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CN110022874A - 以tpcs-2a诱导的吉西他滨光化学内在化治疗胆管癌 - Google Patents

以tpcs-2a诱导的吉西他滨光化学内在化治疗胆管癌 Download PDF

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CN110022874A
CN110022874A CN201780073846.XA CN201780073846A CN110022874A CN 110022874 A CN110022874 A CN 110022874A CN 201780073846 A CN201780073846 A CN 201780073846A CN 110022874 A CN110022874 A CN 110022874A
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tpcs
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platinum
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P·K·塞尔博
K·艾文德维克
L·费尼桑德
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Abstract

本发明提供TPCS2a、吉西他滨和任选的另一种细胞毒剂，优选顺铂，在治疗人类患者的胆管癌的方法中使用，该方法包括一种光化学内在化法。还提供了用于实施本发明的相关试剂盒。

Description

以TPCS-2A诱导的吉西他滨光化学内在化治疗胆管癌
技术领域
本发明涉及一种治疗患者胆管癌的方法，该方法包括对患者全身给予TPCS2a，随后全身给予吉西他滨，并通过适当放置的光纤辐照所述胆管癌。该疗法可以与进一步全身给予吉西他滨和/或另一种细胞毒剂相结合，该细胞毒剂优选顺铂。
背景技术
胆管癌(bile duct cancer,也称为cholangiocarcinoma，CCA)是一种罕见但通常致命的疾病。CCA分为肝内的和肝外的CCA，后者可再分为门周的和远端的CCA。超过90％的CCA是腺癌。CCA在人群中的发病率约为1.7/100,000。在亚洲，特别是在中国，发病率较高。仅美国和欧盟的新病例数约为11,000例每年。60％至80％的CCA是肝外的，且其中70-80％不适于治愈性切除术。五年生存率低于5％，而当肿瘤无法手术时，五年生存率为0％。无法手术的CCA的平均生存期是12个月。
目前，CCA通过手术、支架植入和/或化疗进行处理。手术是CCA唯一潜在的治愈性疗法。然而，不到三分之一的肿瘤在出现时可切除。内镜支架植入术是不可切除性疾病患者进行姑息性胆汁引流的合适方法。目前不存在被批准的用于CCA治疗的化学疗法。推荐的化疗治疗包括吉西他滨和顺铂联合，但这并非治愈性的。Valle等(2010，新英格兰医学杂志(New England J.Med)，362，第1273-1281页)报道了对局部晚期或转移性的胆道癌患者给予顺铂和吉西他滨的试验，其达到了11.7个月的中位总生存期。
对于用来治疗CCA，特别是用于治疗那些无法手术和不存在治愈性疗法的CCA的治疗方法，仍然有巨大的需求。
光化学内在化(PCI)是一种已知的技术，其改善了分子向胞质溶胶中的递送。这可以用于内化分子以影响细胞的功能(例如细胞毒性分子以杀死细胞)或允许它们呈递至细胞表面，例如在疫苗接种方法中。PCI是一种使用光敏剂并结合照射步骤以激活该剂的技术，并且已知其能实现将共同施用于细胞的分子释放到细胞的胞质溶胶。这种技术允许被细胞吸收并进入细胞器例如核内体的分子在经过照射后，能从这些细胞器释放到胞质溶胶中。PCI提供了一种机制，以不会导致广泛的细胞破坏或细胞死亡的方式，将其他的膜不可渗透(或渗透性差)的分子引入一个细胞的胞质溶胶中。
在WO 96/07432和WO 00/54802中描述了光化学内在化(PCI)的基本方法，这两篇专利通过引用的方式并入本文。在这样的方法中，将待内化的分子(在本发明中将会是细胞毒剂)和光敏剂与细胞接触。所述光敏剂和所述待内化的分子被吸收至细胞内的细胞膜结合的小室中，即它们被内吞至一个细胞内囊泡(例如一个溶酶体或核内体)中。当细胞暴露于适当波长的光下时，光敏剂被激活，其直接或间接地产生破坏细胞内囊泡膜的活性物质。这使得被内化的分子能被释放到胞质溶胶中。
发现在这种方法中，大多数细胞的功能或活力没有受到不利影响。因此，这种方法的效应被称为“光化学内在化”，用于将各种不同的分子包括治疗剂，运输到胞质溶胶中，即进入细胞内部。
PCI已被证明可以增强不易穿透质膜的各种大分子和其他分子的生物活性，不易穿透质膜的各种大分子和其他分子包括I型核糖体失活蛋白、免疫毒素、化学治疗剂例如博来霉素和阿霉素、编码基因质粒(gene encoding plasmid)和寡核苷酸。已经发现，与相应的光动力疗法(PDT)相比，PCI能在更深的组织层中诱导细胞毒性。由于靶向治疗与在实体瘤中优先积累的光敏剂所诱导的光激活胞质溶胶递送相结合，PCI可以是高度特异性的，而且这也有助于增强抗肿瘤功效。
如上所述，CCA需要一种医学疗法，其可以替代现有的对患者预期寿命改善有限的治疗方法。本发明致力于满足这一需求。
发明内容
本发明人惊奇地发现，有利的是，一种包括使用本文限定剂量的光敏剂TPCS2a和吉西他滨，并用有效波长的光进行辐照以激活所述光敏剂的方法，相对于标准治疗方法取得了显著的改善。如将在下面的实施例中更详细描述的，已证明在治疗6个月后，超过80％的病变已经缩减并且超过50％的病变已不再检测得到。这是一个非常重要的结果，其为CCA的治疗提供了新的希望。该结果特别令人惊讶，因为PCI方法依赖于将核内体中的分子释放到胞质溶胶中，然而未曾有任何迹象表明吉西他滨被细胞吸收并进入核内体内并由此可从PCI治疗中受益。
因此，第一方面，本发明提供了一种治疗人类患者胆管癌的方法，包括：
i)对所述患者全身给予TPCS2a至剂量为0.05-0.5mg/kg(或0.1-0.5mg/kg)，和
ii)3-5天后，全身给予吉西他滨至剂量为500-1500mg/m2，并用光纤以640-665nm波长的光辐照所述胆管癌，所述光纤置于所述胆管癌的3cm以内以提供10-60J/cm(或15-60J/cm)(例如，所述光纤或肿瘤的cm)的光剂量；以及任选地
iii)1-40天后(优选7-21天后)全身给予吉西他滨和/或另一种细胞毒剂，优选顺铂。
如本文所定义的，“治疗”是指相对于治疗以前的症状，减轻、缓解或消除正在治疗的CCA的一种或多种症状。特别地，所述治疗可包括减小所要治疗的CCA的尺寸或体积。所述治疗可包括对最靠近所述光纤的CCA的效果，还包括对离光纤较远的和可能不直接接收来自光源的辐照的其他CCA的效果。在本发明的一个方面，该方法治疗一个或多个胆管癌(或其细胞)，它们在辐照步骤中未被辐照(这包括直接或间接辐照，即未接受到由所述辐照步骤所产生的光剂量)。
“胆管癌”可以是肝内的或肝外的(其可以是门周的和远端的)胆管癌。超过90％的CCA是腺癌。
所述“患者”是人。
“全身给予”包括任何形式的非局部给药，其中药剂在不直接邻近CCA或在CCA的局部附近的部位给予身体，从而使得全身接受所给予的药剂。方便地，全身给予可以通过肠内给药(例如口服)或非肠道给药(例如静脉内，肌肉内或皮下)。优选静脉内给药。
