[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

ES2876232T3 - Biomarcador para predecir la sensibilidad al inhibidor de proteína quinasa y uso de este - Google Patents

Biomarcador para predecir la sensibilidad al inhibidor de proteína quinasa y uso de este Download PDF

Info

Publication number
ES2876232T3
ES2876232T3 ES15837406T ES15837406T ES2876232T3 ES 2876232 T3 ES2876232 T3 ES 2876232T3 ES 15837406 T ES15837406 T ES 15837406T ES 15837406 T ES15837406 T ES 15837406T ES 2876232 T3 ES2876232 T3 ES 2876232T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
ron
cancer
active
expression
mutant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15837406T
Other languages
English (en)
Inventor
Dong Hoon Jin
Seung Woo Hong
Jai Hee Moon
Jae Sik Shin
Seung Mi Kim
Eun Kyung Choi
Jeong Eun Kim
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wellmarker Bio Co Ltd
Original Assignee
Wellmarker Bio Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wellmarker Bio Co Ltd filed Critical Wellmarker Bio Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2876232T3 publication Critical patent/ES2876232T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Un método para predecir la sensibilidad de un paciente en cuestión con cáncer a un inhibidor de la proteína quinasa c-MET que comprende: (a) medir el nivel de expresión de un Recepteur d'Origine Nantais (RON) en una forma activa que comprende una variante de corte y empalme o mutante del gen RON dentro de una muestra biológica que se obtiene de un sujeto mediante un método de detección por el uso de un agente seleccionado de un oligonucleótido antisentido, un par de cebadores, o una sonda que se une específicamente al ARNm del RON activo o un anticuerpo, un péptido o un nucleótido que se une específicamente a la proteína RON activa; y (b) determinar la sensibilidad del sujeto a un inhibidor de la proteína quinasa en base al resultado que se midió en la etapa (a).

Description

DESCRIPCIÓN
Biomarcador para predecir la sensibilidad al inhibidor de proteína quinasa y uso de este
[Campo técnico]
La presente descripción se refiere a un biomarcador para predecir la sensibilidad a un inhibidor de la proteína quinasa y un uso de este como se define en las reivindicaciones.
[Antecedentes de la técnica]
Generalmente, con respecto a la terapia antineoplásica, la reactividad in vivo a un fármaco antineoplásico depende en gran medida de la sensibilidad al fármaco de las células cancerosas, a las que se dirige el fármaco. Tal sensibilidad de las células cancerosas a un fármaco determinado varía mucho de una célula cancerosa a otra. La sensibilidad de las células cancerosas se atribuye a la diferencia cuantitativa o cualitativa en las moléculas diana del fármaco o factores implicados en el mismo, a la adquisición de resistencia al fármaco, etcétera. En base a tales antecedentes, será muy beneficioso confirmar el cambio genético de las células cancerosas, que aparece específicamente cuando las células cancerosas exhiben la sensibilidad a un fármaco antineoplásico dado, porque la confirmación permitiría la determinación temprana del efecto de un fármaco, el establecimiento de terapias, la selección de una nueva terapia, etcétera. Adicionalmente, sería muy útil desde el punto de vista clínico para medir la presencia de la sensibilidad de una célula cancerosa determinada a un fármaco, en base al cambio genético, mediante el tratamiento de la célula cancerosa con el fármaco después de separar la célula cancerosa del tejido canceroso, que se obtiene antes del tratamiento, del tejido de la biopsia, etcétera, de acuerdo con un método convencional, porque la medición permitiría predecir la eficacia del fármaco en el tratamiento.
Mientras tanto, una proteína quinasa es una enzima que regula la actividad, la ubicación y la función de otras proteínas mediante fosforilación, controlando de esta manera los diversos procesos intracelulares. Las anormalidades en la función de la proteína quinasa se asocian estrechamente con mecanismos de enfermedades tales como el cáncer, enfermedades inmunitarias, enfermedades neurológicas, enfermedades metabólicas, infecciones, etcétera. Los ejemplos de proteínas quinasas pueden incluir Abl, ACK, ALK, Arg, ARK5, Aurora, Axl, Bmx, BTK, CDK, CHK, c-Kit, c-MET, c-RAF, c-SRC, EGFR, FAK, Fes, FGFR, Flt3, GSK3, IGF, IKK, JAK, Lck, LIMK, Lyn, MEK, Mer, MK-2, P38alfa, PDGFR, PDK, Pim, PKA, PKB, PKCR, Plk-1/3, Ret, RON, Ros, Rse, Tie, Trk, Tyro3, VEGFR, YES, etcétera.
Entre estos, con respecto a c-MET, la activación aberrante de c-MET se asociada estrechamente con el deterioro del pronóstico del tratamiento antineoplásico, y la sobreexpresión y la mutación de c-MET se observan en diversos tipos de cáncer tales como el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Dado que la invasión y metástasis de un tumor es una de las principales causas de muerte en pacientes con cáncer, se espera que la inhibición de la señalización de c-MET sea eficaz para el tratamiento del cáncer.
Recepteur d'Origine Nantais (RON) es una proteína receptor que pertenece a la serie MET (c-MET). Se secreta en el hígado y es el receptor de una proteína sérica (proteína estimulante de macrófagos (MSP), que regula las acciones de los macrófagos (Zhou YQ, He C, Chen YQ, Wang D, Wang MH: Altered expression of the RON receptor tyrosine kinase in primary human colorectal adenocarcinomas: generation of different splicing RON variants and their oncogenic potential. Oncogene 2003, 22 (2): 186 - 197). La expresión de RON se regula anormalmente en el cáncer de mama y en el cáncer colorrectal, y específicamente, se asocia estrechamente con la metástasis del cáncer colorrectal. El grado de actividad de RON se regula mediante corte y empalme alternativo, que es uno de los procesos principales en la regulación de la expresión génica de los organismos eucariotas. Las variantes de corte y empalme de rOn RONA155, RONA160, y RONA165 descritas en Dussault y otros, (Anti-cancer agents in medicinal chemistry, vol.9, núm. 2, 1 Febrero 2009, páginas 221-229) son las formas generadas por la omisión de exones mediante tal corte y empalme y siempre están en un estado estructuralmente activo incluso sin un ligando. Pero ninguno de estos documentos sugiere cualquier correlación entre la activación de RON y la sensibilidad a la quinasa c-MET.
Adicionalmente, la mutación del gen RON se correlaciona con la aparición y el grado de diversos tipos de cáncer. CJ12495, CJ12537, CJ12524, y CJ12567, que se describen en la patente coreana núm. 10-1350006, son fármacos antineoplásicos capaces de inhibir la proliferación anormal de células cancerosas y son inhibidores capaces de inhibir las actividades de las proteínas quinasas.
Como se describió anteriormente, los medicamentos antineoplásicos muestran diferencias individuales con respecto a la resistencia y la toxicidad y tienen el problema de que más de aproximadamente la mitad de los pacientes muestran resistencia y, por lo tanto, la selección de un marcador que reaccione al tratamiento adecuado puede producir una mejora innovadora. En consecuencia, en la actualidad se desarrollan de forma activa y continuada estudios sobre la reactividad al tratamiento de fármacos individuales contra el cáncer de acuerdo con genes particulares.
Sin embargo, el logro es aun insignificante debido a las acciones complejas de los factores asociados con las reacciones in vivo a los fármacos particulares, a la diversidad de fármacos de tratamiento y a los modos de administración y a las dificultades para obtener muestras suficientes.
[Invención y Descripción]
[Problema técnico]
En estas circunstancias, los presentes inventores se han esforzado por desarrollar un biomarcador capaz de predecir la sensibilidad a un inhibidor de la proteína quinasa, que es un fármaco antineoplásico contra el cáncer de colon. Como resultado, analizaron variantes y mutantes del gen RON y la sensibilidad de acuerdo con la activación del gen RON y confirmaron que el grado de disminución en el tamaño y peso de la célula cancerosa por la sensibilidad a un fármaco en particular variaba en las células de cáncer de colon de acuerdo con las características de activación o expresión de RON de las variantes y mutantes del gen RON, de esta manera se completa la presente descripción.
Por consiguiente, en un objeto, la presente descripción proporciona un biomarcador para predecir la sensibilidad a los inhibidores de proteína quinasa, una composición, un kit y un método de estos.
[Solución técnica]
La presente invención se refiere a la materia de las reivindicaciones.
Para lograr el objeto anterior, un objeto de la presente descripción proporciona un biomarcador para predecir la sensibilidad a los inhibidores de proteína quinasa, que incluye el Recepteur d'Origine Nantais (RON) activo.
Adicionalmente, la presente descripción proporciona una composición para predecir la sensibilidad a los inhibidores de proteína quinasa, que contiene un agente para medir el nivel de expresión de RON activo.
Adicionalmente, la presente descripción proporciona un kit para predecir la sensibilidad a un inhibidor de proteína quinasa que incluye la composición.
Adicionalmente, la presente descripción proporciona un método para predecir la sensibilidad a un inhibidor de proteína quinasa.
[Efectos ventajosos de la invención y descripción]
El uso del biomarcador de la presente descripción para predecir la sensibilidad a los inhibidores de proteína quinasa puede determinar con certeza la sensibilidad de un paciente individual antes del inicio del tratamiento y, por lo tanto, es posible seleccionar un fármaco antineoplásico con un alto efecto terapéutico. Adicionalmente, puede evitarse el uso de medicamentos antineoplásicos sin un efecto notable y, por lo tanto, pueden prevenirse efectos secundarios innecesarios.
