ES2841941T3 - Tratamiento del colangiocarcinoma a través de la internalización fotoquímica de gemcitabina inducida por TPCS2a - Google Patents

Abstract

Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino, para su uso en el tratamiento de un colangiocarcinoma en un paciente humano, en el que i) dicho TPCS2a debe administrarse sistémicamente a dicho paciente a una dosis de 0,05 a 0,5 mg/kg; y ii) después de 3-5 días, dicha gemcitabina debe administrarse sistémicamente a dicho paciente a una dosis de 500-1500 mg/m2 y dicho colangiocarcinoma debe irradiarse con luz con una longitud de onda de 640- 665nm utilizando una fibra óptica colocada dentro de los 3 cm de dicho colangiocarcinoma para proporcionar una dosis de luz de 10 a 60 J/cm; y opcionalmente iii) después de 1-40 días (preferiblemente después de 7-21 días), gemcitabina y/u otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino, debe administrarse sistémicamente a dicho paciente.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento del colangiocarcinoma a través de la intemalización fotoquímica de gemcitabina inducida por TPCS2a La presente invención se refiere a gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente, a otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino, para su uso en el tratamiento de un colangiocarcinoma en un paciente que comprende la administración sistémica de TPCS2a al paciente y, posteriormente, la administración sistémica de gemcitabina e irradiar el colangiocarcinoma a través de una fibra óptica colocada adecuadamente, como se define en las reivindicaciones. Este tratamiento se puede combinar con una administración sistémica adicional de gemcitabina y/u otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino.

El cáncer de los conductos biliares (también denominado colangiocarcinoma, CCA) es una enfermedad rara pero habitualmente mortal. Los CCA se dividen en CCA intrahepáticos y extrahepáticos, estos últimos pueden subdividirse en CCA perihiliares y distales. Más del 90% de los CCA son adenocarcinomas. El CCA tiene una incidencia de aproximadamente 1,7/100.000 en la población. Se encuentra una prevalencia más alta en Asia, en particular en China. El número de casos nuevos solo en los EE. UU. y la UE es de aproximadamente 11.000 por año. Del 60 al 80% de los CCA son extrahepáticos y del 70 al 80% de estos no son candidatos a resección curativa. La tasa de supervivencia a cinco años es inferior al 5% y al 0% cuando el tumor es inoperable. La supervivencia media de las CCA inoperables es de 12 meses.

Actualmente, los CCA se tratan mediante cirugía, colocación de prótesis (stents) y/o quimioterapia. La cirugía es el único tratamiento potencialmente curativo para el CCA. Sin embargo, menos de un tercio de los tumores son resecables en el momento de la presentación. La colocación de prótesis endoscópicas es el procedimiento de elección para el drenaje biliar paliativo en pacientes con enfermedad irresecable. No existe una quimioterapia aprobada para el tratamiento del CCA. El tratamiento de quimioterapia recomendado incluye una combinación de gemcitabina y cisplatino, pero no es curativo. Valle et al., 2010, New England J. Med., 362, págs. 1273-1281 informan sobre experimentos en los que se administraron cisplatino y gemcitabina a pacientes con cáncer de conductos biliares localmente avanzado o metastásico y alcanzaron una mediana de supervivencia global de 11,7 meses.

Sigue existiendo una gran necesidad de un tratamiento para los CCA, en particular para aquellos que son inoperables y para los que no existen tratamientos curativos.

La internalización fotoquímica (PCI) es una técnica conocida que mejora el suministro de moléculas al citosol. Esto se puede usar para internalizar moléculas que afecten a la función de las células (por ejemplo, moléculas citotóxicas para matar las células) o para permitir su presentación en la superficie celular, por ejemplo. en métodos de vacunación. La PCI es una técnica que utiliza un agente fotosensibilizante, en combinación con un paso de irradiación para activar ese agente, y se sabe que logra la liberación de moléculas coadministradas a una célula en el citosol de la célula. Esta técnica permite a las moléculas que son absorbidas por la célula en orgánulos, como los endosomas, que se liberen de estos orgánulos al citosol, después de la irradiación. La PCI proporciona un mecanismo para introducir moléculas que de otro modo serían impermeables a la membrana (o poco permeables) en el citosol de una célula de una manera que no dé como resultado una destrucción celular generalizada o muerte celular.

El método básico de internalización fotoquímica (PCI) se describe en los documentos WO 96/07432 y WO 00/54802. En tales métodos, la molécula a internalizar (que en la presente invención serían los agentes citotóxicos) y un agente fotosensibilizante se ponen en contacto con una célula. El agente fotosensibilizante y la molécula a internalizar se recogen en un subcompartimento unido a la membrana celular dentro de la célula, es decir, se endocitan en una vesícula intracelular (por ejemplo, un lisosoma o endosoma). Al exponer la célula a la luz de la longitud de onda adecuada, se activa el agente fotosensibilizante que genera directa o indirectamente especies reactivas que rompen las membranas de la vesícula intracelular. Esto permite que la molécula internalizada se libere en el citosol.

Se encontró que en tal método la funcionalidad o la viabilidad de la mayoría de las células no se ve afectada de manera perjudicial. Por tanto, se propuso la utilidad de tal método, denominado "internalización fotoquímica" para transportar una variedad de moléculas diferentes, incluidos agentes terapéuticos, al citosol, es decir, al interior de una célula.

Se ha demostrado que la PCI potencia la actividad biológica de una gran variedad de macromoléculas y otras moléculas que no penetran fácilmente a través de la membrana plasmática, incluidas las proteínas inactivadoras de ribosomas de tipo I, inmunotoxinas, agentes quimioterapéuticos como Bleomicina (Blenoxane®) y Doxorrubicina, plásmidos que codifican genes y oligonucleótidos. Se ha descubierto que induce citotoxicidad en capas de tejido más profundas que la correspondiente terapia fotodinámica (TFD). Debido a la combinación de terapias dirigidas con liberación citosólica activada por luz inducida por fotosensibilizadores que se acumulan preferentemente en tumores sólidos, la PCI puede ser altamente específica y esto también contribuye a mejorar la eficacia antitumoral. NCT01900158 (ClinicalTrials.gov) describe un estudio de seguridad y eficacia de fase I/II de PCI de gemcitabina y quimioterapia en pacientes con colangiocarcinomas.

Como se señaló anteriormente, los CCA necesitan un tratamiento médico que pueda proporcionar alternativas a los métodos existentes que, en la actualidad, ofrecen mejoras limitadas a la esperanza de vida de los pacientes. La presente invención aborda esta necesidad.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que, ventajosamente, un método que implica el uso de un agente fotosensibilizante, TPCS2a, y gemcitabina en las dosis definidas aquí, y la irradiación con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizante da como resultado mejoras significativas en relación con los tratamientos estándar. Como se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos, se ha demostrado que después de 6 meses de tratamiento más del 80% de las lesiones se habían encogido y más del 50% de las lesiones ya no eran detectables. Este es un resultado notable e importante que ofrece nuevas esperanzas para el tratamiento de los CCA. El resultado es particularmente sorprendente ya que el método PCI se basa en la liberación de moléculas del endosoma al citosol y no había nada que sugiriera que las células absorbieran gemcitabina en el endosoma y, por lo tanto, pudiera beneficiarse del tratamiento PCI.

La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino, para su uso en el tratamiento de un colangiocarcinoma en un paciente humano, en el que i) dicho TPCS2a debe administrarse sistémicamente a dicho paciente en una dosis de 0,05 a 0,5 mg/kg; y ii) después de 3-5 días, dicha gemcitabina debe administrarse sistémicamente a dicho paciente a una dosis de 500-1500 mg/m2 y dicho colangiocarcinoma debe irradiarse con luz con una longitud de onda de 640-665nm utilizando una fibra óptica colocada dentro de los 3 cm de dicho colangiocarcinoma para proporcionar una dosis de luz de 10 a 60 J/cm; y opcionalmente iii) después de 1-40 días (preferiblemente después de 7-21 días), debe administrarse sistémicamente a dicho paciente gemcitabina y/u otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino.

Como se define en el presente documento, "tratar' se refiere a reducir, aliviar o eliminar uno o más síntomas del CCA que se está tratando, en relación con los síntomas antes del tratamiento. En particular, dicho tratamiento puede comprender la reducción del tamaño o volumen del CCA que se está tratando. El tratamiento puede incluir efectos en el CCA más cercano a la fibra óptica, así como en otros CCA que están más distantes y pueden no recibir directamente la irradiación de la fuente de luz. En un aspecto de la invención, el método trata uno o más colangiocarcinomas (o por lo tanto células) que no se irradian durante la etapa de irradiación (esto incluye irradiación directa o indirecta, es decir, que no reciben una dosis de luz resultante de la etapa de irradiación).

Un "colangiocarcinoma" es un cáncer de los conductos biliares que puede ser intrahepático o extrahepático (que puede ser perihiliar y distal). Más del 90% de los CCA son adenocarcinomas.

El "paciente" es un ser humano.

La "administración sistémica" incluye cualquier forma de administración no local en la que el agente se administra al cuerpo en un sitio que no sea directamente adyacente a, o en la vecindad local del CCA, dando como resultado que todo el cuerpo reciba el agente administrado. Convenientemente, la administración sistémica puede ser por vía enteral (por ejemplo, oral) o parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular o subcutánea). Se prefiere la administración intravenosa.