“TPCS2a”是具有以下结构的光敏剂(四苯基二氢卟酚二磺酸)或其异构体。下面的结构提供了7,8-二氢异构体。12,13-和17,18-二氢异构体包括在术语TPCS2a中。它们药学上可接受的盐也包括在其中。这些分子如WO03/020309和WO2011/018635所述，这两篇文献通过引用的方式并入本文。
TPCS2a可从美国纽约的BOC Sciences或挪威的PCI Biotech AS获得。或者，TPCS2a可以如WO03/020309和WO2011/018635中描述的来制备。药学上可接受的盐包括与生理学上可接受的有机或无机酸的酸加成盐。合适的酸包括例如盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，乙酸，乳酸，柠檬酸，酒石酸，琥珀酸，马来酸，富马酸和抗坏血酸。疏水盐也可以方便地制得，例如通过沉淀。合适的盐包括例如乙酸盐，溴化物盐，氯化物盐，柠檬酸盐，盐酸盐，马来酸盐，甲磺酸盐，硝酸盐，磷酸盐，硫酸盐，酒石酸盐，油酸盐，硬脂酸盐，甲苯磺酸盐，钙盐，葡甲胺盐，钾盐和钠盐。成盐的方法在本领域中是常规的。
优选的盐包括二乙醇胺盐，乙醇胺盐(优选双(单乙醇胺))，N-甲基-葡糖胺盐，三乙醇胺盐，1-(2-羟甲基)-吡咯烷盐和2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇盐。
如本文所提及的“药学上可接受的”是指与本发明的方法或用途中使用的其他成分相容且接受者在生理学上可以接受的成分。
本文使用的药剂，例如TPCS2a、吉西他滨和/或另一种细胞毒剂可以以药物组合物的形式提供用于本发明的方法中，并且可以根据制药领域已知的技术和方法以任何方便的方式配制，例如，使用一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。“药学上可接受的”具有如上文所述的含义。可根据选择和所需的给药途径等以常规方式选择组合物和载体或赋形剂材料的性质，剂量等。在可能存在变化的情况下，剂量同样可以以常规方式确定，并可取决于分子的性质、治疗目的、患者年龄、给药方式等。
如实施例中所述，已发现TPCS2a以0.05-0.5mg/kg(或0.1-0.5mg/kg)(mg药剂/kg体重)的剂量(或浓度)使用，具有特别有利的结果。方便地，使用0.05-0.3mg/kg(或0.1-0.3mg/kg)的剂量，优选使用0.2-0.3mg/kg的剂量。所述光敏剂可以快速的或更缓慢的给予患者。方便地，TPCS2a可以在不到30秒的时间内给予，例如从1秒至15秒，或在更长的时间范围内，例如1分钟到10分钟。
“吉西他滨”是具有下述结构的核苷类似物(4-氨基-1-(2-脱氧-2,2-二氟-β-D-赤式-戊呋喃糖基)嘧啶-2(1H)-酮)及包括其药学上可接受的盐。
吉西他滨通过抑制DNA合成和抑制核糖核苷酸还原酶而起作用，核糖核苷酸还原酶也参与细胞的复制机制。吉西他滨被批准用于适应症例如卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和胰腺癌的几种标准癌症化疗方案。它也常用于胆管癌的姑息疗法，虽然未被批准用于该适应症。
吉西他滨可从Eli Lilly&Co或Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)等渠道获得。所述药学上可接受的盐优选如上文所定义的，优选为盐酸盐。
吉西他滨以500-1500mg/m2(其是指每m2身体表面积(BSA)的吉西他滨mg)的剂量(或浓度)给予患者。BSA例如可以使用Mosteller公式(√([高度(cm)x重量(kg)]/3600))来计算。(必要时，通过使用普通成人的换算系数0.025mg/kg＝1mg/m2，可以将其转换成mg/kg)。方便地，以900-1100mg/m2的剂量使用。方便地，吉西他滨可以在不到1小时范围内给予，例如15-45分钟，例如约30分钟或更长的时间范围，例如从1小时到12小时。
“辐照”胆管癌是指如本文定义的通过光纤用光来辐照肿瘤。辐照(Irradiation)在本文中也可称为照射(illumination)。其用于激活光敏剂。所述肿瘤的细胞可以被直接照射(当与光纤直接接触时)或间接照射(当离光纤较远时，通过其他细胞的屏(screen))，即接收光剂量。
照射所述患者的肿瘤或细胞可以在给予光敏剂3-5天后进行。优选地，所述照射在给予光敏剂4天后进行。
为确保光敏剂的活性影响吉西他滨的释放，在吉西他滨恰好给药前、给药期间和/或给药之后进行辐照。须将吉西他滨带入细胞才能发挥作用，而且在大多数细胞中，各种核苷转运蛋白对于吉西他滨带入细胞是重要的。但是，在一些癌细胞中，这种转运蛋白的表达可能非常低，严重限制了吉西他滨的摄取和所能达到的治疗效果。然而，在这样的细胞中，吉西他滨仍然可以通过内吞作用带入，并且已发现的PCI诱导增强吉西他滨细胞毒性作用(例如在实施例中描述的体外癌细胞研究中)，表明这可能是这类细胞的一种重要的运输机制。
虽然不希望受理论束缚，但吉西他滨很可能被摄入至患者细胞的细胞内区室中并通过光敏剂的激活使吉西他滨释放到细胞中。因此，在进行辐照之前，光敏剂必须在细胞内的相关区室中。已发现，激活光敏剂时位于那些区室中的分子，或者在光敏剂被激活后立即被吸收到这些细胞中的分子，均释放到了胞质溶胶中。(这方面请参见WO02/44396，该文献通过引用方式并入本文，其涉及的是所谓的“光照之前”方法。)
便利地，在吉西他滨给药开始前1小时至吉西他滨给药开始后4或5或6小时的时间范围内进行所述辐照。优选的，在吉西他滨给药开始的3或4小时内(即从吉西他滨给药开始，至吉西他滨给药开始后3或4小时；例如以0时作为吉西他滨给药开始的时刻，在0、30、60、120、180或240分钟的时刻)进行所述辐照。因此，例如，当吉西他滨给药进行30分钟，并且辐照进行15分钟时，吉西他滨给药可以在0时刻开始，在30分钟时停止；辐照在120分钟时开始并在135分钟时结束。但是，在吉西他滨给药后进行长达1、2、3或4天的辐照也包括在本发明的方法中。
在合适的情况下，光辐照步骤可以进行超过一次(例如2、3或4次)。这对于特别大的肿瘤或在较宽区域上扩散的离散肿瘤可能是必要的。在这种情况下，可以使用一根或多根光纤，它们可以位于相同或不同的位置。针对每个辐照步骤，一根或多根光纤的位置可以变化或保持不变(例如移动至接近其他离散肿瘤或接近单个肿瘤块的其他区域的位置)。
激活光敏剂的所述光辐照步骤可以根据本领域熟知的技术和方法进行。要使用的光的波长为640-665nm，优选为652nm。合适的人工光源是本领域中所公知的。方便地，照射(辐照)通过PCI Biotech AS 652nm激光系统二极管激光器提供，但也可采用任何合适的红光源。
光纤用于提供光，该光纤置于所述CCA的3cm范围内。如本文所述，“光纤”是一种薄的柔性透明纤维，通过它光可以在远端传输。优选地，所述光被漫射以使光均匀地散布在一个表面，从而最小化或去除高强度亮点。可以使用光纤末端的各种尖端，例如前置分配器或微透镜尖端或球形漫射器。在替代方案中，可以使用气囊导管来散射光(例如，Medlight的扩散气囊导管)。在另一个替代方案中，所述光纤可以是未加工的，例如，可以使用一个裸尖端。优选地，所述光通过一个圆柱形漫射器传输，其中光纤的末端是一个使沿其长度传输的光均匀分布的照明尖端。
