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ES2864842T3 - Cisteínas de anticuerpos protegidas y no protegidas, y su uso en la conjugación fármaco-anticuerpo - Google Patents

Cisteínas de anticuerpos protegidas y no protegidas, y su uso en la conjugación fármaco-anticuerpo Download PDF

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ES2864842T3
ES2864842T3 ES16760548T ES16760548T ES2864842T3 ES 2864842 T3 ES2864842 T3 ES 2864842T3 ES 16760548 T ES16760548 T ES 16760548T ES 16760548 T ES16760548 T ES 16760548T ES 2864842 T3 ES2864842 T3 ES 2864842T3
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ES
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antibody
cysteine
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protected
cis
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ES16760548T
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Xiaotian Zhong
Amarnauth Shastrie Prashad
Ronald William Kriz
Tao He
Will Somers
Wenge Wang
Leo Joseph Letendre
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Original Assignee
Pfizer Inc
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Abstract

Un procedimiento de enlace de un resto predeterminado de protección a uno o más residuos de cisteína no pareados en un anticuerpo, comprendiendo dicho procedimiento el paso de: cultivar una línea celular que expresa anticuerpo, en un medio de cultivo que contiene dicho resto predeterminado de protección, o un precursor de dicho resto predeterminado de protección, en el que dicha línea celular expresa dicho anticuerpo, y en el que dicho resto predeterminado de protección está unido mediante un enlace covalente a al menos uno de dichos residuos de cisteína no pareados en dicho anticuerpo expresado, en el que el resto de protección es seleccionado de entre un grupo reactivo que consiste en maleimido trioxa-4-formil benzamida (MTFB) con un asa de aldehído, o maleimido azido-lisina con un asa de azida, o dibenzociclooctil-polietileno maleimida (DBCO-PEG4-maleimida) con un asa de alquino.

Description

DESCRIPCIÓN
Cisteínas de anticuerpos protegidas y no protegidas, y su uso en la conjugación fármaco-anticuerpo
Campo de la invención
La invención se basa en el descubrimiento según el cual puede modificarse en células vivas el estado de protección de residuos de cisteína sobre anticuerpos. Así, la invención se refiere al procedimiento de fabricación de anticuerpos en células de mamíferos, en el cual residuos de cisteína manipulados de manera no pareada son modificados de modo postranslacional y protegidos con entidades químicas particulares, anticuerpos protegidos que son bien adecuados para pasos adicionales de conjugación específica de sitio, para formar conjugados de fármacoanticuerpo (ADCs) o conjugados de fármaco proteína. También se divulgan ADCs fabricados usando estos anticuerpos protegidos, en particular ADCs formados mediante la reducción selectiva de los residuos protegidos de cisteína de anticuerpos, lo cual evita la reducción de los disulfuros entre cadenas y así elimina la necesidad de un paso de (re) oxidación antes de la conjugación. También se divulgan novedosos anticuerpos protegidos con nitrobenzoato, que permiten la reducción selectiva con tris (3-sulfonatofenil) fosfina (TSPP) o agentes relacionados para conjugación directa, y por ello elimina los tratamientos de pasos de reducción-reoxidación disulfuro entre cadenas. La invención también se refiere al diseño de novedosas protecciones de Cis, consistentes en las asas químicas, tal como grupos biortogonales tales como aldehído/azida/alquino, lo cual permite la química adicional de conjugación de fármaco. También se divulgan los anticuerpos no protegidos preparados mediante células en medio bajo en cisteína, cistina y glutatión media, y ADCs fabricados vía conjugación directa con estos anticuerpos no protegidos.
Antecedente de la invención
Los ADCs han emergido como una clase prometedora de terapéuticos focalizados con potencial significativo para mejorar la eficacia clínica y tolerabilidad sobre la terapia con anticuerpos o quimioterapia tradicional. Los ADCs clínicamente útiles son capaces de hacer entrega específica de antígeno de fármacos citotóxicos altamente potentes a células tumorales. Los restos de anticuerpos monoclonales de ADCs pueden reconocer específicamente antígenos de superficie celular, los cuales son sustancialmente más elevados en células tumorales que en células sanas, disminuyendo de este modo la absorción no específica e incrementando la absorción específica de fármacos conjugados, por células tumorales. Recientes datos clínicos han conducido a la comercialización de los productos de ADCs aprobados por FDA, incluyendo brentuximab vedotin: un conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CD30, y Ado-trastuzumab emtansine: un conjugado de anticuerpo monoclonal anti-HER2. Un tercer ADC comercializado es gemtuzumab ozogamicin, un conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CD33, está disponible comercialmente en Japón.
Una aproximación por la cual los fármacos se unen a un anticuerpo (es decir, conjugación) es un aspecto importante del desarrollo de ADC. Todos los tres productos ADC comerciales referenciados utilizan procedimiento convencional de conjugación no específica. Brentuximab vedotin es preparado mediante la modificación de tioles de cadena lateral de cisteína nativa en disulfuros expuestos a solvente, mientras ado-trastuzumab emtansina y gemtuzumab ozogamicin son preparados vía la modificación de aminas de cadena lateral de lisina de superficie. Estos procedimientos de conjugación no específicos han dado como resultado mezclas heterogéneas de ADC.
Con objeto de mejorar el índice terapéutico y la farmacocinética de ADCs, recientemente se han desarrollado ADCs específicos de sitio en base a cisteína, para generar productos fármacos más homogéneos con mayor control sobre los sitios de unión. Los residuos de cisteína no pareados han sido introducidos desde hace rato en proteínas para etiquetado y conjugación de fármaco específicos de sitio. See: Lyons et al., Protein Eng. 3, 703-708 (1990); Zheng et al., Biochemistry, 30, 9125-9132 (1991); Stimmel, et al., J. Biol. Chem. 275, 30445-30450 (2000); Junutula et al., Nat. Biotechnol., 26, 925-932 (2008); Voynov et al., Bioconjug. Chem. 21, 385-392 (2010); y Shen et al., Nat. Biotechnol., 30, 184-189 (2012). Estos residuos manipulados de cisteína están localizados típicamente en la superficie de una proteína, y no alteran la estructura y función de la proteína. Se ha mostrado recientemente que ADCs específicos de sitio en base a cisteína poseen índice terapéutico mejorado y toxicidad reducida sobre los conjugados convencionales de Cis y de Lys. See: Junutula et al., Nat. Biotechnol., 26, 925-932 (2008); Junutula et al., Clin. Cancer Res. 16, 4769-47788 (2010); Shen et al., Nat. Biotechnol., 30, 184-189 (2012); y Kung et al., Blood 122, 1455-1463 (2013).
Sin embargo, los ADCs específicos de sitio en base a cisteína, introducen complejidad en el procedimiento de conjugación de fármaco. Se ha hallado que cuando son producidos en células de mamíferos, el(los) grupo(s) tiol de residuos de cisteína no pareados de anticuerpo mutante de cisteína forma(n) disulfuros con otras cisteínas (cisteinilación) o glutatión (glutationilación) (Junutula, Raab et al. 2008, Chen, Nguyen et al. 2009). Estas modificaciones postranslacionales son denominadas protección de cisteína o protección de Cis. Esta protección de cisteína crea grupos de bloqueo enlazados a tiol que previenen o inhiben la conjugación y así, antes de la conjugación del fármaco se requiere la regeneración del grupo tiol a través de un paso de reducción parcial con agentes reductores. Dado que este tratamiento también reduce los disulfuros entre cadenas de anticuerpo (también conocido como cisteínas "pareadas") tienen que reformarse luego aquellos disulfuros entre cadena de anticuerpo reducidos. Esto es logrado en un procedimiento de reoxidación que incluye la diálisis de los agentes reductores, cisteína o glutatión, y tratamiento con agentes oxidantes. Esta reducción y reoxidación potencialmente introduce arrastre de disulfuro (también denominado batido de disulfuro, véase el óvalo punteado abajo para ilustración) y torsión sobre el anticuerpo. Un anticuerpo retorcido puede afectar adversamente el plegado de la proteína y la calidad de la proteína, y causar también problemas tales como un PK más pobre para los ADCs resultantes. Abajo se muestra este fenómeno:
Figure imgf000003_0001
No es claro el mecanismo subyacente para estas protecciones "naturales" por cisteinilación y glutationilación. Dado que ambas modificaciones involucran la formación de enlace disulfuro, desde hace tiempo se ha especulado que estas modificaciones pueden tener lugar en el lumen del retículo endoplasmático (ER) donde ocurre la formación de enlaces disulfuro. Es bien conocido que el lumen de ER está más oxidado que el citosol (Hwang, Sinskey et al.
1992), debido a una ruta molecular de oxidación altamente conservada (Frand, Cuozzo et al. 2000, Sevier y Kaiser 2006). La proteína Ero1 de membrana que contiene flavina (Frand y Kaiser 1998, Pollard, Travers et al. 1998) explota el poder de oxidación del oxígeno para introducir enlaces disulfuro dentro de sí misma, luego transfiere el enlace disulfuro a la proteína disulfuro isomerasa (PDI) que puede pasarlos a proteínas extracelulares (Tu, Ho-Schleyer et al. 2000). también contribuyen a la formación de enlace disulfuro en células de mamíferos, rutas alternativas de oxidación independientes de Ero1, tales como la superfamilia quiescina sulfhidrilo oxidasa/Erv y vitamina K epóxido reductasa, (Margittai y Banhegyi 2010, Sevier 2010). GSH está presente en el lumen del e R debido a un transportador (Hwang, Sinskey et al. 1992, Banhegyi, Lusini et al. 1999) o poros (Le Gall, Neuhof et al.
