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ES2963157T3 - Anticuerpos anti-SIRP-alfa y métodos relacionados - Google Patents

Anticuerpos anti-SIRP-alfa y métodos relacionados Download PDF

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ES2963157T3
ES2963157T3 ES18765224T ES18765224T ES2963157T3 ES 2963157 T3 ES2963157 T3 ES 2963157T3 ES 18765224 T ES18765224 T ES 18765224T ES 18765224 T ES18765224 T ES 18765224T ES 2963157 T3 ES2963157 T3 ES 2963157T3
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Abstract

Se proporcionan anticuerpos anti-SIRPα, incluidos anticuerpos anti-SIRPα multiespecíficos, así como composiciones y métodos relacionados. Los anticuerpos de la divulgación se unen a SIRPα y pueden bloquear la interacción de CD47 en una célula con SIRPα en una célula fagocítica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-SIRP-alfa y métodos relacionados
ANTECEDENTES
[0001] El recambio de células comienza con la inducción de un programa apoptótico u otros cambios celulares que las marcan para su eliminación y el posterior reconocimiento de marcadores por fagocitos que incluyen macrófagos, células dendríticas y similares. Este proceso requiere una eliminación específica y selectiva de las células no deseadas. A diferencia de las células sanas, las células no deseadas/envejecidas/moribundas muestran marcadores o ligandos llamados señales de "cómeme", es decir, "yo alterado", que a su vez pueden ser reconocidos por receptores en los fagocitos. Las células sanas pueden mostrar señales de "no me comas" que inhiben activamente la fagocitosis; estas señales están reguladas por disminución en las células moribundas, están presentes en una conformación alterada o son reemplazadas por la regulación por incremento de las señales profagocíticas o "cómeme". La proteína de superficie celular CD47 en células sanas y su participación en un receptor de fagocitos, SIRPa constituye una señal clave de "no me comas" que puede desactivar el engullimiento mediado por múltiples modalidades, incluyendo la depuración de células apoptóticas y la fagocitosis mediada por FcR. El bloqueo de la participación mediada por CD47 de SIRPa en un fagocito puede provocar la eliminación de células vivas que llevan señales de "cómeme".
[0002] CD47 es una glicoproteína transmembrana ampliamente expresada con un único dominio similar a Ig y cinco regiones que atraviesan la membrana, que funciona como un ligando celular para SIRPa con unión mediada a través del dominio similar a V NH2-terminal de SIRPa. SIRPa se expresa principalmente en células mieloides que incluyen macrófagos, granulocitos, células dendríticas mieloides (DC), mastocitos y sus precursores, incluyendo las células madre hematopoyéticas. Lee et al. analizan los determinantes estructurales de SIRPa que median la unión de CD47. (2007) J. Inmunol. 179:7741-7750; Hatherley et al. (2007) JBC 282:14567-75; y el papel de la dimerización en cis de SIRPa en la unión de CD47 es analizado por Lee et al. (2010) JBC 285:37953-63. De acuerdo con el papel de CD47 para inhibir la fagocitosis de las células normales, hay evidencias de que es regulado por incremento en células madre hematopoyéticas (HSC) y progenitoras justo antes y durante su fase migratoria, y que el nivel de CD47 en estas células determina la probabilidad de que sean engullidas in vivo.
La US 2014/242095 describe anticuerpos y fragmentos de anticuerpos dirigidos a SIRPa y su uso en el tratamiento de cánceres hematológicos. La WO 2017/068164 describe métodos y composiciones para modificar la polarización de macrófagos en células proinflamatorias para tratar el cáncer. Seiffert et al. (1999) American Society of Hematology 94(11):3633-3643 informa que la proteína reguladora de señales humana se expresa en subconjuntos de células mieloides leucémicas normales, pero no en subconjuntos, y media la adhesión celular que implica su contrarreceptor CD47. Zhao et al. (2011) PNAS 108(45): 18342-18347 informa que la interacción de la proteína alfa reguladora de señales CD47 (SIRPa) forma una barrera para la destrucción de células tumorales mediada por anticuerpos. Strohl et al. (2009) Current Opinion in Biotechnology 20(6):685-691 describe la optimización de funciones efectoras mediadas por Fc de anticuerpos monoclonales. La WO 2011/066501 describe mutantes Fc de anticuerpos con funciones efectoras extirpadas. Hezareh et al. (2001) Journal of Virology 75(24): 12161-12168 describe las actividades de la función efectora de un panel de mutantes de un anticuerpo ampliamente neutralizante contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo l. Kodjo et al. (2016) Infection and Immunity 84(7):2002-2011 informa que las interacciones CD47-SIRPa regulan la captación de macrófagos de eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum y la depuración de la malaria in vivo. Tadahiko et al. (2017) JCI Insight 2(1):1-15 describe los anticuerpos anti-SIRPa como una nueva herramienta potencial para la inmunoterapia contra el cáncer. La WO 2015/138600 describe anticuerpos anti-SIRPa y anticuerpos potenciadores de macrófagos biespecíficos.
SUMARIO
[0004] La invención proporciona un anticuerpo humanizado aislado, que comprende: una secuencia VH de la SEQ ID NO: 7 y una secuencia VL de la SEQ ID<n>O: 8.
[0005] La invención proporciona además un polinucleótido aislado o un conjunto de polinucleótidos que codifican el anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, una V<h>del mismo, una V<l>del mismo, una cadena ligera del mismo, una cadena pesada del mismo o una porción de unión a antígeno del mismo.
[0006] La invención proporciona además un vector o conjunto de vectores que comprende el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos de la invención.
[0007] La invención proporciona además una célula huésped que comprende el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos de la invención o el vector o conjunto de vectores de la invención.
[0008] La invención proporciona además un método para producir un anticuerpo que comprende expresar el anticuerpo con la célula huésped de la invención y aislar el anticuerpo expresado.
[0009] La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0010] La invención proporciona además el anticuerpo o la composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección en un sujeto con necesidad de ello, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo o la composición farmacéutica de la invención. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o diagnóstico in vivo se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para diagnóstico in vivo.
[0011] En la presente se divulga un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado que: se une específicamente a SIRPa humana; no se une específicamente a SIRPy humana; y opcionalmente comprende una región Fc humana que comprende por lo menos una modificación que reduce la unión a un receptor Fc humano.
[0012] En algunos aspectos, el anticuerpo comprende: una CDR-H1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1; una CDR-H2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:2; una CDR-H3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:3; una CDR-L1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:4; una CDR-L2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:5; y una CDR-L3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:6; o una CDR-H1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:9; una CDR-H2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:10; una CDR-H3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:11; una CDR-L1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 12; una CDR-L2 que comprende la secuencia expuesta en la s Eq ID NO:13; y una CDR-L3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:14.
[0013] En algunos aspectos, el anticuerpo comprende: una secuencia VH de la SEQ ID NO:7 y una secuencia Vl de la Se Q ID NO:8; o una secuencia Vh de la SEQ ID NO:15 y una secuencia Vl de la SEQ ID NO:16.
[0014] En algunos aspectos, el anticuerpo comprende: una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 18; o una cadena pesada de la SEQ ID NO:19 y una cadena ligera de la SEQ<i>D NO:20.
[0015] También se divulga en la presente un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado, que comprende: una CDR-H1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1; una CDR-H2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ iD NO:2; una CDR-H3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:3; una CDR-L1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:4; una CDR-L2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:5; y una CDR-L3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:6.
[0016] También se divulga en la presente un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado, que comprende: una secuencia V<h>de la SEQ ID<n>O:7 y una secuencia V<l>de la SEQ ID NO:8.
[0017] También se divulga en la presente un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado, que comprende: una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 18.
[0018] También se divulga en la presente un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado, que comprende: una CDR-H1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 9; una CDR-H2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ iD NO: 10; una CDR-H3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:11; una CDR-L1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:12; una CDR-L2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ iD NO:13; y una CDR-L3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:14.
[0019] También se divulga en la presente un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado, que comprende: una secuencia Vh de la SEQ ID n O:15 y una secuencia Vl de la SEQ ID NO:16.
[0020] También se divulga en la presente un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado, que comprende: una cadena pesada de la SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 20.
[0021] En algunos aspectos, un anticuerpo divulgado en la presente comprende una región Fc humana que comprende por lo menos una modificación que reduce la unión a un receptor Fc humano.
[0022] En algunos aspectos, un anticuerpo divulgado en la presente: (a) compite por la unión a SIRPa humana con un anticuerpo seleccionado entre 1H9 y 3C2; (b) no compite por la unión a SIRPa humana con el anticuerpo KWar; (c) compite parcialmente por la unión a SIRPa humana con el anticuerpo KWar; (d) inhibe la unión de CD47 humano a SIRPa humana; (e) inhibe la unión de SP-A humana a SIRPa humana; (f) inhibe la unión de SP-D humana a SIRPa humana; (g) se une a SIRPa de mono rhesus; (h) se une a SIRPa de cynomolgus; (i) aumenta la fagocitosis con respecto al control; o (j) es capaz de cualquier combinación de (a)-(i).
[0023] En algunos aspectos, un anticuerpo divulgado en la presente es panespecífico para los isotipos de SIRPa humana. Un anticuerpo divulgado en la presente, como 1H9, puede unirse a múltiples isotipos humanos de SIRPa, incluyendo uno o más de V1, V2 y V1/V5. Un anticuerpo divulgado en la presente puede unirse a cada uno de los isotipos V1 y V2 de SIRPa humana. Un anticuerpo divulgado en la presente puede unirse al isotipo V1 de SIRPa humana, incluyendo los homocigotos. Un anticuerpo divulgado en la presente puede unirse al isotipo V2 de SIRPa humana, incluyendo los homocigotos. Un anticuerpo divulgado en la presente puede unirse a los isotipos V1/V5 (heterocigotos) de SIRPa humana. Un anticuerpo divulgado en la presente, como 1H9, puede unirse a múltiples isotipos de SIRPa humana, incluyendo cada uno de V1, V2 y V1/V5. Tales anticuerpos pueden incluir 1H9 y 3C2. La unión a las variantes de SIRPa humana puede medirse usando ensayos conocidos en la técnica que incluyen PCR y/o citometría de flujo. Por ejemplo, una muestra dada puede genotiparse para determinar el estado de SIRP y la unión a SIRP puede determinarse usado citometría de flujo.
[0024] En algunos aspectos, un anticuerpo divulgado en la presente es específico para un isotipo de SIRPa humana.
[0025] En algunos aspectos, la SIRPa humana se expresa en una célula presentadora de antígeno profesional. En algunos aspectos, la SIRPa humana se expresa en un macrófago.
[0026] Un anticuerpo divulgado en la presente, como 1H9, puede unirse a SIRPa humana en la superficie celular. La unión de un anticuerpo divulgado en la presente a SIRPa puede ser estable, por ejemplo, durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más de 24 horas. Un anticuerpo divulgado en la presente puede evitar la internalización sustancial tras la unión a SIRPa. Tales anticuerpos pueden incluir 1H9 y 3C2, incluyendo las versiones humanizadas y/o manipuladas con Fc de tales anticuerpos. La unión a la SIRPa humana puede medirse usando ensayos conocidos en la técnica que incluyen citometría de flujo y/o IHC.
[0027] En algunos aspectos, el anticuerpo es 1H9 o 3C2.
[0028] En algunos aspectos, la región Fc humana es IgG1 o IgG4, opcionalmente modificada con una modificación.
[0029] En algunos aspectos, la glicosilación del anticuerpo se reduce mediante la desglicosilación enzimática, la expresión en un huésped bacteriano o la modificación de un residuo de aminoácido utilizado para la glicosilación. En algunos aspectos, una modificación divulgada en la presente reduce la glicosilación de la región Fc humana. En algunos aspectos, la modificación de la región Fc humana comprende una modificación en la posición de índice EU asparagina 297. En algunos aspectos, la modificación de la región Fc humana comprende una sustitución de aminoácidos en la posición de índice EU asparagina 297. En algunos aspectos, la modificación de la región Fc humana comprende una sustitución de aminoácido N297A, numerada de acuerdo con el índice EU. En algunos aspectos, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en: N297A; L234A/L235A; C220S/C226S/C229S/P238S; C226S/C229S/E3233P/L234V/L235A; o L234F/L235E/P331S, numeración de acuerdo con el índice EU. En algunos aspectos, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en: N297; L234/L235; C220/C226/C229/P238; C226/C229/E3233/L234/L235; o L234/L235/P331, numeración de acuerdo con el índice UE. En algunos aspectos, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región CH2 en las posiciones 234, 235 y/o 237 del índice EU. En algunos aspectos, la modificación comprende una o ambas sustituciones de aminoácidos L234A y L235A, y opcionalmente P331S y/o K322A y/o G237A, numeración de acuerdo con el índice EU. En algunos aspectos, la modificación comprende la sustitución del aminoácido K322A, numeración de acuerdo con el índice EU. En algunos aspectos, la modificación comprende E233P/L234V/L235A/G236+A327G/A330S/P331S, numeración de acuerdo con el índice EU.
[0030] En algunos aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
[0031] En algunos aspectos, el anticuerpo es multiespecífico. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a más de un antígeno o más de un epítopo en un único antígeno.
[0032] En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de una clase seleccionada de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de la clase IgG y una subclase seleccionada de IgG1, IgG4, IgG2 e IgG3.
[0033] En algunos aspectos, el anticuerpo se une a SIRPa humana con una Kd menor o igual a aproximadamente 1, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10x10-9 M, según se mide mediante el ensayo Biacore.
[0034] En algunos aspectos, un anticuerpo divulgado en la presente es para su uso como medicamento. En algunos aspectos, un anticuerpo divulgado en la presente es para su uso en el tratamiento de un cáncer o una infección. En algunos aspectos, un anticuerpo divulgado en la presente es para su uso en el tratamiento de un cáncer, en donde el cáncer se selecciona de un tumor sólido y un tumor hematológico. En algunos aspectos, un anticuerpo divulgado en la presente es para su uso en el aumento de la fagocitosis.
[0035] También se divulga en la presente un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado que compite por unirse a la SIRPa humana con un anticuerpo divulgado en la presente.
[0036] También se divulga en la presente un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado que se une al epítopo de SIRPa humana unido al que se ha unido un anticuerpo divulgado en la presente.
[0037] También se divulga en la presente un polinucleótido aislado o un conjunto de polinucleótidos que codifican un anticuerpo aislado divulgado en la presente, una V<h>del mismo, una V<l>del mismo, una cadena ligera del mismo, una cadena pesada del mismo o una porción de unión a antígeno del mismo.
[0038] También se divulga en la presente un vector o conjunto de vectores que comprende un polinucleótido o conjunto de polinucleótidos divulgados en la presente.
[0039] También se divulga en la presente una célula huésped que comprende un polinucleótido o conjunto de polinucleótidos divulgados en la presente o un vector o conjunto de vectores divulgados en la presente.
[0040] También se divulga en la presente un método para producir un anticuerpo que comprende expresar el anticuerpo con una célula huésped divulgada en la presente y aislar el anticuerpo expresado.
[0041] También se divulga en la presente una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo divulgado en la presente y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0042] También se divulga en la presente un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección en un sujeto con necesidad de ello, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en la presente o una composición farmacéutica divulgada en la presente.
[0043] En algunos aspectos, la enfermedad o afección es: cáncer; infección; una infección viral; una infección bacteriana; una infección por hongos; fibrosis; arterosclerosis; una infección parasitaria, opcionalmente malaria; y agotamiento o reducción de las células madre formadoras de sangre endógenas de la médula ósea para permitir el acondicionamiento reducido o libre de radiación y/o quimioterapia para el trasplante de células madre formadoras de sangre, opcionalmente en combinación con el anticuerpo anti-CKIT (CD117).
[0044] En algunos aspectos, la enfermedad o afección es un cáncer, y el cáncer se selecciona de un tumor sólido y un tumor hematológico.
[0045] También se divulga en la presente un método para aumentar la fagocitosis en un sujeto con necesidad de ello, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en la presente o una composición farmacéutica divulgada en la presente.
[0046] También se divulga en la presente un método para modular una respuesta inmunitaria en un sujeto con necesidad de ello, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en la presente o una composición farmacéutica divulgada en la presente.
[0047] En algunos aspectos, un método divulgado en la presente comprende además administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales al sujeto.
[0048] En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo. En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que se une a una proteína o proteínas en la superficie de una célula tumoral. En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que se une a: HER2 (ERBB2/neu), CD52, PD-L1, VEGF, CD30, EGFR, CD38, RANKL (CD254), GD2 (gangliósido), SLAMF7 (CD319), CD20, EGFR, PDGFRa, VEGFR2, CD33, CD44, CD99, CD96, CD90, CD133, CKIT (CD117 para tumores positivos para CKIT); CTLA-4, PD-1, PD-L1, CD40 (agonista), LAG3 (CD223), 41BB(CD137 agonista), OX40 (CD134, agonista); y/o CKIT (CD117) para agotar las células madre formadoras de sangre para la terapia de trasplante. En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional es por lo menos uno de: Rituximab, Cetuximab, Alemtuzumab (CD52), Atezolizumab (PD-L1), Avelumab (PD-L1), Bevacizumab (VEGF), Brentuximab (CD30), Daratumumab (Cd 38), Denosumab (Ra NKl ), Dinutuximab (GD2), Elotuzumab (SLAMF7), Ibritumomab (CD20), Ipilimumab (CTLA-4), Necitumumab (EGFR), Nivolumab (PD-1), Obinutuzumab (CD20), Ofatumumab (CD20), Olaratumab (PDGFRa), Panitumumab (EGFR), Pembrolizumab (Pd -1), pertuzumab (HEr 2), ramucirumab (VEGFR2), tositumomab (CD20) y gemtuzumab (Cd 33).
[0049] En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional se formula en la misma composición farmacéutica que el anticuerpo. En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional se formula en una composición farmacéutica diferente a la del anticuerpo.
[0050] En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional se administra antes de administrar el anticuerpo. En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional se administra después de administrar el anticuerpo. En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional se administra al mismo tiempo que el anticuerpo.
[0051] También se divulga en la presente un kit que comprende un anticuerpo divulgado en la presente o una composición farmacéutica divulgada en la presente; e instrucciones de uso.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS
[0052] Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción y los dibujos acompañantes, donde:
[0053]Figura 1. Secuencias de región variable de cadena pesada (A) y ligera (B) de 1H9. Las CDR están subrayadas.
[0054]Figura 2. Secuencias de región variable de cadena pesada (A) y ligera (B) de 3C2. Las CDR están subrayadas.
[0055]Figura 3. 1H9 y 3C2 reconocen epítopos distintos. (A) La proteína de fusión SIRPa-Fc se revistió en una placa de 96 pocillos y se incubó con 1H9 o 3C2 en ausencia o presencia de cantidades en exceso de 50 o 100 veces de Kwar de ratón. (B) La proteína de fusión SIRPa-Fc se revistió en una placa de 96 pocillos y se incubó con 1H9 de ratón en ausencia o presencia de cantidades en exceso de 5, 10, 50 y 100 veces de 1H9 o 3C2. (C) La proteína de fusión SIRPa-Fc se revistió en una placa de 96 pocillos y se incubó con 3C2 de ratón en ausencia o presencia de cantidades en exceso de 5, 10, 50 y 100 veces de 3C2 o 1H9.
[0056] Figura 4. 1H9 y 3C2 hacen sinergia con rituximab para promover la fagocitosis mediada por macrófagos de las células Raji.Los macrófagos se diferenciaron de los monocitos del donante A (A) y del donante B (B) en presencia de suero humano durante 7 días. Las células Raji se marcaron con CFSE y se incubaron con los macrófagos en presencia de 10 ug/ml de rituximab solo o en combinación con 10 ug/ml de 1H9-G4, 1H9-G1, 3C2-G4 o 3C2-G1. Dos horas después, se calculó el porcentaje de fagocitosis mediante análisis de citometría de flujo en busca de macrófagos GFP+.
[0057]Figura 5. Secuencias de región variable de cadena pesada (A) y ligera (B) de 1H9 humanizado.Las CDR están subrayadas.
[0058]Figura 6. Secuencias de región variable de cadena pesada (A) y ligera (B) de 3C2 humanizado.Las CDR están subrayadas.
[0059]Figura 7. 1H9 y 3C2 humanizados poseen la misma especificidad de unión a antígeno que sus anticuerpos originales.(A) La proteína de fusión SIRPa-Fc se revistió en una placa de 96 pocillos y se incubó con 1H9 de ratón en ausencia o presencia de cantidades en exceso de 5, 10, 50 y 100 veces de 1H9 humanizado. (B) La proteína de fusión SIRPa-Fc se revistió en una placa de 96 pocillos y se incubó con 3C2 de ratón en ausencia o presencia de cantidades en exceso de 5, 10, 50 y 100 veces de 3C2 humanizado.
[0060]Figura 8. Medición de afinidad por Biacore de 1H9 y 3C2 humanizados.
[0061]Figura 9. 1H9 y 3C2 humanizados hacen sinergia con anticuerpos terapéuticos para promover la fagocitosis.(A) Las células Raji se marcaron con CFSE y se incubaron con macrófagos derivados de monocitos humanos en presencia de 10 ug/ml de rituximab solo o en combinación con 10 ug/ml de HulH9-G1 o Hu3C2-G1. (B) Las células HT29 se marcaron con CFSE y se incubaron con macrófagos derivados de monocitos humanos en presencia de 0,1 ug/ml de cetuximab solo o en combinación con 0,5 ug/ml, 5 ug/ml y 10 ug/ml de HulH9-G1 o Hu3C2-G1. Dos horas después, se calculó el porcentaje de fagocitosis mediante análisis de citometría de flujo en busca de macrófagos GFP+.
[0062]Figura 10. Reactividad cruzada con SIRPB y SIRPG.(A) La unión de Kwar, 1H9 y 3C2 a la proteína de fusión SIRPB-His humana se determinó mediante ELISA. (B) La unión de Kwar, 1H9 y 3C2 a la proteína de fusión SIRPG-His humana se determinó mediante ELISA.
[0063]Figura 11. 9B11 y 7E11 hacen sinergia con rituximab para promover la fagocitosis de células Raji mediada por macrófagos.
[0064]Figura 12. Unión a epítopo de 7E11 y 9B11.7E11 reconoce un epítopo superpuesto en comparación con Kwar (similar a 3C2) y 9B11 reconoce un epítopo muy similar o idéntico en comparación con Kwar.
[0065]Figura 13.HulH9-G1 se une a las variantes tanto V1 como V2 de SIRPa en las células.
[0066]Figura 14.HulH9-G1 bloquea la unión de CD47 a monocitos de diferentes donantes.
[0067]Figura 15.HulH9-G1 hace sinergia con cetuximab para promover la fagocitosis en diferentes donantes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Definiciones
[0068] A menos que se defina lo contrario, se pretende que todos los términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica usada en la presente tengan los significados comúnmente entendidos por los expertos en la técnica. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en la presente para mayor claridad y/o para facilitar la referencia, y no debe interpretarse necesariamente la inclusión de tales definiciones en la presente como una diferencia sobre lo que se entiende generalmente en la técnica. Las técnicas y los procedimientos descritos o a los que se hace referencia en la presente generalmente son bien entendidos y se emplean comúnmente usando metodologías convencionales por los expertos en la técnica, como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4a ed. (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Según corresponda, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado generalmente se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos y condiciones definidos por el fabricante, a menos que se indique lo contrario.
[0069] Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se pretende que los términos "incluir", "tal como" y similares transmitan inclusión sin limitación, a menos que se indique específicamente lo contrario.
[0070] Como se usa en la presente, el término "que comprende" también incluye específicamente realizaciones "que consiste en" y "que consiste esencialmente en" los elementos enumerados, a menos que se indique específicamente lo contrario. Por ejemplo, un anticuerpo multiespecífico "que comprende un diacuerpo" incluye un anticuerpo multiespecífico "que consiste en un diacuerpo" y un anticuerpo multiespecífico "que consiste esencialmente en un diacuerpo".
[0071] El término "aproximadamente" indica y abarca un valor indicado y un rango por encima y por debajo de ese valor. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" indica el valor designado ±10%, ±5% o ±1%. En ciertas realizaciones, cuando corresponda, el término "aproximadamente" indica el valor o valores designados ± una desviación estándar de ese valor o valores.
[0072] SIRPa1 (PTPNS1, SHPS1), es una glicoproteína transmembrana, expresada principalmente en células mieloides y neuronales. SIRPa interactúa con la proteína de membrana CD47 ampliamente distribuida. Además de SIRPa, hay dos proteínas estrechamente relacionadas en la familia SIRP: SIRPp y SIRPy. Las tres tienen tres dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) en su región extracelular. En humanos, la proteína SIRPa se encuentra en dos formas principales. Una forma, la variante 1 o forma V1, tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como NCBI RefSeq NP_542970.1 (los residuos 27-504 constituyen la forma madura). Otra forma, la variante 2 o forma V2, difiere en 13 aminoácidos y tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en GenBank como CAA71403.1 (los residuos 30-504 constituyen la forma madura). Estas dos formas de SIRPa constituyen aproximadamente el 80% de las formas de SIRPa presentes en los humanos, y ambas están abarcadas en la presente por el término "SIRPa humana". El término "SIRPa humana" también abarca las formas menores del mismo que son endógenas a los humanos y tienen la misma propiedad de desencadenar la transducción de señales a través de CD47 al unirse al mismo. Puede accederse a las secuencias de variantes humanas de SIRPa a través de bases de datos públicas, incluyendo los números de acceso de Genbank: reflNP_542970.1; gblEAX10606.1; reflXP_005260726.1; gblEAX10606.1; XP_005260726.1; gblEAX10611.1; gblEAX10609.1; dbjlBAA12974.1; gblAAH26692.1; reflXP_011527475.1. Ver, por ejemplo, Lee et al. (2007) J. Inmunol. 179(11): 7741-7750.
[0073] Los anticuerpos que se unen específicamente a SIRPa humana son conocidos y se usan en la técnica, y pueden adaptarse mediante el uso de una región Fc diseñada como se divulga en la presente. Los anticuerpos ejemplares incluyen los descritos en la solicitud de patente internacional WO 2015/138600; en la solicitud de Estados Unidos publicada 2014/0242095 (University Health Networks); solicitud publicada CN103665165 (JIANGSU KUANGYA BIOLOGICAL MEDICAL SCIENCE & TECHNOLOGY; ZhaoXW et al.Proc Natl Acad Sci USA108:18342-7 (2011). Un anticuerpo anti-SIRPa puede ser panespecífico, es decir, unirse a dos o más isoformas de SIRPa humanas diferentes; o puede ser específico para una isoforma. Por ejemplo, se informa que el anticuerpo 1.23A descrito por Zhang et al., supra, es específico para la variante SIRPa1, mientras que el anticuerpo 12C4 es panespecífico. Los anticuerpos anti-SIRPa también pueden ser específicos para SIRPa y carecer de unión a SIRPp y/o SIRP<y>. Los anticuerpos anti-SIRPa pueden ser panespecíficos con respecto a SIRPp y/o SIRP<y>.
[0074] El término "inmunoglobulina" se refiere a una clase de proteínas estructuralmente relacionadas que generalmente comprenden dos pares de cadenas polipeptídicas: un par de cadenas ligeras (L) y un par de cadenas pesadas (H). En una "inmunoglobulina intacta", estas cuatro cadenas están interconectadas por enlaces disulfuro. La estructura de las inmunoglobulinas ha sido bien caracterizada. Ver, por ejemplo, Paul,Fundamental Immunology7a ed., cap. 5 (2013) Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA. Brevemente, cada cadena pesada comprende típicamente una región variable de cadena pesada (V<h>) y una región constante de cadena pesada (C<h>). La región constante de la cadena pesada típicamente comprende tres dominios, abreviados CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende típicamente una región variable de cadena ligera (V<l>) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende típicamente un dominio, abreviado Cl.
[0075] El término "anticuerpo" se usa en la presente en su sentido más amplio e incluye ciertos tipos de moléculas de inmunoglobulina que comprenden uno o más dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a un antígeno o epítopo. Un anticuerpo incluye específicamente anticuerpos intactos (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas), fragmentos de anticuerpos y anticuerpos multiespecíficos. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una estructura base alternativa. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo consiste en un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo consiste esencialmente en un fragmento de anticuerpo. Un "anticuerpo para SIRP-ALFA", "anticuerpo anti-SIRP-ALFA," o "anticuerpo específico de SIRP-ALFA" es un anticuerpo, como se proporciona en la presente, que se une específicamente al antígeno de SIRP-ALFA. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al dominio extracelular de SIRP-ALFA. En ciertas realizaciones, un anticuerpo para SIRP-ALFA proporcionado en la presente se une a un epítopo de SIRP-ALFA que se conserva entre las proteínas SIRP-ALFA de diferentes especies.
[0076] El término "estructura base alternativa" se refiere a una molécula en la que pueden diversificarse una o más regiones para producir uno o más dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a un antígeno o epítopo. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno se une al antígeno o epítopo con especificidad y afinidad similares a las de un anticuerpo. Entre las estructuras base alternativas ejemplares se incluyen las derivadas de fibronectina (por ejemplo, Adnectins™), el sándwich p (por ejemplo, iMab), lipocalina (por ejemplo, Anticalins®), EETI-II/AGRP, BPTI/LACI-D1/ITI-D2 (por ejemplo, dominios Kunitz), aptámeros peptídicos de tiorredoxina, proteína A (por ejemplo, Affibody®), repeticiones de anquirina (por ejemplo, DARPins), gamma-B-cristalina/ubiquitina (por ejemplo, Affilins), CTLD3 (por ejemplo, tetranectinas), Fynómeros y (módulo LDLR-A) (por ejemplo, avimeros). Información adicional sobre estructuras base alternativas se proporciona en Binz et al.,Nat. Biotechnol.,2005 23:1257-1268; Skerra,Currrent Opin. in Biotech.,2007 18:295-304; y Silacci et al.,J. Biol. Chem.,2014, 289:14392-14398. Una estructura base alternativa es un tipo de anticuerpo.
[0077] El término "dominio de unión a antígeno" significa la porción de un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a un antígeno o epítopo. Un ejemplo de un dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno formado por un dímero V<h>-V<l>de un anticuerpo. Otro ejemplo de un dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno formado por la diversificación de ciertos giros del décimo dominio tipo III de fibronectina de una Adnectina. Un dominio de unión a antígeno puede incluir las CDR 1, 2 y 3 de una cadena pesada en ese orden; y las CDR 1, 2 y 3 de una cadena ligera en ese orden.
[0078] Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en la presente indistintamente para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a la estructura de un anticuerpo de origen natural y que tiene cadenas pesadas que comprenden una región Fc. Por ejemplo, cuando se usa para referirse a una molécula de IgG, un "anticuerpo de longitud completa" es un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.
[0079] El término "región Fc" o "Fc" significa la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que, en los anticuerpos de origen natural, interactúa con los receptores Fc y ciertas proteínas del sistema del complemento. Las estructuras de las regiones Fc de varias inmunoglobulinas y los sitios de glicosilación contenidos en las mismas son conocidos en la técnica. Consultar Schroeder y Cavacini,J. Allergy Clin. Immunol.,2010, 125:S41-52. La región Fc puede ser una región Fc natural o una región Fc modificada como se describe en la técnica o en otra parte de esta divulgación.
[0080] Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad ("regiones hipervariables (HVR)", también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR)) intercaladas con regiones que están más conservadas. Las regiones más conservadas se denominan regiones marco (FR). Cada Vh y Vl generalmente comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas en el siguiente orden (desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Las CDR están implicadas en la unión al antígeno e influyen en la especificidad del antígeno y la afinidad de unión del anticuerpo. Consultar Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest5a ed. (1991) Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.
[0081] La cadena ligera de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno de dos tipos, llamados kappa (<k>) y lambda (A), sobre la base de la secuencia de su dominio constante.
[0082] La cadena pesada de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a una de cinco clases diferentes (o isotipos): IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Estas clases también se designan a, 8, £, y y M, respectivamente. Las clases de IgG e IgA se dividen además en subclases sobre la base de las diferencias en secuencia y función. Los humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
[0083] Los límites de la secuencia de aminoácidos de una CDR pueden ser determinados por un experto en la técnica usando cualquiera de varios esquemas de numeración conocidos, incluyendo los descritos por Kabat et al., supra (esquema de numeración de "Kabat"); Al-Lazikani et al., 1997,J. Mol. Biol.,273:927-948 (esquema de numeración de "Chothia"); MacCallum et al., 1996,J. Mol. Biol.262:732-745 (esquema de numeración de "contacto"); Lefranc et al.,Dev. Comp. Immunol.,2003, 27:55-77 (esquema de numeración "IMGT"); y Honegge y Plückthun,J. Mol. Biol.,2001, 309:657-70 (esquema de numeración "a Ho").
[0084] La Tabla 1 proporciona las posiciones de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 identificadas por los esquemas de Kabat y Chothia. Para CDR-H1, la numeración de residuos se proporciona usando los esquemas de numeración tanto de Kabat como de Chothia.
[0085] Las CDR pueden asignarse, por ejemplo, usando software de numeración de anticuerpos, como Abnum, disponible en www.bioinf.org.uk/abs/abnum/, y descrito en Abhinandan and Martin,Immunology,2008, 45:3832-3839.
T l 1. R i n l DR r n l m n m r i n K h hi
[0086] El "esquema de numeración EU" se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en una región constante de cadena pesada de anticuerpo (por ejemplo, como se informa en Kabat et al., supra). A menos que se indique lo contrario, el esquema de numeración EU se usa para referirse a los residuos en las regiones constantes de la cadena pesada del anticuerpo descritas en la presente.
[0087] Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, como la región variable o de unión a antígeno de un anticuerpo intacto. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, por ejemplo, fragmentos Fv, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos scFv (sFv) y fragmentos scFv-Fc.
[0088] Los fragmentos "Fv" comprenden un dímero no covalentemente enlazado de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera.
[0089] Los fragmentos "Fab" comprenden, además de los dominios variables de cadena ligera y pesada, el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (Cm) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab pueden generarse, por ejemplo, mediante métodos recombinantes o por digestión con papaína de un anticuerpo de longitud completa.
[0090] Los fragmentos "F(ab')2" contienen dos fragmentos Fab' unidos, cerca de la región bisagra, por enlaces disulfuro. Los fragmentos F(ab')2 pueden generarse, por ejemplo, por métodos recombinantes o por digestión con pepsina de un anticuerpo intacto. Los fragmentos F(ab') pueden disociarse, por ejemplo, mediante tratamiento con pmercaptoetanol.
[0091] Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "sFv" o "scFv" comprenden un dominio V<h>y un dominio V<l>en una sola cadena polipeptídica. La V<h>y la V<l>generalmente están unidas por un conector peptídico. Consultar Pluckthun A. (1994). Puede usarse cualquier enlazador adecuado. En algunas realizaciones, el conector es un (GGGGS)n (SEQ ID NO: 50). En algunas realizaciones, n = 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Consultar Anticuerpos deEscherichia coli.En Rosenberg M. & Moore GP (Eds.),The Pharmacology of Monoclonal Antibodiesvol. 113 (págs. 269-315). Springer-Verlag, Nueva York.
[0092] Los fragmentos "scFv-Fc" comprenden un scFv unido a un dominio Fc. Por ejemplo, puede unirse un dominio Fc al extremo C-terminal del scFv. El dominio Fc puede seguir a la V<h>o la V<l>, dependiendo de la orientación de los dominios variables en el scFv (es decir, V<h>-V<l>o V<l>-V<h>). Puede usarse cualquier dominio Fc adecuado conocido en la técnica o descrito en la presente. En algunos casos, el dominio Fc comprende un dominio Fc de IgG4.
[0093] El término "anticuerpo de dominio único" se refiere a una molécula en la que un dominio variable de un anticuerpo se une específicamente a un antígeno sin la presencia del otro dominio variable. Los anticuerpos de dominio único, y fragmentos de los mismos, se describen en Arabi Ghahroudi et al.,FEBS Letters,1998, 414:521-526 y Muyldermans et al.,Trendsin Biochem. Sci.,2001,26:230-245. Los anticuerpos de dominio único también se conocen como sdAbs o nanocuerpos.
[0094] Un "anticuerpo multiespecífico" es un anticuerpo que comprende dos o más dominios de unión a antígeno diferentes que colectivamente se unen específicamente a dos o más epítopos diferentes. Los dos o más epítopos diferentes pueden ser epítopos en el mismo antígeno (por ejemplo, una sola molécula SIRP-ALFA expresada por una célula) o en antígenos diferentes (por ejemplo, diferentes moléculas SIRP-ALFA expresadas por la misma célula, o una molécula SIRP-ALFA y una molécula que no es SIRP-ALFA). En algunos aspectos, un anticuerpo multiespecífico se une a dos epítopos diferentes (es decir, un "anticuerpo biespecífico"). En algunos aspectos, un anticuerpo multiespecífico se une a tres epítopos diferentes (es decir, un "anticuerpo triespecífico").
[0095] Un "anticuerpo monoespecífico" es un anticuerpo que comprende uno o más sitios de unión que se unen específicamente a un solo epítopo. Un ejemplo de un anticuerpo monoespecífico es una molécula de IgG de origen natural que, aunque es divalente (es decir, que tiene dos dominios de unión a antígeno), reconoce el mismo epítopo en cada uno de los dos dominios de unión a antígeno. La especificidad de unión puede estar presente en cualquier valencia adecuada.
[0096] El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos. Una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos comprende anticuerpos que son sustancialmente similares y que se unen a los mismos epítopos, excepto por las variantes que normalmente pueden surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal. Tales variantes generalmente están presentes solo en cantidades menores. Un anticuerpo monoclonal se obtiene típicamente mediante un proceso que incluye la selección de un solo anticuerpo de una pluralidad de anticuerpos. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, como un grupo de clones de hibridoma, clones de fagos, clones de levadura, clones bacterianos u otros clones de ADN recombinante. El anticuerpo seleccionado puede alterarse adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad para el objetivo ("maduración de afinidad"), para humanizar el anticuerpo, para mejorar su producción en cultivo celular, y/o para reducir su inmunogenicidad en un sujneto.
[0097] El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o liviana se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.
[0098] Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado es generalmente un anticuerpo humano (anticuerpo receptor) en el que los residuos de una o más CDR se reemplazan por residuos de una o más CDR de un anticuerpo no humano (anticuerpo donante). El anticuerpo donante puede ser cualquier anticuerpo no humano adecuado, como un anticuerpo de ratón, rata, conejo, pollo o primate no humano que tenga una especificidad, afinidad o efecto biológico deseados. En algunos casos, los residuos de la región marco seleccionados del anticuerpo receptor se reemplazan por los residuos de la región marco correspondientes del anticuerpo donante. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo del receptor ni en el anticuerpo del donante. Tales modificaciones pueden realizarse para refinar aún más la función del anticuerpo. Para detalles adicionales, consultar Jones et al.,Nature,1986, 321:522-525; Riechmann et al.,Nature,1988, 332:323-329; y Presta,Curr. Op. Estructura. Biol.,1992, 2:593-596.
[0099] Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana, o derivado de una fuente no humana que utiliza un repertorio de anticuerpos humanos o secuencias codificantes de anticuerpos humanos (por ejemplo, obtenidos de fuentes humanas o diseñados de novo). Los anticuerpos humanos excluyen específicamente los anticuerpos humanizados.
[0100] "Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno o epítopo). A menos que se indique lo contrario, como se usa en la presente, "afinidad" se refiere a la afinidad de unión intrínseca, que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno o epítopo). La afinidad de una molécula X por su compañero Y puede representarse mediante la constante de equilibrio de disociación (K<d>). Los componentes cinéticos que contribuyen a la constante de equilibrio de disociación se describen con más detalle a continuación. La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en la presente, como la tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) (por ejemplo, BIACORE®) o interferometría de biocapa (por ejemplo, FORTEBIO®).
[0101] Con respecto a la unión de un anticuerpo a una molécula objetivo, los términos "unión", "unión específica", "se une específicamente a", "específico para", "se une selectivamente" y "selectivo para" un antígeno particular (por ejemplo, un objetivo polipeptídico) o un epítopo en un antígeno particular significan unión que es diferente mediblemente de una interacción no específica o no selectiva (por ejemplo, con una molécula no objetivo). La unión específica puede medirse, por ejemplo, midiendo la unión a una molécula objetivo y comparándola con la unión a una molécula no objetivo. La unión específica también puede determinarse por competencia con una molécula de control que imita el epítopo reconocido en la molécula objetivo. En ese caso, la unión específica está indicada si la molécula de control inhibe competitivamente la unión del anticuerpo a la molécula objetivo. En algunos aspectos, la afinidad de un anticuerpo para SIRP-ALFA por una molécula no objetivo es menor de aproximadamente el 50% de la afinidad por SIRP-ALFA. En algunos aspectos, la afinidad de un anticuerpo para SIRP-ALFA por una molécula no objetivo es menor de aproximadamente el 40% de la afinidad por SIRP-ALFA. En algunos aspectos, la afinidad de un anticuerpo para SIRP-ALFA por una molécula no objetivo es menor de aproximadamente el 30% de la afinidad por SIRP-ALFA. En algunos aspectos, la afinidad de un anticuerpo para SIRP-ALFA por una molécula no objetivo es menor de aproximadamente el 20% de la afinidad por SIRP-A<lf>A. En algunos aspectos, la afinidad de un anticuerpo para SIRP-ALFA por una molécula no objetivo es menor de aproximadamente el 10% de la afinidad por SIRP-ALFA. En algunos aspectos, la afinidad de un anticuerpo para SIRP-ALFA por una molécula no objetivo es menor de aproximadamente el 1% de la afinidad por SIRP-ALFA. En algunos aspectos, la afinidad de un anticuerpo para SIRP-ALFA por una molécula no objetivo es menor de aproximadamente el 0,1% de la afinidad por SIRP-ALFA.
[0102] El término "kd" (seg_1), como se usa en la presente, se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción antígeno-anticuerpo particular. Este valor también se denomina valor koff.
[0103] El término "ka" (M‘1xseg ■1), como se usa en la presente, se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción antígeno-anticuerpo particular. Este valor también se conoce como el valor de kon.
[0104] El término "K<d>" (M), tal como se usa en la presente, se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción antígeno-anticuerpo particular. K<d>= kd/ka. En algunas realizaciones, la afinidad de un anticuerpo se describe en términos de K<d>para una interacción entre dicho anticuerpo y su antígeno. Para mayor claridad, como se sabe en la técnica, un valor de K<d>menor indica una interacción de mayor afinidad, mientras que un valor de K<d>mayor indica una interacción de menor afinidad.
[0105] El término "Ka" (M'1), como se usa en la presente, se refiere a la constante de equilibrio de asociación de una interacción antígeno-anticuerpo particular. Ka = ka/kd.
[0106] Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, como un agente terapéutico (citoquina, por ejemplo) o de diagnóstico.
[0107] Las "funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas mediadas por la región Fc de un anticuerpo, cuyas actividades pueden variar dependiendo del isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen la unión de C1q para activar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la unión del receptor Fc para activar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).
[0108] Cuando se usa en la presente en el contexto de dos o más anticuerpos, el término "compite con" o "competencia cruzada con" indica que los dos o más anticuerpos compiten por unirse a un antígeno (por ejemplo, SIRP-ALFA). En un ensayo ejemplar, SIRP-ALFA se recubre sobre una superficie y se pone en contacto con un primer anticuerpo para SIRP-ALFA, después de lo cual se añade un segundo anticuerpo para SIRP-ALFA. En otro ensayo ejemplar, se recubre una superficie con un primer anticuerpo para SIRP-ALFA y se pone en contacto con SIRP-ALFA, y luego se añade un segundo anticuerpo para SIRP-ALFA. Si la presencia del primer anticuerpo para SIRP-ALFA reduce la unión del segundo anticuerpo para SIRP-ALFA, en cualquier ensayo, entonces los anticuerpos compiten entre sí. El término "compite con" también incluye combinaciones de anticuerpos en las que un anticuerpo reduce la unión de otro anticuerpo, pero donde no se observa competencia cuando se añaden los anticuerpos en el orden inverso. Sin embargo, en alguno casos, el primer y el segundo anticuerpos inhiben la unión entre sí, independientemente del orden en que se añadan. En algunos casos, un anticuerpo reduce la unión de otro anticuerpo a su antígeno en por lo menos un 25%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90% o por lo menos un 95%. Un experto en la técnica puede seleccionar las concentraciones de los anticuerpos usados en los ensayos competitivos basándose en las afinidades de los anticuerpos por SIRP-ALFA y la valencia de los anticuerpos. Los ensayos descritos en esta definición son ilustrativos y un experto en la técnica puede utilizar cualquier ensayo adecuado para determinar si los anticuerpos compiten entre sí. Los ensayos adecuados se describen, por ejemplo, en Cox et al.,Assay Guidance Manual [Internet],actualizado el 24 de diciembre de 2014 (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/; consultado el 29 de septiembre de 2015); Silman et al.,Cytometry,2001, 44:30-37; y Finco et al.,J. Pharm. Biomed. Anal.,2011, 54:351-358.
[0109] El término "epítopo" significa una parte de un antígeno que se une específicamente a un anticuerpo. Los epítopos con frecuencia consisten en residuos de aminoácidos accesibles en la superficie y/o cadenas laterales de azúcar y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión a los primeros pero no a los últimos puede perderse en presencia de solventes desnaturalizantes. Un epítopo puede comprender residuos de aminoácidos que están directamente implicados en la unión y otros residuos de aminoácidos que no están directamente implicados en la unión. El epítopo al que se une un anticuerpo puede determinarse usando técnicas conocidas para la determinación de epítopos como, por ejemplo, la prueba de unión de anticuerpos a variantes de SIRP-ALFA con diferentes mutaciones puntuales, o variantes de SIRP-ALFA quiméricas.
[0110] El porcentaje de "identidad" entre una secuencia polipeptídica y una secuencia de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando software disponible públicamente como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, MEGALIGN (DNASTAR), CLUSTALW, CLUSTALOMEGA o MUSCLE. Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima en la longitud completa de las secuencias que se comparan.
[0111] Una "sustitución conservadora" o una "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a la sustitución de un aminoácido con un aminoácido química o funcionalmente similar. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos similares son bien conocidas en la técnica. A modo de ejemplo, los grupos de aminoácidos proporcionados en las Tablas 2-4 se consideran, en algunas realizaciones, sustituciones conservadoras entre sí.
[0112]Tabla 2.Grupos seleccionados de aminoácidos que se consideran sustituciones conservadores entre sí, en ciertas realizaciones.
[0113]Tabla 3.Grupos seleccionados adicionales de aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras entre sí, en ciertas realizaciones.
[0114]Tabla 4.Grupos seleccionados adicionales de aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras entre sí, en ciertas realizaciones.
[0114] Sustituciones conservadoras adicionales pueden encontrarse, por ejemplo, en Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties2a ed. (1993) W.H. Freeman & Co., Nueva York, NY Un anticuerpo generado mediante la realización de una o más sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos en un anticuerpo original se denomina "variante modificada de manera conservadora".
[0116] El término "aminoácido" se refiere a los veinte aminoácidos de origen natural comunes. Los aminoácidos de origen natural incluyen alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C); ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), Glicina (Gly; G); histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).
[0117] El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está enlazado. El término incluye el vector como estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. Tales vectores se denominan en la presente "vectores de expresión".
[0118] Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido un ácido nucleico exógeno y la progenie de tales células. Las células huésped incluyen "transformantes" (o "células transformadas") y "transfectantes" (o "células transfectadas"), cada una de las cuales incluye la célula primaria transformada o transfectada y la progenie derivada de la misma. Dicha progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácidos nucleicos a una célula original y puede contener mutaciones.
[0119] El término "que trata" (y variaciones del mismo como "tratar" o "tratamiento") se refiere a una intervención clínica en un intento de alterar el curso natural de una enfermedad o afección en un sujeto que lo necesita. El tratamiento puede realizarse tanto para la profilaxis como durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y la remisión o mejora del pronóstico.
[0120] Como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo o composición farmacéutica proporcionada en la presente que, cuando se administra a un sujeto, es eficaz para tratar una enfermedad o trastorno.
[0121] Como se usa en la presente, el término "sujeto" significa un sujeto mamífero. Los sujetos ejemplares incluyen humanos, monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, camellos, cabras, conejos y ovejas. En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad o afección que puede tratarse con un anticuerpo proporcionado en la presente. En algunos aspectos, la enfermedad o afección es un cáncer. En algunos aspectos, la enfermedad o afección es una infección viral.
[0122] El término "prospecto" se usa para hacer referencia a las instrucciones incluidas habitualmente en los paquetes comerciales de productos terapéuticos o de diagnóstico (por ejemplo, kits) que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, la administración, la terapia de combinación, las contraindicaciones y/o las advertencias relacionadas con el uso de dichos productos terapéuticos o de diagnóstico.
[0123] El término "agente citotóxico", como se usa en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular.
[0124] Un "agente quimioterapéutico" se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los agentes quimioterapéuticos incluyen "agentes antihormonales" o "agentes terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer.
[0125] El término "agente citostático" se refiere a un compuesto o composición que detiene el crecimiento de una célula in vitro o in vivo. En algunas realizaciones, un agente citostático es un agente que reduce el porcentaje de células en fase S. En algunas realizaciones, un agente citostático reduce el porcentaje de células en la fase S en por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 60% o por lo menos aproximadamente un 80%.
[0126] El término "tumor" se refiere a todo el crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no se excluyen mutuamente según se refieren en la presente. Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que están asociados con algún grado de proliferación celular anormal. En algunas realizaciones, el trastorno de proliferación celular es un cáncer. En algunos aspectos, el tumor es un tumor sólido. En algunos aspectos, el tumor es una enfermedad maligna hematológica.
[0127] El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que tiene una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz en el tratamiento de un sujeto, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para el sujeto en las cantidades proporcionadas en la composición farmacéutica.
[0128] Los términos "coadministración", "coadministrar" y "en combinación con" incluyen la administración de dos o más agentes terapéuticos o simultánea, concurrente o secuencialmente sin límites de tiempo específicos. En una realización, los agentes están presentes en la célula o en el cuerpo del sujeto al mismo tiempo o ejercen su efecto biológico o terapéutico al mismo tiempo. En una realización, los agentes terapéuticos están en la misma composición o forma de dosificación unitaria. En otras realizaciones, los agentes terapéuticos están en composiciones separadas o formas de dosificación unitaria. En ciertas realizaciones, puede administrarse un primer agente antes de (por ejemplo, minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), concomitantemente o después (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) de la administración de un segundo agente terapéutico.
[0129] Los términos "modular" y "modulación" se refieren a reducir o inhibir o, alternativamente, activar o aumentar, una variable citada.
[0130] Los términos "aumentar" y "activar" se refieren a un aumento del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces o más en una variable citada.
[0131] Los términos "reducir" e "inhibir" se refieren a una disminución del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, o más en una variable citada.
[0130] El término "agonizar" se refiere a la activación de la señalización del receptor para inducir una respuesta biológica asociada con la activación del receptor. Un "agonista" es una entidad que se une a un receptor y lo agoniza.
[0133] El término "antagonizar" se refiere a la inhibición de la señalización del receptor para inhibir una respuesta biológica asociada con la activación del receptor. Un "antagonista" es una entidad que se une y antagoniza a un receptor.
Anticuerpos SIRP-ALFA
[0134] En la presente se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a SIRP-ALFA. En algunos aspectos, SIRP-ALFA es SIRP-ALFA humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente se unen específicamente al dominio extracelular de SIRP-ALFA. SIRP-ALFA puede expresarse en la superficie de cualquier célula objetivo adecuada. En algunas realizaciones, la célula objetivo es una célula presentadora de antígeno profesional. En algunas realizaciones, la célula objetivo es un macrófago. Un anticuerpo puede ser panespecífico para los isotipos de SIRPa humanas. Un anticuerpo puede ser específico para un isotipo de SIRPa humana.
[0135] En ciertas realizaciones, un anticuerpo es 1H9. En ciertos casos, un anticuerpo es 3C2.
[0136] En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente comprenden una cadena ligera. En algunos aspectos, la cadena ligera es una cadena ligera kappa. En algunos aspectos, la cadena ligera es una cadena ligera lambda.
[0137] En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente comprenden una cadena pesada. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgA. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgD. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgE. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgG. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgM. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgG1. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgG2. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgG3. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgG4. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgA1. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgA2.
[0138] En algunas realizaciones, un anticuerpo se une a SIRPa humana con una K<d>menor o igual a aproximadamente 1, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10x10'9 M, medida mediante el ensayo Biacore.
[0139] En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente comprenden un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente consisten en un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente consisten esencialmente en un fragmento de anticuerpo. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fv. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento F(ab')2. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab'. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento scFv (sFv). En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento scFv-Fc. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo de dominio único.
[0140] En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente se deriva de un anticuerpo ilustrativo proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, los fragmentos de anticuerpos proporcionados en la presente no se derivan de un anticuerpo ilustrativo proporcionado en la presente y pueden, por ejemplo, aislarse de novo de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente para obtener fragmentos de anticuerpos.
[0141] En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente retiene la capacidad de antagonizar SIRP-ALFA, según se mide mediante uno o más ensayos o efectos biológicos descritos en la presente. En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente retiene la capacidad de evitar que SIRP-ALFA interactúe con uno o más de sus ligandos, como se describe en la presente.
[0142] En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente compite por la unión a SIRP-ALFA con 1H9 y/o 3C2. En algunas realizaciones, un fragmento de un anticuerpo proporcionado en la presente se une al mismo epítopo de SIRP-ALFA que dicho anticuerpo.
[01423] Como alternativa al uso de un anticuerpo que comprende una región Fc humana con afinidad reducida por un receptor F<cy>, puede diseñarse un anticuerpo para que carezca de secuencias Fc, por ejemplo, produciendo un fragmento de anticuerpo como un fragmento F(ab')2. Para generar un fragmento F(ab)2, el anticuerpo purificado se suspende con pepsina de preparación de F(ab')2 de Pierce inmovilizada en resina sedimentada, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La digestión con pepsina típicamente produce un fragmento F(ab')2 (~110 kDa por SDS-PAGE en condiciones no reductoras) y numerosos péptidos pequeños de la porción Fc. El fragmento F(ab')2 resultante se compone de un par de unidades Fab' conectadas por dos enlaces disulfuro. El fragmento Fc se degrada ampliamente y se separa de F(ab')2 mediante diálisis, filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico.
[0144] En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente son anticuerpos monoclonales. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente son anticuerpos policlonales.
[0145] El anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado aislado que comprende una secuencia de VH de la SEQ ID NO: 7 y una secuencia de VL de la SEQ<i>D NO: 8.
[0146] En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente comprenden una estructura base alternativa. Puede usarse cualquier estructura base alternativa adecuada. En algunos aspectos, la estructura base alternativa se selecciona de un Adnectin™, un iMab, un Anticalin®, un EETI-II/AGRP, un dominio Kunitz, un aptámero peptídico de tiorredoxina, un Affibody®, un DARPin, un Affilin, un Tetranectin, un Finómero y un Avímero.
[0147] En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente inhibe la unión de SIRP-ALFA a uno o más ligandos de SIRP-ALFA.
[0148] En ciertos aspectos, un anticuerpo no se une a SIRP-Gamma. En ciertos aspectos, un anticuerpo no se une sustancialmente a SIRP-Gamma.
[0149] En algunos aspectos, un anticuerpo divulgado en la presente es panespecífico para los isotipos de SIRPa humana. Un anticuerpo divulgado en la presente, como 1H9, puede unirse a múltiples isotipos humanos de SIRPa, incluyendo uno o más de V1, V2 y V1/V5. Secuencia ejemplar de V1 mostrada en la SEQ ID NO:48. Secuencia ejemplar de V2 mostrada en la SEQ ID NO:49. Consultar también El polimorfismo en Sirpa modula el injerto de células madre hematopoyéticas humanas. Nature Immunology, 8; 1313, 2007. Un anticuerpo divulgado en la presente puede unirse a cada uno de los isotipos V1 y V2 de SIRPa humana. Un anticuerpo divulgado en la presente puede unirse al isotipo V1 de SIRPa humana, incluyendo los homocigotos. Un anticuerpo divulgado en la presente puede unirse al isotipo V2 de SIRPa humana, incluyendo los homocigotos. Un anticuerpo divulgado en la presente puede unirse a los isotipos V1/V5 (heterocigotos) de SIRPa humana. Un anticuerpo divulgado en la presente, como 1 H9, puede unirse a múltiples isotipos humanos de SIRPa, incluyendo cada uno de V1, V2 y V1/V5. Tales anticuerpos pueden incluir 1H9 y 3C2, incluyendo versiones humanizadas y/o manipuladas con Fc de tales anticuerpos. 1H9 puede unirse a cada uno de los isotipos humanos V1 y V2 de SlRPa. 1H9 puede unirse al isotipo V1 de SIRPa humana, incluyendo los homocigotos. 1H9 puede unirse al isotipo V2 de SIRPa humana, incluyendo los homocigotos. 1H9 puede unirse a los isotipos V1/V5 de SIRPa humanas (heterocigotos). 1H9 puede unirse a múltiples isotipos humanos de SIRPa, incluyendo cada uno de V1, V2 y V1/V5. La unión a las variantes de SIRPa humana puede medirse usando ensayos conocidos en la técnica que incluyen PCR y/o citometría de flujo. Por ejemplo, puede genotipificarse una muestra determinada para determinar el estado de SIRP y puede determinarse la unión a SIRP mediante citometría de flujo.
[0150] En ciertos aspectos, un anticuerpo compite por unirse a SIRPa humana con un anticuerpo seleccionado de 1H9 y 3C2. En ciertos aspectos, un anticuerpo se une al mismo epítopo de SIRPa humana al que se une a 1H9 o 3C2. En ciertos aspectos, un anticuerpo se une a un epítopo de SlRPa humana al que se une 1H9 o 3C2. En ciertos aspectos, un anticuerpo se une a un epítopo de SIRPa humana distinto al que se une 1H9 o 3C2.
[0151] En ciertos aspectos, un anticuerpo no compite por la unión a SIRPa humana con el anticuerpo KWar.
[0152] En ciertos aspectos, un anticuerpo compite parcialmente por la unión a SIRPa humana con el anticuerpo KWar.
[0153] En ciertos aspectos, un anticuerpo inhibe la unión de CD47 humano a SIRPa humana.
[0154] En ciertos aspectos, un anticuerpo inhibe la unión de SP-A humana a SIRPa humana.
[0155] En ciertos aspectos, un anticuerpo inhibe la unión de SP-D humana a SIRPa humana.
[0156] En ciertos aspectos, un anticuerpo se une a SIRPa de mono rhesus.
[0157] En ciertos aspectos, un anticuerpo se une a SIRPa de cynomolgus.
[0158] En ciertos aspectos, un anticuerpo aumenta la fagocitosis con respecto al control.
[0159] También se divulga en la presente un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado que compite por unirse a la SIRPa humana con un anticuerpo divulgado en la presente.
[0160] También se divulga en la presente un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado que se une al epítopo de SIRPa humana al que se une un anticuerpo divulgado en la presente.
[0161] En ciertos aspectos, un anticuerpo comprende una región Fc humana que comprende por lo menos una modificación que reduce la unión a un receptor Fc humano.
[0162] En algunas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo que compite con un anticuerpo ilustrativo proporcionado en la presente, por ejemplo, 1H9 y/o 3C2. En algunos aspectos, el anticuerpo que compite con el anticuerpo ilustrativo proporcionado en la presente se une al mismo epítopo que un anticuerpo ilustrativo proporcionado en la presente.
[0163] Se sabe que cuando un anticuerpo se expresa en células, el anticuerpo se modifica después de la traducción. Los ejemplos de la modificación postraduccional incluyen la escisión de la lisina en el extremo C-terminal de la cadena pesada por una carboxipeptidasa; modificación de glutamina o ácido glutámico en el extremo N-terminal de la cadena pesada y la cadena ligera a ácido piroglutámico por piroglutamilación; glicosilación; oxidación; desamidación; y glicación, y se sabe que tales modificaciones postraduccionales se producen en varios anticuerpos (Ver Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447). En algunas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que ha experimentado una modificación postraduccional. Los ejemplos de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que ha experimentado una modificación postraduccional incluyen un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo que han experimentado piroglutamilación en el extremo N-terminal de la región variable de la cadena pesada y/o eliminación de lisina en el extremo C-terminal de la cadena pesada. Se sabe en la técnica que dicha modificación postraduccional debida a la piroglutamilación en el extremo N-terminal y la eliminación de lisina en el extremo C-terminal no tiene ninguna influencia sobre la actividad del anticuerpo o fragmento del mismo (Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).
Secuencias de anticuerpos SIRP-ALFA
[0164] Un anticuerpo puede comprender: una CDR-H1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1; una CDR-H2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:2; una CDR-H3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:3; una CDR-L1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:4; una CDR-L2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:5; y una CDR-L3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:6.
[0165] Un anticuerpo puede comprender: una secuencia Vh de la SEQ ID NO:7 y una secuencia Vl de la SEQ ID NO:8.
[0166] Un anticuerpo puede comprender: una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 18.
[0167] Un anticuerpo puede comprender: una CDR-H1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:9; una CDR-H2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10; una CDR-H3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11; una CDR-L1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:12; una CDR-L2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:13; y una CDR-L3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:14.
[0168] Un anticuerpo puede comprender: una secuencia V<h>de la SEQ ID NO:15 y una secuencia V<l>de la SEQ ID NO:16.
[0169] Un anticuerpo puede comprender: una cadena pesada de la SEQ ID NO:19 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:20.
[0170] Un anticuerpo puede comprender: una CDR-H1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:21; una CDR-H2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:22; una CDR-H3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:23; una CDR-L1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:24; una CDR-L2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:25; y una CDR-L3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:26.
[0171] Un anticuerpo puede comprender: una secuencia V<h>de la SEQ ID NO:27 y una secuencia V<l>de la SEQ ID NO:28.
[0172] Un anticuerpo puede comprender: una CDR-H1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:29; una CDR-H2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:30; una CDR-H3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:31; una CDR-L1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:32; una CDR-L2 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:33; y una CDR-L3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:34.
[0173] Un anticuerpo puede comprender: una secuencia V<h>de la SEQ ID NO:35 y una secuencia V<l>de la SEQ ID NO:36.
[0174] En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender una o más CDR de 1H9. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender todas las CDR de 1H9. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender una o más secuencias variables de 1H9. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender cada secuencia variable de 1H9. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena pesada de 1H9. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena ligera de 1 H9. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena pesada y la cadena ligera de 1H9. En ciertos aspectos, un anticuerpo es 1H9.
[0175] En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender una o más CDR de 3C2. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender todas las CDR de 3C2. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender una o más secuencias variables de 3C2. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender cada secuencia variable de 3C2. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena pesada de 3C2. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena ligera de 3C2. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena pesada y la cadena ligera de 3C2. En ciertos aspectos, un anticuerpo es 3C2.
[0176] En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender una o más CDR de 9B11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender todas las CDR de 9B11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender una o más secuencias variables de 9B11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender cada secuencia variable de 9B11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena pesada de 9B11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena ligera de 9B11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena pesada y la cadena ligera de 9B11. En ciertos aspectos, un anticuerpo es 9B11.
[0177] En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender una o más CDR de 7E11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender todas las CDR de 7E11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender una o más secuencias variables de 7E11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender cada secuencia variable de 7E11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena pesada de 7E11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena ligera de 7E11. En ciertos aspectos, un anticuerpo puede comprender la cadena pesada y la cadena ligera de 7E11. En ciertos aspectos, un anticuerpo es 7E11.
[0178] En algunos casos, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de identidad con una secuencia ilustrativa proporcionada en la SEQ ID NO: 1-36. En algunos casos, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 1-36, con hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 sustituciones de aminoácidos. En algunos aspectos, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservadoras. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este párrafo se denominan en la presente "variantes". En algunas realizaciones, tales variantes se derivan de una secuencia proporcionada en la presente, por ejemplo, mediante maduración por afinidad, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria o cualquier otro método conocido en la técnica o descrito en la presente. En algunas realizaciones, tales variantes no se derivan de una secuencia proporcionada en la presente y pueden, por ejemplo, aislarse de novo de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente para obtener anticuerpos.
Anticuerpos de SIRP-ALFA monoespecíficos y multiespecíficos
[0179] En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente son anticuerpos monoespecíficos.
[0180] En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente son anticuerpos multiespecíficos.
[0181] En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico proporcionado en la presente se une a más de un antígeno. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico se une a 2 antígenos. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico se une a 3 antígenos. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico se une a 4 antígenos. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico se une a 5 antígenos.
[0182] En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico proporcionado en la presente se une a más de un epítopo en un antígeno de SIRP-ALFA. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico se une a 2 epítopos en un antígeno de SIRP-ALFA. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico se une a 3 epítopos en un antígeno de SIRP-ALFA.
[0183] En la técnica se conocen muchos constructos de anticuerpos multiespecíficos, y los anticuerpos proporcionados en la presente pueden proporcionarse en forma de cualquier constructo multiespecífico adecuado.
[0184] En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico comprende una inmunoglobulina que comprende por lo menos dos regiones variables de cadena pesada diferentes, cada una emparejada con una región variable de cadena ligera común (es decir, un "anticuerpo de cadena ligera común"). La región variable de cadena ligera común forma un dominio de unión a antígeno distinto con cada una de las dos regiones variables de cadena pesada diferentes. Consultar Merchant etal.,Nature Biotechnol.,1998, 16:677-681.
[0185] En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico comprende una inmunoglobulina que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo unido a uno o más de los extremos N- o C-terminales de las cadenas pesada o ligera de dicha inmunoglobulina. Consultar Coloma y Morrison,Nature Biotechnol.,1997, 15:159-163. En algunos aspectos, dicho anticuerpo comprende un anticuerpo biespecífico tetravalente.
[0186] En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico comprende una inmunoglobulina híbrida que comprende por lo menos dos regiones variables de cadena pesada diferentes y por lo menos dos regiones variables de cadena ligera diferentes. Consultar Milstein y Cuello,Nature,1983, 305:537-540; y Staerz y Bevan,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1986, 83:1453-1457.
[0187] En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico comprende cadenas de inmunoglobulina con alteraciones para reducir la formación de productos secundarios que no tienen multiespecificidad. En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden una o más modificaciones de "botones en agujeros" como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.731.168.
[0188] En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico comprende cadenas de inmunoglobulina con una o más modificaciones electrostáticas para promover el ensamblaje de heteromultímeros Fc. Consultar la WO 2009/089004.
[0189] En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico comprende una molécula de cadena sencilla biespecífica. Consultar Traunecker et al.,EMBO J.,1991, 10:3655-3659; yGruberet al.,J. Immunol.,1994, 152:5368-5374.
[0190] En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera conectados por un conector polipeptídico, donde la longitud del conector se selecciona para promover el ensamblaje del anticuerpo multiespecífico con la multiespecificidad deseada. Por ejemplo, los scFv monoespecíficos generalmente se forman cuando un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera están conectados por un conector polipeptídico de más de 12 residuos de aminoácidos. Consultar la Patente de Estados Unidos N° 4.946.778 y 5.132.405. En algunas realizaciones, la reducción de la longitud del conector polipeptídico a menos de 12 residuos de aminoácidos evita el emparejamiento de dominios variables de cadena ligera y pesada en la misma cadena polipeptídica. permitiendo de este modo el emparejamiento de dominios variables de cadena ligera y pesada de una cadena con los dominios complementarios de otra cadena.
Por lo tanto, el anticuerpo resultante tiene multiespecificidad, con la especificidad de cada sitio de unión aportada por más de una cadena polipeptídica. Las cadenas polipeptídicas que comprenden dominios variables de cadena ligera y pesada que se unen mediante conectores entre 3 y 12 residuos de aminoácidos forman predominantemente dímeros (denominados diacuerpos). Con conectores entre 0 y 2 residuos de aminoácidos, se favorecen los trímeros (denominados triacuerpos) y tetrámeros (denominados tetracuerpos). Sin embargo, el tipo exacto de oligomerización parece depender de la composición de residuos de aminoácidos y el orden del dominio variable en cada cadena polipeptídica (por ejemplo, VH-conector-VL frente a Vi_-conector-VH), además de la longitud del conector. Un experto en la técnica puede seleccionar la longitud apropiada del conector basándose en la multiespecificidad deseada.
Glicosilación y variantes relacionadas
[0191] Un anticuerpo proporcionado en la presente puede modificarse para aumentar, disminuir o eliminar el grado en que está glicosilado. La glicosilación de polipéptidos suele estar "ligada a N" o "ligada a O". En algunos aspectos, la glicosilación del anticuerpo se reduce mediante la desglicosilación enzimática, la expresión en un huésped bacteriano o la modificación de un residuo de aminoácido utilizado para la glicosilación. Pueden usarse modificaciones tales como mutaciones para alterar la glicosilación.
[0192] La glicosilación "ligada a N" se refiere a la unión de una fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial.
[0193] La glicosilación "ligada a O" se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina otreonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
[0194] La adición o deleción de sitios de glicosilación ligado a N a o de un anticuerpo proporcionado en la presente puede lograrse alterando la secuencia de aminoácidos de manera que se cree o se elimine una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente. La adición o deleción de sitios de glicosilación ligados a O puede lograrse mediante la adición, deleción o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina en o para (según sea el caso) la secuencia de un anticuerpo.
[0195] En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende un motivo de glicosilación que es diferente de un anticuerpo de origen natural. En el anticuerpo proporcionado en la presente puede modificarse cualquier motivo de glicosilación de origen natural adecuado. Las propiedades estructurales y de glicosilación de las inmunoglobulinas, por ejemplo, se conocen en la técnica y se resumen, por ejemplo, en Schroeder y Cavacini,J. AllergyClin. Immunol.,2010, 125:S41-52.
[0196] En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una región Fc de IgG1 con modificación del oligosacárido unido a la asparagina 297 (Asn 297). Los anticuerpos IgG1 de origen natural producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que generalmente se une mediante un enlace N a Asn 297 del dominio de CH2 de la región Fc. Ver Wright et al.,TIb Te CH,1997, 15:26-32. El oligosacárido unido a Asn 297 puede incluir varios carbohidratos como manosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido biantenario.
[0197] En algunas realizaciones, el oligosacárido unido a Asn 297 se modifica para crear anticuerpos que tienen ADCC alterada. En algunas realizaciones, el oligosacárido se altera para mejorar la ADCC. En algunas realizaciones, el oligosacárido se altera para reducir la ADCC.
[0198] En algunos aspectos, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende un dominio de IgG1 con un contenido de fucosa reducido en la posición Asn 297 en comparación con un dominio de IgG1 de origen natural. Se sabe que tales dominios Fc tienen ADCC mejorada. Consultar Shields et al.,J. Biol. Chem.,2002, 277:26733-26740. En algunos aspectos, tales anticuerpos no comprenden ninguna fucosa en la posición Asn 297. La cantidad de fucosa puede determinarse usando cualquier método adecuado, por ejemplo, como se describe en la WO 2008/077546.
[0199] En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende un oligosacárido bisecado, como un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo que está bisecado por GlcNAc. Tales variantes de anticuerpos pueden tener una fucosilación reducida y/o una función ADCC mejorada. Los ejemplos de tales variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en la WO 2003/011878; la Patente de Estados Unidos N° 6.602.684; y la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2005/0123546.
[0200] Otras variantes de glicosilación ilustrativas que pueden incorporarse en un anticuerpo proporcionado en la presente se describen, por ejemplo, en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° 2003/0157108, 2004/0093621, 2003/0157108, 2003/0115614, 2002/0164328, 2004/0093621, 2004/0132140, 2004/0110704, 2004/0110282, 2004/0109865; las Publicaciones de Patente Internacional N° 2000/61739, 2001/29246, 2003/085119, 2003/084570, 2005/035586, 2005/035778; 2005/053742, 2002/031140; Okazaki et al.,J. Mol. Biol.,2004, 336:1239-1249; y Yamane-Ohnuki et al.,Biotech. Bioeng.,2004, 87: 614-622.
[0201] En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una región Fc con por lo menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Tales variantes de anticuerpos pueden tener una función de CDC mejorada. Los ejemplos de tales variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en la WO 1997/30087; la WO 1998/58964; y la WO 1999/22764.
[0202] Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen células Lec 13 CHO, que son deficientes en la fucosilación de proteínas (consultar Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys., 1986, 249:533-545; Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2003/0157108; WO 2004/056312) y líneas celulares knockout, como el gen ALFA-1,6-fucosiltransferasa o células CHO knockout FUT8 (ver Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 2004, 87: 614-622; Kanda et al., Biotechnol. Bioeng., 2006, 94:680-688; y WO 2003/085107.
[0203] En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es un anticuerpo aglicosilado. Un anticuerpo aglicosilado puede producirse usando cualquier método conocido en la técnica o descrito en la presente. En algunos aspectos, un anticuerpo aglicosilado se produce modificando el anticuerpo para eliminar todos los sitios de glicosilación. En algunos aspectos, los sitios de glicosilación se eliminan solo de la región Fc del anticuerpo. En algunos aspectos, un anticuerpo aglicosilado se produce expresando el anticuerpo en un organismo que no es capaz de glicosilarse, comoE. coli,o expresando el anticuerpo en una mezcla de reacción libre de células.
[0204] En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente tiene una región constante con una función efectora reducida en comparación con un anticuerpo de IgG1 nativo. En algunas realizaciones, la afinidad de una región constante de una región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente por el receptor Fc es menor que la afinidad de una región constante de IgG1 nativa por dicho receptor Fc.
Región Fc y variantes
[0205] En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una región Fc. En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una región Fc con una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en comparación con una región Fc natural. En algunos aspectos, dichas sustituciones, inserciones o deleciones producen anticuerpos con estabilidad, glicosilación u otras características alteradas. En algunos aspectos, tales sustituciones, inserciones o deleciones producen anticuerpos aglicosilados.
[0206] Una "región Fc variante" o "región Fc manipulada" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de por lo menos una modificación de aminoácidos, preferiblemente una o más sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, la región Fc variante tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido original, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido principal. La región Fc variante en la presente poseerá preferiblemente por lo menos aproximadamente un 80% de homología con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido original, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de homología con la misma.
[0207] Las secuencias variantes de Fc para un "Fc muerto" pueden incluir tres sustituciones de aminoácidos en la región CH2 para reducir la unión de F<cy>RI en las posiciones del índice EU 234, 235 y 237 (ver Duncan et al., (1988) Nature 332:563). Dos sustituciones de aminoácidos en el sitio de unión C1q del complemento en las posiciones 330 y 331 del índice EU reducen la fijación del complemento (ver Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) y Canfield y Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)). La sustitución en residuos de IgG1 e IgG2 humana en las posiciones 233 236 y residuos de IgG4 en las posiciones 327, 330 y 331 reduce en gran medida ADCC y CDC (ver, por ejemplo, Armor KL. et al., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613-24; y Shields R L. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604).
[0208] La unión de IgG a los FcyRs o C1q depende de los residuos localizados en la región bisagra y el dominio CH2. Dos regiones del dominio CH2 son críticas para la unión de F<cy>R<s>y C1q, y tienen secuencias únicas en IgG2 e IgG4. Se ha demostrado que las sustituciones en los residuos de IgG1 o IgG2 humana en las posiciones 233-236 y los residuos de IgG4 en las posiciones 327, 330 y 331 reducen en gran medida la ADCC y la CDC. Se han realizado numerosas mutaciones en el dominio CH2 de la IgG1 humana.
[0209] La sustitución de triple aminoácido L234A, L235A y G237A elimina en gran medida F<cy>R y las funciones efectoras del complemento (consultar, por ejemplo, la US20100266505).
[0210] En algunas realizaciones, la región Fc se ha modificado mediante la elección del huésped de expresión, el tratamiento enzimático de las sustituciones de aminoácidos para que tengan una glicosilación y unión a F<cy>R reducidas, con respecto a la proteína nativa. Las mutaciones que reducen la unión a FcyR incluyen, sin limitación, la modificación de la glicosilación en asparagina 297 del dominio Fc, que se sabe que se requiere para una interacción óptima de FcR. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conocidas incluyen N297A o N297G, lo que da como resultado la pérdida de un sitio de glicosilación en la proteína. Los dominios Fc desglicosilados enzimáticamente, los anticuerpos expresados de forma recombinante en presencia de un inhibidor de la glicosilación y la expresión de los dominios Fc en bacterias tienen una pérdida similar de glicosilación y la consiguiente unión a los F<cy>R.
[0211] La variante LALA, L234A/L235A, también tiene una unión a FcyR significativamente reducida; al igual que E233P/L234V/L235A/G236+A327G/A330S/P331S. Consultar, por ejemplo, Armor et al. (1999) Eur J Immunol.
29(8):2613-24. El conjunto de mutaciones: K322A, L234A y L235A son suficientes para suprimir casi por completo la unión de F<cy>R y C1q. Un conjunto de tres mutaciones, L234F/L235E/P331S (Dubbed™), tienen un efecto muy similar.
[0212] Son posibles otras variantes de Fc, que incluyen, sin limitación, una en la que se elimina una región capaz de formar un enlace disulfuro, o en la que se eliminan ciertos residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal de una forma de Fc nativa o se le añade un residuo de metionina.
[0213] La Fc puede tener cadenas de azúcar nativas, cadenas de azúcar aumentadas en comparación con una forma nativa o cadenas de azúcar disminuidas en comparación con la forma nativa, o puede estar en una forma aglicosilada o desglicosilada. El aumento, disminución, eliminación u otra modificación de las cadenas de azúcar puede lograrse mediante métodos comunes en la técnica, como un método químico, un método enzimático o expresándolo en una línea celular de producción manipulada genéticamente. Tales líneas celulares pueden incluir microorganismos, por ejemplo, Pichia Pastoris, y línea celular de mamíferos, por ejemplo, células CHO, que expresan enzimas glicosilantes de manera natural. Además, los microorganismos o las células pueden manipularse para que expresen enzimas de glicosilación, o pueden volverse incapaces de expresar enzimas de glicosilación (ver, por ejemplo, Hamilton, et al., Science, 313:1441 (2006); Kanda, et al, J. Biotechnology, 130:300 (2007); Kitagawa, et al., J. Biol. Chem., 269 (27): 17872 (1994); Ujita-Lee et al., J. Biol. Chem., 264 (23): 13848 (1989), Imai-Nishiya et al., BMC Biotechnology 7:84 (2007) y la WO 07/055916). Como ejemplo de una célula manipulada para que tenga una actividad de sialilación alterada, el gen 1 de alfa-2,6-sialiltransferasa se ha manipulado en células de ovario de hámster chino y en células sf9. Los anticuerpos expresados por estas células manipuladas son sialilados por el producto del gen exógeno. Un método adicional para obtener moléculas Fc que tienen una cantidad modificada de residuos de azúcar en comparación con una pluralidad de moléculas nativas incluye separar dicha pluralidad de moléculas en fracciones glicosiladas y no glicosiladas, por ejemplo, usando cromatografía de afinidad con lectina (ver, por ejemplo, la WO 07/117505). Se ha demostrado que la presencia de fracciones de glicosilación particulares altera la función de las inmunoglobulinas. Por ejemplo, la eliminación de las cadenas de azúcar de una molécula Fc da como resultado una fuerte disminución de la afinidad de unión a la parte C1q del primer componente C1 del complemento y una disminución o pérdida de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por lo que no induce respuestas inmunitarias innecesarias in vivo. Las modificaciones importantes adicionales incluyen sialilación y fucosilación: la presencia de ácido siálico en IgG se ha correlacionado con actividad antiinflamatoria (ver, por ejemplo, Kaneko, et al, Science 313:760 (2006)), mientras que la eliminación de fucosa de la IgG lleva a una actividad de ADCC mejorada (ver, por ejemplo, Shoj-Hosaka, et al, J. Biochem., 140:777 (2006)).
[0214] El término "anticuerpo que comprende la región Fc" se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fc. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la purificación del anticuerpo o mediante ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Por consiguiente, un anticuerpo que tenga una región Fc puede comprender un anticuerpo con o sin K447.
[0215] En algunos aspectos, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente se modifica para proporcionar un anticuerpo con afinidad alterada por un receptor Fc, o un anticuerpo que es inmunológicamente más inerte. En algunas realizaciones, las variantes de anticuerpos proporcionadas en la presente poseen algunas funciones efectoras, pero no todas. Tales anticuerpos pueden ser útiles, por ejemplo, cuando la vida media del anticuerpo es importante in vivo, pero cuando ciertas funciones efectoras (por ejemplo, activación del complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales.
[0216] En algunas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente es una región Fc de IgG4 humana que comprende una o más de las mutaciones estabilizadoras de bisagra S228P y L235E. Consultar Aalberse et al.,Immunology,2002, 105:9-19. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 comprende una o más de las siguientes mutaciones: E233P, F234V y L235A. Consultar Armour et al.,Mol. Immunol.,2003, 40:585-593. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 comprende una deleción en la posición G236.
[0217] En algunas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente es una región Fc de IgG1 humana que comprende una o más mutaciones para reducir la unión al receptor Fc. En algunos aspectos, la una o más mutaciones están en residuos seleccionados de S228 (por ejemplo, S228A), L234 (por ejemplo, L234A), L235 (por ejemplo, L235A), D265 (por ejemplo, D265A) y N297 (por ejemplo, N297A). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una mutación PVA236. PVA236 significa que la secuencia de aminoácidos ELLG, desde la posición de aminoácidos 233 a la 236 de IgG1 o EFLG de IgG4, se reemplaza por PVA. Consultar la Patente de Estados Unidos N° 9.150.641.
[0218] En algunas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente se modifica como se describe en Armor et al.,Eur. J. Immunol.,1999, 29:2613-2624; WO 1999/058572; y/o Solicitud de Patente del Reino Unido N° 98099518.
[0219] En algunas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente es una región Fc de IgG2 humana que comprende una o más mutaciones A330S y P331S.
[0220] En algunas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente tiene una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas de 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329. Consultar la Patente de Estados Unidos N° 6.737.056. Tales mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el denominado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina. Consultar la Patente de Estados Unidos N° 7.332.581. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una alanina en la posición de aminoácidos 265. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una alanina en la posición de aminoácidos 297.
[0221] En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, como una sustitución en una o más de las posiciones 298, 333 y 334 de la región Fc. En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 239, 332 y 330, como se describe en Lazar et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2006, 103:4005-4010.
[0222] En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una o más alteraciones que mejoran o disminuyen la unión a C1q y/o CDC. Consultar la Patente de Estados Unidos N° 6.194.551; la WO 99/51642; e Idusogie et al.,J. Immunol.,2000, 164:4178-4184.
[0223] En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una o más alteraciones para aumentar la vida media. Los anticuerpos con vidas medias aumentadas y unión mejorada al receptor Fc neonatal (FcRn) se describen, por ejemplo, en Hinton et al.,J. Immunol.,2006, 176:346-356; y la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2005/0014934. Tales variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 y 434 de una IgG.
[0224] En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una o más variantes de la región Fc como se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 7.371.826, 5.648.260 y 5.624.821; Duncan y Winter,Nature,1988, 322:738-740; y la WO 94/29351.
Nucleótidos, vectores, células huésped y métodos relacionados
[0225] También se proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican anticuerpos de SIRP-ALFA, vectores que comprenden los ácidos nucleicos y células huésped que comprenden los vectores y ácidos nucleicos, así como técnicas recombinantes para la producción de anticuerpos.
[0226] En algunos casos, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de identidad con una secuencia ilustrativa proporcionada en las SEQ ID NO: 1-36. En algunos casos, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 1-36, con hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 sustituciones de aminoácidos. En algunos caso, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de identidad con una secuencia ilustrativa proporcionada en las SEQ ID NO: 37-44. En algunos casos, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 37-44, con hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 mutaciones. En algunos aspectos, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservadoras. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este párrafo se denominan en la presente "variantes". En algunas realizaciones, tales variantes se derivan de una secuencia proporcionada en la presente, por ejemplo, mediante maduración por afinidad, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria o cualquier otro método conocido en la técnica o descrito en la presente. En algunas realizaciones, tales variantes no se derivan de una secuencia proporcionada en la presente y pueden, por ejemplo, aislarse de novo de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente para obtener anticuerpos.
[0227] Para la producción recombinante de un anticuerpo, el o los ácidos nucleicos que lo codifican pueden aislarse e insertarse en un vector replicable para clonación adicional (es decir, amplificación del ADN) o expresión. En algunos aspectos, el ácido nucleico puede producirse mediante recombinación homóloga, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.204.244.
[0228] En la técnica se conocen muchos vectores diferentes. Los componentes del vector generalmente incluyen uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción, por ejemplo como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.534.615.
[0229] A continuación se proporcionan ejemplos ilustrativos de células huésped adecuadas. No se pretende que estas células huésped sean limitativas, y puede usarse cualquier célula huésped adecuada para producir los anticuerpos proporcionados en la presente.
[0230] Las células huésped adecuadas incluyen cualquier célula procariota (por ejemplo, bacteriana), eucariótica inferior (por ejemplo, levadura) o eucariótica superior (por ejemplo, de mamífero). Las procariotas adecuadas incluyen eubacterias, como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae comoEscherichia (E. coli), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella (S. typhimurium), Serratia (S. marcescans), Shigella, Bacilli (B. subtilisyB. licheniformis), Pseudomonas (P. aeruginosa)yStreptomyces.Un huésped de clonación deE. coliútil esE. coli294, aunque también son adecuadas otras cepas comoE. coliB,E. coliX1776 yE. coliW3110.
[0231] Además de las procariotas, los microbios eucariotas, como los hongos filamentosos o las levaduras, también son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican el anticuerpo para SIRP-ALFA.Saccharomyces cerevisiae,o levadura de panadería común, es un microorganismo huésped eucariota inferior usado comúnmente. Sin embargo, hay disponibles y son útiles otros géneros, especies y cepas, comoSchizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thermotoleransyK. marxianus), Yarrowia, Pichia pastoris, Candida (C. albicans), Tri choderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces (S. occidentalis),y hongos filamentosos como, por ejemplo,Penicillium, TolypocladiumyAspergillus (A. nidulansyA. niger).
[0232] Las células huésped de mamífero útiles incluyen células COS-7, células HEK293; células de riñón de cría de hámster (BHK); ovario de hámster chino (CHO); células de sertoli de ratón; células de riñón de mono verde africano (VERO-76), y similares.
[0233] Las células huésped usadas para producir el anticuerpo para SIRP-ALFA pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles como, por ejemplo, F10 de Ham, Medio Mínimo Esencial (MEM), RPMI-1640 y MEdio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, puede usarse cualquiera de los medios descritos en Ham et al.,Meth. Enz.,1979, 58:44; Barnes et al.,Anal. Biochem.,1980, 102:255; y las Patentes de Estados Unidos N° 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 y 5.122.469; o WO 90/03430 y WO 87/00195.
[0234] Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos, oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario en concentraciones apropiadas que serán conocidas por los expertos en la técnica.
[0235] Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.
[0236] Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primer paso, los restos de partículas, ya sean células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Por ejemplo, Carter et al.(Bio/Technology,1992, 10:163-167) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan en el espacio periplásmico deE. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los desechos de las células pueden eliminarse mediante centrifugación.
[0237] En algunas realizaciones, el anticuerpo se produce en un sistema libre de células. En algunos aspectos, el sistema libre de células es un sistema de transcripción y traducción in vitro como se describe en Yin et al.,mAbs,2012, 4:217-225. En algunos aspectos, el sistema libre de células utiliza un extracto libre de células de una célula eucariota o de una célula procariota. En algunos aspectos, la célula procariota esE. coli.La expresión libre de células del anticuerpo puede ser útil, por ejemplo, cuando el anticuerpo se acumula en una célula como un agregado insoluble, o cuando los rendimientos de la expresión periplásmica son bajos.
[0238] Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon® o Millipore® Pellcon®. En cualquiera de los pasos anteriores puede incluirse un inhibidor de proteasa como PMSF para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes accidentales.
[0239] La composición de anticuerpos preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, la cromatografía de afinidad siendo una técnica de purificación particularmente útil. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Puede usarse proteína A para purificar anticuerpos que comprenden cadenas pesadas<y>1,<y>2 o<y>4 humanas (Lindmark et al.,J. Immunol. Meth.,1983, 62:1-13). La proteína G es útil para todos los isotipos de ratón y para<y>3 humana (Guss et al.,EMBOJ.,1986, 5:1567-1575).
[0240] La matriz a la que se une el ligando de afinidad suele ser agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables, como el vidrio de poro controlado o el poli(estirenodivinil)benceno, permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden lograrse con la agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, para la purificación es útil la resina BakerBond ABX®.
[0241] También están disponibles y pueden ser aplicadas por un experto en la técnica otras técnicas para la purificación de proteínas, como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, la HPLC de fase inversa, la cromatografía en sílice, la cromatografía en heparina SepHarose®, el cromatoenfoque, SDS-PAGE y la precipitación con sulfato de amonio.
[0242] Después de cualquier paso o pasos de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes puede someterse a una cromatografía de interacción hidrofóbica de pH bajo usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 4,5, generalmente realizado a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,25 M de sal).
Métodos de elaboración de anticuerpos para SIRP-ALFA
Preparación del antígeno de SIRP-ALFA
[0243] El antígeno de SIRP-ALFA usado para el aislamiento o la creación de los anticuerpos proporcionados en la presente puede ser SIRP-ALFA intacto o un fragmento de SIRP-ALFA. El antígeno de SIRP-ALFA puede estar, por ejemplo, en forma de una proteína aislada o una proteína expresada en la superficie de una célula.
[0244] En algunas realizaciones, el antígeno de SIRP-ALFA es una variante de origen no natural de SIRP-ALFA, como una proteína SIRP-ALFA que tiene una secuencia de aminoácidos o una modificación postraduccional que no se produce en la naturaleza.
[0245] En algunas realizaciones, el antígeno de SIRP-ALFA se trunca mediante la eliminación de, por ejemplo, secuencias intracelulares o que atraviesan la membrana, o secuencias señal. En algunas realizaciones, el antígeno de SIRP-ALFA se fusiona en su extremo C-terminal en un dominio Fc de IgG1 humana o una etiqueta de polihistidina.
Métodos de elaboración de anticuerpos monoclonales
[0246] Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse, por ejemplo, usando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al.,Nature,1975, 256:495-497 y/o mediante métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.816.567). También pueden obtenerse anticuerpos monoclonales, por ejemplo, usando bibliotecas basadas en fagos o levaduras. Consultar, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 8.258.082 y 8.691.730.
[0247] En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Luego, los linfocitos se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Consultar Goding J.W.,Monoclonal Antibodies: Principies and Practice3a ed. (1986) Academic Press, San Diego, CA.
[0248] Las células de hibridoma se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
[0249] Las células de mieloma útiles son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan una producción estable de alto nivel de anticuerpos por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a las condiciones del medio, como la presencia o ausencia de medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, como las derivadas de tumores de ratón MOP-21 y MC-11 (disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA), y células SP-2 o X63-Ag8-653 (disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, MD). También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. Consultar, por ejemplo, Kozbor,J. Immunol.,1984, 133:3001.
[0250] Después de la identificación de células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad biológica deseadas, los clones seleccionados pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante métodos estándar. Consultar Goding, supra. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal.
[0251] El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Por tanto, las células de hibridoma pueden servir como una fuente útil de anticuerpos que codifican ADN con las propiedades deseadas. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped como bacterias (por ejemplo,E. coli),levaduras (por ejemplo,SaccharomycesoPichiasp.), células COS, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen anticuerpos, para producir los anticuerpos monoclonales.
Métodos para elaborar anticuerpos quiméricos
[0252] Métodos ilustrativos para producir anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 4.816.567; y Morrison et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1984, 81:6851-6855. En algunos casos, se elabora un anticuerpo quimérico usando técnicas recombinantes para combinar una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, como un mono) con una región constante humana.
Métodos para elaborar anticuerpos humanizados
[0253] Los anticuerpos humanizados pueden generarse reemplazando la mayoría, o todas, las partes estructurales de un anticuerpo monoclonal no humano con las correspondientes secuencias de anticuerpos humanos. En consecuencia, se genera una molécula híbrida en la que solo la variable específica de antígeno, o CDR, está compuesta por una secuencia no humana. Los métodos para obtener anticuerpos humanizados incluyen los descritos, por ejemplo, en Winter and Milstein,Nature,1991, 349:293-299; Rader et al.,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.,1998, 95:8910-8915; Steinberger et al.,J. Biol. Chem.,2000, 275:36073-36078; Queen et al.,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.,1989, 86:10029-10033; y las Patentes de Estados Unidos N° 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 y 6.180.370.
Métodos para elaborar anticuerpos humanos
[0254] Los anticuerpos humanos pueden generarse mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de animales transgénicos (por ejemplo, ratones humanizados). Consultar, por ejemplo, Jakobovits et al.,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.,1993, 90:2551; Jakobovits et al.,Nature,1993, 362:255-258; Bruggermann et al.,Year in Immuno.,1993, 7:33; y las Patentes de Estados Unidos N° 5.591.669, 5.589.369 y 5.545.807. Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de bibliotecas de presentación de fagos (consultar, por ejemplo, Hoogenboom et al.,J. Mol. Biol.,1991, 227:381-388; Marks et al.,J. Mol. Biol.,1991, 222:581-597; y las Patentes de Estados Unidos N° 5.565.332 y 5.573.905). Los anticuerpos humanos también pueden ser generados por células B activadas in vitro (consultar, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.567.610 y 5.229.275). Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de bibliotecas basadas en levaduras (consultar, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 8.691.730).
Métodos para elaborar fragmentos de anticuerpos
[0255] Los fragmentos de anticuerpos proporcionados en la presente pueden elaborarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo los métodos ilustrativos descritos en la presente o los conocidos en la técnica. Los métodos adecuados incluyen técnicas recombinantes y digestión proteolítica de anticuerpos completos. Métodos ilustrativos para elaborar fragmentos de anticuerpos se describen, por ejemplo, en Hudson et al.,Nat. Med.,2003, 9:129-134. Los métodos para elaborar anticuerpos scFvse describen, por ejemplo, en Plückthun, enThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994); la WO 93/16185; y las Patentes de Estados Unidos N° 5.571.894 y 5.587.458.
Métodos para elaborar estructuras base alternativas
[0256] Las estructuras base alternativas proporcionadas en la presente pueden elaborarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo los métodos ilustrativos descritos en la presente o los conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos para preparar Adnectins™ se describen en Emanuel et al.,mAbs,2011, 3:38-48. Los métodos para preparar iMabs se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2003/0215914. Los métodos para preparar Anticalins® se describen en Vogt y Skerra,Chem. Biochem.,2004, 5:191-199. Los métodos para preparar los dominios de Kunitz se describen en Wagner et al.,Biochem.&Biophys. Res. Comm.,1992, 186:118-1145. Los métodos para preparar aptámeros peptídicos de tiorredoxina se proporcionan en Geyer y Brent,Meth. Enzymol.,2000, 328:171-208. Los métodos para preparar Affibodies se proporcionan en Fernandez,Curr. Opinión in Biotech.,2004, 15:364-373. Los métodos para preparar DARPins se proporcionan en Zahnd et al.,J. Mol. Biol.,2007, 369:1015-1028. Los métodos para preparar Affilins se proporcionan en Ebersbachet al.,J. Mol. Biol.,2007, 372:172-185. Los métodos para preparar tetranectinas se proporcionan en Gravesen et al.,J. Biol. Chem.,2000, 275:37390-37396. Los métodos para preparar Aviméros se proporcionan en Silverman et al.,Nature Biotech.,2005, 23:1556-1561. Los métodos para preparar Fynómeros se proporcionan en Silacci et al.,J. Biol. Chem.,2014, 289:14392-14398. Información adicional sobre estructuras base alternativas se proporciona en Binz et al.,Nat. Biotechnol.,200523:1257-1268; y Skerra,Currenr Opin. in Biotech.,2007 18:295-304.
Métodos para elaborar anticuerpos multiespecíficos
[0257] Los anticuerpos multiespecíficos proporcionados en la presente pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo los métodos ilustrativos descritos en la presente o los conocidos en la técnica. Los métodos para elaborar anticuerpos de cadena ligera comunes se describen en Merchant et al.,Nature Biotechnol.,1998, 16:677-681. Los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos tetravalentes se describen en Coloma y Morrison,Nature Biotechnol.,1997, 15:159-163. Los métodos para elaborar inmunoglobulinas híbridas se describen en Milstein y Cuello,Nature,1983, 305:537-540; y Staerz y Bevan,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.,1986, 83:1453-1457. Los métodos para elaborar inmunoglobulinas con modificación de botones en agujeros se describen en la Patente de Estados Unidos N° 5.731.168. En la WO 2009/089004, se proporcionan métodos para elaborar inmunoglobulinas con modificaciones electrostáticas. Los métodos para elaborar anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos se describen en Traunecker et al.,EMBOJ.,1991, 10:3655-3659; y Gruber et al.,J. Immunol.,1994, 152:5368-5374. Los métodos para elSci.USA,1993, 90:6444-6448. Los métodos para elaborar triacuerpos y tetracuerpos se describen en Todorovska et al.,J. Immunol. Methods,2001, 248:47-66. Los métodos para elaborar derivados de F(ab')3 triespecíficos se describen en Tutt et al.J. Inmunol.,1991, 147:60-69. Los métodos para elaborar anticuerpos reticulados se describen en la Patente de Estados Unidos N° 4.676.980; Brennan et al.,Science,1985, 229:81-83; Staerz, et al.Nature,1985, 314:628-631; y la EP 0453082. Los métodos para elaborar dominios de unión a antígenos ensamblados por cremalleras de leucina se describen en Kostelny et al.,J. Immunol.,1992, 148:1547-1553. Los métodos para elaborar anticuerpos a través del enfoque DNL se describen en las Patentes de Estados Unidos N° 7.521.056; 7.550.143; 7.534.866; y 7.527.787. Los métodos para elaborar híbridos de moléculas de anticuerpos y no de anticuerpos se describen en la WO93/08829. Los métodos para elaborar anticuerpos DAF se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2008/0069820. Los métodos para elaborar anticuerpos mediante reducción y oxidación se describen en Carlring et al.,PLoS One,2011,6:e22533. Los métodos para elaborar DVD-Igs™ se describen en la Patente de Estados Unidos N° 7.612.181. Los métodos para elaborar DARTs™ se describen en Moore et al.,Blood,2011, 117:454-451. Los métodos para elaborar DuoBodies® se describen en Labrijn et al.,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.,2013, 110:5145-5150; Gramer et al.,mAbs,2013, 5:962-972; y Labrijn et al.,Nature Protocols,2014, 9:2450-2463. Los métodos para elaborar anticuerpos que comprenden scFv fusionados con el extremo C-terminal del C<h>3 de una IgG se describen en Coloma y Morrison,Nature Biotechnol.,1997, 15:159-163. Los métodos para elaborar anticuerpos en los que una molécula Fab se une a la región constante de una inmunoglobulina se describen en Miler et al.,J. Immunol.,2003, 170:4854-4861. Los métodos para elaborar CovX-Bodies se describen en Doppalapudi et al.,Proc. NAtl. Acad. Sci. USA,2010, 107:22611-22616. Los métodos para elaborar anticuerpos Fcab se describen en Wozniak-Knopp et al.,Protein Eng. Des. Sel.,2010, 23:289-297. Los métodos para elaborar anticuerpos TandAb® se describen en Kipriyanov et al.,J. Mol. Biol.,1999, 293:41-56 y Zhukovsky et al.,Blood,2013, 122:5116. Los métodos para elaborar Fab en tándem se describen en la WO 2015/103072. Los métodos para elaborar Zybodies™ se describen en LaFleur et al.,mAbs,2013, 5:208-218.
Métodos para elaborar variantes
[0258] Puede usarse cualquier método adecuado para introducir variabilidad en una secuencia o secuencias de polinucleótidos que codifican un anticuerpo, incluyendo la PCR propensa a errores, la combinación aleatoria de cadenas y la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, como la mutagénesis dirigida por trinucleótidos (TRIM). En algunos aspectos, se aleatorizan varios residuos de CDR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Los residuos de CDR implicados en la unión a antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, usando mutagénesis de barrido con alanina o modelado. En particular CDR-H3 y CDR-L3 son a menudo objeto de mutación.
[0259] Puede usarse la introducción de diversidad en las regiones variables y/o las CDR para producir una biblioteca secundaria. Luego, la biblioteca secundaria se analiza para identificar variantes de anticuerpos con afinidad mejorada. La maduración por afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom etal.,Methods in Molecular Biology,2001, 178:1-37.
Ensayos
[0260] Puede usarse una variedad de ensayos conocidos en la técnica para identificar y caracterizar un anticuerpo para SIRP-ALFA proporcionado en la presente.
Ensayos de unión, competencia y mapeo de epítopos
[0261] La actividad de unión a antígeno específica de un anticuerpo proporcionado en la presente puede evaluarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo el uso de SPR, BLI, RIA y MSD-SET, como se describe en otra parte de esta divulgación. Además, la actividad de unión a antígeno puede evaluarse mediante ensayos ELISA y ensayos de transferencia Western.
[0262] Los ensayos para medir la competencia entre dos anticuerpos, o un anticuerpo y otra molécula (por ejemplo, uno o más ligandos de SIRP-ALFA) se describen en otra parte de esta divulgación y, por ejemplo, en Harlow y Lane,Antibodies: A Laboratory Manual cap.14, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
[0263] Los ensayos para mapear los epítopos a los que se une un anticuerpo proporcionado en la presente se describen, por ejemplo, en Morris "Epitope Mapping Protocols", enMethods in Molecular Biologyvol. 66, 1996, Humana Press, Totowa, N.J. En algunas realizaciones, el epítopo se determina mediante competencia peptídica. En algunas realizaciones, el epítopo se determina mediante espectrometría de masas. En algunas realizaciones, el epítopo se determina mediante cristalografía.
Ensayos para funciones efectoras
[0264] La función efectora después del tratamiento con un anticuerpo proporcionado en la presente puede evaluarse usando una variedad de ensayos in vitro e in vivo conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en Ravetch y Kinet,Annu. Rev. Immunol.,1991, 9:457-492; las Patentes de Estados Unidos números N° 5.500.362, 5.821.337; Hellstrom et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA,1986, 83:7059-7063; Hellstrom et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA,1985, 82:1499-1502; Bruggemann et al.,J. Exp. Med.,1987, 166:1351-1361; Clynes et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA,1998, 95:652-656; WO 2006/029879; WO 2005/100402; Gazzano-Santoro et al.,J. Immunol. Methods,1996, 202:163-171; Cragg et al.,Blood,2003, 101:1045-1052; Cragg et al.Blood,2004, 103:2738-2743; y Petkova et al.,Int'l. Immunol.,2006, 18:1759-1769.
Composiciones farmacéuticas
[0265] Un anticuerpo proporcionado en la presente puede formularse en cualquier composición farmacéutica adecuada y administrarse mediante cualquier vía de administración adecuada. Las vías de administración adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las vías intraarterial, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, nasal, parenteral, pulmonar y subcutánea.
[0266] La composición farmacéutica puede comprender uno o más excipientes farmacéuticos. Puede usarse cualquier excipiente farmacéutico adecuado, y un experto en la técnica es capaz de seleccionar excipientes farmacéuticos adecuados. Por consiguiente, se pretende que los excipientes farmacéuticos proporcionados a continuación sean ilustrativos y no limitativos. Los excipientes farmacéuticos adicionales incluyen, por ejemplo, los descritos en elHandbook of PHarmaceutical Excipients,Rowe et al. (Eds.) 6a ed. (2009).
[0267] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un agente antiespumante. Puede usarse cualquier agente antiespumante adecuado. En algunos aspectos, el agente antiespumante se selecciona de un alcohol, un éter, un aceite, una cera, una silicona, un surfactante y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, el agente antiespumante se selecciona de un aceite mineral, un aceite vegetal, etilenbisestearamida, una cera de parafina, una cera de éster, una cera de alcohol graso, un alcohol graso de cadena larga, un jabón de ácido graso, un éster de ácido graso, un glicol de silicio, una fluorosilicona, un copolímero de polietilenglicol-polipropilenglicol, polidimetilsiloxano-dióxido de silicio, éter, alcohol octílico, alcohol caprílico, trioleato de sorbitán, alcohol etílico, 2-etilhexanol, dimeticona, alcohol oleílico, simeticona y combinaciones de los mismos.
[0268] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un cosolvente. Los ejemplos ilustrativos de cosolventes incluyen etanol, polietilenglicol, butilenglicol, dimetilacetamida, glicerina, propilenglicol y combinaciones de los mismos.
[0269] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un tampón. Los ejemplos ilustrativos de tampones incluyen acetato, borato, carbonato, lactato, malato, fosfato, citrato, hidróxido, dietanolamina, monoetanolamina, glicina, metionina, goma guar, glutamato monosódico y combinaciones de los mismos.
[0270] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un portador o carga. Los ejemplos ilustrativos de portadores o cargas incluyen lactosa, maltodextrina, manitol, sorbitol, quitosano, ácido esteárico, goma xantana, goma guar y combinaciones de los mismos.
[0271] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un surfactante. Los ejemplos ilustrativos de surfactantes incluyen d-alfa tocoferol, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, docusato de sodio, behenato de glicerilo, monooleato de glicerilo, ácido láurico, macrogol15 hidroxiestearato, alcohol miristílico, fosfolípidos, polioxietilen alquil éteres, ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitán, polioxietilen estearatos, polioxiglicéridos, lauril sulfato de sodio, ésteres de sorbitán, succinato de polietilen (glicol) de vitamina E y combinaciones de los mismos.
[0272] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un agente antiaglomerante. Los ejemplos ilustrativos de agentes antiaglomerantes incluyen fosfato de calcio (tribásico), hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, óxido de magnesio y combinaciones de los mismos.
[0273] Otros excipientes que pueden usarse con las composiciones farmacéuticas incluyen, por ejemplo, albúmina, antioxidantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, polímeros bioabsorbibles, agentes quelantes, agentes de liberación controlada, diluyentes, agentes dispersantes, potenciadores de la disolución, agentes emulsionantes, agentes gelificantes, bases para pomadas, potenciadores de la penetración, conservantes, agentes solubilizantes, solventes, agentes estabilizadores, azúcares y combinaciones de los mismos. Ejemplos específicos de cada uno de estos agentes se describen en, por ejemplo,Handbook of PHarmaceutical Excipients,Rowe et al. (Eds.) 6a ed. (2009), The Pharmaceutical Press.
[0274] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un solvente. En algunos aspectos, el solvente es una solución salina, como una solución salina isotónica estéril o una solución de dextrosa. En algunos aspectos, el solvente es agua para inyección.
[0275] En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas están en forma particulada, como una micropartícula o una nanopartícula. Las micropartículas y las nanopartículas pueden formarse a partir de cualquier material adecuado, como un polímero o un lípido. En algunos aspectos, las micropartículas o nanopartículas son micelas, liposomas o polimerosomas.
[0276] En la presente se proporcionan además composiciones farmacéuticas anhidras y formas de dosificación que comprenden un anticuerpo, ya que el agua puede facilitar la degradación de algunos anticuerpos.
[0277] Las composiciones farmacéuticas anhidras y las formas de dosificación proporcionadas en la presente pueden prepararse usando ingredientes anhidros o que contienen poca humedad y condiciones de baja humedad. Las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación que comprenden lactosa y por lo menos un ingrediente activo que comprende una amina primaria o secundaria pueden ser anhidras si se espera un contacto sustancial con la humedad durante la fabricación, el envasado y/o el almacenamiento.
[0278] Una composición farmacéutica anhidra debe prepararse y almacenarse de tal manera que se mantenga su naturaleza anhidra. Por consiguiente, las composiciones anhidras pueden envasarse usando materiales que se sabe que evitan la exposición al agua, de tal manera que pueden incluirse en kits de formulario adecuados. Los ejemplos de envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, láminas selladas herméticamente, plásticos, recipientes de dosis unitarias (por ejemplo, viales), envases tipo blíster y envases en tiras.
[0279] En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente se formula como formas de dosificación parenteral. Las formas de dosificación parenteral pueden administrarse a sujetos por varias vías incluyendo, entre otras, subcutánea, intravenosa (incluyendo infusiones e inyecciones en bolo), intramuscular e intraarterial. Como su administración típicamente elude las defensas naturales de los sujetos contra los contaminantes, las formas de dosificación parenteral son típicamente estériles o pueden esterilizarse antes de la administración a un sujeto. Los ejemplos de formas de dosificación parenteral incluyen, entre otros, soluciones listas para inyección, productos secos (por ejemplo, liofilizados) listos para disolverse o suspenderse en un vehículo farmacéuticamente aceptable para inyección, suspensiones listas para inyección y emulsiones.
[0280] Los vehículos adecuados que pueden usarse para proporcionar formas de dosificación parenteral son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: agua para inyección USP; vehículos acuosos como, entre otros, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio e inyección de Ringer lactada; vehículos miscibles en agua como, entre otros, alcohol etílico, polietilenglicol y polipropilenglicol; y vehículos no acuosos como, entre otros, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo.
[0281] Los excipientes que aumentan la solubilidad de uno o más de los anticuerpos divuglados en la presente también pueden incorporarse en las formas de dosificación parenteral.
[0282] En algunas realizaciones, la forma de dosificación parenteral se liofiliza. Las formulaciones liofilizadas ejemplares se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 6.267.958 y 6.171.586; y la WO 2006/044908.
[0283] En la terapéutica humana, el médico determinará la posología que considere más adecuada de acuerdo con un tratamiento preventivo o curativo y de acuerdo con la edad, el peso, el estado y demás factores propios del sujeto a tratar.
[0284] En ciertas realizaciones, una composición proporcionada en la presente es una composición farmacéutica o una forma de dosificación unitaria única. Las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación unitaria única proporcionadas en la presente comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos profilácticos o terapéuticos.
[0285] La cantidad de anticuerpo o composición que será eficaz en la prevención o tratamiento de un trastorno o uno o más síntomas del mismo variará con la naturaleza y gravedad de la enfermedad o afección, y la vía por la que se administra el anticuerpo. La frecuencia y la dosificación también variarán de acuerdo con factores específicos para cada sujeto dependiendo de la terapia específica (por ejemplo, agentes terapéuticos o profilácticos) administrada, la gravedad del trastorno, enfermedad o afección, la vía de administración, así como la edad, el cuerpo, el peso, la respuesta y el historial médico anterior del sujeto. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a dosis derivadas de sistemas de prueba in vitro o en modelos animales.
[0286] Pueden aplicarse diferentes cantidades terapéuticamente eficaces para diferentes enfermedades y afecciones, como sabrán fácilmente los expertos en la técnica. De manera similar, las cantidades de dosificación y los programas de frecuencia de dosis proporcionados en la presente también abarcan cantidades suficientes para prevenir, controlar, tratar o mejorar tales trastornos, pero insuficientes para provocar, o suficientes para reducir, los efectos adversos asociados con los anticuerpos proporcionados en la presente. Además, cuando a un sujeto se le administran múltiples dosificaciones de una composición proporcionada en la presente, no es necesario que todas las dosificaciones sean iguales. Por ejemplo, la dosificación administrada al sujeto puede aumentarse para mejorar el efecto profiláctico o terapéutico de la composición o puede disminuirse para reducir uno o más efectos secundarios que está experimentando un sujeto particular.
[0287] En ciertas realizaciones, el tratamiento o la prevención pueden iniciarse con una o más dosis de carga de un anticuerpo o composición proporcionados en la presente seguido de una o más dosis de mantenimiento.
[0288] En ciertas realizaciones, puede administrarse una dosis de un anticuerpo o una composición proporcionada en la presente para lograr una concentración de estado estacionario del anticuerpo en la sangre o el suero del sujeto. La concentración en estado estacionario puede determinarse mediante la medición de acuerdo con técnicas disponibles para los expertos o puede basarse en las características físicas del sujeto, como la altura, el peso y la edad.
[0289] Como se analiza con más detalle en otra parte de esta divulgación, un anticuerpo proporcionado en la presente puede administrarse opcionalmente con uno o más agentes adicionales útiles para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno. La cantidad eficaz de tales agentes adicionales puede depender de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y los otros factores conocidos en la técnica o descritos en la presente.
Aplicaciones terapéuticas
[0290] Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos se administran a un mamífero, generalmente un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, como las conocidas en la técnica y las analizadas anteriormente. Por ejemplo, los anticuerpos pueden administrarse a un humano por vía intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal o intratumoral. Los anticuerpos también se administran adecuadamente por vías peritumorales, intralesionales o perilesionales, para ejercer efectos terapéuticos tanto locales como sistémicos. La vía intraperitoneal puede ser particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores de ovario.
[0291] Los anticuerpos proporcionados en la presente pueden ser útiles para el tratamiento de cualquier enfermedad o afección que implique SIRP-ALFA. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección que puede beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-SIRP-ALFA. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un tumor. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un trastorno de proliferación celular. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un cáncer. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es una infección.
[0292] Los ejemplos de síntomas, dolencias y/o enfermedades que pueden tratarse con un anticuerpo anti-SIRPa en cuestión incluyen, entre otros, cáncer (cualquier forma de cáncer incluyendo, pero no limitadas a: carcinomas, tumores de tejidos blandos, sarcomas, teratomas, melanomas, leucemias, linfomas, cánceres cerebrales, tumores sólidos, mesotelioma (MSTO), etc.); infección (por ejemplo, infección crónica); y una enfermedad o trastorno inmunológico (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria) (por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis y similares, por ejemplo, para terapia inmunosupresora). Un anticuerpo anti-SlRpa en cuestión también puede usarse para acondicionamiento de trasplantes (por ejemplo, trasplante de células madre, trasplante de médula ósea, etc.) (por ejemplo, para destruir células malignas, proporcionar inmunosupresión para evitar que el cuerpo del paciente rechace las células/células madre del donante, etc.). Por ejemplo, en algunos casos, una combinación de anticuerpos del sujeto o anticuerpo biespecífico (por ejemplo, anti-SIRPa en combinación con anti-CD117) encuentra uso para el acondicionamiento de trasplantes. Por ejemplo, puede usarse una combinación de anticuerpos del sujeto o un anticuerpo biespecífico (por ejemplo, anti-SlRPa en combinación con anti-CD117) para el acondicionamiento del trasplante de médula ósea. En algunos casos, puede usarse un anticuerpo anti-SIRPa en cuestión (por ejemplo, una combinación de anticuerpos) para terapia inmunosupresora.
[0293] En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente se proporcionan para su uso como medicamento. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente se proporcionan para su uso en la fabricación o preparación de un medicamento. En algunas realizaciones, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad o afección que puede beneficiarse de un anticuerpo anti-SIRP-ALFA. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un tumor. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un trastorno de proliferación celular. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un cáncer. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es una infección. Una enfermedad o afección puede ser cáncer; infección; una infección viral; una infección bacteriana; una infección fúngica; fibrosis; arterosclerosis; una infección parasitaria, opcionalmente malaria; y/o agotamiento o reducción de células madre formadoras de sangre endógenas de la médula ósea para permitir el acondicionamiento libre o reducido de radiación y/o quimioterapia para el trasplante de células madre formadoras de sangre, opcionalmente en combinación con anticuerpo anti-CKIT (CD117).
[0294] En algunos casos, en la presente se divulga un método para tratar una enfermedad o afección en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto. En algunos aspectos, la enfermedad o afección es un cáncer. En algunos aspectos, la enfermedad o afección es una infección.
[0295] En algunos casos, en la presente se divulga un método para tratar una enfermedad o afección en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto, en donde la enfermedad o afección es un cáncer, y el cáncer se selecciona entre un tumor sólido y un tumor hematológico.
[0296] En algunos casos, en la presente se divulga un método para aumentar la fagocitosis en un sujeto con necesidad de ello, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o una composición farmacéutica divulgada en la presente.
[0297] En algunos casos, en la presente se divulga un método para modular una respuesta inmunitaria en un sujeto con necesidad de ello, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o una composición farmacéutica divulgada en la presente.
[0298] Con los anticuerpos proporcionados en la presente puede tratarse cualquier cáncer adecuado.
[0299] Por ejemplo, cualquier cáncer en el que las células cancerosas muestren una mayor expresión de CD47 en comparación con las células no cancerosas, es un cáncer adecuado para ser tratado por los métodos y composiciones en cuestión. Como se usa en la presente, "cáncer" incluye cualquier forma de cáncer incluyendo, entre otros, cánceres de tumores sólidos (por ejemplo, cáncer de pulmón, próstata, mama, vejiga, colon, ovario, páncreas, riñón, hígado, glioblastoma, meduloblastoma, leiomiosarcoma, carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, melanomas, neuroendocrino, etc.) y cánceres líquidos (por ejemplo, cánceres hematológicos); carcinomas; tumores de tejidos blandos; sarcomas; teratomas; melanomas; leucemias; linfomas; y cánceres cerebrales, incluyendo enfermedad residual mínima, e incluyendo tumores tanto primarios como metastásicos. Cualquier cáncer, donde las células cancerosas expresen CD47 (por ejemplo, en algunos casos, las células cancerosas muestran una expresión aumentada de CD47 en comparación con células no cancerosas), es un cáncer adecuado para ser tratado mediante los métodos y composiciones en cuestión (por ejemplo, un anticuerpo anti-SIRPa en cuestión).
[0300] Los carcinomas son enfermedades malignas que se originan en los tejidos epiteliales. Las células epiteliales cubren la superficie externa del cuerpo, revisten las cavidades internas y forman el revestimiento de los tejidos glandulares. Los ejemplos de carcinomas incluyen, pero no se limitan a: adenocarcinoma (cáncer que comienza en las células glandulares (secretoras)), por ejemplo, los cánceres de mama, páncreas, pulmón, próstata y colon pueden ser adenocarcinomas; carcinoma adrenocortical; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células renales; carcinoma de ovario; carcinoma in situ; carcinoma ductal; carcinoma de mama; carcinoma de células basales; carcinoma de células escamosas; carcinoma de células de transición; carcinoma de colon; carcinoma nasofaríngeo; carcinoma de células renales quísticas multiloculares; carcinoma de células de avena; carcinoma de pulmón de células grandes; carcinoma de pulmón de células pequeñas; carcinoma de pulmón de células no pequeñas; y similares. Los carcinomas pueden encontrarse en la próstata, páncreas, cerebro (habitualmente como metástasis secundarias), pulmón, mama, piel, etc.
[0301] Los tumores de tejidos blandos son un grupo muy diverso de tumores raros que se derivan del tejido conectivo. Los ejemplos de tumores de tejidos blandos incluyen, pero no se limitan a: sarcoma alveolar de partes blandas; histiocitoma fibroso angiomatoide; fibroma de condromioxido; condrosarcoma esquelético; condrosarcoma mixoide extraesquelético; sarcoma de células claras; tumor desmoplásico de células redondas pequeñas; dermatofibrosarcoma protuberante; tumor del estroma endometrial; Sarcoma de Ewing; fibromatosis (desmoide); fibrosarcoma, infantil; tumor del estroma gastrointestinal; tumor óseo de células gigantes; tumor tenosinovial de células gigantes; tumor miofibroblástico inflamatorio; leiomioma uterino; leiomiosarcoma; lipoblastoma; lipoma típico; células fusiformes o lipoma pleomórfico; lipoma atípico; lipoma condroide; liposarcoma bien diferenciado; liposarcoma mixoide/de células redondas; liposarcoma pleomórfico; histiocitoma fibroso maligno mixoide; histiocitoma fibroso maligno de alto grado; mixofibrosarcoma; tumor maligno de la vaina del nervio periférico; mesotelioma; neuroblastoma; osteocondroma; osteosarcoma; tumor neuroectodérmico primitivo; rabdomiosarcoma alveolar; rabdomiosarcoma embrionario; schwannoma benigno o maligno; sarcoma sinovial; tumor de Evan; fascitis nodular; fibromatosis de tipo desmoide; tumor fibroso solitario; dermatofibrosarcoma protuberante (DFSP); angiosarcoma; hemangioendotelioma epitelioide; tumor tenosinovial de células gigantes (TGCT); sinovitis villonodular pigmentada (PVNS); displasia fibrosa; mixofibrosarcoma; fibrosarcoma; sarcoma sinovial; tumor maligno de la vaina del nervio periférico; neurofibroma; y adenoma pleomorfo de partes blandas; y neoplasias derivadas de fibroblastos, miofibroblastos, histiocitos, células vasculares/células endoteliales y células de la vaina nerviosa.
[0302] Un sarcoma es un tipo raro de cáncer que surge en las células de origen mesenquimatoso, por ejemplo, en el hueso o en los tejidos blandos del cuerpo, incluyendo los cartílagos, la grasa, los músculos, los vasos sanguíneos, el tejido fibroso u otro tejido conectivo o de soporte. Los diferentes tipos de sarcoma se basan en el lugar donde se forma el cáncer. Por ejemplo, el osteosarcoma se forma en el hueso, el liposarcoma se forma en la grasa y el rabdomiosarcoma se forma en el músculo. Los ejemplos de sarcomas incluyen, pero no se limitan a: tumor de Askin; sarcoma botrioides; condrosarcoma; sarcoma de Ewing; hemangioendotelioma maligno; schwanoma maligno; osteosarcoma; y sarcomas de tejidos blandos (por ejemplo, sarcoma alveolar de partes blandas; angiosarcoma; cistosarcoma filodesdermatofibrosarcoma protuberante (DFSP); tumor desmoides; tumor desmoplásico de células redondas pequeñas; sarcoma epitelioide; condrosarcoma extraesquelético; osteosarcoma extraesquelético; fibrosarcoma; tumor del estroma gastrointestinal (GIST); hemangiopericitoma; hemangiosarcoma (más comúnmente conocido como "angiosarcoma"); sarcoma de Kaposi; leiomiosarcoma; liposarcoma; linfangiosarcoma; tumor maligno de la vaina del nervio periférico (MPNST); neurofibrosarcoma; sarcoma sinovial; sarcoma pleomórfico indiferenciado, y similares).
[0303] Un teratoma es un tipo de tumor de células germinales que puede contener varios tipos diferentes de tejido (por ejemplo, puede incluir tejidos derivados de cualquiera o todas las tres capas germinales: endodermo, mesodermo y ectodermo) incluyendo, por ejemplo, cabello, músculo y hueso. Los teratomas se producen con mayor frecuencia en los ovarios de las mujeres, los testículos de los hombres y el coxis de los niños.
[0304] El melanoma es una forma de cáncer que comienza en los melanocitos (células que producen el pigmento melanina). Puede comenzar en un lunar (melanoma de la piel), pero también puede comenzar en otros tejidos pigmentados, como en el ojo o en los intestinos.
[0305] Las leucemias son cánceres que comienzan en el tejido que forma la sangre, como la médula ósea, y provocan la producción de grandes cantidades de células sanguíneas anormales que se introducen en el torrente sanguíneo. Por ejemplo, las leucemias pueden originarse en células derivadas de la médula ósea que normalmente maduran en el torrente sanguíneo. Las leucemias se nombran según la rapidez con la que se desarrolla y progresa la enfermedad (por ejemplo, aguda frente a crónica) y por el tipo de glóbulo blanco afectado (por ejemplo, mieloide frente a linfoide). Las leucemias mieloides también se denominan leucemias mielógenas o mieloblásticas. Las leucemias linfoides también se denominan leucemia linfoblástica o linfocítica. Las células de la leucemia linfoide pueden acumularse en los ganglios linfáticos, que pueden inflamarse. Los ejemplos de leucemias incluyen, entre otros: leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), y leucemia linfocítica crónica (CLL).
[0306] Los linfomas son cánceres que comienzan en las células del sistema inmunitario. Por ejemplo, los linfomas pueden originarse en células derivadas de la médula ósea que normalmente maduran en el sistema linfático. Hay dos categorías básicas de linfomas. Un tipo es el linfoma de Hodgkin (HL), que se caracteriza por la presencia de un tipo de célula llamada célula de Reed-Sternberg. Actualmente hay 6 tipos reconocidos de HL. Los ejemplos de linfomas de Hodgkin incluyen: linfoma de Hodgkin clásico (CHL) de esclerosis nodular, CHL de celularidad mixta, CHL con agotamiento de linfocitos, CHL rico en linfocitos y HLcon predominio de linfocitos nodulares.
[0307] La otra categoría de linfoma son los linfomas no Hodgkin (LNH), que incluye un grupo grande y diverso de cánceres de las células del sistema inmunitario. Los linfomas no Hodgkin pueden dividirse además en cánceres que tienen un curso indolente (crecimiento lento) y aquellos que tienen un curso agresivo (crecimiento rápido). Actualmente hay 61 tipos reconocidos de NHL. Los ejemplos de linfomas no Hodgkin incluyen, entre otros: linfomas relacionados con el SIDA, linfoma anaplásico de células grandes, linfoma angioinmunoblástico, linfoma blástico de células NK, linfoma de Burkitt, linfoma similar a Burkitt (linfoma de células pequeñas no escindidas), leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño, linfoma cutáneo de células T, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células T de tipo enteropatía, linfoma folicular, linfomas de células T gamma-delta hepatoesplénicos, leucemias de células T, linfoma linfoblástico, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, linfoma nasal de células T, linfoma pediátrico, linfomas periféricos de células T, linfoma primario del sistema nervioso central, linfomas transformados, linfomas de células T relacionados con el tratamiento y macroglobulinemia de Waldenstrom.
[0308] Los cánceres cerebrales incluyen cualquier cáncer de los tejidos cerebrales. Los ejemplos de cánceres cerebrales incluyen, pero no se limitan a: gliomas (por ejemplo, glioblastomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, ependimomas y similares), meningiomas, adenomas hipofisarios, schwannomas vestibulares, tumores neuroectodérmicos primitivos (meduloblastomas), etc.
[0309] Como se usa en la presente, el término "infección" se refiere a cualquier estado en por lo menos una célula de un organismo (es decir, un sujeto) que está infectada por un agente infeccioso (por ejemplo, un sujeto tiene una infección patógena intracelular, por ejemplo, una infección patógena intracelular crónica). Como se usa en la presente, el término "agente infeccioso" se refiere a una entidad biológica extraña (es decir, un patógeno) que induce la expresión de CD47 (por ejemplo, expresión aumentada de CD47) en por lo menos una célula del organismo infectado. Por ejemplo, los agentes infecciosos incluyen, entre otros, bacterias, virus, protozoos y hongos. Los patógenos intracelulares son de particular interés. Las enfermedades infecciosas son trastornos provocados por agentes infecciosos. Algunos agentes infecciosos no provocan síntomas o enfermedades reconocibles bajo ciertas condiciones, pero tienen el potencial de provocar síntomas o enfermedades bajo condiciones modificadas. Los métodos en cuestión pueden usarse en el tratamiento de infecciones crónicas por patógenos, por ejemplo, que incluyen pero no se limitan a infecciones virales, por ejemplo, retrovirus, lentivirus, virus hepadna, virus del herpes, virus de la viruela, virus del papiloma humano, etc.; infecciones bacterianas intracelulares, por ejemplo,Mycobacterium, Chlamydophila, Ehrlichia, Rickettsia, Brucella, Legionella, Francisella, Listeria, Coxiella, Neisseria, Salmonella, Yersinia sp, Helicobacter pylori,etc.; y patógenos protozoarios intracelulares, por ejemplo,Plasmodium sp., Trypanosoma sp., Giardia sp., Toxoplasma sp., Leishmania sp.,etc.
[0310] En algunos casos, en la presente se divulga un método para antagonizar SIRP-ALFA en una célula objetivo de un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0311] En algunos casos, en la presente se divulga un método para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0312] En algunos casos, en la presente se divulga un método que retrasa la aparición de un tumor en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0313] En algunos casos, en la presente se divulga un método para prevenir la recurrencia o la aparición de un tumor en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0314] En algunos casos, en la presente se divulga un método para retrasar la aparición de un cáncer en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0315] En algunos casos, en la presente se divulga un método para prevenir la recurrencia o la aparición de un cáncer en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0316] En algunos casos, en la presente se divulga un método para reducir el tamaño de un tumor en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0317] En algunos casos, en la presente se divulga un método para reducir el número de metástasis en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0318] En algunos casos, en la presente se divulga un método para retrasar la aparición de una infección en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0319] En algunos casos, en la presente se divulga un método para prevenir la recurrencia o el inicio de una infección en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0320] En algunos casos, en la presente se divulga un método para reducir el título viral de un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0321] En algunos casos, en la presente se divulga un método para eliminar un virus de un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
[0322] En algunos casos, en la presente se divulga un método para extender el período de supervivencia general, el tiempo medio de supervivencia o la supervivencia libre de progresión en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.
Terapias de combinación
[0323] En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente se administra con por lo menos un agente terapéutico adicional. Con un anticuerpo proporcionado en la presente puede administrarse cualquier agente terapéutico adicional adecuado. En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional se selecciona de radiación, un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente citostático, un agente antihormonal, un inhibidor de EGFR, un agente inmunoestimulador, un agente antiangiogénico y combinaciones de los mismos.
[0324] En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional comprende un agente inmunoestimulador.
[0325] En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo.
[0326] Los anticuerpos anti-SIRPa pueden usarse terapéuticamente en combinación con un segundo anticuerpo o agente que se une selectivamente a una célula objetivo. El término "célula objetivo" puede usarse de diferentes maneras dependiendo del contexto. Típicamente, una "célula objetivo" es una célula que será fagocitada por una célula fagocítica (por ejemplo, un fagocito), donde la fagocitosis se potencia como resultado de la administración de un anticuerpo anti-SIRPa en cuestión. Por tanto, el término "célula objetivo" puede referirse a una célula que expresa CD47, porque un anticuerpo anti-SIRPa en cuestión, que inhibe la interacción entre la célula que expresa CD47 y la célula fagocítica que expresa SIRPa, facilita la fagocitosis de la célula que expresa CD47.
[0327] Sin embargo, en algunos casos, no es necesario que la célula objetivo exprese altos niveles de CD47 (y en algunos casos no es necesario que exprese CD47 en absoluto) para que un anticuerpo multiespecífico del sujeto induzca la fagocitosis de la célula objetivo. Por ejemplo, en el contexto de un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, biespecífico), la región de unión de SIRPa (la primera región de unión) de un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, biespecífico) en cuestión se une a SIRPa en una célula fagocítica (por ejemplo, un macrófago), lo que permite que el anticuerpo multiespecífico funcione como una atadura para acercar la célula fagocítica a las cercanías de una célula que expresa un antígeno (por ejemplo, un marcador de una célula cancerosa) que es reconocido por (se une específicamente) una segunda región de unión del anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, la segunda región de unión de un anticuerpo biespecífico). Por lo tanto, en el contexto de un anticuerpo multiespecífico, una célula objetivo puede ser una célula que no exprese niveles elevados de CD47 (y también puede ser una célula que no exprese CD47). En algunas realizaciones, una célula objetivo es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana. Una célula objetivo puede ser de cualquier individuo (por ejemplo, paciente, sujeto y similares) como se describe a continuación.
[0328] En algunos casos, una célula objetivo es una célula "afectada" (por ejemplo, una célula de un individuo "afectado"), donde el término "afectado" se usa en la presente para referirse a un sujeto con síntomas, una enfermedad o una enfermedad que puede tratarse con un anticuerpo anti-SIRPa en cuestión. Un sujeto "afectado" puede tener cáncer, puede albergar una infección (por ejemplo, una infección crónica) y/o puede tener otras condiciones hiperproliferativas, por ejemplo, esclerosis, fibrosis y similares, etc. Las "células afectadas" pueden ser aquellas células que provocan los síntomas, la dolencia o la enfermedad. Como ejemplos no limitativos, las células afectadas de un paciente afectado pueden ser células cancerosas que expresan<c>D47, células infectadas, células inflamatorias, células inmunitarias y similares. Una indicación de que una enfermedad puede tratarse con un anticuerpo anti-SIRPa en cuestión es que las células involucradas (es decir, las células afectadas, por ejemplo, las células cancerosas, las células infectadas, las células inflamatorias, las células inmunitarias, etc.) expresan CD47 (por ejemplo, en algunos casos, un nivel aumentado de CD47 en comparación con células normales del mismo tipo de célula).
[0329] En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que se une a una proteína o proteínas en la superficie de una célula tumoral.
[0330] Para el tratamiento del cáncer, el anticuerpo anti-SIRPa puede combinarse con uno o más anticuerpos específicos para un antígeno tumoral. De estos, los antígenos asociados a tumores (TAA) están relativamente restringidos a las células tumorales, mientras que los antígenos específicos de tumores (TSA) son exclusivos de las células tumorales. Los TSA y los TAA suelen ser porciones de moléculas intracelulares expresadas en la superficie celular como parte del complejo principal de histocompatibilidad.
[0331] Los antígenos de diferenciación específicos de tejido son moléculas presentes en las células tumorales y sus contrapartidas de células normales. Los antígenos asociados a tumores que se sabe que son reconocidos por mAbs terapéuticos se clasifican en varias categorías diferentes. Los antígenos de diferenciación hematopoyética son glicoproteínas que habitualmente se asocian con grupos de grupos de agrupaciones de diferenciación (CD) e incluyen CD20, CD30, CD33 y CD52. Los antígenos de diferenciación de la superficie celular son un grupo diverso de glicoproteínas y carbohidratos que se encuentran en la superficie de las células tanto normales como tumorales. Los antígenos que participan en la señalización del crecimiento y la diferenciación suelen ser factores de crecimiento y receptores de factores de crecimiento. Los factores de crecimiento que son objetivos de los anticuerpos en pacientes con cáncer incluyen CEA, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR; también conocido como ERBB1), ERBB2 (también conocido como HER2), ERBB3, MET (también conocido como HGFR), receptor de factor de crecimiento 1 tipo insulina (IGF1R), receptor de efrina A3 (EPHA3), receptor 1 de ligando de inducción de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAILR1; también conocido como TNFRSF10A), TRAILR2 (también conocido como TNFRSF10B) y activador del receptor del ligando del factor nuclear kB (RANKL; también conocido como TNFSF11). Los antígenos implicados en la angiogénesis suelen ser proteínas o factores de crecimiento que apoyan la formación de nueva microvasculatura, incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el receptor de VEGF (VEGFR), la integrina aVp3 y la integrina a5p1. El estroma tumoral y la matriz extracelular son estructuras de soporte indispensables para un tumor. Los antígenos de la matriz extracelular y del estroma que son objetivos terapéuticos incluyen la proteína de activación de fibroblastos (FAP) y la tenascina.
[0332] Los ejemplos de anticuerpos terapéuticos útiles en configuraciones biespecíficas o como terapia de combinación incluyen, sin limitación, rituximab; ibritumomab; tiuxetán; tositumomab; brentuximab; vedotina; gemtuzumab; ozogamicina; alemtuzumab; IGN101; adecatumumab; labetuzumab; huA33; pemtumomab; oregovomab; CC49 (minretumomab); cG250; J591; MOv18; MORAb-003 (farletuzumab); 3F8, ch14.18; KW-2871; hu3S193; IgN311; bevacizumab; IM-2C6; CDP791; etaracizumab; volociximab; cetuximab, panitumumab, nimotuzumab; 806; trastuzumab; pertuzumab; MM-121;AMG102, METMAB; SCH 900105; AVE1642, IMC-A12, MK-0646, R1507; CP 751871; KB004; IIIA4; mapatumumab (HGS-ETR1); HGS-ETR2; CS-1008; denosumab; sibrotuzumab; F19; y 81C6. Un anticuerpo biespecífico puede usar la región Fc que activa un receptor F<cy>.
[0333] Para el tratamiento del cáncer, el anticuerpo anti-SIRPa puede combinarse con uno o más anticuerpos que inhiben las proteínas del punto de control inmunitario. De particular interés son las proteínas del punto de control inmunitario que se muestran en la superficie de una célula tumoral. Los receptores de puntos de control inmunitarios que se han estudiado más activamente en el contexto de la inmunoterapia clínica contra el cáncer, el antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA4; también conocido como CD152) y la proteína de muerte celular programada 1 (PD1; también conocida como CD279), son receptores inhibidores. La actividad clínica de los anticuerpos que bloquean cualquiera de estos receptores implica que la inmunidad antitumoral puede mejorarse en múltiples niveles y que las estrategias combinatorias pueden diseñarse de manera inteligente, guiadas por consideraciones mecánicas y modelos preclínicos.
[0334] Los dos ligandos para PD1 son el ligando 1 de PD1 (PDL1; también conocido como B7-H1 y CD274) y PDL2 (también conocido como B7-DC y CD273). PDL1 se expresa en las células cancerosas y, mediante la unión a su receptor PD1 en las células T, inhibe la activación/función de las células T. Consultar, por ejemplo, Avelumab como anticuerpo terapéutico.
[0335] Los agentes que agonizan una molécula coestimuladora inmunitaria también son útiles en los métodos divulgados en la presente. Tales agentes incluyen agonistas de CD40 y OX40. CD40 es una proteína coestimuladora que se encuentra en las células presentadoras de antígenos (APC) y es necesaria para su activación. Estas APC incluyen fagocitos (macrófagos y células dendríticas) y células B. CD40 es parte de la familia de receptores TNF. Las principales moléculas de señalización de activación para CD40 son IFN<y>y el ligando de CD40 (CD40L). La estimulación a través de CD40 activa los macrófagos.
[0336] Los anticuerpos anti-CCR4 (CD194) de interés incluyen anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos contra el receptor 4 de quimiocinas C-C (CCR4) con actividades antiinflamatorias y antineoplásicas potenciales.
[0337] En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que se une a: HER2 (ERBB2/neu), CD52, PD-L1, VEGF, CD30, EGFR, CD38, RANKL (CD254), GD2 (gangliósido), SLAMF7 (CD319), CD20, EGFR, PDGFRa, VEGFR2, CD33, CD44, CD99, CD96, CD90, CD133, CKIT (CD117 para tumores positivos para CKIT); CTLA-4, PD-1, PD-L1, CD40 (agonista), LAG3 (CD223), 41BB (CD137 agonista), OX40 (CD134, agonista); y/o CKIT (CD117) para agotar las células madre formadoras de sangre para la terapia de trasplante.
[0338] En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es por lo menos uno de: Rituximab, Cetuximab, Alemtuzumab (CD52), Atezolizumab (PD-L1), Avelumab (PD-L1), Bevacizumab (VEGF), Brentuximab (CD30), Daratumumab (CD38), Denosumab (RANKL), Dinutuximab (GD2), Elotuzumab (SLAMF7), Ibritumomab (CD20), Ipilimumab (CTLA-4), Necitumumab (EGFR), Nivolumab (PD-1), Obinutuzumab (CD20), Ofatumumab (CD20), Olaratumab (PDGFRa), Panitumumab (EGFR), Pembrolizumab (PD-1), Pertuzumab (HER2), Ramucirumab (VEGFR2), Tositumomab (CD20) y Gemtuzumab (CD33).
[0339] El agente terapéutico adicional puede administrarse mediante cualquier medio adecuado. En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se incluyen en la misma composición farmacéutica. En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se incluyen en diferentes composiciones farmacéuticas.
[0340] En realizaciones en las que un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se incluyen en diferentes composiciones farmacéuticas, la administración del anticuerpo puede producirse antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico adicional. En algunos aspectos, la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se produce con una diferencia de aproximadamente un mes. En algunos aspectos, la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se produce con una diferencia de aproximadamente una semana. En algunos aspectos, la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se produce con una diferencia de aproximadamente un día. En algunos aspectos, la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se produce con una diferencia de aproximadamente doce horas. En algunos aspectos, la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se produce con una diferencia de aproximadamente una hora.
Métodos de diagnóstico
[0341] También se proporcionan métodos para detectar la presencia de SIRP-ALFA en células de un sujeto. Tales métodos pueden usarse, por ejemplo, para predecir y evaluar la respuesta al tratamiento con un anticuerpo proporcionado en la presente.
[0342] En algunas realizaciones, se obtiene una muestra de sangre de un sujeto y se determina la fracción de células que expresan SIRP-ALFA. En algunos aspectos, se determina la cantidad relativa de SIRP-ALFA expresada por dichas células. La fracción de células que expresan SIRP-ALFA y la cantidad relativa de SIRP-ALFA expresada portales células pueden determinarse mediante cualquier método adecuado. En algunas realizaciones, se usa citometría de flujo para realizar tales mediciones. En algunas realizaciones, se usa la clasificación de células asistida por fluorescencia (FACS) para realizar dicha medición. Ver Li et al.,J. Autoimmunity,2003, 21:83-92 para métodos de evaluación de la expresión de SIRP-ALFA en sangre periférica.
Kits
[0343] También se proporcionan kits que comprenden un anticuerpo proporcionado en la presente. Los kits pueden usarse para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de una enfermedad o trastorno, como se describe en la presente.
[0344] En algunas realizaciones, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con él. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y bolsas de solución IV. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales, como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es por sí misma, o cuando se combina con otra composición, eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar una enfermedad o trastorno. El recipiente puede tener un puerto de acceso estéril. Por ejemplo, si el recipiente es una bolsa de solución intravenosa o un vial, puede tener un puerto que pueda perforarse con una aguja. Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo proporcionado en la presente. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la condición seleccionada.
[0345] En algunas realizaciones, el kit comprende (a) un primer recipiente con una primera composición contenida en el mismo, en donde la primera composición comprende un anticuerpo proporcionado en la presente; y (b) un segundo recipiente con una segunda composición contenida en el mismo, en donde la segunda composición comprende un agente terapéutico adicional. El kit en esta realización puede comprender además un prospecto que indica que las composiciones pueden usarse para tratar una afección particular.
[0346] Alternativa, o adicionalmente, el kit puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, el excipiente es un tampón. El kit puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo filtros, agujas y jeringuillas.
EJEMPLOS
[0347] A continuación se muestran ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen únicamente con propósitos ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención de ninguna manera. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero, por supuesto, deben permitirse algunos errores y desviaciones experimentales.
[0348] La puesta en práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Consultar, por ejemplo, T.E. Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties(W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook, et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2a edición, 1989);Methods In Enzymology(S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.);Remington's Pharmaceutical Sciences,18a edición (Easton, Pensilvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey y SundbergAdvanced Organic Chemistry3a ed. (Plenum Press) Vols A y B (1992).
Materiales y métodos
[0349]Generación de anticuerpos. Se sintetizó un fragmento de ADNc de SIRPa humana que codificaba el dominio extracelular y se fusionó con Fc de ratón para generar una proteína de fusión SIRPa-Fc, que se usó para inmunizar ratones para producir anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD47 humano. Los hibridomas se generaron usando protocolos estándar. En resumen, se inmunizaron ratones Balb/c de 4-6 semanas de edad con una proteína de fusión SIRPa-Fc recombinante purificada dos veces por semana durante un total de 4 semanas. Posteriormente se evaluaron los títulos y las células de bazo se fusionaron con células SP2/0. Se seleccionaron los hibridomas y los sobrenadantes de los clones resultantes se seleccionaron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
[0350]Clonación y secuenciación del anticuerpo V.La estrategia de clonación usada aquí implicó un aislamiento inicial de ARN de células de hibridoma (Qiagen). Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos monoclonales 1H9 y 3C2 se obtuvieron usando técnicas 5' RACE-PCR (Clontech) y se secuenciaron usando técnicas estándar de secuenciación de ADN.
[0351]Modelado molecular y humanización de anticuerpos. La humanización de 1H9 y 3C2 se realizó instalando residuos de CDR de anticuerpos de ratón en estructuras marco de línea germinal humana (FR). Brevemente, se humanizaron 1H9 y 3C2 de ratón mediante el reclutamiento juicioso de los residuos de CDR correspondientes. Las diferencias entre 1H9 y 3C2 de ratón y los residuos de FR humanos se modelaron individualmente para investigar su posible influencia en la conformación de CDR.
[0352]Transfección celular.Las células 293F se cultivaron en medio de expresión FreeStyle™ 293 (Invitrogen). La transfección transitoria se realizó mediante cotransfección de vectores de expresión que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo usando el reactivo de transfección 293fectin (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. De cuatro a cinco días después, se recogieron los sobrenadantes de las células transfectadas y se analizó la secreción de anticuerpos por ELISA. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 1 pg/ml de anticuerpo gamma Fc antihumano de cabra en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 16 horas a 4° C. Después de bloquear durante 1 hora con BSA al 0,4% en PBS a temperatura ambiente, se añadieron sobrenadantes aislados en diluciones secuenciales de 1/3 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, las placas se lavaron tres veces y se incubaron con anticuerpo específico de kappa antihumano de cabra conjugado con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se desarrollaron con TMB. La reacción se detuvo con 2M H2SO4, y la OD se midió a 450 nM.
[0353]Purificación y caracterización de anticuerpos.Se aplicó el sobrenadante del cultivo a columnas de proteína A SepHarose (GE Healthcare). La columna se lavó con PBS y luego la proteína se eluyó con tampón de elución (tampón de citrato de sodio 0,1 M, pH 3,0). Las fracciones recogidas se neutralizaron con Tris 1 M pH 9,0. Finalmente, las muestras purificadas se dializaron frente a PBS. La pureza de la fracción de anticuerpo eluida se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en geles al 10% en condiciones reductoras o no reductoras. Las bandas se visualizaron mediante tinción con azul brillante de Coomassie.
[0354]Medición de la afinidad de anticuerpos.La proteína de fusión SIRPa-His humana se preparó fusionando el dominio extracelular de SIRPa humana con la etiqueta His y se usó para medir la afinidad de unión monomérica a 1H9 y 3C2. Los experimentos de unión se realizaron en Biacore 3000 a 25° C. El anticuerpo de captura antihumano de cabra se inmovilizó (como se indica en la tabla) en la superficie del chip mediante inmovilización directa usando la química de acoplamiento EDC/NHS en las celdas de flujo 2, 3 y 4 del chip CM5. Los sitios desocupados se bloquearon con etanolamina 1M. La celda de flujo 1 no se trató y se usó como referencia para la sustracción de cualquier unión no específica del Ag a la superficie del chip. Los Abs de prueba se capturaron en la celda de flujo 2, 3 y 4 en una RU como se indica. El antígeno se hizo fluir sobre el chip a una única concentración de analito. La unión del antígeno al ligando se monitorizó en tiempo real para obtener las constantes de asociación (ka) y disociación (kd). La constante de equilibrio (Kd) se calculó a partir de las ka y kd observadas. Para las interacciones de constante de disociación rápida, KD se determinó mediante análisis cinético de estado estacionario.
[0355]Ensayo de fagocitosis in vitro.Se lavaron y contaron las células cancerosas Raji y HT29, luego se añadieron a cada pocillo 25 pl que contenían 1 x 105 células en IMDM sin suero. Se añadió a los pocillos tratamiento con anticuerpos (en 25 pl) con una concentración final de 10 pg/ml de 1H9, 3C2 (si no se indica en las figuras), rituximab o 0,1 pg/ml de cetuximab y se incubó a 37° C durante 30 minutos. A los 30 minutos, se contaron los macrófagos que se habían recolectado previamente con TrypLE y se colocaron en placas con 5x104 células en 50 pl de IMDM libre de suero. Las placas se incubaron a 37° C durante 2 horas (Efector:Objetivo=1:2). El porcentaje de fagocitosis se calculó mediante análisis de citometría de flujo en busca de macrófagos GFP+.
[0356]Genotipado de variantes de SIRPa. Se aisló ADN genómico de muestras de sangre de donantes humanos usando el kit de aislamiento de ADN QlAamp (Qiagen). La PCR se realizó usando el ADN genómico aislado y los cebadores de TAG AAT ACA GGC TCA TGT TGC AGG T y GCC TTC AGC AAA TAG CAT GAC GT. Los fragmentos de PCR se purificaron y secuenciaron. Se analizaron e identificaron diferentes variantes de SIRPa de acuerdo con las secuencias de referencia de SIRPa (Polymorphism in Sirpa modulates engraftment of human hematopoietic stem cells. Nature Immunology, 8; 1313, 2007).
[0357]Bloqueo de la unión de CD47 humano en monocitos aislados de donantes humanos.Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de sangre humana usando Ficoll. Se incubaron 5 x 105 células con 1 ug/ml de proteína de fusión CD47-Fc humana conjugada con AF488 en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de hHulH9-G1. La unión de CD47 en las células se midió y analizó mediante citometría de flujo.
[0358]Internalización de HulH9-G1.La internalización de 1H9 humanizado se probó incubando 10 ug/ml del anticuerpo con células de macrófagos diferenciadas de sangre humana normal a 37° C. A continuación, las células se fijaron y permeabilizaron en cada punto de tiempo (0, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h y 24 h). Se usó anticuerpo IgG1 antihumano marcado con PE para detectar 1H9. Se usó DAPI para teñir los núcleos. Se usó la incubación a 4° C como control para la tinción superficial de 1H9.
Ejemplo 1: generación de anticuerpos monoclonales anti-SIRPa y mapeo de epítopos
[0359] Se fusionó un fragmento de ADNc de SIRPa humana que codifica el dominio extracelular con Fc de ratón para generar una proteína de fusión SIRPa-Fc (SEQ ID NO: 45), que se usó para inmunizar ratones para producir anticuerpos monoclonales de ratón anti-SIRPa humana. La especificidad de los clones de hibridomas seleccionados se examinó mediante unión ELISA a SIRPa humana. Se obtuvieron dos de los clones positivos y se designaron como 1H9 y 3C2. Se clonaron y se secuenciaron las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras, y se determinaron las secuencias de Vh y Vl de 1H9 (FIG. 1) y 3C2 (Figura 2).
[0360] Para determinar los epítopos reconocidos por 1H9 y 3C2, se revistió proteína de fusión SIRPa-Fc humana en una placa de 96 pocillos. La unión de SIRPa con 1H9 y 3C2 se midió en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de un anticuerpo anti-SIRPa, KWar (divulgado en la Solicitud Internacional WO 2015/138600; las secuencias Vhy Vl se muestran en las SEQ ID NO 46-47). Como se muestra en la Figura 3A, Kwar no compitió con 1H9 por la unión de SIRPa, lo que indica que 1H9 reconoce un epítopo distinto que KWar. Por el contrario, Kwar compitió con 3C2 por la unión de SIRPa; sin embargo, la unión de 3C2 a SIRPa solo se bloqueó parcialmente incluso cuando se usaron cantidades de KWar en exceso 100 veces mayores. Esto indica que 3C2 probablemente reconoce un epítopo superpuesto pero no idéntico en comparación con KWar (Figura 3A). También se realizó la unión competitiva entre 1H9 y 3C2, y se demostró que la unión de 1H9 con SIRPa competía con el propio 1H9 de una manera dependiente de la dosis, pero no con 3C2 (Figura 3B). De manera similar, 3C2 compitió consigo mismo de manera dependiente de la dosis pero no por 1H9 (Figura 3C). Como tal, 1H9 y 3C2 reconocen epítopos distintos en SIRP-alfa.
Ejemplo 2: Selección de ¡sotipos de anticuerpos para 1H9 y 3C2
[0361] Se construyeron 1H9 y 3C2 quiméricos fusionando sus dominios variables de cadena ligera y pesada con las regiones constantes de kappa humana, IgG4 humana o IgG1 humana que tiene una mutación N297A para suprimir la interacción con FcgR. Los anticuerpos resultantes se probaron luego en un ensayo de fagocitosis in vitro en combinación con rituximab (Rx). Se observaron los efectos de la variación del donante. 1H9 sinergizó con rituximab para promover la fagocitosis igualmente bien en formatos humanos IgG4 (1H9-G4) e IgG1 N297A (1H9-G1) usando macrófagos diferenciados de monocitos de algunos donantes (Figura 4A). Mientras que, usando macrófagos diferenciados de monocitos de diferentes donantes, 1H9-G1 desencadenó una mejor sinergia con rituximab que la de 1H9-G4 (Figura 4B). También se observaron resultados similares con 3C2 (Figura 4A-B). Es posible que diferentes variaciones alélicas en los FcgR expresados en macrófagos puedan provocar las variaciones observadas en el ensayo de fagocitosis in vitro. Estos resultados demuestran el beneficio general del constructo dead-Fc para anticuerpos antiSIRPa, al reducir la variabilidad de la capacidad de respuesta, es decir, reducir el número de individuos que no responden en la potenciación de la fagocitosis cuando se combina con un anticuerpo dirigido a células.
Ejemplo 3: Humanización 1H9 y 3C2
[0362] La humanización de 1H9 y 3C2 se realizó mediante injerto de CDR, y las secuencias humanizadas de V<h>y Vl de 1H9 y 3C2 se muestran en las Figuras 5 y 6, respectivamente. Las secuencias de longitud completa se muestran en las SEQ ID NO 37-40.
[0363] Para evaluar la especificidad de unión al antígeno de 1H9 y 3C2 humanizados, se llevó a cabo mediante ELISA la unión competitiva entre 1H9 o 3C2 de ratón humanizado y parental. Demostró que 1H9 y 3C2 humanizados competían con 1H9 y 3C2 de ratón por la unión de SIRPa de una manera dependiente de la dosis, respectivamente (Figura 7). Por tanto, 1H9 y 3C2 humanizados poseen la misma especificidad de unión a antígeno que sus anticuerpos originales. A continuación, se midieron las afinidades de unión al antígeno de 1H9 y 3C2 humanizados usando resonancia de plasmones superficiales. 1H9 humanizado se unió al antígeno SIRPa humana monomérico con una K<d>de 1,15 x 10-9 M, y 3C2 humanizado unido a SIRPa humana monomérico con una Kd de 5,53 x 10-9 M (Figura 8).
Ejemplo 4 : 1H9 y 3C3 humanizados hacen sinergia con anticuerpos terapéuticos para promover la fagocitosis mediada por macrófagos
[0364] A continuación, investigamos la capacidad de 1H9 y 3C2 humanizados para permitir la fagocitosis de células cancerosas humanas por macrófagos derivados de sangre periférica humana en combinación con anticuerpos terapéuticos. 1H9 o 3C2 humanizados solos no indujeron sustancialmente la fagocitosis; sin embargo, cuando se combinaron con rituximab (Rx), ambos anticuerpos indujeron una mayor actividad fagocítica de las células Raji que la de rituximab solo (Figura 9A). Además, 1H9 y 3C2 humanizados hicieron sinergia con cetuximab (Cx) para inducir la fagocitosis de una línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29, y se observó actividad sinérgica en un intervalo de concentraciones de 1H9 y 3C2 humanizados que se probaron (Figura 9B).
Ejemplo 5: reactividad cruzada de 1H9 y 3C2 con miembros de la familia SIRP
[0365] Además de SIRP alfa, hay dos proteínas estrechamente relacionadas en la familia SIRP, a saber (SIRPB, número de registro NM_001083910.3) y SIRP gamma (SIRPG, número de registro NM_001039508.1). SIRPB, aunque está estrechamente relacionado con SIRPa, no parece unirse a CD47 y carece de ITIM citoplasmáticos o cualquier otro motivo citosólico reconocible para la señalización. En cambio, SIRPB contiene una región transmembrana con un residuo de lisina cargado positivamente que media en la asociación con DAP12, una proteína adaptadora que transporta un ITAM. La fosforilación de DAP12 ITAM media el reclutamiento de la proteína tirosina quinasa Syk y la consiguiente activación de la vía MAPK que regula varias funciones. La activación del receptor SIRPB murino, por ejemplo, que también forma complejos con DAP12, promueve la fagocitosis en los macrófagos. SIRPG, el tercer miembro de la familia SIRP humana, se expresa en células T y células NK activadas. Puede unirse a CD47, aunque con una afinidad 10 veces menor en comparación con SIRPa. Además, la interacción SIRPg-CD47 media la adhesión célula-célula y apoya el contacto de células APC-T, mejorando la presentación de antígenos, la consiguiente proliferación de células T y la secreción de citoquinas. Es poco probable que el propio SIRPG genere señales intracelulares porque no tiene ningún motivo de señalización conocido. En cambio, SIRPG puede desencadenar la señalización de CD47 en APC.
[0366] Se generaron proteínas de fusión His SIRPB y SIRPG y se probó la unión de 1H9 y 3C2 a SIRPB y SIRPG. Como se muestra en la Figura 10, 1H9 y 3C2 unidos a SIRPB en comparación con el de Kwar (Figura 10 A). A diferencia de Kwar, no se detectó unión de 1H9 o 3C2 a SIRPG (Figura 10B). La falta de unión de SIRPG por 1H9 y 3C2 confiere las siguientes ventajas potenciales a estos anticuerpos con respecto a los anticuerpos anti-SIRPA de última generación: (1) SIRPA tiene una expresión más restringida con respecto a SIRPG, lo que reduce el riesgo de efectos fuera del objetivo, (2) hay un menor riesgo de toxicidad, por ejemplo, dada la especificidad aumentada para SIRPA, (3) hay un menor riesgo de desarrollar un fenómeno de "sumidero de antígenos" cuando se dosifica el anticuerpo en un sujeto, y (4) hay un menor riesgo de interferencia con la función de las células T y/o las células B por parte del anticuerpo.
Ejemplo 6: Generación y prueba de anticuerpos anti-SIRP-alfa adicionales
[0367] Se generaron anticuerpos adicionales contra SIRPa humana inmunizando ratones como se ha descrito anteriormente. Se designaron dos clones de anticuerpos monoclonales: 9B11 y 7E11, respectivamente. Ver SEQ ID NO 21-36 y 41-44. Las regiones variables de ratón se unieron como una quimera a la región Fc de IgG4 humana (designada como 7E11-G4 o 9B11-G4), o a una región Fc de IgG1 humana que comprende la mutación N297A para anular la interacción con los F<cy>R humanos (designada como 7E11-G1 o 9B11-G1).
[0368] Tal como se descubrió con 1H9 y 3C2, los anticuerpos 9B11 y 7E11 mostraron una respuesta sinérgica al potenciar la fagocitosis de las células cancerosas cuando se combinaron con Rituximab. Se muestra en la Figura 11, los macrófagos se diferenciaron de los monocitos del donante A (A) y del donante B (B) en presencia de suero humano durante 7 días. Las células Raji se marcaron con CFSE y se incubaron con los macrófagos en presencia de 10 pg/ml de rituximab (Rx) solo o en combinación con 10 pg/ml de 9B11-G4, 9B11-G1,7E11-G4 o 7E11-G1. Dos horas después, se calculó el porcentaje de fagocitosis mediante análisis de citometría de flujo en busca de macrófagos GFP+.
[0369] Los datos muestran que, aunque tanto los anticuerpos con formato IgG4 como los anticuerpos con formato IgG1 mutado podrían proporcionar una respuesta sinérgica, el formato IgG1 mutado proporcionó una respuesta más uniforme entre los donantes.
[0370] Para determinar los epítopos reconocidos por 9B11 y 7E11, se revistió proteína de fusión SIRPa-Fc humana en una placa de 96 pocillos. La unión de SIRPa con 9B11 y 7E11 se midió en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de un anticuerpo anti-SIRPa, KWar (divulgado en la solicitud internacional WO 2015/138600). Como se muestra en la Figura 12, 7E11 reconoce un epítopo superpuesto en comparación con Kwar (similar a 3C2) y 9B11 reconoce un epítopo muy similar o idéntico en comparación con Kwar.
Ejemplo 7: Unión de HulH9-G1 a diferentes variantes de SIRP-Alfa en células humanas primarias
[0371] La SIRP-a humana es altamente polimórfica en el dominio IgV, sin embargo, la mayoría de las variantes son la variante 1 (V1) y la variante 2 (V2).
[0372] Se seleccionaron y genotiparon 22 donantes humanos normales y se identificaron los donantes con estado homocigoto V1, homocigoto V2 y heterocigoto V1/V5 para SIPR-alfa. (El polimorfismo en Sirpa modula el injerto de células madre hematopoyéticas humanas. Nature Immunology, 8; 1313, 2007; como referencia: la secuencia V1 se muestra en la SEQ ID NO: 48; la secuencia V2 se muestra en la SEQ ID NO: 49). Se probó 1H9 humanizado y se descubrió que se unía a cada uno de los alelos V1, V2 y V1/V5 usando los monocitos y los macrófagos de los donantes (Figura 13). Estos datos indican que puede usarse el 1H9 humanizado en una amplia variedad de humanos dada su capacidad para unirse a múltiples variantes distintas de SIRP-alfa en células de donantes humanos primarios.
Ejemplo 8: HulH9-G1 bloquea la unión de CD47 a monocitos de diferentes donantes
[0373] A continuación, se probó 1H9-G1 humanizado para determinar si puede bloquear la interacción de CD47 y SIRP-alfa que se expresa como variantes diferentes. Los monocitos se aislaron de donantes que expresaban V1, V2 y V1/V5 y se incubaron con proteína de fusión CD47-Fc en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de 1H9 humanizado (Figura 14). Los datos muestran que el 1H9 humanizado bloqueó la interacción de CD47 y SIRP-alfa de manera dependiente de la dosis, y las actividades de bloqueo fueron comparables entre las diferentes variantes de SIRP-alfa probadas.
Ejemplo 9: HulH9-G1 actúa en sinergia con cetuximab para promover la fagocitosis entre diferentes donantes[0374] Se realizó fagocitosis in vitro usando macrófagos diferenciados de diferentes donantes. 1H9-G1 humanizado hizo sinergia con cetuximab para promover la fagocitosis en donantes que tienen variantes V1, V2 y V1/V5 (Figura 15).
Ejemplo 10: Internalización de HulH9-G1
[0375] La internalización de 1H9 humanizado se probó incubando 10 ug/ml del anticuerpo con células macrófagas diferenciadas de sangre humana normal a 37° C. A continuación, las células se fijaron y permeabilizaron en cada punto de tiempo (0, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h y 24 h). Se usó anticuerpo IgG1 antihumano marcado con PE para detectar 1H9. Se usó DAPI para teñir los núcleos. Se usó incubación a 4° C como control para la tinción superficial de 1H9.
[0376] Los datos muestran que el 1H9 humanizado no se internaliza en las células y la tinción superficial de 1H9 fue detectable en cada punto de tiempo, incluyendo las 24 horas (datos no mostrados). Estos datos indican que el 1H9 humanizado es estable en la superficie celular, lo que puede ser indicativo de una mayor eficacia terapéutica in vivo.
TABLA A - SECUENCIAS
(Continuación)
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(Continuación)
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humanizado aislado, que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:7 y una secuencia VLde la SEQ ID NO:8.
2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende: una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 18.
3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo comprende una región Fc humana con funciones dependientes de Fc reducidas, que comprende opcionalmente por lo menos una modificación que reduce la unión a un receptor Fc humano.
4. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la modificación de la región Fc humana comprende:
(a) una modificación en la posición del índice EU asparagina 297,
(b) una sustitución de aminoácido N297A, numeración de acuerdo con el índice EU,
(c) una o más sustituciones de aminoácidos en: N297A; L234A/L235A; C220S/C226S/C229S/P238S; C226S/C229S/E3233P/L234V/L235A; o L234F/L235E/P331S, numeración de acuerdo con el índice EU, o (d) una o más sustituciones de aminoácidos en: N297; L234/L235; C220/C226/C229/P238; C226/C229/E3233/L234/L235; o L234/L235/P331, numeración de acuerdo con el índice EU.
5. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
(a) el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, y/o
(b) el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico, opcionalmente un anticuerpo biespecífico, y/o
(e) el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de la clase IgG y una subclase seleccionada de IgG1, IgG4, IgG2 e IgG3.
6. Un polinucleótido aislado o un conjunto de polinucleótidos que codifican el anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, una V<h>y una V<l>del mismo, una cadena ligera y una cadena pesada del mismo, o una porción de unión a antígeno del mismo.
7. Un vector o conjunto de vectores que comprende el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos de la reivindicación 6.
8. Una célula huésped que comprende el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos de la reivindicación 6 o el vector o conjunto de vectores de la reivindicación 7.
9. Un método para producir un anticuerpo que comprende expresar el anticuerpo con la célula huésped de la reivindicación 8 y aislar el anticuerpo expresado.
10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o la composición farmacéutica de la reivindicación 10, para su uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección en un sujeto con necesidad de ello, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o una composición farmacéutica de la reivindicación 10.
12. El anticuerpo o composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 11, en donde la enfermedad o afección se selecciona de:
(a) cáncer;
(b) infección;
(e) una infección viral;
(d) una bacteria! infección;
(e) una infección fúngica;
(f) fibrosis;
(g) arterioesclerosis;
(h) una infección parasitaria, opcionalmente malaria.
13. El anticuerpo o composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 12, en donde la enfermedad o afección es un cáncer, y el cáncer se selecciona de un tumor sólido y un tumor hematológico.
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Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
WO2017121771A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Blink Biomedical Sas Humanized, mouse or chimeric anti-cd47 monoclonal antibodies
JOP20190009A1 (ar) 2016-09-21 2019-01-27 Alx Oncology Inc أجسام مضادة ضد بروتين ألفا منظم للإشارات وطرق استخدامها
CN118027200A (zh) 2016-12-09 2024-05-14 艾利妥 抗SIRPα抗体及其使用方法
JP7160833B2 (ja) 2017-04-13 2022-10-25 サイロパ ビー．ブイ． 抗ｓｉｒｐアルファ抗体
MX2020000957A (es) 2017-07-26 2020-07-22 Forty Seven Inc Anticuerpos anti-sirp-alfa y metodos relacionados.
SI3752190T1 (sl) 2018-02-12 2022-11-30 Forty Seven, Inc. Shema zdravljenja proti raku z uporabo protiteles proti CD47 in proti CD20
WO2019183266A1 (en) 2018-03-21 2019-09-26 ALX Oncology Inc. Antibodies against signal-regulatory protein alpha and methods of use
CN110386984B (zh) * 2018-04-17 2022-04-22 杭州尚健生物技术有限公司 结合cd47蛋白的融合蛋白及其应用
WO2019217942A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Beam Therapeutics Inc. Methods of substituting pathogenic amino acids using programmable base editor systems
JP7337099B2 (ja) 2018-05-25 2023-09-01 アレクトル エルエルシー 抗ｓｉｒｐａ抗体およびその使用法
US11591390B2 (en) 2018-09-27 2023-02-28 Celgene Corporation SIRP-α binding proteins and methods of use thereof
TW202028237A (zh) 2018-09-27 2020-08-01 美商西建公司 SIRPα結合蛋白及其使用方法
WO2020097193A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptors for phagocytosis
KR20210094610A (ko) 2018-11-26 2021-07-29 포티 세븐, 인코포레이티드 c-Kit에 대한 인간화 항체
US11026973B2 (en) 2019-04-30 2021-06-08 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof
CA3140639A1 (en) * 2019-05-24 2020-12-03 Forty Seven, Inc. Regimes for co-administration of immunotherapeutic agents against c-kit and cd47
MA56119A (fr) 2019-06-07 2022-04-13 Alx Oncology Inc Procédés et réactifs pour réduire les interférences de médicaments se liant au cd47 dans des dosages sérologiques
EP3990476A1 (en) 2019-06-25 2022-05-04 Gilead Sciences, Inc. Flt3l-fc fusion proteins and methods of use
US20220288118A1 (en) * 2019-07-31 2022-09-15 Forty Seven, Inc. Depletion regimes for engineered t-cell or nk-cell therapy
AU2020286285A1 (en) * 2019-08-20 2021-03-11 Elpiscience (Suzhou) Biopharma, Ltd. Novel anti-SIRPa antibodies
JP2022546592A (ja) 2019-09-03 2022-11-04 マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド ゲノム組込みのための方法および組成物
AU2020365113A1 (en) 2019-10-18 2022-04-07 Forty Seven, LLC Combination therapies for treating myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia
JP2022552748A (ja) 2019-10-31 2022-12-19 フォーティ セブン， インコーポレイテッド 抗ｃｄ４７及び抗ｃｄ２０による血液癌の治療
CA3162633A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating cancer
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
CA3165735A1 (en) 2019-12-24 2021-07-01 Carna Biosciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
CN116769031A (zh) * 2019-12-24 2023-09-19 礼新医药科技(上海)有限公司 抗SIRPα单克隆抗体及其用途
MX2022009947A (es) 2020-02-14 2022-11-07 Jounce Therapeutics Inc Anticuerpos y proteinas de fusion que se unen a ccr8 y usos de estos.
TW202214303A (zh) 2020-05-19 2022-04-16 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 用於癌症治療之結合分子
EP4157315A1 (en) 2020-06-01 2023-04-05 ALX Oncology Inc. Combination therapies comprising a hypomethylation agent for treating cancer
WO2022048616A1 (zh) * 2020-09-04 2022-03-10 江苏恒瑞医药股份有限公司 SIRPγ变体及其融合蛋白
TW202406932A (zh) 2020-10-22 2024-02-16 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
US20240016787A1 (en) 2020-11-03 2024-01-18 Rdiscovery, LLC Methods for treatment of cancer and phagocytosis-deficiency related diseases
JP2023549140A (ja) 2020-11-04 2023-11-22 マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド 操作されたキメラ融合タンパク質組成物およびその使用方法
WO2022110922A1 (zh) * 2020-11-30 2022-06-02 启愈生物技术(上海)有限公司 抗SIRPα抗体或其抗原结合片段及应用
JP2023552375A (ja) 2020-12-06 2023-12-15 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド 血清学的アッセイにおいてｃｄ４７に結合する薬物の干渉を低減するための多量体
CN112574310B (zh) 2020-12-11 2023-05-05 浙江博锐生物制药有限公司 抗SIRPα抗体及其用途
TW202302145A (zh) 2021-04-14 2023-01-16 美商基利科學股份有限公司 ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合及ＮＥＤＤ８活化酶Ｅ１調節次單元之共抑制以用於治療癌症
CA3216908A1 (en) 2021-05-13 2022-11-17 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating cancer
TW202313094A (zh) 2021-05-18 2023-04-01 美商基利科學股份有限公司 使用ＦＬＴ３Ｌ—Ｆｃ融合蛋白之方法
TW202317620A (zh) 2021-06-04 2023-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 抗ＳＩＲＰα抗體
KR20240023629A (ko) 2021-06-23 2024-02-22 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 디아실글리세롤 키나제 조절 화합물
JP2024524210A (ja) 2021-06-23 2024-07-05 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ジアシルグリセロールキナーゼ調節化合物
US11926628B2 (en) 2021-06-23 2024-03-12 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
AU2022297373A1 (en) 2021-06-23 2024-01-04 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
IL309405A (en) 2021-06-29 2024-02-01 Seagen Inc Methods for treating cancer with a combination of non-fucosylated anti-CD70 antibody and CD47 antagonist
BR112024002199A2 (pt) 2021-08-05 2024-04-30 Immunos Therapeutics Ag Medicamentos de combinação compreendendo proteínas de fusão do hla
WO2023020459A1 (zh) * 2021-08-17 2023-02-23 杭州九源基因工程有限公司 靶向SIRPα的单克隆抗体及其用途
JP2024539252A (ja) 2021-10-28 2024-10-28 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ピリジジン－３（２ｈ）－オン誘導体
IL312107A (en) 2021-10-29 2024-06-01 Gilead Sciences Inc CD73 compounds
AU2022417491A1 (en) 2021-12-22 2024-05-23 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023122581A2 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
IL315083A (en) 2022-03-17 2024-10-01 Gilead Sciences Inc The IKAROS family of zinc fingers degrades and uses them
AU2023240346A1 (en) 2022-03-24 2024-09-19 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
TW202345901A (zh) 2022-04-05 2023-12-01 美商基利科學股份有限公司 用於治療結腸直腸癌之組合療法
AU2023256670A1 (en) 2022-04-21 2024-10-17 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
WO2023213763A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab
AU2023281712A1 (en) 2022-06-01 2024-11-28 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating urothelial carcinoma
WO2024003353A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Transgene Fusion protein comprising a surfactant-protein-d and a member of the tnfsf
US20240116928A1 (en) 2022-07-01 2024-04-11 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
US20240091351A1 (en) 2022-09-21 2024-03-21 Gilead Sciences, Inc. FOCAL IONIZING RADIATION AND CD47/SIRPa DISRUPTION ANTICANCER COMBINATION THERAPY
WO2024105180A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Boehringer Ingelheim International Gmbh Predictive efficacy biomarkers for anti-sirpa antibodies
US20240254118A1 (en) 2022-12-22 2024-08-01 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2024167830A2 (en) * 2023-02-06 2024-08-15 Apeximmune Therapeutics Inc. ANTI-SIRPα ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2024165671A1 (en) 2023-02-08 2024-08-15 Immunos Therapeutics Ag FUSION PROTEINS OF ß2 MICROGLOBULIN, HLA HEAVY CHAIN POLYPEPTIDES, AND INHIBITOR OF CD47-SIRPA
WO2024215754A1 (en) 2023-04-11 2024-10-17 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
WO2024220917A1 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof

Family Cites Families (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL97459A0 (en) 1990-03-09 1992-06-21 Hybritech Inc Trifunctional antibody-like compounds as a combined diagnostic and therapeutic agent
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ATE503496T1 (de) 1992-02-06 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker
WO1993016177A1 (en) 1992-02-11 1993-08-19 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
CA2259122A1 (en) 1996-06-17 1997-12-24 Max Planck Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Novel ptp-20, pcp-2, bdp1, clk and sirp proteins and related products and methods
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
CA2226962A1 (en) 1998-02-16 1999-08-16 Marie Sarfati Use of binding agents to cd47 and its ligands in the treatment or the prophylaxis of various inflammatory, autoimmune and allergic diseases and in the treatment of graft rejection
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
WO2000024869A2 (en) 1998-10-23 2000-05-04 Yale University Methods for modulating cell fusion
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
ES2601882T5 (es) 1999-04-09 2021-06-07 Kyowa Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
EP1048299A1 (en) 1999-04-28 2000-11-02 Faculteit der Geneeskunde van de Vrije Universiteit Method for inhibiting cell functioning for use in anti-inflammatory and anti-tumour therapies
US7527787B2 (en) 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
US7534866B2 (en) 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US7550143B2 (en) 2005-04-06 2009-06-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US7504256B1 (en) 1999-10-19 2009-03-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing polypeptide
EP1244707A1 (de) 1999-11-30 2002-10-02 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Antikörper gegen signal-regulator-proteine
GB9930706D0 (en) 1999-12-24 2000-02-16 Medical Res Council Composition for inhibiting macrophage activity
GB0021484D0 (en) 2000-09-01 2000-10-18 Boehringer Ingelheim Pharma Method for identifying substances which positively influence inflammatory conditions of chronic inflammatory airway diseases
CA2358061A1 (en) 2000-09-08 2002-03-08 Stemcell Technologies Inc. Novel antibody compositions for the negative selection of specific rat leukocyte subsets
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
ES2620359T3 (es) 2000-10-06 2017-06-28 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células que producen unas composiciones de anticuerpo
ATE498718T1 (de) 2000-12-18 2011-03-15 Dyax Corp Gerichtete bibliotheken die genetisch verpackt sind
AU2002339845B2 (en) 2001-08-03 2009-03-26 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
GB0124145D0 (en) 2001-10-08 2001-11-28 Bayer Ag Genes and proteins for prevention,prediction,prognosis and therapy of cardiovascular disease
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20030215914A1 (en) 2001-12-10 2003-11-20 Erwin Houtzager Structure for presenting desired peptide sequences
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JPWO2003085119A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物のＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合活性を高める方法
WO2003084569A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition anticorps
AU2003236020B2 (en) 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
KR20050000380A (ko) 2002-04-09 2005-01-03 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 게놈이 개변된 세포
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
EP1578364A4 (en) 2002-09-16 2011-06-08 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING IMMUNE DISEASES
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP2289936B1 (en) 2002-12-16 2017-05-31 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
US8613922B2 (en) 2003-04-24 2013-12-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods for inhibiting diabetic retinopathy with an antibody against integrin associated protein (IAP)
US20040213792A1 (en) 2003-04-24 2004-10-28 Clemmons David R. Method for inhibiting cellular activation by insulin-like growth factor-1
JP3936673B2 (ja) 2003-06-02 2007-06-27 国立大学法人群馬大学 Ｃｄ４７部分ペプチドと抗ｓｈｐｓ−１モノクロナール抗体
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
LT2348051T (lt) 2003-11-05 2019-02-25 Roche Glycart Ag Cd20 antikūnai su padidintu fc receptoriaus prisijungimo giminingumu ir efektorine funkcija
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
WO2006107617A2 (en) 2005-04-06 2006-10-12 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
EP2067789A1 (en) 2004-04-13 2009-06-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-P selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2627981A1 (en) 2005-11-07 2007-05-18 The Rockefeller University Reagents, methods and systems for selecting a cytotoxic antibody or variant thereof
NZ572379A (en) 2006-04-05 2012-06-29 Univ Rockefeller Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
DK2059533T3 (da) 2006-08-30 2013-02-25 Genentech Inc Multispecifikke antistoffer
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
DK3124497T3 (da) 2007-09-14 2020-05-11 Adimab Llc Rationelt designede syntetiske antistofbiblioteker og anvendelser deraf
CA2702217A1 (en) 2007-10-11 2009-04-16 Jayne Danska Modulation of sirp.alpha. - cd47 interaction for increasing human hematopoietic stem cell engraftment and compounds therefor
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
EP3043181B1 (en) 2008-01-15 2020-04-08 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Markers of acute myeloid leukemia stem cells
WO2009091601A1 (en) 2008-01-15 2009-07-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47
EP2111869A1 (en) 2008-04-23 2009-10-28 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Compositions and methods to enhance the immune system
BRPI0923442A2 (pt) 2008-12-19 2016-01-12 Novartis Ag polipeptídeos solúveis para uso em tratamento de distúrbio autoimunes e inflamatórios.
DK2429574T3 (da) 2009-05-15 2015-06-22 Univ Health Network Sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af hæmatologiske cancere der targeterer sirp-cd47-interaktionen
BR112012013038A2 (pt) 2009-11-30 2016-10-25 Janssen Biotech Inc mutantes fc de anticorpo com funções efetoras ablacionadas
EP2516458A1 (en) 2009-12-22 2012-10-31 Novartis AG Tetravalent cd47-antibody constant region fusion protein for use in therapy
KR101593262B1 (ko) 2009-12-22 2016-02-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 서열 의존 응집
EP2609194B1 (en) 2010-08-27 2019-01-16 University Health Network Methods for enriching pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte progenitor cells and cardiomyocyte cells based on sirpa expression
WO2012162741A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Monash University Enrichment of cardiomyocytes
WO2013056352A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 University Health Network Antibodies and antibody fragments targeting sirp-alpha and their use in treating hematologic cancers
PL3721888T3 (pl) 2013-02-05 2023-04-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Terapie ukierunkowane na cd47 w leczeniu choroby zakaźnej
ES2898627T3 (es) 2013-04-29 2022-03-08 Univ Leland Stanford Junior Uso de agentes anti-CD47 para mejorar la inmunización
CN103665165B (zh) 2013-08-28 2016-02-24 江苏匡亚生物医药科技有限公司 一种靶向人CD47-SIRPα信号通路的双特异性抗体及其制备方法和用途
WO2015041987A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modulation of efferocytosis pathways for treatment of atherosclerotic disease
CA2931641C (en) 2013-12-30 2022-05-10 Epimab Biotherapeutics Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
CN106456749B (zh) * 2014-03-11 2021-03-30 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗SIRPα抗体和双特异性巨噬细胞增强型抗体
US10144916B2 (en) 2014-05-09 2018-12-04 Becton, Dickinson And Company Cell surface signature for processing cardiomyocyte subsets from heterogeneous cell samples
WO2016005548A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing hematological cancers
WO2016205042A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University SIRPα AGONIST ANTIBODY
JP7078533B2 (ja) * 2015-10-21 2022-05-31 オーエスイー イムノセラピューティクス 炎症促進性細胞へのマクロファージ分極を改変して癌を治療するための抗ＳＩＲＰａ化合物
WO2017121771A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Blink Biomedical Sas Humanized, mouse or chimeric anti-cd47 monoclonal antibodies
DK3443010T3 (da) * 2016-04-14 2024-09-30 Ose Immunotherapeutics Nye anti-SIRPa-antistoffer og terapeutiske anvendelser deraf
EP3493845A4 (en) 2016-08-03 2020-04-15 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University INTERRUPTION OF FC RECEPTOR USE ON MACROPHAGES TO IMPROVE THE EFFECTIVENESS OF ANTI-SIRPALPHA ANTIBODY THERAPY
MX2020000957A (es) 2017-07-26 2020-07-22 Forty Seven Inc Anticuerpos anti-sirp-alfa y metodos relacionados.

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