ES2761937T3

ES2761937T3 - Método para preparar micropartículas recubiertas con polímero

Info

Publication number: ES2761937T3
Application number: ES06851733T
Authority: ES
Inventors: Gil Lee; Hao Shang; Won-Suk Chang
Original assignee: MAGSENSE LIFE SCIENCES Inc
Current assignee: MAGSENSE LIFE SCIENCES Inc
Priority date: 2005-10-24
Filing date: 2006-10-24
Publication date: 2020-05-21
Anticipated expiration: 2026-10-24
Also published as: WO2008048271A2; DK1945271T3; EP1945271B1; EP1945271A4; EP1945271A2; US20070172426A1; WO2008048271A3; US8715739B2

Abstract

Método de preparación de micropartículas uniformes, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar nanopartículas de partida que tienen o bien una superficie hidrófoba o bien una superficie hidrófila, en el que dichas nanopartículas de partida tienen un diámetro de partícula de entre 1 y 100 nm, en el que las nanopartículas de partida comprenden uno o más materiales magnéticos; (b) suspender dichas nanopartículas de partida en una primera fase fluida para proporcionar una suspensión de las nanopartículas de partida en dicha primera fase fluida, en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófobo si las nanopartículas iniciales son hidrófobas, y en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófilo si las nanopartículas iniciales son hidrófilas; (c) mezclar la suspensión formada en la etapa (b) con una segunda fase fluida en la que la primera fase fluida no es miscible, produciendo de ese modo una emulsión de gotas de la suspensión formada en la etapa (b) dispersas en la segunda fase fluida, en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase acuosa si la primera fase fluida comprende nanopartículas de partida hidrófobas en suspensión en un disolvente hidrófobo, y en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase hidrófoba si la primera fase fluida comprende nanopartículas de partida hidrófilas en suspensión en un disolvente hidrófilo; (d) evaporar suficiente cantidad de disolvente hidrófobo o hidrófilo de la emulsión para autoensamblar nanopartículas para formar micropartículas en suspensión ahora en la segunda fase fluida; (e) proporcionar un monómero polimerizable a la segunda fase fluida; y (f) polimerizar el monómero polimerizable para proporcionar una capa de polímero sobre las micropartículas; en el que las micropartículas recubiertas tienen un núcleo magnético que comprende más del 50% de la masa de la partícula, en el que el núcleo magnético es la nanopartícula desnuda sin sus recubrimientos hidrófobos o hidrófilos y sin un recubrimiento polimérico; y en el que el tamaño de las micropartículas recubiertas oscila entre 0,01 y 10 μm.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para preparar micropartículas recubiertas con polímero

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a métodos para producir partículas uniformes de tamaño micrométrico que comprenden nanopartículas densamente empaquetadas, y más particularmente a métodos para preparar micropartículas magnéticas altamente uniformes, de alto momento magnético, recubiertas con polímero, usando una técnica de ensamblaje con plantilla basada en emulsión. Dichas partículas son útiles en separaciones biológicas, mediciones biofísicas, ensayos bioanalíticos, administración de fármacos, tratamiento de hipertermia y obtención de imágenes mediante resonancia magnética (IRM).

Descripción de la técnica relacionada

Las micropartículas paramagnéticas recubiertas con polímeros se han empleado en una variedad de aplicaciones, como separaciones biológicas, mediciones biofísicas, ensayos bioanalíticos, terapéutica e IRM. Las partículas magnéticas pueden recubrirse con químicas específicas de modo que las partículas tengan la capacidad de unirse a las dianas correspondientes a partir de una mezcla de materiales biológicos. Estas partículas magnéticas pueden separarse de la mezcla atrayéndolas a un campo magnético exterior de modo que la diana unida a la superficie de la partícula pueda separarse. La capacidad de unir materiales biológicos específicos a las partículas magnéticas proporciona un medio simple y eficaz para la separación y purificación de células, virus y macromoléculas biológicas. Los ejemplos de publicaciones relevantes revisadas por pares incluyen Kemshead et al, “Monoclonal-Antibodies Attached to Microspheres Containing Magnetic Compounds, Used to Remove Neuro-Blastoma Cells from Bone-Marrow Taken for Autologous Transplantation”, European Journal of Cancer & Clinical Oncology, 18 (10), 1982, págs. 1043; Dirami et al, “Separation and Characterization of Leydig Cells and Macrophages from Rat Testes”, Journal of Endocrinology, 130(3), 1991, págs. 357-365; Ahmed et al., “Isolation and Partial-Purification of a Melanocyte-Stimulating Hormone Receptor from B16 Murine Melanoma-Cells - a Novel- Approach Using a Cleavable Biotinylated Photoactivated Ligand and Streptavidin-Coated Magnetic Beads”, Biochemical Journal, 286, 1992, págs.

377-382; Ito et al., “Sequence-Specific DNA Purification by Triplex Affinity Capture”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89(2), 1992, págs. 495-498; McCornell et al., “Biopanning phage display libraries using magnetic beads vs. polystyrene plates”, Biotechniques, 26(2), págs. 208. Los ejemplos de patentes relevantes incluyen la patente estadounidense n.° 4.695.392 y la patente estadounidense n.° 4.230.685. Las partículas magnéticas también se han empleado como herramienta en mediciones biofísicas. La capacidad de generar una fuerza bajo un campo magnético ha hecho que las partículas sean particularmente útiles en la ciencia biológica para caracterizar interacciones de unión específica y diferenciar interacciones de unión específica e inespecífica. El uso de partículas magnéticas en mediciones biofísicas se describe, por ejemplo, en Shang et al , “The Application of Magnetic Force Differentiation for the Measurement of the Affinity of Peptide Libraries”, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 293, 2005, págs. 382-388; Strick et al, “The elasticity of a single supercoiled DNA molecule”, Science, 271(5257), 1996, 1835-1837.

Las partículas magnéticas se han utilizado como herramienta bioanalítica. La patente estadounidense n.° 5.236.824 describe un método de inmunoensayo magnético con láser in situ, que permite una determinación cuantitativa de una sustancia inmunológica diana en una disolución de analito que contiene especies unidas y libres. El ensayo de discriminación de fuerza se describe en la patente estadounidense n.° 6.180.418 B1. La patente estadounidense n.° 6.294.342 B1 describe métodos de ensayo que utilizan la respuesta de partículas magnéticas a la influencia de un campo magnético para medir cualitativa o cuantitativamente la unión entre pares de unión específicos y, por tanto, puede determinarse la presencia o la cantidad de analito contenido en una muestra de prueba.

Las partículas magnéticas se han utilizado en la investigación médica, especialmente en la administración de fármacos, el tratamiento de hipertermia y la obtención de imágenes IRM. Las partículas magnéticas se han utilizado para transportar y localizar el agente terapéutico en una diana específica tal como se describe en Yellen et al, “Targeted drug delivery to magnetic implants for therapeutic applications”, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 293 (1), 2005, págs. 647-654; Saravanan et al, “Ultrasonically controlled release and targeted delivery of diclofenac sodium via gelatin magnetic microspheres”, International Journal of Pharmaceutics, 283(1-2), 2004, págs.

71-82. En el tratamiento de hipertermia, el calor generado por las partículas magnéticas bajo un campo de CA se usa para destruir células defectuosas, tales como cáncer, tal como se presenta en Uskokovic et al., “Silica-coated lanthanum-strontium manganites for hyperthermia treatments”, Materials Letters, 60(21-22), 2006, págs. 2620-2622; Jordan et al, “The effect of thermotherapy using magnetic nanoparticles on rat malignant glioma”, Journal of Neuro-Oncology, 78(1), 2006, págs. 7-14. Las partículas magnéticas, como agente de contraste, pueden mejorar el rendimiento de la imagen de IRM. Se han realizado numerosas investigaciones en esta área, tales como Dousset et al, “MR Imaging of relapsing multiple sclerosis patients using ultra-small-particle iron oxide and compared with gadolinium”, American Journal of Neuroradiology, 27(5), 2006, págs. 1000-1005; McDonald et al, “Investigations into the physicochemical properties of dextran small particulate gadolinium oxide nanoparticles”, Academic Radiology, 13(4), 2006, págs. 421-427; Kleinschnitz et al., “ In vivo detection of developing vessel occlusion in photothrombotic ischemic brain lesions in the rat by iron particle enhanced MRI”, Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 25(11), 2005, págs. 1548-1555.

Estas aplicaciones requieren partículas magnéticas de tamaño micrométrico, estables en disoluciones salinas fisiológicas y que tienen una imantación alta y uniforme con escasa imantación residual.

