 1 de cadena pesada son los residuos 1 a 30 de SEQ ID NO: 367 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 2 de cadena pesada son los residuos 36 a 49 de SEQ ID NO: 367 en la lista de secuencias; la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 3 de cadena pesada son los residuos 67 a 98 de SEQ ID NO: 368 en la lista de secuencias; y la secuencia de aminoácidos de la región de entramado 4 de cadena pesada son los residuos 5 a 15 de SEQ ID NO: 407 en la lista de secuencias.

En la tabla 2 se muestran ejemplos de combinaciones de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y las regiones variables de cadena ligera.

La presente invención es un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano que comprende regiones variables que tienen respectivamente secuencias de aminoácidos según la combinación V1 mostrada en la tabla 2.

Los ejemplos comparativos de un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano comprenden regiones determinantes de complementariedad que tienen respectivamente secuencias de aminoácidos según una combinación específica (V8, V15, V17 o V18 en la tabla 2).

Dependiendo de la diferencia en las regiones constantes de cadena pesada, las moléculas de inmunoglobulina humana se clasifican en IgG (incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) que tiene cadenas pesadas y; IgM que tiene cadenas pesadas |i ; IgA (incluyendo IgA1 e IgA2) que tiene cadenas pesadas a ; IgD que tiene cadenas pesadas 8; e IgE que tiene cadenas pesadas g. Todos estos tipos están abarcados en las regiones constantes del anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano dado a conocer en el presente documento. Las cadenas ligeras se clasifican en cadenas ligeras<k>y X que difieren en su posición en el cromosoma. La cadena ligera en la presente invención abarca ambas cadenas ligeras. En la producción de un producto farmacéutico de anticuerpos, se prefiere un anticuerpo que tenga cadenas ligeras<k>desde la perspectiva de la agregación, pero también es útil un anticuerpo que tenga cadenas ligeras X, porque las cadenas ligerasXtienen una secuencia de aminoácidos diferente a la de las cadenas<k>y tienen una diversidad similar a la de las cadenas<k>. El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención es preferiblemente IgG que tiene cadenas ligeras X y cadenas pesadas y, más preferiblemente IgG1 que tiene cadenas ligeras X y cadenas ligeras y1, desde la perspectiva de la estabilidad en sangre.

Dado que la secuencia de aminoácidos de IL-33 es diferente entre especies animales, la secuencia de aminoácidos de IL-33 humana mostrada en SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias es diferente de la de IL-33 de mono mostrada en SEQ ID NO: 227 en la lista de secuencias. En general, dado que los monos se usan como animales de experimentación en pruebas farmacológicas o pruebas de seguridad de productos farmacéuticos de anticuerpos, el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención puede unirse además preferiblemente a IL-33 de mono, y más preferiblemente puede unirse a IL-33 de mono con una afinidad de unión similar a la de una IL-33 humana. En una realización particularmente preferida, la razón de koff contra IL-33 humana frente a koff contra IL-33 de mono está dentro de aproximadamente 20 veces, más preferiblemente dentro de aproximadamente 10 veces, aún más preferiblemente dentro de aproximadamente cinco veces.

Los ejemplos ilustrativos del fragmento de anticuerpo de la presente invención incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos F(ab')<2>, fragmentos Fab' y fragmentos scFv. Estos fragmentos de anticuerpos pueden unirse a moléculas funcionales que no son anticuerpos, tales como polímeros no peptídicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG); materiales radiactivos; toxinas; compuestos de bajo peso molecular; citocinas; albúmina; y enzimas.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención puede unirse a un anticuerpo que tenga especificidad de unión por un antígeno distinto de IL-33, para producir un anticuerpo multiespecífico tal como un anticuerpo biespecífico. Los ejemplos no limitativos del antígeno distinto de IL-33 incluyen TNF-a , receptores de IL-6, CD3, CD20, integrina a 4, BLys, linfopoyetina estromal tímica, IgE, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-17, IL-23 e IL-25.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano y los fragmentos del mismo pueden modificarse en su secuencia de aminoácidos o estructura de cadenas de azúcar en regiones Fc, para producir un anticuerpo funcionalmente modificado que tiene funciones o propiedades reguladas, tales como función citotóxica, función de activación del complemento y semivida en sangre (Kenya Shitara, Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 2009, vol. 129(1), pág. 3; Akiko Ishiiet al.,Folia Pharmacologica Japonica, 2010, vol. 136(5), pág.

280; Shuhei Hashiguchiet al.,SEIKAGAKU (The Journal of Biochemistry), 2010, vol. 82(8), pág. 710; Strohl, Current Opinion in Biotechnology, 2009, vol. 20, pág. 685).

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano y los fragmentos de anticuerpo del mismo pueden unirse a otra molécula funcional para formar un anticuerpo conjugado. Por ejemplo, puede añadirse una nueva función uniendo al anticuerpo una molécula funcional, tal como un polímero no peptídico, por ejemplo, polietilenglicol (PEG); materiales radiactivos; toxinas; compuestos de bajo peso molecular; albúmina; citocinas; y enzimas.

Una molécula de ácido nucleico puede codificar para una porción proteica de un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano que comprende regiones de entramado que tienen secuencias de aminoácidos de línea(s) germinal(es); un vector que incluye la molécula de ácido nucleico; una célula huésped que incluye el vector; y un método para la producción de un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano que incluye cultivar la célula huésped.

Hay una composición que comprende el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano descrito anteriormente. Dado que la IL-33 induce inflamación y similares, se espera que el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano sea aplicable al diagnóstico, al tratamiento, a la prevención o al alivio de una enfermedad asociada con IL-33. Por consiguiente, hay un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la invención para su uso en el tratamiento, la prevención o el alivio de una enfermedad asociada con IL-33. En aún otra realización, dado que la IL-33 induce citocinas, quimiocinas y mediadores inflamatorios, hay un inhibidor de citocinas que comprende el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la invención.

La citocina que va a inhibirse por el inhibidor de citocinas es una de las citocinas inducidas por IL-33.

En otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo monoclonal de la presente invención. La presente invención también se refiere al diagnóstico, al tratamiento, a la prevención o al alivio de una enfermedad asociada con IL-33, que comprende administrar el anticuerpo monoclonal de la invención.

La enfermedad asociada con IL-33 incluye, pero sin limitarse a, asma, dermatitis atópica, urticaria, polinosis, choque anafiláctico, sinusitis (incluyendo sinusitis eosinofílica), encefalomielitis alérgica, síndrome hipereosinofílico, polimialgia reumática, enfermedades cardíacas reumáticas, esclerosis múltiple, artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis juvenil, artritis psoriásica, artrosis deformante y síndrome de Reiter), lupus eritematoso sistémico (incluyendo lupus discoide), pénfigo, penfigoide, psoriasis, espondilitis anquilosante, hepatitis (por ejemplo, hepatitis autoinmunitaria y hepatitis crónica activa), enfermedades inflamatorias del intestino (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y enteropatía sensible al gluten), síndrome de Sjogren, anemia hemolítica autoinmunitaria, enfermedades oculares inflamatorias autoinmunitarias, trombocitopenia neonatal autoinmunitaria, neutropenia autoinmunitaria, ooforitis y orquitis autoinmunitarias, trombocitopenia autoinmunitaria, tiroiditis autoinmunitaria, miositis múltiple, dermatomiositis, miastenia grave, resistencia a los agonistas adrenérgicos, alopecia areata (alopecia greata), síndrome antifosfolipídico, enfermedades autoinmunitarias suprarrenales (por ejemplo, enfermedad autoinmunitaria de Addison), dermatitis celiaca, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmunitaria (SFCDI), enfermedad de aglutininas frías, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis (por ejemplo, nefropatía por IgA), enfermedad de Graves, hipertiroidismo (es decir, tiroiditis de Hashimoto), púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), enfermedad mixta del tejido conjuntivo, diabetes mellitus tipo 1 o inmunomediada, anemia perniciosa, policondritis, síndrome poliglandular, síndrome del hombre rígido, vitíligo, sarcoidosis, poliendocrinopatía, otras endocrinopatías, arterioesclerosis, fibrosis hepática (por ejemplo, cirrosis biliar primaria), fibrosis pulmonar (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), esclerodermia (incluyendo el síndrome CREST y el fenómeno de Raynaud), nefritis tubulointersticial, enfermedad por depósitos densos, lesión renal aguda, miocarditis, miocardiopatía, neuritis (por ejemplo, síndrome de Guillain-Barré), poliarteritis nudosa, síndrome de cardiotomía, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía por IgA, liquen plano, enfermedad de Meniere, síndrome post-infarto de miocardio (post-IM), uveítis, oftalmía por uveítis, vasculitis, agammaglobulinemia primaria, cáncer (por ejemplo, tumor cerebral, cáncer de laringe, cáncer de labio y boca, cáncer de hipofaringe, cáncer de tiroides, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, carcinoma corticosuprarrenal, cáncer de las vías biliares, cáncer de vesícula biliar, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer testicular, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, tumor de Ewing, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, melanoma, mesotelioma y mieloma múltiple), infecciones resistentes al aclaramiento por el sistema inmunitario (por ejemplo, síndrome respiratorio agudo grave (SARS)), tormenta letal de citocinas asociada con infección de gripe virulenta y septicemia. La enfermedad asociada con IL-33 es preferiblemente asma, dermatitis atópica, polinosis, choque anafiláctico, sinusitis (incluyendo sinusitis eosinofílica), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, artritis, lupus eritematoso sistémico, pénfigo, penfigoide, esclerodermia, espondilitis anquilosante, fibrosis hepática (incluyendo cirrosis biliar primaria), fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), lesión renal aguda, vasculitis y cáncer.

Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención puede contener además un portador, diluyente o excipiente farmacológicamente aceptable, además del anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano o una sal del mismo como principio activo. La composición farmacéutica puede contener además un principio activo adicional distinto del anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención, por ejemplo, un agente antiinflamatorio o un agente inmunosupresor. Una composición de este tipo se proporciona en una forma de dosificación adecuada para administración parenteral u oral. Desde la perspectiva del uso como producto farmacéutico de anticuerpos, se prefiere la administración parenteral. Los ejemplos de la administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, administración intravenosa, intraarterial, subcutánea, tópica, intraperitoneal, intramuscular, nasal, oftálmica, transdérmica, transmucosa, intratecal, rectal, intramuscular e intracerebral.

La composición farmacéutica puede proporcionarse en cualquier forma de dosificación dependiendo de la vía de administración. Los ejemplos de la forma de dosificación incluyen inyección, polvo, infusión, gránulo, comprimido y supositorio. Desde la perspectiva de la administración parenteral, la forma de dosificación es preferiblemente inyección, infusión o polvo para disolver antes de su uso. Estas preparaciones pueden contener además cualquiera de los diversos adyuvantes usados en productos farmacéuticos. Los ejemplos específicos del adyuvante incluyen portadores y otros aditivos, tales como estabilizador, conservante, analgésico y emulsionante.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención puede proporcionarse mediante infusión continua a intervalos de, por ejemplo, una vez por día, semana o mes, o de una a siete veces por año, o mediante dosificación. La dosificación puede proporcionarse mediante administración intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular o intraventricular, o mediante inhalación. Un protocolo de dosis preferido implica la dosis máxima o una frecuencia de administración para evitar efectos secundarios adversos graves. La dosis semanal total es generalmente de al menos aproximadamente 0,05 |ig/kg (peso corporal), más generalmente de al menos aproximadamente 0,2 |ig/kg, lo más generalmente de al menos aproximadamente 0,5 |ig/kg, normalmente de al menos aproximadamente 1 |ig/kg, más normalmente de al menos aproximadamente 10 |ig/kg, lo más normalmente de al menos aproximadamente 100 |ig/kg, preferiblemente de al menos aproximadamente 0,2 mg/kg, más preferiblemente de al menos aproximadamente 1,0 mg/kg, lo más preferiblemente de al menos aproximadamente 2,0 mg/kg, óptimamente de al menos aproximadamente 10 mg/kg, más óptimamente de al menos aproximadamente 25 mg/kg, lo más óptimamente de al menos aproximadamente 50 mg/kg.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención es útil, por ejemplo, en un ensayo de diagnóstico para la detección de la expresión de IL-33 en células o tejidos específicos, o en suero sanguíneo, de un paciente con una enfermedad asociada con IL-33. Para aplicaciones de diagnóstico, normalmente, el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano es preferiblemente un anticuerpo conjugado marcado con un resto detectable.