"TPCS2a" es un agente fotosensibilizante (ácido tetrafenilclorin disulfónico) que tiene la estructura siguiente o isómeros del mismo. La siguiente estructura proporciona el isómero 7,8-dihidro. Los isómeros 12,13-dihidro y 17,18-dihidro están englobados por el término TPCS2a. También se incluyen sus sales farmacéuticamente aceptables. Tales moléculas son como se describen en WO03/020309 y WO2011/018635.

El TPCS2a se puede obtener de BOC Sciences, NY, EE.UU. o de PCI Biotech AS, Noruega. Alternativamente, TPCS2a se puede preparar como se describe en WO03/020309 y WO2011/018635. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácido con ácidos orgánicos o inorgánicos fisiológicamente aceptables. Los ácidos adecuados incluyen, por ejemplo, los ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, láctico, cítrico, tartárico, succínico, maleico, fumárico y ascórbico. La sal hidrófoba también se puede producir convenientemente mediante, por ejemplo, precipitación. Las sales apropiadas incluyen, por ejemplo, sales de acetato, bromuro, cloruro, citrato, clorhidrato, maleato, mesilato, nitrato, fosfato, sulfato, tartrato, oleato, estearato, tosilato, calcio, meglumina, potasio y sodio. Los procedimientos para la formación de sales son convencionales en la técnica.

Las sales preferidas incluyen sal de dietanolamina, sal de etanolamina (preferiblemente bis(monoetanolamina)), sal de N-metilglucamina, sal de trietanolamina, sal de 1-(2-hidroximetil)-pirrolidina y sal de 2-amino-2-(hidroximetil) propano-1,3-diol.

"Farmacéuticamente aceptable", como se denomina en el presente documento, se refiere a ingredientes que son compatibles con otros ingredientes usados en los métodos o usos de la invención, así como fisiológicamente aceptables para el receptor.

Los agentes usados aquí, por ejemplo, el TPCS2a, gemcitabina y/u otro agente citotóxico pueden proporcionarse en forma de una composición farmacéutica para su uso en el método de la invención y pueden formularse de cualquier manera conveniente de acuerdo con técnicas y procedimientos conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, utilizando uno o más diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. "Farmacéuticamente aceptable" tiene el significado descrito anteriormente. La naturaleza de la composición y los vehículos o materiales excipientes, dosis, etc. pueden seleccionarse de manera rutinaria según la elección y la vía de administración deseada, etc. Cuando sea posible una variación, las dosis también se pueden determinar de manera rutinaria y pueden depender de la naturaleza de la molécula, el propósito del tratamiento, la edad del paciente, el modo de administración, etc.

Como se establece en los ejemplos, se ha encontrado que el uso de TPCS2a a una dosis (o concentración) de 0,05 a 0,5 mg/kg (o 0,1 a 0,5 mg/kg) (mg de agente por kg de peso corporal) proporciona resultados particularmente ventajosos. Convenientemente, se usa una dosis de 0,05 a 0,3 mg/kg (o de 0,1 a 0,3 mg/kg), preferiblemente de 0,2 a 0,3 mg/kg. El agente fotosensibilizante puede administrarse al paciente de forma rápida o más lenta. Convenientemente, TPCS2a puede administrarse durante menos de 30 segundos, por ejemplo, de 1 a 15 segundos o durante un período de tiempo más largo, por ejemplo, de 1 minuto a 10 minutos.

La "gemcitabina" es un análogo de nucleósido que tiene la estructura indicada a continuación (4-amino-1-(2-desoxi-2,2-difluoro-p-D-eritro-pentofuranosil)pirimidin-2(1H)-on) e incluye sus sales farmacéuticamente aceptables.

La gemcitabina actúa inhibiendo la síntesis de ADN e inhibiendo la enzima ribonucleótido reductasa, que también participa en la maquinaria de replicación de la célula. La gemcitabina está aprobada para varios regímenes estándar de quimioterapia contra el cáncer en indicaciones como cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de páncreas. Aunque no está aprobado para esta indicación, también se usa comúnmente para el tratamiento paliativo del colangiocarcinoma.

La gemcitabina está disponible de fuentes tales como Eli Lilly & Co (Gemzar®) o Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU. La sal farmacéuticamente aceptable es preferiblemente como se define aquí anteriormente, preferiblemente la sal de clorhidrato.

La gemcitabina se administra al paciente a una dosis (o concentración) de 500-1500 mg/m2 (que se refiere a mg de gemcitabina por m2 de superficie corporal, BSA). BSA se puede calcular, por ejemplo, usando la fórmula de Mosteller (V ([altura (cm) x peso (kg)]/3600)). (Cuando sea necesario, se puede convertir a mg/kg utilizando un factor de conversión para un adulto medio de 0,025 mg/kg = 1 mg/m2). Se usa convenientemente una dosis de 900-1100 mg/m2. Convenientemente, la gemcitabina se puede administrar durante menos de 1 hora, por ejemplo, 15 a 45 minutos, por ejemplo, alrededor de 30 minutos o durante un período de tiempo más largo, por ejemplo, de 1 hora a 12 horas.

"Irradiar" el colangiocarcinoma se refiere a la irradiación del tumor con luz como se define en el presente documento a través de una fibra óptica. La irradiación también puede denominarse aquí iluminación. Esto sirve para activar el agente fotosensibilizante. Las células del tumor pueden iluminarse directamente (cuando están en contacto directo con la fibra óptica) o indirectamente (cuando se ubican lejos de la fibra óptica, a través de la pantalla de otras células), es decir, recibir una dosis de luz.

La iluminación del tumor o las células del paciente se produce 3-5 días después de la administración del agente fotosensibilizante. Preferiblemente, la iluminación ocurre 4 días después de esa administración.

Para asegurar que la actividad del agente fotosensibilizante afecte a la liberación de gemcitabina, la irradiación se realiza justo antes, durante y/o después de la administración de gemcitabina. La gemcitabina debe introducirse en la célula para que sea activa y, en la mayoría de las células, varios transportadores de nucleósidos son importantes para su absorción en la célula. En algunas células cancerosas, la expresión de dichos transportadores puede, sin embargo, ser bastante baja, limitando gravemente la captación de gemcitabina y, por tanto, el efecto terapéutico que se puede lograr. En tales células, sin embargo, la gemcitabina todavía puede ser absorbida por endocitosis, y el aumento del efecto citotóxico de gemcitabina inducido por PCI que se ha observado (por ejemplo, en los estudios de células cancerosas in vitro descritos en los Ejemplos) indica que esto puede ser un mecanismo de transporte importante en tales células.

Aunque no se desea ceñirse a ninguna teoría, es probable que la gemcitabina se absorba en compartimentos intracelulares en las células del paciente y la activación del agente fotosensibilizante libera la gemcitabina en la célula. Como consecuencia, antes de que se lleve a cabo la irradiación, el agente fotosensibilizante debe estar en los compartimentos correspondientes de la célula. Se ha encontrado que las moléculas en esos compartimentos en el momento de la activación del agente fotosensibilizante, o que se han absorbido en dichas células inmediatamente después de dicha activación, se liberan en el citosol. (Véase al respecto WO02/44396, que se refiere al método llamado "luz antes").

Convenientemente, dicha irradiación se realiza dentro del intervalo de tiempo de 1 hora antes del inicio de la administración de gemcitabina hasta 4, 5 o 6 horas después del inicio de la administración de gemcitabina. Preferiblemente, la irradiación se realiza dentro de las 3 o 4 horas posteriores al inicio de la administración de gemcitabina (es decir, desde el inicio de la administración de gemcitabina hasta 3 o 4 horas después del inicio de la administración de gemcitabina, por ejemplo, en el momento 0, 30, 60, 120, 180 o 240 minutos cuando el tiempo 0 es el inicio de la administración de gemcitabina). Así, por ejemplo, cuando la administración de gemcitabina se realiza durante 30 minutos y la irradiación se realiza durante 15 minutos, la administración de gemcitabina puede iniciarse en el tiempo 0, interrumpirse a los 30 minutos, la irradiación se inicia a los 120 minutos y concluye a los 135 minutos. Sin embargo, la irradiación realizada hasta 1, 2, 3 o 4 días después de la administración de gemcitabina también está incluida en el método de la invención.

Cuando sea apropiado, la etapa de irradiación de luz puede realizarse más de una vez (por ejemplo, 2, 3 o 4 veces). Esto puede ser necesario para tumores particularmente grandes o tumores discretos diseminados en un área amplia. En este caso, se pueden usar una o más fibras ópticas que pueden estar en la misma ubicación o en diferentes ubicaciones. La ubicación de una o más fibras ópticas puede cambiarse o mantenerse para cada etapa de irradiación (por ejemplo, trasladarse a una ubicación cercana a otros tumores discretos o áreas de una sola masa tumoral).

La etapa de irradiación de luz para activar el agente fotosensibilizante puede tener lugar de acuerdo con técnicas y procedimientos bien conocidos en la técnica. La longitud de onda de la luz a utilizar es 640-665 nm, preferiblemente 652 nm. Las fuentes de luz artificial adecuadas son bien conocidas en la técnica. Convenientemente, la iluminación (irradiación) la proporciona el láser de diodo del sistema láser PCI Biotech AS 652nm, aunque se puede utilizar cualquier fuente de luz roja adecuada.

