ES2710280T3 - Soporte para células que contiene colágeno - Google Patents
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Abstract
Uso de una composición para el cultivo de células biológicas, que muestra los parámetros siguientes: Colágeno [% en peso] aprox. 30 a 80, Nitrógeno de amida [% en peso] aprox. 0,06 a 0,6, Poliol [% en peso] aprox. 0 a 50, Grasa [% en peso] aprox. 0 a 20, Ceniza [% en peso] aprox. 0 a 10, Agua [% en peso] aprox. 5 a 40, Valor de pH: aprox. 3 a 10, Peso por unidad de superficie [g/m2]: aprox. 10 a 100, Resistencia a la tracción [N/mm2]: aprox. 0,5 a 100.
Description
DESCRIPCION
Soporte para celulas que contiene colageno
La presente invencion se refiere al uso de una composicion que contiene colageno para el cultivo de celulas biologicas.
Los soportes para el cultivo de celulas biologicas son conocidos en general por el estado de la tecnica. Estos soportes se denominan a menudo matrices o andamios. Estos soportes constituyen la base nutritiva o, en general, la estructura sobre la que se depositan las celulas durante el cultivo celular.
Las composiciones que contienen colageno representan lostipos mas conocidos de soporte para celulas. El colageno es una protema animal de la matriz extracelular, correspondiente a las escleroprotemas, normalmente insoluble en agua y formada por fibras, que interviene sobre todo en la construccion de tejidos conectivos, por ejemplo, piel, vasos sangumeos, ligamentos, tendones y cartflago, asf como en la formacion de huesos y dientes. Debido a estas propiedades, los biomateriales basados en colageno de origen animal se utilizan desde hace anos en medicina. Los colagenos, como material de soporte, se han usado especialmente en productos de aplicacion clmica para la hemostasia, como sustitucion de la duramadre o, tambien, en diversos campos de la cirugfa plastica. Los colagenos, de los que se han identificado 28 tipos hasta hoy, y al menos otras 10 protemas con dominios similares a los del colageno, muestran escasas diferencias entre las distintas especies. Dado que no existe ningun patron diferenciador pronunciado y que la descomposicion enzimatica no produce productos toxicos de degradacion, los colagenos se consideran biocompatibles.
Las matrices de colageno que se ofrecen en el mercado hoy en dfa muestran una variacion muy importante en cuanto a propiedades. De este modo, se ha comprobado que algunas matrices de colageno usadas para el cultivo de celulas biologicas desencadenan in vitro reacciones inflamatorias que tienen como consecuencia procesos catabolicos sobre el metabolismo. Un inconveniente adicional de las matrices de colageno disponibles actualmente es que son muy gruesas, por lo general, mayores de 200 pm y, por consiguiente, no pueden ser examinadas al microscopio. A esto se anade que las matrices de colageno ofrecidas hasta ahora para el cultivo de celulas biologicas son muy caras.
Como soporte para el cultivo celular se toman en consideracion, ademas, los denominados hidrogeles. Un hidrogel es un polfmero que contiene agua, pero que es insoluble en agua, cuyas moleculas estan unidas entre sf de forma qmmica, por ejemplo, por enlaces covalentes o ionicos, o ffsica, por ejemplo, por enmaranamiento de cadenas polfmeras, para formar una reticula tridimensional. Debido a los componentes polfmeros hidrofilos incorporados, se hinchan en agua con un incremento considerable de volumen, aunque sin perder su equilibrio material. Sin embargo, el inconveniente de los hidrogeles es que son inestables a causa de la gran cantidad de agua almacenada.
Con frecuencia, ademas, durante la colonizacion celular se produce una condensacion de los hidrogeles. Por lo tanto, la aplicacion de los hidrogeles es muy limitada.
El llamado acido hialuronico representa una matriz adicional, adecuada para la colonizacion de celulas biologicas. Esta matriz esta compuesta por macromoleculas de la sustancia base del cartflago y, por esta razon, en su forma no modificada posee una elevada biocompatibilidad. Para generar una estructura apropiada con suficiente capacidad de carga mecanica es necesario reticular las cadenas moleculares. Esta reticulacion tiene lugar por medio de una esterificacion con alcohol, lo cual puede limitar la biocompatibilidad.
El denominado alginato constituye un andamio adicional. Se trata de un copolfmero obtenido de algas marinas pardas, compuesto por acido L-guluronico y acido D-manuronico. El producto se puede gelificar o fluidificar por medio de la adicion de EDTA o citrato sodico, respectivamente. Esto confiere al alginato propiedades para el cultivo celular similares a las que se han descrito ya para los geles basados en colageno, aunque con posibilidades optimizadas de resuspension para analisis celulares y de biologfa molecular. A pesar de las ventajas con respecto a otros materiales de soporte y de las buenas propiedades del material in vitro, in vivo no se han logrado resultados satisfactorios. In vivo, la sustancia se absorbe mal y origina considerables reacciones inmunologicas y de cuerpo extrano. Por lo tanto, hasta la fecha el alginato no se puede utilizar para realizar implantes en el ser humano.
Otro material de soporte para celulas biologicas es la agarosa. Se comporta de manera similar al alginato. La agarosa esta compuesta por cadenas de azucares y se obtiene a partir de las paredes celulares del alga roja. Al igual que el alginato, in vivo provoca reacciones inmunologicas y de cuerpo extrano, por lo que hasta la fecha la agarosa no se ha podido usar en el ser humano.