A continuación se describirá el método para la producción del anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 y similares de la presente invención. El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano puede prepararse mediante una técnica de ingeniería genética, mediante la incorporación de una secuencia de ADN que contiene secuencias que codifican para una combinación deseada de regiones determinantes de complementariedad y una combinación de regiones de entramado y codifica para regiones variables de cadena ligera y cadena pesada en un vector de expresión; transformación del vector de expresión en una célula huésped; y luego cultivo de la célula huésped (véase, por ejemplo, Borrebaeck C. A. K. y Larrick J. W. THERAPEuTiC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990). Alternativamente, pueden producirse secuencias de ADN que codifican, respectivamente, para una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa mediante la unión de una secuencia de ADN que codifica para la región constante de cadena ligera a una secuencia de ADN que codifica para la región variable de cadena ligera y la unión de una secuencia de ADN que codifica para la región constante de cadena pesada a una secuencia de ADN que codifica para la región variable de cadena pesada. La combinación de secuencias de ADN que codifican, respectivamente, para la cadena pesada de longitud completa y la cadena ligera de longitud completa de un anticuerpo neutralizante anti-IL-33 humano preferido de la presente invención incluye, por ejemplo, la de IgG1 que tiene una cadena ligera X tal como se muestra en la tabla 5. Si el anticuerpo se produce con una célula animal mediante una técnica de ingeniería genética, puede delecionarse el residuo de lisina C-terminal. Por este motivo, los tres nucleótidos “aag” en el extremo 3'-terminal de la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada mostrada en la tabla 5 (SEQ ID NO: 254 a 277 en la lista de secuencias) pueden delecionarse de cada secuencia de ácido nucleico de cadena pesada.

[Tabla 5]

Tabla 5. Las siguientes SEQ ID NO. muestran las SEQ ID NO. en la lista de secuencias

El sistema de producción para preparar anticuerpos puede ser cualquiera de los sistemas de producciónin vitro.Los ejemplos del sistema de producciónin vitroincluyen células eucariotas, por ejemplo, células animales, células vegetales o células fúngicas; y células procariotas, por ejemplo, células bacterianas tales comoEscherichia coliyBacillus subtilis.Los ejemplos de células animales aplicables incluyen células de mamífero, por ejemplo, células usadas generalmente, tales como células CHO, COS, de mieloma, BHK, HeLa, Vero, 293, NS0, Namalwa e YB2/0; y también pueden usarse células de insectos y células vegetales. Se prefieren las células 293 y CHO.

Si el anticuerpo monoclonal se produce en un sistema de producciónin vitrotal como se describió anteriormente, el ADN que codifica para la cadena pesada y el ADN que codifica para la cadena ligera pueden incorporarse en vectores de expresión independientes para cotransformar el huésped, o pueden incorporarse juntos en un vector de expresión único para transformar el huésped (véase el documento WO 94/11523). Los ejemplos del vector preferido aplicable a células animales incluyen, pero no se limitan a, pConPlus, pcDM8, pcDNA I/Amp, pcDNA3.1 y pREP4.

El anticuerpo así producido puede purificarse hasta homogeneidad. Los anticuerpos pueden separarse y purificarse mediante cualquier método habitual usado para la separación y purificación de proteínas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden separarse y purificarse seleccionando o combinando adecuadamente métodos e instrumentos incluyendo, pero sin limitarse a, columnas cromatográficas para cromatografía de afinidad, filtración, ultrafiltración, precipitación de sales, diálisis, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y enfoque isoeléctrico (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Las columnas usadas en cromatografía de afinidad incluyen columnas de proteína A y columnas de proteína G. Los ejemplos de la columna de proteína A incluyen las columnas Hyper D, POROS y Sepharose F. F. (Amersham Biosciences).

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención puede unirse a cualquier anticuerpo que tenga especificidad de unión por otro antígeno distinto de IL-33 para producir un anticuerpo multiespecífico, tal como un anticuerpo biespecífico. Ya se conocen bien varios métodos químicos para producir el anticuerpo biespecífico (Nisonoff, A.et al.,Archives of biochemistry and biophysics., 1961, vol. 90, págs. 460 462, Brennan, M.et al.,Science, 1985, vol. 299, págs. 81-83). En tales métodos, cada uno de dos anticuerpos diferentes se hidroliza con una enzima y luego se escinden los enlaces disulfuro en las cadenas pesadas del anticuerpo con un agente reductor, seguido del mezclado de los dos anticuerpos heterólogos y la reoxidación de la mezcla. De ese modo se produce un anticuerpo bivalente. También se ha dado a conocer recientemente la preparación de anticuerpos usando un reticulante, tal como glutaraldehído o carbodiimida (publicación de solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2-1556). Ya se han establecido en la técnica varias técnicas de ingeniería genética para producir anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos. Puede prepararse un anticuerpo biespecífico deseado uniendo regiones de unión al antígeno de dos anticuerpos monoclonales diferentes en tándem según el método DVD-Ig (Wuet al.,Nature Biotechnology 25(11), 1290(2007)), o modificando la región Fc de un anticuerpo para combinar cadenas pesadas de dos anticuerpos diferentes que pueden unirse a antígenos diferentes según el método ART-Ig (Kitazawaet al.,Nature Medicine 18(10), 1570(2012)), por ejemplo.

Una forma funcionalmente modificada del anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención o un anticuerpo conjugado que contiene el anticuerpo de la invención puede prepararse mediante un método descrito a continuación, por ejemplo. Si el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la invención se produce en células huésped CHO inactivadas para el gen de a 1,6-fucosiltransferasa (FUT8), el anticuerpo tiene un contenido reducido de fucosa en las cadenas de azúcar, lo que da como resultado una mayor función citotóxica, mientras que un anticuerpo producido en células huésped CHO transfectadas con el gen FUT8 tiene una menor función citotóxica (documentos WO 2005/035586, WO 2002/31140 y WO 00/61739). La función de activación del complemento del anticuerpo puede regularse mediante la modificación de su región Fc mediante una modificación en los residuos de aminoácidos (patentes estadounidenses n.os 6737056, 7297775 y 7317091). La semivida del anticuerpo en sangre puede prolongarse con una variante de la región Fc que tenga una mayor capacidad de unión a FcRn, uno de los receptores de Fc (Shuhei Hashiguchiet al.,SEIKAGAKU (The Journal of Biochemistry), 2010, vol. 82(8), pág. 710). Tales anticuerpos funcionalmente modificados pueden producirse mediante técnicas de ingeniería genética.

El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano de la presente invención puede unirse a otras moléculas funcionales para producir un anticuerpo conjugado. Por ejemplo, si se une PEG como molécula funcional a un anticuerpo, los ejemplos no limitativos del PEG incluyen PEG con un peso molecular de 2000 a 100000 Da, más preferiblemente de 10000 a 50000 Da. El PEG puede ser o bien lineal o bien ramificado. El PEG puede unirse a un grupo amino N-terminal de un aminoácido en el anticuerpo usando el grupo activo NHS. Los ejemplos de materiales radiactivos usados como molécula funcional incluyen 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu, 211At y similares. Los materiales radiactivos pueden unirse directamente al anticuerpo mediante cualquier método, tal como el método de cloramina T. Los ejemplos de toxinas usadas como molécula funcional incluyen toxinas bacterianas (por ejemplo, toxina diftérica), fitotoxinas (por ejemplo, ricina), toxinas de bajo peso molecular (por ejemplo, geldanamicina), maitansinoide y caliqueamicina. Los ejemplos del compuesto de bajo peso molecular usado como molécula funcional incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, mitomicina, neocarzonostatina, vindesina y colorantes fluorescentes tales como FITC. Los ejemplos de enzimas usadas como molécula funcional incluyen luciferasa (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; patente estadounidense n.° 4737456), malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRPO)), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasa (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasa heterocíclica (por ejemplo, uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa y microperoxidasa. Los ejemplos del grupo de unión usado en la unión química de toxina, compuesto de bajo peso molecular o enzima incluyen radicales divalentes (por ejemplo, alquileno, arileno y heteroarileno), grupos de unión representados por -(CR<2>)nO(CR<2>)n- (donde R es cualquier grupo sustituyente), unidades de repetición de alcoxilo (por ejemplo, polietilenoxilo, PEG y polimetilenoxilo), alquilamino (por ejemplo, polietilenamino y Jeffamine™) y ésteres y amidas de diácidos (incluyendo succinatos, succinamidas, diglicolatos, malonatos y capramidas). Ya se han establecido en la técnica varios métodos de modificación química para unir la molécula funcional (D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd., Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc.; Chariet al.,Cancer Res., 1992 vol. 152:127; Liuet al.,Proc Natl Acad Sci USA, 1996, vol.

93:8681).

Puede producirse un anticuerpo quimérico ligando un ADN que codifica para regiones variables de un anticuerpo no humano con un ADN que codifica para regiones constantes de un anticuerpo humano, incorporando el ADN resultante en un vector de expresión, que luego se transforma en una célula huésped para la expresión del anticuerpo de interés (véanse los documentos EP 125023 y WO 92/19759).

Puede prepararse un anticuerpo humano mediante el procedimiento descrito en los ejemplos a continuación. El anticuerpo humano también puede prepararse mediante cualquier técnica, tal como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozboret al.,1983 Immunol Today 4: pág. 72) y la técnica de hibridoma de VEB para producir un anticuerpo monoclonal humano (Coleet al.,1985, MONOCLONAL ANTIBODIES AND C<a>N<c>E<r>THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pág. 77). El anticuerpo humano también puede producirse inmunizando un ratón transgénico al que se le ha introducido un gen de anticuerpo humano con una proteína antigénica para producir un hibridoma. Los ejemplos de ratón transgénico incluyen ratón HuMab (marca registrada) (Medarex), ratón KMTM (Kirin Pharma), ratón KM (FCyRllb-KO) y ratón Veloclmmune (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.).

En otra divulgación, hay un anticuerpo artificial que compite en la unión a IL-33 con el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 de la invención. Como anticuerpo artificial, puede usarse, por ejemplo, la décima unidad del dominio de fibronectina humana tipo III (FNfn10). Puede producirse un anticuerpo artificial que puede unirse a una diana deseada introduciendo una mutación en los bucles BC, DE y/o FG de la unidad. Además del dominio extracelular de fibronectina, como anticuerpo artificial pueden usarse dominios Kunitz de inhibidores de serina proteasa y péptidos tales como anquirina y lipocalina. Estos anticuerpos artificiales pueden producirse mediante una técnica de ingeniería genética que implica la introducción de un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido en células deEscherichia coli,levadura o animales, el cultivo de las células huésped y luego la recuperación y purificación del sobrenadante de cultivo.

El anticuerpo artificial puede seleccionarse buscando en una biblioteca de secuencias aleatorias que incluye combinaciones aleatorias de aminoácidos para moléculas peptídicas de bajo peso molecular que puedan unirse específicamente al epítopo de la presente invención, tal como un anticuerpo, en lugar del uso de la secuencia de aminoácidos de una proteína específica o una parte de la misma tal como se describió anteriormente (por ejemplo, Hipolitoet al.,Current Opinion in Chemical Biology, 2012 vol. 16: 196; Yamagishiet al.,Chemistry & Biology, 2011 vol. 18: 1562). Un péptido de este tipo también puede producirse mediante cualquier método de síntesis química tal como una técnica de fluorenilmetiloxicarbonilo o una técnica de t-butiloxicarbonilo, en lugar de una técnica de ingeniería genética.

[Combinación de secuencias del anticuerpo]

Las combinaciones C1 a C30 mostradas en la tabla 1, es decir, combinaciones de secuencias de aminoácidos para regiones determinantes de complementariedad; las combinaciones V1 a V30 mostradas en la tabla 2, es decir, combinaciones de secuencias de aminoácidos para regiones variables; las combinaciones CN1 a CN30 mostradas en la tabla 5, es decir, combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos para regiones determinantes de complementariedad; y las combinaciones IGN1 a IGN30 mostradas en la tabla 5, es decir, combinaciones de secuencias de ácido nucleico, del anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano descrito en la memoria descriptiva corresponden respectivamente a secuencias de clones idénticas. La correspondencia entre las secuencias se muestra en la tabla 6. Por ejemplo, las regiones determinantes de complementariedad del clon A10-1C04 corresponden respectivamente a las seis secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad representadas por la combinación C1, y la combinación de secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad pueden estar codificadas respectivamente por las seis secuencias de ácidos nucleicos de la combinación CN1. El clon comprende regiones variables de cadena pesada y cadena ligera que corresponden respectivamente a las dos secuencias de aminoácidos de la combinación V1. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera X y la cadena pesada y, incluyendo las regiones variables, de la combinación V1 están codificadas respectivamente por las dos secuencias de ácidos nucleicos de la combinación IGN1.

[Tabla 6]

Tabla 6

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora con más detalle mediante ejemplos, que no deben interpretarse como limitativos de la invención, a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1: Preparación de anticuerpos anti-IL-33 e identificación de péptidos epitópicos

[Preparación de anticuerpos]

Se inmunizó a un animal con una proteína IL-33 humana para producir un hibridoma a partir de las células esplénicas del animal inmunizado, y de ese modo se preparó el anticuerpo monoclonal. El ARN se extrajo de las células esplénicas del animal inmunizado para producir una biblioteca de anticuerpos del animal. Se clonaron anticuerpos que podían unirse a la proteína IL-33 humana a partir de dicha biblioteca y de la biblioteca de anticuerpos humanos sin tratamiento previo mediante la técnica de presentación en fagos. De ese modo se prepararon ocho anticuerpos monoclonales anti-IL-33 (anticuerpos A a H).