[Descripción de las Figuras]
La Figura 1a muestra los resultados de RT-PCR para variantes de RON de tipo silvestre o RONA155 o RONA160 en líneas celulares de cáncer de colon (HT29, colo320hsr y MKN28) y una muestra de un paciente con cáncer de colon. La Figura 1b muestra los resultados de la transferencia western e inmunoprecipitación (IP) para variantes de RON de tipo silvestre o RONA155 o RONA160 en líneas celulares de cáncer de colon (HT29, colo320hsr y MKN28) y una muestra de un paciente con cáncer de colon. La Figura 1c muestra los resultados de IHC para P-RON en una muestra de un paciente con cáncer de colon.
La Figura 2a muestra un diagrama esquemático que ilustra el proceso de una prueba de sensibilidad a fármacos en un modelo PDX. La Figura 2b muestra los resultados de la medición del tamaño tumoral en un caso en el que la muestra 116, que es una muestra de un paciente con cáncer de colon que se determinó que era positiva con respecto a las variantes de RON durante el proceso de preparación del modelo PDX, se trasplantó, y el tamaño tumoral en un caso en el que se trasplantó la muestra 130, que no se determinó como positiva con respecto a las variantes de RON durante el proceso de preparación del modelo PDX.
La Figura 3a muestra las imágenes de tejido de cáncer formado en un ratón desnudo cuando se administró CJ12567 en un modelo de xenoinjerto de tejido de cáncer de colon derivado de paciente (PDX-modelo), que es un ratón desnudo trasplantado con las muestras 87 y 116 de pacientes con cáncer de colon. La Figura 3b muestra los resultados de la medición del tamaño de los tejidos tumorales que se obtienen de los ratones anteriores. La Figura 3c muestra los resultados de la medición del peso de los tejidos tumorales que se obtienen de los ratones anteriores. La Figura 3d muestra los resultados de IHC de los tejidos tumorales que se obtienen de los ratones anteriores. La Figura 3e muestra los resultados de la transferencia western de los tejidos tumorales que se obtienen de los ratones anteriores.
La Figura 4a muestra la inhibición de la fosforilación de RON por CJ12495. La Figura 4b muestra la inhibición de la fosforilación de RON en una célula a la que se introdujo un gen mutante de RON. La Figura 4c muestra la inhibición de la fosforilación de RON en una variante del gen RON.
La Figura 5a muestra la inhibición de la motilidad celular por CJ12495. La Figura 5b muestra la inhibición de la motilidad celular en una célula a la que se introdujo un gen mutante de RON. La Figura 5c muestra la inhibición de la motilidad celular en una variante del gen RON.
La Figura 6a muestra la inhibición de la metástasis celular por CJ12495. La Figura 6b muestra la inhibición de la metástasis celular en una célula a la que se introdujo un gen mutante de RON. La Figura 6c muestra la inhibición de la metástasis celular en una variante del gen RON.
La Figura 7a muestra la inhibición de la fosforilación de RON por CJ12524. La Figura 7b muestra la inhibición de la fosforilación de RON en una variante del gen RON. La Figura 7c muestra la apoptosis mediada por CJ12524. La Figura 7d muestra la apoptosis en una variante del gen RON. La Figura 7e muestra la inhibición de la metástasis celular por CJ12524.
La Figura 8a muestra los resultados de la medición del tamaño y peso de los tejidos tumorales que se obtienen de los ratones después de la administración de CJ12524 en un modelo de xenoinjerto de células cancerosas con RON activo. La Figura 8b muestra las imágenes del tamaño de los tejidos tumorales formados en los ratones. La Figura 8c muestra los resultados de IHC de los tejidos tumorales que se obtienen de los ratones. La Figura 8d muestra los resultados de la transferencia western de los tejidos tumorales que se obtienen de los ratones. La Figura 9 muestra los resultados de la medición del volumen tumoral después de la administración de CJ12537 en un modelo de xenoinjerto de células de cáncer de estómago con RON inactivo.
[Descripción detallada de la invención y la descripción]
A continuación, la presente descripción se explica con mayor detalle. La presente invención se refiere a la materia de las reivindicaciones.
En un aspecto, la presente descripción proporciona un biomarcador para predecir la sensibilidad a los inhibidores de proteína quinasa, que incluye el Recepteur d'Origine Nantais (RON) activo.
Como se usa en la presente descripción, el término "Recepteur d'Origine Nantais (RON)" se refiere a una proteína receptor que pertenece a la serie MET (c-MET), que se secreta en el hígado y actúa como receptor para una proteína sérica (proteína estimulante de macrófagos, MSP), que regula las acciones de los macrófagos. La proteína RON y el gen RON se conocen en la técnica y pueden obtenerse a partir de una base de datos conocida. Específicamente, las secuencias de la proteína RON pueden ser las descritas en GenBank Núm. NP_002438.2 y las secuencias de los genes RON pueden ser las descritas en GenBank Núm. NM_002447.1.
En la presente descripción, se confirmó que la sensibilidad a un inhibidor de proteína quinasa aumenta cuando RON está en un estado activado o presente en una forma activa. Por consiguiente, el rOn activo puede usarse como biomarcador. El RON activo puede entenderse como un concepto que abarca todo lo que puede confirmarse como la forma activa en todos los niveles de expresión, tales como niveles de ADN, ARNm, proteína, etcétera. En una modalidad ilustrativa, el RON activo puede ser RON con fosforilación, por ejemplo, el RON activo puede estar presente en una forma en la que la proteína RON está fosforilada en el dominio quinasa, por lo tanto, está presente en una forma activa, o el RON activo puede estar en una forma que se indujo a una forma activa en presencia de un ligando tal como MSP. Adicionalmente, el RON activo puede incluir una variante de corte y empalme o un mutante del gen RON, en el que el RON siempre está en forma activada.
Por consiguiente, en una modalidad ilustrativa, la presente descripción proporciona un biomarcador para predecir la sensibilidad a los inhibidores de proteína quinasa, que incluye una variante de corte y empalme o mutante del gen RON.
Como se usa en la presente descripción, el término "variante" se refiere a una isoforma de RON que se formó mediante la deleción de las regiones del exón del gen correspondiente mediante corte y empalme alternativo.
En una modalidad preferida de la presente descripción, la variante de la presente descripción puede ser una en la que al menos uno seleccionado del grupo que consiste en los exones 5, 6 y 11 del gen RON se elimina mediante corte y empalme alternativo. Con mayor preferencia, la variante de la presente invención puede ser RONA155 (una variante en la que se eliminan los exones 5, 6 y 11 del gen RON), RONA160 (una variante en la que se eliminan los exones 5 y 6 del gen RON), o RONA165 (una variante en la que se elimina el exón 11 del gen RON).
La variante RONA155 del gen RON está representada por la SEQ ID NO: 1, RONA160 por la SEQ ID NO: 2 y RONA165 por la SEQ ID NO: 3.
De acuerdo con la presente descripción, las variantes de corte y empalme, en las que los exones se eliminan mediante un mecanismo de corte y empalme alternativo del gen RON, se descubren con frecuencia específicamente en células y tejidos de pacientes con cáncer de colon humano, y su sensibilidad a los fármacos varía de acuerdo a su expresión.
Como se usa en la presente descripción, el término "mutante" incluye aquellos en los que los nucleótidos o una secuencia de aminoácidos del gen correspondiente experimentaron sustitución, deleción, inserción, amplificación y reordenamiento de bases. La modificación de nucleótidos indica un cambio en la secuencia de nucleótidos con respecto a la secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre), por ejemplo, inserción, deleción, inversión o sustitución de al menos un nucleótido, tal como polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Este término, a menos que se indique de cualquier otra manera, también puede incluir cambios en el complemento de la secuencia de nucleótidos. La modificación de nucleótidos puede ser una mutación somática o un polimorfismo de la línea germinal.
Adicionalmente, la modificación de aminoácidos puede indicar un cambio en la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre), por ejemplo, inserción, sustitución o deleción de al menos un aminoácido, tal como la deleción interna o truncamiento de los extremos N- o C- terminales.
En una modalidad preferida, el mutante de la presente descripción puede ser uno en el que el aminoácido del polipéptido de la SEQ ID NO: 4 esté sustituido, delecionado o insertado.
En una modalidad preferida de la presente invención, el mutante de la presente descripción puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un mutante en el que el amino ácido 1254 en el polipéptido de la SEQ ID NO: 4 está sustituido de M a T; un mutante en el que el amino ácido 1335 en el polipéptido de la SEQ ID NO: 4 está sustituido de R a G; un mutante en el que el amino ácido 523 en el polipéptido de la s Eq ID NO: 4 está sustituido de R a Q; un mutante en el que el aminoácido 1232 en el polipéptido de la SEQ ID NO: 4 está sustituido de D a V; y un mutante en el que el amino ácido 1268 en el polipéptido de la SEQ ID NO: 4 está sustituido de M a T.
El biomarcador de la presente descripción puede ser un indicador de la sensibilidad a los inhibidores de proteína quinasa, que son fármacos antineoplásicos. Dado que el biomarcador de la presente descripción tiene una precisión y fidelidad excelentes a los fármacos antineoplásicos para un marcador sensible, puede usarse para el tratamiento de la aparición, desarrollo y/o metástasis del cáncer.