2004) en la membrana. Presumiblemente Cis está presente también debido a una actividad de transporte (Hwang, Sinskey et al. 1992). Por ello el lumen oxidante del ER más la presencia de GSH y Cis han hecho el lumen del ER un sitio razonable para la glutationilación o cisteinilación. Sin embargo, no existe evidencia concluyente que soporte esta hipótesis.
Sumario de la invención
El procedimiento de la invención está definido en las reivindicaciones. La invención se refiere a un procedimiento de producción de anticuerpos en células de mamíferos en el cual se modifican postranslacionalmente y se protegen con entidades químicas particulares residuos de cisteína no pareados, anticuerpos protegidos que son bien adecuados para pasos adicionales de conjugación específica de sitio para formar conjugados de fármaco- anticuerpo (ADCs). También se divulgan ADCs preparados usando estos anticuerpos protegidos, en particular ADCs formados por la reducción selectiva de los residuos de cisteína de anticuerpos protegidos, lo cual evita la reducción de disulfuros entre cadenas y así elimina la necesidad de un paso de (re)oxidación antes de la conjugación. También se divulgan novedosos anticuerpos protegidos con nitrobenzoato, en particular anticuerpos protegidos con ácido 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB), tipo de anticuerpos protegidos que permite la reducción selectiva con tris (3-sulfonatofenil) fosfina (TSPP) o agentes reductores relacionados o con acción similar para la conjugación directa, y por ello elimina tratamientos de pasos de reducción-reoxidación de disulfuro entre cadenas. La invención se refiere también a la manipulación de novedosas protecciones de cisteína, que consisten en asas químicas tales como grupos biortogonales de aldehído/azida/alquino, lo cual permite la química adicional de conjugación de fármacos.
La optimización del medio de cultivo permite la generación de anticuerpo mutante de cisteína con diferentes estados de protección, incluyendo anticuerpos cisteinilados, glutationilados, no protegidos, o protegidos con nitrobenzoato. Los novedosos anticuerpos protegidos con nitrobenzoato permiten en particular la reducción selectiva con TSPP seguida por conjugación directa, eliminando la necesidad del uso de tratamientos severos de pasos de reducción/reoxidación de disulfuro entre cadenas. En el siguiente esquema se muestran los rasgos clave del procedimiento de conjugación como se divulgan en esta memoria:
Figure imgf000004_0001
Anticuerpo no bloqucado. no protegido Anticuerpo protegido con TNB
en el que el anticuerpo que ordinariamente podría estar protegido por una cisteína (cisteinilado), y así conjugado usando los pasos de reducción y oxidación descritos anteriormente, es protegido más bien con TNB. La protección con TNB es retirada, y simultáneamente se realiza la conjugación, vía reducción selectiva (por ejemplo, usando TSPP) como se muestra a continuación:
Figure imgf000004_0002
Cargas útiles de cnlazador representativo Dado que se evita la reoxidación, el procedimiento divulgado permite que el anticuerpo mantenga sus pliegues originales y permanezca intacto. Esto mejora y simplifica profundamente el procedimiento de conjugación del fármaco para ADCs específicos de sitio en base a cisteína.
En esta memoria se divulga que los anticuerpos mutantes de cisteína están protegidos con nitrotiobenzoato cuando al medio se añade ditionitrobenzoato. El reactivo de Ellman, también conocido como ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) y DTNB, actúa para añadir tionitrobenzoato (TNB) a un anticuerpo expresado mediante una línea celular, por ejemplo una línea celular CHO. A esto sigue la purificación del anticuerpo, y puede producir una mayoría de las especies de proteína con protección con tionitrobenzoato. Véase el Ejemplo 1.
La protección de anticuerpos con TNB no disminuye la estabilidad térmica, según se mire por ejemplo mediante DSC, tal que los anticuerpos cisteinilados, no protegidos, y protegidos con TNB se comportaron de modo casi idéntico. Véase el Ejemplo 2.
El anticuerpo protegido con TNB es reducido de manera selectiva con TSPP. Los grupos tiol libres generados en este procedimiento permiten la conjugación directa de fármaco, sin los pasos de reducción y reoxidación entre cadenas, lo cual a su vez acelera el procedimiento de manipulación in vitro. Véase el Ejemplo 3.
El procedimiento de la invención incluye protecciones manipuladas de cisteína que comprenden “asas” químicas diferentes a TNB o restos lábiles similares, útiles para tipos adicionales de química de conjugación de fármaco seleccionados de entre el grupo consistente en de maleimido trioxa-4-formil benzamida (MTFB) con un aldehído, maleimidio azido-lisina con un asa de azida, o dibenzociclooctil-polietileno maleimida (DBCO-PEG4-maleimida) con un asa de alquino. Estas asas son unidas al anticuerpo mediante adición de los novedosos espaciadores químicos alquilantes al medio de cultivo. Los espaciadores químicos alquilantes contienen asas químicas tales como aldehídos, cetonas, azidas, y alquinos. En el caso de las cetonas y aldehídos, éstas asas químicas pueden reaccionar con nucleófilos aminooxi o hidrazida para química adicional de conjugación, formando productos de oxima/hidrazona. En el caso de azidas y alquinos, éstas asas químicas pueden permitir la conjugación de cicloadición. Los espaciadores químicos alquilantes adicionales incluyen dominio funcional de biotina, lo cual permite la interacción estrecha específica no covalente entre Strepavidina y Biotina. Véase el Ejemplo 4 que discute las asas químicas maleimido trioxa-4-formil benzamida (MTFB), dibenzociclooctil-polietileno maleimida (DBCO-PEG4-maleimida), y maleimida-PEG2-biotina (MPB).
Así, se ha demostrado adicionalmente que mediante la adición de espaciadores químicos alquilantes al medio de cultivo, pueden manipularse protecciones Cis novedosas consistentes en asas químicas tales como grupo aldehído. Estas protecciones novedosas pueden suministrar asas químicas para química de conjugación de fármaco adicional, en parte como se ilustra a continuación:
Figure imgf000005_0001
en la que:
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También se divulga la generación de anticuerpo mutante de cisteína totalmente desprotegido, vía expresión transitoria HEK293 o CHO estable en medio de cultivo que tiene cero o bajos niveles de cisteína, de cistina y glutatión. Véanse los Ejemplos 5 y 6.
En este documento, la recitación o discusión de medio de cultivo que tiene cero o bajos niveles de cisteína, cistina y glutatión, se refiere al medio que tiene: cisteína 0-5 mM, preferentemente cisteína 0-1 mM, y más preferentemente cisteína 0,2 mM; y glutatión 0-5 mM, preferentemente glutatión 0-1 mM, y más preferentemente glutatión 0,2 mM. Los medios con estos niveles característicos de componentes están disponibles comercialmente o pueden ser preparados fácilmente a partir de medios disponibles comercialmente, usando técnicas convencionales. Ocasionalmente, estos medios que tienen cero o bajos niveles de cisteína, cistina y glutatión son denominados como un medio "triplemente libre" o medio "bajo".
Como se usa en esta memoria, el término "alquilo" en sí mismo o como parte de otro se refiere a un hidrocarburo saturado de cadena recta o ramificado, que tiene el número indicado de átomos de carbono (por ejemplo, alquilo "C-rCa" se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono). Típicamente, los grupos alquilo comprenden de 1 a 20 átomos de carbono, preferentemente de 1 a 6 átomos de carbono, y más preferentemente del a 4 átomos de carbono. Cuando no se indica el número de átomos de carbono, el grupo alquilo tiene de 1 a 8, o de 1 a 6, átomos de carbono. Los alquilo C-i-Cs de cadena recta representativos incluyen, pero no están limitados, metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo y n-octilo; mientras los alquilo C-i-Cs ramificados incluyen, pero no están limitados a, isopropilo, sec-butilo, isobutilo, tert-butilo, isopentilo, y 2-metilbutilo; los alquilo C2-C8 insaturados incluyen, pero no están limitados a, vinilo, alilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, acetilenilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo y 3-metil-1-butinilo. La referencia a "alquilo" se refiere en esta memoria a restos no sustituidos y sustituidos como se describió anteriormente.
Como se usa en esta memoria, el término "arilo" en sí mismo o una parte de otro término, indica un resto de hidrocarburo aromático sustituido o no sustituido monovalente carbocíclico de 5-20, preferentemente 5-14 o 6-14, átomos de carbono, derivado del retiro de un átomo de hidrógeno de un átomo de carbono individual de un sistema progenitor de anillo aromático. Los grupos arilo típicos incluyen, pero no están limitados a, restos derivados de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo, y similares.
"Heteroarilo" se refiere a un sistema de anillo aromático monovalente sustituido o no sustituido monocíclico, bicíclico o tricíclico que tiene de 2 a 10, 2 a 14, o 2-20 átomos de carbono, preferentemente 3 a 8, átomos de carbono (también denominados como miembros del anillo) y uno a cuatro heteroátomos miembros de anillo, seleccionados independientemente de N, O, P o S, y derivados mediante retiro de un átomo de hidrógeno de un átomo de anillo de un sistema progenitor de anillo. Uno o más átomos de N, C o S en el heterociclilo pueden estar oxidado. Los heteroarilos pueden ser sistemas de anillo monocíclico, bicíclico, o tricíclico. Los heteroarilos representativos incluyen, pero no están limitados a triazolilo, tetrazolilo, oxadiazolilo, piridilo, furilo, benzofuranilo, tiofenilo, benzotiofenilo, quinolinilo, pirrolilo, indolilo, oxazolilo, benzoxazolilo, imidazolilo, bencimidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, isoxazolilo, pirazolilo, isotiazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, pirimidilo, azepinilo, oxepinilo, y quinoxalinilo. Opcionalmente los heteroarilo están sustituidos.
Como se usa en esta memoria, el término "predeterminado" se refiere a un componente químico que es seleccionado por el profesional, en oposición a un componente químico que ocurre de manera presente. Así, un "resto de protección predeterminado" es un resto de protección que ha sido seleccionado por el profesional para su colocación sobre (es decir, enlazado de manera covalente a) el(los) resto(s) de cisteína de un anticuerpo. Un resto de protección predeterminado es típicamente un componente seleccionado para la adición a un medio de cultivo, que da como resultado la presencia de una protección particular y deseada sobre un anticuerpo. Un resto predeterminado de protección no es hallado en un medio de cultivo de propósito general.
También se divulga la conjugación directa de una carga útil o una especie de carga útil de enlazador a un anticuerpo mutante de cisteína no protegido.
Es notable que sea inusual la preparación de Cis no pareada expuesta a solvente, completamente desprotegida en anticuerpo en células de mamífero, dado que sólo muy bajo porcentaje de residuos de cisteína libre ha sido detectado un previamente en anticuerpos recombinantes de IgG1, IgG2, y IgG4 (Zhang y Czupryn 2002). Los residuos canónicos de Cis para una IgG normal están presumiblemente enlazados por disulfuro. El bajo nivel de Cis libre es debido probablemente a dos fuentes: una fuente es la degradación de enlaces disulfuro entre cadenas entre cadenas pesadas o entre cadena pesada y cadena liviana. Los residuos de Cis que forman enlaces disulfuro entre cadenas son susceptibles a la reducción (Liu y May 2012), porque ellos están altamente expuestos al solvente. Bajo condiciones básicas, los enlaces disulfuro puede ser descompuestos en deshidroalanina y persulfuro, lo cual puede retornar a Cis (Florence 1980). La otra fuente es la formación incompleta de enlaces disulfuro entre cadenas durante la biosíntesis. Los enlaces disulfuro y Cis entre cadenas están ocultos dentro de las estructuras de lámina p antiparalelas y no están expuestas al solvente. Se sabe que la Cis de línea germinal no canónica, que no está presente en el anticuerpo de este estudio, existe en la región variable de anticuerpo. Su frecuencia en la línea germinal humana es relativamente rara, variando de 6 %-10 % (Ehrenmann, Kaas et al. 2010, Buchanan, Clementel et al. 2013). Varios reportes (Kroon, Baldwin-Ferro et al. 1992, Johnson, Oliver et al. 1997, Gadgilo, Bondarenko et al. 2006, Banks, Gadgil et al. 2008, Buchanan, Clementel et al. 2013) indican que estas Cis no canónicas tienen poco efecto en la estabilidad y agregación de la proteína. Se ha encontrado que algunas de estas Cis no canónicas están expuestas al solvente y cisteiniladas (Banks, Gadgil et al. 2008, Buchanan, Clementel et al. 2013). De acuerdo con el hallazgo de este estudio, probablemente la cisteinilación de estas Cis no canónicas ocurre fuera de las células de mamíferos.
Parece que la susceptibilidad al tiol depende no sólo de factores extrínsecos tales como el ambiente oxidante, sino también factores intrínsecos tales como accesibilidad al solvente y ambiente Cis local. La ubicación Cis en la región de Fab, Fc, cadena pesada o cadena liviana no es un factor que afecta la modificación de cisteinilación (Banks, Gadgil et al. 2008, Junutula, Raab et al. 2008, Chen, Nguyen et al. 2009, Buchanan, Clementel et al. 2013). La consecuencia biológica de la cisteinilación o glutationilación no es clara. Varias proteínas tales como tirosina fosfatasas y chaperones moleculares, contienen Cis sensible a rédox (Georgiou 2002, Barford 2004). Para anticuerpos, el retiro de la cisteinilación de una Cis no canónica no afecta la estructura secundaria de la proteína, sino que aparentemente mejora la estructura terciaria o cuaternaria de la proteína, reduciendo la agregación e incrementando las temperaturas de fusión (Banks, Gadgil et al. 2008). Para Cis Fc en este estudio, la cisteinilación no tiene efecto en absoluto en la estabilidad estructural de la proteína.
Novel Cellular Mechanism Uncovered: Cys-Capping of Unpaired Surface Cysteina Likely Occurs Outside Mammalian Cells-Based, sobre los datos de este estudio se propone un modelo hipotético de modificaciones de protección de Cis (Figura 7). Los polipéptidos de cadena pesada y liviana de anticuerpo son translocados dentro del lumen de ER a través del complejo Sec61 (Schwartz y Blobel 2003). Los enlaces disulfuro nativos son formados a través de la familia de proteína PDI con poder de oxidación de las rutas Ero1 u otras fuentes oxidativas. Los enlaces disulfuro incorrectos son reducidos por GSH que es generado de la glutatión reductasa citosólica (Chakravarthi, Jessop et al.
2006) e importado a través del transportador de membrana (Hwang, Sinskey et al. 1992, Banhegyi, Lusini et al.
1999, Le Gall, Neuhof et al. 2004). El anticuerpo mutante de Cis completamente ensamblado permanece no protegido y es secretado finalmente al medio de cultivo. Ctn y GSH en el medio de cultivo forman enlace disulfuro con la Cis libre del anticuerpo a través del intercambio con disulfuro, seguido por la oxidación de oxígeno disuelto en el medio.
El hecho de que pueda generarse Cis completamente desprotegida en células de mamífero podría haber revelado algunos estatus rédox fisiológicos interesantes acerca del lumen de ER. En primer lugar, el lumen de ER está significativamente menos oxidado que el espacio extracelular. Esto es consistente con la idea de que la formación apropiada de disulfuro requiere tanto de reacciones de oxidación como de reducción en el lumen de ER. Los disulfuros nativos y no nativos son formados y reducidos transitoriamente con objeto de obtener la conformación correcta. Se ha propuesto que es importante un equilibrio preciso entre las reacciones de oxidación y reducción en ER, para que estos enlaces covalentes permanezcan dinámicos hasta que se completa el plegado de la proteína. Bien sea un ER sobreoxidante, que estabiliza enlaces no nativos, o un ER reductor, que previene la formación de disulfuro, pueden desencadenar respuestas de tensión de ER (Margittai y Sitia 2011). La ruta de Ero1 y otras rutas oxidativas contribuyen al poder de oxidación para la formación de disulfuro (Frand, Cuozzo et al. 2000, Sevier y Kaiser 2006, Margittai y Banhegyi 2010, Sevier 2010), haciendo el lumen de ER más oxidado que el citosol (Hwang, Sinskey et al. 1992). Al mismo tiempo, la forma reducida de GSH generada por la reductasa GSH citosólica puede ser importada al interior del lumen de ER para suministrar poder de reducción (Jessop y Bulleid 2004, Chakravarthi, Jessop et al. 2006, Gomez, Vinson et al. 2010). Las células de levadura pueden sobrevivir sin ruta de síntesis de GSH, sugiriendo que el lumen de ER de levaduras es más oxidado que el ER de los mamíferos. Dado que la levadura es un organismo celular único, es posible que se requieran más pocas y más simples proteínas extracelulares con enlaces disulfuro, para llevar a cabo funciones celulares menos complicadas que aquellas de las células de mamíferos. Adicionalmente, un ER menos oxidado es soportado adicionalmente por el hallazgo según el cual PDI puede reducir las proteínas mal plegadas en el ER por retrotranslocación por degradación (Kopito y Sitia 2000), desplegar cadena A1 de toxina de cólera para transporte de citosol (Tsai, Rodighiero et al. 2001), y servir como reductasa cuando es exportada a la superficie celular (Yoshimori, Semba et al. 1990, Jordan y Gibbins 2006).
La segunda revelación acerca del lumen de ER es que el GSH o Cis libres en el lumen de ER, y el residuo de Cis libre de una proteína, son sustratos pobres de PDI para la formación conjunta de enlace disulfuro. La formación de enlace disulfuro de proteínas extracelulares es catalizada por PDI y miembros de la familia de oxidorreductasa, cuyo enlace disulfuro es transferido desde Ero1. Dado que no se forma enlace disulfuro entre GSH/Cis y la Cis manipulada del anticuerpo en el ER, no son un sustrato de las oxidorreductasas, incluso aunque GSH puede reducir el PDI oxidado (Chakravarthi, Jessop et al. 2006). Se ha reportado que se halló que una fracción mayor del GHS ubicado en el ER estaba en disulfuro mixto con proteína de ER (Bass, Ruddock et al. 2004). Es posible que las proteínas de ER que forman disulfuros mixtos con GSH sean PDI y otras oxidorreductasas. Vale la pena mencionar que, aparte de cisteinilación y glutationilación, se ha identificado un tercer tipo de protección, como un enlace disulfuro que forma cadena altamente liviana con la Cis manipulada (Gomez, Vinson et al. 2010). Es posible que el lugar para esta modificación sea el lumen de ER, dado que se encontró que la formación de cadena triplemente liviana era afectada por la producción de GSH intracelular y la relación de mARN entre LC y HC.
Desde hace mucho tiempo se ha desconocido por qué el porcentaje de protección varía de lote a lote (Banks, Gadgil et al. 2008, Junutula, Raab et al. 2008, Chen, Nguyen et al. 2009, Gomez, Vinson et al. 2010, Buchanan, Clementel et al. 2013). Los datos indican que esto se debe a insuficiente Cis/Ctn en el medio, lo cual puede ser afectado por el crecimiento celular y la preparación del medio. Es interesante notar que no se detectaron materiales glutationilados en cultivo transitorio HEK293 o cultivo de corto plazo de CHO estable. Esto es consistente con el hecho según el cual la concentración de GSH en medio de cultivo típico de mamífero, es muy baja. Por otro lado, el citosol contiene aproximadamente 2-10 mM de GSH (Meister y Anderson 1983). Los materiales glutationilados pueden ser detectados en los materiales de cultivo de duodécimo día de CHO estables (datos no publicados), sugiriendo que probablemente la fuente de GSH es la lisis celular. En verdad, se ha reportado que la concentración de GSH aumentó gradualmente en el medio de cultivo junto con los días de cultivo más largos y puede ir aproximadamente hasta 10 veces más a 200 pM (Gomez, Vinson et al. 2010). en este estudio, la adición de exceso de GSH o Ctn al cultivo puede producir anticuerpo mutante de Cis produce completamente glutationilados o cisteinilados. Se ha reportado previamente que puede retirarse efectivamente la glutationilación de especies purificadas de anticuerpo de Cis y puede ser intercambiada con cisteinilación in vitro usando el par rédox Cis/Ctn (Chen, Nguyen et al. 2009). No se ha reportado el retiro de la cisteinilación con GSH y la generación de glutationilación in vitro.
La invención se refiere a un procedimiento para la unión de un resto predeterminado de protección sobre uno o más residuos de cisteína no pareados en un anticuerpo, en el que dicho procedimiento comprende el paso de: cultivo de una línea celular que expresa anticuerpo en un medio de cultivo que contiene dicho resto predeterminado de protección, o un precursor de dicho resto predeterminado de protección, en el que dicha línea celular expresa dicho anticuerpo, y en el que dicho resto predeterminado de protección esta unido mediante un enlace covalente a por lo menos uno de dichos residuos de cisteína no pareados en dicho anticuerpo expresado. Los restos de protección del procedimiento de la invención son seleccionados de entre el grupo consistente en maleimido trioxa-4-formil benzamida (MTFB) con un asa de aldehído, o maleimido azido-lisina con un asa de azida, o dibenzociclooctilpolietileno maleimida (DBCO-PEG4-maleimida) con un asa de alquino. También se divulga que el resto de protección puede ser uno seleccionado de entre grupo consistente en ácido 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB), 2-mercaptopiridina, ditiodipiridina (DTDP), ácido 4-tiobenzoico, ácidos 2-tiobenzoico, ácido 4-tiobencenosulfónico, ácido 2-tiobencenosulfónico, metil sulfonato (Ms), p-toluenosulfonato (Ts) y trifluorometanosulfonato (Tf).
Los restos de protección divulgados incluyen los denominados restos de protección de asa química, como se anotó anteriormente, tales como maleimido trioxa-4-formil benzamida (MTFB) y más generalmente, azidas y alquinos enlazados (lo cual facilita la química click adicional), aldehídos y cetonas enlazados (lo cual facilita la química de oxima adicional), haloacetilos enlazados (lo cual facilita la química de tiol y amina), y maleimidas enlazadas (que facilita la química de tiol adicional). La química de enlace de adición puede ser ejecutada como se describe en esta memoria, y también de acuerdo con las técnicas conocidas.
También se divulga un procedimiento para la preparación de un conjugado de fármaco anticuerpo (ADC) o un conjugado de proteína que comprende los pasos de: (a) preparación de un anticuerpo protegido en un cultivo celular, en el que uno o más residuos de cisteína no pareados en dicho anticuerpo están unidos de manera covalente a través de enlaces de azufre, a uno o más restos predeterminados de protección; (b) exposición de dicho anticuerpo protegido a un agente reductor capaz de retirar dichos restos de protección de dicho anticuerpo, sin reducir los enlaces de azufre de anticuerpo entre cadenas; y (c) sin la introducción de un agente oxidante, conjugación de uno o más enlaces de azufre reducidos sobre dicho anticuerpo a una carga útil vía un resto de enlace. El procedimiento mencionado anteriormente para la preparación de ADCs puede ser ejecutado cuando el resto de protección es seleccionado de entre el grupo consistente en ácido 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB), 2-mercaptopiridina y ditiodipiridina (DTDP). Es de particular interés la protección con ácido con 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB).
Tal protección ocurre típicamente, seguida por una reducción selectiva en residuos de cisteína no pareados.
La carga útil usada en el procedimiento anterior es más frecuentemente una auristatina, una espliceostatina, una calicheamicina o un dímero que comprende uno o más monómeros de CBI, CPI y CTI. Cuando es una auristatina puede ser seleccionada de (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida); (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida); (2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3 oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético); (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida); (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S,2R)-1 -hidroxi-1 -fenilpropan-2-il]amino}-1 - metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida); (2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético); monometil dolastatina 10; (N-metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-norefedrina); y (N-metilvalina-valinadolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina).
El agente de enlace usado en (el)los procedimiento(s) anterior(es) es frecuentemente mc o mcvcPABC, pero muchos otros agentes de enlace están dentro del alcance de la invención, incluyendo aquellos descritos en, por ejemplo, WO15/110935. Como se usa en esta memoria, "PABC" se refiere a p aminobenziloxicarbonilo y restos derivados del mismo, por ejemplo la estructura:
Figure imgf000009_0001
o variantes de la misma. "VC" o "vc" se refiere al péptido valina-citrulina. "MC" o "mc" se refiere a:
Figure imgf000009_0002
Como se usa en esta memoria, "mcvcPABC" se refiere al agente de enlace:
Figure imgf000009_0003
El agente reductor usado en el procedimiento anterior es típicamente de la fórmula:
Figure imgf000009_0004
o R4-S-H, en las que cada uno de R1, R2, R3 y R4 son seleccionados independientemente, de entre el grupo que consiste en alquilo (C1-C6), arilo (C5-C7) y heteroarilo (C5-C7), en la que cada uno de R1, R2, R3 y R4 es independientemente, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre SO3Na, COOH, OH, OMe, NO2 y NH2.
Frecuentemente el agente reductor es tris (3-sulfofenil) fosfina (TSPP):
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También se divulga que el resto TNB de protección está unido al anticuerpo usando di-TNB, también conocido como reactivo de Ellman:
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para preparar el anticuerpo protegido en el cultivo celular.
También se divulga un procedimiento para la preparación de un anticuerpo que comprende una o más cisteínas no pareadas no protegidas. Las cisteínas no pareadas no protegidas están definidas como residuos de cisteína con cadenas laterales de tiol expuestas. Estos grupos tiol libres no están formando enlaces covalentes o no covalentes con ninguna otra sustancia química, de modo que son muy reactivos a la conjugación química. El siguiente es un diagrama de residuos de cisteína no protegidos en un anticuerpo:
Figure imgf000010_0001
Este procedimiento comprende los pasos de: (a) cultivo de una célula que expresa anticuerpo en un medio de cultivo bajo en cisteína, bajo en cistina y bajo en glutatión, y (b) colección del anticuerpo expresado no protegido. En este procedimiento, el medio de cultivo comprende típicamente menos que 5 mM, menos que 1 mM o menos que 0,2 mM de cisteína, menos que 5 mM, menos que 1 mM o menos que 0,2 mM de cistina y menos que 5 mM, menos que 1 mM o menos que 0,2 mM de glutatión. También en este procedimiento, la línea celular puede ser seleccionada del grupo que consiste en CHO, HEK293 y NSO, pero desde luego, otros tipos de líneas celulares están dentro del alcance de la invención.
También se divulga un procedimiento para la preparación de un conjugado de fármaco anticuerpo (ADC) o un conjugado de proteína, en el que dicho procedimiento comprende los pasos de: (a) cultivo de una célula que expresa anticuerpo en un medio de cultivo bajo en cisteína, bajo en cistina y bajo en glutatión, (b) colección del anticuerpo expresado que comprende una o más de cisteínas no pareadas no protegidas, y (c) conjugación de una carga útil de agente de enlace a dicho anticuerpo colectado.
También se divulgan procedimientos para la preparación de un conjugado de fármaco anticuerpo (ADC) o un conjugado de proteína, que comprende el paso de conjugación de una carga útil de agente de enlace a un anticuerpo aislado que comprende una o más cisteínas no pareada cisteínas.
Descripción de las figuras
Figura 1. Figura 1A: diagrama esquemático de cisteinilación y glutationilación de anticuerpo con mutación de Cis de superficie manipulada, en la región Fc. Figura 1B: gráfico de espectro de masas de anticuerpo mutante de cisteína expresado en células CHO-DUKX estables. Figura 1C. Gráfica de espectro de masas de anticuerpo mutante de cisteína expresado en expresión HEK293 transitoria.
Figura 2. El exceso de GSH o cistina añadidos al medio de cultivo da como resultado la generación de especies totalmente glutationiladas o cisteiniladas. Figura 2A: Análisis SEC de anticuerpo mutante de Cis expresado transitoriamente en células HEK293 con exceso de cistina o glutatión. Figura 2B. análisis de espectro de masas de anticuerpos mutantes de cisteína mostrado en la Figura 2A.
Figura 3. Se genera anticuerpo mutante de cisteína completamente desprotegido mediante expresión HEK293 transitoria de medio bajo en cisteína, cistina y glutatión ("triplemente bajo"). Figura 3A: Análisis de SEC de anticuerpo mutante de cisteína expresado de manera transitoria en células HEK293 en medio triplemente bajo. Figura 3b : Análisis de espectroscopía de masas de anticuerpo mutante de cisteína, como se muestra en la Figura 3A.
Figura 4. El anticuerpo mutante de cisteína totalmente desprotegido es generado por expresión de CHO estable, en medio triplemente bajo (bajo en cisteína, bajo en cistina y bajo en glutatión). Figura 4A: Análisis SEC de anticuerpo mutante de cisteína expresado en CHO-DUKX estable, en medio triplemente bajo. Figura 4B: Análisis de espectrometría de masas de anticuerpo mutante de cisteína como se muestra en la Figura 4A.
Figura 5. El anticuerpo mutante de cisteína es protegido adicionalmente con nitrotiobenzoato (TNB) cuando se añade al medio ditionitrobenzoato (DTNB, también denominado reactivo de Ellman). Figura 5A: Análisis SDS-PAGE y análisis SEC de anticuerpo mutante de cisteína expresado en CHO-DUKX estable en medio CD-CHO (Thermo-Fischer) (en esta memoria, medio CD-CHO se refiere bien sea a medio CD-CHO disponible comercialmente o a formulaciones de medio de propietario equivalentes) CD-CHO más DTNB 0,5 mM, y el medio triplemente bajo. Figura 5B: análisis de espectrometría de masas de anticuerpo mutante de Cis, como se muestra en la Figura 5A.
Figura 6. DSC termograma que compara las temperaturas de fusión de anticuerpos mutantes de cisteína que están cisteinilados, no protegidos, y protegidos con nitrobenzoato, y tabla de datos acompañante.
Figura 7. Modificaciones probablemente entendidas del mecanismo de cisteinilación y glutationilación en anticuerpo mutante de cisteína en células de mamíferos.
Figura 8. Reducción selectiva de TSPP y conjugación directa elimina la reducción/reoxidación de disulfuro entre cadenas.
Figura 9. El anticuerpo protegido con TNB produce 90% DAR2 ADC con reducción/conjugación de TSPP. Figura 9A. Análisis de espectrometría de masas de anticuerpo mutante de cisteína sometido a digestión con PNGase F para anticuerpo intacto de L443C. Figura 9B. Reducción selectiva de TSPP y subsiguiente conjugación directa de carga útil de agente de enlace mcvcPABC0101.
Figura 10. Herc-K290C/K334C protegido con TNB produce 90% DAR4 ADC con TSPP de reducción/conjugación. Figura 10A. análisis de espectrometría de masas de anticuerpo mutante de cisteína sometido a digestión con PNGase F e IdeS para región Fc de K290C/K334C. Figura10B. reducción selectiva de TSPP y subsiguiente conjugación directa de carga útil de agente de enlace mcvcPABC0101.
Figura 11. Preparación de novedosos espaciadores químicos protegidos con cisteína con nuevas asas químicas diferentes a los tioles reactivos.
Figura 12. Preparación de HAB08 L443C protegido con MFTB en células estables de CHO. Figura 12A. Conteo celular y viabilidad celular de células CHO estables en presencia de MFTB o DTNB en medio triplemente bajo. Figura 12B. análisis SEC de anticuerpo mutante de cisteína expresado en células estables de CHO en medio triplemente bajo con MFTB. Figura12C. Análisis de espectrometría de masas de anticuerpo mutante de cisteína sometido a digestión con PNGase F para anticuerpo de L443C intacto.
Figura 13. Perfil HIC que Muestra la Conjugación Directa de Anticuerpo No Protegido con mcvcPABC0101. Para comparación, se muestran los perfiles HIC del anticuerpo y el ADC sintetizados mediante el protocolo convencional (reducción total seguida por reoxidación y conjugación).
Figura 14. Preparación de anticuerpo K290C de un brazo 8D3 protegido con DBCO-PEG4-maleimida en células HEK293 transitorias. Análisis de espectro de masas de anticuerpo mutante de cisteína sometido a digestión con PNGase F para molécula intacta de anticuerpo K290C 8D3 de un brazo.
Figura 15. Preparación de HAB08 L443C protegido con maleimida-PEG2-biotina en células CHO estables. Análisis de espectro de masas anticuerpo de HAB08 L443C intacto.
Figura 16. el anticuerpo K290C mutante de Cis protegido con nitrotiobenzoato es generado eficientemente con sistema de expresión transitoria HEK293F en medio normal que contiene cisteína cuando se titula la adición de DTNB al cultivo celular. Análisis de espectrometría de masas de anticuerpo mutante de cisteína sometido a digestión con enzima Ides para la porción Fc del anticuerpo K290C mutante de cisteína.
Descripción detallada de la invención
Procedimientos generales
Cultivo celular, Transfecciones, y Desarrollo de Línea celular: Se cultivaron líneas celulares de mamíferos y se mantuvieron en un incubador humidificado con 5% o 7% de CO2 a 37 °C. Se cultivaron células CHO y células HEK293F [American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA] en medio de expresión FreeStyleMR 293 (Invitrogen, Grand Island, NY). Para la preparación del anticuerpo se usó un procedimiento de transfección HEK293 transitorio de gran escala, como se describe en (Zhong, Kieras et al., J. Biol. Chem. 288(2): 1490-1419 (2013)). Para la transfección estable, se cultivaron células CHO-DUKX en medios alfa Minimum Essential Medium Eagle Alfa Modification (Sigma-Aldrich, M0644) suplementados con adenosina (10 mg/l), desoxiadenosina (10 mg/l), y timidina (10 mg/l). Se transfectaron las células CHO-DUKX con ADNs que codifican una proteína de anticuerpo recombinante de mutante de cisteína y se sometieron a selección con metotrexate 100 nM y 1 mg/ml de G418. Se permitió que los conjuntos estables soportaran selección durante 3 semanas y luego se inocularon a 37 °C a 2e5 células/ml dentro de suspensión libre de suero. Las células CHO-DUKX estables fueron mantenidas en medio alfa suplementado con metotrexate 100 nM y 1 mg/ml de G418. Durante la preparación, se inocularon células en medio CD-CHO y el medio acondicionado fue cosechado al final de la preparación y clarificado mediante centrifugación antes de la purificación. El medio triplemente bajo es un medio similar a Minimum Essential Medium Eagle Alfa Modification (Sigma-Aldrich) para cultivo de células de mamíferos, que no contiene GSH, Cis, y Ctn. Éste medio contiene insulina como un factor de crecimiento y un polímero (polivinil alcohol) como un protector contra el cizallamiento.
Purificación de proteínas: se sometió a equilibrio previo resina rmpProtein A (GE Healthcare, Piscataway, NJ) con Tris 50 mM (tris(hidroximetil)aminometano), NaCl 150 mM, pH 7,5 (TBS) durante la noche a 4 °C. Se filtró la resina usando un filtro PES 0,2 y se le empacó dentro de una columna donde fue lavado con 2 CVs de TBS, 5 CVs de CaCl2, pH 7,5, 3 CVs de Tris 10 mM, NaCl 10 mM, pH 7,5 antes de realizar elución de la proteína usando 100% del paso de glicina 150 mM, NaCl 40 mM, pH 3,5. Se tituló la proteína hasta pH 3,5 usando glicina 2 M, pH 7,2 antes de ajustar el pH a 7,0 usando HEPES 2M, pH 8,0. Se realizó diálisis a la proteína en PBS (NaCl 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 2,7 mM, pH 7,2) antes de concentrarla y cargarla sobre una columna Superdex 200 equilibrada con PBS, pH 7,2. Las fracciones de picos fueron agrupadas y se le realizó diálisis en histidina 20 mM, sacarosa 8,5%, pH 5,8, y luego se concentraron hasta 10 mg/ml usando un dispositivo de centrífuga MWCO de 50 kDa.
Desglicosilación de glicanos enlazados a N: se desglicosilaron muestras de anticuerpo mediante adición de PNGase F (NE BioLabs, Ipswich, MA). Se acidificaron las muestras diluyendo 1:1 con TFA 0,05% (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), seguido por análisis de Cromatografía Líquida y Espectrometría de Masas.
Cromatografía Líquida y Espectrometría de Masas: El análisis por cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS) fue ejecutado usando un espectrómetro de masas Waters Xevo Q-TOF G2 (Waters, Milford, MA) acoplado a un HPLC Agilent (Santa Clara, CA) 1200 capilar. Se separaron las muestras desglicosiladas sobre una columna Waters BEH300 C4, 1,7 pm, (1,0 x 50 mm) mantenida a 80 °C con una tasa de flujo de 65 pl/min. La fase A móvil era agua con TFA al 0,05%, y la fase B móvil era acetonitrilo con TFA al 0,05%. Se realizó elución de las proteínas desde la columna usando un gradiente: 2 % a 20 % de B en 0,5 min, 20 % a 40 % de B en 6 min, y 40 % a 100 % de B en 4 min. El espectrómetro de masas fue operado en modo de sólo MS positivo, barriendo desde 800 a 3.500 m/z y se adquirieron datos con el software MassLynx (Waters) 4.1. Se sumarizaron las señales TOF-MS para el anticuerpo y fueron desenmarañadas usando el programa MaxEnt1 (Waters). Se determinaron las especies protegidas de cisteína, GSH, TNB, o MTFB (maleimido trioxa-4-formil benzamida) mediante el desplazamiento de masa (Cis: 119,004 Da, GSH: 305,068 Da, TNB:198,175, MTFB: 503,54 Da).
Calorimetría de Barrido Diferencial (DSC): Se analizaron las estabilidades térmicas de la proteína de anticuerpo mutante de Cis, usando un sistema capilar de MicroCal DSC, VP-DSC (Northampton, MA). Se calentaron las muestras de proteína a concentración de 0,002 mM en una formulación de sacarosa histidina, de 10 a 110 °C a una tasa de barrido de 100 °C por hora. Se realizó corrección de línea base a la capacidad calorífica resultante, sustrayendo contra un barrido de formulación blanco de sacarosa/histidina y ajustada con la función de transiciones de estado no 2, usando el software Origin7.0 de MicroCal (OriginLab Corporation, Northampton, MA).
Ejemplos de referencia
Generalmente, los ejemplos de referencia discutidos a continuación describen los rasgos relevantes del estado de la técnica, de la técnica que es mejorada mediante la invención descrita en esta memoria.
Ejemplo 1 de Referencia: Detección de residuos de Cisteína no protegida en anticuerpos mutantes de cisteína preparados mediante expresión transitoria de HEK293: Se investigó un modelo de anticuerpo HAB08 con una leucina de superficie modificada para cisteína en la región CH3 (Figura 1A). Se encontró este mutante completamente cisteinilado cuando fue expresado de manera estable en células CHO-DUKX (véanse los datos de espectrometría de masa de representativos mostrados en la Figura 1B). También se detectó un muy pequeño porcentaje de especies glutioniladas. Cuando se expresó este mutante mediante transfección transitoria dentro de células HEK293, se encontró sorprendentemente que se detectaba aproximadamente 10% de anticuerpo mutante de Cis totalmente desprotegido más 30 % de materiales individuales no protegidos. La detección de anticuerpo de Cis no protegido fue consistente en tanto el porcentaje varió lote a lote. En la Figura 1C se muestran datos representativos de espectrometría de masas. Se detectaron muy pocas especies glutationiladas en materiales transitorios de HEK293. Los materiales de proteína de HEK293 transitoria y CHO estable contenían ambas pequeñas cantidades de especies de proteína con escisión alternativa de secuencia de líder.
Ejemplo 2 de Referencia: El exceso de Glutatión o Cistina en el medio de cultivo da como resultado la generación de especies completamente glutationiladas o cisteiniladas: Como se demuestra en el ejemplo 1 de referencia, se encontraron los anticuerpos mutantes de cisteína preparados mediante células CHO estables completamente protegidos con cisteinilación. Para determinar si las especies no protegidas detectadas en materiales de HEK293 eran atribuibles a la insuficiente presencia de cisteína y cistina en el medio de expresión FreeStyleMR 293, se añadió un exceso de cantidad de estas moléculas al medio de cultivo. Por ello, la preparación transitoria de HEK293 fue conducida en el medio con un exceso de cantidad de cisteína o glutatión. Las células HEK293 fueron transfectadas en medio FreeStyle, del cual se estimó que contenía alrededor de 1 mM de cistina. Después de la transfección, a las 24 horas se realizó un intercambio de medio suspendiendo nuevamente las células transfectadas dentro de medio fresco o medio que contenía adicionalmente 5 mM de Ctn o 5 mM de GSH (reducido:oxidado =1:4). A las 96 horas se midió la viabilidad de las células, se cosechó el medio acondicionado y se purificó el anticuerpo. Ambas condiciones de cultivo compartieron viabilidad de crecimiento celular aproximadamente idéntica (> 80 %), nivel de expresión de proteína (~30 mg/l), perfil de elución proA, y patrón de migración de proteína en SDS-PAGE. La Figura 2A muestran los datos de análisis por columna de exclusión de tamaño (SEC), lo cual indica cromatografía aproximadamente idéntica con menos que 1% de agregación de proteína. Las muestras de proteína fueron analizadas en el espectrómetro de masas para medir su estado de protección, como se muestra en la Figura 2B. En contraste con las muestras de medio de expresión FreeStyleMR 293 de control, que tenían especies de protección heterogénea no protegidas, con una protección y dos protecciones, como se muestra en la Figura 1C. La muestra de proteína del medio de cultivo con Ctn 5 mM adicional estaba totalmente protegida cisteinilada, y la muestra de proteína del medio de cultivo con GSH adicional estaba completamente protegida glutationilada. Así, mediante la adición de cantidades suficientes de cisteína o glutatión dentro del medio de cultivo, se preparó anticuerpo mutante de cisteína completamente cisteinilado o glutationilado.
Los Ejemplos de Referencia anteriores, y los Ejemplos a continuación, demuestran que la protección de cisteína ocurre fuera de, no dentro de, las células de mamíferos. Esto implica que la protección de cisteína con otros reactivos podría ser preparada si estos reactivos son añadidos directamente dentro del medio durante el cultivo celular. Novedosos materiales protegidos podrían suministrar potencialmente ventajas al procedimiento de conjugación de fármaco.
Ejemplos
Ejemplo 1: Los anticuerpos mutantes de cisteína son preparados con nitrotiobenzoato cuando al medio se añade ditionitrobenzoato: se examinó el reactivo de Ellman, ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB), como un agente de protección para añadir tionitrobenzoato (TNB). (DTNB es usado comúnmente para determinar el contenido de tiol libre en proteínas. Este reactivo no puede interrumpir el enlace disulfuro pero puede reaccionar con Cis libre. Ha sido usado para tratar materiales de anticuerpo parcialmente reducidos, para generar cuatro Cis libres para conjugación con fármaco.) Se cultivó una línea celular CHO que expresa de manera estable el anticuerpo mutante de cisteína hasta 4x10e6/ml en medio CD-CHO, luego se cambió a medio CD-CHO fresco, medio CD-CHO fresco con DTNB 0,5 mM, o el medio triplemente bajo como un control. Se cultivaron células en estas condiciones durante 72 horas, se midió la viabilidad celular y se cosechó el medio acondicionado. La viabilidad celular de células CHO estables en el medio con DTNB cayó a 40%, posiblemente indicando que DTNB era tóxico a las células CHO. El color del cultivo celular de DTNB se tornó amarillo, sugiriendo que en el cultivo estaba presente tionitrobenzoato y que ocurrió la alquilación a la proteína de la superficie celular. La expresión de proteína del medio que contenía fue también 5 veces más baja que la de CD-CHO. La purificación del anticuerpo de la columna ProA y la migración de proteína en SDS-PAGE de todos los tres materiales de condiciones de cultivo fueron aproximadamente idénticas, como se muestra en la Figura 5A. Todas las tres muestras en análisis SEC muestran especies de monómero, con muy poca agregación. Como se muestra en la tabla 1, todas las tres formas de protección pudieron ser concentradas a aproximadamente 10 mg/ml con una agregación menor que aproximadamente 2 %, y las proteínas fueron estables después del tratamiento de congelación-descongelación.
Tabla 1. Sumario bioquímico de anticuerpo mutante de Cis con diferentes estados de protección.
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Como se muestra en la Figura 5B, los datos de espectro de masas indican que el medio CD-CHO de control produjo materiales completamente cisteinilados (incremento de masa de 238 Da) y que el medio triplemente bajo generó materiales completamente desprotegidos. El medio DTNB produjo una mayoría (> 70 %) de las especies de proteína con protección de tionitrobenzoato (incremento de la masa de ~396 Da). También estaba presente un pequeño porcentaje de especies completamente cisteiniladas, dado que alrededor de 1 mM de cistina estaba presente en el medio. Así, DTNB fue más eficiente para la protección de cisteína, que cistina. Dado que DTNB es una molécula cargada y no permeable a la membrana, este resultado suministra además evidencia que muestra que la protección de cisteína ocurre fuera de la célula.
Ejemplo 2: la protección de los anticuerpos con TNB no disminuye la estabilidad térmica: se investigaron las consecuencias de la protección con TNB para determinar si los cambios estructurales inducidos por tal protección desestabilizan el anticuerpo. Se empleó DSC para vigilar la estabilidad térmica del anticuerpo con cisteinilación, no protegido, o protegido con tiobenzoato. Como se muestra en la Figura 6, los anticuerpos cisteinilados, no protegidos y protegidos con TNB se comportaron de manera casi idéntica, con Tm1 por encima de 69 °C. En contraste con la cisteinilación en la región Fab (Banks, Gadgil et al. 2008) que es conocida por dar como resultado una disminución de 6 °C en la temperatura de fusión comparada con los materiales no protegidos, la cisteinilación y la protección con nitrobenzoato en la Cis no pareada en la región CH3 no parecen afectar la estabilidad estructural del anticuerpo. Esto es consistente con la observación según la cual el anticuerpo con Cis no protegida puede ser concentrado hasta 10 mg/ml con poca agregación de proteína, y contradice la suposición según la cual un tiol reactivo desencadena la oligomerización de la proteína.
Ejemplo 3: Reducción selectiva con TSPP de anticuerpo protegido con TNB: El anticuerpo mutante de cisteína protegido con TNB es reducido selectivamente con TSPP (Figura 8). Los grupos tiol libres generados permiten la conjugación directa con el fármaco, sin los pasos de reducción y reoxidación entre cadenas, lo cual acelera el procedimiento de manipulación in vitro. Además, como se muestra en la Figura 9A, se generó Herceptin L443C completamente protegida con TNB (2 protecciones por anticuerpo, o DAR2) y se analizó vía espectroscopía de masas. El anticuerpo protegido DAR2 con TNB fue conjugado directamente después del tratamiento con TSPp con una eficiencia de 90 %, según se analizó mediante HIC (Figura 9B). De modo similar, se generó Herceptin K290CK334C completamente protegida con TNB en la forma de 4 protecciones por anticuerpo (DAR4) y se analizó vía espectroscopía de masas después de IDES y digestión PNGase F (Figura 10A), y se conjugó directamente después del tratamiento con TSPP, con una eficiencia de 90% (Figura 10B).
Como un ejemplo adicional, en esta memoria se discuten la protección con TNB y conjugación (K290C/K334C). El protocolo de conjugación protegida con TNB para conjugación de mutante de cisteína consiste en dos pasos que conducen al conjugado crudo: reducción selectiva y conjugación. En el primer paso, se logra una reducción selectiva de cisteínas mutantes, (pero no de disulfuros entre cadenas) para alcanzar el retiro del(los) grupo(s) protector(es) de los residuos de cisteína mutante. Típicamente, esto es hecho usando un exceso (~10 equivalentes) de un agente reductor tal como tris(3-sulfofenil fosfina) (TSPP) a 25 °C durante 2 h. En un caso específico: a 1 mg (6,9 nmol; 7,6 mg/ml en PBS; 131,58 ul) de anticuerpo K290C/K334C en un tubo de eppendorf de 0,5 ml se añadieron 39,2 ^g de TSPP (10 equivalentes; 69,05 nmol; 50 mM en agua; 1,38^l), Se incubó la mezcla de reacción a 25 °C, 2 h.
En un segundo paso, se conjugan las cisteínas mutantes no protegidas con una carga útil de agente de enlace. Típicamente, a la reacción se añade un exceso (~10 equivalentes) de carga útil de agente de enlace y la reacción es ejecutada a 25 °C durante 1 h para preparar el conjugado crudo. Así, en un caso específico: a la mezcla de reacción del paso 1 arriba se añadieron 92,6 ^g de carga útil de agente de enlace mcvcPABC0101 (10 equivalentes, 69,05 nmol; 10 mM en dimetilsulfóxido; 6,9 ^L). Se incubó la mezcla de reacción a 25 °C, 1 h. Para el análisis de la mezcla de reacción se usó un ensayo por cromatografía de interacción hidrófoba (HIC).
Ejemplo 4: Protecciones adicionales manipuladas de Cisteína con asas químicas para química de conjugación de fármaco adicional: Una aplicación de la invención es la manipulación de protecciones novedosas (es decir, diferentes a TNB) mediante la adición de espaciadores químicos alquilantes novedosos dentro del medio de cultivo. Como se muestra en la Figura 11, estos espaciadores químicos alquilantes contienen asas químicas tales como grupos funcionales aldehído o azida, que permiten la química de conjugación de fármaco adicional. En el caso de cetona/aldehído, pueden reaccionar con nucleófilos aminooxi o hidrazida para química de conjugación adicional, formando productos de oxima/hidrazona.
La maleimido trioxa-4-formil benzamida (MTFB) es una maleimida con un agente de enlace PEG3 y 4-formilbenzamida (Solulink Inc, San Diego, CA). Como se muestra abajo, MTFB es un espaciador químico alquilante con un grupo aldehído:
Figure imgf000014_0001
Como se muestra en la Figura 12A, se cultivaron a 37 °C a aproximadamente 2.5e6 células/ml, células CHO-DUKX que expresan de manera estable anticuerpo HAB08L443C en medio CD-CHO, luego se cambió a medio triplemente bajo (cero o bajo en Cis, Ctn, y GSH). Se añadió MTFB 19,8 mM, disuelto en DMSO, a 50 ml de cultivo celular a una concentración final de 0,25 mM durante 24 horas. Se midió la viabilidad celular y se cosechó el medio acondicionado. Comparados con el cultivo controlado con DTNB 0,5 mM, la viabilidad celular y conteos celulares en la condición con MTFB fueron significativamente más bajos. A continuación se purificó el anticuerpo HAB08L443C a tales condiciones, mediante una columna ProA de 1 ml (Figura 12B). Tal anticuerpo fue sometido a estudio LC/MS de parte 2, primero mediante digestión con PNGF para retirar los glicanos de Fc e IDES, para separar Fab2 de scFc que contiene 443 Cis. Como se muestra en la Figura12C, se prepararon especies de anticuerpos HAB08 L443C protegidos con MTFB
El grupo aldehído de anticuerpo protegido con MTFB reacciona con hidrazinas o cargas útiles que contienen aminooxi tales como aminooxi-PEG3-C2-amida-MMAD. Se incuban 10 ^M de anticuerpo y de carga útil en presencia de anilina 100 mM recientemente preparada en fosfato de Na 0,3M (pH 7,0). La reacción es llevada a cabo a temperatura ambiente durante 24 h para formar hidrazona o productos de oxima. El anticuerpo conjugado final es purificado a través de columna HIC.
Los espaciadores químicos alquilantes que contienen asas químicas tales como grupos funcionales alquino o azida permite la conjugación por cicloadición. Como se muestra abajo, la dibenzociclooctil-polietilen maleimida (DBCO-PEG4-maleimida) es una maleimida con un agente de enlace PEG4 y dibenzociclooctil (Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ). La azido-PEG3-maleimida es una maleimida con un agente de enlace PEG3 y dominio azido (Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ).
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(Az¡do-PEG3-Maleimida)
Para demostrar que se generó la protección novedosa de Cis con DBCO-PEG4-maleimida, se transfectaron transitoriamente células HEK293F con un anticuerpo 8D3K290C de un brazo, en 2 litros de medio FreeStyle a la densidad celular de 2.0e6 células/ml a 37 °C. A 24 horas después de la transfección, se cambiaron las células HEK293F al medio triplemente bajo (cero o bajo el Cis, Ctn, y GSH) durante 96 horas adicionales a 37 °C. Se cosechó el medio acondicionado, se le filtró e incubó con una concentración final de 0,14 mM de DBCO-PEG4-maleimida, desde una concentración madre de 29,6 mM disuelto en DMSO durante 24 horas adicionales a 37 °C. A continuación se purificó anticuerpo 8D3K290C de un brazo de tal medio acondicionado mediante una columna ProA de 5 ml. Tal anticuerpo fue sometido a estudio LC/MS, primero sometido a digestión con PNGase F para retirar glicanos de Fc. Como se muestra en la Figura 14, se preparó especie de anticuerpo 8D3K290C protegido con DBCO-PEG4-maleimida. De modo similar, se preparó también, 8D3K290C protegido con azida-PEG3-maleimida.
Para reacción de conjugación por cicloadición, se incuba anticuerpo protegido con azido-PEG3-maleimida 10 pM en amortiguador de PbS con dibenzociclooctil-polietilen glicol 100 pM (DBCO-PEG)-MMAF (ACME Bioscience; Palo Alto, CA) a temperatura ambiente durante 16 h. La reacción de conjugación click libre de cobre es detenida mediante de azida de sodio 1mM. El anticuerpo conjugado puede ser purificado mediante columna de HIC.
Los ejemplos adicionales novedosos de protección de Cis incluyen espaciadores químicos alquilantes con dominio funcional de biotina. Esta protección de Cis con biotina permite interacción específica no covalente entre Strepavidina y Biotina para la formación de imágenes de la célula y etiquetado de proteína. Como se ve abajo, la maleimida-PEG2-biotina (MPB) es una maleimida con un agente de enlace PEG2 y un dominio de biotina.
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Se cultivaron a aproximadamente 2,5e6 células/ml a 37 °C en medio CD-CHO, células CHO-DUKX que expresan de manera estable el anticuerpo HAB08L443C, luego se cambiaron a medio triplemente bajo (cero o bajo en Cis, Ctn y GSH). Se añadió maleimida-PEG2-biotina 20 mM a 50 ml de cultivo celular a una concentración final de 0,2 mM durante 48 horas. La viabilidad celular y recuentos celulares no fueron afectados por el tratamiento MPB. A continuación bajo tal condición de cultivo, el anticuerpo HAB08L443C fue purificado mediante una columna ProA de 1 ml y sometido a un estudio por LC/MS de parte 2, sometido a digestión con PNGase F para retirar glicanos de Fc e IDES para separar Fab2 del scFc que contiene 443 Cis. Como se muestra en la Figura 15, se preparó especie de anticuerpo HAB08 L443C protegido con MPB.
Ejemplo 5: Generación de Anticuerpo Mutante de Cisteína completamente desprotegido vía expresión transitoria de HEK293 en medios cero o bajos en Cisteína, Cistina y Glutatión: El hallazgo según el cual el exceso de cisteína o glutatión en medios de cultivo afecta el estado de protección de anticuerpos mutantes de cisteína sugiere que la protección de cisteína tiene lugar fuera de la célula. Para investigar esto en más detalle, se generó un medio que carecía de cisteína, cistina y glutatión (un medio denominado "triplemente bajo"). Sin estar limitados a una teoría en particular, se sospechó que si la cisteinilación y glutationilación ocurriesen dentro de la célula (como se especulaba comúnmente) los anticuerpos sustancialmente cisteinilados o glutationilados deberían todavía ser detectados en anticuerpos generados usando medio triplemente bajo, dado que el lumen de ER tiene suficientes cisteína, cistina y glutatión (sintetizables a partir de otros componentes del medio, tales como serina y metionina). A la inversa, si la cisteinilación y glutationilación ocurriesen fuera de la célula, el anticuerpo mutante de cisteína debería estar completamente desprotegido cuando es preparado en el medio triplemente bajo, dado que no hay fuente de protección disponible en el medio. Se transfectaron células HEK293 en medio regular de expresión FreeStyleMR 293 y luego se suspendieron de nuevo en medio fresco de expresión FreeStyleMR 293 (control) o medio triplemente bajo. La transfección se completó en 24 horas. A las 96 h, se midió la viabilidad celular y se cosechó el medio de cultivo acondicionado. Para el medio triplemente bajo, la viabilidad de las células de cultivo fue de 50 %, mientras la viabilidad celular fue de 80% en el medio de expresión FreeStyleMR 293. (Esta observación de viabilidad no es inesperada. Incluso aunque Cis es un aminoácido no esencial, las células todavía necesitarían tiempo para adaptarse a los cambios de carencia de suministro directo de Cis). La expresión de proteína en el medio triplemente bajo fue 5 veces menor que aquella en el medio regular, dado que la síntesis de proteína fue probablemente ralentizada debido a la carencia de suministro inmediato de cisteína. La purificación de anticuerpo de la columna ProA y la migración de proteína en SDS-PAGE fueron casi idénticas (datos no mostrados). La Figura 3A muestra los datos SEC, los cuales indican cromatografía casi idéntica con menos que 1 % de agregación de proteína. Luego se analizaron las muestras de proteína en espectrometría de masas para medir su estado de protección. Como se muestra en la Figura 3B, mientras el medio regular dio una mezcla de protección heterogénea similar, de manera interesante, el medio triplemente bajo produjo sólo especies completamente desprotegidas - no estaban presentes especies cisteiniladas. Estos datos indican que en células HEK293, la protección por cisteinilación parece ocurrir fuera de las células.
Ejemplo 6: Generación de anticuerpos mutantes de cisteína completamente desprotegida, vía expresión de CHO estable en medio cero o bajo en cisteína, cistina y glutatión: Para descartar la posibilidad de que las observaciones del Ejemplo 5 fuesen específicas de la línea celular o relacionados con expresión transitoria, se repitió el experimento usando la línea CHO-DUKX estable. La línea CHO-DUKX estable, que expresa de manera estable el anticuerpo mutante de cisteína fue cultivada en medio CD-CHO hasta 4x10e6/ml, luego se cambiaron estas células a medio CD-CHO (control) o al medio triplemente bajo. Un control más es el cultivo de medio CD-CHO fresco a 31 °C, y no a 37 °C. A 72 horas se midió la viabilidad celular y se cosechó el medio acondicionado. Para células cultivadas en medio triplemente bajo, la viabilidad celular de células CHO estables fue de 60 %. La viabilidad celular para células cultivadas en el medio CD-CHO fue mayor que 95 %. La expresión de proteína en el medio triplemente bajo fue aproximadamente 5 veces más baja que aquella del medio CD-CHO, probablemente debido a la falta de cisteína en el medio. La purificación de anticuerpo de la columna ProA y la migración de proteína en SDS-PAGE de ambos medios fue aproximadamente idéntica (datos no mostrados). La Figura 4A muestra unos datos SEC similares con muy pequeña agregación. Las muestras de proteína fueron realizadas mediante espectrometría de masas para medir la protección. Como se muestra en la Figura 4B, para el medio CD-CHO, el anticuerpo mutante de cisteína estaba completamente cisteinilado, sea a 37 °C o a 31 °C, indicando que las temperaturas de cultivo no afectaron el estado de protección. Las células CHO estables en medio triplemente bajo produjeron proteína mutante de cisteína totalmente desprotegida. Así, en células CHO la protección por cisteinilación parece ocurrir fuera de las células. Estos datos confirman que la generación de anticuerpo mutante de cisteína completamente desprotegida en medio triplemente bajo, no es específica de la célula.
Ejemplo 7: Conjugación directa de anticuerpo mutante de cisteínas no protegidas: a 0,5 mg (3,45 nmol; 10,19 mg/ml; 49,07 jl) de mAb IL13Ra2 L443C no protegido del ejemplo 6 en amortiguador de histidina 20 mM, pH 5,8 se añadieron 32,0 jg de carga útil de agente de enlace mcvcPABC0101 (10 equivalentes, 34,52 nmol; 10 mM en dimetilsulfóxido; 1,7 jl). Se incubó la mezcla de reacción 25 °C, 1 h. Se usó un ensayo de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) para analizar la mezcla de reacción. Véase la Figura 13, que compara los cromatogramas HIC para el ejemplo 7 ADC con el correspondiente anticuerpo no conjugado, y el correspondiente ADC preparado mediante procedimientos convencionales.
Ejemplo 8: El anticuerpo K290C mutante de Cis protegido con nitrotiobenzoato es generado eficientemente con sistema de expresión transitoria HEK293F en un medio FreeStyleMR normal que contiene cisteína, cuando se titula la adición de DTNB cultivo celular: Para determinar si la protección con nitrotiobenzoato puede ser generada bajo medio de cultivo celular normal durante la expresión transitoria de HEK293F, se añadieron a cultivo HEK293F diferentes concentraciones de soluciones de DTNB después de la transfección de ADN. Brevemente, se cultivaron células de HEK293F a aproximadamente 1,0e6/ml en medio FreeStyleMR, se mezcló 1 mg de ADNs (0,5 mg de ADN de cadena pesada y 0,5 mg de ADN de cadena liviana de un anticuerpo K290C mutante de Cis) con 3,5 mg de agente de transfección para incubación durante 20 min a temperatura ambiente. Se inoculó la mezcla con 1 litro de células HEK293F y se cultivaron a 37 °C las células transfectadas. A 16 horas después de la transfección, se inoculó una concentración final de DTNB a 0,5 mM, o 1 mM, o 2 mM, o 3 mM, o 4 mM, o 6 mM desde una concentración madre de 40 mM dentro de alícuotas de 50 ml de cultivo celular del 1 litro de cultivo celular transfectado. Se continuó al cultivo celular por 5 días adicionales. Se cosechó y filtró el medio acondicionado, y se sometió a una purificación en columna ProA de 1 ml. Las eluciones de proteína fueron sometidas a diálisis contra amortiguador de PBS, y fueron concentradas a través de Centricon.
Como se muestra en la Figura 16, el espectro de masas indica que con un incremento en la concentración de DTNB, mejoraron drásticamente las especies de proteína con protección de tionitrobenzoato (incremento de masa de ~ 396 Da). A la concentración mayor que 3 mM de DTNB, casi todas las especies de proteína estaban protegidas con tionitrobenzoato. Este resultado indica que la protección con tionitrobenzoato puede ser generada durante la expresión transitoria de HEK293F en medio de cultivo normal con cisteína, y que la generación de protección con tionitrobenzoato parece ser mucho más eficiente que la protección por cisteinilación.

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de enlace de un resto predeterminado de protección a uno o más residuos de cisteína no pareados en un anticuerpo, comprendiendo dicho procedimiento el paso de: cultivar una línea celular que expresa anticuerpo, en un medio de cultivo que contiene dicho resto predeterminado de protección, o un precursor de dicho resto predeterminado de protección, en el que dicha línea celular expresa dicho anticuerpo, y en el que dicho resto predeterminado de protección está unido mediante un enlace covalente a al menos uno de dichos residuos de cisteína no pareados en dicho anticuerpo expresado, en el que el resto de protección es seleccionado de entre un grupo reactivo que consiste en maleimido trioxa-4-formil benzamida (MTFB) con un asa de aldehído, o maleimido azido-lisina con un asa de azida, o dibenzociclooctil-polietileno maleimida (DBCO-PEG4-maleimida) con un asa de alquino.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la línea celular es una línea celular de mamífero.
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