JP5638950B2 - コラーゲン含有細胞担体 - Google Patents

Description

本発明は、生体細胞を培養するためのコラーゲン含有組成物の使用、生体細胞の培養方法、生体材料の生体への埋め込み方法、および生体細胞の培養に対する組成物の適合性の改良方法に関する。

生体細胞を培養するための担体は、当該技術分野において一般に知られている。このような担体は、多くの場合、マトリックスまたは足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）と称される。このような担体は、培養地、または一般に細胞培養において細胞が成長する基盤となる。

コラーゲン含有組成物は、最もよく知られた種類の細胞担体である。動物性タンパク質の細胞外マトリックスとしてのコラーゲンは、硬タンパク質に属し、通常、水不溶性で線維性の構造である。コラーゲンは、皮膚、血管、靭帯、腱、軟骨等の結合組織の構造、および骨や歯の構造の主要成分の１つである。このような特徴があるため、動物由来のコラーゲン系の生体材料はここ数年にわたり医療分野において既に使用されている。特に、硬膜の代替物として用いられる臨床的に適用可能な止血用の製品として、または様々な形成外科処置領域において、コラーゲンは担体材料として定着している。このようなコラーゲンとして、現在までに２８種の様々なコラーゲンが確認されており、さらに、個々の生物種間でごくわずかしか違いのない、コラーゲン様領域を有するタンパク質が少なくとも１０種類は報告されている。異物として同定される型が見出されておらず、酵素により分解されても毒性をもつ分解産物が少しも生じないため、コラーゲンは生体適合性を有するとみなされている。

現在に至るまで市場で提供されてきたコラーゲンマトリックスは、非常に様々な特性をもつ。生体細胞の培養に使用されるコラーゲンマトリックスのいくつかは、インビトロで使用すると、異化代謝過程へと至る炎症反応を引き起こすことがわかった。現在入手可能なコラーゲンマトリックスのまた別の欠点は、通常２００μｍを超えるほど分厚いため、顕微鏡下で観察できないことである。さらに、生体細胞の培養用に提供されるコラーゲンマトリックスは、現在まで非常に高価であった。

細胞培養をするための代替の担体として、いわゆるヒドロゲルが挙げられる。ヒドロゲルは、含水性であるが水不溶性のポリマーであり、その分子は化学的に（共有結合やイオン結合等により）または物理的に（ポリマー鎖の相互結合等により）結合して三次元網目構造をなしている。親水性のポリマー成分が集積しているため、水中で大幅に体積を増加しながら膨張するが、凝集力を失うことはない。しかしながら、ヒドロゲルの欠点は、その非常に高い保水能により、物理的に不安定になることである。

さらに、ヒドロゲルは、細胞と定着する際にしばしば凝縮する。したがって、ヒドロゲルは非常に限定的にしか使用できない。

生体細胞と定着させるのに適した別のマトリックスとして、いわゆるヒアルロン酸が挙げられる。このマトリックスは、軟骨マトリックスに含まれる巨大分子からなり、非修飾形態において高い生体適合性を示す。物理的に十分な弾性を有する好適な構造体を作製するためには、ヒアルロン酸の分子鎖同士を結合する必要がある。この結合は、アルコールとのエステル化によってなされるが、この処理により生体適合性が低下する可能性がある。

また別の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）として、いわゆるアルギン酸塩が挙げられる。これは褐藻類から得られるコポリマーに関連し、Ｌ−グルロン酸およびＤ−マンヌロン酸からなる。アルギン酸塩からなる製品は、ＥＤＴＡおよび／またはクエン酸Ｎａを添加することによりゲル化または液状化できる。これにより、既に記載したコラーゲン系のゲルと同様の、細胞培養をするための特性がアルギン酸塩に付与でき、しかも、細胞生物学的分析および分子生物学的分析をする際に再懸濁しやすくなる。インビトロにおいて、この材料は他の担体マトリックスに勝る利点および良好な特性をもつにもかかわらず、インビボで使用すると結果は良くない。インビボでは、この物質は吸収されにくく、強力な免疫反応および異物反応を引き起こす。したがって、アルギン酸塩はヒト用インプラントの担体材料として使用するには未だ適していない。

また別の生体細胞用の担体材料として、アガロースが挙げられる。これはアルギン酸塩と同様の挙動を示す。アガロースは２種類の糖鎖からなり、紅藻類の細胞壁から得られる。アルギン酸塩と同様、アガロースはインビボで使用すると免疫反応および異物反応を引き起こすため、ヒト用インプラントには未だ使用することができない。

また別の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）として、フィブリン系のものが挙げられる。これは球状の血漿タンパク質に関連し、特に「網状となる」重合能により血液を凝固させる。しかしながら、現在まで、フィブリンもインビボで使用するための試験に耐えるものではない。細胞担体としてフィブリンを使用するには、大部分がまだ未開発であり、なお広範囲な評価が行われるべきである。さらに、フィブリンは非常に高価である。