Se utiliza una fibra óptica para proporcionar la luz que se coloca dentro de los 3 cm del CCA. Como se denomina en el presente documento, una "fibra óptica" es una fibra delgada, flexible y transparente a través de la cual se puede transmitir luz en el extremo distal. Preferiblemente, la luz se difunde para esparcir la luz uniformemente a través de una superficie, minimizando o eliminando los puntos brillantes de alta intensidad. Pueden usarse varias puntas en el extremo de la fibra óptica, por ejemplo, un distribuidor frontal o punta de microlente o un difusor esférico. Como alternativa, se puede usar un catéter de globo para dispersar la luz (por ejemplo, el catéter de globo de difusión de Medlight). En otra alternativa, la fibra puede estar sin adornos, por ejemplo se puede usar una punta desnuda. Preferiblemente, la luz se transmite a través de un difusor cilíndrico en el que el extremo distal de la fibra es una punta de iluminación que distribuye uniformemente la luz transmitida a lo largo de su longitud.

La fibra puede estar hecha de vidrio o plástico y tiene un diámetro de núcleo que es al menos el diámetro del canal de salida del láser, preferiblemente de 200 a 800 |im (por ejemplo, 400-600, por ejemplo, 500 |im) o un diámetro de 400 hasta 1200 |im (por ejemplo, 900 a 1000 |im) incluido cualquier recubrimiento. Se pueden utilizar fibras con longitudes de difusor de 10 a 70 mm, preferiblemente de 20 a 40 mm. Puede usarse más de una fibra óptica para tumores grandes o múltiples tumores discretos dentro de un paciente, por ejemplo, 2 o más, por ejemplo, 3, 4, 5, 6 o más, por ejemplo, menos de 10. Como alternativa, se puede usar una única fibra óptica que se puede mover a diferentes ubicaciones, o mantener en la misma ubicación, para múltiples rondas de iluminación (irradiación).

De acuerdo con la invención, la fibra (o al menos una o cada fibra) se coloca dentro de los 3 cm del CCA. Esta medida se refiere a la distancia entre la superficie exterior de la fibra y la parte más cercana del CCA. Preferiblemente, la fibra se coloca lo más cerca posible del CCA, por ejemplo, dentro de 1 o 2 cm del CCA o dentro del CCA. Convenientemente, la fibra se coloca en el conducto biliar (por ejemplo, a través de un catéter).

La fibra óptica se puede proporcionar mediante un catéter, por ejemplo, en forma de un catéter basado en fibra óptica que puede acoplarse con una fuente de láser (es decir, de manera que la fibra óptica esté dentro del catéter durante el tratamiento y la irradiación de luz de la fibra se produzca a través de la pared del catéter). La fibra óptica guía la luz desde el extremo proximal del dispositivo al distal. El extremo distal tiene preferiblemente una punta de iluminación ("difusor") que puede distribuir uniformemente la luz transmitida por la fibra óptica a lo largo de su longitud. El catéter permite la liberación endoscópica de la luz. Preferiblemente se usa un difusor de luz. Convenientemente, se pueden usar difusores de luz cilíndricos Medlight SA (Suiza), por ejemplo, el difusor de luz cilíndrico Modelo RD con marcadores radiopacos.

El tiempo durante el cual las células del paciente se exponen a la luz en los métodos de la presente invención puede variar para lograr la dosis de luz requerida. El tiempo puede seleccionarse de acuerdo con varios factores que incluyen la dosis del agente fotosensibilizante y gemcitabina y la tasa de fluencia de la luz que se va a usar y la proximidad de la fibra óptica al tumor.

La dosis de luz total para las células tumorales puede expresarse en J/cm de la fibra (o tumor) y se calcula como la tasa de fluencia (W/cm de la fibra o tumor) x tiempo de tratamiento.

Dependiendo de la tasa de fluencia de la fuente de luz a usar, para lograr la dosis de luz deseada, puede seleccionarse en consecuencia el tiempo de irradiación. Por ejemplo, para lograr una dosis de luz de 10 o 30 J/cm (o 15 o 30 J/cm) con una velocidad de fluencia de 100 mW/cm, se puede usar un tiempo de irradiación de 2,5 minutos o 5 minutos, respectivamente. Por tanto, con una velocidad de fluencia de 100 mW/cm para lograr una dosis de luz de 10 a 60 J/cm (o 15 a 60 J/cm), se puede usar un tiempo de irradiación de 2,5 a 10 minutos. Una tasa de fluencia mayor o menor permite utilizar un tiempo de irradiación menor o mayor, respectivamente. Preferiblemente, teniendo en cuenta lo anterior, el tiempo de irradiación es de 1 minuto a 20 minutos, por ejemplo 2 a 10 minutos, dependiendo de la tasa de fluencia de la fuente de luz. Estos tiempos se refieren a cada tiempo de irradiación cuando se utilizan múltiples rondas de iluminación (irradiación).

Una persona experta en la técnica puede seleccionar dosis de luz apropiadas y de nuevo dependerá de los factores indicados anteriormente. En particular, dosis o concentraciones más altas del agente fotosensibilizante (TPCS2a) permiten usar una dosis de luz más baja. En la presente invención se ha descubierto que la luz a una dosis de 10 a 60 J por cm (o de 15 a 60 J por cm) de la fibra óptica (difusor) o tumor es particularmente ventajosa. En la unidad "J por cm", el cm es la longitud de la fibra óptica si se emite luz sobre una longitud de la fibra (por ejemplo, cuando se usa un difusor). Como alternativa, esto puede ser cm de tumor, por ejemplo, cuando se utiliza una fuente de luz puntual. En ambos casos, J/cm se refiere a la dosis de luz proporcionada por cm al entorno local. Convenientemente, la dosis de luz se logra utilizando un difusor de luz con una fluencia de 100 mW por cm de fibra (por ejemplo, un difusor) y, por lo tanto, un tiempo de irradiación de 2,5 a 10 minutos. Preferiblemente una dosis de 10 a 45 (o 15 a 45), por ejemplo, se utilizan de 20 a 40 o de 25 a 35 J/cm.

Además, si se quiere mantener la viabilidad celular, se debe evitar la generación de niveles excesivos de especies tóxicas y los parámetros relevantes se pueden ajustar en consecuencia.

Los métodos de la invención pueden inevitablemente dar lugar a algún daño celular en virtud del tratamiento fotoquímico, es decir, por los efectos de la terapia fotodinámica a través de la generación de especies tóxicas sobre la activación del agente fotosensibilizante. Dado que la función del método de la invención es destruir las células tumorales, esta muerte celular puede no tener consecuencias y, de hecho, puede ser ventajosa. En algunas realizaciones, sin embargo, debe evitarse la muerte celular para asegurar que las moléculas citotóxicas sean absorbidas por las células para asegurar la muerte celular localizada y específica. Los métodos de la invención pueden modificarse de modo que la fracción o proporción de células supervivientes se regule seleccionando la dosis de luz en relación con la dosis (concentración) del agente fotosensibilizante. De nuevo, estas técnicas son conocidas en la técnica.

Preferiblemente, sustancialmente todas las células, o una mayoría significativa (por ejemplo, al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80, 85, 90 o 95% de las células) no son destruidas por el método de internalización fotoquímica solo (es decir, sin un agente citotóxico). La viabilidad celular in vitro después del tratamiento con PCI se puede medir mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como la prueba MTS. La muerte celular in vivo de uno o más tipos de células se puede evaluar dentro de un radio de 1 cm del punto de administración (o en una cierta profundidad de tejido), por ejemplo, mediante microscopía u otros medios apropiados. Como la muerte celular puede no ocurrir instantáneamente, el % de muerte celular se refiere al porcentaje de células que permanecen viables a las pocas horas de la irradiación (por ejemplo, hasta 4 horas después de la irradiación) pero preferiblemente se refiere al % de células viables 4 o más horas después de la irradiación.

En los métodos opcionales de la invención, 1-40 días después de la etapa (ii), es decir, después de administrar la gemcitabina y someter al paciente a irradiación, al paciente se le puede administrar sistémicamente gemcitabina y/u otro agente citotóxico. Preferiblemente, dicha administración se produce de 5 a 30 días, especialmente preferiblemente de 7 a 21 días después de la etapa (ii).

Cuando se administra gemcitabina, esta se puede administrar como se describe anteriormente para la gemcitabina administrada en la etapa ii) (es decir, en lo que respecta a la dosis, vía y duración de la administración).

El otro agente citotóxico puede ser cualquier agente tóxico que sea adecuado para tratar un cáncer, particularmente un colangiocarcinoma con efectos secundarios aceptables en el paciente (por ejemplo, fármacos de quimioterapia comúnmente usados). Dichos agentes incluyen fármacos alquilantes, antraciclinas y otros antibióticos citotóxicos (por ejemplo, bleomicina), una toxina proteica (por ejemplo, gelonina), antimetabolitos (sin incluir gemcitabina), alcaloides de la vinca y etopósido, inhibidores de la tirosina quinasa y otros fármacos antineoplásicos como compuestos de platino, por ejemplo, cisplatino.

El "cisplatino" es un fármaco anticanceroso que contiene platino con la estructura que se indica a continuación ((SP-4-2)-diaminadicloroplatino (II)).

El cisplatino está disponible en fuentes tales como Hospira (Cisplatino Hospira).

Se conocen en la técnica dosis apropiadas para los otros agentes citotóxicos. Si se usa cisplatino, convenientemente se usa a una dosis de 10-50 mg/m2, preferiblemente 20-30 mg/m2 La vía y la duración de la administración pueden ser las descritas anteriormente para la gemcitabina.

