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ES2725948T3 - Suministro multivalente de inmunomoduladores mediante ácidos nucleicos esféricos liposomales para aplicaciones profilácticas o terapéuticas - Google Patents

Suministro multivalente de inmunomoduladores mediante ácidos nucleicos esféricos liposomales para aplicaciones profilácticas o terapéuticas Download PDF

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ES2725948T3
ES2725948T3 ES15753219T ES15753219T ES2725948T3 ES 2725948 T3 ES2725948 T3 ES 2725948T3 ES 15753219 T ES15753219 T ES 15753219T ES 15753219 T ES15753219 T ES 15753219T ES 2725948 T3 ES2725948 T3 ES 2725948T3
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ES
Spain
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oligonucleotides
liposomal
nanostructure
antigen
oligonucleotide
Prior art date
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Active
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ES15753219T
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English (en)
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Aleksandar Filip Radovic-Moreno
Richard Kang
Subbarao Nallagatla
Christopher C Mader
Sergei Gryaznov
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Exicure Inc
Original Assignee
Exicure Inc
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Abstract

Una nanoestructura, que comprende un nucleo liposomal que tiene una bicapa lipidica, en donde un inmunoestimulador o un inmunosupresor estan asociados a la bicapa lipidica, y los oligonucleotidos estan colocados en el exterior del nucleo liposomal, en donde los oligonucleotidos comprenden oligonucleotidos que contienen el motivo de CpG, en donde los oligonucleotidos estan unidos indirectamente al nucleo liposomal a traves de un enlazador, y en donde todos los oligonucleotidos tienen su extremo 5' expuesto a la superficie externa de la nanoestructura.

Description

DESCRIPCIÓN
Suministro multivalente de inmunomoduladores mediante ácidos nucleicos esféricos liposomales para aplicaciones profilácticas o terapéuticas
Antecedentes de la invención
El sistema inmunitario es una red compleja de componentes celulares y humorales que actúan al unísono reconociendo sustancias extrañas y posiblemente peligrosas en el cuerpo y eliminándolas de una manera enormemente selectiva y controlada. En general, puede dividirse en sistemas inmunitarios innatos y adaptativos. El sistema inmunitario innato está codificado por la línea germinal y está diseñado para responder a los motivos conservados presentes en los patógenos. El sistema inmunitario adaptativo desarrolla su repertorio de especificidad antigénica a través de procesos de recombinación somática controlados y puede responder con una especificidad exquisita a una amplia variedad de tipos de antígenos. Se ha demostrado que la estimulación de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas es una estrategia eficaz para tratar o prevenir una amplia variedad de enfermedades en animales, en modelos de enfermedades animales y en seres humanos.
El éxito de las estrategias inmunomoduladoras para tratar o prevenir varias enfermedades infecciosas ha sido extraordinario. A pesar de ello, posiblemente hay muchas más enfermedades que podrían abordarse utilizando una estrategia basada en inmunoterapia. Sigue habiendo dos limitaciones críticas: (1) la sensibilización adecuada de las células inmunitarias innatas con las señales correctas suministradas en el momento óptimo y en proporciones óptimas para reforzar su función de manera segura al mismo tiempo que se proporciona un entorno adecuado para inducir una respuesta inmunitaria adaptativa y (2) la identificación del antígeno correcto o de la combinación de antígenos correcta a la que debe dirigirse la respuesta adaptativa.
Las estrategias actuales para estimular una respuesta inmunitaria dependen en gran medida de las mezclas de compuestos que se sabe que son inmunomoduladores de forma aislada. En la actualidad, los compuestos que se utilizan en la clínica son mezclas sin procesar de inmunoestimuladores, opcionalmente combinados con antígenos, que se ha determinado empíricamente que inducen respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, respectivamente. A pesar de casi un siglo de desarrollo, las estrategias convencionales solo han producido dos inmunoestimuladores aprobados por la FDA: (1) alumbre, que es una combinación de sales de aluminio y (2) monofosforil lípido A. Aunque el alumbre en particular tiene un impresionante historial de seguridad y eficacia en enfermedades infecciosas, cada vez está más claro que estos agentes no parecen ser suficientes para inducir respuestas inmunitarias eficaces para combatir enfermedades más complejas, tales como, entre otras, enfermedades causadas por patógenos intracelulares, cáncer, alergias y enfermedades alérgicas. Los esfuerzos para desarrollar nuevos inmunoestimuladores han fracasado en gran medida, principalmente debido a la falta de eficacia o por motivos de seguridad.
El sistema inmunitario evolucionó durante milenios para responder a patógenos tales como bacterias, virus, hongos y helmintos. En consecuencia, la mayoría de las células inmunitarias están optimizadas para reconocer, fagocitar, procesar, y después responder a, motivos presentes en los microorganismos y tienen receptores que están "sincronizados" con las proporciones que normalmente están presentes en estos organismos.
Sumario
La invención es como se define en las reivindicaciones 1 y 12 y abarca las realizaciones definidas en las reivindicaciones 2-11 y 13-14. Las realizaciones que quedan fuera del alcance de estas reivindicaciones se incluyen en este documento solo como referencia.
En el presente documento se describen ácidos nucleicos esféricos liposomales que funcionan como inmunomoduladores multivalentes. La invención se basa en una nanoestructura, que comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que los oligonucleótidos comprenden oligonucleótidos que contienen el motivo de CpG, en la que los oligonucleótidos están unidos indirectamente al núcleo liposomal a través de un enlazador, y en la que todos los oligonucleótidos tienen su extremo 5' expuesto a la superficie externa de la nanoestructura.
En algunas realizaciones, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que los oligonucleótidos forman una cubierta oligonucleotídica. En otras realizaciones, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que los oligonucleótidos forman una cubierta oligonucleotídica, en el que la cubierta oligonucleotídica comprende al menos un oligonucleótido modulador de receptores de reconocimiento patrón.
En algunas realizaciones, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que los oligonucleótidos forman una cubierta oligonucleotídica, en la que la cubierta oligonucleotídica comprende al menos un oligonucleótido modulador de receptores de reconocimiento patrón, en la que el oligonucleótido modulador de receptores de reconocimiento patrón es un agonista de TLR.
En otras realizaciones, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que los oligonucleótidos forman una cubierta oligonucleotídica, en la que la cubierta oligonucleotídica comprende al menos un oligonucleótido modulador de receptores de reconocimiento patrón, en la que el oligonucleótido modulador de receptores de reconocimiento patrón es un antagonista de TLR. En determinadas realizaciones, el TLR se selecciona del grupo que consiste en TLR3, TLR 7, TLR8, TLR9 y TLR13. En algunas realizaciones, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que los oligonucleótidos forman una cubierta oligonucleotídica, en la que la cubierta oligonucleotídica comprende al menos un oligonucleótido modulador de receptores de reconocimiento patrón, en la que el oligonucleótido modulador de receptores de reconocimiento patrón es un agonista de RIG-I.
En otras realizaciones, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que los oligonucleótidos forman una cubierta oligonucleotídica, en la que la cubierta oligonucleotídica comprende al menos un oligonucleótido modulador de receptores de reconocimiento patrón, en la que el oligonucleótido modulador de receptores de reconocimiento patrón es un antagonista de RIG-I. En algunas realizaciones, la cubierta oligonucleotídica comprende oligonucleótidos y una molécula transportadora. En otras realizaciones la cubierta oligonucleotídica comprende oligonucleótidos en su totalidad.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos están compuestos por oligonucleótidos de ADN monocatenario o bicatenario.
En otras realizaciones, los oligonucleótidos están compuestos por oligonucleótidos de ARN monocatenario o bicatenario.
En otras realizaciones, los oligonucleótidos están compuestos por oligonucleótidos de ARN-ADN quimérico.
En otras realizaciones, los oligonucleótidos están compuestos por combinaciones de oligonucleótidos de ADN, ARN monocatenario o bicatenario o de ARN-ADN quimérico.
En otra realización, los oligonucleótidos de la cubierta oligonucleotídica tienen oligonucleótidos estructuralmente idénticos.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos de la cubierta oligonucleotídica tienen al menos dos oligonucleótidos estructuralmente diferentes.
En otras realizaciones, los oligonucleótidos de la cubierta oligonucleotídica tienen 2-10 secuencias nucleotídicas diferentes.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen al menos un enlace fosforotioato.
En otras realizaciones, los oligonucleótidos no tienen un enlace fosforotioato.
En otra realización, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que los oligonucleótidos comprenden oligonucleótidos que contienen el motivo de CpG.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos que contienen CpG se seleccionan del grupo que consiste en oligonucleótidos de las clases A, B y C que contienen CpG.
En otra realización, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que los oligonucleótidos comprenden ARN inmunoestimulador monocatenario o bicatenario.
En algunas realizaciones, al menos un oligonucleótido tiene su extremo 5' expuesto a la superficie externa de la nanoestructura.
En otras realizaciones todos los oligonucleótidos tienen su extremo 5' expuesto a la superficie externa de la nanoestructura.
En otra realización, los oligonucleótidos están directamente unidos al núcleo liposomal.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos están indirectamente unidos al núcleo liposomal a través de un enlazador.
En otras realizaciones, los oligonucleótidos están indirectamente unidos al núcleo liposomal a través de más de un enlazador.
En otras realización, el enlazador es uno o más de los siguientes enlazadores: tocoferoles, esfingolípidos, tales como esfingosina, fosfato de esfingosina, esfingosinas y esfinganinas metiladas, ceramidas, fosfatos de ceramida, 1­ 0 acil ceramidas, dihidroceramidas, 2-hidroxi ceramidas, esfingomielina, esfingolípidos glicosilados, sulfátidos, gangliósidos, fosfoesfingolípidos y fitoesfingosinas de diversas longitudes y estados de saturación y sus derivados, fosfolípidos, tales como, fosfatidilcolinas, lisofosfatidilcolinas, ácidos fosfatídicos, ácidos lisofosfatídicos, LPA cíclico, fosfatidiletanolaminas, lisofosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, lisofosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, lisofosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatos de inositol, LPI, cardiolipinas, lisocardiolipinas, bis(monoacilglicero) fosfatos, (diacilglicero) fosfatos, lípidos de éter, lípidos de difitanil éter y plasmalógenos de diversas longitudes, estados de saturación, y sus derivados, esteroles, tales como, colesterol, desmosterol, estigmasterol, lanosterol, latosterol, diosgenina, sitosterol, zimosterol, zimostenol, 14-desmetil-lanosterol, sulfato de colesterol, DHEA, sulfato de DHEA, 14-desmetil-14-deshidrolanosterol, sitostanol, campesterol, lípidos aniónicos de éter, lípidos catiónicos de éter, lípidos quelantes del lantánidos, oxiesteroles sustituidos en el anillo A, oxiesteroles sustituidos en el anillo B, oxiesteroles sustituidos en el anillo D, oxiesteroles sustituidos en la cadena lateral, oxiesteroles de doble sustitución, derivados del ácido colestanoico, esteroles fluorados, esteroles fluorescentes, esteroles sulfonados, esteroles fosforilados, esteroles poliinsaturados de diferentes longitudes, estados de saturación, ácidos grasos saturados en C8-C22, derivados de éter de glicerol saturados en C8-C22, derivados de ácidos grasos de amida saturados e insaturados en C8-C22 y mono y 1,2 o 1,3-di-amino gliceroles y sus derivados.
En otra realización, los oligonucleótidos comprenden 2-1.000 oligonucleótidos.
En algunas realizaciones, el núcleo liposomal comprende uno o más lípidos seleccionados de: esfingolípidos, tales como esfingosina, fosfato de esfingosina, esfingosinas y esfinganinas metiladas, ceramidas, fosfatos de ceramida, 1­ 0 acil ceramidas, dihidroceramidas, 2-hidroxi ceramidas, esfingomielina, esfingolípidos glicosilados, sulfátidos, gangliósidos, fosfoesfingolípidos y fitoesfingosinas de diversas longitudes y estados de saturación y sus derivados, fosfolípidos, tales como, fosfatidilcolinas, lisofosfatidilcolinas, ácidos fosfatídicos, ácidos lisofosfatídicos, LPA cíclico, fosfatidiletanolaminas, lisofosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, lisofosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, lisofosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatos de inositol, LPI, cardiolipinas, lisocardiolipinas, bis(monoacilglicero) fosfatos, (diacilglicero) fosfatos, lípidos de éter, lípidos de difitanil éter y plasmalógenos de diversas longitudes, estados de saturación, y sus derivados, esteroles, tales como, colesterol, desmosterol, estigmasterol, lanosterol, latosterol, diosgenina, sitosterol, zimosterol, zimostenol, 14-desmetil lanoesterol, sulfato de colesterol, DHEA, sulfato de DHEA, 14-desmetil-14-deshidrolanosterol, sitostanol, campesterol, lípidos aniónicos de éter, lípidos catiónicos de éter, lípidos quelantes del lantánidos, oxiesteroles sustituidos en el anillo A, oxiesteroles sustituidos en el anillo B, oxiesteroles sustituidos en el anillo D, oxiesteroles sustituidos en la cadena lateral, oxiesteroles de doble sustitución, derivados del ácido colestanoico, esteroles fluorados, esteroles fluorescentes, esteroles sulfonados, esteroles fosforilados y esteroles poliinsaturados de diferentes longitudes, estados de saturación, ácidos grasos saturados en C8-C22, derivados de éter de glicerol saturados en C8-C22 y derivados de ácidos grasos de amida saturados e insaturados en C8-C22 y mono y 1,2 o 1,3-di-amino gliceroles y sus derivados.
En otra realización, el núcleo liposomal comprende un tipo de lípido.
En algunas realizaciones, el núcleo liposomal comprende 2-10 lípidos diferentes.
En otras realizaciones, el inmunoestimulador se selecciona del grupo que consiste en monofosforil lípido A, lípido A de origen bacteriano, trehalosa 22:0, dimetildioctadecilamonio, Kdo2 lípido A, fosfatos de inositol incluyendo IP3(1,3,4), IP3(1,3,5), IP3(1,4,5), IPR(1,3,4,5), agonistas selectivos de receptores de LPA/S1P, PAF y análogos de PAF, liponucleótidos, LPA cíclico, ceramidas bioactivas, endocanabinoides, anandamidas, productos de la oxidación de los lípidos, diacilglicerol fosfato, lípidos de la membrana bacteriana, lípidos de N-acilglicina, lípidos de acilcarnitina, ácidos micólicos, extractos de lípidos de plantas, FSL-1, PAM3CSK4, HKLM, LPS, FLA-ST, imiquimod, resiquimod, C12-IE-DAP, agonistas de receptores de tipo Toll L18-MDP, agonistas de receptores NOD y agonistas de receptores inmunitarios proinflamatorios.
En otra realización, la nanoestructura comprende adicionalmente un antígeno.