Como se usa en la presente descripción, el término "sensibilidad" significa si un fármaco particular presenta algún efecto contra el cáncer de pacientes con cáncer individuales.
Por ejemplo, el fármaco en particular se refiere principalmente a fármacos antineoplásicos, y entre estos fármacos antineoplásicos, se conoce que algunos fármacos presentan efectos contra el cáncer mientras que otros no. Adicionalmente, incluso para el cáncer contra el que se ha demostrado que los fármacos son eficaces, se conoce que los fármacos pueden ser eficaces o no en dependencia de los pacientes individuales. La presencia del efecto de los fármacos antineoplásicos en pacientes con cáncer individuales se denomina sensibilidad a los fármacos antineoplásicos. Por consiguiente, si es posible predecir a los pacientes de acuerdo con la presente descripción antes del inicio del tratamiento, si se espera que el efecto del fármaco se muestre en los pacientes (pacientes que responden) o no se espera que se muestre el efecto del fármaco en los pacientes (pacientes que no responden), puede practicarse una quimioterapia con alta efectividad y seguridad.
Como se usa en la presente descripción, el término "predicción" se usa para indicar la posibilidad de si un fármaco o conjunto de fármacos pueden reaccionar de forma ventajosa o desventajosa para un paciente en cuestión. En un aspecto, la predicción puede relacionarse con el grado de tal reactividad. Por ejemplo, la predicción se refiere a la supervivencia de un paciente sin recurrencia del cáncer después del tratamiento con un agente terapéutico particular y/o una extirpación quirúrgica de un tumor primario y/o quimioterapia durante un período de tiempo predeterminado, y/o la probabilidad de esta. La predicción de la presente descripción puede usarse clínicamente para determinar el tratamiento mediante la selección del método de tratamiento más apropiado para pacientes con cáncer de colon. La predicción de la presente descripción es una herramienta útil para predecir si el paciente puede reaccionar de manera ventajosa al tratamiento terapéutico, por ejemplo, un tratamiento terapéutico dado (por ejemplo, la administración de un agente terapéutico dado o un agente combinado, una introducción de cirugía, quimioterapia, etcétera) o si el paciente puede sobrevivir a largo plazo después del tratamiento terapéutico.
En una modalidad preferida de la presente descripción, la proteína quinasa puede ser al menos una seleccionada del grupo que consiste en Abl, ACK, ALK, Arg, a Rk5, Aurora, Axl, Bmx, BTK, CDK, CHK, c-Kit, c-MET, c-RAF, c-SRC, EGFR, FAK, Fes, FGFR, Flt3, GSK3, IGF, IKK, JAK, Lck, LIMK, Lyn, MEK, Mer, MK-2, P38alpha, PDGFR, PDK, Pim, PKA, PKB, PKCR, Plk-1/3, Ret, RON, Ros, Rse, Tie, Trk, Tyro3, VEGFR, and YES, more specifically, c-MET, c-RAF, c-SRC, EGFR, FAK, Fes, FGFR, MEK, Mer, MK-2, P38alpha, PDGFR, PDK, Pim, PKA, PKB, PKCR, Plk-1/3, Ret, o RON, y más específicamente, de acuerdo con la presente invención, c-MET y RON.
En una modalidad preferida de la presente descripción, el inhibidor de proteína quinasa puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en CJ12495, CJ12537, CJ12524, CJ12567, K252a, SU11274, PHA-665752, ARQ-197, PF-02341066, PF-04217903, JNJ-38877605, Foretinib, SGX523, MP470, AMG102, AMG706, LY2801653, XL-184, Flavopihdol, Olomoucina, Roscovitina, Purvanolols, CGP74514A, Roscovitina, Bevacizumab, Cetuximab, Gefitinib, Erlotinib, Panitumumab, PKI-166, EKB-569, HKI-272 (WAY-177820), Lapatinib, Canertinib, AEE788, XL647, BMS 5599626, y Zactima, más específicamente, CJ12495, CJ12537, CJ12524, CJ12567, K252a, SU11274, PHA-665752, ARQ-197, PF-02341066, PF-04217903, JNJ-38877605, Foretinib, SGX523, MP470, AMG102, AMG706, LY2801653, o XL-184, y más específicamente, de acuerdo con la presente invención, CJ12495, CJ12537, CJ12524,o CJ12567.
Los CJ12495, CJ12537, CJ12524 y CJ12567 descritos anteriormente son inhibidores que suprimen las actividades de las proteínas quinasas como se describe en la patente coreana núm. 10-1350006,. En la presente descripción, CJ12495, CJ12537, CJ12524 y CJ12567 se usan como fármacos antineoplásicos que tienen la función de inhibir la proliferación anormal de células cancerosas.
Específicamente, los inhibidores de proteína quinasa de la presente descripción pueden ser un compuesto representado por la siguiente Fórmula 1, que se describe en la Patente Coreana Núm. 10-1350006, o una sal de este.
Figure imgf000006_0001
Más específicamente, CJ12495, que es un inhibidor de proteína quinasa de la presente invención, es "4-etoxi-N-(3-fluoro-4-(2-(1-metil-1H-imidazol-4-il)tieno[3,2-b]piridin-7-iloxi)fenil)-1-(4-fluorofenil)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-carboxamida”preparado en el Ejemplo 1 de la Patente Coreana Núm. 10-1350006, y puede ser un compuesto representado por la Fórmula 2 que se muestra más abajo. Adicionalmente, CJ12537 es una sal de HCl de CJ12495, es decir, una sal de HCl de "4-etoxi-N-(3-fluoro-4-(2-(1-metil-1H-imidazol-4-il)tieno[3,2-b]piridin-7-iloxi)fenil)-1-(4-fluorofenil)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-carboxamida".
Figure imgf000006_0002
Adicionalmente, más específicamente, CJ12524, que es un inhibidor de la proteína quinasa de la presente invención, es "4-etoxi-N-(3-fluoro-4-(2-(piridin-2-il)tieno[3,2-b]piridin-7-iloxi)fenil)-1-(4-fluorofenil)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-carboxamida” preparado en el Ejemplo 8 de la Patente Coreana Núm. 10-1350006, y puede ser un compuesto representado por la Fórmula 3 que se muestra más abajo. Adicionalmente, CJ12567 es una sal de HCl de CJ12524, es decir, una sal de HCl de "4-etoxi-N-(3-fluoro-4-(2-(pyridin-2-il)tieno[3,2-b]piridin-7-iloxi)fenil)-1-(4-fluorofenil)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-carboxamida".
[Fórmula 3]
Figure imgf000007_0001
De acuerdo con otro aspecto, la presente descripción proporciona una composición para predecir la sensibilidad a un inhibidor de proteína quinasa que contiene un agente para medir el nivel de expresión del Recepteur d'Origine Nantais activo (RON). El Ron activo es el mismo que se explicó anteriormente, y específicamente de acuerdo con la presente invención, el nivel de expresión del RON activo puede incluir el de una variante de corte y empalme o mutante. En la presente descripción, puede entenderse que el nivel de expresión de RON activo se refiere a todo tipo de niveles de expresión, que incluye los niveles de ADN, ARNm, proteína, etcétera.
De acuerdo con una modalidad preferida, los inhibidores de proteína quinasa de la presente descripción pueden ser un agente terapéutico para el cáncer, psoriasis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el cáncer puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer productor de ACTH, leucemia linfocítica o linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda o crónica, leucemia aguda no linfocítica, cáncer de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, cáncer de canal cervical, leucemia mieloide crónica, cáncer intestinal, linfoma de la zona T, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, sarcoma de Ewing, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de lengua, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma, mieloma múltiple, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de pene, retinoblastoma, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de testículo, tumor de Wilms y trofoblastoma. Más específicamente, el cáncer puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de canal cervical, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de pene, retinoblastoma, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de testículo, tumor de Wilms y trofoblastoma, y más específicamente, cáncer de colon.
Como se usa en la presente descripción, el término "cáncer de colon" se refiere conjuntamente a cáncer de recto, cáncer colorrectal y cáncer anal.
En la presente descripción, a menos que se indique de cualquier otra manera, la expresión "medición de un nivel de expresión" se refiere a la detección de un objetivo que necesita detectarse en una muestra dada. En la presente descripción, el objetivo que necesita detectarse puede incluir la forma activada de la proteína correspondiente dentro de la muestra dada, y puede incluir tanto el ARNm y/o la proteína de una variante o mutante de un gen. Es decir, la presencia de la expresión puede confirmarse mediante la detección de ARN, que es un producto de una variante o mutante de un gen, o una proteína, que es un producto de un gen, así como también mediante la detección de la forma activada de la proteína.
La detección puede realizarse mediante una extracción convencional de ARN o una proteína de una muestra o mediante la detección de ARN o una proteína presente en el extracto. La detección de ARN o una proteína puede medirse mediante un método de inmunoensayo, un método de hibridación y un método de amplificación, pero el método de detección no se limita a estos y la detección puede realizarse fácilmente mediante el uso de diversos procedimientos conocidos en la técnica.
De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el agente para medir el nivel de expresión puede incluir un oligonucleótido antisentido, un par de cebadores o una sonda que se une específicamente al ARNm y, en particular, al ARNm de la variante de corte y empalme o mutante.