Otros andamios estan basados en fibrina. En este caso, se trata de una protema plasmatica globular que por su capacidad de polimerizacion de reticulacion produce, entre otras, la coagulacion sangumea. Sin embargo, hasta ahora no se ha podido usar fibrina en aplicaciones in vivo. En la practica, no se ha investigado suficientemente el uso de fibrina como soporte para celulas y es necesario evaluarlo de forma exhaustiva. Ademas, la fibrina tiene un coste muy elevado.
Otras matrices utilizadas para el cultivo de celulas biologicas se basan en quitina o quitosano. La quitina forma la sustancia de partida para la preparacion de quitosano. Para ello, se separan qmmica o enzimaticamente los grupos acetilo de la quitina. Tanto la quitina como el quitosano son biopolfmeros entre los cuales no existe una transicion
exactamente definida. Sin embargo, se habla de quitosano cuando el grado de desacetilacion es mayor de 40 a 50% y el enlace en los acidos organicos es soluble. Sin embargo, las posibilidades de utilizacion de quitina o quitosano estan fuertemente limitadas y hasta el momento no se ha acreditado tampoco su utilidad para el cultivo de celulas. La quitina es una sustancia ajena al organismo y representa, por lo tanto, siempre una sustancia extrana. Todavfa se debe investigar detenidamente el uso de quitina como soporte para celulas.
En la actualidad, se estan investigando tambien multiples andamios sinteticos. Entre ellos, cabe citar los polfmeros polilactida (PLA) y poliglicolida (PGA), asf como el poliacido L-lactico (en ingles, “poly-L-lactic acid”, PLLA o “bioglass” [biovidrio]). Caractensticas especiales de los polfmeros PLA y PGA es su reducida solubilidad en medios acuosos, que solo mejora por la degradacion de las cadenas polfmeras, es decir, hidrolisis, en oligomeros o monomeros de menor peso molecular y que da lugar, de este modo, a la erosion de estos materiales. En general, se ha demostrado que estos polfmeros no son apropiados para el cultivo de cualquier material biologico. Los polfmeros absorbibles se descomponen por hidrolisis espontanea para formar acidos organicos. Los osteoblastos se diferencian en medio acido, de manera que una gran cantidad de estos polfmeros puede provocar mas degradacion que formacion de tejido oseo.
El documento US2005/0208478 da a conocer un producto compuesto que contiene colageno que, segun los conocimientos de los inventores, muestra un contenido extremadamente bajo de humedad y es fragil. Por lo tanto, su manipulacion resulta compleja y no es apropiado para utilizar en la “ingeniena de tejidos” actual.
Con estos antecedentes, la invencion tiene la tarea de poner a disposicion una nueva composicion para el cultivo de celulas biologicas, con la que se puedan evitar los inconvenientes que sufren los soportes para celulas conocidos por el estado de la tecnica. De manera especial, es preciso poner a disposicion una composicion que, a gran escala, se pueda preparar con un coste favorable y una alta calidad uniforme.
Esta tarea se resuelve con el uso de una composicion para el cultivo de celulas biologicas que tiene los parametros siguientes:
La Comparua Naturin GmbH & Co, KG, Badenstrasse 13, Weinheim (Alemania), comercializa ya una composicion de este tipo en forma de lamina. Estas laminas tienen, por ejemplo, los numeros de referencia asignados por Naturin 400011899, 400023747, 400026193, 400019485,400000084 y 400000109.
Este hallazgo fue sorprendente. La composicion se utilizaba hasta entonces exclusivamente en el campo de la alimentacion, por ejemplo, como lamina de separacion entre la redecilla y la carne en la preparacion de jamon. De manera particular, no cabfa esperar que una composicion de este tipo fuera especialmente adecuada para el cultivo de material biologico.
La composicion segun la invencion se puede fabricar de manera reproducible a gran escala y tiene una alta calidad constante. La composicion se distingue especialmente por su buena biocompatibilidad, su grosor de lamina muy fino, su transparencia relativamente elevada y su gran estabilidad mecanica, de forma que muestra un amplio espectro de aplicacion.
Se prefiere el uso de glicerol y/o sorbitol como poliol, con una concentracion prevista de 0 a 50% en peso (glicerol) o 0 a 40% en peso (sorbitol).
Esta medida tiene la ventaja de que se utilizan polioles cuya accion esta particularmente acreditada, a las concentraciones indicadas, como agentes de conservacion de la humedad o de retencion de agua como proteccion contra la desecacion.
Segun una variante, la composicion tiene los parametros siguientes:
Con esta medida, las concentraciones de los distintos componentes se optimizan de nuevo, de modo que se mejora nuevamente la adecuacion de la composicion para el cultivo de celulas biologicas.
En este sentido, es preferible que la grasa sea esencialmente un aceite vegetal.
El uso de aceite vegetal para obtener la composicion segun la invencion ha demostrado ser especialmente conveniente. De esta forma, el aceite vegetal mejora claramente las posibilidades de aplicacion de la composicion gracias al aumento de la extensibilidad. Asimismo, mediante el uso de un aceite vegetal es posible evitar los signos de rancidez y asf se puede mejorar la preparacion y conservacion de la composicion. Se debe entender que la composicion debe contener una fraccion minima residual de grasa animal, sin que se vean afectadas las ventajas del aceite vegetal.
Segun una realizacion especialmente preferida, el valor de pH de la composicion segun la invencion es de aprox. 5,0 a 8,0, preferiblemente 6,8 a 8,0, mas preferiblemente de 7,0 a 7,8 y, de manera particularmente preferida, de aprox.