所述光纤可以由玻璃或塑料制成，且其芯直径至少为激光输出通道的直径，优选为200-800μm(例如400-600μm，例如500μm)或直径为400-1200μm(例如900-1000μm)，包括其任意的涂层。可以使用带有长度10-70mm(优选20-40mm)的漫射器的光纤。对于一个患者体内的大肿瘤或多个离散肿瘤，可用多于一根的光纤，例如，2根或更多根，例如3、4、5、6根或更多根，例如不到10根。在替代方案中，可以用单根光纤进行多轮照射(或辐照)，该光纤可以移动到不同位置或者保持在相同位置。
根据本发明，所述光纤(或至少一根或每根光纤)放置在CCA的3cm内。该尺寸是指光纤外表面与CCA最接近的部分之间的距离。优选地，所述光纤尽可能的靠近CCA放置，例如，在CCA的1cm或2cm范围内或位于CCA内。方便地，将所述光纤置于胆管中(例如通过一根导管)。
所述光纤可以通过一根导管的方式提供，例如，基于光纤的导管的形式，其可以和一个激光源耦合(即，在治疗期间使所述光纤位于所述导管内，并且来自光纤的光辐照透过导管壁而发生)。所述光纤将光从设备的近端引导至设备的远端。所述远端优选具有照明尖端(“漫射器”)，其可以使经光纤沿其长度传输的光均匀地分布。所述导管允许内窥镜输送光。优选使用一个光漫射器。方便地，可使用Medlight SA(瑞士)圆柱形光漫射器，例如带有不透射线标记的圆柱形光漫射器模型RD。
在本发明的方法中，患者的细胞暴露在光中的时间可以变化以达到所需的光剂量。可以根据多种因素来选择所述时间，这些因素包括光敏剂和吉西他滨的剂量、要用的光的注量率及光纤与肿瘤的靠近程度。
对肿瘤细胞的总光剂量可以用J/cm的光纤(或肿瘤)表示，并且按照注量率(W/cm的光纤或肿瘤)×治疗时间来计算。
根据要使用的光源的注量率，为达到所需的光剂量，可相应地选择辐照时间。例如，注量率为100mW/cm，为了达到10J/cm或30J/cm(或15J/cm或30J/cm)的光剂量，辐照时间可以分别是2.5分钟或5分钟。因此，注量率为100mW/cm时，为达到10-60J/cm(或15-60J/cm)的光剂量，辐照时间可以是2.5-10分钟。更高或更低的注量率允许分别采用更短或更长的辐照时间。考虑到上述情况，优选地，所述辐照时间为1分钟至20分钟，例如2-10分钟，取决于所述光源的注量率。当采用多轮照射(辐照)时，这些时间是指每轮的辐照时间。
本领域技术人员可以选择适当的光剂量，且也取决于前面所描述的各因素。特别是更高剂量或浓度的光敏剂(TPCS2a)，允许使用更低的光剂量。在本发明中，已经发现，光的剂量为10-60J每cm(或15-60J每cm)的光纤(的漫射器)或肿瘤是特别有利的。在单位“J每cm”中，如果光是在一段光纤上发射(例如，当使用漫射器时)，所述cm是指所述光纤的长度。在替代方案中，cm可以是肿瘤的cm，例如，当使用点光源时。在两种情况下，J/cm是指每cm提供至局部环境的光剂量。
方便地，使用一个光漫射器来达到所述光剂量，该光漫射器的注量率为100mW每cm的光纤(例如漫射器)，因此照射时间为2.5分钟至10分钟。优选采用的剂量为10-45J/cm(或15-45J/cm)，例如20-40J/cm或25-35J/cm。
此外，如果要维持细胞活力，应避免产生过量水平的毒性物质，并可以相应地调整相关参数。
通过光化学处理，即通过在光敏剂活化时产生有毒物质的光动力疗法效应，本发明的方法可能不可避免地引起一些细胞损伤。因本发明方法的作用在于破坏肿瘤细胞，这种细胞死亡可能是不重要的，并可能确实是有利的。然而，在一些实施方案中，细胞死亡应避免，以确保细胞毒性分子被带入到细胞中，从而确保局部的和特异性的细胞死亡。本发明的方法可以修改，以通过选择与光敏剂的剂量(浓度)有关的光剂量来调节存活细胞分数或比例。同样，这些技术在本领域中是已知的。
优选地，基本上所有细胞，或绝大多数(例如至少75％，更优选至少80％、85％、90％或95％的细胞)不被单独的光化学内在化方法(即不使用细胞毒剂)所杀死。PCI治疗后的体外细胞存活率可采用本领域已知的标准技术进行测量，例如MTS试验。一种或多种细胞类型的体内细胞死亡可在给药点的1cm半径范围内(或在组织的某一深度)进行评估，例如通过显微镜或其他适当的方法进行评估。由于细胞可能不会立即死亡，因此细胞死亡百分比是指在辐照的几小时内(例如照射后长达4小时)仍能存活的细胞的百分比，但优选指辐照后4小时或更长时间仍能存活的细胞的百分比。
本发明可选的方法中，在步骤(ii)之后1-40天，即在给予吉西他滨及对患者进行辐照后，所述患者可以全身给予吉西他滨和/或另一种细胞毒剂。优选地，这类给药发生在步骤(ii)之后5-30天，特别优选发生在步骤(ii)之后7-21天。
当给予吉西他滨时，其可以如上文所述的在步骤ii)中给予吉西他滨那样进行(即关于给药剂量、给药途径和给药的持续时间)。
所述的另一种细胞毒剂可以是任何适用于治疗癌症的毒性剂，特别是适用于治疗胆管癌且在患者中产生可接受的副作用的毒性剂(例如常用的化疗药物)。这类药物包括烷基化药物，蒽环类药物和其他细胞毒性抗生素(例如博来霉素)，蛋白质毒素(例如多花白树毒蛋白)，抗代谢物(不包括吉西他滨)，长春花生物碱和依托泊苷，酪氨酸激酶抑制剂和其他抗肿瘤药物例如铂化合物，例如顺铂。
“顺铂”是含铂的抗癌药物，具有如下所示的结构((SP-4-2)-二氨二氯铂(II))。
顺铂可从Hospira(Cisplatin Hospira)等渠道获得。
其他的细胞毒剂的合适剂量是本领域已知的。如果使用顺铂，其方便的使用剂量为10-50mg/m2，优选20-30mg/m2。给药的途径和持续时间可以如上文对吉西他滨所述的那样。
在步骤iii)中，当使用吉西他滨和至少一种其他细胞毒剂时，它们可以同时使用、分开使用或先后使用。当同时使用时，它们同时给予，但可以通过单一途径给予或通过不同途径给予(例如一种静脉内给予的混合物，或两种(或更多种)制剂通过不同的静脉输入点同时给予)。当分开给予时，它们可以同时给予或先后给予和/或可以在它们的给予时间上重叠。当先后使用时，不同药物分开给予的时间不超过24小时。便利地，它们以单一混合物的形式一起给予。
在本发明的优选特征中，步骤iii)中使用的所述吉西他滨和/或另一种细胞毒剂给予超过一次，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10次(例如多达20次)。该给予次数可以是在单个(或每个)周期中的，或者是在多个周期中总共的。
如本文所述的，一个“周期”是应用特定治疗方案的一个时间段，并且通常重复进行以提供周期性治疗。每个周期中的治疗可以相同或不同(例如可以使用不同的剂量、时间等)。一个周期的时间长度可以是14-30天，例如，一个21天的周期。可以采用多个周期，例如，至少2、3、4或5个周期，例如6、7、8、9或10个周期(例如多达8、9、10或20个周期)。如上文所述，在每个周期内，所述吉西他滨和/或另一种细胞毒剂可以给药一次或多于一次。在一个优选的特征中，所述吉西他滨和/或另一种细胞毒剂在每个周期中给予两次并优选至少3次；优选地，至少进行5个周期。
尽管在一个优选特征中，上述步骤iii)用吉西他滨和/或另一种细胞毒剂进行治疗，但在本发明的另一方面中未进行这种治疗，特别是该治疗不包括使用另一种细胞毒剂例如顺铂。
为有效治疗，本文所述的方法或其部分可以重复的进行。因而，例如步骤i)和ii)可以重复一次或多次，例如2次或3次，例如在间隔1-6个月或更长时间后，例如在步骤ii)或iii)之后。在一个优选的方面，整个方法重复至少两次，例如3次或4次。