En algunas realizaciones, el antígeno se mezcla junto con la nanoestructura.
En otras realizaciones, el antígeno está unido directamente a la cubierta oligonucleotídica.
En algunas realizaciones, el antígeno está unido indirectamente a la cubierta oligonucleotídica a través de un enlazador.
En otras realizaciones, el antígeno está unido directamente al núcleo liposomal.
En otra realización más, el antígeno está indirectamente unido al núcleo liposomal a través de un enlazador.
En otra realización, un conjugado antígeno-oligonucleótido está unido al núcleo liposomal a través de hibridación de oligonucleótidos.
En algunas realizaciones, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que el inmunoestimulador está asociado con el núcleo liposomal embebiéndose dentro del núcleo liposomal.
En otras realizaciones, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que el inmunoestimulador está asociado con el núcleo liposomal al estar unido indirectamente al núcleo liposomal.
En algunas realizaciones, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que el inmunoestimulador está asociado con el núcleo liposomal al estar unido directamente al núcleo liposomal.
En algunas realizaciones, la nanoestructura comprende un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en la que un inmunoestimulador o un inmunosupresor está asociado con la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en la que los oligonucleótidos forman una cubierta oligonucleotídica, en la que los oligonucleótidos de la cubierta oligonucleotídica está orientados radialmente hacia afuera.
En otras realizaciones, el enlazador se selecciona del grupo que consiste en tocoferoles, esfingolípidos, tales como esfingosina, fosfato de esfingosina, esfingosinas y esfinganinas metiladas, ceramidas, fosfatos de ceramida, 1-0 acil ceramidas, dihidroceramidas, 2-hidroxi ceramidas, esfingomielina, esfingolípidos glicosilados, sulfátidos, gangliósidos, fosfoesfingolípidos y fitoesfingosinas de diversas longitudes y estados de saturación y sus derivados, fosfolípidos, tales como, fosfatidilcolinas, lisofosfatidilcolinas, ácidos fosfatídicos, ácidos lisofosfatídicos, LPA cíclico, fosfatidiletanolaminas, lisofosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, lisofosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, lisofosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatos de inositol, LPI, cardiolipinas, lisocardiolipinas, bis(monoacilglicero) fosfatos, (diacilglicero) fosfatos, lípidos de éter, lípidos de difitanil éter y plasmalógenos de diversas longitudes, estados de saturación, y sus derivados, esteroles, tales como, colesterol, desmosterol, estigmasterol, lanosterol, latosterol, diosgenina, sitosterol, zimosterol, zimostenol, 14-desmetil lanoesterol, sulfato de colesterol, DHEA, sulfato de DHEA, 14-desmetil-14-deshidrolanosterol, sitostanol, campesterol, lípidos aniónicos de éter, lípidos catiónicos de éter, lípidos quelantes del lantánidos, oxiesteroles sustituidos en el anillo A, oxiesteroles sustituidos en el anillo B, oxiesteroles sustituidos en el anillo D, oxiesteroles sustituidos en la cadena lateral, oxiesteroles de doble sustitución, derivados del ácido colestanoico, esteroles fluorados, esteroles fluorescentes, esteroles sulfonados, esteroles fosforilados y esteroles poliinsaturados de diferentes longitudes, estados de saturación, ácidos grasos saturados en C8-C22, derivados de éter de glicerol saturados en C8-C22, derivados de ácidos grasos de amida saturados e insaturados en C8-C22 y mono y 1,2 o 1, 3-di-amino gliceroles y sus derivados.
En algunas realizaciones, el antígeno se encapsula dentro del núcleo liposomal en una capa acuosa interna.
En otras realizaciones, el antígeno está unido al oligonucleótido de la cubierta oligonucleotídica mediante enlace no covalente.
En otras realizaciones, el antígeno se selecciona del grupo que consiste en un antígeno de cáncer, un antígeno bacteriano, un antígeno vírico, un antígeno parasitario, un hapteno y un alérgeno.
En algunas realizaciones, la nanoestructura es una nanoestructura autoensamblable.
Otro aspecto de la invención comprende una nanoestructura de ácido nucleico para su uso en medicina administrando dicha nanoestructura a un sujeto en una cantidad eficaz para promover una respuesta inmunitaria.
En una realización, el uso en medicina es en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno.
En otra realización, el trastorno es cáncer.
En algunas realizaciones, el trastorno es una enfermedad infecciosa.
En otras realizaciones la enfermedad infecciosa es una infección vírica.
En algunas realizaciones la enfermedad infecciosa es una infección bacteriana.
En otra realización, el trastorno es alergia.
En algunas realizaciones, el trastorno es asma.
En otra realización, el trastorno es una enfermedad autoinmunitaria.
Adicionalmente, algunas realizaciones comprenden administrar al sujeto un protocolo terapéutico.
En otra realización, el protocolo terapéutico es la cirugía.
En algunas realizaciones, el protocolo terapéutico es la radiación.
En otras realizaciones, el protocolo terapéutico es un medicamento.
En una realización, el método comprende adicionalmente administrar un adyuvante.
En una realización, la nanoestructura es para su uso en medicina, en la que la nanoestructura está asociada con una molécula selectiva.
En una realización, la nanoestructura es para su uso en medicina, en la que la nanoestructura se suministra por una vía seleccionada del grupo que consiste en la vía oral, nasal, sublingual, intravenosa, subcutánea, mucosa, respiratoria, directa, enema y dérmica.
En otro aspecto, la composición para su uso en el tratamiento de enfermedades, comprende la nanoestructura de ácido nucleico y sus realizaciones.
Cada una de las limitaciones de la invención puede abarcar varias realizaciones de la invención. Por lo tanto, se espera que cada una de las limitaciones de la invención, que implique uno cualquiera del elemento o combinaciones de elementos, pueda incluirse en cada uno de los aspectos de la invención. La aplicación de la presente invención no está limitada a los detalles de la construcción y de la disposición de los componentes establecidos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención puede tener otras realizaciones y puede practicarse o llevarse a cabo de varias maneras. Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los apartados de Descripción Detallada, Ejemplos, Reivindicaciones y Figuras que se adjuntan. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
No se pretende que los dibujos adjuntos estén dibujados a escala. En los dibujos, cada componente idéntico o casi idéntico que se ilustra en varias figuras, se representa con un número similar. Por razones de claridad, en cada dibujo no puede marcarse cada componente. En los dibujos:
La Figura 1 muestra una estructura general de una nanoestructura liposomal a modo de ejemplo de la invención para el suministro conjunto de inmunoestimuladores oligonucleotídicos y lipófilos. La nanoestructura incluye: (1) un núcleo liposomal, que contiene inmunoestimuladores lipófilos (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, entre otros) unidos a, y posiblemente embebidos en, la bicapa lipídica, y (2) una cubierta oligonucleotídica, que tiene una doble función, ya que ayuda a dirigir toda la construcción a las células inmunitarias y también actúa estimulando a receptores inmunitarios que pueden reconocer a ácidos nucleicos (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, TLR13, RIG-I, entre otros).
La Figura 2 muestra una estructura general de otra nanoestructura liposomal a modo de ejemplo conjugada con antígeno para el suministro conjunto de inmunoestimuladores oligonucleotídicos y lipófilos y antígeno. La construcción es similar a la que se muestra en la Figura 1, pero incluye una modificación adicional por la cual un oligonucleótido conjugado con antígeno se une mediante enlace no covalente a la estructura precursora. El antígeno se conjuga con el ANE (ácido nucleico esférico) liposomal a través de interacciones con la cubierta oligonucleotídica.
La Figura 3 muestra otra estructura general de una nanoestructura liposomal a modo de ejemplo conjugada con antígeno para el suministro conjunto de inmunoestimuladores oligonucleotídicos y lipófilos y antígeno. El antígeno también puede estar encapsulado en el núcleo liposomal.
La Figura 4 es un gráfico que muestra que la estimulación tanto de TLR4 como de TLR9 mediante nanoestructuras liposomales induce mayor activación que cualquiera de ellos aislado. Las nanoestructuras liposomales que transportan agonistas tanto de TLR4 como de TLR9, inducen mayor activación de las células RAW Blue que cualquiera de ellos solo, aislado.
Las Figuras 5A-5B son un conjunto de gráficos de barras que muestran que la activación de NF-kB mediante MPLA (monomonofosforil lípido A) depende de TLR4 funcional. La activación de NF-kB mediante ANE liposomales que contenían MPLA dependía de TLR4 funcional, ya que la línea celular RAW Blue (Figura 5A), pero no la línea celular Ramos Blue (Figura 5B), demostró activación de NF-kB en respuesta a la estimulación. ANOVA unidireccional ****p< 0,0001, ***p< 0,001, ** p< 0,01.
Las Figuras 6A-6B son un conjunto de gráficos de barras que muestran que el suministro conjunto de nanoestructuras de motivos de CpG y MPLA, activa de manera óptima las rutas tanto dependientes como independientes de MyD88. Las nanoestructuras liposomales que suministran tanto CpG 1826 como MPLA en una sola construcción, demuestran que no pueden duplicarse niveles elevados de TNF (Figura 6A) y de IFN-alfa (Figura 6B) suministrando cada uno de ellos aislado, o suministrando ambos componentes en el mismo pocillo pero no en la misma construcción. ANOVA, **p< 0,01, ****p< 0,0001.
Las Figuras 7A-7B son un conjunto de gráficos de barras que muestran que el suministro de MPLA mediante la nanoestructura liposomal, mejora la activación de NF-kB incluso sin el motivo de CpG. La figura 7A muestra la activación de NF-kB y la figura 7B muestra la de TNF (DO). ANOVA unidireccional ****p< 0,0001.
La Figura 8 es un gráfico que muestra que el aumento del suministro de MPLA en la formulación de nanoestructuras por encima de 3,8 % pero no más allá de 7,7 % mejora la actividad. En la línea celular RAW Blue, se observó que al aumento del suministro de MPLA hasta 7,7% de MPLA pero no hasta 11,5 % aumentaba la fuerza de activación del ANE liposomal.
La Figura 9 es un conjunto de gráficos que muestran que los enlaces de fosforotioato (PS) aumentan la fuerza pero no la estimulación máxima en células inmunitarias murinas al 11,5 % de MPLA (panel superior) o al 7,7 % de MPLA (panel inferior). En las células RAW Blue, se observó un cambio en la fuerza de las nanoestructuras liposomales pero no en la estimulación máxima, aunque se espera que esto dependa de la especie.
La Figura 10 es un gráfico que muestra nanoestructuras liposomales conjugadas con antígeno que demuestran la activación de células inmunitarias.
La Figura 11 es un gráfico que muestra que las nanoestructuras inducen respuestas celulares más eficazmente que el oligo y alumbre exentos de PS. Los días 0 y 21, se inmunizaron ratones C57BL/6 (N=4/grupo) con las formulaciones indicadas, utilizando ovoalbúmina como antígeno modelo. El día 28, los esplenocitos se recogieron y se incubaron durante una noche en placas ELISPOT IFN-y, con OVA(257-264) 1 uM. La cantidad de manchas de IFN-y se cuantificó utilizando un contador ELISPOT automatizado. *p< 0,05, NS=no significativo. La Figura 12 es un gráfico que muestra que las nanoestructuras huecas con antígeno reducen las tasas de crecimiento tumoral. Se inocularon ratones C57BL/6 (N=10/grupo) con 1x106 células E.G7-OVA el día 0 y después se trataron con los compuestos indicados los días 3, 7, 10.
Descripción detallada de determinadas realizaciones
Los receptores de tipo Toll (TLR, del inglés Toll-like receptora) son una familia de receptores de reconocimiento de patrones (PRR, del inglés pattern recognition receptora) que desencadenan la activación de células inmunitarias innatas, promoviendo sus funciones efectoras y puenteando la inmunidad innata y adaptativa. Los agentes que estimulan los TLR se están investigando exhaustivamente como posibles compuestos terapéuticos y profilácticos debido al papel central que desempeñan estos receptores en la coordinación de las respuestas inmunitarias. Similar a la forma en la que se estimulan múltiples TLR y receptores inmunitarios cuando una célula inmunitaria procesa un patógeno, se ha demostrado que la estimulación de TLR múltiples con compuestos múltiples puede producir una mayor eficacia. Sin embargo, el suministro eficaz de agonistas de TLR múltiples en combinación puede ser bastante difícil por varias razones: 1) a menudo se observa sinergia solo en una ventana estrecha de proporciones de concentración fijas entre los dos compuestos, debido a sus valores de CI50 o CE50 normalmente diferentes, 2) diferentes propiedades fisicoquímicas tales como diferentes tamaños, carga e hidrofobicidad, puede hacer que unirlos entre sí sea difícil o hacer que tengan propiedades PK/PD/ADME drásticamente diferentes, (3) los niveles tóxicos de los compuestos tienden a ser diferentes y (4) los receptores diana de uno o más de los diferentes compuestos pueden ser inaccesibles, tales como el citosol, o estar ubicados en un compartimento degradativo, tal como los endosomas o los lisosomas.
Según la invención, se ha desarrollado una nueva clase de nanoestructuras que tienen una actividad inmunomoduladora inesperadamente alta. Estas nanoestructuras son ensamblajes supramoleculares, que son ácidos nucleicos esféricos liposomales (a veces denominados ANE) inmunomoduladores. Estas nanoestructuras pueden suministrar a las células combinaciones de materiales inmunomoduladores de una manera enormemente controlada desde el punto de vista espaciotemporal (en las Figuras 1-3 se muestran ejemplos). Una característica distintiva de estas nanoestructuras es la incorporación de materiales inmunomoduladores tanto dentro de la cubierta externa como dentro del núcleo, que trabajan al unísono para obtener efectos inmunomoduladores inesperados en cuando a la magnitud y a la calidad de la respuesta inmunitaria. Estos efectos inmunomoduladores no pueden obtenerse suministrando los materiales individualmente ni en combinación aunque no estén asociados físicamente entre sí en la misma construcción. Según la invención, se ha demostrado que el ensamblaje de todos los componentes en una sola estructura es vital para obtener efectos óptimos (en las figuras 6-7 se muestran datos).
Además de lo anterior, también se desarrolló un método para realizar el suministro conjunto de antígeno con las estructuras inmunomoduladoras multivalentes (en las Figuras 2-3 se ilustran ejemplos). Esto permite que estas construcciones suministren señales tanto antigénicas como coestimuladoras para puentear la inmunidad innata y adaptativa para inducir respuestas inmunitarias contundentes contra varias enfermedades (aplicación estimuladora) o para provocar una tolerancia específica de antígeno al suministrar antígeno en ausencia de coestimulación, logrado por la falta de una señal estimuladora o por el bloqueo de la señalización inmunitaria con moléculas antagonistas, lo que conduce a anergia en células efectoras o a inducción de linfocitos T reguladores (aplicación reguladora).