7,2 a 7,5.
Tal como han descubierto los inventores, un cultivo de celulas biologicas a los valores de pH citados se lleva a cabo especialmente bien. Por lo tanto, la composicion tiene un valor de pH situado en el intervalo fisiologico y constituye un medio que se asemeja en gran medida al entorno natural de las celulas biologicas. Las composiciones disponibles en el comercio, por ejemplo, de la Compama Naturin GmbH & Co. KG, tienen por lo general un valor de pH de alrededor de 4,8. Bajo estas condiciones acidas no resulta posible, por ejemplo, el cultivo de material biologico susceptible al acido. El ajuste del valor de pH deseado se puede efectuar por incubacion de la composicion en, por ejemplo, una solucion tampon de fosfato que contiene calcio o magnesio, si bien resultan igualmente adecuados otros tampones habituales conocidos por el experto.
Teniendo en consideracion estos antecedentes, en la presente invencion tambien se describe un procedimiento para mejorar una composicion que tiene los parametros siguientes:
optimizando su adecuacion para el cultivo de celulas biologicas, en donde el procedimiento presenta las etapas siguientes:
(1) Preparar la composicion, y
(2) Ajustar el valor de pH hasta aprox. 5,0 a 8,0, preferiblemente, aprox. 6,8 a 8,0, mas preferiblemente, aprox. 7,0 a 7,8 y, de forma especialmente preferida, aprox. 7,2 a 7,5.
Con este “procedimiento de optimizacion” es posible mejorar de manera evidente y sencilla la adecuacion de las laminas disponibles en el comercio tales como, por ejemplo, las de la Comparua Naturin GmbH & Co. KG, como soporte para celulas biologicas. En este caso, la etapa (2) se lleva a cabo preferiblemente por medio de la incubacion de la composicion en una solucion tampon con un valor de pH de aprox. 7,2 a 7,5.
Preferiblemente, el procedimiento de optimizacion incluye una etapa (3) adicional, en la que la composicion se incuba con sustancias fuertemente liposolubles.
Esta medida tiene la ventaja de que, por ejemplo, usando acetona al 100%, se extraen las sustancias liposolubles. De este modo, es posible mejorar una vez mas la propiedad de la composicion para el cultivo de material biologico.
De forma adicional, en el procedimiento de optimizacion se prefiere que la etapa (3) comprenda la etapa (3.1), en la que tiene lugar un lavado de la composicion en una solucion tampon.
Con esta etapa (3.1) se separa el resto de sustancias liposolubles y, eventualmente, otros residuos contaminantes, de modo que la membrana este preparada para su uso o se puede procesar o transformar de forma adicional.
El procedimiento de optimizacion incluye, preferiblemente, una etapa (4) ulterior en la que se lleva a cabo el secado de la composicion.
Esta medida tiene la ventaja de que se puede obtener de esta forma un producto facil de manipular y que permite una conservacion practicamente ilimitada.
Segun una realizacion preferida, la composicion segun la invencion se acondiciona como una lamina plana.
Con esta medida, la composicion se prepara en una forma que resulta especialmente apropiada tanto para las aplicaciones de cultivos celulares como para el implante de material biologico en un organismo. La composicion segun la invencion acondicionada como lamina se puede cortar o troquelar de manera sencilla en cualquier forma y tamano.
En este contexto, la composicion se acondiciona preferiblemente como soporte o matriz o “andamio” para las aplicaciones de cultivos celulares o como soporte para el implante de material biologico, preferiblemente de celulas madre y celulas precursoras, o de celulas espedficas de un tejido en un organismo. Debido a su biocompatibilidad y sus propiedades estimuladoras de adherencia, resulta util para la inmovilizacion de las celulas. Este factor puede ser de gran importancia en el campo de la medicina regenerativa, por ejemplo, para el cultivo de ligamentos, tendones, tejido oseo y cartflago y, ademas, se puede aplicar tambien a otros tejidos. Por consiguiente, tambien es adecuada como recubrimiento de heridas. Adicionalmente, la composicion se puede usar, por ejemplo, en el campo de la cosmetica como recubrimiento de la piel. Ademas, debido a la composicion qrnmica de los colagenos, resulta especialmente apropiada para el acoplamiento de principios activos que actuan sobre las celulas tales como, por ejemplo, factores de crecimiento.
El hecho de que la lamina plana segun la invencion se adhiera, despues del secado, sobre superficies sinteticas lisas sin necesidad de ayudas adicionales de fijacion resulta especialmente conveniente. De este modo, la lamina forma, por ejemplo, junto con superficies de material sintetico para el cultivo celular una unidad libre de burbujas de aire que se conserva incluso en presencia de cultivos celulares exhaustivos. De esta manera, es posible prescindir de coadyuvantes de adhesion y fijacion que pueden afectar a las celulas durante el cultivo de las mismas. En el caso de aplicaciones espedficas, sin embargo, esta composicion se puede desprender con ayudas mecanicas, por ejemplo, pinzas, sin producir danos, retirando la lamina de la placa de cultivo celular con las celulas que crecen sobre ella.
De manera alternativa, la composicion se acondiciona como una cubierta tubular.
Esta realizacion es especialmente adecuada como reservorio de celulas y sustancias activas en ensayos de implantes.