在一个特别优选的方面，该方法包括实施该方法两次(即，实施步骤i)，ii)，iii)，i)，ii)和iii))或更多次；优选地，其中在第一和/或第二(或之后)轮的步骤i)至iii)，步骤iii)进行至少两次。因而，作为示例，该方法可以按如下方式进行：
i)对所述患者全身给予TPCS2a至剂量为0.05-0.5mg/kg(或0.1-0.5mg/kg)，和
ii)3-5天后，全身给予吉西他滨至剂量为500-1500mg/m2，并且在完成所述吉西他滨给药后2-4小时，用光纤以640-665nm波长的光辐照所述胆管癌，所述光纤置于所述胆管癌的3cm以内以提供10-60J/cm(或15-60J/cm)的光剂量；
iii)1-40天之后(优选7-21天之后)全身给予吉西他滨和/或另一种细胞毒剂，优选顺铂；
iv)重复步骤iii)至少一次；和
v)重复步骤i)至iv)至少一次。
在一个特别优选的方面，步骤iii)如上文所述的进行数个周期；特别是步骤iii)进行多个周期(在开始步骤iv)之前)，且在这些周期的每个周期中，所述吉西他滨和/或另一种细胞毒剂比如顺铂给予两次或更多次。
作为示例，该方法可以这样进行，其中在第一轮和第二轮中，步骤iii)包括2、3或4个周期的吉西他滨和顺铂一次或两次的给予，例如在第1天和第8天给予。当在第一轮步骤iii)之后及第二轮步骤iii)之前进行步骤i)和ii)，这可能会影响第二轮的步骤iii)的第一个周期，例如所述吉西他滨给予和辐照可以取代在第一周期中吉西他滨和顺铂的首次给予。在一种可选方案中，在第一轮(的步骤i)，ii)和iii))之后及第二轮开始之前，患者在1周至4周的期间内不进行任何治疗。在该情况下，之后如上文所述的从步骤i)和ii)重新开始治疗，接着进行步骤iii)。优选地，所述治疗的时间和/或要用的剂量如实施例中所述。
在治疗之前，可以对待治疗的患者进行胆道支架植入，以确保充分的胆汁引流。所述支架采用本领域已知的方法置于胆管中，所述支架可以是塑料的或金属的。后者可以在照射期间保持在原位，而前者在照射期间被移除并且在该过程之后插入一个新支架。
上述方法及其优选的特征也适用于上述药剂的用途。因此，另一方面，本发明提供吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂，优选顺铂，用于治疗人类患者的胆管癌，其中i)对所述患者全身给予所述TPCS2a至剂量为0.05-0.5mg/kg(或0.1-0.5mg/kg)；和
ii)3-5天后，对所述患者全身给予所述吉西他滨至剂量为500-1500mg/m2，并用光纤以640-665nm波长的光辐照所述胆管癌，所述光纤置于所述胆管癌的3cm以内以提供10-60J/cm(或15-60J/cm)(例如所述光纤或肿瘤的cm)的光剂量；和任选地
iii)1-40天后(优选在7-21天后)，对所述患者全身给予吉西他滨和/或另一种细胞毒剂，优选顺铂。
上文所述的定义和优选特征同样适用。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包含如上文所定义的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂，它们优选同时、分开或先后使用用于治疗患者的胆管癌，其中优选所述使用如上文所定义的。
根据本发明的优选方面如实施例中所述，其中在实施例中使用的一个或多个参数或组分可用作上文所述方法的优选特征。
附图说明
现在将参照以下附图在以下非限制性实施例中更详细地描述本发明，其中：
图1示出了用吉西他滨孵育72小时后的细胞毒性。如实施例1中的材料和方法中所描述的，在吉西他滨中孵育72小时后用MTT试验分析细胞系TFK-1(A)和EGI-1(B)的存活率。各个数据点代表三次实验的平均值(+/-标准偏差)。
图2示出了在TFK-1细胞系中配合使用100nM吉西他滨的PCI。如实施例1中的材料和方法所描述的，用剂量为100nM的吉西他滨进行该实验。数据点是三个平行测量值的平均值(+/-标准偏差)，且表示3个独立实验的一个代表。该图中的PDT表示“单独PCI”。
图3示出了在EGI-1细胞系中配合使用100nM吉西他滨的PCI。如实施例1中的材料和方法所描述的，用剂量100nM的吉西他滨进行该实验。数据点是3个平行测量值的平均值(+/-标准偏差)，且表示3个独立实验的一个代表。图中的PDT表示“单独PCI”。
图4示出了配合使用不同剂量吉西他滨的PCI进行治疗后，TFK-1细胞的集落形成能力。如实施例1中的材料和方法所描述的，用不同剂量的吉西他滨(如图所示)和140秒的照射时间进行该实验。进行了三次独立实验，结果基本相似。
图5示出了一项动物实验的结果，该动物实验研究了PCI联合使用200mg/kg吉西他滨的效果。对具有皮下生长的NCI-H460人肺癌肿瘤细胞的动物，通过静脉注射给予5mg/kg(TPCS2a)。3天后，对这些动物给予200mg/kg的吉西他滨，并在4小时后照射其肿瘤。每周测量2-3次肿瘤的大小。结果显示，与肿瘤未被治疗(未治疗)的对照组相比，单独的光化学治疗(单独PCI)或单独的吉西他滨都不会对肿瘤生长产生显著影响。相反，PCI和吉西他滨相联合显著地减少了肿瘤生长，表明PCI可以显著增强吉西他滨的作用。
图6示出了一项动物实验的结果，该动物实验研究了PCI联合使用400mg/kg吉西他滨的效果。该方法除了使用400mg/kg的吉西他滨之外，其余如上文对于图5所述的方法进行。结果显示，与肿瘤未被治疗(未治疗)的对照组相比，单独的光化学治疗(单独PCI)或单独的吉西他滨(吉西他滨400mg/kg)都对肿瘤生长没有显著影响。相比之下，PCI和吉西他滨相联合显著地减少了肿瘤生长，表明PCI可以显著增强吉西他滨的作用。
图7示出了在第6个月时对治疗表现出阳性应答的患者百分比，即那些具有部分缓解(PR)或完全缓解(CR)的患者。接受PCI治疗的患者(PCI 1期：组群3和组群4)与那些采用标准非PCI化疗治疗(ABC02)的患者进行比较。
图8示出了组群3和组群4的胆管癌患者在PCI治疗后，在所有靶(可测量的)病变的总和状态方面的应答。
图9示出了组群3和组群4的胆管癌患者在PCI治疗后，在预期治疗的靶(可测量的)病变状态方面的应答。
图10示出了来自所有组群的所有放射学可评估的胆管癌患者的靶肿瘤尺寸缩小的总体情况。
具体实施方式
实施例1：胆管癌细胞中使用PCI联合吉西他滨的体外评价
材料和方法
细胞系和生长培养基
使用的细胞系为TFK-1和EGI-1，两者均来自挪威奥斯陆Norwegian Radium医院的癌症预防部。TFK-1是人乳头状胆管腺癌细胞系，EGI-1是低分化的人胆管腺癌细胞系。两种细胞系都源自肝外肿瘤(Saijyo等，1995，Tohoku J.Exp.Med.,177:61-71；EGI-1-细胞LINCS基于网络的细胞标志综合数据库(EGI-1-Cell LINCS Library of Intergratednetwork-based Cellular Signatures)。可从该网站获得:http:// lincs.hms.harvard.edu/db/cells/50181/.)，但在形态学和生理学上都有很大不同(Xu等，2013，临床癌症研究,1月1日；19(1)：118-27；Pignochino等，2010，BMC癌症，10：631)。
