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ES2706387T3 - Modulación de la expresión de receptor de andrógeno - Google Patents

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ES2706387T3
ES2706387T3 ES13845244T ES13845244T ES2706387T3 ES 2706387 T3 ES2706387 T3 ES 2706387T3 ES 13845244 T ES13845244 T ES 13845244T ES 13845244 T ES13845244 T ES 13845244T ES 2706387 T3 ES2706387 T3 ES 2706387T3
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antisense
sugar
nucleosides
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Robert Macleod
Youngsoo Kim
Tianyuan Zhou
Susan Freier
Punit Seth
Eric Swayze
Brett Monia
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Original Assignee
Ionis Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 35, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la que el oligonucleótido modificado comprende: un segmento hueco que consiste en 9 desoxinucleósidos enlazados; un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; y un segmento del ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados; en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; los tres nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar 2'-O-metoxietil en la dirección 5' a 3'; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina

Description

DESCRIPCIÓN
Modulación de la expresión de receptor de andrógeno
Campo
[0001] Ciertas realizaciones se dirigen a compuestos y composiciones dirigidas al receptor de andrógenos humanos (RA) para la inhibición de los niveles del receptor de andrógenos en una célula, que puede ser útil para métodos de tratamiento de cáncer y la inhibición del crecimiento o proliferación de células cancerosas.
Antecedentes
[0002] El receptor de andrógenos (RA) pertenece a la superfamilia de receptores nucleares y se activa al unirse a sus ligandos de hormonas: andrógenos, testosterona o d Ht . Al unirse al ligando de la hormona en el citoplasma, el receptor de andrógenos se traslada al núcleo donde se une al ADN y funciona como un factor de transcripción para regular la expresión de varios genes diana, como el antígeno específico de la próstata (PSA) y TMPRSS2. Knudsen et al. (Trends Endocrinol Metab 21:315-24, 2010) Bennett et al. (Int J Biochem Cell Biol. 42: 813-827, 2011).
[0003] La señalización del receptor de andrógenos (RA) es una vía de supervivencia crítica para las células de cáncer de próstata, y la terapia de deprivación de andrógenos (ADT), también conocida como "castración química", es una estrategia de tratamiento de primera línea contra las hormonas sensibles. Cáncer de próstata dependiente de andrógenos que reduce los niveles de andrógenos circulantes y por lo tanto inhibe la actividad rA. Aunque la mayoría de los pacientes inicialmente responden a la TDA, la mayoría eventualmente desarrollará resistencia a la castración en la cual la enfermedad progresa a pesar de los niveles de testosterona en la castración. Este tipo de cáncer se conoce como cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). Hay una serie de mecanismos que subyacen al desarrollo de la resistencia a la castración (castración), incluido un aumento en la expresión de la proteína RA que puede sensibilizar a las células a niveles bajos de andrógenos, mutaciones de RA que pueden alterar la transactivación o sensibilizar la RA a ligandos alternativos y la aparición de formas alternativamente empalmadas de RA, que carecen del dominio de unión al ligando pero que, sin embargo, pueden actuar para promover el crecimiento tumoral en ausencia de estimulación del ligando. Además, los tumores de próstata también pueden sintetizar sus propios andrógenos, lo que aumenta los niveles de testosterona local intra-tumoral disponibles para activar la RA.
[0004] La señalización del receptor de andrógenos (RA) es una vía crítica de supervivencia para las células de cáncer de próstata, y la terapia de deprivación de andrógenos (ADT) sigue siendo el tratamiento principal para los pacientes con enfermedad localmente avanzada y metastásica. Aunque la mayoría de los pacientes inicialmente responden a la TDA, la mayoría eventualmente desarrollará resistencia a la castración en la cual la enfermedad progresa a pesar de los niveles de testosterona en la castración. Este tipo de cáncer se conoce como cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) (Karantos et al., Oncogene advance online:1 -13, 2013). Hay una serie de mecanismos que subyacen en el desarrollo de la resistencia a la castración, incluido un aumento en la expresión de la proteína rA que puede sensibilizar a las células a niveles bajos de andrógenos (Gregory et al., Cancer Res 61:2892-2898, 2001; Linja et al., Cancer Res 61:3550-3555, 2001), mutaciones de RA que pueden alterar la transactivación o sensibilizar RA a ligandos alternativos (Scher et al., J Clin Oncol 23: 8253-8261, 2005) y la aparición de formas de RA empalmadas alternativamente., que carecen del dominio de unión al ligando pero que, sin embargo, pueden actuar para promover el crecimiento del tumor en ausencia de estimulación del ligando (Yingming et al., Cancer Res 73: 483-489, 2013). Además, los tumores de próstata también pueden sintetizar sus propios andrógenos, lo que aumenta los niveles locales de testosterona intra-tumoral disponibles para activar la RA (Attard et al., Cancer Cell 16: 458-462, 2009).
[0005] El hecho de que el receptor de andrógenos se mantiene activo en el cáncer de próstata resistente a la castración ha llevado al desarrollo de nuevos agentes que inhiben la producción de ligandos de andrógenos o bloquear las acciones de estos ligandos en la RA. Estos nuevos agentes incluyen acetato de abiraterona que inhibe la actividad de 17-a-hidroxilasa/17,20-liasa (CYP17), lo que resulta en una reducción de los andrógenos residuales sintetizados por las glándulas suprarrenales y en el propio tumor de próstata de Bono et al. (N Engl J Med 364:1995-2006, 2011) y enzalutamida que evita que el ligando andrógeno se una a RA, se traslade al núcleo y se una al ADN (Scher et al., N Engl J Med 367:1187-1197, 2012). Se están desarrollando varios otros inhibidores de la síntesis de andrógenos o bloqueadores de los receptores de andrógenos ya sea de forma preclínica o clínica e incluyen, por ejemplo, ARN509, ODM201, TOK001, VT464.
[0006] Aunque la actividad de agentes tales como enzalutamida y abiraterona en CRPC es muy alentador, ni trabaja en todos los pacientes y ambos están asociados con el desarrollo de resistencia adicional a través de reactivación de la RA por los mecanismos descritos anteriormente (Yingming et al., Cancer Res 73: 483-489, 2013). Por lo tanto, existe una necesidad continua de identificar terapias alternativas para el tratamiento de CRPC, y en particular aquellas que pueden eliminar y/o inhibir la actividad de todas las formas de RA, incluidas, por ejemplo, RA de tipo salvaje, mutadas y de empalme.
[0007] En este documento se describen oligonclueótidos antisentido que, en virtud de su diseño y modo de acción (par de bases con la diana ARN RA y median en su destrucción por la RNasa H, una enzima que destruye el ARN en un dúplex de ADN/ARN) tienen como objetivo la inhibición de las principales formas de RA. Al dirigirse a una región apropiada del ARNm de RA, el oligonucleótido antisentido dará como resultado la inhibición de las formas principales (longitud completa, variante de empalme y formas mutadas) de proteínas receptoras de andrógenos y, por lo tanto, será adecuado para el tratamiento de pacientes con CRPC.
[0008] Aparte de cáncer de próstata, RA es también implicado como un factor en la progresión de otros tumores, como el cáncer de mama. En el cáncer de mama, la RA se expresa en un 70-80% de los tumores que también son positivos para RE y en el 12% de los casos que son conocidos como triple negativos (sin expresión de RE, RP y HER2) (Hickey et al., Molecular Endocrinology 26:1252-1267, 2012). En estudios preclínicos, el antagonista del receptor de andrógenos bicalutamida induce respuestas antiproliferativas in vitro en células de cáncer de mama y esto se potencia mediante la adición de un inhibidor de Pi3K/mTOR (Ni et al., Cancer Cell 20:119-131,2011). La 2da generación anti-andrógeno, enzalutamida inhibe la proliferación mediada por dihidrotestosterona (DHT) en células de cáncer de mama RE+/RA y es tan efectiva como el tamoxifeno para inhibir el crecimiento de tumores de cáncer de mama estimulados por estrógeno en modelos preclínicos in vivo (Cochrane et al., Cancer Res 72 (24 Suplemento): P2-14-02, 2012). La enzalutamida también inhibe la proliferación en células de cáncer de mama HER2 y triple negativas. Parece que en situaciones donde la acción del estrógeno se reduce (por ejemplo, la privación de estrógeno a largo plazo o la ausencia de RE) los niveles de RA aumentan y pueden volverse oncogénicos. Esto sugeriría que los antagonistas de RA pueden posicionarse mejor en entornos de cáncer de mama triple negativo o resistente a las hormonas (Hickey et al., Molecular Endocrinology 26:1252-1267, 2012). Las terapias dirigidas por RA están actualmente bajo investigación en ensayos clínicos para el cáncer de mama (NCT00468715, NCT01597193, NCT01381874, NCT00755886).
[0009] La RA también se expresa en una variedad de otros tumores, que incluyen, entre otros, vejiga, ovario, gástrico, pulmón e hígado. Los datos preclínicos apoyan un papel similar al del cáncer de mama, para promover la supervivencia de la proliferación de células tumorales; por lo tanto, el bloqueo de la RA en estos tumores podría tener un beneficio clínico terapéutico (Chang et al., Oncogene advance online:1-10, 2013).
[0010] F Hamyl et al. (Prostate Cancer Prostatic Dis, 2003, 6: 27-33) describe un bloqueo observado de la actividad del receptor de andrógenos por oligonucleótidos antisentido.
[0011] JH Chan et al. (Clin Exp Pharmacol Physiol, 2006, 33: 533-440) describe el diseño y la aplicación terapéutica de ciertos oligonucleótidos antisentido.
[0012] A Aartsma-Rus (Methods Mol Biol, 2012, 867:117-129) da una visión general de diseño de oligonucleótidos antisentido para omisión de exón.
Resumen
[0013] Aquí se incluye un compuesto que comprende un oligonucleótido monocatenario modificado que consta de 16 nucleósidos enlaces que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 35, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento hueco que consiste en 9 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados;
y un segmento del ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; los tres nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar 2”-O-metoxietil en la dirección 5' a 3'; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0014] También se proporciona en el presente documento una composición que comprende el compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0015] También se proporciona en el presente documento es una composición que comprende el compuesto de la invención y un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464.
[0016] En el presente documento también se proporciona el compuesto o composición de la invención, para uso en un método para tratar el cáncer.
[0017] Varias realizaciones descritas en el presente documento se refieren al descubrimiento de compuestos y composiciones para inhibir los niveles de receptores de andrógenos en una célula, que pueden ser útiles para los métodos de tratamiento del cáncer e inhibición de la proliferación o el crecimiento de células cancerosas, como el cáncer de próstata, mama, ovario, gástrico o vejiga.
Descripción detallada
[0018] Ha de entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, según se reivindica. Aquí, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en este documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo" así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitativo. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique lo contrario.
[0019] Los encabezados de sección usados en este documento son sólo para fines de organización y no deben interpretarse como limitantes del objeto descrito. Definiciones
[0020] A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y medicinal descritas en este documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico.
[0021] A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2”-O-metoxietilo" (también de 2”-MOE y 2”-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación O-metoxietil en la posición 2' de un anillo de azúcar, por ejemplo, un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietil es un azúcar modificado.
[0022] "Nucleósido de 2'-MOE" (también nucleósido 2'-O-metoxietil) significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar modificado 2'-MOE.
[0023] "Nucleósido sustituido en 2'" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo de furanosilo distinto de H u OH. En ciertas realizaciones, los nucleósidos sustituidos en 2' incluyen nucleósidos con modificaciones bicíclicas de azúcar.
[0024] "Sitio diana 3' se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más 3' de un compuesto antisentido particular.
[0025] "Sitio diana 5'" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al extremo 5' más nucleótidos de un compuesto antisentido particular.
[0026] "5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metil unido a la posición 5'. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
[0027] "Aproximadamente" significa dentro del 7% de un valor. Por ejemplo, si se indica, "los compuestos afectaron al menos aproximadamente el 70% de inhibición del Receptor de Andrógeno", se implica que los niveles de Receptor de Andrógeno se inhiben dentro de un rango de 63% y 77%.
[0028] La "administración" o "administrar" se refiere a las rutas de introducción de un compuesto antisentido proporcionado en este documento a un sujeto para realizar su función prevista. Un ejemplo de una vía de administración que se puede usar incluye, entre otros, la administración parenteral, como la inyección o infusión subcutánea, intravenosa o intramuscular.
[0029] El "receptor positivo de andrógenos" con respecto al cáncer de mama o una célula de cáncer de mama se refiere a un cáncer de mama o una célula de cáncer de mama que expresa el receptor de andrógenos.
[0030] "Animal" se refiere a un animal humano o no humano, que incluye, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluidos, entre otros, monos y chimpancés.
[0031] "Agente anti-androgénico" se refiere a un compuesto terapéutico o fármaco que es un inhibidor de la síntesis de andrógenos o un bloqueador del receptor de andrógenos.
[0032] "Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína diana codificada por dicho ácido nucleico diana.
[0033] "Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos antisentido, ARNsi, ARNsh, ARNss de cadena simple y compuestos basados en la ocupación.
[0034] "Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana en ausencia del compuesto antisentido.
[0035] Los "mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con ácido nucleico diana, en el que el resultado o el efecto de la hibridación es la degradación diana o la ocupación de la diana con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o empalme.
[0036] "Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación a una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico diana.
[0037] La "complementariedad de la base" se refiere a la capacidad para el apareamiento preciso de bases de las nucleobases de un oligonucleótido antisentido con las nucleobases correspondientes en un ácido nucleico diana (es decir, hibridación), y está mediada por Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertida entre las nucleobases correspondientes.
[0038] "Resto de azúcar bicíclico" significa un resto de azúcar modificado que comprende un anillo de 4 a 7 miembros (incluido, entre otros, un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, dando como resultado una estructura bicíclica. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo de azúcar. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En ciertas de tales realizaciones, el puente conecta el carbono 2' y el carbono 4' del furanosilo.
[0039] También incluidos dentro de la definición de LNA son LNA en los que el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar ribosilo está conectado al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar, formando de este modo un puente de metilenoxi (4'-CH2-O-2') para formar el resto de azúcar bicíclico. El puente también puede ser un grupo metileno (-CH2-) de conexión al átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', para lo cual se utiliza el término metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA. Además; en el caso del resto de azúcar bicíclico que tiene un grupo de puente de etileno en esta posición, se utiliza el término etilenoxi (4'-CH2CH2-O-2') LNA. a -L- metilenoxi (4'-CH2-O-2'), un isómero de metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA también se engloba en la definición de LNA, como se usa en el presente documento.
[0040] "Estructura de tapa" o "resto de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que han sido incorporadas en cualquiera de los terminales de un compuesto antisentido.
[0041] El "cáncer de próstata resistente a la castración" o "cáncer de próstata resistente a la castración" y las células cancerosas de próstata se refieren a la reducción de la sensibilidad del cáncer de próstata y las células de cáncer de próstata a la terapia de privación de andrógenos o un agente antiandrogénico.
[0042] "cEt" o "etil constreñido" significa un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0043] "Nucleósido de etil restringido" (también nucleósido cEt) significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0044] "Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos 2'-O-metoxietil es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2'-O-metoxietilo.
[0045] "Compuestos antisentido quiméricos" significa compuestos antisentido que tienen al menos 2 regiones químicamente distintas, y cada posición tiene una pluralidad de subunidades.
[0046] "Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
[0047] "Comprenden", "comprende" y "que comprende" se entenderá que implican la inclusión de un paso indicado o elemento o grupo de etapas o elementos, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.
[0048] "Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
[0049] "Desoxirribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los desoxirribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
[0050] "Diseñar" o "Diseñado para" se refieren al proceso de diseño de un compuesto oligomérico que se hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
[0051] "Aguas abajo" se refiere a la dirección relativa hacia el extremo 3' o el extremo C-terminal de un ácido nucleico.
[0052] "Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
[0053] "Receptor de estrógeno (RE) positivo" con respecto al cáncer de mama o una célula de cáncer de mama se refiere al cáncer de mama o una célula de cáncer de mama que expresa el receptor de estrógeno (RE).
[0054] El "receptor de estrógeno (RE) negativo" con respecto al cáncer de mama o una célula de cáncer de mama se refiere a un cáncer de mama o una célula de cáncer de mama que no expresa el receptor de estrógeno (RE).
[0055] La "expresión" incluye todas las funciones mediante las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y que operan en una célula. Tales estructuras incluyen, pero no se limitan a los productos de transcripción y traducción.
[0056] "Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.
[0057] "Gápmero" significa un compuesto antisentido quimérico en el que se coloca una región interna tiene una pluralidad de nucleósidos que soporta la RNasa H de escisión entre las regiones externas tiene uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o de los nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna se puede denominar "brecha" y las regiones externas se pueden denominar "alas".
[0058] "HER2/neu negativo" con respecto a cáncer de mama o una célula de cáncer de mama se refiere a cáncer de mama o una célula de cáncer de mama que no expresa HER2/neu.
[0059] "Hibridación" significa que la hibridación de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un compuesto antisentido y una diana de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido antisentido y una diana de ácido nucleico.
[0060] "Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
[0061] "Individual" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
[0062] "Inducir", "inhibir", "potenciar", "elevar", "aumentar", "disminuir", "regular hacia arriba","regular hacia abajo", o similares, generalmente denotan diferencias cuantitativas entre dos estados.
[0063] "Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción, bloqueo de la expresión o actividad y no necesariamente indica una eliminación total de la expresión o actividad.
[0064] "Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre los nucleósidos.
[0065] Los oligonucleótidos antisentido "alargados" son aquellos que tienen uno o más nucleósidos adicionales en relación con un oligonucleótido antisentido descrito en el presente documento.
[0066] "Desoxinucleósido enlazado" significa una base de ácido nucleico (A, G, C, T, U) sustituida por desoxirribosa unida por un éster de fosfato para formar un nucleótido.
[0067] "Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes unidos entre sí por un enlace internucleósido.
[0068] "Falta de coincidencia" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso cuando una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o diana.
[0069] "Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleósido natural (es decir, un enlace internucleósido fosfodiéster).
[0070] "Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
[0071] "Nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado y/o nucleobase modificada.
[0072] "Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, un enlace internuclósido modificado o una nucleobase modificada.
[0073] "Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleósido modificado, un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
[0074] "Azúcar modificado" significa la sustitución y/o cualquier cambio de un resto de azúcar natural.
[0075] "Monómero" se refiere a una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean naturales o modificados.
[0076] "Motivo" significa el patrón de nucleósidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido.
[0077] "Razón de azúcar natural" significa un resto de azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
[0078] "Enlace internucleosídico natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
[0079] "Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno con otro o de otro modo apoyan la hibridación.
[0080] "Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios y ácidos nucleicos bicatenarios.
[0081] "Nucleobase" significa un resto heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.
[0082] La "complementariedad de nucleobase" se refiere a una nucleobase que es capaz de emparejar bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En ciertas realizaciones, nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejar bases con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una cierta posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una cierta posición de un ácido nucleico diana, entonces se considera que la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana es complementaria en ese par de nucleobases.
[0083] "Secuencia de nucleobase" significa el orden de las nucleobases contiguas independientemente de cualquier modificación de azúcar, enlace y/o nucleobase.
[0084] "Nucleósido" significa una nucleobase unida a un azúcar.
[0085] "Nucleósido mimético" incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen miméticos de azúcar morfolino, ciclohexenil, ciclohexil, tetrahidropiranil, biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar sin furanosa. El mimético de nucleótidos incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster). El sustituto del azúcar se superpone con el término mimético de nucleósidos, un término un poco más amplio, pero está destinado a indicar el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en este documento son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en el que el grupo de azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillo de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que están sustituidos por un azúcar, una nucleobase y/o un enlace entre nucleósidos. En general, se utiliza un mimético en lugar de la combinación de enlaces de azúcar o de azúcar-internucleósido, y la nucleobase se mantiene para la hibridación a una diana seleccionada.
[0086] "Nudeótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
[0087] "Compuesto oligomérico" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazadas que es capaz de hibridar con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
[0088] "Oligonucleósido" significa un oligonucleótido en el que los enlaces internucleósido no contienen un átomo de fósforo.
[0089] "Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede ser modificado o no modificado, independientemente uno del otro.
[0090] "Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace de fosforotioato es un enlace modificado entre nucleósidos.
[0091] "Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido [0092] El "receptor de progesterona (RP) negativo" con respecto al cáncer de mama o una célula de cáncer de mama se refiere a cáncer de mama o una célula de cáncer de mama que no expresa el receptor de progesterona (RP).
[0093] La "región" se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable.
[0094] "Ribonucleótido" quiere decir un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición de la porción azúcar del nucleótido 2'. Los ribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
[0095] Los "segmentos" se definen como más pequeños o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico diana.
[0096] Los "sitios", como se usan en este documento, se definen como posiciones únicas de nucleobases dentro de un ácido nucleico diana.
[0097] "Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, mientras que exhibe efectos mínimos o nulos en los ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos. Las “condiciones de hibridación rigurosas" o “condiciones rigurosas" se refieren a las condiciones en las que un compuesto oligomérico se hibridará con su secuencia diana, pero con un número mínimo de otras secuencias.
[0098] "Sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
[0099] "Sinergia" o "sinergizar" se refiere a un efecto de una combinación que es mayor que el de los efectos de cada componente solo
[0100] "Diana" se refiere a una proteína, cuya modulación se desea.
[0101] "Gen diana" se refiere a un gen que codifica una diana.
[0102] "Focalización" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente un ácido nucleico diana e inducir un efecto deseado.
[0103] "Ácido nucleico diana", "ARN diana", "transcripción de ARN diana" y "diana de ácido nucleico" significan un ácido nucleico capaz de ser atacado por compuestos antisentido.
[0104] "Región diana" significa una porción de un ácido nucleico diana a la que se dirige uno o más compuestos antisentido.
[0105] "Segmento diana" se refiere a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al cual se focaliza un compuesto antisentido. "Sitio diana 5' se refiere al nucleótido más 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3'" se refiere a la mayoría de nucleótidos 3' de un segmento diana.
[0106] "Tratamiento del cáncer" se refiere a la realización de acciones que conducen a una mejoría del cáncer o de los síntomas acompañados por el mismo. La combinación de dichas acciones está abarcada por el término "tratamiento". La mejora del cáncer incluye, pero no se limita a, la reducción del número de células cancerosas en un sujeto o la reducción del número de células cancerosas en el sujeto. Dicho tratamiento, como se usa en este documento, también incluye una restauración completa de la salud con respecto al cáncer. Debe entenderse que el tratamiento como se usa de acuerdo con las realizaciones proporcionadas en el presente documento puede no ser efectivo en todos los sujetos a tratar. Sin embargo, una población de sujetos que padecen cáncer a los que se hace referencia en el presente documento puede tratarse con éxito. En ciertas realizaciones, el "tratamiento del cáncer" se puede describir mediante varios parámetros diferentes que incluyen, entre otros, la reducción en el tamaño de un tumor en un sujeto que tiene cáncer, la reducción en el crecimiento o la proliferación de un tumor en un sujeto que tiene cáncer, previniendo la metástasis o reduciendo la extensión de la metástasis, y/o extendiendo la supervivencia de un sujeto que tiene cáncer en comparación con el control. El cáncer al que se hace referencia en esta definición puede ser cualquier cáncer, incluido uno seleccionado entre cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer gástrico y cáncer de vejiga. Las nucleobases "no modificadas" significan las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
[0108] "Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases naturales, restos de azúcar y enlaces internucleósidos. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósido) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
[0109] "Aguas arriba" se refiere a la dirección relativa hacia el extremo 5' o el extremo N-terminal de un ácido nucleico.
Ciertas realizaciones
[0110] Ciertos inventores describen métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión del ARNm del receptor de andrógenos (RA).
[0111] Ciertas realizaciones describen compuestos o composiciones antisentido dirigidas a un ácido nucleico del receptor de andrógenos. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico del receptor de andrógenos son las secuencias expuestas en el número de registro de GENBANK NT_011669.17_TRUnC_5079000_5270000 (incorporado aquí como SEQ ID NO:1), el número de acceso GENBANK NM_000044.3 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2), N° de acceso de GENBANK NM_001011645.2 (incorporado aquí como SEQ iD NO: 3), N° de acceso de GENBANK FJ235916.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 4), N° de acceso de GENBANK FJ235917.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 5), N° de acceso de GENBANK FJ235918.1 (incorporado aquí como SEQ ID nO: 6), N° de acceso de GENBANK FJ235919.1 (incorporado aquí como SeQ ID NO: 7), o N° de acceso de GENBANK FJ235920.1 (incorporado aquí como SEQ iD NO: 8).
[0112] En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones comprenden un oligonucleótido modificado 10 a 30 nucleósidos enlazados en longitud dirigida a RA. La diana de RA puede tener una secuencia recitada en cualquiera de las SEQ ID NO:1-8 o una porción de la misma o una variante de la misma. En ciertas realizaciones, la diana de RA puede tener una secuencia de variantes conocidas de empalme de RA que incluyen, pero no se limitan a, RA-V1, RA-V2, RA-V3, RA-V4, RA-V5, RA-V6 y RA-V7 (también conocido como Ra 3), que contiene los exones 1-3 pero carece de los exones 4-8, RA-V1, RA-V2, RA-V3, RA-V4, RA-V5, RA-V6, rA-V7, y las variantes de empalme adicionales que se pueden obtener por los compuestos descritos aquí se describen en Hu et al., Cancer Res 2009; 69:16-22 y en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° US 2010/0068802.
[0113] En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 12-179. En ciertas realizaciones, uno o más nucleósidos modificados en el segmento del ala tienen un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, el azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el nucleósido modificado es un nucleósido de LNA. En ciertas realizaciones, el nucleósido modificado es un nucleósido sustituido en 2'. En ciertas realizaciones, los nucleósidos sustituidos en 2' incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcares bicíclicos. En ciertas realizaciones, el nucleósido modificado es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el nucleósido modificado es un nucleósido de etil (cEt) restringido.
[0114] En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en una secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NOs:12-179. En ciertas realizaciones, uno o más nucleósidos modificados en el segmento del ala tienen un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, el azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el nucleósido modificado es un nucleósido de LNA. En ciertas realizaciones, el nucleósido modificado es un nucleósido sustituido en 2'. En ciertas realizaciones, los nucleósidos sustituidos en 2' incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcares bicíclicos. En ciertas realizaciones, el nucleósido modificado es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el nucleósido modificado es un nucleósido de etil (cEt) restringido.
[0115] En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones dirigidas al receptor de andrógenos comprenden un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 o 175, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido a RA humano es ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269, o ISIS 584269, o ISIS 584269, ISIS 584269, o ISIS 584269, ISIS 584269.
[0116] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento hueco que consiste en desoxianucleósidos enlazados; b) un segmento del ala 5' que consiste en nucleósidos enlazados; y c) un segmento en el ala 3' que consiste en nucleósidos enlazados. El segmento de la brecha se coloca entre el segmento del ala 5' y el segmento del ala 3' y cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar modificado.