En la etapa iii) cuando se usa gemcitabina y al menos otro agente citotóxico, se pueden usar simultáneamente, por separado o secuencialmente. Cuando se usan simultáneamente, se administran al mismo tiempo, pero pueden administrarse por una vía única o por vías separadas (por ejemplo, una mezcla administrada por vía intravenosa o la administración de dos (o más) preparaciones al mismo tiempo, pero a través de diferentes puntos de entrada intravenosa). Cuando se administran por separado, pueden administrarse al mismo tiempo o secuencialmente y/o pueden solaparse en su tiempo de administración. Cuando se usa secuencialmente, el tiempo de separación entre la administración de los diferentes agentes no es más de 24 horas. Convenientemente, se administran juntos en una sola mezcla.

En las características preferidas de la invención, la gemcitabina y/u otro agente citotóxico usado en la etapa iii) se administra más de una vez, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces (por ejemplo, hasta 20 veces). Esta administración puede ser en un solo (o cada) ciclo o en total en múltiples ciclos.

Como se denomina en el presente documento, un "ciclo" es un período de tiempo durante el cual se aplica un régimen de tratamiento particular y generalmente se repite para proporcionar un tratamiento cíclico. El tratamiento en cada ciclo puede ser el mismo o diferente (por ejemplo, pueden usarse diferentes dosis, tiempos, etc.). Un ciclo puede tener una duración de 14 a 30 días, por ejemplo, un ciclo de 21 días. Pueden usarse múltiples ciclos, por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o 5 ciclos, por ejemplo, 6, 7, 8, 9 o 10 (por ejemplo, hasta 8, 9, 10 o 20) ciclos. Dentro de cada ciclo, la gemcitabina y/u otro agente citotóxico se pueden administrar una o más de una vez, como se describe anteriormente. En una característica preferida, la gemcitabina y/u otro agente citotóxico se administran dos veces en cada ciclo y preferiblemente se realizan al menos 3, preferiblemente al menos 5 ciclos.

Mientras que en una característica preferida se realiza el tratamiento de la etapa iii) anterior con gemcitabina y/u otro agente citotóxico, en otro aspecto de la invención dicho tratamiento no se realiza y en particular el tratamiento no incluye el uso de otro agente citotóxico como cisplatino.

Para un tratamiento eficaz, se puede repetir el método descrito en este documento, o una parte del mismo. Así, por ejemplo, las etapas i) y ii) pueden repetirse una o más veces, por ejemplo, 2 o 3 veces, por ejemplo después de un intervalo de 1 a 6 meses o más, por ejemplo, después de la etapa ii) o iii). En un aspecto preferido, el método completo se repite al menos dos veces, por ejemplo, 3 o 4 veces.

En un aspecto particularmente preferido, el método comprende la realización del método dos veces (es decir, la realización de las etapas i), ii), iii), i), ii) y iii)) o más, preferiblemente en las que en la primera y/o la segunda ronda (o posterior) de las etapas i) a iii), la etapa iii) se realiza al menos dos veces. Así, a modo de ejemplo, el método se puede realizar como sigue:

i) administrar sistémicamente TPCS2a a dicho paciente a una dosis de 0,05 a 0,5 mg/kg (o 0,1 a 0,5 mg/kg) y ii) después de 3-5 días, administrar de forma sistémica gemcitabina a una dosis de 500-1500 mg/m2 y 2-4 horas después de completar la administración de gemcitabina irradiar dicho colangiocarcinoma con luz con una longitud de onda de 640-665 nm utilizando una fibra óptica colocada a 3 cm de dicho colangiocarcinoma para proporcionar una dosis de luz de 10 a 60 J/cm (o de 15 a 60 J/cm);

iii) después de 1-40 días (preferiblemente después de 7-21 días) administrar sistémicamente gemcitabina y/u otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino;

iv) repetir la etapa iii) al menos una vez; y

v) repetir las etapas i) a iv) al menos una vez.

En un aspecto particularmente preferido, la etapa iii) se realiza en ciclos como se describe anteriormente, en particular se realizan múltiples ciclos de la etapa iii) (antes de comenzar con la etapa iv)) y en cada uno de estos ciclos la gemcitabina y/u otro agente citotóxico como el cisplatino se administra dos veces o más.

A modo de ejemplo, se puede realizar el método en el que la etapa iii) en la primera y la segunda ronda comprende 2, 3 o 4 ciclos de gemcitabina y cisplatino administrados una o dos veces, por ejemplo, en los días 1 y 8. Cuando las etapas i) y ii) se realizan después de la primera etapa iii) de la ronda y antes de la etapa iii) de la segunda ronda, puede incidir en el primer ciclo en la etapa iii) de la segunda ronda, por ejemplo, la administración e irradiación de gemcitabina pueden reemplazar la primera administración de gemcitabina y cisplatino en el primer ciclo. En una opción, el paciente no se somete a ningún tratamiento durante un período de entre 1 semana y 4 semanas después de la primera ronda (de las etapas i), ii) y iii)) antes de comenzar la segunda ronda. En ese caso, el tratamiento se reanuda con las etapas i) y ii) como se indicó anteriormente, seguido de la etapa iii). Los tiempos preferidos del tratamiento y/o las dosis a usar son los descritos en los Ejemplos.

Antes del tratamiento, el paciente que se va a tratar puede someterse a una endoprótesis biliar para asegurar un drenaje biliar adecuado. La prótesis, que puede ser de plástico o metal, se coloca en el conducto biliar usando procedimientos conocidos en la técnica. Este último puede mantenerse en su lugar durante la iluminación, mientras que el primero se retira durante la iluminación y se inserta una nueva prótesis después de ese procedimiento.

La presente invención también proporciona un kit que comprende gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico como se define aquí anteriormente, para uso simultáneo, separado o secuencial para tratar un colangiocarcinoma en un paciente, donde dicho uso es como se define aquí anteriormente.

Los aspectos preferidos de acuerdo con la invención son los expuestos en los ejemplos.

La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes con referencia a los siguientes dibujos en los que:

La Figura 1 muestra la citotoxicidad después de 72 horas de exposición a gemcitabina. La viabilidad de las líneas celulares TFK-1 (A) y EGI-1 (B) se analizaron mediante el ensayo MTT después de 72 horas de incubación con gemcitabina como se describe en Materiales y métodos en el Ejemplo 1. Cada punto de datos representa la media (+/- desviación estándar) de tres experimentos.

La Figura 2 muestra PCI con gemcitabina 100 nM en la línea celular TFK-1. El experimento se realizó con una dosis de gemcitabina de 100 nM como se describe en Materiales y métodos en el Ejemplo 1. Los puntos de datos son valores medios de 3 mediciones paralelas (+/- desviación estándar) y representan un representante de 3 experimentos independientes. PDT en la figura significa "PCI solo".

La Figura 3 muestra PCI con gemcitabina 100 nM en la línea celular EGI-1. El experimento se realizó con una dosis de gemcitabina de 100 nM como se describe en Materiales y métodos en el Ejemplo 1. Los puntos de datos son valores medios de 3 mediciones paralelas (+/- desviación estándar) y representan un representante de 3 experimentos independientes. PDT en la figura significa "PCI solo".

La Figura 4 muestra la capacidad de formación de colonias de las células TFK-1 después del tratamiento con PCI con diferentes dosis de gemcitabina. El experimento se realizó como se describe en Materiales y Métodos en el Ejemplo 1 con diferentes dosis de gemcitabina (indicadas en la figura) y un tiempo de iluminación de 140 s. Se realizaron tres experimentos independientes con resultados esencialmente similares.

La Figura 5 muestra los resultados de un estudio en animales sobre el efecto de PCI con 200 mg/kg de gemcitabina. A los animales con células tumorales de cáncer de pulmón humano NCI-H460 en crecimiento subcutáneo se les administró 5 mg/kg de Amphinex® (TPCS2a) mediante inyección intravenosa. 3 días después, se administró a los animales 200 mg/kg de gemcitabina y los tumores se iluminaron 4 h después. El tamaño de los tumores se midió 2-3 veces por semana. Los resultados muestran que ni el tratamiento fotoquímico solo (PCI solo) ni la gemcitabina sola tuvieron un efecto significativo sobre el crecimiento tumoral en comparación con un grupo de control con tumores no tratados (No tratados). Por el contrario, la combinación de PCI y gemcitabina redujo sustancialmente el crecimiento tumoral, lo que indica que la PCI puede mejorar significativamente el efecto de la gemcitabina.

La Figura 6 muestra los resultados de un estudio en animales sobre el efecto de PCI con 400 mg/kg de gemcitabina. El método se realizó como se describe anteriormente para la Figura 5, excepto que se utilizaron 400 mg/kg de gemcitabina. Los resultados muestran que ni el tratamiento fotoquímico solo (PCI solo) ni la gemcitabina sola (Gemcitabina 400 mg/kg) tuvieron un efecto significativo sobre el crecimiento tumoral en comparación con un grupo de control con tumores no tratados (No tratados). Por el contrario, la combinación de PCI y gemcitabina redujo sustancialmente el crecimiento tumoral, lo que indica que la PCI puede mejorar significativamente el efecto de la gemcitabina.

La Figura 7 muestra el porcentaje de pacientes que mostraron una respuesta positiva al tratamiento a los 6 meses, es decir, aquellos con una respuesta parcial (PR) o una respuesta completa (RC). Pacientes sometidos a tratamiento con pCi (fase 1 de PCI: cohortes 3 y 4) en comparación con los tratados con un tratamiento de quimioterapia estándar sin PCI (ABC02).

