ES2865449T3

ES2865449T3 - Cromatografía de intercambio iónico con selectividad mejorada para la separación de monómeros, agregados y fragmentos polipeptídicos por modulación de la fase móvil

Info

Publication number: ES2865449T3
Application number: ES17201391T
Authority: ES
Inventors: Sebastian Neumann
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2012-03-14
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2032-03-14
Also published as: EP3318571B1; PL2686334T5; US9394337B2; ES2656167T3; ES2656167T5; EP3318571A1; WO2012123488A1; SI2686334T1; SI3318571T1; EP2686334A1; US20200148719A1; HRP20210588T1; PL2686334T3; HRP20180028T4; JP2018058900A; JP5984854B2; JP6273326B2; SI2686334T2; US10377793B2; US20140081000A1

Abstract

Un procedimiento para producir un anticuerpo de la clase IgG en forma monomérica que comprende las siguientes etapas: - aplicar una primera solución que comprende opcionalmente poli(etilenglicol) y glicina a un material cromatográfico de intercambio catiónico y equilibrar, de este modo, el material, - aplicar la solución que comprende el anticuerpo de la clase IgG al material de cromatografía equilibrado y cargar, de este modo, el material de cromatografía, - producir el anticuerpo de la clase IgG en forma monomérica aplicando una solución al material cromatográfico que comprende poli(etilenglicol) y glicina y desorber/eluir, de este modo, el anticuerpo de la clase IgG en forma monomérica del material cromatográfico, con lo que el poli(etilenglicol) tiene una concentración de un 10 % en peso y la glicina tiene una concentración de desde un 1 % a un 8 % en peso.

Description

DESCRIPCIÓN

Cromatografía de intercambio iónico con selectividad mejorada para la separación de monómeros, agregados y fragmentos polipeptídicos por modulación de la fase móvil

En el presente documento se informa de un procedimiento para separar monómeros, agregados y fragmentos polipeptídicos usando cromatografía de intercambio iónico, con lo que en la etapa de recuperación se añaden un polímero no iónico y un aditivo a la fase móvil.

Antecedentes de la invención

Las proteínas, y especialmente las inmunoglobulinas, desempeñan un papel importante en la cartera médica actual. Los polipéptidos para su uso en aplicaciones farmacéuticas se producen principalmente en células de mamífero, tales como células CHO, células NS0, células Sp2/0, células COS, células He K, células BHK, células PER.C6® y similares.

Debido a sus propiedades químicas y físicas, tales como el peso molecular y la arquitectura de los dominios, incluyendo las modificaciones secundarias, el procesamiento posterior de las inmunoglobulinas es muy complicado. Por ejemplo, no solo se requieren soluciones concentradas para fármacos formulados, sino también para intermediarios en el procesamiento posterior (DSP), para lograr bajos volúmenes para la gestión económica y el almacenamiento de aplicaciones. El procesamiento posterior de inmunoglobulinas producidas biotecnológicamente típicamente comprende tres etapas de cromatografía: una primera etapa de cromatografía de afinidad usando, por ejemplo, proteína A, para extraer moléculas distintas a inmunoglobulina, seguida de dos etapas de cromatografía de intercambio iónico. La inmunoglobulina purificada se obtiene en una solución de baja concentración que requiere una etapa de concentración antes de formular el anticuerpo en la formulación farmacéutica. Muchas proteínas, incluyendo IgG, forman dímeros, oligómeros o agregados de orden superior. Para proporcionar un producto de proteína terapéutica con la pureza requerida, estas especies moleculares se deben extraer por el procedimiento de purificación.

Están bien establecidos diferentes procedimientos y se usan ampliamente para la purificación de proteínas (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102). Zhou, J.X., et al. (J. Chrom. A 1175 (2007) 69-80) informan de una cromatografía de intercambio catiónico con gradiente híbrido de pH-conductividad para la purificación de anticuerpos monoclonales a escala de procedimiento. Se informa de la separación de monómeros de anticuerpo de sus multímeros por el uso de cromatografía de intercambio iónico en el documento EP 1084 136. El documento US 5.429.746 se refiere a la aplicación de cromatografía de combinación con cromatografía de interacción hidrófoba para la purificación de proteínas de moléculas de anticuerpo.

Se informa de la modulación del disolvente de cromatografía en columna por Arakawa, T., et al. en Prot. Pep. Lett. 15 (2008) 544-555. En el documento EP 1729867, se informa de un procedimiento para la purificación cromatográfica. Se informa de la extracción de agregados de anticuerpo por cromatografía con hidroxiapatita en Gagnon, P. y Beam, K., en Curr. Pharm. Biotechnol. 10 (2009) 440-446. En J. Immunol. Meth. (336 (2008) 222-228), Gagnon, P. informa de una extracción de agregados de anticuerpo mejorada por cromatografía con hidroxiapatita en presencia de polietilenglicol. En el documento WO 2004/013162, se informa de una capacidad de unión dinámica incrementada en la cromatografía de intercambio iónico por adición de polietilenglicol. En el documento WO 2005/094960, se informa de un procedimiento para la purificación cromatográfica. Se informa de la capacidad y purificación potenciadas de anticuerpos por cromatografía en modo mixto en presencia de polímeros orgánicos no iónicos solubles en agua en el documento W o 2008/086335. En el documento WO 2009/149067, se informa de un procedimiento para la purificación de anticuerpos.

Milby, K.H., et al. informan de la cromatografía de intercambio iónico de proteínas y del efecto de polímeros neutros en la fase móvil (J. Chrom. 482 (1989) 133-144). En Biotechnology Techniques (12 (1998) 289-293) Feng, X-L., et al. informan de que polietilenglicol mejora la purificación del factor de necrosis tumoral humano recombinante durante la cromatografía de intercambio iónico. Se informa de un procedimiento para obtener selectividades únicas en la cromatografía de intercambio iónico por adición de polímeros orgánicos a la fase móvil por Gagnon, P., et al. (J. Chrom. 743 (1996) 51-55). Gagnon, P., en un artículo de internet en validated.com (http://www.validated.com/revalbio/pdffiles/ionslect.pdf), informa del ajuste de selectividad en los intercambiadores iónicos. En el documento WO 2009/149067, se informa de un procedimiento para la purificación de anticuerpos.

Sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones y todo lo que no entre dentro de las reivindicaciones es con propósitos informativos.

Se ha descubierto que se pueden emplear altas concentraciones de PEG durante la cromatografía de intercambio catiónico en presencia de determinados aditivos (potenciadores de solubilidad) para modular la selectividad y mejorar la resolución de las especies de monómeros y agregados de anticuerpo, por ejemplo, en comparación con los procedimientos que solo emplean PEG.

En el presente documento se informa de un procedimiento para aislar u obtener o producir un polipéptido de interés en forma monomérica de otro(s) componente(s), tal(es) como el polipéptido de interés en forma agregada, que comprende al menos una etapa cromatográfica. En un modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto una solución que comprende el polipéptido de interés con un material de cromatografía de intercambio catiónico, en el que el contacto con el material de cromatografía tiene lugar en ausencia de un polímero no iónico y un aditivo, y en el que la recuperación tiene lugar en presencia de un polímero no iónico y un aditivo.

Se ha descubierto que, usando un aditivo adicional en un procedimiento como se informa en el presente documento, se puede mejorar el efecto del polímero no iónico.

Un aspecto como se informa en el presente documento es un procedimiento para producir un anticuerpo de la clase IgG en forma monomérica que comprende las siguientes etapas:

- aplicar una primera solución que comprende opcionalmente poli(etilenglicol) y glicina a un material cromatográfico de intercambio catiónico y equilibrar, de este modo, el material,

- aplicar la solución que comprende el anticuerpo de la clase IgG al material de cromatografía equilibrado y cargar, de este modo, el material de cromatografía,

- producir el anticuerpo de la clase IgG en forma monomérica aplicando una solución al material cromatográfico que comprende poli(etilenglicol) y glicina y desorber/eluir, de este modo, el anticuerpo de la clase IgG en forma monomérica del material cromatográfico,

con lo que el poli(etilenglicol) tiene una concentración de un 10 % en peso y la glicina tiene una concentración de desde un 1 % a un 8 % en peso.

Otro aspecto como se informa en el presente documento es un procedimiento para producir en forma monomérica un anticuerpo CrossMab de cuatro cadenas de longitud completa que comprende las siguientes etapas:

a) cultivar una célula de mamífero que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo y recuperar el anticuerpo de la célula o del medio de cultivo,

b) purificar el anticuerpo con un procedimiento de cromatografía de intercambio catiónico que comprende las siguientes etapas:

- aplicar una solución que comprende poli(etilenglicol) y glicina a un material de cromatografía en el que se ha adsorbido un anticuerpo, con lo que el anticuerpo de longitud completa de cuatro cadenas en forma monomérica permanece adsorbido en un material de cromatografía de intercambio iónico, y

- recuperar el anticuerpo CrossMab de longitud completa de cuatro cadenas en forma monomérica del material de cromatografía de intercambio iónico aplicando una solución que comprende poli(etilenglicol) y glicina, con lo que el poli(etilenglicol) tiene una concentración de un 10 % en peso y la glicina tiene una concentración de desde un 1 % a un 8 % en peso, y producir, de este modo, el anticuerpo.

En el presente documento se informa de un procedimiento para producir un anticuerpo en forma monomérica que comprende las siguientes etapas:

- aplicar una solución que comprende un polímero no iónico y un aditivo a un material de cromatografía en el que se ha adsorbido un anticuerpo, con lo que el anticuerpo en forma monomérica permanece adsorbido en el material de cromatografía de intercambio iónico, y

- recuperar el anticuerpo en forma monomérica del material de cromatografía de intercambio iónico aplicando una solución que comprende un polímero no iónico, un aditivo y un compuesto de elución, y producir, de este modo, el anticuerpo en forma monomérica.

En el presente documento se informa de un procedimiento para producir una preparación de polipéptido con contenido de proteína de célula huésped reducido, con lo que la preparación se obtiene de un sobrenadante de cultivo de células de mamífero, especialmente un sobrenadante de cultivo de células CHO, que comprende las siguientes etapas:

- aplicar una solución que comprende un polímero no iónico y un aditivo a un material de cromatografía en el que se ha adsorbido el polipéptido, con lo que el polipéptido en forma monomérica permanece adsorbido en el material de cromatografía de intercambio iónico, y

- recuperar el polipéptido en forma monomérica del material de cromatografía de intercambio iónico aplicando una solución que comprende un polímero no iónico, un aditivo y un compuesto de elución, y producir, de este modo, la preparación de polipéptido con contenido de proteína de célula huésped reducido.