细胞在75cm2组织培养瓶(NUNC，Thermo Fisher Scientific，罗斯基勒，丹麦)中于37℃、5％(v/v)CO2条件下生长为单层培养物。TFK-1细胞系在含有L-谷氨酰胺、10％胎牛血清(FCS)(PAA实验室，Pasching，奥地利)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich)的RPMI-1640培养基(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)中生长。EGI-1细胞系培养于含有L-谷氨酰胺、10％FCS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(Sigma-Aldrich)中。
TPCS2a光敏剂
二(单乙醇铵)内消旋-四苯基二氢卟吩二磺酸盐
(TPCS2a/)由PCI Biotech AS(Lysaker，挪威)提供。Amphinex批号：FAMP 1002。TPCS2a(溶于3％聚山梨醇酯80、2.8％甘露醇、50mM pH8.5的Tris中)储备溶液(0.4mg/ml)等分避光保存于4℃。所有使用光敏剂的操作都是在柔和的光线下进行的。
光源
采用Lumisource(PCI Biotech，奥斯陆)进行细胞照射。该灯由四个标准发光管(18W/管，Osram L 18/67)组成，这些发光管发射主峰在约435nm处的蓝光，并用于激发TPCS2a。从蓝色光源发出的辐照度为12mW/cm2，并且在整个照射区域(765cm2)上的变化小于10％。在曝光期间，该光源采用空气冷却以保持辐照度稳定并防止细胞过热。
没有PCI的吉西他滨的细胞毒性
将细胞与不同浓度的吉西他滨(1-1000nM)一起孵育72小时，这些细胞系的细胞存活率采用先前所述的MTT试验(见下文)进行评估(Pignochino等，2010，同前；Lieke等，2012，生物医学中心(BioMedCentral)，12:1471-2407)。
PCI联合吉西他滨
将细胞接种于96孔板或6孔板(Nunclon，Nunc，罗斯基勒，丹麦)中，并使其在37℃下附着过夜。将吉西他滨加入这些细胞中并孵育54小时，然后加入0.4μg/ml TPCS2a。进一步孵育18小时后，将这些细胞在不含TPCS2a的培养基中洗涤，重悬于含有吉西他滨且不含TPCS2a的培养基中并孵育4小时。对细胞进行照射、洗涤并重悬于无药物的培养基中，并在照射之后48小时通过MTT试验评估细胞存活率，或者在照射之后6天通过集落形成试验进行评估(参见下文)。
MTT细胞存活率试验
用Lumisource光照之后48小时进行MTT法(四唑染料还原)。除去培养基并将细胞在含有0.25mg/ml MTT(Sigma)的培养基中孵育约3小时，然后用100μl的99％二甲基亚砜(Sigma)替换。将96孔板置于振荡器上5分钟，然后用power wave XS2(Biotek,VT,美国)在570nm处测吸光度。不含有细胞的孔仅用MTT培养基孵育，用于扣除空白。
集落形成试验
将细胞(25000个细胞/孔)接种在6孔板(Nunc)中使其粘附过夜，并进行上文所描述的光化学处理。将细胞置于培养箱中，培养3天后用新鲜培养基更换其中的培养基。集落用0.9％mg/ml NaCl洗涤一次，在96％乙醇中固定10分钟，并用亚甲蓝(Sigma)饱和溶液染色10分钟。随后，在H2O中洗涤细胞，然后干燥，之后通过肉眼检查来评估。
结果和讨论
吉西他滨对TFK-1和EG1-1细胞系的细胞毒性
在最初的实验中，用吉西他滨孵育4小时来研究细胞毒性，因为对于几种其他药物，这是PCI实验中合适的孵育时间。然而，结果显示，即使在非常高的剂量下(测试了高达1mM的剂量)孵育4小时，吉西他滨对这些细胞系仅具有非常有限的细胞毒性作用(数据未示出)。因此决定将吉西他滨的孵育时间增加至72小时，在早期对于这些细胞系已用过该孵育时间(Pignochino等，2010，同上；Lieke等，2012，同上)。
图1示出了，浓度高达3μM的吉西他滨孵育72小时的细胞毒性。可以看出，即使孵育72小时，吉西他滨的细胞毒性也非常有限，3μM吉西他滨对TFK-1细胞系达到约50％的细胞毒性；而对于EGI-1细胞系，即使在该实验中使用最高剂量其对吉西他滨也不敏感。我们决定在PCI实验中使用100nM的吉西他滨浓度，因为在该剂量下，单独的吉西他滨的细胞毒性最温和，且不会影响PCI治疗的效果。
PCI与吉西他滨配合时的MTT细胞毒性试验
使用100nM剂量的吉西他滨按照材料和方法中所描述的进行实验。从图2可以看出，在TFK-1细胞系中，PCI显著增强了吉西他滨的细胞毒性作用。因此，虽然单独的吉西他滨产生约50％的细胞毒性作用(与图1中示出的结果完全一致)，但与PCI联合以光剂量依赖性的方式大大增强了细胞毒性。单独的光化学处理(图2中的PDT)对细胞存活仅具有有限的作用，表明PCI协同增强了吉西他滨的细胞毒性。
从EGI-1细胞系的实验可以得出相同的结论(图3)。在该细胞系中，单独的吉西他滨对细胞存活没有影响(再次与图1中的结果一致)。但是，联合PCI却达到了非常强的细胞毒性作用(99％细胞杀伤)，而单独的光化学治疗(单独PCI)在最高光剂量下仅杀死了约50％的细胞。在该细胞系中，在单独的吉西他滨或单独的PCI(图中的PDT)都没有达到任何细胞毒性作用(图3中的120s照射)的条件下，联合PCI也达到了非常好的细胞毒性作用，清楚地显示出PCI与吉西他滨的协同作用。值得注意的是联合PCI，使用100nM的吉西他滨剂量可以达到>90％的细胞杀伤；然而没有PCI，即使剂量高30倍(图1B中的3000nM剂量)也未能获得这种细胞杀伤水平。
PCI对TFK-1细胞系集落形成能力的影响
用PCI处理TFK-1细胞，并通过如材料和方法中所描述的集落形成试验评估细胞存活率。初步实验表明，单独的吉西他滨对集落形成能力的影响比通过MTT试验所评估的细胞存活率(参见图4)的影响大得多。因此，在该实验中，也有必要使用较低剂量的吉西他滨。从图4中可以看出，在用剂量330nM和100nM的吉西他滨处理后，TFK-1不能形成集落；在33nM时可以观察到一些集落形成；而在10nM时观察到大量集落形成，尽管仍然低于未处理样品中所观察到的。用10nM吉西他滨+PCI处理，未观察到集落形成；而在单独的PCI处理的样品中，细胞仍具有形成集落的能力。这强烈表明PCI也增强了吉西他滨对细胞形成集落能力的影响，这对于在癌症治疗中应用当然非常重要，因为这是细胞在治疗后继续生长的能力的一种度量。
结论
结果表明，光化学内在化可以显著增强吉西他滨对两种不同胆管癌细胞系的作用，而这些细胞系在没有PCI的情况下对吉西他滨的作用相当具有抵抗力。
实施例2：PCI联合吉西他滨的抗癌作用的体内评价(小鼠)
该研究用于评估使用光敏剂TPCS2a的光化学内在化(PCI)与细胞毒剂吉西他滨联合的体内抗癌功效。
材料
试验物质1：Amphinex(TPCS2a)(批号：FAMP 1002,PCI Biotech AS)
试验物质2：吉西他滨(Sigma-Aldrich)
Amphinex的媒介物：3％吐温-80；2.8％甘露醇；50mM Tris pH8.5
吉西他滨的媒介物：0.9％NaCl
小鼠、给药途径和剂量水平
使用裸(nu/nu)无胸腺小鼠(雌性，CD-1nu/nu品系，至少6周龄)，其已被广泛用于产生人肿瘤异种移植物，并且仍然是用于测试给人施用之前新化合物的抗肿瘤功效的实验方法。测试物质的给药途径是静脉注射。基于PCI Biotech AS和合作方早期进行的小鼠研究，的剂量为5mg/kg。
方法
配制用于给药的通过将在3％吐温-80、2.8％甘露醇、50mM pH8.5的Tris中稀释以提供1.25mg/mL的给药溶液。
配制用于给药的吉西他滨，通过将吉西他滨溶解在0.9％NaCl中以得到20mg/mL和40mg/mL的给药溶液。