El agente para medir la presencia de la expresión de ARNm puede seleccionarse del grupo que consiste en un oligonucleótido antisentido, un par de cebadores y una sonda, que son específicos del gen anterior, y una combinación de estos. Es decir, la detección de un ácido nucleico puede realizarse mediante al menos una reacción de amplificación, que emplea al menos un cebador oligonucleotídico que se hibrida con una molécula de ácido nucleico que codifica un gen o un producto complementario de la molécula de ácido nucleico.
Por ejemplo, la detección de ARNm mediante el uso de un cebador puede realizarse mediante la confirmación de la presencia de amplificación de un gen mediante un método conocido en la técnica, después de amplificar la secuencia del gen mediante un método de amplificación tal como PCR.
De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el par de cebadores puede consistir en (a) un cebador directo de la SEQ ID NO: 5; y (b) un cebador inverso de la SEQ ID NO: 6.
Adicionalmente, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el agente para medir el nivel de expresión puede incluir una proteína RON, por ejemplo, un anticuerpo, un péptido o un nucleótido, que se une específicamente a RON activo o a una proteína mutante. Adicionalmente, el agente para medir el nivel de expresión puede incluir un anticuerpo para detectar la fosforilación de RON para confirmar la presencia de una forma activa de la proteína RON.
El agente para medir la presencia de la expresión de la proteína se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a las proteínas y puede incluir todos de, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante y una combinación de estos.
El anticuerpo no solo puede incluir un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante y una forma completa de un anticuerpo que tiene dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa, sino que, además, puede incluir todos los fragmentos funcionales de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, Fab, F(ab'), F(ab')2, y Fv. El anticuerpo puede prepararse fácilmente mediante el uso de un procedimiento conocido en la técnica a la que pertenece la presente descripción, y puede usarse, además, cualquier anticuerpo preparado y disponible en el mercado comercial.
Aunque la composición de la presente descripción contiene un agente para medir la presencia de la expresión del gen descrito anteriormente, la composición puede contener, además, un marcador que permita medir cuantitativa o cualitativa la formación de un complejo antígeno-anticuerpo, un dispositivo convencional usado para los inmunoensayos, un reactivo, etcétera.
Los ejemplos del marcador que permite la medición cuantitativa o cualitativa de la formación del complejo antígenoanticuerpo pueden incluir enzimas, materiales fluorescentes, ligandos, materiales emisores de luz, micropartículas, moléculas redox, isótopos radiactivos, etcétera, pero no se limitan a estos. Los ejemplos de las enzimas que se usan como marcador de detección pueden incluir p-glucuronidasa, p-D-glucosidasa, p-D-galactosidasa, ureasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa, hexoquinasa y GDPasa, RNasa, glucosa oxidasa y luciferasa, fosfofructoquinasa, fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, aspartato aminotransferasa, fosfoenolpiruvato descarboxiquinasa, p-lamatasa, etcétera, pero no se limitan a estos. Los ejemplos de materiales fluorescentes pueden incluir fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, oftalaldehído, fluorescamina, etcétera, pero no se limitan a estos. Los ejemplos de ligandos pueden incluir derivados de biotina, pero no se limitan a estos. Los ejemplos de materiales emisores de luz pueden incluir éster de acridinio, luciferina, luciferasa, etcétera, pero no se limitan a estos. Los ejemplos de micropartículas pueden incluir oro coloidal, látex coloreado, etcétera, pero no se limitan a estos. Los ejemplos de moléculas redox pueden incluir ferrocenos, complejos de rutenio, viológenos, quinonas, iones Ti, iones Cs, diimidas, 1,4-benzoquinona, hidroquinona, K4 W(CN)8 , [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4-, etcétera, pero no se limitan a estos. Los ejemplos de isótopos radiactivos pueden incluir 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re, etcétera, pero no se limitan a estos.
Los ejemplos del dispositivo o reactivo pueden incluir un portador, solubilizante, limpiador, tampón, estabilizador apropiado, pero no se limitan a estos. Cuando el material de marcaje es una enzima, puede incluirse un sustrato que permita medir la actividad enzimática y un terminador de reacción. El portador puede ser un portador soluble o un portador insoluble. Los ejemplos del portador soluble pueden incluir un tampón fisiológicamente aceptable conocido en la técnica, por ejemplo, PBS. Los ejemplos del portador insoluble pueden incluir poliestireno, polietileno, polipropileno, poliéster, poliacrilonitrilo, resina fluorada, dextrano reticulado, polisacárido, papel, vidrio, metal, agarosa y una combinación de estos.
Dado que la composición de la presente descripción contiene el biomarcador descrito anteriormente como ingrediente activo, en la presente descripción se omite la descripción repetida del contenido para evitar una complejidad excesiva de la presente descripción.
De acuerdo con otro aspecto, la presente descripción proporciona un kit para predecir la sensibilidad a un inhibidor de proteína quinasa que incluye la composición.
El kit puede incluir no solo el agente para medir el nivel de expresión de un gen, sino también una herramienta, un reactivo, etcétera, generalmente usado en la técnica para inmunoensayos.
En una modalidad ilustrativa de la herramienta o reactivo puede incluir un material de marcaje capaz de formar una señal detectable, un cromóforo, un solubilizante, un limpiador, un tampón, un estabilizador, etcétera, pero no se limita a estos. Cuando el material de mareaje es una enzima, puede incluirse un sustrato que permita medir la actividad enzimática y un terminador de reacción. El portador puede ser un portador soluble o un portador insoluble. Los ejemplos del portador soluble pueden incluir un tampón fisiológicamente aceptable conocido en la técnica, por ejemplo, PBS. Los ejemplos del portador insoluble pueden incluir poliestireno, polietileno, polipropileno, poliéster, poliacrilonitrilo, resina fluorada, dextrano reticulado, polisacárido, papel, vidrio, metal, agarosa y una combinación de estos.
Dado que la composición de la presente descripción contiene el biomarcador descrito anteriormente como una composición, en la presente descripción se omite la descripción repetida del contenido para evitar una complejidad excesiva de la presente descripción.
Aun de acuerdo con otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para predecir la sensibilidad a un inhibidor de proteína quinasa, que incluye (a) medir el nivel de expresión del Recepteur d'Origine Nantais (RON) activo dentro de una muestra biológica que se obtiene de un sujeto; y (b) determinar la sensibilidad del sujeto a un inhibidor de la proteína quinasa en base al resultado que se midió en la etapa (a).
El nivel de expresión del RON activo que va a medirse es el mismo que se explicó anteriormente, y específicamente, puede incluir el nivel de expresión de una variante de corte y empalme o mutante del gen RON.
De acuerdo con una modalidad preferida de la presente descripción, en el caso de que se confirme la expresión del RON activo de la etapa (a), se determina que el sujeto tiene sensibilidad al inhibidor de la proteína quinasa.
El método de predicción de la presente descripción se realiza mediante la obtención de una muestra biológica que se obtiene de un paciente en cuestión; mediante la medición del nivel de expresión de uno o de una pluralidad seleccionados del grupo que consiste en variantes o mutantes del gen RON dentro de la muestra; y después de la confirmación de la expresión, determinar que la muestra correspondiente tiene sensibilidad para un inhibidor de la proteína quinasa.
Es decir, el método de predicción de la presente descripción se caracteriza porque la presencia de la expresión de una variante o mutante particular dentro de una muestra se usa como un índice para la sensibilidad de un fármaco antineoplásico para las células cancerosas.
Adicionalmente, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente descripción, en el caso de que el nivel de expresión del RON activo de la etapa (a) sea mayor que el del grupo de control, se determina que el sujeto tiene la sensibilidad para el inhibidor de la proteína quinasa.
La presente descripción puede incluir, además, comparar el nivel de expresión de la muestra con el del grupo de control.
El método de predicción de la presente descripción se realiza mediante la obtención de una muestra biológica que se obtiene de un paciente en cuestión; mediante la medición del nivel de la expresión de uno o de una pluralidad seleccionados del grupo que consiste en variantes o mutantes del gen RON dentro de la muestra; y después mediante la comparación de los niveles de expresión, y en base a las características de expresión de estos, determinar que la muestra correspondiente tiene la sensibilidad para un inhibidor de la proteína quinasa.
A menos que se especifique de cualquier otra manera, como se usa en la presente descripción, el término "grupo de control" se refiere al nivel de expresión de una variante del gen correspondiente o una proteína de este de una persona sana normal; el nivel de expresión de un tipo silvestre del gen correspondiente o una proteína de este de una persona sana normal; el nivel de expresión de una variante del gen correspondiente o una proteína de este de un paciente en cuestión con una enfermedad para la comparación; o el nivel de expresión de un tipo silvestre del gen correspondiente, o una proteína de este, de un paciente en cuestión con una enfermedad para la comparación. Más específicamente, la etapa (b) de la presente descripción es un proceso en el que se determina que las células cancerosas correspondientes que se obtienen del paciente en cuestión tienen la sensibilidad para el inhibidor de la proteína quinasa como agente antineoplásico, en el caso de que el nivel de expresión de RON activo del grupo de control (por ejemplo, una variante del gen RON, mutante o de tipo silvestre) se confirma que es mayor que la que se midió en la etapa (a).
Como se usa en la presente descripción, el término "alta expresión" indica el valor o nivel de un biomarcador dentro de una muestra biológica, que es más alto que el valor o nivel de un biomarcador detectado en la muestra biológica que se obtiene de un individuo sano o de tipo silvestre (normal), en el caso de que el biomarcador exhiba un proceso anormal, una enfermedad u otras afecciones patológicas en un individuo, o un signo de estos. Adicionalmente, el término "alta expresión" puede indicar "un nivel diferencial" o "un valor diferencial" o "expresado de manera diferente" en comparación con el nivel o valor de expresión "normal" de un biomarcador, y puede incluir tanto la diferencia cuantitativa como la diferencia cualitativa en el nivel de expresión.