En el presente documento se informa de un procedimiento para determinar la concentración de un polímero no iónico y un aditivo para su uso en una cromatografía de intercambio iónico de un polipéptido que comprende las siguientes etapas:

- determinar en solución, en ausencia del aditivo, la concentración del polímero no iónico en la que menos de un 50 % del polipéptido permanece en solución,

- determinar en solución, en presencia de una concentración del polímero no iónico que se ha determinado en la etapa previa, la concentración del aditivo en la que más de un 95 % del polipéptido permanece en solución, determinando, de este modo, la concentración de un polímero no iónico y un aditivo.

En el presente documento se informa de un procedimiento para producir un anticuerpo en forma monomérica que comprende la siguiente etapa:

- recuperar el anticuerpo en forma monomérica de un material de cromatografía de intercambio iónico aplicando una solución que comprende un polímero no iónico, un aditivo y un compuesto de elución, y producir, de este modo, el anticuerpo en forma monomérica,

en el que la eficacia de separación (resolución) de la cromatografía se potencia en comparación con una cromatografía en ausencia del polímero no iónico, y

en el que la concentración empleada del polímero no iónico daría como resultado una precipitación parcial o completa del anticuerpo en ausencia del aditivo.

En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio iónico es un material de cromatografía de intercambio catiónico.

El polímero no iónico se puede seleccionar del grupo que comprende poli(etilenglicol) (PEG), poli(propilenglicol) (PPG), copolímeros PEG-PPG y copolímeros de tres bloques compuestos por poli(oxipropileno) (poli(óxido de propileno)) flanqueado por poli(oxietileno) (poli(óxido de etileno)). En otro modo de realización, el polímero no iónico es poli(etilenglicol).

El aditivo se puede seleccionar del grupo que comprende iones dipolares, aminoácidos, urea, derivados de urea, anfolitos, CHAPSO, productos naturales, glúcidos y polioles. En otro modo de realización, el aditivo es sorbitol. El polímero no iónico puede tener una concentración de desde aproximadamente un 5 % a un 15 % en peso y/o el aditivo tiene una concentración de desde un 3 % a un 25 % en peso.

En un modo de realización, el polipéptido es un anticuerpo de clase IgG o IgD o IgE o IgA. En otro modo de realización, el polipéptido es un anticuerpo de clase IgG, subclase IgG1, o subclase IgG2, o subclase IgG3, o subclase IgG4. En un modo de realización, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

- aplicar una primera solución que comprende opcionalmente un polímero no iónico y un aditivo a un material cromatográfico de intercambio iónico y equilibrar, de este modo, el material de cromatografía de intercambio iónico,

- aplicar una solución tamponada que comprende el polipéptido al material de cromatografía equilibrado y adsorber, de este modo, el polipéptido en el material de cromatografía, con lo que la solución está esencialmente libre de un polímero no iónico y un aditivo,

- aplicar una solución tamponada que comprende un polímero no iónico y un aditivo al material de cromatografía, con lo que el polipéptido en forma monomérica permanece adsorbido en el material de cromatografía de intercambio iónico, y

- recuperar el polipéptido en forma monomérica del material de cromatografía de intercambio iónico aplicando una solución que comprende un polímero no iónico, un aditivo y un compuesto de elución.

En un modo de realización, el polipéptido es un anticuerpo.

En un modo de realización, se aplican aproximadamente 40 g de polipéptido (anticuerpo) por litro de material de cromatografía. En un modo de realización, se aplican aproximadamente 30 g de polipéptido (anticuerpo) por litro de material de cromatografía. En un modo de realización, se aplican aproximadamente 20 g de polipéptido (anticuerpo) por litro de material de cromatografía.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se informa de un procedimiento para producir un polipéptido de interés en forma monomérica separándolo de otro(s) componente(s), tal(es) como el polipéptido de interés en forma agregada, que comprende al menos una etapa cromatográfica. En un modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto una solución que comprende el polipéptido de interés y un material de cromatografía de intercambio catiónico, en el que el contacto con el material de cromatografía tiene lugar en ausencia de un polímero no iónico y un aditivo, y en el que la recuperación tiene lugar en presencia de un polímero no iónico y un aditivo.

Se ha descubierto que la presencia de un polímero no iónico y un aditivo incrementa la diferencia en el tiempo de retención (resolución) de un polipéptido en forma monomérica en comparación con el polipéptido en forma agregada en un material de cromatografía de intercambio catiónico, lo que posibilita, de este modo, una selectividad novedosa para la extracción mejorada de un polipéptido en forma agregada del polipéptido en forma monomérica.

Especialmente, se ha descubierto que se pueden emplear altas concentraciones de PEG durante la cromatografía de intercambio catiónico en presencia de determinados aditivos (potenciadores de solubilidad) para modular la selectividad y para mejorar la resolución de las especies de monómeros y agregados de anticuerpo, por ejemplo, en comparación con los procedimientos que solo emplean PEG.

El poli(etilenglicol) es viscoso y las altas viscosidades de los tampones de migración en aplicaciones cromatográficas dan lugar a determinadas limitaciones prácticas durante las aplicaciones cromatográficas.

Un procedimiento de separación cromatográfica se puede caracterizar por la resolución de los picos individuales del cromatograma de elución. El valor de resolución se puede calcular de acuerdo con Kaltenbrunner, O., et al., Biotechnol. Bioeng. 98 (2007) 201-210, o Grushka, E., Anal. Chem. 44 (1972) 1733 -1738.

Los procedimientos cromatográficos generales y su uso son conocidos por un experto en la técnica. Véanse, por ejemplo, Heftmann, E., (ed.), Chromatography, 5.a edición, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Deyl, Z., (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, vol. 60, Elsevier Science BV, Ámsterdam, The Netherlands, (1998); Poole, C.F., y Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag (1982); Sambrook, J. et al., (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); o Ausubel, F.M. et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1998).

Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácido unidos por enlaces peptídicos, ya sean producidos natural o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 20 residuos de aminoácido se denominan "péptidos". Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas o al menos una cadena polipeptídica de más de 100 residuos de aminoácido. Un polipéptido también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos glucídicos. Los grupos glucídicos y otros sustituyentes no peptídicos se pueden añadir a un polipéptido por la célula en la que se produce el polipéptido, y variarán con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen en el presente documento en términos de sus estructuras de cadena principal aminoacídica; los sustituyentes, tales como los grupos glucídicos, en general, no se especifican, pero, no obstante, pueden estar presentes.

El término "aplicar a" indica una etapa parcial de un procedimiento de purificación en la que una solución se pone en contacto con un material de cromatografía. Esto indica que a) la solución se añade a un dispositivo cromatográfico en el que está contenido el material de cromatografía, o bien b) que el material de cromatografía se añade a una solución que comprende el polipéptido. En el caso a), la solución pasa a través del dispositivo, lo que permite la adsorción de las sustancias contenidas en solución en el material de cromatografía. Dependiendo de las condiciones, tales como, por ejemplo, pH, conductividad, concentración de sal, temperatura y/o caudal, algunas sustancias de la solución se adsorben en el material de cromatografía y otras sustancias se pueden recuperar de la fracción no adsorbida. La "fracción no adsorbida" indica la solución obtenida después del paso del dispositivo, que puede ser la solución aplicada o bien una solución tamponada, que se usa para lavar la columna o para provocar la elución de sustancias adsorbidas en el material de cromatografía. En un modo de realización, el dispositivo es una columna o un casete. En el caso b), el material de cromatografía se puede añadir, por ejemplo, como un sólido, a la solución, por ejemplo, que contiene la sustancia de interés que se va a purificar, lo que permite una interacción entre el material de cromatografía y las sustancias en solución. Después de la interacción, el material de cromatografía se extrae, por ejemplo, por filtración, y la sustancia unida al material de cromatografía también se extrae con el mismo de la solución, mientras que las sustancias no unidas al material de cromatografía permanecen en solución. En un modo de realización, se adsorben aproximadamente 40 g de polipéptido (anticuerpo) por litro de material de cromatografía. En un modo de realización, se adsorben aproximadamente 30 g de polipéptido (anticuerpo) por litro de material de cromatografía. En un modo de realización, se adsorben aproximadamente 20 g de polipéptido (anticuerpo) por litro de material de cromatografía.

El término "modo de unión y elución" indica un modo de funcionamiento de una etapa de cromatografía, en el que se aplica una solución que contiene una sustancia de interés que se va a purificar a un material de cromatografía, con lo que la sustancia de interés se une al material de cromatografía. Por tanto, la sustancia de interés se retiene en el material de cromatografía, mientras que las sustancias que no son de interés se extraen con la fracción no adsorbida o el sobrenadante. La sustancia de interés se recupera después del material de cromatografía en una segunda etapa con una solución de elución. En un modo de realización, el procedimiento como se informa en el presente documento se hace funcionar en modo de unión y elución.

Las soluciones empleadas en el procedimiento como se informa en el presente documento son soluciones brutas o tamponadas. El término "solución tamponada" indica una solución en la que los cambios de pH debidos a la adición o liberación de sustancias ácidas o alcalinas se nivelan por la sustancia tampón disuelta. Se puede usar cualquier sustancia tampón con dichas propiedades. En general, se usan sustancias tampón farmacéuticamente aceptables. En un modo de realización, la solución tamponada se selecciona de una solución tamponada con fosfato que consiste en ácido fosfórico y/o sales del mismo, o una solución tamponada con acetato que consiste en ácido acético y sales del mismo, o una solución tamponada con citrato que consiste en ácido cítrico y/o sales del mismo, o una solución tamponada con morfolina, o una solución tamponada con un 2-(N-morfolino)etanosulfónico, o una solución tamponada con histidina, o una solución tamponada con glicina o una solución tamponada con tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). En otro modo de realización, la solución tampón se selecciona de una solución tamponada con fosfato, o una solución tamponada con acetato, o una solución tamponada con citrato o una solución tamponada con histidina. Opcionalmente, la solución tamponada puede comprender una sal adicional, tal como, por ejemplo, cloruro de sodio, sulfato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, citrato de sodio o citrato de potasio.