[0117] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados, el segmento de brecha que consiste en 10 desoxinucleósidos enlazados, el segmento del ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados, el segmento del ala 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados, cada uno el nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietil, cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0118] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados, un segmento de brecha que consiste en 10 desoxinucleósidos enlazados, un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados, un segmento del ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados, cada uno el nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar de etil (cEt) restringido, cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0119] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados, un segmento de hueco que consta de 9 desoxinucleósidos enlaces, un segmento de ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados, un segmento de ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados; los tres nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar 2'-O-metoxietil en la dirección 5' a 3'; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0120] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados, un segmento de hueco que consta de 8 desoxinucleósidos enlaces, un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados, un segmento de ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados; los cinco nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; los tres nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0121] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados, un segmento de hueco que consta de 8 desoxinucleósidos enlaces, un segmento de ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados, un segmento de ala 5' que consta de cuatro nucleósidos enlazados; los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar etil (cEt) restringido, un azúcar etil (cEt) restringido y un azúcar etil (cEt) restringido en la dirección 5' a 3', los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar 2'-O-metoxietil en la dirección 5' a 3'; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0122] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados, un segmento de espacio vacío consta de 8 desoxinucleósidos enlazados, un segmento en el ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados, un segmento en el ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados; los cinco nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar de etil (cEt) restringido en la dirección 5' a 3'; los tres nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0123] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados, un segmento de hueco que consta de 7 desoxinucleósidos enlazados, un segmento de ala 5' que consta de siete nucleósidos enlazados, un segmento de ala 3' que consta de dos nucleósidos enlazados; los siete nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar etil (cEt) restringido, un azúcar etil (cEt) restringido, un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar de 2'-O-metoxietil, un azúcar de etil restringido (cEt) y un azúcar de etil restringido (cEt) en la dirección 5' a 3'; los dos nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0124] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados, un segmento de hueco que consta de 7 desoxinucleósidos enlaces, un segmento de ala 5' que consta de seis nucleósidos enlazados, un segmento de ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados; los seis nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar etil (cEt) restringido, un azúcar etil (cEt) restringido, un azúcar 2'-O-metoxietil restringido, un azúcar etil (cEt) restringido, y un azúcar de etil (cEt) restringido en la dirección 5' a 3'; los tres nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0125] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados, un segmento de hueco que consta de 7 desoxinucleósidos enlazados, un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados, un segmento de ala 5' que consta de cuatro nucleósidos enlazados; los cinco nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar de etil (cEt) restringido en la dirección 5' a 3'; los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar 2'-O-metoxietil en la dirección 5' a 3'; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0126] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados, un segmento de hueco que consta de 7 desoxinucleósidos enlazados, un segmento de ala 5' que consta de cuatro nucleósidos enlazados, un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados; Los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar etil (cEt) restringido, un azúcar etil (cEt) restringido y un azúcar etil (cEt) restringido en la dirección 5' a 3'; los cinco nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de 2'-O-metoxietil y un azúcar de 2'-O-metoxietil en la dirección 5' a 3'; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0127] En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones dirigidas al receptor de andrógenos comprenden un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 o 175, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que el oligonucleótido modificado comprende un segmento hueco que consiste en desoxinucleósidos; un segmento de ala 5'; y un segmento de ala 3', en el que el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada citosina del oligonucleótido modificado es una 5'-metilcitosina.
[0128] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 35, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento hueco que consiste en 9 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento del ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; los tres nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar 2'-O-metoxietil en la dirección 5' a 3' cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0129] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado de cadena sencilla que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 39, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento hueco que consiste en 9 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento del ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; los tres nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar 2'-O-metoxietil en la dirección 5' a 3'; cada enlace internudeósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0130] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido a receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido monocatenario modificado que consta de 16 nucleósidos enlaces que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 39, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento hueco que consiste en 8 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de cuatro nucleósidos enlazados; y
un segmento del ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar etil (cEt) restringido, un azúcar etil (cEt) restringido y un azúcar etil (cEt) restringido en la dirección 5' a 3'; los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar 2'-O-metoxietil en la dirección 5' a 3'; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0131] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 39, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento hueco que consiste en 8 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; los cinco nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar de etil (cEt) restringido en la dirección 5' a 3'; los tres nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0132] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 39, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento hueco que consiste en 7 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de cuatro nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar etil (cEt) restringido, un azúcar etil (cEt) restringido y un azúcar etil (cEt) restringido en la dirección 5' a 3'; los cinco nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar 2'-O-metoxietilo, y un azúcar 2'-O-metoxietil en la dirección 5' a 3'; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0133] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 35, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento hueco que consiste en 7 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de seis nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; los seis nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son un azúcar 2'-O-metoxietil, un azúcar etil (cEt) restringido, un azúcar etil (cEt) restringido, un azúcar 2'-O-metoxietil restringido, un etil restringido (cEt)) azúcar, y un azúcar de etil (cEt) restringido en la dirección 5' a 3'; los tres nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0134] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 43, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento hueco que consta de 10 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0135] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO:124, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento hueco que consta de 10 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0136] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO:150, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento hueco que consta de 10 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0137] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado de cadena sencilla que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de SEQ ID NO:155, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento hueco que consiste en 10 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento del ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0138] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 169, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento hueco que consta de 10 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0139] En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO:175, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento hueco que consta de 10 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar de etil (cEt) restringido; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0140] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido o un oligonucleótido antisentido dirigido a un receptor de andrógenos de ácido nucleico es complementario dentro de las siguientes regiones de nucleótidos de SEQ ID NO: 1: 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351­ 3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886­ 3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305­ 4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754­ 4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942­ 4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481­ 5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509, 5521-5536, 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189­ 13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329­ 29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720­ 58739, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58724-58739, 58725-58740, 58725­ 58740, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755­ 58770, 60902-60917, 67454-67469, 102156-102171, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, 134971­ 134986, 139682-139697, 139762-139777, 139782-139797, 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443-148458, 148520-148535, 181695-181710, 182958-182973, o 183049-183064.
[0141] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido u oligonucleótido antisentido dirigido a un ácido nucleico receptor de andrógenos se dirige a las siguientes regiones de nucleótidos de SEQ ID NO: 1: 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361­ 3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901­ 3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532­ 4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769­ 4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951­ 4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486 5501, 5488-5503, 5494-5509, 5521-5536, 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58724-58739, 58725-58740, 58725-58740, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454-67469, 102156-102171, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, 134971-134986, 139682-139697, 139762-139777, 139782-139797, 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443-148458, 148520­ 148535, 181695-181710, 182958-182973, o 183049-183064.
[0142] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido se dirigen a una región de un ácido nucleico Receptor de Andrógenos. En ciertas realizaciones, dichos compuestos u oligonucleótidos dirigidos a una región de un ácido nucleico del receptor de andrógenos tienen una parte de nucleobase contigua que es complementaria a una parte de nucleobase de igual longitud de la región. Por ejemplo, la porción puede ser al menos una porción de nucleobases contiguas de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 complementarias a una porción de igual longitud de una región mencionada aquí. En ciertas realizaciones, dichos compuestos u oligonucleótidos se dirigen a las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513­ 3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962­ 3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537­ 4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804­ 4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052­ 5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494­ 5509, 5521-5536, 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58724-58739, 58725-58740, 58725-58740, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454-67469, 102156­ 102171, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, 134971-134986, 139682-139697, 139762-139777, 139782-139797, 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443-148458, 148520-148535, 181695­ 181710, 182958-182973, o 183049-183064.
[0143] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido o oligonucleótido antisentido descrito en este documento se orienta a RA dentro del exón 1, por ejemplo dentro de las regiones de nucleótidos 2.863-5,593 (exón 1) o 27672­ 27853 (exón 1B) de la SEQ ID NO:1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento dirigido al exón 1 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735­ 3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038­ 4053, 4047-4062, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571­ 4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837­ 4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060­ 5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509, o 5521-5536.
[0144] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido o oligonucleótido antisentido descrito en este documento se orienta a RA dentro del exón 2, por ejemplo dentro de las regiones de nucleótidos 102.087-102,238 (exón 2) o 139551-139834 (exón 2c) de la SEQ ID NO:1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento dirigido al exón 2 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 102155-102170,102156-102171, 139682-139697, 139762-139777 o 139782­ 139797,
[0145] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido o oligonucleótido antisentido descrito en este documento se orienta a RA dentro del exón 3, por ejemplo dentro de las regiones de nucleótidos 144.841-144.957 (exón 3), 148.380-148.594 (exón 3b), o 153.504-154.908 (exón 3d) de la SEQ ID NO:1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en el presente documento dirigido al exón 3 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 144856-144871, 144938-144953, 148406­ 148421, 148443-148458, o 148520-148535.
[0146] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido u oligonucleótido antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del exón 7, por ejemplo dentro de la región de nucleótidos 181658-181815 de la SEQ ID NO:1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento está dirigido al exón 7 de RA es complementario dentro de la región de nucleótidos 181695-181710 de la SEQ ID NO:1,
[0147] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido o oligonucleótido antisentido descrito en este documento se orienta a RA dentro del exón 8, por ejemplo dentro de la región de nucleótidos 182517-189455 de SEQ ID NO:1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido divulgado en el presente documento dirigido al exón 8 de RA es complementario dentro de las regiones de nucleótidos 182958-182973 o 183049-183064 de la SEQ ID NO:1,
[0148] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido u oligonucleótido antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del intrón 1, por ejemplo dentro de las regiones de nucleótidos 5594-27671 o 27854-102086 de la SEQ ID NO:1. En ciertas realizaciones, se describe un compuesto antisentido aquí dirigido al intrón 1 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58724-58739, 58725-58740, 58725-58740, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, o 67454-67469.
[0149] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido o oligonucleótido antisentido descrito en este documento se orienta a RA dentro del intrón 2, por ejemplo dentro de las regiones de nucleótidos 102239-139550 o 139835­ 144840 de la SEQ ID NO:1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se orienta al intrón 2 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380 o 134971-134986.
[0150] En ciertas realizaciones, las siguientes regiones de nucleótidos de SEQ ID NO:1, cuando el blanco de compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido, muestran al menos el 50% de inhibición: 3099-3114, 3120­ 3135, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3513-3528, 3519-3534, 3768-3783, 3799-3814, 3851-3866, 3888-3903, 4059-4074, 4534-4549, 4555-4570, 4571-4586, 4578-4593, 4655-4670, 4699-4714, 4750-4765, 4755-4770, 4865­ 4880, 5054-5069, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5155-5170, 5265-5280, 5392-5407, 5448-5463, 5483-5498, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855­ 11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865­ 18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719­ 58734, 58720-58735, 58720-58739, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750­ 58765, 58750-58769, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454­ 67469, 102156-102171, 114874-114889, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, 134971-134986, 144856-144871, 181695-181710, 182958-182973, y 183049-183064.
[0151] En ciertas realizaciones, las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO:1, cuando son blanco de compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido, muestran al menos 60% de inhibición: 3799-3814, 3851­ 3866, 3888-3903, 4059-4074, 4534-4549, 4555-4570, 4571-4586, 4578-4593, 4655-4670, 4699-4714, 4755-4770, 4865-4880, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5155-5170, 5265-5280, 5392-5407, 5448-5463, 5483-5498, 7543­ 7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58735, 58720-58739, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58765, 58750-58769, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 67454-67469, 102156-102171, 115272-115287, 115365­ 115380, 144856-144871, 181695-181710, 182958-182973 y 183049-183064.
[0152] En ciertas realizaciones, las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO:1, cuando son blanco de compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido, muestran al menos 70% de inhibición: 3799-3814, 3851­ 3866, 3888-3903, 4059-4074, 4534-4549, 4655-4670, 4699-4714, 4755-4770, 4865-4880, 5060-5075, 5062-5077, 5155-5170, 5265-5280, 5392-5407, 5448-5463, 5483-5498, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10865­ 10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968­ 16983, 17206-17221, 18865-18880, 33315-33330, 42017-42032, 58719-58734, 58720-58739, 58720-58735, 58721­ 58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-58766, 58752­ 58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 102156-102171, 115365-115380, 144856-144871, 181695­ 181710, 182958-182973, y 183049-183064.
[0153] En ciertas realizaciones, las siguientes regiones nucleotídicas de la SEQ ID NO:1, cuando son blanco de compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido, muestran al menos 80% de inhibición: 3799-3814, 38513866, 3888-3903, 4059-4074, 4534-4549, 4655-4670, 4699-4714, 4755-4770, 4865-4880, 5060-5075, 5062-5077, 5155-5170, 5265-5280, 5392-5407, 5448-5463, 5483-5498, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10865-10880, 11197-11212, 13189-13204, 16793-16808, 58719-58734, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 102156-102171, 144856-144871, 181695-181710, 182958-182973, y 183049-183064.
[0154] En ciertas realizaciones, las siguientes regiones nucleotídicas de la SEQ ID NO:1, cuando son blanco de compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido, muestran al menos un 90% de inhibición: 4534-4549, 5060­ 5075, 5062-5077, 5155- 5170, 5265-5280, 5448-5463, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58765, 58751-58766, 58752-5877, 58754-58769, 58755-58770, 182958-182973, y 183049-183064.
[0155] En ciertas realizaciones, los siguientes compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido se dirigen a una región de un ácido nucleico del receptor de andrógenos y producen al menos un 50% de inhibición de un ARNm del receptor de andrógenos, ID de ISIS: 549332, 549334, 549338, 549347, 549358, 549360, 549361, 549362, 549366, 549371, 549372, 549374, 549377, 549379, 549380, 549381, 549387, 549390, 549414, 549432, 549434, 549457, 549458, 549459, 560071, 560098, 560099, 560100, 560131, 560132, 560133, 560137, 569213, 569215, 569216, 569220, 569222, 569223, 569227, 569228, 569229, 569236, 569238, 583559, 583608, 583609, 583613, 583635, 583638, 583662, 583795, 583796, 583799, 583834, 583919, 548145, 583148, 584149, 584152, 583157, 584158, 584162, 584163, 584165, 584166, 584167, 584168, 584179, 584180, 584183, 584184, 584192, 584233, 584242, 584245, 584263, 584269, 584274, 584312, 584329, 584361, 584465, 584465, 584468, 584469, 584469, 584495, 585233, 585259, 585262, 585263, 585264, 585265, 585268, 585269, 585271, 585274, 586124, 586224, 586224, 586225, 586225, 586227, y 586227.
[0156] En ciertas realizaciones, los siguientes compuestos antisentido o oligonucleótidos se dirigen a la región de un ácido nucleico de receptor de andrógenos y afectan al menos un 50% de inhibición de un ARNm del receptor de andrógenos, SEQ ID NOs:12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 46, 49, 53, 54, 55, 57, 59, 63, 92, 93, 95, 101, 125, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176 y 177.
[0157] En ciertas realizaciones, los siguientes compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido se dirigen a una región de un ácido nucleico receptor de andrógenos y producen al menos una inhibición del 60% de un ARNm del receptor de andrógenos, ID de ISIS: 549332, 549334, 549338, 549347, 549358, 549360, 549361, 549362, 549366, 549371, 549372, 549374, 549377, 549379, 549338, 549381, 549390, 549414, 549432, 549434, 549457, 549458, 549459, 560071, 560098, 560099, 560100, 560131, 560137, 56213, 569216, 569222, 569228, 569236, 583795, 583796, 583799, 584145, 584148, 584149, 584152, 584157, 584158, 584162, 584163, 584165, 584166, 584167, 584168, 584179, 584180, 584183, 584184, 584192, 584233, 584242, 584245, 584274, 584312, 584361, 584468, 584469, 585233, 585259, 585262, 585263, 585264, 585265, 585268, 585269, 585274, 586124, 586224, 586225, y 586227.
[0158] En ciertas realizaciones, los siguientes compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido se dirigen a una región de un ácido nucleico del receptor de andrógenos y afectan al menos un 60% de inhibición de un ARNm del receptor de andrógenos, SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 92, 93, 95, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170. 171, 173, 175 y 176.
[0159] En ciertas realizaciones, los siguientes compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido se dirigen a una región de un ácido nucleico del receptor de andrógenos y producen al menos una inhibición del 70% de un ARNm del receptor de andrógenos, ID de ISIS: 549332, 549334, 549338, 549347, 549358, 549360, 549361, 549362, 549366, 549371, 549372, 549374, 549377, 549379, 549380, 549381, 549387, 549390, 549414, 549432, 549434, 549457, 549458, 549459, 560071, 560098, 560099, 560100, 560131, 560137, 569222, 584145, 584148, 584149, 584152, 584162, 584163, 584165, 584166, 584167, 584168, 584179, 584180, 584183, 584184, 584192, 584245, 584274, 584469, 585259, 585262, 585268, 585269, 586124, 586224, 586225, y 586227.
[0160] En ciertas realizaciones, los siguientes compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido se dirigen a una región de un ácido nucleico del receptor de andrógenos y el efecto por lo menos un 70% de inhibición de un ARNm del receptor de andrógenos, SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 148, 149, 150, 151, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 167, 170, y 176.
[0161] En ciertas realizaciones, los siguientes compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido se dirigen a una región de un ácido nucleico del receptor de andrógenos y afectan al menos 80% de inhibición de un ARNm del receptor de andrógenos, ISIS IDs: 549332, 549334, 549338, 549347, 549358, 549360, 549361, 549362, 549366, 549371, 549372, 549374, 549377, 549379, 549380, 549381, 549387, 549390, 549414, 549432, 549434, 549457, 549458, 549459, 560098, 560099, 560100, 560137, 58414, 584148, 584148, 584148, 584142, 584162, 584162, 584163, 584148, 584148, 584142, 584162, 584162, 584162, 584162, 584162, 584148, y 586227,
[0162] En ciertas realizaciones, los siguientes compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido se dirigen a una región de un receptor de andrógenos de ácido nucleico y afectan al menos 80% de inhibición de un ARNm del receptor de andrógenos, SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 43, 149, 150, 151, 154, 155, 157 y 161.
[0163] En ciertas realizaciones, los siguientes compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido diana a una región de un receptor de andrógenos de ácido nucleico y afectan al menos 90% de inhibición de un ARNm del receptor de andrógenos, ISIS IDs: 549358, 549371, 549372, 549374, 549377, 549380, 549432, 549434, 549457, 549458, 549459, 560098, 560099, 560100, 560137, y 586224.
[0164] En ciertas realizaciones, los siguientes compuestos antisentido u oligonucleótidos antisentido se dirigen a una región de un ácido nucleico del receptor de andrógenos y afectan al menos 90% de inhibición de un ARNm del receptor de andrógenos, SEQ ID NOs: 16, 21, 22, 23, 24, 26, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, y 41.
[0165] El porcentaje de inhibición de ARNm del receptor de andrógenos se puede determinar usando métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica, tales como los descritos en el Ejemplo 1,
[0166] Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los ejemplos contenidos en este documento es independiente de cualquier modificación a un resto de azúcar, un enlace internucleósido o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a un resto de azúcar, un enlace internucleósido o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el número ISIS (ISIS) indican una combinación de secuencia de nucleobases, modificación química y motivo.
[0167] En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen en el presente documento son eficaces en virtud de tener al menos uno de una CI50 in vitro de menos de 250 nM, menos de 200 nM, menos de 150 nM, menos de 100 nM, menos de 90 nM, menos de 80 nM, menos de 70 nM, menos de 65 nM, menos de 60 nM, menos de 55 nM, menos de 50 nM, menos de 45 nM, menos de 40 nM, menos de 35 nM, menos de 30 nM, menos de 25 nM o menos de 20 nM cuando se administran a las células HuVEC. En ciertas realizaciones, la inhibición se mide con el conjunto de sondas de cebador RTS3559, como se describe en el presente documento.
[0168] En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen en el presente documento son altamente tolerables como se demuestra al tener al menos uno de un aumento de un valor de ALT o AST de no más de 4 veces, 3 veces o 2 veces más que la solución salina tratada. animales o un aumento en el peso del hígado, el bazo o los riñones de no más del 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% o 2%. En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen en el presente documento son altamente tolerables como se demuestra al no tener aumento de ALT o AST sobre animales tratados con solución salina. En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen en el presente documento son altamente tolerables como se demuestra al no tener un aumento en el peso del hígado, bazo o riñón sobre los animales tratados con solución salina.
[0169] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a una variante de empalme RA que incluye el exón 1 que codifica el dominio N-terminal y los exones 2 y 3 que codifican el dominio de unión al ADN, pero no incluye al menos una parte de la codificación del exón 4 la región de bisagra corta o al menos una porción de los exones 4-8 que codifican el dominio de unión al ligando. Un ejemplo de dicha variante de empalme de RA incluye, pero no se limita a, RA-V7, que contiene los exones 1-3 pero carece de los exones 4-8, Los ejemplos adicionales de tales variantes de empalme de RA incluyen, por ejemplo, RA3, RA4, RA4b, RA5 y RA6 (SEQ ID NOs: 4-8, respectivamente). En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a RA aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando es capaz de inhibir los niveles del receptor de andrógenos en mayor medida que un compuesto antisentido dirigido al dominio de unión al ligando, como EZN-4176, que está dirigido al exón 4 y corresponde a la SEQ ID NO: 58 descrita en el documento US 7.737.125.
[0170] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido se dirige a una variante de empalme de RA que tiene un dominio de unión a ADN funcional, pero no un dominio de unión a ligando funcional. Se entenderá que, en ciertas realizaciones, un compuesto antisentido puede dirigirse a una variante de empalme de RA que incluye la porción completa o al menos funcional del exón 1 que codifica el dominio N-terminal y la porción completa o al menos funcional de los exones 2 y 3 que codifica el dominio de unión al ADN, pero no incluye al menos una parte funcional del exón 4 que codifica la región de bisagra corta o al menos una parte funcional de los exones 4-8 que codifican el dominio de unión al ligando. Se contempla que ciertas variantes de empalme de RA dirigidas por los compuestos antisentido descritos en el presente documento que consisten sustancialmente en exones 1-3 también pueden incluir una porción no funcional de secuencia de ácido nucleico de una región genómica o exones 4-8, Se contempla que el proceso de empalme puede dar lugar a tales variantes de empalme de RA que retienen la función de unión al ADN pero no la función de unión al ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a una variante de empalme de RA que tiene un dominio de unión a ADN funcional, pero no un dominio de unión a ligando funcional, es capaz de inhibir el crecimiento o la proliferación de células de cáncer de próstata que son resistentes a la castración. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a una variante de empalme de RA que tiene un dominio de unión a ADN funcional, pero no un dominio de unión a ligando funcional, es capaz de inhibir el crecimiento o la proliferación de una célula de cáncer de próstata resistente a un inhibidor de la diarilhidantoína RA de Fórmula XI en mayor medida que un compuesto antisentido dirigido al dominio de unión al ligando, como EZN-4176, que está dirigido al exón 4 y corresponde a la SEQ ID NO: 58 descrita en el documento US 7.737.125. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del exón 1, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del exón 2, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en el presente documento se dirige a RA dentro del intrón 1, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando.
[0171] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en la presente es capaz de reducir la expresión de ambos de longitud completa RA y una variante de corte y empalme RA que incluye el exón 1 que codifica el dominio N-terminal y los exones 2 y 3 que codifican el dominio de unión a ADN, pero no incluye al menos una porción del exón 4 que codifica la región de bisagra corta o al menos una porción de uno cualquiera de los exones 4­ 8 que codifican el dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, dicho compuesto antisentido se dirige al receptor de andrógenos humanos aguas arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido se dirigen al receptor de andrógenos humanos aguas arriba del extremo 3' del exón 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del exón 1, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del exón 2, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en el presente documento se dirige a RA dentro del intrón 1, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando.
[0172] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito aquí se dirige a una variante de empalme RA que incluye el exón 1 que codifica el dominio N-terminal y los exones 2 y 3 que codifican el dominio de unión al ADN, pero no incluye al menos una parte de la codificación del exón 4 la región de bisagra corta o al menos una porción de los exones 4-8 que codifican el dominio de unión al ligando. Un ejemplo de dicha variante de empalme de RA incluye, pero no se limita a, RA-V7, que contiene los exones 1-3 pero carece de los exones 4-8,
[0173] Ciertas realizaciones se dirigen a un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógeno humano (RA) aguas arriba del dominio de unión al ligando que es capaz de inhibir el crecimiento o la proliferación de la célula de cáncer de próstata resistente en mayor medida que un compuesto antisentido dirigido a dominio de unión a ligando, tal como EZN-4176, que está dirigido al exón 4 y corresponde a la SEQ ID NO: 58 descrita en el documento US 7.737.125. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógeno humano (RA) aguas arriba del dominio de unión al ligando se dirige a una región de RA aguas arriba del extremo 3' del exón 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito aquí se dirige a RA dentro del exón 1, que está arriba del extremo 3' del exón 3 y/o más arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del exón 2, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en el presente documento se dirige a RA dentro del intrón 1, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando.
[0174] En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobases de un oligonucleótido modificado descrito en este documento es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1- 8, como se mide en la totalidad del oligonucleótido modificado.
[0175] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases al menos el 90% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-8 según se mide en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado.
[0176] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases 100% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-8 según se mide en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, un compuesto u oligonucleótido modificado descrito en el presente documento es monocatenario.
[0177] En ciertas realizaciones, un oligonucleótido modificado descrito en el presente documento consiste en 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados.
[0178] En ciertas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico de un oligonucleótido modificado descrito en el presente documento es un enlace internucleósido modificado. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico es un enlace internucleósido fosforotioato.
[0179] En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, al menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietil (2'-O(CH2)2-OCHa). En ciertas realizaciones, el azúcar modificado comprende un grupo 2 -O-CH3.
[0180] En ciertas realizaciones, al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente 4”- (CH2 V O-2 ', en donde n es 1 ó 2. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente 4'- CH2-O-2 '. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(CH3 )-O-2'.
[0181] En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido de un oligonucleótido modificado descrito en este documento comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
[0182] En ciertas realizaciones, un oligonucleótido modificado descrito en el presente documento consiste en un oligonucleótido modificado de cadena sencilla.
[0183] En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en el presente documento comprenden una sal del oligonucleótido modificado.
Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas
[0184] Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de varios criterios, entre los que se incluyen, entre otros, la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis que se administrará.
[0185] Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del receptor de andrógenos se pueden utilizar en las composiciones farmacéuticas por combinación del compuesto antisentido con un diluyente farmacéuticamente aceptable o portador adecuado. En ciertas realizaciones, un diluyente farmacéuticamente aceptable es agua, tal como agua estéril adecuada para inyección. Por consiguiente, en una realización, en los métodos descritos en el presente documento se emplea una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del receptor de andrógenos y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es agua. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido descrito en el presente documento.
[0186] Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualesquiera sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o sales de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo biológicamente activo de los mismos. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
[0187] Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinde por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
[0188] En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones comprenden además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Ciertas indicaciones
[0189] Ciertos aspectos de la divulgación se dirigen a métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el cáncer es RA positivo. En ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de vejiga o cáncer gástrico. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la SEQ ID NO: 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 o 175. En ciertos casos, En las realizaciones, el compuesto antisentido es monocatenario. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos es ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269, o ISIS 584269, o ISIS 584169.
[0190] Ciertos aspectos se dirigen a un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos descrito en el presente documento para uso en el tratamiento del cáncer. En ciertas realizaciones, el cáncer es RA positivo. En ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de vejiga o cáncer gástrico. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la SEQ ID NO: 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 o 175. En ciertos casos, En las realizaciones, el compuesto antisentido es monocatenario. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido a receptor de andrógenos es ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269 o ISIS 584468.
[0191] Ciertos aspectos están dirigidos al uso de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos descrito en el presente documento para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer. En ciertas realizaciones, el cáncer es RA positivo. En ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de vejiga o cáncer gástrico. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la SEQ ID NO: 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 o 175. En las realizaciones, el compuesto antisentido es monocatenario. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos es ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269, o ISIS 584269, o ISIS 584169.