De acuerdo con una modalidad preferida de la presente descripción, la alta expresión significa que el nivel de expresión del objetivo aumenta 1,2 veces en comparación con el del grupo de control.
En la presente descripción, la presencia y la expresión de variantes y mutantes del gen puede afectar la sensibilidad a los inhibidores de la proteína quinasa como se describió anteriormente.
La detección de las variantes o mutantes puede realizarse mediante la clonación de moléculas diana y el análisis de secuencia mediante el uso de un procedimiento ampliamente conocido en la técnica, por ejemplo, el análisis de secuencia de ADN; ensayos de extensión de cebadores tales como ensayo de incorporación de nucleótidos específicos de alelo y ensayo de extensión de cebadores específicos de alelos (por ejemplo, PCR específica de alelos, reacción en cadena de ligación específica de alelos (LCR) y gap-LCR); ensayo de hibridación de oligonucleótidos específico de alelo (por ejemplo, ensayo de ligación de oligonucleótidos); ensayo de protección de escisión para detectar desapareamiento de nucleótidos dentro de las dobles hélices de ácido nucleico mediante el uso de la protección de un agente de escisión; ensayo de unión a proteína MutS; análisis de electroforesis para comparar la movilidad de ácidos nucleicos de variantes y de tipo silvestre; electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE, por ejemplo como en [Myers y otros, (1985) Nature 313: 495]); ensayo de escisión de RNasa en pares de bases no apareadas; análisis de la escisión química o enzimática de ADN doble hélice hetero; espectrofotometría (por ejemplo, MALDITOF); análisis de bits genéticos (GBA); ensayo de nucleasa 5' (por ejemplo, TaqMan®); y ensayo mediante el uso de balizas moleculares, pero la técnica no se limita a estos.
Como se usa en la presente descripción, el término "una muestra biológica" se refiere a cualquier muestra que puede obtenerse de un sujeto, en la que puede detectarse la expresión de un biomarcador de la presente descripción.
La muestra biológica puede ser cualquiera seleccionada del grupo que consiste en saliva, biopsia, sangre, tejido cutáneo, cultivo líquido, heces y orina. Sin embargo, la muestra biológica no está particularmente limitada a estas y puede prepararse mediante cualquier método usado convencionalmente en la técnica. De acuerdo con el método de la presente descripción, la sensibilidad se determina mediante el uso del biomarcador descrito anteriormente, y en la presente descripción se omite la descripción repetida del contenido para evitar una complejidad excesiva de la presente descripción.
[Descripción detallada de la invención]
En lo adelante, la presente descripción se describirá con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son solo para fines ilustrativos, y la invención no pretende limitarse por estos ejemplos. Condiciones y métodos experimentales
RT-PCR
El ARN total se extrajo de una línea celular de cáncer de colon o una muestra de un paciente con cáncer de colon humano mediante el método de extracción de ARN Trizol y se sintetizó nuevamente 1 |jg del ARN total en ADNc. Después, se realizó RT-PCR mediante el uso de un par de cebadores de RON (un cebador directo 5'-CTCTGGGGACCAGGTTTTCC-3' de la SEQ ID NO: 5 y un cebador inverso 5"-ACCATCAATGGCAGGGAGTG-3' de la SEQ ID NO: 6), y el producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se tiñó con bromuro de etidio. Las condiciones de la PCR se muestran en la Tabla 1 más abajo.
[Tabla 1]
Figure imgf000010_0001
Transferencia Western
Las células de la muestra se lisaron mediante el uso de tampón RIPA y la proteína se extrajo de allí mediante el uso de una centrífuga de alta velocidad. La proteína en una cantidad de 30 jg por célula se separó por electroforesis, se transfirió a una membrana de PDVF mediante transferencia western y se dejó reaccionar con anticuerpos de RON, que se diluyeron en leche desnatada al 5 % en una relación de 1 : 2000, a 4 °C durante 12 horas. Después, el resultante se lavó 3 veces con tampón TBS-T durante 15 minutos por cada lavado, se hizo reaccionar con los anticuerpos secundarios, los cuales se diluyeron en leche desnatada al 5 % en una relación de 1: 2000, a temperatura ambiente durante 2 horas, se lavaron 3 veces con tampón TBS-T durante 15 minutos por cada lavado.
La iluminación de la membrana de PDVF se indujo mediante el uso de tampón ECL y la expresión de la proteína RON se reveló mediante el uso de una película de rayos X. Adicionalmente, se añadió 1 |jg del anticuerpo RON a la proteína en una cantidad de 500 jg por célula mediante el método de inmunoprecipitación, se hizo reaccionar a 4 °C durante 12 horas y se añadieron perlas anti-anticuerpo para inmunoprecipitar el anticuerpo de RON. El resultante se separó mediante electroforesis, se transfirió a una membrana de PDVF mediante transferencia western y se dejó reaccionar con anticuerpos p-Tyr, que se diluyeron en leche desnatada al 5 % en una relación de 1 : 1000, a 4 °C durante 12 horas. Después, el resultante se lavó 3 veces con tampón TBS-T durante 15 minutos por cada lavado, se hizo reaccionar con los anticuerpos secundarios, que se diluyeron en leche desnatada al 5 % en una relación de 1 : 2000, a temperatura ambiente durante 2 horas, y se lavaron 3 veces con tampón TBS-T durante 15 minutos por cada lavado. La iluminación de la membrana de PDVF se indujo mediante el uso de tampón ECL y la expresión de la proteína p-Tyr RON se reveló mediante el uso de una película de rayos X.
Inmunohistoquímica
Una vez completada la administración del fármaco, se extirpó el tejido, se fijó en una solución de formalina al 10 % y se preparó un bloque de parafina al día siguiente. El tejido se seccionó en un tamaño de 5 jm, se trató con xileno, se trató con EtOH al 100 %, 95 % y 70 %, se bloqueó con BSA al 3 % y se dejó reaccionar con fosfo-RON y el anticuerpo RON, que se diluyeron cada uno en BSA al 1 % en una relación de 1 : 100, a 4 °C durante 12 horas. Después, el resultante se lavó 3 veces con tampón PBS-T durante 15 minutos por cada lavado, se hizo reaccionar con los anticuerpos secundarios, los cuales se diluyeron con BSA al 1 % en una relación de 1 : 100, a temperatura ambiente durante 2 horas, se lavaron 3 veces con tampón TBS-T durante 15 minutos por cada lavado, se trató con un sustrato DAB, se trató con hematoxilina y se sometió a un proceso de deshidratación. Después, se dejó caer una solución de montaje sobre el mismo, se cubrió con un cubreobjetos y se tiñó para evidenciar la expresión de la proteína.
Modelo de xenoinjerto de cáncer de colon (modelo PDX)
El tumor de un modelo de ratón, que se derivó de un tejido de paciente criopreservado, se descongeló en hielo y se estabilizó en un medio, en el que se añadieron HBBS, FBS al 5 %, IX penicilina/estreptomicina y IX gentamicina/anfotericina B. El resultante, de un tamaño de aproximadamente 3 mm3, se cortó y se trasplantó a la superficie de la piel de un ratón después de cortarle la piel, y se cosió la superficie. Después de confirmar la formación del tumor, cuando el tumor creció hasta un tamaño de 400 mm3 a 500 mm3, el tejido se extirpó y se cortó nuevamente en un tamaño de 3 mm3 y se trasplantó a ratones desnudos Balb/c. Después de confirmar la formación del tumor, los ratones se sometieron a la administración de fármacos.
Tratamiento con un fármaco antineoplásico
El fármaco antineoplásico usado en la presente descripción es un inhibidor de c-MET, que es CJ12567 descrito en la Patente Coreana Núm. 10-1350006 y LY2801653 (Lily Co.) se usó como control positivo.
Después de confirmar la formación del tumor, cuando el tamaño tumoral alcanzó los 100 mm3, los animales experimentales se dividieron en varios grupos de administración de fármacos y se les administró CJ12567 y LY-2801653, que se disolvieron en metilcelulosa al 0,5 %. CJ12567 se administró por vía oral diariamente en una concentración de 30 mpk y 100 mpk y LY-2801653 en una concentración de 30 mpk durante 14 días. Durante la administración, se midió el tamaño tumoral mediante el uso de un calibrador a intervalos de 3 días y se midió el peso corporal de los ratones.
Mutantes del gen RON
Se usaron mutantes del gen RON (RON M1254T, RONR1335G y RON R523Q).
Ejemplo 1- Selección de variantes del gen RON de tejidos de pacientes con cáncer de colon
Para confirmar las variantes del gen RON en los tejidos de pacientes con cáncer de colon, los presentes inventores analizaron un total de 200 muestras de tejido de pacientes con cáncer de colon.
Primeramente, para confirmar la expresión de las variantes RON de tipo silvestre o RONA155 o RONA160 en las líneas celulares de cáncer de colon (HT29, colo320hsr y MKN28) y las muestras de pacientes con cáncer de colon, se realizó una RT-PCR mediante el uso de los cebadores preparados por los presentes inventores.
Como resultado, como se muestra en la Figura 1a, se confirmó que la línea celular HT29 expresó la variante RONA160 mientras que la línea celular colo320hsr expresó la variante RONA155. Adicionalmente, se confirmó que la variante RONA155 o RONA160 se expresó en las muestras Núms. 87 y 116 de pacientes con cáncer de colon. Después, para confirmar la expresión de RON en las mismas muestras que las de los pacientes con cáncer de colon en los que se realizó RT-PCR, se realizaron transferencia western (Figura 1b) e inmunohistoquímica (Figura 1c).
Como resultado, como se muestra en las Figuras 1b y 1c, el tamaño de las proteínas RON en las muestras Núms.
87 y 116 de pacientes con cáncer de colon, donde se confirmó la variante RONA155 o la variante RONA160, fue el mismo que el tamaño de la proteína de la variante RÜNA160 en la línea celular HT29. Adicionalmente, considerando que la variante RÜNA160 puede expresar la proteína p-Tyr RON, se confirmó que la variante RÜNA160 puede activar a las proteínas RON.
Ejemplo 2 Análisis de sensibilidad del fármaco a CJ12567 en un modelo de xenoinjerto de cáncer de colon derivado de paciente que expresa la variante RON (modelo PDX)
Para analizar la sensibilidad del fármaco a CJ12567 en un estado in vivo, los presentes inventores trasplantaron las muestras Núms. 87 y 116 de pacientes con cáncer de colon, que se determinó que eran positivas a variantes de RON, en ratones desnudos y, por lo tanto, se preparó un modelo de xenoinjerto de cáncer de colon derivado de paciente (modelo PDX).
Mientras tanto, durante el proceso de preparación del modelo de xenoinjerto, como se muestra en la Figura 2b, cuando se trasplantó la muestra No. 116 de un paciente con cáncer de colon, que se determinó que era positiva para variantes de RON, el tejido tumoral era mucho más grande y se formó más rápidamente en comparación con el trasplante de la muestra Núm. 130, que no se determinó que era positiva a las variantes de RON.
A los ratones en los que se trasplantaron los tejidos de cáncer de colon derivados del paciente se les administró CJ12567 (30 mpk, 100 mpk), LY2801653 (30 mpk) como grupo de control positivo y vehículo (metilcelulosa al 0,5 %) como grupo de control normal. Después, se midió el tamaño y el peso de los tejidos cancerosos y se sometieron a análisis de IHC y transferencia western, de esta manera se determinó la sensibilidad al fármaco.
2-1. Sensibilidad al fármaco CJ12567 en un modelo de xenoinjerto de cáncer de colon derivado de una muestra de paciente núm. 116 (modelo PDX)
Como se muestra en las Figuras 3a a 3c, cuando el modelo de xenoinjerto derivado del paciente (modelo PDX), en el que se trasplantó la muestra Núm. 116 de un paciente con cáncer de colon a ratones desnudos, se administró con CJ12567 (30 mpk), el tamaño y el peso de las células cancerosas se redujeron significativamente en un 53,15 % y un 47,87 %, respectivamente, en comparación con las del grupo de control normal (el grupo al que se administró el vehículo). Adicionalmente, estos valores son similares a los del grupo de control positivo, que se administró con LY2801653.
Adicionalmente, cuando se administró con CJ12567 (100 mpk), el tamaño y el peso de las células cancerosas se redujeron considerablemente en un 35,05 % y un 18,09 %, respectivamente, en comparación con los del grupo de control positivo (el grupo administrado con vehículo). Estos valores representan los resultados de que el tamaño y el peso de las células cancerosas se redujeron considerablemente en comparación con los del grupo de control positivo, que se administró con LY2801653 (Figuras 3a a 3c).
Adicionalmente, cuando se administró con CJ12567 (100 mpk), no hubo cambios en la cantidad total de proteína RON en ambas administraciones de CJ12567 (100 mpk) y LY2801653 (30 mpk), como se confirmó por el método de inmunohistoquímica (Figura 3d) y transferencia western (Figura 3e). Sin embargo, la expresión de la proteína p-RON, que es RON activo, se redujo y la expresión de las proteínas MSP y p-ERK también se redujo, lo que sugiere que la administración de CJ12567 (100 mpk) provoca una disminución de la expresión de MSP y p-ERK, aumentando de esta manera la sensibilidad.
2-2. Sensibilidad del fármaco a CJ12567 en el modelo de xenoinjerto de cáncer de colon derivado de la muestra de paciente núm. 87 (modelo PDX)
Como se muestra en las Figuras 3a a 3c, cuando el modelo de xenoinjerto derivado del paciente (modelo PDX), en el que se trasplantó la muestra Núm. 87 de un paciente con cáncer de colon a ratones desnudos, se administró con CJ12567 (30 mpk), el tamaño y el peso de las células cancerosas se redujeron significativamente en un 64,02 % y 61,36 %, respectivamente, en comparación con las del grupo de control normal (el grupo al que se administró el vehículo). Adicionalmente, estos valores son similares a los del grupo de control positivo, que se administró con LY2801653.
Adicionalmente, cuando se administraron con CJ12567 (100 mpk), el tamaño y el peso de las células cancerosas se redujeron considerablemente en un 56,43 % y 40,91 %, respectivamente, en comparación con los del grupo de control positivo (el grupo al que se administró vehículo). Estos valores representan los resultados de que el tamaño y el peso de las células cancerosas se redujeron considerablemente en comparación con los del grupo de control positivo, que se administró con LY2801653 (Figuras 3a a 3c).
Estos resultados sugieren que la presencia de una variante del gen RON en la muestra de un paciente con cáncer de colon aumenta la sensibilidad a CJ12567.
En consecuencia, el gen RON activado y la variante del gen RON muestran su uso potencial como biomarcador para predecir la sensibilidad a CJ12567, que es un inhibidor de c-MET.
Ejemplo 3 Análisis de sensibilidad al fármaco para CJ12495 en un gen RON de tipo silvestre, mutante y en una variante
3-1. Inhibición de la fosforilación de RON por CJ12495
Los presentes inventores analizaron el efecto inhibidor del tratamiento con CJ12495 sobre la fosforilación de RON en un gen RON de tipo silvestre, mutante y en una variante.
Primeramente, el gen RON de tipo silvestre se sobreexpresó en una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (NIH3T3), activada mediante tratamiento con MSP y se trató con CJ12495 para confirmar el nivel de inhibición contra la fosforilación de RON.
Como resultado, como se muestra en la Figura 4a, el análisis de transferencia western mediante el uso del anticuerpo de fosfotirosina después de la inmunoprecipitación con la proteína RON confirmó que el gen RON se activó por MSP y que la fosforilación de RON activado se inhibió por el compuesto CJ12495.
Adicionalmente, cada uno de los genes mutantes de RON (RON M1254T, RON R1335G, y RON R523Q) se sobreexpresó en una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón, se activó mediante tratamiento con MSP y se trató con CJ12495 para confirmar el nivel de inhibición contra la fosforilación de RON.
Como resultado, como se muestra en la Figura 4b, el análisis de transferencia western mediante el uso de anticuerpo de fosfotirosina después de la inmunoprecipitación con la proteína RON confirmó que el gen RON se activó por MSP y que la fosforilación del RON activado se inhibió en células en las que se introdujo cada uno de los genes mutantes de RON.
Adicionalmente, cada una de las variantes del gen RON (gen RON-activo A160 y gen RON-activo A165) se sobreexpresó en una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (NIH3T3) y se trató con CJ12495 para confirmar el nivel de inhibición contra la fosforilación de RON.
Como resultado, como se muestra en la Figura 4c (gen RON-activo A160) y en la Figura 4d (gen RON-activo A165), el análisis de transferencia western mediante el uso de anticuerpo de fosfotirosina después de la inmunoprecipitación con la proteína RON confirmó que la fosforilación de RON activo se inhibió en cada uno de los grupos tratados con CJ12495.
A partir de los resultados anteriores, se confirmó que la presencia de un gen RON activado por MSP o un gen RON activo puede aumentar la sensibilidad a CJ12495, de esta manera se favorece un excelente efecto inhibidor de CJ12495 sobre la fosforilación de RON.
3-2. Efecto inhibidor sobre la motilidad celular debido a la inhibición de la fosforilación de RON por CJ12495 Los presentes inventores analizaron el efecto inhibidor sobre la motilidad celular debido a la inhibición de la fosforilación de RON provocada por el tratamiento con CJ12495 en un gen RON de tipo silvestre, mutante y en una variante.
Primeramente, el gen RON de tipo silvestre se sobreexpresó en una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (NIH3T3), se activó mediante tratamiento con MSP y se trató con CJ12495 para confirmar la motilidad celular. Como resultado, como se muestra en la Figura 5a, el ensayo de migración celular confirmó que el aumento de la motilidad celular debido a la activación por MSP se inhibió por CJ12495.
Adicionalmente, cada uno de los genes mutantes de RON (RON M1254T y RON R1335G) se sobreexpresó en una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón, se activó mediante tratamiento con MSP y se trató con CJ12495 para confirmar la motilidad celular.
Como resultado, como se muestra en la Figura 5b, el ensayo de migración celular confirmó que el aumento de la motilidad de las células debido a la activación por MSP se inhibió en ambos grupos, donde cada grupo se introdujo con cada uno de los genes mutantes RON y se trató con CJ12495.
Adicionalmente, cada una de las variantes del gen RON (gen RON-activo A160 y gen RON-activoA 165) se sobreexpresó en la línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (NIH3T3) y se trató con CJ12495 para confirmar el efecto inhibidor sobre la motilidad celular.
Como resultado, como se muestra en la Figura 5c, el ensayo de migración celular confirmó que la motilidad celular se inhibió en ambos grupos tratados con CJ12495.
A partir de los resultados anteriores, se confirmó que la presencia de un gen RON activado por MSP o un gen RON activo aumenta la sensibilidad a CJ12495, de esta manera se exhibe un excelente efecto inhibidor sobre la motilidad celular por CJ12495.
3- 3. Efecto inhibidor sobre la metástasis celular debido a la inhibición de la fosforilación de RON por CJ12495 Los presentes inventores analizaron el efecto inhibidor sobre la metástasis celular debido a la inhibición de la fosforilación de RON provocada por el tratamiento con CJ12495 en un gen RON de tipo silvestre, mutante y en una variante.
El gen RON de tipo silvestre y un gen RON mutante (R523Q) se sobreexpresaron cada uno en una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (NIH3T3), y RON se activó mediante tratamiento con MSP y se trató con CJ12495 para confirmar el grado de invasión celular.
Como resultado, como se muestra en la Figura 6a, se confirmó que el aumento de metástasis celular debido a la activación por MSP se inhibió por el tratamiento con CJ12495 en ambos grupos donde cada grupo se introdujo con cada uno de los genes RON de tipo silvestre y el gen mutante R523Q y se trataron con CJ12495.
Adicionalmente, cada uno de los genes mutantes de RON (RON M1254T y RON R1335G) se sobreexpresó en una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón, se activó mediante tratamiento con MSP y se trató con CJ12495 para confirmar el grado de invasión celular.
Como resultado, como se muestra en la Figura 6b, se confirmó que el aumento de la metástasis celular debido a la activación por MSP se inhibió por el tratamiento con CJ12495 en ambos grupos donde cada grupo se introdujo con cada uno de los genes mutantes del gen RON y se trató con CJ12495.
Adicionalmente, cada uno de los genes mutantes de RON (gen RON-activo A160 y gen RON-activo A165) se sobreexpresó en una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón, se activó mediante tratamiento con MSP y se trató con CJ12495 para confirmar el grado de invasión celular.
Como resultado, como se muestra en la Figura 6c, se confirmó que el aumento de la metástasis celular debido a la activación por MSP se inhibió por el tratamiento con CJ12495 en ambos grupos tratados con CJ12495.
Estos resultados indican que cuando RON se activa en las células cancerosas, por ejemplo, cuando está presente una variante del gen RON o un mutante del gen RON, puede aumentarse la sensibilidad a CJ12495.
Por consiguiente, RON activo, por ejemplo, una variante del gen RON o un mutante del gen RON, muestra su uso potencial como biomarcador para predecir la sensibilidad a CJ12567.
Adicionalmente, en el caso de que se exprese el RON activo, puede usarse CJ12495 como fármaco antineoplásico para el mismo.
Ejemplo 4 Análisis de sensibilidad al fármaco para CJ12524 en un gen RON de tipo silvestre, mutante y en una variante
4- 1. Inhibición de la fosforilación de RON por CJ12524
Los presentes inventores analizaron el efecto inhibidor del tratamiento con CJ12524 sobre la fosforilación de RON en un gen RON de tipo silvestre, mutante y en una variante.
Las líneas celulares de cáncer de colon, HT29 y HCT8, que tienen un alto nivel de expresión de p-RON porque el RON siempre está activado, se trataron con CJ12524 para confirmar el nivel de inhibición contra la fosforilación de RON.
Como resultado, como se muestra en la Figura 7a, se confirmó que la fosforilación de RON se inhibió en las células tratadas con diversas concentraciones de CJ12524.
Adicionalmente, Colo320HSR, una línea celular de cáncer de colon en la que no se expresa RON, se le introdujo el gen RON-activo A155 y el gen RON-activo A160, que se expresan constantemente en Colo320HSR, y se trataron con CJ12524 para confirmar el efecto inhibidor contra la fosforilación de RON por el tratamiento con CJ12524.
Como resultado, como se muestra en la Figura 7b, se confirmó que la fosforilación de RON se redujo cuando a las líneas celulares se introdujeron el gen RON-activo A155 y el gen RON-activo A160 y se trataron con CJ12524.
4-2. Inducción de apoptosis debido a la inhibición de la fosforilación de RON por CJ12524
Los presentes inventores analizaron el efecto de inducir la apoptosis debido a la inhibición de la fosforilación de RON por el tratamiento con CJ12524.
Las líneas celulares de cáncer de colon, HT29 y HCT8, que tienen un alto nivel de expresión de p-RON porque el RON siempre está fosforilado, se trataron con CJ12524 para confirmar la presencia de apoptosis.
Como resultado, como se muestra en la Figura 7c, se confirmó que el tratamiento con CJ12524 en diversas concentraciones también aumentaba la apoptosis de acuerdo con la concentración. En particular, se redujo la fosforilación de RON y se incrementó la expresión de la caspasa 3 escindida.
Adicionalmente, la línea celular de cáncer de colon Colo320HSR, en la que no se expresa RON, se le introdujo el gen RON-activo A155 y el gen RON-activo A160, que están constantemente activos en Colo320HSR, y se trató con CJ12524 en varias concentraciones para confirmar la presencia de apoptosis.
Como resultado, como se muestra en la Figura 7d, se confirmó que el tratamiento con CJ12524 en diversas concentraciones también aumentaba la apoptosis de acuerdo con la concentración. En particular, la fosforilación de RON se redujo y la expresión de la caspasa 3 escindida, que es un marcador de apoptosis, se incrementó de acuerdo con la concentración.
4- 3. Inhibición de la metástasis celular debido a la inhibición de la fosforilación de RON por CJ12524
Los presentes inventores analizaron el efecto de inhibir la metástasis celular debido a la inhibición de la fosforilación de RON mediante el tratamiento con CJ12524.
La línea celular de cáncer de colon HCT8, donde el RON siempre está fosforilado, se trató con CJ12524 para confirmar el grado de invasión celular.
Como resultado, como se muestra en la Figura 7e, se confirmó que el tratamiento con CJ12524 inhibió el grado de metástasis celular en aproximadamente un 60 %.
Ejemplo 5 Análisis de sensibilidad al fármaco para CJ12524 en un modelo de xenoinjerto de células cancerosas con RON-activo (modelo PDX)
Para analizar la sensibilidad al fármaco para CJ12524 en un estado in vivo, los presentes inventores trasplantaron una línea de células cancerosas que se determinó que era positiva contra la actividad RON en ratones desnudos y, de esta manera se preparó un modelo de xenoinjerto derivado de células cancerosas (modelo PDX).
5- 1. Confirmación de la inhibición tumoral por CJ12524 en un modelo de xenoinjerto in vivo
La línea celular HCT8, donde RON siempre muestra actividad, se trató con CJ12524 en diversas concentraciones durante 14 días.
Como resultado, como se muestra en la Figura 8a, se confirmó que cuando se midió el tamaño tumoral, se inhibió el crecimiento del tumor (arriba). En particular, casi no hubo disminución en el peso corporal de los ratones (abajo). Adicionalmente, como se muestra en la Figura 8b, cuando se extirpó el tejido tumoral una vez completada la administración del fármaco y se midió el peso del tumor, se confirmó que el peso del tumor se redujo en todos los grupos tratados con CJ12524.
5-2. Inhibición de la fosforilación de RON por CJ12524 en un modelo de xenoinjerto in vivo
Una vez completada la administración de CJ12524, se realizó la ablación del tejido y se confirmó la presencia de fosforilación de RON.
Como resultado, basándose en los análisis mediante el método de tinción inmunoquímica (Figura 8c) y transferencia western (Figura 8d), se confirmó que la fosforilación de RON disminuyó en el grupo tratado con CJ12524.
Estos resultados indican que cuando RON muestra una actividad en las células cancerosas, por ejemplo, cuando está presente una variante del gen RON o un mutante del gen RON, puede aumentarse la sensibilidad a CJ12524. Por consiguiente, el RON activo, por ejemplo, una variante del gen RON o un mutante del gen RON, muestra su uso potencial como biomarcador para predecir la sensibilidad a CJ12524.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para predecir la sensibilidad de un paciente en cuestión con cáncer a un inhibidor de la proteína quinasa c-MET que comprende:
(a) medir el nivel de expresión de un Recepteur d'Origine Nantais (RON) en una forma activa que comprende una variante de corte y empalme o mutante del gen RON dentro de una muestra biológica que se obtiene de un sujeto mediante un método de detección por el uso de un agente seleccionado de un oligonucleótido antisentido, un par de cebadores, o una sonda que se une específicamente al ARNm del RON activo o un anticuerpo, un péptido o un nucleótido que se une específicamente a la proteína RON activa; y
(b) determinar la sensibilidad del sujeto a un inhibidor de la proteína quinasa en base al resultado que se midió en la etapa (a).
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cuando se confirma la expresión de RON activo, se determina que el sujeto en cuestión con cáncer tiene sensibilidad a un inhibidor de la proteína quinasa c-MET.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cuando el nivel de expresión de RON activo es más alto que el del grupo de control, se determina que el paciente en cuestión con cáncer tiene sensibilidad a un inhibidor de la proteína quinasa c-MET.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la variante de corte y empalme es al menos una seleccionada del grupo que consiste en RONA155 de la SEQ ID NO: 1, RONA160 de la SEQ ID NO: 2 y RONA165 de la SEQ ID NO: 3.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el mutante es al menos uno seleccionado del grupo que consiste de un mutante en el que el aminoácido 1254 en el polipéptido de la SEQ ID NO: 4 se sustituye de M a T; un mutante en el que el aminoácido 1335 en el polipéptido de la SEQ ID NO: 4 se sustituye de R a G; un mutante en el que el aminoácido 523 en el polipéptido de la SEQ ID NO: 4 se sustituye de R a Q; un mutante en el que el aminoácido 1232 en el polipéptido de la SEQ ID NO: 4 se sustituye de D a V; y un mutante en el que el aminoácido 1268 en el polipéptido de la SEQ ID NO: 4 se sustituye de M a T.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de proteína quinasa es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en CJ12495, CJ12537, CJ12524, CJ12567, K252a, SU11274, PHA-665752, ARQ-197, PF-02341066, JNJ-38877605, Foretinib, SGX523, MP470, AMG102, AMG706, LY2801653 y XL-184.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de proteína quinasa es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en CJ12495, CJ12537, CJ12524 y CJ12567.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente para medir el nivel de expresión de un Recepteur d'Origine Nantais (RON) en una forma activa que comprende una variante de corte y empalme o mutante del gen de RON, es un par de cebadores que consiste en un cebador directo de la SEQ ID NO: 5 y un cebador inverso de la SEQ ID NO: 6.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente para medir el nivel de expresión de un Recepteur d'Origine Nantais (RON) en una forma activa que comprende una variante de corte y empalme o mutante del gen RON, es un anticuerpo capaz de detectar la fosforilación de RON.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer productor de ACTH, leucemia linfocítica o linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda o crónica, leucemia no linfocítica aguda, cáncer de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, cáncer de canal cervical, leucemia mieloide crónica, cáncer intestinal, linfoma de la zona T, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, sarcoma de Ewing, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de lengua, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma, mieloma múltiple, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de pene, retinoblastoma, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de testículo, tumor de Wilms y trofoblastoma,
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer es cáncer de colon.
12. Uso de una composición o un kit que comprende un agente para medir el nivel de expresión de RON activo seleccionado de un oligonucleótido antisentido, un par de cebadores o una sonda que se une específicamente al ARNm de RON activo o un anticuerpo, un péptido o un nucleótido que se une específicamente a la proteína RON activa, en un método de acuerdo con la reivindicación 1 para predecir la sensibilidad de un paciente en cuestión con cáncer a un inhibidor de la proteína quinasa c-MET.
13. Uso de una composición o un kit de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el agente para medir el nivel de expresión de RON activo es un par de cebadores que consisten en un cebador directo de la SEQ ID NO: 5 y un cebador inverso de la SEQ ID NO: 6.
14. Uso de una composición o un kit de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el agente para medir el nivel de expresión de RON activo es un anticuerpo capaz de detectar la fosforilación de RON.
ES15837406T 2014-09-03 2015-09-03 Biomarcador para predecir la sensibilidad al inhibidor de proteína quinasa y uso de este Active ES2876232T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140116787 2014-09-03
PCT/KR2015/009322 WO2016036172A1 (ko) 2014-09-03 2015-09-03 단백질 키나제 억제제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2876232T3 true ES2876232T3 (es) 2021-11-12

Family

ID=55440124

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15837406T Active ES2876232T3 (es) 2014-09-03 2015-09-03 Biomarcador para predecir la sensibilidad al inhibidor de proteína quinasa y uso de este

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11946934B2 (es)
EP (1) EP3190416B1 (es)
JP (2) JP6761798B2 (es)
KR (1) KR101862719B1 (es)
CN (1) CN107406492B (es)
ES (1) ES2876232T3 (es)
WO (1) WO2016036172A1 (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102221689B1 (ko) * 2018-03-08 2021-03-02 웰마커바이오 주식회사 티에노피리딘 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2020226333A1 (ko) * 2019-05-03 2020-11-12 주식회사 디시젠 암 예후 예측방법 및 이의 조성물
JP2022554042A (ja) * 2019-09-06 2022-12-28 ウェルマーカー・バイオ・カンパニー・リミテッド バイオマーカー型治療用組成物
WO2021158071A1 (ko) * 2020-02-06 2021-08-12 웰마커바이오 주식회사 Kras 돌연변이와 관련된 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
EP4115887A4 (en) * 2020-03-03 2024-07-17 Wellmarker Bio Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF CANCER HAVING KRAS MUTATION AND RON ACTIVATION
CN113388680B (zh) * 2020-03-14 2023-07-04 复旦大学附属妇产科医院 上皮性卵巢癌靶点ret及其在诊断和治疗中的作用
WO2021235813A1 (ko) * 2020-05-18 2021-11-25 웰마커바이오 주식회사 Ron 돌연변이와 관련된 췌장암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 방법
KR20210142554A (ko) * 2020-05-18 2021-11-25 웰마커바이오 주식회사 Ron 돌연변이와 관련된 비소세포 폐암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 방법
CN115916210A (zh) * 2020-05-18 2023-04-04 伟迈可生物有限公司 用于预防或治疗与ron突变相关的小细胞肺癌的药物组合物及其使用方法
EP4501328A1 (en) * 2022-03-31 2025-02-05 Chordia Therapeutics Inc. Biomarker for treatment of solid cancer by imidazo[4,5-b]pyridine derivative
WO2023195803A1 (ko) * 2022-04-06 2023-10-12 웰마커바이오 주식회사 Ron 돌연변이와 관련된 두경부암 예방 또는 치료용 약학 조성물

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050266417A1 (en) * 2003-09-12 2005-12-01 Francis Barany Methods for identifying target nucleic acid molecules
US20080113874A1 (en) * 2004-01-23 2008-05-15 The Regents Of The University Of Colorado Gefitinib sensitivity-related gene expression and products and methods related thereto
JP2010511382A (ja) * 2006-12-01 2010-04-15 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 癌関連タンパク質キナーゼ
WO2009051992A1 (en) 2007-10-19 2009-04-23 Bausch & Lomb Incorporated Compositions and methods for treating diseases involving ocular angiogenesis by inhibiting one or more selected receptor tyrosine kinases
AR069393A1 (es) * 2007-11-21 2010-01-20 Imclone Systems Inc Inhibicion del receptor para la proteina estimulante del macrofago (ron) y metodos para el tratamiento del mismo
US20130260376A1 (en) * 2010-08-02 2013-10-03 Whitehead Institute For Biomedical Research Prediction of and Monitoring Cancer Therapy Response Based on Gene Expression Profiling
KR101245559B1 (ko) 2012-06-29 2013-03-22 한국화학연구원 신규 다중치환 벤즈옥사졸로 치환된 피리딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 이상세포 성장 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR101350006B1 (ko) 2012-09-06 2014-02-13 씨제이제일제당 (주) 피리돈 유도체를 포함하는 단백질 키나제 억제제
JP6779858B2 (ja) * 2014-07-29 2020-11-04 ウェルマーカー バイオ カンパニー リミテッド Ｅｇｆｒ−標的製剤に対する感受性予測用の新規なバイオマーカー及びその用途

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160028399A (ko) 2016-03-11
JP7037836B2 (ja) 2022-03-17
CN107406492B (zh) 2021-12-24
JP2017527287A (ja) 2017-09-21
WO2016036172A1 (ko) 2016-03-10
JP6761798B2 (ja) 2020-09-30
EP3190416A4 (en) 2018-04-11
EP3190416B1 (en) 2021-03-17
CN107406492A (zh) 2017-11-28
JP2020202839A (ja) 2020-12-24
US11946934B2 (en) 2024-04-02
KR101862719B1 (ko) 2018-05-31
EP3190416A1 (en) 2017-07-12
US20180180616A1 (en) 2018-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2876232T3 (es) Biomarcador para predecir la sensibilidad al inhibidor de proteína quinasa y uso de este
US10787713B2 (en) Mutations of the PIK3CA gene in human cancers
Azarova et al. Emerging importance of ALK in neuroblastoma
Lee et al. Comprehensive analysis of RET and ROS1 rearrangement in lung adenocarcinoma
JP6404378B2 (ja) 前立腺癌における再発性遺伝子融合
JP7369672B2 (ja) Ｅｇｆｒ－標的製剤に対する感受性予測用の新規なバイオマーカー及びその用途
CN109563549B (zh) 反义长非编码rna中的遗传变异作为对疾病治疗的敏感性的生物标志物
ES2727904T3 (es) Método para el pronóstico y tratamiento de cáncer metastatizante del hueso que se origina a partir de cáncer de mama
US20160032399A1 (en) Method for the Prognosis and Treatment of Renal Cell Carcinoma Metastasis
ES2968789T3 (es) Procedimiento combinado para el tratamiento del cáncer
Wu et al. Coexpression of receptor tyrosine kinase AXL and EGFR in human primary lung adenocarcinomas
ES2305087T3 (es) Polinucleotidos relacionados con el cancer de colon.
US10563265B2 (en) Use of RHOA in cancer diagnosis and inhibitor screening
ES2873377T3 (es) Procedimientos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de cáncer de pulmón
US20140377252A1 (en) Method for predicting the response to treatment with an her2-blocking agent
WO2013172922A1 (en) Lmtk3 genotype analysis for use in predicting outcome and therapy selection