Los términos "elución continua" y "procedimiento de elución continua" indican un procedimiento en el que la conductividad de una solución que provoca la elución, es decir, la recuperación de un compuesto unido de un material de cromatografía, se cambia, es decir, se eleva o disminuye, de forma continua, es decir, la concentración se cambia por una secuencia de pequeñas etapas, cada una no mayor de un cambio de un 2 %, o de un 1 %, de la concentración de la sustancia que provoca la elución. En esta "elución continua", una o más condiciones, por ejemplo, el pH, la fuerza iónica, concentración de una sal y/o el flujo de la fase móvil, se pueden cambiar de forma lineal o exponencial o asintótica. En un modo de realización, el cambio es lineal.

El término "elución escalonada" indica un procedimiento en el que, por ejemplo, la concentración de una sustancia que provoca la elución, es decir, la recuperación de una sustancia unida de un material de cromatografía, se eleva o disminuye de una vez, es decir, directamente desde un valor/nivel al siguiente valor/nivel. En esta "elución escalonada", una o más condiciones, por ejemplo, el pH, la fuerza iónica, concentración de una sal y/o el flujo de una cromatografía, se pueden cambiar todas a la vez desde un primer valor, por ejemplo, de partida, a un segundo valor, por ejemplo, final. Por tanto, las condiciones se cambian de forma incremental, es decir, de forma escalonada, a diferencia de un cambio lineal.

El término "material de cromatografía de intercambio iónico" indica una matriz de alto peso molecular inmóvil que tiene sustituyentes cargados unidos covalentemente usadacomo fase estacionaria en la cromatografía de intercambio iónico. Para la neutralidad de carga global, los contraiones no unidos covalentemente se unen a la misma. El "material de cromatografía de intercambio iónico" tiene la capacidad de intercambiar sus contraiones no unidos covalentemente por iones cargados de forma similar de la solución circundante. Dependiendo de la carga de sus contraiones intercambiables, la "resina de intercambio iónico" se denomina resina de intercambio catiónico o resina de intercambio aniónico. Dependiendo de la naturaleza del grupo cargado (sustituyente), la "resina de intercambio iónico" se denomina, por ejemplo, en el caso de resinas de intercambio catiónico, resina de ácido sulfónico (S) o resina de sulfopropilo (SP) o resina de carboximetilo (CM).

Están disponibles diferentes tipos de materiales de intercambio iónico, es decir, fases estacionarias, bajo diferentes nombres y de una multitud de empresas, tales como, por ejemplo, los materiales de intercambio catiónico Bio-Rex® (por ejemplo, de tipo 70), Chelex® (por ejemplo, de tipo 100), Macro-Prep® (por ejemplo, de tipo CM, High S, 25 S), Ag® (por ejemplo, de tipo 50W, m P), todos disponibles de BioRad Laboratories, WCX 2, disponible de Ciphergen, Dowex® MAC-3, disponible de Dow Chemical Company, Mustang C y Mustang S, disponibles de Pall Corporation, Cellulose CM (por ejemplo, de tipo 23, 52), hyper-D, partisphere, disponible de Whatman plc., Amberlite® IRC (por ejemplo, de tipo 76, 747, 748), Amberlite® GT 73, Toyopearl® (por ejemplo, de tipo SP, CM, 650M), todos disponibles de Tosoh Bioscience GmbH, CM 1500 y CM 3000, disponibles de BioChrom Labs, SP-Sepharose™, CM-Sepharose™, disponibles de GE Healthcare, resinas Poros, disponibles de Applied Biosystems o PerSeptive Biosystems, Asahipak ES (por ejemplo, de tipo 502C), CXpak P, IEC Cm (por ejemplo, de tipo 825, 2825, 5025, LG), IEC SP (por ejemplo, de tipo 420n , 825), IEC QA (por ejemplo, de tipo LG, 825), disponibles de Shoko America Inc., resina de intercambio catiónico 50W, disponible de Eichrom Technologies Inc. En un modo de realización, el material de intercambio catiónico es un material de intercambio catiónico fuerte, tal como Macro-Prep® High S o 25S, o MacroCap SP, o Toyopearl® SP 650M, o Source S, o SP Sepharose, o POLYCAT A, o Mono S o Highscreen SP.

El término "en condiciones adecuadas para su unión" y los equivalentes gramaticales del mismo indican que una sustancia de interés, por ejemplo, un anticuerpo en forma monomérica, se une a una fase estacionaria cuando se pone en contacto con ella, por ejemplo, un material de intercambio iónico. Esto no indica necesariamente que un 100 % de la sustancia de interés se une, sino que esencialmente un 100 % de la sustancia de interés se une, es decir, al menos un 50 % de la sustancia de interés se une, en un modo de realización al menos un 75 % de la sustancia de interés se une, en otro modo de realización al menos un 85 % de la sustancia de interés se une, en otro modo de realización más de un 95 % de la sustancia de interés se une a la fase estacionaria.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo terapéutico. El término "anticuerpo terapéutico" indica un anticuerpo que se somete a prueba en estudios clínicos para su aprobación como agente terapéutico en seres humanos y que se puede administrar a un individuo para el tratamiento de una enfermedad. En otro modo de realización, el anticuerpo terapéutico es un anticuerpo monoclonal. En otro modo de realización, el anticuerpo terapéutico se obtiene de un homínido o de un animal transformado con un locus de anticuerpo humano o un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal humanizado. En un modo de realización, el anticuerpo terapéutico es un anticuerpo monoclonal humano. En otro modo de realización, el anticuerpo terapéutico es un anticuerpo monoclonal humanizado. Se usan ampliamente anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades, tales como enfermedades oncológicas (por ejemplo, neoplasias malignas hemáticas y sólidas, incluyendo linfoma no hodgkiniano, cáncer de mama y cáncer colorrectal), enfermedades inmunitarias, enfermedades del sistema nervioso central, vasculopatías o enfermedades infecciosas. Dichos anticuerpos son, en un modo de realización, anticuerpos frente a ALK, receptor de cinasas relacionadas con la adhesión (por ejemplo, Axl) o receptores de ERBB (por ejemplo, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4), o receptores hepatocelulares productores de eritropoyetina (EPH) (por ejemplo, EphA1; EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB5, EphB6) o receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (por ejemplo, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, Fg FR5), o Fgr, o IGF-1R, o receptor de insulina, o LTK, o M-Cs FR, o MuSK, o receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (por ejemplo, PDGFR-A, PDGFR-B), o RET, o ROR1, o ROR2, o ROS, o RYK, o receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (por ejemplo, VEGF-R1/FLT1, VEGF-R2/FLK1, VEGF3), o receptores de tirosina cinasa con dominios similares a inmunoglobulinas y similares a EGF (TIE) (por ejemplo, TIE-1, TIE-2/TEK), o Tec, o TYRO10, o receptores del factor de crecimiento insulínico (IGF) (por ejemplo, INS-R, IGF-IR, IR-R), o receptores del dominio de discoidina (DD) (por ejemplo, DDR1, DDR2), o receptor para c-Met (MET), o recepteur d'origine nantais (RON, también conocido como receptor estimulante de macrófagos 1), o FLT3 (tirosina cinasa 3 relacionada con FMS), o receptor del factor estimulante de colonias 1 (CSF1), o receptor para c-kit (KIT o SCF-R) o receptores relacionados con el receptor de insulina (IRR), o CD19, o CD20, o HLA-DR, o CD33, o CD52, o G250, o GD3, o PSMA, o CD56, o CEA, o antígeno de Lewis Y, o receptor de IL-6.

El término "anticuerpo" engloba las diversas formas de estructuras de anticuerpo, incluyendo anticuerpos completos. El anticuerpo, en un modo de realización, es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo deficitario para antígenos de linfocitos T.

La genomanipulación de anticuerpos se describe, por ejemplo, en Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; los documentos US 5.202.238; US 5.204.244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de las cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE e IgG. Algunas de estas clases se dividen además en subclases (isotipos), es decir, IgG en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, o IgA en IgA1 e IgA2. De acuerdo con la clase a la que pertenece un anticuerpo, las regiones constantes de la cadena pesada de los anticuerpos se indican como a (IgA), ó (IgD), £ (IgE) y y (IgG), respectivamente. El término "anticuerpo de clase IgG1 humana", por ejemplo, indica un anticuerpo en el que la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes se deriva de la secuencia de aminoácidos de la IgG1 humana. El término incluye anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y conjugados de anticuerpo.

El término "anticuerpo completo" indica un anticuerpo que comprende dos polipéptidos de cadena ligera (cadenas ligeras) y dos polipéptidos de cadena pesada (cadenas pesadas). Cada uno de los polipéptidos de cadena pesada y ligera contiene un dominio variable (región variable, en general, la porción aminoterminal) que comprende regiones de unión que pueden interactuar con un antígeno. Cada uno de los polipéptidos de cadena pesada y ligera comprende una región constante (en general, la porción carboxiterminal). El dominio variable de una cadena ligera o pesada comprende, a su vez, diferentes segmentos, es decir, cuatro regiones estructurales (FR) y tres regiones hipervariables (CDR).

El término "conjugado de anticuerpo" indica un polipéptido que comprende al menos un dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo conjugada por medio de un enlace peptídico a otro polipéptido. El otro polipéptido puede ser un péptido distinto a un anticuerpo, tal como una hormona, o toxina, o receptor de crecimiento, o péptido antifusogénico, o factor del complemento, o similares.

Para la purificación de anticuerpos producidos de forma recombinante se puede emplear una combinación de diferentes etapas de cromatografía en columna. En general, una cromatografía de afinidad con proteína A está seguida de una o dos etapas de separación adicionales. La etapa de purificación final es la llamada "etapa de pulido" para la extracción de impurezas y contaminantes mínimos, como anticuerpos agregados, PCH (proteína de célula huésped) residual, ADN (ácido nucleico de célula huésped), virus o endotoxinas.

El término "anticuerpo en forma monomérica" indica una molécula de anticuerpo que no se asocia con una segunda molécula de anticuerpo, es decir, que no se une ni covalente ni tampoco no covalentemente a otra molécula de anticuerpo. El término "anticuerpo en forma agregada" indica una molécula de anticuerpo que se asocia, covalente o bien no covalentemente, con al menos una molécula de anticuerpo adicional, y que se eluye en un único pico de una columna de cromatografía de exclusión por tamaño. El término "en forma monomérica" como se usa en el presente documento no necesariamente indica que un 100 % de una molécula de anticuerpo esté presente en forma monomérica. Indica que un anticuerpo está esencialmente en forma monomérica, es decir, al menos un 90 % del anticuerpo está en forma monomérica, en un modo de realización al menos un 95 % del anticuerpo está en forma monomérica, en otro modo de realización al menos un 99 % del anticuerpo está en forma monomérica, en otro modo de realización al menos un 99,5 % del anticuerpo está en forma monomérica, y también en un modo de realización más de un 99,8 % del anticuerpo está en forma monomérica, determinada como el área de pico de un cromatograma de exclusión por tamaño. El término "forma de alto peso molecular (APM)" indica el anticuerpo polimérico, es decir, agregado, con lo que este agregado todavía es soluble en solución acuosa tamponada.