Actualmente, los métodos utilizados en la clínica para inducir efectos inmunológicos generalmente se dividen en dos categorías: 1) compuestos que activan o potencian las respuestas inmunitarias, tales como vacunas y adyuvantes, agonistas de molécula pequeña de receptores de tipo Toll, tales como imiquimod y resiquimod, u oligonucleótidos tales como ISS 1018 (Dynavax Technologies Corporation), entre algunos otros y 2) compuestos que actúan reduciendo respuestas inmunitarias no deseadas, tales como corticosteroides, ciclosporina y tracolimus. Estos compuestos tienen limitaciones significativas conocidas por los expertos en la materia.
En general, los intentos de inmunoestimulación en la técnica anterior se han visto limitados por la falta de capacidad para activar respuestas inmunitarias celulares contundentes contra el antígeno diana, lo que conduce a errores en el desarrollo de vacunas eficaces y rentables para diversas enfermedades infecciosas, tales como VIH, tuberculosis, malaria, dengue, clamidia, y otras. De manera similar, varios compuestos de vacunas experimentales para el cáncer no han alcanzado su criterio de valoración primario en ensayos clínicos de fase tardía. Un desafío clave que aún no parece haberse resuelto satisfactoriamente, es una formulación de antígeno e inmunoestimulador que pueda conseguir resultados superiores. La nanoestructura de la invención consigue estos objetivos, produciendo la activación de respuestas celulares fuertes contra el antígeno in vivo con evidencia de reducción significativa (95 %) de carga tumoral (Figura 12).
La nanoestructura de la invención incluye: (1) un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, que contiene un inmunoestimulador embebido en, o unido a, la bicapa lipídica y (2) una capa de oligonucleótidos, que puede ser una cubierta oligonucleotídica, y que puede tener una doble función, ya que ayuda a dirigir la nanoestructura a las células inmunitarias y también actúa estimulando a receptores inmunitarios que pueden reconocer a ácidos nucleicos (Figura 1). A esta construcción también puede acoplarse un antígeno, de tal manera que se suministre junto con las señales coestimuladoras (Figura 2). Una construcción similar a la que se muestra en la Figura 1 experimenta una modificación adicional por la cual un oligonucleótido conjugado con antígeno se une a la nanoestructura. Como alternativa o adicionalmente un inmunoestimulador o antígeno soluble en agua puede encapsularse en el núcleo.
La nanoestructura de la invención incluye un núcleo liposomal. Un núcleo liposomal, como se usa en el presente documento, se refiere a un compartimento de núcleo, localizado en el centro, formado por un componente de los lípidos o fosfolípidos que forman una bicapa lipídica. Los “liposomas” son estructuras vesiculares de autocierre, artificiales, de varios tamaños y estructuras, en los que una o varias membranas encapsulan un núcleo acuoso. Lo más normalmente, las membranas de liposomas están formadas por membranas de bicapas lipídicas, en las que los grupos de cabeza hidrófila se orientan hacia el entorno acuoso y las cadenas de lípidos están embebidas en el núcleo lipófilo. Los liposomas pueden formarse también a partir de otras moléculas monoméricas y poliméricas anfifílicas, tales como polímeros, como copolímeros de bloque o polipéptidos. Las vesículas unilaminares son liposomas definidos por una sola membrana que encierra un espacio acuoso. Por el contrario, las vesículas oligo- o multilaminares están formadas por varias membranas. Normalmente, las membranas tienen un espesor de apenas 4 nm y están compuestas por lípidos anfifílicos, tales como fosfolípidos, de origen natural o sintético. Opcionalmente, las propiedades de la membrana pueden modificarse incorporando otros lípidos, tales como derivados de esteroles o ácido cólico.
La bicapa lipídica está compuesta por dos capas de moléculas lipídicas. En una capa, cada molécula lipídica está orientada sustancialmente en paralelo con respecto a las bicapas lipídicas adyacentes, y las dos capas que forman una bicapa tienen los extremos polares de sus moléculas expuestos a la fase acuosa y los extremos no polares adyacentes entre sí, como se muestra en los diagramas de las Figuras 1-3. La región acuosa central del núcleo liposomal puede estar vacía o cargada, total o parcialmente, con agua, emulsión acuosa, antígeno, inmunoestimulador, inmunosupresor u otro agente terapéutico o de diagnóstico.
"Lípido" se refiere a su sentido convencional como un término genérico que incluye grasas, lípidos, constituyentes solubles en alcohol-éter de protoplasma, que son insolubles en agua. Los lípidos normalmente constan de un resto hidrófilo y uno hidrófobo. En el agua, los lípidos pueden autoorganizarse para formar membranas de bicapa, en las que los restos hidrófilos (grupos de cabeza) se orientan hacia la fase acuosa y los restos lipófilos (cadenas de acilo) están embebidos en el núcleo de la bicapa. Los lípidos pueden comprender también dos restos hidrófilos (bolaanfifilos). En este caso, las membranas pueden estar formadas por una sola capa de lípidos y no por una bicapa. Son ejemplos típicos de lípidos en el presente contexto, las grasas, aceites grasos, aceites esenciales, ceras, esteroides, esteroles, fosfolípidos, glucolípidos, sulfolípidos, aminolípidos, cromolípidos y ácidos grasos. El término incluye lípidos tanto naturales como sintéticos. Los lípidos preferidos en relación con la presente invención son: esteroides y esterol, en particular colesterol, fosfolípidos, incluyendo fosfatidilo, fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas y esfingomielinas. En el caso de que haya ácidos grasos, podían ser cadenas de aproximadamente 12-24 carbonos de longitud, conteniendo hasta 6 dobles enlaces. Los ácidos grasos se unen a la cadena principal, que puede proceder de glicerol. En un lípido, los ácidos grasos pueden ser diferentes (asimétricos) o puede haber sólo 1 cadena de ácido graso, por ejemplo, lisolecitinas. También son posibles formulaciones mixtas, en particular cuando los lípidos no catiónicos proceden de fuentes naturales, tales como lecitinas (fosfatidilcolinas) purificadas de yema de huevo, corazón bovino, cerebro, hígado o soja.
El núcleo liposomal puede construirse a partir de uno o más lípidos conocidos por los expertos en la técnica, incluidos, pero sin limitación: esfingolípidos, tales como esfingosina, fosfato de esfingosina, esfingosinas y esfinganinas metiladas, ceramidas, fosfatos de ceramida, 1-0 acil ceramidas, dihidroceramidas, 2-hidroxi ceramidas, esfingomielina, esfingolípidos glicosilados, sulfátidos, gangliósidos, fosfoesfingolípidos y fitoesfingosinas de diversas longitudes y estados de saturación y sus derivados, fosfolípidos, tales como, fosfatidilcolinas, lisofosfatidilcolinas, ácidos fosfatídicos, ácidos lisofosfatídicos, LPA cíclico, fosfatidiletanolaminas, lisofosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, lisofosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, lisofosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatos de inositol, LPI, cardiolipinas, lisocardiolipinas, bis(monoacilglicero) fosfatos, (diacilglicero) fosfatos, lípidos de éter, lípidos de difitanil éter y plasmalógenos de diversas longitudes, estados de saturación, y sus derivados, esteroles, tales como, colesterol, desmosterol, estigmasterol, lanosterol, latosterol, diosgenina, sitosterol, zimosterol, zimostenol, 14-desmetil-lanosterol, sulfato de colesterol, DHEA, sulfato de DHEA, 14-desmetil-14-deshidrolanosterol, sitostanol, campesterol, lípidos aniónicos de éter, lípidos catiónicos de éter, lípidos quelantes del lantánidos, oxiesteroles sustituidos en el anillo A, oxiesteroles sustituidos en el anillo B, oxiesteroles sustituidos en el anillo D, oxiesteroles sustituidos en la cadena lateral, oxiesteroles de doble sustitución, derivados del ácido colestanoico, esteroles fluorados, esteroles fluorescentes, esteroles sulfonados, esteroles fosforilados y esteroles poliinsaturados de diferentes longitudes, estados de saturación, y sus derivados.
Un inmunoestimulador está asociado con la bicapa lipídica del núcleo lisosomal. Un inmunoestimulador, como se usa en el presente documento, es una sustancia que causa la estimulación del sistema inmunitario de tal manera que uno o más factores inmunitarios, es decir, citocinas, células inmunitarias, anticuerpos, quimiocinas, se inducen o activan. La respuesta inmunitaria puede comprender una respuesta celular y/o humoral. El inmunoestimulador puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña, un ácido nucleico, una proteína, o una combinación de los mismos. El inmunoestimulador también puede ser capaz de activar la expresión de moléculas inmunoestimuladoras en células de un microambiente localizado.
El inmunoestimulador incorporado en la bicapa puede ser una amplia variedad de moléculas, incluyendo, pero sin limitación: monofosforil lípido A, lípido A de origen bacteriano, trehalosa 22:0, dimetildioctadecilamonio, Kdo2 lípido A, fosfatos de inositol incluyendo IP3(1,3,4), IP3(1,3,5), IP3(1,4,5), IPR(1,3,4,5), agonistas selectivos de receptores de LPA/S1P, PAF y análogos de PAF, liponucleótidos, LPA cíclico, ceramidas bioactivas, endocanabinoides, anandamidas, productos de la oxidación de los lípidos, diacilglicerol fosfato, lípidos de la membrana bacteriana, lípidos de N-acilglicina, lípidos de acil-carnitina, ácidos micólicos, extractos de lípidos de plantas, FSL-1, PAM3CSK4, HKLM, LPS, FLA-ST, imiquimod, resiquimod, C12-IE-DAP, L18-MDP y otros compuestos conocidos por los expertos en la técnica que puedan estimular a receptores de tipo Toll, receptores NOD y otros receptores inmunitarios proinflamatorios que serían productivos para inducir una respuesta inmunitaria.
El inmunoestimulador está asociado con el núcleo lisosomal. Puede asociarse con él embebiéndose dentro del núcleo o puede unirse o ligarse, bien indirectamente (es decir, mediante enlace no covalente o covalente, a través de otras moléculas tales como enlazadores) o directamente (es decir, mediante enlace covalente).
La nanoestructura de la invención también incluye un oligonucleótido que es, preferentemente, un oligonucleótido terapéutico. Un oligonucleótido, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula que contenga ácido nucleico. El ácido nucleico puede ser ADN, ARN, APN, ANB, ANE o combinaciones o modificaciones de los mismos. También puede ser mono-, bi- o tricatenario. Un oligonucleótido terapéutico es un oligonucleótido que puede funcionar como un agente terapéutico o de diagnóstico.
Los oligonucleótidos se colocan en el exterior del núcleo liposomal. Al menos un oligonucleótido está en el exterior. En algunas realizaciones, al menos 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1.000 oligonucleótidos, o cualquier intervalo de combinación de los mismos, están en el exterior del núcleo liposomal. En algunas realizaciones, en la superficie hay 1-1000, 10-500, 50-250 o 50-300 oligonucleótidos. En algún caso, los oligonucleótidos forman una cubierta oligonucleotídica. Se forma una cubierta oligonucleotídica cuando al menos el 50 % del área superficial disponible de la superficie exterior del núcleo liposomal incluye un oligonucleótido. E algunas realizaciones al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 % o 99 % del área superficial disponible de la superficie exterior del núcleo liposomal incluye un oligonucleótido. Los oligonucleótidos de la cubierta oligonucleotídica pueden orientarse en varias direcciones. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos están orientados radialmente hacia afuera.
Los oligonucleótidos pueden estar unidos al núcleo o entre sí y/o a otras moléculas, tales como antígenos, ya sea directa o indirectamente a través de un enlazador. Los oligonucleótidos pueden conjugarse con un enlazador a través del extremo 5' o del extremo 3'. Por ejemplo [Secuencia, 5'-3']-Enlazador o Enlazador-[Secuencia, 5'-3']. Algunos o todos los oligonucleótidos de la nanoestructura pueden estar unidos entre sí ya sea directa o indirectamente a través de un enlace covalente o no covalente. El enlace de un oligonucleótido con otro oligonucleótido puede ser adicional a, o alternativamente al enlace de ese oligonucleótido con el núcleo liposomal. Uno o más de los oligonucleótidos también pueden unirse a otras moléculas, tales como un antígeno. Los oligonucleótidos pueden unirse al antígeno del núcleo ya sea directa o indirectamente a través de un enlace covalente o no covalente.
Las cubierta oligonucleotídica puede ser una amplia variedad de moléculas, incluyendo, pero sin limitación: desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y otros oligonucleótidos monocatenarios, desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y otros oligonucleótidos bicatenarios, oligonucleótidos triplex, que incorporan desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos u oligonucleótidos. En otra realización, uno o una multiplicidad de oligonucleótidos diferentes, están presentes en la misma superficie de una sola nanoestructura liposomal.
La cubierta oligonucleotídica puede estar anclada a la superficie del núcleo liposomal a través de la conjugación con una o una multiplicidad de moléculas enlazadoras que incluyen, pero sin limitación: tocoferoles, esfingolípidos, tales como esfingosina, fosfato de esfingosina, esfingosinas y esfinganinas metiladas, ceramidas, fosfatos de ceramida, 1­ 0 acil ceramidas, dihidroceramidas, 2-hidroxi ceramidas, esfingomielina, esfingolípidos glicosilados, sulfátidos, gangliósidos, fosfoesfingolípidos y fitoesfingosinas de diversas longitudes y estados de saturación y sus derivados, fosfolípidos, tales como, fosfatidilcolinas, lisofosfatidilcolinas, ácidos fosfatídicos, ácidos lisofosfatídicos, LPA cíclico, fosfatidiletanolaminas, lisofosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, lisofosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, lisofosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatos de inositol, LPI, cardiolipinas, lisocardiolipinas, bis(monoacilglicero) fosfatos, (diacilglicero) fosfatos, lípidos de éter, lípidos de difitanil éter y plasmalógenos de diversas longitudes, estados de saturación, y sus derivados, esteroles, tales como, colesterol, desmosterol, estigmasterol, lanosterol, latosterol, diosgenina, sitosterol, zimosterol, zimostenol, 14-desmetil-lanosterol, sulfato de colesterol, DHEA, sulfato de DHEA, 14-desmetil-14-deshidrolanosterol, sitostanol, campesterol, lípidos aniónicos de éter, lípidos catiónicos de éter, lípidos quelantes del lantánidos, oxiesteroles sustituidos en el anillo A, oxiesteroles sustituidos en el anillo B, oxiesteroles sustituidos en el anillo D, oxiesteroles sustituidos en la cadena lateral, oxiesteroles de doble sustitución, derivados del ácido colestanoico, esteroles fluorados, esteroles fluorescentes, esteroles sulfonados, esteroles fosforilados y esteroles poliinsaturados de diferentes longitudes, estados de saturación, y sus derivados. El oligonucleótido puede ser un ácido nucleico que interacciona con una molécula o complejo de moléculas que, cuando se estimula, produce una respuesta inmunitaria en respuesta a esa interacción. La molécula o complejo de moléculas puede ser un receptor. En algunas realizaciones, el oligonucleótido puede ser un oligonucleótido modulador de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Los PRR son una parte primitiva del sistema inmunitario compuesta por proteínas expresadas por células del sistema inmunitario innato que identifican patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, del inglés pathogen-associated molecular patterns), que están asociados con patógenos microbianos o estrés celular, así como patrones moleculares asociados al daño (DAMP, del inglés damage-associated molecular patterns), que están asociados con componentes celulares liberados durante el daño celular. Los PRR incluyen, pero sin limitación, PRR unidos a la membrana, tales como cinasas receptoras, receptores de tipo Toll (TLR) y receptores de lectina de tipo C (CLR, del inglés C-type lectin Receptora) (receptores de manosa y receptores de asialoglicoproteína); PRR citoplasmáticos, tales como receptores de tipo RiG-I (RLR, del inglés RIG-I-like receptors), ARN helicasas, PRR de plantas y cinasas No RD; y PRR secretados. Los oligonucleótidos moduladores de PRR incluyen, pero sin limitación, agonistas de TLR, agonistas o antagonistas de RIG-I, factores de transcripción, maquinaria de traducción celular, maquinaria de transcripción celular, enzimas que actúan sobre los ácidos nucleicos y autoantígenos asociados a los ácidos nucleicos. Un ejemplo de esta realización es el uso de motivos de 5'-citosina-fosfato-guanosina-3' (CpG, del inglés cytosine-phosphate-guanosine) no metilados. Otro es el uso de los motivos 5-UUG-3' o 5-UUA-3'. Otro más es el uso de ARN bicatenario largo.