溶液在给药当天新鲜配制并避光。
共有6个治疗组，每组10只小鼠。给小鼠皮下注射7×107个细胞/mL的NCI-H460肿瘤细胞，从而得以选择最佳肿瘤纳入研究中。将合适大小的肿瘤分配至各个治疗组。
每组给予一个编号(1至6)。治疗组如下：
通过尾静脉静脉内给予使用的剂量体积为4mg/kg。
吉西他滨的给药途径为静脉注射，剂量体积为10mL/kg。
媒介物组为0.9％NaCl，并通过静脉注射以10mL/kg的剂量体积给药。
在吉西他滨或媒介物给药后约4小时，第2、第3和第6组的动物用650nm二极管激光器照射它们的肿瘤(见下文)。
程序
从体外培养的亚融合培养物(sub-confluent cultures)中收集人NCI-H460非小细胞肺癌细胞(美国典型培养物保藏中心[ATCC]，马里兰，美国；或欧洲动物细胞保藏中心[ECACC]，Porton Down，英国)并测定活细胞数。然后将细胞以约7×107个细胞/mL的浓度重悬于无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中。裸(nu/nu)无胸腺小鼠在右侧皮下注射约7×106个NCI-H460细胞，体积为0.1mL。定期检查动物是否出现肿瘤。当在大多数小鼠中产生了可测量的肿瘤时，将动物分成6个治疗组，每组最多10只小鼠。当肿瘤达到一定大小时，向小鼠静脉注射Amphinex，以使肿瘤体积在72小时后大约在100mm3至150mm3的范围内。此时，对动物给予吉西他滨，约4小时后照射肿瘤。
为了照射肿瘤，每个动物一次一只的被约束在一个金属约束装置中，该金属约束装置仅暴露了下侧面区域，即肿瘤区域加上直径为2mm的周围区域。然后使用650nm二极管激光器(TWI二极管激光器，QuantaSystem，意大利)将肿瘤组织暴露于15J/cm2的光剂量下，注量率为90mW/cm2。每只动物的肿瘤暴露于激光约167秒，以达到所需的剂量15J/cm2。
如果肿瘤大小变化很大，则将动物表面的注量率调节到90mW/cm2，以给每只动物提供正确的剂量和照射时间。例如，对于15J/cm2的光剂量，需要120mW的光纤输出以覆盖1.3cm的照射直径(近似于肿瘤平均直径)，照射时间为167s，且光纤到肿瘤的距离应为2.1厘米。
在照射后长达4周的时间内，或直至小鼠的肿瘤大小(如UK Home Office Licence说明的那样)或其他临床体征为需要从研究中移除该小鼠，使用数显卡尺每周至少测量两次肿瘤大小。记录肿瘤尺寸(长度和宽度)，并使用公式(W2×L)/2计算肿瘤体积，其中W是最宽的肿瘤尺寸，L是最长的肿瘤尺寸。如果肿瘤尺寸过大或发现存在任何不良反应时，则终止动物。
数据分析
记录在研究期间测量的肿瘤尺寸-长度(L，长)和宽度(W，短)(mm)，并保存为原始数据。报告每组在治疗第一天的平均肿瘤体积。计算相关肿瘤的体积并绘制平均肿瘤生长曲线图。还得到了体重数据。
结果和讨论
研究结果表明，PCI技术可以显著增强吉西他滨在体内的作用(图5)。可以看出，与未治疗的对照组相比，单纯的吉西他滨处理对肿瘤生长没有(图5，200mg/kg吉西他滨)或仅有非常有限(图6，400mg/kg吉西他滨)的作用。还可以看出，单独的光化学治疗(单独PCI，即和激光应用，不用吉西他滨)也几乎没有效果。然而，用那两种剂量的吉西他滨和PCI联合都导致了肿瘤生长的大幅延迟，诱导了明显的协同效应。
该研究中动物的体重如表1所示。在研究开始时所有实验组都包括10只动物，但在研究期间，一些动物须被处死，主要是由于实验肿瘤的过度生长。在对照组中(即“未治疗”组和“单独PCI”组)，必须被处死的动物数量更多，而接受PCI联合吉西他滨的组中必须被处死的动物数量最少；因为后一种治疗诱导了肿瘤生长的显著延迟。可以看出，在研究结束时，在所有实验组中的动物平均体重都增加了。显然，在“单独PCI”对照组中体重增加最多，而其在研究开始时具有最轻的平均体重。在其他组之间，体重增加非常相似。在一些组中，在照射时间点之后的第一个时期中，观察到体重的轻微减少(最大7％)。这种减少在接受PCI和吉西他滨联合治疗的组中最为明显，但在一些其他组中也观察到可能短暂的体重减轻。这些数据表明，Amphinex或PCI治疗都对吉西他滨的一般毒性没有明显或不可逆的恶化。
将雌性裸(nu/nu)无胸腺CD-1小鼠皮下移植人NCI-H460肺癌细胞。当肿瘤达到约100mm3的体积时，通过静脉(i.v.)注射给予小鼠TPCS2a(5mg/kg)。4天之后通过静脉注射给予吉西他滨(表中指定的剂量)，4小时后用剂量为15J/cm2的650nm的光照射肿瘤。在照射后(第0天＝照射日)，在不同时间点记录动物的肿瘤大小和体重。治疗组列于该表中；针对每个治疗组的上排是平均体重占第0天体重的百分比；下排是测得的体重(以克为单位)±标准偏差。
结论
结果表明，使用Amphinex光敏剂的PCI可显著增强吉西他滨在裸鼠NCI-H460肺癌模型中的抗肿瘤作用。
实施例3：PCI联合吉西他滨治疗胆管癌的体内(人)评价
该研究是一项I/II期剂量递增研究，旨在评估诱导的吉西他滨光化学内在化(PCI)结合随后进行的吉西他滨/顺铂化疗对于晚期不能手术的胆管癌患者的安全性、耐受性和疗效。
研究群体：
组织学或细胞学诊断为不能手术的、局部晚期的或转移性的胆管癌男性和女性患者，这些患者为化疗初治患者。
药物：
Amphinex 30mg/ml：30mg/ml的活性物质TPCS2a.2MEA(TPCS2a.2(单乙醇胺))(26mg/ml的活性部分TPCS2a)
辅料：TPCS2a.2MEA配制在3.0％吐温80、50mM pH8.5的Tris缓冲液和2.8％甘露醇中。
治疗：
支架植入术：
所有患者在PCI治疗前均进行了胆道支架植入术，以确保充分的胆汁引流。
反映这一点的一个关键排除参数是“血清(总)胆红素”，其最高可为医院的正常值上限(ULN)的1.5倍。
支架可以是塑料的或金属的。如果是塑料支架植入：这个/这些支架在激光照射(第4天)之前的ERCP过程中被移除，并且在照射程序之后立即在适当的位置放置新的支架。如果使用的是金属支架：在激光照射期间，这些支架也在胆管中保持就位。
PCI治疗
第0天：单次剂量的(fimaporfin)通过静脉注射(剂量递增-见下文)全身给予，给药体积小于1ml体积，其用0.9％NaCl冲洗。
第4天：单次剂量的吉西他滨，1000mg/m2，根据SmPC/处方信息用0.9％氯化钠重新配制和稀释，通过静脉输注在30分钟内给予。
第4天-激光应用：在吉西他滨给药开始后3小时(±1小时)的时间窗内进行。使用CE标记的PCI 652nm红光激光器进行激光应用，辐照度100mW/cm(即100mW每cm光纤漫射器长度)，以达到给定的光剂量(例如，在组群1中，患者接受了150秒的照射以达到15J/cm的剂量，组群2-4的患者接受了300秒的照射以达到30J/cm的剂量，但是一些具有更大或更多肿瘤的患者需要额外的照射)。(剂量递增-见下文)
光纤：圆柱形光漫射器模型RD，有源漫射器长度为2cm、3cm或4cm。供应商：Medlight SA，瑞士(http://www.medlij3ht.com/)。如果存在不只一个肿瘤，或者肿瘤大于该光纤的有源漫射器尖端，则可能发生额外的照射，以覆盖整个/所有肿瘤。
用于定位该光纤的导管(该光纤被推入该导管中，因此该光纤的有源远端漫射器尖端可以放置在肿瘤部位)：在透视引导下，半透明的ERCP导管被推进到胆管中。所用的ERCP导管为：MTW ERCP导管，带金属尖端，长215厘米，产品编号99 01 3031 2；或MTW ERCP-导管035锥形金属尖端插管，长215厘米，产品编号01 30 611。由德国MTW Endoskopie提供