La patente estadounidense n.° 4.654.267 describe posiblemente la primera partícula magnética en la que se prepararon las partículas poliméricas magnéticas tratando partículas poliméricas compactas o porosas con una disolución de sales de hierro, que pueden formar partículas de óxido de hierro de tamaño nanométrico elevando el valor de pH. Se han desarrollado al menos otros tres métodos para producir micropartículas magnéticas. En primer lugar, en el procesamiento de núcleo-cubierta, se adsorben física o químicamente partículas magnéticas en una partícula polimérica de tamaño micrométrico tal como se describe en Bizdoaca et al, “Magnetically directed selfassembly of submicron spheres with a Fe3O4 nanoparticle shell”, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 240(1-3), 2002, págs. 44-46. La patente estadounidense n.° 6.133.047 describe las partículas superparamagnéticas que comprenden un núcleo de un primer polímero, una capa interna de un segundo polímero que recubre el núcleo en el que se distribuye un material magnético y una capa externa de un tercer polímero que recubre la capa magnética. La patente estadounidense n.° 5.232.782 describe un procedimiento para preparar micropartículas de núcleo-cubierta imantables basadas en un organopolisiloxano reticulado. El segundo enfoque usa la polimerización heterogénea de partículas magnéticas de tamaño nanométrico y un monómero polimérico tal como se describe en Rana et al, “Synthesis of magnetic beads for solid phase synthesis and reaction scavenging”, 40(46), 1999, págs.

8137-8140. En el tercer enfoque, se usan técnicas de emulsión para sintetizar las micropartículas. La patente estadounidense n.° 5.814.687 describe un método para producir partículas poliméricas magnéticas dispersando las partículas nanomagnéticas en una disolución de monómero hidrófobo con el iniciador hidrófobo. Se preparó una emulsión dispersando la disolución de monómero en agua y se inició la polimerización mediante calentamiento. La patente estadounidense n.° US 5846517 describe un método de preparación de micropartículas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere en general a métodos para producir partículas uniformes de tamaño micrométrico que comprenden nanopartículas densamente empaquetadas, y más particularmente a métodos para preparar partículas magnéticas altamente uniformes, de alto momento magnético, recubiertas con polímero, según la reivindicación 1. Un aspecto preferido de la invención comprende: 1) proporcionar nanopartículas que tienen un tamaño de entre 1 nm y 100 nm; 2) opcionalmente, añadir una capa superficial hidrófoba a las nanopartículas; 3) preparar una suspensión de las nanopartículas hidrófobas y el iniciador de polimerización en un disolvente hidrófobo; 4) opcionalmente disolver un monómero en el disolvente hidrófobo; 5) preparar una emulsión dispersando gotas del disolvente hidrófobo en una fase acuosa continua con un emulsionante; 6) opcionalmente dimensionar la primera emulsión para proporcionar una segunda emulsión de los mismos componentes básicos pero en la que las gotas son sustancialmente uniformes y tienen un tamaño de entre 2 y 20 |im; 7) evaporar al menos una porción sustancial de las gotas hidrófobas dispersas para ensamblar nanopartículas para formar micropartículas en suspensión ahora en la fase acuosa; 8) opcionalmente reemplazar el primer tensioactivo por un segundo tensioactivo, que es preferiblemente un tensioactivo polimerizable; 9) opcionalmente añadir un monómero polimerizable a la fase acuosa y permitir que se adsorba en la micropartícula; 10) polimerizar el/los monómero(s) para proporcionar una capa de polímero sobre las micropartículas; y 11) opcionalmente funcionalizar la capa superficial de polímero de las micropartículas con una o más capas de polímero, de nanopartículas o de macromoléculas biológicas.

Otro aspecto de la presente invención dentro de las limitaciones de la reivindicación 1 proporciona un método similar en el que se dispersan nanopartículas hidrófilas en una fase acuosa en suspensión en una fase hidrófoba continua, que se conoce habitualmente como una emulsión de agua en aceite. En este método, el iniciador debe ser soluble en la fase acuosa. La fase hidrófoba debe seleccionarse para que tenga una presión de vapor menor que la fase acuosa, de modo que la fase acuosa pueda evaporarse para permitir el ensamblaje de las nanopartículas.

Las micropartículas tienen un recubrimiento polimérico y un contenido magnético que comprende más del 50%, preferiblemente más del 70% y más preferiblemente más del 90% de la masa de la partícula. La cubierta polimérica puede contener uno o más grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes útiles en el manejo de una variedad de separaciones.

Un beneficio de la presente invención es la capacidad de proporcionar micropartículas magnéticamente sensibles que tienen un núcleo que comprende nanopartículas que son superparamagnéticas y presentan un magnetismo residual insignificante. Dichas nanopartículas pueden estar compuestas por magnetita, pueden tener un tamaño menor de 50 nm y pueden presentar solo propiedades paramagnéticas.

Otro beneficio de la presente invención es la producción de una micropartícula magnética con imantación uniforme. La imantación uniforme se fomenta produciendo nanopartículas dispersas uniformemente en un disolvente hidrófobo tal como se describió anteriormente.

Otro beneficio de la presente invención es proporcionar micropartículas magnéticas cuyo diámetro global puede variarse dentro de un amplio intervalo simplemente cambiando la carga de nanopartículas o el tamaño de la emulsión. Las micropartículas ensambladas preferiblemente varían de tamaño entre 0,01 y 5 micrómetros de diámetro. En algunas realizaciones, las partículas varían de tamaño entre 0,1 y 3,0 micrómetros, mientras que en otras realizaciones las partículas varían de tamaño entre 0,5 y 2,0 micrómetros de diámetro.

Otro beneficio de la presente invención es el desarrollo de una micropartícula magnética cuya distribución de tamaño puede controlarse en un intervalo estrecho. Con los materiales y métodos descritos, los tamaños de las micropartículas ensambladas pueden controlarse de tal manera que las micropartículas sean de tamaño uniforme, con un coeficiente de variación (del tamaño de partícula) de menos del 40%, preferiblemente menos del 20%, más preferiblemente menos del 5%, y pudiendo obtenerse de la manera más preferible de menos del 2% para lotes de micropartículas preparadas mediante el método descrito.

Otro beneficio de la presente invención es proporcionar el procedimiento de polimerización en el que el iniciador está confinado dentro y sobre la superficie de las partículas del núcleo sin fugarse a las disoluciones en las que están en suspensión las partículas. Con los métodos de la presente invención, la polimerización sólo se produce dentro y alrededor de la superficie de las partículas porque aquí es donde está el iniciador. Esto contrasta con los métodos en los que se permite que el iniciador se fugue a la disolución, haciendo que toda la disolución se polimerice y que las partículas se agreguen entre sí.

Otro beneficio de la presente invención es proporcionar a las partículas grupos funcionales, tales como carboxilo y amina primaria, de modo que las partículas sean estables en disoluciones salinas fisiológicas y las biomoléculas de interés puedan unirse covalentemente a la superficie de la partícula.

Otro beneficio de la presente invención es proporcionar métodos para formar partículas recubiertas con una capa de poli(etilenglicol) u otro polímero hidrófilo tal como dextrano, lo que puede usarse para reducir la adsorción inespecífica de proteínas a la superficie de la partícula.

Otro beneficio de la presente invención es proporcionar métodos para formar partículas recubiertas con una capa de nanopartículas, lo que puede usarse para conferir propiedades específicas o un comportamiento funcional a la micropartícula.

Otro beneficio de la presente invención es proporcionar partículas magnéticas con el recubrimiento polimérico que puedan suprimir la adsorción inespecífica y reaccionar específicamente con la diana para que se minimice el falso positivo.

Las partículas magnéticas recubiertas novedosas preparadas mediante los métodos descritos anteriormente e ilustrados a continuación tienen un núcleo magnético (es decir, las nanopartículas desnudas sin sus recubrimientos hidrófobos o hidrófilos, y sin un recubrimiento polimérico) que comprende una proporción significativa de la masa de la partícula, es decir, de más del 50%. Partículas recubiertas preferidas tienen un núcleo magnético que comprende más del 70%, preferiblemente más del 80%, y más preferiblemente más del 90%, de la masa de la partícula. Esto contrasta con los métodos de la técnica anterior en los que el núcleo comprende normalmente el 10-30% de la masa de partículas. El núcleo magnético más grande puede dar como resultado un aumento de la imantación de las partículas terminadas. Por ejemplo, algunos aspectos de la presente invención proporcionan micropartículas recubiertas que tienen una imantación de hasta aproximadamente 25 a aproximadamente 50 uem/g.

En otro aspecto de la invención, las partículas tienen tanto un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 70% de la masa de la partícula como un coeficiente de variación (del tamaño de partícula) de menos del 40%. Partículas preferidas tienen tanto un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 80% de la masa de la partícula como un coeficiente de variación (del tamaño de partícula) de menos del 20%, mientras que partículas más preferidas tienen tanto un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 80% de la masa de la partícula como un coeficiente de variación (del tamaño de partícula) de menos del 5%.