La Figura 8 muestra la respuesta de los pacientes con colangiocarcinoma de las cohortes 3 y 4 en términos del estado de la suma de todas las lesiones diana (medibles) después del tratamiento con PCI.

La Figura 9 muestra la respuesta de los pacientes con colangiocarcinoma de las cohortes 3 y 4 en términos del estado de las lesiones diana tratadas anticipadas (medibles) después del tratamiento con PCI.

La Figura 10 muestra la reducción global del tamaño del tumor diana en todos los pacientes con colangiocarcinoma evaluables radiológicamente de todas las cohortes.

Ejemplo 1: Evaluación in vitro de PCI con gemcitabina en células de colangiocarcinoma

Materiales y métodos

Líneas celulares y medios de crecimiento

Las líneas celulares utilizadas fueron TFK-1 y EGI-1, ambas se obtuvieron del Departamento de Prevención del Cáncer, The Norwegian Radium Hospital, Oslo, Noruega. TFK-1 es una línea celular de adenocarcinoma del conducto biliar papilar humano y EGI-1 es una línea celular de adenocarcinoma del conducto biliar humano poco diferenciada. Ambas líneas celulares se originan a partir de tumores extrahepáticos (Saijyo et al., 1995, Tohoku J. Exp. Med., 177: 61-71; EGI-1 - Cell LINCS Library of Intergrated network-based Cellular Signatures. Disponible en: http://lincs.hms.harvard.edu/db/cells/50181/.), pero son bastante diferentes tanto morfológica como fisiológicamente (Xu et al., 2013, Clinical Cancer Research, 1 de enero; 19 (1): 118-27; Pignochino y col., 2010, BMC Cancer, 10: 631).

Las células se hicieron crecer como cultivos de monocapa en matraces de cultivo de tejidos de 75 cm2 (NUNC, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) a 37°C con 5% (v/v) de CO2. La línea celular TFK-1 se cultivó en medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) Con L-glutamina, suero de ternero fetal al 10% (FCS) (PAA Laboratories, Pasching, Austria), 100 U/ml de penicilina y 100 |ig/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich). La línea celular EGI-1 se cultivó en medio DMEM (Sigma-Aldrich) con L-glutamina, FCS al 10%, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 |ig/ml.

Fotosensibilizador TPCS2a

El meso-tetrafenil cloro disulfonato de di(monoetanolamonio) (TPCS2a/Amphinex®) fue proporcionado por PCI Biotech AS (Lysaker, Noruega). Número de lote de Amphinex: FAMP 1002. La solución madre de TPCS2a (en polisorbato 80 al 3%, manitol al 2,8%, Tris 50 mM pH 8,5) (0,4 mg/ml) se mantuvo a 4°C en alícuotas y se protegió de la luz. Todo el trabajo con el fotosensibilizador se realizó bajo luz tenue.

Fuente de luz

La iluminación de las células se realizó utilizando Lumisource (PCI Biotech, Oslo). Esta lámpara consta de cuatro tubos de luz estándar (18 W/tubo, Osram L 18/67), que emiten luz azul con un pico principal a aproximadamente 435 nm y se utilizó para la excitación de TPCS2a. La radiación emitida por la fuente de luz azul fue de 12 mW/cm2 y varió menos del 10% a lo largo del área de iluminación (765 cm2). La fuente de luz se enfrió por aire durante la exposición a la luz para mantener estable la radiación y evitar que las células sufran hipertermia.

Citotoxicidad de gemcitabina sin PCI

Las células se incubaron con diferentes concentraciones de gemcitabina (1-1000 nM) durante 72 horas y la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT (ver más abajo) como se describe anteriormente para estas líneas celulares (Pignochino et al., 2010, supra ; Lieke et al., 2012, BioMed Central, 12: 1471-2407).

PCI con gemcitabina

Las células se sembraron en placas de 96 o 6 pocillos (Nunclon, Nunc, Roskilde, Dinamarca) y se dejaron unir a 37°C durante la noche. Se añadió gemcitabina a las células y se incubó durante 54 horas antes de la adición de 0,4 mg/ml de TPCS2a. Después de 18 h de incubación adicional, las células se lavaron en medio sin TPCS2a, se resuspendieron en medio sin TPCS2a con gemcitabina y se incubaron durante 4 h. Las células se iluminaron, lavaron y resuspendieron en medio sin fármaco, y se evaluó la viabilidad celular mediante el ensayo MTT 48 horas después de la iluminación, o mediante el ensayo de formación de colonias 6 días después de la iluminación (véase más adelante).

Ensayo de viabilidad celular MTT

El método MTT (reducción de colorante de tetrazolio) se realizó 48 h después de la exposición a la luz con Lumisource. Se retiró el medio de cultivo y las células se incubaron en un medio que contenía 0,25 mg/ml de MTT (Sigma) durante aproximadamente 3 horas antes de reemplazarlas con 100 |il de dimetilsulfóxido al 99% (Sigma). Las placas de 96 pocillos se colocaron en un agitador durante 5 minutos antes de medir la absorbancia a 570 nm con una onda de potencia XS2 (Biotek, VT, EE. UU.). Los pocillos sin células incubados con medio MTT solo se utilizaron para la resta del blanco.

Ensayo de formación de colonias

Las células (25 000 células/pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos (Nunc) y se dejaron adherir durante la noche y se sometieron al tratamiento fotoquímico descrito anteriormente. Las células se colocaron en la incubadora y el medio de cultivo se reemplazó con medio de cultivo fresco después de 3 días de incubación. Las colonias se lavaron una vez con 0,9% mg/ml de NaCl, se fijaron en etanol al 96% durante 10 min y se tiñeron con una solución saturada de azul de metileno (Sigma) durante 10 min. Posteriormente, las células se lavaron en H2O y luego se secaron antes de ser evaluadas por inspección visual.

Resultados y discusión

Citotoxicidad de gemcitabina en las líneas celulares TFK-1 y EGI-1

En experimentos iniciales se investigó la citotoxicidad con un tiempo de incubación de gemcitabina de 4 horas, ya que con varios otros fármacos este es un tiempo de incubación adecuado en experimentos de PCI. Sin embargo, los resultados mostraron que con 4 horas de exposición incluso a dosis muy altas (se probó hasta 1 mM), la gemcitabina solo tuvo un efecto citotóxico muy modesto en estas líneas celulares (datos no mostrados). Por lo tanto, se decidió aumentar el tiempo de exposición a gemcitabina a 72 horas, que se ha utilizado antes para estas líneas celulares (Pignochino et al., 2010, supra; Lieke et al., 2012, supra).

La citotoxicidad de gemcitabina en concentraciones de hasta 3 mM con 72 horas de exposición se muestra en la Figura 1. Se puede ver que incluso con 72 horas de incubación, la citotoxicidad de gemcitabina fue bastante modesta, alcanzando aproximadamente un 50% de citotoxicidad a 3 mM de gemcitabina para la línea celular TFK-1, mientras que la línea celular EGI-1 fue insensible a la gemcitabina incluso a la dosis más alta empleada en este experimento. Se decidió utilizar una concentración de gemcitabina de 100 nM en los experimentos de PCI, ya que a esta dosis la citotoxicidad de gemcitabina sola era como mucho modesta y no oscurecería los efectos del tratamiento de PCI.

PCI con gemcitabina con el ensayo de citotoxicidad MTT

El experimento se realizó con una dosis de gemcitabina de 100 nM como se describe en Materiales y métodos. En la Figura 2 puede verse que en la línea celular TFK-1, PCI aumentó significativamente el efecto citotóxico de gemcitabina. Por tanto, mientras que la gemcitabina sola dio un efecto citotóxico de aproximadamente el 50% (de acuerdo con los resultados mostrados en la Figura 1), la combinación con PCI aumentó fuertemente la citotoxicidad de una manera dependiente de la dosis de luz. El tratamiento fotoquímico solo (TFD en la Figura 2) tuvo sólo un efecto modesto sobre la supervivencia celular, lo que indica que PCI aumenta sinérgicamente la citotoxicidad de gemcitabina.

La misma conclusión podría extraerse de los experimentos con la línea celular EGI-1 (Figura 3). En esta línea celular, la gemcitabina sola no tuvo ningún efecto sobre la supervivencia celular (de nuevo de acuerdo con los resultados de la Figura 1). Sin embargo, con PCI se logró un efecto citotóxico muy fuerte (99% de muerte celular) mientras que el tratamiento fotoquímico solo (PCI solo) a la dosis de luz más alta mató solo alrededor del 50% de las células. En esta línea celular con PCI también se logró un efecto citotóxico muy bueno en condiciones en las que ni la gemcitabina ni la PCI sola (PDT en la figura) tuvieron ningún efecto citotóxico (por ejemplo, Iluminación de 120 s en la Figura 3), mostrando claramente el efecto sinérgico de PCI con gemcitabina. También vale la pena señalar que con PCI> 90% se podría lograr la muerte celular con una dosis de gemcitabina de 100 nM, mientras que sin PCI este nivel de muerte celular no se obtuvo ni siquiera con una dosis 30 veces mayor (dosis de 3000 nM en la Figura 1B). Efecto de PCI sobre la capacidad de formación de colonias de la línea celular TFK-1

Se trataron células TFK-1 con PCI y se evaluó la viabilidad celular mediante el ensayo de formación de colonias como se describe en Materiales y métodos. Los experimentos iniciales mostraron que la gemcitabina sola tiene un efecto sustancialmente más fuerte sobre la capacidad de formación de colonias que sobre la viabilidad según lo evaluado por el ensayo MTT (ver también la Figura 4). En este experimento, por lo tanto, fue necesario utilizar también dosis más bajas de gemcitabina. En la Figura 4 se puede ver que después de los tratamientos con dosis de gemcitabina de 330 y 100 nM, el TFK-1 no pudo formar colonias, a 33 nM se pudo observar cierta formación de colonias, mientras que a 10 nM se observó una formación sustancial de colonias, aunque todavía menos de lo observado en muestras no tratadas. Con gemcitabina 10 nM PCI no se observó formación de colonias, mientras que en las muestras tratadas con PCI solo, las células todavía tenían la capacidad de formar colonias. Esto indica claramente que la PCI mejora el efecto de la gemcitabina también sobre la capacidad de las células para formar colonias, algo que, por supuesto, es muy importante para su uso en el tratamiento del cáncer, ya que es una medida de la capacidad de las células para seguir creciendo después del tratamiento.

Conclusión

Los resultados muestran que la internalización fotoquímica puede mejorar significativamente el efecto de la gemcitabina en dos líneas celulares de colangiocarcinoma diferentes que son bastante resistentes al efecto de la gemcitabina cuando se usan sin PCI.

Ejemplo 2: Evaluación in vivo (ratones) de PCI con gemcitabina para proporcionar un efecto anticancerígeno Este estudio se utilizó para evaluar la eficacia anticancerosa in vivo de la internalización fotoquímica (PCI) con el fotosensibilizador TPCS2a utilizado en combinación con el agente citotóxico gemcitabina.

Materiales

Sustancia de prueba 1: Amphinex (TPCS2a) (número de lote FAMP 1002, PCI Biotech AS) Sustancia de prueba 2: Gemcitabine (Sigma-Aldrich)

Vehículo para Amphinex: Tween-80 al 3%; 2,8% de manitol; Tris 50 mM pH 8,5

Vehículo para gemcitabina: NaCl al 0,9%

Ratones, vía de administración y niveles de dosis

Se usaron ratones atímicos desnudos (nu/nu) (hembras, cepa CD-1 nu/nu, de al menos 6 semanas de edad) que se han usado ampliamente para generar xenoinjertos de tumores humanos y siguen siendo el método experimental de elección para probar la eficacia antitumoral de nuevos compuestos antes de su administración en el hombre. La vía de administración de las sustancias de ensayo fue intravenosa. La dosis de Amphinex® fue de 5 mg/kg, basada en estudios anteriores en ratones realizados por PCI Biotech AS y colaboradores.

Métodos

Se formuló Amphinex® para dosificación diluyéndolo en Tween-80 al 3%; 2,8% de manitol; Tris 50 mM pH 8,5 para proporcionar una solución de dosificación de 1,25 mg/ml.

Se formuló gemcitabina para dosificación disolviéndola en NaCl al 0,9% para dar soluciones de dosificación de 20 y 40 mg/ml.

Las soluciones se prepararon frescas el día de la dosificación y se protegieron de la luz.

Hubo 6 grupos de tratamiento con 10 ratones por grupo. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea 7 x 107 células/ml de células tumorales NCI-H460 para permitir la selección de tumores óptimos para su inclusión en el estudio. Se asignaron tumores del tamaño apropiado a los diversos grupos de tratamiento.

A cada grupo se le asignó un número (1 a 6). Los grupos de tratamiento fueron los siguientes:

Grupo 1 Gemcitabina; 200 mg/kg

Grupo 2 Amphinex® Gemcitabina tratamiento con láser; 5 mg/kg 200 mg/kg

Grupo 3 Grupo de vehículo Amphinex® tratamiento con láser; 5 mg/kg

Grupo 4 Grupo de vehículo sin tratamiento con láser;

Grupo 5 Gemcitabina; n = 10; 400 mg/kg

Grupo 6 Amphinex® Gemcitabina tratamiento con láser; 5 mg/kg 400 mg/kg

Se administró Amphinex® por vía intravenosa a través de una vena de la cola, usando un volumen de dosis de 4 ml/kg.

La vía de administración de gemcitabina fue intravenosa a un volumen de dosis de 10 ml/kg.

El grupo de vehículo era NaCl al 0,9% y se dosificó mediante inyección intravenosa a un volumen de dosis de 10 ml/kg.

Aproximadamente 4 h después de la administración de gemcitabina o vehículo, se iluminaron los tumores de los animales de los Grupos 2, 3 y 6 con un láser de diodo de 650 nm (véase más adelante).

Procedimiento

Células de cáncer de pulmón de células no pequeñas NCI-H460 humanas (American Type Culture Collection [ATCC], Maryland, EE. UU., o la colección europea de cultivos celulares [ECACC], Porton Down, Reino Unido) se recogieron de cultivos subconfluentes que crecieron in vitro y se determinó el número de células viables. A continuación, las células se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril a una concentración de aproximadamente 7 x 107 células/ml. Se inyectaron subcutáneamente ratones atímicos desnudos (nu/nu) en el flanco derecho con aproximadamente 7 x 106 células NCl-H460 en un volumen de 0,1 ml. Los animales se examinaron regularmente para detectar la aparición de tumores. Cuando se establecieron tumores medibles en la mayoría de los ratones, los animales se asignaron a 6 grupos de tratamiento con un objetivo de hasta 10 ratones por grupo. Los ratones recibieron una inyección intravenosa de Amphinex cuando los tumores habían alcanzado un tamaño tal que el volumen del tumor estaba aproximadamente en el rango de 100 a 150 mm372 horas después. En este momento, los animales recibieron una dosis de gemcitabina y los tumores se iluminaron aproximadamente 4 horas después.

Para la iluminación del tumor, cada animal fue inmovilizado, uno a la vez, en una restricción de metal que permite exponer solo el área del flanco inferior, es decir, el área del tumor más un área circundante de 2 mm de diámetro. A continuación, se utilizó un láser de diodo de 650 nm (láser de diodo TWI, Quanta System, Italia) para exponer el tejido tumoral a una dosis de luz de 15 J/cm2, con una velocidad de fluencia de 90 mW/cm2 Cada animal tuvo su tumor expuesto al láser durante aproximadamente 167 s, para dar la dosis requerida de 15 J/cm2.

Si los tamaños de los tumores variaban en grandes cantidades, entonces la tasa de fluencia en la superficie del animal se ajustaba a 90 mW/cm2, para dar la dosis y el tiempo de iluminación correctos para cada animal. Por ejemplo, para una dosis de luz de 15 J/cm2, se requiere una salida de fibra de 120 mW para cubrir un diámetro de iluminación de 1,3 cm (un diámetro tumoral promedio aproximado), el tiempo de iluminación es de 167 s y la distancia de la fibra al tumor debe medir 2,1 cm.

El tamaño del tumor se midió al menos dos veces por semana usando calibradores digitales durante hasta 4 semanas después de la iluminación o hasta que el tamaño del tumor (como se especifica en el UK Home Office Licence) u otros signos clínicos requirieron la eliminación de ese ratón del estudio. Se registraron las dimensiones del tumor (largo y ancho) y se calcularon los volúmenes del tumor usando la fórmula (W2 x L)/2, donde W es la dimensión tumoral más ancha y L es la más larga. Los animales se sacrificaron si el tamaño del tumor se había vuelto excesivo o si se observaba algún efecto adverso.

Análisis de los datos

Las dimensiones del tumor medidas durante el período del estudio - longitud (L, largo) y ancho (W, corto) en mm, se registraron y se mantuvieron como datos brutos. Se informaron los volúmenes tumorales medios el primer día de tratamiento para cada grupo. Se realizaron cálculos de volúmenes tumorales relativos y gráficos de curvas de crecimiento tumoral medio. También se obtuvieron datos de peso corporal.

Resultados y discusión

Los resultados del estudio mostraron que la tecnología PCI puede mejorar significativamente el efecto de la gemcitabina in vivo (Figura 5). Se puede ver que el tratamiento con Gemcitabina pura no tuvo (Figura 5, 200 mg/kg de gemcitabina) o solo tuvo un efecto muy modesto (Figura 6, 400 mg/kg de gemcitabina) sobre el crecimiento del tumor en comparación con un grupo de control no tratado. También se observó que el tratamiento fotoquímico solo (PCI solo, es decir, Amphinex® y aplicación de luz láser sin gemcitabina) tampoco tuvo prácticamente ningún efecto. Sin embargo, la combinación de gemcitabina e PCI provocó un retraso sustancial en el crecimiento tumoral con ambas dosis de gemcitabina, lo que indujo un claro efecto sinérgico.

Los pesos corporales de los animales en el estudio se muestran en la Tabla 1. Todos los grupos experimentales incluyeron 10 animales al inicio del estudio, pero durante el estudio algunos animales tuvieron que ser sacrificados, principalmente debido al crecimiento excesivo del tumor experimental. El número de animales que tuvieron que sacrificarse fue mayor en los grupos de control (es decir, grupos "sin tratar" y "PCI solo") y menor en los grupos que recibieron PCI con gemcitabina, ya que el último tratamiento indujo un retraso significativo en el crecimiento tumoral. Se puede observar que en todos los grupos experimentales los animales habían ganado, en promedio, peso al final del estudio. Aparentemente, el aumento de peso fue mayor en el grupo de control "PCI solo", que tenía el peso corporal promedio más bajo al comienzo del estudio. Entre los otros grupos, el aumento de peso fue bastante similar. En algunos de los grupos se observó una ligera reducción del peso corporal (máximo 7%) en el primer período después del momento de iluminación. Esta reducción fue más pronunciada en los grupos que recibieron PCI con tratamiento con gemcitabina, pero también se observó una posible reducción de peso de corta duración en algunos de los otros grupos. Estos datos sugieren que no hay un empeoramiento obvio o irreversible de la toxicidad general de la gemcitabina por Amphinex o el tratamiento PCI.

T l 1: P ^ r r l l nim l r n P I n m i in .

Se trasplantaron subcutáneamente ratones CD-1 atímicos hembras desnudas (nu/nu) con células de cáncer de pulmón humano NCI-H460. Cuando los tumores habían alcanzado un volumen de aproximadamente 100 mm3, se administró a los ratones TPCS2a (5 mg/kg) mediante inyección intravenosa (i.v.). 4 días después, se administró gemcitabina (dosis especificadas en la tabla) por vía i.v. inyección, y 4 h después los tumores se iluminaron con luz de 650 nm a una dosis de 15 J/cm2 El tamaño del tumor y el peso corporal de los animales se registraron en diferentes momentos después de la iluminación (día 0 = día de iluminación). Los grupos de tratamiento se indican en la tabla; la fila superior para cada grupo de tratamiento es el peso corporal promedio en porcentaje del peso en el día 0; la fila inferior son los pesos corporales medidos (en gramos) ± desviación estándar.

Conclusión

Los resultados muestran que PCI con el fotosensibilizador Amphinex puede mejorar significativamente el efecto antitumoral de gemcitabina en el modelo de cáncer de pulmón NCI-H460 en ratones desnudos.

Ejemplo 3: Evaluación in vivo (humanos) de PCI con gemcitabina en el tratamiento del colangiocarcinoma

El estudio fue un estudio de escalada de dosis de fase I/II para evaluar la seguridad, tolerabilidad y eficacia de la internalización fotoquímica (PCI) de gemcitabina inducida por Amphinex® seguida de quimioterapia con gemcitabina/cisplatino en pacientes con colangiocarcinomas inoperables avanzados.

Población de estudio:

Pacientes hombres y mujeres con colangiocarcinoma inoperable, localmente avanzado o metastásico diagnosticado histológicamente o citológicamente que no habían recibido quimioterapia previa.

Fármaco:

Amphinex 30 mg/ml: 30 mg/ml del principio activo TPCS2a.2MEA (TPCS2a.2 (monoetanolamina)) (26 mg/ml de la porción activa TPCS2a) Excipientes: TPCS2a.2MEA está formulado en Tween al 3,0% Tampón Tris 80, 50 mM, pH 8.5 y manitol al 2,8%

Tratamiento:

Colocación de prótesis:

A todos los pacientes se les colocó una prótesis biliar antes del tratamiento con PCI, para asegurar un drenaje biliar adecuado.

Un parámetro de exclusión clave que refleja esto es la 'bilirrubina sérica (total)', que podría ser hasta un máximo de 1.5 x el límite superior de normalidad (LSN) para el hospital.

Las prótesis pueden ser de plástico o de metal. Si se colocó una prótesis de plástico: esta/estas se quitaron durante el procedimiento de CPRE antes de la iluminación láser (día 4) y se colocaron nuevas prótesis justo después del procedimiento de iluminación. Si se utilizaron prótesis metálicas: estos se mantuvieron en su lugar en el conducto biliar también durante la iluminación láser.

Tratamiento PCI

Día 0: Una dosis única de Amphinex® (fimaporfina) administrada sistémicamente mediante inyección intravenosa (aumento de la dosis - ver más adelante) en un volumen de menos de un ml que se lavó abundantemente con NaCl al 0,9%.

Día 4: Una dosis única de gemcitabina, 1000 mg/m2, reconstituida y diluida con cloruro de sodio al 0,9% de acuerdo con la ficha técnica/Información de prescripción, administrada por infusión intravenosa durante 30 minutos.

Día 4 - Aplicación de luz láser: realizada dentro de una ventana de tiempo de 3 horas (61 horas) después del inicio de la administración de gemcitabina. La aplicación de luz láser se realizó utilizando el láser de luz roja PCI 652 nm con marcado CE, radiación de 100 mW/cm (es decir, 100 mW por cm de longitud del difusor de la fibra óptica) para lograr la dosis de luz indicada (por ejemplo, en la cohorte 1, los pacientes fueron sometidos a 150 pulsos de iluminación para lograr una dosis de 15J/cm y la cohorte 2-4 pacientes fueron sometidos a 300 pulsos de iluminación para lograr una dosis de 30 J/cm, pero algunos pacientes con tumores más grandes o más requirieron iluminaciones adicionales). (Escalada de dosis - ver más abajo)

Fibra óptica: Difusor de luz cilíndrico Modelo RD, con longitudes de difusor activo de 2, 3 o 4 cm. Proveedor: Medlight SA, Suiza (http://www.medlight.com/). Si hubiera más de un tumor, o el tumor fuera más grande que la punta difusora activa de la fibra, podrían producirse iluminaciones adicionales para cubrir la totalidad o todos los tumores.

Catéter para la colocación de la fibra óptica (la fibra óptica se empujó en este catéter, por lo que la punta difusora distal activa de la fibra podría colocarse en el sitio o sitios del tumor: bajo guía fluoroscópica, el catéter de CPRE translúcido avanzó hacia el conducto biliar. Catéteres CPRE utilizados: catéter CPRE MTW, con punta metálica, longitud 215 cm, 0 = 2,3 > 1,8 mm, artículo n° 9901 3031 2, o catéter CPRE MTW 035 cánula cónica con punta metálica, longitud 215 cm, 0 = 1,8 mm Artículo n° 01 30 61 1. Suministrado por MTW Endoskopie, Alemania (http://nmg.kiev.ua/fites/Katalog%20MTW.pdf).

En un paciente de la cohorte 1 (paciente 2), se realizó un segundo tratamiento de PCI aproximadamente 9 meses después del primer tratamiento de PCI usando los mismos parámetros de dosis (Amphinex 0,06 mg/kg y una dosis de luz de 15 J/cm). El paciente 6 de la cohorte 2 también recibió un segundo tratamiento de PCI aproximadamente 17 meses después del primer tratamiento de PCI utilizando Amphinex a 0,25 mg/kg y una dosis de luz de 30 J/cm. Tratamiento de base (tratamiento estándar)

Comenzando entre 7 y 21 días después de la aplicación de luz láser, todos excepto 4 pacientes recibieron 8 ciclos de quimioterapia sistémica estándar: cisplatino (25 mg/m2) y gemcitabina (1000 mg/m2), administrados el día 1 y el día 8 de cada ciclo de 21 días.

En particular, las cohortes de pacientes recibieron los siguientes tratamientos de base:

Cohorte 1: 3 pacientes - 2 recibieron 8 ciclos; 1 recibió los ciclos 1 y 2 y la primera administración de quimioterapia (Día 1) del ciclo 3

Cohorte 2: 3 pacientes - los 3 recibieron 8 ciclos

Cohorte 3: 4 pacientes - 3 pacientes recibieron 8 ciclos; 1 recibió la primera administración de quimioterapia (Día 1) del ciclo 1

Cohorte 4: 6 pacientes - 4 pacientes recibieron 8 ciclos; 1 recibió 6 ciclos; 1 no recibió ningún ciclo Escalada de dosis - Fase I

Se exploraron las siguientes dosis de Amphinex y luz en un total de 16 pacientes. Una cohorte constaba de un mínimo de 3 pacientes (completando al menos el ciclo 1 de la quimioterapia de base, para la evaluación de seguridad necesaria para escalar al siguiente nivel de dosis).

Resultados - Seguridad:

No se observó toxicidad limitante de la dosis (TLD) y no hubo aumento aparente de reacciones adversas con dosis crecientes. Los eventos adversos más comunes fueron: reacciones leves de fotosensibilidad, dolor abdominal y colangitis.

Resultados - Eficacia:

Los pacientes fueron examinados por CT o MR al inicio del estudio, y aproximadamente 3 y 6 meses después del comienzo del ciclo 1 del tratamiento de quimioterapia estándar. Todas las imágenes fueron evaluadas por separado por dos expertos en RECIST (criterios de evaluación de respuesta en tumor sólido) y cáncer de vías biliares. La evaluación fue realizada a nivel local por expertos del hospital que tratan al paciente (lectura local) para las cohortes 1-4 o por los dos expertos radiológicos centrales independientes (lectura central) para las cohortes 3 y 4. Para la lectura central, en el caso de disputa entre los lectores, se utilizó un adjudicador para la evaluación.

Los niveles de dosis aplicados en las cohortes 1 a 3 estaban por debajo de lo que se esperaba que fuera efectivo (Sultan et al., 2016, Lancet Oncology 17: 1217-29).

Resultados a los 6 meses de las cohortes 3 y 4 (7 evaluables de 9 pacientes): 2 con enfermedad progresiva (PE -> 20% de crecimiento), 1 con enfermedad estable (EE), 2 con respuesta parcial (RP -> 30% encogimiento) y 2 con respuesta completa (RC - sin tumor visible) (vía lectura central). La tasa de respuesta objetiva (RP RC) fue superior al 50% (4/7 pacientes con carcinoma hiliar, sin tratamiento previo), que está muy por encima de lo esperado con el tratamiento estándar (combinación de gemcitabina y cisplatino (Valle et al, 2010, N. Engl. J. Med., 362: 1273­ 81), 13 pacientes con carcinoma hiliar, sin tratamiento previo) .

La evaluación de la respuesta a nivel de paciente de las cohortes 3 y 4 (lectura central) se muestra en la Figura 7 en comparación con el tratamiento de quimioterapia estándar (ABC02). La evaluación de la respuesta al nivel de la lesión diana de las cohortes 3 y 4, evaluando la suma de todas las lesiones diana (= medibles) identificadas por los dos expertos radiológicos centrales independientes (lectura central) se muestra en la Figura 8. Evaluación de la respuesta en la lesión diana nivel de las cohortes 3 y 4, en la Figura 9 se muestra la evaluación de las lesiones objetivo tratadas anticipadas (= medibles) identificadas por los dos expertos radiológicos centrales independientes (lectura central).

Los resultados muestran que más del 50% de los pacientes de las cohortes 3 y 4 (tratados con TPSC2a a 0,12 o 0,25 mg/kg y expuestos a una dosis de luz de 30 J/cm de fibra) presentaron una respuesta parcial o completa a tratamiento a los 6 meses, mientras que el tratamiento con quimioterapia estándar dio como resultado un tratamiento parcial de menos del 10% de los pacientes (1/13) (Figura 7). Además, casi el 90% de las lesiones diana seleccionadas mostraron encogimiento y más del 60% fueron indetectables a los 6 meses (Figura 8). Se observaron resultados similares al examinar las lesiones diana tratadas anticipadas (Figura 9). Se observará en la Figura 9 que se anticipó que solo se tratarían 14 tumores (es decir, en el área de iluminación). Sin embargo, como se indica en la Figura 8 al considerar todos los tumores, incluidos los que no se encuentran en el área de irradiación, de 19 tumores, 17 mostraron una respuesta. Esto indica que al menos 3 de los tumores fuera del área de iluminación respondieron al tratamiento, lo que sugiere que el efecto se extiende más allá del área de iluminación. Se considera posible que esto pueda resultar de la liberación de moléculas de los tumores irradiados que pueden estimular una respuesta inmune local que se dirige a los tumores fuera del sitio de irradiación. Estos resultados son de gran importancia para ofrecer tratamiento de colangiocarcinomas a pacientes donde anteriormente no se disponía de un tratamiento eficaz.

En la Figura 10 se muestra el efecto sobre el tamaño global del tumor diana para cada paciente evaluable radiológicamente de todas las cohortes. Para las cohortes 1 y 2 se muestran los resultados de lectura local. Para las cohortes 3 y 4 se muestran los resultados de la lectura central. Los pacientes 4 y 11 fueron excluidos porque no fueron evaluables por radiología, es decir, sus lesiones no pudieron medirse para permitir un cálculo de reducción tumoral. La Figura 10 muestra que aproximadamente el 90% de todos los pacientes mostraron una reducción en el tamaño del tumor.

En la Tabla 2 a continuación se muestra una descripción general de los pacientes examinados, sus resultados RECIST y su supervivencia global (SG). Las dos columnas para RECIST a los 6 meses muestran la lectura local (columna de la izquierda) y la lectura central (columna de la derecha). Cuatro pacientes permanecen vivos (pacientes 6, 12, 14 y 16). La supervivencia media hasta la fecha es de 16 meses (ver la columna final) y la supervivencia media es de 14,4 meses (no se muestran los datos). A la luz de los cuatro pacientes que siguen con vida, se espera que la supervivencia media aumente más allá de los 16 meses para los pacientes del estudio.

Ejemplo 4: Evaluación in vivo (humanos) de PCI con gemcitabina en el tratamiento del colangiocarcinoma (protocolo de tratamiento alternativo)

El estudio tiene como objetivo evaluar la eficacia de la intemalización fotoquímica (PCI) de gemcitabina inducida por Amphinex® seguida de quimioterapia con gemcitabina/cisplatino en pacientes con colangiocarcinomas inoperables avanzados usando una segunda ronda de tratamiento de PCI.

Población de estudio:

Pacientes hombres y mujeres con colangiocarcinoma inoperable, localmente avanzado o metastásico diagnosticado histológicamente o citológicamente que no habían recibido quimioterapia previa.

Fármaco:

Amphinex 30 mg/ml, como en el Ejemplo 3.

Tratamiento:

El tratamiento se realiza como en el Ejemplo 3 pero con el siguiente tiempo:

a) Primer tratamiento de PCI

Días 0 y 4: Tratamiento con Amphinex® (fimaporfina) y Gemcitabina, seguido de irradiación (2-4 horas después de completar la administración de gemcitabina) como se describe en el Ejemplo 3 para lograr una dosis de 30 J/cm. b) Quimioterapia sistémica estándar

Comenzando entre 7 o 21 días después de la aplicación de la luz láser, los pacientes reciben 4 ciclos de quimioterapia sistémica estándar: cisplatino (25 mg/m2) y gemcitabina (1000 mg/m2), administrados el día 1 y el día 8 de cada ciclo de 21 días, como se describe en el Ejemplo 3.

c) Segundo tratamiento PCI

El día 18 del cuarto ciclo y el día 1 del quinto ciclo de quimioterapia sistémica estándar, el tratamiento con PCI se repite como en los días 0 y 4 anteriores. El inicio del segundo tratamiento PCI (= día 18 del ciclo 4) y el inicio de la quimioterapia sistémica posterior pueden posponerse hasta 4 semanas, dependiendo del estado de salud del paciente.

d) Quimioterapia sistémica estándar

El ciclo 5 comienza el día después del día 21 del ciclo 4 (a menos que se retrase debido a la salud del paciente, como se indicó anteriormente). La quimioterapia sistémica se realiza como se establece en b) pero el día 8 solo en el ciclo 5. Se realizan tres ciclos adicionales como se establece en b) (es decir, el tratamiento en los días 8 y 21). La seguridad y la eficacia se evalúan como se describe en el Ejemplo 3.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino, para su uso en el tratamiento de un colangiocarcinoma en un paciente humano, en el que

i) dicho TPCS2a debe administrarse sistémicamente a dicho paciente a una dosis de 0,05 a 0,5 mg/kg; y ii) después de 3-5 días, dicha gemcitabina debe administrarse sistémicamente a dicho paciente a una dosis de 500-1500 mg/m2 y dicho colangiocarcinoma debe irradiarse con luz con una longitud de onda de 640-665nm utilizando una fibra óptica colocada dentro de los 3 cm de dicho colangiocarcinoma para proporcionar una dosis de luz de 10 a 60 J/cm; y opcionalmente

iii) después de 1-40 días (preferiblemente después de 7-21 días), gemcitabina y/u otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino, debe administrarse sistémicamente a dicho paciente.

2. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho TPCS2a debe administrarse a una dosis de 0,1 a 0,5 mg/kg o 0,05 a 0,3 mg/kg, preferiblemente de 0,2 a 0,3 mg/kg.

3. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicha gemcitabina en la etapa ii) debe administrarse a una dosis de 900-1100 mg/m2.

4. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que

i) dicha irradiación debe realizarse dentro de las 4 horas siguientes al inicio de la administración de gemcitabina; y/o

ii) la longitud de onda de dicha luz es 652 nm.

5. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha dosis de luz es de 15 a 60 J/cm o de 10 a 45 J/cm, preferiblemente de 25 a 35 J/cm.

6. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la etapa iii) se administrarán tanto gemcitabina como otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino.

7. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que en la etapa iii) la gemcitabina debe administrarse a una dosis de 500-1500 mg/m2, preferiblemente 900-1100 mg/m2.

8. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que en la etapa iii) el agente citotóxico es cisplatino que se administrará a una dosis de 10-50 mg/m2, preferiblemente 20-30 mg/m2.

9. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que en la etapa iii) dicha gemcitabina y/u otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino, se administrarán más de una vez.

10. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha gemcitabina y/u otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino, debe administrarse más de una vez (preferiblemente dos veces) en un ciclo de 14-30 días que sigue de 1 a 40 días después de las etapas i) y ii).

11. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en el que dicha gemcitabina y/u otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino, se administrará una o más (preferiblemente dos) en al menos 3, preferiblemente al menos 5 ciclos de 14 a 30 días, en los que dicho primer ciclo de 14 a 30 días sigue de 1 a 40 días después de las etapas i) y ii).

12. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que las etapas (i), (ii) y (iii) deben realizarse al menos dos veces, en la que preferiblemente en cada ronda de etapas (i), (ii) y (iii), la etapa (iii) debe realizarse al menos dos veces.

13. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la administración sistémica de uno o más de TPCS2a, gemcitabina y otro agente citotóxico, preferiblemente cisplatino, debe ser intravenosa.

14. Gemcitabina y TPCS2a y, opcionalmente, otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 9 a 13, en el que el cisplatino no se va a usar en dicho tratamiento.

15. Gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho otro agente citotóxico es cisplatino.

16. Un kit que comprende gemcitabina y TPCS2a y opcionalmente otro agente citotóxico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 7 u 8 para uso simultáneo, separado o secuencial para tratar un colangiocarcinoma en un paciente, en el que dicho uso es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.