生体細胞の培養に使用されるまた他のマトリックスとして、キチンまたはキトサン系のものが挙げられる。キチンは、キトサンを生成するための原料となる。キトサンを生成するために、キチンのアセチル基は化学的または酵素的に切断される。キチンおよびキトサンはいずれも生体高分子であり、この２つを明確に区別する線を引くことはできない。通常、脱アセチル化の度合いが４０〜５０％より高く、有機酸に可溶性であると、キトサンと称される。しかしながら、キチンおよびキトサンは適用できる範囲が非常に限定的であり、これらが細胞培養に使用可能であることも示されていない。キチンは体内で生成される物質ではないため、生体にとっては常に異物である。細胞担体としてのキチンの使用については、なお基礎研究が行われるべきである。

現在、数多くの人工の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）も試験されている。このようなポリマーとしては、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＰＬＡ）（「生体ガラス」とも称される）等が挙げられる。ＰＬＡおよびＰＧＡの特性として、水性溶媒への低可溶性が挙げられる。この低可溶性は、分子量の小さいオリゴマーまたはモノマーへのポリマー鎖の分解、すなわち加水分解によってのみ改良され、結果としてこれらの物質の腐食が起こる。しかしながら、このようなポリマーは生体材料の培養に適していないことが示されている。自発的加水分解により、吸収性ポリマーが崩壊し有機酸が生じる。骨芽細胞は酸性環境で分化するため、このようなポリマーが多量に存在すると、骨の構築ではなく骨の破壊が起こりうる。

このような背景のもと、本発明の主な目的は、当該技術分野の細胞担体について知られている欠点を有さない、生体細胞を培養するための新規組成物を提供することである。特に、一定して高品質かつ経済的に大量生産できる組成物を提供する。

前記目的は、
生体細胞の培養のための組成物の使用であって、
パラメータ：
コラーゲン（ｗｔ％）：約３０〜８０、
アミド窒素（ｗｔ％）：約０．０６〜０．６、
ポリオール（ｗｔ％）：約０〜５０、
油脂（ｗｔ％）：約０〜２０、
灰分（ｗｔ％）：約０〜１０、
水（ｗｔ％）：約５〜４０、
ｐＨ値：約３〜１０、
単位面積あたりの重量（ｇ／ｍ^２）：約１０〜１００、
抗張力（Ｎ／ｍｍ^２）：約０．５〜１００または２０〜１００
を有することを特徴とする組成物の使用によって達成される。

このような組成物は、Ｎａｔｕｒｉｎ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ（Ｂａｄｅｎｉａｓｔｒａｓｓｅ １３，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）から、フィルムの形状で既に市販されている。Ｎａｔｕｒｉｎが指定しているこれらのフィルムの参照番号は、４０００１１８９９、４０００２３７４７、４０００２４２０３、４０００２６１９３、４０００１９４８５、４００００００８４、４０００００１０９等である。

前記の発見は、驚くべきことであった。現在までこのような組成物は食品業界において独占的に使用されており、例えば、ハムの製造分野で網と肉とを分離するフィルムに使用されている。何よりも、このような組成物が生体材料の培養に特に適していることは予想されなかった。

本発明の組成物は大量に複製可能であり、一定して高品質である。この組成物は、良好な生体適合性、非常に薄い膜厚、比較的高い透明性および高い物理的安定性をもつため優れており、広範囲な用途をもつ。

さらに、前記ポリオールとして、グリセリンおよび／またはソルビトールを使用する場合は、グリセリンの濃度が０〜５０ｗｔ％、ソルビトールの濃度が０〜４０ｗｔ％であることが好ましい。

この手段は、上記規定の濃度において特に効果を発揮するポリオールを、乾燥を抑制するための湿潤剤または水結合剤として使用できるという利点を有する。

特定の構成では、前記組成物のパラメータは、
コラーゲン（ｗｔ％）：約５０〜７０、
アミド窒素（ｗｔ％）：約０．１４〜０．４、
グリセリン（ｗｔ％）：約１２〜３５、
油脂（ｗｔ％）：約３〜７、
ソルビトール（ｗｔ％）：約０〜２０、
灰分（ｗｔ％）：約０．５〜３、
水（ｗｔ％）：約１２〜１８、
ｐＨ値：約５．５〜８、
単位面積あたりの重量（ｇ／ｍ^２）：約２０〜４０、
抗張力（Ｎ／ｍｍ^２）：約５〜２５または４０〜８０
である。

生体細胞の培養に対する該組成物の適合性をさらに改良できるように、個々の成分の濃度をこの方法によりさらに最適化した。

上記目的を達成するため、油脂は実質的に植物油であることが好ましい。
本発明の組成物を保存するために植物油を使用すると、特に有益であることが判明した。植物油の使用により弾性が増大するため、該組成物の適用範囲が明らかに広くなる。また、植物油を使用することにより酸敗臭を抑制することができ、該組成物の製造および保存が容易となる。ごく僅かな量の動物油脂が残留していたとしても、植物油の利点が打ち消されないことは明白である。