Otras micropartículas preferidas pueden tener un núcleo que comprende más de un tipo de nanopartículas. Es decir, pueden ensamblarse diversas nanopartículas para dar núcleos homogéneos si tienen un tamaño y una energía superficial similares.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra un aspecto de la presente invención según una realización preferida.

La figura 2 muestra el uso de un dispositivo de cizallamiento usado para formar emulsiones.

La figura 3 muestra los perfiles de descomposición programados a temperatura de las micropartículas.

La figura 4 muestra el espectro de fotoelectrones de rayos X de las micropartículas producidas por la muestra 4 en el ejemplo 1.

La figura 5 muestra la curva de imantación de las micropartículas magnéticas.

La figura 6 muestra la emulsión producida por el esfuerzo de cizallamiento.

La figura 7 muestra la imagen de TEM de las partículas que consisten en nanopartículas de óxido de hierro.

La figura 8 muestra la distribución del tamaño de partícula obtenida con una disolución de dextrano al 30%.

La figura 9 muestra la imagen de TEM de las partículas que consisten en nanopartículas de oro y óxido de hierro. La figura 10 muestra la imagen de TEM de las partículas magnéticas con unión exterior de nanopartículas de oro. La figura 11 es un espectro UV-Vis de partículas magnéticas decoradas con nanopartículas de Au, que muestra el pico de adsorción de las partículas magnéticas modificadas con nanopartículas de Au de 5 nm y Au de 10 nm, respectivamente.

La figura 12 es una señal colorimétrica producida por los conjugados de anticuerpo-HRP sobre las micropartículas preparadas usando las condiciones de reacción descritas en la tabla I.

Descripción detallada de la invención

Con el fin de fomentar una comprensión de los principios de la invención, ahora se hará referencia a realizaciones específicas y se usará un lenguaje específico para describir las mismas. No obstante, se entenderá que no se pretende de ese modo limitar el alcance de la invención. Cualquier alteración y modificación en la invención descrita, y cualquier aplicación adicional de los principios de la invención tal como se ilustra en la misma, se contemplan tal como se le ocurriría normalmente a un experto en la técnica a la que se refiere la invención.

Tal como se resumió anteriormente, un aspecto de la invención se refiere a un método para preparar micropartículas con un recubrimiento polimérico dentro de las limitaciones de la reivindicación 1. En una realización preferida, el método comprende: 1) proporcionar nanopartículas de un material superparamagnético que tiene un tamaño de entre 1 nm y 100 nm; 2) opcionalmente añadir una capa superficial hidrófoba a las partículas, preferiblemente combinándolas con un material que tiene un primer extremo que se adsorbe a la superficie de la nanopartícula y un segundo extremo que se extiende lejos de la nanopartícula y confiere hidrofobicidad a las partículas; 3) preparar una suspensión de las nanopartículas hidrófobas y un iniciador de polimerización en el disolvente hidrófobo; 4) opcionalmente añadir un monómero polimerizable al disolvente hidrófobo; 5) preparar una emulsión de la fase hidrófoba en una fase acuosa continua con un emulsionante, en el que la fase hidrófoba comprende gotas en las que se disuelven iniciador de polimerización, nanopartículas hidrófobas y opcionalmente monómero polimérico en las mismas, y la fase acuosa comprende opcionalmente un aditivo viscoelástico; 6) opcionalmente dimensionar la primera emulsión para proporcionar una segunda emulsión de los mismos componentes básicos pero en la que las gotas tienen un tamaño sustancialmente uniforme de entre 2 y 20 |im; 7) evaporar al menos una porción sustancial del disolvente hidrófobo para ensamblar nanopartículas en suspensión en el disolvente hidrófobo para formar agregados de tamaño micrométrico; 8) opcionalmente reemplazar el primer tensioactivo por un segundo tensioactivo, que es preferiblemente un tensioactivo polimerizable; 9) opcionalmente añadir al menos un monómero polimerizable al medio acuoso; 10) polimerizar el/los monómero(s) para proporcionar una capa de polímero sobre las micropartículas; y 11) opcionalmente funcionalizar la capa de polímero de las micropartículas con una o más capas de polímero, nanopartículas o macromoléculas biológicas. La figura 1 ilustra este método preferido.

La figura 1 ilustra determinados aspectos del procedimiento preferido para producir las partículas. En la etapa A, las nanopartículas se suspenden en hexano 12, en el que se disuelve la benzofenona. Se forma una emulsión de aceite en agua en bruto dispersando la disolución en hexano 12 en disolución de SDS 11. En la etapa B, la emulsión en bruto se fuerza a través de una membrana 13 con un tamaño de poro definido para formar una emulsión refinada 14. En la etapa C, se permite que se evapore el hexano en la emulsión refinada para formar micropartículas 15. En la etapa D, las micropartículas se suspenden en disolución de monómero 17 y se inicia la polimerización exponiendo la disolución a una fuente de luz UV 18. Se forma una cubierta de polímero alrededor de cada partícula 16.

Las nanopartículas

Pueden ensamblarse y recubrirse una variedad de nanopartículas conocidas en la técnica mediante el método según la presente invención, siendo las nanopartículas preferidas superparamagnéticas. Aunque se conocen una variedad métodos para formar tales nanopartículas superparamagnéticas, pueden prepararse nanopartículas magnéticas preferidas para su uso en la presente invención mediante la coprecipitación de sales férricas y ferrosas según el método descrito por Landfester, “Magnetic Polystyrene Nanoparticles with a High Magnetite Content Obtained by Miniemulsion Processes”, Macromolecular Chemistry and Physics, 204, 2003, págs. 22-31 y por la patente estadounidense n.° 5.648.124. Una mezcla de cloruro ferroso y cloruro férrico en agua desoxigenada se combina con hidróxido de amonio acuoso y se calienta con agitación vigorosa. La suspensión espesa de color negro resultante se dializa, se filtra e hidrofobiza con ácido oleico (tal como se describe más detalladamente a continuación).

Tal como se indicó anteriormente, las nanopartículas están compuestas por uno o más materiales magnéticos. Por consiguiente, las nanopartículas incluyen o consisten esencialmente en un material magnético tal como Fe (incluyendo magnetita y maghemita), Ni y Co, o mezclas de estos materiales. En otras realizaciones, pueden usarse aleaciones magnéticas, tales como aleaciones que contienen Mn, y/o antimonio.

En otras realizaciones, al menos algunas de las nanopartículas están compuestas por uno o más materiales metálicos. Por consiguiente, las nanopartículas pueden incluir o consistir esencialmente en alúmina, aluminio, magnesio, cobre, plata u oro.

En otras realizaciones, al menos algunas de las nanopartículas están compuestas por uno o más materiales no metálicos. Por consiguiente, las nanopartículas pueden incluir o consistir esencialmente en un polvo de óxidos tales como sílice.

Las nanopartículas son preferiblemente esféricas y monodispersas. El tamaño de las nanopartículas está en el intervalo de 1 nm a 100 nm, preferiblemente de desde 5 nm hasta 50 nm.

La capa superficial de nanopartículas

Las nanopartículas pueden estar dotadas de una capa superficial alrededor de la partícula para controlar su energía superficial y, por tanto, su solubilidad en las fases o bien hidrófobas o bien hidrófilas. Cuando va a proporcionarse una capa superficial hidrófoba sobre nanopartículas hidrófilas, esto puede realizarse, por ejemplo, poniendo en contacto las partículas con un compuesto generalmente alifático que tiene un grupo de extremo polar. El primer extremo de cada molécula del compuesto puede incluir un grupo carboxilo, un grupo amina, un silano, etc., que se adsorbe en la superficie de la partícula. El segundo extremo de cada molécula del compuesto puede incluir un grupo alcano que se extiende lejos de la partícula y proporciona hidrofobicidad a la partícula recubierta.

Puede usarse una amplia variedad de materiales para proporcionar la capa superficial hidrófoba. Por ejemplo, pueden usarse generalmente ácidos grasos saturados tales como ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico y ácido esteárico, y variantes insaturadas de los mismos, tales como ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. Se ha preferido el ácido oleico como material de recubrimiento hidrófobo en las pruebas realizadas hasta la fecha. Los silanos tales como octadecil-triclorosilano también se han usado ampliamente para funcionalizar superficies de óxido.

La capa superficial hidrófoba generalmente se proporciona simplemente mezclando las nanopartículas en un volumen de material de recubrimiento hidrófobo adecuado para recubrir las partículas. Generalmente se usa un exceso de material de recubrimiento hidrófobo de modo que las nanopartículas formen una suspensión en el material de recubrimiento hidrófobo. Cada nanopartícula tendrá entonces una capa hidrófoba sobre su superficie. En otras realizaciones, puede ser deseable suspender una partícula hidrófoba en la disolución acuosa. Esto puede realizarse poniendo en contacto las partículas con un compuesto generalmente alifático que tiene un grupo de extremo polar. El extremo de alcano hidrófobo en la molécula se adsorberá sobre la superficie de la partícula dejando que el extremo hidrófilo del compuesto se extienda lejos de la partícula proporcionando una capa de recubrimiento hidrófila.

Formación de la emulsión.

En la presente invención, se usa una emulsión para facilitar el ensamblaje de las micropartículas. Se forman emulsiones a partir de dos fases inmiscibles y se estabilizan mediante el uso de emulsionantes. Cuando las nanopartículas se suspenden en una fase hidrófoba, puede prepararse una emulsión de aceite en agua añadiendo una cantidad suficiente de una disolución acuosa que contiene tensioactivo a la fase hidrófoba y agitando vigorosamente la mezcla para producir una fase hidrófoba polidispersa en la fase acuosa continua. Cuando las nanopartículas se suspenden en una fase hidrófila, puede prepararse una emulsión de agua en aceite añadiendo una cantidad suficiente de una disolución hidrófoba que contiene tensioactivo a la fase hidrófila y agitando vigorosamente la mezcla para producir una fase hidrófila polidispersa en la fase hidrófoba continua. .

Puede usarse una variedad de fluidos hidrófobos para la fase hidrófoba incluyendo, pero sin limitarse a, alcano, alqueno, cicloalcano, disolventes orgánicos aromáticos y apolares, por ejemplo, hexano, octano, ciclohexano, tolueno, benceno, xileno, estireno , compuestos de acrilato, etc. El hexano es la fase hidrófoba preferida, ya que tiene una presión de vapor lo suficientemente baja a temperatura ambiente para que la emulsión pueda procesarse, pero el hexano puede eliminarse fácilmente por evaporación.

La fase hidrófoba también puede proporcionar un vehículo para añadir iniciador de polimerización y monómero a las micropartículas ensambladas. Los iniciadores preferidos son los que pueden activarse con luz ultravioleta, tales como derivados de benzofenona, derivados de tioxantona, derivados de fenilpropanona, derivados de acetofenona, derivados de fenilcetona y derivados de óxido de fosfina. El sinergista iniciador de UV tal como derivados de aminobenzoato y el benzoato de benzoílo puede usarse con fotoiniciadores de UV para una reacción UV más eficaz. La benzofenona ha sido el iniciador preferido en las pruebas realizadas hasta la fecha. En las realizaciones preferidas, el iniciador de polimerización es soluble en la fase hidrófoba, y se añade disolviendo el iniciador en la fase hidrófoba. La cantidad de iniciador de polimerización se selecciona según los monómeros usados, la cantidad de monómero que va a polimerizarse y otros parámetros conocidos por los expertos en la técnica.

También pueden ser adecuados otros iniciadores de polimerización, tales como iniciadores que pueden activarse mediante calentamiento suave. Como regla general, los iniciadores activados por calor deben permitir que las temperaturas de polimerización permanezcan a o por debajo de 75°C. Los ejemplos de iniciadores activados por calor adecuados incluyen, pero no se limitan a, VAZO 33 (2,2'-azobis(4-metoxi-2,4-dimetilvaleronitrilo) o VAZO 52 (2,2'-azo-bis(2,4-dimetilpentanonitrilo), ambos comercializados por E.I. DuPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE.

Puede ser deseable añadir monómero polimérico a la fase hidrófoba si estos monómeros son escasamente solubles en la fase acuosa. Los monómeros hidrófobos que son solubles en la fase hidrófoba incluyen estireno, derivados de acrilato (metacrilato de metilo, acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de hidroxietilo, etc.), derivados de monómero de maleimida y anhídrido maleico, derivados de monómero de vinilo, etc.

Opcionalmente, pueden añadirse agentes de reticulación hidrófobos al disolvente hidrófobo tales como derivados de compuestos multivinílicos (por ejemplo, divinilbenceno), derivados de multiacrilato (por ejemplo, metilenbisdiacrilato), multiacrilatos de uretano (por ejemplo, diacrilato de uretano, triacrilato de uretano), derivados de pentaeritritol, multiacrilato de polietileno (por ejemplo, tetraacrilato de polietileno), derivados de epoxi-multiacrilato (por ejemplo, epoxi-dimetacrilato), etc.

En las realizaciones preferidas, la fase acuosa es una disolución acuosa de un tensioactivo tal como dodecilsulfato de sodio (SDS), Triton o Tween, siendo el SDS el más preferido en las pruebas realizadas hasta la fecha. El tensioactivo estabiliza la emulsión, dispersa la fase en la que el tensioactivo no se disuelve y fomenta un tamaño de partícula uniforme y estabiliza eficazmente las micropartículas.

Control del tamaño de emulsión

Las emulsiones iniciales comprenden una fase discontinua con un alto grado de polidispersidad. Un beneficio de controlar el tamaño de las partículas en la emulsión es que puede controlarse el tamaño de partícula terminada y puede hacerse más uniforme el tamaño de partícula.

En un aspecto de la invención, la distribución de tamaño de la fase discontinua en la emulsión se controla por filtración. Esto puede realizarse, por ejemplo, haciendo pasar la emulsión a través de una membrana que tiene un tamaño de poro deseado. Si el tamaño de poro de la membrana es menor que el tamaño de gota promedio en emulsión, parece que se forman gotas uniformes que están determinadas por el tamaño de poro de la membrana, la presión de filtración y la tensión superficial de la interfase tensioactivo-aceite-agua. En una realización preferida, la membrana puede tener un tamaño de poro de 1 |im a 10 |im, más preferiblemente 2 |im a 5 |im.

En otro aspecto de la invención, el tamaño de la fase discontinua en la emulsión se controló usando un esfuerzo de cizallamiento.

La figura 2 ilustra el dispositivo de cizallamiento usado para controlar el tamaño de la emulsión, en el que el hexano 22, que contiene nanopartículas, iniciadores y monómeros hidrófobos opcionales, y la disolución acuosa 23 se alimentan de manera continua al dispositivo de cizallamiento a través del orificio inferior 21. Las dos disoluciones se alimentan directamente al dispositivo de cizallamiento sin formar previamente la emulsión. El dispositivo de cizallamiento consiste en dos cilindros concéntricos 24 y 25 con una separación uniforme entre ellos. El cilindro exterior 25 es inmóvil mientras que el cilindro interior 24 rota con relación al eje central. la separación entre el cilindro interior y el cilindro exterior se prefiere en el intervalo de 0,05-1 mm, más preferiblemente 0,1-0,3 mm. Dos juntas tóricas 26 se colocan en los extremos superior e inferior del cilindro interior. Dos rodamientos 27 se colocan en los extremos superior e inferior del cilindro exterior. Los diámetros de los cilindros interior y exterior permanecen constantes en el alcance entre los dos cojinetes. Se prefiere que las disoluciones se alimenten a través del orificio inferior y la emulsión se recoja a través del orificio superior 28. En tal dispositivo, la disolución experimenta la velocidad de cizallamiento constante y uniforme. La velocidad de cizallamiento se controla mediante un motor eléctrico, que acciona el cilindro interior. La velocidad de rotación se controla mediante un tacómetro.

Es esencial que la disolución acuosa de partida sea viscoelástica. La viscoelasticidad de la disolución acuosa puede obtenerse incorporando uno o más aditivos, tales como derivados de dextrano, derivados de sacarosa, derivados de celulosa, derivados de carboximetilcelulosa, derivados de quitosano. El dextrano ha sido el aditivo preferido en las pruebas realizadas hasta la fecha.

Formación de agregados de nanopartículas

La evaporación del disolvente hidrófobo en la emulsión proporciona una suspensión acuosa de micropartículas generalmente monodispersas en forma de agregados de nanopartículas que tienen una capa superficial hidrófoba. La micropartícula puede tener un diámetro de 0,01 a 5 micrómetros, más preferiblemente de 0,1 a 3,0 micrómetros, y lo más preferiblemente de 0,5 a 2,0 micrómetros de diámetro. Pueden introducirse gases como burbujas de aire en la disolución para acelerar la evaporación. Preferiblemente se usan gases inertes.

Intercambio de tensioactivos

Si se desea, el tensioactivo usado cuando se forma la emulsión puede retirarse de la suspensión y reemplazarse por otro tensioactivo que tenga propiedades más adecuadas para facilitar la polimerización de las partículas finales. En una realización, el primer tensioactivo se retira por lavado con una disolución acuosa que contiene un tensioactivo polimerizable tal como alcohol de polietilato de nonilfenoxipropileno (RN-10).

Adsorción de monómeros sobre las micropartículas

Las micropartículas pueden recubrirse con una capa de polímero mediante la adición de un monómero polimérico a la disolución acuosa. Los monómeros pueden incluir ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido itacónico, ácido vinilacético, ácido 4-pentenoico, ácido undecilénico, y sales de los mismos. Generalmente pueden usarse monómeros básicos tales como acrilamida, metacrilato de aminoetilo, metacrilato de dimetilaminoetilo, metacrilato de t-butilaminoetilo, pirrol, N-vinilcarbazol, vinilpiridina, vinilpirrolidona, y sales de los mismos. El ácido acrílico ha sido el monómero preferido en las pruebas realizadas hasta la fecha.

Puede utilizarse una variedad de comonómeros. Un comonómero particularmente adecuado es RN-10, tal como se mencionó anteriormente. Otros comonómeros adecuados pueden incluir monómeros difuncionales tales como, por ejemplo, ésteres de di- y tri-acrilato de dioles y trioles.

Cuando se usa ácido acrílico, el pH de la disolución de ácido acrílico se ajusta preferiblemente a 3,1 usando hidróxido de sodio. Las pruebas han demostrado que el pH óptimo está en el intervalo de 2,8-3,3.

Cuando se usa un iniciador tal como benzofenona, la iniciación implica exponer la mezcla a una fuente de luz ultravioleta. La elección de la fuente de luz ultravioleta depende del iniciador usado, la cantidad de volumen de reacción y otros parámetros conocidos por los expertos en la técnica. Una vez que se ha logrado la polimerización deseada, las partículas magnéticas recubiertas pueden recogerse con un imán permanente diluyendo la mezcla de reacción viscosa con metanol, aclarando con metanol y agua adicionales y almacenando a temperaturas reducidas. El ejemplo 1 a continuación ilustra aspectos preferidos de la presente invención.

Funcionalización de la capa de polímero.

Tal como se indicó anteriormente, el recubrimiento polimérico de las partículas puede tener uno o más grupos funcionales que pueden unirse con una variedad de materiales bioactivos o que pueden funcionalizarse adicionalmente para permitir esta unión. Por ejemplo, los ácidos carboxílicos unidos a la superficie del recubrimiento pueden hacerse reaccionar con clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC) para facilitar la unión a proteínas y otros materiales bioactivos.

En algunos aspectos de la presente invención, el recubrimiento de las micropartículas puede tener funcionalidad de poli(etilenglicol). Esto puede proporcionarse mediante la incorporación de un comonómero tal como RN-10 que minimiza la absorción inespecífica por el mecanismo de impedimento estérico. El ejemplo 13 a continuación ilustra la capacidad de micropartículas recubiertas preferidas para absorber un material bioactivo objetivo mientras se evita la absorción de un segundo material bioactivo no objetivo.

Preparación de micropartículas a partir de emulsiones de agua en aceite

En la mayoría de las realizaciones descritas anteriormente, las nanopartículas se suspenden en una fase hidrófoba y se dispersan luego gotas de esa fase hidrófoba en una fase acuosa continua. En otras realizaciones de la presente invención, puede ser deseable suspender las nanopartículas hidrófilas en una fase hidrófila y formar gotas de esa fase hidrófila en una fase hidrófoba continua. Debe apreciarse que cuando se usa la técnica de emulsión de agua en aceite, los monómeros, agentes de reticulación e iniciadores que son solubles en la fase acuosa pueden incorporarse directamente en la fase acuosa. En este caso, la fase hidrófoba debe tener una presión de vapor lo suficientemente baja como para que las pérdidas sean insignificantes durante la evaporación de la fase hidrófila. Por consiguiente, en su definición más amplia, la invención proporciona un método de preparación de micropartículas uniformes, que comprende:

(a) proporcionar nanopartículas de partida que tienen o bien una superficie hidrófoba o bien una superficie hidrófila, en el que dichas nanopartículas de partida tienen un diámetro de partícula de entre 1 y 100 nm, en el que las nanopartículas de partida comprenden uno o más materiales magnéticos;

(b) suspender dichas nanopartículas de partida en una primera fase fluida para proporcionar una suspensión de las nanopartículas de partida en dicha primera fase fluida, en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófobo si las nanopartículas iniciales son hidrófobas, y en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófilo si las nanopartículas iniciales son hidrófilas;

(c) mezclar la suspensión formada en la etapa (b) con una segunda fase fluida en la que la primera fase fluida no es miscible, produciendo de ese modo una emulsión de gotas de la suspensión formada en la etapa (b) dispersas en la segunda fase fluida, en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase acuosa si la primera fase fluida comprende nanopartículas de partida hidrófobas en suspensión en un disolvente hidrófobo, y en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase hidrófoba si la primera fase fluida comprende nanopartículas de partida hidrófilas en suspensión en un disolvente hidrófilo;

(d) evaporar suficiente cantidad del disolvente hidrófobo o hidrófilo de la emulsión para autoensamblar nanopartículas para formar micropartículas en suspensión ahora en la segunda fase fluida;

(e) proporcionar un monómero polimerizable a la segunda fase fluida; y

(f) polimerizar el monómero polimerizable para proporcionar una capa de polímero sobre las micropartículas. Además, las micropartículas recubiertas tienen un núcleo magnético que comprende más del 50% de la masa de la partícula, y el tamaño de las micropartículas recubiertas oscila entre 0,01 y 10 |im.

Tal como se indicó anteriormente, el método de la invención general puede emplearse en una realización en la que la primera fase fluida comprende un disolvente hidrófobo y la segunda fase fluida comprende una fase acuosa. Alternativamente, el método de la invención general puede emplearse en una realización en la que la primera fase fluida comprende un disolvente hidrófilo y dicha segunda fase fluida comprende una fase hidrófoba.

Aspectos adicionales de la invención.

Mediante el método de la invención se proporcionan micropartículas con capas de recubrimiento. Dichas partículas varían de tamaño entre 0,01 y 10 |im, aunque en algunas realizaciones las partículas tienen un tamaño de entre 0,1 y 10 |im, mientras que en otras realizaciones las partículas tienen un tamaño de entre 0,5 y 10 |im. En realizaciones adicionales, las partículas varían de tamaño entre 0,01 y 5 |im, mientras que en otras realizaciones las partículas tienen un tamaño de entre 0,01 y 3 |im. En otras realizaciones, las partículas varían de tamaño entre 0,1 y 5 |im, mientras que en otras realizaciones las partículas varían de tamaño entre 0,5 y 3 |im.

Cualquiera que sea el tamaño de partícula que se desee, puede hacerse que los lotes de las partículas tengan un tamaño uniforme, pudiendo obtenerse un coeficiente de variación de menos del 40%, preferiblemente menos del 20%, más preferiblemente menos del 5%, y lo más preferiblemente menos del 2% para lotes de micropartículas preparadas mediante el método dado a conocer.

Tal como se indicó anteriormente, las partículas magnéticas recubiertas novedosas preparadas mediante los métodos descritos en el presente documento tienen un “núcleo” magnético (es decir, las nanopartículas desnudas sin sus recubrimientos hidrófobos o hidrófilos, y sin un recubrimiento polimérico) que comprende una proporción significativa de la masa de la partícula. Las partículas recubiertas tienen un núcleo metálico que comprende más del 50%, preferiblemente más del 70%, más preferiblemente más del 80%, y lo más preferiblemente más del 90% de la masa de la partícula.

En una realización de la invención, las partículas1 tienen tanto un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 70% de la masa de la partícula como un coeficiente de variación (del tamaño de partícula) de menos del 40%. En otra realización, las partículas tienen un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 70% de la masa de la partícula, y un coeficiente de variación de menos del 20%, mientras que en otra realización las partículas tienen tanto un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 70% de la masa de la partícula como un coeficiente de variación de menos del 10%. En otra realización, las partículas tienen un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 70% de la masa de la partícula y un coeficiente de variación (del tamaño de partícula) de menos del 5%.

En otra realización de la invención, las partículas tienen tanto un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 80% de la masa de la partícula como un coeficiente de variación (del tamaño de partícula) de menos del 40%, mientras que en otra realización las partículas tienen un núcleo de nanopartícula desnuda mayor del 80% de la masa de la partícula y un coeficiente de variación de menos del 20%. En todavía otra realización, las partículas tienen tanto un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 80% de la masa de la partícula como un coeficiente de variación de menos del 10%, mientras que en otra realización las partículas tienen tanto un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 80% de la masa de la partícula como un coeficiente de variación de menos del 5%.

En otra realización de la invención, las partículas tienen tanto un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 90% de la masa de la partícula como un coeficiente de variación (del tamaño de partícula) de menos del 40%, mientras que en otra realización las partículas tienen un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 90% de la masa de la partícula y un coeficiente de variación de menos del 20%. En todavía otra realización, las partículas tienen un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 90% de la masa de la partícula y un coeficiente de variación de menos del 10%, mientras que en otra realización las partículas tienen un núcleo de nanopartícula desnuda de más del 90% de la masa de la partícula y un coeficiente de variación de menos del 5%.

Las capas de recubrimiento pueden comprender nanopartículas adicionales, tales como las descritas en el ejemplo 12. También pueden adsorberse capas de polímero adicionales y reticularse sobre la superficie de la partícula para

1 En las realizaciones de la invención en las que se identifica un coeficiente de variación de tamaño, la descripción del coeficiente de variación de las “partículas” significa el coeficiente de variación (tamaño) de un lote o una pluralidad de partículas individuales.

modificar la densidad de la micropartícula o proporcionar un aumento de la estabilidad química o mecánica.

En otro aspecto de la invención, las micropartículas se compondrán de más de un tipo de nanopartículas. Tales micropartículas varían de tamaño entre 0,1 y 10 |im, prefiriéndose micropartículas con un tamaño de entre 0,1 y 5 |im, y prefiriéndose más micropartículas con un tamaño de entre 0,5 y 3 |im. En este caso también, independientemente del tamaño de las micropartículas individuales, los lotes de las micropartículas pueden ser de tamaño uniforme, pudiéndose obtener un coeficiente de variación de menos del 40%, preferiblemente de menos del 20%, más preferiblemente de menos del 5% y lo más preferiblemente de menos del 2% para lotes de micropartículas preparadas mediante el método dado a conocer. Estas partículas pueden formarse añadiendo dos o más tipos de nanopartículas a la fase discontinua en la emulsión, tales como las descritas en el ejemplo 11. La única limitación en los tipos de nanopartículas que pueden usarse es que deben ser de un tamaño y energía superficial similares.

En vista de la discusión anterior, puede observarse que un primer aspecto de la presente divulgación proporciona un método de preparación de micropartículas uniformes, que comprende:

(a) proporcionar nanopartículas de partida que tienen una superficie hidrófoba y un diámetro de partícula de entre 1 y 100 nm;

(b) suspender dichas partículas en un disolvente hidrófobo para proporcionar una suspensión de las partículas; (c) mezclar la suspensión formada en la etapa (b) con una fase acuosa en la que la suspensión no es miscible, proporcionando de ese modo una emulsión de gotas de la suspensión formada en la etapa (b) dispersas en la fase acuosa;

(d) evaporar suficiente cantidad de disolvente hidrófobo de la emulsión para ensamblar micropartículas a partir de las nanopartículas, en el que después de la evaporación las micropartículas quedan en suspensión en la fase acuosa;

(e) proporcionar un monómero polimerizable a la fase acuosa; y

(f) polimerizar el monómero polimerizable para proporcionar una capa de polímero sobre las micropartículas. Un segundo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que las nanopartículas de partida comprenden un material ferromagnético.

Un tercer aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que las nanopartículas de partida comprenden un material paramagnético.

Un cuarto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que las nanopartículas de partida comprenden un material no magnético.

Un quinto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que las nanopartículas de partida comprenden una aleación.

Un sexto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que las nanopartículas de partida comprenden magnetita.

Un séptimo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que las nanopartículas de partida comprenden maghemita.

Un octavo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que las nanopartículas de partida comprenden un material seleccionado del grupo que consiste en Ni, Co, Mn, Sb, alúmina, Cu, Ag, Au y Mg.

Un noveno aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que las nanopartículas de partida comprenden un polímero.

Un décimo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que las nanopartículas de partida comprenden uno o más tipos de nanopartículas.

Un undécimo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que el método incluye además proporcionar un iniciador de polimerización al monómero polimerizable antes de la polimerización. Un duodécimo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que el iniciador de polimerización se proporciona añadiendo iniciador de polimerización al disolvente hidrófobo antes de preparar la emulsión.

Un decimotercer aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que el iniciador de polimerización comprende un iniciador activado por luz ultravioleta.

Un decimocuarto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 13, en el que el iniciador de polimerización comprende benzofenona.

Un decimoquinto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 11, en el que el iniciador de polimerización comprende un iniciador activado por calor.

Un decimosexto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que el método incluye además proporcionar un monómero soluble en disolvente hidrófobo.

Un decimoséptimo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 16, en el que el monómero soluble en disolvente hidrófobo se proporciona añadiendo el monómero al disolvente hidrófobo antes de preparar la emulsión.

Un decimoctavo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 16, en el que el monómero comprende estireno.

Un decimonoveno aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que el método incluye además la etapa de dimensionar la emulsión formada en la etapa (c) para proporcionar una emulsión en la que al menos el 95% de las gotas de disolvente hidrófobo dispersas se dimensionan entre 2 y 10 |im.

Un vigésimo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 19, en el que la etapa de dimensionamiento comprende hacer pasar la emulsión a través de una membrana.

Un vigesimoprimer aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 20, en el que la membrana comprende poros que tienen un tamaño de 2 a 5 |im.

Un vigesimosegundo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que el disolvente hidrófobo y la fase acuosa forman una emulsión al exponerse a un esfuerzo de cizallamiento.

Un vigesimotercer aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 22, en el que el medio acuoso es viscoelástico.

Un vigesimocuarto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 23, en el que el medio acuoso contiene el 20-30% de dextrano.

Un vigesimoquinto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 22, en el que el medio acuoso contiene carboximetilcelulosa.

Un vigesimosexto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 22, en el que dicho disolvente hidrófobo y la fase acuosa se alimentan al dispositivo de cizallamiento en dos corrientes independientes. Un vigesimoséptimo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 22, en el que dicho esfuerzo de cizallamiento es de 800 a 3500 s-1.

Un vigesimoctavo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 22, en el que dicho esfuerzo de cizallamiento se logra usando dos cilindros concéntricos que rotan uno con respecto al otro.

Un vigesimonoveno aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 22, en el que dicho disolvente hidrófobo y dicha fase acuosa se alimentan al dispositivo de cizallamiento a través del orificio inferior.

Un trigésimo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que el medio líquido de la etapa (b) es una fase acuosa que comprende un primer tensioactivo.

Un trigésimo primer aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 30, en el que dicho primer tensioactivo comprende SDS.

Un trigésimo segundo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 30, en el que dicho método incluye la etapa de lavar las partículas autoensambladas de la etapa (d) para reemplazar el primer tensioactivo por un segundo tensioactivo.

Un trigésimo tercer aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que dicha mezcla de monómeros se mezcla con una disolución de hidróxido de sodio para ajustar el pH a 2,8-3,3.

Un trigésimo cuarto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 1, en el que dicho método incluye además la etapa de funcionalizar la capa de polímero de las micropartículas.

Un trigésimo quinto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 34, en el que dicha funcionalización comprende proporcionar receptores biológicos a la capa de polímero.

Un trigésimo sexto aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 35, en el que dichos receptores biológicos se unen a la capa de polímero a través de un enlace covalente a los ácidos carboxílicos haciendo reaccionar con clorhidrato de con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC).

Un trigésimo séptimo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 34, en el que dicha funcionalización comprende proporcionar nanopartículas a la capa de polímero.

Un trigésimo octavo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 37, en el que dichas nanopartículas son nanopartículas de oro.

Un trigésimo noveno aspecto de la presente divulgación proporciona un método de preparación de micropartículas uniformes, que comprende:

(a) proporcionar nanopartículas de partida que tienen o bien una superficie hidrófoba o bien una superficie hidrófila, en el que dichas nanopartículas tienen un diámetro de partícula de entre 1 y 100 nm;

(b) suspender dichas partículas en una primera fase fluida para proporcionar una suspensión de las partículas en dicha primera fase fluida, en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófobo si las partículas son hidrófobas, y en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófilo si las partículas son hidrófilas;

(c) mezclar la suspensión formada en la etapa (b) con una segunda fase fluida en la que la primera fase fluida no es miscible, proporcionando de ese modo una emulsión de gotas de la suspensión formada en la etapa (b) dispersas en la segunda fase fluida, en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase acuosa si la primera fase fluida comprende partículas hidrófobas en suspensión en un disolvente hidrófobo, y en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase hidrófoba si la primera fase fluida comprende partículas hidrófilas en suspensión en un disolvente hidrófilo;

(d) evaporar suficiente cantidad de disolvente hidrófobo o hidrófilo de la emulsión para autoensamblar nanopartículas para formar micropartículas en suspensión ahora en la segunda fase fluida;

(e) proporcionar un monómero polimerizable a la segunda fase fluida; y

(f) polimerizar el monómero polimerizable para proporcionar una capa de polímero sobre las micropartículas. Un cuadragésimo aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 39, en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófobo y en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase acuosa.

Un cuadragésimo primer aspecto de la presente divulgación proporciona un método como en el aspecto 39, en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófilo y en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase orgánica.

Un cuadragésimo segundo aspecto de la presente divulgación proporciona una partícula preparada mediante el procedimiento del aspecto 1.

Aspectos adicionales de la presente descripción proporcionan partículas preparadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42.

Un cuadragésimo cuarto aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas preparadas mediante el procedimiento del aspecto 1, en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10|im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 70% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 40%.

Un cuadragésimo quinto aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas, en las que cada partícula en dicha pluralidad tiene un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10|im, y en las que cada partícula en dicha pluralidad comprende un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, en las que dicho núcleo paramagnético comprende al menos el 70% del peso de la partícula, y en las que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 40%.

Un cuadragésimo sexto aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas formadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 70% del peso de la partícula, y en las que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 40%.

Un cuadragésimo séptimo aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas preparadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 70% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 20%.

Un cuadragésimo octavo aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas preparadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 70% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 10%.

Un cuadragésimo noveno aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas formadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 70% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 5%.

Un quincuagésimo aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas preparadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42, en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 70% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 2%.

Un quincuagésimo primer aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas preparadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 80% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 40%.

Un quincuagésimo segundo aspecto de la presente descripción proporciona una pluralidad de partículas preparadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 80% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 20%.

Un quincuagésimo tercer aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas formadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 80% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 10%.

Un quincuagésimo cuarto aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas preparadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 80% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 5%.

Un quincuagésimo quinto aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas preparadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 80% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 2%.

Un quincuagésimo sexto aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas preparadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 90% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 40%.

Un quincuagésimo séptimo aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas formadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 90% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 20%.

Un quincuagésimo octavo aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas preparadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 90% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 10%.

Un quincuagésimo noveno aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas formadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 90% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 5%.

Un sexagésimo aspecto de la presente divulgación proporciona una pluralidad de partículas formadas mediante cualquiera de los procedimientos de los aspectos 1 a 42,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 90% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 2%.

La presente divulgación se resume en los siguientes puntos:

1. Un método de preparación de micropartículas uniformes, que comprende:

(e) proporcionar un monómero polimerizable a la fase acuosa; y

(f) polimerizar el monómero polimerizable para proporcionar una capa de polímero sobre las micropartículas.

2. El método del punto 1, en el que dichas nanopartículas de partida comprenden un material paramagnético.

3. El método del punto 1, en el que dichas nanopartículas de partida comprenden magnetita o maghemita.

4. El método del punto 1, en el que dichas nanopartículas de partida comprenden un material seleccionado del grupo que consiste en Ni, Co, Mn, Sb, alúmina, Cu, Ag, Au, Mg y polímeros.

5. El método del punto 1, en el que dicho método incluye además proporcionar un iniciador de polimerización al monómero polimerizable antes de la polimerización.

6. El método del punto 5, en el que dicho iniciador de polimerización se proporciona añadiendo iniciador de polimerización al disolvente hidrófobo antes de preparar la emulsión.

7. El método del punto 5, en el que dicho iniciador de polimerización comprende un iniciador activado por luz ultravioleta.

8. El método del punto 7, en el que dicho iniciador de polimerización comprende benzofenona.

9. El método del punto 1, en el que dicho método incluye además proporcionar un monómero soluble en disolvente hidrófobo.

10. El método del punto 9, en el que el monómero soluble en disolvente hidrófobo se proporciona añadiendo el monómero al disolvente hidrófobo antes de preparar la emulsión.

11. El método del punto 10, en el que dicho monómero comprende estireno.

12. El método del punto 1, en el que dicho método incluye además la etapa de dimensionar la emulsión formada en la etapa (c) para proporcionar una emulsión en la que al menos el 95% de las gotas de disolvente hidrófobo dispersas se dimensionan entre 2 y 10 |im.

13. El método del punto 12, en el que dicha etapa de dimensionamiento comprende hacer pasar la emulsión a través de una membrana.

14. El método del punto 13, en el que dicha membrana comprende poros que tienen un tamaño de 2 a 5 |im.

15. El método del punto 1, en el que dicho disolvente hidrófobo y la fase acuosa forman una emulsión por exposición a esfuerzo de cizallamiento.

16. El método del punto 15, en el que el medio acuoso es viscoelástico.

17. El método del punto 16, en el que el medio acuoso contiene el 20-30% de dextrano.

18. El método del punto 15, en el que el medio acuoso contiene carboximetilcelulosa.

19. El método del punto 15, en el que dicho esfuerzo de cizallamiento es de 800 a 3500 s-1.

20. El método del punto 1, en el que el medio líquido de la etapa (b) es una fase acuosa que comprende un primer tensioactivo.

21. El método del punto 20, en el que dicho primer tensioactivo comprende SDS.

22. El método del punto 1, en el que dicho método incluye la etapa de lavar las partículas ensambladas de la etapa (d) para reemplazar el primer tensioactivo por un segundo tensioactivo.

23. El método del punto 1, en el que dicha mezcla de monómeros se mezcla con una disolución de hidróxido de sodio para ajustar el pH a 2,8-3,3.

24. El método del punto 1, en el que dicho método incluye además la etapa de funcionalizar la capa de polímero de las micropartículas.

25. El método del punto 24, en el que dicha funcionalización comprende proporcionar receptores biológicos a la capa de polímero.

26. El método del punto 25, en el que dichos receptores biológicos se unen a la capa de polímero a través de un enlace covalente a los ácidos carboxílicos haciendo reaccionar con clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC).

27. El método del punto 24, en el que dicha funcionalización comprende proporcionar nanopartículas a la capa de polímero.

28. El método del punto 27, en el que dichas nanopartículas son nanopartículas de oro.

29. Un método de preparación de micropartículas uniformes, que comprende:

(b) suspender dichas partículas en una primera fase fluida para proporcionar una suspensión de las partículas en dicha primera fase fluida, en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófobo si las partículas son hidrófobas, y en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófilo si las partículas son hidrófilas; (c) mezclar la suspensión formada en la etapa (b) con una segunda fase fluida en la que la primera fase fluida no es miscible, proporcionando de ese modo una emulsión de gotas de la suspensión formada en la etapa (b) dispersas en la segunda fase fluida, en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase acuosa si la primera fase fluida comprende partículas hidrófobas en suspensión en un disolvente hidrófobo, y en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase orgánica si la primera fase fluida comprende partículas hidrófilas en suspensión en un disolvente hidrófilo;

(e) proporcionar un monómero polimerizable a la segunda fase fluida; y

30. El método del punto 29, en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófobo y en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase acuosa.

31. El método del punto 29, en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófilo y en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase orgánica.

32. Una partícula preparada mediante el procedimiento del punto 1.

33. Una pluralidad de partículas preparadas mediante el procedimiento del punto 1,

en las que dicha pluralidad de partículas comprenden partículas que tienen un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, comprendiendo dichas partículas un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, comprendiendo dicho núcleo paramagnético al menos el 70% del peso de la partícula, y en el que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 40%.

34. Una composición particulada que comprende una pluralidad de partículas, en la que cada partícula en dicha pluralidad tiene un tamaño de partícula de entre 0,01 |im y 10 |im, y en la que cada partícula en dicha pluralidad comprende un núcleo paramagnético y una cubierta polimérica, en la que dicho núcleo paramagnético comprende al menos el 70% del peso de la partícula, y en la que la pluralidad de partículas tienen un coeficiente de variación de tamaño de menos del 40%.

Ejemplos

Ahora se hará referencia a ejemplos específicos que usan los procedimientos descritos anteriormente. Debe entenderse que los ejemplos se proporcionan para describir más completamente realizaciones preferidas, y que no se pretende de ese modo ninguna limitación al alcance de la invención.

EJEMPLO 1

Formación de micropartículas recubiertas con polímero

El procedimiento general para producir micropartículas se ilustra en la figura 1.

(a) Formación de nanopartículas de óxido de hierro

Se prepararon las nanopartículas de óxido de hierro mediante la coprecipitación de cloruro férrico y cloruro ferroso en agua desoxigenada en condiciones alcalinas. Se añadió rápidamente hidróxido de amonio a la disolución con agitación vigorosa y se calentó la mezcla de reacción resultante hasta aproximadamente 70°C, y se mantuvo a esa temperatura con agitación continua durante aproximadamente 30 minutos para dar una suspensión espesa de color negro de nanopartículas magnéticas. Se lavó la suspensión espesa en primer lugar con agua y luego con ácido perclórico al 18% (v/v). Se dializaron las nanopartículas resultantes usando un tubo flexible de 12.000-14.000 Da (disponible de Spectrum, Rancho Dominguez, California) para retirar cualquier cantidad de ácido restante. Se filtraron kas nanopartículas magnéticas con una membrana de policarbonato Nuclepore de 1 |im (disponible de Whatman, Florham Park, NJ).

(b) Hacer que la superficie de la partícula sea hidrófoba

Se hidrofobizaron las nanopartículas magnéticas poniendo en suspensión las partículas en una disolución de ácido oleico al 16% durante 20 minutos con agitación. Se retiró el ácido oleico en exceso con un aclarado con etanol y se resuspendieron las partículas en hexano para dar una concentración aproximada del 5% p/v de nanopartículas magnéticas.