El término "100 %" como se usa en el presente documento indica que la cantidad de componentes distintos de un componente especificado está por debajo del límite de detección del procedimiento analítico al que se hace referencia en las condiciones especificadas.

Los términos "90 %", "95 %", "99 %", "99,5 %" y "99,8 %" como se usa en la presente solicitud no indican ningún valor exacto, sino valores dentro de la exactitud del procedimiento analítico al que se hace referencia en las condiciones especificadas.

El término "compuesto de elución" indica una sal usada para recuperar un polipéptido unido de un material de intercambio iónico, con lo que el compuesto incrementa la conductividad del/de la tampón/solución. Esto se puede lograr por una concentración de sal tampón incrementada o bien por la adición de otras sales, llamadas sales de elución, a la solución tamponada. Las sales de elución preferentes son citrato de sodio, cloruro de sodio, sulfato de sodio, fosfato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, fosfato de potasio, así como otras sales de ácido cítrico y fosfórico, y cualquier mezcla de estos componentes. En un modo de realización, el compuesto de elución se selecciona de citrato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio y mezclas de los mismos.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencias parciales derivadas de un anticuerpo no humano y de un anticuerpo humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados se derivan de un anticuerpo humano (anticuerpo receptor), en el que los residuos de una región hipervariable se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo, oveja, cobaya o primate no humano, que tenga la especificidad y afinidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) del anticuerpo humano se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender otras modificaciones, por ejemplo, residuos de aminoácido que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Dichas modificaciones dan como resultado variantes de dicho anticuerpo receptor o donante, que son homólogas, pero no idénticas, a la secuencia original correspondiente. Estas modificaciones se pueden realizar para refinar además el rendimiento del anticuerpo.

En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables, al menos uno y típicamente dos, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden a los de un anticuerpo donante no humano, y todas o sustancialmente todas las FR son las de un anticuerpo receptor humano. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo, típicamente la de un anticuerpo humano.

En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la región hipervariable, y posiblemente algunos residuos de la región estructural, se sustituyen con residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor o primate no humano.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales de la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades insignificantes. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose frente a un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpo policlonal, que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes sitios antigénicos (determinantes o epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige frente a un único sitio antigénico en un antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en tanto que se pueden sintetizar sin contaminarse por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier procedimiento particular.

El término "anticuerpo quimérico" indica un anticuerpo que comprende un dominio variable, es decir, una región de unión, de una primera especie y al menos una porción de una región constante derivada de una segunda especie diferente.

Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica las cadenas de anticuerpo, o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las propiedades de unión a antígeno que el anticuerpo original.

En la tabla 1 se muestran sustituciones aminoacídicas conservadoras bajo el encabezamiento de "sustituciones preferentes". Los cambios más sustanciales se proporcionan en la tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones ejemplares" y como se describe a continuación en referencia a clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en las cadenas de anticuerpo y cribar los productos para determinar la retención de la actividad biológica del anticuerpo original.

Tabla.

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. El término "fase móvil" indica cualquier mezcla de agua y/o tampón acuoso y/o disolventes orgánicos que sea adecuada para recuperar polipéptidos de una columna de cromatografía. El término "eluir" o "elución", respectivamente, en el presente contexto se usa como es conocido por el experto en la técnica e indica la disolución, opcionalmente el desplazamiento, de sustancia(s) adsorbida(s) de sólidos o adsorbentes, que se impregnan con líquidos, es decir, el material de la columna en el que se adsorbe(n) la(s) sustancia(s).

El término "adsorción" indica la acumulación de sustancias de un líquido, por ejemplo, una fase móvil, en la fase límite formada entre el líquido y una fase sólida, en la que esta última puede adsorber las sustancias de interés en su superficie. Esta adsorción da lugar a una acumulación de las sustancias adsorbidas. La sustancia que puede acumular la sustancia de interés en su superficie se denomina adsorbente y el material adsorbido adsorbato. El término adsorción normalmente se distingue del término "absorción", que, aparte de la acumulación en una superficie, también se refiere a la penetración de las sustancias acumuladas en el interior del sólido o líquido adsorbente. En general, la adsorción es un proceso físico en el que las sustancias, normalmente moléculas, se adhieren a una superficie del adsorbente y, por tanto, se acumulan en la superficie respectiva. Las fuerzas que son responsables de esta adherencia se consideran fuerzas físicas en lugar de enlaces químicos y, por tanto, la adsorción también es conocida en la técnica como adsorción física o fisisorción, que no excluye necesariamente el enlace químico de sustancias con respecto a la superficie. Las fuerzas físicas implicadas en la adsorción de sustancias en una superficie, en la mayoría de los casos, son fuerzas de Van der Waals, fuerzas de London o interacciones dipolo/dipolo, por ejemplo, enlaces de hidrógeno o interacciones dipolo-dipolo inducido, en las que estos términos se usan como se explica en el presente documento o bien como normalmente se usan en contexto con adsorción.

En cromatografía (en columna) normalmente se usan disolventes como eluyente, es decir, el agente de elución en el que la(s) sustancia(s) que se va(n) a eluir es/son al menos suficientemente soluble(s).

En un modo de realización, el polímero no iónico es un polímero no iónico hidrófilo. El polímero se puede seleccionar de poliéter no iónico, tal como poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) (PPG), copolímeros de bloque PEG-PPG, copolímeros PEG-PPG, copolímeros de tres bloques compuestos por poli(oxipropileno) (poli(óxido de propileno)) y dos polímeros de poli(oxietileno) (poli(óxido de etileno)) (poloxámero, Pluronic™) y otros polímeros de tres bloques PEG-PPG-PEG.

El polímero no iónico empleado se puede caracterizar, además de por su bloque constitutivo monomérico, por su peso molecular dado en daltons (Da). El término "peso molecular' indica, con respecto a los polímeros, el peso molecular medio del polímero, puesto que los compuestos poliméricos no se obtienen con un peso molecular definido, sino que, de hecho, tienen una distribución de pesos moleculares. El peso molecular de un polímero se da en la forma "aproximadamente X Da", con lo que "X" indica el valor medio del peso molecular del polímero. El término "aproximadamente" indica que, en la preparación de polímero, algunas moléculas tendrán un peso mayor y algunas moléculas tendrán un peso menor que el peso molecular medio indicado, es decir, el término aproximadamente se refiere a una distribución de pesos moleculares en la que un 95 % de las moléculas de polímero tienen un peso molecular dentro de /- 30 % del peso molecular indicado. Por ejemplo, un peso molecular de 3500 Da indica un intervalo de desde 2450 kDa a 4550 Da. En un modo de realización, las moléculas de polímero tienen un peso molecular dentro de /- 20 % del peso molecular indicado. En un modo de realización, las moléculas de polímero tienen un peso molecular dentro de /- 10 % del peso molecular indicado.

El polímero no iónico puede estar presente en una solución tamponada, tal como una solución tamponada que contiene sal. La solución que comprende el polipéptido de interés se puede obtener directamente del sobrenadante de cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido. El sobrenadante puede ser un sobrenadante de cultivo clarificado o no clarificado.

En un modo de realización, uno o más polímeros no iónicos están presentes en la solución aplicada al material de cromatografía para recuperar el polipéptido, especialmente el anticuerpo. En un modo de realización, la solución aplicada al material de cromatografía para recuperar el anticuerpo en forma monomérica comprende uno, o dos, o tres, o cuatro o cinco polímeros no iónicos diferentes. Si más de un polímero no iónico está presente en la solución, la suma de las concentraciones de todos los polímeros no iónicos presentes en la solución está preferentemente dentro del intervalo como se da en el presente documento.

En un modo de realización, uno o más aditivos están presentes en la solución aplicada al material de cromatografía para recuperar el polipéptido, especialmente el anticuerpo. En un modo de realización, la solución aplicada al material de cromatografía para recuperar el anticuerpo en forma monomérica comprende uno, o dos, o tres, o cuatro o cinco aditivos diferentes. Si más de un aditivo está presente en la solución, la suma de las concentraciones de todos los aditivos presentes en la solución está preferentemente dentro del intervalo como se da en el presente documento.

De forma alternativa, la solución que comprende el polipéptido de interés puede ser el eluido de una etapa de cromatografía precedente.

Las interacciones entre el polipéptido de interés y el material de cromatografía de intercambio iónico pueden ser adsorción, es decir, unión del polipéptido, o un retraso del polipéptido en relación con otro(s) componente(s) también presente(s) en la solución.

Para recuperar un polipéptido en forma monomérica del material de cromatografía de intercambio iónico, la adsorción está seguida de una etapa de elución del polipéptido de interés adsorbido en forma monomérica del material de cromatografía de intercambio iónico. La elución del polipéptido adsorbido se puede efectuar por el cambio de las condiciones salinas, es decir, conductividad y/o el valor de pH en comparación con la etapa de adsorción.

Con la excepción de la adición de un polímero no iónico y un aditivo a las fases móviles durante la recuperación o elución del polipéptido de interés del material de cromatografía de intercambio iónico, las etapas de cromatografía del procedimiento como se informa en el presente documento se realizan de acuerdo con condiciones de funcionamiento generales convencionales y principios bien conocidos en el campo. Se usan convenientemente columnas de cromatografía convencionales, estando adaptado su tamaño para cada caso, como lo son los materiales de partida, tampones, matrices, incluyendo los grupos funcionales de los ligandos, etc.

La carga de un polipéptido se puede cambiar al cambiar el valor de pH de la solución circundante. Es bien conocido que un material de intercambio iónico puede ser un material de intercambio iónico fuerte, lo que significa que se carga a todos los valores de pH, o un material de intercambio iónico débil, lo que significa que se puede cargar al variar el pH.

Se demostró que añadir un polímero no iónico y un aditivo a la fase móvil en una etapa de recuperación de cromatografía de intercambio iónico como se informa en el presente documento incrementaba de forma inesperada el rendimiento del polipéptido en forma monomérica, en comparación con la cromatografía de intercambio iónico convencional. La cromatografía de intercambio iónico es una cromatografía de intercambio catiónico. La concentración del polímero no iónico es de al menos aproximadamente un 5 % en peso y la concentración del aditivo es de al menos un 3 % en peso.