特に好ましい構成では、本発明の組成物のｐＨ値は約５．０〜８．０、好ましくは６．８〜８．０、より好ましくは７．０〜８、最も好ましくは約７．２〜７．５である。

本発明者らが見出したように、上記規定のｐＨ値において生体細胞の培養は特に良い結果を示す。すなわち、該組成物は生理学的範囲内のｐＨ値を有するため、生体細胞の自然環境と非常によく似た状況を作り出す。Ｎａｔｕｒｉｎ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ等から市販されている組成物は、通常約４．８のｐＨ値を有する。このような酸性環境では、例えば、酸に対して感受性を示す生体材料の培養は不可能である。所望のｐＨ値は、例えばカルシウムまたはマグネシウムを含有するリン酸緩衝液中で、該組成物をインキュベーションすることにより調整できる。当業者に周知の従来の緩衝液も同様に、この調整に適している。

このような背景のもと、本発明の別の目的は、
生体細胞の培養に対する組成物の適合性の改良方法であって、
該組成物のパラメータが、
コラーゲン（ｗｔ％）：約３０〜８０、
アミド窒素（ｗｔ％）：約０．０６〜０．６、
ポリオール（ｗｔ％）：約０〜５０、
油脂（ｗｔ％）：約０〜２０、
灰分（ｗｔ％）：約０〜１０、
水（ｗｔ％）：約５〜４０、
ｐＨ値：約３〜１０、
単位面積あたりの重量（ｇ／ｍ^２）：約１０〜１００、
抗張力（Ｎ／ｍｍ^２）：約０．５〜１００または２０〜１００
であり、
（１）該組成物を用意する工程と、
（２）該ｐＨ値を約５．０〜８．０、好ましくは約６．８〜８．０、より好ましくは約７．０〜７．８、最も好ましくは約７．２〜７．５に調整する工程と
を含む改良方法に関するものである。

この「改良方法」により、例えばＮａｔｕｒｉｎ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ等から提供されている市販のフィルムは、細胞培養担体として使用するのに明らかに改良された適合性を示す。前記工程（２）は、約７．２〜７．５のｐＨ値を有する緩衝液中で、該組成物をインキュベーションして行われることが好ましい。

前記改良方法は、好ましくは、該組成物を高脂溶性物質とともにインキュベートする工程（３）をさらに含む。

この工程は、例えば、１００％アセトンを使用することにより脂溶性物質を抽出できるという利点を有する。生体材料を培養するための該組成物の品質は、このようにしてさらに改良することができる。

本発明の改良方法を実施する際に、前記工程（３）が、該組成物を緩衝液中で洗浄する工程（３．１）をさらに含むことが好ましい。

前記工程（３．１）を実施する際に、残留した高脂溶性物質、および必要に応じて他の汚染残留物もこの膜から除去されるため、すぐに使用できる状態またはさらなる加工もしくは処理ができる状態となる。

好ましくは、本発明の改良方法は、該組成物を乾燥する工程（４）をさらに含む。
この工程は、簡単に取り扱えて、ほぼ無期限に保存することのできる製品を得ることができるという利点を有する。

好ましい構成では、本発明の組成物は平坦なフィルムとして構成される。
この構成により、該組成物を、細胞培養と生体材料の生体内への埋め込みとの両方に特に適した形状で提供できる。フィルムとして構成された本発明の組成物は、任意の形状または大きさへと容易に切断したり、型抜くことができる。

このような背景のもと、該組成物は、細胞培養用の担体、マトリックス、「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」として、または生体材料、好ましくは幹/前駆細胞や特定の組織細胞を生体へ埋め込むための担体として構成される。また、生体適合性および付着支持性により、細胞を固定するために該組成物を使用することができる。このことは、靱帯、腱、骨、軟骨用の細胞培養等の再生医療分野に大いに関連する。さらに、該組成物を他の組織に使用することもできる。該組成物は、創傷用被覆材としての使用にも適している。さらに、該組成物は、皮膚用被覆材として化粧品分野等において使用することもできる。さらに、コラーゲンの化学組成により、該組成物は、成長因子等の細胞に影響を及ぼす成分とともに使用するのに特に適している。

本発明の平坦なフィルムの特別な利点として、なんら特別な手段がなくても乾燥後に平坦な合成表面上に付着できることが挙げられる。これにより、例えば、細胞培養用のプラスチック表面上に、該フィルムを用いて気泡のないユニットを作製することができ、温和な条件下であれば細胞培養中も、該ユニットは原形のまま維持される。したがって、細胞培養において細胞に影響を及ぼす接着手段および固定手段はなくても良い。しかしながら、特定の用途においては、ピンセット等の器具を使用することにより、損傷を与えることなくこの接着を外すことができ、上面で培養された細胞をつけたまま細胞培養皿から該フィルムを外すことができる。

別の方法として、本発明の組成物は管状ケーシングとして構成される。
この構成は、埋め込み試験の際に、細胞および活性物質を保持するのに特に適している。

乾燥状態において、本発明の平坦なフィルムまたは管状ケーシングの厚さは、約５〜２００μｍ、好ましくは１０〜１００μｍ、より好ましくは１５〜３０μｍ、より好ましくは約２０μｍ、最も好ましくは約１５μｍである。

この構成は、顕微鏡下の観察が可能な、透明でとりわけ薄いフィルムまたはケーシングを提供できるという利点を有する。現在の最先端技術において知られているコラーゲン系の細胞担体は、この利点を有しない。本発明によれば、この厚さは乾燥状態で測定される。「乾燥」とは空気乾燥であり、残留する絶対湿度は約１０〜１５％に相当する。

好ましいさらなる形態において、該組成物は放射線滅菌され、好ましくは電離放射線、より好ましくはβ放射線および／またはγ放射線によって行われる。

この工程は、汚染生物を死滅でき、培養される生体材料の汚染を極力防ぐことができるという利点を有する。放射線滅菌法は、熱に対して感受性を示すコラーゲンが損傷を受けないという利点をもたらす。

このような背景のもと、本発明の改良方法は、該化合物の放射線滅菌を行う工程（５）をさらに含む。

さらに、本発明の組成物に色素、好ましくは蛍光を吸収する色素を添加することが好ましい。

インビトロ診断の目的のため、該組成物は様々な色に染めることができる。この方法を実施する際、すなわち、薬理学的、生理学的または細胞生物学的試験を目的とする通過試験において、該フィルムを通過した、蛍光色に染められた細胞が観察できる。例えば、該組成物に含まれる蛍光を吸収する色素が、通過していない蛍光細胞を覆う。そのため、蛍光顕微鏡下での試験では、通過した細胞のみが光を発して見える。

本発明の別の目的は、
生体材料の培養方法であって、
（１）生体材料の担体として使用するのに適した組成物を用意する工程と、
（２）該生体材料を該組成物と接触させる工程と、
（３）該組成物を該生体材料とともに培養条件下でインキュベートする工程と
を含み、
該組成物として、本発明に記載の用途に合った、上記の組成物が使用されることを特徴とする培養方法に関する。

本発明の別の目的は、
生体材料の生体への埋め込み方法であって、
（１）生体材料の担体として使用するのに適した組成物を用意する工程と、
（２）該生体材料を該組成物と接触させる工程と、
（３）該組成物と接している該生体材料を生体に導入する工程と
を含み、
該組成物として、本発明に記載の用途に合った、上記の組成物が使用されることを特徴とする埋め込み方法に関する。

本発明の別の目的は、腫瘍細胞の浸潤性および転移性を調べるための、本発明の組成物の使用に関する。

腫瘍細胞の浸潤性および転移性を調べる一般的なインビトロ試験は、有孔性および非分解性の合成フィルムを用いて、腫瘍細胞の浸潤性を測定する原理に基づく。インビトロ試験におけるこの原理は、例えば、腫瘍細胞の浸潤性に対する抗発癌薬の効果を調べるのに有用である。しかしながら、腫瘍細胞の浸潤性は、結合組織内の隙間（細孔）内での遊走能だけでなく、主にコラーゲンからなる結合組織を酵素的に分解または再構築する能力にも依存している。前記生体コラーゲンフィルムは、その厚みが薄いこと、均一化および標準化された製造から、培養細胞のタンパク質分解能を調べるための新たな薬理試験系を開発するのに有用であり得る。この薬理試験系では、２つの小室をもつ構造体で細胞を培養する。この２つの小室は、前記コラーゲンフィルムを用いて仕切られる。検査の対象となる細胞を、該フィルム上の上側の小室内で培養する。適当な時間培養した後、該コラーゲン膜を通過して該膜の底側に遊走した細胞数を定量する。このように、本発明の組成物を使用することにより、インビトロ診断における新たな領域を開拓することができる。

また、本発明の組成物は、例えば幹細胞の生死試験として、非腫瘍細胞のタンパク質分解能および浸潤性を調べるために使用することができる。

上記および以下で説明される特徴は、記載されたそれぞれの組合せに適用可能なだけでなく、本発明の範囲を逸脱することなく、他の組合せまたは単独の方法にも適用可能であることは明白である。

本発明の特徴だけでなく、さらなる基準および利点について、実施形態に基づき本発明をより詳細に説明する。以下に添付の図面について説明する。

６ウェルの細胞培養プレート用の、厚さ２０μｍのコラーゲン挿入物（Ａ）と、および埋め込み試験において細胞を保持する本発明の管状ケーシング（Ｂ、Ｂ’）とを示す。 ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）のＢｒｄＵ増殖アッセイ、すなわちＢｒｄＵ陽性細胞の免疫細胞化学的分析の結果を示す。従来のプラスチック製の培養表面上（Ａ、Ａ’）、および本発明のコラーゲンマトリックス上で、該細胞を培養し、ＢｒｄＵとともに１時間インキュベートした。 コラーゲンマトリックス上および従来のプラスチック製の培養表面上で培養したヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の、ＢｒｄＵ増殖アッセイ（Ａ）およびＭＴＴ試験（Ｂ）の結果を示す。平均値をそれぞれ標準偏差とともに示す。 骨形成分化条件下でｈＭＳＣとともに培養後、石灰化したコラーゲンマトリックスの上面図（Ａ、Ａ’）と、コラーゲンマトリックス上で２週間培養した、マウス胎児（Ｅ１８）頭蓋冠由来の骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性（Ｂ、Ｂ’）を示す。 増殖条件下（Ａ、Ａ’）、および骨形成分化条件下（Ｂ、Ｂ’）で、マウス胎児（Ｅ１８）頭蓋冠由来の骨芽細胞とともに培養したコラーゲンマトリックスのパラフィン断面を示す。図Ｂおよび図Ｂ’より、三次元マトリックスが途切れずに石灰化したことが明白である。融合能および浸透能は細胞の種類に依存する。 細胞を保持していない本発明の管状ケーシングのＣ５７／ＢＬ６マウスへ埋め込み（Ａ）、およびヌードマウスに埋め込んでから６週間後のマトリックス（Ｂ）を示す。 ｈＭＳＣとともに１日かけて定着させた、埋め込む直前の本発明の管状フィルム（Ａ）、および結合組織内で発達し、６週間後に取り出した該管状フィルム（Ｂ）を示す。 Ｃ５７／ＢＬ６マウスから６週間後に取り出した、本発明の管状フィルムの拡大図を示す。血管が該コラーゲンフィルム全体に広がっていることが明らかに認められる。 取り出したインプラントから作製したパラフィン切片のＨＥ染色を示す。

１．コラーゲン含有組成物
本発明者らは、Ｎａｔｕｒｉｎ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧから市販されている７種のフィルムを使用し、これらが本発明の用途に適していることを見出した。試験に使用した該市販フィルムのパラメータを以下の表１に示す。

１．１ 本発明のフィルム形状の組成物の作製
本発明のフィルム形状の組成物を作製するためには、トレーサビリティと衛生基準に関してＥＣ規定第８５３／２００４号に規定された要件を満たしている、牛皮革の切断片（ｈｉｄｅ ｓｐｌｉｔ）を出発材料として使用する。

前記牛皮革の切断片（ｈｉｄｅ ｓｐｌｉｔ）を機械的に粗く予備切断し、いくつかの方法からなる工程において、まず最初に水で洗浄し、次いでアルカリを用いて分解する。分解度は、処理時間、アルカリ溶媒の濃度（ｐＨ値）、温度等の要素に依存して変化しうる。該アルカリ溶媒の濃度設定には、石灰水、水酸化ナトリウム溶液、またはこれらの２つの成分の混合物が通常使用される。しかしながら、他のアルカリ溶媒の組合せも同様に適している。このアルカリ処理は、例えばｐＨ値１２．５で、目的とする皮革の分解度に応じて、例えば、１５〜１５０時間を超えて行われる。アミド窒素を、コラーゲン組織の分解度を分析により追跡するためのパラメータとして使用できる。アミド窒素が少ないほど、分解度は高い。

所望の分解度に達したら、酸を添加した後、繰り返し水を用いて濯ぐ。酸性化は、通常６〜１０時間を超えて塩酸を用いて行われ、ｐＨ値は２未満、好ましくは１未満におよぶ。他の酸の使用も可能である。終了段階における、水を用いた多数回の濯ぎ処理により、ｐＨ値を２．６から３．３に上昇させる。

得られた「コラーゲン硬化物（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｃａｌｌｏｓｉｔｉｅｓ）」を、機械的に細断し、細断したものを有孔円板に押し出し、その孔径を徐々に小さくすることにより、ゲル様の粘弾性物質へと加工する。

１．１．１ 平坦なフィルムとしての成形（組成物番号１）
前記「濃縮」コラーゲン塊を、攪拌機に移し、グリセリン、水、および酸を添加する。同時に、ｐＨ値を好ましくは２．６〜３．２に調整し、乾燥コラーゲンの割合を１．６〜２．５ｗｔ％に調整する。次に、ホモジナイザーに通して空気を含ませ、スリットノズルからベルトコンベア上に噴射する。得られたゲルフィルムを、該ベルトコンベアに載せたままトンネル乾燥機内を通過させる。乾燥機内に入る前に、好ましくはアンモニアガスを用いて、ガス滅菌する。それにより、該ゲルのｐＨ値が上昇する。乾燥した該フィルムを、乾燥機の終点で再度水分を含ませる区域を通過させ、その後巻き上げる。

１．１．２ 管状ケーシングとしての成形（組成物番号２〜７）
１．１で得られた粘弾性のコラーゲン塊を、混和機内に移し、処方に応じてグリセリンを添加する。ｐＨ値および乾燥コラーゲンの割合の調整は、水および酸の添加と同時に行う。

次に、均質な塊を環状のスロットノズルから押し出して、切れ目のない管状ケーシングを製造する。押し出しを支持する気流を同時に吹き出させることにより、管状ケーシングが崩れるのを防ぐ。

押し出しラインを通ってブロー成形された管状ケーシングは、製造されるケーシングの種類に応じて、細部にわたり様々な方法で輸送される。原理的には、変更可能な一続きのラインにおいて、化学物質を噴霧する区間および乾燥を行う区間を通過してもよい。押出しラインの終点において、乾燥した管状ケーシングを、ローラー間で平坦にし、この状態のまま巻き枠に巻き上げる。

次に、得られた管状フィルムを熱処理して、以後の用途に必要とされる物理的安定性を与える。また、本発明のフィルム形状または管状の組成物は、他のコラーゲン源を原料として作製することもでき、この場合、コラーゲンゲルの処理方法は、その詳細において前述の記載と異なることがある。例えば、ＤＥ１００６０６４３およびＥＰ１４２３０１６に記載されているように、豚皮革コラーゲンを主成分にすると、好適な方法では油脂量を減らす方がよい。ＥＳ２０１７５６４等には、コラーゲン物質を製造するために動物の腸を使用することが記載されている。これらの文献は、引用として本願の開示に組み込まれている。

１．２ ｐＨ値の調整
カルシウムおよびマグネシウムを含有するリン酸緩衝液（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＡＡ社製緩衝液 品種コードＨ１５−００１））を用いて、コラーゲン系のフィルムのｐＨ値をｐＨ７．２〜７．５の生理学的範囲内に調整する。この目的を達成するため、該コラーゲンフィルムを、５日かけて該緩衝液系で攪拌洗浄する。該緩衝液は１日に２回交換する。

あるいは、ｐＨ値７．３のグリセリン含有リン酸緩衝液（ＫＨ_２ＰＯ_４ １５．６ｇと、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ７１．３ｇと、グリセリン４９２．９ｇとを７７２２ｇの蒸留水に溶解して調製したもの）中に、前記コラーゲン膜を１時間浸漬させてもよい。その後、処理した該フィルムを放置して水分を切り、テンターフレームに入れ室温で一晩乾燥する。

１．３ さらなる任意の処理
前記コラーゲン膜を蒸留水中で短時間平衡化した後、脂溶性物質を抽出し、水溶性タンパク質を分解するため１００％アセトンで処理する。アセトンを除去した後、カルシウムおよびマグネシウムを含有するリン酸緩衝液（ＰＡＡ社製緩衝液 品種コードＨ１５−００１ 組成（単位：ｇ／ｌ）：ＫＣｌ ０．２、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．２、ＮａＣｌ ８．０、無水Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １．１５、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．１３２、ＭｇＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．１）を用いて、乾燥させたコラーゲン膜を陰圧で１時間洗浄し、これを合計３回繰り返す。緩衝塩を除去するため、蒸留水中で１時間洗浄し、これを合計３回繰り返す。

１．４ 乾燥
得られた膜またはフィルムを乾燥する。この乾燥は、６０℃の乾燥キャビネット内で行うことができ、キャビネット内の湿度は５％未満、例えば３％に達する。また、この膜を単に空気中に放置して室温で乾燥させてもよく、膜またはフィルムの湿度が大気中の湿度と均衡することにより、最終的に大気の相対湿度に調整される。該膜またはフィルムの湿度は、通常、約８〜１３ｗｔ％になる。

１．５ 成形および放射線滅菌
得られた乾燥コラーゲン膜またはフィルムは、任意の方法で切断したり、ＤＩＮ規格のＡ５シート等に型抜きすることができる。得られたシートを、２５ｋＧｙまたは５０ｋＧｙのβ放射線またはγ放射線により滅菌する。

前記コラーゲンフィルムは、例えば、マイクロタイタープレート等のプラスチック製の任意の構造をもった凹みへの挿入物として完成されてもよく、直径が２ｍｍ未満で長さが約１２ｍｍ〜数ｃｍの、好ましくは継ぎ目のない管状ケーシングとして製造されてもよい。該フィルムを熱溶着したり、接着することも可能である。

１．６ フィルムの形状に製造された本発明の組成物のパラメータ
様々な種類の平坦なコラーゲンフィルムのパラメータを以下の表２に示す。これらのフィルムは、１．１．１に記載の方法に従って得られたものであるが、１．３に記載の工程は実施されなかった。

（＊）Ｂ〜Ｇの各試料に対し、５つの補助試験として、（ａ）滅菌なし、（ｂ）β放射線２５ｋＧｙ、（ｃ）β放射線５０ｋＧｙ、（ｄ）γ放射線２５ｋＧｙ、および（ｅ）γ放射線５０ｋＧｙを行った。

以下の分析方法を適用した。
ヒドロキシプロリンに関する規定を満たすコラーゲン。
ＥＰ１６７６５９５（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｓｏｅｈｎｅ ＡＧ）に記載のアミド窒素の類似物。
グリセリンを、ＨＰＬＣにより測定した。
植物油を、ソックスレー抽出により測定した。
ソルビトールを、ＨＰＬＣにより測定した。
灰分を、マッフル炉内にて６００℃、５時間で灰化後、重量測定した。
水分含量を、キャビネット内にて１５０℃で乾燥後、重量測定した。
ｐＨ値を、前記フィルムを小片に切断して５％ＮａＣｌ溶液中に入れ、１０分後にガラス電極を用いて測定した。
単位面積あたりの質量を、前記フィルムの１０ｃｍ×１０ｃｍ片を大気中の湿度と均衡させた後、重量測定した。
縦方向および横方向の抗張力を、型抜きした前記フィルムを２１℃、相対湿度６０％の空調下に置いた後、ＵＴＳユニバーサル試験機（３／２０５型、ＵＴＳ Ｔｅｓｔｓｙｓｔｅｍｅ ＧｍｂＨ）を用いて移動速度１００ｍｍ／分で測定した。

２．生体材料の培養
２．１ 組成物の構成
図１は、細胞培養プレートのウェルへの挿入物として構成された、厚さ２０μｍの本発明のコラーゲンフィルム（Ａ）を示す。図の（Ｂ）に管状ケーシングを示し、この模式図を（Ｂ’）に示す。参照番号１は、管状ケーシングを示す。参照番号２で示される細胞は、該ケーシング内に入れることができる。参照番号３で示される活性物質または成長因子も、生体細胞に対して効果を与える目的で、該ケーシング内に入れることができる。

２．２ ヒト細胞の増殖挙動
図２に示すように、ヒト細胞、すなわち間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびヒト細胞株ＳａＯＳ２の増殖挙動は、本発明のコラーゲンフィルム上と、従来の培養方法におけるプラスチック製培養皿上とで、なんら差を示さなかった。従来のプラスチック製培養表面上（Ａ）および本発明のコラーゲンフィルム上（Ｂ）で前記細胞を培養し、ＢｒｄＵとともに１時間インキュベートした。模式図（Ｂ’）において、参照番号１はコラーゲンフィルムを、参照番号２は細胞を、参照番号５はコラーゲン線維を、参照番号６はＢｒｄＵ陽性細胞を示す。図３の（Ａ）にＢｒｄＵ増殖アッセイを、および（Ｂ）にＭＴＴ生存能試験の統計学的評価を示す。

したがって、本発明のコラーゲンフィルムと従来のプラスチック皿との間に有意差はない。

２．３ 生体適合性
マウス胎児頭蓋冠由来の前駆細胞とｈＭＳＣとを、骨形成分化条件下において、本発明のマトリックス上で培養し、本発明のコラーゲンフィルムの生体適合性を評価した。この結果を図４に示す。

部分図（Ａ）は、骨形成分化条件下でｈＭＳＣとともに培養した、石灰化した本発明のコラーゲンマトリックスの概観を示す。部分図（Ｂ）は、本発明のコラーゲンフィルム上で２週間培養した、マウス胎児頭蓋冠由来の骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性を示す。部分模式図（Ａ’）および（Ｂ’）において、参照番号１はコラーゲン膜を、参照番号２ａは細胞を、参照番号２ｂは細胞内アルカリホスファターゼ活性検出時の細胞を示す。

アルカリホスファターゼ活性および前記細胞より誘発された石灰化を検出したことにより、該培養細胞に分化能があること、すなわち、本発明のマトリックスが生体適合性であることは明白である。

２．４ 三次元網状構造の培養
定着したコラーゲンフィルムのパラフィン断面を作製した。この断面を用いて石灰化を組織化学的に分析した。この結果を図５に示す。部分図（Ａ、Ａ’）は増殖時のパラフィン断面を示し、部分図（Ｂ、Ｂ’）は骨形成分化時のパラフィン断面を示す。参照番号１はコラーゲンフィルムを、参照番号２は細胞を、参照番号４は硝酸銀の沈着を示す。

この実験で、三次元フィルム／マトリックス内での前記細胞の高い石灰化能および融合能が示された。本発明のマトリックスを使うことにより、三次元網状構造の培養が可能となる。

２．５ 埋め込み
埋め込み実験を、ヌードマウスおよびＣ５７／ＢＬ６マウスを用いて行った。この実験では、細胞を保持させた本発明の管状ケーシングを、皮下組織と腹膜との間に埋め込んだ。この実験の結果を図６に示す。部分図（Ａ）は埋め込みの状況を示し、部分図（Ｂ）はヌードマウスに埋め込んでから６週間後の本発明のマトリックスを示す。白抜きの矢印は、細胞を保持させた本発明の管状ケーシングを示す。非生分解性の糸で装着部位へと挿入された管状ケーシングも、点線で示されるように容易に部分図（Ｂ）に見ることができる。部分図（Ｂ）において、この標本により本発明の管状ケーシングが依然として存在していることが明白に示されている。

図７の部分図（Ａ）は、ｈＭＳＣを１日かけて定着させた、埋め込む直前の本発明の管状ケーシングを示す。部分図（Ｂ）は、結合組織内で発達し、６週間後に取り出した該管状ケーシング（Ｂ）を示す。それにより、初期の吸収プロセスにもかかわらず、埋め込みから６週間後であっても、管状ケーシングが完全なまま損なわれていないことが明白である。

前記インプラントが、動物の結合組織内で発達したことは明らかであり、図８（Ａ、Ａ’）を参照すると、血管が通っていたことが分かる。模式図（Ａ’）において、参照番号１はコラーゲン膜を、参照番号２は細胞を、参照番号５はコラーゲン線維を、参照番号７は血管を示す。

また、図９を参照すると、ＨＥ染色したパラフィン切片の免疫組織化学的分析から、前記細胞が本発明のフィルム内に遊走したことが分かる。該インプラント内で、血管が構築したことが明白である（図Ａの矢印参照）。模式図（Ａ’）において、参照番号１は管状ケーシングを、参照番号２は細胞を、参照番号５はコラーゲン線維を、参照番号７は血管を、参照番号８は結合組織を示す。

３．結論
本発明者らにより、大量生産において複製可能で、特に生体材料の培養および作製に適した、フィルムまたはケーシングの形状のコラーゲン含有組成物が提供される。

Claims (20)

1. 生体細胞を培養するための組成物の使用であって、
   パラメータ：
   コラーゲン（ｗｔ％）：５０〜７０、
   アミド窒素（ｗｔ％）：０．１４〜０．４、
   グリセリン（ｗｔ％）：１２〜３５、
   油脂（ｗｔ％）：３〜７、
   ソルビトール（ｗｔ％）：０〜２０、
   灰分（ｗｔ％）：０．５〜３、
   水（ｗｔ％）：１２〜１８、
   ｐＨ値：６．８〜８、
   単位面積あたりの重量（ｇ／ｍ^２）：２０〜４０、
   抗張力（Ｎ／ｍｍ^２）：５〜２５
   を有することを特徴とする、組成物の使用（但し、ヒトの生体内での使用を除く）。
2. 前記油脂が植物油であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
3. 前記組成物が平坦なフィルムとして構成されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
4. 前記組成物が管状ケーシングとして構成されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
5. 前記組成物の厚さが乾燥状態において５〜２００μｍであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
6. 前記組成物の厚さが乾燥状態において１０〜３０μｍであることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
7. 前記組成物が細胞培養用の担体として構成されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
8. 前記組成物が、幹/前駆細胞を生体へ埋め込むための担体として構成されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
9. 前記組成物が放射線滅菌されていることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
10. 前記放射線滅菌が電離放射線を用いて行われることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
11. 前記電離放射線がβ放射線および／またはγ放射線であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
12. 前記組成物が、色素を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
13. 腫瘍細胞の浸潤性および転移性を調べるための組成物の使用であって、使用される該組成物が請求項１〜１２のいずれかに記載の使用の組成物であることを特徴とする使用。
14. 生体材料の培養方法であって、
    （１）生体材料の担体として使用するのに適した組成物を用意する工程と、
    （２）該生体材料を該組成物と接触させる工程と、
    （３）該組成物を該生体材料とともに培養条件下でインキュベートする工程と
    を含み、
    使用される該組成物が請求項１〜１２のいずれかに記載の使用の組成物であることを特徴とする、培養方法。
15. 生体材料の生体への埋め込み方法であって、
    （１）生体材料の担体として使用するのに適した組成物を用意する工程と、
    （２）該生体材料を該組成物と接触させる工程と、
    （３）該組成物と接している該生体材料をヒト以外の生体に導入する工程と
    を含み、
    使用される該組成物が請求項１〜１２のいずれかに記載の使用の組成物であることを特徴とする、埋め込み方法。
16. 生体細胞の培養に対する組成物の適合性の改良方法であって、
    該組成物のパラメータが、
    コラーゲン（ｗｔ％）：５０〜７０、
    アミド窒素（ｗｔ％）：０．１４〜０．４、
    グリセリン（ｗｔ％）：１２〜３５、
    油脂（ｗｔ％）：３〜７、
    ソルビトール（ｗｔ％）：０〜２０、
    灰分（ｗｔ％）：０．５〜３、
    水（ｗｔ％）：１２〜１８、
    ｐＨ値：３〜１０、
    単位面積あたりの重量（ｇ／ｍ^２）：２０〜４０、
    抗張力（Ｎ／ｍｍ２）：５〜２５であり、
    （１）該組成物を用意する工程と、
    （２）該ｐＨ値を６．８〜８．０に調整する工程と
    を含む改良方法（但し、ヒトの生体内で行われる方法を除く）。
17. 前記方法が、
    （３）該組成物を高脂溶性物質とともにインキュベートする工程
    をさらに含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
18. 前記方法が、
    （３．１）該組成物を緩衝液中で洗浄する工程
    をさらに含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
19. 前記方法が、
    （４）該組成物を乾燥する工程
    をさらに含むことを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
20. 前記方法が、
    （５）該組成物を放射線滅菌する工程
    をさらに含むことを特徴とする、請求項１５または１９に記載の方法。

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