(http://nmg.kiev.ua/files/Katalog％20MTW.pdf)。
在组群1的一名患者(患者2)中，在第一次PCI治疗后约9个月，使用相同的剂量参数(Amphinex 0.06mg/kg和15J/cm的光剂量)进行了第二次PCI治疗。组群2的患者6也在第一次PCI治疗后约17个月，使用0.25mg/kg的Amphinex和30J/cm的光剂量接受了第二次PCI治疗。
背景治疗(标准治疗)
在激光应用后的7至21天之间开始，除4名患者外，所有患者均接受8个周期的标准全身化学疗法：顺铂(25mg/m2)和吉西他滨(1000mg/m2)，在每一个21天的周期中的第1天和第8天给药。
具体为接受了以下背景治疗的患者组群：
组群1：3位患者-2位接受了8个周期；1位接受了周期1和周期2，以及周期3的第一次化疗给药(第1天)
组群2：3位患者—3位患者都接受了8个周期
组群3：4位患者—3位患者接受了8个周期；1位患者接受了周期1的第一次化疗给药(第1天)
组群4：6位患者—4位患者接受8个周期；1位接受了6个周期；1位没有接受任何周期
剂量递增I期
在总共16名患者中研究了以下的Amphinex剂量和光剂量。一个组群包括至少3名患者(至少完成背景化疗的周期1-用于递增到下一剂量水平所需的安全性评估)。
*TPCS2a.2MEA的剂量
**组群3和组群4中各一名患者退出-没有接受/完成背景治疗的周期1(此为完成组群的安全性评估的一个要求)
结果-安全性：
没有观察到剂量限制毒性(DLT)，并且随着剂量增加，不良反应没有明显增加。最常见的不良反应是：轻度光敏反应，腹痛和胆管炎。
结果-疗效：
在基线时，和在标准化学疗法治疗的周期1开始后约3个月和6个月，通过CT或MR对患者进行检查。所有图像由RECIST(实体瘤疗效评价标准)和胆管癌方面的两位专家分别评估。对于组群1-4，由治疗患者的医院的专家(当地阅读)以地方级别进行评估；或对于组群3和组群4，由两名中心的独立放射学专家(中心阅读)进行评估。对于中心阅读，阅读者之间存在争议时，由一名评判员进行评估。
组群1-3中的应用剂量水平低于预期有效的剂量水平(Sultan等，2016,柳叶刀肿瘤学(Lancet Oncology)17:1217-29)。
组群3和组群4在6个月的结果(9名患者中7名是可评估的)：2名患者具有进展性疾病(PD->20％增长)，1名患者疾病稳定(SD)，2名患者为部分缓解(PR->30％缩减)和2名患者为完全缓解(CR-无可见肿瘤)(通过中心阅读)。客观缓解率(PR+CR)超过50％(4/7肝门癌患者，初始治疗)，远远高于标准治疗预期(吉西他滨和顺铂联合(Valle等，2010，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med)，362:1273-81)，13例肝门癌，初始治疗)。
图7示出了，与标准化学疗法治疗(ABC02)相比，在来自组群3和组群4(中心阅读)的患者层面的应答评估。评估来自组群3和组群4的靶病变水平的应答，评估由两名中心独立放射学专家(中心阅读)鉴定的所有靶(＝可测量的)病变的总和，如图8所示。评估来自组群3和组群4的靶病变水平的响应，评估由两名中心独立放射学专家(中心阅读)鉴定的预期治疗的靶(＝可测量的)病变，如图9所示。
结果显示，组群3和组群4中(用剂量0.12mg/kg或0.25mg/kg的TPSC2a治疗，并暴露于光剂量为30J/cm的光纤)超过50％的患者在6个月时对治疗表现出部分缓解或完全缓解，然而，使用标准化疗的治疗仅有不到10％的患者(1/13)部分治疗(图7)。此外，几乎90％选定的靶病变表现出缩减，其中超过60％在6个月时检测不到(图8)。当检查预期治疗的靶病变时，观察到了类似的结果(图9)。从图9可以看出，预计只有14个肿瘤得到治疗(即，在照射区域中)。然而，如图8所示，当考虑所有肿瘤，包括那些不在照射区域的肿瘤时，19个肿瘤中有17个显示出应答。这表明照射区域外的至少3个肿瘤对治疗有应答，表明该效果延伸至了照射区域外。我们认为这可能是由于被照射的肿瘤中释放的分子可刺激局部免疫应答，该局部免疫应答靶向照射部位之外的肿瘤。这些结果对于以往没有有效治疗方法的胆管癌患者的治疗具有重要意义。
图10示出了对于来自所有组群的每个放射学可评估的患者的总体靶肿瘤大小的影响。对于组群1和组群2，示出了当地阅读的结果。对于组群3和组群4，示出了中心阅读的结果。排除了患者4和11，因为他们无法通过放射学评估，即，它们的病变无法测量以用于肿瘤减少的计算。图10显示，所有患者中约90％表现出肿瘤尺寸减小。
所检查患者的概况，他们的RECIST结果和他们的总生存期(OS)如下表2所示。对应在6个月时的RECIST的两列示出了本地阅读(左侧列)和中心阅读(右侧列)。4名患者仍然存活(患者6、12、14和16)。迄今为止的平均存活期为16个月(参见最后一列)，中位存活期为14.4个月(数据未示出)。鉴于4名患者仍然存活，预计本研究中患者的平均存活期将增加至超过16个月。
实施例4：PCI联合吉西他滨治疗胆管癌(替代治疗方案)的体内(人)评价
本研究旨在评估，诱导的吉西他滨光化学内在化(PCI)结合随后进行的吉西他滨/顺铂化疗，对晚期不能手术的胆管癌患者中进行第二轮的PCI治疗的疗效。
研究群体：
组织学或细胞学诊断为不能手术的、局部晚期的或转移性的胆管癌男性和女性患者，这些患者为化疗初治患者。
药物：
Amphinex 30mg/ml，如实施例3中所述。
治疗：
如实施例3所述进行治疗，但使用以下时间：
a)首次PCI治疗
第0天和第4天：用(fimaporfin)和吉西他滨进行治疗，然后如实施例3所述的进行辐照(在吉西他滨给药完成之后2-4小时)以达到30J/cm的剂量。
b)标准全身化疗
在激光应用后7或21天开始，患者接受4个周期的标准全身化疗：顺铂(25mg/m2)和吉西他滨(1000mg/m2)，如实施例3所述的，在每个21天的周期中的第1天和第8天给药。
c)第二次PCI治疗
在标准全身化疗的第4周期的第18天和第5周期的第1天，如上面所述的在第0天和第4天那样重复进行PCI治疗。
根据患者的健康状况，第二次PCI治疗的开始(＝周期4的第18天)和随后的全身化疗的开始可延迟至多4周。
d)标准全身化疗
在周期4的第21天后的那天开始周期5(除非由于患者的健康状况而延迟，如上所述)。全身化疗如b)中所述那样进行，但仅在周期5的第8天进行。按b)中所述的那样另外进行三个周期(即在第8天和第21天进行治疗)。
安全性和疗效的评估如实施例3中所述。

Claims (31)

1.一种治疗人类患者胆管癌的方法，包括：
i)对所述患者全身给予TPCS2a至剂量为0.05-0.5mg/kg，和
ii)3-5天后，全身给予吉西他滨至剂量为500-1500mg/m2，并用光纤以640-665nm波长的光辐照所述胆管癌，所述光纤置于所述胆管癌的3cm以内以提供10-60J/cm的光剂量；和任选地