En general, no existen ninguna exclusión de pesos moleculares para el polímero no iónico usado en el procedimiento como se informa en el presente documento. El peso molecular del polímero no iónico se elige de manera que sea lo más bajo posible mientras que dé como resultado, en combinación con el aditivo, un rendimiento incrementado del polipéptido en forma monomérica en comparación con el uso del polímero no iónico solo. El experto en la técnica conoce que la adición de cualquier sustancia, es decir, del polímero no iónico y el aditivo, afecta a (incrementa) la viscosidad de la solución resultante. Por lo tanto, un experto en la técnica apreciará que, debido a las propiedades fisicoquímicas del polímero no iónico y del aditivo, existe un límite superior para la adición de estos compuestos.

El polímero no iónico usado como en el procedimiento como se informa en el presente documento comprende grupos que son ricos en átomos de oxígeno. En un modo de realización, el polímero no iónico es un polímero lineal o ramificado no cargado soluble en agua. Dichos polímeros no iónicos pueden ser poliéter, tal como poli(etilenglicol) (PEG), poli(propilenglicol) (PPG), copolímeros de bloque PEG-PPG, copolímeros PEG-PPG, copolímeros de tres bloques compuestos por una cadena hidrófoba central de poli(oxipropileno) (poli(óxido de propileno)) flanqueada por dos cadenas hidrófilas de poli(oxietileno) (poli(óxido de etileno)) (poloxámero, Pluronic™) y otros polímeros de tres bloques PEG-PPG-PEG, etilhidroxietilcelulosa (EHEC) y polímeros similares, éter alilglicidílico polimerizado, éter fenilglicidílico polimerizado, dextrano, almidón, celulosa, polivinilpirrolidona y diversos tensioactivos y otros compuestos que comprenden estos bloques constitutivos. El polímero no iónico es poli(etilenglicol) (PEG). El término poli(etilenglicol) también comprende poli(etilenglicoles) que se han modificado.

Se puede usar cualquier polímero no iónico de peso molecular en el procedimiento como se informa en el presente documento. Sin embargo, la concentración óptima y la proporción del polímero no iónico y el aditivo pueden variar para cada proteína y, en la mayoría de los casos, existe un peso molecular preferente del polímero no iónico y una proporción preferente del polímero no iónico con respecto al aditivo.

El polímero no iónico es poli(etilenglicol).

Se puede usar poli(etilenglicol) como un polipéptido no iónico modelo general para determinar el comportamiento de polímeros no iónicos dentro del procedimiento como se informa en el presente documento. Por tanto, aunque se usa poli(etilenglicol) como ejemplo en el presente documento, se debe tener en cuenta que la información proporcionada también se aplica a otros polímeros no iónicos, incluyendo los específicamente enumerados anteriormente en el presente documento.

El poli(etilenglicol) está disponible de una serie de fuentes comerciales. En un modo de realización, el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular en el intervalo de desde aproximadamente 100 Da a aproximadamente 40.000 Da. En un modo de realización, el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 400 Da y aproximadamente 10.000 Da. En un modo de realización, el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1000 Da y aproximadamente 8000 Da. En otros modos de realización se utiliza una mezcla de poli(etilenglicoles) de diferentes tamaños.

En un modo de realización, el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2450 Da y aproximadamente 4550 Da. En un modo de realización, el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2625 Da y aproximadamente 4375 Da. En un modo de realización, el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2800 Da y aproximadamente 4200 Da. En un modo de realización, el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 3150 Da y aproximadamente 3850 Da.

En un modo de realización, el poli(etilenglicol) es un poli(etilenglicol) lineal o ramificado.

Los poli(etilenglicoles) de menor peso molecular pueden requerir una mayor concentración másica para usarse para tener un efecto similar en comparación con poli(etilenglicoles) de mayor peso molecular.

Asimismo, se pueden emplear menores concentraciones de un poli(etilenglicol) de un peso molecular especificado para producir un polipéptido más grande en forma monomérica, tal como anticuerpos y proteínas de fusión, en comparación con las concentraciones requeridas para obtener la misma pureza de polipéptidos más pequeños. Por ejemplo, un anticuerpo de la clase IgA, que está presente principalmente como un dímero, que tiene un peso molecular de aproximadamente 320 kDa, requerirá una menor concentración de poli(etilenglicol) en comparación con un anticuerpo de la clase IgG que tiene un peso molecular de aproximadamente 150 kDa. La retención de agregados, complejos y otras moléculas grandes, en general, se puede incrementar más en comparación con la del polipéptido monomérico. También se puede requerir una menor concentración de poli(etilenglicol) para incrementar la retención de polipéptidos que interactúan/se adsorben fuertemente en el material de cromatografía de intercambio catiónico en comparación con la concentración requerida de poli(etilenglicol) requerida para incrementar la adsorción de polipéptidos que normalmente se adsorben débilmente en el material de cromatografía de intercambio catiónico.

El aditivo es una sustancia que puede reducir o incluso evitar la precipitación que se induce por la presencia del polímero no iónico.

En un modo de realización, el aditivo tiene una conductividad que sea lo suficientemente baja como para no interferir en una cromatografía de intercambio catiónico. En otro modo de realización, el aditivo no tiene ninguna capacidad tamponante detectable.

El aditivo puede ser un ion dipolar, o un aminoácido (tal como glicina, bicina, tricina, alanina, prolina, betaína), o urea, o un derivado de urea (tal como alquilureas (metilurea, etilurea, etc.)), o alquilenglicoles (tales como etilenglicol o propilenglicol), o un anfolito (tal como los tampones basados en ácido aminosulfónico tampón MES, MOPS, HEPES, PIPES y CAPS), o CHAPSO, o un producto natural (tal como determinados alcaloides y betaínas), o un glúcido (tal como glucosa, sacarosa, rafinosa) o un poliol (tal como glicerol o xilitol o sorbitol).

El aditivo puede ser un aminoácido. El aminoácido puede ser glicina, o bicina, o tricina, o alanina, o prolina o betaína.

Para cualquier aditivo, se debe tener en cuenta que se debe considerar el límite de solubilidad individual cuando se determina la cantidad o concentración respectiva empleada.

Si se emplea un aminoácido como aditivo, se debe tener en cuenta que una cadena lateral cargada requerirá el uso de ácido o base adicional para ajustar el valor de pH de la solución. Por la adición de ácido o base en exceso, se cambia la fuerza iónica de la fase móvil, lo que, a su vez, podría tener una influencia sobre el resultado de la cromatografía.

Por ejemplo, se puede usar glicina como aditivo en el procedimiento como se informa en el presente documento. La glicina es un compuesto de ion dipolar, más precisamente la glicina es un aminoácido. En los valores de pH, en general, empleados en los procedimientos de cromatografía de intercambio catiónico, la glicina no contribuye a la conductividad global y, por tanto, no debe interferir en el procedimiento de cromatografía de intercambio catiónico. Adicionalmente, la glicina no presenta un efecto tamponante en solución acuosa, tampoco afectará al valor de pH de la fase móvil. Se puede usar glicina como aditivo en el procedimiento como se informa en el presente documento en una concentración de desde aproximadamente 50 mM a 5 M. En un modo de realización, la glicina tiene una concentración de desde aproximadamente 100 mM a aproximadamente 4 M. En otro modo de realización, la glicina tiene una concentración de desde aproximadamente 250 mM a aproximadamente 3 M. En otro modo de realización, la glicina tiene una concentración de desde aproximadamente 500 mM a aproximadamente 2 M. Todavía en otro modo de realización, la glicina tiene una concentración de aproximadamente 1 M. Si se usa más de un aditivo, las concentraciones de los aditivos individuales pueden ser menores que las dadas de forma ejemplar en el párrafo anterior.

Se debe señalar que se puede usar cualquier aditivo en una concentración que sea mayor que la concentración necesaria para lograr el efecto pretendido. Especialmente un experto en la técnica puede determinar el intervalo de concentraciones de aditivos en tanto que el efecto esté presente y que se pueda tolerar en el procedimiento como se informa en el presente documento.

Cuando el aditivo es urea o un derivado de urea, el aditivo está presente en una concentración de hasta 6 molar. En un modo de realización, el aditivo está presente en una concentración por debajo de 2 molar.

Como se explica anteriormente, la concentración del polímero no iónico y del aditivo en la solución de recuperación puede variar. En general, se puede usar cualquier concentración de poli(etilenglicol). La concentración de poli(etilenglicol) es de al menos aproximadamente un 0,5 % en peso.

La concentración del polímero no iónico se puede mantener constante o se puede cambiar durante el transcurso de la cromatografía. Este cambio incluye, pero no se limita a, un gradiente de concentración creciente o decreciente, o con cambios escalonados en la concentración.

El polímero no iónico puede tener una concentración de desde aproximadamente un 7 % a un 13 % en peso y/o el aditivo puede tener una concentración de desde un 3 % a un 25 % en peso.

El uso o adición de un polímero no iónico da como resultado una reducción de la solubilidad de un polipéptido, especialmente de un anticuerpo, presente de forma simultánea en esta solución. En la siguiente tabla, se muestra la dependencia de la solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 (5 mg/ml) como un polipéptido ejemplar a temperatura ambiente (TA) y a 4 °C de la concentración de poli(etilenglicol) 3500 Da añadido (malonato de sodio 50 mM, NaCl 90 mM, pH 6,5).

Tabla.

En la siguiente tabla, se muestra la dependencia de la solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 (5 mg/ml) como un polipéptido ejemplar a temperatura ambiente y a 4 °C de la concentración de cloruro de sodio añadido (malonato de sodio 50 mM, 7,5 % en peso de poli(etilenglicol) con un PM de 3500 Da, pH 6,5).

Tabla.

En la figura 3, se muestra la solubilidad de un anticuerpo en una solución que comprende poli(etilenglicol) de un peso molecular de aproximadamente 3500 Da en una concentración de un 10 % en peso como ejemplo de un polímero no iónico y diferentes polioles en concentraciones variables como aditivo.

En la figura 4, se muestra la solubilidad de un anticuerpo en una solución que comprende poli(etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente 3500 Da en una concentración de un 10 % en peso como ejemplo de un polímero no iónico y diferentes aminoácidos en concentraciones variables como aditivo.

En la figura 5 se muestra la solubilidad de un anticuerpo en una solución que comprende poli(etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente 3500 Da en una concentración de un 10 % en peso como ejemplo de un polímero no iónico y diferentes glúcidos en concentraciones variables como aditivo.