[0192] Ciertos aspectos de la divulgación se dirigen al uso de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógeno humano (RA) como se describe en el presente documento, para tratar a un paciente con cáncer cuyo cáncer se ha vuelto resistente al tratamiento con un agente anti-androgénico (por ejemplo, compuesto o droga). En ciertas realizaciones, dicho cáncer es cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, dicho paciente es uno que tiene cáncer o cuyo cáncer ha desarrollado resistencia al tratamiento con un agente seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, acetato de abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la SEQ ID NO: 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 o 175. En ciertos casos, En las realizaciones, el compuesto antisentido se dirige a RA dentro del exón 1, por ejemplo, dentro de las regiones de nucleótidos 2863-5593 (exón 1) o 27672­ 27853 (exón 1B) de la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento dirigido a exón 1 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133­ 3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876­ 3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103­ 4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747­ 4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916­ 4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392­ 5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509, or 5521-5536. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito aquí se dirige a RA dentro del exón 2, por ejemplo dentro de las regiones de nucleótidos 102087-102238 (exón 2) o 139551-139834 (exón 2c) de la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, se describe un compuesto antisentido aquí dirigido al exón 2 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones nucleotídicas de la SEQ ID NO: 1: 102155-102170, 102156-102171, 139682­ 139697, 139762-139777, o 139782-139797, En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito aquí se dirige a RA dentro del exón 3, por ejemplo dentro de las regiones de nucleótidos 144841-144957 (exón 3), 148380­ 148594 (exón 3b), o 153504-154908 (exón 3d) de la SEQ ID NO: 1 En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento dirigido al exón 3 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443­ 148458, o 148520 -148535. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del intrón 1, por ejemplo dentro de las regiones de nucleótidos 5594-27671 o 27854-102086 de la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento dirigido al intrón 1 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 15666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 5820-58739, 58720-58735, 58721-58736, 58722-5877, 587 58738, 58724-58739, 58724-58739, 58725-58740, 58725-58740, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-5879, 58752-58790, 58754-58768 60902-60917, o 67454-67469. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito aquí se dirige a RA dentro del intrón 2, por ejemplo dentro de las regiones de nucleótidos 102239-139550 o 139835-144840 de la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento dirigido al intrón 2 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, o 134971-134986. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es monocatenario. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos es ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269, o ISIS 584269, o ISIS 584169.
[0193] Por resistente al tratamiento con un agente particular (por ejemplo, un compuesto o un fármaco) se entiende que el agente es menos o ya no es efectivo para detener el crecimiento o la propagación del cáncer y, por lo tanto, el paciente, o su cáncer, se ha vuelto menos sensible o sensible con el tiempo. Típicamente, tal paciente se clasificaría como resistente a dicho agente y ya no se trataría con dicho agente. Un sujeto que tiene cáncer de próstata resistente a un agente seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, acetato de abiraterona, TOK001, tAk700 y VT464 puede incluir, por ejemplo, un paciente que previamente recibió dicho agente pero cuyo cáncer de próstata es menos sensible o sensible a un agente. Por ejemplo, el cáncer de próstata resistente a un agente anti-androgénico seleccionado entre: MDV3100, ARN-059, o Dm-201, acetato de abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, puede incluir cáncer de próstata que ha aumentado en volumen tumoral, metástasis o progresión a pesar de tratamiento con el agente. En ciertas realizaciones, el cáncer de próstata resistente a un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, acetato de abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, puede incluir cáncer de próstata que es refractario al agente y no disminuye volumen tumoral, metástasis o progresión a pesar del tratamiento. Varias realizaciones se relacionan con un método para tratar el cáncer de próstata resistente a un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, acetato de abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, en un sujeto que comprende identificar al sujeto con cáncer de próstata resistente al agente y administrando al sujeto un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógeno humano (RA) aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando, como se describe aquí. Varias realizaciones se refieren a un método para tratar el cáncer de próstata resistente a un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, acetato de abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, en un sujeto que comprende administrar a un sujeto identificado o diagnosticado por tener cáncer de próstata resistente a dicho agente antiandrogénico, un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos (RA) humano aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o cadena arriba del dominio de unión al ligando, como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, las células de cáncer de próstata resistentes a un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, acetato de abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, expresan preferentemente una variante de empalme RA sobre RA completo.
[0194] Ciertos aspectos de la divulgación se dirigen a un método para tratar a un paciente que padece cáncer de próstata en el que el paciente, o su cáncer, se ha desarrollado o se ha vuelto resistente al tratamiento con un agente antiandrogénico (compuesto o fármaco) que comprende administrar a dicho paciente, un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógeno humano (RA) como se describe en este documento. En ciertas realizaciones, dicho paciente es uno que ha desarrollado resistencia al tratamiento con un agente seleccionado entre: MDV3100, ARN-059, ODM-201, acetato de abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la SEQ ID NO: 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 o 175. En las realizaciones, el compuesto antisentido es monocatenario. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos es ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269, o ISIS 584269, o ISIS 584169.
[0195] Un cáncer de próstata que se ha desarrollado o se ha vuelto resistente al tratamiento con un agente antiandrogénico se conoce como cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). Por lo tanto, en varias realizaciones, una célula de cáncer de próstata resistente a un agente anti-androgénico, como el MDV3100, se expuso previamente al inhibidor y se ha vuelto menos sensible o sensible al mismo con el tiempo. Por ejemplo, el MDV3100 inicialmente puede inhibir el crecimiento o la proliferación de células de cáncer de próstata en el paciente, pero con el tiempo tal efecto inhibitorio puede disminuir cuando las células se vuelven resistentes al inhibidor.
[0196] Ciertos aspectos de la divulgación se dirigen al uso de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos descrito en el presente documento para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer en un paciente cuyo cáncer se ha vuelto resistente al tratamiento con un agente antiandrogénico (compuesto o droga). En ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, dicho paciente es uno que, o cuyo cáncer ha desarrollado resistencia al tratamiento con un agente seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, acetato de abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la SEQ ID NO: 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 o 175. En las realizaciones, el compuesto antisentido es monocatenario. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos es ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269, o ISIS 584269, o ISIS 584169.
Enzalutamida:
[0197] MDV3100, también conocido como enzalutamida (XtandiTM) y por el nombre IUPAC 4-(3-(4-ciano-3-(trifluorometil)fenil)-5,5-dimetil-4-oxo-2-tioxoimidazolidina-1-il)-2-fluoro-N-metilbenzamida, es un inhibidor de la unión al ligando del receptor de andrógenos que pertenece a la clase de diarilhidantoína de los inhibidores del receptor de andrógenos representados por la Fórmula X i. MDV3100 tiene la siguiente fórmula química:
Figure imgf000023_0001
[0198] El MDV3100 y los inhibidores adicionales del receptor de andrógeno y diarilhidantoína adecuados para su uso en ciertas realizaciones proporcionadas en el presente documento se describen en la Patente de EE.UU. N° 7.709.517, Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° US20100172975 y Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° US20100210665.
ARN-509:
Figure imgf000024_0001
[0200] El compuesto de fórmula XII, también conocido como ARN-509 y por el nombre IUPAC 4-(7-(6-ciano-5-(trifluorometil)piridin-3-il)- 6,8-dioxo-5,7-diazaespiro [3.4]octan-5-il)-2-fluoro-N-metilbenzamida, es un inhibidor de la unión del ligando del receptor de andrógenos. ARN-509 y los inhibidores adicionales del receptor de andrógenos adecuados para su uso en ciertas realizaciones proporcionadas en el presente documento se describen en los documentos WO 2007126765, WO 2008119015 y en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2013/0116258.
Acetato de abiraterona
[0201] El compuesto de fórmula XIII, que es también conocido como acetato de abiraterona y ZYTIGA® y por el nombre iUpAC [(3S, 8R, 9S, 10R, 13S, 14S)-10,13-dimetil-17-(3-piridil)-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15-decahidro-1H-ciclopenta [a]fenantren-3-il] acetato, es un inhibidor de la biosíntesis de andrógenos y tiene la siguiente fórmula química:
Figure imgf000024_0002
[0202] La estructura y síntesis de acetato de abiraterona se describe en Potter et al., Journal of Medicinal Chemistry (38 (13), 2463-71, 1995).
Galeterona:
[0203] El compuesto de fórmula XIV, que también se conoce como TOK-001 y Galeterone, y por el nombre IUPAC (3S,10R, 13S)-17-(1H-benzo
[d]imidazol-1-il)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15-dodecahidro-1H-ciclopenta
[a]fenantren-3-ol, tiene la siguiente fórmula química:
Figure imgf000024_0003
[0204] La estructura y síntesis de TOK-001 se describe en Handratta et al., (Journal of Medicinal Chemistry (2005), 48 (8), 2972-84, 2005).
Orteronel:
[0205] El compuesto de fórmula XV, que también se conoce como TAK-700 y Orteronel y por el nombre IUPAC 6-[7(s)-hidroxi-6,7-dihidro-5H-pirrolo
[1.2-c]imidazol-7-il]-N-metilnaftaleno-2-carboxamida, es un inhibidor de la bio-síntesis de andrógenos y tiene la siguiente fórmula química:
Figure imgf000025_0001
[0206] La estructura y síntesis de TAK-700 se describe en Kaku et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry (19 (21), 6383-99, 2011).
[0207] Yin et al., (Int. J. Mol. Sci., 14(7):13958-13978, 2013) analizan el progreso reciente con varias terapias farmacéuticas, incluidas ODM-21, VT464, ARN509, TAK700 y TOK 001, para el cáncer de próstata resistente a la castración.
Ciertas combinaciones y terapias de combinación
[0208] En ciertas realizaciones, un primer agente que comprende el compuesto descrito en el presente documento se coadministra con uno o más agentes secundarios. En ciertas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección que el primer agente descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente como el primer agente descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, un primer agente está diseñado para tratar un efecto secundario no deseado de un segundo agente. En ciertas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para tratar un efecto no deseado del primer agente. En ciertas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para producir un efecto combinado. En ciertas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para producir un efecto sinérgico. En ciertas realizaciones, la administración conjunta del primer y segundo agentes permite el uso de dosis más bajas de las que se requerirían para lograr un efecto terapéutico o profiláctico si los agentes se administraran como terapia independiente.
[0209] En ciertas realizaciones, uno o más compuestos o composiciones descritas en el presente documento se administran conjuntamente con uno o más agentes anti-androgénicos. En ciertas realizaciones, uno o más compuestos o composiciones descritas en el presente documento y uno o más agentes anti-androgénicos, se administran en diferentes momentos. En ciertas realizaciones, uno o más compuestos o composiciones descritas en el presente documento y uno o más agentes anti-androgénicos, se preparan juntos en una única formulación. En ciertas realizaciones, uno o más compuestos o composiciones descritas en el presente documento y uno o más agentes anti-androgénicos, se preparan por separado. En ciertas realizaciones, un agente anti-androgénico se selecciona de MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464.
[0210] Ciertos aspectos de la divulgación se dirigen al uso de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos humanos (RA) como se describe en el presente documento en combinación con un agente antiandrogénico. En realizaciones particulares, dicho uso es en un método para tratar a un paciente que padece cáncer o en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer. En ciertas realizaciones, el cáncer se selecciona entre: cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de vejiga o cáncer gástrico. Clases particulares de agentes anti-androgénicos son los agentes antihormonales de segunda generación, tales como: enzalutamida (MDV3100), ARN-059, ODM-201, acetato de abiraterona, galeterona (TOK001), orteronel (TAK700) y VT464 (ver Yin et al. supra).
[0211] Ciertos aspectos se dibujan en una combinación de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos (RA) humano como se describe en este documento y un agente anti-androgénico, como un agente anti­ hormonal de segunda generación seleccionado de: MDV3100, a Rn-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464.
[0212] En ciertas realizaciones, una combinación de este tipo de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos (RA) como se describe en este documento y un agente anti-androgénico, tal como un agente anti­ hormonal de segunda generación seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, es útil para inhibir el crecimiento o la proliferación de células cancerosas y/o para tratar el cáncer. En ciertas realizaciones, el cáncer se selecciona entre: cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de vejiga o cáncer gástrico. En ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, el cáncer es el cáncer de mama. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a RA como descrito aquí y un agente anti-androgénico, como un agente antihormonal de segunda generación seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, sinergizan en combinación para inhibir el crecimiento o la proliferación de un cáncer célula. En varias realizaciones, la célula cancerosa es una célula de cáncer de próstata que es o se ha vuelto resistente a la castración. En diversas realizaciones, la célula cancerosa es una célula de cáncer de próstata que es o se ha vuelto resistente a un agente antihormonal de segunda generación seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la SEQ ID NO: 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 o 175. En ciertos casos, realizaciones, el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos es ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269, o ISIS 584269, o ISIS 584269, o ISIS 584269.
[0213] Se dibujan varias formas de realización de una combinación de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógeno humano (RA) y un inhibidor de la diarilhidantoína RA de Fórmula XI, como el MDV3100. En varias realizaciones, un inhibidor del Receptor de Andrógeno (RA) diaril-hidantoína es un compuesto de Fórmula XVI:
Figure imgf000026_0001
en donde X se selecciona del grupo que consiste en trifluorometil y yodo, en donde W se selecciona del grupo que consiste en O y NR5, en donde R5 se selecciona del grupo que consiste en H, metil, y
Figure imgf000026_0002
en donde D es S o O y E es N o O y G es alquil, aril, alquil sustituido o aril sustituido; o D es S o O y E-G juntos son alquil inferior C1-C4,
en donde R1 y R2 juntos comprenden ocho o menos átomos de carbono y se seleccionan del grupo que consiste en alquil, alquil sustituido que incluye haloalquil y, junto con el carbono al que están unidos, un grupo cicloalquil o cicloalquil sustituido,
donde R3 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, metil, alcoxi C1-C4, formil, haloacetoxi, trifluorometil, ciano, nitro, hidroxil, fenil, amino, metilcarbamoil, metoxicarbonil, acetamido, metanosulfonil, metanosulfonil, metanosulfonil-1-piperazinil, piperazinil, y alquil o alquenil C1-C6 opcionalmente sustituido con hidroxil, metoxicarbonil, ciano, amino, amido, nitro, carbamoil o carbamoil sustituido, incluyendo metilcarbamoil, dimetilcarbamoil y hidroxietilcarbamoilo,
en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquil y haloalquil, y en donde R3 no es metilaminometil o dimetilaminometilo.
R5 puede ser
Figure imgf000027_0001
o
Figure imgf000027_0002
[0214] En ciertas realizaciones, una combinación de este tipo de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos (RA) y un inhibidor de diarilhidantoína RA de Fórmula XVI, como el MDV3100, es útil para inhibir el crecimiento o la proliferación celular del cáncer de próstata y/o para tratar el cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a RA y un inhibidor de diarilhidantoina RA de Fórmula XVI, tal como MDV3100, se sinergizan en combinación para inhibir el crecimiento o la proliferación de una célula de cáncer de próstata. En varias realizaciones, la célula de cáncer de próstata es resistente a la castración. En diversas realizaciones, la célula de cáncer de próstata es resistente a un inhibidor de diarilhidantoína RA de Fórmula XVI, tal como MDV3100. En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de próstata o la célula de cáncer de próstata resistente a la castración expresa preferentemente una variante de empalme de RA sobre la RA de longitud completa. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido a RA como se describe en el presente documento y el otro agente anti-androgénico se usan en un tratamiento de combinación administrando los dos agentes simultáneamente, por separado o secuencialmente. En ciertas realizaciones, los dos agentes se formulan como un producto de combinación de dosis fija. En otras realizaciones, los dos agentes se revelan al paciente como unidades separadas que pueden tomarse simultáneamente o en serie (secuencialmente).
[0215] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido útiles para inhibir células de cáncer de próstata y/o crecimiento celular del cáncer de próstata resistente a castración o proliferación en combinación con otro agente anti-androgénico, tal como un agente anti-hormonal de segunda generación seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, receptor de andrógenos humanos diana aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del exón 1, el exón 2, el exón 3, el intrón 1 o el intrón 2 como se describe en el presente documento.
[0216] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a una variante de empalme de RA que incluye el exón 1 que codifica el dominio N-terminal y los exones 2 y 3 que codifican el dominio de unión al ADN, pero no incluye al menos una parte del exón 4 que codifica la región de bisagra corta o al menos una porción de los exones 4-8 que codifican el dominio de unión al ligando. Un ejemplo de dicha variante de empalme de RA incluye, pero no se limita a, RA-V7, que contiene los exones 1-3 pero carece de los exones 4-8, Los ejemplos adicionales de tales variantes de empalme de RA incluyen, por ejemplo, RA3, RA4, RA4b, RA5 y RA6 (SEQ ID NOs: 4-8, respectivamente). En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de próstata, que puede ser resistente a la castración, expresa preferentemente una variante de empalme de RA sobre RA de longitud completa. En realizaciones particulares, la célula de cáncer de próstata es resistente a la castración frente a un agente antiandrogénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, Od M-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464 En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a RA aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando es capaz de inhibir el crecimiento o la proliferación de una célula de cáncer de próstata, incluida una célula de cáncer de próstata resistente a la castración, en combinación con un agente antiandrogénico seleccionado de: MDV3100 ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, en mayor medida que un compuesto antisentido dirigido al dominio de unión al ligando, como EZN-4176, que está dirigido al exón 4 y corresponde a la SEQ ID. NO: 58 descrito en el documento US 7.737.125, en combinación con el mismo agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464. En ciertas realizaciones, la combinación de un compuesto antisentido como se describe aquí y el agente anti­ androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y v T464, proporciona una sinergia (por ejemplo, mayor que (aditivo) que inhibe el crecimiento o la proliferación de una célula de cáncer de próstata, como una célula de cáncer de próstata resistente a la castración, en comparación con el compuesto antisentido solo o el agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464 solo. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las cantidades de uno o ambos compuestos antisentido y/o agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, cuando se usa en combinación puede ser menor que la cantidad correspondiente del compuesto antisentido solo o el agente antiandrogénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, solo necesario para lograr un nivel equivalente de inhibición del crecimiento o proliferación de células de cáncer de próstata.
[0217] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido da a conocer en la presente memoria útiles para inhibir células de cáncer de próstata y/o crecimiento de células de cáncer de próstata resistentes a la castración o la proliferación en combinación con un agente anti-androgénica selecciona de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, se dirige a una variante de empalme RA que tiene un dominio de unión a ADN funcional, pero no un dominio de unión a ligando funcional. Se entenderá que, en ciertas realizaciones, un compuesto antisentido puede dirigirse a una variante de empalme de RA que incluye la porción completa o al menos funcional del exón 1 que codifica el dominio N-terminal y la porción completa o al menos funcional de los exones 2 y 3. que codifica el dominio de unión al ADN, pero no incluye al menos una parte funcional del exón 4 que codifica la región de bisagra corta o al menos una parte funcional de los exones 4-8 que codifican el dominio de unión al ligando. Se contempla que ciertas variantes de empalme de RA dirigidas por los compuestos antisentido descritos en el presente documento que consisten sustancialmente en exones 1-3 también pueden incluir una porción no funcional de secuencia de ácido nucleico de una región genómica o exones 4-8, Se contempla que el proceso de empalme puede dar lugar a tales variantes de empalme de RA que retienen la función de unión al ADN pero no la función de unión al ligando. En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de próstata, que puede ser resistente a la castración, expresa preferentemente una variante de empalme de RA sobre RA de longitud completa. En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de próstata es resistente a la castración a un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, o Dm-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del exón 1, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del exón 1, el exón 2, el exón 3, el intrón 1 o el intrón 2 como se describe en el presente documento.
[0218] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un variante de corte y empalme RA que tiene un dominio de unión de ADN funcional, pero no es un ligando funcional del dominio de unión, es capaz de inhibir el crecimiento o proliferación de una célula de cáncer de próstata, incluyendo una célula de cáncer de próstata resistente a la castración, en combinación con un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, en mayor medida que un compuesto antisentido dirigido al dominio de unión al ligando, como como EZN-4176, que está dirigido al exón 4 y corresponde a la SEQ ID NO: 58 descrita en el documento US 7.737.125, en combinación con el mismo agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464. En ciertas realizaciones, la combinación de un compuesto antisentido y un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, proporciona un efecto sinérgico (por ejemplo, mayor que aditivo) en la inhibición el crecimiento o proliferación de una célula de cáncer de próstata, como una célula de cáncer de próstata resistente a la castración, en comparación con el compuesto antisentido solo o el agente antiandrogénico solo. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las cantidades de uno o ambos del compuesto antisentido y/o agente antiandrogénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, cuando se usan en combinación pueden ser menores que la cantidad correspondiente del compuesto antisentido solo o del agente anti-androgénico, solo necesario para lograr un nivel equivalente de inhibición del crecimiento o la proliferación de células de cáncer de próstata.
[0219] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en la presente memoria útil para inhibir células de cáncer de próstata y/o crecimiento de células de cáncer de próstata resistentes a la castración o la proliferación en combinación con un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464 es capaz de reducir la expresión de RA de longitud completa y una variante de empalme de RA que incluye el exón 1 que codifica el dominio N-terminal y los exones 2 y 3 que codifican el dominio de unión al ADN, pero no incluye al menos una porción del exón 4 que codifica la región de bisagra corta o al menos una porción de uno cualquiera de los exones 4-8 que codifican el dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, dicho compuesto antisentido se dirige al receptor de andrógenos humanos aguas arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido se dirigen al receptor de andrógenos humanos aguas arriba del extremo 3' del exón 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se dirige a RA dentro del exón 1, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando.
[0220] En ciertas realizaciones, se describe una combinación de un compuesto antisentido dirigido a receptor de andrógeno humano (RA) tal como se describe en el presente documento y un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, en donde el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 12-179. En ciertas realizaciones, se describe una combinación de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógeno humano (RA) y un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, en donde el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, se describe una combinación de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógeno humano (RA) y un agente antiandrogénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, en donde el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 12-179. En ciertas realizaciones, se describe una combinación de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógeno humano (RA) y un inhibidor de diarilhidantoina RA de Fórmula XI, como el MDV3100, en donde el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobase que consiste en la SEQ. ID NO: 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 o 175. En ciertas realizaciones, se describe una combinación de un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógeno humano (RA) y un inhibidor de la diarilhidantoína RA de Fórmula XI. tal como MDV3100, en donde el compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos es SIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269, or ISIS 584468.
[0221] Se describen varias formas de realización de un método para inhibir el crecimiento o la proliferación de células de cáncer de próstata que comprende poner en contacto la célula de cáncer de próstata con un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos humanos (RA) y un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido y un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464, hacen sinergia en combinación para inhibir el crecimiento o la proliferación de la célula de cáncer de próstata. En varias realizaciones, la célula de cáncer de próstata es resistente a la castración. En diversas realizaciones, la célula de cáncer de próstata es resistente a la castración al ser resistente a un agente antiandrogénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464. En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de próstata o la célula de cáncer de próstata resistente a la castración expresan preferentemente una variante de empalme de RA sobre la RA de longitud completa.
[0222] En ciertos aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores, los compuestos antisentido útiles para inhibir el crecimiento o la proliferación de células de cáncer de próstata en combinación con un inhibidor de diarilhidantoína RA de Fórmula XVI, tal como MDV3100, pueden dirigirse (i) al receptor de andrógenos humanos aguas arriba del Extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando o (ii) una variante de empalme RA que tiene un dominio de unión al ADN funcional, pero no un dominio de unión al ligando funcional; y/o es capaz de (i) reducir la expresión tanto de RA de longitud completa como de una variante de empalme de RA que incluye el exón 1 que codifica el dominio N-terminal y los exones 2 y 3 que codifican el dominio de unión al ADN, pero no incluye al menos una parte del exón 4 que codifica la región de bisagra corta o al menos una parte de uno cualquiera de los exones 4-8 que codifican el dominio de unión al ligando; con la condición de que los compuestos antisentido no tengan una secuencia de nucleobases consistente en ninguna de las SEQ ID NO: 194-215 identificada en la Tabla A a continuación.
Tabla A
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[0223] En ciertos aspectos de cualquiera de las anteriores realizaciones, los compuestos antisentido útiles para inhibir el crecimiento o proliferación de células de cáncer de próstata resistentes a agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, t Ok001, TAK700 y VT464, puede dirigirse (i) al receptor de andrógenos humanos aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando o (ii) una variante de empalme RA que tiene un dominio de unión al ADN funcional, pero no un ligando funcional dominio vinculante; y/o es capaz de (i) reducir la expresión tanto de RA de longitud completa como de una variante de empalme de RA que incluye el exón 1 que codifica el dominio N-terminal y los exones 2 y 3 que codifican el dominio de unión al ADN, pero no incluye al menos una parte del exón 4 que codifica la región de bisagra corta o al menos una parte de uno cualquiera de los exones 4-8 que codifican el dominio de unión al ligando; o (ii) inhibir el crecimiento o la proliferación de la célula de cáncer de próstata resistente en mayor medida que un compuesto antisentido dirigido al dominio de unión al ligando, como EZN-4176; con la condición de que los compuestos antisentido no tengan una secuencia de nucleobases que consista en ninguna de las SEQ ID NO: 194-215 descrita en el documento US 7.737.125 como SEQ ID NO: 2-9, 49-50, 52-53, 55-56, y 86-93, e identificadas en la Tabla A.
[0224] Ciertos aspectos están dirigidos a métodos de tratamiento de cáncer de mama y métodos de inhibición de crecimiento de células de cáncer de mama o de proliferación con un oligonucleótido antisentido dirigido a receptor de andrógenos humano (RA) tal como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el cáncer de mama tiene una o más de las siguientes características: Receptor de Andrógeno positivo, dependiente de andrógeno para el crecimiento, Receptor de Estrógeno (RE) negativo, independiente del estrógeno para el crecimiento, Receptor de progesterona (RP) negativo, independiente de la progesterona para crecimiento, o HER2/neu negativo. En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de mama o cáncer de mama es apocrina.
[0225] Ciertas realizaciones se dirigen a un método para tratar el cáncer de mama en un sujeto que comprende administrar al sujeto un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos humanos (RA). Ciertas realizaciones se dirigen a un método para tratar el cáncer de mama en un sujeto que comprende identificar a un sujeto que tiene cáncer de mama y administrar al sujeto un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos (RA) humano, tratando así el cáncer de mama del sujeto. Ciertas realizaciones están dirigidas a un método para inhibir el crecimiento o la proliferación de una célula de cáncer de mama que comprende el contacto de la célula de cáncer de mama con un compuesto antisentido dirigido al receptor de andrógenos humanos (RA). Ciertas realizaciones se relacionan con un método para inhibir la expresión de RA en un sujeto que tiene o corre el riesgo de tener cáncer de mama, que comprende identificar a un sujeto con cáncer de mama y administrar al sujeto un compuesto antisentido dirigido a RA humana, en donde el compuesto antisentido inhibe la expresión de RA en el tema.
[0226] En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de mama o cáncer de mama tiene una o más de las siguientes características: Receptor de andrógenos positivo, dependiente de andrógeno para el crecimiento, Receptor de estrógeno (RE) negativo, independiente del estrógeno para el crecimiento, Receptor de progesterona (RP)) negativo, independiente de la progesterona para el crecimiento, o HER2/neu negativo. En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de mama o cáncer de mama es RE, RP y HER2 triple negativa y RA positiva (RE-, RP-, HER2-, RA+). En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de mama o cáncer de mama es RE negativa y RA positiva (RE-, RA+). En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de mama o cáncer de mama es RE positiva y Ra positiva (RE+, RA+).
[0227] En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de mama o cáncer de mama es apocrina. Los cánceres de mama apocrinos a menudo son "triple negativos", lo que significa que las células no expresan los receptores RE, RP o HER2, y generalmente, pero no necesariamente, RA positivo. En ciertas realizaciones, una célula de cáncer de mama apocrina o cáncer de mama es RE, RP y HER2 triple negativa y RA positiva (RE-, RP-, HER2-, RA+). En ciertas realizaciones, una célula de cáncer de mama o cáncer de mama apocrina es RE negativa y RA positiva (RE-, RA+). En ciertas realizaciones, una célula de cáncer de mama apocrina o cáncer de mama se origina en la glándula sudoríparas de la mama. En ciertas realizaciones, una célula de cáncer de mama o cáncer de mama apocrina es una célula de cáncer de mama o cáncer ductal. En ciertas realizaciones, un cáncer de mama apocrino puede tener una o más de las siguientes características: una gran cantidad de citoplasma granular eosinófil, márgenes bien definidos, grandes núcleos vesiculares, una relación nuclear a citoplásmica de aproximadamente 1:2, y/o acumulaciones de gránulos secretados en el citoplasma apical conocido como hocicos apicales.
[0228] En ciertas realizaciones, la célula de cáncer de mama o cáncer de mama es una célula de cáncer de mama apocrina o RE negativa (RA-, RA+) de RE negativa y RA positiva (RE-). En ciertos aspectos, una RE negativa y [0229] Cáncer de mama apocrino molecular o célula de cáncer de mama RA positiva (RE, RA+) pueden ser RP positivos, RP negativos, HER2 negativos, o HER2 positivos.
[0230] El cáncer de mama puede ser identificado como positivo o negativo con respecto a los receptores de hormonas, tales como RE, RP, o HER2 por técnicas histológicas estándar. Por ejemplo, las muestras histológicas de cáncer de mama pueden clasificarse como "triple negativas" (RE-, RP-, HER2-) cuando menos del 1% de las células muestran tinción nuclear para receptores de estrógeno y progesterona y la tinción inmunohistoquímica para HER2 muestran una puntuación positiva de 0, 1 ó 2 veces y una relación FISH (señales del gen HER2 a señales del cromosoma 17) de menos de 1,8 según las directrices relevantes de ASCO y CAP. (Meyer, P. et al., PLoS ONE 7 (5): e38361 (2012)).
[0231] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido útil para tratar el cáncer de mama o inhibir el crecimiento o proliferación de una diana celular del cáncer de pecho descrito en este documento se orienta a RA dentro del exón 1, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito aquí se dirige a RA dentro del exón 1, por ejemplo dentro de las regiones de nucleótidos 2863-5593 (exón 1) o 27672-27853 (exón 1B) de la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, se describe un compuesto antisentido aquí dirigido al exón 1 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 3353-3368, 3361-3376, 3519-3534, 3735-3750, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3888-3903, 4047-4062, 4062-4077, 4109-4124, 4534­ 4549, 4537-4552, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4655-4670, 4750-4765, 4752-4767, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4916-4931, 4918-4933, 5052-5067, 5054­ 5069, 5060-5075, 5061-5076, 5061-5076, 5062-5077, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5392-5407, 5448-5463, 5483-5498, 5486-5501, o 5494-5509.
[0232] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento se orienta a RA dentro del exón 2, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión a ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido útil para tratar el cáncer de mama o inhibir el crecimiento o la proliferación de una diana celular de cáncer de mama descrita aquí se dirige a RA dentro del exón 2, por ejemplo dentro de las regiones de nucleótidos 102087-102238 (exón 2) o 139551-139834 (exón 2c) de la SEQ iD NO: 1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito en este documento dirigido al exón 2 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 102155-102170 o 102156­ 107171.
[0233] En ciertos aspectos, un compuesto antisentido útil para tratar el cáncer de mama o inhibir el crecimiento o proliferación de una célula de cáncer de mama se da a conocer en el presente documento se orienta a RA dentro del intrón 1, que está aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido descrito aquí se dirige a RA dentro del intrón 1, por ejemplo, dentro de las regiones de nucleótidos 5594-27671 o 27854-102086 de la SEQ ID NO: 1, En ciertos aspectos, un compuesto antisentido descrito aquí dirigido al intrón 1 de RA es complementario dentro de cualquiera de las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1: 5666-5681, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464­ 9479, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16793-16808, 16968­ 16983, 17206-17221, 18865-18880, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050­ 56065, 58719-58734, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58725-58740, 58750-58765, 58751 58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, o 58755-58770.
[0234] En ciertos aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores, los compuestos antisentido útiles para tratar el cáncer de mama o inhibir el crecimiento o la proliferación de una célula de cáncer de mama se dirigen al receptor de andrógenos humano aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del ligando dominio vinculante. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento, incluidos, entre otros, los que se dirigen al receptor de andrógenos humanos aguas arriba del extremo 3' del exón 3 y/o aguas arriba del dominio de unión al ligando, pueden tratar el cáncer de mama o inhibir el crecimiento o la proliferación de un células de cáncer de mama en mayor medida que un compuesto antisentido dirigido al dominio de unión al ligando, como EZN-4176; con la condición de que los compuestos antisentido no tengan una secuencia de nucleobases que consista en ninguna de las SEQ ID NO: 194-215 descrita en el documento US 7.737.125 como SEQ ID NO: 2-9, 49­ 50, 52-53, 55-56, y 86-93, e identificadas en la Tabla A.
Compuestos antisentido
[0235] Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNsi. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
[0236] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en ,a dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. En ciertas realizaciones de este tipo, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige.
[0237] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 10-30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 12 a 22 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 14 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 14 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 15 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 15 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 21 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 20 a 30 subunidades. En otras palabras, dichos compuestos antisentido son de 12 a 30 subunidades vinculadas, 14 a 30 subunidades vinculadas, 14 a 20 subunidades, 15 a 30 subunidades, 15 a 20 subunidades, 16 a 30 subunidades, 16 a 20 subunidades, 17 a 30 subunidades, 17 a 20 subunidades, 18 a 30 subunidades, 18 a 20 subunidades, 18 a 21 subunidades, 20 a 30 subunidades, o 12 a 22 subunidades vinculadas, respectivamente. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 14 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 20 subunidades. En otras realizaciones, el compuesto antisentido es 8 a 80, 12 a 50, 13 a 30, 13 a 50, 14 a 30, 14 a 50, 15 a 30, 15 a 50, 16 a 30, 16 a 50, 17 a 30, 17 a 50, 18 a 22, 18 a 24, 18 a 30, 18 a 50, 19 a 22, 19 a 30, 19 a 50, o 20 a 30 subunidades enlazadas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28., 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 subunidades vinculadas en longitud, o un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En algunas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, y las subunidades enlazadas son nucleótidos.
[0238] En ciertas realizaciones se podrán reducir o truncar oligonucleótidos antisentido. Por ejemplo, una sola subunidad se puede eliminar del extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3' (truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico del Receptor de Andrógeno puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
[0239] Cuando una sola subunidad adicional está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede estar situada en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando dos o más subunidades adicionales están presentes, las subunidades agregadas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades agregadas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3'), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades agregadas pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad agregada al extremo 5' y una subunidad agregada al extremo 3'.
[0240] Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases no coincidentes sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 7305-7309, 1992), una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud se ensayaron para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases no coincidentes cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían desajustes. De manera similar, la escisión específica de la diana se logró utilizando 13 oligonucleótidos antisentido de nucleobases, incluidos aquellos con 1 o 3 desapareamientos.
[0241] Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, marzo de 2001) demostró la capacidad de un oligonucleótido con un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y con 3 desajustes con el ARNm de bcl-XL para reducir la expresión de ambos bcl -2 y bcl-XL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
[0242] Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358,1988) ensayaron una serie de oligonucleótidos antisentido de nucleobase en tándem 14, y un oligonucleótido antisentido de 28 y 42 nucleobases compuesto por la secuencia de dos o tres de oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Ciertos motivos y mecanismos compuestos antisentido
[0243] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido de las propiedades tales como la actividad inhibidora mejorada, aumento de la afinidad de unión para un ácido nucleico diana, o la resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
[0244] Compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente al menos una región modificada de modo que confieren una mayor resistencia a la degradación por nucleasas, aumento de la captación celular, aumento de la afinidad de unión para el ácido nucleico diana, y/o aumento de la actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede conferir otra propiedad deseada, por ejemplo, servir como un sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que corta la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
[0245] La actividad antisentido puede resultar de cualquier mecanismo que implica la hibridación del compuesto antisentido (por ejemplo, oligonucleótido) con un ácido nucleico diana, en el que la hibridación en última instancia resulta en un efecto biológico. En ciertas realizaciones, la cantidad y/o actividad del ácido nucleico diana se modula. En ciertas realizaciones, se reduce la cantidad y/o actividad del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico diana da como resultado finalmente una degradación del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido para el ácido nucleico diana no da como resultado la degradación del ácido nucleico diana. En ciertas de tales realizaciones, la presencia del compuesto antisentido hibridado con el ácido nucleico diana (ocupación) da como resultado una modulación de la actividad antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen un motivo químico particular o un patrón de modificaciones químicas son particularmente adecuados para explotar uno o más mecanismos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido funcionan a través de más de un mecanismo y/o a través de mecanismos que no se han dilucidado. Por consiguiente, los compuestos antisentido descritos en el presente documento no están limitados por un mecanismo particular.
[0246] Los mecanismos antisentido incluyen, sin limitación, antisentido mediado por RNasa H; los mecanismos de ARNi, que utilizan la vía RISC e incluyen, sin limitación, los mecanismos de ARNsi, ARNss y microARN; y mecanismos basados en la ocupación. Ciertos compuestos antisentido pueden actuar a través de más de uno de estos mecanismos y/o mediante mecanismos adicionales.
Antisentido mediado por RNasa H
[0247] En ciertas realizaciones, la actividad antisentido resulta al menos en parte de la degradación de ARN diana por la ARNasa H. RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido monocatenarios que son "similares a ADN" provocan la actividad de la ARNasa H en células de mamíferos. Por consiguiente, los compuestos antisentido que comprenden al menos una porción de ADN o nucleósidos similares a ADN pueden activar la ARNasa H, dando como resultado la escisión del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que utilizan RNasa H comprenden uno o más nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, dichos compuestos antisentido comprenden al menos un bloque de 1-8 nucleósidos modificados. En ciertas de tales realizaciones, los nucleósidos modificados no soportan la actividad de la ARNasa H. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido son gápmeros, como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones de este tipo, la separación del separador comprende nucleósidos de a Dn . En ciertas de tales realizaciones, la separación del separador comprende nucleósidos similares a ADN. En ciertas realizaciones de este tipo, el hueco del separador comprende nucleósidos de ADN y nucleósidos similares a ADN.
[0248] Ciertos compuestos antisentido que tienen un motivo gápmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un espacio abierto, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de la RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo hueco, el segmento hueco generalmente sirve como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos del ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un separador se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gápmero pueden en algunas realizaciones incluir p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (tales nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE) y 2'-O-CH3 , entre otros), y nucleósidos bicíclicos modificados de azúcar (tales nucleósidos bicíclicos modificados en el azúcar pueden incluir los que tienen un acetato constreñido). En ciertas realizaciones, los nucleósidos en las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados, que incluyen, por ejemplo, 2'-MOE y restos de azúcar bicíclicos, tales como etil restringido o LNA. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados y no modificados. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias combinaciones de nucleósidos 2'-MOE, restos de azúcares bicíclicos tales como nucleósidos de etil restringidos o nucleósidos de LNA y 2'-desoxinucleósidos.
[0249] Cada región distinta puede comprender restos de azúcar uniformes, variantes, o restos de azúcar alternantes. El motivo ala-brecha-ala se describe frecuentemente como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud del ala 5', "Y" representa la longitud de la brecha, y "Z" representa la longitud de 3'-ala. "X" y "Z" pueden comprender restos de azúcares uniformes, variantes o alternos. En ciertas realizaciones, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se usa en este documento, un separador de gápmero descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que la separación se coloca inmediatamente adyacente a cada una de las alas 5' y 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5' y la brecha, o la brecha y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en el presente documento puede tener un motivo de gápmero. En ciertas realizaciones, "X" y "Z" son iguales; en otras realizaciones son diferentes. En ciertas realizaciones, "Y" está entre 8 y 15 nucleósidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleósidos.
[0250] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del Receptor de Andrógeno tiene un motivo gápmero en el que el espacio consiste en 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleósidos unidos.
[0251] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido tiene un motivo de azúcar descrito por la Fórmula A de la siguiente manera: (J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w -(J)x-(B)y-(J)z
en donde:
cada A es independientemente un nucleósido sustituido en 2';
cada B es independientemente un nucleósido bicíclico;
cada J es independientemente un nucleósido sustituido en 2' o un 2'-desoxinucleósido;
cada D es un 2'-desoxinucleósido;
m es 0-4; n es 0-2; p es 0-2; r es 0-2; t es 0-2; v es 0-2; w es 0-4; x es 0-2; y es 0-2; z es 0-4; g es 6-14; siempre que:
al menos uno de m, n y r es distinto de 0;
al menos uno de w y y es distinto de 0;
la suma de m, n, p, r y t es de 2 a 5; y
la suma de v, w, x, y y z es de 2 a 5.
Compuestos ARNi
[0252] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARN interferente (ARNi), que incluyen compuestos de ARN bicatenario (también denominados ARN de interferón corto o ARNsi) y compuestos de ARNi monocatenario (o ARNbc). Dichos compuestos funcionan, al menos en parte, a través de la ruta RISC para degradar y/o secuestrar un ácido nucleico diana (por lo tanto, incluyen compuestos mímicos de microARN/microARN). En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden modificaciones que los hacen particularmente adecuados para tales mecanismos.
i. Compuestos de ARNss
[0253] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que incluyen aquellos particularmente adecuados para uso como compuestos de ARNi de cadena sencilla (ARNss) comprenden un extremo 5'-terminal modificado. En ciertas de tales realizaciones, el extremo 5' terminal comprende un resto de fosfato modificado. En ciertas realizaciones, dicho fosfato modificado está estabilizado (por ejemplo, resistente a la degradación/escisión en comparación con el 5'-fosfato no modificado). En ciertas realizaciones, tales nucleósidos 5'-terminales estabilizan el resto 5'-fósforo. Ciertos nucleósidos 5'-terminales modificados pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo, en el documento WO/2011/139702.
[0254] En ciertas realizaciones, el extremo 5' de nucleósido de un compuesto de ARN de cadena simple tiene la fórmula IIc:
Figure imgf000035_0001
en donde:
T1 es un resto fósforo opcionalmente protegido;
T2 es un grupo de enlace internucleosídico que une el compuesto de Fórmula IIc en el compuesto oligomérico;
[0255] A tiene una de las fórmulas:
Figure imgf000035_0002
Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C1 -C6 alcoxi, C1 -C6 alcoxi sustituido, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil, C2-C6 alquinil sustituido o N(R3)(R4);
Q3 es O, S, N(Ra) o C(Ra)(Ry);
cada R3, R4 R5, R6 y R7 es, independientemente, H, C1-C6 alquil, C1 -C6 alquil sustituido o C1 -C6 alcoxi;
M3 es O, S, NR14 , C(R15)(R16), C(R15)(R1b)C(R17)(R18), C(R15)=C(R17), OC(R15)(R1b) o OC(R^) (Bx*);
R14 es H, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C1-C6 alcoxi, C1-C6 alcoxi sustituido, C2-C6 alquenil, C2-C6 alq sustituido, C2-C6 alquinil o C2-C6 alquinil sustituido;
R15, R16, R17 y R18 son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C1-C6 alcoxi, C1-C6 alcoxi sustituido, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil o C2-C6 alquinil sustituido;
Bx1 es un resto base heterocíclico;
o si Bx2 está presente, entonces Bx2 es un resto base heterocíclico y Bx1 es H, halógeno, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C1-C6 alcoxi, C1-C6 alcoxi sustituido, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil o C2
C6 alquinil sustituido;
J4 , J5 , J6 y J7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C1-C6 alcoxi, C1-C6 alcoxi sustituido, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil o C2-C6 alquinil sustituido;
o J4 forma un puente con uno de J5 o J7 en donde dicho puente comprende de 1 a 3 grupos birradicales unidos seleccionados de O, S, NR19, C(R2ü)(R21 ), C(R2ü)=C(R21 ), C [=C(R2ü)(R21 )] y C(=O) y los otros dos de J5 , J6 y J7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C1-C6 alcoxi, C1-C6 alcoxi sustituido, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil o C2-C6 alquinil sustituido;
cada R19, R20 y R21 es, independientemente, H, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C1-C6 alcoxi, C1-C6 alcoxi sustituido, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil o C2-C6 alquinil sustituido;
G es H, OH, halógeno o O-[C(R8 )(R9 )]N-[(C=O)m-X1]j-Z;
cada R8 y R9 es, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquil o C1-C6 alquil sustituido;
X1 es O, S o N (E1);
Z es H, halógeno, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil, C2-C6 alquinil sustituido o N(E2 )(E3);
E1 , E2 y E3 son cada uno, independientemente, H, C1-C6 alquil o C1-C6 alquil sustituido;
n es de 1 a aproximadamente 6;
m es 0 o 1;
j es 0 o 1;
cada grupo sustituido comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente entre halógeno, OJ1 , N (J1XJ2 ), =NJ1 , SJ1, N3 , CN, OC(=X2)J1 , OC(=X2)N(J1)(J2 ) y C(=X2 )N(J1 )(J2 );
X2 es O, S o NJ3 ;
cada J1 , J2 y J3 es, independientemente, H o C1-C6 alquil;
cuando j es 1, Z es distinto de halógeno o N(E2)(E3); y
en donde dicho compuesto oligomérico comprende de 8 a 40 subunidades monoméricas y es hibridable a al menos una porción de un ácido nucleico diana.
[0256] En ciertas realizaciones, M3 es O, CH=CH, OCH2 o OC(H)(Bx2 ). En ciertas realizaciones, M3 es O.
[0257] En ciertas realizaciones, J4 , J5 , J6 y J7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, J4 forma un puente con una de J5 o J7.
[0258] En ciertas realizaciones, A tiene una de las fórmulas:
Figure imgf000036_0001
en donde:
Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C1-C6 alcoxi o C1-C6 alcoxi sustituido. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2 son cada uno H. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H o halógeno. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2 es H y el otro de Q1 y Q2 es F, CH3 u OCH3.
[0259] En ciertas realizaciones, T1 tiene la fórmula:
Figure imgf000037_0002
en donde:
Ra y Rc son cada uno, independientemente, hidroxilo protegido, tiol protegido, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, Ci-Ca alcoxi, C1-C6 alcoxi sustituido, amino o sustituido protegido aminado; y
Rb es O o S. En ciertas realizaciones, Rb es O y R a y Rc son cada uno, independientemente, OCH3, OCH2CH3 o CH(CH3)2.
[0260] En ciertas realizaciones, G es halógeno, OCH3 , OCH2 F, OCHF2 , OCF3 , OCH2CH3, O(CH2)2 F, OCH2CHF2 , OCH2CF3 , OCH2- CH=CH2 , O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3, O(CH2)3 -N(R1 ü)(Rh ), O(CH2)2-ON(R10)(Rn), 0 (CH2)2-0 (CH2 )2-N(R1 ü)(Rh ), OCH2C(=O)-N(R1 ü)(Rn), OCH2C(=O)-N(R12 )-(CH2)2-N(R1 ü)(Rn) u O(CH2)2-N(R12)-C(=NR13)
[N(R1 ü)(Rh )] en donde R1Ü, R11 , R12 y R13 son cada uno, independientemente, H o C1 -Ca alquil. En ciertas realizaciones, G es halógeno, OCH3, OCF3 , OCH2CH3, OCH2CF3 , OCH2-CH=CH2 , O(CH2 )2-OCH3 , O(CH2 )2-O(CH2)2-N(CH3)2, OCH2C(=O)-N(H)CH3, OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2 o OCH2-N(H)-C(=NH)NH2. En ciertas realizaciones, G es F, OCH3 o O(CH2)2-OCH3. En ciertas realizaciones, G es O(CH2 )2-OCH3.
[0261] En ciertas realizaciones, el nucleósido 5'-terminal tiene la Fórmula IIe:
Figure imgf000037_0001
[0262] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluidos aquellos particularmente adecuados para ARNss, comprenden uno o más tipos de restos de azúcar modificados y/o restos de azúcar naturales dispuestos a lo largo de un oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de azúcar. Tales motivos pueden incluir cualquiera de las modificaciones de azúcar discutidas en este documento y/u otras modificaciones de azúcar conocidas.
[0263] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden o consisten en una región que tiene modificaciones de azúcar uniformes. En ciertas realizaciones de este tipo, cada nucleósido de la región comprende la misma modificación de azúcar tipo ARN. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-F. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido cEt. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido LNA. En ciertas realizaciones, la región uniforme constituye todo o esencialmente todo el oligonucleótido. En ciertas realizaciones, la región constituye el oligonucleótido completo a excepción de 1-4 nucleósidos terminales.
[0264] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una o más regiones de modificaciones de azúcar alternantes, en donde los nucleósidos alternativos entre los nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un primer tipo y nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un segundo tipo. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de ambos tipos son nucleósidos similares a ARN. En ciertas realizaciones, los nucleósidos alternos se seleccionan entre: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA y cEt. En ciertas realizaciones, las modificaciones alternativas son 2'-F y 2'-OMe. Dichas regiones pueden ser contiguas o pueden ser interrumpidas por nucleósidos modificados de manera diferente o nucleósidos conjugados.
[0265] En ciertas realizaciones, la región alternante de modificaciones alternantes consisten de un solo nucleósido (es decir, el patrón es (AB)xAy en donde A es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un primer tipo y B es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un segundo tipo; x es 1-20 e y es 0 o 1). En algunas formas de realización, una o más regiones alternas en un motivo alternativo incluyen más de un solo nucleósido de un tipo. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden incluir una o más regiones de cualquiera de los siguientes motivos de nucleósidos:
AABBAA;
ABBABB;
AABAAB;
ABBABAABB;
ABABAA;
AABABAB;
ABABAA;
ABBAABBABABAA;
BABBAABBABABAA; o
ABABBAABBABABAA;
en donde A es un nucleósido de un primer tipo y B es un nucleósido de un segundo tipo. En ciertas realizaciones, A y B se seleccionan cada uno de 2'-F, 2'-OMe, BNA y MOE.
[0266] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen un motivo alternante también comprenden un nucleósido 5'-terminal modificado, tales como los de fórmula IIc o IIe.
[0267] En ciertos casos, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo 2-2-3. Tales regiones comprenden el siguiente motivo:
-(A)2-(B) x-(A)2-(C)y-(A)3-en donde: A es un primer tipo de nucleósido modifcado;
B y C son nucleósidos que están modificados de manera diferente de A, sin embargo, B y C pueden tener modificaciones iguales o diferentes entre sí;
x e y son de 1 a 15.
[0268] En ciertas realizaciones, A es un nucleósido modificado de 2'-OMe. En ciertas realizaciones, B y C son ambos nucleósidos modificados en 2'-F. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido modificado en 2'-OMe y B y C son ambos nucleósidos modificados en 2'-F.
[0269] En ciertas realizaciones, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q)-(AB)xAy-(D)z
en donde:
Q es un nucleósido que comprende un resto de fosfato estabilizado. En ciertas realizaciones, Q es un nucleósido que tiene la Fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
B es un segundo tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente del nucleósido adyacente al mismo. Por lo tanto, si y es 0, entonces D debe modificarse de manera diferente que B y si y es 1, entonces D debe modificarse de manera diferente que A. En ciertas realizaciones, D difiere de A y B.
X es 5-15;
Y es 0 o 1;
Z es 0-4,
[0270] En ciertas realizaciones, oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q)-(A)x-(D)z
en donde:
Q es un nucleósido que comprende un resto de fosfato estabilizado. En ciertas realizaciones, Q es un nucleósido que tiene la Fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente de A.
X es 11-30;
Z es 0-4.
[0271] En ciertas realizaciones A, B, C, y D en los motivos anteriores se seleccionan de: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA, y AEC. En ciertas realizaciones, D representa nucleósidos terminales. En ciertas realizaciones, tales nucleósidos terminales no están diseñados para hibridarse con el ácido nucleico diana (aunque uno o más podrían hibridar por casualidad). En las realizaciones certificadas, la nucleobase de cada nucleósido D es adenina, independientemente de la identidad de la nucleobase en la posición correspondiente del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la nucleobase de cada nucleósido D es timina.
[0272] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluidos aquellos particularmente adecuados para su uso como ARNss, comprenden enlaces internucleosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o un motivo de enlace internucleósido modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleósido alternativo. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región de enlaces internucleósidos modificados uniformemente. En ciertas de tales realizaciones, el oligonucleótido comprende una región que está unida uniformemente por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido está unido uniformemente por enlaces internucleosídicos fosforotioicos. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato y al menos un enlace internucleósido es fosforotioato.
[0273] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 8 enlaces internucleósidos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 12 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas de tales realizaciones, al menos uno de estos bloques está ubicado en el extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas de tales realizaciones, al menos uno de tales bloques está localizado dentro de 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido.
[0274] Los oligonucleótidos que tienen cualquiera de los diversos motivos de azúcar descritos en el presente documento, pueden tener cualquier motivo de enlace. Por ejemplo, los oligonucleótidos, que incluyen pero no se limitan a los descritos anteriormente, pueden tener un motivo de enlace seleccionado entre los no limitantes de la tabla a continuación:
Figure imgf000040_0001
ii. Compuestos de ARNsi
[0275] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARNi de doble cadena (ARNsi). En tales realizaciones, una o ambas cadenas pueden comprender cualquier motivo de modificación descrito anteriormente para ARNss. En ciertas realizaciones, los compuestos de ARNss pueden ser ARN no modificados. En ciertas realizaciones, los compuestos de ARNsi pueden comprender nucleósidos de ARN no modificados, pero enlaces internucleósidos modificados.
[0276] Varias realizaciones se refieren a composiciones de doble cadena en las que cada cadena comprende un motivo definido por la ubicación de uno o más nucleósidos modificados o no modificados. En ciertas realizaciones, se describen composiciones que comprenden un primer y un segundo compuesto oligomérico que se hibridan total o al menos parcialmente para formar una región dúplex y que además comprenden una región que es complementaria e hibrida con una diana de ácido nucleico. Es adecuado que dicha composición comprenda un primer compuesto oligomérico que sea una cadena antisentido que tenga una complementariedad total o parcial con una diana de ácido nucleico y un segundo compuesto oligomérico que sea una cadena con sentido que tenga una o más regiones de complementariedad y forme al menos una región dúplex con el primer compuesto oligomérico.
[0277] Las composiciones de varias formas de realización modular la expresión génica mediante la hibridación a una diana de ácido nucleico resulta en la pérdida de su función normal. En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es el receptor de andrógenos. En ciertas realizaciones, la degradación del receptor de andrógenos dirigido se facilita por un complejo RISC activado que se forma con las composiciones de la divulgación.
[0278] Varias realizaciones están dirigidas a composiciones de doble cadena en las que una de las cadenas es útil para, por ejemplo, influir en la carga preferencial de la cadena opuesta en el complejo RISC (o escisión). Las composiciones son útiles para dirigirse a moléculas de ácido nucleico seleccionadas y modular la expresión de uno o más genes. En algunas realizaciones, las composiciones se hibridan con una porción de un ARN diana que da como resultado la pérdida de la función normal del ARN diana.
[0279] Ciertas realizaciones se dirigen a composiciones de doble cadena en las que ambas cadenas comprenden un motivo de imitación, un motivo completamente modificado, un motivo modificado de posición o un motivo alternativo. Cada cadena de las composiciones puede modificarse para cumplir una función particular, por ejemplo, en la ruta del ARNsi. El uso de un motivo diferente en cada cadena o el mismo motivo con diferentes modificaciones químicas en cada cadena permite dirigir la cadena antisentido para el complejo RISC mientras se inhibe la incorporación de la cadena con sentido. Dentro de este modelo, cada cadena puede modificarse independientemente de manera que se mejore para su función particular. La cadena antisentido puede modificarse en el extremo 5' para mejorar su papel en una región del RISC, mientras que el extremo 3' puede modificarse diferencialmente para mejorar su papel en una región diferente del RISC.
[0280] Las moléculas de doble cadena de oligonucleótidos puede ser una molécula de polinucleótido bicatenario que comprende regiones con sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una parte del mismo y la región de sentido que tiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma. Las moléculas de oligonucleótidos de doble cadena se pueden ensamblar a partir de dos oligonucleótidos separados, donde una cadena es la cadena con sentido y la otra es la cadena antisentido, en donde las cadenas antisentido y con sentido son auto-complementarias (es decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en la otra cadena, como cuando la cadena antisentido y la cadena con sentido forman una estructura dúplex o bicatenaria, por ejemplo, en la que la región de doble cadena es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 pares de bases; la cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la cadena de sentido comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma (por ejemplo, aproximadamente 15 a aproximadamente 25 o más nucleótidos de la molécula de oligonucleótido de doble cadena son complementarios del ácido nucleico diana o una porción del mismo). Alternativamente, el oligonucleótido de doble cadena se ensambla a partir de un solo oligonucleótido, donde las regiones antisentido y complementarias del ARNsi se unen por medio de un enlazador basado en ácido nucleico o no nucleico.
[0281] El oligonucleótido de doble cadena puede ser un polinucleótido con un duplex, dúplex asimétrica, horquilla o estructura secundaria de horquilla asimétrica, que tiene regiones de sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende la secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana separada o una porción de la misma y la región de sentido que tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma. El oligonucleótido bicatenario puede ser un polinucleótido monocatenario circular que tiene dos o más estructuras de bucle y un vástago que comprende regiones antisentido y sentido auto-complementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la región de sentido que tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma, y en la que el polinucleótido circular puede procesarse in vivo o in vitro para generar una molécula de ARNsi activa capaz de mediar ARNi.
[0282] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido bicatenario comprende secuencias o regiones de sentido y antisentido separadas, en donde las regiones de sentido y antisentido están unidas covalentemente por moléculas enlazadoras nucleotídicas o no nucleotídicas como se conoce en la técnica, o son alternativamente unidas de forma no covalente por interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de van der waals, interacciones hidrófobas y/o interacciones de apilamiento. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de doble cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la secuencia de nucleótidos de un gen diana. En otra realización, el oligonucleótido de doble cadena interactúa con la secuencia de nucleótidos de un gen diana de una manera que provoca la inhibición de la expresión del gen diana.
[0283] Como se usa en este documento, los oligonucleótidos de doble cadena no necesitan ser limitados a aquellas moléculas que contienen sólo ARN, pero abarcan además nucleótidos modificados químicamente y no nucleótidos. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico intermedias cortas carecen de nucleótidos que contienen 2'-hidroxi (2'-OH). En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos de corta interferencia no incluyen opcionalmente ningún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH). Sin embargo, tales oligonucleótidos de doble cadena que no requieren la presencia de ribonucleótidos dentro de la molécula para soportar ARNi pueden tener un enlazador o enlazadores unidos u otros grupos, restos o cadenas unidas o asociadas, que contienen uno o más nucleótidos con grupos 2'-OH. Opcionalmente, los oligonucleótidos de doble cadena pueden comprender ribonucleótidos en aproximadamente el 5, 10, 20, 30, 40 o 50% de las posiciones de nucleótidos. Tal como se usa en el presente documento, el término ARNsi está destinado a ser equivalente a otros términos utilizados para describir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar ARNi específicos de secuencia, por ejemplo ARN corto de interferencia (ARNsi), ARN bicatenario (ARNbc), micro ARN (ARNmi), ARN de horquilla corta (ARNsh), oligonucleótido de interferencia corta, ácido nucleico de interferencia corta, oligonucleótido modificado de interferencia corta, ARNsi modificado químicamente, ARN de silenciamiento de genes post-transcripcional (ARNptgs), y otros. Además, como se usa en el presente documento, el término ARNi pretende ser equivalente a otros términos utilizados para describir la interferencia de ARN específica de la secuencia, como el silenciamiento génico postranscripcional, la inhibición de la traducción o la epigenética. Por ejemplo, los oligonucleótidos de doble cadena se pueden usar para silenciar epigénicamente los genes tanto en el nivel postranscripcional como en el nivel de pre-transcripción. En un ejemplo no limitativo, la regulación epigenética de la expresión génica por las moléculas de ARNsi de la divulgación puede resultar de la modificación mediada por ARNsi de la estructura de la cromatina o del patrón de metilación para alterar la expresión génica (ver, por ejemplo, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672­ 676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297,1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).
[0284] Se contempla que los compuestos y composiciones de varias formas de realización descritas en este documento pueden dirigirse a receptor de andrógenos por un gen de silenciamiento mediado por ARNbc o mecanismo de RNAi, incluyendo, por ejemplo, de "horquilla" o moléculas efectoras de ARN bicatenarias bucle de doble cadena en donde una cadena de ARN individual con secuencias autocomplementarias es capaz de suponer una conformación de doble cadena, o moléculas efectoras de ARNds dúplex que comprenden dos cadenas separadas de ARN. En varias realizaciones, el ARNds consiste completamente en ribonucleótidos o consiste en una mezcla de ribonucleótidos y desoxinucleótidos, tales como los híbridos de ARN/ADN descritos, por ejemplo, por el documento WO 00/63364, presentado el 19 de abril de 2000, o el el N° de Ser. de EE.UU. 60/130.377, presentada el 21 de abril de 1999. La molécula efectora del ARNds o ARNds puede ser una única molécula con una región de auto-complementariedad tal que los nucleótidos en un segmento del par de bases de la molécula con nucleótidos en otro segmento de la molécula. En diversas realizaciones, un ARNbc que consiste en una sola molécula consiste completamente en ribonucleótidos o incluye una región de ribonucleótidos que es complementaria a una región de desoxirribonucleótidos. Alternativamente, el ARNbc puede incluir dos cadenas diferentes que tienen una región de complementariedad entre sí.
[0285] En varias realizaciones, ambas cadenas consisten completamente en ribonucleótidos, una cadena consiste completamente en ribonucleótidos y una cadena consiste enteramente en desoxirribonucleótidos, o una o ambas cadenas contienen una mezcla de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. En ciertas realizaciones, las regiones de complementariedad son al menos 70, 80, 90, 95, 98 o 100% complementarias entre sí y con una secuencia de ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la región del ARNdc que está presente en una conformación de doble cadena incluye al menos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75,100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos o incluye todos los nucleótidos en un ADNc u otra secuencia de ácido nucleico diana que se representa en el ARNds. En algunas realizaciones, el ARNds no contiene ninguna región de cadena sencilla, como los extremos de cadena única, o el ARNds es una horquilla. En otras realizaciones, el ARNbc tiene una o más regiones de cadena simple o salientes. En ciertas realizaciones, los híbridos de ARN/ADN incluyen una cadena o región de ADN que es una cadena o región antisentido (por ejemplo, tiene al menos 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de complementariedad con un ácido nucleico diana) y una cadena o región de ARN que es una cadena o región sentido (por ejemplo, tiene al menos 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de identidad con un ácido nucleico diana), y viceversa.
[0286] En diversas realizaciones, el híbrido de ARN/ADN se realiza in vitro utilizando métodos sintéticos enzimáticos o químicos, como los descritos en este documento o los descritos en el documento WO 00/63364, presentado el 19 de abril de 2000, o en el N° de Ser. de EE.UU. 60/130.377, presentada el 21 de abril de 1999. En otras realizaciones, una cadena de ADN sintetizada in vitro se compleja con una cadena de ARN creada in vivo o in vitro antes, después, o simultáneamente con la transformación de la cadena de ADN en la célula. En otras realizaciones más, el ARNds es un único ácido nucleico circular que contiene una región de sentido y antisentido, o el ARNds incluye un ácido nucleico circular y un segundo ácido nucleico circular o un ácido nucleico lineal (véase, por ejemplo, el documento WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o el N° de Ser. de EE.UU. 60/130.377, presentada el 21 de abril de 1999.) Los ácidos nucleicos circulares ejemplares incluyen estructuras lariat en las que el grupo 5' fosforilo libre de un nucleótido se une al grupo hidroxilo 2' de otro nucleótido en forma de bucle.
[0287] En otras realizaciones, el ARNdc incluye uno o más nucleótidos modificados en los que la posición 2' en el azúcar contiene un halógeno (como el grupo flúor) o contiene un grupo alcoxi (como un grupo metoxi) que aumenta la vida media del ARNds in vitro o in vivo en comparación con el ARNds correspondiente en el que la posición 2' correspondiente contiene un grupo de hidrógeno o de hidroxilo. En otras realizaciones más, el ARNds incluye uno o más enlaces entre nucleótidos adyacentes distintos de un enlace fosfodiéster natural. Los ejemplos de tales enlaces incluyen los enlaces de fosforamida, fosforotioato y fosforoditioato. Los ARNbc también pueden ser moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente como se enseña en la patente de EE.UU. N° 6.673.661. En otras realizaciones, el ARNdc contiene una o dos cadenas limitadas, como se describe, por ejemplo, por el documento WO 00/63364, presentado el 19 de abril de 2000, o el número de serie de EE.UU. N° 60/130.377, presentado el 21 de abril de 1999.
[0288] En otras realizaciones, el ARNds puede ser cualquiera de las moléculas de ARN de doble cadena al menos parcialmente descritas en WO 00/63364, así como cualquiera de las moléculas de ARNds descritas en la Solicitud Provisional de EE.UU. 60/399.998; y la Solicitud Provisional de EE.UU. 60/419,532, y PCT/US2003/033466. Cualquiera de los ARNbc puede expresarse in vitro o in vivo utilizando los métodos descritos aquí o los métodos estándar, como los descritos en el documento WO 00/63364.
Ocupación
[0289] En ciertas realizaciones, no se espera que los compuestos antisentido den como resultado la escisión o el ácido nucleico diana a través de la ARNasa H o que den como resultado la escisión o el secuestro a través de la ruta de RISC. En ciertas realizaciones de este tipo, la actividad antisentido puede resultar de la ocupación, en la que la presencia del compuesto antisentido hibridado interrumpe la actividad del ácido nucleico diana. En ciertas de tales realizaciones, el compuesto antisentido puede modificarse uniformemente o puede comprender una mezcla de modificaciones y/o nucleósidos modificados y no modificados.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
[0290] Las secuencias de nucleótidos que codifican el receptor de andrógenos humano incluyen, sin limitación, lo siguiente: N° de acceso de GEN-BANK Nt_011669.17_TRUNC_5079000_5270000 (incorporado aquí como SEQ ID ID:1), N° de acceso GENBANK NM_000044.3 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2), número de acceso GENBANK NM_001011645.2 (incorporado aquí como SeQ ID nO: 3), número de acceso GENBANK FJ235916.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 4), número de acceso GENBANK FJ235917.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 5), número de acceso de GENBANK FJ235918.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 6), número de acceso de GENBANK FJ235919.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 7) y número de acceso de Ge NbANK. FJ235920.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 8).
[0291] El ARNm del receptor de andrógenos codifica varios dominios funcionales. En ciertas realizaciones, el ARNm del receptor de andrógenos de longitud completa incluye el exón 1 que codifica el dominio N-terminal, los exones 2 y 3 que codifican el dominio de unión al ADN, el exón 4 que codifica la región de la bisagra corta y los exones 4-8 que codifican el dominio de unión al ligando.
[0292] En ciertas realizaciones, las variantes de empalme del Receptor de Andrógenos que se pueden dirigir por los compuestos antisentido descritos en el presente documento incluyen el exón 1 que codifica el dominio N-terminal y los exones 2 y 3 que codifican el dominio de unión al ADN, o sus porciones funcionales, pero no incluyen al menos una parte del exón 4 que codifica la región de bisagra corta o al menos una parte de los exones 4-8 que codifican el dominio de unión al ligando. Los ejemplos de tales variantes de empalme de RA incluyen, pero no se limitan a, RA-V1, RA-V2, RA-V3, RA-V4, RA-V5, rA-V6 y RA-V7 (también conocido como RA3), que contienen exones 1-3 pero carecen de exones 4-8, RA-V1, RA-V2, Ra -V3, RA-V4, RA-V5, RA-V6, RA-V7, y las variantes adicionales de empalme que se pueden obtener por los compuestos antisentido descritos en este documento se describen en Hu et al., Cancer Res 2009; 69:16-22 y en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° US 2010/0068802. Los ejemplos adicionales de tales variantes de empalme de RA que pueden conseguirse por los compuestos antisentido descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, RA3, RA4, RA4b, RA5 y RA6 (Seq ID No.: 4-8, respectivamente) como se describe en Guo et al., Cancer Res. 2009; 69: 2305-13.
Hibridación
[0293] En algunas realizaciones, la hibridación ocurre entre un compuesto antisentido descrito aquí y un Receptor de Andrógenos. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, Watson-Crick, Hoogsteen o enlaces de hidrógeno invertidos de Hoogsteen) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
[0294] La hibridación puede ocurrir en condiciones variables. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico que se hibridan.
[0295] Los métodos para determinar si una secuencia es hibridable específicamente a un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento son hibridables específicamente con el Receptor de Andrógenos.
Complementariedad
[0296] Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido pueden unirse mediante enlaces de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico diana, de manera que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico del receptor de andrógenos).
[0297] Nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico del receptor de andrógenos pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido sigue siendo capaz de hibridarse específicamente a un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico del Receptor de Andrógeno de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, falta de coincidencia o estructura de horquilla).
[0298] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en este documento, o una porción específica de los mismos, son, o son al menos, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementario a un ácido nucleico del Receptor de Andrógenos, una región diana, un segmento diana o una porción específica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar usando métodos de rutina.
[0299] Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarios de una región diana y, por lo tanto, hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido con una longitud de 18 nucleobases que tiene cuatro nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de completa complementariedad con el ácido nucleico diana tendría una complementariedad total del 77,8% con el ácido nucleico diana y, por lo tanto, estaría dentro del alcance de la presente descripción. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de manera rutinaria utilizando los programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y los programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y otros, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando la configuración predeterminada, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).
[0300] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento, o partes especificadas de los mismos, son totalmente complementarios (es decir, 100% complementarias) a un ácido nucleico diana, o una porción especificada de la misma. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico del Receptor de Andrógenos, o una región diana, o un segmento diana o una secuencia diana del mismo. Como se usa en este documento, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de un emparejamiento preciso de bases con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. Completamente complementario también se puede usar en referencia a una porción específica del primer y/o segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción correspondiente de 20 nucleobases en donde cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, todo el compuesto antisentido de 30 nucleobases puede o no ser completamente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias de la secuencia diana.
[0301] La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, las nucleobases o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, vinculadas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está localizada en el segmento del ala de un oligonucleótido antisentido gápmero.
[0302] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen, o son hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico del Receptor de Andrógenos, o una porción específica del mismo.
[0303] En ciertas realizaciones, compuestos antisentido que son, o son hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementarias(s) en relación con un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico del receptor de andrógenos, o una porción específica de los mismos.
[0304] Los compuestos antisentido descritos también incluyen los que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se usa en este documento, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "parte" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 9 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 10 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 11 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 12 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 13 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 14 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan los compuestos antisentido que son complementarios a al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más porciones de nucleobases de un segmento diana, o un rango definido por cualesquiera dos de estos valores.
Identidad
[0305] Los compuestos antisentido descritos en este documento también pueden tener un porcentaje de identidad definido a una secuencia particular de nucleótidos, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o porción del mismo. Como se usa en este documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en este documento si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan versiones abreviadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en el presente documento, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido descritos en el presente documento. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas en todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un par de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se está comparando.
[0306] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, descritos en este documento.
[0307] En ciertas realizaciones, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción de nucleobase de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
[0308] En ciertas realizaciones, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
Modificaciones
[0309] Un nucleósido es una combinación a base de azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto base heterocíclico. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosil, el grupo fosfato se puede unir al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura del oligonucleótido, se hace referencia comúnmente a los grupos fosfato como formadores de los enlaces internucleósidos del oligonucleótido.
[0310] Las modificaciones de los compuestos antisentido comprenden sustituciones o cambios a enlaces internucleosídicos, restos de azúcar, o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados son a menudo preferidos sobre las formas nativas debido a las propiedades deseables, tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad aumentada por la diana del ácido nucleico, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas, o actividad inhibitoria incrementada.
[0311] Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado para su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces Internucleosídicos modificados
[0312] El enlace internucleosídico natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, no naturales, a menudo se seleccionan sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleósidos naturales, debido a las propiedades deseables como, por ejemplo, la captación celular mejorada, la afinidad mejorada por los ácidos nucleicos diana y el aumento de estabilidad en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleósidos modificados incluyen enlaces internucleósidos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleósidos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
[0314] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del receptor de andrógenos comprenden uno o más enlaces internucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico fosforotioato.
Restos de azúcar modificados
[0315] Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que se ha modificado el grupo azúcar. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir una mayor estabilidad de las nucleasas, mayor afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden restos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluidos los grupos sustituyentes 5' y 2', la unión de los átomos del anillo no geminal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), la sustitución del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S, N(R) o C(R1 )(R2 )(R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, C1 -C12 alquil o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen 2'-F-5'-nucleósido sustituido con metil (ver solicitud internacional PCT WO 2008/101157, publicada el 8/21/08 para otros nucleósidos sustituidos en 5', 2'-bis descritos) o reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S por sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente de EE.UU. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, sustitución 5' de un BNA (ver Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181 Publicada el 11/22/07 en el que 4'-(CH2)-O-2' (LNA) está sustituido con, por ejemplo, un grupo de 5'-metil o un 5'-vinilo).
[0316] Los ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinil, 5'-metil (R o S), 4'-S, 2'-F, 2 -OCH3 , 2'-OCH2 CH3 , 2'-OCH2 CH2 F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede ser seleccionado de alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1- 1 0 alquil, OCF3 , OCH2 F, O(CH2 )2 SCH3 , O(CH2 )2-O-N(Rm )(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm )(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2 )2 -N(Rm )(Rn), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o C1-C10 alquil sustituido o no sustituido.
[0317] Como se usa en este documento, "nucleósidos bicíclicos" se refieren a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Los ejemplos de dichos nucleósidos bicíclicos con puentes de 4' a 2' incluyen, entre otros, una de las fórmulas: 4'-(CH2 )-O-2' (LNA); 4'-(CH2 )-S-2'; 4'-(CH2 )2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3 )-O-2' (también denominado etil restringido o cEt) y 4'-CH(CH2OCH3 )-O-2' (y sus análogos se encuentran en la patente de EE.UU. 7.399.845, emitida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3 )(CH3 )-O-2' (y sus análogos se encuentran en la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3 )-2' (y sus análogos se encuentran en la Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-ON(CH3 )-2' (ver la solicitud de patente de EE.UU. publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-n (r )-O-2', en donde R es H, C1-C12 alquil, o un grupo protector (véase la patente US 7.427.672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3 )-2” (ver Chattopadhyaya et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C (=CH2 )-2' (y sus análogos se encuentran en la Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).
[0318] Se pueden encontrar informes adicionales relacionados con nucleósidos bicíclicos en la literatura publicada (véase, por ejemplo, Singh y otros, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin y otros, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava y col., J. Am. Chem. Soc., 2007,129 (26) 8362-8379; Elayadi y col., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch y otros, Chem. Biol., 2001, 8,1-7; y Orum y otros, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239 -243; Patentes de EE.UU. Nos 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; y 7.696.384; 61/026.995; 61/026.998; 61/056.564; 61/086.231; 61/097.787; y 61/099.844; Solicitudes internacionales PCT publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones de azúcares estereoquímicos que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y PD-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
[0319] En ciertas realizaciones, los restos de azúcares bicíclicos de los nucleósidos de BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre las posiciones 4' y 2' del resto de azúcar de pentofuranosilo en el que dichos puentes comprenden independientemente 1 o 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra )=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa )-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, y -N(Ra)-;
en donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxil, C1-C12 alquil, C1-C12 alquil sustituido, C2-C12 alquenil, C2-C12 alquenil sustituido, C2-C12 alquinil, C2-C12 alquinil sustituido, C5-C20 aril, C5-C20 aril sustituido, heterociclo radical, heterociclo sustituido radical, heteroaril, heteroaril sustituido, C5-C7 alicíclico radical, radical alicíclico C5-C7 , halógeno, OJ1, NJ1J2 , SJ1, N3 , COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J-i ), o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, C1-C12 alquil, C1-C12 alquil sustituido, C2-C12 alquenil, C2-C12 alquenil sustituido, C2-C12 alquinil, alquinil C2-C12 sustituido, aril C5-C20 , aril C5-C20 sustituido, acil (C(=O)-H), acil sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, C1-C12 aminoalquil, C1-C12 aminoalquil sustituido o un grupo protector.
[0320] En ciertas realizaciones, el puente de un resto de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(Ra Rb)-N(R)-O- o -C(Ra Rb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2 )2-2', 4'-(CH2 )3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2 )2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o C1-C12 alquil.
[0321] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2'metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA se han incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).
[0322] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos que incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2 ') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2 )2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N (R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, y (F) metil(metilenoxi) (4'-CH(CHa)-O-2') BNA, (G) metileno-tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) carbocíclico de metil (4'-CH2-CH(CHa)-2') BNA, (J) carbocíclico de propileno (4'-(CH2 )3-2') BNA y (K) vinilo BNA como se representa a continuación:
Figure imgf000047_0001
en donde Bx es el resto de base y R es independientemente H, un grupo protector, C1 -C12 alquil o C1-C12 alcoxi.
[0323] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos que están descritos que tienen la Fórmula I:
Figure imgf000047_0002
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc )-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc )-, -CH2-N(Rc )-O- o -N(Rc )-O-CH2 ;
R c es C1-C12 alquil o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxil, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
[0324] En ciertas realizaciones, se describen nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:
Figure imgf000048_0001
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxil, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es C1-C6 alquil, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquinil, C1-C6 alquil sustituido, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil sustituido, acil, acil sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
[0325] En una realización, cada uno de los grupos sustituidos es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente entre halógeno, oxo, hidroxil, OJc , NJcJd , SJc , N3 , OC(=X)Jc , y NJeC(=X)NJcJd , en donde cada Jc , Jd y Je es, independientemente, H, C1-C6 alquil, o C1-C6 alquil sustituido y X es O o NJc .
[0326] En ciertas realizaciones, se describen nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
Figure imgf000048_0002
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxil, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es C1 -C6 alquil, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquinil, C1-C6 alquil sustituido, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
[0327] En ciertas realizaciones, se describen nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:
Figure imgf000048_0003
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxil, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es C1 -C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil o sustituido;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil o C2-C6 alquinil sustituido, C1 -C6 alcoxi, C1 -C6 alcoxi sustituido, acil, acil sustituido, C1 -C6-aminoalquil o C1 -C6 aminoalquil sustituido;
[0328] En ciertas realizaciones, se describen nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:
Figure imgf000049_0001
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxil, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe, y qf y son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, C1 -C12 alquil, C1-C12 alquil sustituido,
C2-C12 alquenil, C2-C12 alquenil sustituido, C2-C12 alquinil, alquinil C2-C12 sustituido, C1-C12 alcoxi, C1 -C12 alcoxi sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2J NJJk, N3 , CN, C(=O)OJj, C(=O)NJJk, C(=O)Jj, O-C(=O)-NJJk, N(H)C(=NH)NJJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son = C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1 -C12 alquil o C1-C12 alquil sustituido.
[0329] La síntesis y la preparación de monómeros de metilenoxi (4 -CH2-O-2 ') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracil, junto con su oligomerización y las propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos han sido descritos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los ácidos nucleicos bicíclicos (BNA) y su preparación también se describen en los documentos WO 98/39352 y Wo 99/14226.
[0330] Los análogos de metilenoxi (4 -CH2-O-2 ') BNA y 2'-tio-BNA, también han sido preparados (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8 , 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para las polimerasas de ácidos nucleicos (Wengel et al., WO 99/14226). Además, la síntesis de 2'-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad comformacionalmente restringido, se ha descrito en la técnica (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino y 2'-metilamino-BNA y se ha informado previamente la estabilidad térmica de sus dúplex con ARN complementario y cadenas de ADN.
[0331] En ciertas realizaciones, se describen nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula VI:
Figure imgf000049_0002
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxil, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj , qk y q1 es, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquil, C1-C12 alquil sustituido, C2-C12 alquenil, C2-C12 alquenil sustituido, C2-C12 alquinil, C2-C12 alquinil sustituido, C1-12 alcoxil, C1.12 alcoxil sustituido, OJj , SJj , SOJj , SO2Jj , NJjJk, N3 , CN, C(=O)OJj , C(=O)NJjJK, C(=O)Jj , O-C(=O)NJjJK, N(H)C(=NH)NJjJK , N(H)C(=O)NJjJK or N(H)C(=S)NJjJK ; y
q i y q j o q1 y qk juntos son = C(qg )(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquil o C1-C12 alquil sustituido.
[0332] Han sido descritos un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2 )3-2” y el puente analógico alquenil 4'-CH=CH-CH2-2' (Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). La síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos también se han descrito (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (26), 8362-8379).
[0333] Como se usa en este documento, "nucleósido bicíclico 4'-2'" o "nucleósido bicíclico 4' a 2'" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.
[0334] Como se usa en este documento, "nucleósidos monocíclicos" se refieren a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcares bicíclicos. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar, o análogo de resto de azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.
[0335] "Azúcar modificado en 2'" Tal como se usa en el presente documento, significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, dichas modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados entre: un haluro, que incluye, pero no se limita a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquil sustituido y no sustituido, aminoalquil sustituido y no sustituido, alquil sustituido y no sustituido, alil sustituido y no sustituido, y alquinil sustituido y no sustituido. En ciertas realizaciones, las modificaciones 2' se seleccionan entre los sustituyentes que incluyen, entre otros: O [(CH2 )nO]m CH3 , O(CH2 )nNH2 , O(CH2 )nCH3 , O(CH2 )nF, O(CH2 )nONH2 , OCH2 C(=O)N(H)CH3 y O(CH2)nON [(CH2)nCH3 ]2 , donde n y m son de 1 a aproximadamente 10, Otros grupos sustituyentes 2' también pueden seleccionarse entre: C1-C12 alquil, alquil sustituido, alquenil, alquinil, alcaril, aralquil, O-alcaril u O-aralquil, SH, SCH3 , OCN, Cl, Br, CN,F, CF3 , OCF3 , SOCH3 , SO2CH3 , ONO2 , NO2 , N3 , NH2 , heterocicloalquil, heterocicloalcaril, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOe (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, como 2'-O-metil, O-propil y O-aminopropil. Los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE también han demostrado ser inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para su uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630­ 637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
[0336] Como se usa en este documento, un "nucleósido tetrahidropirano modificado" o "nucleósido THP modificado" significa un nucleósido que tiene un tetrahidropiran de seis miembros "azúcar" sustituido por el residuo pentofuranosil en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no se limitan a lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico hexitol (HNA), ácido nucleico anitol (ANA), ácido nucleico manitol (MnA) (véase Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) o flúor HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo de tetrahidropirano como se ilustra a continuación:
Figure imgf000050_0001
[0337] En ciertas realizaciones, se seleccionan sustitutos del azúcar que tienen Fórmula VII:
Figure imgf000051_0001
en donde independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:
Bx es un resto base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleósido que une el análogo nucleosídico de tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleósido que une el análogo de nucleósido tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxil, un grupo conjugado unido o un grupo terminal 5' o 3';
q-i , q2 , q3 , q4 , q5 , q6 y q7 son cada uno independientemente, H, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil sustituido, C2-C6 alquenil, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil o C2-C6 alquinil sustituido; y cada uno de R1 y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxil, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1 J2 , SJ1 , N3 , O -C (= x j O-C(=X)NJ1 J2 , NJ3 C(=X)NJJ y CN, en donde X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o C1-C6 alquil.
[0338] En ciertas realizaciones, los nucleósidos THP modificados de Fórmula VII se describen en donde q1, q2 , q3 , q4 , q5 , q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1 , q2 , q3 , q4 , q5 , q6 y q7 es distinto de H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1 , q2 , q3 , q4 , q5 , q6 y q7 es metil. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de THP de fórmula VII se describen en donde uno de R1 y R2 es fluoro. En ciertas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
[0339] En ciertas realizaciones, los sustitutos del azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se han reportado nucleósidos que comprenden restos de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (ver por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; y en las patentes estadounidenses 5.698.685; 5.166.315; 5.185.444 y 5.034.506). Tal como se usa aquí, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000051_0002
[0340] En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando diversos grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. Tales sustitutos del azúcar se denominan en el presente documento "morfolinos modificados". Las combinaciones de modificaciones también se describen sin limitación, tales como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metil (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5', 2'-bis sustituidos) y la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S y la sustitución adicional en la posición 2' (ver la solicitud de patente estadounidense publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente la sustitución 5' de un ácido nucleico bicíclico (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181, publicada el 11.22.07 en donde un nucleósido bicíclico 4'-CH2-O-2' está sustituido adicionalmente en la posición 5' con un extremo 5' de metil o un grupo 5'-vinilo). La síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos también se han descrito (véase, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).
[0342] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo pentofuranosil en nucleósidos que se producen naturalmente. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no se limitan a los descritos en la técnica (véase, por ejemplo, la solicitud PCT publicada WO 2010/036696, publicada el
10 de abril de 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130 (6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24 (5-7), 993-998; Nau welaerts et al., Nucleic Acids Research,
2005, 33 (8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61 (6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60 (9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13 (6), 479-489; Wang y otros, J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure y otros, Nucleic Acids Research, 2001, 29 (24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20 (4-7), 785-788; W ang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595­
8602; Solicitud PCT publicada, WO 06/047842; y Solicitud PCT Publicada WO 01/049687). Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen Fórmula X.
Figure imgf000052_0001
en donde independientemente para cada uno de dichos análogos de nucleósidos de ciclohexenil de Fórmula X:
Bx es un resto base heterocíclico
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleósido que une el análogo de nucleósido ciclohexenilo a un compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleósido que une el análogo de nucleósido tetrahidropirano a un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxil, un grupo conjugado unido, o un grupo terminal 5' o 3'; y
q-i , q2 , q3 , q4 , q5 , q6 , q7 , qs y q9 son cada uno, independientemente, H, C1-C6 a alquenil, C2-C6 alquenil sustituido, C2-C6 alquinil, C2-C6 alquinil sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
[0343] Como se usa en este documento, "2'-modificado" o "2'-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto a H u OH. Los nucleósidos modificados en 2” incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con 2'sustituyentes sin puente, tales como alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10 alquil, -OCF3 , O-(CH2)2-O-CH3 , 2'-O(CH2 )2 SCH3 , O-(CH2 )2-O-N(Rm )(Rn), o O-CH2-C(=O)-N(Rm )(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o C1-C10 alquil sustituido o no sustituido. Los nucleósidos modificados en 2' pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
[0344] Como se usa en el presente documento, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo flúor en la posición 2' del anillo de azúcar.
[0345] Como se usa en el presente documento, "2'-OMe" o "2'-OCH3" o "2'-O-metil" se refieren a un nucleósido que comprende un grupo que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' de azúcar. El anillo de azúcar.
[0346] Como se usa en el presente documento, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
[0347] En la técnica también se conocen muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar biciclo y triciclo que se pueden usar para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver, por ejemplo, artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Tales sistemas de anillos pueden sufrir varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
[0348] Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Algunas patentes de EE.UU. representativas que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen, sin limitación, U.S.: 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134;
5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 y 6.600.032 y la solicitud internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
[0349] En nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobase (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con una diana de ácido nucleico apropiado.
[0350] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados en 2'-MOE están dispuestos en un motivo gápmero. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH3)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gápmero.
Nucleobases modificados
[0351] Las modificaciones o sustituciones de la nucleobase (o base) son distinguibles estructuralmente de, pero funcionalmente intercambiables con, nucleobases sintéticas o naturales no modificadas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en los enlaces de hidrógeno. Dichas modificaciones de nucleobase pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobase, incluyendo sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido para un ácido nucleico diana. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones de la 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2°C (Sanghvi, YS, Crooke, ST y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
[0352] Las nucleobases modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracil, 2- tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracil y citosina, 5-propinil (-C=C-CH3) uracil y citosina y otros derivados alquinílicos de bases de pirimidina, 6-azouracil, citosina y timina, 5-uracil (pseudouracilo), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo en particular 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos 5-sustituidos y citosinas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
[0353] Los restos de bases heterocíclicas también pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza por otros heterociclos, por ejemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-aza-pirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluidas 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracil y 5-propinilcitosina.
[0354] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del receptor de andrógenos comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido acortados o con huecos dirigidos a un ácido nucleico del receptor de andrógenos comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Compuestos antisentido conjugados
[0355] Los compuestos antisentido pueden unirse covalentemente a uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
[0356] Los compuestos antisentido también pueden modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que generalmente están unidos a uno o ambos extremos de compuestos antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. Incluidas en los grupos estabilizadores están las estructuras de los casquetes. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de la exonucleasa, y pueden ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el extremo 5' (5'-tapa), o en el término 3' (3'-tapa), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de los casquetes son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, casquillos abásicos deoxi invertidos. Otros grupos estabilizadores 3' y 5' que se pueden usar para cubrir uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
[0357] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, que incluyen, pero no se limitan a aquellos particularmente adecuados para su uso como ARNss, se modifican mediante la unión de uno o más grupos conjugados. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del oligonucleótido unido, que incluyen, entre otros, farmacodinámica, farmacocinética, estabilidad, unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y eliminación. Los grupos de conjugados se utilizan de forma rutinaria en las técnicas químicas y se enlazan directamente o a través de un resto de enlace conjugado opcional o un grupo de enlace de conjugado a un compuesto parental tal como un oligonucleótido. Los grupos conjugados incluyen, sin limitación, intercaladores, moléculas informadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, tioéteres, poliéteres, colesteroles, tiocolesteroles, restos de ácido cólico, ácido fólico, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazidina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acrénicos, bacterias rodaminas, cumarinas y colorantes. Ciertos grupos conjugados se han descrito anteriormente, por ejemplo: resto de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.Uu ., 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan y otros, Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan y otros., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de decanodiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-racglicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil-amonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido acético de adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biofis Acta, 1995, 1264, 229­ 237), o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
[0358] Para conjugados adicionales que incluyen aquellos útiles para ARNss y su colocación dentro de compuestos antisentido, ver, por ejemplo, la publicación pCt No.; WO2013/033230.
Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas
[0359] Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de varios criterios, entre los que se incluyen, entre otros, la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis que se administrará.
[0360] Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del receptor de andrógenos se puede utilizar en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. En ciertas realizaciones, un diluyente farmacéuticamente aceptable es agua, tal como agua estéril adecuada para inyección. Por consiguiente, en una realización, en los métodos descritos en el presente documento se emplea una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del receptor de andrógenos y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es agua. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido proporcionado en el presente documento.
[0361] Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal, ésteres o sales farmacéuticamente aceptables de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el agente biológico activo. metabolito o residuo de los mismos. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
[0362] Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinden por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Ensayo in vitro de oligonucleótidos antisentido.
[0363] En este documento se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse adecuadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
[0364] Las células pueden tratarse con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente 60-80% de confluencia en cultivo.
[0365] Un reactivo comúnmente utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN que puede variar de 2 a 12 |jg/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM.
[0366] Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LiPo FeCTAMINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINA en un medio de suero reducido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINA que puede variar de 2 a 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM.
[0367] Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
[0368] Otra técnica más utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la libre absorción de los oligonucleótidos por las células.
[0369] Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por métodos de rutina. Las células pueden recolectarse 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótido antisentido, momento en el cual los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana se miden mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en este documento. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos repetidos.
[0370] La concentración de oligonucleótido antisentido utilizada varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótido antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINA. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan en concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan utilizando electroporación.
Aislamiento de ARN
[0371] El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando el Reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
EJEMPLOS
Divulgación no limitativa
[0372] Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en el presente documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en el presente documento y no pretenden limitarlos.
Ejemplo 1: Inhibición antisentido de RA humana en células HuVEC
[0373] Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico RA y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de RA in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Las células HuVEC cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de RA se midieron por PCR cuantitativo en tiempo real. El conjunto de sondas de cebador humano RTS3559 (secuencia directa TCCTTCACCAATGTCAACTCC, designada en este documento como SEQ ID NO: 9; secuencia inversa GAGCCATCCAAACTCTTGAGA, designada en este documento como SEQ ID NO: 10; secuencia de la sonda AGTACCCACGCACGACACAGAAGTCCG, designada en este documento como SEQ ID NO: 11) se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm RA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, según lo medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas. Se analizaron un total de 155 oligonucleótidos. Solo los oligonucleótidos que se seleccionaron para estudio adicional se muestran en las Tablas 1 y 2.
[0374] Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas 1 y 2 se diseñaron como gápmeros 3-10-3 (S)-cET. Los gápmeros espaciales tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento central de la brecha comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala tanto en la dirección 5' como en la dirección 3' que comprende tres nucleósidos. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación (S)-cEt. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. "Sitio de parada" indica el nucleósido más a lo largo de 3' al que se dirige el gápmero a la secuencia génica humana. Cada gápmero listado en las Tablas 1 y 2 está dirigido a la secuencia genómica de RA humana, designada en este documento como SEQ ID NO: 1 (número de registro de GENBANK NT_011669.17 truncada desde los nucleótidos 5079000 a 5270000) o la secuencia de ARNm de RA humano, designada en este documento como SEQ ID NO: 2 (GENBANK n° de registro NM_000044.3), o ambos. “n/a” indica que el oligonucleótido no se dirige a esa secuencia de genes en particular.
Tabla 1
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Ejemplo 2: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de RA humana en células HuVEC
[0375] Se seleccionaron los gápmeros del estudio descrito anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de RA y se ensayaron a diversas dosis en células HuVEC. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con 18,5 nM, 55,6 nM, 166,7 nM, 500,0 nM y 1500,0 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas 3 y 4, Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de RA mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador RA humano RTS3559 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de RA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, según lo medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación.
[0376] La concentración inhibidora máxima media (CI50) de cada oligonucleótido también se presenta en las Tablas 3 y 4. Como se ilustra, los niveles de ARNm de RA se redujeron de una manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótido antisentido.
T a b la 3
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Ejemplo 3: Inhibición antisentido de RA humana en células HuVEC
[0377] Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico RA y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de RA in vitro. Las células HuVEC cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de RA mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas de cebador humano RTS3559 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de RA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, según lo medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas. Se analizaron un total de 82 oligonucleótidos. Solo los oligonucleótidos que se seleccionaron para estudio adicional se muestran en la Tabla 5.
[0378] Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en la Tabla 5 se diseñaron como gápmeros de 3-10-3 (S)-cET o gápmeros de 5-10-5 MOE. Los gápmeros de 3-10-3 (S)-cET tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento central de la brecha comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por segmentos de ala tanto en la dirección 5' como en la dirección 3' que comprenden tres nucleósidos. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación (S)-cET. El gápmero 5-10-5 MOE tiene una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento central de la brecha comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprende cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. "Sitio de parada" indica el nucleósido más a lo largo de 3' al que se dirige el gápmero a la secuencia génica humana. Cada gápmero listado en la Tabla 5 está dirigido a la secuencia genómica de RA humana, designada en este documento como SEQ ID NO: 1 (GENBANK n° de registro NT_011669.17 truncado desde los nucleótidos 5079000 hasta 5270000).
Tabla 5
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Ejemplo 4: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de RA humana en células HuVEC
[0379] Se seleccionaron gápmeros de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de RA y se ensayaron a diversas dosis en células HuVEC. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido 31,3 nM, 62,5 nM, 125,0 nM, 250,0 nM, 500,0 nM y 1000,0 nM, como se especifica en la Tabla 6, Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de RA mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador RA humano RTS3559 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de RA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de a Rn , medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación.
[0380] La concentración inhibidora máxima media (CI50) de cada oligonucleótido también se presenta en la Tabla 6. Como se ilustra, los niveles de ARNm de RA se redujeron de una manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 6
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Ejemplo 5: Inhibición antisentido de RA humana en células HuVEC
[0381] Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico RA y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de RA in vitro. Las células HuVEC cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 250 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de RA mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas de cebador humano RTS3559 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de RA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, según lo medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas. Se analizaron un total de 40 oligonucleótidos. Solo los oligonucleótidos que se seleccionaron para un estudio adicional se muestran en la Tabla 7.
[0382] Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en la Tabla 7 se diseñaron como gápmeros de 3-10-3 (S)-cEt o desoxi, MOE y oligonucleótidos (S)-cEt. Los gápmeros de 3-10-3 (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento central de la brecha comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y en la dirección 3' que comprende tres nucleósidos. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación (S)-cEt. Los oligonucleótidos deoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el nucleósido tiene una modificación de azúcar de m Oe , una modificación de azúcar de (S)-cEt o una modificación deoxi. La columna "Química" describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido. “k” indica una modificación de azúcar (S)-cEt; el número indica el número de desoxinucleósidos; y “e” indica una modificación de MOE. Los enlaces internucleósidos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas. La SEQ ID NO indicada en la tabla se refiere a la secuencia de oligonucleótidos. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. "Sitio de parada" indica el nucleósido más a lo largo de 3' al que se dirige el gápmero a la secuencia génica humana. Cada gápmero listado en la Tabla 7 está dirigido a la secuencia genómica de Ra humana, designada en este documento como SEQ ID NO: 1 (GENBANK n° de registro NT_011669.17 truncado desde los nucleótidos 5079000 hasta 5270000).
Tabla 7
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Ejemplo 6: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de RA humana en células HuVEC
[0383] Los gápmeros de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de RA se seleccionaron y ensayaron a diversas dosis en células HuVEC. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido 31,3 nM, 62,5 nM, 125,0 nM, 250,0 nM, 500,0 nM y 1000,0 nM, como se especifica en la Tabla 8. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de RA mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador RA humano RTS3559 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Ra se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RI-BOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación.
[0384] La concentración inhibidora máxima media (CI50) de cada oligonucleótido también se presenta en la Tabla 8. Como se ilustra, los niveles de ARNm de RA se redujeron de una manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 8
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Ejemplo 7: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de RA humana en células HuVEC
[0385] Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales como desoxi, MOE y oligonucleótidos (S)-cEt dirigidos a secuencias de genes RA y se ensayaron a diversas dosis en células HuVEC. Los oligonucleótidos tienen una longitud de 16 nucleósidos en donde el nucleósido tiene una modificación de azúcar de MOE, una modificación de azúcar (S)-cEt o una modificación deoxi. La columna "Química" describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido. “k” indica una modificación de azúcar (S)-cEt; el número indica el número de desoxinucleósidos; de lo contrario, “d” indica desoxirribosa; y “e” indica una modificación de MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas. La SEQ ID NO indicada en la tabla se refiere a la secuencia de oligonucleótidos. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. "Sitio de parada" indica el nucleósido más a lo largo de 3' al que se dirige el gápmero a la secuencia génica humana. Cada gápmero listado en la Tabla 9 está dirigido a la secuencia genómica de Ra humana, designada en este documento como SEQ ID NO: 1 (GENBANK n° de registro NT_011669.17 truncado desde los nucleótidos 5079000 a 5270000)
Tabla 9
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[0386] Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocilio y se transfectaron utilizando electroporación con 62,5 nM, 125,0 nM, 250,0 nM, 500,0 nM y concentraciones de 1000,0 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas 10-12. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de RA mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador RA humano RTS3559 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de RA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de a Rn , según lo medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación.
[0387] La concentración inhibitoria máxima media (CI50) de cada oligonucleótido también se presenta en las Tablas 10-12. Como se ilustra, los niveles de ARNm de RA se redujeron de manera dependiente de la dosis en algunas de las células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 10
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Tabla 11
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Tabla 12
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Ejemplo 8: Inhibición antisentido de RA humana en células HuVEC
[0388] Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico RA y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de RA in vitro. Las células HuVEC cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 1.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de RA mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas de cebador humano RTS3559 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de rA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, según lo medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas. Se ensayaron un total de 75 oligonucleótidos. Solo los oligonucleótidos que se seleccionaron para un estudio adicional se muestran en la Tabla 13.
[0389] Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en la Tabla 13 se diseñaron como gápmeros 3­ 10-3 (S)-cEt, 3-9-4 (S)-cEt gápmeros, 4-8-4 (S)-cEt gápmeros, 4-9-3 (S)-cEt gápmeros, 5-7-4 (S)-cEt gápmeros, 5-8­ 3 (S)-cEt gápmeros, 6-7-3 (S)-cEt gápmeros, o desoxi, MOE y (S)-cEt oligonucleótidos. Los 3-10-3 (S)-cEt gápmeros tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento central de la brecha comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por segmentos de ala tanto en la dirección 5' como en la dirección 3' que comprenden tres nucleósidos. Los 3-9-4 (S)-cEt gápmeros tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de brecha central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por un segmento de ala en la dirección 5' que comprende tres nucleótidos y en la dirección 3' que comprende cuatro nucleósidos. Los gápmeros de 4-8-4 (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento central de la brecha comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala tanto en la dirección 5' como en la dirección 3' que comprende cuatro nucleósidos. Los gápmeros de 4-9-3 (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de brecha central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por un segmento de ala en la dirección 5' que comprende cuatro nucleótidos y en la dirección 3' que comprende tres nucleósidos. Los gápmeros de 5-7-4 (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de brecha central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por un segmento de ala en la dirección 5' que comprende cinco nucleótidos y en la dirección 3' que comprende cuatro nucleótidos. Los gápmeros de 5-8-3 (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de brecha central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por un segmento de ala en la dirección 5' que comprende cinco nucleótidos y en la dirección 3' que comprende tres nucleósidos. Los gápmeros de 6-7-3 (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de brecha central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por un segmento de ala en la dirección 5' que comprende seis nucleótidos y en la dirección 3' que comprende tres nucleósidos. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación (S)-cEt. Los oligonucleótidos deoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el nucleósido tiene una modificación de azúcar de MOE, una modificación de azúcar de (S)-cEt o una modificación deoxi. La columna "Química" describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido. “k” indica una modificación de azúcar (S)-cEt; el número indica el número de desoxinucleósidos; de lo contrario, “d” indica desoxirribosa; y “e” indica una modificación de MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces de fosforotioato. Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas.
[0390] La SEQ ID NO enumerada en la tabla se refiere a la secuencia de oligonucleótidos. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. "Sitio de parada" indica el nucleósido más a lo largo de 3' al que se dirige el gápmero a la secuencia génica humana. Cada gápmero listado en la Tabla 13 está dirigido a la secuencia genómica de RA humana, designada en este documento como SEQ ID NO: 1 (GENBANK n° de registro NT_011669.17 truncado desde los nucleótidos 5079000 a 5270000).
Tabla 13
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Ejemplo 9: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de RA humana en células HuVEC
[0391] Se seleccionaron oligonucleótidos antisentido de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de RA y se ensayaron a diversas dosis en células HuVEC. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido 31,25 nM, 62,5 nM, 125,0 nM, 250,0 nM, 500,0 nM y 1000,0 nM, como se especifica en la Tabla 14. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de RA mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador RA humano RTS3559 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de RA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, según lo medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación.
[0392] La concentración inhibidora máxima media (CI50) de cada oligonucleótido también se presenta en la Tabla 14. Como se ilustra, los niveles de ARNm de RA se redujeron de una manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 14
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Ejemplo 10: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de RA humana en células HuVEC
[0393] Los gápmeros del Ejemplo 8 que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de RA se seleccionaron y ensayaron a diversas dosis en células HuVEC. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con 46,9 nM, 187,5 nM, 750,0 nM y 3000,0 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 15. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN fue aislado de las células y los niveles de ARNm de RA se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador RA humano RTS3559 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de RA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, según lo medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas.
[0394] La concentración inhibidora máxima media (CI50) de cada oligonucleótido también se presenta en la Tabla 15. Como se ilustra, los niveles de ARNm de RA se redujeron de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 15
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Ejemplo 11:Inhibición antisentido de RA humana en células HuVEC
[0395] Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico RA y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de RA in vitro. Las células HuVEC cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de RA mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas de cebador humano RTS3559 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de RA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, según lo medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas. Un total de 616 oligonucleótidos fueron ensayados. Sólo los oligonucleótidos que se seleccionaron para un estudio adicional se muestran en las Tablas 16-23.
[0396] Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas 16-23 se diseñaron como gápmeros 3-10-3 (S)-cEt. Los gápmeros espaciales tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento central de la brecha comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala tanto en la dirección 5' como en la dirección 3' que comprende tres nucleósidos. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación (S)-cEt. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces de fosforotioato. Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas.
[0397] La SEQ ID NO enumerada en la tabla se refiere a la secuencia del oligonucleótido. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. "Sitio de parada" indica el nucleósido más a lo largo de 3' al que se dirige el gápmero a la secuencia génica humana. Cada gápmero enumerado en las Tablas 16-23 se dirige a la secuencia genómica de RA humana, designada en este documento como SEQ ID NO: 1 (número de registro de GENBANK NT_011669.17 truncada desde los nucleótidos 5079000 a 5270000) o la secuencia de ARNm de RA humano, designada aquí como SEQ ID NO: 2 (GEN-BANK n° de registro NM_000044.3), o ambos. “n/a” indica que el oligonucleótido no se dirige a esa secuencia de genes en particular.
Tabla 16
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Tabla 17
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Tabla 18
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Tabla 19
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Tabla 20
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Tabla 21 Tabla 22
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Tabla 23
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Ejemplo 12: Inhibición antisentido de RA humana en células HuVEC
[0398] Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico RA y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de RA in vitro. Las células HuVEC cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 1.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de RA mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas de cebador humano RTS3559 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de rA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, según lo medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas. Se analizaron un total de 385 oligonucleótidos. Solo los oligonucleótidos que se seleccionaron para un estudio adicional se muestran en las Tablas 24-28.
[0399] Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas 24-28 se diseñaron como gápmeros de 3-10-3 (S)-cEt. Los gápmeros espaciales tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento central de la brecha comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala tanto en la dirección 5' como en la dirección 3' que comprende tres nucleósidos. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación (S)-cEt. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces de fosforotioato. Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas.
[0400] La SEQ ID NO enumerada en la tabla se refiere a la secuencia de oligonucleótidos. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. "Sitio de parada" indica el nucleósido más a lo largo de 3' al que se dirige el gápmero a la secuencia génica humana. Cada gápmero listado en las Tablas 24-28 está dirigido a la secuencia genómica de RA humana, designada en este documento como SEQ ID NO: 1 (GENBANK n° de registro NT_011669.17 truncado desde los nucleótidos 5079000 hasta 5270000)
Tabla 24
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Tabla 25
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Tabla 26
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Tabla 27
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Tabla 28
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Ejemplo 13: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de RA humana en células HuVEC
[0401] Los gápmeros de los estudios descritos anteriormente que muestran una inhibición in vitro significativa del ARNm de RA se seleccionaron y ensayaron a diversas dosis en células HuVEC. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con 46,9 nM, 187,5 nM, 750,0 nM y 3000,0 nM de oligonucleótidos antisentido, como se especifica en las Tablas 29-37, Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de RA mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador RA humano RTS3559 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de RA se ajustaron de acuerdo con el contenido total de a Rn , según lo medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de RA, en relación con las células de control no tratadas.
[0402] La concentración inhibidora máxima media (CI50) de cada oligonucleótido también se presenta en las Tablas 29-37. Como se ilustra, los niveles de ARNm de RA se redujeron de manera dependiente de la dosis en algunas de las células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 29
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Tabla 30
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Tabla 31
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Tabla 32
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Tabla 33
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Tabla 34
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Tabla 35
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Tabla 36
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Tabla 37
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Ejemplo 14: Selección de oligonucleótidos antisentido dirigidos al ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) para ensayos con líneas celulares de cáncer de próstata
[0403] Se seleccionaron oligonucleótidos antisentido de los presentados en los estudios anteriores, dirigidos a diferentes regiones de la secuencia genómica de RA humana, para estudios adicionales en líneas celulares de cáncer de próstata. RA-V7 y RA-V567es son las principales variantes de empalme RA detectadas en pacientes con cáncer como se describe en Hornberg, E. et al., PLoS One 2011. Vol. 6,
[0404] Los siguientes oligonucleótidos ISIS se seleccionaron para estudios adicionales: ISIS 549372, que se dirige a la secuencia genómica de RA humana en el exón 1; ISIS 549434, que se dirige a la secuencia genómica de RA humana en el extremo 3' del exón 8 más allá del codón de parada de RA; ISIS 560131, que se dirige a la secuencia genómica RA humana en el intrón 1; e ISIS 569236, que se dirige a la secuencia genómica de RA humana en el intrón 1. Otro oligonucleótido antisentido, ISIS 554221 (ACCAAGTTTCTTCAGC, designado en este documento como SEQ ID NO: 178), se diseñó como un gápmero de LNA 3-10-3 con esqueleto de fosforotio dirigido al exón 4, (es decir, el dominio de unión al ligando) de rA idéntico a un oligonucleótido antisentido designado como SEQ ID NO: 58 de US 7.737.125 para uso como punto de referencia.
Ejemplo 15: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) en los niveles de proteína del receptor de andrógeno en células C4-2B resistentes a MDV3100
[0405] Las células C4-2B son células de adenocarcinoma de próstata humano independientes de andrógenos usadas comúnmente en el campo de la oncología y se han establecido como células cultivadas clínicamente relevantes (Thalmann, GN et al., Cancer Res. 1994. 54: 2577). MDV3100 o Enzalutamida es un fármaco antagonista experimental del receptor de andrógenos desarrollado por Medivation para el tratamiento del cáncer de próstata resistente a la castración. ISIS 549372, ISIS 554221 e ISIS 549434 se ensayaron en células C4-2B resistentes a MDV3100 (MR).