iii)1-40天后(优选7-21天后)，全身给予吉西他滨和/或另一种细胞毒剂，优选顺铂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，给予所述TPCS2a至剂量为0.05-0.3mg/kg，优选0.2-0.3mg/kg。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤ii)中给予所述吉西他滨至剂量为900-1100mg/m2。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述辐照在吉西他滨给药开始的4小时内进行。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述光的波长是652nm。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述光剂量为10-45J/cm，优选25-35J/cm。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中，在步骤iii)中给予吉西他滨和另一种细胞毒性剂，优选顺铂。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，在步骤iii)中，给予所述吉西他滨至剂量为500-1500mg/m2，优选900-1100mg/m2。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在步骤iii)中，所述细胞毒剂是顺铂，给予所述顺铂至剂量为10-50mg/m2，优选20-30mg/m2。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在步骤iii)中，所述吉西他滨和/或另一种细胞毒剂，优选顺铂，给予超过一次。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述吉西他滨和/或另一种细胞毒剂，优选顺铂，在步骤i)和ii)之后的1-40天之后的一个14-30天的周期中，给予超过一次(优选两次)。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述吉西他滨和/或另一种细胞毒剂，优选顺铂，在至少3个优选至少5个14-30天的周期中，给予一次或多次(优选两次)，其中所述第一个14-30天的周期在步骤i)和ii)之后的1-40天之后。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中步骤(i)、(ii)和(iii)至少进行两次，其中优选在每轮的步骤(i)、(iii)和(iii)中，步骤(iii)至少进行两次。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中TPCS2a、吉西他滨和另一种细胞毒剂中的一种或多种的全身给予为静脉注射，所述另一种细胞毒剂优选顺铂。
15.如权利要求1-8或10-14中任一项所述的方法，其中在所述治疗中不使用顺铂。
16.吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂，优选顺铂，用于治疗人类患者的胆管癌，其中i)对所述患者全身给予所述TPCS2a至剂量为0.05-0.5mg/kg；和
ii)3-5天后，对所述患者全身给予所述吉西他滨至剂量为500-1500mg/m2的，并用光纤以640-665nm波长的光辐照所述胆管癌，所述光纤置于所述胆管癌的3cm以内以提供10-60J/cm的光剂量；及任选地
iii)1-40天后(优选在7-21天后)，对所述患者全身给予吉西他滨和/或另一种细胞毒剂，优选顺铂。
17.如权利要求16所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中，给予所述TPCS2a至剂量为0.05-0.3mg/kg，优选0.2-0.3mg/kg。
18.如权利要求16或17所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中在步骤ii)中，给予所述吉西他滨至剂量为900-1100mg/m2。
19.如权利要求16-18任一项所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中所述辐照在吉西他滨给药开始的4小时内进行。
20.如权利要求16-19任一项所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中所述光的波长为652nm。
21.如权利要求16-20任一项所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中所述光剂量为10-45J/cm，优选25-35J/cm。
22.如权利要求16-21任一项所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中在步骤iii)中，给予吉西他滨和另一种细胞毒剂，优选顺铂。
23.如权利要求16-22任一项所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中在步骤iii)中，给予所述吉西他滨至剂量为500-1500mg/m2，优选900-1100mg/m2。
24.如权利要求16-23任一项所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中在步骤iii)中，所述细胞毒剂为顺铂，给予所述顺铂至剂量为10-50mg/m2，优选20-30mg/m2。
25.如权利要求16-24任一项所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中在步骤iii)中，所述吉西他滨和/或另一种细胞毒剂，优选顺铂，给予超过一次。
26.如权利要求25所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中所述吉西他滨和/或另一种细胞毒剂，优选顺铂，在步骤i)和ii)之后的1-40天之后的一个14-30天的周期中，给予超过一次(优选两次)。
27.如权利要求24或25所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中所述吉西他滨和/或另一种细胞毒剂，优选顺铂，在至少3个优选至少5个14-30天的周期中，给予一次或多次(优选两次)，其中所述第一个14-30天的周期在步骤i)和ii)之后的1-40天之后。
28.如权利要求16-27任一项所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中步骤(i)、(ii)和(iii)至少进行两次，其中优选在每轮的步骤(i)、(iii)和(iii)中，步骤(iii)至少进行两次。
29.如权利要求16-28任一项所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中TPCS2a、吉西他滨和另一种细胞毒剂中的一种或多种的全身给予为静脉注射，所述另一种细胞毒剂优选顺铂。
30.如权利要求16-23和25-29中任一项所述的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂用于治疗，其中在所述治疗中不使用顺铂。
31.一种试剂盒，其包含如权利要求1-3、8、9、16-18、23或24中任一项所定义的吉西他滨和TPCS2a以及任选的另一种细胞毒剂，优选同时、分开或先后使用以用于治疗患者的胆管癌，其中优选所述使用如权利要求16-30中任一项所定义的。
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