Como se puede ver a partir de la siguiente tabla, las separaciones en presencia de solo el aditivo no proporcionan una mejora en el valor de resolución.

Tabla.

El término "poliol" indica un compuesto que tiene al menos tres grupos hidroxilo, es decir, es un triol.

La reducción de la solubilidad por la adición de un polímero no iónico, por ejemplo, poli(etilenglicol), se puede evitar por la adición de un aditivo, por ejemplo, sorbitol.

Por tanto, en el presente documento se informa de un procedimiento para determinar la concentración de un polímero no iónico y un aditivo para su uso en una cromatografía de intercambio iónico de un polipéptido que comprende las siguientes etapas:

En la siguiente tabla, se muestra la dependencia de la solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 (10 mg/ml) como un polipéptido ejemplar a temperatura ambiente de la concentración de sorbitol añadido como ejemplo de un aditivo también en diferentes concentraciones de cloruro de sodio (citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente 3500 Da, pH 5,0).

Tabla.

En la siguiente tabla, se muestra la dependencia de la solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 (10 mg/ml) y un anticuerpo anti-CSF-1R (10 mg/ml) como polipéptidos ejemplares a temperatura ambiente de la concentración de glicerol añadido como ejemplo de un aditivo (citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) con un PM de 3500 Da, pH 5,0).

Tabla.

En la siguiente tabla, se muestra la dependencia de la solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 (10 mg/ml) y un anticuerpo anti-CSF-1R (10 mg/ml) como polipéptidos ejemplares a temperatura ambiente de la concentración de xilitol añadido como ejemplo de un aditivo (citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) con un PM de 3500 Da, pH 5,0).

Tabla.

En la siguiente tabla, se muestra la dependencia de la solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 (10 mg/ml) y un anticuerpo anti-CSF-1R (10 mg/ml) como polipéptidos ejemplares a temperatura ambiente de la concentración de glicina añadida como ejemplo de un aditivo (citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) con un PM de 3500 Da, pH 5,0).

Tabla.

En la siguiente tabla, se muestra la dependencia de la solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 (10 mg/ml) y un anticuerpo anti-CSF-1R (10 mg/ml) como polipéptidos ejemplares a temperatura ambiente de la concentración de prolina añadida como ejemplo de un aditivo (citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) con un PM de 3500 Da, pH 5,0).

Tabla.

En la siguiente tabla, se muestra la dependencia de la solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 (10 mg/ml) y un anticuerpo anti-CSF-1R (10 mg/ml) como polipéptidos ejemplares a temperatura ambiente de la concentración de betaína añadida como ejemplo de un aditivo (citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) con un PM de 3500 Da, pH 5,0).

Tabla.

En la siguiente tabla, se muestra la dependencia de la solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 (10 mg/ml) y un anticuerpo anti-CSF-1R (10 mg/ml) como polipéptidos ejemplares a temperatura ambiente de la concentración de sacarosa añadida como ejemplo de un aditivo (citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) con un PM de 3500 Da, pH 5,0).

Tabla.

En la siguiente tabla, se muestra la dependencia de la solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 (10 mg/ml) y un anticuerpo anti-CSF-1R (10 mg/ml) como polipéptidos ejemplares a temperatura ambiente de la concentración de fructosa añadida como ejemplo de un aditivo (citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) con un PM de 3500 Da, pH 5,0).

Tabla.

En la siguiente tabla, se muestra la dependencia de la solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 (10 mg/ml) y un anticuerpo anti-CSF-1R (10 mg/ml) como polipéptidos ejemplares a temperatura ambiente de la concentración de glucosa añadida como ejemplo de un aditivo (citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) con un PM de 3500 Da, pH 5,0).

Tabla.

Cuando se combina un polímero no iónico con un aditivo en un procedimiento como se informa en el presente documento, se puede lograr un valor de resolución mejorado. En la siguiente tabla, se muestra el valor de resolución obtenido de una combinación de poli(etilenglicol) 3500 en una concentración de un 10 % en peso como ejemplo de un polímero no iónico y un aditivo en la concentración enumerada en una separación cromatográfica de un anticuerpo anti-IL17.

Tabla.

Si se usa un 10 % en peso de poli(etilenglicol) sin un aditivo, el anticuerpo precipita. Por lo tanto, el valor de referencia en la tabla anterior se determinó en presencia de un 5 % en peso del polímero no iónico.

En la siguiente tabla, se muestra el cambio del contenido de proteína de célula huésped y el contenido de ADN de célula huésped de una muestra sometida a un procedimiento como se informa en el presente documento. Se debe señalar que para determinar el contenido de proteína de célula huésped y el contenido de ADN de célula huésped, se tuvo que incrementar el tamaño de fracción, lo que dio como resultado un valor de resolución reducido. La elución se efectúa en todos los ejemplos presentados al incrementar la concentración de cloruro de sodio en la fase móvil.

Tabla.

Como se puede ver a partir de la tabla anterior, en un procedimiento cromatográfico que comprende un polímero no iónico y un aditivo en la solución de recuperación, el contenido de PCH (proteína de célula huésped) en la preparación de anticuerpo recuperado se puede reducir en comparación con los procedimientos realizados en ausencia de esta combinación.

Por tanto, en el presente documento se informa de un procedimiento para producir una preparación de anticuerpo con contenido de proteína de célula huésped reducido, con lo que la preparación se obtiene de un sobrenadante de cultivo de células de mamífero, especialmente un sobrenadante de cultivo de células CHO, que comprende las siguientes etapas:

- aplicar una solución que comprende un polímero no iónico y un aditivo a un material de cromatografía en el que se ha adsorbido un anticuerpo, con lo que el anticuerpo en forma monomérica permanece adsorbido en un material de cromatografía de intercambio iónico, y

- recuperar el anticuerpo en forma monomérica del material de cromatografía de intercambio iónico aplicando una solución que comprende un polímero no iónico, un aditivo y un compuesto de elución, y producir, de este modo, la preparación de anticuerpo con contenido de proteína de célula huésped reducido.

En el presente documento se informa de un procedimiento para producir un anticuerpo que comprende las siguientes etapas:

- recuperar el anticuerpo en forma monomérica del material de cromatografía de intercambio iónico aplicando una solución que comprende un polímero no iónico, un aditivo y un compuesto de elución, y producir, de este modo, el anticuerpo.

En la siguiente tabla, se muestran los valores de resolución obtenidos con diferentes materiales de cromatografía de intercambio catiónico con un anticuerpo anti-IL17. La elución se efectúa en todos los ejemplos presentados al incrementar la concentración de cloruro de sodio en la fase móvil.

Tabla.

En la siguiente tabla, se muestran los valores de resolución obtenidos con un procedimiento como se informa en el presente documento usando poli(etilenglicol) de 400 Da de PM y de 10.000 Da de PM como polímero no iónico con diferentes pesos moleculares y el poliol sorbitol como aditivo con un anticuerpo anti-IL17.

Tabla.

Dependiendo de la pureza contemplada después de la realización de un procedimiento como se informa en el presente documento, la recuperación del polipéptido monomérico varía dependiendo de la combinación de la concentración del polímero no iónico y del aditivo.

En lo que sigue, esta interrelación se ejemplifica con poli(etilenglicol) como polímero no iónico, sorbitol como aditivo, y un anticuerpo anti-IL17 como polipéptido.

En la siguiente tabla, se muestra la recuperación y la pureza final del anticuerpo anti-IL17 monomérico con una pureza de al menos un 99 % en las fracciones de elución agrupadas (combinadas) dependiendo de la concentración de poli(etilenglicol) y sorbitol.

Tabla.

Los valores para las celdas vacías no se determinaron.

En la siguiente tabla, se muestra la recuperación y la pureza final del anticuerpo anti-IL17 monomérico con una pureza de al menos un 99,5 % en las fracciones de elución agrupadas (combinadas) dependiendo de la concentración de poli(etilenglicol) y sorbitol.

Tabla.

Los valores para las celdas vacías no se determinaron.

En la siguiente tabla, se muestra la recuperación y la pureza final del anticuerpo anti-IL17 monomérico con una pureza de al menos un 99,9 % en las fracciones de elución agrupadas (combinadas) dependiendo de la concentración de poli(etilenglicol) y sorbitol.

Tabla.

Los valores para las celdas vacías no se determinaron.

En la siguiente tabla, se muestra la recuperación y la pureza final del anticuerpo anti-IL17 monomérico con una pureza de un 100 % en las fracciones de elución agrupadas (combinadas) dependiendo de la concentración de poli(etilenglicol) y sorbitol.

Tabla.

Los valores para las celdas vacías no se determinaron.

En general, una etapa de separación cromatográfica comprende varias subetapas:

- equilibrar el material cromatográfico de relleno en una columna de cromatografía,

- aplicar la solución que comprende el polipéptido de interés al material de cromatografía equilibrado en condiciones adecuadas para la adsorción/unión del polipéptido de interés en el material de cromatografía y cargar, de este modo, la columna de cromatografía,

- lavar opcionalmente el material cromatográfico sin desorber/eluir el polipéptido de interés del material cromatográfico,

- recuperar el polipéptido de interés aplicando una solución de recuperación al material cromatográfico y, de este modo, desorber/eluir el polipéptido de interés del material cromatográfico.

En un modo de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico en la columna se equilibra antes de la aplicación de la solución que comprende el polipéptido a la columna. Esto se puede lograr aplicando un tampón de equilibrado a la columna para establecer un valor de pH y/o conductividad y/o concentración de sal adecuados en el interior del o en el material de cromatografía de intercambio catiónico.

En un modo de realización, la solución que comprende el polipéptido se ajusta a condiciones comparables a aquellas en las que se equilibra la columna de cromatografía de intercambio catiónico.

Son posibles diferentes procedimientos para cargar la columna de cromatografía con el polipéptido de interés. En un modo de realización, el polipéptido de interés se añade a la solución y se carga en la columna. En otro modo de realización, el polipéptido de interés se añade después de que la columna se equilibre y/o lave. En un modo de realización, el equilibrado comprende la aplicación de un tampón de unión antes de cargar la solución en el material cromatográfico.

Como se explica anteriormente, el procedimiento como se informa en el presente documento se realiza en modo de unión y elución.

