ES2700578T3

ES2700578T3 - Producción microbiana de 1,3-dioles

Info

Publication number: ES2700578T3
Application number: ES15745054T
Authority: ES
Inventors: Andreas W Schirmer; Noah Helman; Haibo Wang; Zhihao Hu; Vikranth Arlagadda; Alma Itzel Ramos-Solis; Elizabeth Clarke
Original assignee: REG Life Sciences LLC
Current assignee: REG Life Sciences LLC
Priority date: 2014-07-18
Filing date: 2015-07-17
Publication date: 2019-02-18
Anticipated expiration: 2035-07-17
Also published as: JP2017520270A; AU2020200828B2; AU2015289430A1; CA2955370A1; CN113355268A; US20170204436A1; CN106574238A; US20210071207A1; WO2016011430A1; MX2017000669A; KR20240023194A; US20220267813A1; ES2920511T3; AU2015289430B2; JP6925258B2; EP4089176A1; AU2020201038A1; US11359216B2; MY188944A; EP3460066A1

Abstract

Microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso que tiene una longitud de cadena de al menos 5 átomos de carbono cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple derivada de una materia prima renovable, estando el microorganismo modificado por ingeniería genética para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende: (a) una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14); y (b) una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42).

Description

DESCRIPCIÓN

Producción microbiana de 1,3-dioles

Lista de secuencias

Se ha presentado electrónicamente una lista de secuencias en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 17 de julio de 2015, se denomina LS00052PCT_SL.txt y tiene un tamaño de 50.064 bytes.

Campo

La invención se refiere a un microorganismo recombinante modificado por ingeniería genética para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para una tioesterasa y una ácido carboxílico reductasa, y también a un método para producir un 1,3-diol graso que tiene una longitud de cadena de al menos 5 átomos de carbono a partir de una fuente de carbono simple.

Antecedentes

Los alcoholes grasos pueden tener muchos usos comerciales como componentes de agentes y procedimientos industriales, particularmente en la producción de detergentes y tensioactivos. Se usan como emulsionantes, emolientes y espesantes en cosméticos y alimentos y como plastificantes y disolventes industriales. Pueden producirse alcoholes grasos a partir de materias primas derivadas de productos petroquímicos u oleoquímicos. Los productos petroquímicos son productos químicos derivados del petróleo. Los productos oleoquímicos son aceites refinados derivados de fuentes naturales tales como grasas vegetales y animales.

La ruta química para la obtención de alcoholes grasos consume mucha energía y es medioambientalmente costosa y requiere el uso de reactivos peligrosos. Por ejemplo, puede oligomerizarse etileno usando trietilaluminio seguido por oxidación en aire. Este procedimiento crea alcoholes grasos de número par y se conoce como el procedimiento Ziegler. Alternativamente, puede oligomerizarse etileno para dar mezclas de alquenos, que entonces se someten a hidroformilación, dando como resultado aldehídos de número impar que posteriormente se hidrogenan para dar alcoholes grasos. En otro procedimiento químico, se convierten productos de olefina en aldehídos grasos y luego en alcoholes grasos. Los productos de olefina se obtienen mediante el procedimiento Shell para olefinas superiores que se comercializó en 1977 por Royal Dutch Shell (por ejemplo, produciendo aproximadamente más de un millón de toneladas de olefinas anualmente).

La ruta natural para obtener alcoholes grasos, aunque se considera un procedimiento ecológico, todavía es costoso en comparación con la ruta química. Tradicionalmente, los alcoholes grasos se derivaban de ésteres grasos o ésteres de cera, que se extraían originalmente del aceite de esperma de ballenas y más tarde del sebo (por ejemplo, grasa animal procedente de ternera o cordero). Una fuente vegetal alternativa para ésteres de cera es la planta de jojoba. En la actualidad, los alcoholes grasos también pueden producirse a partir de materias primas derivadas de productos oleoquímicos (por ejemplo, aceites vegetales refinados) tales como aceite de colza, aceite de semilla de mostaza, aceite de coco o aceite de palmiste. Tales aceites vegetales están compuestos predominantemente por tríacilgliceroles (TAG), que contienen glicerol esterificado con tres ácidos grasos (FA). Los diversos usos de los aceites vegetales dependen de la composición de FA de los TAG. Por ejemplo, una alta proporción de ácido láurico (12:0) es necesaria para la producción de jabón, mientras que los aceites ricos en ácido oleico (18:1) están recomendados para cocinar. Los TAG pueden someterse a transesterificación para dar ésteres, que a su vez se hidrogenan para dar alcoholes grasos. Aunque el sebo es principalmente C16-C18, la longitud de cadena de las fuentes vegetales es más variable (por ejemplo, C6-C24). Pueden obtenerse alcoholes de cadena larga (por ejemplo, C20-C22) a partir de colza o semilla de mostaza, mientras que pueden obtenerse alcoholes grasos medios (por ejemplo, C12-C14) a partir de aceite de coco o palmiste. El aceite de coco y el de palmiste son ricos en ácido láurico (C12) y ácido mirístico (C14). Desde el brote europeo de la encefalopatía espongiforme bovina (es decir, enfermedad de las vacas locas) en 2000, el sebo se ha reemplazado frecuentemente por ácidos grasos oleicos vegetales, derivados de aceite de palma y aceite de soja.

Los dioles grasos o dioles alifáticos son ejemplos de alcoholes grasos y pueden producirse a través de métodos químicos. Por ejemplo, los 1,3-dioles pueden sintetizarse a partir de etileno y cloruros de ácido carboxílico (véase, por ejemplo, Kirchanov et al. (1981) Translation from Izvestiya Akademii Nauk SSSR, Seriya Khimicheskaya 4:909-911). Los 1,3-dioles también pueden obtenerse mediante hidratación de cetonas y aldehídos insaturados en a,p, en los que el ceto-alcohol resultante se hidrogena. Otra síntesis química de 1,3-dioles implica la hidroformilación de epóxidos seguido por hidrogenación del aldehído (por ejemplo, obteniendo 1,3-propanodiol a partir de óxido de etileno). Rutas más especializadas para dar 1,3-dioles incluyen la reacción entre un alqueno y un formaldehído y el uso de p-hidroxicetonas. Los 1,3-dioles se han asociado con ser útiles como aditivos alimentarios (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 3.806.615). La configuración 1,3-dihidroxilo es responsable de la naturaleza no tóxica de estas entidades químicas.

Los 1,3-dioles son bifuncionales y pueden usarse como moléculas de unión entre otras moléculas, por ejemplo en la producción de polímeros. Por ejemplo, se usa un 1,3-propanodiol como monómero en la producción de polímeros. También puede usarse un 1,3-diol graso como precursor para tensioactivos, por ejemplo, un tensioactivo “Gemini” en que tambos restos de alcohol están modificados químicamente (por ejemplo, etoxilado, glicosilado, sulfatado, etc.). Los restos 3-hidroxilo de los 1,3-dioles grasos también son quirales, lo que los hace útiles como sintones para la producción de compuestos quiralmente importantes tales como monómeros, productos farmacéuticos, productos nutracéuticos, pesticidas, herbicidas, aromas, fragancias, disolventes, y similares.

Puesto que los dioles grasos son componentes importantes de agentes y procedimientos industriales, sería deseable producirlos en altas cantidades suficientes para cumplir las necesidades industriales, a la vez que se mantiene un menor impacto sobre el medio ambiente.

El documento Wang et al; Applied and Environmental Microbiology, 2012, páginas 519-527, dan a conocer una nueva estrategia para la producción de polihidroxialcanoatos de longitud de cadena media mediante E. coli recombinante.

Peng, en una tesis en la Universidad de Columbia Británica (Vancouver), 2012, se refiere a derivados de betacetoácido, posibles productos intermedios de ruta y productos finales.

Sumario

Una realización de la invención proporciona un microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, incluyendo el microorganismo una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), y una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42). En un aspecto, el 1,3-diol graso se produce in vivo. En otro aspecto, el 1,3-diol graso incluye, pero no se limita a, un 1,3-diol graso C5, un 1.3- diol graso C⁶, un 1,3-diol graso C7, un 1,3-diol graso C⁸, un 1,3-diol graso C9, un 1,3-diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1,3-diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18 y un 1,3-diol graso C19. Todavía en otro aspecto, la fuente de carbono simple se deriva de una materia prima renovable. En una realización, la divulgación proporciona un microorganismo recombinante, en el que el microorganismo incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), y una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42), y en el que el microorganismo produce un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico es exógena. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico incluye una o más secuencia(s) de ácido nucleico.

Otra realización de la invención proporciona un microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, incluyendo el microorganismo una ruta modificada por ingeniería genética para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), y una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42). En un aspecto, el 1,3-diol graso se produce in vivo. En otro aspecto, el 1,3-diol graso incluye, pero no se limita a, un 1,3-diol graso C5, un 1,3-diol graso C⁶, un 1,3-diol graso C7, un 1,3-diol graso C⁸, un 1,3-diol graso C9, un 1,3-diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1,3-diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18 y un 1,3-diol graso C19. Todavía en otro aspecto, la fuente de carbono simple se deriva de una materia prima renovable. En una realización, la divulgación proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta modificada por ingeniería genética para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), y una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42), en el que dicho microorganismo produce un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico es exógena. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico incluye una o más secuencia(s) de ácido nucleico.

Otra realización de la invención proporciona un microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, estando el microorganismo modificado por ingeniería genética para expresar una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42), y opcionalmente una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.). En un aspecto, el 1.3- diol graso se produce in vivo. En otro aspecto, el 1,3-diol graso incluye, pero no se limita a, un 1,3-diol graso C5, un 1,3-diol graso C⁶, un 1,3-diol graso C7, un 1,3-diol graso C⁸, un 1,3-diol graso C9, un 1,3-diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1,3-diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18 y un 1,3-diol graso C19. Todavía en otro aspecto, la fuente de carbono simple se deriva de una materia prima renovable. En una realización, la divulgación proporciona un microorganismo recombinante modificado por ingeniería genética para expresar una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42) y una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.), en el que dicho microorganismo es para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple. En otra realización, la una o más secuencia(s) de ácido nucleico son exógenas.

Otra realización de la invención proporciona un microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, incluyendo el microorganismo una ruta modificada por ingeniería genética para expresar una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42), y opcionalmente una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.). En un aspecto, el 1,3-diol graso se produce in vivo. En otro aspecto, el 1,3-diol graso incluye, pero no se limita a, un 1.3- diol graso C5, un 1,3-diol graso C⁶, un 1,3-diol graso C7, un 1,3-diol graso C⁸, un 1,3-diol graso C9, un 1,3-diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1,3-diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18 y un 1,3-diol graso C19. Todavía en otro aspecto, la fuente de carbono simple se deriva de una materia prima renovable. En una realización, la divulgación proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta modificada por ingeniería genética para expresar una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42) y una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.), en el que dicho microorganismo produce un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple. En otra realización, la una o más secuencia(s) de ácido nucleico son exógenas.

Otra realización de la invención proporciona un microorganismo recombinante, tal como se define en las reivindicaciones, para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, en el que la fuente de carbono simple se deriva de una materia prima renovable.

Otra realización de la invención proporciona un microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, en el que el microorganismo expresa una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), y una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42). En una realización, la tioesterasa incluye, pero no se limita a, fatB1, TE_EEI82564, TE_CAD63310, phaG y tesA. En otra realización, la ácido carboxílico reductasa es carB. Todavía en otra realización, la una o más secuencia(s) de ácido nucleico son exógenas.

Otra realización de la invención proporciona un microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, incluyendo el microorganismo una ruta modificada por ingeniería genética para expresar una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), y una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42). En una realización, la tioesterasa incluye, pero no se limita a, fatB1, TE_EEI82564, TE_CAD63310, phaG y tesA. En otra realización, la ácido carboxílico reductasa es carB. Todavía en otra realización, la una o más secuencia(s) de ácido nucleico son exógenas.

Otra realización de la invención proporciona un microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, en el que el microorganismo expresa una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42) y una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.). En una realización, la tioesterasa incluye, pero no se limita a, fatB1, TE_EEI82564, TE_CAD63310, phaG y tesA. En otra realización, la ácido carboxílico reductasa es carB. Todavía en otra realización, la alcohol deshidrogenasa es alrA. Aún en otra realización, la una o más secuencia(s) de ácido nucleico son exógenas.

Otra realización de la invención proporciona un microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, incluyendo el microorganismo una ruta modificada por ingeniería genética para expresar una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42) y una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.). En una realización, la tioesterasa incluye, pero no se limita a, fatB1, TE_EEI82564, TE_CAD63310, phaG y tesA. En otra realización, la ácido carboxílico reductasa es carB. Todavía en otra realización, la alcohol deshidrogenasa es alrA. Aún en otra realización, la una o más secuencia(s) de ácido nucleico son exógenas.

La divulgación engloba además un cultivo celular que incluye un microorganismo recombinante, tal como se define en las reivindicaciones, para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple. El microorganismo está modificado por ingeniería genética para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), y una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42). En otra realización, el microorganismo está modificado por ingeniería genética para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42) y una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.-). El cultivo celular produce 1,3-dioles grasos que tienen una longitud de cadena de al menos 5 átomos de carbono. Por ejemplo, el cultivo celular produce un 1,3-diol graso que incluye un 1,3-diol graso C5, un 1,3-diol graso C⁶, un 1,3-diol graso C7, un 1,3-diol graso C⁸, un 1.3- diol graso C9, un 1,3-diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1,3-diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18, un 1,3-diol graso C19 y similares. En una realización, la secuencia de ácido nucleico es exógena. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico incluye una o más secuencia(s) de ácido nucleico.

Otra realización de la invención proporciona un método de producción de un 1,3-diol graso que incluye proporcionar un microorganismo recombinante en un caldo de fermentación, expresando el microorganismo una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14), una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42), y opcionalmente una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.-); y aislar un 1,3-diol graso de dicho caldo de fermentación. En una realización, el método incluye además añadir una fuente de carbono simple al caldo de fermentación. Aún en otra realización, la fuente de carbono simple se deriva de una materia prima renovable. En otra realización, la invención proporciona un método de producción de un 1,3-diol graso que incluye proporcionar un microorganismo recombinante en un caldo de fermentación, estando el microorganismo modificado por ingeniería genética para expresar una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14); y una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42) ; y aislar un 1,3-diol graso del caldo de fermentación. En un aspecto, el 1,3-diol graso incluye, pero no se limita a, un 1,3-diol graso C5, un 1,3-diol graso C⁶, un 1,3-diol graso C7, un 1,3-diol graso C⁸, un 1,3-diol graso C9, un 1.3- diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1,3-diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18 y un 1,3-diol graso C19. En una realización, el método incluye además añadir una fuente de carbono simple al caldo de fermentación. Aún en otra realización, la fuente de carbono simple se deriva de una materia prima renovable.

Otro aspecto de la divulgación proporciona un microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, expresando el microorganismo una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una actividad acil-ACP reductasa (EC 1.2.1.80 o EC 1.2.1.42) . En un aspecto, el 1,3-diol graso se produce in vivo. En otro aspecto, el diol graso incluye, pero no se limita a, un 1,3-diol graso C5, un 1,3-diol graso C⁶, un 1,3-diol graso C7, un 1,3-diol graso C⁸, un 1,3-diol graso C9, un 1,3-diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1,3-diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18 y un 1,3-diol graso C19. En una realización, la secuencia de ácido nucleico es exógena.

Todavía otro aspecto de la divulgación proporciona un microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, expresando el microorganismo una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad acil-ACP reductasa (EC 1.2.1.80 o ^eC 1.2.1.42), y una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.-). En un aspecto, el 1,3-diol graso se produce in vivo. En otro aspecto, el diol graso incluye, pero no se limita a, un 1,3-diol graso C5, un 1,3-diol graso C⁶, un 1,3-diol graso C7, un 1,3-diol graso C⁸, un 1,3-diol graso C9, un 1,3-diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1,3-diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18 y un 1,3-diol graso C19. En una realización, la una o más secuencia(s) de ácido nucleico son exógenas.

La divulgación contempla además un cultivo celular que incluye un microorganismo recombinante para producir un 1.3- diol graso cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple, estando el microorganismo modificado por ingeniería genética para expresar una o más secuencia(s) de ácido nucleico que codifican(n) para un polipéptido que tiene una actividad acil-ACP reductasa (EC 1.2.1.80 o EC 1.2.1.42), y opcionalmente una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.-). En un aspecto, el cultivo celular produce 1,3-dioles grasos. En otro aspecto, el diol graso incluye, pero no se limita a, un 1,3-diol graso C5, un 1,3-diol graso C⁶, un 1.3- diol graso C7, un 1,3-diol graso C⁸, un 1,3-diol graso C9, un 1,3-diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1,3-diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18 y un 1,3-diol graso C19. En una realización, la una o más secuencia(s) de ácido nucleico son exógenas.

Aún en otro aspecto, la divulgación engloba un método de producción de un 1,3-diol graso que incluye proporcionar un microorganismo recombinante en un caldo de fermentación, estando el microorganismo modificado por ingeniería genética para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una actividad acil-ACP reductasa (EC 1.2.1.80 o EC 1.2.1.42); y aislar un 1,3-diol graso del caldo de fermentación. En una realización, el microorganismo expresa además una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.-). En otra realización, el método incluye además añadir una fuente de carbono simple al caldo de fermentación. Aún en otra realización, la fuente de carbono simple se deriva de una materia prima renovable. El método produce un diol graso que incluye, pero no se limita a, un 1,3-diol graso C5, un 1,3-diol graso C⁶, un 1,3-diol graso C7, un 1,3-diol graso C⁸, un 1,3-diol graso C9, un 1,3-diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1,3-diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18 y un 1,3-diol graso C19.

En una realización, la invención engloba además la secreción y recuperación de 1,3-dioles grasos de un microorganismo tal como se define en las reivindicaciones. En una realización, los 1,3-dioles grasos se secretan en el caldo de fermentación. En otra realización, los 1,3-dioles grasos se recuperan por medio de separación de aceiteagua tal como por medio de sedimentación por gravedad, centrifugación, decantación, o similares.

Todavía otro aspecto de la divulgación da a conocer el uso de dioles grasos en la producción de tensioactivos, incluyendo etoxilatos y similares.

La divulgación se refiere además a 1,3-dioles grasos quirales, a sus enantiómeros y mezclas quirales.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa una ruta a modo de ejemplo para obtener 1,3-dioles, incluyendo funcionalidades enzimáticas. La figura 2 representa una ruta a modo de ejemplo para obtener 1,3-dioles, que proporciona ejemplos de funcionalidades enzimáticas para fines ilustrativos.

La figura 3 muestra una ruta alternativa para obtener 1,3-dioles, incluyendo funcionalidades enzimáticas.

La figura 4 muestra un cromatograma de CG/EM de un extracto de una cepa de E. coli recombinante que expresa TE_EEI82564 y CarB. Todas las muestras se derivatizaron con BSTFA TMCS al 1%. El pico (1) es 1,3-octanol derivatizado y el pico (2) es 1,3-decanol derivatizado.

La figura 5 muestra los espectros de masas del pico 1 y el pico 2 derivatizados de la figura 4, que se derivan de cepas de E. coli recombinante que expresan TE_EEI82564 y CarB. El agente de derivatización fue BSTFA TMCS al 1%.

La figura 6 ilustra el patrón de fragmentación iónica de 1,3-decanodiol derivatizado con BSTFA TMCS al 1%. La figura 7 muestra la composición de 1,3-dioles (Diol) y alcoholes grasos (FALC) producidos por una cepa de E. coli recombinante que expresa TE_CAD63310 y CarB.

En las figuras 8-11 se usan las siguientes abreviaturas:

FAS - Biosíntesis de ácidos grasos/ácido graso sintasa

TE - tioesterasa

ACS - acil CoA sintasa

TL - 3-cetoacil CoA tiolasa (reversible)

(S)3HACS -(S)-3-hidroxi-acil CoA deshidrogenasa (reversible)

(S)2ECOH -(S)-2-enoil CoA hidratasa/(S)-3-hidroxilacil CoA deshidratasa

CAR - ácido carboxílico reductasa

FAR - acil graso CoA/ACP reductasa y acil graso CoA/ACP reductasa de formación de alcohol graso

ACR - acil CoA reductasa AAR - acil ACP/CoA reductasa

La figura 8 representa rutas bioquímicas que conducen a 1,3-dioles grasos a partir de acil-ACP. La ruta 1 usa funcionalidades enzimáticas tales como TE, CAR y ADH para producir 1,3-dioles. La ruta 2 usa TE, ACS, ACR y ADH para producir 1,3-dioles. La ruta 3 usa AAR y ADH para producir 1,3-dioles. La ruta 4 usa FAR y ADH para producir 1,3-dioles. La ruta 5 usa FAR para producir 1,3-dioles.

La figura 9 representa rutas bioquímicas que conducen a 1,3-dioles grasos a partir de acil-CoA. La ruta 1 usa funcionalidades enzimáticas tales como TE, CAR y ADH para producir 1,3-dioles. La ruta 2 usa ACR y ADH para producir 1,3-dioles. La ruta 3 usa AAR y ADH para producir 1,3-dioles. La ruta 4 usa FAR y ADH para producir 1,3-dioles. La ruta 5 usa FAR para producir 1,3-dioles.

La figura 10 muestra la producción de (R)-1,3-diol graso. La ruta 1 usa funcionalidades enzimáticas tales como TE, CAR y ADH para producir 1,3-dioles quirales dextrógiros. La ruta 2 usa TE, ACR y ADH para producir 1,3-dioles quirales dextrógiros. La ruta 3 usa AAR y ADH para producir 1,3-dioles quirales dextrógiros. La ruta 4 usa FAR y ADH para producir 1,3-dioles quirales dextrógiros. La ruta 5 usa FAR para producir 1,3-dioles quirales dextrógiros. La figura 11 muestra la producción de (S)-1,3-diol graso. La ruta 1 usa funcionalidades enzimáticas tales como TE, CAR y ADH para producir 1,3-dioles quirales levógiros. La ruta 2 usa ACR y ADH para producir 1,3-dioles quirales levógiros. La ruta 3 usa AAR y ADH para producir 1,3-dioles quirales levógiros. La ruta 4 usa FAR y ADH para producir 1,3-dioles levógiros. La ruta 5 usa FAR para producir 1,3-dioles quirales levógiros. La ruta 6 usa TE, ACS, FadE y (S)2ECOH para producir 1,3-dioles quirales levógiros. La ruta 7 usa ácidos grasos y ACS para producir 1,3-dioles quirales levógiros. La ruta 8 usa TE, ACS, TL y (S)3HACS para producir 1,3-dioles quirales levógiros.

Descripción detallada

Visión general

El desarrollo de un método nuevo y respetuoso con el medio ambiente para la producción de dioles grasos proporciona una mejora para la industria. El método permite la producción de dioles grasos a partir de una fuente de carbono simple que se deriva de una materia prima renovable incluyendo, pero sin limitarse a, hidratos de carbono procedentes de maíz, caña de azúcar, gas natural o biomasa lignocelulósica; productos residuales tales como residuos sólidos municipales, glicerol, gas de combustión, gas de síntesis, dióxido de carbono; o las corrientes de carbono que resultan de la nueva formación de materiales orgánicos tales como biomasa, gas natural u otros materiales carbonosos. El método permite además la producción dioles grasos a partir de CO2 y luz mediante organismos fotosintéticos, tales como cianobacteria y algas. Este método es mejor para el medio ambiente porque no produce los subproductos tóxicos que generan los procedimientos derivados de productos petroquímicos.

Más específicamente, la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, proporciona microorganismos recombinantes que están modificados por ingeniería genética para convertir una fuente de carbono simple derivada de una materia prima renovable en dioles grasos. Los 1,3-dioles son ejemplos de dioles grasos que son entidades químicas estables que son incoloras e inodoras. Se espera que los 1,3-dioles producidos de manera microbiana tengan muchas aplicaciones industriales, incluyendo como componentes de detergentes, tensioactivos, emulsionantes, emolientes, disolventes, plásticos, aromas, fragancias y compuestos bioactivos. Los 1,3-dioles producidos de manera microbiana también encontrarán uso en la industria alimentaria como sustitutos de (o aditivos de) alimentos naturales porque se metabolizan fácilmente, no son tóxicos, no son volátiles y son altamente energéticos con una vida útil de almacenamiento larga.

Los microorganismos recombinantes de la presente invención se usan en procedimientos de fermentación para la producción de dioles grasos que tienen una longitud de cadena de al menos 5 átomos de carbono. En el presente documento, la divulgación engloba metabolismos de ácidos grasos microbianos y la conversión de sus productos intermedios en 1,3-dioles. Una ventaja de la presente invención es un método de producción más limpio, es decir, empleando un procedimiento de fermentación sencillo. El uso de materias primas renovables protege el medio ambiente porque se basa en materiales de partida renovables y sostenibles que no agotan recursos naturales. El uso de productos residuales industriales (por ejemplo, glicerol) como materias primas respalda mejor el tratamiento y reciclado de residuos. Otra ventaja es la opción de fabricar productos objetivo industriales novedosos, es decir, composiciones de diol graso con longitudes de cadena selectivas, quiralidades y en mezclas específicas o en combinación con derivados.

Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, los términos “1,3-diol graso” o “1,3-diol” o “1,3-dialcohol” o “3-OH alcohol graso” o “3-hidroxialcohol graso” o “1,3-dihidroxialcohol” o “1,3-diol alifático” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a una entidad química que tiene una longitud de cadena de al menos 5 carbonos y que se origina a partir de metabolismos de ácidos grasos microbianos por medio de productos intermedios de tioéster de acil-graso y tiene al menos dos grupos OH, es decir, un grupo OH en la posición 1 y un grupo OH en la posición 3 de su cadena de carbonos.

Un “1,3-diol” tal como se menciona en el presente documento se produce mediante un microorganismo recombinante o una célula huésped microbiana recombinante.

Una “composición de 1,3-diol” normalmente incluye al menos un 1,3-diol en combinación con otro componente. El término “número de clasificación de enzimas (EC)” se refiere a un número que indica una secuencia específica de polipéptido o enzima. Los números de EC clasifican las enzimas según la reacción que catalizan. Los números de EC se establecen mediante el comité de nomenclatura de la unión internacional de bioquímica y biología molecular (IUBMB), cuya descripción está disponible en el sitio web de nomenclatura de enzimas del IUBMB en la red informática mundial.

El término “tioesterasa” se refiere a una actividad enzimática que se caracteriza por el número de EC 3.1.2.14 o el número de EC 3.1.1.5 o el número de EC 3.1.2.-.

El término “ácido carboxílico reductasa (CAR)” se refiere a una actividad enzimática que se caracteriza por el número de EC 6.2.1.3 o el número de EC 1.2.1.42 o el número de EC 1.2.99.6.

Los términos “aldehído reductasa” y “alcohol deshidrogenasa” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a una actividad enzimática que se caracteriza por el número de EC 1.1.-.-.

El término “acil-ACP reductasa (AAR)” se refiere a una actividad enzimática que se caracteriza por el número de EC 1.2.1.80 o el número de EC 1.2.1.42.

El término “acetil-CoA carboxilasa” se refiere a una actividad enzimática que se caracteriza por el número de EC 6.4.1.2.

Los términos “número de registro” y “número de registro de NCBI” y “número de registro de GenBank” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a un número que indica una secuencia específica de ácido nucleico. Los números de registro de secuencia que se comentan en esta descripción se obtuvieron de bases de datos proporcionadas por el NCBI (Centro Nacional para la Información Biotecnológica) mantenida por los Institutos Nacionales de Salud, EE.UU., y de las bases de datos de conocimiento UniProt (UniProtKB) y Swiss-Prot proporcionadas por el Instituto Suizo de Bioinformática (también denominado número de registro de Uni-ProtKB). Tal como se usa en el presente documento, el término “nucleótido” se refiere a una unidad monomérica de un polinucleótido que consiste en una base heterocíclica, un azúcar y uno o más grupos fosfato. Las bases que se producen de manera natural (guanina, (G), adenina, (A), citosina, (C), timina, (T) y uracilo (U)) normalmente son derivados de purina o pirimidina, aunque debe entenderse que también se incluyen análogos de bases que se producen de manera natural y no natural. El azúcar que se produce de manera natural es la pentosa (azúcar de cinco carbonos) desoxirribosa (que forma ADN) o ribosa (que forma ARN), aunque debe entenderse que también se incluyen análogos de azúcar que se producen de manera natural y no natural. Los ácidos nucleicos normalmente están unidos por medio de uniones fosfato para formar ácidos nucleicos o polinucleótidos, aunque se conocen en la técnica muchas otras uniones (por ejemplo, fosforotioatos, boranofosfatos, y similares).

Tal como se usa en el presente documento, el término “polinucleótido” se refiere a un polímero de ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN), que pueden ser monocatenarios o bicatenarios y que pueden contener nucleótidos no naturales o alterados. Los términos “polinucleótido”, “secuencia de ácido nucleico” y “secuencia de nucleótidos” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, o bien ARN o bien ADN. Estos términos se refieren a la estructura primaria de la molécula, y por tanto incluyen ADN mono y bicatenario y ARN mono y bicatenario. Los términos incluyen, como equivalentes, análogos de o bien ARN o bien ADN compuestos por análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados tales como, aunque sin limitarse a, polinucleótidos metilados y/o tapados. El polinucleótido puede estar en cualquier forma, incluyendo pero sin limitarse a, plásmido, viral, cromosómico, EST, ADNc, ARNm y ARNr.

Los términos “polinucleótido endógeno” y “ADN endógeno” y “secuencia de ácido nucleico endógena” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a ADN que se origina dentro de la célula huésped. Los términos “polinucleótido exógeno” y “ADN exógeno” y “secuencia de ácido nucleico exógena” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a ADN que se origina fuera de la célula huésped. Por ejemplo, un gen de la célula huésped A puede insertarse en la célula huésped B. Sin embargo, un gen que se origina a partir de la célula huésped A puede manipularse o modificarse (dentro o fuera de la célula huésped A) y volver a insertarse dentro de la misma célula huésped A.

Los términos “polinucleótido modificado” y “ADN modificado” y “secuencia de ácido nucleico modificada” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a ADN que se ha alterado en alguna forma en relación con su estado original o natural. Esta alternación puede afectar a la estabilidad, expresión, actividad o función del ADN o su producto génico codificado (por ejemplo, polipéptido o proteína). En una realización, la expresión del polipéptido codificado está aumentada. En otra realización, la expresión del polipéptido codificado está disminuida. En otra realización, la expresión del polipéptido codificado está ausente.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “polipéptido” y “proteína” y “secuencia de polipéptido” y “secuencia de proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a un polímero de residuos de aminoácido. El término “polipéptido recombinante” se refiere a un polipéptido que se produce mediante técnicas recombinantes, en las que generalmente se inserta ADN o ARN que codifica para la proteína expresada en un vector de expresión adecuado que a su vez se usa para transformar una célula huésped para producir el polipéptido.

Tal como se usa en el presente documento, el término “homólogo” se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que comprende una secuencia que es idéntica en al menos aproximadamente el 50% a la secuencia de polinucleótido o polipéptido correspondiente. Preferiblemente, los polinucleótidos o polipéptidos homólogos tienen secuencias de polinucleótido o secuencias de aminoácidos que tienen una homología de al menos aproximadamente el 70%, el 71%, el 72%, el 73%, el 74%, el 75%, el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o al menos aproximadamente el 99% con la secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótido correspondiente. Tal como se usa en el presente documento, los términos “homología” de secuencia e “identidad” de secuencia se usan de manera intercambiable. Un experto habitual en la técnica conocerá métodos para determinar la homología entre dos o más secuencias. Brevemente, pueden realizarse cálculos de “homología” entre dos secuencias tal como sigue. Las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en uno o ambos de un primer y un segundo aminoácido o secuencia de ácido nucleico para la alineación óptima y pueden ignorarse las secuencias no homólogas para fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de una primera secuencia que está alineada para fines de comparación es de al menos aproximadamente el 30%, preferiblemente al menos aproximadamente el 40%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 60%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o aproximadamente el 100% de la longitud de una segunda secuencia. Entonces se comparan los residuos de aminoácido o nucleótidos en posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótidos correspondientes de las secuencias primera y segunda. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de homología entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias puede llevarse a cabo usando un algoritmo matemático, tal como BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215(3): 403-410). El porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos también puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando o bien una matriz Blossum 62 o bien una matriz PAM250, y un valor de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un valor de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 (Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453). El porcentaje de homología entre dos secuencias de nucleótidos también puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna. CMP y un valor de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un valor de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un experto habitual en la técnica puede realizar cálculos de homología iniciales y ajustar los parámetros del algoritmo en consecuencia. Un conjunto de parámetros preferido (y el que debe usarse si un médico no está seguro sobre qué parámetros deben aplicarse para determinar si una molécula está dentro de una limitación de homología de las reivindicaciones) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización por extensión de hueco de 4, y una penalización de hueco de desplazamiento de marco de 5. Se conocen métodos adicionales de alineación de secuencia en las técnicas de biotecnología (véase, por ejemplo, Rosenberg (2005) BMC Bioinformatics 6:278); Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109).

Un péptido “endógeno” se refiere a un polipéptido codificado por el genoma de la célula huésped (por ejemplo, célula microbiana parental) del que se deriva o se modifica por ingeniería genética la célula recombinante.

Un polipéptido “exógeno” se refiere a un polipéptido que no se codifica originalmente por el genoma de la célula microbiana parental o huésped (por ejemplo, la célula huésped). Un polipéptido variante (es decir, mutante) es un ejemplo de un polipéptido exógeno. Otro ejemplo de un polipéptido exógeno es una proteína que se produce en la célula nativa pero que es el resultado de expresión alterada, por ejemplo, expresión de un polinucleótido exógeno (por ejemplo, un vector o plásmido que contiene un gen idéntico a un gen nativo, pero modificado por ingeniería genética para sobreexpresarse en la célula huésped; un gen de este tipo puede insertarse opcionalmente en el ADN del huésped).

El término “heterólogo” generalmente significa derivado de una especie diferente o derivado de un organismo diferente o derivado de una fuente diferente. Tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos o una secuencia de polipéptido que no está presente de manera natural en un organismo particular. Expresión heteróloga significa que una proteína o polipéptido se expresa en una célula que normalmente no expresa esa proteína. Como tal, heterólogo significa que una proteína transferida inicialmente se derivaba de un tipo de célula diferente o una especie diferente o una fuente diferente que el receptor. Por ejemplo, puede introducirse una secuencia de polinucleótido endógena para una célula vegetal en una célula huésped bacteriana mediante métodos recombinantes, y el polinucleótido vegetal es entonces un polinucleótido heterólogo en una célula huésped bacteriana recombinante. Otro ejemplo de un polipéptido heterólogo es una proteína que se produce en la célula nativa pero que es el resultado de expresión alterada, por ejemplo, expresión de un polinucleótido heterólogo (por ejemplo, un vector o plásmido que contiene un gen idéntico a un gen nativo, pero modificado por ingeniería genética para sobreexpresarse en la célula huésped; un gen de este tipo puede insertarse opcionalmente en el ADN del huésped).

Tal como se usa en el presente documento, el término “fragmento” de un polipéptido se refiere a una parte más corta de un polipéptido o una proteína de longitud completa cuyo tamaño oscila entre cuatro residuos de aminoácido y toda la secuencia de aminoácidos menos un residuo de aminoácido. En determinadas realizaciones de la divulgación, un fragmento se refiere a toda la secuencia de aminoácidos de un dominio de un polipéptido o una proteína (por ejemplo, un dominio de unión a sustrato o un dominio catalítico).

Tal como se usa en el presente documento, el término “mutagénesis” se refiere a un procedimiento mediante el cual se cambia la información genética de un organismo de manera estable. La mutagénesis de una secuencia de ácido nucleico que codifica para proteína produce una proteína mutante. Mutagénesis también se refiere a cambios en secuencias de ácido nucleico no codificantes que dan como resultado actividad de proteína modificada.

Tal como se usa en el presente documento, el término “gen” se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican para o bien un producto de ARN o bien un producto de proteína, así como secuencias de ácido nucleico operativamente unidas que afectan a la expresión del ARN o la proteína (por ejemplo, tales secuencias incluyen pero no se limitan a secuencias promotoras o potenciadoras) o secuencias de ácido nucleico operativamente unidas que codifican para secuencias que afectan a la expresión del ARN o la proteína (por ejemplo, tales secuencias incluyen pero no se limitan a sitios de unión al ribosoma o secuencias de control de la traducción).

Se conocen en la técnica secuencias de control de la expresión e incluyen, por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores de la transcripción, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), y similares, que proporcionan la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula huésped. Las secuencias de control de la expresión interaccionan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción (Maniatis et al. (1987) Science 236:1237-1245). Se describen secuencias de control de la expresión a modo de ejemplo, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expresion Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

El término “pluralidad” se refiere a al menos 2 en número (por ejemplo, una pluralidad de secuencias de polinucleótido significa al menos dos secuencias de polinucleótido).

En los métodos de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, una secuencia de control de la expresión está operativamente unida a una secuencia de polinucleótido. Por “operativamente unida” quiere decirse que una secuencia de polinucleótido y una(s) secuencia(s) de control de la expresión se conectan de tal manera que se permita la expresión génica cuando se unen las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción) a la(s) secuencia(s) de control de la expresión. Están ubicados promotores operativamente unidos en el sentido de 5' de la secuencia de polinucleótido seleccionada en cuanto a la dirección de transcripción y traducción. Pueden estar ubicados potenciadores operativamente unidos en el sentido de 5', dentro de o en el sentido de 3' del polinucleótido seleccionado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico, es decir, una secuencia de polinucleótido, a la que se ha unido. Un tipo de vector útil es un episoma (es decir, un ácido nucleico que puede realizar replicación extracromosómica). Los vectores útiles son aquéllos que pueden realizar replicación y/o expresión autónoma de los ácidos nucleicos a los que se unen. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los que se unen operativamente se denominan en el presente documento “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de “plásmidos”, que se refieren en general a bucles de ADN bicatenario circular que, en su forma de vector, no se unen al cromosoma. Los términos “plásmido” y “vector” se usan de manera intercambiable en el presente documento, en la medida en que un plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, también se incluyen otras de tales formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que se han conocido en la técnica posteriormente al presente documento. En algunas realizaciones, un vector recombinante comprende además un promotor unido operativamente a la secuencia de polinucleótido. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor regulado por el desarrollo, uno específico de orgánulo, uno específico de tejido, uno inducible, uno constitutivo o uno específico de célula. El vector recombinante normalmente comprende al menos una secuencia que incluye (a) una secuencia de control de la expresión acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; (b) un marcador de selección acoplado operativamente a la secuencia de polinucleótido; (c) una secuencia de marcador acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; (d) un resto de purificación acoplado operativamente a la secuencia de polinucleótido; (e) una secuencia de secreción acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; y (f) una secuencia de selección como diana acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido. En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos se incorpora de manera estable en el ADN genómico de la célula huésped, y la expresión de la secuencia de nucleótidos está bajo el control de una región promotora regulada. Los vectores de expresión descritos en el presente documento incluyen una secuencia de polinucleótido descrita en el presente documento en una forma adecuada para la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula huésped. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va transformarse, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión descritos en el presente documento pueden introducirse en células huésped para producir polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión, codificados por las secuencias de polinucleótido tal como se describe en el presente documento. La expresión de genes que codifican para polipéptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, se lleva a cabo con la mayor frecuencia con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de polipéptidos o bien de fusión o bien de no fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a un polipéptido codificado en los mismos, habitualmente al extremo amino terminal o carboxilo terminal del polipéptido recombinante. Tales vectores de fusión sirven normalmente para uno o más de los tres propósitos siguientes: (1) aumentar la expresión del polipéptido recombinante; (2) aumentar la solubilidad del polipéptido recombinante; y (3) ayudar en la purificación del polipéptido recombinante actuando como ligando en purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y el polipéptido recombinante. Esto permite la separación del polipéptido recombinante del resto de fusión después de la purificación del polipéptido de fusión. En determinadas realizaciones, una secuencia de polinucleótido de la divulgación está operativamente unida a un promotor derivado del bacteriófago T5. En determinadas realizaciones, la célula huésped es una célula de levadura, y el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan et al. (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) y picZ (Invitrogen Corp., San Diego, CA). En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de insecto, y el vector de expresión es un vector de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto en cultivo (por ejemplo, células Sf9) incluyen, por ejemplo, la serie de pAc (Smith et al. Mol. Cell Biol. 3:2156-2165 (1983)) y la serie de pVL (Lucklow et al. (1989) Virology 170:31-39 (1989)). En aún otra realización, las secuencias de polinucleótido descritas en el presente documento pueden expresarse en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Se conocen bien en la técnica otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas; véase, por ejemplo, Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).

Tal como se usa en el presente documento, el término “acil-CoA” se refiere a un tioéster de acilo formado entre el carbono de carbonilo de la cadena de alquilo y el grupo sulfhidrilo del resto 4'-fosfopantetionilo de la coenzima A (CoA), que tiene la fórmula R-C(O)S-CoA, en la que R es cualquier grupo alquilo que tiene al menos 4 átomos de carbono.

Tal como se usa en el presente documento, “acil-ACP” se refiere a un tioéster de acilo formado entre el carbono de carbonilo de una cadena de alquilo y el grupo sulfhidrilo del resto fosfopanteteinilo de una proteína transportadora de acilo (ACP). El resto fosfopanteteinilo se une de manera postraduccional a un residuo de serina conservado en la ACP mediante la acción de la proteína sintasa transportadora de holo-acilo (ACPS), una fosfopanteteinilo transferasa que usa coenzima A como sustrato y el donador de fosfopanteteinilo. En algunas realizaciones, una acil-ACP es un producto intermedio en la síntesis de acil-ACP totalmente saturadas. En otras realizaciones, una acil-ACP es un producto intermedio en la síntesis de acil-ACP insaturadas. En algunas realizaciones, la cadena de carbonos tendrá aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26 carbonos. Cada una de estas acil-ACP son sustratos para enzimas que las convierten en derivados de ácido graso. Tal como resulta evidente para un experto, el resto 4'-fosfopantetionilo de holo-ACP se deriva de la coenzima A. Por tanto, las enzimas que utilizan acil-ACP como sustrato a menudo tienen alguna actividad para acil CoA y las enzimas que utilizan acil-CoA como sustrato a menudo tienen alguna actividad para acil-ACP.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ruta de biosíntesis de ácidos grasos” significa una ruta de biosíntesis que produce ácidos grasos, tioésteres de ácidos grasos y/o derivados de los mismos. La ruta de biosíntesis de ácidos grasos puede incluir enzimas o polipéptidos adicionales con actividades enzimáticas además de las comentadas en el presente documento para producir derivados de ácidos grasos que tienen características deseadas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “clon” normalmente se refiere a una célula o un grupo de células que descienden de y son esencialmente idénticas de manera genética a un único ancestro común, por ejemplo, las bacterias de una colonia bacteriana clonada surgida a partir de una única célula bacteriana

Tal como se usa en el presente documento, el término “cultivo” se refiere normalmente a un medio líquido que comprende células viables. En una realización, un cultivo comprende células que se reproducen en medios de cultivo predeterminados en condiciones controladas, por ejemplo, un cultivo de células huésped recombinantes hechas crecer en medios líquidos que comprenden una fuente de carbono y nitrógeno seleccionada. “Cultivar” o “cultivo” se refieren al crecimiento de una población de células huésped microbianas en condiciones adecuadas en un medio líquido o sólido. En realizaciones particulares, cultivar se refiere a la bioconversión fermentativa de un sustrato en un producto final. Se conocen bien medios de cultivo y los componentes individuales de tales medios de cultivo están disponibles de fuentes comerciales, por ejemplo, con las marcas comerciales Difco™ y BBL™. En un ejemplo no limitativo, el medio de nutrientes acuoso es un “medio rico” que comprende fuentes complejas de nitrógeno, sales y carbono, tal como el medio YP, que comprende 10 g/l de peptona y 10 g/l de extracto de levadura de un medio de este tipo. La célula huésped de un cultivo puede modificarse por ingeniería genética adicionalmente para asimilar el carbono eficazmente y usar materiales celulósicos como fuentes de carbono según los métodos descritos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5.000.000; 5.028.539; 5.424.202; 5.482.846; 5.602.030; documento WO 2010127318. Además, en algunas realizaciones la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar una invertasa de modo que puede usarse sacarosa como fuente de carbono.

Tal como se usa en el presente documento, el término “en condiciones eficaces para expresar una secuencia de polinucleótido modificada genéticamente por ingeniería genética” significa cualquier condición que permita que una célula huésped exprese la funcionalidad enzimática correspondiente con el fin de producir un derivado de ácido graso deseado tal como un diol graso. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condiciones de fermentación.

El término “microorganismo recombinante” se refiere a una célula huésped que se ha modificado genéticamente o modificado por ingeniería genética de modo que determinadas actividades enzimáticas dentro de la célula huésped se han alterado, añadido y/o delecionado en relación con la célula parental o célula huésped nativa. Una célula huésped modificada genéticamente o modificada por ingeniería genética es un ejemplo de un microorganismo recombinante. Como tal, un “nivel modificado o alterado de actividad de una proteína”, por ejemplo una enzima, en una célula huésped recombinante se refiere a una diferencia en una o más características en la actividad determinada en relación con la célula huésped parental o nativa en que está ausente la misma modificación. Normalmente, las diferencias en la actividad se determinan entre una célula huésped recombinante, que tiene actividad modificada, y la célula huésped silvestre correspondiente (por ejemplo, la comparación de un cultivo de una célula huésped recombinante en relación con la célula huésped silvestre correspondiente), que no tiene la actividad modificada. Las actividades modificadas pueden ser el resultado de, por ejemplo, cantidades modificadas de proteína expresadas por una célula huésped recombinante (por ejemplo, como resultado del número aumentado o disminuido de copias de secuencias de ADN que codifican para la proteína, el número aumentado o disminuido de transcritos de ARNm que codifican para la proteína, y/o las cantidades aumentadas o disminuidas de traducción de proteína de la proteína a partir de ARNm); cambio en la estructura de la proteína (por ejemplo, cambios en la estructura primaria, tal como, cambios en la secuencia codificante de la proteína que dan como resultado cambios en la especificidad de sustrato, cambios en los parámetros cinéticos observados); y cambios en la estabilidad de la proteína (por ejemplo, degradación aumentada o disminuida de la proteína). En algunas realizaciones, el polipéptido es un mutante o una variante de cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento, siempre que se encuentre dentro de las reivindicaciones. En determinados casos, las secuencias codificantes para los polipéptidos descritos en el presente documento se someten a optimización de codones para la expresión en una célula huésped particular. Por ejemplo, para la expresión en E. coli, pueden optimizarse uno o más codones (tal como se describe en, por ejemplo, Grosjean et al. (1982) Gene 18:199-209). El microorganismo recombinante de la invención produce un 1,3-diol que tiene una longitud de cadena de al menos 5 átomos de carbono.

El término “secuencias reguladoras” tal como se usa en el presente documento se refiere normalmente a una secuencia de bases en ADN, operativamente unida a secuencias de ADN que codifican para una proteína que controla en última instancia la expresión de la proteína. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras de ARN, secuencias de unión a factor de transcripción, secuencias de terminación de la transcripción, moduladores de la transcripción (tales como elementos potenciadores), secuencias de nucleótidos que afectan a la estabilidad del ARN y secuencias reguladoras de la traducción (tales como sitios de unión al ribosoma (por ejemplo, secuencias de Shine-Dalgarno en procariotas o secuencias de Kozak en eucariotas), codones de iniciación, codones de terminación).

Los términos “nivel alterado de expresión” y “nivel modificado de expresión” se usan de manera intercambiable y significan que está presente un polinucleótido, polipéptido, metabolito o producto (por ejemplo, un derivado de ácido graso) en una concentración diferente en una célula huésped modificada por ingeniería genética en comparación con su concentración en una célula silvestre correspondiente en las mismas condiciones. Los ejemplos de derivados de ácidos grasos son ácidos grasos, 3-hidroxiácidos grasos, aldehídos grasos, 3-hidroxialdehídos grasos, alcoholes grasos, 1,3-dioles grasos y similares.

Tal como se usa en el presente documento, el término “título” se refiere a la cantidad de un derivado de ácido graso tal como, por ejemplo, un diol graso (por ejemplo, 1,3-diol) producido por volumen unitario de cultivo de células huésped, y generalmente se notifica en unidades de masa/volumen, por ejemplo, 10 g/l. El título puede referirse a un 1,3-diol particular o a una combinación de 1,3-dioles producidos por un cultivo de células huésped recombinante dado. El título también puede referirse a una composición de diol graso (por ejemplo, composición de 1,3-diol) producida por un cultivo de células huésped recombinante dado.

Tal como se usa en el presente documento, el “rendimiento de dioles grasos (por ejemplo, 1,3-dioles) producido por una célula huésped” se refiere a la eficacia mediante la cual una fuente de carbono de entrada se convierte en un producto (por ejemplo, en un diol graso) en una célula huésped, y en el caso de un “rendimiento en masa” se notifica en porcentaje de masa (producto)/unidades de masa (fuente de carbono), por ejemplo, un rendimiento en masa del 30% se referiría a 30 g de producto que se producen a partir de 100 g de fuente de carbono; un rendimiento en masa del 20% se refería a 20 g de producto que se producen a partir de 100 g de fuente de carbono; un rendimiento en masa del 10% se referiría a 10 g de producto que se producen a partir de 100 g de fuente de carbono, etc. El rendimiento puede referirse a un 1,3-diol particular o a una combinación de 1,3-dioles producidos por un cultivo de células huésped recombinantes dado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “productividad” se refiere a la cantidad de un diol graso (por ejemplo, 1,3-diol) o derivados producidos por volumen unitario de cultivo de células huésped por tiempo unitario (por ejemplo, notificado como g/l/h). La productividad puede referirse a un 1,3-diol particular o a una combinación de 1,3-dioles producidos por un cultivo de células huésped recombinante dado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tasa de utilización de glucosa” significa la cantidad de glucosa usada por el cultivo por tiempo unitario, notificada como gramos/litro/hora (g/l/h).

Una “materia prima” es el material de partida que se usa en la fabricación de un producto o para un procedimiento industrial. Una “materia prima renovable” es un material de partida que se deriva de materiales renovables tales como un material biológico, por ejemplo, materia vegetal y que puede reemplazarse a través de medios naturales (por ejemplo, maíz, caña de azúcar, biomasa lignocelulósica) o productos residuales tales como residuos sólidos municipales, glicerol, free ácidos grasos, gas de combustión, o gas de síntesis; dióxido de carbono, o similares. En comparación, una “materia prima no renovable” es un material de partida que se agota por el uso (por ejemplo, petróleo crudo, carbón, combustible nuclear, etc.) y no puede regenerarse.

Tal como se usa en el presente documento, el término “fuente de carbono simple” se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para usarse como fuente de combustible para el crecimiento de células procariotas o eucariotas simples. Las fuentes que están cualificadas como fuente de carbono simple pueden estar en diversas formas, incluyendo, pero sin limitarse a polímeros, hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, aminoácidos, péptidos y gases (por ejemplo, CO y CO2). Las fuentes de carbono a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, tales como glucosa, fructosa, manosa, galactosa, xilosa y arabinosa; oligosacáridos, tales como fructo-oligosacárido y galacto-oligosacárido; polisacáridos tales como almidón, celulosa, pectina y xilano; disacáridos, tales como sacarosa, maltosa, celobiosa y turanosa; material celulósico y variantes tales como hemicelulosas, metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio; ácidos grasos saturados o insaturados, succinato, lactato y acetato; alcoholes, tales como etanol, metanol y propanol; glicerol, o mezclas de los mismos. En una realización, la fuente de carbono simple se deriva de maíz, caña de azúcar, sorgo, remolacha, pasto varilla, ensilaje, paja, madera, pulpa, aguas residuales, basura, residuos urbanos celulósicos, gas de combustión, gas de síntesis, o dióxido de carbono. La fuente de carbono simple también puede ser un producto de fotosíntesis, tal como glucosa. En una realización, la fuente de carbono simple se deriva de una materia prima renovable. En una realización particular, la fuente de carbono simple se deriva de una materia prima renovable tal como un hidrato de carbono de maíz, caña de azúcar o biomasa lignocelulósica; o de un producto residual tal como glicerol, ácidos grasos, gas de combustión o gas de síntesis; o de la nueva formación de materiales orgánicos tales como biomasa; o de dióxido de carbono que se fija fotosintéticamente. En otra realización, la fuente de carbono simple se selecciona de glucosa, fructosa, manosa, galactosa, xilosa, arabinosa, fructo-oligosacárido, galacto-oligosacárido, almidón, celulosa, pectina, xilano, sacarosa, maltosa, celobiosa, turanosa, hemicelulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, succinato, lactato, acetato, etanol, metanol, glicerol, y mezclas de los mismos. En determinadas realizaciones, la fuente de carbono simple se deriva de biomasa. Una fuente de biomasa a modo de ejemplo es materia vegetal o vegetación, tal como maíz, caña de azúcar o pasto varilla. Otra fuente de biomasa a modo de ejemplo son productos residuales metabólicos, tales como materia animal (por ejemplo, estiércol de vaca). Las fuentes de biomasa a modo de ejemplo adicionales incluyen algas y otras plantas marinas. La biomasa también incluye productos residuales de la industria, agricultura, explotación forestal y domésticos, incluyendo, pero sin limitarse a, residuos de fermentación, ensilaje, paja, madera, aguas residuales, basura, residuos urbanos celulósicos y restos de alimentos. El término “biomasa” también puede referirse a fuentes de carbono, tales como hidratos de carbono (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos o polisacáridos)

Tal como se usa en el presente documento, el término “aislado”, con respecto a productos (tales como 1,3-dioles o derivados) se refiere a productos que están separados de componentes celulares, medios de cultivo celular, o precursores químicos o sintéticos. Los 1,3-dioles y composiciones relacionadas producidas mediante los métodos descritos en el presente documento pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación, así como en el citoplasma. Por tanto, las composiciones de dioles grasos pueden recogerse en una fase orgánica o bien de manera intracelular o bien de manera extracelular. En una realización, las composiciones de 1,3-diol se recogen de manera extracelular.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “purificar”, “purificado”, o “purificación” significan la retirada o el aislamiento de una a molécula se su entorno, por ejemplo, mediante aislamiento o separación. Las moléculas “sustancialmente purificadas” están libres en al menos aproximadamente el 60% (por ejemplo, libres en al menos aproximadamente el 70%, libres en al menos aproximadamente el 75%, libres en al menos aproximadamente el 85%, libres en al menos aproximadamente el 90%, libres en al menos aproximadamente el 95%, libres en al menos aproximadamente el 97%, libres en al menos aproximadamente el 99%) de otros componentes con los que se asocian. Tal como se usa en el presente documento, estos términos también se refieren a la retirada de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la retirada de contaminantes puede dar como resultado un aumento en el porcentaje de dioles grasos en una muestra. Por ejemplo, cuando se produce un 1,3-diol en una célula huésped recombinante, el 1,3-diol puede purificarse mediante la retirada de proteínas de la célula huésped. Después de la purificación, el porcentaje de 1,3-diol en la muestra aumenta. Los términos “purificar”, “purificado” y “purificación” son términos relativos que no requieren pureza absoluta. Por tanto, por ejemplo, cuando se produce un 1,3-diol en células huésped recombinantes, un 1,3-diol purificado es un 1,3-diol que está sustancialmente separado de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos, hidratos de carbono u otros hidrocarburos).

El término “producir un diol graso (es decir 1,3-diol) in vivo”, tal como se usa para el fin de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, significa producir un diol graso en células huésped viable y/o recombinantes y/o modificadas genéticamente a partir de una fuente de carbono simple, en el que la fuente de carbono simple se añade a un caldo de fermentación de modo que las células huésped pueden captar y metabolizar la fuente de carbono simple durante la fermentación. En una realización, una fuente de carbono simple se deriva de una materia prima renovable.

Cepas de células huésped modificadas por ingeniería genética para selección

La biosíntesis de ácidos grasos es uno de los sistemas más conservados de la maquinaria biosintética bacteriana. El complejo multienzimático ácido graso sintasa (FAS) está presente en todas las bacterias y eucariotas. La mayoría de los genes relacionados con FAS se requieren para el crecimiento y la supervivencia celulares. Las FAS eucariotas y bacterianas dirigen esencialmente el mismo tipo de transformación bioquímica. En eucariotas, FAS se denomina FAS I y la mayoría de sus dominios catalíticos están codificados por una cadena polipeptídica (no disociable). En procariotas, tales como bacterias, FAS se denomina FASII y sus enzimas y proteínas portadoras individuales se codifican por genes independientes que codifican para proteínas diferenciadas (disociables).

La proteína transportadora de acilo (ACP) junto con las enzima en un control de una ruta de FAS controlan la longitud, el grado de saturación y la ramificación de los ácidos grasos producidos en un organismo nativo. Las etapas en esta ruta están catalizadas por enzimas de la biosíntesis de ácidos grasos (FAB) y las familias de genes de acetil-CoA carboxilasa (ACC). Por ejemplo, las enzimas que pueden incluirse en una ruta de FAS modificada por ingeniería genética incluyen acetil-CoA carboxilasa (por ejemplo, AccABCD, malonil-CoA:ACP transacilasa (por ejemplo, FabD), 3-cetoacil-ACP sintasa III (por ejemplo, FabH), 3-cetoacil-ACP reductasa (por ejemplo, FabG), 3-hidroxiacil-ACP deshidratasa/isomerasa (por ejemplo, FabA), 3-hidroxiacil-ACP deshidratasa (por ejemplo, FabZ), trans-2-enoil-ACP reductasa (por ejemplo, FabI o fabL o fabK), trans-2-enoil-ACP isomerasa (por ejemplo, FabM), 3-cetoacil-ACP sintasa I (por ejemplo, FabB) y 3-cetoacil- ACP sintasa II (por ejemplo, FabF). Dependiendo del producto deseado, uno o más de estos genes pueden atenuarse o sobreexpresarse. Como tal, las células huésped se han modificado por ingeniería genética para aumentar la producción de derivados de ácidos grasos (por ejemplo, dioles grasos, alcoholes grasos) así como productos intermedios derivados de ácidos grasos (por ejemplo, aldehídos grasos) mediante la alimentación de una fuente de carbono simple que puede derivarse de materia prima renovable. En el presente documento, el principal objetivo es aumentar la actividad de enzimas de control clave que regulan la producción de derivados de ácidos grasos tales como dioles grasos con el fin de convertir la cepa bacteriana en una fábrica microbiana para la producción de dioles grasos. Las cepas bacterianas de la invención producen 1,3-dioles que tienen una longitud de cadena de al menos 5 átomos de carbono. En otra realización, las cepas bacterianas produce los 1,3-dioles en combinación con alcoholes grasos. En otra realización, las cepas bacterianas se modifican adicionalmente de manera que en particular la actividad cetoacil-ACP reductasa está aumentada y/o la actividad 3-hidroxiacil-ACP deshidratasa está disminuida, lo que conduce a una producción aumentada de 1,3-diol graso.

Las células huésped se han modificado previamente por ingeniería genética para aumentar otros derivados de ácidos grasos, incluyendo ésteres de metilo de ácidos grasos (FAME), ésteres de etilo de ácidos grasos (FAEE), y alcoholes grasos (FALC) (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.283.143). Tal como apreciará un experto en la técnica, también puede producirse síntesis de ácidos grasos a través de la elongación de acil-CoA usando biosíntesis de ácidos grasos independiente de acil-ACP. Las enzimas de FAS responsables de las reacciones de biosíntesis, condensación, reducción, deshidratación, reducción y similares de ácidos grasos correspondientes, también pueden usarse para la síntesis de tioésteres de acilo que pueden usarse como sustratos para la producción de derivados de ácidos grasos, incluyendo pero sin limitarse a ácidos grasos, aldehídos grasos, alcoholes grasos y 3-hidroxi-derivados de los mismos, incluyendo 1,3-dioles grasos. Tal como conocen los expertos en la técnica, las reacciones bioquímicas responsables de la oxidación de ácidos grasos (el ciclo de p-oxidación) pueden funcionar a la inversa para soportar la síntesis de tioésteres de ácidos grasos. Estos tioésteres de acilo pueden usarse como sustratos para la producción de derivados de ácidos grasos, incluyendo pero sin limitarse a ácidos grasos, aldehídos grasos, alcoholes grasos y 3-hidroxi-derivados de los mismos, incluyendo 1,3-dioles grasos. Además, en algunos organismos, la biosíntesis de ácidos grasos puede producirse sin ACP, por ejemplo a través de la síntesis de acil CoA (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2014/0051136A1; la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US 2014/0273114A1; y Dellomonaco et al. (2011) Nature 476(7360):355-9). En un aspecto, los componentes de estos diversos y diferentes sistemas de FAS pueden coexpresarse en la misma célula para funcionar de manera cooperativa para producir tioésteres de acil graso y derivados, incluyendo pero sin limitarse a ácidos grasos, aldehídos grasos, alcoholes grasos y 3-hidroxiderivados de los mismos, incluyendo 1,3-dioles grasos.

Moléculas quirales

Se dice que una molécula es quiral si puede existir como estereoisómeros (es decir, enantiómeros) que son imágenes especulares no superponibles entre sí. Esto es relevante porque la respuesta de un organismo a una molécula particular a menudo depende de cómo encaje esa molécula en un sitio particular en una molécula receptora en el organismo. Las moléculas quirales que incluyen dioles y alcoholes quirales son elementos estructurales para la síntesis de determinados compuestos tales como, por ejemplo, productos farmacéuticos, productos nutracéuticos y otros compuestos activos. En aplicaciones farmacéuticas y nutracéuticas, es necesario conocer qué enantiómero es el activo y encaja en el receptor deseado.

Un modo para obtener el compuesto como un isómero activo puro es producir el compuesto químico empleando organismos tales como microbios, porque la producción de biomoléculas en organismos es estereoespecífica (es decir, produce un estereoisómero específico). Por ejemplo, las levaduras producen de manera natural aminoácidos, vitaminas y hormonas durante la fermentación del azúcar y pueden recogerse de las mismas. Los expertos en la técnica aprecian las propiedades de las enzimas como catalizadores quirales y el aumento en la demanda de fármacos enantioméricamente puros ha aumentado el interés en las enzimas a efectos de realizar una buena síntesis química. A diferencia de la producción de moléculas quirales por medio de organismos, cuando las moléculas quirales se producen mediante procedimientos químicos, se obtiene una mezcla de los enantiómeros (es decir, una mezcla racémica).

Los métodos actuales de análisis enantiomérico incluyen técnicas no cromatográficas tales como polarimetría, resonancia magnética nuclear, dilución isotópica, calorimetría y técnicas enzimáticas. Estas técnicas requieren muestras puras y no está implicada la separación de enantiómeros. La cuantificación (que no requiere muestras puras) y la y separación de enantiómeros puede realizarse simultáneamente mediante cromatografía quiral, tal como cromatografía de gases (CG) o cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) usando columnas quirales (véase Stereochemistry of Organic Compounds, Ernest L. Elil/Samuel H. Wilen, 1994, John Wiley & Sons, Inc.).

Pueden usarse biocatalizadores para obtener los compuestos quirales y la pureza quiral de los productos puede identificarse usando métodos cromatográficos quirales, tales como HPLC o CL/EM quiral (véanse las publicaciones de solicitud de patente estadounidense nos. US2008/0248539A1 y US2013/0052699A1).

Quiralidad de derivados de 3-hidroxiácidos grasos

Un aspecto único de los derivados de 3-hidroxiácidos grasos (por ejemplo, 3-hidroxiácidos grasos, 3-hidroxiésteres grasos, 3-hidroxialdehídos grasos, 3-hidroxialcoholes grasos, etc.), es que cada molécula es quiral. La funcionalidad 3-hidroxilo es un estereocentro, que proporciona un punto de quiralidad para cada compuesto. La quiralidad puede ser un atributo molecular útil en la definición de aplicaciones moleculares incluyendo, pero sin limitarse a, rendimiento de polímeros, bioactividad, potencia farmacéutica, y similares. El estereoisómero de derivados de 3-hidroxiácidos grasos depende de la selectividad de la biosíntesis de ácidos grasos (FAS) a partir de la cual se producen. Manipulando qué enzimas de FAS son responsables de la síntesis de derivados de 3-hidroxiácidos grasos, puede controlarse la quiralidad del derivado de 3-hidroxiácido graso resultante. Por ejemplo, aprovecharse de la FAS de E. coli nativa para la biosíntesis de 1,3-dioles grasos producirá el (R)-1,3-diol graso, cuyo centro quiral está creado por la actividad de la 3-cetoacil-ACP reductasa de formación de (R)-3-hidroxi-acil-ACP, catalizado por FabG en E. coli (y homólogos en otros microorganismos). La (R)-3-hidroxilacil-ACP es un sustrato para polipéptidos de biosíntesis de alcohol incluyendo, pero sin limitarse a, los mostrados en las rutas 1-5 en la figura 10, que los convierten en (R)-1,3-diol graso. Además, (S)-3-hidroxi-acil CoA es un producto intermedio en la degradación de ácidos grasos a través de la ruta de beta-oxidación. Los ácidos grasos libres se convierten en acil-CoA mediante la acil-CoA sintasa, catalizado por FadD en E. coli y homólogos en otros microorganismos; esto se oxida para dar trans-2-enoil-CoA mediante la acil graso-CoA deshidrogenasa, catalizado por FadE en E. coli y homólogos en otros microorganismos; esto se hidrata entonces para dar (S)-3-hidroxi-acil-CoA mediante la 2-trans-enoil-CoA hidratasa/(S)-3-hidroxi-acil-CoA deshidratasa, catalizado por FadB en E. coli y homólogos en otros microorganismos; esto se oxida entonces adicionalmente para dar 3-ceto-acil-CoA mediante la 3-ceto-acil-CoA deshidrogenasa, también catalizado por FadB en E. coli y homólogos en otros microorganismos; finalmente esto se tioliza para dar acil-CoA y acetil-CoA mediante la 3-cetoacil-CoA tiolasa, catalizado por FadA en E. coli y homólogos en otros microorganismos. Una cepa que se altera selectivamente en la actividad (S)-3-hidroxi-acil-CoA deshidrogenasa de beta oxidación, por ejemplo, mediante una mutación de histidina 450 en la FadB de E. coli (o un homólogo funcional en o procedente de un microorganismo diferente), acumularía (S)-3-hidroxi-acil CoA cuando se proporcionara un ácido graso libre (rutas 6 y 7 en la figura 11). La histidina 450 es el residuo catalítico de la L-3-hidroxiacil Coenzima A deshidrogenasa asociada con la subunidad a grande del complejo multienzimático de la oxidación de ácidos grasos a partir de E. coli (véase He et al. (1996) Biochemistry 35(29):9625-9630). La (S)-3-hidroxi-acil CoA podría convertirse entonces en (S)-1,3-diol graso a través de la acción de polipéptidos de formación de alcoholes grasos, tales como los descritos en las rutas 1-5 en la figura 11. El ácido graso libre podría proporcionarse a la célula de manera externa (ruta 7 en la figura 11) o podría generarse dentro de la célula, por ejemplo mediante la hidrólisis de una acil-ACP mediante una tioesterasa (ruta 6 en la figura 11). En una realización, el producto intermedio de acil CoA en las reacciones anteriores se elonga para dar 3-cetoacil-CoA mediante la 3-cetoacil-CoA tiolasa (véase la ruta 8 en la figura 11), catalizado por FadA en E. coli y homólogos en otros microorganismos; esto se reduce entonces mediante mutantes de FadB que se alteran selectivamente en su actividad hidratasa/deshidratasa (por ejemplo, mediante una mutación de Glu 119 en E. coli FadB (o su homólogo en enzimas relacionadas). Esto podría dar como resultado la acumulación de (S)-3-hidroxilacil-CoA, que entonces podría convertirse en (S)-1,3-dioles grasos mediante polipéptidos de formación de dioles grasos tales como los mostrados en las rutas 1-5 en la figura 11. El glutamato-119 de la subunidad alfa grande es la base catalítica en la hidratación de 2-trans-enoil-coenzima A catalizado por el complejo multienzimático de la oxidación de ácidos grasos de E. coli (véase He et al. (1997) Biochemistry 36(36): 11044-11049). El glutamato 139 de la subunidad alfa grande es la base catalítica en la deshidratación tanto de D- como de L-3-hidroxiacil-coenzima A, pero no en la isomerización de delta 3, delta 2-enoilcoenzima A catalizado por el complejo multienzimático de la oxidación de ácidos grasos de E. coli (véase Yang et al. (1995) Biochemistry 34(19):6441-6447). En otra realización, el producto intermedio de acil-CoA en las reacciones anteriores se elonga para dar 3-cetoacil CoA mediante la 3-cetoacil CoA tiolasa, catalizado por FadA en E. coli y homólogos en otros microorganismos, esto se reduce entonces mediante (S)-3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasas (por ejemplo, a partir de la EC 1.1.1.35) (ruta 8, figura 11). Esto daría como resultado la acumulación de (S)-3 hidroxilacil CoA, que entonces se convertiría en (S)-1,3-dioles grasos mediante polipéptidos de formación de dioles grasos tales como los mostrados en las rutas 1-5 en la figura 11.

Con el fin de modificar por ingeniería genética células huésped para expresar determinadas funcionalidades enzimáticas (véase la tabla 1, a continuación) puede realizarse modificación genética en las células huésped. En algunas realizaciones, se proporciona una secuencia de polinucleótido (o gen) a la célula huésped a modo de un vector recombinante, que incluye un promotor asociado operativamente a la secuencia de polinucleótido. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor regulado por el desarrollo, uno específico de orgánulo, uno específico de tejido, uno inducible, uno constitutivo o uno específico de célula. En algunas realizaciones, el vector recombinante incluye al menos una secuencia seleccionada de una secuencia de control de la expresión acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; un marcador de selección acoplado operativamente a la secuencia de polinucleótido; una secuencia de marcador acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; un resto de purificación acoplado operativamente a la secuencia de polinucleótido; una secuencia de secreción acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; y una secuencia de selección como diana acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido. Los vectores de expresión descritos en el presente documento incluyen una secuencia de polinucleótido en una forma adecuada para la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula huésped. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va transformarse, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión descritos en el presente documento pueden introducirse en células huésped para producir polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión, codificados por las secuencias de polinucleótido tal como se describió anteriormente. La expresión de genes que codifican para polipéptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, se lleva a cabo con la mayor frecuencia con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de polipéptidos o bien de fusión o bien de no fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a un polipéptido codificado en los mismos, habitualmente al extremo amino terminal o carboxilo terminal del polipéptido recombinante. Tales vectores de fusión sirven normalmente para uno o más de los tres propósitos siguientes incluyendo aumentar la expresión del polipéptido recombinante; aumentar la solubilidad del polipéptido recombinante; y ayudar en la purificación del polipéptido recombinante actuando como ligando en purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y el polipéptido recombinante. Esto permite la separación del polipéptido recombinante del resto de fusión después de la purificación del polipéptido de fusión. Los ejemplos de tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión a modo de ejemplo incluyen el vector pGEX (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; Smith et al. (1988) Gene 67:31-40), pMAL vector (New England Biolabs, Beverly, MA), y el vector pRITS (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N.J.), que fusionan la glutatión S-transferasa (GST), la proteína de unión a maltosa E, o la proteína A, respectivamente, al polipéptido recombinante diana.

Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli de no fusión, inducibles incluyen el vector pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) y el vector pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). La expresión del gen diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripción por la ARN polimerasa del huésped a partir de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión del gen diana a partir del vector pET 11d se basa en la transcripción a partir de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediada por una ARN polimerasa viral coexpresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral la suministran cepas huésped BL21(DE3) o HMS174(DE3) a partir de un profago X residente que alberga un gen de T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5. Se conocen bien en la técnica sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas; (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory). Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli de no fusión, inducibles incluyen el vector pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315)) y el vector PET 11d (Studier et al. (1990), Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, págs. 60-89). En determinadas realizaciones, una secuencia de polinucleótido de la divulgación está operativamente unida a un promotor derivado del bacteriófago T5. En una realización, la célula huésped es una célula de levadura. En esta realización, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Pueden introducirse vectores en células procariotas o eucariotas por medio de una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped en, por ejemplo, Sambrook et al. (citado anteriormente). Para la transformación estable de células bacterianas, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transformación usados, sólo una pequeña fracción de células captará y replicará el vector de expresión. Con el fin de identificar y seleccionar estos transformantes, puede introducirse un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a un antibiótico) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables incluyen los que confieren resistencia a fármacos tales como, pero sin limitarse a, ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Pueden introducirse ácidos nucleicos que codifican para un marcador seleccionable en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento o pueden introducirse en un vector independiente. Las células transformadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante crecimiento en presencia de un fármaco de selección apropiado. La célula huésped modificada por ingeniería genética o recombinante tal como se describe en el presente documento es una célula usada para producir una composición de derivado de ácido graso tal como una composición de diol graso. La célula huésped puede seleccionarse de una planta eucariota, bacterias, algas, cianobacteria, bacteria verde del azufre, bacteria verde no del azufre, bacteria púrpura del azufre, bacteria púrpura no del azufre, extremófilo, levadura, hongo, organismo modificado por ingeniería genética de los mismos, o un organismo sintético. En algunas realizaciones, la célula huésped depende de la luz o fija carbono. En algunas realizaciones, la célula huésped tiene actividad autótrofa. Pueden usarse diversas células huésped para producir dioles grasos, tal como se describe en el presente documento.

Las células huésped o microorganismos de la divulgación incluyen cepas huésped o células huésped que pueden modificarse genéticamente por ingeniería genética o modificarse para contener alteraciones con el fin de someter a prueba la eficacia de actividades enzimáticas específicas. Pueden usarse diversas manipulaciones y alteraciones genéticas opcionales de manera intercambiable de una célula huésped a otra, dependiendo de qué rutas enzimáticas nativas estén presentes en la célula huésped original. Una cepa huésped puede englobar varias alteraciones genéticas con el fin de someter a prueba variables específicas, incluyendo pero sin limitarse a, condiciones de cultivo incluyendo componentes de fermentación, fuente de carbono (por ejemplo, materia prima), temperatura, presión, condiciones de contaminación de cultivo reducidas, y niveles de oxígeno.

En una realización, una cepa huésped engloba una atenuación o deleción opcional de una o más enzimas implicadas en la beta-oxidación de ácidos grasos y/o sitios de unión a fagos. Estas modificaciones genéticas están diseñadas para disminuir la degradación intracelular de los ácidos grasos y para aumentar la resistencia a bacteriófagos. En una realización, la cepa huésped es E. coli y la modificación genética es una atenuación o deleción de fadE y/o fhuA. La acil-CoA deshidrogenasa (FadE en E. coli) es una enzima que es importante para metabolizar ácidos grasos. Cataliza la segunda etapa en la degradación de ácidos grasos (beta-oxidación), que es el procedimiento de metabolización de tioésteres de ácidos grasos (acil-CoA) para dar moléculas de acetil-CoA y NAD(P)H. Más específicamente, la segunda etapa del ciclo de p-oxidación de la degradación de ácidos grasos en bacterias es la oxidación de la acil-CoA para dar 2-enoil-CoA, que está catalizada por FadE. Cuando E. coli u otra bacteria carece o presenta atenuación en FadE o acil graso CoA deshidrogenasa, crecen escasamente o no crecen en absoluto en ácidos grasos como fuente de carbono. La incapacidad para utilizar ácidos grasos de cualquier longitud de cadena concuerda con el fenotipo notificado de las cepas fadE, es decir, cepas mutantes fadE donde la función de FadE está alterada. El gen fadE puede estar opcionalmente desactivado o atenuado para garantizar que los acil-CoA, que pueden ser productos intermedios en una ruta de derivado de ácido graso, puedan acumularse en la célula, de manera que todos los acil-CoA puedan convertirse eficazmente en derivados de ácidos grasos. Sin embargo, la atenuación de fadE puede ser opcional cuando se usa azúcar como fuente de carbono en condiciones no limitativas, puesto que en tal condición, la expresión de FadE puede estar reprimida y por tanto FadE sólo puede estar presente en pequeñas cantidades y no puede competir eficazmente con la éster sintasa u otras enzimas por sustratos de acil-CoA. En estas circunstancias, podría considerarse que FadE está reprimida debido a la represión del catabolito. E. coli y muchos otros microbios prefieren consumir azúcar con respecto a ácidos grasos, por lo que cuando ambas fuentes están disponibles, se esperará que el azúcar se consuma primero, como resultado de la represión del regulón fad (véase D. Clark, J Bacteriol. (1981) 148(2):521-6). Además, la ausencia de azúcares y la presencia de ácidos grasos induce la expresión de FadE. Los productos intermedios de acil-CoA podrían perderse para la ruta de beta-oxidación, puesto que las proteínas expresadas por el regulón fad (incluyendo FadE) estarían reguladas por incremento y competirían eficazmente por las acil-CoA. Por tanto, puede ser beneficioso tener el gen fadE desactivado o atenuado. Puesto que las fuentes de carbono pueden basarse en azúcar, es opcional para atenuar FadE.

Por ejemplo, en E. coli, puede delecionarse cualquiera del gen fadE (que codifica para acil-CoA deshidrogenasa) o el gen fadD (que codifica para acil-CoA sintetasa). Tales cepas no pueden degradar ácidos grasos o solo muy escasamente, por tanto, por lo que se aumenta la disponibilidad de ácidos grasos dentro de la célula. Tales ácidos grasos se hacen disponibles entonces para una conversión aumentada a producto, tal como derivados de ácidos grasos. Los ácidos grasos también pueden estar disponibles delecionando otras enzimas de degradación de ácidos grasos, tales como fadA o fadB. La deleción de cualquiera de estos genes es opcional y puede implementarse cuando los ácidos grasos libres se suministran de manera exógena o son productos intermedios de una ruta de producto. La tabla 1 (a continuación) proporciona una lista completa de actividad enzimática dentro de las rutas metabólicas, incluyendo diversas enzimas de degradación de ácidos grasos que pueden atenuarse para aumentar la disponibilidad de los ácidos grasos en una cepa huésped.

En E. coli, el gen fhuA codifica para la proteína TonA, que es un transportador y receptor con acoplamiento de energía en la membrana externa de E. coli (V. Braun (2009) J Bacteriol. 191(11 ):3431 -3436). Su deleción es opcional. La deleción de fhuA permite que la célula se vuelva más resistente al ataque de fagos, lo que puede ser perjudicial en fermentaciones comerciales. Por tanto, puede ser deseable delecionar fhuA en una célula huésped que se somete probablemente a contaminación potencial durante series de fermentación. De manera similar, las proteínas homólogas en otros organismos así como otros sitios de unión a fago son posibles candidatos para deleción para mejorar la resistencia a fagos.

En otra realización, la cepa huésped (anteriormente) también engloba sobreexpresión opcional de uno o más de los siguientes genes, incluyendo fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, fabV y/o fabF. Ejemplos de tales genes son fadR de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (NP_460164), fabG de Salmonella typhimurium (NP_460165), fabH de Salmonella typhimurium (NP_460163), fabV de Vibrio cholerae (YP_001217283) y fabF de Clostridium acetobutilicum (NP_350156). La sobreexpresión de uno o más de estos genes, que codifican para enzimas y reguladores de la biosíntesis de ácidos grasos, puede servir para aumentar el título de productos intermedios derivados de ácidos grasos incluyendo aldehídos grasos, así como productos finales tales como dioles grasos en diversas condiciones de cultivo.

En una realización, se usan cepas de E. coli como células huésped para la producción de dioles grasos (es decir 1,3-dioles grasos que tienen una longitud de cadena de al menos 5 átomos de carbono). Estas células huésped pueden incluir sobreexpresión opcional de uno o más genes de biosíntesis (es decir, genes que codifican para enzimas y reguladores de la biosíntesis de ácidos grasos) que pueden aumentar o potenciar adicionalmente el título de compuestos derivados de ácidos grasos, tales como productos intermedios (por ejemplo, aldehídos grasos) y productos finales (por ejemplo, dioles grasos, alcoholes grasos) derivados de ácidos grasos en diversas condiciones de cultivo incluyendo, pero sin limitarse a, fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, fabV y/o fabF. Los ejemplos de alteraciones genéticas incluyen fadR de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (N^p_460164), fabG de Salmonella typhimurium (NP_460165), fabH de Salmonella typhimurium (NP_460163), fabV de Vibrio cholerae (YP_001217283) y fabF de Clostridium acetobutilicum (NP_350156). En algunas realizaciones, pueden modificarse por ingeniería genética operones sintéticos que portan estos genes biosintéticos y expresarse en células con el fin de someter a prueba la sobreexpresión de productos intermedios derivados de ácidos grasos en diversas condiciones de cultivo y/o potenciar adicionalmente la producción de dioles grasos. Tales operones sintéticos contienen uno o más genes biosintéticos. El operón ifab138, por ejemplo, es un operón modificado por ingeniería genética que contiene genes biosintéticos de ácidos grasos opcionales, incluyendo fabV de Vibrio cholerae, fabH de Salmonella typhimurium, fabD de S. typhimurium, fabG de S. typhimurium, fabA de S. typhimurium y/o fabF de Clostridium acetobutilicum que pueden usarse para facilitar la sobreexpresión de derivados y productos intermedios de ácidos grasos con el fin de someter a prueba condiciones de cultivo específicas. Una ventaja de tales operones sintéticos es que la tasa de producción de derivados de ácidos grasos (por ejemplo, ácidos grasos, aldehídos grasos, alcoholes grasos, dioles grasos, etc.) puede aumentarse o potenciarse adicionalmente en células que los contienen.

Las células huésped o microorganismos que se usan para producir tioésteres de acilo (tales como acil-CoA o acil-ACP) y enzimas biosintéticas (por ejemplo, TE, CAR, AR, ^aD^h, ACC, AAR, FAR, ACR; véanse también las figuras 1 y 3 así como las figuras 8-11) expresarán además genes que engloban determinadas actividades enzimáticas que pueden aumentar la producción para uno o más derivados de ácidos grasos particulares tales como ácidos grasos, 3-hidroxiácidos grasos, alcoholes grasos, 1,3-dioles grasos, aldehídos grasos, 3-hidroxialdehídos grasos, y similares. La célula huésped tiene actividad tioesterasa (TE) (EC 3.1.2.- o EC 3.1.2.14 o EC 3.1.1.5) para la producción de ácidos grasos y 3-hidroxiácidos grasos que puede aumentarse mediante la sobreexpresión del gen. En otro aspecto, la célula huésped tiene una actividad tioesterasa (TE) (EC 3.1.2.- o EC 3.1.2.14 o EC 3.1.1.5) y ácido carboxílico reductasa (CAR) (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42 o EC 1.2.99.6) para la producción de aldehídos grasos y/o 3-hidroxialdehídos grasos. En un aspecto, la célula huésped tiene una actividad tioesterasa (TE) (EC 3.1.2.- o EC 3.1.2.14 o EC 3.1.1.5) y actividad ácido carboxílico reductasa (CAR) (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42 o EC 1.2.99.6) y actividad alcohol deshidrogenasa (ADH)/aldehído reductasa (AR) (EC 1.1.1.-) para la producción de alcoholes grasos y/o dioles grasos. En un aspecto, la célula huésped tiene actividad acil-ACP reductasa (AAR) (EC 1.2.1.80 o EC 1.2.1.42) para la producción de aldehídos grasos y/o 3-hidroxialdehídos grasos. En otro aspecto, la célula huésped tiene actividad acil-ACP reductasa (AAR) (EC 1.2.1.80 o EC 1.2.1.42) y actividad alcohol deshidrogenasa (ADH)/aldehído reductasa (AR) (EC 1.1.1.-) para la producción de alcoholes grasos y/o dioles grasos. La combinación de genes puede sobreexpresarse o subexpresarse modificando por ingeniería genética microbios en consecuencia. En una realización, uno o más de los genes sobreexpresados son endógenos. En otra realización, uno o más de los genes sobreexpresados son exógenos.

En aspectos alternativos, la célula huésped tiene actividad acil-ACP reductasa (AAR) (EC 1.2.1.80 o EC 1.2.1.42) y/o actividad acil-ACP/acil CoA reductasa (AAR/ACR) (EC 1.2.1.80 o EC 1.2.1.42 o EC 1.2.1.50) y/o actividad alcohol deshidrogenasa (E.C. 1,1.-.-.) y/o actividad acil-CoA/Acil-ACP reductasa de formación de alcohol graso (FAR) (EC 1.1.1.-) y/o actividad ácido carboxílico reductasa (CAR) (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42 o EC 1.2.99.6) y/o actividad tioesterasa (TE) (EC 3.1.2.- o EC 3.1.2.14 o EC 3.1.1.5) para la producción de alcoholes grasos. En otros aspectos alternativos, la célula huésped tiene actividad acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50) y actividad acil-CoA sintasa (FadD) (EC 2.3.1.86) y actividad tioesterasa (TE) (EC 3.1.2.- o EC 3.1.2.14 o EC 3.1.1.5) para la producción de alcoholes grasos. La expresión de estas actividades enzimáticas alternativas en microorganismos y células microbianas se enseña en las patentes estadounidenses números 8.097.439; 8.110.093; 8.110.670; 8.183.028; 8.268.599; 8.283.143; 8.232.924; 8.372.610; y 8.530.221. En otros aspectos, las células huésped o microorganismos que se usan para producir acil-ACP y/o acil-CoA y otras enzimas biosintéticas incluirán determinadas actividades enzimáticas nativas que están reguladas por incremento o sobreexpresadas con el fin de producir uno o más derivados de ácidos grasos particulares, tales como un aldehído graso y/o alcohol graso y/o diol graso. En un aspecto, la célula huésped tiene una actividad tioesterasa (TE) nativa para la producción de ácidos grasos que puede aumentarse mediante la sobreexpresión del gen de tioesterasa.

La presente divulgación da a conocer cepas huésped o microorganismos que expresan genes que codifican para enzimas biosintéticas (anteriormente). Las células huésped recombinantes producen productos intermedios derivados de ácidos grasos tales como aldehídos grasos y productos finales derivados de ácidos grasos tales como alcoholes grasos y/o dioles grasos y composiciones y combinaciones de los mismos. Los productos finales derivados de ácidos grasos normalmente se recubren del medio de cultivo y/o se aíslan de las células huésped. En una realización de la invención, los 1,3-dioles grasos se recubren del medio de cultivo (extracelular). En otra realización, los 1,3-dioles grasos se aíslan de las células huésped (intracelular). En otra realización, los 1,3-dioles grasos se recuperan del medio de cultivo y se aíslan de las células huésped. En otra realización, los dioles grasos y/o alcoholes grasos son extracelulares y se asocian con las células huésped y se aíslan de las células huésped. La composición de diol graso producida por una célula huésped puede analizarse usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, CG-FID, con el fin de determinar la distribución de dioles grasos particulares, así como las longitudes de cadena y el grado de saturación de los componentes de las composiciones de diol graso.

Los ejemplos de células huésped que funcionan como microorganismos (por ejemplo, células microbianas), incluyen pero no se limitan a, células del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Synechococcus, Synechocystis, Lactococcus, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana Gram positiva. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana Gram negativa. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de E. coli. En alguna realización, la célula huésped es una célula de E. coli B, una célula de E. coli C, una célula de E. coli K o una célula de E. coli W. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus lichenoformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis o una célula de Bacillus amiloliquefaciens. Todavía en otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhodococcus opacus, una célula de Rhizomucor miehei o una célula de Mucor michei. Aún en otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Streptomyces lividans o una célula de Streptomyces murinus. Aún en otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Actinomycetes. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de Saccharomyces cerevisiae. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de una planta eucariota, algas, cianobacteria, bacteria verde del azufre, bacteria verde no del azufre, bacteria púrpura del azufre, bacteria púrpura no del azufre, extremófilo, levadura, hongo, un organismo modificado por ingeniería genética de los mismos, o un organismo sintético. En algunas realizaciones, la célula huésped depende de la luz o fija carbono. En algunas realizaciones, la célula huésped tiene actividad autótrofa. En algunas realizaciones, la célula huésped tiene actividad fotoautótrofa, tal como en presencia de luz. En algunas realizaciones, la célula huésped es heterótrofa o mixótrofa en ausencia de luz. En determinadas realizaciones, la célula huésped es una célula de Arabidopsis thaliana, Panicum virgatum, Miscanthus giganteus, Zea mays, Botryococcuse braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliela salina, Synechococcus sp. PCC 7002, Synechococcus sp. PCC 7942, Synechocystis sp. PCC 6803, Thermosynechococcus elongates BP-1, Clorobium tepidum, Clorojlexus auranticus, Chromatium vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palusris, Clostridium ljungdahlii, Clostridium thermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida o Zymomonas mobilis. En una realización particular, la célula microbiana es de una cianobacteria incluyendo, pero sin limitarse a, Proclorococcus, Synechococcus, Synechocystis, Cianothece y Nostoc punctiforme. En otra realización, la célula microbiana es de una especie cianobacteriana específica incluyendo, pero sin limitarse a, Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803 y Synechococcus sp. PCC7001.

Células huésped recombinantes modificadas por ingeniería genética para producir 1,3-dioles

La presente divulgación identifica polinucleótidos que codifican para polipéptidos de función enzimática con el fin de modificar rutas enzimáticas para la producción de compuestos deseables tales como dioles grasos (por ejemplo, 1,3-dioles). Estos polipéptidos, que se identifican en el presente documento mediante números de registro de enzimas (números de EC, véase la tabla 1, a continuación), son útiles para modificar por ingeniería genética rutas de ácidos grasos que conducen a la producción de dioles grasos. Más específicamente, las figuras 1-3 y 8-11 representan rutas que se modifican por ingeniería genética para producir 1,3-dioles. Tal como se muestra, una proteína transportadora de 3'-hidroxi-acilo (ACP) que transporta un producto intermedio de acilo (acil-ACP o 3-hidroxi-acil-ACP) puede convertirse en un 1,3-diol, empleando un 3'-hidroxi-ácido graso (3' OH FA) y un 3'-hidroxi-aldehído graso (3' OH aldehído graso) como productos intermedios. En una realización, en la figuras 1-3 y 8-11 se representan rutas modificadas por ingeniería genética que producen 1,3-dioles. En el presente documento, una fuente de carbono simple tal como glucosa se convierte en primer lugar en una 3'-hidroxi-acil-ACP mediante el organismo microbiano (por ejemplo, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Synechococcus, Synechoystis, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces). En algunas realizaciones, la acil-ACP o 3'-hidroxi-acil-ACP universal y altamente conservada se produce mediante la ruta nativa del organismo microbiano. En una realización, la 3'-hidroxi-acil-ACP puede usarse para iniciar la ruta modificada por ingeniería genética. Por ejemplo, la 3'-hidroxi-acil-ACP pueden convertirse en un producto intermedio tal como 3' OH FA mediante una enzima que tiene actividad tioesterasa (TE) (véase la tabla 2, a continuación). El producto intermedio 3' OH FA puede convertirse entonces en otro producto intermedio tal como 3' OH aldehído mediante una enzima que tiene actividad ácido carboxílico reductasa (CAR) (véase la tabla 3, a continuación). Una enzima que tiene actividad alcohol deshidrogenasa (ADH) o aldehído reductasa (AR) (véase la tabla 4, a continuación) puede convertir el 3' OH aldehído en un 1,3-diol. Con el fin de ilustrar adicionalmente una ruta de este tipo, la figura 2 proporciona ejemplos de enzimas específicas que tienen la actividad tioesterasa (por ejemplo, fatB1, tesA, phaG); la actividad CAR (por ejemplo, carB); y la actividad ADH/AR (por ejemplo, alrA). En la tabla 2 se muestran ejemplos adicionales de enzimas tioesterasa (TE) que pueden llevar a cabo la reacción de convertir una 3'OH acil-ACP en un 3' OH FA. En una realización, los genes que codifican para estas tioesterasas son tesA, tesB, fatB, fatB1, fatB2, fatB3, TE_EEI82564, TE_CAD63310 y phaG. En otra realización, los genes que codifican para estas tioesterasas son TE_EEI82564 y/o TE_CAD63310, que no se han asociado previamente con la capacidad para convertir 3' OH acil -ACP en 3' OH FA (por ejemplo, véase Jing et al. (2011) BMC Biochemistry 12(44):1471-2091). En la tabla 3 se muestran ejemplos adicionales de enzimas CAR que pueden llevar a cabo la reacción de convertir un 3' OH FA en un 3' OH aldehído. En una realización, el gen que codifica para la enzima CAR es carB. En la tabla 4 se muestran ejemplos adicionales de enzimas ADH/AR que pueden llevar a cabo la reacción de convertir un 3' OH aldehido en un 1,3-diol. En una realización, los genes que codifican para estas enzimas ADH/AR son alrA y/o yqhD.

En otra realización, en la figura 3 se representa una ruta modificada por ingeniería genética que también produce 1,3-dioles. De manera similar, una fuente de carbono simple tal como glucosa se convierte en primer lugar en una 3' hidroxi-acil-ACP mediante el organismo microbiano (por ejemplo, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Synechococcus, Synechoystis, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces). En algunas realizaciones, la 3' hidroxi-acil-ACP universal y altamente conservada se produce mediante la ruta nativa del organismo microbiano. Tal como se indicó anteriormente, la 3' hidroxi-acil-ACP puede usarse para iniciar la ruta modificada por ingeniería genética. Por ejemplo, la 3' hidroxi-acil-ACP se convierte en un producto intermedio tal como 3' OH aldehído graso mediante una enzima que tiene actividad acil-ACP reductasa (A^aR) (véase la tabla 1). La producción de alcoholes grasos y/o aldehídos grasos mediante AAR puede potenciarse a través de la expresión heteróloga de un gen denominado accABCD que codifica para una acetil-CoA carboxilasa. Los ejemplos de enzimas AAR que pueden llevar a cabo la reacción de convertir una 3'OH acil-ACP en un 3' OH aldehído incluyen, pero no se limitan a, una enzima de Synechococcus elongatus, Cianothece sp., Synechosystis sp. y Proclorococcus marinus. Una enzima que tiene actividad alcohol deshidrogenasa (ADH) o aldehído reductasa (AR) (véase la tabla 4) puede convertir entonces el 3' OH aldehído en un diol graso tal como 1,3-diol. Por tanto, la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, proporciona microorganismos recombinantes que pueden producir de manera eficaz y selectiva 1,3-dioles in vivo. Debe indicarse que la mayoría de las células producen de manera nativa enzimas que pueden reducir aldehídos, ya que pueden ser citotóxicos. Por consiguiente, puede no requerirse la expresión heteróloga de AR y ADH para la producción de dioles y alcoholes grasos, pero pueden mejorar la eficacia con la que se producen alcoholes grasos y dioles.

Además, pueden atenuarse opcionalmente en las células huésped polinucleótidos que codifican para polipéptidos con actividad enzimática de degradación de ácidos grasos. Ejemplos no limitativos de tales polipéptidos son acil-CoA sintetasa (tal como E. coli FadD) y acil-CoA deshidrogenasa (tal como E. coli FadE). La tabla 1 proporciona una lista completa de actividades enzimáticas en rutas metabólicas a modo de ejemplo, incluyendo diversas enzimas de degradación de ácidos grasos que pueden atenuarse opcionalmente según métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.283.143, anteriormente). Por ejemplo, FadR (véase la tabla 1) es un factor regulador clave implicado en la degradación de ácidos grasos y las rutas biosintéticas de ácidos grasos en E. coli (Cronan et al., Mol. Microbiol., 29(4): 937-943 (1998)). La enzima FadD de E. coli (véase la tabla 1) y la proteína transportadora de ácidos grasos FadL son componentes de un sistema de captación de ácidos grasos. FadL y sus homólogos median el transporte de ácidos grasos al interior de la célula bacteriana, y FadD y sus homólogos median la formación de ésteres de acil-CoA. Como alternativa, el sistema de captación heterólogo para ácidos grasos y derivados de ácidos grasos es la proteína AlkL de membrana externa de Pseudomonas (Julsing et al. (2012) Appl. Environ. Microbiol. 78:5724-5733). Cuando no está disponible otra fuente de carbono, las bacterias captan ácidos grasos exógenos y los convierten en ésteres de acil-CoA, que pueden unirse al factor de transcripción FadR y reducir la expresión de los genes fad que codifican para proteínas responsables del transporte de (FadL), la activación (FadD) y la p-oxidación (FadA, FadB y FadE) de ácidos grasos. Cuando se dispone de fuentes de carbono alternativas, las bacterias sintetizan ácidos grasos como acil-ACP, que se usan para la síntesis de fosfolípidos, pero no son sustratos para la p-oxidación. Por tanto, acil-CoA y acil-ACP son ambas fuentes independientes de ácidos grasos que pueden dar como resultado diferentes productos finales (Caviglia et al., J. Biol. Chem., 279(12): 1163-1169 (2004)). FadR y/o FabB y sus homólogos funcionales pueden potenciar la producción de derivados de ácidos grasos en células huésped (por ejemplo, E. coli) pero su sobreexpresión es opcional. En el presente documento, se contempla que la sobreexpresión de FabB puede aumentar la tasa de elongación (síntesis de cadenas de ácidos grasos), y la sobreexpresión de FadR puede aumentar la expresión de FabA y FabB. Esto último es posible porque se contempla que FadR sea un regulador positivo de FabA y FabB.

Tabla 1: Actividades enzimáticas

Tabla 2: Actividad tioesterasa

Tabla 3: Actividad ácido carboxílico reductasa (CAR)

Tabla 4: Actividad alcohol deshidrogenasa (ADH) o aldehído reductasa (AR)

La divulgación identifica polinucleótidos que codifican para polipéptidos con actividad enzimática que son útiles en las células huésped recombinantes y los métodos de producción. Los polipéptidos con actividad enzimática contribuyen a la producción de composiciones que incluyen los compuestos de diol graso. Generalmente se reconocerá que no es necesaria la identidad de secuencia absoluta con tales polinucleótidos. Por ejemplo, pueden realizarse cambios en una secuencia de polinucleótido particular (por ejemplo, un polinucleótido que codifica para un polipéptido con función enzimática) y puede seleccionarse el polipéptido codificado por su actividad. Tales cambios normalmente comprenden mutaciones conservativas y mutaciones silenciosas (por ejemplo, optimización de codones). Los polinucleótidos modificados o modificados genéticamente por ingeniería genética y los polipéptidos variantes codificados pueden seleccionarse para una función deseada, incluyendo pero sin limitarse a, actividad catalítica aumentada, estabilidad aumentada o inhibición disminuida (por ejemplo, inhibición de realimentación disminuida), usando métodos conocidos en la técnica.

Además, la divulgación identifica actividades enzimáticas implicadas en diversas etapas (es decir, reacciones) de rutas modificadas por ingeniería genética implicadas en la producción de dioles grasos, tal como se describe en el presente documento (anteriormente) según el número de clasificación de enzimas (EC), y proporciona polipéptidos a modo de ejemplo (por ejemplo, enzimas) clasificadas por tales números de EC, y polinucleótidos a modo de ejemplo que codifican para tales polipéptidos. Tales polipéptidos y polinucleótidos a modo de ejemplo, que se identifican en el presente documento por los números de registro y/o números de identificación de secuencia (SEQ ID NO), son útiles para rutas de ácidos grasos modificadas por ingeniería genética que conducen a la producción de dioles grasos incluyendo 1,3-dioles grasos en células huésped parentales para obtener las células huésped recombinantes o modificadas genéticamente descritas en el presente documento. Los polipéptidos y polinucleótidos descritos en el presente documento son a modo de ejemplo y no limitativos. Las secuencias de homólogos de polipéptidos a modo de ejemplo descritos en el presente documento están disponibles para los expertos en la técnica a través de diversas bases de datos (por ejemplo, la bases de datos Entrez proporcionadas por el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI), las bases de datos ExPasy proporcionadas por el Instituto Suizo de Bioinformática, la base de datos BRENDA proporcionada por la Universidad Técnica de Braunschweig, y la base de datos KEGG proporcionada por el Centro de Bioinformática de la Universidad de Kioto y la Universidad de Tokio, estando todas ellas disponibles en la red informática mundial).

Fermentación y producción de dioles grasos

Tal como se usa en el presente documento, fermentación se refiere de manera amplia a la conversión de materiales orgánicos en sustancias objetivo mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, esto incluye la conversión de una fuente de carbono mediante células huésped recombinantes en derivados de ácidos grasos tales como dioles grasos mediante propagación de un cultivo de las células huésped recombinantes en unos medios que comprenden la fuente de carbono. Las condiciones que permiten la producción de las sustancias objetivo tales como dioles grasos y/o alcoholes grasos son cualquier condición que permite que una célula huésped produzca un producto deseado, tal como una composición de dioles grasos. De manera similar, esto incluye cualquier condición en la que la secuencia de polinucleótido de un vector que se expresa en las células huésped permite que las células huésped sinteticen el polipéptido objetivo. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condiciones de fermentación típicas. Las condiciones de fermentación pueden incluir muchos parámetros, incluyendo, pero sin limitarse a, intervalos de temperatura, niveles de pH, niveles de aireación, tasas de alimentación y composición de medios. Cada de una de estas condiciones, de manera individual y en combinación, permite que la célula huésped crezca. La fermentación puede ser aeróbica, anaeróbica o variaciones de las mismas (tales como microaeróbica). Los medios de cultivo a modo de ejemplo incluyen caldos (líquido) o geles (sólido). Generalmente, el medio incluye una fuente de carbono (por ejemplo, una fuente de carbono simple derivada de una materia prima renovable) que puede metabolizarse directamente por una célula huésped. Además, pueden usarse enzimas en el medio para facilitar la movilización (por ejemplo, la despolimerización de almidón o celulosa para dar azúcares fermentables) y el posterior metabolismo de la fuente de carbono.

Para la producción a pequeña escala, las células huésped modificadas por ingeniería genética pueden hacerse crecer en lotes, por ejemplo, de aproximadamente 100 pl, 200 pl, 300 pl, 400 pl, 500 pl, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 15 ml, 25 ml, 50 ml, 75 ml, 100 ml, 500 ml, 1 l, 2 l, 5 l o 10 l; fermentarse; e inducirse para expresar secuencias de polinucleótido deseadas, tales como unos polinucleótidos que codifican para polipéptidos que tienen actividad enzimática específica (por ejemplo, actividad enzimática ^tE, CAR, ADH, FAR, ACR, ACC y/o AAR). Para la producción a gran escala, las células huésped modificadas por ingeniería genética pueden hacerse crecer en cultivos que tienen un volumen de lotes de aproximadamente 10 l, 100 l, 1000 l, 10.000 l, 100.000 l, 1.000.000 l o más; fermentarse; e inducirse para expresar cualquier secuencia de polinucleótido deseada. Las composiciones de dioles grasos descritas en el presente documento pueden encontrarse en el entorno extracelular del cultivo de células huésped recombinantes y pueden aislarse fácilmente del medio de cultivo. Un derivado de ácido graso tal como un diol graso y/o un alcohol graso puede secretarse por la célula huésped recombinante, transportarse al entorno extracelular o transferirse pasivamente al entorno extracelular del cultivo de células huésped recombinantes. La composición de dioles grasos puede aislarse de un cultivo de células huésped recombinantes usando métodos rutinarios conocidos en la técnica.

Con el fin de producir dioles grasos, se realizaron varias modificaciones a células huésped de producción (anteriormente). Por tanto, la divulgación proporciona células huésped recombinantes que se han modificado por ingeniería genética para proporcionar una ruta de biosíntesis con respecto a células huésped nativas o no modificadas por ingeniería genética (por ejemplo, células huésped silvestres que funcionan como células de control), lo cual se logra, por ejemplo, mediante mejoras de cepa específicas. Pueden usarse microorganismos tales como bacterias, cianobacterias, levadura, algas u hongos filamentosos como huéspedes de producción. Los ejemplos no limitativos de microorganismos que pueden usarse como huéspedes de producción incluyen E. coli, S. cerevisiae y otros. Las cepas microbianas convierten eficazmente glucosa u otras materias primas renovables en derivados de ácidos grasos, incluyendo alcoholes grasos y dioles grasos. Con el fin de lograr eso, se han modificado cuidadosamente las cepas por ingeniería genética para expresar enzimas clave con funcionalidades específicas. Se han establecido protocolos y procedimientos para fermentaciones de alta densidad para la producción de diversos compuestos (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 8.372.610; 8.323.924; 8.313.934; 8.283.143; 8.268.599; 8.183.028; 8.110.670; 8.110.093; y 8.097.439).

De manera notable, hasta ahora no existían métodos para producir de manera directa y eficaz dioles grasos, incluyendo 1,3-dioles a partir de glucosa u otras materias primas renovables. Sin embargo, estos dioles grasos encuentran uso como componentes para detergentes, tensioactivos, emulsionantes, emolientes, disolventes, plásticos y aditivos alimenticios. El método basado en fermentación para la producción de dioles grasos y composiciones de los mismos tal como se presenta en el presente documento proporciona una alternativa respetuosa con el medio ambiente a los métodos químicos empleados en la técnica. En algunas realizaciones, la célula huésped se cultiva en un medio de cultivo (por ejemplo, medio de fermentación) que comprende una concentración inicial de una fuente de carbono (por ejemplo, una fuente de carbono simple) de aproximadamente 20 g/l a aproximadamente 900 g/l. En otras realizaciones, el medio de cultivo comprende una concentración inicial de una fuente de carbono de aproximadamente 2 g/l a aproximadamente 10 g/l; de aproximadamente 10 g/l a aproximadamente 20 g/l; de aproximadamente 20 g/l a aproximadamente 30 g/l; de aproximadamente 30 g/l a aproximadamente 40 g/l; o de aproximadamente 40 g/l a aproximadamente 50 g/l. En algunas realizaciones, el nivel de fuente de carbono disponible en el medio de cultivo puede monitorizarse durante el avance de la fermentación. En algunas realizaciones, el método incluye además añadir una fuente de carbono complementaria al medio de cultivo cuando el nivel de la fuente de carbono inicial en el medio es de menos de aproximadamente 0,5 g/l. En algunas realizaciones, se añade una fuente de carbono complementaria al medio de cultivo cuando el nivel de la fuente de carbono en el medio es de menos de aproximadamente 0,4 g/l, menos de aproximadamente 0,3 g/l, menos de aproximadamente 0,2 g/l, o menos de aproximadamente 0,1 g/l. En algunas realizaciones, la fuente de carbono complementaria se añade para mantener un nivel de fuente de carbono de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 25 g/l. En algunas realizaciones, la fuente de carbono complementaria se añade para mantener un nivel de fuente de carbono de aproximadamente 2 g/l o más (por ejemplo, aproximadamente 2 g/l o más, aproximadamente 3 g/l o más, aproximadamente 4 g/l o más). En determinadas realizaciones, la fuente de carbono complementaria se añade para mantener un nivel de fuente de carbono de aproximadamente 5 g/l o menos (por ejemplo, aproximadamente 5 g/l o menos, aproximadamente 4 g/l o menos, aproximadamente 3 g/l o menos). En algunas realizaciones, la fuente de carbono complementaria se añade para mantener un nivel de fuente de carbono de aproximadamente 2 g/l a aproximadamente 5 g/l, de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 10 g/l, o de aproximadamente 10 g/l a aproximadamente 25 g/l.

En una realización la fuente de carbono para la fermentación se deriva de una materia prima renovable. En algunas realizaciones, la fuente de carbono es glucosa. En otras realizaciones, la fuente de carbono es glicerol. Otras fuentes de carbono posibles incluyen, pero no se limitan a, fructosa, manosa, galactosa, xilosa, arabinosa, almidón, celulosa, pectina, xilano, sacarosa, maltosa, celobiosa y turanosa; material celulósico y variantes tales como hemicelulosas, metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio; ácidos grasos saturados o insaturados, succinato, lactato y acetato; alcoholes, tales como etanol, metanol, y glicerol, o mezclas de los mismos. En una realización, la fuente de carbono se deriva de maíz, caña de azúcar, sorgo, remolacha, pasto varilla, ensilaje, paja, madera, pulpa, aguas residuales, basura, residuos urbanos celulósicos, gas de combustión, gas de síntesis o dióxido de carbono. La fuente de carbono simple también puede ser un producto de fotosíntesis, tal como glucosa o sacarosa. En una realización, la fuente de carbono se deriva de un producto residual tal como glicerol, gas de combustión o gas sintético; o de la reformación de materiales orgánicos tales como biomasa; o de gas natural o de metano, o de la reformación de estos materiales para dar gas de síntesis; o de dióxido de carbono que se fija por fotosíntesis, por ejemplo pueden producirse 1,3-dioles mediante cianobacterias recombinantes que crecen por fotosíntesis y usan

CO2 como fuente de carbono. En determinadas realizaciones, la fuente de carbono se deriva de biomasa. Una fuente de biomasa a modo de ejemplo es materia vegetal o vegetación, tal como maíz, caña de azúcar o pasto varilla. Otra fuente de biomasa a modo de ejemplo son productos residuales metabólicos, tales como materia animal

(por ejemplo, estiércol de vacas). Las fuentes de biomasa a modo de ejemplo adicionales incluyen algas y otras plantas marinas. La biomasa también incluye productos residuales de la industria, agricultura, explotación forestal y domésticos, incluyendo, pero sin limitarse a, residuos de fermentación, ensilaje, paja, madera, aguas residuales, basura, residuos urbanos celulósicos, residuos sólidos municipales, y restos de alimentos.

En algunas realizaciones, el diol graso (es decir 1,3-diol) se produce a una concentración de aproximadamente

0,5 g/l a aproximadamente 40 g/l. En algunas realizaciones, el diol graso se produce a una concentración de aproximadamente 1 g/l o más (por ejemplo, aproximadamente 1 g/l o más, aproximadamente 10 g/l o más, aproximadamente 20 g/l o más, aproximadamente 50 g/l o más, aproximadamente 100 g/l o más). En algunas realizaciones, el diol graso se produce a una concentración de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 170 g/l, de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 10 g/l, de aproximadamente 40 g/l a aproximadamente 170 g/l, de aproximadamente 100 g/l a aproximadamente 170 g/l, de aproximadamente 10 g/l a aproximadamente 100 g/l, de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 40 g/l, de aproximadamente 40 g/l a aproximadamente 100 g/l, o de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 100 g/l.

En algunas realizaciones, el 1,3-diol graso se produce a un título de aproximadamente 25 mg/l, aproximadamente

50 mg/l, aproximadamente 75 mg/l, aproximadamente 100 mg/l, aproximadamente 125 mg/l, aproximadamente

150 mg/l, aproximadamente 175 mg/l, aproximadamente 200 mg/l, aproximadamente 225 mg/l, aproximadamente

250 mg/l, aproximadamente 275 mg/l, aproximadamente 300 mg/l, aproximadamente 325 mg/l, aproximadamente

350 mg/l, aproximadamente 375 mg/l, aproximadamente 400 mg/l, aproximadamente 425 mg/l, aproximadamente

450 mg/l, aproximadamente 475 mg/l, aproximadamente 500 mg/l, aproximadamente 525 mg/l, aproximadamente

550 mg/l, aproximadamente 575 mg/l, aproximadamente 600 mg/l, aproximadamente 625 mg/l, aproximadamente

650 mg/l, aproximadamente 675 mg/l, aproximadamente 700 mg/l, aproximadamente 725 mg/l, aproximadamente

750 mg/l, aproximadamente 775 mg/l, aproximadamente 800 mg/l, aproximadamente 825 mg/l, aproximadamente

850 mg/l, aproximadamente 875 mg/l, aproximadamente 900 mg/l, aproximadamente 925 mg/l, aproximadamente

950 mg/l, aproximadamente 975 mg/l, aproximadamente 1000 mg/l, aproximadamente 1050 mg/l, aproximadamente

1075 mg/l, aproximadamente 1100 mg/l, aproximadamente 1125 mg/l, aproximadamente 1150 mg/l, aproximadamente 1175 mg/l, aproximadamente 1200 mg/l, aproximadamente 1225 mg/l, aproximadamente

1250 mg/l, aproximadamente 1275 mg/l, aproximadamente 1300 mg/l, aproximadamente 1325 mg/l, aproximadamente 1350 mg/l, aproximadamente 1375 mg/l, aproximadamente 1400 mg/l, aproximadamente

1425 mg/l, aproximadamente 1450 mg/l, aproximadamente 1475 mg/l, aproximadamente 1500 mg/l, aproximadamente 1525 mg/l, aproximadamente 1550 mg/l, aproximadamente 1575 mg/l, aproximadamente

1600 mg/l, aproximadamente 1625 mg/l, aproximadamente 1650 mg/l, aproximadamente 1675 mg/l, aproximadamente 1700 mg/l, aproximadamente 1725 mg/l, aproximadamente 1750 mg/l, aproximadamente

1775 mg/l, aproximadamente 1800 mg/l, aproximadamente 1825 mg/l, aproximadamente 1850 mg/l, aproximadamente 1875 mg/l, aproximadamente 1900 mg/l, aproximadamente 1925 mg/l, aproximadamente

1950 mg/l, aproximadamente 1975 mg/l, aproximadamente 2000 mg/l (2 g/l), 3 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l,

50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l o un intervalo limitado por dos cualesquiera de los valores anteriores. En otras realizaciones, un diol graso (por ejemplo, 1,3-diol) se produce a un título de más de 100 g/l, más de 200 g/l, más de 300 g/l, o superior, tal como 500 g/l, 700 g/l, 1000 g/l, 1200 g/l, 1500 g/l o 2000 g/l. Un título preferido de un diol graso tal como un 1,3-diol producido por una célula huésped recombinante según los métodos de la divulgación es de desde 5 g/l hasta 200 g/l, de 10 g/l a 150 g/l, de 20 g/l a 120 g/l y de 30 g/l a 100 g/l, de 100 g/l a 150 g/l, y de

120 g/l a 180 g/l. En una realización, el título de un 1,3-diol producido por una célula huésped recombinante según los métodos de la invención es de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 250 g/l y más particularmente de

90 g/l a aproximadamente 120 g/l. El título puede referirse a un 1,3-diol particular o a una combinación de 1,3-dioles de diferente longitud de cadena o diferentes funcionalidades producidos por un cultivo de células huésped recombinantes dado.

En otras realizaciones, las células huésped modificadas por ingeniería genética para producir un 1,3-diol según los métodos de la invención tienen un rendimiento de al menos el 1%, al menos el 2%, al menos el 3%, al menos el 4%, al menos el 5%, al menos el 6%, al menos el 7%, al menos el 8%, al menos el 9%, al menos el 10%, al menos el

11%, al menos el 12%, al menos el 13%, al menos el 14%, al menos el 15%, al menos el 16%, al menos el 17 menos el 18%, al menos el 19%, al menos 20 %, al menos el 21%, al menos el 22%, al menos el 23%, al menos el

24%, al menos el 25%, al menos el 26%, al menos el 27%, al menos el 28%, al menos el 29% o al menos el 30 al menos el 40% o un intervalo limitado por dos cualesquiera de los valores anteriores. En otras realizaciones, un

1,3-diol se produce a un rendimiento de más del 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o más.

Alternativamente, o de manera adicional, el rendimiento es de aproximadamente el 30% o menos, aproximadamente el 27% o menos, aproximadamente el 25% o menos, o aproximadamente el 22% o menos. Por tanto, el rendimiento puede estar limitado por dos cualesquiera de los puntos finales anteriores. Por ejemplo, el rendimiento de un 1,3-diol producido por la célula huésped recombinante según los métodos de la invención pueden ser del 5% al 15%, del

10% al 25%, del 10% al 22%, del 15% al 27%, del 18% al 22%, del 20% al 28% o del 20% al 30%. En una realización particular, el rendimiento de un 1,3-diol producido por la célula huésped recombinante es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 40%. En otra realización particular, el rendimiento de un 1,3-diol producido por la célula huésped recombinante es de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 30%. El rendimiento puede referirse a un 1,3-diol particular o a una combinación de 1,3-dioles producidos por un cultivo de células huésped recombinantes dado. Además, el rendimiento también dependerá de la materia prima usada.

En algunas realizaciones, la productividad de un 1,3-diol producido por una célula huésped recombinante es de al menos 100 mg/l/hora, al menos 200 mg/l/hora, al menos 300 mg/l/hora, al menos 400 mg/l/hora, al menos 500 mg/l/hora, al menos 600 mg/l/hora, al menos 700 mg/l/hora, al menos 800 mg/l/hora, al menos 900 mg/l/hora, al menos 1000 mg/l/hora, al menos 1100 mg/l/hora, al menos 1200 mg/l/hora, al menos 1300 mg/l/hora, al menos 1400 mg/l/hora, al menos 1500 mg/l/hora, al menos 1600 mg/l/hora, al menos 1700 mg/l/hora, al menos 1800 mg/l/hora, al menos 1900 mg/l/hora, al menos 2000 mg/l/hora, al menos 2100 mg/l/hora, al menos 2200 mg/l/hora, al menos 2300 mg/l/hora, al menos 2400 mg/l/hora o al menos 2500 mg/l/hora. Por ejemplo, la productividad de un 1,3-diol producido por una célula huésped recombinante según los métodos de la invención puede ser de desde 500 mg/l/hora hasta 2500 mg/l/hora o desde 700 mg/l/hora hasta 2000 mg/l/hora. En una realización particular, la productividad es de aproximadamente 0,7 mg/l/h a aproximadamente 3 g/l/h. La productividad puede referirse a un 1,3-diol particular producido por un cultivo de células huésped recombinantes dado.

En algunas realizaciones, la célula huésped usada en los procedimientos de fermentación de la invención es una célula de mamífero, célula vegetal, célula de insecto, célula de levadura, célula de hongo, célula de hongo filamentoso, una célula de alga, una célula de cianobacteria, y célula bacteriana. En realizaciones particulares, la célula huésped se selecciona de los géneros Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus, Rhodococcus, Synechococcus, Synechoystis, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus licheniformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis o una célula de Bacillus amiloliquefaciens. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Pseudomonas putida. En determinadas realizaciones, la célula huésped es Synechococcus sp. PCC7002, Synechococcus elongatus PCC 7942, Synechoystis sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC6301, Proclorococcus marinus CCMP1986 (MED4), Anabaena variabilis ATCC29413, Nostoc punctiforme ATCC29133 (PCC73102), Gloeobacter violaceus ATCC29082 (PCC7421), Nostoc sp. ATCC27893 (PCC7120), Cianothece sp. PCC7425 (29141), Cianothece sp. ATCC51442 o Synechococcus sp. ATCC27264 (PCC7002). En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhodococcus opacus, una célula de Rhizomucor miehei o una célula de Mucor michei. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Actinomycetes. En aún otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Streptomyces lividans o una célula de Streptomyces murinus. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Saccharomyces cerevisiae.

En aún otras realizaciones, la célula huésped es una célula de una planta eucariota, alga, cianobacteria, bacteria verde del azufre, bacteria verde no del azufre, bacteria púrpura del azufre, bacteria púrpura no del azufre, extremófilo, levadura, hongo, organismos modificados por ingeniería genética de los mismos o un organismo sintético. En determinadas realizaciones, la célula huésped es una célula de Arabidopsis thaliana, Panicum virgatums, Miscanthus giganteus, Zea mays, Botryococcuse braunii, Chalamydomonas reinhardtii, Dunaliela salina, Thermosynechococcus elongatus, Synechococcus elongatus, Synechococcus sp., Synechocystis sp., Clorobium tepidum, Cloroflexus auranticus, Chromatiumm vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palusris, Clostridium ljungdahlii, Clostridiuthermocellum o Pencillium chrysogenum. En determinadas otras realizaciones, la célula huésped es de Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolitica, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida o Zymomonas mobilis. En realizaciones aún adicionales, la célula huésped es una célula de Synechococcus sp. PCC 7002, Synechococcus sp. PCC 7942 o Synechocystis sp. PCC6803. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula CHO, una célula COS, una célula VERO, una célula BHK, una célula HeLa, una célula Cv1, una célula MDCK, una célula 293, una célula 3T3 o una célula PC12. En realizaciones particulares, la célula huésped es una célula de E. coli. En algunas realizaciones, la célula de E. coli es una célula de E. coli de cepa B, cepa C, cepa K o cepa W.

Composiciones y formulaciones de dioles grasos

Los bioproductos (por ejemplo, las composiciones de dioles grasos producidas según la presente invención) que incluyen compuestos orgánicos biológicamente producidos, y en particular, las composiciones de dioles grasos producidas usando la ruta de biosíntesis de ácidos grasos dada a conocer en el presente documento, se producen a partir de fuentes renovables (por ejemplo, a partir de una fuente de carbono simple derivada de materias primas renovables) y, como tales, son composiciones de materia nuevas. Los nuevos bioproductos pueden distinguirse de compuestos orgánicos derivados de carbono petroquímico basándose en determinación de huella de isótopos de carbono dobles o datación por 14C. Adicionalmente, la fuente específica de carbono obtenido de fuente biológica (por ejemplo, glucosa frente a glicerol) puede determinarse mediante determinación de huella de isótopos de carbono dobles (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.169.588). La capacidad para distinguir los bioproductos tales como los dioles grasos actualmente dados a conocer de compuestos orgánicos basados en petróleo resulta beneficiosa para realizar un rastreo de estos materiales en el comercio. Por ejemplo, los compuestos orgánicos o productos químicos que comprenden perfiles de isótopos de carbono tanto de base biológica como basados en petróleo pueden distinguirse de compuestos orgánicos y productos químicos compuestos únicamente por materiales basados en petróleo. Por tanto, puede realizarse un seguimiento o rastreo de los bioproductos producidos en el presente documento en el comercio basándose en su perfil de isótopos de carbono único. Pueden distinguirse bioproductos de compuestos orgánicos basados en petróleo comparando la razón de isótopos de carbono estables (13C/12C) en cada muestra. La razón de 13C/12C en un bioproducto dado es una consecuencia de la razón de 13C/12C en el dióxido de carbono atmosférico en el momento en el que se fija el dióxido de carbono. También refleja la ruta metabólica precisa. También se producen variaciones regionales. El petróleo, plantas C3 (hoja ancha), plantas C4 (las hierbas) y carbonatos marinos muestran todos ellos diferencias significativas en 13C/12C y los valores de 813C correspondientes. Las plantas tanto C4 como C3 muestran un intervalo de razones de isótopos 13C/12C, pero los valores típicos son de aproximadamente -7 a aproximadamente -13 por mil para las plantas C4 y de aproximadamente -19 a aproximadamente -27 por mil para las plantas C3 (véase, por ejemplo, Stuiver et al., Radiocarbon 19:355 (1977)). Los materiales no renovales tales como carbón y petróleo se encuentran generalmente en este último intervalo.

813C (%o) = [(13C/12C)muestra -(13C/12C)patrón] / (13C/12C)patrón x 1000

Se ha desarrollado una serie de RM alternativos en colaboración con IAEA, USGS, NIST, y otros laboratorios de isótopos internacionales seleccionados. Las notaciones para las desviaciones por mil de PDB son 813C. Se realizan mediciones con CO2 mediante espectrometría de masas de razón estable de alta precisión (IRMS) con iones moleculares con masas de 44, 45 y 46. Las composiciones descritas en el presente documento incluyen composiciones y productos de dioles grasos producidos mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Específicamente, la composición o producto de dioles grasos puede tener una 813C de aproximadamente -28 o más, aproximadamente -27 o más, -20 o más, -18 o más, -15 o más, -13 o más, -10 o más o -8 o más. Por ejemplo, la composición o producto de dioles grasos puede tener una 813C de aproximadamente -30 a aproximadamente -15, de aproximadamente -27 a aproximadamente -19, de aproximadamente -25 a aproximadamente -21, de aproximadamente -15 a aproximadamente -5, de aproximadamente -13 a aproximadamente -7 o de aproximadamente -13 a aproximadamente -10. En otros casos, la composición o producto de dioles grasos t puede tener una 813C de aproximadamente -10, -11, -12 ó -12,3. Las composiciones y productos de dioles grasos producidos según la divulgación en el presente documento también pueden distinguirse de compuestos orgánicos basados en petróleo comparando la cantidad de 14C en cada compuesto. Dado que 14C tiene una semivida nuclear de 5730 años, los combustibles basados en petróleo que contienen carbono “más antiguo” pueden distinguirse de composiciones y bioproductos de dioles grasos que contienen carbono “más nuevo” (véase, por ejemplo, Currie, “Source Apportionment of Atmospheric Particles”, Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, eds., 1 de vol. I de IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992)).

La suposición básica en la datación por radiocarbono es que la constancia de la concentración de 14C en la atmósfera conduce a la constancia de 14C en los organismos vivos. Sin embargo, debido a las pruebas nucleares atmosféricas desde 1950 y a la quema de combustible fósil desde 1850, 14C ha adquirido una segunda característica temporal geoquímica. Su concentración en el CO2 atmosférico, y por tanto en la biosfera viva, aproximadamente se duplicó en el momento máximo de las pruebas nucleares, a mediados de la década de 1960. Desde entonces ha ido volviendo gradualmente hasta la tasa de isótopos (14C/12C) de nivel inicial cosmogénica (atmosférica) de estado estacionario de aproximadamente 1,2 x 10'12, con una “semivida” de relajación aproximada de 7-10 años. Esta última semivida no debe interpretarse de manera literal; en vez de eso debe usarse la función de entrada/degradación nuclear atmosférica detallada para trazar la variación del 14C atmosférico y biosférico desde el inicio de la era nuclear. Esta última característica temporal de 14C biosférico es la que ofrece la promesa de datación anual de carbono biosférico reciente. El 14C puede medirse mediante espectrometría de masas con acelerador (AMS), con resultados facilitados en unidades de fracción de carbono moderno (fM). Con respecto a eso, la fM tiene el mismo significado que el definido por el Instituto nacional de estándares y tecnología (NIST), materiales de referencia de patrones (SRM 4990B y 4990C), conocidos como patrones de ácidos oxálicos HOxI y HOxII. La definición fundamental se refiere a 0,95 veces la razón de isótopos 14C/12C de HOxI (con referencia al año 1950). Esto es aproximadamente equivalente a la madera previa a la revolución industrial corregida para la degradación. Para la biosfera viva actual (material vegetal), la fM es de aproximadamente 1,1. Las composiciones y productos de dioles grasos descritos en el presente documento incluyen bioproductos que pueden tener una fM de 14C de al menos aproximadamente 1. Por ejemplo, el bioproducto de la divulgación puede tener una fM de 14C de al menos aproximadamente 1,01, una fM de 14C de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,5, una fM de 14C de aproximadamente 1,04 a aproximadamente 1,18, o una fM de 14C de aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124.

Otra medición de 14C se conoce como el porcentaje de carbono moderno (pMC). Para un arqueólogo o geólogo que usa fechas de ¹⁴C, el año 1950 equivale a cero años de antigüedad. Esto también representa 100 pMC. El carbono de bomba en la atmósfera alcanzó casi el doble del nivel normal en 1963 en el momento máximo de armas termonucleares. Su distribución dentro de la atmósfera se ha estimado desde su aparición, mostrando valores que son mayores que 100 pMC para plantas y animales que viven desde el año 1950. Ha disminuido gradualmente a lo largo del tiempo, siendo el valor actual de casi 107,5 pMC. Esto significa que un material de biomasa reciente, tal como maíz, dará una firma de ¹⁴C de casi 107,5 pMC. Los compuestos basados en petróleo tendrán un valor de pMC de cero. Combinar carbono fósil con carbono actual dará como resultado una dilución del contenido en pMC actual. Suponiendo que 107,5 pMC representa el contenido en ¹⁴C de los materiales de biomasa actuales y 0 pMC representa el contenido en ¹⁴C de productos basados en petróleo, el valor de pMC medido para ese material reflejará las proporciones de los dos tipos de componente. Por ejemplo, un material derivado al 100% de semillas de soja actuales dará una firma de radiocarbono de casi 107,5 pMC. Si se diluye ese material al 50% con productos basados en petróleo, dará una firma de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC. Un contenido en carbono de base biológica se deriva asignando el 100% como igual a 107,5 pMC y el 0% igual a 0 pMC. Por ejemplo, una muestra que mide 99 pMC dará un contenido en carbono de base biológica equivalente del 93%. Este valor se denomina resultado de carbono de base biológica medio y supone que todos los componentes dentro del material analizado se originaron o bien de material biológico actual o bien de material a base de petróleo. Un bioproducto que comprende uno o más dioles grasos tal como se describe en el presente documento puede tener un pMC de al menos aproximadamente 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100. En otros casos, una composición de dioles grasos descrita en el presente documento puede tener un pMC de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100; aproximadamente 60 y aproximadamente 100; aproximadamente 70 y aproximadamente 100; aproximadamente 80 y aproximadamente 100; aproximadamente 85 y aproximadamente 100; aproximadamente 87 y aproximadamente 98; o aproximadamente 90 y aproximadamente 95. En aún otros casos, una composición de dioles grasos descrita en el presente documento puede tener un pMC de aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94 ó 94,2.

Los dioles grasos tales como 1,3-dioles son moléculas que son valiosas y deseables en muchas aplicaciones industriales. La presente invención produce 1,3-dioles grasos que tienen una longitud de cadena de al menos 5 átomos de carbono mediante microorganismos recombinantes, incluyendo in vivo, y de ese modo genera una gama de productos útiles. Estos productos no son en sí mismos parte de la invención, pero a continuación se facilitan algunos ejemplos. Los 1,3-dioles incluyen, pero no se limitan a, 1,3-dioles C5 (1,3-pentanodiol); 1,3-dioles C⁶(1,3-hexanodiol); 1,3-dioles C7 (1,3-heptanodiol); 1,3-dioles Cs (1,3-octanodiol); 1,3-dioles C9 (1,3-nonanodiol); 1,3-dioles C10 (1,3-decanodiol); 1,3-dioles C11 (1,3-undecanodiol); 1,3-dioles C12 (1,3-dodecanodiol); 1,3-dioles C13 (1,3-tridecanodiol); 1,3-dioles C14 (1,3-tetradecanodiol); 1,3-dioles C15 (1,3-pentadecanodiol); 1,3-dioles C16 (1,3-hexadecanodiol); 1,3-dioles C17 (1,3-heptadecanodiol); 1,3-dioles C18 (1,3-octadecanodiol); 1,3-dioles C19 (1,3-nonadecanodiol); y similares. Aunque principalmente se describen 1,3-dioles de cadena par en el presente documento, también se incluyen 1,3-dioles de cadena impar, tales como los que tienen 7-21 carbonos, y más preferiblemente 5-19 carbonos.

Los 1,3-dioles producidos mediante el método de la invención tienen diversas longitudes de cadena y/o características de saturación y/o ramificación. Una composición de 1,3-dioles incluye principalmente un tipo de 1,3-diol tal como, por ejemplo, un 1,3-diol C5 (1,3-pentanodiol); un 1,3-diol C⁶(1,3-hexanodiol); un 1,3-diol C7 (1,3-heptanodiol); un 1,3-diol C⁸(1,3-octanodiol); un 1,3-diol C9 (1,3-nonanodiol); un 1,3-diol C10 (1,3-decanodiol); un 1,3-diol C11 (1,3-undecanodiol); un 1,3-diol C12 (1,3-dodecanodiol); un 1,3-diol C13 (1,3-tridecanodiol); un 1,3-diol C14 (1,3-tetradecanodiol); un 1,3-diol C15 (1,3-pentadecanodiol); un 1,3-diol C16 (1,3-hexadecanodiol); un 1,3-diol C17 (1,3-heptadecanodiol); un 1,3-diol C18 (1,3-octadecanodiol); un 1,3-diol C19 (1,3-nonadecanodiol); o similares. En otro ejemplo, la composición de 1,3-dioles incluye principalmente mezclas de 1,3-dioles específicos de una longitud de cadena específica en razones particulares. En aún otro ejemplo, la composición de 1,3-dioles incluye combinaciones de uno o más 1,3-dioles de una longitud de cadena específica en combinación con otros ingredientes o componentes con el fin de producir detergentes, tensioactivos, emulsionantes, emolientes, disolventes, plásticos y aditivos alimenticios.

En un ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C12 en una mezcla de alcoholes grasos de cadena recta. En otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C12 en una mezcla de alcoholes grasos de cadena ramificada. En otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C12 en una mezcla de alcoholes grasos de cadena recta y ramificada. En otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C12 en combinación con componentes adicionales tales como, por ejemplo, componentes detergentes o tensioactivos. En aún otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C12 en combinación con componentes adicionales tales como, por ejemplo, componentes emulsionantes o disolventes. En todavía otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C12 en combinación con polímeros. En el presente documento, la composición de dioles grasos puede usarse como componente para plásticos. En otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C12 en una mezcla de ingredientes alimenticios. En otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye un 1,3-diol como producto intermedio en la síntesis de un tensioactivo o detergente, tal como un glucósido o etóxido, o en combinación con una fragancia, o un elemento estructural químico a partir del cual pueden sintetizarse otros compuestos químicos.

En otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C⁸, C10 y C12 en determinadas razones en una mezcla de alcoholes grasos de cadena recta. En otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C⁸, C10 y C12 en determinadas razones en una mezcla de alcoholes grasos de cadena ramificada. En otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C⁸, C10 y C12 en determinadas razones en una mezcla de alcoholes grasos de cadena recta y ramificada. En otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C⁸, C10 y C12 en determinadas razones en combinación con componentes adicionales tales como, por ejemplo, componentes detergentes o tensioactivos. En aún otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C⁸, C10 y C12 en determinadas razones en combinación con componentes adicionales tales como, por ejemplo, componentes emulsionantes o disolventes. En todavía otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C⁸, C10 y C12 en determinadas razones en combinación con polímeros. En el presente documento, la composición de dioles grasos puede usarse como componente para plásticos. En otro ejemplo, la composición de dioles grasos incluye 1,3-dioles C⁸, C10 y C12 en determinadas razones en una mezcla de ingredientes alimenticios.

La divulgación da a conocer además una composición de dioles grasos que incluye 1,3-dioles C5, C⁶, C7, C⁸, C9, C10 y/o C11 solos o en determinadas razones en una mezcla de ingredientes relacionados con alimentos. Tales dioles grasos serán útiles como estabilizadores alimenticios, potenciadores alimenticios, aditivos alimenticios o sustitutos alimenticios. Los compuestos y composiciones de los dioles grasos pueden formularse de manera que pueden realizarse productos deseables incluyendo detergentes, tensioactivos, emulsionantes, emolientes, disolventes, plásticos, aditivos alimenticios, y más. En un aspecto, se contemplan 1,3-dioles C10-C18 para su uso como tensioactivos. En otro aspecto, se usan 1,3-dioles directamente o como productos intermedios en la síntesis de productos nutracéuticos, productos farmacéuticos, productos químicos para la agricultura y otras moléculas bioactivas.

Ejemplos

EJEMPLO 1: Cultivo de cepas de E. co li recombinante para la producción de 1,3-dioles

Todos los experimentos comenzaron a partir de colonias individuales o cultivos madre congelados de una cepa microbiana particular. Se llevaron a cabo protocolos de alto rendimiento (HTP) en placas de 96 pocillos de la siguiente manera por cuadruplicado para cada cepa: se usaron 40 pl de cultivo de Luria-Bertani (LB) (a partir de un cultivo de LB que crecía en una placa de 96 pocillos) para inocular 360 pl de medios LB, que después se incubaron durante 3-4 horas a 32°C con agitación. Se usaron 40 pl de la siembra de LB para inocular 360 pl de medios Nlim (véase a continuación). Tras crecer a 32°C durante 2 horas a 30-35°C, se indujeron los cultivos con IPTG (concentración final de 1 mM). Después se incubaron los cultivos a 30-35°C con agitación durante 20 horas si no se indica lo contrario, tras lo cual se extrajeron siguiendo el protocolo de extracción convencional detallado a continuación. Se llevaron a cabo protocolos en frascos de agitación de manera similar excepto porque se aumentaron a escala los volúmenes de cultivo de manera que el volumen de medios de producción final fue de 15 ml en lugar de 400 pl. Los medios de frascos de agitación también contenían Triton X100 al 0,25% (v/v). Dependiendo de las cepas microbianas, se añadieron los antibióticos apropiados a los medios en todas las fases.

El procedimiento inicial en los biorreactores fue el siguiente: se cultivó un vial de banco de células de la cepa en un frasco de agitación de LB que contenía antibiótico(s) a 32°C hasta que la lectura de DO del cultivo fue >1. Se realizó una transferencia del 5% v/v de este cultivo en medios de siembra mínimos (que contenían cloruro de amonio, cloruro de sodio, fosfato de potasio monobásico, sulfato de magnesio, cloruro de calcio, glucosa, una disolución de oligoelementos, citrato férrico tribásico monohidratado, tampón y antibiótico(s)), y se cultivó durante la noche a 32°C. Después se usó este cultivo de siembra para inocular un biorreactor preparado para la producción.

Los medios de biorreactor iniciales para este procedimiento contenían diversas concentraciones de los mismos componentes que los medios de siembra, así como una disolución de vitaminas traza, y opcionalmente pequeñas cantidades de un componente de medios complejos, tales como casaminoácidos, maíz fermentado en polvo o extracto de levadura. Las adiciones tras la esterilización al biorreactor incluyeron opcionalmente vitaminas termolábiles o aminoácidos, glucosa y antibiótico(s).

Antes de la inoculación, se estabilizaron los parámetros del biorreactor y se activaron los controladores: punto de consigna de oxígeno disuelto: 10 - 50%; punto de consigna de temperatura: 27 - 37°C; punto de consigna de aireación: 0,25 - 1 vvm; punto de consigna de pH: 6,5 - 7,5. Se inoculó el biorreactor con el 5% v/v de un cultivo de siembra y se indujo con IPTG 1 mM cuando la densidad del cultivo alcanzó un punto de consigna deseado.

Una disolución de alimentación compuesta por glucosa, sacarosa, fructosa, xilosa o glicerol con otros componentes de medios posibles incorporados en los medios basales de biorreactor se alimentó al cultivo a una tasa máxima de 1 - 50 g/l/h de glucosa (basándose en el volumen de cultivo nominal), usando un desencadenante de DO o pH para indicar al controlador cuándo se había agotado la fuente de carbono de los medios y debía añadirse la siguiente inyección de disolución de alimentación. Se cosechó el biorreactor tras entre 48 y 96 horas de cultivo.

EJEMPLO 2: Análisis de 1,3-dioles

Se extrajeron muestras de caldo de fermentación producidas por cepas de E. coli recombinante con el siguiente procedimiento:

1. Agitar con vórtex el caldo a 3000 rpm durante 30 segundos antes de pesarlo.

2. Tomar muestra de 500 pl de caldo inmediatamente después de la agitación con vórtex con un dispositivo Vortex Genie.

3. Añadir 5 ml de acetato de butilo con 1-undecanol 500 mg/l como patrón interno.

4. Extraer caldo en un agitador en vórtex (agitador en vórtex de múltiples tubos DVX-2500, VWR) a 2500 rpm durante 20 minutos.

5. Centrifugar el extracto (a 4750 rpm) durante 10 min a temperatura ambiente.

6. Extraer con pipeta 100 pl del sobrenadante de fase superior en viales de CG con insertos.

7. Derivatizar añadiendo 100 pl de (BSTFA TMCS al 1%) al vial de CG a temperatura ambiente.

8. Mezclar el extracto y reactivo BSTFA durante 30 segundos antes de inyectar en CG/EM tal como se describe a continuación:

Condición del instrumento para la identificación

Temperatura inicial: 60°C

Tiempo inicial: 5 minutos

Tiempo de equilibración: 1 minuto

Tasa de programa: 25°C/minuto

Temperatura final: 300°C

Tiempo final: 1,6 minutos

Detector: MSD

Temperatura de entrada: 300°C

Temperatura de línea de transferencia: 300°C

Fuente de EM: 230°C

Cuad. de EM: 150°C

Razón de división: 20:1

Flujo de columna: 1 ml/minuto

Tamaño de muestra: 1 pl

EJEMPLO 3: Producción de 1,3-dioles usando una ruta con TE de A naerococcus tetradius o Lactobacillus plan tarum y carB

Este ejemplo muestra la producción inesperada de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica que incluye una tioesterasa microbiana de Anaerococcus tetradius (TE_EEI82564, número de registro de Genbank W^p_004837416) o Lactobacillus plantarum (TE_CAD63310, número de registro de Genbank WP_003640969) y variantes de ácido carboxílico reductasa, CarB, de Mycobacterium smegmatis (número de registro de Genbank YP_889972).

Se clonaron los genes que codifican para carB2 (SEQ ID NO: 6) y TE_EEI82564 en un vector derivado de pCL1920 (replicón de SC101, marcador de resistencia a espectinomicina), de manera que su transcripción se controló por el promotor Ptrc inducible por IPTG y formaron un operón con genes que codifican para una alcohol deshidrogenasa, alrA, que no se requiere para la producción de alcoholes grasos o dioles grasos, pero que sí mejora la tasa de su producción, y variantes de 3-ceto-acil-ACP sintasa (fabB) y un regulador de la transcripción (fadR). El plásmido se denominó pVA369 (véase la tabla 5). Se clonó el gen para TE_CAD63310 de L. plantarum de una manera idéntica junto con el gen para carB12 (SEQ ID NO: 4), el plásmido resultante se denominó pJP2 (véase la tabla 5, a continuación).

Las cepas de base usadas para la transformación de plásmido fueron V668 y DJ81. En resumen, el genoma de las cepas de base se manipuló de la siguiente manera: en V668, se delecionó el gen de fadE (acil-CoA deshidrogenasa), y se sobreexpresaron un operón sintético de biosíntesis de ácidos grasos y una fosfopanteteinil transferasa (entD). En resumen, el genoma de la cepa de base DJ81 se manipuló de la siguiente manera: se delecionó el gen de acil-CoA deshidrogenasa (fadE), y se sobreexpresaron un operón sintético de biosíntesis de ácidos grasos, una fosfopanteteinil transferasa (entD) y una tioesterasa variante (tesA).

Se transformaron los plásmidos pVA369 y pJP2 en las cepas de base D848 y V668, respectivamente, dando como resultado las cepas VA370 y JP-11 (véase la tabla 6, a continuación). Después se cultivaron las cepas y se analizaron para determinar su capacidad para producir alcoholes grasos tal como se describió en los ejemplos 1 y 2. Sorprendentemente, ambas cepas produjeron varios picos desconocidos.

La figura 4 muestra un cromatograma de CG-EM de un extracto de la cepa VA370 que sobreexpresaba TE_EEI82564. Dos picos a TR=8,199 min y TR=9,094 min en el cromatograma de CG-EM no coincidían con el tiempo de retención de los alcoholes grasos y ácidos grasos previstos, tales como dodecanol y tetradecanol, o ácido dodecanoico y ácido tetradecanoico. El pico 1 eluyó antes que dodecanol y el pico 2 eluyó después que tetradecanol y antes que ácido tetradecanoico. Los patrones de fragmentación iónica de los picos 1 y 2 (véase la figura 5) sugirieron que estos dos picos eran 1,3-trimetilsiloxioctano y 1,3-trimetilsiloxidecano, que son los productos de derivatización de BSTFA (véase el ejemplo 2) con 1,3-octanodiol y 1,3-decanodiol, respectivamente. Para ilustración, la figura 6 muestra un esquema de los fragmentos iónicos de 1,3-trimetilsiloxidecano tal como se observan en el pico 1 en la figura 5. También se observó cantidad traza 1,3-dodecanodiol y 1,3-tetradecanodiol de derivatizados.

De manera similar, extractos de la cepa JP-11 que expresaba TE_CAD63310 contenían nuevos picos que se identificaron como 1,3-octanodiol, 1,3-decanodiol, 1,3-tetradecanol y 1,3-tetradecenol basándose en su patrón de fragmentación iónica y tiempo de retención tal como se describió anteriormente. JP-11 produjo un total de 1,9 ± 0,05 g/l de 1,3-dioles en un protocolo de fermentación de HTP así como alcoholes grasos tales como octanol, decanol, dodecanol, dodecenol, tetradecanol y tetradecenol. En la figura 7 se muestra la distribución de productos de la cepa JP-11.

La producción de 1,3-dioles fue sorprendente por dos motivos: (i) requiere 3-OH ácidos grasos como productos intermedios, que a su vez se derivan lo más probablemente de 3-OH acil-ACP mediante la acción de una tioesterasa (véase la figura 2). Ambas tioesterasas usadas en este ejemplo se habían expresado anteriormente en E. coli y sólo se notificó que dieran lugar a ácidos grasos (Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44) sugiriendo que no son adecuadas para la producción de 3-OH ácidos grasos y por tanto 1,3-dioles, (ii) requiere que se reduzcan productos intermedios de 3-OH ácidos grasos para dar 3-OH aldehídos grasos mediante ácido carboxílico reductasa CarB, que después se reducen para dar 1,3-dioles mediante alcohol deshidrogenasa (ADH). Mientras que se sabe que las ADH son más bien promiscuas, anteriormente no se había mostrado que CarB convirtiera 3-OH ácidos grasos en 3-OH aldehídos grasos. Por tanto, los solicitantes han descubierto que determinadas tioesterasas microbianas, por ejemplo, TE_EEI82564 y TE_CAD63310, cuando se expresan conjuntamente con CarB en células huésped de E. coli, sobreproducen 1,3-dioles. El análisis de los 1,3-dioles puede mostrar que están altamente enriquecidos en enantiómero (R), demostrando la enantioselectividad de la 3-cetoacil ACP reductasa (FabG) de la maquinaria de biosíntesis de ácidos grasos de E. coli nativa.

Tabla 5: Plásmidos usados para la producción de 1,3-dioles

Tabla 6: Cepas usadas para la producción de 1,3-dioles

EJEMPLO 4A: Producción de 1,3-dioles usando una ruta con fatBI de Um bellu laria californica y carB Este ejemplo muestra la producción de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica que incluye una tioesterasa vegetal, fatB1, de Umbellularia california, (número de registro de Genbank Q41635) y una ácido carboxílico reductasa variante, CarB, de Mycobacterium smegmatis.

Se clonaron los genes que codifican para carB8 (SEQ ID NO: 8) y fatB1 en un vector derivado de pCL1920 (replicón de SC101, marcador de resistencia a espectinomicina), de manera que su transcripción se controló por el promotor Ptrc inducible por IPTG y formaron un operón con un gen que codifica para una alcohol deshidrogenasa, alrA. El plásmido se denominó pNH330 (véase la tabla 5).

La cepa de base usada para la transformación de plásmido fue la cepa D178. En resumen, el genoma de la cepa D178 se modificó de la siguiente manera: se delecionó el gen de fadE (acil-CoA deshidrogenasa) y se sobreexpresó una fosfopanteteinil transferasa (entD). Se transformó el plásmido pNH330 en D178 dando como resultado la cepa stNH1371 (véase la tabla 6). Después se cultivó la cepa y se analizó para determinar su capacidad para producir alcoholes grasos y 1,3-dioles tal como se describió en los ejemplos 1 y 2. Se identificaron los picos de 1,3-dioles tal como se describió en el ejemplo 2.

La cepa stNH1371 produjo 39,5 ± 3,2 mg/l de 1,3-dioles en un protocolo de fermentación de HTP. El 1,3-dodecanodiol fue uno de los 1,3-dioles producidos. Además de 1,3-dioles, también se detectaron alcoholes grasos tales como dodecanol. El análisis de los 1,3-dioles puede mostrar que están altamente enriquecidos en enantiómero (R) demostrando la enantioselectividad de la 3-cetoacil ACP reductasa (FabG) de la maquinaria de biosíntesis de ácidos grasos de E. coli nativa.

EJEMPLO 4B: Producción de 1,3-dioles usando una ruta con phaG de Pseudom onas putida y carB

Este ejemplo muestra la producción de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica que incluía una tioesterasa/transacilasa, phaG, de Pseudomonas putida (número de registro de Genbank AAN67031), y una ácido carboxílico reductasa variante, CarB, de Mycobacterium smegmatis.

Se clonaron el gen que codifica para carB8 (véase la lista de secuencias adjunta con el presente documento, a continuación) y phaG en un vector derivado de pCL1920 (replicón de SC101, marcador de resistencia a espectinomicina), de manera que su transcripción se controló por el promotor Ptrc inducible por IPTG y formaron un operón con un gen que codifica para una alcohol deshidrogenasa, alrA. El plásmido se denominó pNH328 (véase la tabla 5).

La cepa de base usada para la transformación de plásmido fue la cepa D178. En resumen, el genoma de la cepa D178 se modificó de la siguiente manera: se delecionó el gen de fadE (acil-CoA deshidrogenasa) y se sobreexpresó una fosfopanteteinil transferasa (entD). Se transformó el plásmido pNH328 en D178 dando como resultado la cepa stNH1369 (véase la tabla 6, anteriormente). Después se cultivó la cepa y se analizó para determinar su capacidad para producir alcoholes grasos y 1,3-dioles tal como se describió en los ejemplos 1 y 2. Se identificaron los picos de 1,3-dioles tal como se describió en el ejemplo 2.

La cepa stNH1369 produjo 600 ± 27 mg/l de 1,3-dioles en un protocolo de fermentación de HTP. Los 1,3-dioles producidos fueron 1,3-octanodiol, 1,3-decanodiol, 1,3-dodecanodiol y 1,3-tetradecanodiol. Además de 1,3-dioles, sólo se detectaron cantidades minoritarias de ácidos grasos. El análisis de los 1,3-dioles puede mostrar que están altamente enriquecidos en enantiómero (R) demostrando la enantioselectividad de la 3-cetoacil ACP reductasa (FabG) de la maquinaria de biosíntesis de ácidos grasos de E. coli nativa.

EJEMPLO 5: Producción de 1,3-dioles usando una ruta con AAR de Synechococcus elongatus

Este ejemplo muestra la producción de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica que incluye una acil-ACP reductasa variante, AAR, de Synechococcus elongatus (número de registro de Genbank YP_400611; silvestre). Para la secuencia de AAR variante, véase la lista de secuencias adjunta con el presente documento (a continuación).

Se clonó el gen que codifica para una variante de AAR (SEQ ID NO: 2) en un vector derivado de pCL1920 (replicón de SC101, marcador de resistencia a espectinomicina), de manera que su transcripción se controló por el promotor Ptrc inducible por IPTG y formó un operón con un gen que codifica para una alcohol deshidrogenasa, alrA. El plásmido se denominó pNT16 (véase la tabla 5).

La cepa de base usada para la transformación de plásmido fue DV2. En resumen, el genoma de cepa DV2 se manipuló delecionando el gen de fadE (acil-CoA deshidrogenasa). Se transformó el plásmido pNT16 en cepas de base DV2 dando como resultado la cepa Becos247 (véase la tabla 6). Después se cultivó Becos247 y se analizó para determinar su capacidad para producir alcoholes grasos tal como se describió en los ejemplos 1 y 2. Sorprendentemente, la cepa produjo 1,3-dioles. Se identificaron los picos de 1,3-dioles tal como se describió en el ejemplo 2.

La cepa Becos247 produjo 0,57 g/l de 1,3-dioles en una fermentación de 5 l, lo cual constituyó el 9,1% de las especies de ácidos grasos totales producidas. Los 1,3-dioles producidos fueron 1,3-dodecanodiol, 1,3-tetradecenodiol y 1,3-tetradecanodiol, además de los alcoholes grasos decanol, dodecenol, dodecanol, tetradecenol, tetradecanol, hexadecenol, hexadecanol y octadecenol, así como se produjeron cantidades minoritarias de ácidos grasos.

La producción de 1,3-dioles en este experimento a través de 3-OH aldehídos grasos como productos intermedios es sorprendente (véase la figura 3), porque la acil-ACP reductasa usada en este ejemplo, AAR silvestre de Synechococcus elongatus, se había expresado anteriormente en E. coli y se notificó que sólo daba lugar a alcoholes grasos a partir de acil-ACP, pero no 1,3-dioles a partir de 3-OH acil-ACP (Schirmer et al. (2010) Science 329, 559). El análisis de los 1,3-dioles puede mostrar que están altamente enriquecidos en enantiómero (R) demostrando la enantioselectividad de la 3-cetoacil ACP reductasa (FabG) de la maquinaria de biosíntesis de ácidos grasos de E. coli nativa.

EJEMPLO 6A: Producción de 1,3-dioles usando una ruta con fatBI de Um bellu laria californica y carB Este ejemplo describe cómo demostrar la producción de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica que incluye una tioesterasa vegetal, fatB1, de Umbellularia california, y ácido carboxílico reductasa, carB, de Mycobacterium smegmatis.

Se clonan los genes que codifican para carB y fatB1 silvestres en un vector derivado de pCL1920 (replicón de SC101, marcador de resistencia a espectinomicina), de manera que su transcripción se controla por el promotor P trc inducible por IPTG y forman un operón con un gen que codifica para una alcohol deshidrogenasa, alrA. Se transforma el plásmido en una cepa de base tal como cepa DV2 (véase el ejemplo 5).

Después se cultiva la cepa resultante y se analiza para determinar su capacidad para producir alcoholes grasos y dioles tal como se describió en los ejemplos 1 y 2. Se espera que la cepa produzca 1,3-dioles. El análisis de los 1,3-dioles mostrará que están altamente enriquecidos en enantiómero (R) demostrando la enantioselectividad de la 3-cetoacil ACP reductasa (FabG) de la maquinaria de biosíntesis de ácidos grasos de E. coli nativa.

EJEMPLO 6B: Producción de 1,3-dioles usando una ruta simplificada con fatB1 de Umbellularia californica y carB

Este ejemplo describe cómo demostrar la producción de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica simplificada que incluye una tioesterasa vegetal, fatB1, de Umbellularia california, y ácido carboxílico reductasa, carB, de Mycobacterium smegmatis.

Se clonan los genes que codifican para carB y fatB1 silvestres en un vector derivado de pCL1920 (replicón de SC101, marcador de resistencia a espectinomicina), de manera que su transcripción se controla por el promotor P trc inducible por IPTG. Se transforma el plásmido en una cepa de base tal como cepa DV2 (véase el ejemplo 5).

Después se cultiva la cepa resultante y se analiza para determinar su capacidad para producir alcoholes grasos y dioles tal como se describió en los ejemplos 1 y 2. Se espera que la cepa produzca 1,3-dioles, lo cual demuestra que una tioesterasa y ácido carboxílico reductasa son suficientes para permitir que la célula microbiana produzca 1,3-dioles. El análisis de los 1,3-dioles mostrará que están altamente enriquecidos en enantiómero (R) demostrando la enantioselectividad de la 3-cetoacil ACP reductasa (FabG) de la maquinaria de biosíntesis de ácidos grasos de E. coli nativa.

EJEMPLO 7: Producción de 1,3-dioles usando una ruta con tesA de E. co li y carB

Este ejemplo describe cómo demostrar la producción de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica que incluye tioesterasa, tesA, y ácido carboxílico reductasa, CarB, de Mycobacterium smegmatis.

Se clonan los genes que codifican para carB silvestre y tesA silvestre en un vector derivado de pCL1920 (replicón de SC101, marcador de resistencia a espectinomicina), de manera que su transcripción se controla por el promotor P trc inducible por IPTG y forman un operón con un gen que codifica para una alcohol deshidrogenasa, alrA. Se transforma el plásmido en una cepa de base tal como cepa DV2 (véase el ejemplo 5).

EJEMPLO 8: Producción de 1,3-dioles usando una ruta simplificada con AAR silvestre de Synechococcus elongatus

Este ejemplo describe cómo demostrar la producción de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica que incluye acil-ACP reductasa, ^aA^r, de Synechococcus elongatus.

Se clona el gen que codifica para AAR silvestre en un vector derivado de pCL1920 (replicón de SC101, marcador de resistencia a espectinomicina), de manera que su transcripción se controla por el promotor Ptrc inducible por IPTG. Se transforma el plásmido en una cepa de base tal como cepa DV2 (véase el ejemplo 5).

Después se cultiva la cepa resultante y se analiza para determinar su capacidad para producir alcoholes grasos y dioles tal como se describió en los ejemplos 1 y 2. Se espera que la cepa produzca 1,3-dioles lo cual demuestra que la producción heteróloga de AAR es suficiente para permitir que la célula microbiana produzca 1,3-dioles. El análisis de los 1,3-dioles mostrará que están altamente enriquecidos en enantiómero (R) demostrando la enantioselectividad de la 3-cetoacil ACP reductasa (FabG) de la maquinaria de biosíntesis de ácidos grasos de E. coli nativa.

EJEMPLO 9: Producción de 1,3-dioles usando una ruta con fatB de C innam om um cam phora y carB Este ejemplo describe cómo demostrar la producción de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica que incluye una tioesterasa vegetal, fatB, de Cinnamomum camphora y ácido carboxílico reductasa, carB, de Mycobacterium smegmatis.

Se clonan los genes que codifican para carB y fatB silvestres de Cinnamomum camphora en un vector derivado de pCL1920 (replicón de SC101, marcador de resistencia a espectinomicina), de manera que su transcripción se controla por el promotor Ptrc inducible por IPTG y forman un operón con un gen que codifica para una alcohol deshidrogenasa, alrA. Se transforma el plásmido en una cepa de base tal como cepa DV2 (véase el ejemplo 5). Después se cultiva la cepa resultante y se analiza para determinar su capacidad para producir alcoholes grasos y dioles tal como se describió en los ejemplos 1 y 2. Se espera que la cepa produzca 1,3-dioles, lo cual demuestra que una tioesterasa y ácido carboxílico reductasa son suficientes para permitir que la célula microbiana produzca 1,3-dioles. El análisis de los 1,3-dioles mostrará que están altamente enriquecidos en enantiómero (R) demostrando la enantioselectividad de la 3-cetoacil ACP reductasa (FabG) de la maquinaria de biosíntesis de ácidos grasos de E. coli nativa.

EJEMPLO 10: Producción de 1,3-dioles usando una ruta con acr1 de A cinetobacter bay ly i

Este ejemplo describe cómo demostrar la producción de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica que incluye acil graso-CoA reductasa, acr1, de Acinetobacter bailyi (número de registro de Genbank AAC45217).

Se clona el gen que codifica para acr1 en un vector derivado de pCL1920 (replicón de SC101, marcador de resistencia a espectinomicina), de manera que su transcripción se controla por el promotor Ptrc inducible por IPTG y forma un operón con genes que codifican para una acil-CoA sintetasa (fadD) y una tioesterasa. Se transforma el plásmido en una cepa de base tal como cepa DV2 (véase el ejemplo 5).

Después se cultiva la cepa resultante y se analiza para determinar su capacidad para producir alcoholes grasos y dioles tal como se describió en los ejemplos 1 y 2. Se espera que la cepa produzca 1,3-dioles.

EJEMPLO 11: Producción de 1,3-dioles usando una ruta con FAR de M arinobacter aquaeolei

Este ejemplo describe cómo demostrar la producción de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica que incluye acil graso-ACP reductasa, FAR, de Marinobacter aquaeolei (número de registro de Genbank YP_959486).

Se clonan los genes que codifican para FAR silvestre en un vector derivado de pCL1920 (replicón de SC101, marcador de resistencia a espectinomicina), de manera que su transcripción se controla por el promotor Ptrc inducible por IPTG. Se transforma el plásmido en una cepa de base tal como cepa DV2 (véase el ejemplo 5).

Después se cultiva la cepa resultante y se analiza para determinar su capacidad para producir alcoholes grasos y dioles tal como se describió en los ejemplos 1 y 2. Se espera que la cepa produzca 1,3-dioles, lo cual demuestra que FAR producida de manera heteróloga es suficiente para permitir que la célula produzca 1,3-dioles

EJEMPLO 12: Producción de 1,3-dioles usando una ruta con un complejo de FAR de Photorhabdus lum inescens

Este ejemplo describe cómo demostrar la producción de 1,3-dioles en E. coli recombinante usando una ruta metabólica que incluye un complejo de acil graso-ACP reductasa, FAR, que incluye LuxC, LuxD y LuxE de Photorhabdus luminescens (números de registro de Genbank AHH25015-17).

Claims

REIVINDICACIONES

i . Microorganismo recombinante para producir un 1,3-diol graso que tiene una longitud de cadena de al menos 5 átomos de carbono cuando crece en un caldo de fermentación con una fuente de carbono simple derivada de una materia prima renovable, estando el microorganismo modificado por ingeniería genética para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende:

(a) una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14); y

(b) una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42).
2. Microorganismo recombinante según la reivindicación 1, en el que dicha tioesterasa se selecciona del grupo que consiste en fatB1, TE_EEI82564, TE_CAD63310 y phaG.
3. Microorganismo recombinante según la reivindicación 1, en el que dicho ácido carboxílico reductasa es carB.
4. Método de producción de un 1,3-diol graso que comprende

(a) proporcionar un microorganismo recombinante en un caldo de fermentación, expresando dicho microorganismo una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una actividad tioesterasa (EC 3.1.2.-, EC 3.1.1.5 o EC 3.1.2.14); y una actividad ácido carboxílico reductasa (EC 6.2.1.3 o EC 1.2.1.42); y

(b) aislar un 1,3-diol graso de dicho caldo de fermentación, en el que dicho caldo de fermentación comprende una fuente de carbono simple derivada de una materia prima renovable.
5. Microorganismo recombinante según la reivindicación 1, que expresa además una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1. ).
6. Microorganismo recombinante según la reivindicación 5, en el que dicha alcohol deshidrogenasa es alrA.
7. Microorganismo recombinante según la reivindicación 1, en el que dicho 1,3-diol graso se produce in vivo.
8. Microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-7, en el que dicho 1,3-diol graso se selecciona del grupo que consiste en un 1,3-diol graso C5, un 1,3-diol graso C⁶, un 1,3-diol graso C7, un 1,3-diol graso C⁸, un 1,3-diol graso C9, un 1,3-diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1,3-diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18 y un 1,3-diol graso C19.
9. Microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-7, en el que dicho 1,3-diol graso es un 1,3-diol graso C12.
10. Cultivo celular que comprende el microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-9.
11. Cultivo celular según la reivindicación 10, en el que dicho cultivo celular produce 1,3-dioles grasos.
12. Método según la reivindicación 4, que expresa además una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.-).
13. Método según la reivindicación 4, o cultivo celular según la reivindicación 11, en el que dicho 1,3-diol graso se selecciona del grupo que consiste en un 1,3-diol graso C5, un 1,3-diol graso C⁶, un 1,3-diol graso C7, un 1.3- diol graso C⁸, un 1,3-diol graso C9, un 1,3-diol graso C10, un 1,3-diol graso C11, un 1,3-diol graso C12, un 1.3- diol graso C13, un 1,3-diol graso C14, un 1,3-diol graso C15, un 1,3-diol graso C16, un 1,3-diol graso C17, un 1,3-diol graso C18 y un 1,3-diol graso C19.