[0406] Las células se cultivaron en presencia de una concentración de 5 pM de MDV3100 a lo largo de 2 meses para inducir la resistencia a MDV3100. ISIS 549372, ISIS 549434 e ISIS 554221 a una concentración 1 mM de oligonucleótido antisentido se agregaron cada uno al medio de cultivo a una concentración de 1 pM para la libre absorción por parte de las células. Después de un período de tratamiento de 2 días, las células se recogieron en tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasa. La presencia de bandas para RA de longitud completa, así como la forma variante, RA-V7, se detectó mediante transferencia Western usando un anticuerpo RA (N-2o, Santa Cruz). El tratamiento de las células con ISIS 549372 redujo la RA de longitud completa y RA-V7 más ampliamente que el tratamiento con ISIS 554221 o ISIS 549434.
Ejemplo 16: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) en los genes diana RA en células C4-2B resistentes a MDV3100
[0407] Se analizó el efecto de la inhibición antisentido de RA en genes diana de RA. ISIS 549372, ISIS 549458, ISIS 554221 e ISIS 549434 se ensayaron en células MR C4-2B.
[0408] Las células se cultivaron en placas a una densidad de 40.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron en medio RPMI1640 con suero bovino fetal al 10%. Las células se cultivaron en presencia de una concentración de 5 pM de MDV3100 en el transcurso de 2 meses para inducir la resistencia a MDV3100. ISIS 549372, ISIS 549458, ISIS 549434 e ISIS 554221 se agregaron a concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,04 pM, 0,20 pM, 1,00 pM y 5,00 pM al medio de cultivo para la libre absorción de las células. Se incluyó como control negativo un oligonucleótido de control, ISIS 347526 (secuencia TCTTATGTTTCCGAACCGTT (SeQ ID NO: 179) 5-10-5 MOE gápmero) sin región diana conocida en secuencias de genes humanos. Después de un período de tratamiento de 24 horas, los niveles totales de ARNm de RA se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el conjunto de sondas de cebador RTS3559. El conjunto de sondas de cebador RA humano hAR_LTS00943 (secuencia directa GCCCCTGGATGGATAGCTACT, designado en este documento como SEQ ID NO: 180; secuencia inversa CCACAGATCAGGCAGGTCTTC, designada aquí como SEQ ID NO: 181; secuencia de sondeo ACTGCCAGGGACCATGTTTTGGT) para medir los niveles de ARNm de RA-V7. Los niveles de ARNm de RA se ajustaron a los niveles de ARNm de actina humana. Los resultados se presentan en la Tabla 38 como porcentaje de inhibición de RA total, en relación con las células de control no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 549372, ISIS 549458 e ISIS 549434 redujo los niveles de transcripción de RA total de una manera dependiente de la dosis más ampliamente que el tratamiento con ISIS 554221.
[0409] El análisis de Western de RA de longitud completa, así como la variante de RA-V7, también se llevó a cabo de una manera similar al ensayo descrito anteriormente. El ensayo demostró que el tratamiento con ISIS 549372 e ISSI 549458 redujo los niveles de RA de longitud completa y RA-V7. El tratamiento con ISIS 549434 redujo los niveles de RA de longitud completa, pero no el de RA-V7. El tratamiento con ISIS 554221 redujo los niveles de RA de longitud completa menos extensivamente en comparación con ISIS 549372, y no redujo los niveles de RA-V7. El oligonucleótido de control ISIS 347526 no redujo los niveles de proteína, como se esperaba.
[0410] El nivel de ARNm del gen diana RA, KLK2 se midió utilizando el conjunto de sondas de cebador FiKLk2_LTS00963 (secuencia directa CTTGCGCCCCAGGAGTCT, designada aquí como SEQ ID NO: 183; secuencia inversa CTCAGAGTAAGCTCTCGACACACATGTC, designada aquí como SEQ ID NO: 184; secuencia de la sonda AGTGTGTGAGCCTCCATCTCCTGTCCAA, designada en este documento como SEQ ID NO: 185). El nivel de ARNm del gen diana RA, KLK3 fue medido utilizando el conjunto de sondas de cebador RTS1072 (secuencia directa GCCAAGGAGGGAGGGTCTT, designada en este documento como SEQ ID NO: 186; secuencia inversa CCCCCCATAGTGAATCAGCTT, designada en este documento como SEQ ID NO: 187; secuencia de la sonda ATGAAGTAAGGAGAGGGACTGGACCCCC, designada en este documento como SEQ ID NO. Como se presenta en las Tablas 39 y 40, el tratamiento con I ISIS 549372, ISIS 549458 e ISIS 549434 redujo los niveles del gen diana de una manera dependiente de la dosis más ampliamente que el tratamiento con ISIS 554221.
Tabla 38
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Tabla 39
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Ejemplo 17: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) sobre la capacidad proliferativa de las células C4-2B resistentes a MDV3100
[0411] Se analizó el efecto de la inhibición antisentido de RA sobre la capacidad proliferativa de las células cancerosas. ISIS 549372, ISIS 549458, ISIS 554221 e ISIS 549434 se ensayaron en células MR C4-2B.
[0412] Se añadieron ISIS 549372, ISIS 549434, ISIS 549458 e ISIS 554221 a los medios de cultivo a una concentración de oligonucleótido antisentido de 0,04 j M, 0,20 j M, 1,00 j M y 5,00 j M. ISIS 347526 se incluyó como control negativo. Después de un período de tratamiento de 6 días, la capacidad proliferativa de las células cancerosas se midió con el uso del kit de proliferación celular CellTiteR96® AQueous One Solution (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en la Tabla 41 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 549372, ISIS 549434 e ISIS 549458 redujo la proliferación de las células de una manera dependiente de la dosis más ampliamente que el tratamiento con ISIS 554221.
Tabla 41
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Ejemplo 18: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) en células LMR20 resistentes a MDV3100
[0413] Se creó una línea celular resistente a MDV3100, designada como LMR20. Se analizó el efecto de la inhibición antisentido de RA sobre la capacidad proliferativa y los niveles de ARNm de RA de células LMR20. ISIS 560131, ISIS 549458 e ISIS 569236 se ensayaron junto con el gápmero LNA, ISIS 554221.
[0414] Las células LnCaP se incubaron con concentraciones crecientes de MDV3100 durante aproximadamente 6 meses. Se seleccionó un único clon después de un cultivo extenso en presencia de 20 j M MDV3100. El clon, LMR20, mantuvo la capacidad de permitir la libre absorción de oligonucleótidos antisentido sin transfección mediada por lípidos, al tiempo que demuestra un aumento de aproximadamente diez veces la CI50 cuando se trata con MDV3100, en comparación con las células LnCaP parentales.
Estudio 1
[0415] Las células LMR20 se colocaron en placas a 1.500 células por pocilio en medio libre de rojo fenol con suero fetal bovino (CSS) sin carbón, para eliminar cualquier andrógeno del medio (Life Technologies). ISIS 560131, ISIS 549458, ISIS 569236 e ISIS 554221 se agregaron individualmente a los medios de cultivo a una concentración de 0,04 |j M, 0,2 |j M, 1,0 |j M o 5,0 |j M. ISIS 549148, que no tiene una secuencia diana humana conocida, se incluyó como control. El agonista de andrógenos sintético, R1881, (Takeda, AN et al., Mol. Pharmacol. 2007, 71:473-82) se añadió el día 1 a una dosis de 1 nM a un conjunto de células también tratadas con cada uno de los oligonucleótidos antisentido. Se añadió DHT el día 1 a una dosis de 10 nM a otro conjunto de células también tratadas con cada uno de los oligonucleótidos antisentido. Se añadió MDV3100 el día 1 a una dosis de 10 nM a otro conjunto de células no tratadas con oligonucleótido antisentido, que sirvió como control. Después de un período de tratamiento de 5 días, la capacidad proliferativa de las células cancerosas se midió mediante el ensayo estándar MTT. Los resultados se presentan en la Tabla 42 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas.
[0416] Como se presenta en la Tabla 42, en presencia de los agonistas de andrógenos R188 1 o DHT, ISIS 560131, ISIS 549458 e ISIS 569236 inhibieron significativamente la proliferación de células de cáncer de próstata resistente a MDV3100 de una manera dependiente de la dosis más extensamente que ISIS 554221. Inhibición de la proliferación de los oligonucleótidos antisentido también fue comparable o más potente que con el tratamiento con MDV3100.
Tabla 42
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Estudio 2
[0417] Las células LMR20 se colocaron en placas a 1.500 células por pocillo en medio sin fenol rojo con CSS. ISIS 560131, ISIS 549458, ISIS 569236, y el gápmero de LNA ISIS 554221 se agregaron individualmente a los medios de cultivo a una concentración de 0,04 jiM, 0,2 jiM, 1,0 jiM o 5,0 jiM. ISIS 549148, que no tiene una secuencia diana humana conocida, se incluyó como control. Se añadió MDV3100 el día 1 a una dosis de 10 nM a un conjunto de células, y sirvió como control. Se añadió DHT el día 1 a una dosis de 10 nM durante 72 horas a un conjunto de células también tratadas con cada uno de los oligonucleótidos antisentido o MDV3100. R1881 se añadió el día 1 a una dosis de 10 nM durante 72 horas a otro conjunto de células también tratadas con cada uno de los oligonucleótidos antisentido o MDV3100. Se midieron los niveles de ARNm de RA, antígeno prostático específico (PSA) y TMPRSS2, un gen regulado por andrógenos (Lin, B., et al., Cancer Res. 1999. 59: 4180). Los resultados se presentan en las Tablas 43-45 como niveles de ARNm expresados como un porcentaje de los valores de referencia. Los niveles de ARNm pueden disminuir o aumentar después del tratamiento.
[0418] Como se presenta en las Tablas 43-45, ISIS 560131, ISIS 549458 e ISIS 569236 redujeron los niveles de ARNm de RA en células LMR20, tratadas con o sin agonista de RA, de una manera dependiente de la dosis con respecto a la línea base. El tratamiento con LNA gápmero ISIS 554221 no alteró los niveles de ARNm de RA. ISIS 560131, ISIS 549458 e ISIS 569236 redujeron los niveles de PSA y TMPRSS2 más ampliamente que el gápmero LIS ISIS 554221 o MDV3100. El tratamiento con MDV3100 aumentó los niveles de ARNm de RA en células tratadas con agonista de RA, y no redujo los niveles de ARNm de PSA o TMPRSS2.
Tabla 43
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Tabla 44
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Tabla 45
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Ejemplo 19: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) en combinación con MDV3100 sobre la capacidad proliferativa de las células C4-2B
[0419] Se analizó el efecto de la inhibición antisentido de RA en combinación con diferentes dosis de MDV3100 sobre la capacidad proliferativa de las células cancerosas. ISIS 549372, ISIS 549434, ISIS 549458 e ISIS 554221 se ensayaron en células C4-2B.
[0420] Las células C4-2B se colocaron en placas a 1.500 células por pocillo. ISIS 549372, ISIS 549434, ISIS 549458 o ISIS 554221 se agregaron individualmente a los medios de cultivo a una concentración de 0,1 pM. ISIS 347526 se incluyó como control negativo. MDV3100 también se agregó el día 1 en dosis de 0,25 pM o 1,00 pM. Después de un período de tratamiento de 6 días, la capacidad proliferativa de las células cancerosas se midió con el kit CellTiter96® AQueous One Solution Proliferación Celular (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en la Tabla 46 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 549372 o ISIS 549458 redujo la proliferación de las células más ampliamente que el tratamiento con ISIS 554221. Por ejemplo, como se presenta en la Tabla 46, el tratamiento con ISIS 549372 solo redujo la proliferación celular en un 59% y el tratamiento con ISIS 549458 redujo la proliferación celular en un 74% en comparación con ISIS 554221 solo, lo que redujo la proliferación celular en 23%.
[0421] Como se presenta en las Tablas 46 y 47, ISIS 549372 o ISIS 549458 en combinación con MDV3100 inhibieron la proliferación de células de cáncer de próstata en mayor grado que una concentración molar igual de ISIS 554221 en combinación de MDV3100.
[0422] Para averiguar si el tratamiento de las células con ISIS 549372 o ISIS 549458 fue sinérgico con MDV3100, se repitió el ensayo a 0,1 pM de ASO. Como se presenta en la Tabla 46, el tratamiento con ISIS 549372 o ISIS 549458 fue sinérgico con MDV3100. Por ejemplo, m Dv 3100 solo a 0,25 pM inhibió la proliferación en un 4%; ISIS 549372 solo a 0,1 pM inhibió la proliferación celular en un 23%; en combinación, la proliferación celular fue inhibida en un 66%. De manera similar, ISIS 549458 solo a 0,1 pM inhibió la proliferación celular en un 39%; en combinación, la proliferación celular fue inhibida en un 75%. Por lo tanto, la combinación de ISIS 549372 o ISIS 549458 y MDV3100 fue sinérgica (es decir, más que aditiva) en términos de inhibición de la proliferación de células de cáncer de próstata.
Tabla 46
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Tabla 47
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Ejemplo 20: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) en combinación con MDV3100 sobre la capacidad proliferativa de las células LNCaP
[0423] Se analizó el efecto de la inhibición antisentido de RA en combinación con diferentes dosis de MDV3100 sobre la capacidad proliferativa de las células cancerosas. ISIS 560131 e ISIS 569236 se ensayaron en células LNCaP.
[0424] Se plaquearon células LNCaP a 1.000 células por pocillo. ISIS 560131 o ISIS 569236 se agregaron individualmente a los medios de cultivo a una concentración de 0,08 pM, 0,04 pM, 0,2 pM o 1,0 pM. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Se añadió MDV3100 a las células tratadas con oligonucleótidos ISIS el día 2 a dosis de 0,016 |j M, 0,08 j i M, 0,4 |j M o 2,0 |j M. Después de un período de tratamiento de 5 días, la capacidad de proliferación de las células cancerosas se midió con el kit de proliferación celular CellTiter96® AQueous One o CellTiter-Glo® (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en las Tablas 48­ 52 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas.
[0425] Tal como se presenta en las Tablas, el tratamiento con ISIS 560131 o ISIS 569236 fue sinérgico con MDV3100. Por ejemplo, MDV3100 con oligonucleótido de control, ISIS 549148, a 0,08 jiM inhibió la proliferación en un promedio del 7%; ISIS 560131 solo a 0,04 ji M inhibió la proliferación celular en un 24%; en combinación, la proliferación celular se inhibió en un 41%. De manera similar, ISIS 569236 solo a 0,04 ji M inhibió la proliferación celular en un 9%; en combinación, la proliferación celular se inhibió en un 26%. Por lo tanto, la combinación de ISIS 560131 o ISIS 569236 y MDV3100 fue sinérgica (es decir, más que aditiva) en términos de inhibición de la proliferación celular de cáncer de próstata.
Tabla 48
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Tabla 49
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Tabla 50
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Tabla 51
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Tabla 52
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Ejemplo 21:Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) en combinación con MDV3100 sobre la capacidad proliferativa de las células C4-2B
[0426] Se analizó el efecto de la inhibición antisentido de RA en combinación con diferentes dosis de MDV3100 sobre la capacidad proliferativa de las células cancerosas. ISIS 560131 e ISIS 569236 se ensayaron en células C4-2B.
[0427] Las células C4-2B se colocaron en placas a 1.000 células por pocillo. ISIS 560131 o ISIS 569236 se agregaron individualmente al medio de cultivo a una concentración de 0,08 j M, 0,04 j M, 0,2 j M o 1,0 j M. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Se añadió MDV3100 a las células tratadas con oligonucleótidos ISIS el día 2 a dosis de 0,016 j M, 0,08 j M, 0,4 j M o 2,0 j M. Después de un período de tratamiento de 5 días, la capacidad proliferativa de las células cancerosas se midió con el kit CellTiter96® AQueous One Solution Proliferación Celular (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en las Tablas 53-57 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas.
[0428] Tal como se presenta en las Tablas, el tratamiento con ISIS 560131 o ISIS 569236 fue sinérgico con MDV3100. Por ejemplo, MDV3100 con oligonucleótido de control, ISIS 549148, a 0,4 j M inhibió la proliferación en un promedio del 6%; ISIS 560131 solo a 0,08 j M inhibió la proliferación celular en un 16%; en combinación, la proliferación celular se inhibió en un 31%. De forma similar, MDV3100 con oligonucleótido de control, ISIS 549148, a 0,08 j M no inhibió la proliferación (0%); ISIS 569236 solo a 0,2 j M inhibió la proliferación celular en un 37%; en combinación, la proliferación celular fue inhibida en un 52%. Por lo tanto, la combinación de ISIS 560131 o ISIS 569236 y MDV3100 fue sinérgica (es decir, más que aditiva) en términos de inhibición de la proliferación de células de cáncer de próstata.
Tabla 53
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Tabla 54
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Tabla 55
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Tabla 56
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Tabla 57
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Ejemplo 22: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) en combinación con MDV3100 sobre la capacidad proliferativa de las células 22RV1
[0429] Se analizó el efecto de la inhibición antisentido de RA en combinación con diferentes dosis de MDV3100 sobre la capacidad proliferativa de las células cancerosas. ISIS 560131 e ISIS 569236 se ensayaron en células 22RV1.
[0430] Las células 22RV1 se sembraron en placas a 2.000 células por pocillo en medio de CSS al 5% durante 48 horas. Las células se transfectaron utilizando reactivo RNAiMAX con ISIS 560131 o ISIS 569236 a concentraciones de 0,4 nM, 1,34 nM, 4 nM o 13,4 nM. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Se añadió DHT a 1 nM y/o MDV3100 a dosis de 0,04 jiM, 0,2 jiM, 1,0 |jM o 5,0 |jM después de 4 horas. Después de un período de tratamiento de 3 días, la capacidad proliferativa de las células cancerosas se midió con el kit CellTiter96® AQueous One Solution Proliferación Celular (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en las Tablas 58-62 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas.
[0431] Tal como se presenta en las Tablas, el tratamiento con ISIS 560131 o ISIS 569236 fue sinérgico con MDV3100. Por ejemplo, MDV3100 con oligonucleótido de control, ISIS 549148, a 1,0 jiM inhibió la proliferación en un promedio del 5%; ISIS 560131 solo a 1,34 nM inhibió la proliferación celular en un 3%; en combinación, la proliferación celular fue inhibida en un 23%. De forma similar, MDV3100 con oligonucleótido de control, ISIS 549148, a 1,0 jiM inhibió la proliferación en un 5%; ISIS 569236 solo a 1,0 jiM inhibió la proliferación celular en un 17%; en combinación, la proliferación celular fue inhibida en un 30%. Por lo tanto, la combinación de ISIS 560131 o ISIS 569236 y MDV3100 fue sinérgica (es decir, más que aditiva) en términos de inhibición de la proliferación de células de cáncer de próstata.
Tabla 58
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Tabla 59
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Tabla 60
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Tabla 61
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Tabla 62
Figure imgf000083_0004
Ejemplo 23: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) en células CWR22-RV1
[0432] Se analizó el efecto de la inhibición antisentido de RA sobre la capacidad proliferativa de las células cancerosas. ISIS 549372, ISIS 549434, ISIS 549458 e ISIS 554221 se ensayaron en células CWR22-RV1.
[0433] Las células CWR22-RV1 se colocaron en placas y se transfectaron utilizando el reactivo RNAiMax (Life Technologies) con oligonucleótidos ISIS a concentraciones de 1,7 nM, 5,0 nM, 16,7 nM o 50 nM. ISIS 347526 se incluyó como control negativo. Después de un período de tratamiento de 6 días, se midió la reducción diana y la capacidad proliferativa de las células cancerosas.
[0434] La inhibición antisentido de ARNm de longitud completa de RA se midió con el conjunto de sondas de cebador RTS3559. Los resultados se presentan en la Tabla 63 como porcentaje de inhibición con respecto a las células no tratadas. La reducción en la variante de empalme V7 del ARNm de RA también se midió mediante RT-PCR utilizando la tinción con SYBR Green (Hu, R. et al., Cancer Res. 2009. 69:16-22). Los resultados se presentan en la Tabla 64, como porcentaje de reducción, en relación con las células no tratadas. La proliferación celular se midió con el kit de proliferación celular CellTiter96® AQueous One Solution (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en la Tabla 65 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas.
Tabla 63
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Tabla 64
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Tabla 65
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Ejemplo 24: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) por la captación libre del oligonucleótido antisentido por las células C4-2B
[0435] Se investigó el efecto de la libre absorción de oligonucleótidos antisentido en los niveles de ARNm de RA. Fueron ensayados ISIS 549372, ISIS 549434, ISIS 549458 e ISIS 554221.
[0436] Las células se colocaron en placas a una concentración de 1.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos para medir la proliferación celular, y a 4.000 células/pocillo para medir la reducción de la diana. ISIS 549458, ISIS 549372, iSiS 549434 e ISIS 554221 se agregaron individualmente a 0,04 pM, 0,20 pM, 1,00 pM o 5,00 pM. Después de un período de incubación de 24 horas, los niveles de ARNm se midieron utilizando hAR_LTS00943. Los datos se presentan en la Tabla 66. Los resultados indican que ISIS 549458, ISIS 549372 e ISIS 549434 inhibieron la expresión de ARNm de RA de manera más potente que ISIS 554221.
[0437] En el día 6, las células en placa para medir la proliferación se incubaron con reactivo MTT hasta el desarrollo del color. La intensidad del color se midió utilizando un espectrofotómetro a 490 nm. Los datos se presentan en la Tabla 67.
Tabla 66
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Tabla 67
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Ejemplo 25: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) por la libre absorción del oligonucleótido antisentido por las células LnCaP
[0438] Se investigó el efecto de la libre absorción de oligonucleótidos antisentido en los niveles de ARNm de RA.
[0439] Las células se colocaron en placas a una concentración de 4.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Oligonucleótidos ISIS, especificados en la Tabla 68 se añadió individualmente a 0,02 jiM, 0,10 jiM, 0,50 jiM, 2,50 jiM o 10,00 jiM. Después de un período de incubación de 24 horas, los niveles de ARNm se midieron utilizando el conjunto de sondas de cebador hAR_LTS00943. Los datos se presentan en la Tabla 68. Los resultados indican que la mayoría de los oligonucleótidos ISIS inhibieron la expresión del ARNm de RA de manera más potente que el iSlS 554221 en cada concentración.
Tabla 68
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Ejemplo 26: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm del receptor de andrógeno humano (RA) en presencia de DHT sobre la capacidad proliferativa de las células 22RV1
[0440] La dihidrotestosterona (DHT) es una hormona androgénica y un activador RA. Se analizó el efecto de la inhibición antisentido de RA sobre la capacidad proliferativa de las células cancerosas tratadas con DHT. ISIS 560131 e ISIS 569236 se ensayaron en la línea celular de carcinoma de próstata humano, 22RV1.
[0441] Las células 22RV1 se sembraron en placas a 1.500 células por pocillo. ISIS 560131 e ISIS 569236 se transfectaron individualmente en las células utilizando el reactivo RNAiMAX™ (Life Technologies) a una concentración de 1,34 nM, 4,00 nM, 13,4 nM o 40,0 nM. ISIS 549148, que no tiene una secuencia diana humana conocida, se incluyó como control. Conjuntos separados de células, también tratadas con cada uno de los oligonucleótidos antisentido, se trataron con DHT añadido el día 1 a una concentración final de 1 nM. Después de un período de tratamiento de 5 días, se midió la capacidad proliferativa de las células cancerosas utilizando el ensayo estándar MTT. Los resultados se presentan en la Tabla 69 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas.
[0442] Como se presenta en la Tabla 69, tanto ISIS 560131 como ISIS 569236 inhibieron significativamente la proliferación de células de cáncer de próstata incluso en presencia de un activador RA, DHT, en comparación con el control. El oligonucleótido de control no mostró ningún efecto sobre la proliferación, como se esperaba.
Tabla 69
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Ejemplo 27: Estudio en el tiempo del tratamiento de células C4-2B con oligonucleótidos ISIS dirigidos a RA [0443] Se analizó el efecto de la inhibición antisentido de las células cancerosas C4-2B sobre la expresión génica. Se ensayaron ISIS 560131 y ISIS 569236.
Análisis de ARNm RA
[0444] Las células C4-2B se colocaron en placas a 1.000 células por pocillo en medio completo. ISIS 560131 o ISIS 569236 se agregaron individualmente al medio de cultivo a las concentraciones finales de concentraciones de 0,04 |jM, 0,2 |j M, 1,0 |j M o 5,0 |j M sin usar el reactivo de transfección. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Se añadió MDV3100 a una dosis de 0,04 jiM, 0,2 jiM, 1,0 jiM o 5,0 jiM en un conjunto separado de células. Después de un período de tratamiento de 8 horas, 24 horas y 48 horas, se midió la expresión de RA con el conjunto de sondas de cebador hAR-LTS00943. Los resultados se presentan en las Tablas 70-72 como porcentaje de expresión de RA, en relación con las células no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 560131 o ISIS 569236 redujo la expresión de RA en las células en relación con el conjunto de control. El tratamiento con MDV-3100 aumentó la expresión de RA en el punto de tiempo de 48 horas.
Tabla 70
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Tabla 71
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Tabla 72
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Análisis de proteínas RA
[0445] También se analizaron los niveles de proteína en las células. Las células se recogieron en tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasa. La presencia de bandas para RA de longitud completa se detectó mediante transferencia Western usando un anticuerpo RA (N-20, SC-816, Santa Cruz Biotechnology). La RA de longitud completa se redujo significativamente en las células tratadas con ISIS 560131 o ISIS 569236 durante 24 horas y 48 horas, normalizadas a los niveles del gen house-keeping, GAPDH.
Análisis de la expresión del ARNm de genes aguas abajo.
[0446] También se analizaron los análisis de expresión de antígeno prostético específico (PSA) y TMPRSS2. Los resultados se presentan en las Tablas 73-75 como porcentaje de inhibición de la expresión de PSA y en las Tablas 76-78 como porcentaje de inhibición de la expresión de TMPRSS2, en relación con las células no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 560131 o ISIS 569236 redujo la expresión de PSA y TMPRSS2 en las células en relación con el control establecido en los puntos de tiempo de 24 horas y 48 horas. El tratamiento con MDV-3100 también redujo las expresiones génicas posteriores pero no tan potentemente como con los oligonucleótidos ISIS.
Tabla 73
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Tabla 74
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Tabla 75
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Table 76
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Tabla 77
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Tabla 78
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Ejemplo 28: Inhibición antisentido del ARNm de RA en células LNCaP cultivadas en medios completos y medios CSS
[0447] Se investigó el efecto de la inhibición antisentido de RA en células LNCaP cultivadas en medio completo, así como el medio CSS con DHT.
Expresión génica en medio completo.
[0448] Las células se plaquearon a 1.000 células por pocillo. ISIS 560131 o ISIS 569236 se agregaron individualmente a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Se añadió MDV3100 a una dosis de 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M. mM en un conjunto separado de células. Después de un período de incubación de 48 horas, se midieron los niveles de ARN de RA, PSA y TMPRSS2. Los datos se presentan en las Tablas 79-81.
[0449] El análisis de proteínas de RA de longitud completa también demostró una disminución de la expresión dependiente de la dosis, normalizada a los niveles del gen de mantenimiento de la casa, GAPDH.
Tabla 79
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Tabla 80
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Tabla 81
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Expresión génica en medio CSS y CSS DHT.
[0450] Las células se colocaron en placas a 2.000 células por pocilio y se cultivaron en RPMI sin rojo de fenol complementado con medio de suero (Gibco) recortado con carbón al 5% durante 16 horas. ISIS 560131 o ISIS 569236 se agregaron individualmente a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M a cada conjunto de células. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Se añadió MDV3100 a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M en un conjunto separado de células. Después de un período de incubación de 4 horas, se añadió DHT al medio hasta una concentración final de 1 nM como se indica. Los ARN se recogieron 48 horas más tarde y se midieron los niveles de RA, PSA y TMPRSS2. Los datos se presentan en el cuadro 82-85. En ausencia de DHT, la expresión de RA en las células LNCaP fue del 95%, la expresión de PSA fue del 7% y la expresión de TMPRSS2 fue del 24% en comparación con el control no tratado.
Tabla 82
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Tabla 83
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Tabla 84
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Tabla 85
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Efecto sobre la proliferación en medio CSS y CSS DHT.
[0451] Después de un período de tratamiento de 5 días en medio completo o CSS 1 nM DHT, la capacidad proliferativa de las células cancerosas se midió con el uso de CellTiter96® AQueous One Solution o CellTiter-Glo® solution Cell Proliferation kit (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en las Tablas 86 y 87 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 560131, ISIS 569236 y MDV-3100 redujo la proliferación de las células en una dosis dependiente en comparación con el control. El tratamiento con oligonucleótidos ISIS en medio CSS DHT redujo la capacidad proliferativa en mayor medida que el tratamiento con MVD-3100. La capacidad de proliferación de las células cultivadas en medio CSS sin DHT es del 17% de los niveles de control sin tratar.
Tabla 86
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Tabla 87
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Ejemplo 29: Inhibición antisentido de ARNm de RA en células C4-2 cultivadas en medios completos y medios CSS
[0452] Se investigó el efecto de la inhibición antisentido de los niveles de ARNm de RA en células C4-2 cultivadas en medio completo, así como el medio CSS con DHT.
Expresión génica en medio completo.
[0453] Las células se colocaron en placas a 1.000 células por pocillo. ISIS 560131 o ISIS 569236 se agregaron individualmente a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Se añadió MDV3100 a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M en un conjunto separado de células. Después de un período de incubación de 48 horas, se midieron los niveles de ARN de RA, PSA y TMPRSS2. Los datos se presentan en las Tablas 88-90. El tratamiento con oligonucleótido ISIS inhibió la expresión de RA, mientras que el tratamiento con MDV-3100 aumentó la expresión de RA en las células.
[0454] El análisis de proteínas de RA de longitud completa y PSA también demostró una disminución de la expresión dependiente de la dosis, normalizada a los niveles del gen de mantenimiento de la casa, GAPDH.
Tabla 88
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Tabla 89
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Tabla 90
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Expresión génica en medios CSS DHT
[0455] Las células se colocaron en placas a 2.000 células por pocilio y se cultivaron en medios CSS con 1 nM de DHT. ISIS 560131 o ISIS 569236 se agregaron individualmente a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M a cada conjunto de células. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Se añadió MDV3100 a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M en un conjunto separado de células. Después de un período de incubación de 48 horas, se midieron los niveles de ARN de RA, PSA y TMPRSS2. Los datos se presentan en el cuadro 91-93. En ausencia de DHT, la expresión de RA en células C4-2 fue del 153%, la expresión de PSA fue del 42% y la expresión de TMPRSS2 fue del 23% en comparación con el control no tratado. El tratamiento con oligonucleótido ISIS inhibió la expresión de RA, mientras que el tratamiento con MDV-3100 aumentó la expresión de RA en las células.
Tabla 91
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Tabla 92
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Tabla 93
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Efecto sobre la proliferación en medio CSS y CSS DHT.
[0456] Después de un período de tratamiento de 5 días en medio completo o medio CSS 1 nM DHT, se midió la capacidad proliferativa de las células cancerosas utilizando el kit CellTiter96® AQueous One Solution o el kit de proliferación celular CellTiter-Glo® (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en las Tablas 94 y 95 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 560131, ISIS 569236 y MDV-3100 redujo la proliferación de las células de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control. La capacidad proliferativa de las células cultivadas en medio CSS sin DHT es del 17% de los niveles de control no tratados.
Tabla 94
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Tabla 95
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Ejemplo 30: Inhibición antisentido del ARNm de RA en células C4-2B cultivadas en medios completos y medios CSS
[0457] Se investigó el efecto de la inhibición antisentido de los niveles de ARNm de RA en células C4-2B cultivadas en medio completo, así como el medio CSS con DHT.
Expresión génica en medio completo.
[0458] Las células se plaquearon a 1.000 células por pocillo. ISIS 560131 o ISIS 569236 se agregaron individualmente a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Se añadió MDV3100 a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M en un conjunto separado de células. Después de un período de incubación de 48 horas, se midieron los niveles de ARN de RA, PSA y TMPRSS2. Los datos se presentan en las Tablas 96-98. El tratamiento con oligonucleótido ISIS inhibió la expresión de RA, mientras que el tratamiento con MDV-3100 aumentó la expresión de RA en las células.
[0459] El análisis de proteínas de RA de longitud completa también demostró una disminución de la expresión dependiente de la dosis, normalizada a los niveles del gen de mantenimiento doméstico, GAPDH.
Tabla 96
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Tabla 97
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Tabla 98
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Expresión génica en medios CSS DHT
[0460] Las células se plaquearon a 2.000 células por pocilio y se cultivaron en medios CSS con 1 nM de DHT. ISIS 560131 o ISIS 569236 se agregaron individualmente a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M a cada conjunto de células. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Se añadió MDV3100 a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M en un conjunto separado de células. Después de un período de incubación de 48 horas, se midieron los niveles de ARN de RA, PSA y TMPRSS2. Los datos se presentan en las Tablas 99-101. En ausencia de DHT, la expresión de RA en las células C4-2 fue del 188%, la expresión de PSA fue del 43% y la expresión de TMPRSS2 fue del 27% en comparación con el control no tratado. El tratamiento con oligonucleótido ISIS inhibió la expresión de RA, mientras que el tratamiento con MDV-3100 aumentó la expresión de RA en las células.
Tabla 99
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Tabla 100
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Tabla 101
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Efecto sobre la proliferación en medio CSS y CSS DHT.
[0461] Después de un período de tratamiento de 5 días en medio completo o medio CSS 1 nM DHT, se midió la capacidad proliferativa de las células cancerosas utilizando el kit de proliferación celular CellTiter96® AQueous One o CellTiter-Glo® Solution (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en las Tablas 102 y 103 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 560131, ISIS 569236 y MDV-3100 redujo la proliferación de las células en una dosis dependiente en comparación con el control. El tratamiento con oligonucleótidos ISIS en medio CSS DHT redujo la capacidad proliferativa en mayor medida que el tratamiento con MVD-3100. La capacidad proliferativa de las células cultivadas en medio CSS sin DHT es del 12% de los niveles de control no tratados.
Tabla 102
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Tabla 103
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Ejemplo 31:Inhibición antisentido de ARNm de RA en células VCaP cultivadas en medios completos y medios CSS
[0462] Se investigó el efecto de la inhibición antisentido de RA en células de cáncer de próstata VCaP (Korenchuk, S. et al., In vivo. 2001. 15:163-168) cultivadas en medio completo, así como medio CSS con DHT. Las células VCaP expresan tanto RA de longitud completa como la variante V7.
Expresión génica en medio completo.
[0463] Las células se plaquearon a 10.000 células por pocillo. ISIS 560131 o ISIS 569236 se agregaron individualmente a 1,34 nM, 4 nM, 13,4 nM o 40 nM usando el reactivo de transfección RNAiMax. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Después de un período de incubación de 48 horas, se midieron los niveles de ARN de RA de longitud completa, la variante V7, PSA y TMPRSS2. Los datos se presentan en las tablas 104-107.
[0464] El análisis de proteínas de RA de longitud completa y la variante V7 también demostró una disminución de la expresión de ambos dependiente de la dosis en comparación con los niveles del gen de mantenimiento de la casa, GAPDH.
Tabla 104
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Tabla 105
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Tabla 106
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Tabla 107
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[0465] Un conjunto separado de células se trató con MDV-3100 a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M. Después de un período de incubación de 48 horas, se midieron los niveles de ARN de RA de longitud completa, la variante V7, PSA y TMPRSS2. Los datos se presentan en las Tablas 108 expresados como porcentaje de expresión de los niveles de genes en comparación con el control no tratado.
Tabla 108
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Expresión génica en medios CSS DHT
[0466] Las células se colocaron en placas a 15.000 células por pocillo y se cultivaron en medios CSS durante 16 horas. Las células se transfectaron luego utilizando el reactivo RNAiMax con ISIS 560131 o ISIS 569236 a 1,34 nM, 4 nM, 13,4 nM o 40 nM para cada conjunto de células. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Después de 4 horas, se añadió 1 nM DHT. Se añadió MDV3100 en un conjunto separado de células en dosis de 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M. Después de un período de incubación de 48 horas, se midieron los niveles de ARN de RA, PSA y TMpRSS2. Los datos se presentan en las tablas 109-113. En ausencia de DHT, la expresión de RA en las células VCaP fue del 555%, la expresión de la variante de V7 fue del 656%, la expresión de PSA fue del 11% y la expresión de TMPRSS2 fue del 22% en comparación con el control no tratado.
Tabla 109
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Tabla 110
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Tabla 111
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Tabla 112
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Tabla 113
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Efecto sobre la proliferación
[0467] Después de un período de tratamiento de 5 días en medio completo o CSS 1 nM medio DHT, la capacidad proliferativa de las células cancerosas se midió utilizando el kit de proliferación celular CellTiter96® AQueous One o CellTiter-Glo® Solution (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en las Tablas 114-116 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 560131, ISIS 569236 y MDV-3100 redujo la proliferación de las células en una dosis dependiente en comparación con el control. El tratamiento con oligonucleótidos ISIS en medio CSS DHT redujo la capacidad proliferativa en mayor medida que el tratamiento con MVD-3100. La capacidad proliferativa de las células cultivadas en medio CSS sin DHT es del 12% de los niveles de control no tratados.
Tabla 114
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Tabla 115
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Tabla 116
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Efecto sobre la apoptosis.
[0468] Después de un período de tratamiento de 72 horas en medio completo, la apoptosis de las células cancerosas se midió con el ensayo Caspasa-Glo 3/7 (Promega). Los resultados se presentan en las Tablas 117 y 118 como porcentaje de apoptosis de las células, en relación con las células no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 560131, ISIS 569236 y MDV-3100 aumentó la apoptosis de las células en una dosis dependiente en comparación con el control.
[0469] La apoptosis también se midió mediante el análisis de transferencia Western de proteínas de los niveles de PARP escindidos, que se demostró que aumentaban de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con ISIS 560131, ISIS 569236 y MDV-3100.
Tabla 117
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Tabla 118
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Ejemplo 32: Inhibición antisentido de ARNm de RA en células 22RV1 cultivadas en medios completos y medios CSS
[0470] Se investigó el efecto de la inhibición antisentido de RA en células 22RV1 cultivadas en medio completo, así como medio CSS con DHT.
Expresión génica en medio completo.
[0471] Las células se plaquearon a 1.000 células por pocillo. ISIS 560131 o ISIS 569236 se agregaron individualmente a 1,34 nM, 4 nM, 13,4 nM o 40 nM usando el reactivo de transfección RNAiMax. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Después de un período de incubación de 48 horas, se midieron los niveles de ARN de RA de longitud completa, la variante V7, PSA y TMPRSS2. Los datos se presentan en las Tablas 119-122.
[0472] El análisis de proteínas de RA de longitud completa y la variante V7 también demostró una disminución de la expresión dependiente de la dosis en comparación con los niveles del gen de mantenimiento de la casa, GAPDH.
Tabla 119
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Tabla 120
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Tabla 121
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Tabla 122
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[0473] Se trató un conjunto separado de células con MDV-3100 a 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M. Después de un período de incubación de 48 horas, se midieron los niveles de ARN de RA de longitud completa, la variante V7, PSA y TMPRSS2. Los datos se presentan en las Tablas 123 expresados como porcentaje de expresión de los niveles de genes en comparación con el control no tratado.
Tabla 123
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Expresión génica en medios CSS DHT
[0474] Las células se colocaron en placas a 2.000 células por pocillo y se cultivaron en medios CSS durante 16 horas. Las células se transfectaron luego utilizando el reactivo RNAiMax con ISIS 560131 o ISIS 569236 a 1,34 nM, 4 nM o 13,4 nM para cada conjunto de células. ISIS 549148 se incluyó como control negativo. Después de 4 horas, se añadió 1 nM DhT. Se añadió MDV3100 en un conjunto separado de células en dosis de 0,04 j M, 0,2 j M, 1,0 j M o 5,0 j M. Después de un período de incubación de 48 horas, se midieron los niveles de ARN de RA, variante de RA V7, PSA y TMPRSS2. Los datos se presentan en las Tablas 124-128. En ausencia de DHT, la expresión de RA en las células VCaP fue del 555%, la expresión de la variante de V7 fue del 656%, la expresión de PSA fue del 11% y la expresión de TMPRSS2 fue del 22% en comparación con el control no tratado.
[0475] El tratamiento con oligonucleótidos ISIS dio como resultado una inhibición significativa de RA de longitud completa y la variante V7, así como la expresión génica aguas abajo. El tratamiento con oligonucleótidos ISIS produjo una inhibición de la expresión génica en mayor medida que el tratamiento con MVD-3100.
Tabla 124
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Tabla 125
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Tabla 126
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Tabla 127
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Tabla 128
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Efecto sobre la proliferación
[0476] Después de un período de tratamiento de 5 días en medio completo, se midió la capacidad proliferativa de las células cancerosas utilizando el kit de proliferación celular CellTiter96® AQueous One o CellTiter-Glo® (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en las Tablas 129 y 130 como porcentaje de inhibición de la proliferación, en relación con las células no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 560131, ISIS 569236 y MDV-3100 redujo la proliferación de las células en una dosis dependiente en comparación con el control. El tratamiento con oligonucleótidos ISIS en medio CSS DHT redujo la capacidad proliferativa en mayor medida que el tratamiento con MVD-3100. La capacidad proliferativa de las células cultivadas en medio CSS sin DHT es del 12% de los niveles de control no tratados.
Tabla 129
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Tabla 130
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Efecto sobre la apoptosis.
[0477] Después de un período de tratamiento de 72 horas en medio completo o medio CSS DHT, se midió la apoptosis de las células cancerosas con el kit de ensayo Caspasa-glo 3/7 (Promega). Los resultados se presentan en las Tablas 131 y 132 como porcentaje de apoptosis de las células, en relación con las células no tratadas. El tratamiento de las células con ISIS 560131 e ISIS 569236 aumentó la apoptosis de las células en una dosis dependiente en comparación con el control.
Tabla 131
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Tabla 132
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Ejemplo 33: Efecto de los oligonucleótidos antisentido ISIS que se dirigen al receptor de andrógenos humanos en monos cynomolgus
[0478] Los monos Cynomolgus se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente. Se evaluaron la eficacia y tolerabilidad del oligonucleótido antisentido. Los oligonucleótidos antisentido humanos analizados son reactivos cruzados con la secuencia genómica rhesus (GENBANK N° de registro NW_001218131.1 truncado desde los nucleótidos 134001 hasta 308000 y designado aquí como SEQ ID NO: 189). El sitio de inicio diana y la región diana de cada oligonucleótido a SEQ ID NO: 189, así como los detalles de su química y secuencia, se presentan en la Tabla 133.
Tabla 133
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Tratamiento
[0479] Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante un período de 30 días, durante los cuales los animales se observaron diariamente por su salud general. Los monos tenían entre 2 y 4 años y pesaban entre 2 y 4 kg. Trece grupos de cuatro monos cynomolgus machos asignados al azar fueron inyectados cada uno por vía subcutánea con oligonucleótido ISIS o p Bs . La solución de PBS o los oligonucleótidos ISIS, a una dosis de 40 mg/kg, se administraron con un régimen de carga que consta de cuatro dosis en la primera semana del estudio (días 1, 3, 5 y 7), seguido de un régimen de mantenimiento que consiste en la administración una vez por semana a partir del día 14 (semanas 2 a 6). Las inyecciones subcutáneas se realizaron en rotaciones en sentido horario en 4 sitios en la parte posterior; un sitio por dosis. Los sitios de inyección se delinearon con un tatuaje, mientras que se sedaban con ketamina, y se separaron por un mínimo de 3 cm.
[0480] Durante el período de estudio, se observó a los monos un mínimo de una vez al día para detectar signos de enfermedad o angustia. Los protocolos descritos en el Ejemplo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales ( iAc UC).
Reducción diana
Análisis de ARN
[0481] El ARN se extrajo de los tejidos del hígado, corazón, músculo esquelético, riñón y próstata para el análisis de PCR en tiempo real de RA utilizando el conjunto de sondas de cebador RTS3559. Los resultados se normalizaron a RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición del ARNm de RA, en relación con el control de PBS. Como se muestra en la Tabla 134, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS produjo una reducción significativa del ARNm de RA, en relación con el control de PBS. “n/a” indica que los niveles de ARNm no se midieron en ese órgano.
Tabla 134
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Análisis de proteínas
[0482] Los niveles de proteína de testosterona en suero se midieron en el plasma con un kit ELISA (Enzo Life Sciences), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en la Tabla 135, expresada en ng/mL. Los resultados indican que algunos de los oligonucleótidos ISIS redujeron los niveles de proteína de testosterona.
Tabla 135
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Estudios de tolerabilidad
Mediciones de peso corporal y orgánico
[0483] Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales y de órganos. Los pesos corporales se midieron el día 42 y se presentan en la Tabla 136. Los pesos de los órganos se midieron en el momento de la eutanasia y los datos también se presentan en la Tabla 136. Específicamente, el tratamiento con ISIS 560131 fue bien tolerado en términos de peso corporal y orgánico de los monos.
Tabla 136
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Función del hígado
[0484] Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche. Aproximadamente, se recogieron 1,5 ml de muestras de sangre el día 44 de todos los grupos de estudio. La sangre se recogió en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y luego se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos. Los niveles de diversos marcadores de función hepática se midieron utilizando un analizador de química 120FR NEO de Toshiba (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en la Tabla 137, Específicamente, el tratamiento con ISIS 560131 fue bien tolerado en términos de los marcadores de la función hepática.
Tabla 137
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Hematología
[0485] Para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus sobre parámetros hematológicos, se recogieron muestras de sangre de aproximadamente 0,5 ml de sangre el día 44 de cada uno de los animales de estudio disponibles en tubos que contenían K2-EDTA. Las muestras se analizaron para el recuento de glóbulos rojos (RBC), recuento de glóbulos blancos (WBC), recuento de plaquetas, contenido de hemoglobina y hematocrito, utilizando un analizador de hematología ADVIA2120i (SIEMENS, EE.UU.). Los datos se presentan en la Tabla 138.
[0486] Los datos indican que el tratamiento con la mayoría de los oligonucleótidos no causó cambios en los parámetros hematológicos fuera del rango esperado para oligonucleótidos antisentido a esta dosis. Específicamente, el tratamiento con ISIS 560131 fue bien tolerado en cuanto a la hematología de los monos.
Tabla 138
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Función del riñón
[0487] Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche. Aproximadamente, se recogieron 1,5 ml de muestras de sangre de todos los grupos de estudio el día 44. Se recogió sangre en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y luego se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos. Los niveles de BUN y creatinina se midieron utilizando un analizador de química 120FR NEO de Toshiba (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en la Tabla 139, expresados en mg/dL. Los datos de química del plasma indican que la mayoría de los oligonucleótidos ISIS no tuvieron ningún efecto sobre la función renal fuera del rango esperado para oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 560131 fue bien tolerado en términos de la función renal de los monos.
[0488] La función renal también se evaluó mediante análisis de orina. La orina fresca de todos los animales se recogió el día 44 utilizando una bandeja de jaula limpia sobre hielo húmedo. La comida se retiró durante la noche el día anterior a la recolección de orina fresca, pero se suministró agua. Los niveles totales de proteína y creatinina se midieron utilizando un analizador químico automatizado Toshiba 120FR NEO (Toshiba Co., Japón) y se calculó la proporción de proteína a creatinina. Los resultados se presentan en la Tabla 140.
Tabla 139
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Tabla 140
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Análisis de nivel de proteína C reactiva
[0489] Para evaluar cualquier efecto inflamatorio de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus, los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche. Aproximadamente, se recogieron 1,5 ml de muestras de sangre de todos los grupos de estudio el día 44. Se recogió sangre en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y luego se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos. La proteína C reactiva (CRP), que se sintetiza en el hígado y que sirve como marcador de inflamación, se midió el día 43 con un analizador de química 120FR NEO de Toshiba (Toshiba Co., Japón). El complemento C3 también se midió de manera similar, y los datos se presentan como un porcentaje de los valores de referencia. Los resultados se presentan en la Tabla 141 e indican que el tratamiento con la mayoría de los oligonucleótidos ISIS no causó ninguna inflamación en los monos.
Tabla 141
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Estudios de farmacocinética
[0490] Se midieron las concentraciones del oligonucleótido de longitud completa en el riñón y el hígado de los grupos de tratamiento seleccionados. El método utilizado es una modificación de los métodos publicados previamente (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consisten en una extracción con fenol-cloroformo (líquidolíquido) seguida de una extracción en fase sólida. Se añadió un estándar interno (ISIS 355868, un oligonucleótido fosforotioato modificado con 2'-O-metoxietil 27-mer, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTTT, designado aquí como SEQ ID ID:190) antes de la extracción. Las concentraciones de la muestra de tejido se calcularon utilizando curvas de calibración, con un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 1,14 pg/g.
[0491] Los resultados se presentan en la Tabla 142, expresados como pg/g de tejido. La relación riñón/hígado también se calculó y se presenta en la Tabla 142.
Tabla 142
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Ejemplo 34: Efecto de la inhibición antisentido del receptor de andrógenos (RA) en un modelo ortotópico de cáncer de mama dependiente del receptor de andrógenos
[0492] Las células MDA-MB-453 expresan RA en ausencia de receptores de estrógeno y receptor de progesterona (Hall, R.E. et al., Eur. J. Cancer 1994. 30: 484-490). El efecto de la inhibición de la expresión del ARNm de RA con oligonucleótidos antisentido se examinó en ratones portadores de tumores MDA-MB-453.
Estudio 1
[0493] El ISIS 569216 (TGATTTAATGGTTGCA; SEQ ID NO: 39), que es el oligonucleótido antisentido analizado en el ensayo, se diseñó como un deoxi, MOE y oligonucleótido (S)cEt, y tiene 16 nucleósidos de longitud. La química del oligonucleótido es 5' - Te Gk Ak Tk Td Td Ad Ad Td Gd Gd Td Tk Gk Ck A, donde "e" denota una 2'-O-metoxietilribosa; “k” denota un (S)-cEt; “d” denota una 2'-desoxirribosa. Los enlaces internucleosídicos a lo largo del oligonucleótido son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo del oligonucleótido son 5-metilcitosinas. ISIS 569216 tiene dos sitios de inicio de destino, 58720 y 58750, en la secuencia genómica de RA humana (GENBANK N° de registro NT_011669.17 truncado desde los nucleósidos 5079000 a 5270000, SEQ ID NO: 1).
Tratamiento
[0494] Se inyectaron células de carcinoma de mama MDA-MB-453 (5 x 106), mezcladas con Matrigel al 50%, en la almohadilla de grasa mamaria de 10 ratones NSG hembras. Los gránulos de dihidrotestosterona (DHT), la forma activa del andrógeno principal en circulación, la testosterona, se implantaron por vía subcutánea al mismo tiempo. Una vez que el tumor alcanzó un tamaño de 100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos de tratamiento. El primer grupo de tratamiento se inyectó con ISIS 569216 administrado por inyección subcutánea en una dosis de 50 mg/kg cinco veces por semana durante 4 semanas. El segundo grupo de tratamiento se inyectó solo con vehículo, se administró por inyección subcutánea cinco veces a la semana durante 4 semanas y sirvió como grupo de control. El crecimiento del tumor se controló una vez a la semana y los ratones se sacrificaron el día 32 después del tratamiento. Se recogieron muestras de tejido tumoral y de interfaz de TB y se procesaron para un análisis adicional.
Análisis de ARN
[0495] Los tumores se extirparon y el tejido se procesó para la extracción de ARN y los análisis de qPCR. La expresión de ARNm RA se evaluó en la interfaz t B y se normalizó a la expresión del ARNm de actina. La expresión de ARNm de RA en ratones tratados con ISIS 569216 se inhibió en un 48% en comparación con el grupo de control. Medición del volumen tumoral
[0496] Los volúmenes de tumores se midieron de forma regular a lo largo del período de estudio, utilizando calibradores a Vernier. Como se muestra en la Tabla 143, los volúmenes de tumores disminuyeron significativamente en ratones tratados con ISIS 569216 en comparación con el grupo de control.
Tabla 143
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Estudio 2
Tratamiento
[0497] Las células MDA-MB-453 obtenidas de ATCC se mantuvieron en medio L-15 de Leibovitz con FBS al 10%. Se implantaron ratones hembra NSG (Jackson Laboratories) en la almohadilla de grasa mamaria con 5 x 106 células tumorales en matrigel con factor de crecimiento reducido (1:1). Las pastillas de DHT también se implantaron al mismo tiempo en los ratones entre los omóplatos.
[0498] Después de 20 días, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos de tratamiento. Los grupos de ratones se inyectaron con 50 mg/kg de ISIS 569236 o ISIS 560131 administrados por vía subcutánea 5 días a la semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones se trató de manera similar con el oligonucleótido de control, ISIS 549148 (un gápmero 3-10-3 (S)-cEt con secuencia GGCTAC-TACGCCGTCA, designado aquí como SEQ ID NO: 193, sin secuencia humana conocida). Otro grupo control de ratones se trató de manera similar con PBS.
Medición del crecimiento tumoral.
[0499] Los volúmenes de los tumores se midieron de forma regular a lo largo del período de estudio, utilizando calibradores a vernier. Como se muestra en la Tabla 144, los volúmenes de tumores se redujeron en los ratones tratados con oligonucleótidos antisentido dirigidos a RA en comparación con el grupo de control.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 35, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la que el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento hueco que consiste en 9 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento del ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; los tres nucleósidos enlazados del segmento del ala 5' son cada uno un azúcar de etil (cEt) restringido; los cuatro nucleósidos enlazados del segmento del ala 3' son un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido, un azúcar de etil (cEt) restringido y un azúcar 2'-O-metoxietil en la dirección 5' a 3'; cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato; y cada citosina es una 5-metilcitosina.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto consiste en el oligonucleótido modificado de cadena sencilla.
3. Una composición que comprende el compuesto de la reivindicación 1 o 2, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
4. Una composición que comprende el compuesto de la reivindicación 1 o 2 y un agente anti-androgénico seleccionado de: MDV3100, ARN-059, ODM-201, abiraterona, TOK001, TAK700 y VT464.
5. La composición de la reivindicación 4, en la que el agente antiandrogénico es MDV3100.
6. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, para uso en un método para tratar el cáncer.
7. El compuesto o composición para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el cáncer es cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer gástrico o cáncer de vejiga.
8. El compuesto o composición para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el cáncer es cáncer de próstata resistente a la castración.
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