La recuperación del polipéptido en forma monomérica en el procedimiento como se informa en el presente documento se puede llevar a cabo usando un gradiente lineal, un gradiente escalonado, o una combinación de un gradiente lineal y uno escalonado. Un gradiente lineal se puede usar, por ejemplo, para mejorar además la resolución del polipéptido en forma monomérica del polipéptido en forma agregada y/o de otros contaminantes, tales como la proteína de célula huésped. Se puede usar un gradiente escalonado para reducir el volumen de la solución de polipéptido recuperado. La selección y uso de cualquier gradiente en la recuperación del polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico se puede realizar fácilmente por un experto en la técnica.

En un modo de realización, la aplicación de la solución que comprende el polipéptido está seguida de la aplicación de una solución de lavado tamponada al material de cromatografía, a menudo de la misma composición que el tampón de equilibrado.

En un modo de realización, la concentración del polímero no iónico se mantiene constante durante la elución, mientras que se cambia el valor de pH y/o se incrementa la concentración de la sal que provoca la elución.

En un modo de realización, la concentración del polímero no iónico se incrementa durante la elución, mientras que se cambia el valor de pH y/o se incrementa la concentración de una sal que provoca la elución.

En un modo de realización, la concentración del polímero no iónico disminuye durante la elución, mientras que el valor de pH y/o la concentración de la sal se mantienen constantes.

Después de su uso, el material de cromatografía de intercambio catiónico se puede limpiar, desinfectar y almacenar en un agente apropiado.

El procedimiento como se informa en el presente documento se puede poner en práctica en combinación con una o más de otras etapas o procedimientos cromatográficos, tales como, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad con proteína A y otras formas de cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba u otra cromatografía en modo mixto.

El procedimiento como se informa en el presente documento se puede poner en práctica en una columna de lecho de relleno, una columna de lecho fluidizado/expandido que contenga el material de cromatografía de intercambio catiónico y/o un funcionamiento por lotes donde el material de cromatografía de intercambio catiónico se mezcle con la preparación de polipéptido durante un determinado tiempo.

El procedimiento como se informa en el presente documento es útil para producir polipéptidos biológicamente activos en forma monomérica. Dichos polipéptidos biológicamente activos se pueden seleccionar de anticuerpos, variante de anticuerpo, conjugados de anticuerpo. En otro modo de realización, el polipéptido de interés es un anticuerpo, especialmente un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser de cualquier mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobaya, oveja, vaca o un animal transgénico con un locus de inmunoglobulina humana, o puede ser una variante deficitaria en epítopos de linfocitos T remodelada en superficie humanizada del mismo.

Se debe entender que un experto en la técnica puede poner en práctica el procedimiento como se informa en el presente documento para producir cualquier polipéptido. Por tanto, un anticuerpo como se usa en el presente documento se debe tratar como ejemplo de un polipéptido.

En el procedimiento como se informa en el presente documento se puede usar una preparación de anticuerpo diferente, tal como de anticuerpos no purificados (brutos) o parcialmente purificados de fuentes naturales, sintéticas o recombinantes. Las preparaciones de anticuerpo brutas se pueden obtener de diversas fuentes, incluyendo, pero sin limitarse a, plasma, suero, ascitis o leche de un animal de experimentación, extractos vegetales, lisados de células bacterianas, lisados de levaduras o medios de cultivo de células animales acondicionados. Se pueden obtener preparaciones parcialmente purificadas de preparaciones brutas que se hayan sometido a al menos una etapa de cromatografía, precipitación, otra de fraccionamiento o cualquier combinación de las mismas. La etapa de precipitación puede incluir cualquier procedimiento, tal como precipitación con sal o poli(etilenglicol). También se pueden usar otras etapas de fraccionamiento, tales como cristalización o filtración por membrana. En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo no PEGilado.

Con el procedimiento como se informa en el presente documento, se puede obtener un polipéptido que esté sustancialmente libre de agregados. En un modo de realización, el contenido del polipéptido en forma agregada como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño es de menos de aproximadamente un 5 % en base al área de pico total. En otro modo de realización, el contenido del polipéptido en forma agregada es de menos de aproximadamente un 1 %. En otro modo de realización, la cantidad del polipéptido en forma agregada es de menos de aproximadamente un 0,5 %. En todavía otro modo de realización, la cantidad del polipéptido en forma agregada es de menos de aproximadamente un 0,1 %.

Recientemente se ha publicado un nuevo formato de anticuerpo bivalente biespecífico (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 11187-11192), el llamado "CrossMab". Este anticuerpo biespecífico comprende cuatro cadenas de anticuerpo diferentes, es decir, dos cadenas ligeras diferentes y dos cadenas pesadas diferentes. Durante la expresión, se pueden formar diferentes impurezas relacionadas con el producto. Una de estas impurezas relacionadas con el producto es el llamado "anticuerpo %", un anticuerpo que carece de una cadena ligera, que presenta un peso molecular de aproximadamente 125 kDa en comparación con un peso de aproximadamente 150 kDa para un anticuerpo de cuatro cadenas completo. Estas clases de fragmentos de anticuerpo se pueden formar, en general, durante la expresión de anticuerpos.

Por tanto, en el presente documento se informa de un procedimiento para producir un anticuerpo de cuatro cadenas de longitud completa que comprende las siguientes etapas:

- aplicar una solución que comprende un polímero no iónico y un aditivo a un material de cromatografía en el que se ha adsorbido un anticuerpo, con lo que el anticuerpo de longitud completa de cuatro cadenas en forma monomérica permanece adsorbido en un material de cromatografía de intercambio iónico, y

- recuperar el anticuerpo de longitud completa de cuatro cadenas en forma monomérica del material de cromatografía de intercambio iónico aplicando una solución que comprende un polímero no iónico, un aditivo y un compuesto de elución, y producir, de este modo, el anticuerpo.

El material de cromatografía de intercambio iónico es un material de cromatografía de intercambio catiónico.

El polímero no iónico se puede seleccionar del grupo que comprende poli(etMenglicol) (PEG), poli(propMenglicol) (PPG), copolímeros PEG-PPG y copolímeros de tres bloques compuestos por poli(oxipropileno) (poli(óxido de propileno)) flanqueado por poli(oxietileno) (poli(óxido de etileno)). En un modo de realización, el polímero no iónico es poli(etilenglicol).

El aditivo se puede seleccionar del grupo que comprende iones dipolares, aminoácidos, urea, derivados de urea, anfolitos, CHAPSO, productos naturales, glúcidos y polioles. En otro modo de realización, el aditivo es sorbitol.

El polímero no iónico puede tener una concentración de desde aproximadamente un 5 % a un 15 % en peso y/o el aditivo puede tener una concentración de desde un 3 % a un 25 % en peso.

En un modo de realización de todos los aspectos como se explica anteriormente, el polipéptido es un anticuerpo de clase IgG, o IgD, o IgE, o IgA. En otro modo de realización, el polipéptido es un anticuerpo de clase IgG, subclase IgG1, o subclase IgG2, o subclase IgG3, o subclase IgG4.

En un modo de realización de todos los aspectos como se explica anteriormente, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

En un modo de realización, la recuperación es por elución con gradiente.

Se proporcionan los siguientes ejemplos y figuras para ayudar al entendimiento de la presente invención, exponiéndose su verdadero alcance en las reivindicaciones adjuntas.

Figuras:

Figura 1 Cromatograma de elución de la cromatografía de intercambio catiónico del anticuerpo anti-IL17 en el material de cromatografía de intercambio catiónico.

Figura 2 Distribución de anticuerpo en forma monomérica y anticuerpo en forma agregada frente a las fracciones recogidas.

Figura 3 Solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 y un anticuerpo anti-CSF-1R en una solución que comprende poli(etilenglicol) 4000 en una concentración de un 10 % en peso como ejemplo de un polímero no iónico y diferentes polioles en concentraciones variables como aditivo.

Figura 4 Solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 y un anticuerpo anti-CSF-1R en una solución que comprende poli(etilenglicol) 4000 en una concentración de un 10 % en peso como ejemplo de un polímero no iónico y diferentes aminoácidos en concentraciones variables como aditivo.

Figura 5 Solubilidad de un anticuerpo anti-IL17 y un anticuerpo anti-CSF-1R en una solución que comprende poli(etilenglicol) en una concentración de un 10 % en peso como ejemplo de un polímero no iónico y diferentes glúcidos en concentraciones variables como aditivo.

Figura 6 Distribución de anticuerpo en forma monomérica, fragmento de anticuerpo % y anticuerpo en forma agregada frente a las fracciones recogidas para los ejemplos 25 y 26.

Material:

Cada anticuerpo (anticuerpo anti-IL17: para las secuencias, véase el documento WO 2010/034443, anticuerpo anti-CSF-1R: para las secuencias, véase el documento PCT/EP2010/069090; anticuerpo anti-Ang2/VEGF: para las secuencias, véase el documento WO 2010/040508) se purificó en una primera etapa con una cromatografía de afinidad con proteína A. La elución de la columna con proteína A se llevó a cabo en condiciones ácidas. Después, el pH de la muestra se ajustó a aproximadamente pH 3,5 con ácido cítrico 1 M y se incubó durante ~1 hora. Posteriormente, el pH se ajustó a 5,0 o 5,5 añadiendo TRIS 1 M/HCl, pH 8-9 o solución de TRIS 1 M (TRIS: tris(hidroximetil)aminometano). Después de la incubación a 4 °C durante 12-18 horas, la muestra se filtró en profundidad. La muestra es una solución con una concentración de proteína entre 5 mg/ml y 20 mg/ml. Este material se denomina en lo que sigue eluido de proteína A acondicionado, que está preparado para cargarse en un material de cromatografía de intercambio catiónico.

Además, el anticuerpo anti-Ang2/VEGF se purificó por cromatografía de intercambio aniónico. El valor de pH del eluido de proteína A acondicionado se ajustó a 7,5 por la adición de solución tampón TRIS 1 M. Posteriormente, la muestra se procesó por cromatografía de intercambio aniónico a pH 7,5 en modo de fracción no adsorbida.

En el primer ejemplo, se ha llevado a cabo el procedimiento como se informa en el presente documento. Por tanto, en el ejemplo 1 se dan todas las condiciones del procedimiento. En los siguientes ejemplos a continuación, solo se enumeran las diferencias. Todos los parámetros no mencionados son idénticos.