[Barrido de matriz de péptidos]

Para identificar el epítopo de los anticuerpos contra IL-33 resultantes, se llevó a cabo un barrido de matriz de péptidos para confirmar la unión de cada anticuerpo a cada uno de los péptidos parciales (20 residuos de longitud) de IL-33 humana. Se sintetizaron péptidos que consistían en 20 aminoácidos, cada uno desplazado en 10 aminoácidos dentro de la secuencia que abarca valina en la posición 101 N-terminal (V101) y treonina en la posición 270 N-terminal (T270) para cubrir la mayor parte de las moléculas de IL-33 humana madura. De ese modo se sintetizaron dieciséis péptidos en total (PEP11 a PEP26). La secuencia y la posición de cada uno de estos péptidos se muestran en la tabla 7.

[Tabla 7]

Tabla 7

Cada péptido se biotiniló en el extremo N-terminal y se inmovilizó como ligando en un chip sensor NeutrAvidin de un sistema de resonancia de plasmón superficial (SPR) (ProteOn XPR36, disponible de Bio-Rad Laboratories, Inc.). Como control positivo, la IL-33 humana madura (residuos 112 a 270) se unió en el extremo N-terminal con la secuencia de Avitag y se biotiniló mediante una reacción de biotina ligasa específica para la secuencia de AviTag. La proteína resultante (hlL-33) como ligando se inmovilizó en el chip sensor de SPR. Luego se cargó cada anticuerpo de prueba, la proteína receptor de IL-33 humana (quimera<s>T2 Fc humana recombinante) (ALX-201-367-C050, disponible de Enzo Life Science, Inc.) o tampón (Tween 20 al 0,05 %/PBS) solo como analito en el chip sensor que contiene el ligando inmovilizado en el mismo (concentración de anticuerpo: 10 |ig/ml; velocidad de flujo: 100 |il/min), para permitir que se unan al ligando. Después del lavado, se midió la cantidad de analito (cantidad de anticuerpo) unido al ligando en el chip sensor como valor en UR. Los resultados se muestran en la figura 2.

Los anticuerpos se designaron, en secuencia, según la posición del epítopo en la proteína IL-33 humana: el anticuerpo contra el epítopo situado en la porción más N-terminal se denominó “anticuerpo A”. Los anticuerpos A y B se unieron a PEP12, los anticuerpos C y D se unieron a PEP14, el anticuerpo E se unió a PEP16 y PEP17, el anticuerpo F se unió a PEP24 y los anticuerpos G y H se unieron a PEP26. Un anticuerpo policlonal anti-IL-33 humano disponible comercialmente (AF3625, disponible de R&D Systems, Inc.) se unió a la mayoría de los 16 péptidos de IL-33 humana estudiados. El receptor de IL-33 humana (ST2) se unió a la proteína IL-33 humana, pero sustancialmente no se unió a los péptidos de IL-33 humana (PEP11 a PEP26). El experimento no logró identificar qué porción de IL-33 era significativa para la unión con ST2. No se observó unión con el ligando en el tampón solo o en la IgG murina (MAB002, disponible de R&D Systems, Inc.). Se comparó la capacidad de unión de los anticuerpos sometidos a prueba a hIL-33 (residuos 112 a 270). El orden descendente de la capacidad de unión del anticuerpo a hIL-33 (residuos 112 a 270) fue anticuerpo G, anticuerpo H, anticuerpo D, anticuerpo E, anticuerpo B, anticuerpo A, anticuerpo C y anticuerpo F.

Ejemplo 2: Evaluación de la actividad neutralizante de IL-33 de los anticuerpos monoclonales anti-IL-33 - 1

Se midió la actividad neutralizante de IL-33 de los anticuerpos A, B, E y F basándose en el efecto inhibidor sobre la unión entre IL-33 humana y ST2 humana inmovilizada como indicador. Se dispensó quimera ST2 Fc humana recombinante (ALX-201-367-C050, disponible de Enzo Life Science, Inc.) diluida con solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una microplaca de 96 pocillos (NuncTM, n.° 442404) (1 |ig/ml, 50 |il/pocillo) y se dejó reposar durante la noche a una temperatura de 4 °C. Al día siguiente, la microplaca se lavó una vez con PBS que contenía BSA al 1 % (PBS-B) y se añadió PBS-B a la microplaca (250 |il/pocillo) para el bloqueo a temperatura ambiente durante dos horas. Después del bloqueo, se añadió una disolución mixta de cada anticuerpo de prueba diluido con PBS-B (concentración final: 10 |ig/ml) y una proteína IL-33 humana recombinante (ILC0701, disponible de ATGen Co., Ltd.) (concentración final: 1 |ig/ml) a la microplaca (50 |il/pocillo) y se incubó la disolución a temperatura ambiente durante dos horas. Después de lavar la microplaca con PBS que contenía Tween 20 al 0,1 % (PBS-T) cinco veces, se añadió posteriormente anticuerpo de cabra anti-IL-33 humana (AF3625, disponible de R&D Systems, Inc.; concentración final: 1 |ig/ml; 50 |ig/pocillo) diluido con PBS-B a la microplaca y luego se incubó la disolución a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar la microplaca con PBS-T cinco veces, se añadió el anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra marcado con HRP (Invitrogen: 61-1620, 50 |il/pocillo) diluido hasta 2000 veces con PBS-B y se incubó la disolución a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar la microplaca con PBS-T cinco veces, se añadió sustrato de peroxidasa de micropocillos SureBlue™ TMB (KPL: 52-00-01, 50 |il/pocillo). Se dejó reaccionar la disolución a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego se detuvo la reacción con disolución de parada TMB (KPL: 50 85-05, 50 |il/pocillo). Se midió la diferencia entre la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm y a una longitud de onda de 620 nm con un lector de microplacas (SpectraMax 190, disponible de Molecular Devices, LLC.). Se preparó una muestra reemplazando la IL-33 humana por IL-1 p humana (PeproTech, 200-01B) (concentración final: 1 |ig/ml), y los resultados observados en esta muestra se establecieron como fondo. El efecto inhibidor de cada anticuerpo sobre la unión de ST2 e IL-33 (porcentaje de inhibición competitiva en el sistema de unión IL-33/ST2) se determinó calculando el porcentaje de inhibición (%) de la unión de cada anticuerpo con respecto a la unión observada en una muestra que contenía IL-33 humana sola (concentración final: 1 |ig/ml). Según los resultados, el anticuerpo A (epítopo: PEP12) mostró una inhibición del 66 %, el anticuerpo B (epítopo: PEP12) mostró una inhibición del 55 %, el anticuerpo E (epítopos: PEP16 y PEP17) mostró una inhibición del 0 % y el anticuerpo F (epítopo: PEP24) mostró una inhibición del 39 %. Los cuatro anticuerpos sometidos a prueba, excepto el anticuerpo E (es decir, los anticuerpos A, B y F), mostraron un porcentaje de inhibición del 30 % o mayor a una concentración final de 10 |ig/ml.

[Tabla 8]

Tabla 8

Anticuerpo F

Ejemplo 3: Evaluación del efecto neutralizante de IL-33 del anticuerpo monoclonal anti-IL-33 - 2

Se midió la actividad neutralizante de IL-33 de cada uno de los anticuerpos de prueba (anticuerpos A a H) basándose en el efecto inhibidor sobre la producción de IL-6 inducida por<i>L-33 humana en células endoteliales de la vena umbilical humanas normales (HUVEC) (CLC2517A, disponible de LONZA Group Ltd.) como indicador. Las células HUVEC se inocularon en una microplaca de 96 pocillos (IWAKI, MT4940-010) (6 * 103/0,1 ml/pocillo) y se confirmó la confluencia celular. Se añadieron (0,2 ml/pocillo) cada anticuerpo anti-IL-33 (concentración final: 10 |ig/ml) e IL-33 humana recombinante (ILC0701, disponible de ATGen Co., Ltd.; concentración final: 100 ng/ml) a un medio (medio EGM-2 (CLCC-3156 y CLCC-4176, disponible de LONZA Group Ltd.)) y se incubó la disolución a una temperatura de 37 °C durante 24 horas. Después de 24 horas, se midió la concentración de IL-6 en el medio con un kit de ELISA disponible comercialmente (EH2IL6, disponible de Thermo Scientific). Después de la recogida del medio, se midió la viabilidad celular con un kit de recuento celular (345-06463, disponible de Dojindo Molecular Technologies, Inc.), para confirmar que el efecto inhibidor sobre la producción de IL-6 no fue provocado por una disminución en el recuento de células viables. Para determinar la actividad neutralizante de IL-33 de cada anticuerpo de prueba (% de inhibición de la producción de IL-6 en el sistema HUVEC), se calculó el porcentaje de inhibición (%) de la producción de IL-6 con respecto a la producción de IL-6 provocada por el tratamiento con IL-33 humana recombinante sola. Según los resultados, el anticuerpo A (epítopo: PEP12) mostró una inhibición del 51 %, el anticuerpo B (epítopo: PEP12) mostró una inhibición del 48 %, el anticuerpo C (epítopo: PEP14) mostró una inhibición del 33 %, el anticuerpo D (epítopo: PEP14) mostró una inhibición del 38 %, el anticuerpo E (epítopo: PEP16 y PEP17) mostró una inhibición del 0 %, el anticuerpo F (epítopo: PEP24) mostró una inhibición del 38 %, el anticuerpo G (epítopo: PEP26) mostró una inhibición del 48 % y el anticuerpo H (epítopo: PEP26) mostró una inhibición del 56 %. Los ocho anticuerpos analizados, excepto el anticuerpo E, mostraron un porcentaje de inhibición del 30 % o mayor (tabla 9). Entre estos anticuerpos, aquellos que podían unirse a un epítopo que consistía en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 111 a 130, 131 a 150, 231 a 250 y 251 a 270 de SEQ ID NO: 1 en la lista de secuencias mostraron aumentos significativos en la actividad neutralizante, a la concentración de anticuerpo de 3, 10 y 30 |ig/ml (por ejemplo, el anticuerpo D mostró una inhibición del 23 %, el 42 % y el 61 %, respectivamente); los resultados demuestran que tales epítopos son adecuados para producir un anticuerpo que tiene una acción antagonista.

[Tabla 9]

Tabla 9

El anticuerpo E se unió a hIL-33 (figura 2), pero no mostró capacidad neutralizante funcional (tablas 8 y 9). PTL 2 (documento WO 2008/132709) da a conocer tres epítopos: epítopo 1 (posiciones 155 a 198), epítopo 2 (posiciones 165 a 188) y epítopo 3 (posiciones 175 a 178). Los presentes experimentos revelaron que estos epítopos tenían una secuencia que se superponía con los péptidos epitópicos para el anticuerpo E (posiciones 151 a 180) que se confirmó que no tenían actividad neutralizante de IL-33. Estos resultados sugieren que los anticuerpos contra los epítopos descritos en PTL 2 no pueden inhibir suficientemente la unión de IL-33 con ST2, su receptor, y tienen una actividad neutralizante de IL-33 nula o muy baja.

Teóricamente, las posibles causas de la ausencia de actividad neutralizante de IL-33 en el anticuerpo E serían la inferioridad del epítopo y la insuficiencia de afinidad. Los anticuerpos D, G y H tendían a tener una menor avidez con hIL-33, en comparación con el anticuerpo E, pero mostraron claramente actividad neutralizante de IL-33. En vista de la existencia de tales clones, se cree que la ausencia de actividad neutralizante probablemente no se deba a una insuficiencia de afinidad. Basándose en tales hallazgos, se cree que los cuatro epítopos encontrados actualmente por los inventores (PEP12, PEP14, PEP24 y PEP26) son epítopos funcionales cuando el propósito es la neutralización de la citocina IL-33, en el sentido de que la avidez entre IL-33 y los anticuerpos para los epítopos es relevante para la actividad neutralizante de IL-33 de los anticuerpos, a diferencia de los epítopos dados a conocer en PTL 2. Un anticuerpo que puede unirse a un epítopo funcional tiene un alto efecto antagonista sobre IL-33, mientras que un anticuerpo que puede unirse a un epítopo no funcional tiene un efecto antagonista bajo o nulo sobre IL-33.

Ejemplo 4: Mapeo de péptidos epitópicos en la conformación de IL-33 humana

Para identificar los átomos interfaciales (el átomo de IL-33 ubicado a una distancia atómica de 5 A o menos de un átomo componente de ST2, cuando los dos átomos están en la proximidad más cercana) que serían un epítopo preferido para la producción de un anticuerpo con efecto antagonista, los cuatro péptidos epitópicos se mapearon en la conformación del complejo IL-33 humana/ST2 humana. La estructura cristalográfica de rayos X del complejo IL-33 humana/ST2 humana (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics: PDB ID 4KC3) carecía de una estructura parcial de la proteína IL-33, por lo que fue imposible mostrar las posiciones de todos los péptidos epitópicos identificados en la invención. Los inventores crearon así un modelo de homología basado en la estructura cristalográfica de rayos X (4KC3) como molde (figura 3; se usó Discovery Studio 3.5 (disponible de Accelrys)) y los péptidos epitópicos (PEP12, PEP14, PEP24 y PEP26) correspondientes a los anticuerpos que mostraron actividad neutralizante en los presentes experimentos se mapearon en el modelo (figura 4 a figura 7). En las figuras 4 a 7, la IL-33 humana y los péptidos epitópicos se muestran en gris oscuro, y la ST2 unida a IL-33 o a los péptidos epitópicos se muestra en gris claro. Los átomos interfaciales se resaltan indicándolos con esferas más grandes para mostrar claramente la posición de la superficie de contacto entre la proteína IL-33 y los receptores de IL-33 en la superficie de la proteína IL-33. Los resultados demostraron que cada uno de estos péptidos epitópicos (PEP12, PEp14, PEP24 y PEP26) tiene aminoácidos que contienen átomos interfaciales. Los ejemplos de aminoácidos que contienen los átomos interfaciales incluyen P118, I119, T120, Y122, L123, R124, S125, L126, S127, Y129 y N130 de PEP12; D131, Q132, S133, T135, A137, L138, E139, S142, Y143, E144, I145, Y146, E148, D149 y L150 de PEP14; D244, N245 y H246 de PEP24; y K266, L267, S268 y E269 de PEP26. Se cree que un epítopo preferido al que se unirá específicamente un anticuerpo con efecto antagonista tiene aminoácidos que contienen átomos interfaciales.

Ejemplo 5: Preparación de anticuerpos anti-IL-33 humanos (clones parentales)

Usando una biblioteca de presentación en fagos de scFv humano (n-CoDeR, disponible de Biolnvent International AB) (Soderlindet al.,Nature biotechnology, 2000, vol. 18(8), pág. 852), se prepararon dos clones parentales diferentes (scFv) (indica que la forma molecular es scFv; a continuación en el presente documento representados de la misma manera) (clones designados A00-0070 y A00-0036), que podían unirse a IL-33 (residuos 112 a 270) para inhibir la unión de IL-33 a ST2 e inhibir la actividad de IL-33, cuando se analizaron basándose en la producción de IL-6 dependiente de IL-33 en células endoteliales de la vena umbilical humanas normales (HUVEC) tal como se describe a continuación. Los anticuerpos se secuenciaron para obtener sus secuencias de bases y secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena ligera y cadena pesada. A00-0070 y A00-0036 tenían respectivamente secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena ligera y cadena pesada según las combinaciones V29 y V30, respectivamente, mostradas en la tabla 2.

Ejemplo 6: Determinación de la sustitución de aminoácidos para mejorar las regiones determinantes de complementariedad

Las regiones determinantes de complementariedad de dos clones parentales se modificaron mediante técnicas de presentación en ribosomas Fab y presentación en fagos Fab, para conseguir una afinidad aumentada con IL-33 y propiedades físicas mejoradas (es decir, hidrofobia superficial reducida y la consiguiente agregación disminuida y solubilidad aumentada) de los clones. Las regiones determinantes de complementariedad se modificaron en las dos etapas siguientes: la primera etapa de determinación de sustituciones de un solo aminoácido para mejorar la afinidad con IL-33 y las propiedades físicas; y la segunda etapa de determinación de combinaciones de tales sustituciones de un solo aminoácido (Fujinoet al.,Biochem. Biophys. Res. Commun., 2012, vol. 428(3), pág. 395).

Se construyó un vector de presentación en ribosomas Fab basándose en las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de los dos clones parentales, y luego se sometió a reacciones de PCR de múltiples etapas que implicaban PCR de mutagénesis dirigida y PCR de extensión solapada, para construir una biblioteca completa de variantes de sustitución de un solo aminoácido que cubrieran todas las sustituciones de un solo aminoácido dentro de las seis regiones determinantes de complementariedad (LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3) del anticuerpo. Los residuos de aminoácidos se reemplazaron respectivamente por 20 aminoácidos naturales en total. El procedimiento de visualización en ribosomas Fab (Fujinoet al.,Biochem. Biophys. Res. Commun., 2012, vol. 428(3), pág. 395) se realizó en un sistema de traducción libre de células reconstituidas, el sistema PURE (PUREfrex, disponible de GeneFrontier Corporation) (Shimizuet al.,Nature Biotechnology, 2001, vol. 19(8), pág. 751) a lo largo de la biblioteca completa de variantes de sustitución de un solo aminoácido. La selección de la biblioteca se repitió varias rondas usando una proteína IL-33 humana recombinante (ILC0701, disponible de ATGen Co., Ltd.) como cebo, para enriquecer la biblioteca. Cada uno de los clones (Fab) (“clon (Fab)” indica que el clon tiene una forma molecular de Fab; a continuación en el presente documento se usa la misma representación) contenidos en la biblioteca antes del enriquecimiento (es decir, justo después de la construcción) y después del enriquecimiento se secuenció con un secuenciador de nueva generación (Roche, 454) para determinar las secuencias de bases de las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada. Se obtuvieron datos de secuencia con varios miles de lecturas de la biblioteca antes y después del enriquecimiento para calcular la frecuencia de cada una de todas las variantes que tenían una sustitución de un solo aminoácido en las regiones determinantes de complementariedad. La razón de cambio entre las frecuencias en la biblioteca antes y después del enriquecimiento (es decir, la razón de enriquecimiento) se calculó para cada una de todas las variantes de sustitución de un solo aminoácido. La magnitud de la razón de enriquecimiento en el enriquecimiento de la biblioteca se usó como indicador para determinar algunas sustituciones de un solo aminoácido que se suponía que eran útiles para mejorar la afinidad con la proteína IL-33 humana. Basándose en el número total de sustituciones de un solo aminoácido y la distribución en la secuencia de aminoácidos, se determinaron las posiciones donde iban a introducirse las sustituciones de aminoácidos para la construcción de la biblioteca personalizada en la segunda etapa.

En el clon parental A00-0070, se determinó la introducción de sustituciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: asparagina en la posición 12 de LCDR1 (SEQ ID NO: 2 en la lista de secuencias); glutamina en la posición 4 de LCDR2 (SEQ ID NO: 11 en la lista de secuencias); serina en la posición 2, tirosina en la posición 3 y serina en la posición 6 de LCDR3 (SEQ ID NO: 23 en la lista de secuencias); ácido aspártico en la posición 1 y asparagina en la posición 5 de HCDR1 (SEQ ID NO: 43 en la lista de secuencias), serina en la posición 4, serina en la posición 5, serina en la posición 7 e isoleucina en la posición 9 de HCDR2 (SEQ ID NO: 64 en la lista de secuencias). En el clon parental A00-0036, se determinó la introducción de sustituciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: asparagina en la posición 9 y asparagina en la posición 13 de LCDR1 (SEQ ID NO: 6 en la lista de secuencias); arginina en la posición 6 y leucina en la posición 7 de LCDR2 (SEQ ID NO:20 en la lista de secuencias); alanina en la posición 1, alanina en la posición 9 y valina en la posición 10 de LCDR3 (SEQ ID NO: 40 en la lista de secuencias); asparagina en la posición 1 de HCDR1 (SEQ ID NO: 47 en la lista de secuencias); serina en la posición 4, serina en la posición 5, serina en la posición 6, serina en la posición 7, tirosina en la posición 8, isoleucina en la posición 9, tirosina en la posición 10, tirosina en la posición 11, ácido aspártico en la posición 13 y lisina en la posición 16 de HCDR2 (SEQ ID NO: 64 en la lista de secuencias); y glicina en la posición 2, histidina en la posición 5 y ácido aspártico en la posición 6 de HCDR3 (SEQ ID NO: 78 en la lista de secuencias).

Para mejorar las propiedades físicas de los clones, se generaron modelos de homología de los dos clones parentales con un programa de análisis de la estructura de proteínas (Discovery Studio, disponible de Accelrys) para predecir regiones con alta hidrofobia superficial dentro de las regiones determinantes de complementariedad, y luego para determinar las posiciones que van a sustituirse para reducir la hidrofobia superficial de las regiones previstas. En el clon parental A00-0070, se determinó la introducción de sustituciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: tirosina en la posición 3 de LCDR3 (SEQ ID NO: 23 en la lista de secuencias); y serina en la posición 7 e isoleucina en la posición 9 de HCDR2 (SEQ ID NO: 64 en la lista de secuencias). En el clon parental A00-0036, se determinó la introducción de sustituciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: arginina en la posición 6 y leucina en la posición 7 de LCDR2 (SEQ ID NO: 20 en la lista de secuencias); y serina en la posición 7, tirosina en la posición 8 e isoleucina en la posición 9 de HCDR2 (SEQ ID NO: 64 en la lista de secuencias). Basándose en los datos sobre la razón de enriquecimiento obtenidos en el análisis de mutación usando la biblioteca completa de variantes de sustitución de un solo aminoácido, se supone que las sustituciones de aminoácidos son útiles para reducir la hidrofobia superficial sin afectar a la capacidad de unión a la proteína IL-33 humana entre estos sitios.

Ejemplo 7: Producción de un anticuerpo anti-IL-33 humano con regiones determinantes de complementariedad modificadas

Se combinaron dos o más de las sustituciones de aminoácidos útiles para mejorar la afinidad y las propiedades físicas tal como se describió anteriormente para diseñar una biblioteca personalizada a gran escala para modificar las regiones determinantes de complementariedad. Se construyeron vectores para los procedimientos de presentación en ribosomas Fab y presentación en fagos Fab. Luego, el vector de presentación en ribosomas Fab se sometió a reacciones de PCR de múltiples etapas que implicaban PCR de mutagénesis dirigida al sitio y PCR de extensión solapada, y el vector de presentación en fagos Fab se usó como molde para realizar mutagénesis específica del sitio mediante el método de mutagénesis de Kunkel (Fellouseet al.,J. Mol. Biol.

2007, vol. 373, pág. 924), para construir una biblioteca personalizada para la mejora de las regiones determinantes de complementariedad, en la que las posiciones en las regiones determinantes de complementariedad se aleatorizaron basándose en el diseño descrito anteriormente. Se realizaron los procedimientos de presentación en ribosomas Fab y presentación en fagos Fab. La selección de la biblioteca se repitió varias rondas usando proteína IL-33 humana y proteína IL-33 de macaco cangrejero (GenBank:<e>H<h>57404; que abarca desde el residuo Ser 112 hasta el residuo Glu 269 en SEQ ID NO: 227 en la lista de secuencias) como cebo, para enriquecer la biblioteca. En la segunda mitad de las rondas, se realizó una selección negativa con portadores de columna hidrófobos tales como Octyl Sepharose (GE Healthcare) o Phenyl Sepharose (GE Healthcare) antes de permitir la unión con las proteínas IL-33, para enriquecer el Fab que tiene alta afinidad con la proteína IL-33 y baja hidrofobia superficial.

Las proteínas recombinantes usadas como cebo se prepararon mediante el siguiente procedimiento. Una secuencia genética que codifica para la IL-33 humana madura (residuos 112 a 270) y la IL-33 madura de macaco cangrejero (residuos 112 a 269 de SEQ ID NO: 227 en la lista de secuencias) se unió en el extremo N-terminal con la etiqueta 6His-AviTag, y la secuencia resultante se insertó en pET30a(-) para construir un vector de expresión para preparar la proteína recombinante. La cepa deEscherichia coliBL21(DE3), incluyendo el vector de expresión, se precultivó en 5 ml de medio LB y luego se inoculó 1 ml de la disolución de precultivo en 50 ml de medio de expresión (Overnight Express, disponible de Merck Millipore Corporation; complementado con kanamicina). Las células bacterianas se cultivaron para la expresión de proteínas durante 18 horas a 200 rpm y a una temperatura de 30 °C. Las células bacterianas se recogieron y se lavaron y luego se bacteriolizaron con BagBuster (Novagen), y se recuperó el sobrenadante. La IL-33 de macaco cangrejero unida a 6His-AviTag (residuos 112 a 269) contenida en el sobrenadante se purificó con Ni-NTA agarosa (disponible de QIAGEN) y se biotiniló. La modificación con biotina específica para la porción de AviTag se introdujo con una biotina ligasa disponible comercialmente (BirA, disponible de Avidity LLC).

La biblioteca después del enriquecimiento se usó para construir una biblioteca deEscherichia colique secretan y expresan Fab. Los sobrenadantes de cultivo de varios cientos de clones deEscherichia colise sometieron a medición de la constante de velocidad de disociación (koff) mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) (ProteOn XPR36, disponible de Bio-Rad Laboratories, Inc.). La proteína IL-33 humana (4 |ig/ml) y la proteína IL-33 de macaco cangrejero (4 |ig/ml) biotiniladas se cargaron como ligandos en un chip sensor (chip sensor NLC, disponible de Bio-Rad Laboratories, Inc.) para inmovilizar la proteína IL-33 humana en una cantidad equivalente a de 1300 a 1600 UR y la proteína IL-33 de macaco cangrejero en una cantidad equivalente a de 1100 a 1500 UR. Luego se cargó en el mismo el sobrenadante de cultivo deEscherichia colicomo analito para obtener un sensograma con una fase de asociación de un minuto y una fase de disociación de 10 a 30 minutos. El sensograma se sometió a corrección entre puntos y corrección de blanco usando un programa de análisis de datos de SPR (ProteOn Manager v3.1.0, disponible de Bio-Rad Laboratories, Inc.), y luego se determinaron los valores de koff mediante el análisis de la velocidad de disociación del modelo de Langmuir.

Entre los clones (Fab) con regiones determinantes de complementariedad modificadas, se seleccionaron 28 clones (correspondientes a V1 a V28 en la tabla 2) que tenían una mayor afinidad con la proteína IL-33 humana y tenían capacidad de unión a la proteína IL-33 de macaco cangrejero para analizarse en pruebas de nivel superior en el ejemplo 8 y los ejemplos siguientes. Tal como se muestra en la tabla 10, los clones seleccionados (Fab) tenían mayor afinidad (es decir, un valor de koff bajo) con las proteínas IL-33 humana y de macaco cangrejero, en comparación con sus clones parentales (Fab). Estos clones no tenían sustitución de aminoácidos dentro de las regiones de entramado en las regiones variables. Incluso si dos variantes tienen una sustitución de un solo aminoácido idéntica en las regiones determinantes de complementariedad, el efecto de mejora de la afinidad es diferente entre una variante de sustitución de un solo aminoácido y una variante con dos o más sustituciones de aminoácidos. Por tal motivo, algunas sustituciones de aminoácidos fueron frecuentes en las secuencias de los 28 clones para una evaluación de nivel superior, aunque la razón de enriquecimiento de las variantes de sustitución de un solo aminoácido que contenían tales sustituciones fue baja en la primera etapa en la biblioteca completa de aminoácidos variantes de sustitución de un solo aminoácido, y viceversa.

[Tabla 10]

Tabla 10

Ejemplo 8: Preparación de anticuerpos IgG

Se insertaron cada uno de los ADN que codifican respectivamente para secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras y pesadas de los siete clones de anticuerpos anti-IL-33 humanos preparados anteriormente (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02, A00-0070 y A00-0036) en el sentido de 3' de un promotor de CMV para construir un vector de expresión para células de mamíferos para la expresión de IgG. Las secuencias de ADN de la cadena ligera de los clones fueron las que se muestran en las SEQ ID NO: 228, 232, 239, 241, 242, 230 y 253, respectivamente, en la lista de secuencias. Las secuencias de ADN de la cadena pesada de los clones fueron las que se muestran en las SEQ ID NO: 254, 261, 262, 264, 265, 276 y 277, respectivamente, en la lista de secuencias. Cada uno de los vectores de expresión se transfectó en células FreeStyle 293-F (Life Technologies) usando un reactivo de transfección NeoFection-293-1 (disponible de Astec Co., Ltd.). Después de la transfección, las células se cultivaron durante cinco días y luego se recogió el sobrenadante de cultivo. Se establecieron líneas celulares estables de células CHO con el sistema GS (disponible de LONZA Group Ltd.) usando un vector pConPlus y células CHO K1SV. Se cultivaron líneas celulares estables de células CHO, partiendo de una concentración de 0,3 * 106 células/ml usando WAVE Bioreactor SYSTEM 20/50 EHT (GE Healthcare), y se recogió la disolución de cultivo que contenía IgG secretada. La IgG se purificó del sobrenadante de cultivo mediante cromatografía de afinidad usando AKTA explorer 100 (GE Healthcare) y una resina de proteína A (HiTrap MabSelect SuRe, disponible de GE Healthcare). La IgG unida a la resina de proteína A se eluyó con un tampón de elución con un pH de 3,2, y luego el eluato se neutralizó inmediatamente hasta tener un pH aproximadamente neutro y luego se dializó con PBS (con un pH de 7,2). La IgG después de la purificación con la columna de proteína A se purificó adicionalmente con CHT (resina de hidroxiapatita cerámica de tipo I, disponible de Bio-Rad Laboratories, Inc.) para aumentar la pureza. La IgG unida a CHT se eluyó con un gradiente de concentración de NaCl. Se recogieron las fracciones de interés y luego se dializaron con PBS (con pH de 7,2). Los anticuerpos obtenidos mediante este procedimiento de purificación se denominan “anticuerpos purificados en condiciones neutras”.

También se realizó otro procedimiento de purificación, que implica además la etapa de lavar con un volumen de seis columnas de tampón carbonato de sodio 100 mM (con un pH de 11,0) durante seis minutos antes de la etapa de elución de IgG a partir de la resina de proteína A en el procedimiento de purificación descrito anteriormente. Los anticuerpos obtenidos a partir de este procedimiento de purificación se denominan “anticuerpos purificados en condiciones alcalinas”. Las tasas de recuperación de los anticuerpos purificados en condiciones alcalinas individuales después de cada etapa se muestran en la tabla 11. Los anticuerpos purificados en condiciones alcalinas después de la purificación se concentraron mediante ultrafiltración centrífuga con VIVASPIN Turbo1530000 MWCO (Sartorius AG).

[Tabla 11]

Tabla 11

Ejemplo 9: Afinidad con la proteína IL-33

Cada anticuerpo de prueba (IgG) (“anticuerpo (IgG)” indica un anticuerpo que tiene una forma molecular de IgG; a continuación en el presente documento, se usa la misma representación) se analizó para confirmar la afinidad con la proteína IL-33 humana midiendo la constante de disociación (Kd) entre cada anticuerpo de prueba y la proteína IL-33 humana en PBS mediante ensayo de exclusión cinética (KinExA) (KinExA3200, disponible de Sapidyne Instruments, Inc.). Se prepararon muestras de mezcla de un anticuerpo de prueba y una proteína IL-33 humana (ILC0701, disponible de ATGen Co., Ltd.). La proteína IL-33 humana se tituló hasta una concentración constante de anticuerpo de prueba (concentración final: varias decenas de pM a varios cientos de pM) en un amplio intervalo de concentración de la proteína IL-33 humana (de modo que cubriera las concentraciones de la proteína IL-33 humana resultante de diluciones de duplicación en serie de 12 etapas, es decir, de una a 2048 veces, con el límite superior de concentración final establecido entre varios nM y varias decenas de nM). Las muestras de mezcla se incubaron a temperatura ambiente hasta que la reacción antígeno-anticuerpo alcanzó el equilibrio. Después de que la reacción alcanzó el equilibrio, se analizó el porcentaje de anticuerpo anti-IL-33 libre en cada muestra usando KinExA3200. Los valores de Kd se calcularon ajustando la gráfica de porcentajes de anticuerpo anti-I L-33 no unido a la proteína IL-33 humana (eje vertical) y concentraciones de antígeno (eje horizontal) a una fórmula teórica, usando un programa de análisis de datos KinExA (KinExA Pro Software v3.5.3, disponible de Sapidyne Instruments, Inc.). Se prepararon perlas para capturar el anticuerpo anti-IL-33 suspendiendo 50 mg de perlas de Azlactone (Sapidyne) en 1 ml de disolución de recubrimiento (proteína IL-33 humana 10 |ig/ml (ILC0701, disponible de ATGen Co., Ltd.), carbonato de sodio 50 mM a pH de 9,6) e incubando la disolución a temperatura ambiente durante una hora. El anticuerpo para la detección usado fue anticuerpo anti-F(ab)'2 humano conjugado con DyLight649 (Jackson, 309-495-006). Tal como se muestra en la tabla 12, los anticuerpos con regiones determinantes de complementariedad modificadas (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02) mostraron afinidad con la proteína IL-33 humana de Kd = 231 pM en el más bajo (A23-1A05) y Kd = 720fM en el más alto (A25-2C02), en el caso en que se evaluaron en forma de anticuerpos purificados en condiciones neutras.

Cada uno de los anticuerpos purificados en condiciones alcalinas se analizó para confirmar la afinidad con la proteína IL-33 humana (residuos 112 a 270) (ILC0701, disponible de ATGen Co., Ltd.) o la proteína IL-33 humana de longitud completa con el instrumento KinExA (tabla 12), tal como en la evaluación descrita anteriormente. La afinidad con la proteína IL-33 humana (residuos 112 a 270) fue tal como sigue: A10-1C04 mostró una afinidad de Kd = 100,3 pM; A23-1A05 mostró una afinidad de Kd = 195,3 pM; A25-2C02 mostró una afinidad de Kd = 700 fM; A25-3H04 mostró una afinidad de Kd = 7,7 pM; y A26-1F02 mostró una afinidad de Kd = 5,3 pM. La afinidad con la proteína IL-33 humana de longitud completa fue la siguiente: A10-1C04 mostró Kd = 179,8 pM y A26-1F02 mostró afinidad de Kd = 10,4 pM.

La proteína recombinante usada como ligando se preparó mediante el siguiente procedimiento. La secuencia del gen que codifica para la proteína IL-33 humana de longitud completa se unió en el extremo N-terminal con la secuencia de escisión de la proteasa NusA tag-6His tag-TEV, y la secuencia resultante se insertó en pET30a(+) para construir un vector de expresión para preparar la proteína recombinante. Se cultivó previamente la cepa deEscherichia coliBL21 (DE3), incluyendo el vector de expresión, y las células bacterianas se inocularon en 50 ml de medio LB a una densidad de DO = 0,5 y se cultivaron con agitación durante cuatro horas a una temperatura de 37 °C. Después de cuatro horas, la temperatura de cultivo se cambió a 13 °C y las células se cultivaron con agitación durante 30 minutos. Se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,1 mM y las células se cultivaron adicionalmente con agitación durante 72 horas a una temperatura de 13 °C. De este modo se obtuvoEscherichia colique expresa la IL-33 de longitud completa.Escherichia colique expresa la IL-33 de longitud completa se bacteriolizó con BugBuster Master Mix (Novagen) y luego la fracción sobrenadante se recogió mediante separación centrífuga. Luego, la fracción sobrenadante se sometió a purificación IMAC con una columna HisTrap FF Crude (GE Healthcare) y luego a una purificación por intercambio aniónico con una columna CaptoQ Impress (GE Healthcare), para aumentar la pureza de la proteína. Cada muestra después del intercambio aniónico se concentró mediante ultrafiltración centrífuga usando VIVASPIN6 (5000 MWCO). A 1750 |il del concentrado, se añadieron 100 |il de proteasa Turbo TEV (Nacalai Tesque, Inc.) y 4,5 |il de DTT 1 M. La disolución resultante se incubó a una temperatura de 4 °C para escindir NusTag e HisTag. Después de la escisión de las etiquetas, se hizo pasar la disolución a través de una columna Ni Sepharose Excel (GE Healthcare) para eliminar la proteasa NusTag y Turbo TEV (fusionada con HisTag) en la disolución, y se recogió la fracción de flujo a través. Se añadió DTT a la fracción flujo a través hasta una concentración final de 3,3 mM, y el resultado se usó como proteína IL-33 humana de longitud completa en la medición con KinExA.

[Tabla 12]

Tabla 12

El valor numérico de la tabla significa la constante de disociación del anticuerpo monoclonal (IgG) anti-IL-33 purificado mediante un método específico para cada ligando.

Ejemplo 10: Evaluación de la actividad neutralizantein vitrocontra IL-33 humana en HUVEC

Se evaluó la actividad neutralizantein vitrode cada anticuerpo de prueba (IgG) contra la IL-33 humana, basándose en la producción de IL-6 dependiente de IL-33 por parte de HUVEC como indicador. Se usó como control positivo un anticuerpo policlonal anti-IL-33 disponible comercialmente (AF3625, disponible de R&D Systems, Inc.). Se suspendieron HUVEC (CLC2517A, disponible de LONZA Group Ltd.) en un medio EGM-2 (CLCC-3156 y CLCC-4176, disponible de LONZA Group Ltd.), y se inocularon en una microplaca de 96 pocillos (IWAKI) (6 x 103/pocillo), y se confirmó que la densidad celular era confluente. Una disolución mixta de cada anticuerpo anti-IL-33 (concentración final: 1 |ig/ml (aproximadamente 6,7 nM)) y una proteína IL-33 humana recombinante (ILC0701, disponible de ATGen Co., Ltd.) (concentración final: 100 ng/ml (aproximadamente 5 nM)) se añadieron al medio y la disolución resultante se incubó a una temperatura de 37 °C durante 24 horas. Luego se recogió el medio y se midió la concentración de IL-6 en el sobrenadante de cultivo con un kit ELISA disponible comercialmente (EH2IL6, disponible de Thermo Scientific). También se midió la viabilidad celular después de la recogida del medio con un kit de recuento celular (345-06463, disponible de Dojindo Molecular Technologies, Inc.), para confirmar que el efecto inhibidor sobre la producción de IL-6 no fue provocado por una disminución en el recuento de células viables. Se calculó el porcentaje de inhibición (%) de la producción de IL-6 con respecto a la producción de IL-6 provocada por el tratamiento con IL-33 sola para determinar la actividad neutralizante de IL-33 de cada anticuerpo de prueba. En la evaluación de la forma purificada neutra, A10-1C04 mostró una inhibición del 67 %, A23-1A05 mostró una inhibición del 74 %, A25-2C02 mostró una inhibición del 96 %, A25-3H04 mostró una inhibición del 97 %, A26-1F02 mostró una inhibición del 96 %, A00-0070 mostró una inhibición del 4 % y A00-0036 mostró una inhibición del -2 %. Los resultados demuestran que los clones mostraron una fuerte actividad neutralizante, mientras que los clones parentales mostraron una actividad neutralizante muy baja. Cuando la concentración se aumentó hasta 10 |ig/ml, los clones parentales mostraron una actividad neutralizante moderada: A00-0070 mostró una inhibición del 42 % y A00-0036 mostró una inhibición del 38 %. El anticuerpo policlonal disponible comercialmente (AF3625, disponible de R&D Systems, Inc.) mostró una inhibición del 30 %, lo que indica una actividad neutralizante moderada, cuando se añadió a una concentración final de 1 |ig/ml.

Además de la evaluación anterior, se usó una disolución mixta de cada anticuerpo de prueba purificado en condiciones alcalinas (concentración final: de 0,1 a 10 |ig/ml (aproximadamente de 0,67 a 67 nM)) y la IL-33 humana recombinante (ILC0701, disponible de ATGen Co., Ltd.) (concentración final: 100 ng/ml (aproximadamente 5 nM)) a las HUVEC. Se calculó el efecto inhibidor sobre la producción de IL6 con respecto a la producción de IL-6 provocada por el tratamiento con IL-33 sola (valor de CI<50>) para determinar la actividad neutralizante del anticuerpo. Los resultados fueron los siguientes: A10-1C04 tenía una CI<50>= 0,35 |ig/ml; A231A05 tenía una CI<50>= 0,27 |ig/ml; A25-2C02 tenía una CI<50>= 0,19 |ig/ml; A25-3H04 tenía una CI<50>= 0,21 |ig/ml; y A26-1F02 tenía una CI<50>= 0,23 |ig/ml.

Además, se añadió una disolución mixta de cada anticuerpo purificado en condiciones alcalinas (concentración final: de 0,1 a 3 |ig/ml) e IL-33 de macaco cangrejero recombinante (preparada como en el ejemplo 7 y se usó sin biotinilación) (concentración final: 100 ng/ml) a las HUVEC. Se calculó el efecto inhibidor sobre la producción de IL6 con respecto a la producción de IL-6 provocada por el tratamiento con IL-33 sola (valor de CI<50>) para determinar la actividad neutralizante del anticuerpo. A10-1 C04 tenía una CI<50>= 0,43 |ig/ml, y se confirmó que neutraliza la IL-33 humana y la IL-33 de macaco cangrejero a un nivel similar.

Ejemplo 11: Evaluación de la actividad neutralizantein vitrocontra IL-33 humana en células KU-812

Se evaluó la actividad neutralizantein vitrode cada anticuerpo de prueba (IgG) contra la IL-33 humana, basándose en la producción dependiente de IL-33 de IL-5, IL-6 e IL-13 por parte de las células KU-812 como indicador. Se usó como control positivo un anticuerpo policlonal anti-IL-33 disponible comercialmente (AF3625, disponible de R&D Systems, Inc.). Se inocularon línea celular de basófilos humanos, células KU-812 (ECACC, EC90071807), en una microplaca de 96 pocillos (Falcon) (1 x 104/pocillo). Se añadió una disolución mixta de cada anticuerpo de prueba (concentración final: 3 |ig/ml (aproximadamente 20 nM)) y una proteína IL-33 humana recombinante (ILC0701, disponible de ATGen Co., Ltd.) (concentración final: 100 ng/ml (aproximadamente 5 nM)) al medio y la disolución resultante se incubó a una temperatura de 37 °C durante 24 horas. Las concentraciones de IL-5, IL-6 e IL-13 en el medio RPMI-1640 que contenía FBS al 10 % se midieron usando el conjunto flexible de IL-5 humana, el conjunto flexible de IL-6 humana y el conjunto flexible de IL-13 humana de matriz de perlas citométricas BDTM (BD Biosciences). También se midió la viabilidad celular después de la recogida del medio con un kit de recuento celular (345-06463, disponible de Dojindo Molecular Technologies, Inc.), para confirmar que el efecto inhibidor sobre la producción de<i>L-5, IL-6 y la<i>L-13 no fue provocado por una disminución en el recuento de células viables. En la evaluación de la forma purificada neutra, A26-1F02 inhibió la producción de IL-5, IL-6 e IL-13 en un 70 %, un 82 % y un 72 %, respectivamente, en este sistema de evaluación. Los resultados indican que A26-1F02 mostró una actividad neutralizante más fuerte en la producción de todas las citocinas, en comparación con el anticuerpo policlonal disponible comercialmente (mostró una inhibición del 47 %, el 51 % y el 41 %, respectivamente).

Como en la evaluación anterior, se añadió una disolución mixta de cada anticuerpo de prueba purificado en condiciones alcalinas (concentración final: de 100 a 0,01 |ig/ml (aproximadamente de 667 a 0,067 nM)) y la IL-33 humana recombinante (ILC0701, disponible de ATGen Co., Ltd.) (concentración final: 3 ng/ml (aproximadamente 0,15 nM)), IL-3 humana (PeproTech, 200-03; concentración final: 10 ng/ml (aproximadamente 0,67 nM)) y complemento humano C5a (C5788, disponible de Sigma-Aldrich Co., LLC. (concentración final: 1 nM) a las células KU-812. La disolución resultante se incubó a una temperatura de 37 °C durante 24 horas. Se midieron las concentraciones de IL-5 e IL-13 en el medio RPMI-1640 que contenía FBS al 10 %. La viabilidad celular después de la recogida del medio también se midió con un kit de recuento celular para confirmar que el efecto inhibidor sobre la producción de IL-5 e IL-13 no fue provocado por una disminución en el recuento de células viables. En este sistema de evaluación, los anticuerpos de prueba purificados en condiciones alcalinas (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04 y A26-1F02) mostraron cada uno un efecto inhibidor del 50 % o más de inhibición contra la producción de IL-5 y IL-13 a una concentración final de 1 |ig/ml.

Ejemplo 12: Evaluación de la actividad neutralizantein vitrocontra IL-33 humana en células mononucleares de sangre periférica humana:

Se evaluó la actividad neutralizantein vitrode cada anticuerpo de prueba (IgG) contra la IL-33 humana, basándose en la producción de IFN-y dependiente de IL-33 por parte de las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) como indicador. Se usó como control positivo un anticuerpo policlonal anti-IL-33 disponible comercialmente (AF3625, disponible de R&D Systems, Inc.). Se prepararon<p>B<m>C y se inocularon en una microplaca de 96 pocillos (2 x 105/pocillo), y se añadió IL-12 humana recombinante (Wako Pure Chemical Industries, Inc.) (concentración final: 10 ng/ml) a la microplaca. Se añadió a la microplaca una mezcla de cada anticuerpo de prueba y una proteína IL-33 humana recombinante (10 ng/ml) y la disolución resultante se incubó a una temperatura de 37 °C durante 48 horas. Luego se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió el nivel de producción de IFN-y en el medio con el kit de inmunoensayo de IFN-y humano AlfaLISA TM (PerkinElmer Inc.) para evaluar la actividad neutralizante de IL-33. En este sistema de evaluación, cuando se permitió que los anticuerpos purificados en condiciones alcalinas actuaran a una concentración final de 10 |ig/ml, los porcentajes de inhibición fueron los siguientes: A10-1C04 mostró una inhibición del 96,9 %, A23-1A05 mostró una inhibición del 97,5 %, A25-2C02 mostró una inhibición del 98,75 %, A25-3H04 mostró una inhibición del 97,9 % y A26-1F02 mostró una inhibición del 98,25 %.

Ejemplo 13: Evaluación de efectos sobre la inflamación inducida por la administración intraperitoneal de IL-33 humana

La administración intraperitoneal de IL-33 humana a ratones indujo diversos cambios inflamatorios, es decir, aumentos de IgE, IgA e IL-5 en sangre, y del recuento de neutrófilos en sangre, el recuento de eosinófilos en sangre y el recuento de basófilos en sangre, y un aumento de las células esplénicas (un aumento en el peso del bazo) y cambios patológicos en diversos órganos mucosos. Basándose en estos cambios como indicadores, se evaluó la acción antiinflamatoriain vivodel anticuerpo de prueba (IgG).

Se administró por vía intraperitoneal proteína IL-33 humana (R&D Systems, 3625-IL-010) a ratones C57BL6 macho (de seis a ocho semanas de edad) (Charles River Laboratories International, Inc.) a una dosis de 0,4 |ig/indiv¡duo durante siete días (del día 0 al día 6). El anticuerpo de prueba (IgG) también se administró por vía intraperitoneal durante siete días (del día 0 al día 6). Siete días después del inicio de la administración (día 7), los animales a los que se les administró PBS en lugar de la proteína IL-33 humana (representada como “vehículo” en las figuras) tenían un peso medio del bazo de 76 ± 4 mg, mientras que los animales a los que se les administró la proteína IL-33 tenían un peso medio del bazo de 90 ± 7 mg. Los animales a los que se administró por vía intraperitoneal 10 mg/kg (representado como “mpk” en las figuras) de IgG de control humano (MP Biomedicals, 55908) además de la proteína IL-33 tenían un peso medio del bazo de 93 ± 4 mg, mientras que los animales a los que se les administró por vía intraperitoneal l0 mg/kg del anticuerpo purificado en condiciones neutras A26-1F02 además de la proteína IL-33 tenían un peso medio del bazo de 66 ± 3 mg.

Luego se evaluó el anticuerpo purificado en condiciones alcalinas. El anticuerpo purificado en condiciones alcalinas se administró por vía subcutánea sólo una vez (s.c., una inyección), el día antes de la administración de la proteína IL-33 humana (día -1) y se realizó la evaluación. Siete días después del inicio de la administración (día 7), los animales a los que se les administró PBS en lugar de la proteína IL-33 humana tenían un peso medio del bazo de 70 mg, mientras que los animales a los que se les administró por vía subcutánea sólo una vez la IgG de control humana (10 mg/kg ) además de la proteína IL-33 tenían un peso medio del bazo de 152 mg. Por el contrario, los animales a los que se les administró por vía subcutánea A25-3H04 (1, 3, 5 y 10 mg/kg) además de la proteína IL-33 tenían pesos del bazo de 143, 106, 109 y 78 mg, respectivamente, tal como se muestra en la figura 8. Los resultados indicaron que A25-3H04 mostró una inhibición dependiente de la dosis del aumento del peso del bazo provocado por la inflamación. Además de los efectos antiinflamatorios sobre el peso del bazo, se confirmó que A25-3H04 tenía efectos antiinflamatorios sobre los aumentos en la concentración sérica de IgA, la concentración sérica de IgE, el recuento de neutrófilos en sangre, el recuento de basófilos en sangre y el recuento de eosinófilos en sangre y la concentración sérica de IL-5, que habían sido provocados por la administración de IL-33 humana (figura 8). Estos resultados confirman que A25-3H04 muestra un efecto inhibidor sobre la respuesta inflamatoria inducidain vivopor IL-33. La concentración en sangre de A25-3H04 en ratones se midió siete días después del inicio de la administración (día 7). Las concentraciones medidas en los animales a los que se les administró el anticuerpo en dosis de 1, 3, 5 y 10 mg/kg, respectivamente, fueron de 0,6, 3,7, 6,5 y 20,3 |ig/ml.

También se evaluaron los efectos antiinflamatoriosin vivode otros anticuerpos de prueba (IgG) mediante administración subcutánea según el mismo protocolo (10 mg/kg). Como resultado, los animales a los que se les administró por vía subcutánea IgG de control humana tenían un peso medio del bazo de 181 mg, los animales a los que se les administró por vía subcutánea anticuerpo purificado en condiciones alcalinas (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02 o A26-1F02) además de la administración de proteína IL-33 tenían pesos medios del bazo de 82 mg, 92 mg, 100 mg y 77 mg, respectivamente, tal como se muestra en la figura 9. Los resultados indican que cada anticuerpo inhibió el aumento del peso del bazo provocado por la inflamación. Además de los efectos antiinflamatorios sobre el peso del bazo, se confirmó que cada anticuerpo purificado en condiciones alcalinas (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02 y A26-1F02) tenía efectos antiinflamatorios sobre los aumentos en la concentración sérica de IgA, la concentración sérica de IgE, el recuento de neutrófilos en sangre, el recuento de basófilos en sangre y el recuento de eosinófilos en sangre, que habían sido provocados por la administración de la proteína IL-33 humana (figura 9). Estos resultados confirman que estos anticuerpos (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02 y A26-1F02), además de A25-3H04, también muestran efectos inhibidores sobre la respuesta inflamatoria inducidain vivopor IL-33.

Ejemplo 14: Evaluación de efectos sobre trastornos pulmonares inducidos por la administración intratraqueal de IL-33 humana

A los ratones se les administra por vía intratraqueal proteína IL-33 humana y luego se recoge el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) de los ratones. En el BALF se observan aumentos en el recuento total de células, el recuento de eosinófilos y el recuento de neutrófilos, y se observa hiperplasia de la mucosa en el epitelio traqueal. En el BALF también se observa producción de citocinas, tales como iL-4, IL-5, IL-6 e IL-13. Los efectos de cada anticuerpo de prueba sobre los trastornos pulmonares pueden evaluarse mediante la administración intraperitoneal, subcutánea o intravenosa del anticuerpo de prueba (IgG) al sistema.

Ejemplo 15: Evaluación de efectos sobre la hiperreactividad de las vías respiratorias inducida por la administración intranasal de IL-33 humana

La administración intranasal de una proteína IL-33 induce una hiperreactividad de las vías respiratorias a la metacolina inhalada posteriormente. Los efectos del anticuerpo de prueba sobre la hiperreactividad de las vías respiratorias pueden evaluarse mediante la administración intraperitoneal, subcutánea o intravenosa del anticuerpo de prueba (IgG) al sistema de evaluación.

Ejemplo 16: Evaluación de los efectos de IL-33 en ratones con inactivación de IL-33 humana

La administración de antígeno deDermatophagoideso papaína a ratones con inactivación de IL-33 humana mediante goteo nasal o administración intratraqueal induce inflamación de las vías respiratorias. El BALF recogido de los ratones muestra un mayor recuento total de células en el BALF. Con respecto a la inflamación de las vías respiratorias inducida por el antígeno deDermatophagoideso papaína, se sabe que la actividad proteasa del antígeno deDermatophagoideso papaína provoca la liberación de IL-33 de las células epiteliales de las vías respiratorias (Obokiet al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, pág. 18581). Los efectos de cada anticuerpo de prueba sobre la inflamación de las vías respiratorias inducida por proteasa y sobre la inducida por IL-33in vivopueden evaluarse mediante la administración intraperitoneal, subcutánea o intravenosa del anticuerpo de prueba (IgG) al sistema de evaluación.

Ejemplo 17: Evaluación de efectos antiinflamatorios sobre el modelo de septicemia al que se le administra por vía intraperitoneal LPS

La administración intraperitoneal de LPS a ratones con inactivación de IL-33 humana induce septicemia (Obokiet al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, pág.

18581). La administración intraperitoneal, subcutánea o intravenosa del anticuerpo de prueba (IgG) antes de la administración de LPS permite la evaluación de los efectos del anticuerpo de prueba sobre la mortalidad posterior de los ratones. Las citocinas inflamatorias, tales como la IL-6 y el TNF-a, se detectan en la sangre a altas concentraciones en el plazo de varias horas después de la administración de LPS. Los efectos antiinflamatorios del anticuerpo de prueba pueden evaluarse midiendo las concentraciones de tales citocinas inflamatorias.

Ejemplo 18: Evaluación de efectosin vivosobre el cáncer en ratones portadores de cáncer

Las células de líneas celulares cancerosas murinas o humanas se transfieren por vía subcutánea o intravenosa a ratones y luego se administran con IL-33 humana. El número de células que van a transferirse se determina adecuadamente según la línea celular cancerosa y el sitio de transferencia es el mismo entre los animales. A los ratones se les administra por vía intraperitoneal, subcutánea o intravenosa cada anticuerpo de prueba (IgG) y se analizan para confirmar el número de células cancerosas en el sitio del cáncer primario y en la lesión metastásica en otro órgano después de la transferencia de las células de la línea celular cancerosa basándose en el volumen o el recuento celular. De este modo pueden evaluarse los efectos de cada anticuerpo de prueba sobre el cáncer. Ejemplo 19: Evaluación de la estabilidad coloidal de anticuerpos

Se analizó cada anticuerpo de prueba (IgG) para confirmar la estabilidad coloidal mediante dispersión dinámica de luz basada en la presencia de agregados. Cada anticuerpo purificado en condiciones alcalinas se concentró a un nivel de aproximadamente 50 mg/ml con VIVASPIN o ViVa SPIN TURBO (disponible de Sartorius AG; de 10000 a 50000 MWCO). La centrifugación se realizó a una temperatura de 4 °C, mientras que las revoluciones por minuto y la duración se cambiaron apropiadamente. La disolución de cada anticuerpo de prueba se diluyó secuencialmente y de 200 a 250 |il de cada muestra se sometieron a medición de dispersión dinámica de luz (Nanotrac UPA UT-151, disponible de NIKKISO CO., LTD.), para obtener datos dentro de un intervalo de concentración que cubre de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml. La distribución del tamaño de partícula de cada proteína de anticuerpo se calculó basándose en los datos acumulados durante 200 segundos, para evaluar la presencia de agregados. La distribución de tamaño de partículas de los anticuerpos de prueba (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04 y A26-1F02) mostró un cambio de pico muy ligero desde aproximadamente 10 nm hacia tamaños de partículas más grandes junto con el aumento de la concentración de anticuerpos, y no tuvo un pico en un tamaño de partícula que excediera varias decenas de nanómetros, es decir, no tuvo un pico que se suponía que no dependía de la concentración de anticuerpo sino que era provocado por una agregación irreversible. Estos resultados confirman que los anticuerpos de prueba tienen una excelente estabilidad coloidal.

Para evaluar cuantitativamente la estabilidad coloidal, se calculó el parámetro de interacción (kü). El parámetro de interacción indica la dependencia de la concentración del coeficiente de difusión (inversamente proporcional al tamaño de partícula) y es un indicador importante usado en el diseño de formulaciones para las formulaciones de proteína de alta concentración, tales como los anticuerpos. Se informa que un parámetro de interacción superior a -12,4 ml/g indica una alta estabilidad coloidal y una baja autoasociación debido a la interacción repulsiva (Saitoet al.,Pharm. Res., 2013. vol. 30 pág. 1263). Cada disolución de anticuerpo de prueba disuelta en PBS (a pH de 7,2) se concentró mediante ultrafiltración a una concentración de varias decenas de mg/ml y se sometió a diluciones de duplicación en serie con el mismo disolvente para preparar muestras. Cada muestra se analizó para confirmar el tamaño de partícula con un analizador dinámico de dispersión de luz (Nanotrac UPA UT 151, disponible de NIKKISO CO., LTD.). Basándose en el tamaño de partícula medido, el coeficiente de difusión se calculó mediante la siguiente ecuación de Stokes-Einstein:

[Fórmula matemática 1]

donde D es el coeficiente de difusión (cm2/s); kB es la constante de Boltzmann (J/K); T es la temperatura termodinámica (K); % es la constante Pi; ^ es la viscosidad P (poise) de la disolución diluida; y d es el tamaño de partícula (nm).

Se trazó la dependencia de la concentración del coeficiente de difusión y el gráfico se ajustó a la siguiente ecuación para determinar el parámetro de interacción.

[Fórmula matemática 2]

donde D es el coeficiente de difusión calculado mediante la ecuación de Stokes-Einstein; D<0>es el coeficiente de difusión en la dilución infinita; y c es la concentración medida de cada anticuerpo de prueba (g/ml). Basándose en la ecuación, se calculó el parámetro de interacción (kü) que representa la inclinación de la línea de ajuste. Los resultados son tal como sigue: A10-1C04 tuvo un parámetro de interacción kü = -8,1 ml/g (intervalo analítico: 0,41-63,7 mg/ml); A23-1A05 tenía un parámetro de interacción kü = -5,6 ml/g (intervalo analítico: 0,40-61,8 mg/ml); A25-2C02 tenía un parámetro de interacción kü = -6,2 ml/g (intervalo analítico: 0,43-66,3 mg/ml); A25-3H04 tenía un parámetro de interacción kü = - 7,5 ml/g (intervalo analítico de 0,34 a 56,5 mg/ml); A26-1F02 tenía un parámetro de interacción kü = -6,7 ml/g (intervalo analítico: 0,35-62,7 mg/ml). Los resultados demuestran que todos los anticuerpos de prueba tenían un parámetro de interacción superior a -12,4 ml/g, lo que indica una excelente estabilidad coloidal.

Ejemplo 20: Evaluación de la estabilidad termodinámica de los anticuerpos

Se analizó cada anticuerpo de prueba (IgG) para confirmar la estabilidad termodinámica a una temperatura en la que desaparecía el plegamiento del dominio de inmunoglobulina (Tm). Se añadió kit de colorante Protein Thermal Shift (Life Technologies) a cada disolución de anticuerpo de prueba en una concentración de varias decenas de |ig/ml según el manual de instrucciones. La intensidad de fluorescencia de la disolución diluida se midió con el sistema de PCR en tiempo real 7500 Fast (Life Technologies) mientras se aumentaba la temperatura a una velocidad de aproximadamente 1 °C/min. Los datos obtenidos se analizaron con Protein Thermal Shift (Life Technologies) para determinar la temperatura Tm. Si se observaron dos o más temperaturas Tm, la temperatura más baja se definió como Tm1, la segunda temperatura más baja como Tm2, y así sucesivamente. Los resultados de la evaluación de anticuerpos purificados en condiciones neutras fueron tal como sigue: A10-1C04 tenía Tm = 73,9 °C; A23-1A05 tenía Tm1 = 69,3 °C y Tm2 = 77,6 °C; A25-2C02 tenía Tm1 = 69,3 °C y Tm2 = 80,3 °C; A25-3H04 tenía Tm1 = 70,0 °C y Tm2 = 76,4 °C; y A26-1F02 tenía Tm = 74,5 °C. Los resultados de la evaluación de los anticuerpos purificados en condiciones alcalinas fueron tal como sigue: A10-1C04 tenía Tm = 73,7 °C; A23-1A05 tenía Tm1 = 69,5 °C y Tm2 = 77,5 °C; A25-2C02 tenía Tm1 = 69,5 °C y Tm2 = 80,4 °C; A25-3H04 tenían Tm1 = 70,1 °C y Tm2 = 76,4 °C; y A26-1F02 tenía Tm = 74,4 °C. Los resultados indican que todos los anticuerpos tenían una temperatura Tm superior a 65 °C, lo que demuestra una excelente estabilidad termodinámica.

Ejemplo 21: Evaluación de la estabilidad de conservación de los anticuerpos

Cada anticuerpo purificado en condiciones alcalinas se disolvió en un tampón citrato (ácido cítrico 50 mM; NaCl 150 mM (pH: 6,3)) a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml y se conservó a una temperatura de 40 °C durante cuatro semanas para evaluar la estabilidad de conservación de cada anticuerpo de prueba (IgG). Para la evaluación de la pureza del monómero de cada anticuerpo después de la conservación, la pureza del monómero se midió mediante análisis de cromatografía de exclusión molecular (SEC) y electroforesis SüS capilar con microchip (mCE-SüS), y la actividad de unión al antígeno se midió mediante resonancia de plasmón superficial.

Se unieron dos columnas TSKgel G3000SWXL (disponibles de Tosoh Bioscience LLC) y se montaron en un sistema HPLC (Beckman System Gold (gestor de disolventes 126, detector 166 e inyector automático 508)) y se realizó un análisis de filtración en gel. El disolvente de la fase móvil era tampón fosfato 0,1 M (a pH de 6,7) que contenía sulfato de sodio 0,1 M. Cada muestra se separó a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min y se detectó con una absorbancia de UV de 215 nm. La muestra para análisis se preparó diluyendo aproximadamente 10 mg/ml de la disolución de anticuerpo conservado hasta 100 veces y se inyectaron 50 |il de la muestra para análisis en las columnas. La pureza del monómero determinada mediante cromatografía de exclusión molecular se muestra en la tabla 13. Los resultados indican que todos los anticuerpos de prueba (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04 y A26-1F02) conservaron una pureza de monómero superior al 90 % después de la conservación a una temperatura de 40 °C durante cuatro semanas, lo que demuestra una excelente estabilidad de conservación.

La electroforesis capilar SDS se realizó usando Lab Chip GX II (disponible de PerkinElmer Inc.). Cada muestra se redujo con el kit de reactivos dedicado para el sistema, reactivo HT Protein Express (disponible de PerkinElmer Inc.), según el protocolo convencional del fabricante, en condiciones desnaturalizantes. Como muestra analítica, se añadieron 2 |il de disolución de anticuerpo conservado con una concentración de aproximadamente 10 mg/ml. El reactivo usado para la electroforesis se tomó del kit y se añadió a un chip dedicado, chip HT Protein Express Lab, versión 2 (disponible de PerkinElmer Inc.), y la muestra se midió según el protocolo incorporado para el análisis de anticuerpos, anticuerpo HT 200. Tal como se muestra en la tabla 13, en condiciones desnaturalizantes y reductoras, todos los anticuerpos de prueba (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04 y A26-1F02) conservaron una pureza de monómero que excedía el 90 % después de la conservación a una temperatura de 40 °C durante cuatro semanas, lo que demuestra una excelente estabilidad de conservación.

Para confirmar la presencia o ausencia de agregación irreversible que no depende de la concentración de anticuerpo después de la conservación, se midió el tamaño de partícula de cada anticuerpo de prueba. Cada muestra para análisis se preparó diluyendo cada disolución de anticuerpo conservada hasta 10 veces con un tampón citrato (ácido cítrico 50 mM, NaCl 150 mM (pH: 6,3)) (concentración final: aproximadamente 1 mg/ml) y se analizó mediante técnica de dispersión dinámica de luz (Nanotrac UPA UT-151, disponible de NIKKISO CO., LTD.) para medir el tamaño de partícula de cada anticuerpo de prueba. El tiempo de acumulación fue de 200 segundos. No se detectó ningún agregado en el análisis de los anticuerpos de prueba (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02, A00-0070, A00-0036) después de la conservación a una temperatura de 40 °C durante cuatro semanas, lo que demuestra una excelente estabilidad de conservación.

Para confirmar la presencia de capacidad de unión al antígeno después de la conservación, se midió la actividad de unión al antígeno con un sistema de resonancia de plasmón superficial, Biacore T200 (disponible de GE Healthcare). Se inmovilizó una proteína IL-33 humana (ILC0701, disponible de ATGen Co., Ltd.) en un chip sensor CM5 (GE Healthcare) (la cantidad de proteína inmovilizada fue de aproximadamente 3000 a 6000 UR) con un kit de acoplamiento de aminas (GE Healthcare). Luego, cada disolución de anticuerpo conservada se diluyó hasta 10 veces con un tampón cítrico (ácido cítrico 50 mM, NaCl 150 mM (pH: 6,3)) y la disolución resultante se analizó para medir la concentración total de proteína en la disolución, usando un espectrofotómetro de microvolumen, Astragene II (Astranet Systems, Ltd.) (concentración de proteína: aproximadamente 1 mg/ml). La disolución de anticuerpo después de la medición de la concentración total de proteína se diluyó hasta 1000 veces con tampón HBS-EP (H<e>P<e>S 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % (v/v) (a pH de 7,4)). De este modo se preparó el analito. La temperatura de medición fue de 25 °C. Cada analito se añadió durante 36 segundos a dos velocidades de flujo de 5 |il/min y 100 |il/min para obtener sensogramas de la fase de asociación. Luego, los sensogramas se analizaron mediante análisis de concentración libre de calibración usando un programa de análisis de datos (GE Healthcare, software de evaluación Biacore T200 v1.0) para determinar la concentración del anticuerpo que tiene actividad de unión a antígeno. Como control, también se analizó cada anticuerpo de prueba después de la conservación a una temperatura de 4 °C durante cuatro semanas para confirmar la actividad de unión al antígeno, para calcular la relación de actividad de unión al antígeno de cada anticuerpo de prueba después de la conservación a una temperatura de 40 °C durante cuatro semanas. Tal como se muestra en la tabla 13, todos los anticuerpos de prueba (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04 y A26-1F02) mantuvieron una actividad de unión al antígeno superior al 90 % incluso después de la conservación a una temperatura de 40 °C durante cuatro semanas, lo que demuestra una excelente estabilidad de conservación.

[Tabla 13]

Tabla 13

Ejemplo 22: Evaluación de la estabilidad de anticuerpos mediante oxidación forzada

Se analizó cada anticuerpo de prueba (IgG) para confirmar las influencias de la oxidación en su actividad de unión al antígeno. A cada anticuerpo purificado en condiciones alcalinas con una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml, se le añadió una solución de peróxido de hidrógeno (concentración final: 1 %) y la disolución resultante se oxidó a una temperatura de 37 °C durante 24 horas. A la disolución resultante se le añadió entonces una disolución de metionina 80 mM para detener la oxidación. Luego, cada disolución de anticuerpo de prueba se reemplazó con PBS con una columna de desalinización, Zebaspin (disponible de Thermo Scientific). Cada uno de los anticuerpos de prueba oxidados se analizó con un sistema de resonancia de plasmón superficial Biacore T200 (GE Healthcare) para confirmar la actividad de unión al antígeno, tal como en el ejemplo 21. Se calculó la razón entre la actividad de unión al antígeno del anticuerpo oxidado y la del anticuerpo de prueba no tratado. Los resultados son los siguientes: A10-1C04 mantuvo el 83 % de la actividad de unión, A23-1A05 mantuvo el 95 % de la actividad de unión, A25-2C02 mantuvo el 100,5 % de la actividad de unión, A25-3H04 mantuvo el 98,7 % de la actividad de unión y A26-1F02 mantuvo el 89,5 % de la unión actividad. Estos resultados indican que todos los anticuerpos de prueba (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04 y A26-1F02) mostraron una estabilidad tal que mantuvieron una actividad de unión al antígeno superior al 80 % incluso después de la oxidación forzada mediante tratamiento con disolución de peróxido de hidrógeno al 1 %.

Ejemplo 23: Evaluación de la agregación provocada por estrés físico (agitación)

Cada anticuerpo de prueba (IgG) se diluyó con PBS hasta una concentración de 0,2 mg/ml y la disolución diluida se agitó en una celda discontinua colocada en el Aggregates Sizer (disponible de Shimadzu Corporation) para aplicar estrés físico. Cada disolución se agitó mediante el movimiento vertical de la placa agitadora a temperatura ambiente durante 30 minutos (190 vibraciones/min) y luego se analizó para confirmar concentraciones de agregados que tenían un tamaño de partícula de 40 nm a 20 |im con el Aggregates Sizer. En la evaluación de cada anticuerpo purificado en condiciones alcalinas, las concentraciones de agregados producidos mediante agitación fueron tal como sigue: 17,2 |ig/ml en A10-1C04; 16,4 |ig/ml en A23-1A05; 13,3 |ig/ml en A25-2C02; 23,4 |ig/ml en A25-3H04; y 17,0 |ig/ml en A26-1F02. Los resultados indican que todos los anticuerpos mostraron el 15 % o menos de agregación inducida por el estrés físico, lo que demuestra que todos los anticuerpos de prueba eran estables contra el estrés físico.

Ejemplo 24: Evaluación de la concentración plasmática de los anticuerpos en ratones

Cada anticuerpo de prueba (IgG) se marcó con fluorescencia y se administró por vía intravenosa (3 mg/kg) a ratones macho C57BL6 (de ocho a diez semanas de edad) (Charles River Laboratories International, Inc.). La concentración del anticuerpo de prueba se midió detectando la fluorescencia en el plasma. Tal como se muestra en la figura 10, en la evaluación de cada anticuerpo purificado en condiciones alcalinas, todos los anticuerpos de prueba (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04 y A26-1F02) tuvieron una semivida de eliminación de 100 horas o más, lo que indica un buen perfil farmacocinético.

Ejemplo 25: Evaluación de la concentración sérica de los anticuerpos en monos

Cada anticuerpo de prueba (IgG) (1 mg/kg) se administró por vía intravenosa a macacos cangrejeros macho (de dos a tres años de edad) (Hamri Co., Ltd.), y luego se midió la concentración sérica del anticuerpo de prueba con el kit de EIA para IgG1 terapéutica humana (500910, disponible de Cayman Chemical). El anticuerpo A10-1C04 purificado en condiciones alcalinas se administró a dos macacos cangrejeros (n.os 201 y 202), y el anticuerpo A23-1A05 purificado en condiciones alcalinas se administró a un macaco cangrejero (n.° 301). Tal como se muestra en la figura 11, la semivida de eliminación de A10-1C04 fue de 16,56 días (n.° 201) y 11,40 días (n.° 202), y el aclaramiento fue de 3,598 ml/día/kg (n.° 201) y 5,451 ml/día/kg (n.° 202). A23-1A05 tuvo una semivida de eliminación de 10,87 días y un aclaramiento de 10,07 ml/día/kg. Ambos anticuerpos de prueba mostraron buenos perfiles farmacocinéticos en macacos cangrejeros.

Ejemplo 26: Evaluación de la inmunogenicidad de los anticuerpos

Se evaluó el potencial de inmunogenicidad de cada anticuerpo de prueba (IgG) mediante un ensayo de células Tin vitro(LONZa Group Ltd.). Se recogieron muestras de 50 donantes para representar la población objetivo, y se añadieron 50 |ig/ml de cada anticuerpo purificado en condiciones alcalinas a células dendríticas de sangre periférica humana recogidas de los donantes, de modo que las células dendríticas capturaron el anticuerpo. Se aislaron células T positivas para CD4 de sangre periférica humana recogidas de un donante idéntico. A continuación, se cultivaron conjuntamente ambas células, es decir, las células dendríticas que habían capturado el anticuerpo de prueba y las células T positivas para CD4, para determinar la reacción (proliferación) de las células T positivas para CD4. Como control negativo, se usó un tampón (PBS) que no contenía ningún anticuerpo de prueba en la misma reacción de células T positivas para CD4, y los resultados se compararon para evaluar el potencial de inmunogenicidad de cada anticuerpo. Los resultados indican que ninguno de los anticuerpos de prueba (A10-1C04, A25-2C02, A25-3H04 y a 26-1F02) mostró potencial de inmunogenicidad en las condiciones de prueba.

Ejemplo 27: Evaluación de la reactividad cruzada con tejidos humanos

Se evaluó la reactividad cruzada de cada anticuerpo de prueba (IgG) con tejidos humanos (muestra congelada de 35 tejidos que cumplen con las directrices de la FDA y la EMA, de un donante) mediante tinción inmunohistoquímica (Covance Laboratories Ltd.). Los 35 tejidos incluyen glándula suprarrenal, vejiga, células sanguíneas, médula ósea, glándula mamaria, cerebelo, corteza cerebral, colon, células endoteliales (vasos sanguíneos), globo ocular, trompa de Falopio, tracto gastrointestinal (incluyendo el músculo liso), corazón, riñón (glomérulo y túbulo renal), hígado, pulmón, ganglio linfático, ovario, páncreas, glándula paratiroidea, glándula parótida, nervio periférico, glándula pituitaria, placenta, próstata, piel, médula espinal, bazo, músculo estriado, testículos, timo, tiroides, amígdala, uréter y útero (región del cuello uterino y endometrio). Como resultado, en la evaluación de anticuerpos purificados en condiciones alcalinas, todos los anticuerpos de prueba (A10-1C04, A23-1A05, A26-1F02 y A25-2C02) tiñeron intensamente las células endoteliales vasculares (control positivo). Se sabe que la IL-33 se expresa ampliamente en las células endoteliales vasculares. En diversos tejidos tales como epitelio, células intersticiales, tejidos neurales, tejidos musculares y hemocitos, se confirmó reactividad cruzada con el citoplasma o el núcleo, pero no se observó reactividad cruzada con la membrana citoplasmática en ningún tejido. Según las directrices ICH S6(R1) y otros artículos (Toxicologic Pathology 2010, 38(7):1138-1166), la reactividad cruzada con el citoplasma o el núcleo, donde es menos probable que llegue un anticuerpoin vivo,tiene menos importancia toxicológica. Por tanto, ninguno de los anticuerpos de prueba (A10-1C04, A23-1A05, A26-1F02 y A25-2C02) mostró preocupación toxicológica.

Ejemplo 28: Estrechamiento de las regiones de epítopo de A10-1C04 y A25-3H04

Los anticuerpos monoclonales anti-IL-33 A10-1C04 y A25-3H04 se unieron al epítopo PEP14 tal como se describe en el ejemplo 1. Los experimentos se realizaron con una biblioteca de presentación en fagos de secuencias de aminoácidos continuos que se incluyen en PEP14 que consiste en 20 aminoácidos y son más cortas que PEP14, y se encontraron dos epítopos diferentes (LEDESYEIYV (SEQ ID NO: 426 en la lista de secuencias) y EDESYEIYV (SEQ ID NO: 427 en la lista de secuencias)). El péptido LEDESYEIYV corresponde a la secuencia que abarca los residuos 138 a 147 de IL-33 humana mostrada en SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias, y el péptido EDESYEIYV corresponde a la secuencia que abarca los residuos 139 a 147 de IL-33 humana mostrada en SEQ ID NO: 226 en la lista de secuencias. Estos péptidos se sintetizaron y la afinidad con los anticuerpos purificados con álcali se calculó como Kd mediante el experimento KinExA como en el ejemplo 9 (tabla 14).

[Tabla 14]

Aplicabilidad industrial

El anticuerpo con efecto neutralizante de la presente invención puede usarse como composición farmacéutica para el diagnóstico, el tratamiento, la prevención o el alivio de enfermedades asociadas con IL-33.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES 1. Anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano aislado, en el que la combinación de las respectivas secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena ligera y cadena pesada es la combinación representada por V1 tal como sigue:
2. 2. Anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano según la reivindicación 1, en el que la cadena ligera es una cadena X.
3. 3. Anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano es IgG.
4. 4. Anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el antígeno es IL-33 humana e IL-33 de mono.
5. 5. Molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. 6. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5.
7. 7. Célula huésped que comprende un vector según la reivindicación 6.
8. 8. Método para producir un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo el método cultivar una célula huésped según la reivindicación 7.
9. 9. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
10. 10. Anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en el tratamiento, la prevención o el alivio de una enfermedad asociada con IL-33, en el que la enfermedad asociada con IL-33 es una enfermedad inflamatoria.
11. 11. Anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-33 humano para su uso según la reivindicación 10, en el que la enfermedad asociada con IL-33 se selecciona del grupo que consiste en asma, dermatitis atópica, polinosis, choque anafiláctico, artritis inducida por autoanticuerpos, artritis reumatoide, esclerosis sistémica, fibrosis, psoriasis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple y espondilitis anquilosante.