Un agonista de TLR, como se usa en el presente documento, es una molécula de ácido nucleico que interacciona con, y estimula, la actividad de un TLR. Los receptores de tipo Toll (TLR) son una familia de polipéptidos enormemente conservados que juegan un papel crítico en la inmunidad innata en mamíferos. Se han identificado al menos diez miembros de la familia, denominados TLR1 - TLR10. Los dominios citoplasmáticos de los diversos TLR se caracterizan por un dominio receptor de tipo Toll de interleucina 1 (IL-1) (TIR, del inglés Toll-interleukin 1 receptô ). Medzhitov R et al. (1998) Mol Cell 2:253-8. El reconocimiento de la invasión microbiana por los TLR desencadena la activación de una cascada de señalización que se conserva evolutivamente en Drosophila y mamíferos. Se ha informado de que en los TLR, la proteína adaptadora que contiene el dominio TIR, MyD88, se asocia con los TLR y acumula cinasa asociada al receptor de IL-1 (IRAK, del inglés IL-1 receptor-associated kinase) y factor 6 asociado con el receptor del factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés tumor necrosis factor) (TRAF6, del inglés TNF receptor-associated factor 6). Se cree que la ruta de señalización dependiente de MyD88 conduce a la activación de factores de transcripción NF-KB y de proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPK, del inglés mitogen-activated protein kinases), cinasa c-Jun NH2 terminal (Jnk, del inglés c-Jun NH2 terminal kinase), etapas críticas en la activación inmunitaria y en la producción de citocinas inflamatorias. Para una revisión, véase Aderem A et al. (2000) Nature 406:782-87.
Se cree que los TLR se expresan diferencialmente en varios tejidos y en varios tipos de células inmunitarias. Por ejemplo, se ha informado que el TLR7 humano se expresa en la placenta, en el pulmón, en el bazo, en los ganglios linfáticos, en la amígdala y en células dendríticas plasmacitoides (pDC, del inglés plasmacytoid dendritic cells) precursoras. Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8); Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9. Se ha informado que el TLR8 humano se expresa en el pulmón, en leucocitos de sangre periférica (PBL, del inglés penpheral blood leukocytes), en la placenta, en el bazo, en los ganglios linfáticos y en monocitos. Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9; Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8. Según se informa, el TLR9 humano se expresa en el bazo, en los ganglios linfáticos, en la médula ósea, en PBL y en pDC y en linfocitos B. Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9; Bauer S et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:9237-42; Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8.
Se conocen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del TLR7 humano y murino. Véanse, por ejemplo, los n.° de referencia de GenBank AF240467, AF245702, NM_016562, AF334942, NM_133211; y AAF60188, AAF78035, NP_057646, AAL73191 y AAL73192, incorporándose el contenido de todos ellos en el presente documento por referencia. Se informa que el TLR7 humano tiene una longitud de 1049 aminoácidos. Se informa que el TLR7 murino tiene una longitud de 1050 aminoácidos. Los polipéptidos de TLR7 incluyen un dominio extracelular que tiene una región de repetición rica en leucina, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que incluye un dominio TIR.
Se conocen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del TLR8 humano y murino. Véanse, por ejemplo, los n.° de referencia de GenBank AF246971, AF245703, NM_016610, XM_045706, AY035890, NM_133212; y AAF64061, AAF78036, NP_057694, XP_045706, AAK62677 y NP_573475, incorporándose el contenido de todos ellos en el presente documento por referencia. Se informa que el TLR8 humano existe en al menos dos isoformas, una de 1041 aminoácidos de longitud y la otra de 1059 aminoácidos de longitud. El TLR8 murino tiene una longitud de 1032 aminoácidos. Los polipéptidos de TLR8 incluyen un dominio extracelular que tiene una región de repetición rica en leucina, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que incluye un dominio TIR.
Se conocen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de TLR9 humano y murino. Véanse, por ejemplo, los n.° de referencia de GenBank NM_017442, AF259262, AB045180, AF245704, AB045181, AF348140, AF314224, NM_031178; y NP_059138, AAF72189, BAB19259, AAF78037, BAB19260, AAK29625, AAK28488 y NP_112455, incorporándose el contenido de todos ellos en el presente documento por referencia. Se informa que el TLR9 humano existe en al menos dos isoformas, una de 1032 aminoácidos de longitud y la otra de 1055 aminoácidos de longitud. El TLR9 murino tiene una longitud de 1032 aminoácidos. Los polipéptidos de TLR9 incluyen un dominio extracelular que tiene una región de repetición rica en leucina, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que incluye un dominio TIR.
Como se usa en el presente documento, la expresión "señalización de TLR" se refiere a cualquier aspecto de señalización intracelular asociada con la señalización a través de un TLR. Como se usa en el presente documento, la expresión "respuesta inmunitaria mediada por TLR" se refiere a la respuesta inmunitaria que está asociada con la señalización de TLR. El nivel de señalización de TLR puede mejorarse sobre un nivel de señalización preexistente o puede inducirse sobre un nivel de señalización de fondo.
Una respuesta inmunitaria mediada por TLR3 es una respuesta asociada con la señalización de TLR3. Los agonistas de TLR3 incluyen, pero sin limitación, ARNbc, tal como ARNbc que tiene múltiples motivos de AU.
Una respuesta inmunitaria mediada por TLR7 es una respuesta asociada con la señalización de TLR7. La respuesta inmunitaria mediada por TLR7 se caracteriza generalmente por la inducción de citocinas inducibles por IFN-a e IFN, tales como IP-10 e I-TAC. Los niveles de citocinas IL-1 a/p, IL-6, IL-8, MIP-1a/p y MIP-3a/p inducidos en una respuesta inmunitaria mediada por TLR7 son menores que los inducidos en una respuesta inmunitaria mediada por TLR8. Los ligandos de TLR7 incluyen, sin limitación, análogos de guanosina tales como guanosinas C8 sustituidas, mezclas de ribonucleósidos que consisten esencialmente en G y U, ribonucleótidos de guanosina y moléculas de ARN o similares a ARN (PCT/US03/10406) y compuestos basados en adenosina (por ejemplo, 6-amino-9-bencil-2-(3-hidroxi-propoxi)-9H-purin-8-ol, y compuestos similares fabricados por Sumitomo (por ejemplo, CL-029)).
Como se usa en el presente documento, la expresión "análogos de guanosina" se refiere a un nucleótido similar a la guanosina (excluyendo la guanosina) que tiene una modificación química que implica la base de guanina, el azúcar del nucleósido de guanosina, o tanto la base de guanina como el azúcar del nucleósido de guanosina. Los análogos de guanosina incluyen específicamente, sin limitación, 7-deaza-guanosina.
Los análogos de guanosina incluyen además guanosinas sustituidas en C8, tales como 7-tia-8-oxoguanosina (inmunosina), 8-mercaptoguanosina, 8-bromoguanosina, 8-metilguanosina, 8-oxo-7,8-dihidroguanosina, C8-arilamino-2'-desoxiguanosina, C8-propinil-guanosina, ribonucleósidos de guanina sustituida en C8 y N7, tales como 7-alil-8-oxoguanosina (loxorribina) y 7-metil-8-oxoguanosina, 8-aminoguanosina, 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina, 8-hidroxiguanosina y guanosina 7-deaza 8-sustituida.
Una respuesta inmunitaria mediada por TLR8 es una respuesta asociada con la señalización de TLR8. Esta respuesta se caracteriza además por la inducción de citocinas proinflamatorias tales como IFN-y, IL-12p40/70, TNFa, IL-1a/p, IL-6, IL-8, MIP-1 a/p y MIP-3 a/p. Los ligandos de TLR8 incluyen mezclas de ribonucleósidos que consisten esencialmente en G y U, ribonucleótidos de guanosina y moléculas de ARN o similares a ARN (PCT/US03/10406). En Gorden et al. J. Immunol. 2005, 174:1259-1268, también se desvelan ligandos de TLR8 adicionales.
Como se usa en el presente documento, un "agonista de TLR7/8" se refiere en su conjunto a cualquier ácido nucleico que sea capaz de aumentar la señalización de TLR7 y/o TLR8 (es decir, un agonista de TLR7 y/o TLR8). Algunos ligandos de TLR7/8 solo inducen la señalización de TLR7 (por ejemplo, agonistas específicos de TLR7), algunos solo inducen la señalización de TLR8 (por ejemplo, agonistas específicos de TLR8), y otros inducen la señalización tanto de TLR7 como de TLR8.
Una respuesta inmunitaria mediada por TLR9 es una respuesta asociada con la señalización de TLR9. Esta respuesta se caracteriza además al menos por la producción/secreción de IFN-y e IL-12, aunque a niveles más bajos en comparación con los obtenidos a través de una respuesta inmunitaria mediada por TLR8. Como se usa en el presente documento, la expresión "agonista de TLR9" se refiere a cualquier agente que sea capaz de aumentar la señalización de TLR9 (es decir, un agonista de TLR9). Los agonistas de TLR9 incluyen específicamente, sin limitación, ácidos nucleicos inmunoestimuladores, y en particular, ácidos nucleicos inmunoestimuladores con CpG. "Ácidos nucleicos CpG inmunoestimuladores" u "oligonucleótidos CpG inmunoestimuladores" se refiere a cualquier ácido nucleico que contiene CpG que es capaz de activar una célula inmunitaria. Al menos la C del dinucleótido CpG está normalmente, pero no necesariamente, sin metilar. Los ácidos nucleicos CpG inmunoestimuladores se describen en diversas patentes emitidas y en solicitudes de patente publicadas, incluyendo las patentes de Estados Unidos n.° 6.194.388; 6.207.646; 6.218.371; 6.239.116; 6.339.068; 6.406.705; y 6.429.199.
Una respuesta inmunitaria mediada por TLR13 es una respuesta asociada con la señalización de TLR13. Un agonista de TLR13 es el ARNr 23S bacteriano.
Los oligonucleótidos también pueden ser agonistas o antagonistas del gen-I inducible por ácido retinoico (RIG-I, del inglés retinoic acid inducible gene-!). RIG-I corresponde al n.° de referencia de GenBank AF038963. Los agonistas de RIG-I incluyen, pero sin limitación, ARNbc, tal como Poli(I:C). Los antagonistas de RIG-I incluyen ADN o ARN corto de 5' trifosfato.
Un "oligonucleótido inmunoestimulador" es cualquier ácido nucleico (ADN o ARN) que contiene un motivo inmunoestimulador o una cadena principal inmunoestimuladora que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. Una inducción de una respuesta inmunitaria se refiere a cualquier aumento en el número o actividad de una célula inmunitaria, o un aumento en la expresión o niveles absolutos de un factor inmunitario, tal como una citocina. Las células inmunitarias incluyen, pero sin limitación, linfocitos NK, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos B, células dendríticas, macrófagos y otras células presentadoras de antígeno. La citocinas incluyen, pero sin limitación, interleucinas, TNF-a, IFN-a,p y y, ligando Flt y moléculas coestimuladoras. Los motivos inmunoestimuladores incluyen, pero sin limitación, motivos de CpG y motivos ricos en T.
Un conjunto no limitante de oligonucleótidos inmunoestimuladores incluye:
ARNbc:
poli(A:C) y poli(I:C)
ARNmc:
CCGUCUGUUGUGUGACUC (SEQ ID NO:4)
GCCACCGAGCCGAAGGCACC (SEQ ID NO:6)
UAUAUAUAUAUAUAUAUAUA (SEQ ID NO:7)
UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU (SEQ ID NO:8)
UUUUAUUUUAUUUUAUUUUA (SEQ ID NO:9)
UGUGUGUGUGUGUGUGUGUG(SEQ ID NO:10)
UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU (SEQ ID NO:11)
UUUGUUUGUUUGUUUGUUUG (SEQ ID NO:12)
UUAUUUAUUUAUUUAUUUAUUUAU (SEQ ID NO:13)
UUGUUUGUUUGUUUGUUUGUUUGU (SEQ ID NO:14)
GCCCGUCUGUUGUGUGACUC (SEQ ID NO:15)
GUCCUUCAAGUCCUUCAA (SEQ ID NO:16)
ADN:
GGTGCATCGATGCAGGGGGG (SEQ ID NO:5)
TCCATGGACGTTCCTGAGCGTT (SEQ ID NO:17)
TCGTCGTTCGAACGACGTTGAT (SEQ ID NO:18)
TCGTCGACGATCCGCGCGCGCG (SEQ ID NO:19)
GGGGTCAACGTTGAGGGGGG (SEQ ID NO:20)
TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO:21)
TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO:22)
GGGGGACGATCGTCGGGGGG (SEQ ID NO:23)
GGGGACGACGTCGTGGGGGGG (SEQ ID NO:24)
TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO:25)
TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT (SEQ ID NO:26)
Los términos "oligonudeótido" y "ácido nucleico" se utilizan indistintamente para dar a entender múltiples nucleótidos (es decir, moléculas que comprenden un azúcar (por ejemplo, ribosa o desoxirribosa) unidas a un grupo fosfato y a una base orgánica intercambiable, que puede ser una pirimidina sustituida ( por ejemplo, citosina (C), timidina (T) o uracilo (U)) o una purina sustituida (por ejemplo, adenina (A) o guanina (G)). Por lo tanto, los términos abarcan oligonucleótidos tanto de ADN como de ARN. Los términos también incluirán oligonucleósidos (es decir, un oligonucleótido menos el fosfato) y cualquier otro polímero que contenga una base orgánica. Los oligonucleótidos pueden obtenerse de fuentes de ácido nucleico existentes (por ejemplo, genómico o ADNc), pero son preferentemente sintéticos (por ejemplo, producidos por síntesis de ácido nucleico).
Los oligonucleótidos pueden ser monocatenarios (una cadena) o bicatenarios (dos cadenas). En el presente documento, un oligonucleótido bicatenario también se conoce como un dúplex. Los oligonucleótidos bicatenarios de la invención pueden comprender dos cadenas de ácido nucleico complementarias separadas.
Como se usa en el presente documento, "dúplex" incluye una o más moléculas de ácido nucleico bicatenario en el que las secuencias complementarias o las secuencias parcialmente complementarias están unidas entre sí por hidrógeno. Las secuencias complementarias pueden incluir una cadena en sentido y una cadena antisentido. La secuencia de nucleótidos antisentido puede ser idéntica o suficientemente idéntica a la del gen diana para mediar la inhibición efectiva del gen diana (por ejemplo, al menos aproximadamente 98 % idéntica, 96 % idéntica, 94 % idéntica, 90 % idéntica, 85 % idéntica, u 80 % idéntica) a la secuencia del gen diana.
Un oligonucleótido bicatenario puede ser bicatenario en toda su longitud, lo que significa que no tiene secuencias salientes monocatenarias y, por lo tanto, tiene extremos romos. En otras realizaciones, las dos cadenas del oligonucleótido bicatenario pueden tener diferentes longitudes produciendo uno o más salientes monocatenarios. Un oligonucleótido bicatenario de la invención puede contener emparejamientos erróneos y/o bucles o protuberancias. En algunas realizaciones, es bicatenario en al menos aproximadamente el 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la longitud del oligonucleótido. En algunas realizaciones, el oligonucleótido bicatenario de la invención contiene al menos o hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 emparejamientos erróneos.
Los oligonucleótidos asociados con la invención pueden modificarse, tal como en el resto de azúcar, el enlace fosfodiéster y/o la base. Como se usa en el presente documento, los “restos de azúcar" incluyen azúcares naturales, no modificados, incluyendo pentosa, ribosa y desoxirribosa, azúcares modificados y análogos de azúcar. Las modificaciones de los restos de azúcar pueden incluir el reemplazo de un grupo hidroxilo con un halógeno, un heteroátomo o un grupo alifático, y pueden incluir la funcionalización del grupo hidroxilo como, por ejemplo, un éter, una amina o un tiol.
La modificación de los restos de azúcar puede incluir 2'-O-metil nucleótidos, a los que se hace referencia como "metilados". En algunos ejemplos, los oligonucleótidos asociados con la invención solo pueden contener restos de azúcar modificados o no modificados, mientras que en otros ejemplos, los oligonucleótidos contienen algunos restos de azúcar que están modificados y otros que no lo están.
En algunos ejemplos, los nucleomonómeros modificados incluyen ribonucleótidos modificados con azúcar o en la cadena principal. Los ribonucleótidos modificados pueden contener una base no natural, tal como las uridinas o las citidinas modificadas en la posición 5', por ejemplo, 5'-(2-amino)propil uridina y 5'-bromo uridina; adenosinas y guanosinas modificadas en la posición 8, por ejemplo, 8-bromo guanosina; deaza nucleótidos, por ejemplo, 7-deazaadenosina; y nucleótidos N-alquilados, por ejemplo, N6-metil adenosina. Además, los ribonucleótidos modificados con azúcar pueden tener el grupo 2'-OH reemplazado por un grupo H, alcoxi (u OR), R o alquilo, halógeno, SH, SR, amino (tal como NH2, NHR, NR2,) o CN, en el que R es alquilo, alquenilo o alquinilo inferior. En algunas realizaciones, los ribonucleótidos modificados pueden tener el grupo fosfodiéster eonectado a los ribonucleótidos adyacentes reemplazados por un grupo modificado, tal como un grupo fosforotioato.
En algunos aspectos, las modificaciones de 2'-O-metilo pueden ser beneficiosas para reducir las respuestas de estrés celular indeseables, tal como la respuesta del interferón a los ácidos nucleicos bicatenarios. Los azúcares modificados pueden incluir D-ribosa, 2'-O-alquilo (incluyendo 2'-O-metilo y 2'-O-etilo), es decir, 2'-alcoxi, 2'-amino, 2'-S-alquilo, 2'-halo (incluyendo 2'-flúor), 2'-metoxietoxi, 2'-aliloxi (-OCH2CH=CH2), 2'-propargilo, 2'-propilo, etinilo, etenilo, propenilo y ciano y similares. El resto de azúcar también puede ser una hexosa.
El término “alquilo" incluye grupos alifáticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc.), grupos alquilo de cadena ramificada (isopropilo, terc-butilo, isobutilo, etc.), grupos cicloalquilo (alicíclicos) (ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo o ciclooctilo), grupos cicloalquilo sustituidos con alquilo, y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo. En algunas realizaciones, un alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada tiene 6 o menos átomos de carbono en su cadena principal (por ejemplo, C1-C6 para cadenas lineales, C3-C6 para cadenas ramificadas), y más preferentemente 4 o menos. Asimismo, los cicloalquilos preferidos tienen de 3 a 8 átomos de carbono en su estructura de anillo, y más preferentemente tienen 5 o 6 carbonos en la estructura de anillo. La expresión C1-C6 incluye grupos alquilo que contienen de 1 a 6 átomos de carbono.
A menos que se especifique de otro modo, el término alquilo incluye tanto "alquilos no sustituidos" como "alquilos sustituidos", el último de los cuales se refiere a restos alquilo que tienen sustituyentes seleccionados independientemente que reemplazan a un hidrógeno en uno o más carbonos de la cadena principal de hidrato de carbono. El término "alquenilo" incluye grupos alifáticos insaturados análogos en longitud y sustituciones posibles en los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un doble enlace. A menos que se especifique de otro modo, el término alquenilo incluye tanto "alquenilos no sustituidos" como "alquenilos sustituidos", el último de los cuales se refiere a restos alquenilo que tienen sustituyentes seleccionados independientemente que reemplazan a un hidrógeno en uno o más carbonos de la cadena principal de hidrato de carbono.
El término "base" incluye las bases heterocíclicas de purina y pirimidina conocidas, deazapurinas y análogos (incluidos los análogos heterocíclicos sustituidos, por ejemplo, aminoetoxi fenoxazina), derivados (por ejemplo, derivados de 1 -alquilo, 1-alquenilo, heteroaromáticos y 1 -alquinilo) y sus tautómeros. Los ejemplos de purinas incluyen adenina, guanina, inosina, diaminopurina y xantina y análogos (por ejemplo, 8-oxo-N6-metiladenina o 7-diazaxantina) y sus derivados. Las pirimidinas incluyen, por ejemplo, timina, uracilo y citosina, y sus análogos (por ejemplo, 5-metilcitosina, 5-metiluracilo, 5-(1-propinil)uracilo, 5-(1-propinil)citosina y 4,4-etanocitosina). Otros ejemplos de bases adecuadas incluyen bases no purínicas y no pirimidínicas, tales como 2-aminopiridina y triazinas.
En algunos aspectos, los nucleomonómeros de un oligonucleótido de la invención son nucleótidos de ARN, incluyendo nucleótidos de ARN modificados.
El término "nucleósido" incluye bases que están unidas mediante enlace covalente a un resto de azúcar, preferentemente ribosa o desoxirribosa. Los ejemplos de nucleósidos preferidos incluyen ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos. Los nucleósidos también incluyen bases unidas a aminoácidos o a análogos de aminoácidos que pueden comprender grupos carboxilo libres, grupos amino libres, o grupos protectores. En la técnica se conocen bien grupos protectores adecuados (véase P. G. M. Wuts y T. W. Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis”, 2a Ed., Wiley-Interscience, Nueva York, 1999).
Como se usa en el presente documento, el término "enlace" utilizado en el contexto de un enlace internucleotídico, incluye un resto fosfodiéster natural, no modificado (-O-(PO2)-O-) que se acopla mediante enlace covalente a nucleomonómeros adyacentes. Como se usa en el presente documento, la expresión "enlace sustitutivo" o "enlace modificado" o "enlace internucleotídico modificado" incluye cualquier análogo o derivado del grupo fosfodiéster nativo que acopla mediante enlace covalente nucleomonómeros adyacentes. Los enlaces sustitutos incluyen análogos de fosfodiéster, por ejemplo, fosforotioato, fosforoditioato y P-etioxifosfodiéster, P-etoxifosfodiéster, P-alquiloxifosfotriéster, metilfosfonato y enlaces que no contienen fósforo, por ejemplo, acetales y amidas. Dichos enlaces sustitutos se conocen en la técnica (por ejemplo, Bjergarde et al. 1991. Nucleic Acids Res. 19:5843; Caruthers et al. 1991. Nucleosides Nucleotides. 10:47). En determinadas realizaciones, se prefieren enlaces no hidrolizables, tales como enlaces de fosforotioato.
En algunos aspectos, los oligonucleótidos de la invención comprenden los extremos 3' y 5' (excepto los oligonucleótidos circulares). Los extremos 3' y 5' de un oligonucleótido pueden protegerse sustancialmente de las nucleasas, por ejemplo, modificando los enlaces 3' o 5' (por ejemplo, patente de Estados Unidos N.° 5.849.902 y documento WO 98/13526). Los oligonucleótidos pueden hacerse resistentes mediante la inclusión de un "grupo de bloqueo". La expresión "grupo de bloqueo", como se usa en el presente documento, se refiere a sustituyentes (por ejemplo, distintos de los grupos OH) que pueden unirse a oligonucleótidos o nucleomonómeros, como grupos protectores o grupos de acoplamiento para la síntesis (por ejemplo, FITC, propil (CH2-CH2-CH3), glicol (-O-CH2-CH2-O-) fosfato (PO32-), fosfonato de hidrógeno o fosforamidita). Los "grupos de bloqueo" también incluyen "grupos de bloqueo terminales" o "grupos de bloqueo de exonucleasas" que protegen los extremos 5' y 3' del oligonucleótido, incluidos los nucleótidos modificados y las estructuras no nucleotídicas resistentes a exonucleasas.
Los grupos de bloqueo terminales a modo de ejemplo incluyen estructuras en caperuza (por ejemplo, una caperuza de 7-metilguanosina), nucleomonómeros invertidos, por ejemplo, con inversiones 3'-3' o 5'-5' terminales (véase, por ejemplo, Ortiagao et al. 1992. Antisense Res. Dev. 2:129), metilfosfonato, fosforamidita, grupos no nucleotídicos (por ejemplo, enlazadores no nucleotídicos, enlazadores amino, conjugados) y similares. El nucleomonómero 3' terminal puede comprender un resto de azúcar modificado. El nucleomonómero 3' terminal comprende un 3'-O que puede estar opcionalmente sustituido con un grupo de bloqueo que impide degradación del oligonucleótido por la 3'-exonuclesa. Por ejemplo, el 3'-hidroxilo puede esterificarse a un nucleótido a través de un enlace internucleotídico 3 '^ 3'. Por ejemplo, el radical alquiloxi puede ser metoxi, etoxi o isopropoxi, y preferentemente, etoxi. Opcionalmente, el nucleótido enlazado 3 '^ 3' en el extremo 3' puede unirse mediante un enlace sustituto. Para reducir la degradación de las nucleasas, el enlace 5' más 3 '^ 5' puede ser un enlace modificado, por ejemplo, un enlace fosforotioato o un enlace P-alquiloxifosfotriéster. Preferentemente, los dos enlaces 5' más 3 '^ 5' son enlaces modificados. Opcionalmente, el resto hidroxi 5' terminal puede esterificarse con un resto que contenga fósforo, por ejemplo, fosfato, fosforotioato o P-etoxifosfato.
En algunos aspectos, los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos de ARN-ADN quiméricos que incluyen tanto ADN como ARN.
Los oligonucleótidos están preferentemente en el intervalo de 6 a 100 bases de longitud. Sin embargo, los ácidos nucleicos de cualquier tamaño mayor que 4 nucleótidos (incluso de muchos kb de longitud) son capaces de inducir una respuesta biológica según la invención si hay suficientes motivos estimuladores. Preferentemente, el ácido nucleico tiene un tamaño comprendido en el intervalo de entre 8 y 100 nucleótidos y, en algunas realizaciones, entre 8 y 50 u 8 y 30 nucleótidos.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen una cadena principal modificada tal como una cadena principal de fosforotioato (PS). En otras realizaciones, los oligonucleótidos tienen una cadena principal de fosfodiéster (PO). En otras realizaciones más, los oligonucleótidos tienen una cadena principal de PO y PS mixta o quimérica.
La nanoestructura también puede incluir un antígeno. Un antígeno como se usa en el presente documento es una molécula capaz de provocar una respuesta inmunitaria en el cuerpo, especialmente la producción de anticuerpos. Los antígenos incluyen, pero sin limitación, células, extractos celulares, proteínas, polipéptidos, péptidos, polisacáridos, conjugados polisacarídicos, miméticos peptídicos y no peptídicos de polisacáridos y otras moléculas, moléculas pequeñas, lípidos, glucolípidos, hidratos de carbono, virus y extractos víricos y organismos multicelulares, tales como parásitos y alérgenos. El término antígeno incluye ampliamente cualquier tipo de molécula reconocida como extraña por el sistema inmunitario de un hospedador. Los antígenos incluyen, pero sin limitación, antígenos de cáncer, antígenos microbianos y alérgenos.
El antígeno puede unirse a las estructuras por medio del oligonucleótido externo a través de enlace covalente o no covalente, por ejemplo, hibridación de tipo Watson y Crick. De manera alternativa o adicional, el antígeno puede incorporarse en la bicapa liposomal a través de la conjugación a un resto hidrófobo (Figuras 2-3). Los datos presentados en este documento demuestran que esta forma de suministro de antígenos provoca una inducción inesperadamente más fuerte de los efectos inmunoestimuladores in vitro (Figura 10) e induce un procesamiento y una presentación de antígenos eficaces, lo que conduce a la inducción eficaz de una respuesta inmunitaria antitumoral in vivo a niveles enormemente inesperados (Figuras 11-12). En otra realización más, el antígeno puede incorporarse dentro de la capa acuosa interna del liposoma (Figura 3).
En una realización, el antígeno se conjuga con la nanoestructura liposomal a través de interacciones con la cubierta oligonucleotídica (Figura 2). En algunos ejemplos, el conjugado antígeno-oligonucleótido está unido al núcleo liposomal a través de hibridación de oligonucleótidos. En otras palabras, el oligonucleótido se hibrida a un oligonucleótido complementario o parcialmente complementario para formar un dúplex o dúplex parcial. Uno o los dos oligonucleótidos del dúplex están unidos directamente al núcleo liposomal y el antígeno que está orientado hacia afuera (en el exterior de la bicapa lipídica) o que es interno (en la capa acuosa interna) y no está directamente unido al núcleo liposomal está unido a uno o a los dos oligonucleótidos en el dúplex. En otra realización, el antígeno está conjugado con la nanoestructura liposomal a través de interacciones directas con la cubierta liposomal (Figura 3). El antígeno puede estar anclado a la superficie del núcleo liposomal a través de la conjugación con una o una multiplicidad de moléculas enlazadoras que incluyen, pero sin limitación: tocoferoles, esfingolípidos, tales como esfingosina, fosfato de esfingosina, esfingosinas y esfinganinas metiladas, ceramidas, fosfatos de ceramida, 1-0 acil ceramidas, dihidroceramidas, 2-hidroxi ceramidas, esfingomielina, esfingolípidos glicosilados, sulfátidos, gangliósidos, fosfoesfingolípidos y fitoesfingosinas de diversas longitudes y estados de saturación y sus derivados, fosfolípidos, tales como, fosfatidilcolinas, lisofosfatidilcolinas, ácidos fosfatídicos, ácidos lisofosfatídicos, LPA cíclico, fosfatidiletanolaminas, lisofosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, lisofosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, lisofosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatos de inositol, LPI, cardiolipinas, lisocardiolipinas, bis(monoacilglicero) fosfatos, (diacilglicero) fosfatos, lípidos de éter, lípidos de difitanil éter y plasmalógenos de diversas longitudes, estados de saturación, y sus derivados, esteroles, tales como, colesterol, desmosterol, estigmasterol, lanosterol, latosterol, diosgenina, sitosterol, zimosterol, zimostenol, 14-desmetil-lanosterol, sulfato de colesterol, DHEA, sulfato de DHEA, 14-desmetil-14-deshidrolanosterol, sitostanol, campesterol, lípidos aniónicos de éter, lípidos catiónicos de éter, lípidos quelantes del lantánidos, oxiesteroles sustituidos en el anillo A, oxiesteroles sustituidos en el anillo B, oxiesteroles sustituidos en el anillo D, oxiesteroles sustituidos en la cadena lateral, oxiesteroles de doble sustitución, derivados del ácido colestanoico, esteroles fluorados, esteroles fluorescentes, esteroles sulfonados, esteroles fosforilados y esteroles poliinsaturados de diferentes longitudes, estados de saturación, y sus derivados.
Un antígeno de cáncer como se usa en el presente documento es un compuesto, tal como un péptido o una proteína, que está asociado con la superficie de una célula tumoral o cancerosa y que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria cuando se expresa en la superficie de una célula presentadora de antígeno en el contexto de una molécula de MHC. Los antígenos de cáncer pueden prepararse a partir de células cancerosas ya sea preparando extractos crudos de células cancerosas, por ejemplo, como se describe en Cohen, et al., 1994, Cáncer Research, 54:1055, purificando parcialmente los antígenos, mediante tecnología recombinante o mediante la síntesis de novo de antígenos conocidos. Los antígenos de cáncer incluyen, pero sin limitación, antígenos que se expresan por medios recombinantes, una parte inmunogénica, o una parte completa, de un tumor o un cáncer. Dichos antígenos pueden aislarse o prepararse por medios recombinantes o por cualquier otro medio conocido en la materia.
Un antígeno microbiano, como se usa en este documento, es un antígeno de un microorganismo e incluye, pero sin limitación, virus, bacterias, parásitos y hongos. Dichos antígenos incluyen el microorganismo intacto así como también los aislados y fragmentos naturales o derivados de los mismos y también compuestos sintéticos que son idénticos o similares a los antígenos de microorganismos naturales e inducen una respuesta inmunitaria específica para ese microorganismo. Un compuesto es similar a un antígeno de microorganismo natural si induce una respuesta inmunitaria (humoral y/o celular) contra un antígeno de microorganismo natural. Dichos antígenos se utilizan habitualmente en la técnica y son muy conocidos por los expertos en la materia.
Los ejemplos de virus que se han encontrado en seres humanos incluyen, pero sin limitación, los siguientes: Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana, tal como el VIH-1, también conocido como HDTV-III, LAVE o HTLV-III/|Av , o VIH-III; y otros aislados, tales como VIH-LP; Picomaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humanos, rinovirus y ecovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronoviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviradae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del Ébola); Paramyxovirídae (por ejemplo, virus paragripal, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincicial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus gripal); Bunyaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, bunyavirus, flebovirus y nairovirus); Arenaviridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvovirida (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple (VHS) 1 y 2, virus de la varicela zóster, citomegalovirus (CMV), virus del herpes; Poxviridae (virus de la viruela, virus de la variolovacuna, poxvirus); e Iridoviridae (por ejemplo, virus de la peste porcina africana); y otros virus (por ejemplo, el agente de la hepatitis delta (que se piensa que es un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B), virus de la hepatitis C; virus de Norwalk y virus relacionados, y astrovirus).
Las bacterias tanto grampositivas como gramnegativas, sirven como antígenos en animales vertebrados. Dichas bacterias grampositivas incluyen, pero sin limitación, especies de Pasteurella, Staphylococci y Streptococcus. Las bacterias gramnegativas incluyen, pero sin limitación, Escherichia coli, especies de Pseudomonas y especies de Salmonella. Los ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen, pero sin limitación, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, especies de Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Estreptococos del Grupo A), Streptococcus agalactiae (Estreptococos del Grupo B), Streptococcus (del grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (especies anaerobias), Streptococcus pneumoniae, especies patógenas de Campylobacter, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasteurella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia y Actinomyces israelii.
Los ejemplos de hongos incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.
Otros organismos infecciosos (es decir, protistas) incluyen diversas especies (spp, del latín species pluribus) de Plasmodium, tales como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax y Toxoplasma gondii. Los parásitos transmitidos por la sangre y/o tejidos incluyen diversas especies de Plasmodium, Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, diversas especies de Leishmania, Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense y Trypanosoma rhodesiense (enfermedad del sueño (o tripanosomiasis) africana), Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas) y Toxoplasma gondii.
En la bibliografía se han descrito otros microorganismos relevantes desde el punto de vista médico, por ejemplo, véase C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Gran Bretaña 1983.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "antígeno de cáncer" y "antígeno de tumor" se utilizan de manera indistinta para referirse a antígenos que expresan diferencialmente las células cancerosas y, por lo tanto, pueden aprovecharse para dirigirse a las células cancerosas. Los antígenos de cáncer son antígenos que posiblemente pueden estimular respuestas inmunitarias aparentemente específicas de tumor. Algunos de estos antígenos están codificados, aunque no necesariamente expresados, por células normales. Estos antígenos pueden caracterizarse como aquellos que son normalmente silenciosos (es decir, que no se expresan) en células normales, aquellos que se expresan solo en determinadas fases de diferenciación y aquellos que se expresan temporalmente tales como los antígenos embrionarios y fetales. Otros antígenos de cáncer están codificados por genes celulares mutantes, tales como oncogenes (por ejemplo, oncogén Ras activado), genes supresores (por ejemplo, p53 mutante), proteínas de fusión resultantes de deleciones internas o translocaciones cromosómicas. Incluso otros antígenos de cáncer pueden estar codificados por genes víricos, tales como los que llevan los virus tumorales de ARN y ADN.
Las nanoestructuras de la invención pueden suministrarse a un sujeto in vivo o ex vivo para su uso terapéutico y/o diagnóstico o pueden utilizarse in vitro, ex vivo o in vivo con fines de investigación. Como alternativa, las nanoestructuras pueden utilizarse con el fin de provocar una respuesta inmunitaria para generar reactivos tales como anticuerpos o citocinas que pueden recogerse.
Las nanoestructuras pueden administrarse en solitario o en cualquier vehículo farmacéutico apropiado, tal como un líquido, por ejemplo, solución salina, o un polvo, para la administración in vivo. También pueden suministrarse junto con partículas transportadoras más grandes o dentro de dispositivos de administración. Las nanoestructuras pueden formularse o no formularse. Las formulaciones de la invención pueden administrase en soluciones farmacéuticamente aceptables, que habitualmente pueden contener concentraciones de sal, agentes tamponantes, adyuvantes y, opcionalmente, conservantes, farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las nanoestructuras se mezclan con una sustancia tal como una loción (por ejemplo, aquaphor) y se administran a la piel de un sujeto, por lo que las nanoestructuras se suministran a través de la piel del sujeto. Debe apreciarse que cualquier método de suministro de nanopartículas conocido en la técnica puede ser compatible con los aspectos de la invención. Las nanoestructuras también pueden ser estériles.
Para su uso en terapia, se puede administrar una cantidad eficaz de las nanoestructuras a un sujeto por cualquier modo que suministre las nanoestructuras a la célula deseada. La administración de las composiciones farmacéuticas puede realizarse por cualquier medio conocido por el experto en la materia. Las vías de administración incluyen, pero sin limitación, la vía oral, parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutánea, mucosa, intranasal, sublingual, intratraqueal, inhalación, ocular, vaginal, dérmica, rectal, y mediante inyección directa.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención implica el descubrimiento de que las nanoestructuras de la invención son enormemente eficaces en la mediación de los efectos inmunoestimuladores. Estas nanoestructuras (estimuladoras y reguladoras) son útiles desde el punto de vista terapéutico y profiláctico para modular el sistema inmunitario para tratar cáncer, enfermedades infecciosas, alergia, asma, enfermedades autoinmunitarias y otros trastornos que ayudan a proteger contra infecciones oportunistas después de la quimioterapia contra el cáncer.
Por lo tanto, las nanoestructuras de la invención son útiles como una vacuna para el tratamiento de un sujeto que padece, o con riesgo de desarrollar, alergia o asma, una infección con un organismo infeccioso o un cáncer en el que se ha identificado un antígeno específico de cáncer. Las nanoestructuras también pueden formularse sin un antígeno o alérgeno para la protección contra infecciones, alergia o cáncer, y en este caso, las dosis repetidas pueden permitir prolongar la protección. Un sujeto con riesgo, como se usa en el presente documento, es un sujeto que tiene algún riesgo de exposición a una infección que causa un patógeno o un cáncer o un alérgeno o un riesgo de desarrollar cáncer. Por ejemplo, un sujeto en riesgo puede ser un sujeto que planea viajar a una zona donde se encuentra un tipo particular de agente infeccioso o puede ser un sujeto que a través de un estilo de vida o procedimientos médicos está expuesto a líquidos corporales que pueden contener organismos infecciosos o directamente el organismo o incluso cualquier sujeto que viva en una zona donde se haya identificado un organismo infeccioso o un alérgeno. Los sujetos con riesgo de desarrollar una infección también incluyen poblaciones generales en las que una agencia médica recomienda la vacunación con un antígeno de un organismo infeccioso particular. Si el antígeno es un alérgeno y el sujeto desarrolla respuestas alérgicas a ese antígeno en particular y el sujeto puede estar expuesto al antígeno, es decir, durante la temporada de polen, entonces ese sujeto está en riesgo de exposición al antígeno.
Un sujeto que tiene una infección es un sujeto que se ha expuesto a un patógeno infeccioso y tiene niveles detectables agudos o crónicos del patógeno en el cuerpo. Las nanoestructuras pueden utilizarse con o sin un antígeno para crear una respuesta inmunitaria sistémica o mucosa específica de antígeno que sea capaz de reducir o erradicar el nivel del patógeno infeccioso. Una enfermedad infecciosa, como se usa en el presente documento, es una enfermedad que surge de la presencia de un microorganismo extraño en el cuerpo. Es particularmente importante desarrollar estrategias y tratamientos eficaces de vacunas para proteger a las superficies mucosas del cuerpo, que son los sitios de entrada de patógenos principales.
Un sujeto que tiene cáncer es un sujeto que tiene células cancerosas detectables. El cáncer puede ser un cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen, pero sin limitación, cáncer del conducto biliar; cáncer de cerebro; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer de endometrio; cáncer de esófago; cáncer gástrico; neoplasmas intraepiteliales; linfomas; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (por ejemplo, microcítico y no microcítico); melanoma; neuroblastomas; cáncer bucal; cáncer de ovarios; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer de recto; sarcomas; cáncer de piel; cáncer testicular; cáncer de tiroides; y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. En una realización, el cáncer es leucemia de células pilosas (tricoleucemia), leucemia mielógena crónica, leucemia cutánea de linfocitos T, mieloma múltiple, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, carcinoma de células de vejiga, o carcinoma de colon.
Por sujeto se entenderá un ser humano o un animal vertebrado, incluyendo pero sin limitación, un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pavo, pollo, primate, por ejemplo, monos, y peces (especies de acuicultura), por ejemplo, salmón. Por lo tanto, la invención también puede utilizarse para tratar cáncer y tumores, infecciones, enfermedades autoinmunitarias y alergia/asma en sujetos no humanos.
Como se usa en el presente documento, cuando los términos tratar, tratado o tratamiento, se utilizan con respecto a un trastorno, tal como una enfermedad infecciosa, enfermedad autoinmunitaria, cáncer, alergia o asma, se refieren a un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto al desarrollo de la enfermedad (por ejemplo, a la infección con un patógeno) o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle la enfermedad (por ejemplo, se infecte con el patógeno), así como a un tratamiento después de que el sujeto haya desarrollado la enfermedad para combatir la enfermedad (por ejemplo, reducir o eliminar la infección) o impedir que empeore la enfermedad.
Las nanoestructuras de la invención también pueden recubrirse con un agente antimicrobiano o administrarse junto con dicho agente antimicrobiano. Un agente antimicrobiano, como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto natural o sintético que es capaz de destruir o inhibir microorganismos infecciosos. El tipo de agente antimicrobiano útil según la invención dependerá del tipo de microorganismo con el que el sujeto esté infectado o en riesgo de infectarse. Los agentes antimicrobianos incluyen, pero sin limitación, agentes antibacterianos, antivíricos, antifúngicos y antiparasitarios. Frases tales como "agente antiinfeccioso", "agente antibacteriano", "agente antivírico", "agente antifúngico", "agente antiparasitario" y “parasiticida", tienen significados bien establecidos por los expertos habituales en la técnica y se definen en los textos médicos convencionales. En resumen, los agentes antibacterianos destruyen o inhiben bacterias, e incluyen antibióticos, así como otros compuestos sintéticos o naturales que tienen funciones similares. Los antibióticos son moléculas de bajo peso molecular que las células producen como metabolitos secundarios, tales como microorganismos. En general, los antibióticos interfieren con una o más funciones o estructuras bacterianas que son específicas para el microorganismo y que no están presentes en las células hospedadoras. Los agentes antivíricos pueden aislarse de fuentes naturales o sintetizarse y son útiles para destruir o inhibir virus. Los agentes antifúngicos se utilizan para tratar infecciones fúngicas superficiales, así como infecciones fúngicas sistémicas primarias y oportunistas. Los agentes antiparasitarios destruyen o inhiben parásitos.