Ejemplo 1

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Material de intercambio: Poros 50HS

Columna: 8 mm de diámetro interno, 100 mm de longitud, 5,03 ml de volumen

Caudal: 90 cm/h (= 0,75 ml/min)

Solución de equilibrado: tampón citrato de sodio 10 mM, ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado 1: tampón citrato de sodio 10 mM, ajustado a pH 5,0, 1 volumen de columna

Solución de lavado 2: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), D-sorbitol al 15 % (p/p), ajustado a pH 5,0

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), D-sorbitol al 15 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0

Procedimiento de elución: solución de elución del 0 % (v/v) al 100 % (v/v) con gradiente lineal en 22,5 volúmenes de columna

El eluido de proteína A acondicionado se aplicó a una columna de cromatografía que contenía el material de cromatografía de intercambio iónico. Después de la etapa de carga a un caudal de 90 cm/h, la columna se lavó con la solución de lavado 1 (1 volumen de columna) y solución de lavado 2 (3 volúmenes de columna). El anticuerpo en forma monomérica se recuperó con un procedimiento de elución con gradiente lineal, con lo que el valor de pH se mantuvo constante y la conductividad se varió (incrementó) por la adición de cloruro de sodio.

En la figura 1 se muestra el cromatograma de elución de la cromatografía de intercambio catiónico del anticuerpo anti-IL17 en el material de cromatografía de intercambio catiónico. El anticuerpo en forma monomérica y el anticuerpo en forma agregada se separan.

El pico que contenía el anticuerpo se recogió en fracciones de 3 ml, que se analizaron para determinar el contenido de monómero y de agregado, así como para determinar el contenido de proteína de célula huésped CHO y el contenido de ADN de célula huésped CHO. El resultado del análisis se presenta en la siguiente tabla.

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,78.

Ejemplo 2

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-CSF-1R

El pico que contenía el anticuerpo se recogió en fracciones de 3 ml, que se analizaron para determinar el contenido de monómero y de agregado. El resultado del análisis se presenta en la siguiente tabla.

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,88.

Ejemplo 3

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Solución de equilibrado: tampón acetato de sodio 35 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), D-sorbitol al 15 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón acetato de sodio 35 mM, poli(etMenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da),

D-sorbitol al 15 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 1 volumen de columna

Solución de elución: tampón acetato de sodio 35 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da),

D-sorbitol al 15 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0 Procedimiento de elución: solución de elución del 0 % (v/v) al 100 % (v/v) con gradiente lineal en 22,5 volúmenes de columna

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,86.

Ejemplo 4

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Solución de equilibrado: tampón MES 25 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), D-sorbitol al 15 %

(p/p), ajustado a pH 5,5, 4 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón MES 35 mM, poli(etilengMcol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), D-sorbitol al 15 %

(p/p), ajustado a pH 5,5, 4 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón MES 35 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), D-sorbitol al 15 %

(p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,5 Procedimiento de elución: solución de elución del 0 % (v/v) al 100 % (v/v) con gradiente lineal en 22,5 volúmenes de columna

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,77.

Ejemplo 5

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Material de intercambio: SP Sepharose FF

Solución de equilibrado: tampón citrato de sodio 30 mM, ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado 1: tampón citrato de sodio 30 mM, ajustado a pH 5,0, 1 volumen de columna Solución de lavado 2: tampón citrato de sodio 30 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da),

D-sorbitol al 15 % (p/p), ajustado a pH 5,0

Solución de elución: tampón citrato de sodio 30 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da),

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,51.

Ejemplo 6

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Material de intercambio: Toyopearl CM-650 M

D-sorbitol al 15 % (p/p), ajustado a pH 5,0

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,76.

Ejemplo 7

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Material de intercambio: CM Sepharose FF

D-sorbitol al 15 % (p/p), ajustado a pH 5,0

Tabla.

Ejemplo 8

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Solución de equilibrado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), xilitol al 20 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 2 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), xilitol al 20 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), xilitol al 20 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0

Tabla.

Ejemplo 9

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-CSF-1R

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), xilitol al 20 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0 Procedimiento de elución: solución de elución del 0 % (v/v) al 100 % (v/v) con gradiente lineal en 22,5 volúmenes de columna

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,93.

Ejemplo 10

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Solución de equilibrado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), glicerol al 30 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 2 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), glicerol al 30 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), glicerol al 30 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0 Procedimiento de elución: solución de elución del 0 % (v/v) al 100 % (v/v) con gradiente lineal en 22,5 volúmenes de columna

Tabla.

Ejemplo 11

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-CSF-1R

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,90.

Ejemplo 12

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Solución de equilibrado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), sacarosa al 25 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 2 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), sacarosa al 25 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), sacarosa al 25 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0 Procedimiento de elución: solución de elución del 0 % (v/v) al 100 % (v/v) con gradiente lineal en 22,5 volúmenes de columna

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,73.

Ejemplo 13

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-CSF-1R

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), sacarosa al 25 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,84.

Ejemplo 14

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Solución de equilibrado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da),

D-fructosa al 25 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 2 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da),

D-fructosa al 25 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da),

D-fructosa al 25 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0 Procedimiento de elución: solución de elución del 0 % (v/v) al 100 % (v/v) con gradiente lineal en 22,5 volúmenes de columna

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,79.

Ejemplo 15

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-CSF-1R

D-fructosa al 25 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 2 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

D-fructosa al 25 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Tabla.

Ejemplo 16

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Solución de equilibrado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), glicina al 8 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 2 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), glicina al 8 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), glicina al 8 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,85.

Ejemplo 17

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-CSF-1R

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Tabla.

Ejemplo 18

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Solución de equilibrado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), L-prolina al 8 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 2 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), L-prolina al 8 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), L-prolina al 8 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,83.

Ejemplo 19

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-CSF-1R

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,97.

Ejemplo 20

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Solución de equilibrado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), betaína al 8 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 2 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), betaína al 8 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 3500 Da), betaína al 8 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0

Tabla.

Ejemplo 21

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-CSF-1R

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Tabla.

Ejemplo 22

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Solución de equilibrado: tampón citrato de sodio 10 mM, ajustado a pH 5,0, 2 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 400 Da), sorbitol al 15 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 400 Da), sorbitol al 15 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,57.

Ejemplo 23

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-IL17

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 10.000 Da), sorbitol al 15 % (p/p), ajustado a pH 5,0, 4 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón citrato de sodio 10 mM, poli(etilenglicol) al 10 % (p/p) (PM de 10.000 Da), sorbitol al 15 % (p/p), que comprende cloruro de sodio 750 mM, ajustado a pH 5,0

Procedimiento de elución: solución de elución del 0 % (v/v) al 100 % (v/v) con gradiente lineal en 30 volúmenes de columna

Tabla.

Se determinó que la resolución del pico de monómero y del pico de agregado usando el programa PeakFit (Seasolve Software Inc.) era de 0,70.

Ejemplo 24

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-Ang2/VEGF

Material de intercambio: Poros 50HS

Columna: 11 mm de diámetro interno, 250 mm de longitud, 23 ml de volumen

Caudal: 90 cm/h

Solución de equilibrado: tampón fosfato de sodio 40 mM, ajustado a pH 5,0, 3 volúmenes de columna Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón fosfato de sodio 40 mM, ajustado a pH 5,0, 3 volúmenes de columna Solución de elución: tampón fosfato de sodio 40 mM, ajustado a pH 7,5

Procedimiento de elución: solución de elución del 0 % (v/v) al 100 % (v/v) con gradiente lineal en 12 volúmenes de columna

El eluido de intercambio aniónico acondicionado se aplicó a una columna de cromatografía que contenía el material de cromatografía de intercambio catiónico. Después de la etapa de carga a un caudal de 90 cm/h, la columna se lavó con solución de lavado (3 volúmenes de columna). El anticuerpo se recuperó con un procedimiento de elución con gradiente lineal, con lo que el valor de pH se varió (incrementó) de 5,0 a 7,5.

El anticuerpo % se "coeluye" con el monómero de anticuerpo y se detectan dos picos de anticuerpo %.

Ejemplo 25

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-Ang2/VEGF

Material de intercambio: Poros 50HS

Columna: 11 mm de diámetro interno, 250 mm de longitud, 23 ml de volumen

Caudal: 90 cm/h

Solución de equilibrado: tampón fosfato de sodio 40 mM, PEG 4000 al 5 %, ajustado a pH 5,0, 3 volúmenes de columna

Carga: 20 g de proteína/l material de cromatografía

Solución de lavado: tampón fosfato de sodio 40 mM, PEG 4000 al 5 %, ajustado a pH 5,0, 3 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón fosfato de sodio 40 mM, PEG 4000 al 5 %, ajustado a pH 7,5 Procedimiento de elución: solución de elución del 0 % (v/v) al 100 % (v/v) con gradiente lineal en 12 volúmenes de columna

Ejemplo 26

Condiciones de cromatografía:

Polipéptido: anticuerpo anti-Ang2/VEGF

Material de intercambio: Poros 50HS

Columna: 11 mm de diámetro interno, 250 mm de longitud, 23 ml de volumen

Caudal: 90 cm/h

Solución de lavado: tampón fosfato de sodio 40 mM, PEG 4000 al 10 %, glicina al 8 %, ajustado a pH 5,0, 3 volúmenes de columna

Solución de elución: tampón fosfato de sodio 40 mM, PEG 4000 al 10 %, glicina al 8 %, ajustado a pH 7,5 Procedimiento de elución: solución de elución del 0 % (v/v) al 100 % (v/v) con gradiente lineal en 12 volúmenes de columna

En la figura 6, se muestra la distribución de anticuerpo en forma monomérica, fragmento de anticuerpo % y anticuerpo en forma agregada frente a las fracciones recogidas de la cromatografía de intercambio catiónico del anticuerpo anti-Ang2/VEGF en el material de cromatografía de intercambio catiónico. Se separan el anticuerpo en forma monomérica y el anticuerpo en forma agregada y el fragmento de anticuerpo %.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir un anticuerpo de la clase IgG en forma monomérica que comprende las siguientes etapas:

2. Un procedimiento para producir una preparación de anticuerpo de la clase IgG con contenido de proteína de célula huésped reducido que comprende las siguientes etapas:

3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, con lo que el poli(etilenglicol) tiene una concentración de un 10 % en peso y la glicina tiene una concentración de desde un 2 % a un 8 % en peso.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, con lo que el poli(etilenglicol) tiene una concentración de un 10 % en peso y la glicina tiene una concentración de desde un 4 % a un 8 % en peso.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, con lo que el poli(etilenglicol) tiene una concentración de un 10 % en peso y la glicina tiene una concentración de un 8 % en peso.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de 3500 Da /- 20 %.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el anticuerpo monomérico tiene un peso molecular de desde 100 kDa a 200 kDa.

8. Un procedimiento para producir en forma monomérica un anticuerpo CrossMab de cuatro cadenas de longitud completa que comprende las siguientes etapas: