ES2788426T3

ES2788426T3 - Composiciones y métodos para la expresión de ARNs de guía de CRISPR utilizando el promotor de H1

Info

Publication number: ES2788426T3
Application number: ES15809732T
Authority: ES
Inventors: Vinod Jaskula-Ranga; Donald Zack
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 2014-06-16
Filing date: 2015-06-16
Publication date: 2020-10-21
Anticipated expiration: 2035-06-16
Also published as: EP3155101B1; MX2020007078A; SG11201610405RA; AU2015277369A1; US10369234B2; EA201692510A1; JP6930834B2; AU2021269446A1; US20200268907A1; EP3155101A1; BR112016029178A2; JP2021052809A; IL290576A; CN106852157A; SG10202002486QA; IL249584A0; CA2952697A1; US9907863B2; EP3155101A4; MX2016016833A

Abstract

Un sistema CRISPR-Cas no natural que comprende un vector que comprende un promotor H1 bidireccional, en donde el promotor de H1 bidireccional comprende: a) elementos de control que proporcionan la transcripción en una dirección de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula; y b) elementos de control que permiten la transcripción en la dirección opuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9, en donde ARNg se dirige a e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN a la expresión alter del uno o más productos génicos, y en donde dicho sistema está empaquetado en una sola partícula de virus adenoasociado (AAV).

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para la expresión de ARNs de guía de CRISPR utilizando el promotor de H1

Antecedentes

Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente entrecruzadas (CRISPR) junto con los genes cas (asociados a CRISPR) comprenden un sistema inmunitario adaptativo que proporciona resistencia adquirida contra la invasión de ácidos nucleicos extraños en bacterias y arqueas (Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-12). CRISPR consiste en matrices de secuencias repetidas conservadas cortas, espaciadas por secuencias de ADN variables únicas de tamaño similar llamadas espaciadores, que a menudo se originan a partir de ADN de fago o plásmido (Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-12; Bolotin et al. (2005)) Microbiology 151: 2551-61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-82). El sistema CRISPR-Cas funciona mediante la adquisición de piezas cortas de ADN extraño (espaciadores) que se insertan en la región CRISPR y proporcionan inmunidad contra exposiciones posteriores a fagos y plásmidos que llevan secuencias coincidentes (Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709- 12; Brouns et al. (2008) Science 321: 960-64). Es esta interferencia/inmunidad CRISPR-Cas la que permite el silenciamiento mediado por crARN de ácidos nucleicos extraños (Horvath & Barrangou (2010) Science 327: 167-70; Deveau et al. (2010) Annu. Rev. Microbiol. 64: 475-93; Marraffini y Sontheimer (2010) Nat. Rev. Genet. 11: 181-90; Bhaya et al. (2011) Annu. Rev. Genet. 45: 273-97; Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-338).

El uso de construcciones CRISPR que se basan en la actividad nucleasa de la proteína Cas9 (Makarova et al. (2011) Nat. Rev. Microbiol. 9: 467-77) junto con un ARN guía sintético (ARNg) ha revolucionado recientemente la ingeniería genómica, lo que permite la manipulación sin precedentes de secuencias de ADN. Las construcciones CRISPR/Cas9 son simples y rápidas de sintetizar y pueden multiplexarse. Sin embargo, a pesar de la relativa facilidad de su síntesis, los CRISPR tienen restricciones tecnológicas relacionadas con su acceso al espacio genómico direccionable, que es una función tanto de las propiedades de Cas9 en sí como de la síntesis de su gARN.

La escisión por el sistema CRISPR requiere un emparejamiento de bases complementario del ARNg con una secuencia de ADN de 20 nucleótidos y el motivo adyacente protoespaciador (PAM), un motivo de nucleótido corto encontrado 3' en el sitio diana (Jinek et al. (2012) Science 337: 816-821). Teóricamente, se puede apuntar a cualquier secuencia única de N20-PAM en el genoma utilizando la tecnología CRISPR. La especificidad de unión al ADN de la secuencia PAM, que varía dependiendo de la especie de origen del Cas9 específico empleado, proporciona una restricción. Actualmente, la proteína Cas9 menos restrictiva y más comúnmente utilizada es de S. pyogenes, que reconoce la secuencia NGG, y por lo tanto, cualquier secuencia única de 21 nucleótidos en el genoma seguida de dos nucleótidos de guanosina (N20NGG) puede ser dirigida. La expansión del espacio de direccionamiento disponible impuesto por el componente proteico se limita al descubrimiento y uso de nuevas proteínas Cas9 con requisitos PAM alterados (Cong et al. (2013) Science 339: 819-823; Hou et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 110 (39): 15644 9), o en espera de la generación de nuevas variantes de Cas9 a través de mutagénesis o evolución dirigida.

La segunda restricción tecnológica del sistema CRISPR surge de la expresión de ARNg iniciando a un nucleótido de guanosina 5'. El uso de la clase tipo III de promotores de polimerasa de ARN III ha sido particularmente adecuado para la expresión de ARNg porque estas transcripciones cortas no codificantes tienen extremos bien definidos, y todos los elementos necesarios para la transcripción, con la exclusión del nucleótido 1+, están contenidos en la región promotora aguas arriba. Sin embargo, dado que el promotor U6 comúnmente utilizado requiere un nucleótido de guanosina para iniciar la transcripción, el uso del promotor U6 ha restringido aún más los sitios de direccionamiento genómico a GN19NGG (Mali et al. (2013) Science 339: 823-826; Ding et al. (2013) Cell Stem Cell 12: 393-394). Los enfoques alternativos, como la transcripción in vitro por promotores T7, T3 o SP6, también requerirían iniciar nucleótidos de guanosina (Adhya et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 78: 147-151; Melton et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 7035-7056; Pleiss et al. (1998) RNA 4: 1313-1317).

Sumario

Los aspectos de la invención se exponen en las reivindicaciones.

A menos que se indique lo contrario, la práctica de la presente invención emplea típicamente técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, tecnología de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, ADN), inmunología, y ARN de interferencia (ARNi) que están dentro de la habilidad de la técnica. Se encuentran descripciones no limitantes de ciertas de estas técnicas en las siguientes publicaciones: Ausubel, F., et al., (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science and Current Protocols in Cell Biology, todos John Wiley & Sons, NY, edición a partir de diciembre de 2008; Sambrook, Russell y Sambrook, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001; Harlow, E. y Lane, D., Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988; Freshney, RI, "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique", 5a ed., John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2005. La información no limitante sobre agentes terapéuticos y enfermedades humanas se encuentra en The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman y Gilman, 11a Ed., McGraw Hill, 2005, Katzung, B. (ed.) Basic and Clinical Pharmacology, McGraw-Hill/Appleton & Lange 10a ed. (2006) u 11a edición (julio de 2009). La información no limitante sobre genes y trastornos genéticos se encuentra en McKusick, VA: Mendelian Inheritance in Man. A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders. Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1998 (12a edición) o la base de datos en línea más reciente: Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM™. Instituto McKusick-Nathans de Medicina Genética, Universidad Johns Hopkins (Baltimore, Maryland) y Centro Nacional de Información Biotecnológica, Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, Maryland), a partir del 1 de mayo de 2010, disponible en Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/ y en Online Mendelian Inheritance in Animals (OMIA), una base de datos de genes, trastornos y rasgos hereditarios en especies animales (que no sean humanos y ratones), disponible en el World Wide Web: http://omia.angis.org.au/contact.shtml. En caso de conflicto entre la especificación y cualquiera de las referencias, prevalecerá la especificación (incluidas las enmiendas de la misma). Los significados de términos estándar aceptados en la técnica se usan en este documento a menos que se indique lo contrario. Las abreviaturas estándar para varios términos se usan aquí.

La materia actualmente descrita proporciona composiciones y métodos para la expresión de ARN de guía CRISPR usando el promotor H1. La materia actualmente descrita proporciona un sistema CRISPR-Cas que no se produce de forma natural que comprende uno o más vectores que comprenden: a) un promotor H1 unido operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula, y en la que la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula; y b) un elemento regulador operable en una célula unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9, en donde los componentes (a) y (b) están ubicados en los mismos o diferentes vectores del sistema, en donde el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN para alterar la expresión de uno o más productos génicos. En algunos aspectos, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG o TN19NGG. En algunos aspectos, la célula es una célula eucariota. En algunos aspectos, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En algunos aspectos, la célula eucariota es una célula fotorreceptora retiniana. En algunos aspectos, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula. La proteína Cas9 es una proteína Cas9 de tipo II. En algunos aspectos, disminuye la expresión del uno o más productos génicos. En algunos aspectos, el uno o más productos genéticos son la rodopsina. En algunos aspectos, el sistema está empaquetado en una sola partícula de virus adenoasociado (AAV).

En algunos aspectos, el presente objeto divulgado proporciona un sistema de CRISPR-Cas de origen no natural que comprende uno o más vectores que comprende: a) un promotor H1 unido operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN guía del sistema CRISPR-cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula eucariota, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula eucariota; y b) un elemento regulador operable en una célula eucariota unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II, en donde los componentes (a) y (b) están ubicados en los mismos o diferentes vectores del sistema, por lo que el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN, y por lo que se altera la expresión de uno o más productos génicos. En otro aspecto, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG o TN19NGG. En otro aspecto, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula. En otro aspecto más, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula eucariota. En otro aspecto, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En otro aspecto, disminuye la expresión del uno o más productos génicos.

La presente materia divulgada también proporciona un método de expresión de alteración de uno o más productos génicos en una célula, donde la célula comprende una molécula de ADN que codifica uno o más productos génicos, comprendiendo el método introducir en la célula un sistema CRISPR-Cas no de origen natural que comprende uno o más vectores que comprenden: a) un promotor HI unido operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de la molécula de ADN; y b) un elemento regulador operable en la célula unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9, en donde los componentes (a) y (b) están ubicados en los mismos o diferentes vectores del sistema, en donde el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN para alterar la expresión de uno o más productos génicos. En algunos aspectos, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG o TN19NGG. En algunos aspectos, la célula es una célula eucariota. En algunos aspectos, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En algunos aspectos, la célula eucariota es una célula fotorreceptora retiniana. En algunos aspectos, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula. La proteína Cas9 es una proteína Cas9 de tipo II. En algunos aspectos, disminuye la expresión del uno o más productos génicos. En algunos aspectos, el uno o más productos genéticos son la rodopsina. En algunos aspectos, el sistema está empaquetado en una sola partícula de virus adenoasociado (AAV).

En algunos aspectos, el presente objeto divulgado proporciona un procedimiento de expresión de alteración de uno o más productos génicos en una célula eucariota, en donde la célula comprende una molécula de ADN que codifica los uno o más productos génicos, comprendiendo el método la introducción en la célula de un sistema CRISPR-Cas de origen no natural que comprende uno o más vectores que comprenden: a) un promotor H1 unido operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de la Molécula de ADN; y b) un elemento regulador operable en la célula eucariota unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II, en donde los componentes (a) y (b) están ubicados en el mismo o diferentes vectores del sistema, por lo que el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN, y por lo que se altera la expresión de uno o más productos génicos. En otro aspecto, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG o TN19NGG. En otro aspecto, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula. En otro aspecto más, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula eucariota. En otro aspecto, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En otro aspecto, disminuye la expresión del uno o más productos génicos.

El objeto divulgado aquí también proporciona un sistema de CRISPR-Cas de origen no natural que comprende un vector que comprende un promotor H1 bidireccional, en donde el promotor H1 bidireccional comprende: a) elementos de control que permiten la transcripción en una dirección de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula; y b) elementos de control que proporcionan la transcripción en la dirección opuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9, en donde el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN para alterar la expresión de uno o más productos génicos. En algunos aspectos, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG o TN19NGG. En algunos aspectos, la célula es una célula eucariota. En algunos aspectos, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En algunos aspectos, la célula eucariota es una célula fotorreceptora retiniana. En algunos aspectos, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula. La proteína Cas9 es una proteína Cas9 de tipo II. En algunos aspectos, disminuye la expresión del uno o más productos génicos. En algunos aspectos, el uno o más productos genéticos son la rodopsina. En algunos aspectos, el sistema está empaquetado en una sola partícula de virus adenoasociado (AAV).

En algunas divulgaciones del presente documento, el presente objeto divulgado proporciona un sistema CRISPR-Cas de origen no natural que comprende un vector que comprende un promotor H1 bidireccional, en donde el promotor H1 bidireccional comprende: a) los elementos de control que permiten la transcripción en una dirección de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula eucariota, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula eucariota; y b) elementos de control que proporcionan la transcripción en la dirección opuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II, por lo que el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN, y por lo tanto la expresión de la misma o más productos genéticos están alterados. En otro aspecto, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG oTN^NGG. En otro aspecto más, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula eucariota. En otro aspecto, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En otro aspecto, disminuye la expresión del uno o más productos génicos.

El objeto divulgado aquí también proporciona un método de expresión de alteración de uno o más productos génicos en una célula, donde la célula comprende una molécula de ADN que codifica uno o más productos génicos, comprendiendo el método la introducción en la célula de un no sistema CRISPR-Cas de origen natural que comprende un vector que comprende un promotor H1 bidireccional, en donde el promotor H1 bidireccional comprende: a) elementos de control que proporcionan la transcripción en una dirección de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg hibrida con una secuencia diana de la molécula de ADN; y b) elementos de control que proporcionan la transcripción en la dirección opuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9, en donde el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN para alterar la expresión de uno o más productos génicos en la célula En algunos aspectos, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG o TN19NGG. En algunos aspectos, la célula es una célula eucariota. En algunos aspectos, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En algunos aspectos, la célula eucariota es una célula fotorreceptora retiniana. En algunos aspectos, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula. La proteína Cas9 es una proteína Cas9 de tipo II. En algunos aspectos, disminuye la expresión del uno o más productos génicos. En algunos aspectos, el uno o más productos genéticos son la rodopsina. En algunos aspectos, el sistema está empaquetado en una sola partícula de virus adenoasociado (AAV).

El objeto divulgado aquí también proporciona un método de expresión de alteración de uno o más productos génicos en una célula eucariota, en donde la célula comprende una molécula de ADN que codifica uno o más productos génicos, comprendiendo el método la introducción en la célula de un sistema CRISPR-Cas de origen no natural que comprende un vector que comprende un promotor bidireccional H1, en donde el promotor bidirecciona1H1 comprende: a) elementos de control que proporcionan la transcripción en una dirección de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg)), en donde el ARNg hibrida con una secuencia diana de la molécula de ADN; y b) elementos de control que proporcionan la transcripción en la dirección opuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II, por lo que el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de a Dn , y por lo tanto la expresión de la misma o más productos genéticos están alterados. En otro aspecto, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG o TN19NGG. En otro aspecto más, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula eucariota. En otro aspecto, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En otro aspecto, disminuye la expresión del uno o más productos génicos.

El objeto divulgado aquí también proporciona una ribozima regulada por aptámero, que comprende: a) una ribozima de cabeza de martillo de actuación cis que comprende un núcleo catalítico y las regiones dúplex hélice I, hélice II, y hélice III que se extienden de las mismas, en donde la región dúplex de la hélice II y la región dúplex de la hélice III comprende cada una una región de bucle opuesta al núcleo catalítico, y en la que la región dúplex de la hélice II comprende un aptámero que se une a un ligando; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula eucariota, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula eucariota, en donde la secuencia de nucleótidos comprende un extremo 5' y un extremo 3', y en donde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos está directamente acoplado a la región dúplex de hélice III; en donde la unión del ligando al aptámero produce un cambio conformacional en la ribozima de tal manera que la ribozima sufre auto escisión entre el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos y la región dúplex de la hélice III, por lo que se produce el ARNg. También se proporciona una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de codificación que, cuando se transcribe a ARN, produce la ribozima regulada por aptámero; y (ii) una o más secuencias reguladoras de la transcripción que regulan la transcripción del ARN en una célula eucariota. También se proporciona una célula eucariota que comprende la construcción de expresión. También se proporciona un método de alterar la expresión de uno o más productos génicos en una célula eucariota, en donde la célula comprende una molécula de ADN que codifica los uno o más productos génicos, comprendiendo el método la introducción del constructo de expresión en la célula y en contacto la célula con el ligando en una cantidad que altera la actividad de la ribozima, particularmente en donde la célula está en un mamífero o un ser humano. En un aspecto, el ligando es teofilina.

El objeto divulgado aquí también proporciona un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa ocular en un sujeto en necesidad del mismo, comprendiendo el método: (a) proporcionar un sistema de CRISPR-Cas de origen no natural que comprende uno o más vectores que comprenden: i) un promotor H1 operativamente unido a al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula del sujeto, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula; y ii) un elemento regulador operable en una célula unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9, en donde los componentes (i) y (ii) están ubicados en los mismos o diferentes vectores del sistema, en donde el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN para alterar la expresión de uno o más productos génicos; y (b) administrar al sujeto una cantidad efectiva del sistema. En algunos aspectos, la disfunción y/o muerte de las células fotorreceptoras retinianas se ha observado en el sujeto. En algunos aspectos, la enfermedad neurodegenerativa ocular se selecciona del grupo que consiste en glaucoma, degeneración retiniana y degeneración macular relacionada con la edad. En algunos aspectos, la enfermedad neurodegenerativa ocular es la retinitis pigmentosa (RP). En algunos aspectos, la célula es una célula fotorreceptora retiniana. En algunos aspectos, uno o más productos genéticos son rodopsina. En algunos aspectos, el promotor H1 es bidireccional. En algunos aspectos, el sistema se empaqueta en una sola partícula de virus adenoasociado (AAV) antes de administrarse al sujeto. En algunos aspectos, la administración al sujeto ocurre por inyección subretiniana. En algunos aspectos, el sujeto es humano. La proteína Cas9 es una proteína Cas9 de tipo II. En algunos aspectos, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG o TN19NGG. En algunos aspectos, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula. En algunos aspectos, el método actualmente descrito comprende además administrar la construcción de expresión y el ligando en una cantidad que altera la actividad de la ribozima. En algunos aspectos, el ligando es teofilina.

Ciertos aspectos del objeto divulgado aquí han sido indicados anteriormente, que se abordan en su totalidad o en parte por el presente objeto divulgado, otros aspectos resultarán evidentes a medida que la descripción procede cuando se toma en conexión con los ejemplos y figuras que acompañan como se describe mejor a continuación.

Breve descripción de las figuras

Habiendo descrito así el objeto divulgado aquí en términos generales, se hará ahora referencia a las figuras que se acompañan, que no están dibujadas necesariamente a escala, y en donde:

FIG. 1A, FIG. 1B, FIG. 1C y FIG. 1D muestran una evaluación de la capacidad de dirigir el direccionamiento CRISPR a través de la síntesis de ARNg del promotor H1. Una ilustración esquemática que representa las construcciones de expresión de ARNg se muestra en la FIG. 1A. Arriba, el promotor U6 solo expresa ARNg con un nucleótido de guanosina 1; a continuación, el promotor H1 puede conducir la expresión de ARNg que se inician en el nucleótido purina (adenosina o guanosina). A continuación, se muestra una representación en caricatura de la proteína Cas9 con ARNg dirigido a la secuencia genómica AN19NGG (la secuencia que se muestra es la SEQ ID NO: 30). Se indica la ubicación del 1 A. Una visión general esquemática del ensayo de disrupción dirigida eGFP se muestra en la FIG. 1B. La fluorescencia de eGFP se ve interrumpida por la orientación CRISPR seguida de una reparación mediada por NHEJ propensa a errores que resulta en mutaciones de desplazamiento de fotogramas que interrumpen la secuencia de codificación, lo que resulta en la pérdida de fluorescencia. FIG. 1C muestra imágenes de microscopio que demuestran un direccionamiento CRISPR exitoso por ARN expresado por el promotor U6 o H1. Las células H7 ES se tiñeron y las colonias se visualizaron para mostrar núcleos (izquierda, magenta), fluorescencia de eGFP (medio, verde) e imágenes fusionadas (derecha) que indican áreas de mosaicismo de fluorescencia de GFP en la colonia. A la derecha se muestra la cuantificación de la pérdida de fluorescencia de eGFP por citometría de flujo para las construcciones respectivas. A continuación se muestra un aumento mayor de una colonia H7 dirigida por un ARNm expresado en H1 que muestra mosaicismo de expresión. Barra de escala, 50 pM. La cuantificación basada en el ensayo del topógrafo de la frecuencia de NHEJ se muestra en la FIG. 1D. Imagen de gel de bioanalizador que representa el control (primer carril), ARNg expresado en U6 (segundo carril), ARNm expresado en H1 (tercer carril) y marcador (cuarto carril). El % indel (calculado por la fracción de bandas no cortadas (u) a cortadas (c)) se indica a continuación;

FIG. 2 muestra el análisis de Surveyor y la cuantificación de NHEJ en células HEK-293. Se muestra arriba un EPG esquemático con flechas que indican los sitios de dirección. Los sitios diana en el filamento positivo se indican apuntando hacia la derecha, y las dianas del filamento negativo se indican apuntando hacia la izquierda; las flechas azules indican los ARNg del promotor H1 y las flechas anaranjadas indican los ARNg del promotor U6. A continuación se muestra el gel Bioanalyzer del ensayo Surveyor. Las coordenadas del sitio diana se enumeran arriba y el % indel calculado se indica a continuación;

FIG. 3A, FIG. 3B y FIG. 3C muestran el direccionamiento y la recombinación homóloga en el locus AAVS1. El análisis Surveyor de tres ARNg expresados por el promotor H1 (AAVS1-1a a -1-3a), tres ARNg expresados por el promotor U6 (AAVS-1-1 a -1-3) y un ARNg de control no dirigido se muestran en la FIG. 3A. FIG. 3B muestra un esquema del vector donante dirigido a AAVS-1 (que se muestra arriba del Locus AAVS1 (etiquetado como "AAVS1")) y la obtención de imágenes celulares de una colonia de células H7 ES positiva para GFP después de la electroporación con ARN de H1::AAVS1-3a y el vector de dirección AAVS-1. La secuenciación de Sanger de la región de unión dirigida que indica la integración correcta por recombinación homóloga es mostrada en la FIG. 3C (la secuencia mostrada es SEQ ID NO: 31);

FIG. 4A, FIG. 4B, FIG. 4C y FIG. 4D muestra el análisis bioinformático de los sitios GN19NGG y AN19NGG en el genoma. Un diagrama de Circos que representa la frecuencia de los sitios CRIPSR en el genoma humano se muestra en la FIG. 4A. El círculo exterior representa los ideogramas de cromosomas humanos. Moviéndose hacia adentro, la frecuencia de los sitios CRISPR GN19NGG (naranja), AN19NGG (azul) y RN19NGG (púrpura) se indica a lo largo de los cromosomas. Trazado dentro del círculo está la densidad del exón humano (negro) y los loci de la enfermedad de OMIM (azul). La frecuencia y la distancia entre los sitios CRISPR en el genoma se muestran en la FIG. 4B. Se muestra el diagrama de barras de la frecuencia y la distancia de los sitios adyacentes GN19NGG (naranja), AN19NGG (azul) en el genoma. Los valores medios y medianos se insertan dentro de la gráfica, incluidos los sitios RN19NGG. FIG. 4C muestra la cuantificación de diagrama de barras de GN19NGG frente a la frecuencia de sitio AN19NGG en genes humanos (izquierda) o loci de enfermedad OMIM (derecha). FIG. 4D muestra un diagrama de barras que cuantifica la frecuencia de GN19NGG frente a AN19NGG en seis genomas: humano, vaca, ratón, rata, pollo y pez cebra;

FIG. 5A, F iG . 5B, F iG . 5C, FIG. 5D, FIG. 5E y FIG. 5F muestra el análisis bioinformático de los sitios GN19NGG y AN19NGG en el genoma. Se muestran tres paneles que representan la densidad de cada sitio de ARNg en el genoma humano: GN19NGG (FIG. 5A), AN19NGG (FIG. 5B) y RN19NGG (FIG. 5C). Dentro de cada gráfica, la densidad de los sitios CRISPR se traza a lo largo de cada cromosoma. Superpuesta en semitransparente (naranja, azul o morado) está la curva de densidad calculada como un núcleo gaussiano liso. La línea punteada indica 35 pb; como referencia, en promedio, se estima que los sitios de orientación TALEN ocurren cada 35 pares de bases y los sitios ZFN ocurren cada doscientos pares de bases (Sander et al. (2011) Nature Methods 8: 67-69; Cermak et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39 (12): e82). Una gráfica de barras de la densidad de direccionamiento CRISPR media acumulativa por cromosoma humano se muestra en la FIG. 5D. GN19NGG (naranja), AN19NGG (azul) y RN19NGG (púrpura) indican los respectivos sitios CRISPR. La línea punteada indica la referencia de 35 pb. FIG.

5E muestra la frecuencia y la distancia entre sitios CRISPR adyacentes en el genoma. Se muestra el diagrama de barras de la frecuencia y la distancia de los sitios adyacentes GN19NGG (naranja) y AN19NGG (azul) en el genoma. Los valores medios y medianos se insertan dentro de la gráfica. SeqLogo de todos los sitios GN19NGG (arriba a la izquierda), AN19NGG (arriba a la derecha) y RN19NGG (abajo) en el genoma humano se muestran en la FIG. 5F; FiG. 6A, FiG. 6B, FIG. 6C, FIG. 6D, FIG. 6E y FIG. 6F muestran el contenido del genoma de AT/GC y la frecuencia del sitio CRISPR: el porcentaje de AT (azul) o GC (naranja) está indicado para los genomas humanos, de vaca, ratón, rata, pollo y pez cebra (FIG. 6A). Se indica la frecuencia de los sitios GN19NGG (naranja) y AN19NGG (azul) normalizados al contenido de AT/GC (FIG. 6B). La frecuencia del sitio CRISPR por cadena para los sitios GN19NGG (izquierda), AN19NGG (centro) y RN19NGG (derecha) se muestra en la FIG. 6C. La cadena positiva (columna izquierda) se indica con azul verdoso y la cadena negativa (columna derecha) en rojo púrpura. La frecuencia de sitio GN19NGG (naranja) y AN19NGG (azul) en Drosophila, C. elegans y S. cerevisiae se indican en la FIG. 6D. FIG. 6E muestra el porcentaje de contenido de AT (azul) o GC (naranja) y la FIG. 6F muestra la frecuencia normalizada de los sitios CRISPR;

FIG. 7A, FIG. 7B, FIG. 7C y FIG. 7D muestran la orientación CRISPR de AN19NGG en un gen endógeno (MERTK) en células H7 ES. Un diagrama esquemático del locus MERTK y varios dominios de proteínas se muestran en la FIG. 7A. El sitio diana en el exón 2 se muestra a continuación a mayor escala, lo que indica el sitio diana CRISPR AN19NGG (la secuencia que se muestra es la SEQ ID NO: 32). La cuantificación del direccionamiento CRISPR en el exón2 mediante el ensayo Surveyor se muestra en la FIG. 7B. El sitio CRISPR en el exón 2 se muestra arriba, con los diversos cebadores (flechas) utilizados en el ensayo Surveyor; tanto F1:R1 como F2:R2 abarcan el sitio diana, mientras que el producto de PCR de control, F3:R3, está justo fuera del sitio diana. El gel del ensayo Surveyor se muestra a continuación con los tres productos de control que se muestran a la izquierda, y la orientación se muestra a la derecha. Por debajo del % de se indica la frecuencia indel. FIG. 7C muestra la secuenciación de Sanger de líneas mutantes. Las líneas clonales se aislaron y secuenciaron, lo que indica que el direccionamiento CRISPR en los sitios AN19NGG resultó en mutagénesis en esta región. Los cromatogramas alineados muestran las 6 mutaciones únicas que se clonaron (wt es SEQ ID NO: 33; A12 es SEQ ID NO: 34; A1 es SEQ ID NO: 35; A2, 2 es SEQ ID NO: 36; A6 es SEQ ID NO: 37; A7 es SEQ ID NO: 38). FIG. 7D muestra el análisis de transferencia Western para la expresión de Mertk en células RPE derivadas de H7. Los carriles 1, 3 y 4 indican líneas extraídas y el carril 2 indica la expresión de una línea heterocigótica;

FIG. 8A, FIG. 8B, FIG. 8C y FIG. 8D muestran un análisis de los resultados fuera de diana inducidos en los sitios dentro y fuera de diana por los ARNg expresados en U6 o H1. El análisis de qRT-PCR de los niveles de expresión de ARNt de VEGFA T1 a partir de cantidades de titulación del promotor H1 (azul) o del promotor U6 (naranja) se muestra en la FIG. 8A. El análisis dentro y fuera de diana del VEGFA T1 se muestra en la FIG. 8B. El análisis Surveyor se indica a la izquierda y las secuencias diana a la derecha con los desajustes indicados en rojo (T1, SEQ ID NO: 20; OT1-3, SEQ ID NO: 21; OT1-4, SEQ ID NO: 22; OT1- 6, SEQ ID NO: 23; OT1-11, SEQ ID NO: 24). FIG. 8C es lo mismo que la FIG. 8B con la diana VEGFA T3 (VEGFA T3, SEQ ID NO: 25; OT3-1, SEQ ID NO: 26; OT3-2, SEQ ID NO: 27; OT3-4, SEQ ID NO: 28; OT3-18, SEQ ID NO: 29). La especificidad en diana a fuera de diana de VEGFA T1 se muestra en la FIG. 8D. Se muestra la relación de la mutagénesis en diana/mutagénesis fuera de diana entre el promotor H1 (azul) o el promotor U6 (naranja). Los valores debajo de la línea de puntos en 1.0 indican una mayor mutagénesis fuera de diana que la mutagénesis en diana. Para todas las partes, los sitios dentro y fuera de diana están etiquetados como en Fu et al. ((2013) Nat. Biotechnol. 31 (9): 822-6) y Cho et al. ((2014) Genome Research 24: 132-141);

FIG. 9A y la FIG. 9B muestran las propiedades de los promotores U6 versus H1 en la expresión de ARNg para la orientación CRISPR. El diagrama superior de la FIG. 9^amuestra el promotor U6 humano endógeno y el sitio de inicio de la transcripción (SEQ ID NO: 39). El diagrama inferior de la FIG. 9A indica el uso del promotor U6 para conducir ARNg con diferentes nucleótidos 1. Debido a que U6 requiere una G para iniciarse (arriba a la izquierda), los paneles que comienzan con A (arriba a la derecha), C (abajo a la izquierda) o T (abajo a la derecha) probablemente inicien la primera G aguas abajo que conduzca a un ARNg truncado (U6: GN19NGG es SEQ ID NO: 40; U6: AN19NGG es SEQ ID NO: 41; U6: CN19NGG es SEQ ID NO: 42; U6: TN19NGG es SEQ ID NO: 43). El diagrama superior de la FIG. 9B muestra el promotor H1 humano endógeno y el sitio de inicio de la transcripción (SEQ ID NO: 44). El diagrama inferior de la FIG. 9B indica el uso del promotor H1 para conducir ARNg con diferentes nucleótidos 1. H1 puede iniciarse con una G (arriba a la izquierda) o una A (arriba a la derecha) que conducen a ARNg de longitud completa. Además, se ha informado que H1 permite iniciar la transcripción en los nucleótidos C y T, lo que permitiría transcripciones de longitud completa para cualquier nucleótido 1 aguas abajo del promotor H1 (H1: GN19NGG es SEQ ID NO: 45; H1: AN19NGG es SEQ ID NO: 46; H1: CN19NGG es SEQ ID NO: 47; H1: TN19NGG es SEQ ID NO: 48);

FIG. 10A, FIG. 10B, FIG. 10C, FIG. 10D, y FIG. 10E muestran el uso del promotor H1 como un promotor bidireccional para expresar simultáneamente la proteína Cas9 y guiar el ARN. El promotor bidirecciona1H1 se muestra expresando Cas9 como una transcripción pol II hacia la izquierda (cadena negativa), y un ARN guía como una transcripción pol III hacia la derecha (cadena positiva) (FIG. 10A). El casete de expresión global es de aproximadamente 4,4 kb. FIG. 10B muestra la construcción utilizada para probar la capacidad de dirigir la escisión mediada por CRISPR a partir de una construcción H1 bidireccional. La construcción bidireccional, usando un ARNg dirigido a eGFP, se clonó en un plásmido y se expresó en células madre humanas que expresaban GFP. La pérdida de GFP se detecta visualmente (panel central, puntas de flecha), lo que indica la expresión exitosa y el direccionamiento de GFP debido al constructo de expresión (Figura 10C). La identificación exitosa de CRISPR también se muestra a través del ensayo Surveyor con la presencia de las dos bandas en los carriles 2 y 3 (FIG.

10D). En la FIG. 2 se muestra una construcción CRISPR bidireccional que usa el promotor H1 para generar un casete de direccionamiento compacto de ~4,75b, que está dentro del rango de empaquetamiento del virus adenoasociado, se muestra en la FIG. 10E. El terminador SV40 se muestra en naranja, y la construcción está flanqueada por las secuencias de repetición terminal invertida (ITR) requeridas para la producción de virus; FIG. 11A, FIG. 11B, y FIG. 11C muestran una ribozima de cabeza de martillo para generar el extremo 5' de un ARN guía. La representación de una ribozima de cabeza de martillo cis 5' (SEQ ID NO: 49) y ARNg (SEQ ID NO: 50) se muestra en la FIG. 11A. Se indican las secuencias de la ribozima de cabeza de martillo y se indican los nucleótidos importantes para la catálisis (crítico en rojo, importante en naranja). La ubicación de la escisión se indica con la flecha. Tras la escisión de la ribozima (inferior), se libera el ARNg resultante, sin restricción a ningún nucleótido en la posición 5' recién formada. Las construcciones para expresar el gARN de cabeza de martillo se muestran en la FIG. 11B. Se puede usar un promotor, generalmente un promotor pol III como U6, H1 o T7, para expresar la ribozima de cabeza de martillo cis 5', que después de la autoescisión liberará el ARNg. La orientación de dos loci se muestra con el ensayo Surveyor (HH1 = SEQ ID NO: 51; HH2 = SEQ ID NO: 52), con escisión exitosa (flechas) por una ribozima 5' cis-cabeza de martillo (FIG. 11C);

FIG. 12 muestra una construcción CRISPR regulable, que usa aptazimas para procesar ARNg en presencia de aptámeros específicos. En particular, la FIG. 12 representa el aptámero de teofilina (naranja) fusionado con la hélice II de la ribozima de cabeza de martillo que forma la aptazima de teofilina, que es 5' del ARNg (azul). La unión de teofilina estabiliza la hélice II que luego permite la auto escisión de la cabeza de martillo y libera el ARNg (SEQ ID NO: 50). El ARNg, junto con Cas9, ahora puede apuntar a la escisión por el sistema CRISPR. Ribozima de cabeza de martillo, SEQ ID NO: 55;

FIG. 13 muestra la organización genómica del locus H1RNA y PARP-2. Arriba se muestra una representación del gen PARP-2 (azul) transcrito hacia la derecha y el gen H1RNA (naranja) transcrito a la izquierda, dibujado a escala.

A continuación se muestra una región ampliada de la región promotora para ambos genes;

FIG. 14 muestra el reportero eGFP para la actividad H1 pol II. La secuencia del promotor H1 humano está orientada con la transcripción pol II de eGFP a la derecha. Los tres componentes a optimizar se indican en cursiva;

FIG. 15 muestra la expresión del reportero eGFP. Los paneles superiores indican promotor H1 endógeno, los paneles inferiores indican expresión con secuencia Kozak;

FIG. 16A y la FIG. 16B muestran la expresión bidireccional de Cas9 y ARNg. Un diagrama esquemático de la construcción de direccionamiento bidireccional se muestra en la FIG. 16A. La comparación de la escisión en dos loci diferentes usando el suministro estándar de dos vectores (carriles 2 y 5) o el suministro de plásmido de direccionamiento único (carriles 3 y 6) se muestra en la FIG. 16B. El % de modificación genómica, según lo determinado por el ensayo T7EI, se indica debajo de cada carril;

FIG. 17 muestra el locus de rodopsina del ratón hRho: GFP knockin. Arriba, las secuencias respectivas de ratón y humano se indican arriba del esquema de la región promotora rho hasta el final de 3'UTR (dibujado a escala). Abajo, región ampliada que indica la ubicación de P23 y el ARNg, que se muestra a continuación (punta de flecha); FIG. 18A, FIG. ^{1 8}b y F iG. 18C muestra el direccionamiento específico del alelo P23H in vivo. F iG. 18A muestra la dirección a P23 (WT (C57BL/6J, SEQ ID NO: 56; P23H (CCC^CAC), SEQ ID NO: 57; WT (CAST/EiJ), SEQ ID NO: 58). FIG. 18B muestra la secuencia de rodopsina de dos cepas de ratón de tipo silvestre; el SNP se indica con la flecha (secuencia de ADN C57BL/6J, SEQ ID NO: 56; secuencia de proteína C57BL/6J, SEQ ID NO: 59; secuencia de ADN CAST/EiJ+/+, SEQ ID NO: 58; secuencia de proteína CAST/EiJ+/+, SEQ ID NO: 59). FIG. 18C muestra el esquema de cría P23H: el ratón homocigoto P23H (negro) se cruza con un molde WT (blanco) y el heterocigoto resultante (gris) se tratará mediante administración subretiniana de AAV5; y

FIG. 19 muestra el direccionamiento específico de alelo del locus de rodopsina. Se muestra la comparación de la escisión del alelo C57BL/6J (P23H) frente a un desajuste de una base única (molde). El % de la modificación genómica determinado por el ensayo T7EI se indica a continuación.

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Descripción detallada

El objeto divulgado aquí ahora se describirá más completamente en lo sucesivo con referencia a las figuras adjuntas, en las que se muestran algunas, pero no todas las realizaciones del objeto divulgado aquí. Los números iguales se refieren a elementos similares en todas partes. El objeto divulgado aquí puede realizarse de muchas formas diferentes y no debe interpretarse como limitado a las realizaciones establecidas en el presente documento; más bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta divulgación satisfaga los requisitos legales aplicables. De hecho, muchas modificaciones y otras realizaciones del objeto descrito aquí expuesta en este documento le vendrán a la mente a un experto en la materia a la que pertenece la materia actualmente divulgada teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y las Figuras asociadas. Por lo tanto, debe entenderse que el objeto divulgado aquí no debe limitarse a las realizaciones específicas divulgadas y que las modificaciones y otras realizaciones están destinadas a ser incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Las tecnologías de edición del genoma tales como las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) (Porteus y Baltimore (2003) Science 300: 763; Miller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25: 778-785; Sander et al. (2011) Nature Methods 8: 67-69; Wood et al. (2011) Science 333: 307) y nucleasas efectoras activadoras de la transcripción (TALEN) (Wood et al. (2011) Science 333: 307; Boch et al. (2009) Science 326: 1509-1512; Moscou y Bogdanove (2009) Science 326: 1501; Christian et al. (2010) Genetics 186: 757-761; Miller et al. (2011) Nat. Biotechnol.29: 143-148; Zhang et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29: 149-153; Reyon et al. (2012) Nat. Biotechnol. 30: 460-465) han potenciado la capacidad de generar modificaciones específicas del genoma y ofrecen el potencial para corregir mutaciones de la enfermedad con precisión. Si bien son efectivas, estas tecnologías están sujetas a limitaciones prácticas, ya que los pares ZFN y TALEN requieren sintetizar proteínas de reconocimiento grandes y únicas para un sitio diana de ADN dado. Varios grupos han informado recientemente sobre la edición del genoma de alta eficiencia mediante el uso de un sistema de ingeniería CRISPR/Cas9 tipo II que elude estas limitaciones clave (Cong et al. (2013) Science 339: 819-823; Jinek et al. (2013) eLife 2: e00471; Mali et al. (2013) Science 339: 823-826; Cho et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 230-232; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 227- 229). A diferencia de ZFNs y TALENs, que son de realización relativamente lenta y ardua, las construcciones de CRISPR, que se basan en la actividad nucleasa de la proteína Cas9 junto con una ARN guía sintético (ARNg), son sencillas y rápidas de sintetizar y pueden ser multiplexadas. Sin embargo, a pesar de la relativa facilidad de su síntesis, los CRISPR tienen restricciones tecnológicas relacionadas con su acceso al espacio genómico direccionable, que es una función tanto de las propiedades de Cas9 en sí como de la síntesis de su ARNg.

La escisión por el sistema CRISPR requiere el emparejamiento de bases complementarias del ARNg con una secuencia de ADN de 20 nucleótidos y el motivo adyacente protoespaciador (PAM), un motivo de nucleótido corto encontrado 3' en el sitio diana (Jinek et al. (2012) Science 337: 816-821). Teóricamente, se puede apuntar a cualquier secuencia única de N20-PAM en el genoma utilizando la tecnología CRISPR. La especificidad de unión al ADN de la secuencia PAM, que varía dependiendo de la especie de origen del Cas9 específico empleado, proporciona una restricción. Actualmente, la proteína Cas9 menos restrictiva y más comúnmente utilizada es de S. pyogenes, que reconoce la secuencia NGG, y por lo tanto, cualquier secuencia única de 21 nucleótidos en el genoma seguida de dos nucleótidos de guanosina (N20NGG) puede ser dirigida. La expansión del espacio de direccionamiento disponible impuesto por el componente proteico se limita al descubrimiento y uso de nuevas proteínas Cas9 con requisitos PAM alterados (Cong et al. (2013) Science 339: 819-823; Hou et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 110 (39): 15644 9), o en espera de la generación de nuevas variantes de Cas9 mediante mutagénesis o evolución dirigida. La segunda restricción tecnológica del sistema CRISPR surge de la expresión de ARNg que se inicia en un nucleótido de guanosina 5'. El uso de la clase tipo III de promotores de polimerasa de ARN III ha sido particularmente adecuado para la expresión de ARNg porque estas transcripciones cortas no codificantes tienen extremos bien definidos y todos los elementos necesarios para la transcripción, con la exclusión del nucleótido 1+, están contenidos en la región promotora aguas arriba. Sin embargo, dado que el promotor U6 comúnmente utilizado requiere un nucleótido de guanosina para iniciar la transcripción, el uso del promotor U6 ha restringido aún más los sitios de direccionamiento genómico a GN19NGG (Mali et al. (2013) Science 339: 823-826; Ding et al. (2013) Cell Stem Cell 12: 393-394). Los enfoques alternativos, como la transcripción in vitro por promotores T7, T3 o SP6, también requerirían iniciar nucleótidos de guanosina (Adhya et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 78: 147-151; Melton et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 7035-7056; Pleiss et al. (1998) RNA 4: 1313-1317).

El objeto divulgado aquí se refiere al descubrimiento de que el uso del promotor HI para expresar el ARN guía (gARN o sgARN) es más del doble de la precisión del sistema de CRISPR/Cas9 en muchos genomas debido a la alteración de la especificidad del nucleótido 5'. La capacidad de expresar y modificar genes endógenos usando el promotor H1 para expresar los ARNg puede usarse para apuntar a los sitios genómicos AN19NGG y GN19NGG. Los sitios AN19NGG ocurren con un 15% más de frecuencia que los sitios GN19NGG en el genoma humano y el aumento en el espacio de focalización también se enriquece en genes humanos y loci de enfermedades. En consecuencia, el objeto divulgado aquí mejora la versatilidad de la tecnología CRISPR al más del doble del espacio de focalización dentro del genoma humano y otras especies eucariotas. Además, esta modificación permite una focalización de mayor resolución en el genoma humano que las tecnologías CRISPR, TALEN o Zincfinger previamente existentes.

El objeto divulgado aquí también se refiere al descubrimiento de que el uso de la secuencia del promotor HI como un promotor bidireccional para expresar Cas9 y la ARNg permite simultáneamente la generación de casetes de expresión compactos y completamente funcionales que se puede insertar y administrar por vectores virales.

El objeto divulgado aquí también se refiere al uso de ribozimas de ARN y aptazimas regulables para expresar y regular la expresión ARNg in vivo.

I. EXPRESIÓN DE ARNS GUÍA DE CRISPR UTILIZANDO EL PROMOTOR H1.

A. Composiciones

En alguna descripción de la presente memoria descriptiva, el objeto descrito aquí proporciona un sistema CRISPR-Cas que no se produce de forma natural que comprende uno o más vectores que comprenden: a) un promotor H1 unido operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN guía de sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula; y b) un elemento regulador operable en una célula unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9, en donde los componentes (a) y (b) están ubicados en los mismos o diferentes vectores del sistema, en donde el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN para alterar la expresión de uno o más productos génicos.

En algunas divulgación del presente documento, el presente objeto divulgado proporciona un sistema CRISPR-Cas de origen no natural que comprende uno o más vectores que comprende: a) un promotor H1 unido operativamente a al menos una secuencia de nucleótido que codifica un ARN guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula eucariota, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula eucariota; y b) un elemento regulador operable en una célula eucariota unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II, en donde los componentes (a) y (b) están ubicados en los mismos o diferentes vectores del sistema, por lo que el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN, y por lo que se altera la expresión de uno o más productos génicos. En un aspecto, la secuencia diana puede ser una secuencia diana que comienza con cualquier nucleótido, por ejemplo, N20NGG. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos GN19NGG. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos CN19NGG. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos TN19NGG. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG o GN19NGG. En otro aspecto, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula. En otro aspecto, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula eucariota. En otro aspecto, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En otro aspecto más, disminuye la expresión del uno o más productos génicos.

El objeto divulgado aquí también proporciona un sistema de CRISPR-Cas de origen no natural que comprende un vector que comprende un promotor HI bidireccional, donde el promotor HI bidireccional comprende: a) elementos de control que prevén la transcripción en una dirección de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula eucariota, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula eucariota; y b) elementos de control que prevén la transcripción en la dirección opuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II, por lo que el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN, y por lo tanto la expresión de la misma o más productos genéticos están alterados. En un aspecto, la secuencia diana puede ser una secuencia diana que comienza con cualquier nucleótido, por ejemplo, N20NGG. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos GN19NGG. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos CN19NGG. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos TN19NGG. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG o GN19NGG. En otro aspecto, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula. En otro aspecto, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula eucariota. En otro aspecto, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En otro aspecto más, disminuye la expresión del uno o más productos génicos.

En alguna divulgación del presente documento, el complejo de CRISPR consta una o más secuencias de localización nuclear de la fuerza suficiente para impulsar la acumulación del complejo de CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula (por ejemplo, célula eucariota). Sin desear limitarse a la teoría, se cree que una secuencia de localización nuclear no es necesaria para la actividad del complejo de CRISPR en eucariotas, pero que incluir tales secuencias mejora la actividad del sistema, especialmente en lo que se refiere a las moléculas de ácido nucleico en el núcleo. En alguna descripción de este documento, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En alguna descripción de este documento, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En alguna descripción de este documento, la enzima Cas9 es S. pneumoniae, S. pyogenes o Cas9 de S. thermophilus, y puede incluir Cas9 mutado derivado de estos organismos. La enzima puede ser un homólogo u ortólogo Cas9.

En general, y en toda esta memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico que son monocatenarias, bicatenarias o parcialmente bicatenarias; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres, sin extremos libres (por ejemplo, circulares); moléculas de ácido nucleico que comprenden ADN, ARN o ambos; y otras variedades de polinucleótidos conocidos en la técnica. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en donde se pueden insertar segmentos de ADN adicionales, como las técnicas de clonación molecular estándar. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde las secuencias de ADN o ARN derivadas de virus están presentes en el vector para empaquetarse en un virus (por ejemplo, retrovirus, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus, adenovirus de replicación defectuosa y virus asociados a adeno). Los vectores virales también incluyen polinucleótidos transportados por un virus para la transfección en una célula huésped.

Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y, por lo tanto, se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión". Los vectores de expresión comunes de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos.

Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico del objeto descrito aquí en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen uno o más elementos reguladores, que pueden seleccionarse sobre la base de las células huésped que se utilizarán para la expresión, que está operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar.

Dentro de un vector de expresión recombinante, "unido operativamente" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está unida al elemento regulador de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en una transcripción in vitro/sistema de traducción o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped).

El término "elemento regulador" pretende incluir promotores, potenciadores, sitios de entrada ribosomales internos (IRES), y otros elementos de control de expresión (por ejemplo señales de terminación de la transcripción, tales como señales de poliadenilación y secuencias PolyU). Dichos elementos reguladores se describen, por ejemplo, en Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California. Los elementos reguladores incluyen aquellos que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Un promotor específico de tejido puede dirigir la expresión principalmente en un tejido de interés deseado, como músculo, neurona, hueso, piel, sangre, órganos específicos (por ejemplo, hígado, páncreas) o tipos de células particulares (por ejemplo, linfocitos). Los elementos reguladores también pueden dirigir la expresión de una manera dependiente del tiempo, tal como de una manera dependiente del ciclo celular o de la etapa del desarrollo, que puede o no ser específica del tejido o del tipo celular.

En alguna divulgación del presente documento, un vector comprende uno o más promotores de pol III, uno o más promotores de pol II, uno o más promotores de pol I, o combinaciones de los mismos. Los ejemplos de promotores de pol III incluyen, pero no se limitan a, promotores U6 y H1. Los ejemplos de promotores de pol II incluyen, entre otros, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous retroviral (RSV) (opcionalmente con el potenciador de RSV), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) (por ejemplo, Boshart et al. (1985) Cell 41: 521-530), el promotor SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de p-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK) y el promotor EF1a.

El término "elemento regulador" también abarca elementos potenciadores, tales como WPRE; potenciadores de CMV; el segmento R-U5' en LTR de HTLV-I (Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol.8: 466-472); potenciador de SV40; y la secuencia intrónica entre los exones 2 y 3 de la p-globina de conejo (O'Hare et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.

78 (3): 1527-31). Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión deseado, etc. Un vector puede introducirse en las células huésped para producir transcripciones, proteínas o péptidos, incluidas proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en el presente documento (por ejemplo, transcripciones de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente intercaladas (CRISPR), proteínas, enzimas, formas mutantes de las mismas, proteínas de fusión de las mismas, etc.). Los vectores ventajosos incluyen lentivirus y virus adenoasociados, y los tipos de tales vectores también pueden seleccionarse para dirigirse a tipos particulares de células.

Los términos "polinucleótido", "nucleótido", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definido a partir del análisis de enlace, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, interferencia corta ARN (ARNsi), ARN de horquilla corta (ARNsh), micro-ARN (ARNmi), ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. Un polinucleótido puede comprender uno o más nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si está presente, se pueden impartir modificaciones a la estructura de nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente marcador.

En aspectos del objeto divulgado aquí importan los términos "ARN quimérico", "ARN guía quimérico", "ARN guía", "solo ARN guía" y "ARN guía sintético" se usan indistintamente y se refieren a la secuencia de polinucleótido que comprende la secuencia guía. El término "secuencia guía" se refiere a la secuencia de aproximadamente 20 pb dentro del ARN guía que especifica el sitio diana y puede usarse indistintamente con los términos "guía" o "espaciador".

Tal como se utiliza aquí, el término "tipo silvestre" es un término de la técnica que se entiende por los expertos y significa la forma típica de un organismo, cepa, gen o característica que se produce en la naturaleza y que se distingue de las formas mutantes o variantes.

Tal como se utiliza aquí, el término "variante" se debe tomar en el sentido de la exposición de las cualidades que tienen un patrón que se desvía de lo que ocurre en la naturaleza.

Los términos "de origen no natural" o "modificado" se utilizan indistintamente e indican la implicación de la mano del hombre. Los términos, cuando se refieren a moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, significan que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido están al menos sustancialmente libres de al menos otro componente con el que están naturalmente asociados en la naturaleza y como se encuentran en la naturaleza.

La "complementariedad" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para formar enlaces de hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico por Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 siendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100% complementario). "Perfectamente complementario" significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácido nucleico se unirán por hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos en una segunda secuencia de ácido nucleico. "Sustancialmente complementario", como se usa en el presente documento, se refiere a un grado de complementariedad que es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%. 97%, 98%, 99% o 100% en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos, o se refiere a dos ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones rigurosas.

Como se usa en el presente documento, "condiciones rigurosas" para la hibridación se refieren a condiciones en las que un ácido nucleico que tiene complementariedad con una secuencia diana predominantemente se hibrida con la secuencia diana, y sustancialmente no se hibrida con secuencias no diana. Las condiciones estrictas generalmente dependen de la secuencia y varían según una serie de factores. En general, cuanto más larga sea la secuencia, mayor será la temperatura a la que la secuencia se hibrida específicamente con su secuencia diana. En Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes, parte 1, segundo capítulo, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", se describen en detalle ejemplos no limitantes de condiciones rigurosas., Elsevier, NY.

La "hibridación" se refiere a una reacción en la que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre las bases de los residuos de nucleótidos. El enlace de hidrógeno puede ocurrir mediante el emparejamiento de bases de Watson Crick, la unión de Hoogstein o cualquier otra secuencia específica. El complejo puede comprender dos hebras que forman una estructura dúplex, tres o más hebras que forman un complejo de hebras múltiples, una hebra autohibridante simple o cualquier combinación de estas. Una reacción de hibridación puede constituir un paso en un proceso más extenso, como el inicio de la PCR o la escisión de un polinucleótido por una enzima. Una secuencia capaz de hibridarse con una secuencia dada se denomina "complemento" de la secuencia dada.

Como se usa en el presente documento, "expresión" se refiere al proceso por el cual un polinucleótido se transcribe a partir de una plantilla de ADN (tal como en una transcripción ARNm u otro ARN) y/o el proceso por el que un ARNm transcrito posteriormente se traduce en péptidos, polipéptidos o proteínas. Las transcripciones y los polipéptidos codificados pueden denominarse colectivamente "producto genético". Si el polinucleótido se deriva del ADN genómico, la expresión puede incluir el empalme del ARNm en una célula eucariota.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de aminoácidos ácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede ser interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, como la conjugación con un componente de etiquetado.

Tal como se utiliza aquí, el término "aminoácido" incluye aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina e isómeros ópticos tanto D como L, y aminoácidos análogos de ácidos y peptidomiméticos.

La práctica del objeto descrito aquí emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología, biología celular, genómica y ADN recombinante, que están dentro de la experiencia de la técnica (Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición; Ausubel et al., Eds. (1987) Current Protocols in Molecular Biology); MacPherson y col., Eds. (1995) Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach); Harlow y Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney, ed. (1987) Animal Cell Culture).

Varios aspectos del objeto divulgado aquí se refieren a sistemas de vectores que comprenden uno o más vectores, o vectores como tales. Los vectores pueden diseñarse para la expresión de transcripciones CRISPR (por ejemplo, transcripciones de ácido nucleico, proteínas o enzimas) en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, las transcripciones CRISPR se pueden expresar en células bacterianas como Escherichia coli, células de insectos (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Las células huésped adecuadas se discuten adicionalmente en Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California. Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.

Los vectores se pueden introducir y propagar en un procariota. En alguna descripción de este documento, se usa un procariota para amplificar copias de un vector que se introducirá en una célula eucariota o como un vector intermedio en la producción de un vector que se introducirá en una célula eucariota (por ejemplo, amplificar un plásmido como parte de un sistema de embalaje del vector viral). En alguna descripción de la presente memoria, se usa un procariota para amplificar copias de un vector y expresar uno o más ácidos nucleicos, tal como para proporcionar una fuente de una o más proteínas para el suministro a una célula huésped u organismo huésped. La expresión de proteínas en procariotas se realiza con mayor frecuencia en Escherichia coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o de no fusión.

Los vectores de fusión añaden una cantidad de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, tal como al extremo amino terminal de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión pueden servir para uno o más propósitos, tales como: (i) aumentar la expresión de proteína recombinante; (ii) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y (iii) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los ejemplos de vectores de expresión de fusión incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

Ejemplos de vectores de expresión E. coli no de fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amrann et al (1988) Gene.

69: 301-315) y pET 11d (Studier et al (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California).

En alguna divulgación del presente documento, un vector es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en levaduras Saccharomyces cerivisae incluyen pYepSecl (Baldari, et al. (1987) EMBO J.

6: 229-234), pMFa (Kuijan y Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, California) y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, California).

En alguna divulgación del presente documento, un vector es capaz de dirigir la expresión de una o más secuencias en células mamíferas usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión en mamíferos incluyen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Cuando se usan en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión son proporcionadas típicamente por uno o más elementos reguladores. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus simio 40 y otros descritos aquí y conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células procariotas y eucariotas, véanse, por ejemplo, los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.

En alguna divulgación del presente documento, el vector de expresión del mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, elementos reguladores específicos de tejido se utilizan para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido son conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos de linfoides (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J.8: 729-733) e inmunoglobulinas (Baneiji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230: 912-916), y promotores específicos de glándulas mamarias (p. ej., Promotor de suero de leche; Patente de los Estados Unidos Núm. 4.873.316 y Solicitud Europea Publicación N° 264,166). Los promotores regulados por el desarrollo también están incluidos, por ejemplo, los promotores murinos de hox (Kessel y Gruss (1990) Science 249: 374-379) y el promotor de a-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).

En alguna divulgación del presente documento, un elemento regulador está unido operativamente a uno o más elementos de un sistema CRISPR así como a la expresión de accionamiento del uno o más elementos del sistema de CRISPR. En general, los CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas regularmente), también conocidas como SPIDR (repeticiones directas intercaladas SPacer), constituyen una familia de loci de ADN que generalmente son específicos de una especie bacteriana en particular. El locus CRISPR comprende una clase distinta de repeticiones de secuencia corta intercaladas (SSR) que fueron reconocidas en E. coli (Ishino et al. (1987) J. Bacteriol., 169: 5429-5433; y Nakata et al. (1989) J Bacteriol., 171: 3553-3556), y genes asociados. Se han identificado SSR intercalados similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol., 10: 1057-1065; Hoe et al. (1999) Emerg. Infect. Dis., 5: 254-263; Masepohl y otros (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307: 26-30; y Mojica y otros (1995) Mol. Microbiol., 17: 85-93). Los loci CRISPR típicamente difieren de otros SSR por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones cortas regularmente espaciadas (SRSR) (Janssen et al. (2002) OMICS J. Integ. Biol., 6: 23-33; y Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol., 36: 244-246). En general, las repeticiones son elementos cortos que ocurren en grupos que están regularmente separados por secuencias intermedias únicas con una longitud sustancialmente constante (Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol., 36: 244-246). Aunque las secuencias repetidas están altamente conservadas entre las cepas, el número de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones espaciadoras típicamente difieren de una cepa a otra (van Embden et al. (2000) J. Bacteriol., 182: 2393-2401). Se han identificado loci CRISPR en más de 40 procariotas (por ejemplo, Jansen et al. (2002) Mol. Microbiol., 43: 1565-1575; y Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-82) incluyendo, pero no limitado a Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacteriumn, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococ, Picrophilus, Thernioplasnia, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyc,, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myrococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema, y Thermotoga.

En general, "sistema de CRISPR" se refiere colectivamente a las transcripciones y otros elementos implicados en la expresión de o que dirigen la actividad de los genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluyendo secuencias que codifican un gen Cas, una guía de secuencia (también denominada "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno) u otras secuencias y transcripciones de un locus CRISPR. En alguna descripción de este documento, uno o más elementos de un sistema CRISPR se deriva de un sistema CRISPR de tipo I, tipo II o tipo III. En alguna descripción de este documento, uno o más elementos de un sistema CRISPR se derivan de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, tal como Streptococcus pyogenes. En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que promueven la formación de un complejo de CRISPR en el sitio de una secuencia diana (también denominado protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno).

En el contexto de la formación de un complejo de CRISPR, "secuencia diana" se refiere a una secuencia a la que una secuencia guía está diseñada para tener la complementariedad, donde la hibridación entre una secuencia diana y una secuencia guía promueve la formación de un complejo de CRISPR. No se requiere necesariamente una completa complementariedad, siempre que haya suficiente complementariedad para causar hibridación y promover la formación de un complejo de CRISPR. Una secuencia diana puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o a Rn . En alguna divulgación en el presente documento, una secuencia diana se localiza en el núcleo o citoplasma de una célula. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana puede estar dentro de un orgánulo de una célula eucariota, por ejemplo, mitocondrias o cloroplastos. Una secuencia o plantilla que puede usarse para la recombinación en el locus diana que comprende las secuencias diana se denomina "plantilla de edición" o "polinucleótido de edición" o "secuencia de edición". En aspectos de la materia divulgada actualmente, un polinucleótido de plantilla exógeno puede denominarse plantilla de edición. En un aspecto del objeto descrito aquí, la recombinación es recombinación homóloga.

En alguna divulgación del presente documento, un vector comprende uno o más sitios de inserción, tales como una secuencia de restricción de endonucleasa de reconocimiento (también denominado "sitio de clonación"). En alguna descripción de este documento, uno o más sitios de inserción (por ejemplo, aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios de inserción) están ubicados aguas arriba y/o aguas abajo de uno o más elementos de secuencia de uno o más vectores. Cuando se usan múltiples secuencias de guía diferentes, se puede usar una construcción de expresión única para dirigir la actividad CRISPR a múltiples secuencias diana diferentes correspondientes dentro de una célula. Por ejemplo, un solo vector puede comprender aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más secuencias de guía. En alguna divulgación en el presente documento, se pueden proporcionar aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de tales vectores que contienen secuencias de guía, y opcionalmente administrados a una célula.

En alguna divulgación del presente documento, un vector comprende un elemento regulador unido operativamente a una enzima de codificación de secuencia que codifica una enzima de CRISPR, tal como una proteína Cas. Ejemplos no limitantes de proteínas Cas incluyen Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocido como Csn1 y Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos de los mismos o versiones modificadas de los mismos. Estas enzimas son conocidas; por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína Cas9 de S. pyogenes se puede encontrar en la base de datos SwissProt con el número de acceso Q99ZW2. En alguna descripción de este documento, la enzima CRISPR no modificada tiene actividad de escisión de ADN, tal como Cas9. En alguna descripción de este documento, la enzima CRISPR es Cas9, y puede ser Cas9 de S. pyogenes o S. pneumoniae.

En alguna divulgación del presente documento, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas en la ubicación de una secuencia diana, tales como dentro de la secuencia diana y/o dentro del complemento de la secuencia diana. En alguna divulgación aquí, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, o más pares de bases del primer o último nucleótido de una secuencia diana. En alguna descripción de este documento, un vector codifica una enzima CRISPR que está mutada con respecto a una enzima de tipo silvestre correspondiente de tal manera que la enzima CRISPR mutada carece de la capacidad de escindir una o ambas cadenas de un polinucleótido diana que contiene una secuencia diana.

En alguna divulgación del presente documento, una secuencia de codificación que codifica una enzima CRISPR es de codones optimizados para la expresión en células particulares, tales como las células eucariotas. Las células eucariotas pueden ser las de un organismo particular o derivarse de él, como un mamífero, incluidos, entre otros, humanos, ratones, ratas, conejos, perros o primates no humanos. En general, la optimización de codones se refiere a un proceso de modificación de una secuencia de ácido nucleico para mejorar la expresión en las células huésped de interés mediante la sustitución de al menos un codón (por ejemplo, aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más codones) de la secuencia nativa con codones que se usan con mayor frecuencia en los genes de esa célula huésped mientras se mantiene la secuencia de aminoácidos nativa. Varias especies exhiben un sesgo particular para ciertos codones de un aminoácido particular. El sesgo de codones (diferencias en el uso de codones entre organismos) a menudo se correlaciona con la eficiencia de la traducción del ARN mensajero (ARNm), que a su vez se cree que depende, entre otras cosas, de las propiedades de los codones que se están traduciendo y la disponibilidad de transferir moléculas de ARN (ARNt). El predominio de los ARNt seleccionados en una célula es generalmente un reflejo de los codones utilizados con mayor frecuencia en la síntesis de péptidos. En consecuencia, los genes se pueden adaptar para una expresión génica óptima en un organismo determinado basado en la optimización de codones. Las tablas de uso de codones están fácilmente disponibles, por ejemplo, en la "Base de datos de uso de codones", y estas tablas se pueden adaptar de varias maneras. Ver Nakamura et al. (2000) Nucl. Acidos Res. 28: 292. Los algoritmos informáticos para codificar la optimización de una secuencia particular para la expresión en una célula huésped particular también están disponibles, como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, Pa.), también están disponibles. En alguna descripción de este documento, uno o más codones (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más, o todos los codones) en una secuencia que codifica una enzima CRISPR corresponden a los codones más frecuentemente usados para un aminoácido particular.

En general, una secuencia guía es cualquier secuencia de polinucleótido que tiene suficiente complementariedad con una diana secuencia de polinucleótidos para hibridar con la diana de secuencia y la secuencia específica de unión directa de un complejo de CRISPR con la secuencia diana. En alguna descripción de este documento, el grado de complementariedad entre una secuencia guía y su secuencia diana correspondiente, cuando se alinea de manera óptima usando un algoritmo de alineación adecuado, es aproximadamente o más de aproximadamente 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o más. La alineación óptima se puede determinar con el uso de cualquier algoritmo adecuado para alinear secuencias, cuyo ejemplo no limitante incluye el algoritmo Smith-Waterman, el algoritmo Needleman-Wunsch, algoritmos basados en la transformación Burrows-Wheeler (por ejemplo, el alineador Burrows-Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELa Nd (Illumina, San Diego, California), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn) y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). alguna divulgación aquí, una secuencia de guía es aproximadamente o más de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o más nucleótidos de longitud. En alguna descripción de este documento, una secuencia de guía es inferior a aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 o menos nucleótidos de longitud.

La capacidad de una secuencia guía para la secuencia específica de unión directa de un complejo de CRISPR a una secuencia diana puede ser evaluada por cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, se puede proporcionar los componentes de un sistema CRISPR suficiente para formar un complejo de CRISPR, incluida la secuencia de guía a analizar, a una célula huésped que tenga la secuencia diana correspondiente, tal como mediante transfección con vectores que codifican los componentes de la secuencia CRISPR, seguido de una evaluación de escisión de preferencia dentro de la secuencia diana, tal como por el ensayo Surveyor como se describe en este documento. De manera similar, la escisión de una secuencia de polinucleótidos diana puede evaluarse en un tubo de ensayo proporcionando la secuencia diana, los componentes de un complejo de CRISPR, incluida la secuencia guía a analizar y una secuencia guía de control diferente de la secuencia guía de prueba, y comparando la unión o tasa de escisión en la secuencia diana entre la prueba y las reacciones de la secuencia guía de control. Son posibles otros ensayos, y se les ocurrirán a los expertos en la materia.

Una secuencia guía se puede seleccionar para dirigirse a cualquier secuencia diana. En alguna descripción de este documento, la secuencia diana es una secuencia dentro de un genoma de una célula. Las secuencias diana ejemplares incluyen aquellas que son únicas en el genoma diana.

En alguna divulgación del presente documento, la enzima CRISPR es parte de una proteína de fusión que comprende uno o más dominios de proteína heterólogos (por ejemplo, aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más dominios además de la enzima CRISPR). Una proteína de fusión enzimática CRISPR puede comprender cualquier secuencia de proteína adicional, y opcionalmente una secuencia de enlace entre cualquiera de los dos dominios. Los ejemplos de dominios de proteínas que pueden fusionarse con una enzima CRISPR incluyen, sin limitación, etiquetas de epítopo, secuencias de genes informadores y dominios de proteínas que tienen una o más de las siguientes actividades: actividad de metilasa, actividad de desmetilasa, actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad del factor de liberación de la transcripción, actividad de modificación de histona, actividad de escisión de ARN y actividad de unión a ácido nucleico. Los ejemplos no limitantes de etiquetas de epítopo incluyen etiquetas de histidina (His), etiquetas V5, etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina de influenza (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G y etiquetas de tiorredoxina (Trx). Los ejemplos de genes informadores incluyen, pero no se limitan a, glutatión-5-transferasa (GST), peroxidasa de rábano picante (HRP), acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT) beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YFP) y proteínas autofluorescentes, incluida la proteína fluorescente azul (BFP). Una enzima CRISPR puede fusionarse con una secuencia génica que codifica una proteína o un fragmento de una proteína que se une a moléculas de ADN o a otras moléculas celulares, incluidas, entre otras, la proteína de unión a maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones de dominio de unión a ADN de Lex A (DBD), fusiones de dominio de unión a ADN GAL4A y fusiones de proteína del virus del herpes simple (HSV) BP16. Los dominios adicionales que pueden formar parte de una proteína de fusión que comprende una enzima CR ISPR se describen en el documento US20110059502. En alguna descripción de este documento, se usa una enzima CRISPR etiquetada para identificar la ubicación de una secuencia diana.

En un aspecto del objeto divulgado aquí, un gen informador que incluye pero no se limita a glutatión-5-transferasa (GST), peroxidasa de rábano (HRP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP), HcRed, DsRed, proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YFP) y proteínas autofluorescentes, incluida la proteína fluorescente azul (BFP), pueden introducirse en una

célula para codificar un producto genético que sirve como marcador para medir la alteración o modificación de la

expresión del producto génico. En una realización adicional de la materia descrita actualmente, la molécula de ADN

que codifica el producto génico puede introducirse en la célula a través de un vector. En una realización preferida del

objeto descrito aquí, el producto génico es luciferasa. En una realización adicional de la materia descrita actualmente,

se disminuye la expresión del producto génico.

En general, la divulgación de promotor en el presente documento del objeto descrito aquí comprende: 1) un promotor

Pol III completo, que incluye una caja TATA, una secuencia de elemento proximal (PSE), y una secuencia de elemento

distal (DSE); y 2) un segundo promotor básico de Pol III que incluye una caja PSE y TATA fusionada al extremo 5' del

DSE en orientación inversa. La caja TATA, que lleva el nombre de su secuencia de nucleótidos, es un determinante

principal de la especificidad de Pol III. Por lo general, se encuentra en una posición entre nt. -23 y -30 en relación con

la secuencia transcrita, y es un determinante primario del comienzo de la secuencia transcrita. El PSE generalmente

se encuentra entre nt. -45 y -66. El DSE mejora la actividad del promotor básico de Pol III. En el promotor HI, no hay

brecha entre el PSE y el d Se .

Promotores bidireccionales constan de: 1) un promotor de Pol III completo, convencional, unidireccional que contiene

3 elementos de control externos: una caja DSE, PSE, y TATA; y 2) un segundo promotor básico de Pol III que incluye

un PSE y una caja TATA fusionada al terminal 5' del DSE en orientación inversa. La caja TATA, que es reconocida

por la proteína de unión TATA, es esencial para reclutar Pol III en la región promotora. La unión de la proteína de

unión de TATA a la caja de TATA se estabiliza mediante la interacción de SNAPc con el PSE. Juntos, estos elementos

posicionan a Pol III correctamente para que pueda transcribir la secuencia expresada. El DSE también es esencial

para la actividad completa del promotor Pol III (Murphy et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12: 3247-3261; Mittal et al. (1996)

Mol. Cell Biol. 16: 1955-1965; Ford y Hernández (1997) J. Biol. Chem., 272: 16048-16055; Ford y otros (1998) Genes,

Dev., 12: 3528-3540; Hovde y otros (2002) Genes Dev. 16: 2772-2777). La transcripción se mejora hasta 1 O0 veces

mediante la interacción de los factores de transcripción Oct-1 y/o SBF/Staf con sus motivos dentro del DSE (Kunkel y

Hixon (1998) Nucl. Acid Res., 26: 1536-1543). Dado que los promotores básicos orientados hacia adelante e inverso

dirigen la transcripción de secuencias en cadenas opuestas de las plantillas de ADN bicatenario, la cadena positiva

del promotor básico orientado hacia atrás se adjunta al extremo 5' de la cadena negativa del DSE. Las transcripciones

expresadas bajo el control del promotor H1 están terminadas por una secuencia ininterrumpida de 4 o 5 T's.

En el promotor H1, la DSE es adyacente a la caja PSE y TATA (Myslinski et al (2001) Nucl Acid Res. 29: 2502-2509).

Para minimizar la repetición de la secuencia, este promotor se volvió bidireccional creando un promotor híbrido, en

donde la transcripción en la dirección inversa se controla agregando una caja PSE y TATA derivada del promotor U6.

Para facilitar la construcción del promotor HI bidireccional, también se puede insertar una pequeña secuencia

espaciadora entre el promotor básico orientado hacia atrás y el DSE.

B. Métodos

En alguna descripción de la presente memoria descriptiva, el objeto descrito aquí también proporciona un método para

alterar la expresión de uno o más productos génicos en una célula, en donde la célula comprende una molécula de

ADN que codifica el uno o más productos génicos, comprendiendo el método la introducción en la célula de un sistema

CRISPR-Cas de origen no natural que comprende uno o más vectores que comprende: a) un promotor HI unido

operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas

(ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de la molécula de ADN; y b) un elemento regulador

operable en la célula unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9, en donde

los componentes (a) y (b) están ubicados en los mismos o diferentes vectores del sistema, en donde el ARNg se dirige

e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN para alterar la expresión de uno o

más productos génicos.

En alguna descripción de este documento, el objeto descrito aquí también proporciona un método para alterar la

expresión de uno o más productos génicos en una célula eucariota, en donde la célula comprende una molécula de

a Dn que codifica el uno o más productos génicos, comprendiendo el método la introducción en la célula de un sistema

CRISPR-Cas de origen no natural que comprende uno o más vectores que comprenden: a) un promotor HI unido

operable en la célula eucariota operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9

de Tipo II, en donde los componentes (a) y (b) están ubicados en el mismo o diferentes vectores del sistema, por lo

que el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN, y por lo cual

se altera la expresión de uno o más productos génicos. En un aspecto, la secuencia diana puede ser una secuencia

diana que comienza con cualquier nucleótido, por ejemplo, N20NGG. En alguna descripción de este documento, la

secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG. En alguna descripción de este document secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos

alguna descripción de este document secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos alguna descripción de este document secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos TN19NGG. En alguna descripción de este document secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG o GN19NGG. En otro aspecto, la proteína Cas9 es

un codón optimizado para la expresión en la célula. En otro aspecto más, la proteína Cas9 es un codón optimizado

para la expresión en la célula eucariota. En otro aspecto, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En

otro aspecto, disminuye la expresión del uno o más productos génicos.

El objeto divulgado aquí también proporciona un método de expresión de alteración de uno o más productos génicos

en una célula eucariota, en donde la célula comprende una molécula de ADN que codifica uno o más productos

génicos, comprendiendo el método la introducción en la célula de un sistema CRISPR-Cas no de origen natural que

comprende un vector que comprende un promotor de HI bidireccional, en donde el promotor de HI bidireccional

comprende: a) elementos de control que proporcionan la transcripción en una dirección de al menos una secuencia

de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg hibrida con una

secuencia diana de la molécula de ADN; y b) elementos de control que proporcionan la transcripción en la dirección

opuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II, por lo que el ARNg se dirige e

hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN, y por lo tanto la expresión de la misma

o más productos genéticos están alterados. En un aspecto, la secuencia diana puede ser una secuencia diana que

comienza con cualquier nucleótido, por ejemplo, N20NGG. En alguna descripción de este documento, la secuencia

diana comprende la secuencia de nucleótidos AN19NGG. En alguna descripción de este documento, la sec diana comprende la secuencia

nucleótidos GN19NGG. En alguna descripción de este documento, la sec diana comprende la secuencia de nucleótidos CN19NGG. En alguna descripción de este documento, la sec diana comprende la secuencia de nucleótidos TN19NGG. En otro aspecto, la secuencia diana comprende la secuencia

de nucleótidos AN19NGG o GN19NGG. En otro aspecto, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en

la célula. En otro aspecto más, la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula eucariota. En

otro aspecto, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En otro aspecto, disminuye la expresión del

uno o más productos génicos.

En algunos aspectos, el objeto divulgado aquí proporciona métodos que comprenden la administración de uno o más

polinucleótidos, tales como o uno o más vectores como se describe aquí, una o más transcripciones del mismo, y/o

una o más proteínas transcritas del mismo, a una célula huesped. En algunos aspectos, el objeto descrito aquí

proporciona además células producidas por tales métodos y organismos (tales como animales, plantas u hongos) que

comprenden o se producen a partir de tales células. En alguna descripción de este documento, una enzima CRISPR

en combinación con (y opcionalmente complejada con) una secuencia guía se administra a una célula. Los métodos

convencionales de transferencia de genes basados en virus y no virus se pueden usar para introducir ácidos nucleicos

en células de mamíferos o tejidos diana. Tales métodos pueden usarse para administrar ácidos nucleicos que codifican

componentes de un sistema CRISPR a células en cultivo, o en un organismo huésped. Los sistemas de administración

de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ARN (por ejemplo, una transcripción de un vector descrito aquí),

ácido nucleico desnudo y ácido nucleico complejado con un vehículo de administración, tal como un liposoma. Los

sistemas de administración de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o

integrados después de la administración a la célula. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, ver

Anderson (1992) Science 256: 808-813; Nabel y Felgner (1993) TIBTECH 11: 211-217; Mitani y Caskey (1993)

TIBTECH 11: 162-166; Dillon (1993) TIBTECH 11: 167-175; Miller (1992) Nature 357: 455-460; Van Brunt (1998)

Biotechnology 6 (10): 1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36; Kremer y

Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51 (1): 31-44; Haddada y col. (1995) Current Topics in Microbiology and

Immunology. Doerfler y Bohm (eds); y Yu et al. (1994) Gene Therapy 1: 13-26.

Los métodos de suministro no viral de ácidos nucleicos incluyen lipofección, nucleofección, microinyección, biolística,

virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o lípidos: conjugados de ácido nucleico, ADN desnudo, viriones

artificiales y captación de ADN potenciada por el agente. La lipofección se describe, por ejemplo, en la patente de

EE.UU. Nos 5,049,386, 4,946,787; y 4,897,355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo,

Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección eficiente de

polinucleótidos con reconocimiento de receptor incluyen los de Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024. El suministro

puede ser a células (por ejemplo, administración in vitro o ex vivo) o tejidos diana (por ejemplo, administración in vivo).

La preparación de complejos de lípido: ácido nucleico, incluidos liposomas dirigidos tales como complejos de

inmunolípido, es bien conocido para un experto en la técnica (por ejemplo, Crystal (1995) Science 270: 404-410;

Blaese et al (1995) Cancer Gene Ther. 2: 291-297: Behr et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5: 382-389; Remy et al.

(1994) Bioconjugate Chem. 5: 647-654; Gao et al. (1995) Gene Therapy 2: 710-722; Ahmad et al. (1992) Cancer Res.

52: 4817-4820; Patentes de los Estados Unidos Nos 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054,

4,501,728, 4,774,085, 4,837,028 y 4,946,787).

El uso de sistemas basados en virus de ARN o ADN para la administración de ácidos nucleicos aprovecha los

altamente evolucionados procesos para dirigir un virus a células específicas en el cuerpo y el tráfico de la carga útil

viral al núcleo. Los vectores virales pueden administrarse directamente a pacientes (in vivo) o pueden usarse para

tratar células in vitro, y las células modificadas pueden administrarse opcionalmente a pacientes (ex vivo). Los

sistemas convencionales basados en virus podrían incluir vectores retrovirales, lentivirus, adenovirales,

adenoasociados y del virus del herpes simple para la transferencia de genes. La integración en el genoma del huésped

es posible con los métodos de transferencia génica de virus retrovirus, lentivirus y adenoasociados, lo que a menudo

resulta en la expresión a largo plazo del transgen insertado. Además, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos diferentes de células y tejidos diana.

El tropismo de un retrovirus puede alterarse por incorporación de proteínas de la envoltura exterior, la ampliación de la potencial población diana de células diana. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que son capaces de transducir o infectar células que no se dividen y típicamente producen altos títulos virales. La selección de un sistema de transferencia génica retroviral dependería, por lo tanto, del tejido diana. Los vectores retrovirales están compuestos por repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento de hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR mínimas de acción cis son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de los vectores, que luego se utilizan para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar una expresión transgénica permanente. Los vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia Simian (SIV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y sus combinaciones (p. ej., Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66: 2731 2739; Johann y col. (1992) J. Virol. 66: 1635-1640; Sommnerfelt y col. (1990) J. Virol. 176: 58-59; Wilson y col. (1989) J. Virol. 63: 2374-2378; Miller y otros (1991) J. Virol. 65: 2220-2224; PCT/US94/05700). En aplicaciones donde se prefiere la expresión transitoria, se pueden usar sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con tales vectores, se han obtenido un alto título y niveles de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Los vectores de virus adenoasociados ("AAV") también pueden usarse para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (por ejemplo, West et al. (1987) Virology 160: 38 47; Patente de los Estados Unidos N° 4,797,368; WO 93/24641; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94: 1351 La construcción de vectores de AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, incluyendo la patente de los Estados Unidos Núm. 5.173,414; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260; Tratschin et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081; Hermonat y Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81: 6466-6470; y Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 03822-3828.

Las células de empaquetamiento se usan típicamente para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula huésped. Dichas células incluyen 293 células, que empaquetan adenovirus, y células ^2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores virales utilizados en terapia génica se generan usualmente mediante la producción de una línea celular que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores típicamente contienen las secuencias virales mínimas requeridas para el empaquetamiento y la posterior integración en un huésped, siendo reemplazadas otras secuencias virales por un casete de expresión para que se expresen los polinucleótidos. Las funciones virales faltantes son típicamente suministradas en trans por la línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores de AAV usados en terapia génica típicamente poseen secuencias de ITR del genoma de AAV que se requieren para el empaquetamiento y la integración en el genoma del huésped. El ADN viral está empaquetado en una línea celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes AAV, a saber, rep y cap, pero que carece de secuencias ITR. La línea celular también puede infectarse con adenovirus como ayudante. El virus auxiliar promueve la replicación del vector AAV y la expresión de genes AAV a partir del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no está empaquetado en cantidades significativas debido a la falta de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus puede reducirse mediante, por ejemplo, un tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que el AAV. Los expertos en la técnica conocen métodos adicionales para el suministro de ácidos nucleicos a las células. Ver, por ejemplo, US20030087817.

En alguna divulgación del presente documento, se describe en el presente documento una célula huésped es transfectada transitoria o no transitoriamente con uno o más vectores. En alguna descripción de este documento, una célula se transfecta como ocurre naturalmente en un sujeto. En alguna divulgación en el presente documento, una célula que se transfecta se toma de un sujeto. En alguna descripción de este documento, la célula se deriva de células tomadas de un sujeto, tal como una línea celular. En la técnica se conoce una amplia variedad de líneas celulares para el cultivo de tejidos. Los ejemplos de líneas celulares incluyen, entre otros, C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panel, PC- 3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI- 231, HB56, TIB55, Jurkat, J45,01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264,7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, epitelial de riñón de mono BS-C-1, fibroblastos de embriones de ratón BALB/3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, fibroblastos fetales humanos 132-d5; 10.1 fibroblastos de ratón, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, células BCP-1, BEAS-2B, bEnd,3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO DhfH-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10,0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepalclc7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, células JY, células K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-MeI 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB -231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0,2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI -H69/LX20, NCIH69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, líneas celulares OPCN/OPCT, Peer, PNT-1A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, células Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, línea celular THP1, U373, U87, U937, VCaP, células Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR y variedades transgenicas de los mismos. Las líneas celulares están disponibles en una variedad de fuentes conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Va.)). En alguna descripción de la presente memoria, una célula transfectada con uno o más vectores descritos en la presente memoria se usa para establecer una nueva línea celular que comprende una o más secuencias derivadas de vectores. En alguna descripción de este documento, se usa una célula transfectada transitoriamente con los componentes de un sistema CRISPR como se describe en este documento (tal como por transfección transitoria de uno o más vectores, o transfección con ARN), y modificada a través de la actividad de un complejo de CRISPR, se utiliza para establecer una nueva línea celular que comprende células que contienen la modificación pero que carecen de cualquier otra secuencia exógena. En alguna descripción de este documento, las células transfectadas transitoriamente o no transitoriamente con uno o más vectores descritos en este documento, o las líneas celulares derivadas de tales células se usan para evaluar uno o más compuestos de prueba.

En alguna descripción de este documento, uno o más vectores descritos en este documento se utilizan para producir un animal transgénico no humano. En alguna descripción de este documento, el animal transgénico es un mamífero, tal como un ratón, rata o conejo. En cierta divulgación en este documento, el organismo o sujeto es una planta. Los métodos para producir animales transgénicos son conocidos en la técnica, y generalmente comienzan con un método de transfección celular, tal como se describe en el presente documento.

En un aspecto, el objeto divulgado aquí proporciona métodos para la modificación de un polinucleótido diana en una célula eucariota, que puede ser in vivo, ex vivo o in vitro. En alguna descripción de este documento, el método comprende tomar muestras de una célula o población de células de un animal humano o no humano, y modificar la célula o las células. El cultivo puede ocurrir en cualquier etapa ex vivo. La célula o células pueden incluso reintroducirse en el animal no humano.

En un aspecto, el objeto divulgado aquí proporciona métodos para la modificación de un polinucleótido diana en una célula eucariota. En alguna descripción de este documento, el método comprende permitir que un complejo de CRISPR se una al polinucleótido diana para efectuar la escisión del polinucleótido diana modificando de ese modo el polinucleótido diana, en donde el complejo de CRISPR comprende una enzima CRISPR compleja con una secuencia guía hibridada a una secuencia diana dentro del polinucleótido diana.

En un aspecto, el objeto divulgado aquí proporciona un método de modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota. En alguna descripción de este documento, el método comprende permitir que un complejo de CRISPR se una al polinucleótido de manera que la unión da como resultado una expresión aumentada o disminuida del polinucleótido; en donde el complejo de CRISPR comprende una enzima CRISPR compleja con una secuencia guía hibridada con una secuencia diana dentro del polinucleótido.

En un aspecto, el objeto divulgado aquí proporciona métodos para usar uno o más elementos de un sistema de CRISPR. El complejo de CRISPR del objeto descrito aquí proporciona un medio eficaz para modificar un polinucleótido diana. El complejo de CRISPR del objeto descrito aquí tiene una amplia variedad de utilidad que incluye modificar (por ejemplo, eliminar, insertar, translocar, inactivar, activar) un polinucleótido diana en una multiplicidad de tipos de células. Como tal, el complejo de CRISPR de la materia actualmente divulgada tiene un amplio espectro de aplicaciones en, por ejemplo, terapia génica, detección de drogas, diagnóstico de enfermedades y pronóstico. Un complejo de CRISPR ejemplar comprende una enzima CRISPR compleja con una secuencia guía hibridada con una secuencia diana dentro del polinucleótido diana.

El polinucleótido diana de un complejo de CRISPR puede ser cualquier polinucleótido endógeno o exógeno a la célula eucariota. Por ejemplo, el polinucleótido diana puede ser un polinucleótido que reside en el núcleo de la célula eucariota. El polinucleótido diana puede ser una secuencia que codifica un producto génico (por ejemplo, una proteína) o una secuencia no codificante (por ejemplo, un polinucleótido regulador o un ADN basura). Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que la secuencia diana debe estar asociada con un PAM (motivo adyacente protoespaciador); es decir, una secuencia corta reconocida por el complejo de CRISPR. La secuencia precisa y los requisitos de longitud para el PAM difieren dependiendo de la enzima CRISPR utilizada, pero los PAM son típicamente secuencias de 2-5 pares de bases adyacentes al protoespaciador (es decir, la secuencia diana). Se dan ejemplos de secuencias PAM en la sección de ejemplos a continuación, y la persona experta podrá identificar secuencias PAM adicionales para usar con una enzima CRISPR dada.

Los ejemplos de polinucleótidos diana incluyen una secuencia asociada con una ruta bioquímica de señalización, por ejemplo, un gen o polinucleótido asociado a la ruta bioquímica de señalización. Los ejemplos de polinucleótidos diana incluyen un gen o polinucleótido asociado con la enfermedad. Un gen o polinucleótido "asociado a la enfermedad" se refiere a cualquier gen o polinucleótido que genera productos de transcripción o traducción a un nivel anormal o en una forma anormal en células derivadas de tejidos afectados por la enfermedad en comparación con tejidos o células de un control sin enfermedad. Puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente bajo, donde la expresión alterada se correlaciona con la aparición y/o progresión de la enfermedad. Un gen asociado a una enfermedad también se refiere a un gen que posee mutación(es) o variación genética que es directamente responsable o está en desequilibrio de enlace con uno o más genes que son responsables de la etiología de una enfermedad. Los productos transcritos o traducidos pueden ser conocidos o desconocidos, y pueden estar en un nivel normal o anormal.

La presente divulgación del objeto descrito aquí también se refiere a métodos y composiciones relacionadas con la eliminación de genes, amplificación de genes y reparación de mutaciones particulares asociadas con la inestabilidad de repetición de ADN y trastornos neurológicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Segunda Edición, Academic Press, 13 de octubre de 2011-Medical). Se ha encontrado que los aspectos específicos de las secuencias repetidas en tándem son responsables de más de veinte enfermedades humanas (McIvor et al. (2010) RNA Biol. 7 (5): 551-8). El sistema CRISPR-Cas puede aprovecharse para corregir estos defectos de inestabilidad genómica.

En aún otro aspecto de la materia dada a conocer actualmente, el sistema de CRISPR-cas puede utilizarse para corregir defectos oculares que surgen de varias mutaciones genéticas descritas adicionalmente en Traboulsi, ed. (2012) Genetic Diseases of the Eye, Segunda Edición, Oxford University Press.

Varios aspectos adicionales del objeto divulgado aquí se refieren a la corrección de los defectos asociados con una amplia gama de enfermedades genéticas. Por ejemplo, las enfermedades genéticas cerebrales pueden incluir, entre otras, adrenoleucodistrofia, agenesia del cuerpo calloso, síndrome de Aicardi, enfermedad de Alpers. Enfermedad de Alzheimer, Síndrome de Barth, Enfermedad de Batten, CADASIL, Degeneración Cerebelosa, Enfermedad de Fabry, Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Enfermedad de Huntington y otros trastornos por triplete, Enfermedad de Leigh, Síndrome de Lesch-Nyhan, Enfermedad de Menkes, Miopatías Mitocondriales y Colpocefalia NINDS.

En alguna divulgación del presente documento, la condición puede ser neoplasia. En alguna divulgación en este documento, la condición puede ser degeneración macular relacionada con la edad. En alguna divulgación aquí, la condición puede ser un trastorno esquizofrénico. En alguna descripción de este documento, la condición puede ser un trastorno por repetición de trinucleótidos. En alguna divulgación aquí, la condición puede ser el Síndrome X Frágil. En alguna divulgación aquí, la condición puede ser un trastorno relacionado con secretasa. En alguna divulgación en este documento, la afección puede ser un trastorno relacionado con el Prión. En alguna divulgación aquí, la condición puede ser ALS. En alguna divulgación aquí, la condición puede ser una adicción a las drogas. En alguna divulgación aquí, la condición puede ser autismo. En alguna divulgación aquí, la condición puede ser la enfermedad de Alzheimer. En alguna divulgación aquí, la condición puede ser inflamación. En alguna divulgación aquí, la condición puede ser la enfermedad de Parkinson.

Los ejemplos de proteínas asociadas con la enfermedad de Parkinson incluyen, pero sin limitación, a-sinucleína, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkin, UCHL1, Sinfilina-1 y NURR1.

Los ejemplos de proteínas relacionadas con la adicción pueden incluir ABAT, por ejemplo.

Los ejemplos de proteínas relacionadas con la inflamación pueden incluir la proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP1) codificada por el gen Ccr2, el receptor de quimiocina C-C tipo 5 (CCR5) codificado por el gen Ccr5, el receptor de IgG IIB (FCGR2b, también denominado CD32) codificado por el gen Fcgr2b, o la proteína Fc epsilon R1g (FCER1g) codificada por el gen Fcerlg, por ejemplo.

Los ejemplos de proteínas asociadas a enfermedades cardiovasculares pueden incluir IL1B (interleucina 1, beta), XDH (xantina deshidrogenasa), TP53 (proteína tumoral p53), PTGIS (prostaglandina 12 (prostaciclina) sintasa), MB (mioglobina), IL4 (interleucina 4), ANGPT1 (angiopoyetina 1), ABCG8 (casete de unión a ATP, subfamilia G (BLANCO), miembro 8) o CTSK (catepsina K), por ejemplo.

Los ejemplos de proteínas asociadas a la enfermedad de Alzheimer pueden incluir la proteína del receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR) codificada por el gen VLDLR, la enzima activadora del modificador similar a la ubiquitina 1 (UBA1) codificada por el gen UBA1 o la proteína de subunidad catalítica (UBE1C) de enzima activadora NEDD8 E1 codificada por el gen UBA3, por ejemplo.

Los ejemplos de trastorno del espectro autista asociado a proteínas pueden incluir la proteína 1 (BZRAP1) asociada al receptor de benzodiazapina (periférica) codificada por el gen BZRAP1, la proteína miembro de la familia AF4/FMR2 2 (AFF2) codificada por el gen AFF2 (también denominada MFR2), la proteína de homólogo 1 autosómico retardado mental X frágil (FXR1) codificada por el gen FXR1, o la proteína de homólogo 2 autosómico retardado mental frágil X (FXR2) codificada por el gen FXR2, por ejemplo.

Los ejemplos de Degeneración Macular asociada a proteínas pueden incluir el casete de unión a ATP, la proteína miembro 4 de la subfamilia A (ABC1) (ABCA4) codificada por el gen ABCR, la proteína de la apolipoproteína E (APOE) codificada por el gen APOE, o la proteína ligando 2 de quimiocina (motivo C-C) (CCL2) codificada por el gen CCL2, por ejemplo.

Los ejemplos de esquizofrenia asociada a proteínas pueden incluir NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, DISCI, GSK3B y combinaciones de los mismos.

Los ejemplos de proteínas implicadas en la supresión tumoral pueden incluir ATM (ataxia telangiectasia mutada), ATR (ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3), EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), ERBB2 (v-erbb2 leucemia eritroblástica homóloga viral 2), ERBB3 (homólogo 3 de oncogén viral de leucemia eritroblástica v-erbb2), ERBB4 (homólogo 4 de oncogén viral de leucemia eritroblástica verb-b2), Notch 1, Notch 2, Notch 3 o Notch 4, por ejemplo.

Los ejemplos de proteínas asociadas con un trastorno de secretasa pueden incluir PSENEN (homólogo de potenciador de presenilina 2 (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (proteína precursora de beta amiloide (A4)), APH1B (faringe anterior defectuosa 1 homólogo B (C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (enfermedad de Alzheimer 4)) o BACE1 (enzima 1 de empalme de APP de sitio de beta), por ejemplo.

Los ejemplos de proteínas asociadas con la esclerosis lateral amiotrófica pueden incluir SOD1 (superóxido dismutasa 1), a LS2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionada en sarcoma), TARDBP (proteína de unión a ADN TAR), VAGFA (factor de crecimiento endotelial vascular A), VAGFB (factor de crecimiento endotelial vascular B) y VAGFC (factor de crecimiento endotelial vascular C), y cualquier combinación de los mismos.

Los ejemplos de proteínas asociadas con enfermedades priónicas pueden incluir SODI (superóxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionado en sarcoma), TARDBP (proteína de unión al ADN TAR), VAGFA (factor de crecimiento endotelial vascular A), VAGFB (factor de crecimiento endotelial vascular B) y VAGFC (factor de crecimiento endotelial vascular C), y cualquier combinación de los mismos.

Los ejemplos de proteínas relacionadas con afecciones neurodegenerativas en trastornos de priones pueden incluir A2M (Alfa-2- Macroglobulina), AATF (factor de transcripción antagonista de la apoptosis), ACPP (próstata de fosfatasa ácida), ACTA2 (aorta del músculo liso Actina alfa 2), ADAM22 (Dominio de metalopeptidasa ADAM), ADORA3 (receptor de adenosina A3) o ADRA1D (receptor adrenérgico Alfa-ID para el adrenoreceptor Alfa-ID), por ejemplo.

Los ejemplos de proteínas asociadas con la inmunodeficiencia pueden incluir A2M [alfa-2-macroglobulina]; AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa]; ABCA1 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1]; ABCA2 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 2]; o ABCA3 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 3]; por ejemplo.

Los ejemplos de proteínas asociadas con los trastornos por repetición de trinucleótidos incluyen AR (receptor de andrógenos), FMR1 (retraso mental X frágil 1), HTT (huntingtina) o DMPK (distrofia miotonica-proteína quinasa), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2) por ejemplo.

Los ejemplos de proteínas asociadas con los trastornos de neurotransmisión incluyen SST (somatostatina), NOS1 (óxido nítrico sintasa 1 (neuronal)), ADRA2A (receptor adrenérgico, alfa-2A-), ADRA2C (receptor adrenérgico, alfa-2C-), TACR1 (receptor de taquiquinina 1) o HTR2c (receptor de 5-hidroxitriptamina (serotonina) 2C), por ejemplo.

Los ejemplos de secuencias asociadas al desarrollo neurológico incluyen A2BP1 (proteína 1 de unión a ataxina 2), AADAT (aminoadipato aminotransferasa), AANAT (arilalquilamina N-acetiltransferasa), ABAT (4-aminobutirato aminotransferasa), ABCA1 (casete de unión a ATP, casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1), o ABCA13 (casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 13), por ejemplo.

Se pueden seleccionar ejemplos adicionales de afecciones preferibles tratables con el presente sistema de: Síndrome de Aicardi-Goutiéres; Enfermedad de Alexander; Síndrome de Allan-Herndon-Dudley; Trastornos relacionados con POLG; Alfa-Manosidosis (Tipo II y III); Síndrome de Alstrom; Síndrome de Angelman; Ataxia-telangiectasia; lipofuscinosis neuronal ceroidea; Beta-talasemia; Atrofia óptica bilateral y Atrofia óptica (infantil) tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Enfermedad de Canavan; Síndrome 1 cerebrobroculofacioesquelético (COFS1); Xantomatosis cerebrotendinosa; Síndrome de Cornelia de Lange; Trastornos relacionados con MAPT; Enfermedades genéticas por priones; Síndrome de Dravet; Enfermedad de Alzheimer familiar de inicio temprano; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Síndrome de Fryns; Fucosidosis; Distrofia muscular congénita de Fukuyama; Galactosialidosis; Enfermedad de Gaucher; Acidemias orgánicas; Linfohistiocitosis hemofagocítica; Síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidosis II; Enfermedad de almacenamiento de ácido siálico libre infantil; Neurodegeneración asociada a PLA2G6; Síndrome de Jervell y Lange-Nielsen; Epidermólisis Bullosa de la Unión; Enfermedad de Huntington; Enfermedad de Krabbe (infantil); Síndrome de Leigh asociado a ADN mitocondrial y NARP; Síndrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia asociada a LIS1; Síndrome de Lowe; Jarabe de arce, enfermedad de la orina; Síndrome de duplicación MECP2; Trastornos de transporte de cobre relacionados con ATP7A; Distrofia muscular relacionada con LAMA2; Deficiencia de arilsulfatasa A; Mucopolisacaridosis Tipos I, II o III; Trastornos de biogénesis de peroxisomas, espectro del síndrome de Zellweger; Neurodegeneración con trastornos de acumulación de hierro en el cerebro; Deficiencia de esfingomielinasa ácida; Enfermedad de Niemann-Pick tipo C; Encefalopatía por glicina; Trastornos relacionados con ARX; Trastornos del ciclo de la urea; Osteogénesis imperfecta relacionada con COL1A 1/2; Síndromes de deleción de ADN mitocondrial; Trastornos relacionados con PLP1; Síndrome de Perry; Síndrome de Phelan-McDermid; Enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo II (enfermedad de Pompe) (infantil); Trastornos relacionados con MAPT; Trastornos relacionados con MECP2; Condrodisplasia Rizomelica Punctata Tipo 1; Síndrome de Roberts; Enfermedad de Sandhoff; Enfermedad de Schindler-Tipo 1; Deficiencia de adenosina desaminasa; Síndrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia muscular espinal, ataxia espinocerebelosa de inicio infantil; Deficiencia de hexosaminidasa A; Displasia tanatofórica tipo 1; Trastornos relacionados con el colágeno tipo VI; Síndrome Usher Tipo I; Distrofia muscular congénita; Síndrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiencia de lipasa ácida lisosómica; y Xeroderma pigmentoso.

II. RIBOZIMAS DE ARN Y APTAZIMAS REGULABLES PARA EXPRESAR Y REGULAR LA EXPRESIÓN DE ARNg IN VIVO.

El objeto descrito aquí también se refiere al uso de ribozimas de ARN y aptazimas regulables para expresar y regular la expresión de ARNm in vivo, particularmente el uso de una ribozima de cabeza de martillo 5' para el procesamiento cis de ARN guía con especificidad de 1er nucleótido sin restricciones y regulación in vivo de la función de ARNg a través de aptazimas de ARN.

En consecuencia, el objeto descrito aquí también proporciona una ribozima regulada por un aptámero, que comprende: a) una ribozima de cabeza de martillo de actuación cis que comprende un núcleo catalítico y regiones dúplex de hélice I, hélice II y hélice III que se extienden desde allí, en donde la región dúplex de hélice II y la región dúplex de hélice III comprenden cada una una región de bucle opuesta al núcleo catalítico, y en donde la región dúplex de hélice II comprende un aptámero que se une a un ligando; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula eucariota, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula eucariota, en donde la secuencia de nucleótidos comprende un extremo 5' y un extremo 3', y en donde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos está directamente acoplado a la región dúplex de hélice III; en donde la unión del ligando al aptámero produce un cambio conformacional en la ribozima de tal manera que la ribozima sufre auto escisión entre el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos y la región dúplex de la hélice III, por lo que se produce el ARNg. También se proporciona una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de codificación que, cuando se transcribe a ARN, produce la ribozima regulada por aptámero; y (ii) una o más secuencias reguladoras de la transcripción que regulan la transcripción del ARN en una célula eucariota. También se proporciona una célula eucariota que comprende la construcción de expresión. Un método de alterar la expresión de uno o también se proporciona más productos génicos en una célula eucariota, en donde la célula comprende una molécula de ADN que codifica los uno o más productos génicos, comprendiendo el método introducir el constructo de expresión en la célula y en contacto la célula con el ligando en una cantidad que altera la actividad de la ribozima, particularmente en donde la célula está en un mamífero o un ser humano. En un aspecto, el ligando es teofilina.

Las ribozimas son moléculas de ARN que catalizan una variedad de reacciones químicas tales como la autoescisión o la ligadura (Long y Uhlenbeck (1993) FASEB J. 7: 25-30). Se han identificado varias ribozimas naturales en virus, viroides y protozoos. Uno de los primeros ARN catalíticos se descubrió en el ARN satélite del viroide de la mancha de anillo de tabaco (sTRSV) (De la Pena et al. (2003) EMBO J. 22: 5561-70). In vivo, se demostró que este viroide patógeno actúa en cis y se auto-corta durante la replicación. Desde el descubrimiento de la primera ribozima, se han identificado y caracterizado ampliamente varias clases de ribozimas naturales, incluidas las ribozimas de horquilla y cabeza de martillo.

La ribozima de cabeza de martillo (HRZ) es una de las ribozimas más estudiadas (Long y Uhlenbeck (1993) Faseb J.

7: 25-30; Pley et al (1994) Nature 372: 68-74; Hammann et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98: 5503-8; Blount y Uhlenbeck (2005) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34: 415-40). Se compone de tres regiones helicoidales que convergen en un núcleo catalítico altamente conservado de once nucleótidos (nts) (Khvorova et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10: 708-12; Salehi-Ashtiani y Szostak (2001) Nature 414: 82-4). La escisión es de secuencia específica y se dirige a un triplete 5'-NUX-3 ', donde N es cualquier base, U es uracilo y X es cualquier base, excepto guanina. El NUX óptimo para una escisión eficiente y rápida es GUC. La escisión de la ribozima se cataliza cuando el grupo hidroxilo 2' de X directamente 3' del sitio de escisión se desprotona. Este nucleófilo ataca luego el fosfato escindible y, a través de un estado de transición bipiramidal trigonal coordinado por penta, produce un producto 5' y 3' (Blount y Uhlenbeck (2005) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34: 415-40).

Se postula el plegamiento de la hRz en una conformación activa para proceder a través de eventos de unión de iones divalentes duales. Se produce un evento de unión de alta afinidad a 500 pM y ordena el primer conjunto de interacciones terciarias. La segunda adición de iones de baja afinidad se produce a 10 mM y reestructura las orientaciones del tallo hRz de tal manera que la hélice I se separa de la hélice III e interactúa con la hélice II (Hammann et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98: 5503-8). Las HRz con núcleos catalíticos conservados que no mantienen bucles de tallo específicos se denominan ribozimas de cabeza de martillo (mhRzs) mínimas. Mientras que los mhRz son activos a altas concentraciones de iones divalentes (10 mM), a concentraciones más bajas los mhRz son efectivamente inertes (De la Pena et al. (2003) EMBO J., 22: 5561-70; Khvorova et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10: 708 12). Las estructuras cristalinas de hRz natural representan una molécula en forma de "Y" que tiene dos de los bucles del tallo que interactúan como "bucles de beso" (Pley et al. (1994) Nature. 372: 68-74). Estas interacciones terciarias entre bases no apareadas en los bucles del tallo se proponen para estabilizar la conformación catalíticamente activa y evitar condiciones de iones divalentes altos. Los investigadores han demostrado una actividad catalítica in vitro restaurada a concentraciones de iones divalentes biológicamente relevantes, entre 100 y 500 pM, reincorporando los bucles en diseños mhRz (De la Pena et al. (2003) EMBO J. 22: 5561-70; Khvorova et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10: 708-12; Canny et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126: 10848-9; Penedo et al. (2004) ARN 10: 880 -8; Saksmerprome et al. (2004) RNA 10: 1916-24; Weinberg y Rossi (2005) FEBS Lett. 579: 1619-24). A través de la elucidación de las reglas de diseño para la actividad catalítica in vivo, hRz está ahora preparado para ser un regulador eficaz de la expresión génica.

En consecuencia, una ribozima de cabeza de martillo contiene un núcleo, tres tallos que se extienden desde el núcleo. Los términos "tallo" y "hélice" pueden usarse indistintamente en el presente documento. En consecuencia, los tres tallos que se extienden desde el núcleo se denominan aquí tallo I, tallo II y tallo III (o hélice I, hélice II y hélice III), y al menos un bucle, que se encuentra en el extremo opuesto de un tallo del núcleo. En la divulgación en el presente documento de ribozimas que actúan en cis, la ribozima contiene dos bucles, uno ubicado en el extremo del tallo II (o hélice II) y el otro ubicado en el extremo del tallo II (o hélice III).

Como se usa en este documento, un "ribozima de cabeza de martillo de escisión cis" es una ribozima de cabeza de martillo que, antes de la escisión, se compone de un solo polinucleótido. Una ribozima de cabeza de martillo de escisión cis es capaz de escindirse.

Un tallo (o hélice) es un motivo de ácido nucleico que se extiende desde el núcleo de la ribozima, al menos una porción de la cual está doblemente trenzada. En cierta descripción de este documento, hay un bucle en el extremo opuesto del tallo desde el núcleo de la ribozima, y este bucle conecta las dos hebras del tallo bicatenario. En cierta descripción de este documento, un tallo comprende de 2 a 20 pares de bases complementarias. En cierta descripción en el presente documento, un tallo comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 pares de bases complementarias.

En cierta divulgación en el presente documento, al menos el 30% de los nucleótidos en un tallo son parte de un par de bases complementarias. Los pares de bases restantes pueden ser pares de bases no complementarios, no coincidentes, o pueden ser parte de una protuberancia. En cierta descripción en el presente documento, al menos el 40% de los nucleótidos en un tallo son parte de un par de bases complementarias. En cierta divulgación en el presente documento, al menos el 50% de los nucleótidos en un tallo son parte de un par de bases complementarias. En cierta divulgación en el presente documento, al menos el 60% de los nucleótidos en un tallo son parte de un par de bases complementarias. En cierta divulgación en el presente documento, al menos el 70% de los nucleótidos en un tallo son parte de un par de bases complementarias. En cierta divulgación en el presente documento, al menos el 80% de los nucleótidos en un tallo son parte de un par de bases complementarias. En cierta divulgación en el presente documento, al menos el 90% de los nucleótidos en un tallo son parte de un par de bases complementarias. En cierta divulgación en el presente documento, al menos el 95% de los nucleótidos en un tallo son parte de un par de bases complementarias. En cierta divulgación en el presente documento, al menos el 99% de los nucleótidos en un tallo son parte de un par de bases complementarias. En cierta descripción de este documento, el 100% de los nucleótidos en un tallo son parte de un par de bases complementarias.

Un bucle es una secuencia de nucleótidos que no está emparejada con otra hebra y está ubicada en el extremo distal de un tallo que está opuesto al núcleo. En cierta divulgación en el presente documento, un bucle tiene una longitud de entre 1 y 20 nucleótidos. En cierta divulgación en el presente documento, un bucle tiene una longitud de entre 2 y 10 nucleótidos. En cierta divulgación en el presente documento, un bucle tiene una longitud de entre 3 y 8 nucleótidos. El bucle se numera de acuerdo con el tallo al que está unido. Por lo tanto, el bucle I está ubicado en el extremo del tallo I opuesto al núcleo, el bucle II está ubicado en el extremo del tallo II opuesto al núcleo y el bucle III está ubicado en el extremo del tallo III opuesto al núcleo.

Como se usa en el presente documento, un "tallo/bucle" se refiere a todo el tallo (o hélice), junto con cualquier bulto dentro de ese tallo, y el bucle al final del tallo. Por ejemplo, el tallo/bucle II incluye el tallo II, incluidas las protuberancias dentro del tallo II y el bucle II. Si un tallo carece de un lazo, entonces tallo/lazo se refiere al tallo, junto con cualquier bulto dentro de ese tallo. Como se usa en el presente documento, un "bulto" es una secuencia de nucleótidos que no está emparejada con otra cadena y está flanqueada en ambos lados por secuencias de ácido nucleico de doble cadena. En cierta divulgación en el presente documento, una protuberancia se encuentra dentro de un tallo. Cuando una protuberancia se encuentra dentro de un tallo, los nucleótidos de la protuberancia se consideran parte del tallo. En cierta divulgación en el presente documento, una ribozima de cabeza de martillo comprende más de un bulto. En cierta divulgación en el presente documento, una protuberancia dentro de un tallo se encuentra a dos pares de bases del núcleo. En cierta divulgación en el presente documento, uno o ambos hilos del tallo contienen una protuberancia.

Como se usa en el presente documento, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARNc del sistema CRISPR-Cas comprende un extremo 5' y un extremo 3', y el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos se acopla directamente a la región dúplex de la hélice III. "Acoplado directamente" significa que el bucle, en relación con la estructura activa de la ribozima en ausencia del aptámero, se interrumpe en un solo enlace de fosfodiéster de la columna vertebral entre dos residuos del bucle, reemplazando el enlace de fosfodiéster de la columna vertebral con enlaces de fosfodiéster a los extremos 5' y 3' del aptámero. En la forma activa de la ribozima regulada por el aptámero, los residuos 5' y 3' del dominio de transmisión de información se emparejan entre sí para formar una región dúplex con el fin de preservar la estructura del bucle interrumpido.

"Ligando" o "analito" o equivalentes gramaticales en el presente documento se refieren a cualquier molécula o compuesto a detectar y que pueden interactuar con un aptámero para ser diseñado y/o seleccionado como se describe aquí. Los ligandos o analitos adecuados incluyen, pero no se limitan a pequeñas moléculas químicas tales como químicos ambientales o clínicos, contaminantes o biomoléculas, que incluyen, entre otros, pesticidas, insecticidas, toxinas, drogas terapéuticas y de abuso, hormonas, antibióticos, anticuerpos, materiales orgánicos, etc. Las biomoléculas adecuadas incluyen, entre otras, proteínas (incluidas enzimas, inmunoglobulinas y glucoproteínas), ácidos nucleicos, lípidos, lectinas, carbohidratos, hormonas, células enteras (incluidas las procariotas (como las bacterias patógenas) y las células eucariotas., incluyendo células tumorales de mamíferos), virus, esporas, etc. Los analitos ilustrativos que son proteínas incluyen, pero no se limitan a, enzimas; drogas células; anticuerpos; antígenos y receptores de membrana celular (receptores neurales, hormonales, de nutrientes y de superficie celular) o sus ligandos naturales.

La ribozima de cabeza de martillo (hRz) es un motivo de ARN que es capaz de sostenerse en la escisión trans o cis de un enlace fosfodiéster. La ribozima de cabeza de martillo que actúa en cis (chRz) es un ARN catalítico que sufre una auto-escisión de su propia columna para producir dos productos de ARN. Las ribozimas de cabeza de martillo que actúan en cis contienen tres tallos pareados con bases y un núcleo altamente conservado de residuos necesarios para la escisión. La reacción de escisión se produce mediante un ataque de un oxígeno hidroxilo 2' de un sitio catalítico de citosina en el átomo de fósforo unido al carbono 3' del mismo residuo. Esto rompe el esqueleto de fosfato de azúcar y produce un fosfato cíclico 2',3'.

La secuencia de cabeza de martillo mínima que se requiere para la reacción de auto-escisión incluye aproximadamente 13 nucleótidos "núcleo" conservados o invariantes, la mayoría de los cuales no están involucrados en la formación de pares de bases canónicas Watson-Crick. La región central está flanqueada por los tallos I, II y III, que en general están compuestos por pares de bases canónicos de Watson-Crick, pero que, por lo demás, no están limitados con respecto a la secuencia.

La especificidad de escisión de la ribozima de cabeza de martillo de acción trans (thRz) se controla mediante los brazos de hibridación de la ribozima, que se hibridan con el sustrato de forma complementaria y la escisión directa del enlace de fosfodiéster escindible. Esta actividad está específicamente dirigida a ocurrir después del tercer nucleótido del triplete de escisión.

El objeto descrito aquí proporciona ribozimas de cabeza de martillo de actuación trans reguladas por aptámero y ribozimas de cabeza de martillo de actuación cis reguladas por aptámero. Los sujetos thRzs y chRzs regulados por aptámeros son una clase versátil de ribozimas que pueden diseñarse fácilmente para responder a una variedad de ligandos, y son útiles en muchas aplicaciones. Por ejemplo, los thRzs y chRzs regulados por aptámeros pueden diseñarse para modular la actividad de genes dirigidos de una manera dependiente de ligando, y por lo tanto son útiles para modular la expresión de genes endógenos o heterólogos.

El dominio de ribozima (también aquí el dominio efector) puede tener al menos dos estados conformacionales, un estado "apagado" y un estado "encendido", que se define por su nivel de actividad (velocidad de reacción, por ejemplo) para someterse a auto-escisión en el caso de chRzs, o escisión de una secuencia diana en el caso de thRzs. Los dominios efectores del objeto descrito aquí se pueden cambiar entre sus estados conformacionales "encendido" y "apagado" en respuesta a la unión del ligando al dominio aptámero. Las ribozimas reguladas por aptámeros del objeto descrito aquí, por lo tanto, actúan como un interruptor cuya actividad se activa y desactiva en respuesta a la unión del ligando. En cierta divulgación en el presente documento, la función del dominio de ribozima depende fuertemente de la presencia o ausencia del ligando, o puede mostrar una respuesta dependencia más dosis-respuesta como la de la concentración del ligando disponible para unirse al dominio aptámero.

La elección del ligando al que se une el aptámero, y por lo tanto la ribozima está regulada, es enorme. En ciertos casos, el ligando es una molécula pequeña que tiene un peso molecular inferior a 2500 amu. Estas pueden ser moléculas naturales o no naturales, incluidos péptidos, pequeñas moléculas orgánicas (incluidos fármacos y ciertos metabolitos e intermedios, cofactores, etc.) e iones metálicos simplemente para ilustrar. Los ligandos ejemplares que se unen a un aptámero incluyen, sin limitación, moléculas pequeñas, tales como fármacos, metabolitos, intermedios, cofactores, análogos del estado de transición, iones, metales, ácidos nucleicos y toxinas. Los aptámeros también pueden unirse a polímeros naturales y sintéticos, que incluyen proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, polisacáridos, glucoproteínas, hormonas, receptores y superficies celulares como las paredes celulares y las membranas celulares. La unión de un ligando a un aptámero, que generalmente es ARN, altera el emparejamiento de bases con el dominio de transmisión de información que se transfiere como un cambio estructural en el dominio de ribozima y altera su capacidad para mediar la escisión de un enlace fosfodiéster (ya sea auto-escisión o escisión de una secuencia diana). Por lo tanto, la unión del ligando afecta la capacidad del dominio efector para mediar la inactivación, transcripción, traducción del gen o interferir de otro modo con la actividad normal del gen diana o ARNm, por ejemplo.

Un aptámero más típicamente se habrá obtenido mediante selección in vitro para la unión de una molécula diana. Sin embargo, la selección in vivo de un aptámero también es posible. Los aptámeros tienen regiones de unión específicas que son capaces de formar complejos con una molécula diana deseada en un entorno en donde otras sustancias en el mismo entorno no forman complejos con el ácido nucleico. La especificidad de la unión se define en términos de la disociación comparativa constante (Kd) del aptámero por su ligando, en comparación con la constante de disociación del aptámero para otros materiales en el medio ambiente o moléculas no relacionadas en general. Un ligando es aquel que se une al aptámero con mayor afinidad que al material no relacionado. Típicamente, la Kd para el aptámero con respecto a su ligando será al menos aproximadamente 10 veces menos que la Kd para el aptámero con el material no relacionado o material que lo acompaña en el medio ambiente. Incluso más preferiblemente, la Kd será al menos aproximadamente 50 veces menos, más preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces menos, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 200 veces menos. Un aptámero típicamente tendrá entre aproximadamente 10 y aproximadamente 300 nucleótidos de longitud. Más comúnmente, un aptámero tendrá entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100 nucleótidos de longitud.

Los aptámeros se fabrican fácilmente y se unen a una amplia variedad de moléculas. Cada una de estas moléculas puede usarse como un modulador de la ribozima asociada usando los métodos del objeto descrito aquí. Por ejemplo, se ha demostrado que las moléculas orgánicas, nucleótidos, aminoácidos, polipéptidos, características diana en las superficies celulares, iones, metales, sales, sacáridos, son adecuados para aislar aptámeros que pueden unirse específicamente al ligando respectivo. Por ejemplo, los tintes orgánicos como Hoechst 33258 se han utilizado con éxito como ligandos diana para las selecciones de aptámeros in vitro (Werstuck y Green (1998) Science 282: 296 298). Otras moléculas orgánicas pequeñas como la dopamina, la teofilina, la sulforhodamina B y la celobiosa también se han utilizado como ligandos en el aislamiento de los aptámeros. Los aptámeros también se han aislado para antibióticos como kanamicina A, lividomicina, tobramicina, neomicina B, viomicina, cloranfenicol y estreptomicina. Para una revisión de los aptámeros que reconocen moléculas pequeñas, ver Famulok (1999) Science 9: 324-9.

En cierta descripción en el presente documento, el ligando del aptámero de una ribozima regulada por el aptámero de la materia descrita actualmente es una molécula orgánica pequeña permeable a las células. Las moléculas orgánicas pequeñas que no tienen un efecto inhibitorio general sobre la traducción se prefieren como ligandos. La molécula pequeña preferiblemente también exhibe persistencia in vivo suficiente para lograr el nivel deseado de inhibición de la traducción. Las moléculas también pueden seleccionarse para identificar aquellas que están biodisponibles después, por ejemplo, de la administración oral. En cierta divulgación en el presente documento de la materia divulgada actualmente, el ligando no es tóxico. El ligando puede ser opcionalmente un fármaco, que incluye, por ejemplo, un esteroide. Sin embargo, en algunos de los métodos para controlar la expresión génica, es preferible que el ligando sea farmacológicamente inerte. En alguna descripción de este documento, el ligando es un polipéptido cuya presencia en la célula es indicativa de una enfermedad o afección patológica. En otra divulgación en el presente documento, el ligando para un aptámero es un antibiótico, tal como cloranfenicol. En una realización alternativa, el ligando del aptámero es un tinte orgánico tal como el tinte Hoeschst 33258. En otra realización más, el ligando puede ser un ion metálico. En una realización específica, el dominio aptámero de un ácido nucleico regulado por aptámero responde a la unión a la cafeína.

Los aptámeros se desarrollan típicamente para unirse a ligandos particulares empleando técnicas de selección conocidas in vivo o in vitro (más típicamente, in vitro) conocidas como SELEX (Ellington et al. (1990) Nature 346, 818 22; y Tuerk et al. (1990) Science 249, 505-10). Los métodos para preparar aptámeros también se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 5,582,981; Publicación PCT N° WO 00/20040; Pat. N° 5,270.163; Lorsch y Szostak (1994) Biochemistry 33: 973; Mannironi y col. (1997) Biochemistry 36: 9726; Ciego (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.

96: 3606-3610; Huizenga y Szostak (1995) Biochemistry 34: 656-665; Publicaciones PCT Nos WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 y la patente de EE.UU. N° 5,756,291.

Generalmente, en su forma más básica, las técnicas de selección in vitro para identificar aptámeros implican primero preparar un gran conjunto de oligonucleótidos de la longitud deseada que contienen al menos alguna región que se aleatoriza o mutageniza. Por ejemplo, un conjunto común de oligonucleótidos para la selección de aptámeros podría contener una región de 20-100 nucleótidos aleatorizados flanqueados en ambos extremos por una región larga de aproximadamente 15-25 nucleótidos de secuencia definida útil para la unión de cebadores de PCR. El conjunto de oligonucleótidos se amplifica usando técnicas de PCR estándar, aunque puede emplearse cualquier medio que permita la amplificación fiel y eficiente de secuencias de ácido nucleico seleccionadas. El conjunto de ADN se transcribe luego in vitro para producir transcripciones de ARN. Los transcritos de ARN pueden someterse luego a cromatografía de afinidad, aunque puede usarse cualquier protocolo que permita la selección de ácidos nucleicos en función de su capacidad para unirse específicamente a otra molécula (por ejemplo, una proteína o cualquier molécula diana). En el caso de la cromatografía de afinidad, las transcripciones se pasan típicamente a través de una columna o se ponen en contacto con perlas magnéticas o similares en las que el ligando diana se ha inmovilizado. Las moléculas de ARN en el conjunto que se unen al ligando se retienen en la columna o en el cordón, mientras que las secuencias no ligantes se eliminan por lavado. Las moléculas de ARN que se unen al ligando se transcriben inversamente y se amplifican nuevamente por PCR (generalmente después de la elución). Las secuencias de grupo seleccionadas se pasan luego por otra ronda del mismo tipo de selección. Típicamente, las secuencias de grupo se someten a un total de aproximadamente tres a diez rondas iterativas del procedimiento de selección. El ADNc se amplifica a continuación, se clona y se secuencia usando procedimientos estándar para identificar la secuencia de las moléculas de ARN que son capaces de actuar como aptámeros para el ligando diana. Una vez que se ha identificado con éxito una secuencia de aptámero, el aptámero puede optimizarse aún más realizando rondas adicionales de selección a partir de un conjunto de oligonucleótidos que comprenden la secuencia de aptámero mutagenizado. Para su uso en la presente materia actualmente descrita, el aptámero se selecciona preferiblemente para la unión del ligando en presencia de concentraciones de sal y temperaturas que imitan condiciones fisiológicas normales.

Generalmente, se puede elegir un ligando adecuado sin referencia a si un aptámero todavía está disponible. En la mayoría de los casos, se puede obtener un aptámero que une el ligando de elección por alguien de habilidad ordinaria en la técnica. La naturaleza única del proceso de selección in vitro permite el aislamiento de un aptámero adecuado que se une a un ligando deseado a pesar de una escasez completa de conocimiento previo sobre qué tipo de estructura podría unir el ligando deseado.

Para que un aptámero sea adecuado para su uso en la presente materia actualmente descrita, la afinidad de unión del aptámero por el ligando debe ser lo suficientemente fuerte y la estructura formada por el aptámero cuando se une a su ligando debe ser lo suficientemente significativa como para cambiar una ribozima regulada por aptámero del objeto descrito aquí entre estados "encendido" y "apagado" o ajustar el nivel funcional de una ribozima regulada por aptámero.

La constante de asociación para el aptámero y el ligando asociado es preferiblemente tal que el ligando funcione para unirse al aptámero y tenga el efecto deseado a la concentración de ligando obtenida tras la administración del ligando. Para uso in vivo, por ejemplo, la constante de asociación debería ser tal que la unión se produzca muy por debajo de la concentración de ligando que se puede lograr en el suero u otro tejido. Preferiblemente, la concentración de ligando requerida para uso in vivo también está por debajo de la que podría tener efectos no deseados en el organismo.

Por consiguiente, cierta divulgación en el presente documento proporciona métodos de diseño y selección de aptámeros o dominios de aptámeros que responden a uno o más ligandos preseleccionados o predeterminados. Las ribozimas reguladas por aptámero sujeto también pueden "ajustarse" para que su comportamiento de conmutación responda más o menos a la unión del ligando. Las ribozimas reguladas por aptámeros también pueden "sintonizarse" para que la afinidad de unión del dominio de aptámero sea más o menos sensible a su ligando. Por ejemplo, las propiedades termodinámicas de la formación de dúplex intramolecular y otras estructuras de 2° y 3° en las ribozimas reguladas por el aptámero pueden alterarse para que el dominio del aptámero sea más o menos susceptible a la unión del ligando, es decir, tal como puede manifestarse en el constante de disociación (Kd) u otros parámetros cinéticos (tales como velocidades Kencendido y Kapagado). Alternativamente, los cambios alostéricos en el dominio de la ribozima pueden ser más o menos sensibles a la unión del ligando ante alteraciones en la hibridación y otras interacciones intramoleculares que pueden afectar las estructuras 2 ° y 3 ° del dominio de la ribozima. Las estrategias de ingeniería avanzadas para alterar las propiedades termodinámicas de las estructuras de ácido nucleico son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un emparejamiento de ácido nucleico complementario incrementado puede aumentar la estabilidad de un dominio de ribozima o dominio de aptámero.

III. MÉTODOS PARA TRATAR ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

La materia actualmente descrita también proporciona métodos para tratar enfermedades, trastornos o afecciones neurodegenerativas. En alguna descripción de este documento, la materia actualmente descrita proporciona un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa ocular en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método: (a) proporcionar un sistema CRISPR-Cas de origen no natural que comprende uno o más vectores que comprende: i) un promotor H1 operativamente unido a al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula del sujeto, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula; y ii) un elemento regulador operable en una célula unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9, en donde los componentes (i) y (ii) están ubicados en los mismos o diferentes vectores del sistema, en donde el ARNg se dirige e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN para alterar la expresión de uno o más productos génicos; y (b) administrar al sujeto una cantidad efectiva del sistema.

Por "enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa" se entiende una enfermedad, trastorno o afección (incluida una neuropatía) asociada con la degeneración o disfunción de las neuronas u otras células neurales, como las células fotorreceptoras de la retina. Una enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa puede ser cualquier enfermedad, trastorno o afección en la que puede ocurrir una disminución de la función o disfunción de las neuronas, o pérdida o neuronas u otras células neurales.

Dichas enfermedades, trastornos o afecciones incluyen, pero no se limitan a, glaucoma y enfermedades, trastornos o afecciones neurodegenerativas del sistema nervioso, tales como o asociadas con esclerosis lateral amiotrófica (ELA), neuralgia del trigémino, neuralgia de glosofaringea, Parálisis de Bell, miastenia gravis, distrofia muscular, atrofia muscular progresiva, esclerosis lateral primaria (PLS), parálisis pseudobulbar, parálisis bulbar progresiva, atrofia muscular espinal, atrofia muscular heredada, síndromes de disco invertebrado, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción de la salida torácica, neuropatías periféricas, profiria, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedades de Parkinson plus, atrofia multisistémica, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, enfermedades desmielinizantes, síndrome de Guillain-Barré, esclerosis múltiple, Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedades por priones, enfermedad deCreutzfeldt-Jakob, síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), insomnio familiar fatal (FFI), encefalopatía espongiforme bovina (EEB), enfermedad de Pick, epilepsia y complejo demencial del SIDA.

Otras enfermedades, trastornos o afecciones neurodegenerativas del sistema nervioso, tales como o asociadas con alcoholismo, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, ataxia telangiectasia, enfermedad de Batten (también conocida como enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten), enfermedad de Canavan, síndrome de Cockayne, neuropatía diabética, degeneración lobular frontotemporal, demencia asociada al VIH, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, neuroborreliosis, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelosa tipo 3), degeneración macular húmeda o seca, enfermedad de Niemann Pick, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedades fotorreceptoras degenerativas, como la retinitis pigmentosa y enfermedades asociadas, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoffs, enfermedad de Schilder, degeneración subaguda combinada de la médula espinal secundaria a anemia perniciosa, enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten (también conocida como enfermedad de Batten), ataxia espinocerebelosa (múltiple tipos con características variables), enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski y tabes dorsalis.

Los ejemplos de neurodegeneración relacionada con el ocular incluyen, entre otros, glaucoma, distrofia de la red, retinitis pigmentosa, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), degeneración de fotorreceptores asociada con AMD húmeda o seca, otra degeneración retiniana tal como retinitis pigmentosa (RP), drusas del nervio óptico, neuropatía óptica y neuritis óptica, como la neuritis óptica resultante de la esclerosis múltiple. En alguna descripción de este documento, la enfermedad neurodegenerativa ocular se selecciona del grupo que consiste en glaucoma, degeneración retiniana y degeneración macular relacionada con la edad. En alguna descripción de este documento, la enfermedad neurodegenerativa ocular es la retinitis pigmentosa (RP).

Los ejemplos no limitantes de diferentes tipos de glaucoma que pueden ser prevenidos o tratados de acuerdo con el objeto descrito aquí incluyen glaucoma primario (también conocido como glaucoma primario de ángulo abierto, glaucoma crónico de ángulo abierto, glaucoma crónico simple, y glaucoma simple), glaucoma de baja tensión, glaucoma primario de ángulo cerrado (también conocido como glaucoma primario de ángulo cerrado, glaucoma de ángulo estrecho, glaucoma de bloqueo de la pupila y glaucoma congestivo agudo), glaucoma agudo de ángulo cerrado, glaucoma crónico de ángulo cerrado, glaucoma intermitente de ángulo cerrado, glaucoma crónico de ángulo abierto, glaucoma pigmentario, glaucoma de exfoliación (también conocido como glaucoma pseudoexfoliativo o glaucoma capsulare), glaucoma de desarrollo (p. ej., glaucoma congénito primario y glaucoma infantil), glaucoma secundario (p. ej., glaucoma inflamatorio (p. ej., uveítis e iridociclitis heterocromática de Fuchs), glaucoma facogénico (p. ej., glaucoma de ángulo cerrado con catarata madura, glaucoma facoanafiláctico secundario para ruptura de la cápsula del cristalino, glaucoma facolítico debido al bloqueo de la malla facotóxica y subluxación del cristalino, glaucoma secundario a hemorragia intraocular (p. ej., hifema y glaucoma hemolítico, también conocido como glaucoma eritroclástico), glaucoma traumático (p. ej., glaucoma de recesión angular, recesión traumática en el ángulo de la cámara anterior, glaucoma posquirúrgico, bloqueo pupilar afáquico y glaucoma de bloqueo ciliar), glaucoma neovascular, glaucoma inducido por fármacos (p. ej., glaucoma inducido por corticosteroides y glaucoma de alfaquimotripsina), glaucoma tóxico y glaucoma asociado con tumores intraoculares, desprendimientos de la retina, quemaduras químicas graves del ojo y atrofia del iris. En cierta divulgación en el presente documento, la enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa es una enfermedad, trastorno o afección que no está asociada con una angiogénesis excesiva, por ejemplo, un glaucoma que no es glaucoma neovascular.

Como se usa en el presente documento, el término "trastorno" en general se refiere a cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con un compuesto contra una de las dianas o vías identificadas, incluyendo cualquier enfermedad, trastorno o afección que pueda ser tratada por una cantidad efectiva de un compuesto contra una de las dianas identificadas, o rutas, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Como se usa en el presente documento, el término "tratar" puede incluir revertir, aliviar, inhibir la progresión de, prevenir o reducir la probabilidad de la enfermedad, trastorno o afección a la que se aplica dicho término, o uno o más síntomas o manifestaciones de dicha enfermedad, trastorno o afección (p. ej., una enfermedad o trastorno que causa disfunción y/o muerte de las células fotorreceptoras de la retina). En alguna descripción de este documento, el tratamiento reduce la disfunción y/o muerte de las células fotorreceptoras retinianas. Por ejemplo, el tratamiento puede reducir la disfunción y/o muerte de las células fotorreceptoras de la retina en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 66%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más en comparación con la disfunción y/o muerte de las células fotorreceptoras de la retina en un sujeto antes de someterse a tratamiento o en un sujeto que no se somete a tratamiento. En alguna descripción de este documento, el tratamiento inhibe completamente la disfunción y/o muerte de las células fotorreceptoras retinianas en el sujeto. Como se usa en este documento, una "célula fotorreceptora de la retina" es un tipo especializado de neurona encontrada en la retina que es capaz de fototransducción. En alguna descripción de este documento, al menos un producto génico es la rodopsina.

En alguna descripción de este documento, el sistema se empaqueta en una única partícula de virus adenoasociado (AAV) antes de administración al sujeto. En alguna divulgación en este documento, la administración al sujeto ocurre por inyección subretiniana. El tratamiento, la administración o la terapia pueden ser consecutivos o intermitentes. El tratamiento, la administración o la terapia consecutivos se refieren al tratamiento al menos diariamente sin interrupción en el tratamiento por uno o más días. Tratamiento o administración intermitente, o tratamiento o administración de manera intermitente, se refiere al tratamiento que no es consecutivo, sino de naturaleza cíclica. El tratamiento de acuerdo con los métodos descritos actualmente puede dar como resultado un alivio completo o cura de una enfermedad, trastorno o afección, o una mejora parcial de uno o más síntomas de la enfermedad, condición o afección, y puede ser temporal o permanente. El término "tratamiento" también pretende abarcar la profilaxis, la terapia y la cura.

El término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de un agente que es suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. La cantidad terapéuticamente efectiva puede variar dependiendo de uno o más de: el sujeto y la condición de la enfermedad a tratar, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la condición de la enfermedad, la forma de administración y similares, que pueden determinarse fácilmente por una persona de habilidad ordinaria en la técnica. El término también se aplica a una dosis que proporcionará una imagen para la detección por cualquiera de los métodos de imagen descritos aquí. La dosis específica puede variar dependiendo de uno o más de: el agente particular elegido, el régimen de dosificación a seguir, si se administra en combinación con otros compuestos, el momento de la administración, el tejido a ser fotografiado y el sistema de administración física en que se lleva.

Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento. El sujeto tratado por los métodos descritos actualmente en sus numerosas divulgaciones en el presente documento es deseablemente un sujeto humano, aunque debe entenderse que los métodos descritos en el presente documento son efectivos con respecto a todas las especies de vertebrados, que están destinados a ser incluidos en el término "sujeto". En consecuencia, un "sujeto" puede incluir un sujeto humano con fines médicos, como el tratamiento de una afección o enfermedad existente o el tratamiento profiláctico para prevenir la aparición de una afección o enfermedad, o un sujeto animal con fines médicos o veterinarios, o fines de desarrollo. Los sujetos animales adecuados incluyen mamíferos que incluyen, pero no se limitan a, primates, por ejemplo, humanos, monos, simios y similares; bovinos, p. ej., ganado vacuno, bueyes y similares; ovinos, por ejemplo, ovejas y similares; caprinos, por ejemplo, cabras y similares; porcinos, por ejemplo, cerdos, y similares; equinos, por ejemplo, caballos, burros, cebras y similares; felinos, incluidos gatos salvajes y domésticos; caninos, incluidos perros; lagomorfos, incluidos conejos, liebres y similares; y roedores, incluidos ratones, ratas y similares. Un animal puede ser un animal transgénico. En alguna descripción de este documento, el sujeto es un ser humano que incluye, entre otros, sujetos fetales, neonatales, lactantes, juveniles y adultos. Además, un "sujeto" puede incluir un paciente afectado o sospechoso de estar afectado por una afección o enfermedad.

IV. DEFINICIONES GENERALES

Aunque en este documento se emplean términos específicos, se usan solo en un sentido genérico y descriptivo y no con fines de limitación. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece este objeto descrito aquí.

Después de una convención de derecho de patentes de larga data, los términos “un”, “una”, “el” y “ella” se refieren a "uno o más" cuando se usan en esta solicitud, incluidas las reivindicaciones. Así, por ejemplo, la referencia a "un sujeto" incluye una pluralidad de sujetos, a menos que el contexto sea claramente contrario (por ejemplo, una pluralidad de sujetos), y así sucesivamente.

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones, los términos "comprender", "comprende" y "que comprende" se usan en un sentido no exclusivo, excepto cuando el contexto lo requiera de otra manera. Del mismo modo, el término "incluir" y sus variantes gramaticales están destinados a ser no limitativos, de modo que la recitación de elementos en una lista no excluye otros elementos similares que pueden sustituirse o agregarse a los elementos enumerados.

Para los propósitos de esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, a menos que se indique lo contrario, todos los números expresan cantidades, tamaños, dimensiones, proporciones, formas, formulaciones, parámetros, porcentajes, cantidades, características y otros valores numéricos utilizados en la especificación y las reivindicaciones, deben entenderse como modificadas en todos los casos por el término "aproximadamente" aunque el término "aproximadamente" puede no aparecer expresamente con el valor, cantidad o rango. En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la siguiente especificación y en las reivindicaciones adjuntas no son ni necesitan ser exactos, pero pueden ser aproximados y/o más grandes o más pequeños según se desee, lo que refleja tolerancias, factores de conversión, redondeo, error de medición y similares, y otros factores conocidos por los expertos en la técnica dependiendo de las propiedades deseadas que se buscan obtener por el objeto divulgado aquí. Por ejemplo, el término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor, puede significar que abarca variaciones de, en alguna divulgación aquí, 100% en alguna divulgación aquí 50%, en alguna divulgación aquí 20%, en alguna divulgación aquí 10%, en alguna divulgación aquí 5%, en alguna divulgación aquí 1%, en alguna divulgación aquí 0,5%, y en alguna divulgación aquí 0,1% de la cantidad especificada, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar lo revelado métodos o emplean las composiciones descritas.

Además, el término "aproximadamente" cuando se usa en conexión con uno o más números o rangos numéricos, debe entenderse que se refiere a todos esos números,incluye todos los números en un rango y modifica ese rango al extender los límites por encima y por debajo de los valores numéricos establecidos. La recitación de rangos numéricos por puntos finales incluye todos los números, por ejemplo, números enteros, incluidas sus fracciones, incluidas dentro de ese rango (por ejemplo, la recitación de 1 a 5 incluye 1, 2, 3, 4 y 5, así como sus fracciones, por ejemplo, 1,5, 2,25, 3,75, 4,1 y similares) y cualquier intervalo dentro de ese rango.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se han incluido para proporcionar orientación a un experto en la materia para practicar la divulgación representativa en el presente documento de la materia divulgada actualmente. A la luz de la presente descripción y el nivel general de habilidad en la técnica, los expertos en la materia pueden apreciar que los siguientes ejemplos están destinados a ser solo ejemplares. Las descripciones sintéticas y los ejemplos específicos que siguen solo están destinados a fines ilustrativos, y no deben interpretarse como limitantes de ninguna manera para hacer compuestos de la divulgación por otros métodos.

EJEMPLO 1

Métodos

Construcción del plásmido: Para generar las construcciones que expresan ARN H1 (véanse las Tablas 1, 2 y 3 a continuación), se ensamblaron oligonucleótidos superpuestos para crear el promotor H1 fusionado al andamio de ARNg de 76 pb y la señal de terminación de pol III. Entre el promotor H1 y el armazón de ARNg, se incorporó un sitio BamHI para permitir la inserción de la secuencia de direccionamiento. La secuencia del terminador H1:: andamio ARNg:: pol III se clonó luego con TOPO en pCR4-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se verificó la secuencia; el vector resultante está en la orientación inversa (ver más abajo). Para generar los diversos gARNs utilizados en este estudio, los oligonucleótidos superpuestos se recocieron y amplificaron por PCR usando la polimerasa Phusion Flash DNA de dos pasos (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), y posteriormente se purificaron usando bolas magnéticas Sera-Mag modificadas con carboxilato (Thermo Fisher Scientific) mezclado con 2X volumen de PEG al 25% y NaCl 1,5M. Los productos de PCR purificados se resuspendieron en H2O y se cuantificaron utilizando un NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Las construcciones que expresan ARNg se generaron usando la Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA) (Gibson et al. (2009) Nature Methods 6: 343-345) con ligeras modificaciones para el plásmido digerido AflII (n° 41824, Addgene, Cambridge MA) para la expresión de U6, o la digestión con BamHI del plásmido que se acaba de describir para la expresión de H1. El volumen total de reacción se redujo de 20 pl a 2 pl.

Cultivo celular: Las células hESC línea H7 e IMR-90 iPS (WiCell, Madison WI) se mantuvieron mediante propagación clonal en Matrigel reducido de factor de crecimiento (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) en medio mTeSRl (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC), en una incubadora al 10% de CO2/5% de O2 según los protocolos descritos anteriormente (Walker et al. (2010) Nat. Commun. 1:71; Maruotti et al. (2013) Stem Cells Translational Medicine 2: 341-354). Para el paso, las colonias de hESC se incubaron primero con blebbistatina 5 pM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en mTesR1, y luego se recogieron después de 5-10 minutos de tratamiento con Accutase (Sigma-Aldrich). Los grupos de células se disociaron suavemente en una sola suspensión celular y se sedimentaron por centrifugación. A partir de entonces, hPSCs se resuspendieron en mTeSR1 con blebbistatin y se sembraron a aproximadamente 1.000 1,500 células/cm2. Dos días después del pase, el medio se reemplazó con mTeSR1 (sin blebbistatina) y se cambió a diario.

La línea celular de riñón embrionario humano (HEK) 293T (Life Technologies, Grand Island, NY) se mantuvo a 37°C con 5% de CO2 /20% de O2 en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) suplementado con Suero bovino fetal al 10% (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY) y GlutaMAX 2Mm (Invitrogen).

Orientación de genes de células H7: las células hESC se cultivaron en inhibidor de Rho Kinase 10 pM (DDD00033325, EMD Millipore, Billerica, MA) 24 h antes de la electroporación. La electroporación se realizó usando el kit Neon (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el día de la electroporación, las hESC se digirieron con Accutase (Sigma-Aldrich) durante 1-2 minutos hasta que se levantaron las colonias. Es importante destacar que las colonias no se disociaron en una sola suspensión celular. Después de cosechar las colonias, los gránulos húmedos se mantuvieron en hielo durante 15 minutos y luego se resuspendieron en tampón de electroporación que contenía plásmidos dirigidos a genes. Los parámetros de electroporación fueron los siguientes: voltaje: 1400 ms; intervalo: 30 ms; 1 pulso. Después de la electroporación, las colonias celulares se transfirieron lentamente a medio mTeSR1 que contenía inhibidor de Rho Kinase 10 pM, y luego se mantuvieron a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de colocarlas en placas recubiertas con Matrigel y se cultivaron adicionalmente.

Para el análisis de colonias derivadas clonalmente, se cultivaron hESC electroporadas hasta subconfluencia, se pasaron como se describe en el párrafo anterior y se colocaron en placas a una densidad de 500 células por placa de 35 mm. Posteriormente, las colonias individuales se aislaron mediante recolección manual y se cultivaron adicionalmente.

Para la transfección de células 293T, se sembraron ~100.000 células/pocillo en placas de 24 pocillos (Falcon, Corning, NY) 24 horas antes de la transfección. Las células se transfectaron por cuadruplicado usando el reactivo Lipofectamine LTX Plus (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Para cada pocillo de una placa de 24 pocillos, se mezclaron 400 ng del plásmido Cas9 y 200 ng del plásmido ARNg con 0,5 pl de reactivo Plus y 1,5 pl de reactivo Lipofectamine LTX.

Generación de líneas ESC GFP expresadas constitutivamente: La línea ESC humana H7 (WiCell) se mantuvo en medios mTeSRI (Stem Cell Technologies) en sustrato Matrigel. Antes del paso celular, las células se sometieron a un breve pretratamiento con blebbistatina (>5 min) para aumentar la viabilidad celular, se trataron con Accutase durante 7 min, se trituraron en una sola suspensión celular, se inactivó con un volumen igual de mTesR, se granuló a 80xg durante 5 min y se resuspendió en mTesR que contiene blebbistatina. 1x106 células se sedimentaron, los medios cuidadosamente se eliminaron y las células se colocaron en hielo durante 10-15 min. 10 |jg de vector donante AAV-CAGGSEGFP (n° 22212, Addgene) que contiene homología con el locus de puerto seguro AAVS1, más 5 jg de cada uno de los TALEN hAAVS1 1R L (n° 35431 y 35432, Addgene) (Hockemeyer et al. (2009) Nat. Biotechnol,27: 851 857; Sanjana et al. (2012) Nature Protocols 7: 171-192) en R-buffer se electroporaron con un tipo de punta de 100 j l usando el sistema de transfección de neón (Life Technologies) con los siguientes parámetros: 1500V, 20ms de pulso y 1 pulso. Las células se añadieron luego suavemente a 1 ml de medio y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se colocaron en placas sobre placas de 35 mm recubiertas con Matrigel que contenían mTeSR y blebbistatina 5 jM . Después de 2 días, las células se sembraron a una densidad de 1 x 104 después de lo cual se seleccionaron manualmente sublíneas clonales estables con un microscopio de epifluorescencia Nikon TS100 equipado con fluorescencia.

Ensayo de Surveyor y análisis de secuenciación para la modificación del genoma: Para el análisis de Surveyor, el ADN genómico se extrajo resuspendiendo células en solución QuickExtract (Epicenter, Madison, WI), incubando a 65°C durante 15 min, y luego a 98°C durante 10 minutos. La solución del extracto se limpió con DNA Clean and Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA) y se cuantificó mediante NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). La región genómica que rodea los sitios diana CRISPR se amplificó a partir de 100 ng de ADN genómico usando Phusion DNA polymerase (New England Biolabs). Se agruparon y purificaron múltiples reacciones de PCR independientes usando Qiagen MinElute Spin Column siguiendo el protocolo del fabricante (Qiagen, Valencia, CA). Un volumen de 8 j l que contenía 400 ng del producto de PCR en Tris-HCl 12,5 mM (pH 8,8), KCl 62,5 mM y MgCh 1,875 mM se desnaturalizó y se volvió a recocer lentamente para permitir la formación de heterodúplex: 95°C durante 10 min. 95°C a 85°C en rampa a -1,0°C/seg, 85°C durante 1 seg, 85°C a 75°C en rampa a -1,0°C/seg, 75°C durante 1 seg, 75°C a 65°C en rampa a -1,0°C/seg, 65°C durante 1 seg, 65°C a 55°C en rampa a -1,0°C/seg, 55°C durante 1 seg, 55°C a 45°C a -1,0°C/seg, 45°C durante 1 seg, 45°C a 35°C en rampa a -1,0°C/seg, 35°C durante 1 seg, 35°C a 25°C en rampa a -1,0°C/seg, y luego se mantuvo a 4°C. Se añadieron 1 j l de potenciador Surveyor y 1 j l de nucleasa Surveyor (Transgenomic, Omaha, NE) a cada reacción, se incubaron a 42°C durante 60 minutos, después de lo cual, se añadió 1 j l de la solución de parada a la reacción. Se cuantificó 1 j l de la reacción en el bioanalizador 2100 usando el chip DNA 1000 (Agilent, Santa Clara, CA). Para el análisis en gel, se añadieron 2 j l de tampón de carga 6X (New England Biolabs) a la reacción restante y se cargó en un gel de agarosa al 3% que contenía bromuro de etidio. Los geles se visualizaron en un sistema de imágenes Gel Logic 200 (Kodak, Rochester, NY) y se cuantificaron usando ImageJ v.

1,46. Las frecuencias de NHEJ se calcularon utilizando la ecuación derivada de binomio:

donde los valores de "a" y "b" son iguales al área integrada de los fragmentos escindidos después de la sustracción del fondo y "c" es igual al área integrada del Producto de PCR no escindido después de la sustracción de fondo (Guschin et al. (2010) Methods in Molecular Biology 649: 247-256).

Citometría de flujo: después del tratamiento con blebbistatina, se recogieron colonias de hESC subconfluentes mediante tratamiento con Accutase, se disociaron en una suspensión de células individuales y se sedimentaron. A continuación, las células se resuspendieron en solución de células vivas (Invitrogen) que contenía tinción rubí Vybrant DyeCycle (Invitrogen) y se analizaron en un citómetro de flujo Accuri C6 (BD Biosciences).

QPCR cuantitativa en tiempo real: se sembraron células 293T a 250.000 células/pocillo en placas de 12 pocillos (Falcon) 24 horas antes de la transfección. Las células se transfectaron por triplicado usando Lipofectamine LTX con reactivo Plus (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante con una titulación de 6 dosis del plásmido ARNg: 0 ng, 31,25ng, 62,5ng, 125ng, 250ng o 500ng en cada pocillo. 48 horas después de la transfección, se aisló el ARN total usando RNAzol RT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH), y se purificó usando MiniPrep de ARN Direct-zol (Zymo). Se trataron 500 ng de ARN total dsDNasa (ArticZymes; Plymouth Meeting, PA EE.UU.) Para eliminar la contaminación residual del ADN genómico y se transcribió inversamente en una reacción de 20 j l usando transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para cada reacción, se usaron 0,1 jM de los siguientes oligonucleótidos para cebar cada reacción; andamio de ARNg-CTTCGATGTCGACTCGAGTCAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC (SEQ ID NO: 1), U6 ARNsn-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG (SEQ ID NO: 2). La secuencia de andamio subrayada denota una secuencia de anclaje añadida para la estabilidad de la transcripción. Cada reacción qPCR se llevó a cabo en una máquina de PCR en tiempo real Biorad CFX 96 en un volumen de 10 j l usando el SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix (Biorad) que contenía 250 nM de cebadores oligonucleotídicos y 1 microlitro de una dilución 1:15 del producto de reacción TAde arriba. Las reacciones se llevaron a cabo durante 40 ciclos con desnaturalización de 95°C, temperatura de recocido de 54°C y etapas de extensión de 60°C. Los siguientes cebadores se usaron para detectar el ARN guía respectivamente: Flpara-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAA (SEQ ID NO: 3) y ARN guía andamio rev-AAGCACCGACTCGGTGCCAC (SEQ ID NO: 4) y U6ARNsnF-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT (SEQ ID NO: 5) y U6ARNsnRev-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC (SEQ ID NO: 6). La expresión normalizada relativa para cada muestra de ARN guía y la sem se calculó utilizando el software de gestión CFX integrado de Biorad.

Bioinformática: para determinar todos los sitios CRISPR potenciales en el genoma humano, se usó un script Perl personalizado para buscar cadenas y ocurrencias superpuestas de los sitios de secuencia CRISPR de 23 meros GN19NGG o AN19NGG. Para calcular los valores de distancia media y mediana, el sitio de corte CRISPR predicho se definió por primera vez ocurriendo entre la tercera y cuarta base aguas arriba de la secuencia PAM. Después de clasificar las secuencias, se calcularon las distancias entre todos los ARNg adyacentes en el genoma. Estos datos se importaron a R para calcular los valores estadísticos medios y medianos, y para trazar los datos. Para calcular la densidad media, los sitios de corte de ARNg se agruparon en todo el genoma y se calcularon para la frecuencia de las ocurrencias. Estos datos se trazaron en R usando el paquete ggplot2 o Circos para generar un diagrama circular (Krzywinski et al. (2009) Genome Research 19: 1639-1645). Para calcular las ocurrencias en genes humanos o en loci de enfermedades, se usó la utilidad IntersectBED de BEDTools (Quinlan y Hall (2010) Bioinformatics 26: 841-842) para encontrar la ocurrencia de superposiciones con un archivo BED RefSeq recuperado del Explorador de genoma UCSC o un archivo BED de OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM. Instituto McKusick-Nathans de Medicina Genética, Universidad Johns Hopkins (Baltimore, MD), 2013). Los genomas utilizados en este estudio eran humanos (hg19), ratón (mm10), rata (RN5), vaca (bosTau7), pollo (galGal4), pez cebra (DR7), Drosophila (dm3), C. elegans (ce10) y S. cerevisiae (sacCer3).

Tabla 1. Secuencias y propiedades de direccionamiento de ARNg: construcciones de direccionamiento de eGFP que indican las coordenadas de eGFP, promotor de ARNg, nucleótido 5', cadena de direccionamiento, motivo PAM, contenido de GC, Tm y estabilidad termodinámica

Tabla 2. Secuencias y propiedades de direccionamiento de ARNg: secuencias de direccionamiento de AAVS-1 que indican el promotor de ARNg, nucleótido 5’, cadena de direccionamiento, motivo PAM, contenido de GC, Tm y estabilidad termodinámica

Tabla 3. Secuencias y propiedades de direccionamiento de ARNg: secuencia de las construcciones de ARNg de 20 bases dirigidas a eGFP

continuación

Resultados

Para ampliar las limitaciones actuales de la orientación CRISPR/Cas9, se probó si, en lugar de U6, H1 pol III podría usarse como un promotor alternativo (Baer et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 97-103). Debido a que H1 puede expresar transcripciones con purina (nucleótido R) ubicada en la posición 1, se planteó la hipótesis de que junto con S. pyogenes Cas9, el espacio de direccionamiento CRISPR podría expandirse permitiendo la escisión tanto en sitios de AN19NGG como en GN19NGG (FIG. 1A). Para demostrar la escisión específica del sitio por los ARNm expresados por H1, se desarrolló un ensayo informador para medir la escisión mediada por CRISPR de un gen diana GFP integrado en el locus AAVS-1 en la línea de células madre embrionarias humanas H7 (hESC; FIG. 1B) (Hockemeyer et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27: 851-857). La pérdida de fluorescencia de GFP debido a la interrupción de la secuencia de codificación se midió como un proxy de la frecuencia de unión de extremo no homóloga (NHEJ) propensa a errores; en particular, el ensayo subestimaría NHEJ, ya que no se detectarían mutaciones en el marco o indeles que no interrumpen la fluorescencia de GFP (FIG. 1B y FIG. 1C). Las células H7 se electroporaron con proporciones equimolares de plásmidos de expresión Cas9 y ARNg y las células se visualizaron para fluorescencia GFP después de la formación de colonias. En contraste con la electroporación de control negativo, todas las construcciones de ARNg de los promotores U6 y H1 probados mostraron una pérdida de mosaico de las señales de GFP en las células que sufren mutación dirigida (FIG. 1C y datos no mostrados). La cuantificación del número total de células con una tinción nuclear permitió el análisis basado en células de fluorescencia GFP por citometría de flujo. Aunque el 100% de las construcciones dieron como resultado NHEJ, como se demostró por la pérdida de fluorescencia de GFP, el rango de eficiencias varió para las construcciones U6 y H1 (FIG. 1C, derecha y datos no mostrados). Al expresar los ARNg de los promotores U6 o H1, esto demuestra que la mutagénesis del gen GFP puede ocurrir en los sitios GN19NGG o AN19NGG, respectivamente.

Para confirmar y ampliar estos resultados con otra línea celular, una línea celular HEK-293 que expresa GFP que expresa GFP en el mismo lugar se apuntó con las mismas construcciones de ARNg que anteriormente. Por análisis de Surveyor (Qiu et al. (2004) BioTechniques 36: 702-707), se detectó un rango de eficiencias de edición que variaron según el tipo de promotor y la ubicación de la orientación (FIG. 1D y FIG. 2). Al usar células pluripotentes inducidas por IMR90,4 no modificadas (hiPSC), también se confirmó la capacidad de modificar un gen endógeno dirigiéndose al locus AAVS-1 dentro de la región intrónica del gen PPP1R12C. La escisión dirigida de los ARNh dirigidos por H1 y U6 se observó con eficiencias comparables medidas por el ensayo Surveyor (FIG. 3A, FIG. 3B y FIG. 3C).

Para determinar el aumento potencial en el espacio de direccionamiento, se realizó un análisis bioinformático para evaluar los sitios CRISPR disponibles en el genoma humano. Mientras que los sitios AN19NGG podrían predecirse aproximadamente a la misma frecuencia que los sitios GN19NGG, se descubrió que en realidad son un 15% más comunes (FIG. 4A, FIG. 4B, FIG. 4C, FIG. 4D, FIG. 5A, FIG. 5B, FIG. 5C, FIG. 5D, FIG. 5E y FIG. 5F); cambiando así la especificidad de GN19NGG a RN19NGG más que duplica el número de sitios disponibles (aumento de aproximadamente 115%). Con algunas excepciones (chr16, chr17, chr19, chr20 y chr22), los sitios AN19NGG están presentes en frecuencias más altas que los sitios GN19NGG en cada cromosoma. Para comparar las densidades promedio de focalización de todo el genoma, se calcularon las distancias medias entre los sitios CRISPR adyacentes en el genoma para GN19NGG (59 pb), AN19NGG (47 pb) y RN19NGG (26 pb) (FIG 4B). Además, los sitios AN19NGG se enriquecieron aún más en regiones relevantes de focalización en el genoma humano. Se encontró un aumento del 20% en los sitios AN19NGG en genes humanos, y un aumento del 21% en los loci de la enfermedad obtenidos de la base de datos OMIM (Figura 4C). También se examinaron 1165 genes de ARMmi del genoma humano y se descubrió que 221 de estos genes podían ser dirigidos a través de uno o más sitios AN19NGG, pero no a través de un sitio GN19NGG (datos no mostrados). Dado que la eficiencia de la recombinación homóloga se correlaciona negativamente con el aumento de la distancia desde los sitios de corte, el aumento de los sitios de orientación CRISPR mediante el uso del promotor H1 debería facilitar una orientación de genómica más precisa y la corrección de la mutación (Ran et al. (2013) Cell 6: 1380-1389).

Al utilizarse la tecnología CRISPR cada vez más para la ingeniería genómica en una amplia gama de organismos de plantilla, se determinó el impacto potencial del uso del promotor H1 en otros genomas. Este análisis se llevó a cabo en otros 5 genomas de vertebrados que tenían una alta conservación genómica en el promotor H1 (ratón; rata; pollo; vaca y pez cebra). En todos los casos, se encontró un mayor número de AN ¹⁹NGG en comparación con los sitios GN¹⁹NGG: 9% de vaca; 14% de pollo; 19% de rata; 21% de ratón; y 32% de pez cebra (FIG. 4C). Una explicación para esta prevalencia podría deberse al mayor contenido de AT (FIG. 6A, FIG. 6^b, FIG. 6C, FIG. 6D, FIG.

6E y FIG. 6F). En el genoma humano, la normalización de las ocurrencias del sitio GN¹⁹NGG y AN ¹⁹NGG al contenido de A^tacerca las frecuencias a la paridad, aunque esto no es cierto para todos los genomas (FIG. 6A y FIG. 6F). Sin embargo, esto demuestra la utilidad de usar el promotor H1, que duplica con creces el espacio de orientación CRISPR actualmente disponible en el genoma humano, y de manera similar en todos los demás genomas probados.

A continuación, se demostró la capacidad de dirigirse a un sitio AN ¹⁹NGG en un gen endógeno con la construcción de promotor H1. Usando células H7, fue dirigido el segundo exón del locus MERTK, un gen involucrado con la fagocitosis en el epitelio pigmentario de la retina y los macrófagos, y que cuando muta causa la degeneración de la retina (D'Cruz et al. (2000) Human Molecular Genetics 9: 645-651) (f Ig . 7A y FIG. 7B). Para estimar la eficacia general de la focalización, se recogió el ADN de una población de células que se electroporaron, y se realizó el ensayo Surveyor. La región que rodea los sitios diana se amplificó con dos reacciones de PCR independientes y se calculó una frecuencia indel del 9,5% y del 9,7% (FIG. 7B). A continuación, 42 clones elegidos al azar se aislaron y se analizaron para detectar mutaciones mediante análisis de Surveyor (datos no mostrados). La secuencia reveló que 7/42 (16,7%) albergaban mutaciones agrupadas dentro de 3-4 nucleótidos aguas arriba del sitio PAM diana. 6/7 clones tenían mutaciones únicas (1 clon era redundante) y 3 de ellas eran mutaciones de cambio de marco bi-alélicas que daban como resultado un alelo MERTK nulo predicho que fue confirmado por análisis de transferencia Western (FIG. 7C y FIG. 7D). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran la capacidad de apuntar efectivamente a un sitio AN ¹⁹NGG ubicado en un locus endógeno.

Dado que la aparición de mutaciones fuera de diana con el sistema CRISPR-Cas9 se ha convertido en una preocupación cada vez mayor, se examinó cómo el uso del promotor H1 podría afectar la orientación fuera de diana, utilizando las construcciones de ARNg de GFP descritas anteriormente como sistema modelo. Se usó el análisis Surveyor para examinar tres loci genómicos que se predijeron bioinformáticamente como sitios fuera de diana (GFP_1-33, g Fp_219-197 y GFP_315-293). Dos de estas construcciones (GFP_219-197 y GFP_315-293) eran sitios diana GN¹⁹NGG, lo que permite la expresión con ambos promotores. Un (GFP_11-33), un sitio AN ¹⁹NGG, se expresó a partir del promotor U6 añadiendo un nucleótido 5'-G. En los tres loci fuera de diana examinados, no se pudo detectar ninguna escisión de la diana (datos no mostrados). Sin embargo, la falta de dianas fuera de detección detectables podría resultar de la selección inicial de las dianas de ARNg de GFP, en donde los sitios se seleccionaron en base a una baja homología con otros loci genómicos. Por lo tanto, se razonó que un desafío más estricto sería comparar la expresión de ARNg de los promotores H1 y U6 en los sitios diana específicamente conocidos por provocar altos niveles de resultados fuera de diana (Fu et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 822-826; Pattanayak et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9): 839-43; Cho et al. (2014) Genome Research 24: 132-141). Además, la flexibilidad de nucleótidos en 5' del promotor H1 permitió una comparación directa de ARNg idénticos dirigidos a sitios GN¹⁹NGG entre los promotores U6 y H1. Dos sitios previamente informados por Fu et al. (2013) se probaron: VEGFA sitio 1 (T1) y VEg Fa sitio 3 (T3) (Tabla 4, FIG. 8A, FIG. 8B, FIG. 8C y FIG. 8D) ((Fu et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 822-826; Cho et al. (2014) Genome Research 24: 132-141). Debido a que el aumento de las concentraciones de ARNg y Cas9 se ha demostrado que aumenta los impactos fuera de diana ((Fu et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 822-826; Pattanayak et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9): 839-43; Hsu et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9): 827-32), se razonó que el nivel de expresión de ARNg más bajo del promotor H1 (Boden et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 5033-5038; An et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy 14: 494-504; Makinen et al. (2006) The Journal of Gene Medicine 8: 433-44) también podrían reducir los efectos fuera de diana. Usando qRT-PCR, se probaron los niveles relativos de ARNt de VEGFA T1 de los promotores H1 y U6, confirmando el nivel de expresión reducido esperado del promotor H1 (FIG. 8A). Para el sitio VEGFA T1, se probó la eficiencia del corte en los loci en la diana, así como en cuatro loci fuera de diana. En comparación con el promotor U6, el corte en los loci diana era comparable o ligeramente reducido; sin embargo, los ARNg expresados por el promotor H1 fueron notablemente más estrictos en los loci fuera de diana examinados, lo que indica una mayor especificidad (fuera de diana 1: 8% frente al 25%; fuera de diana 2: indetectable frente al 20%; y fuera de diana 4: 9% frente a 26%) (Tabla 4, FIG. 8A, FIG. 8B, FIG. 8C y FIG.

8D). En el sitio VEGFA T3, se detectó un direccionamiento igual entre las dos construcciones del promotor (26%), pero nuevamente se observaron niveles más bajos de corte fuera de diana con el promotor H1 (Tabla 4, FIG. 8A, FIG. 8B, FIG. 8C y FIG. 8D). Si bien es necesario realizar más estudios sobre los promotores H1 y U6 de los ARNg expresados, los datos sugieren posiblemente una mayor especificidad de los ARNg expresados por H1.

Una ventaja adicional relacionada con la desviación del uso del enfoque del promotor H1 se relaciona con el enfoque recientemente descrito y prometedor de emplear la muesca cooperativa de compensación con el mutante D10A Cas9 para mitigar los posibles efectos de la diana ((Ran et al. (2013) Cell 6: 1380-1389; Mali et al. (2013) Nat. Biotechnol.

31 (9): 833-8). Este enfoque tiene estrictas necesidades de focalización ya que requiere la identificación de dos sitios CRISPR flanqueantes, orientados en hilos opuestos, y dentro de aproximadamente 20 pb del sitio de corte (Ran et al. (2013) Cell 154 (6): 1380-9). Se esperaría que la densidad de direccionamiento adicional proporcionada por el uso del promotor H1 ayude en la identificación de sitios de flanqueo adecuados.

La evidencia acumulada para la diana de S. pyogenes Cas9 in vitro e in vivo indica que el reconocimiento de Cas9: ARNg se extiende por todo el sitio de diana de 20 pares de bases. Primero, al probar >10¹²variantes distintas para la especificidad de ARNg in vitro, un estudio encontró que el 1 nucleótido tiene un papel en el reconocimiento de dianas.

Además, los cálculos de especificidad posicional de estos datos muestran que el nucleótido 5' contribuye a un mayor papel en el reconocimiento de la diana que su vecino 3', lo que indica que el modelo "semilla" para la especificidad CRISPR podría simplificar demasiado la contribución de los nucleótidos proximales PAM (Pattanayak et al. al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9): 839-4328). En segundo lugar, usos alternativos como la interferencia CRISPR (CRISPRi), que reutiliza el sistema CRISPR para la represión transcripcional, descubrieron que los truncamientos 5' en el ARNg comprometían severamente la represión y las extensiones 5' con nucleótidos no coincidentes, como las bases G no coincidentes para la expresión de U6. También reducen la eficiencia de la represión, lo que sugiere que tanto el contexto de nucleótidos de longitud (20 nt) como 5' son importantes para la orientación adecuada de Cas9 (Ran et al. (2013) Cell 154 (6): 1380-9; Mali et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9): 833-8; Larson et al. (2013) Nature Protocols 8: 2180-2196; Qi et al. (2013) Cell 152: 1173-1183; Shan et al. (2013) Nat Biotechnol. 31: 686-688). Finalmente, los datos de la estructura cristalina respaldan aún más los datos experimentales y la importancia del nucleótido 5' en Cas9, ya que se hacen contactos significativos con el nucleótido 5' del ARNg y el extremo 3' del ADN diana (Jinek et al. (2014) Science 343: 6176); Nishimasu y col. (2014) Cell 156: 935-949).

Para aumentar el espacio de direccionamiento, se ha demostrado que el uso de proteínas Cas9 alternativas es eficaz, como en N. meningitides y S. thermophiles (Hou et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 110 (39)): 15644-9; Esvelt et al. (2013) Nature Methods 10 (11): 1116-21). Sin embargo, a pesar del potencial de estas proteínas alternativas, las restricciones PAM de los otros sistemas de tipo II que se han informado tienen requisitos más estrictos (datos no mostrados; Cong et al. (2013) Science 339: 819-823; Hou et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 110 (39): 15644 9). Por el contrario, se esperaría que la expresión de ARNm modificado mediante el uso del promotor H1 expanda en gran medida el repertorio de direccionamiento con cualquier proteína Cas9 independientemente de las diferencias de PAM. Cuando se cuantificaron las respectivas dianas de ARNg para proteínas Cas9 ortólogas (AN23NNNNGATT frente a GN23NNNNGATT para N. meningitides y AN ¹⁷NNAGAAW frente a N17NNAGAAW para S. thermophilus), se cuantificó un aumento del 64% y 69% en los sitios de ARNg con un nucleótido 5'-A se encontraron, lo que indica una expansión aún mayor del espacio de direccionamiento mediante el uso del promotor H1 con proteínas Cas9 alternativas (Tabla 5). Como se sugiere en las plantas, el uso de diferentes promotores puede ampliar la frecuencia de los sitios CRISPR. Mientras que el promotor U6 está restringido a un nucleótido de guanosina 5', el promotor U3 del arroz está limitado a un nucleótido de adenosina 5', lo que resalta aún más la necesidad de diferentes promotores en diferentes sistemas para aumentar el espacio de orientación (Shan et al. (2013) Nat. Biotechnol,31: 686-688). Convenientemente, el uso exclusivo del promotor H1 se puede aprovechar para atacar sitios AN ¹⁹NGG y GN¹⁹NGG (y posiblemente sitios CN¹⁹NGG o TN¹⁹NGG (Tuschl (2002) Nat. Biotechnol. 20: 446-448)) a través de un sistema promotor único (FIG. 9A y FIG. 9B). Esto a su vez puede emplearse para expandir el espacio de orientación de las variantes Cas9 actuales y futuras con restricciones de sitios alteradas.

Con una orientación CRISPR mejorada a través de una selección de sitios juiciosa, variantes Cas9 mejoradas, arquitectura de ARNg optimizada o cofactores adicionales, probablemente se producirá un aumento en la especificidad a lo largo de la secuencia de orientación, dando mayor importancia a la identidad del nucleótido 5'. Como herramienta de investigación, esto permitirá una mayor manipulación del genoma al tiempo que minimiza las mutaciones confusas, y para futuras aplicaciones clínicas, las altas densidades de focalización junto con el reconocimiento de dianas de alta fidelidad serán fundamentales para brindar terapias seguras y efectivas.

Tabla 4. Frecuencia de indels inducidos en sitios en diana y fuera de diana por ARNg expresados por U6 o H1

continuación

Tabla 5. Análisis bioinformático de sitios de orientación Cas9 alternativos en el genoma humano. Las columnas que se mueven de izquierda a derecha indican la especie de origen Cas9, el sitio diana CRISPR, la frecuencia de aparición en el genoma humano sin máscara y la frecuencia de aparición en el genoma humano con máscara repetida. El aumento porcentual se indica luego de los valores apropiados en negrita.

Discusión

El aumento del espacio de orientación CRISPR y la reducción del potencial de efectos fuera de diana tienen amplias implicaciones para la ingeniería genómica. Para aumentar el espacio de direccionamiento, el uso de proteínas Cas9 alternos se ha demostrado ser eficaz, como en S. thermophilus (NNAGAAW) y N. meningitides (NNNNGATT), sin embargo, las restricciones de PAM de otros sistemas de tipo II informados hasta ahora tienen requisitos más estrictos y, por lo tanto, reducen el espacio de secuencia disponible para la orientación cuando se utilizan solo (datos no mostrados y Cong et al. (2013) Science 339: 819-823; Hou et al. (2013) Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU., 110 (39): 15644 9). Por el contrario, se esperaría que la expresión de ARNm modificado mediante el uso del promotor H1 expanda en gran medida el repertorio de direccionamiento con cualquier proteína Cas9. En las plantas, mientras que el promotor U6 está restringido a un nucleótido de guanosina 5', el promotor U3 del arroz está limitado a un nucleótido de adenosina 5'. Como se sugirió recientemente, el uso de ambos promotores podría expandir la frecuencia de sitios CRISPR en genomas de plantas (Shan et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 686-688). Convenientemente, el uso exclusivo del promotor H1 se puede aprovechar para apuntar a sitios AN ¹⁹NGG y GN¹⁹NGG en genomas de vertebrados a través de un único sistema promotor. Esto a su vez puede emplearse para expandir el espacio de orientación de las variantes Cas9 actuales y futuras con restricciones de sitios alteradas.

De manera similar a las tecnologías ZFN o TALEN, un enfoque para mitigar los posibles efectos fuera de diana podría ser emplear una muesca de compensación cooperativa con el mutante Cas9 (D10A) (Mali et al. (2013) Nat. Biotechnol.

31 (9): 833-8; Ran et al. (2013) Cell 154 (6): 1380-9). Esto requiere la identificación de dos sitios CRISPR flanqueantes en hebras opuestas, y se esperaría que la densidad de focalización adicional proporcionada por los sitios AN ¹⁹NGG aumente este enfoque. Un beneficio adicional sobre el promotor U6 también puede ser reducir la escisión espuria; ya que varios grupos han informado que el aumento de las concentraciones de ARNg y Cas9 se correlacionan con un aumento en la propensión a mutaciones fuera de diana (Pattanayak et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9): 839-43; Hsu et al. (2013)) Nat. Biotechnol., 31 (9): 827-32; Fu et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9): 822-6), el nivel más bajo de expresión proporcionado por el promotor H1 puede reducir corte fuera de diana. Además, Pattanayak et al. informó que el reconocimiento de Cas9:ARNg se extiende por todo el sitio de selección de 20 pares de bases (Pattanayak et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9): 839-43). En la prueba de >10¹²variantes distintas para especificidad de ARNg, los autores encontraron que el 1 de nucleótidos contribuyó al reconocimiento de la diana, lo que indica que el modelo de "semilla" (nucleótidos PAM-proximal) de la especificidad de CRISPR se simplifica excesivamente. Con una orientación CRISPR mejorada a través de una selección de sitios juiciosa, variantes Cas9 mejoradas, arquitectura de ARNg optimizada o cofactores adicionales, es probable que se produzca un aumento de la especificidad a lo largo de la secuencia de orientación de 23 pb, dando mayor importancia a la identidad del nucleótido 5'. Como herramienta de investigación, esto permitirá una mayor manipulación del genoma al tiempo que minimiza las mutaciones confusas, y para futuras aplicaciones clínicas, las altas densidades de focalización junto con el reconocimiento de dianas de alta fidelidad serán fundamentales para brindar terapias seguras y efectivas.

EJEMPLO 2

FIG. 10A, FIG. 10B, FIG. 10C, FIG. 10D, y FIG. 10E muestran el uso del promotor H1 como un promotor bidireccional para expresar simultáneamente la proteína Cas9 y el ARN guía. El promotor bidirecciona1H1 se muestra expresando C a s 9 como una transcripción de pol II hacia la izquierda (cadena negativa), y un A R N guía como una transcripción de pol III hacia la derecha (cadena positiva). El casete de expresión global es de aproxim adam ente 4,4 kb (F IG . 10A). P ara probar la capacidad de dirigir la escisió n m ediada por C R IS P R a partir de una construcción H 1 bidireccional, la construcción bidireccional, usando un A R N g dirigido a e G F P , se clonó en un plásm ido y se expresó en célu las madre hum anas que expresan G F P (F IG . 10B ). La pérdida de G F P se detectó visualm ente (F IG . 10 C ; panel central, puntas de flecha) que indica la expresión exitosa y el direccionam iento de G F P debido a la construcción de expresión. La identificación exitosa de C R IS P R también se mostró mediante el ensayo Surveyor con la presencia de las dos bandas en los carriles 2 y 3 (F IG . 10D ). Una construcción C R IS P R bidireccional que usa el promotor H 1 para generar un casete de direccionam iento compacto de ~4,75b, que está dentro del intervalo de em paquetado del virus adenoasociado (FIG . 10 E ). El term inador S V 40 se muestra en naranja, y la construcción está flanqueada por las se cu e n cias de repetición terminal invertida (ITR ) requeridas para la producción de virus;

Métodos

Construcción del plásmido: para generar la construcción bidireccional H 1, el codón humano optimizó el gen C as9 , y un terminador SV 40 se fusionó con el promotor H1 de 230 pb (S E Q ID NO: 54) donde el transcrito de pol II se encuentra endógenam ente (cadena negativa). Entre el promotor H 1 y el andam io de A RN g, se diseñó un sitio AvrII para permitir la inserción de la secu en cia de direccionam iento. La secuen cia term inadora SV40[rev]::hcas9[rev]::H 1::andam io A RN g::po l III se clonó luego en un vector p U C 19 de digestión N deI/XbaI. P ara generar los d iversos g A R N s utilizados en este estudio, los oligonucleótidos superpuestos se recocieron y amplificaron por P C R usando la polim erasa de A DN Phusion Flash de am plificación en dos pasos (Therm o Fish e r Scientific, Rockford, IL), y posteriormente se purificaron usando bolas m agnéticas Sera-M ag m odificadas con carboxilato (Therm o Fish er Scientific) m ezclado con 2 X volumen de P E G al 25 % y N aC l 1,5M . Los productos de P C R purificados se resuspendieron luego en H ²O y se cuantificaron utilizando un NanoDrop 1000 (Therm o Fisher Scientific). Las construcciones que expresan A R N g se generaron usando la G ibson A ssem b ly (New England Biolabs, Ipswich, m A) (G ibson et al. (2009) Nature Methods ⁶: 343 -345 ) con ligeras m odificaciones. El volum en total de reacción se redujo de 20 pl a 2 pl.

Cultivo celular : la línea h E S C H 7 y las célu las IM R-90 iP S (W iCell, Madison W I) se mantuvieron mediante propagación clonal en Matrigel reducido de factor de crecim iento (BD B iosciences, Franklin Lakes, NJ) en medio m T e S R l (Stem C e ll Technologies, Vancouver, BC), en una incubadora al 10 % de C O ²/⁵% de O 2 según los protocolos descritos anteriormente (W alker et al. (2010 ) Nat. Com m un. 1 :71 ; Maruotti et al. (2013 ) Stem C e lls Translational M edicine 2: 341-354 ). P ara el pase, las colonias de h E S C se incubaron primero con blebbistatina 5 pM (Sigm a-A ldrich, St. Louis, MO) en m T e sR 1, y luego se recogieron después de 5 -10 min de tratamiento con A ccutase (Sigm a-Aldrich). Los grupos de célu las se disociaron suavem ente en una sola suspensión celular y se sedimentaron por centrifugación. A partir de entonces, h P S C s se resuspendieron en m T e S R 1 con blebbistatin y se sembraron a aproxim adam ente 1.000 -1,500 célu las/cm 2. Dos d ías después del pase, el medio se reem plazó con m T e S R 1 (sin blebbistatina) y se cam bió a diario.

La línea celu lar de riñón embrionario hum ano (H E K ) 293 T (Life Techno lo gies, G rand Island, N Y) se mantuvo a 37 °C con 5 % de C O ²/ 20 % de O 2 en medio Ea g le modificado de D ulbecco (DM EM ) (Invitrogen) suplem entado con Suero bovino fetal al 10 % (Gibco, Life Technologies, G rand Island, NY) y G lutaM A X 2 M m (Invitrogen).

Orientación de genes de células H7: se cultivaron célu las h E S C en inhibidor de Rho K inase 10 pM (D D D 00033325, EM D Millipore, Billerica, MA) 24 h antes de la electroporación. La electroporación se realizó usando el kit Neon (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevem ente, el d ía de la electroporación, las h E S C se digirieron con A ccutase (Sigm a-A ldrich) durante 1 -2 minutos hasta que se levantaron las colonias. E s importante destacar que las colonias no se disociaron en una sola suspensión celular. D esp ués de co sech ar las colonias, los gránulos húm edos se mantuvieron en hielo durante 15 minutos y luego se resuspendieron en tampón de electroporación que contenía plásm idos dirigidos a genes. Los parámetros de electroporación fueron los siguientes: voltaje: 1400 ms; intervalo: 30 ms; 1 pulso D espués de la electroporación, las colonias celulares se transfirieron lentamente a medio m T e S R 1 que contenía inhibidor de Rho K inase 10 pM, y luego se mantuvieron a temperatura am biente durante 20 minutos antes de colocarlas en p lacas recubiertas con Matrigel y se cultivaron adicionalm ente.

P ara el an á lis is de colonias derivadas clonalm ente, se cultivaron h E S C electroporadas a subconfluencia, se pasaron como se describe en el párrafo anterior y se colocaron en p lacas a una densidad de 500 célu las por placa de 35 mm. Posteriormente, las colonias individuales se aislaron mediante recolección m anual y se cultivaron adicionalm ente.

Generación de líneas ESC GFP expresadas constitutivamente: La línea E S C hum ana H 7 (W iCell) se mantuvo en m edios m T e S R 1 (Stem C ell Technologies) en sustrato Matrigel. A ntes del paso celular, las célu las se sometieron a un breve pretratamiento con blebbistatina (>5 min) para aum entar la viabilidad celular, se trataron con A ccu tase durante 7 min, se trituraron en una sola suspensió n celular, se inactivó con un volumen igual de m T e sR , se granuló a 80xg durante 5 min y se resuspendió en m T e sR que contiene blebbistatina. 1 x 10⁶célu las se sedim entaron, los medios cuidadosam ente se elim inaron y las cé lu las se colocaron en hielo durante 10 -15 min. 10 pg de vector donante A A V -C A G G S E G F P (n° 22212 , Addgene) que contiene hom ología con el locus de puerto seguro A A V S 1 , m ás 5 pg de cada uno de los T A L E N h A A V S 1 1 R L (n° 35431 y 35432, A ddgene) (H ockem eyer et al. (2009) Nat. B iotechnol,27: 851 857; S a n ja n a et al. (2012 ) Nature Protocols 7: 171 -192 ) en tampón R se electroporaron con un tipo de punta de 100 pl usando el sistem a de transfección de neón (Life Techno lo gies) con los siguientes parámetros: 1500 V , 20 m s de pulso y 1 pulso. La s célu las se añadieron luego suavem ente a 1 ml de medio y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 m inutos y luego se colocaron en p lacas sobre p lacas de 35 mm recubiertas con Matrigel que contenían m T e S R y blebbistatina 5 pM. D e sp u é s de 2 d ías, las cé lu las se sem braron a una densidad de 1 x 10⁴d esp ués de lo cual se seleccionaron m anualm ente su b líneas clonales estables con un microscopio de epifluorescencia Nikon T S 100 equipado con fluorescencia.

Ensayo de Surveyor y análisis de secuenciación para la modificación del genoma: para el análisis de Surveyor, el A DN genóm ico se extrajo resuspendiendo célu las en solución Q uickExtract (Epicenter, M adison, WI), incubando a 65 °C durante 15 min, y luego a 98 °C durante 10 minutos. La solución del extracto se limpió con D N A C lean and Concentrator (Zym o R esearch, Irvine, C A ) y se cuantificó mediante NanoDrop (Therm o F ish e r Scientific). La región genóm ica que rodea los sitios diana C R IS P R se amplificó a partir de 100 ng de A D N genóm ico usando polim erasa de Phusion D N A (New England Biolabs). S e agruparon y purificaron múltiples reacciones de P C R independientes usando Qiagen M inElute Spin Colum n siguiendo el protocolo del fabricante (Q iagen, Valen cia, CA). Un volum en de ⁸pl que contenía 400 ng del producto de P C R en T r is -H C l 12 ,5 mM (pH ⁸,⁸), K C l 62 ,5 mM y M gCh 1,875 mM se desnaturalizó y se volvió a recocer lentamente para permitir la formación de heterodúplex: 95 °C durante ^{1 0}min. 95 °C a 85 °C en rampa a -1,0 °C /s e g , 85 °C durante 1 seg, 85 °C a 75 °C en rampa a -1,0 °C /s e g , 75 °C durante 1 seg, 75 °C a 65 °C en rampa a -1,0 °C /s e g , 65 °C durante 1 seg, 65 °C a 55 °C en rampa a - 1,0 °C /s e g , 55 °C durante 1 seg, 55 °C a 45 °C a -1,0 °C /s e g , 45 °C durante 1 seg, 45 °C a 35 °C en rampa a -1,0 °C /s e g , 35 °C durante 1 seg, 35 °C a 25 °C en ram pa a -1,0 °C /s e g , y luego se mantuvo a 4 °C . S e añadieron 1 pl de potenciador Surveyor y 1 pl de nucleasa Surveyor (Transgenom ic, O m aha, N E) a cada reacción, se incubaron a 42 °C durante 60 minutos, después de lo cual, se añadió 1 pl de la solución de parada a la reacción. S e cuantificó 1 pl de la reacción en el bioanalizador 2100 usando el chip D N A 1000 (Agilent, San ta C lara, CA ). P ara el a nális is en gel, se añadieron 2 pl de tampón de carga ⁶X (New England Biolabs) a la reacción restante y se cargó en un gel de agarosa al 3 % que contenía bromuro de etidio. Los geles se visualizaron en un sistem a de im ágenes G e l Logic 200 (Kodak, Rochester, N Y) y se cuantificaron usando Im ageJ v. 1,46. Las frecuencias de N H E J se calcularon utilizando la ecuación derivada de binomio:

donde los valo res de "a" y "b" son iguales al área integrada de los fragm entos escindidos desp u és de la sustracción del fondo y "c" es igual al área integrada de los no escindidos Producto de P C R d esp u és de la sustracción de fondo (G uschin et al. (2010 ) Methods in M olecular Biology 649: 247-256 ).

E J E M P L O 3

F IG . 11 A , F IG . 11 B , y F IG . 11 C muestra una ribozima de cabeza de martillo para generar el extremo 5' de un A R N guía. Una ribozima de cab eza de martillo c is 5' (S E Q ID NO: 49) y A R N g ( S e Q ID NO: 50) se representan en la F IG .

11 A . S e indican las se cu e n cia s de la ribozim a de cab eza de martillo y se indican los nucleótidos importantes para la catálisis (crítico en rojo, importante en naranja). La ubicación de la escisión se indica con la flecha. T ra s la escisión de la ribozima (inferior), se libera el A R N g resultante, sin restricción a ningún nucleótido en la posición 5' recién formada. Las construcciones que se muestran para expresar el cabeza de m artillo-ARNg se muestran en la F IG . 11 B . S e puede usar un promotor, generalm ente un promotor pol III como U⁶, HI o T7, para expresar la ribozima de cabeza de martillo c is 5', que d esp ués de la autoescisión liberará el A R N g . La orientación de dos loci se m uestra en la F IG . 11 C con el ensayo Surveyor (secuencia H H 1 C G G PAM = S E Q ID NO: 51; secuencia H H 2 A G G PAM = S E Q ID NO: 52), con escisión exitosa (flechas) por una ribozima de cabeza de martillo c is 5'.

F IG . 12 muestra una construcción C R IS P R regulable, que usa aptazim as para procesar A R N g en presencia de aptám eros específicos. En particular, F IG . 12 representa el aptám ero de teofilina (naranja) fusionado con la hélice II de la ribozima de cabeza de martillo que forma la aptazim a de teofilina, que es 5' del A R N g (azul). La unión de teofilina estabiliza la hélice II que luego permite la auto-escisión de la carbeza de martillo y libera el A R N g . El A R N g , junto con C a s9 , ahora puede apuntar a la escisión por el sistem a C R IS P R .

Métodos

Construcción de plásmido: para generar la construcción 5' c is -c a b e za de martillo dirigida por el promotor U⁶, HI o T7, la secuencia de cabeza de martillo ( G T A C G T T T C C T C T G A T G A G T C C C A A A T A G G A C G A A A C G C G C T T C G G T G C G T C ; S E Q ID NO: 53) se colocó aguas abajo del promotor, y aguas arriba de la diana de A R N g y el andamio. Para formar la hélice I, se colocaron 10 nucleótidos com plem entarios a la se cu e n cia d iana de A R N g 5' de la se cu en cia de cabeza de martillo, que luego se uniría a la secuencia com plem entaria encontrada en el A R N g (Figura 12). Para generar los diversos g A R N s utilizados en este estudio, los oligonucleótidos superpuestos se recocieron y amplificaron por P C R utilizando la polim erasa de A D N de Phusion F lash de dos paso s de am plificación (Therm o Fish er Scientific, Rockford, IL), y posteriormente se purificaron utilizando bolas m agnéticas SeraM ag m odificadas con carboxilato (Therm o Fish e r Scientific) m ezclado con 2 X volumen de P E G al 25 % y N aC l 1,5M. Los productos de P C R purificados se resuspendieron luego en H ²O y se cuantificaron utilizando un NanoDrop 1000 (Therm o Fish er Scientific). Las construcciones que expresan A R N g se generaron usando la G ibson A ssem b ly (New England Biolabs, Ipswich, MA) (G ibson et al. (2009) Nature Methods ⁶: 343 -345 ) con ligeras m odificaciones. El volum en total de reacción se redujo de ^{2 0}pl a ²pl.

Cultivo celular : la línea h E S C H 7 y las célu las IM R-90 iP S (W iCell, Madison W I) se mantuvieron mediante propagación clonal en Matrigel reducido de factor de crecim iento (BD B iosciences, Franklin Lakes, NJ) en medio m T e S R l (Stem C e ll Technologies, Vancouver, BC), en una incubadora al 10 % de C O ²/ ⁵% de O ²según los protocolos descritos anteriormente (W alker et al. (2010 ) Nat. Com m un. 1 :71 ; Maruotti et al. (2013 ) Stem C e lls Translational M edicine 2: 341-354 ). P ara el paso, las colonias de h E S C se incubaron primero con blebbistatina 5 pM (Sigm a-A ldrich, St. Louis, MO) en m T e s R 1, y luego se recogieron después de 5 -10 minutos de tratamiento con A ccu tase (Sigm a-A ldrich). Los grupos de célu las se disociaron suavem ente en una sola suspensió n celu lar y se sedim entaron por centrifugación. A partir de entonces, h P S C s se resuspendieron en m T e S R 1 con blebbistatina y se sem braron a aproxim adam ente 1.000 1.500 célu las/cm 2. Dos d ía s d esp ués del pase, el medio se reem plazó con m T e S R 1 (sin blebbistatina) y se cam bió a diario.

La línea celu lar de riñón embrionario hum ano (H E K ) 293 T (Life Techno lo gies, G rand Island, N Y) se mantuvo a 37 °C con 5 % de C O ²/^{2 0}% de O ²en Medio Ea g le modificado por D ulbecco (DM EM ) (Invitrogen) suplem entado con suero bovino fetal al 10 % (Gibco, Life Technologies, G rand Island, NY) y G lutaM A X 2 M m (Invitrogen).

Orientación genética de células H7 : se cultivaron célu las h E S C en inhibidor de Rho K inase 10 pM (D D D 00033325, EM D Millipore, Billerica, MA) 24 h antes de la electroporación. La electroporación se realizó usando el kit Neon (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevem ente, el d ía de la electroporación, las h E S C se digirieron con A ccutase (Sigm a-A ldrich) durante 1 -2 minutos hasta que se levantaron las colonias. E s importante destacar que las colonias no se disociaron en una sola suspensión celular. D esp ués de co sech ar las colonias, los gránulos húm edos se mantuvieron en hielo durante 15 minutos y luego se resuspendieron en tampón de electroporación que contenía plásm idos dirigidos a genes. Los parámetros de electroporación fueron los siguientes: voltaje: 1400 ms; intervalo: 30 ms; 1 pulso. D espués de la electroporación, las colonias celulares se transfirieron lentamente a medio m T e S R 1 que contenía inhibidor de Rho K inase 10 pM, y luego se mantuvieron a temperatura am biente durante 20 minutos antes de colocarlas en p lacas recubiertas con Matrigel y se cultivaron adicionalm ente.

Para el a ná lis is de colonias derivadas clonalmente, se cultivaron h E S C electroporadas hasta subconfluencia, se pasaron como se describe en el párrafo anterior y se colocaron en p lacas a una densidad de 500 célu las por placa de 35 mm. Posteriormente, las colonias individuales se aislaron mediante recolección m anual y se cultivaron adicionalm ente.

Generación de líneas ESC GFP expresadas constitutivamente: La línea E S C hum ana H 7 (W iCell) se mantuvo en m edios m T e S R 1 (Stem C ell Technologies) en sustrato Matrigel. A ntes del paso celular, las célu las se sometieron a un breve pretratamiento con blebbistatina (>5 min) para aum entar la viabilidad celular, se trataron con A ccu tase durante 7 min, se trituraron en una sola suspensión celular, se inactivó con un volum en igual de m TesR , se sedim entó a 80xg 5 min y se resuspendió en m T e sR que contiene blebbistatina. 1 x 10⁶cé lu las se sedimentaron, los m edios se eliminaron cuidadosam ente y las cé lu las se colocaron en hielo durante 10 -15 min. 10 pg del vector donante A A V -C A G G S E G F P (n° 22212 , Addgene) que contiene hom ología con el locus de puerto seguro A A V S 1, m ás 5 pg cada uno de T A L E N s h A A V S 1 1 R L (n° 35431 y 35432, A ddgene) (H ockem eyer et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27 : 851-857 ; S a n ja n a et al. (2012 ) Nature Protocols 7: 171 -192 ) en tampón R fueron electroporados con un tipo de punta de 100 pl utilizando el sistem a de transfección de neón (Life Techno lo gies) con los siguientes parámetros: 1500 V , 20 m s de pulso y 1 pulso. La s célu las se añadieron luego suavem ente a 1 ml de medio y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se colocaron en p lacas sobre placas de 35 mm recubiertas con Matrigel que contenían m T e S R y blebbistatina 5 pM. D espués de 2 días, las célu las se sem braron a una densidad de 1 x 10⁴después de lo cual se seleccionaron m anualm ente sub lín eas clonales estables con un m icroscopio de epifluorescencia Nikon T S 100 equipado con fluorescencia.

Ensayo de Surveyor y análisis de secuenciación para la modificación del genoma: para el análisis de Surveyor, el A DN genóm ico se extrajo resuspendiendo célu las en solución Q uickExtract (Epicenter, M adison, WI), incubando a 65 °C durante 15 min, y luego a 98 °C durante 10 minutos. La solución del extracto se limpió con D N A C lean and Concentrator (Zym o R esearch, Irvine, C A ) y se cuantificó m ediante N anoDrop (Therm o Fish e r Scientific). La región genóm ica que rodea los sitios diana C R IS P R se amplificó a partir de 100 ng de A D N genóm ico usando polim erasa Phusion D N A (New England Biolabs). S e agruparon y purificaron múltiples reacciones de P C R independientes usando Qiagen M inElute Spin Colum n siguiendo el protocolo del fabricante (Q iagen, Valen cia, CA). Un volum en de ⁸pl que contenía 400 ng del producto de P C R en T r is -H C l 12 ,5 mM (pH ⁸,⁸), K C l 62 ,5 mM y M gCh 1,875 mM se desnaturalizó y se volvió a recocer lentamente para permitir la formación de heterodúplex: 95 °C durante ^{1 0}min. 95 °C a 85 °C en rampa a -1,0 °C /s e g , 85 °C durante 1 seg, 85 °C a 75 °C en rampa a -1,0 °C /s e g , 75 °C durante 1 seg, 75 °C a 65 °C en rampa a -1,0 °C /s e g , 65 °C durante 1 seg, 65 °C a 55 °C en rampa a - 1,0 °C /s e g , 55 °C durante 1 seg, 55 °C a 45 °C a -1,0 °C /s e g , 45 °C durante 1 seg, 45 °C a 35 °C en rampa a -1,0 °C /s e g , 35 °C durante 1 seg, 35 °C a 25 °C en ram pa a -1,0 °C /s e g , y luego se mantuvo a 4 °C . S e añadieron 1 pl de potenciador Surveyor y 1 pl de nucleasa Surveyor (Transgenom ic, O m aha, N E) a cada reacción, se incubaron a 42 °C durante 60 minutos, después de lo cual, se añadió 1 pl de la solución de parada a la reacción. Se cuantificó 1 |jl de la reacción en el bioanalizador 2100 usando el chip DNA 1000 (Agilent, Santa Clara, CA). Para el análisis en gel, se añadieron 2 j l de tampón de carga 6X (New England Biolabs) a la reacción restante y se cargó en un gel de agarosa al 3% que contenía bromuro de etidio. Los geles se visualizaron en un sistema de imágenes Gel Logic 200 (Kodak, Rochester, NY) y se cuantificaron usando ImageJ v. 1,46. Las frecuencias de NHEJ se calcularon utilizando la ecuación derivada de binomio:

EJEMPLO 4

Resumen

La retinitis pigmentosa (RP) es una enfermedad hereditaria degenerativa de la retina en la que la disfunción y muerte de las células fotorreceptoras de la retina (bastones y conos) conduce a la pérdida de visión y potencialmente a ceguera. Existen formas genéticas de RP autosómica recesiva y autosómica dominante (ARRP y ADRP, respectivamente). En ARRP hay mutaciones en ambas copias del gen responsable de la enfermedad (para la mayoría de los genes, una copia del gen se hereda de la madre y la otra del padre). La enfermedad que causa mutaciones asociadas con ARRP generalmente conduce a la pérdida de la función del gen involucrado, es decir, la degeneración retiniana se debe a la pérdida de la capacidad del gen involucrado para realizar su función normal. En tales casos, es bastante claro, al menos en teoría, lo que hay que hacer para desarrollar un tratamiento adecuado: hay que reemplazar la función génica perdida. Ejemplos elegantes de este enfoque son los estudios de tratamiento humano en curso para la amaurosis congénita de Leber (LCA) en los que la terapia génica con un virus adenoasociado (AAV) se está utilizando para reemplazar la función del gen defectuoso RPE65 que causa la enfermedad.

En ADRP, a diferencia de ARRP, solo una de las dos copias del gen que causa la enfermedad está mutada. En la mayoría de los casos, este gen mutado único no causa degeneración retiniana porque ha perdido la función; más bien, causa enfermedad porque la mutación conduce a la producción de un producto genético que ha adquirido una nueva función, una función que es tóxica o dañina para las células fotorreceptoras de bastones y/o conos. Esta situación hace que las estrategias de reemplazo de genes sean más complejas ya que la introducción de un gen funcional no es suficiente; Una terapia efectiva requiere tanto desarrollar un enfoque para deshacerse de la expresión del producto genético "malo" producido a partir del gen con la mutación tóxica como mantener la función de la copia no mutada del gen, que los genetistas llaman el gen de tipo "silvestre" (WT).

En la actualidad, no hay tratamientos aprobados por la FDA para ADRP. La mayoría de los estudios de laboratorio y de investigación en animales adoptan un enfoque de dos pasos: 1) eliminar la función de las copias mutadas y WT del gen, y luego 2) introducir, generalmente a través de la terapia génica mediada por AAV, una nueva forma "endurecida" del gen WT que es resistente a la terapia utilizada en el primer paso que destruyó el gen WT endógeno.

El objeto divulgado aquí proporciona una nueva estrategia para el tratamiento ADRP, uno que utiliza la edición del gen CRISPR/Cas9 para orientar con precisión la edición de la información genómica de un organismo vivo, es decir, permite la modulación terapéutica de los genes. Los métodos descritos actualmente usan la edición del gen CRISPR/Cas9 para alterar específicamente la copia mutada del gen que causa la enfermedad para que no exprese su producto genético tóxico, sin afectar la expresión del gen WT. Por ejemplo, una versión mutante del gen de la rodopsina asociada con ADRP (P23H) puede ser dirigida específicamente, cambiando su secuencia para que ya no exprese el producto del gen tóxico. En alguna divulgación aquí, los componentes CRISPR/Cas9 se entregan al ojo dentro de una sola partícula viral de AAV. Este sistema se prueba en el modelo mutante de ratón rodopsina P23H de ADRP. Estos estudios validan un nuevo enfoque para la terapia génica basada en la ingeniería genética personalizada de las células de la retina para el tratamiento de ADRP. El objeto divulgado aquí es aplicable a diversas formas de ADRP, así como a otras distrofias retinianas heredadas de forma autosómica dominante.

Objetivos específicos

La forma autosómica dominante de la retinitis pigmentosa (ADRP) constituye aproximadamente el 30-40% de todos los casos de RP, y entre los pacientes con ADRP, el gen asociado a RP más comúnmente mutado es el que codifica la rodopsina del pigmento visual de la barra (Dryja y otros (1990) The New England Journal of Medicine 323, 1302 1307; Dryja y otros (1990) Nature 343, 364-366). El objeto divulgado aquí proporciona un enfoque para tratar ADRP mediante el uso de la tecnología de edición de genes CRISPR/Cas9 (Doudna & Charpentier (2014) Science 346, 1258096; Hsu et al. (2014) Cell 157, 1262-1278) en donde la endonucleasa Cas9 guiada por ARN se usa junto con pequeños ARN de guía personalizables (ARNg) para apuntar y escindir el alelo de rodopsina mutante. La unión final no homóloga propensa a errores (NHEJ) elimina específicamente la expresión del alelo mutante, sin afectar el alelo normal. Los componentes necesarios pueden ser entregados a los fotorreceptores por un solo AAV5, un serotipo AAV con rendimiento documentado en barras de mamíferos. Incluso si se produce la expresión de solo el 50% del nivel de rodopsina de tipo silvestre, los datos en animales sugieren que esto es suficiente para proporcionar una función de barra clínicamente útil (Liang et al. The Journal of Biological Chemistry 279, 48189-48196).

Si bien se ha demostrado que la focalización CRISPR de mutaciones de la enfermedad es efectiva in vitro e in vivo, a través de ratones y otros estudios en animales, todos los enfoques actuales aún están lejos del uso clínico debido en gran parte a las limitaciones de entrega. Los vectores AAV son los vectores virales más utilizados en la terapia génica ocular (Dalkara y Sahel (2014) Comptes Rendus Biologies 337, 185-192; Day et al. (2014) Advances in Experimental Medicine and Biology 801, 687-693; Willett y Bennett (2013 Frontiers in Immunology 4, 261 ; Dinculescu et al. (2005) Human Gene Therapy 16, 649-663). Varias características hacen que el AAV sea una opción atractiva: el virus no es patógeno, infecta tanto las células en división como las que no se dividen, la expresión puede persistir por largos períodos de tiempo y es particularmente notable por su historial de seguridad, eficacia y una falta general de toxicidad en ensayos clínicos. Además, se están desarrollando combinaciones de serotipos y promotores de AAV variantes que son efectivos para atacar a las células fotorreceptoras después de la inyección intravítrea. Sin embargo, dado que en su estado actual, estos vectores desencadenan una respuesta inmune y carecen de tropismo panretiniano eficiente hacia fotorreceptores en el ojo de tamaño humano (Kotterman et al. (2015) Gene therapy 22, 116-126; Mowat et al. (2014) Gene Therapy 21, 96-105; Dalkara et al. (2013) Science Translational Medicine 5, 189ra176), el enfoque estará en el uso ya bien caracterizado del vector AAV5 administrado por inyección subretiniana.

El genoma de AAV es una molécula de ADN monocatenario de 4,7 kb que puede modificarse para transportar hasta 5,2 kb de ADN recombinante, aunque empujar este límite conduce a una menor eficiencia de empaquetado e insertos eliminados (Berns et al. (1986) Fundamental Virology, ed BN Fields and Knipe, DM, 545-562 Raven Press). Debido al gran tamaño del gen que codifica la proteína Cas9 de uso común (4,1 kb), la entrega con un ARNg, que incluye secuencias promotoras, terminadoras y de repetición terminal invertida viral (ITR) necesarias para la expresión a través de un solo vector viral, es actualmente limitada por esta capacidad de embalaje AAV. De hecho, la reconstitución del complejo de CRISPR activo requiere co-transducción, que es menos eficiente que una sola transducción. Además, esto requiere una dosis viral mayor, lo que podría inducir una mayor respuesta inmune y toxicidad asociada. Además, es probable que la entrega de un segundo vector viral en ensayos en humanos conlleve desafíos adicionales para la aprobación de la FDA.

El desarrollo de la tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado el campo de la edición de genes. Los métodos anteriores de las tecnologías de edición del genoma, como las nucleasas de dedo de zinc (ZFN) y las nucleasas efectoras activadoras de la transcripción (TALEN), potenciaron la capacidad de generar modificaciones específicas del genoma y ofrecen el potencial para corregir mutaciones de la enfermedad con precisión. Si bien son efectivas, estas tecnologías están sujetas a limitaciones prácticas, ya que los pares ZFN y TALEN requieren sintetizar proteínas de reconocimiento grandes y únicas para un sitio diana de ADN dado. Varios grupos han informado recientemente sobre la edición del genoma de alta eficiencia mediante el uso de un sistema de ingeniería CRISPR/Cas9 tipo II que evita estas limitaciones clave (Jinek et al. (2012) Science 337, 816-821; Cong et al. (2013)) Science 339, 819-823; Mali et al. (2013) Science 339, 823-826). El sistema CRISPR/Cas9 se compone de un ARN guía (ARNg) que dirige la nucleasa Cas9 al ADN específico de la secuencia. Dado que la edición del genoma CRISPR/Cas9 se basa en un ARNg sintético corto para el direccionamiento genómico en lugar de combinaciones únicas de dominios de unión al ADN dentro de la nucleasa como se requiere por ZFN y TALEN, se elimina la laboriosa y ardua tarea de hacer las construcciones necesarias para la expresión de z Fn y TALEN. Generar construcciones para el sistema CRISPR/Cas9 es simple y rápido, y las dianas se pueden multiplexar. La escisión por el sistema CRISPR requiere un emparejamiento de bases complementario del ARNg con una secuencia de ADN de 20 nucleótidos y el motivo adyacente protoespaciador (PAM), un motivo de nucleótido corto que se encuentra a 3' del sitio diana. Teóricamente, se puede apuntar a cualquier secuencia única de N²⁰-PAM en el genoma utilizando la tecnología CRISPR. Actualmente, la proteína Cas9 menos restrictiva y más utilizada es de S. pyogenes, que reconoce la secuencia NGG y, por lo tanto, la secuencia de direccionamiento CRISPR es N²⁰NGG. El N degenerado en la secuencia NGG significa que dada una secuencia única de 20 nucleótidos (N²⁰), Cas9 dividiría N²⁰AGG, N²⁰TGG, N²⁰CGG y N²⁰GGG por igual, lo que puede ser un problema para la focalización precisa de alelos.

Para el direccionamiento in vivo del gen de la rodopsina, las moléculas efectoras CRISPR/Cas9 requeridas se entregan a las células de la barra mediante la administración subretiniana de vectores AAV5 diseñados de forma apropiada. Se ha demostrado que el vector del serotipo 5 es muy eficiente en la transducción de primates no humanos (Mancuso et al. (2009) Nature 461, 784-787) y fotorreceptores caninos (Beltran et al. (2012) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 2132-2137) y ser capaces de mediar la terapia retiniana. Aunque los vectores AAV modificados con cápside pueden penetrar en los fotorreceptores del vítreo en el ratón (Petrs-Silva et al. (2011) Molecular Therapy: Journal of the American Society of Gene Therapy 19, 293-301), hasta ahora no han podido ser igualmente penetrantes en perros o primates no humanos (observaciones no publicadas).

Un desafío importante para administrar Cas9 y guiar ARN a través de AAV es que el ADN requerido para expresar ambos componentes excede el límite de empaquetado de AAV, aproximadamente 4,7-4,9 kb, mientras que el ADN requerido para expresar Cas9 y el ARNg, por métodos convencionales, supera los 5 kb (promotor, ~ 500 pb; spCas9, 4.140 pb; terminador Pol II, ~ 250 pb; promotor U6, ~ 315 pb; y el ARNg, ~ 100 pb). Swiech y col. (2015, Nature Biotechnology 33, 102-106) abordaron este desafío mediante el uso de un enfoque de dos vectores: un vector AAV para administrar el Cas9 y otro vector AAV para la administración de ARNg. Sin embargo, el enfoque de AAV doble en este estudio aprovechó un promotor particularmente pequeño, el promotor Mecp2 murino, que aunque expresado en células retinianas no se expresa en varillas (Song et al. (2014) Epigenetics & chromatin 7, 17; Jain et al. (2010) Pediatric Neurology 43, 35-40). Por lo tanto, este sistema tal como está construido no sería adecuado para la mayoría de los casos de a Dr P. El objeto divulgado aquí proporciona un enfoque de vector único para la edición del gen de la retina que debería aumentar la eficiencia, enfocarse específicamente en los fotorreceptores y reducir la toxicidad potencial del suministro de carga viral.

Resultados

El promotor H1, en lugar del promotor U6 más tradicionalmente usado, se ha utilizado para dirigir la transcripción de ARNg y permite una duplicación aproximada del espacio de selección de genes CRISPR disponible (Ranganathan et al. (2014) Nature Communications 5, 4516). En particular, se detectó una menor propensión al corte fuera de diana, lo que sugiere que el promotor H1 es más favorable para los enfoques terapéuticos. Durante estos estudios, se observó la presencia de un gen codificador de proteínas (PARP-2) en estrecha proximidad genómica al gen H1RNA endógeno (Baer et al. (1990) Nucleic Acids Research 18, 97-103; Myslinski et al. (2001) Nucleic Acids Research 29, 2502-2509). La secuencia entre el inicio del ARN H1 (una transcripción de ARN pol III) y el gen PARP-2 (una transcripción de pol II) es de 230 pb (Figura 13), lo que indica que esta secuencia relativamente pequeña puede funcionar como un promotor bidireccional compacto. Se cree que esta es la única secuencia promotora bidireccional en genomas de mamíferos que puede dirigir tanto una transcripción pol II como una pol III y puede usarse para superar los obstáculos de tamaño de empacar ambos componentes CRISPR en un solo AAV.

Para desarrollar el uso de H1 como un promotor bidireccional de pol II/III para la expresión dual de Cas9/ARNg, y debido a que su actividad de sondeo III ya está bien caracterizada, se creó una construcción de indicador eGFP para optimizar mejor su actividad de pol II (FIG. 14). Los resultados iniciales en células humanas (HEK293) y de ratón (NIH3T3) demostraron una fluorescencia de GFP débil, pero claramente detectable, lo que indica que el promotor H1 podría dirigir la expresión de pol II, aunque débilmente. Usando este sistema informador GFP, la expresión de pol II se incrementó mientras se mantenía la compacidad del promotor al evaluar los tres componentes variables en el sistema: la secuencia promotora, el 5'UTR y la secuencia del terminador. Las pruebas de las secuencias del promotor H1 de diferentes organismos indicaron que tanto las secuencias de ratón (176 pb) como de rata (207 pb) fueron capaces de generar una expresión de GFP más fuerte que el promotor H1 humano (~ 7 y ~ 6 veces más, respectivamente). Sin embargo, dado que el objetivo es derivar un sistema para uso con células humanas in vivo, se usaron secuencias promotoras humanas siempre que fue posible. Para evaluar diferentes secuencias terminadoras, se probaron siete secuencias diferentes y se descubrió que el terminador SV40 (240 pb) y una secuencia sintética de poli (A) (SPA) de 49 pb (Levitt et al. (1989) Genes & Development 3, 1019-1025) fueron funcionales para la expresión de GFP. Mientras se optimizaba la eficiencia de la traducción a través de la modificación de 5'UTR para mejorar la expresión del indicador, se descubrió que la inserción de una secuencia de 50 pb tomada de la secuencia de betaglobina 5'UTR podía mejorar significativamente la expresión del indicador. De acuerdo con esta noción, la simple inserción de 9 bases que codifican una fuerte secuencia de Kozak (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15, 8125 8148) (5'-GCCGCCACC-3') fue suficiente para aproximar estos niveles (Figura 15.)

En base a la información derivada de estos experimentos de optimización basados en GFP, las construcciones de direccionamiento fueron generadas usando la secuencia promotora H1 humana para expresar simultáneamente la proteína Cas9 y un ARNg dirigido. Para probar la capacidad de estas construcciones bidireccionales para la escisión directa en las células, las células NIH3T3 se electroporaron con un enfoque estándar de dos plásmidos (pCAAGS: Cas9 y H1: gARN), o con el sistema de un solo plásmido que expresa ambos componentes. Se apuntaron dos loci diferentes en el genoma del ratón. Cuarenta y ocho horas después de la electroporación, se recogió el ADN genómico y se realizó un ensayo T7 Endo I (T7EI) (Ran et al. (2013) Nature protocolos 8, 2281-2308) para cuantificar los niveles de modificación genómica. Se usó el ensayo T7EI en lugar del ensayo Surveyor más tradicional porque se ha informado que es más sensible en la detección de deleciones (Vouillot et al. (2015) G3). Se descubrió que la escisión CRISPR podría dirigirse eficazmente a estos dos loci utilizando el sistema bidireccional compacto que es de aproximadamente 4,7 kb, dentro de la capacidad de envasado de AAV (FIG. 16A y FIG. 16B). Además de demostrar la aplicabilidad y relevancia de esta estrategia de focalización en células humanas, existen datos para la focalización de Cas9 en la línea de células madre embrionarias H7 humanas. Al usar el promotor H1 del ratón en lugar de la secuencia humana, y el terminador SPA en lugar de la secuencia del terminador SV40, el tamaño de las construcciones de direccionamiento se puede reducir teóricamente en otros 200 pb. Estas reducciones de secuencia podrían permitir un empaque más eficiente, o potencialmente dar espacio adicional para modificaciones de secuencia que podrían impulsar, reducir e incluso regular la expresión del sistema Cas9; modificaciones que podrían ser importantes para reducir los posibles efectos fuera de diana. Los plásmidos bidireccionales se han generado con un sitio de restricción único que permite la inserción simple de la diana utilizando el método de clonación de Gibson (NEB), junto con sitios NotI flanqueantes que pueden clonarse fácilmente en los vectores que contienen ITR del sistema libre de ayuda de AAV (Agilent).

Diseñe y optimice Cas9 y el promotor de ARNg, procesamiento de ARN y elementos estructurales para que puedan expresarse eficazmente desde un único sistema de vector AAV y generar un vector preclínico similar a GMP apropiado.

A través de la combinación del promotor bidireccional H1 para impulsar simultáneamente la expresión de Cas9 y ARNg, y los esfuerzos de optimización, ya se han realizado avances sustanciales en la reducción del tamaño de la entrega CRISPR bajo la capacidad de envasado de AAV. Las diversas combinaciones de secuencias promotoras alternativas, modificaciones UTR 5'/3' y diferentes ARNg proporcionan un conjunto de herramientas para probar el espectro potencial de eficiencias de direccionamiento.

Una vez que las construcciones se optimizan aún más en términos de tamaño, expresión y eficiencia de corte, se pueden usar para generar vectores AAV para probar in vitro e in vivo. Las construcciones que se utilizan para los estudios de optimización contienen un sitio de restricción único que permite la inserción de dianas simples, junto con sitios NotI flanqueantes que permiten la clonación en los plásmidos vectoriales que contienen ITR para la producción de AAV. El vector AAV5 preclínico similar a GMP de alto título para el cultivo celular y el ratón, se pueden generar estudios en una instalación de producción de vectores independiente, utilizando un método de transfección de plásmidos sin ayuda y purificado por técnicas previamente desarrolladas (desarrollamos (Dryja et al. (1990) The New England Journal of Medicine 323, 1302-1307; Dryja et al. (1990) Nature 343, 364-366). Cada preparación viral se puede producir utilizando el sistema auxiliar de ADN de plásmido pDG mini-Ad, que elimina el adenovirus WT y contaminación por AAV competente en replicación en el vector final. Los vectores se purifican por centrifugación en gradiente de iodixanol seguido de cromatografía de FPLC en columna Q. Para establecer la pureza similar a GMP de las reservas de vectores de AAV, cada vector puede someterse a una batería estandarizada de material físico y ensayos biológicos que incluyen la evaluación de la pureza, la carga biológica, la esterilidad, el título de partículas que contienen ADN, el título infeccioso, la relación de partículas a infectividad y la posible contaminación por a Av competente en replicación.

Aunque los estudios con el promotor H1 hasta la fecha han indicado un bajo nivel de efectos fuera de diana (Ranganathan et al. (2014) Nature Communications 5, 4516), dado que los constructos se están desarrollando con el objetivo de un uso clínico eventual, se deben monitorear cuidadosamente para detectar posibles actividades fuera de diana (Wu et al. (2014) Quantitative Biology 2, 59-70) Para este propósito, se pueden seguir varios enfoques complementarios. Tomando un enfoque bioinformático, todos los sitios CRISPR potenciales en el genoma humano y de ratón se determinaron usando un script Perl personalizado escrito para buscar ambas cadenas y ocurrencias superpuestas del sitio de secuencia CRISPR de 23 meros (Ranganathan et al., manuscrito en preparación, 2015) Por ejemplo, en el genoma humano, se identificó un conjunto inicial de 137,409,562 sitios CRISPR después de filtrar secuencias repetitivas. Luego, cada sitio se calificó de acuerdo con un algoritmo personalizado que asigna valores basados en la unicidad de la secuencia de 23 bases sesgada hacia el extremo 3' o PAM (región semilla) (Jinek et al. (2012) Science 337: 816-821). Finalmente, la propensión de cada sitio a exhibir efectos fuera de diana se calculó utilizando Bowtie (Langmead et al. (2009) Genome Biology 10, R25) para realinear cada sitio CRISPR nuevamente en el genoma permitiendo hasta tres desajustes de bases en toda la secuencia diana. Usando los objetivos fuera de destino pronosticados computacionalmente, cada ARNg puede probarse para detectar dianas espurias. Los cebadores de PCR que flanquean los sitios predichos potenciales fuera de diana se pueden usar para amplificar la secuencia genómica que luego se puede analizar para determinar la eficiencia de escisión con el ensayo T7EI. Esto permitirá monitorear la precisión de la focalización para los experimentos de optimización tanto in vitro como in vivo. El objetivo será cortar menos del 0,5% fuera de diana, aunque será aceptable menos del 5%.

Si bien el enfoque se ha centrado en la orientación estándar de Cas9, también se consideran enfoques alternativos, incluida la orientación de secuencias PAM alternativas. Se ha informado que Cas9 se dirige a motivos PAM con NAG además de las secuencias NGG estándar (Hsu et al. (2013) Nature Biotechnology, doi: 10,1038/nbt,2647). Se han identificado dos secuencias CRISPR en la secuencia humana y tres secuencias de direccionamiento en el genoma del ratón que se superponen a la mutación P23H, lo que podría proporcionar sitios de direccionamiento adicionales. Si bien se espera que los sitios NAG PAM se dirijan con menos eficiencia que los sitios NGG (Zhang et al. (2014) Scientific Reports 4, 5405), esto puede proporcionar un mecanismo para valorar la dosis, lo que puede ser valioso si se determina que las construcciones tienen un significado significativo efectos fuera de diana. Las cinco secuencias que usan el sitio NAG PAM pueden clonarse inicialmente en pH1v126 usando el conjunto Gibson (NEB). Las dos secuencias humanas pueden cotransfectarse (Lipofectamine 3000) con plásmido Cas9 en células 293, mientras que los plásmidos de ratón pueden electroporarse (Invitrogen, Neon) con plásmido Cas9 en células NIH3T3. Para detectar la actividad de ARNg, se pueden cuantificar las tasas de mutaciones indel introducidas por NHEJ en los sitios de escisión de Cas9 entre los sitios NGG canónicos y NAG no canónicos.

También se puede usar un enfoque terapéutico alternativo, conocido como CRISPRi, que utiliza una versión de Cas9 (dCas9) sin nucleasa para reprimir específicamente la expresión del alelo P23H (Qi et al. (2013) Cell 152, 1173- 1183; Gilbert et al. (2013) Cell 154, 442-451; Larson et al. (2013) Nature Protocols 8, 2180-2196; Fuller et al. (2014) Advances in Experimental Medicine and Biology 801, 773-781). En lugar de inducir la escisión, dCas9 permanece unido firmemente a la secuencia de ADN, y cuando se dirige dentro de un gen transcrito activamente, la inhibición de la progresión de pol II a través de un mecanismo de impedimento estérico puede conducir a una represión transcripcional eficiente. Al lograr la represión terapéutica de P23H sin inducir roturas de ADN, y dada la expresión constitutiva de A A V , la adm inistración de un inhibidor transcripcional de A A V 5 podría se r favorable tanto desde el punto de vista de la terapia génica como del obstáculo regulador. La represión transcripcional por C R IS P R i puede optim izarse usando q R T -P C R para medir la expresión de rodopsina específica de alelo.

Valide la capacidad del vector AAV5 desarrollado para cortar y eliminar la expresión del alelo de rodopsina mutante in vitro utilizando cultivos de fotorreceptores primarios del ratón P23H.

S e pueden u sar cultivos de cé lu las fotorreceptoras de ratón prim arias para validar las construcciones de direccionam iento in vitro antes de avanzar a estudios en anim ales. El d ía postnatal 2 -10 anim ales pueden usarse para co se ch ar y d isociar la retina de ratón para a is la r cé lu las para en sayo s de selección. Probar las construcciones en el ratón humano (h) Rho: G F P (Chan et al. (2004) Proceedings of the National A cadem y of S c ie n ce s of the United States of A m erica 101, 9109 -9114 ) puede permitir una m ayor optimización de la orientación de la rodopsina. El ratón knockin h R h o -G F P contiene una fusión de ro d o p sin a-G FP hum ana golpeada en el m arco de lectura abierta de rodopsina de ratón (figura 17). Este ratón parcialm ente hum anizado permite el direccionam iento de se cu e n cias esp ecíficas hum anas en célu las fotorreceptoras. La secuencia rho hum ana puede ser dirigida y luego se puede cuantificar la pérdida de G F P de los fotorreceptores. A unque se está apuntando a la rodopsina, el reportero de G F P se fusiona en el marco y, por lo tanto, la pérdida de fluorescencia sirve como un proxy conveniente para el N H E J propenso a errores en el sitio diana aguas arriba. Con la electroporación de las célu las de la retina, se logra de m anera rutinaria una eficiencia de transfección del 10 -20 % , y para enriquecer a la población de célu las m odificadas C R IS P R , la población transfectada puede clasificarse según la intensidad de un indicador fluorescente C as9. V a ria s construcciones de C a s9 fusionadas con varias P2A : se han generado proteínas indicadoras que permiten controlar la actividad de fluorescencia sin comprometer la actividad de C a s9. Usando cultivos de retina de ratones Rho: G F P , el reportero C as9 : P2A : m Cherry y un A R N g de direccionam iento pueden electroporarse. Luego, d esp ués de 24 horas de cultivo, se pueden clasificar las célu las doblemente positivas, enriqueciendo a s í los fotorreceptores que se han transfectado. Cuarenta y ocho horas después, las célu las se pueden resuspender en tampón Q uickExtract (Epicentro) para recolectar A DN genómico, y analizar la modificación genóm ica mediante el ensayo T 7 E I. De m anera similar, el direccionam iento de la mutación de rodopsina se puede validar utilizando cultivos de fotorreceptores primarios del ratón P 23 H . Incluso con un bajo nivel de transfección ( 10 % ) , la edición del genom a se puede detectar usando el ensayo T 7 E I si la eficacia de la orientación de los constructos es superior al 10 % , de acuerdo con los resultados iniciales. A dem ás, el uso de vectores A A V 5 debería producir eficiencias de transducción significativam ente m ás altas. Tam bién se realizará un a nális is de secuenciación profunda específica de sitio de alta resolución y alta sensib ilidad de sitios dentro y fuera de diana. La s se cu e n cia s genóm icas que flanquean el sitio diana C R IS P R y los sitios predichos fuera de diana pueden am plificarse usando polim erasa de alta fidelidad (N E B, Phusion) durante 15 ciclos, y luego purificarse usando D N A C lean & Concentrator-5 (Zymo). Los productos de P C R purificados pueden am plificarse durante 5 ciclos para unir adaptadores Illumina P 5 y códigos de barras específicos de m uestras, purificarse nuevam ente y luego cuantificarse mediante fluorescencia verde S Y B R , a nalizarse en un B ioA nalyzer y finalmente agruparse en una relación equim olar antes de la secuenciación con un secuenciador personal M iSeq. Para analizar los datos de secuenciación, las lecturas M iSeq de extremo de par de 300 pb se demultiplexarán utilizando el software Illumina M iSeq Reporter, seguido de un adaptador y un ajuste de calidad de las lecturas sin procesar. La s alineacio nes se realizarán en todas las lecturas de la secuen cia de tipo silvestre y la frecuencia de N H E J se calculará de la siguiente m anera: 100 x (número de lecturas indels/núm ero de lecturas indels número de lecturas W T).

Valide la capacidad del vector mejorado de SA2 para cortar y elim inar la expresión del alelo de rodopsina mutante in vivo después de la inyección subretiniana en ratones P23H.

El siguiente paso será dem ostrar el direccionam iento in vivo de la mutación P 23 H Rhodopsin en ratones. A partir de los esfuerzos de bioinformática, se identificó un sitio de orientación C R IS P R de alta puntuación que se superpone al codón P 23 del ratón. El sitio C R IS P R en la forma N²⁰N G G cae en la cadena inversa: 5'-A G T A C T G T G G G T A C T C G A A G G G G -3' (PAM subrayado). La mutación P 23 H es una transversión C ^ A que cam bia un codón de prolina C C C a un codón de histidina C A C . Desafortunadam ente, la ubicación de la mutación P 23 H del ratón dentro del sitio C R IS P R ca e en el N del motivo N G G PAM , la única ubicación en el sitio de orientación que es independiente de la identidad bp. Dado que esto significa que un C R IS P R dirigido contra la secuen cia P 23 H sería incapaz de d iscrim inar entre la secu en cia de tipo silvestre y la secu en cia P 23 H , y por lo tanto se esperaría que la segm entación cortara am bos alelos, se ha desarrollado un enfoque alternativo basado en la aparición de polimorfismos de un solo nucleótido (SN P).

H ay ~ 17 m illones de S N P (incluidas variaciones de base única, indeles, S T R , M NP, etc.) informados en el genom a hum ano (~1 cada 180 pb), y esta variación es inm ensam ente importante en contextos de m edicina genóm ica personalizada. S e razonó que la utilización de variaciones genéticas naturales podría no solo proporcionar un método para apuntar específicam ente al alelo de rodopsina P 23 H en el modelo de ratón, sino también dem ostrar un enfoque de prueba de concepto que probablemente se volverá aún m ás relevante para futuros enfoques de ingeniería genóm ica y terapéutica. S e descubrió que el ratón castaneus (Cast) contiene un S N P dentro del codón prolina 23 del gen de la rodopsina que difiere de la se cu en cia C 57 B L /6 J , y se obtuvo un ratón mutante P 23 H en un fondo genético C 57 B L /6 J para el análisis. El S N P está inm ediatamente adyacente a la transversión causante C ^ A en P 23 H , que proporciona un enfoque para la orientación del alelo dominante P 23 H sin dirigirse al alelo de rodopsina de tipo silvestre. Dado que el fondo para la mutación P 23 H es C 57 B L /6 J , d esp ués de una generación de reproducción C a st/P 23 H , se

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sistema CRISPR-Cas no natural que comprende un vector que comprende un promotor H1 bidireccional, en donde el promotor de H1 bidireccional comprende:

a) elementos de control que proporcionan la transcripción en una dirección de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de una molécula de ADN en una célula, y en donde la molécula de ADN codifica uno o más productos génicos expresados en la célula; y

b) elementos de control que permiten la transcripción en la dirección opuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9,

en donde ARNg se dirige a e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN a la expresión alter del uno o más productos génicos, y en donde dicho sistema está empaquetado en una sola partícula de virus adenoasociado (AAV).

2. Un método in vitro para alterar la expresión de uno o más productos génicos en una célula, en donde la célula comprende una molécula de ADN que codifica el uno o más productos génicos, comprendiendo el método la introducción en la célula de un sistema CRISPR-Cas no natural que comprende un vector que comprende un promotor bidireccional H1, en donde el promotor bidireccional H1 comprende:

a) elementos de control que proporcionan la transcripción en una dirección de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un a Rn guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), en donde el ARNg se hibrida con una secuencia diana de la molécula de ADN; y

en donde el ARNg se dirige a e hibrida con la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN a la expresión alter del uno o más productos génicos en la célula, y en donde dicho sistema se introduce en la célula usando una sola partícula de virus adenoasociado (AAV).

3. Un sistema CRISPR-Cas no natural según la reivindicación 1 para uso en la terapia.

4. Un sistema CRISPR-Cas de origen no natural de acuerdo con la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa ocular en un sujeto que lo necesite.

5. El sistema según la reivindicación 1, el método según la reivindicación 2, o el sistema para uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde la secuencia diana comprende la secuencia de nucleótidos AN ¹⁹NGG, GN¹⁹NGG, CN¹⁹NGG, o TN¹⁹NGG.

6. El sistema según la reivindicación 1, el método según la reivindicación 2, o el sistema para uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde la proteína Cas9 es un codón optimizado para la expresión en la célula.

7. El sistema según la reivindicación 1, el método según la reivindicación 2 o el sistema para uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde la célula es una célula eucariota.

8. El sistema, el método o el sistema para su uso según la reivindicación 7, en donde: (i) la célula eucariota es una célula de mamífero o humana; o (ii) la célula eucariota es una célula fotorreceptora retiniana.

9. El sistema según la reivindicación 1, el método según la reivindicación 2 o el sistema para uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde la expresión de uno o más productos genéticos está disminuida.