La lamina plana o la cubierta tubular segun la invencion tienen, en estado seco, un grosor de aprox. 5 a 200 pm, preferiblemente, 10 a 100 pm, mas preferiblemente, de 15 a 30 pm, todavfa mas preferiblemente de aprox. 20 pm y, de manera especialmente preferida, de aprox. 15 pm.
Esta medida tiene la ventaja de que se puede preparar una lamina o cubierta especialmente delgada, que es transparente y, por lo tanto, susceptible de analisis al microscopio. No sucede lo mismo con los soportes para celulas basados en colageno conocidos en la actualidad por el estado de la tecnica. El grosor se determina, segun la invencion, en estado seco. En este caso, seco significa secado al aire, de modo que persiste un resto de humedad absoluta que es de entre aprox. 10% y 15%
Segun un desarrollo adicional preferido, la composicion se esteriliza por radiacion, lo cual se lleva a cabo preferiblemente por radiacion ionizante, mas preferiblemente por radiacion beta y/o radiacion gamma.
Esta medida tiene la ventaja de que se eliminan los organismos contaminantes y se pueden evitar en gran parte las contaminaciones del material biologico en cultivo. La esterilizacion por radiacion ofrece la ventaja de que no afecta al colageno sensible al calor.
En este contexto, el procedimiento de optimizacion tiene una etapa (5) adicional, en la que se efectua la esterilizacion por radiacion de la composicion.
Adicionalmente, se prefiere que la composicion segun la invencion tenga una sustancia colorante, preferiblemente un colorante capaz de absorber fluorescencia.
Para el diagnostico in vitro, la composicion se puede colorear de manera diferente. De esta forma, en los llamados ensayos de penetracion usados en experimentos farmacologicos, fisiologicos o citobiologicos se detectan celulas tenidas por fluorescencia, que ha penetrado a traves de la lamina, dado que, por ejemplo, una coloracion absorbente de fluorescencia de la composicion oculta las celulas fluorescentes en la que no se ha producido penetracion. En tal caso, en el estudio por microscopia de fluorescencia solo resaltan las celulas en las que se ha producido penetracion. Un objeto adicional de la presente divulgacion es un procedimiento para el cultivo de material biologico que incluye las siguientes etapas:
(1) Prepararde una composicion adecuada como soporte para material biologico;
(2) Poner en contacto el material biologico con la composicion, y
(3) Incubar la composicion con el material biologico bajo condiciones de cultivo,
en donde se utiliza como composicion la composicion descrita anteriormente en relacion con el uso segun la invencion. Un objeto adicional de la presente divulgacion se refiere a un metodo para implantar material biologico en un organismo que comprende las siguientes etapas:
(1) Preparar una composicion adecuada como soporte para material biologico;
(2) Poner en contacto el material biologico con la composicion, y
(3) Incluir el material biologico en contacto con la composicion en un organismo,
en donde se utiliza como composicion la composicion descrita anteriormente en relacion con el uso segun la invencion. Un objeto adicional de la presente memoria descriptiva se refiere al uso de la composicion segun la invencion para determinar el potencial de invasion y metastatizacion de celulas tumorales.
Los actuales procedimientos experimentales in vitro para determinar el potencial de invasion y metastatizacion de celulas tumorales se basan en el siguiente principio: se mide la capacidad de penetracion de las celulas tumorales a traves de una lamina de material sintetico perforado y no degradable. En ensayos in vitro se ha medido con este sistema, por ejemplo, la accion de medicamentos anticancerosos sobre la capacidad de penetracion de las celulas. No obstante, la capacidad invasiva de una celula tumoral no depende solamente de la capacidad de migracion a traves de poros (huecos) en el tejido conectivo, sino tambien de la capacidad de las celulas para degradar o remodelar enzimaticamente los componentes del tejido conectivo, a los que pertenecen en gran medida los colagenos. Con ayuda de la lamina de colageno biologico, y gracias a su reducido grosor, su homogeneidad y produccion estandarizada, ha sido posible preparar un nuevo sistema de ensayo de medicamentos para determinar la potencia proteolttica de celulas cultivadas. Para este metodo, las celulas se cultivan en un sistema bicameral. Las dos camaras se separan con la lamina de colageno. Las celulas que se analizan se cultivan en la camara superior, sobre la lamina. Despues del correspondiente periodo de cultivo, se cuantifica el numero de celulas que han migrado a traves de la membrana de colageno hacia la parte inferior de la membrana. Con ayuda de la composicion segun la invencion se abre, por tanto, un nuevo campo en el diagnostico in vitro.
La composicion segun la invencion se puede usar tambien para determinar la actividad proteolftica de celulas no tumorales y su potencial invasivo, por ejemplo, como ensayo de vitalidad de celulas madre.
La invencion se refiere ademas a los siguientes objetos:
1. Uso de una composicion para determinar el potencial de invasion y metastasis de las celulas tumorales, en la que la composicion utilizada es la composicion para el uso de acuerdo con la invencion,
2. Procedimiento para el cultivo de material biologico, que tiene las siguientes etapas:
(1) Preparar una composicion apropiada como soporte para material biologico;
(2) Poner en contacto el material biologico con la composicion, y
(3) Incubar la composicion con el material biologico bajo condiciones de cultivo,
en donde como composicion se usa una composicion utilizada de acuerdo con la invencion.
3. Procedimiento para implantar material biologico en un organismo, que comprende las etapas de:
(1) Preparar una composicion apropiada como soporte para material biologico;
(2) Poner en contacto el material biologico con la composicion, y
(3) Introducir el material biologico en contacto con la composicion en un organismo,
en la que la composicion utilizada es la composicion para el uso de acuerdo con la invencion,
4. Procedimiento para mejorar una composicion adecuada para el cultivo de celulas biologicas, con los siguientes parametros:
que comprende las siguientes etapas:
(1) Proporcionar la composicion, y
(2) Ajustar el pH a un valor de aproximadamente 5,0 a 8,0, preferiblemente aproximadamente 6,8 a 8,0, mas preferiblemente aproximadamente 7,0 a 7,8, mas preferiblemente aproximadamente 7,2 a 7,5;
5. Procedimiento de acuerdo con 4, en donde la etapa 2 comprende la siguiente etapa:
(2.1) Incubar la composicion en una disolucion tampon con un pH aproximadamete de 7,2 a 7,5.
6. Procedimiento segun 4 o 5, que comprende la siguiente etapa adicional:
(3) Incubar la composiciones en sustancias altamente solubles en grasas.
7. Procedimiento segun 6, que comprende la siguiente etapa adicional:
(3.1) Lavar la composicion en una disolucion tampon.
8. Procedimiento segun 4 a 7, que comprende la siguiente etapa adicional:
(4) Secar la composicion.
9. Procedimiento segun 4 a 8, que comprende la siguiente etapa adicional:
(5) Esterilizar la composicion mediante radiacion.
Debe entenderse que las caractensticas anteriormente mencionadas y las que se explicaran mas adelante se pueden utilizar no solo en la combinacion citada en cada caso, sino tambien en otras combinaciones o de forma aislada, sin apartarse del marco de la presente invencion.
A continuacion, la invencion se explicara de forma mas detallada sobre la base de los ejemplos de realizacion, a partir de los que se pueden deducir caractensticas y ventajas adicionales, asf como otras propiedades de la invencion. Para ello, se hara referencia a las figuras adjuntas en las cuales se observa:
Fig. 1: Muestra una estructura de colageno con un grosor de 20 pm para una placa de cultivo celular con 6 pocillos (A); una cubierta tubular segun la invencion como reservorio de celulas para ensayos de implante (B, B').
Fig. 2: Muestra el resultado de un ensayo de proliferacion con bromodesoxiuridina (BrdU) en celulas madre mesenquimales humanas (hMSC). Analisis inmunocitoqmmico de las celulas positivas para BrdU. Las celulas se cultivaron sobre una superficie plastica de cultivo convencional (A, A') y sobre una matriz de colageno segun la invencion (B, B') y se incubaron durante 1 hora con BrdU.
Fig. 3: Muestra el resultado de un ensayo de proliferacion con BrdU (A) y del ensayo MTT (B) en celulas madre mesenquimales humanas (hMSC) cultivadas sobre una matriz de colageno y una superficie plastica de cultivo convencional. Se representan los valores medios con las correspondientes desviaciones estandar.
Fig. 4: Muestra una vista de planta sobre una matriz de colageno mineralizada, cultivada junto con hMSCs bajo condiciones de diferenciacion osteogenica (A, A'); actividad de fosfatasa alcalina de osteoblastos embrionarios (E18) de raton procedentes del craneo tras una fase de cultivo de dos semanas sobre la matriz de colageno (B, B'). Fig. 5: Muestra una seccion transversal en parafina a traves de la matriz de colageno cultivada con celulas progenitoras osteogenicas de osteoblastos embrionarios (E18) de raton derivadas del craneo, bajo condiciones de proliferacion (A, A') o bajo condiciones de diferenciacion osteogenica (B, B'). La figura B o B' explican la mineralizacion general de la matriz tridimensional. La capacidad de integracion y penetracion depende del tipo de celula.
Fig. 6: Muestra la implantacion de una estructura tubular segun la invencion, libre de celulas, en un raton C57/BL6 (A) y la matriz implantada despues de 6 semanas en el raton desnudo (B).
Fig. 7: Muestra la lamina tubular segun la invencion inmediatamente antes del implante, sembrada durante un dfa con hMSCs (A), y el implante incluido en tejido conectivo, extrafdo despues de 6 semanas (B).
Fig. 8: Muestra una imagen ampliada de la lamina tubular segun la invencion tras la retirada, despues de 6 semanas en un raton C57/BL6. Se reconocen claramente los vasos sangumeos que estan incluidos en la lamina de colageno. Fig. 9: Muestra las tinciones de HE en un corte de parafina tomado del implante retirado.
Ejemplos de realizacion
1. Composicion que contiene colageno
Los inventores han utilizado siete laminas disponibles en el comercio de la Comparua Naturin GmbH & Co. KG, concluyendo que son apropiadas para el uso segun la invencion. Los parametros de las laminas disponibles en el comercio analizadas se muestran en la Tabla 1 siguiente:
Tabla 1: Parametros de las laminas basadas en colageno, comercializadas por Naturin
1.1 Fabricacion de composiciones segun la invencion en forma de lamina
Como material de partida para la fabricacion de composiciones segun la invencion en forma de lamina se utilizan las capas inferiores de cuero bovino, que cumplen las especificaciones relativas a trazabilidad y los requisitos higienicos establecidos en la Directiva (CE) N° 853/2004.
Estas capas inferiores de cuero bovino se trituran mecanicamente en forma grosera y en multiples etapas procedimentales siguientes, se lavan con agua y finalmente se someten a digestion alcalina. El grado de digestion alcalina se puede variar y depende de factores tales como duracion del tratamiento, concentracion del medio alcalino (valor de pH) y temperatura. Por lo general, se utiliza lechada de cal o sosa caustica, o mezclas de estos dos componentes, para el ajuste del medio alcalino, si bien otros compuestos basicos son igualmente adecuados. El tratamiento alcalino se lleva a cabo a un valor de pH de, por ejemplo, 12,5 y puede prolongarse durante, por ejemplo, 15 h hasta 150 h, en funcion de la intensidad prevista de la digestion del cuero. El nitrogeno de amida se ha acreditado como un parametro posible para hacer un seguimiento del grado de digestion del tejido colageno: cuanto mas intensiva es la digestion, menor es el nitrogeno de amida.
Despues de alcanzar el grado de digestion deseado, se acidifica y, a continuacion, se lava con agua multiples veces. La acidificacion tiene lugar, habitualmente, con acido clorhudrico durante un espacio de tiempo de 6 a 10 h; de esta forma, se alcanza un valor de pH <2, preferiblemente <1. Tambien es posible usar otros acidos. Por medio de multiples etapas posteriores de lavado con agua, el valor de pH se incrementa finalmente a 2,6 hasta 3,3.
A continuacion, las “cortezas de colageno” resultantes se someten a un procedimiento mecanico de molienda y el material triturado se hace pasar a presion a traves de placas perforadas con dimensiones gradualmente menores de poro hasta obtener una masa viscoelastica de tipo gel.
1.1.1 Acondicionamiento como lamina plana (Composicion N° 1)
Esta masa de colageno “concentrada” se transfiere a un dispositivo de agitacion, en el que se incorporan glicerol, agua y acido. Al mismo tiempo, se realiza el ajuste del valor de pH a preferiblemente 2,6 a 3,2 y el contenido de colageno seco se ajusta a entre 1,6% en peso y 2,5% en peso. La mezcla se hace pasar seguidamente por un homogeneizador, se extrae el aire y, a continuacion, se vierte mediante una boquilla ranurada sobre una cinta transportadora sobre la que la pelfcula de gel resultante se hace pasar por una secadora de tunel. Antes de entrar en la secadora, se trata preferiblemente con gas de amoniaco, aumentando de este modo el valor de pH del gel. En el extremo final de la secadora la pelfcula seca de hace pasar por una zona de rehumidificacion antes de enrollarla.
1.1.2 Acondicionamiento como cubierta tubular (Composiciones N° 2 a 7)
La masa viscoelastica de colageno del punto 1.1 se transfiere a una mezcladora amasadora a la que se incorpora, de acuerdo con la formulacion, glicerol. Simultaneamente, por medio de la adicion de agua y acido se lleva a cabo el ajuste del valor de pH y del contenido de materia seca.
A continuacion, la masa homogenea se extruye a traves de una boquilla de ranura anular. De este modo, se produce una cubierta tubular sinfm. Mediante la incorporacion simultanea de aire de soporte se impide que la cubierta tubular se colapse.
El transporte de la cubierta tubular inflada a traves de la lmea de extrusion se lleva a cabo de manera diferente en funcion del tipo de funda que se debe producir. En principio, existe la posibilidad de someterla a banos de ducha que contienen sustancias qrnmicas y secciones de secado en secuencias variables. Al final de la lmea de extrusion, la cubierta tubular seca se deposita en plano entre rodillos de prensado y se enrolla en bobinas en este estado.
Las laminas tubulares obtenidas de este modo se someten, seguidamente, a un tratamiento termico, mediante el cual desarrollan la estabilidad mecanica necesaria para su uso posterior. Las composiciones segun la invencion, en forma de lamina o tubo, se pueden preparar tambien usando otras fuentes de colageno, en donde determinados detalles de la produccion del gel de colageno pueden diferir de la descripcion anterior. Por ejemplo, a partir de colageno de piel porcina, se debe establecer una forma adecuada para reducir el contenido de grasa que se describe, por ejemplo, en los documentos DE 10060643 y EP 1423016. El uso de intestinos naturales para fabricar una masa de colageno se describe, por ejemplo, en el documento ES 2017564. Estos documentos se incorporan como referencia a la descripcion de la presente solicitud, formando parte de la misma.
1.2 Ajuste del valor de pH
El ajuste del valor de pH se lleva a efecto usando tampon de fosfato que contiene calcio y magnesio [solucion salina tamponada con fosfato (PBS) con Ca++ y Mg++ (PAA H15-001)] que ajusta el valor de pH de la lamina basada en colageno en el intervalo fisiologico de pH 7,2 a pH 7,5. Para ello, la lamina de colageno se enjuaga, con agitacion, durante 5 dfas con el sistema de tampon. El tampon se cambia dos veces al dfa.
De manera alternativa, la membrana de colageno se puede sumergir tambien durante una hora en un tampon de fosfato que contiene glicerol, con un valor de pH de 7,3 (tampon de fosfato: en 7.722 g de agua destilada se disuelven
15,6 g de KH2PO4, 71,3 g de Na2HPO4 x 2 H2O y 492,9 g de glicerol). A continuacion, la pelfcula tratada de esta forma se deja escurrir, se fija en un bastidor tensor y se deja secar a temperatura ambiente durante la noche.
1.3 Preparacion opcional adicional
Despues de un breve periodo de equilibrado en agua destilada, la membrana de colageno se trata con acetona al 100% para la extraccion de sustancias liposolubles y la precipitacion de protemas hidrosolubles. Despues de retirar la acetona a presion reducida, la membrana seca se lava tres veces con tampon de fosfato que contiene calcio y magnesio (en g/l: KCl 0,2; KH2PO40,2; NaCl 8,0; Na2HPO4 anhidro 1,15; CaCl2-2H2O en H15-001 0,123; MgCl2-2H2O en H15-001 0,1). Para eliminar las sales del tampon se llevan a cabo tres procesos de lavado en agua destilada, de 1 hora de duracion cada uno.
1.4 Secado
La membrana o lamina obtenida se seca. Esto se puede hacer en un armario de secado a 60°C, en donde se pueden alcanzar valores de humedad de <5%, por ejemplo, 3%. La membrana tambien se puede secar a temperatura ambiente exponiendola simplemente al aire, de manera que se establece finalmente una humedad de equilibrio de la membrana o lamina, dependiente de la humedad relativa del aire que, habitualmente, se encuentra entre aprox. 8% en peso y aprox. 13% en peso.
1.5 Conformacion y esterilizacion por radiacion
Las membranas de colageno o laminas de colageno secas obtenidas se pueden cortar o troquelar en cualquier forma, por ejemplo, como hojas de tamano DINA5. Estas se esterilizan por radiacion beta o gamma a 25 kGy o 50 kGy. La lamina de colageno se puede confeccionar como revestimiento para placas de plastico huecas de cualquier estructura, por ejemplo, placas de microtitulacion o, preferiblemente, se producen como cubiertas tubulares sin costura con diametros de <2 mm, aprox. 12 mm hasta varios centimetros. Asimismo, es posible unir las laminas por soldadura termica o pegado.
1.6 Parametros de las composiciones segun la invencion producidas en forma de lamina
En la Tabla 2 siguiente se muestran los parametros de diferentes laminas de colageno obtenidas segun los procedimientos anteriormente descritos segun el punto 1.1.1, en donde no se han llevado a cabo los pasos segun el apartado 1.3.
Tabla 2: Parametros de las laminas fabricadas, basadas en colageno
(*) Para cada una de las muestras 1 a 6 se prepararon 5 sub-muestras: sin esterilizacion (a), radiacion beta 25 kGy (b), radiacion beta 50 kGy (c), radiacion gamma 25 kGy (d) y radiacion gamma 50 kGy (e)
Se utilizaron los siguientes metodos analfticos:
Determinacion de colageno sobre hidroxiprolina / nitrogeno de amida, analogo al documento EP1676595 (Geistlich Sohne AG) / glicerol sobre HPLC / aceite vegetal por extraccion por Soxhlet / sorbitol sobre HPLC / ceniza, gravimetna tras calcinacion en horno de mufla, (5 h a 600°C) / contenido de agua, gravimetna despues de secar en armario de secado a 105°C / valor de pH, corte de la pelfcula en trozos pequenos, incorporacion de los recortes en una solucion de NaCl al 5% y medicion por electrodos de vidrio despues de 10 min / peso por unidad de superficie, por pesada de un trozo de pelfcula de 10 cm x 10 cm con humedad de equilibrio / valor de rotura longitudinal y transversal por medio de una maquina universal de ensayo UTS (Tipo 3/205, UTS Testsysteme GmbH) despues de aclimatar a 21°C / humedad relativa de 60% de las probetas perforadas y una velocidad de cruceta de 100 mm/min.
2. Cultivo de material biologico
2.1 Acondicionamiento de la composicion
Figura 1 muestra una lamina de colageno segun la invencion, con un grosor de 20 pm, acondicionada como revestimiento para un pocillo de una placa de cultivo celular (A). En la imagen parcial (B) se muestra una cubierta tubular que, en la imagen parcial (B'), aparece representada de forma esquematica. Con el numero de referencia 1 se muestra la cubierta tubular. Con el numero de referencia 2 se representan las celulas que se pueden incorporar en el interior de la cubierta tubular. Con el numero de referencia 3 se representa un principio activo o los factores de crecimiento que se pueden introducir igualmente en la cubierta para actuar sobre las celulas biologicas.
2.2 Comportamiento proliferativo de celulas humanas
El comportamiento proliferativo de celulas humanas, celulas madre mesenquimales MSC y de la lmea celular humana SaOS2 sobre la lamina de colageno segun la invencion no mostro ninguna diferencia con respecto al procedimiento de cultivo convencional en la placa de cultivo de plastico; Figura 2. Las celulas se cultivaron en una superficie convencional de cultivo de plastico (A) y sobre una lamina de colageno segun la invencion (B) y se incubaron durante 1 hora con BrdU. En la representacion esquematica (B') la lamina de colageno se designa con 1, las celulas, con 2, las fibras de colageno, con 5 y con 6 se indican las celulas positivas para BrdU. La valoracion estadfstica del ensayo de proliferacion con BrdU (A) y el ensayo de vitalidad MTT (B) se representa en la Figura 3.
De acuerdo con la misma, no se observan diferencias significativas entre la lamina de colageno segun la invencion y las placas de plastico convencionales.
2.3 Biocompatibilidad
Para evaluar la biocompatibilidad de la lamina de colageno segun la invencion, se cultivaron sobre esta matriz tanto celulas progenitoras embrionarias de craneo de raton como hMSCs, bajo condiciones de diferenciacion osteogenica. Los resultados se muestran en la Figura 4.
La imagen parcial (A) muestra una vista sobre una matriz de colageno segun la invencion, que se cultivo junto con hMSCs bajo condiciones de diferenciacion osteogenica. La imagen parcial (B) muestra la actividad de fosfatasa alcalina de osteoblastos embrionarios de raton, derivados del craneo, despues de una fase de cultivo de 2 semanas sobre la lamina de colageno segun la invencion. En las imagenes parciales esquematicas (A') o (B'), el numero 1 designa la membrana de colageno, 2a, las celulas y 2b, las celulas tras la deteccion de la actividad de fosfatasa alcalina celular.
La demostracion de la actividad de fosfatasa alcalina y de la mineralizacion inducida por las celulas explica el potencial de diferenciacion de las celulas cultivadas y, por lo tanto, la biocompatibilidad de la matriz segun la invencion.
2.4 Cultivo de estructuras de tejido tridimensionales
A partir de laminas de colageno colonizadas se prepararon cortes transversales de parafina. En los mismos, se analizo la mineralizacion desde el punto de vista histoqmmico. La Figura 5 muestra los resultados. La imagen parcial (A, A') muestra el corte transversal sobre parafina bajo condiciones de proliferacion y la imagen parcial (B, B'), bajo condiciones de diferenciacion osteogenica. La lamina de colageno se indica con 1, las celulas, con 2 y con el numero 4 se designan las inclusiones de nitrato de plata.
Este experimento demuestra, por una parte, el elevado potencial de mineralizacion y, por otra, la capacidad de integracion de las celulas en el interior de la lamina/matriz tridimensional. Con ayuda de esta matriz tridimensional es concebible el cultivo de estructuras de tejido tridimensionales
2.5 Implantes
En ratones desnudos y C57/BL6 se llevaron a cabo experimentos de implantacion. Con ese fin, se implantaron cubiertas tubulares segun la invencion cargadas con celulas en la region situada entre el tejido subcutaneo y el peritoneo. El resultado de este experimento se muestra en la Figura 6. La imagen parcial (A) muestra el implante y la imagen parcial (B), la matriz segun la invencion implantada despues de 6 semanas en el raton desnudo. La flecha
indica la cubierta tubular segun la invencion cargada de celulas. En la imagen parcial (B) se puede localizar perfectamente la cubierta tubular fijada con hilo no biodegradable, gracias a los puntos de fijacion; flecha punteada. La preparacion muestra claramente en la imagen parcial (B) la cubierta tubular segun la invencion todavfa presente.
En la imagen parcial (A) de la Figura 7 se representa la cubierta tubular segun la invencion inmediatamente antes de la implantacion, colonizada durante un dfa con hMSCs. En la imagen parcial (B) se muestra el implante crecido en el tejido conectivo, extrafdo despues de 6 semanas. Se demuestra que, incluso 6 semanas despues de la implantacion, se mantiene la integridad de la cubierta tubular, a pesar de los procesos incipientes de resorcion.
El implante se ha incorporado claramente en el tejido conectivo del animal y esta atravesado por vasos sangumeos; vease la Figura 8 (A, A'). En la representacion esquematica (A') se indica con 1 la membrana de colageno, con 2, las celulas, con 5, las fibras de colageno y con el numero 7 se indican los vasos sangumeos.
Los analisis inmuno-histologicos en cortes de parafina tenidos con HE (hematoxilina eosina) muestran celulas que han migrado a la lamina segun la invencion; vease la Figura 9. En la zona del implante (A, flecha) se puede determinar claramente un vaso sangumeo. En la representacion esquematica (A') se indica con 1 la cubierta tubular, con 2, las celulas, con 5, las fibras de colageno, con 7, un vaso sangumeo y el numero 8 indica el tejido conectivo.
3. Conclusion
Los inventores han podido preparar una composicion que contiene colageno, por ejemplo, en forma de lamina o cubierta, que se puede producir de manera reproducible a gran escala y que resulta especialmente apropiada para el cultivo y generacion de material biologico.
Claims (14)
1. Uso de una composicion para el cultivo de celulas biologicas, que muestra los parametros siguientes:
2. Uso segun la reivindicacion 1, caracterizado por que. el poliol se selecciona de:
3. Uso segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la grasa es, fundamentalmente, aceite vegetal.
4. Uso segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el valor de pH es de aprox. 5,0 a 8,0, preferiblemente, de aprox. 6,8 a 8,0, mas preferiblemente de aprox. 7,0 a 7,8 y, mas preferiblemente, de aprox. 7,2 a 7,5.
5. Uso segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la composicion esta acondicionada como lamina plana.
6. Uso segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la composicion esta acondicionada como una carcasa tubular.
7. Uso segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la composicion en estado seco tiene un grosor de aprox. 5 a 200 pm.
8. Uso segun la reivindicacion 7, caracterizado por que la composicion en estado seco tiene un espesor de aproximadamente 5 a 100 pm, mas preferiblemente, de aprox. 10 a 30 pm y, muy preferiblemente, de aprox. 15 pm.
9. Uso segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la composicion esta acondicionada como soporte para aplicaciones de cultivo celular.
10. Uso segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la composicion esta acondicionada como soporte para implantes de material biologico, preferiblemente de precursores de las celulas madre en un organismo.
11. Uso segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la composicion se esteriliza por radiacion.
12. Uso segun la reivindicacion 11, caracterizado por que la estirilizacion por radiacion se efectua mediante radiacion ionizante.
13. Uso segun la reivindicacion 12, caracterizado por que la radiacion ionizante es radiacion beta y/o radiacion gamma.
14. Uso segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la composicion segun la invencion tiene un colorante, preferiblemente un colorante que absorbe fluorescencia.
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