Las nanoestructuras de la invención también pueden utilizarse para regular la respuesta inmunitaria de manera que disminuya el nivel de algunos factores inmunitarios. Conseguir una regulación negativa o "tolerancia" inmunitaria específica, es un desafío significativo, ya que en la técnica anterior, en general, se actúa en gran medida regulando negativamente las respuestas inmunitarias. Esta estrategia inespecífica puede conducir a una alta incidencia de efectos secundarios, toxicidad, y un mayor riesgo de adquirir enfermedades infecciosas, entre otras cosas. Ningún compuesto o estructura disponible en el comercio ha demostrado la capacidad de inducir efectos antiinflamatorios fuertes y específicos en la clínica. Un desafío es el suministro de señales apropiadas a las células inmunitarias, tal como un antígeno, en ausencia de señales coestimuladoras adicionales.
Las nanoestructuras de la invención resuelven algunos de estos problemas encontrados en la técnica anterior. En algunas realizaciones, un antígeno puede suministrarse intracelularmente de manera eficaz a través de la conjugación a una nanoestructura de la invención de una manera que consiga o promueva la tolerancia. Los métodos pueden implicar antagonizar los receptores de tipo Toll durante el proceso de suministro del antígeno para mejorar la capacidad de inducir tolerancia específica de antígeno. Las nanoestructuras utilizadas para estas realizaciones de la invención incluyen un núcleo liposomal que está unido a un inmunosupresor, tal como un inmunosupresor TLR 4 y oligonucleótidos colocados en el exterior del núcleo.
Estas nanoestructuras reguladoras son útiles para regular negativamente una respuesta inmunitaria o siempre que se desee inducir tolerancia. Por ejemplo, son útiles para tratar y prevenir enfermedades autoinmunitarias, alergia, asma, u otras afecciones en las que un componente de la patología implique una respuesta inmunitaria hiperactiva, tal como fibrosis hepática o fibrosis pulmonar idiopática.
Un sujeto que tiene una alergia es un sujeto que tiene o que está en riesgo de desarrollar una reacción alérgica en respuesta a un alérgeno. Una alergia se refiere a la hipersensibilidad adquirida a una sustancia (alérgeno). Las afecciones alérgicas incluyen, pero sin limitación, eccema, rinitis alérgica o coriza, fiebre del heno, conjuntivitis, asma bronquial, urticaria (habones) y alergias alimentarias, y otras afecciones atópicas.
Un alérgeno se refiere a una sustancia (antígeno) que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un sujeto susceptible. La lista de alérgenos es enorme y puede incluir pólenes, veneno de insectos, polvo de caspa animal, esporas fúngicas y fármacos (por ejemplo, penicilina). Los ejemplos de alérgenos naturales, animales y vegetales incluyen, pero sin limitación, proteínas específicas de los siguientes géneros: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (por ejemplo, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia); Lolium (por ejemplo, Lolium perenne o Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomena japonica); Altemana (Altemaria altemata); Alder, Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (por ejemplo, Plantago lanceolata); Parietaria (por ejemplo, Parietaria officinalis o Parietaria judaica); Blattella (por ejemplo, Blattella germanica); Apis (por ejemplo, Apis multiflorum); Cupressus (por ejemplo, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica y Cupressus macrocarpa); Juniperus (por ejemplo, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis y Juniperus ashei); Thuya (por ejemplo, Thuya orientalis); Chamaecyparis (por ejemplo, Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (por ejemplo, Periplaneta americana); Agropyron (por ejemplo, Agropyron repens); Secale (por ejemplo, Secale cereale); Triticum (por ejemplo, Triticum aestivum); Dactylis (por ejemplo, Dactylis glomerata); Festuca (por ejemplo, Festuca elatior); Poa (por ejemplo, Poa pratensis o Poa compressa); Avena (por ejemplo, Avena sativa); Holcus (por ejemplo, Holcus lanatus); Anthoxanthum (por ejemplo, Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (por ejemplo, Arrhenatherum elatius); Agrostis (por ejemplo, Agrostis alba); Phleum (por ejemplo, Phleum pratense); Phalaris (por ejemplo, Phalaris arundinacea); Paspalum (por ejemplo, Paspalum notatum); Sorghum (por ejemplo, Sorghum halepensis); y Bromus (por ejemplo, Bromus inermis).
Las enfermedades autoinmunitarias son una clase de enfermedades en las que los propios anticuerpos de un sujeto reaccionan con el tejido del hospedador o en las que los linfocitos T efectores inmunitarios son autorreactivos a los autopéptidos endógenos y causan la destrucción del tejido. Por tanto, se crea una respuesta inmunitaria contra los propios antígenos de un sujeto, denominados autoantígenos. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico (LES), encefalomielitis autoinmunitaria, miastenia grave (MG), tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Goodpasture, pénfigo (por ejemplo, pénfigo vulgar), enfermedad de Grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, esclerodermia con anticuerpos contra colágeno, enfermedad mixta del tejido conectivo, polimiositis, anemia perniciosa, enfermedad idiopática de Addison, infertilidad autoinmunitaria asociada, glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis semilunar, glomerulonefritis proliferativa), pénfigo ampolloso, síndrome de Sjogren, resistencia a la insulina y diabetes mellitus autoinmunitaria.
Un "autoantígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a un antígeno de un tejido hospedador normal. El tejido hospedado normal no incluye células cancerosas. Por tanto, en el contexto de una enfermedad autoinmunitaria, una respuesta inmunitaria creada contra un autoantígeno, es una respuesta inmunitaria no deseable y contribuye a la destrucción y al daño del tejido normal, mientras que una respuesta inmunitaria creada contra un antígeno de cáncer es una respuesta inmunitaria deseable y contribuye a la destrucción del tumor o del cáncer. Por lo tanto, en algunos aspectos de la divulgación dirigida al tratamiento de trastornos autoinmunitarios, no se recomienda que la nanoestructura se formule con autoantígenos, particularmente aquellos que sean las dianas del trastorno autoinmunitario.
En otros ejemplos, las nanoestructuras pueden incluir pequeñas cantidades de autoantígenos. Diversos estudios en animales han demostrado que la administración por vía mucosa de dosis bajas de antígeno puede producir un estado de hiporrespuesta o "tolerancia" inmunitaria. El mecanismo activo parece ser una desviación inmunitaria mediada por citocinas que se aleja de Th1 contra una respuesta predominantemente Th2 y Th3 (es decir, dominada por TGF-p). La supresión activa con el suministro de antígeno en dosis bajas también puede suprimir una respuesta inmunitaria no relacionada (supresión espectadora) que tiene un interés considerable en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, artritis reumatoide y LES. La supresión espectadora implica la secreción de citocinas supresoras, contrarreguladoras de Th1 en el entorno local donde se liberan las citocinas proinflamatorias y Th1 de una manera específica o inespecífica de antígeno. La "tolerancia", como se usa en el presente documento, se utiliza para referirse a este fenómeno. De hecho, la tolerancia oral ha sido eficaz en el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunitarias en animales, incluyendo: encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), miastenia grave autoinmunitaria experimental, artritis inducida por colágeno (AIC) y diabetes mellitus insulinodependiente. En estos modelos, la prevención y supresión de la enfermedad autoinmunitaria está asociada con un cambio en las respuestas humorales y celulares específicas de antígeno de una respuesta Th1 a Th2/Th3.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit que incluye una o más de las composiciones anteriormente mencionadas. Un "kit", como se usa en el presente documento, normalmente define un envase o un conjunto que incluye una o más de las composiciones de la invención, y/u otras composiciones asociadas con la invención, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Cada una de las composiciones del kit, si están presentes, puede proporcionarse en forma líquida (por ejemplo, en solución), o en forma sólida (por ejemplo, en un polvo deshidratado). En determinados casos, algunas de las composiciones pueden constituirse o, de otra manera, procesarse (por ejemplo, a una forma activa), por ejemplo, añadiendo un disolvente adecuado u otra especie adecuada, que puede proporcionarse, o no, con el kit. Los ejemplos de otras composiciones que pueden asociarse con la invención incluyen, pero sin limitación, disolventes, tensioactivos, diluyentes, sales, tampones, emulsionantes, agentes quelantes, cargas, antioxidantes, agentes aglutinantes, agentes espesantes, conservantes, agentes deshidratantes, agentes antimicrobianos, agujas, jeringas, materiales de envasado, tubos, frascos, matraces, vaso de precipitados, placas, materiales de vidrio, filtros, anillos, abrazaderas, envolturas, parches, recipientes, cintas, adhesivos y similares, por ejemplo, para su uso, administrando, modificando, ensamblando, almacenando, envasando, preparando, mezclando, diluyendo y/o conservando los componentes de las composiciones para un uso particular, por ejemplo, para una muestra y/o un sujeto.
En algunas realizaciones, un kit asociado con la invención incluye uno o más componentes de la nanoestructura. Por ejemplo, el kit puede incluir liposomas para formar un núcleo de liposoma, un inmunoestimulador o inmunosupresor de TLR4 y u oligonucleótidos para el exterior de la nanoestructura. Un kit también puede incluir uno o más antígenos y u otros agentes terapéuticos.
El kit de la invención puede, en algunos casos, incluir instrucciones en cualquier forma que se proporcione en relación con las composiciones de la invención de tal manera que un experto habitual en la técnica reconozca que las instrucciones deben asociarse con las composiciones de la invención. Por ejemplo, las instrucciones pueden incluir instrucciones para el uso, modificación, mezclado, dilución, conservación, administración, ensamblaje, almacenamiento, envasado y/o preparación de las composiciones y/u otras composiciones asociadas con el kit. En algunos casos, las instrucciones también pueden incluir instrucciones para el uso de las composiciones, por ejemplo, para un uso particular, por ejemplo, para una muestra. Las instrucciones pueden proporcionarse en cualquier forma que sea reconocible por un experto habitual en la técnica como un soporte adecuado que contenga dichas instrucciones, por ejemplo, escritas o publicadas, verbales, audibles (por ejemplo, telefónicas), digitales, ópticas, visuales (por ejemplo, cintas de vídeo, DVD, etc.) o comunicaciones electrónicas (incluidas las comunicaciones por Internet o basadas en la red), proporcionadas de cualquier manera.
Ejemplos
Para que la invención descrita en el presente documento pueda entenderse de forma más completa, se exponen los siguientes ejemplos. Los ejemplos descritos en la presente memoria descriptiva se ofrecen para ilustrar los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los métodos proporcionados en el presente documento y no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes de su alcance.
Ejemplo 1.
En una realización reducida a la práctica, los oligonucleótidos de secuencia 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID NO:1; denominada "CpG 1826") se modificaron en el extremo 3' con alfa tocoferol y se incorporaron en pequeñas vesículas unilaminares compuestas por (92 % p/p) 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC) mezclada con (8 % p/p) monofosforil lípido A (Figura 1). En una sub-realización, estas estructuras se conjugaron adicionalmente con ovoalbúmina, un modelo de antígeno proteico a través de hibridación de tipo Watson y Crick de una construcción de ovoalbúmina-oligo, en la que la parte oligo era complementaria a CpG 1826 (5'-AACGTCAGGAACGTCATGGA-3' SEQ ID NO:2). (Figura 2). En este caso, el oligonucleótido se seleccionó basándose en su capacidad para estimular TLR9, mientras que el MPLA se seleccionó por su capacidad para estimular TLR4.
Síntesis de ANE liposomales (nanoestructura)
En un recipiente de vidrio, 25 mg de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC) disueltos en 4 ml de diclorometano (DCM) se mezclaron con 1 mg de monofosforil lípido A (MPLA) disuelto en 1 ml de cloroformo. después, los lípidos se secaron sobre las paredes del recipiente de vidrio en una película fina, secando suavemente con argón hasta haber evaporado todo el disolvente. Cualquier disolvente residual se eliminó mediante liofilización durante la noche. Al día siguiente, los lípidos se reconstituyeron en 10 ml de tampón liposomal (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM) mediante vórtice y utrasonido, después se pasaron a través de 2-5 ciclos de congelación y descongelación antes de la extrusión en serie a través de membranas de extrusión de 100 nm, 50 nm y después de 30 nm. Después de la extrusión, 1 umol de oligonucleótido (5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' SEQ ID nO:1) con un grupo 3'-alfa tocoferol unido mediante enlace covalente, se mezcló con los 26 mg de lípido y se incubó durante una noche a 4 °C para formar ANE liposomales. Al día siguiente, los ANE liposomales se purificaron mediante filtración de flujo tangencial utilizando un filtro de corte de membrana de 300 kDA utilizando >5 intercambios de volumen de 1x PBS.
Algunos ANE liposomales se modificaron adicionalmente para contener ovoalbúmina, conjugando en primer lugar la ovoalbúmina con un oligonucleótido complementario a CpG 1826 (5'-AACGTCAGGAACGTCATGGA-3 'SEC ID NO: 2). Después, este conjugado de ovoalbúmina-oligonucleótido se hibridó con los ANE liposomales incubando durante 3 horas a 37 °C hasta un exceso de 2 veces de conjugado de ovoalbúmina-oligonucleótido con respecto al oligonucleótido en el ANE liposomal, seguido de incubación durante la noche a 4 °C. El exceso de conjugado de ovoalbúmina-oligonucleótido se eliminó mediante filtración de flujo tangencial.
Ensayo in vitro
Los compuestos se diluyeron en serie a 1:4. 20 ul de esta mezcla se sembraron por duplicado en una placa de 96 pocillos. Células RAW Blue (InVivoGen), una línea celular indicadora de macrófagos murinos procedente de células RAW 264.7 que contenían una fosfatasa alcalina secretada (SEAP, del inglés secreted alkaline phosphatase) inducible por NF-kB, se sembró a 100k células/pocillo en 180 ul por pocillo y se añadieron a los compuestos de ensayo en la placa de 96 pocillos. Células Ramos Blue (InVivoGen), una línea indicadora de linfocitos B humanos procedente de células Ramos que contenían una SEAP inducible por NF-kB, se sembró a 306k células/pocillo en 180 ul por pocillo y se añadieron a los compuestos de ensayo en la placa de 96 pocillos. Cabe destacar que, las células Ramos Blue no tienen señalización funcional a través de TLR4. Las células se incubaron con el compuesto de ensayo durante la noche a 37 °C, con CO2 al 5 % en una cámara humificada. Al día siguiente, los sobrenadantes se exploraron para determinar la actividad de la SEAP utilizando el reactivo QuantiBlue (InVivoGen) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Los resultados muestran que los ANE liposomales que transportan agonistas tanto de TLR4 como de TLR9, inducen una mayor activación de las células RAW Blue que cualquiera de ellos solo, aislado (Figura 4). Cabe destacar que, los resultados muestran que la activación de NF-kB mediante ANE liposomales que contenían MPLA dependía de TLR4 funcional, ya que la línea celular RAW Blue, pero no la línea celular Ramos Blue, demostró activación de NF-kB en respuesta a la estimulación (Figura 5).
Para realizar un perfil adicional de la respuesta desencadenada por los ANE liposomales que contienen agonistas tanto de TLR9 como de TLR4, se ensayó la capacidad de los a Ne liposomales para inducir la activación de rutas dependientes de MyD88 e independientes de MyD88, medida por niveles de activación de TNF e IFN-alfa, respectivamente. Para ello, se resuspendieron 6 millones de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana a 1 millón/ml en RPMI-1640 complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % y se sembraron a 180k/pocillo con 20 ul de compuesto de ensayo. Tras la incubación durante una noche, el sobrenadante se exploró para determinar los niveles de TNF e IFN-alfa mediante ensayo ELISA. Los resultados muestran que los ANE liposomales, que suministran tanto CpG 1826 como MPLA en una sola construcción, demuestran que no pueden duplicarse niveles elevados de TNF y de IFN-alfa suministrando cada uno de ellos aislado, o suministrando ambos componentes en el mismo pocillo pero no en la misma construcción (Figura 6). Incluso cuando se utilizó una secuencia que no activó TLR9 (denominada "CTL-ps": 5'-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT-3' SEQ ID NO:3) para construir el ANE liposomal, se observó una mayor actividad de MPLA (Figura 7), lo que sugiere que el ANE liposomal suministra MPLA de manera más eficaz de lo que lo hace una formulación liposomal.
A continuación, se identificaron parámetros que podrían modular la eficacia de los ANE liposomales. La cantidad de MPLA suministrada en la etapa de formulación liposomal podría desempeñar un papel, así como la química del enlace internucleotídico (PO frente a PS). Por consiguiente, se desarrollaron a Ne liposomales al aumentar el suministro de MPLA de 3,8 % (p/p) a 11,5 % (p/p) y construcciones que contenían enlaces tanto de PO como de PS y su actividad se sometió a ensayo en células RAW Blue. En esta línea celular, se observó que al aumento del suministro de MPLA hasta 7,7 % de MPLA pero no hasta 11,5 % aumentaba la fuerza de activación del ANE liposomal (Figura 8). En las células RAW Blue, se observó un cambio en la fuerza del ANE liposomal pero no en la estimulación máxima (Figura 9), aunque se espera que esto dependa de la especie.
Por último, se ensayó la capacidad de los ANE liposomales conjugados con antígeno para activar células inmunitarias. Los ANE liposomales cargados con ovoalbúmina se incubaron durante la noche, como se describe, con células RAW Blue al nivel de SEAP explorada mediante el ensayo QuantiBlue. La conjugación del antígeno con los ANE liposomales pareció aumentar su actividad (Figura 10). Es posible que esto ocurra debido a la presencia de motivos de CpG adicionales introducidos por el oligonucleótido complementario que está unido a la ovoalbúmina, que formó los dúplex con CpG 1826.
Ensayo In Vivo
Se ha demostrado que esta forma de suministro de antígenos induce una inducción más fuerte de los efectos inmunoestimuladores in vitro (Figura 10) e induce un procesamiento y una presentación eficaz del antígeno, lo que conduce a una inducción eficaz de una respuesta inmunitaria antitumoral in vivo (Figuras 11-12).
Los días 0 y 21 se inmunizaron ratones C57BL/6 (N=4/grupo) (200 |jl s.c., 100 |jg de dosis equivalente de ovoalbúmina) con las formulaciones indicadas utilizando ovoalbúmina como antígeno modelo (Figura 11). El día 28, los esplenocitos se recogieron y se incubaron durante una noche en placas ELISPOT IFN-y, con OVA(257-264) 1 uM. La cantidad de manchas de IFN-y se cuantificó utilizando un contador ELISPOT automatizado. Este estudio muestra que los ANE inducen respuestas celulares más eficazmente que el oligo y el alumbre exentos de PS. *p< 0,05, NS=no significativo.
En otro experimento, el día 0 se inocularon ratones C57BL/6 (N=11/grupo) con 1x106 células E.G7-OVA (ATCC n° CRL-2113) y después se trataron con los compuestos indicados los días 3, 7, 10 (200 j l s.c., 100 jg de dosis equivalente de ovoalbúmina). El volumen tumoral se calculó midiendo la longitud y la anchura del tumor subcutáneo y aplicando la fórmula volumen tumoral = (longitud) x (anchura) x (anchura)/2. Los resultados demuestran la activación de fuertes respuestas celulares al antígeno in vivo con evidencia de una reducción significativa (95 %) de la carga tumoral (Figura 12).
En las reivindicaciones, los artículos como "uno", "una", "el" y "la" pueden significar uno(a) o más de uno(a), a menos que se indique lo contrario, o de otro modo, se desprenda del contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo, están presentes en, se emplean en, o de otro modo, son relevantes para un producto o proceso dado, a menos que se indique lo contrario, o de otro modo, se desprenda del contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o de otro modo, es relevante para un producto o proceso dado. La invención incluye realizaciones en las que más de uno, o todos los miembros del grupo, están presentes en, se emplean en, o de otro modo, son relevantes para, un producto o proceso dado.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una nanoestructura, que comprende
un núcleo liposomal que tiene una bicapa lipídica, en donde un inmunoestimulador o un inmunosupresor están asociados a la bicapa lipídica, y los oligonucleótidos están colocados en el exterior del núcleo liposomal, en donde los oligonucleótidos comprenden oligonucleótidos que contienen el motivo de CpG, en donde los oligonucleótidos están unidos indirectamente al núcleo liposomal a través de un enlazador, y en donde todos los oligonucleótidos tienen su extremo 5' expuesto a la superficie externa de la nanoestructura.
2. La nanoestructura de la reivindicación 1, en la que los oligonucleótidos forman una cubierta oligonucleotídica, y en la que la cubierta oligonucleotídica comprende oligonucleótidos y una molécula transportadora o comprende oligonucleótidos en su totalidad.
3. La nanoestructura de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que los oligonucleótidos tienen una o más de las siguientes propiedades:
a) la cubierta oligonucleotídica tiene oligonucleótidos estructuralmente idénticos
b) los oligonucleótidos de la cubierta oligonucleotídica tienen al menos dos oligonucleótidos estructuralmente diferentes
c) los oligonucleótidos de la cubierta oligonucleotídica tienen 2-10 secuencias nucleotídicas diferentes d) los oligonucleótidos tienen al menos un enlace fosforotioato
e) los oligonucleótidos no tienen un enlace fosforotioato
f) los oligonucleótidos que contienen CpG se seleccionan del grupo que consiste en oligonucleótidos de las clases A, B y C que contienen CpG
g) los oligonucleótidos comprenden ARN inmunoestimulador monocatenario o bicatenario
h) los oligonucleótidos están indirectamente unidos al núcleo liposomal a través de más de un enlazador i) en donde el enlazador es uno o más de los siguientes enlazadores: tocoferoles, esfingolípidos, tales como esfingosina, fosfato de esfingosina, esfingosinas y esfinganinas metiladas, ceramidas, fosfatos de ceramida, 1-0 acil ceramidas, dihidroceramidas, 2-hidroxi ceramidas, esfingomielina, esfingolípidos glicosilados, sulfátidos, gangliósidos, fosfoesfingolípidos y fitoesfingosinas de diversas longitudes y estados de saturación, fosfolípidos, tales como, fosfatidilcolinas, lisofosfatidilcolinas, ácidos fosfatídicos, ácidos lisofosfatídicos, LPA cíclico, fosfatidiletanolaminas, lisofosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, lisofosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, lisofosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatos de inositol, LPI, cardiolipinas, lisocardiolipinas, bis(monoacilglicero) fosfatos, (diacilglicero) fosfatos, lípidos de éter, lípidos de difitanil éter y plasmalógenos de diversas longitudes y estados de saturación, esteroles, tales como, colesterol, desmosterol, estigmasterol, lanosterol, latosterol, diosgenina, sitosterol, zimosterol, zimostenol, 14-desmetil-lanosterol, sulfato de colesterol, DHEA, sulfato de DHEA, 14-desmetil-14-deshidrolanosterol, sitostanol, campesterol, lípidos aniónicos de éter, lípidos catiónicos de éter, lípidos quelantes del lantánidos, oxiesteroles sustituidos en el anillo A, oxiesteroles sustituidos en el anillo B, oxiesteroles sustituidos en el anillo D, oxiesteroles sustituidos en la cadena lateral, oxiesteroles de doble sustitución, derivados del ácido colestanoico, esteroles fluorados, esteroles fluorescentes, esteroles sulfonados, esteroles fosforilados, esteroles poliinsaturados de diferentes longitudes, estados de saturación, ácidos grasos saturados en C8-C22, derivados de éter de glicerol saturados en C8-C22, derivados de ácidos grasos de amida saturados e insaturados en C8-C22 y mono y 1,2 o 1, 3-di-amino gliceroles y j) los oligonucleótidos comprenden 2-1.000 oligonucleótidos.
4. La nanoestructura de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el núcleo liposomal comprende uno o más lípidos seleccionados de: esfingolípidos, tales como esfingosina, fosfato de esfingosina, esfingosinas y esfinganinas metiladas, ceramidas, fosfatos de ceramida, 1-0 acil ceramidas, dihidroceramidas, 2-hidroxi ceramidas, esfingomielina, esfingolípidos glicosilados, sulfátidos, gangliósidos, fosfoesfingolípidos y fitoesfingosinas de diversas longitudes y estados de saturación, fosfolípidos, tales como, fosfatidilcolinas, lisofosfatidilcolinas, ácidos fosfatídicos, ácidos lisofosfatídicos, LPA cíclico, fosfatidiletanolaminas, lisofosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, lisofosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, lisofosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatos de inositol, LPI, cardiolipinas, lisocardiolipinas, bis(monoacilglicero) fosfatos, (diacilglicero) fosfatos, lípidos de éter, lípidos de difitanil éter y plasmalógenos de diversas longitudes y estados de saturación, esteroles, tales como, colesterol, desmosterol, estigmasterol, lanosterol, latosterol, diosgenina, sitosterol, zimosterol, zimostenol, 14-desmetil-lanosterol, sulfato de colesterol, DHEA, sulfato de DHEA, 14-desmetil-14-deshidrolanosterol, sitostanol, campesterol, lípidos aniónicos de éter, lípidos catiónicos de éter, lípidos quelantes del lantánidos, oxiesteroles sustituidos en el anillo A, oxiesteroles sustituidos en el anillo B, oxiesteroles sustituidos en el anillo D, oxiesteroles sustituidos en la cadena lateral, oxiesteroles de doble sustitución, derivados del ácido colestanoico, esteroles fluorados, esteroles fluorescentes, esteroles sulfonados, esteroles fosforilados y esteroles poliinsaturados de diferentes longitudes, estados de saturación, ácidos grasos saturados en C8-C22, derivados de éter de glicerol saturados en C8-C22 y derivados de ácidos grasos de amida saturados e insaturados en C8-C22 y mono y 1,2 o 1,3-di-amino gliceroles.
5. La nanoestructura de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el núcleo liposomal comprende un tipo de lípido o 2-10 lípidos diferentes.
6. La nanoestructura de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el inmunoestimulador se selecciona del grupo que consiste en monofosforil lípido A, lípido A de origen bacteriano, trehalosa 22:0, dimetildioctadecilamonio, Kdo2 lípido A, fosfatos de inositol incluyendo IP3(1,3,4), IP3(1,3,5), IP3(1,4,5), IPR(1,3,4,5), agonistas selectivos de receptores de LPA/S1P, PAF y análogos de PAF, liponucleótidos, LPA cíclico, ceramidas bioactivas, endocanabinoides, anandamidas, productos de la oxidación de los lípidos, diacilglicerol fosfato, lípidos de la membrana bacteriana, lípidos de N-acilglicina, lípidos de acil-carnitina, ácidos micólicos, extractos de lípidos de plantas, FSL-1, PAM3CSK4, HKLM, LPS, FLA-ST, imiquimod, resiquimod, C12-IE-DAP, agonistas de receptores de tipo Toll L18-MDP, agonistas de receptores NOD y agonistas de receptores inmunitarios proinflamatorios.
7. La nanoestructura de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el inmunoestimulador es una molécula pequeña, un ácido nucleico, una proteína o una combinación de los mismos.
8. La nanoestructura de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que además comprende un antígeno, en la que el antígeno está:
a) mezclado junto con la nanoestructura
b) unido directamente a la cubierta oligonucleotídica,
c) unido indirectamente a la cubierta oligonucleotídica a través de un enlazador
d) unido directamente al núcleo liposomal,
c) unido indirectamente al núcleo liposomal a través de un enlazador, o
f) un conjugado de antígeno-oligonucleótido que está unido al núcleo liposomal a través de hibridación de oligonucleótidos.
9. La nanoestructura de la reivindicación 1, en la que el inmunoestimulador está asociado al núcleo liposomal: a) embebiéndose dentro del núcleo liposomal,
b) uniéndose indirectamente al núcleo liposomal, o
d) uniéndose directamente al núcleo liposomal.
10. La nanoestructura de la reivindicación 8, en la que el antígeno
a) está encapsulado dentro del núcleo liposomal en una capa acuosa interna,
b) está unido al oligonucleótido de la cubierta oligonucleotídica mediante enlace no covalente, o
c) se selecciona del grupo que consiste en un antígeno de cáncer, un antígeno bacteriano, un antígeno vírico, un antígeno parasitario, un hapteno y un alérgeno.
11. La nanoestructura de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la nanoestructura es una nanoestructura autoensamblable.
12. Una composición para su uso en medicina, que comprende una nanoestructura de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
13. La composición para su uso según la reivindicación 12, en la que el uso en medicina es en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno, en donde el trastorno es un cáncer, una infección vírica, una infección bacteriana, alergia, asma o una enfermedad autoinmunitaria.
14. La composición para su uso según la reivindicación 12, en la que la nanoestructura está asociada a una molécula diana.
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