(c) Ubicación del iniciador UV sobre la superficie de la partícula, refinación de la emulsión formada inicialmente y preparación para formar un recubrimiento polimérico exterior

Se añadió cantidad suficiente de benzofenona a la suspensión espesa en hexano para dar una concentración de 100 |iM de benzofenona en la suspensión espesa. Se añadieron cuatro partes de una disolución acuosa de dodecilsulfato de sodio (SDS) (al 1%) a una parte de la suspensión espesa en hexano y se agitó la mezcla en vórtex para dar una emulsión de aceite en agua en bruto. Se forzó la emulsión en bruto a través de una membrana Isopore de 2 ó 5 |im (disponible de Millipore, Billerica, MA) en una extrusora (disponible de Northern Lipids, Vancouver, Canadá) a una presión de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10 psi para refinar el tamaño de la emulsión en bruto. Se diluyó adicionalmente la emulsión resultante con una disolución acuosa de SDS 40 mM (razón 1:27) y se permitió que se evaporase el hexano a temperatura ambiente. El resultado fueron partículas magnéticas de tamaño micrométrico en suspensión en disolución de SDS.

(d) Reemplazo de SDS sobre la superficie de la partícula por tensioactivo polimerizable (RN-10)

Se reemplazó el SDS sobre la superficie de la micropartícula por alcohol de polietilato de nonilfenoxipropenilo (Noigen®, RN-10, comercializado por Dai-Ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd. de Japón) enjuagando la partícula tres veces con una disolución de RN-10 al 1% en agua.

(e) Formación de recubrimiento polimérico exterior en las micropartículas

Se combinó una porción de las micropartículas resultantes con las mezclas de monómeros individuales mostradas en la tabla I, se agitó y se expuso a una luz UV de 20 mW/cm2 durante aproximadamente 10 minutos para dar una mezcla viscosa. Se diluyó la mezcla con metanol y se recogieron las micropartículas recubiertas con un imán permanente, se aclararon con agua y se almacenaron a aproximadamente 4°C.

Tabla I

* CCC es la concentración crítica de coagulación

Las micropartículas recubiertas descritas anteriormente tenían generalmente un diámetro de partícula promedio de menos de aproximadamente 2 |im. Los estudios de análisis de gravedad térmica (TGA, por sus siglas en inglés) demostraron una pérdida de masa de aproximadamente el 8% para la muestra 1, lo que sugiere que los materiales orgánicos representaban aproximadamente el 8% de la masa de la partícula y el núcleo magnético representaba aproximadamente el 92% de la masa de la partícula (figura 3). La muestra 4 tuvo la mayor pérdida de masa, lo que representa el 27% del peso de partícula total. El peso restante para la muestra 4 era de aproximadamente el 73%. La densidad de las micropartículas magnéticas recubiertas producidas era de aproximadamente 2,6 g/cm3, lo que es considerablemente mayor que lo normal de 1 a 1,5 g/cm3 para partículas magnéticas convencionales que comprenden nanopartículas magnéticas dentro de una partícula polimérica. Esto es indicativo del contenido de material magnético mayor de lo normal de las micropartículas recubiertas. Se examinó la estabilidad coloidal de las nanopartículas metálicas recubiertas a diversas concentraciones de cloruro de sodio. Se determinaron las concentraciones críticas de coagulación (CCC) y se proporcionan en la tabla I. Se realizaron mediciones de imantación con la muestra 1, que indican una imantación de saturación de aproximadamente 45,9 uem/g.

Se analizaron las partículas recubiertas usando espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS, por sus siglas en inglés) para determinar la razón molar de ácido acrílico (AA) con respecto a RN-10. El espectro de XPS de la muestra 4 se muestra en la figura 4. Las razones de monómeros en la capa superficial de las partículas se proporcionan en la última columna de la tabla I.

Se formaron partículas recubiertas de manera similar según este procedimiento general con acrilamida con y sin el reemplazo de SDS por RN-10 antes de la polimerización para dar micropartículas recubiertas de manera similar. Pueden utilizarse otros monómeros solubles en agua de manera similar con y en lugar del ácido acrílico y pueden añadirse agentes de reticulación solubles en agua tales como ésteres de di y tri-acrilato de dioles, trioles u otros polioles de manera similar a la mezcla de monómeros.

Aunque el núcleo magnético de tamaño micrométrico utilizado en este ejemplo era una aglomeración de nanopartículas magnéticas más pequeñas, pueden recubrirse nanopartículas similares derivadas de otro material con el procedimiento descrito anteriormente. Finalmente, puede reemplazarse el iniciador UV, la benzofenona, por un iniciador de polimerización sensible al calor generalmente insoluble en agua y puede llevarse a cabo la polimerización calentando la mezcla hasta una temperatura de no más de aproximadamente 75°C.

EJEMPLO 2

Formación de nanopartículas de magnetita hidrófobas usando química de síntesis en una sola etapa

Se cargó un matraz de tres bocas de 250 ml con 12,0 g de FeCh-4H2O y 24,3 g de FeCl3'6H2O en 50 ml de agua desoxigenada bajo atmósfera de N2. Se añadieron rápidamente 40 ml de hidróxido de amonio. Se calentó la disolución hasta 70°C durante 30 min. Se añadieron cinco mililitros de ácido oleico a la disolución y se calentó durante otros 30 minutos. Se lavó tres veces la suspensión espesa de color negro con agua, ácido perclórico al 20% y etanol. Se suspensión la suspensión espesa en hexano al 5% (p/v) y se almacenó a 4°C. La medición de imantación mostró que la partícula tenía la imantación de saturación de 56 uem/g.

EJEMPLO 3

Manipulación de la concentración de benzofenona

Se repitió el método del ejemplo 1 con tres concentraciones de benzofenona diferentes, 1 |iM, 10 |iM y 100 |iM. Las partículas recubiertas preparadas con un nivel 1 |iM de benzofenona eran similares a un gel. Las partículas recubiertas preparadas con un nivel 10 |iM de benzofenona eran menos similares a un gel, pero mostraron una fuerte tendencia a adherirse a una superficie de vidrio. Las partículas recubiertas preparadas con un nivel 100 |iM de benzofenona eran diferenciadas y se recogieron fácilmente diluyendo con metanol y parecían ser estables.

EJEMPLO 4

Se repitió el método del ejemplo 1 con las partículas preparadas en el ejemplo 2. La medición de imantación mostró que la partícula tenía una imantación de saturación de hasta 50,6 uem/g tal como se indica en la figura 5.

EJEMPLO 5

Refinamiento del tamaño de la emulsión por esfuerzo de cizallamiento

Se ajustaron las nanopartículas preparadas en el ejemplo 2 al contenido de sólidos del 0,78% mediante la adición de hexano. Se añadió benzofenona hasta la concentración de 100|iM. La disolución acuosa contenía SDS al 1% y dextrano al 30% (PM de 100-200K). se alimentaron la disolución de hexano y la disolución acuosa al dispositivo de cizallamiento al mismo caudal usando dos jeringas independientes. La disolución estaba sujeta a una velocidad de cizallamiento de 840 s-1. Se recogió la emulsión monodispersa en una disolución de SDS al 0,1% (Figura 6). Se permitió que se evaporase el hexano. Se resuspendieron las partículas en RN-10 al 10% y disolución de ácido acrílico al 10%. Se llevó a cabo la polimerización exponiendo las partículas a una luz UV de 20 mW/cm2 durante aproximadamente 10 minutos. Se centrifugaron las micropartículas a 100 g 10 veces. Cada vez, se desechó la disolución superior y se resuspendieron las partículas en agua. La partícula final mostró un diámetro de alrededor de 1 |im y un coeficiente de variación de menos del 10% tal como se indica en las figuras 7 y 8. El potencial zeta de la partícula era de -1,9 mV.

EJEMPLO 6

Refinamiento alternativo del tamaño de la emulsión por esfuerzo de cizallamiento

El procedimiento operativo en este ejemplo es idéntico al del ejemplo 5, excepto en que se usó dextrano al 20% y se ajustó el esfuerzo de cizallamiento a 3450 s-1.

EJEMPLO 7

Segundo refinamiento alternativo del tamaño de la emulsión por esfuerzo de cizallamiento

El procedimiento operativo en este ejemplo es idéntico al del ejemplo 5, excepto en que se usó carboximetilcelulosa al 3,3% (Cellogen®, HP-8A, comercializado por Dai-Ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd. de Japón).

EJEMPLO 8

Adición de monómeros hidrófobos y agentes de reticulación a la fase hidrófoba

El procedimiento operativo en este ejemplo es idéntico al del ejemplo 5, excepto en que además de la benzofenona, se añadió estireno a hexano a 1,9 M y se añadió divinilbenceno a hexano a 0,46 M antes de la formación de la emulsión. La partícula final mostró una mayor estabilidad cuando se expuso a disoluciones ácidas.

EJEMPLO 9

Ajuste del pH del monómero

Se repitió el método del ejemplo 5 ajustándose el pH de la mezcla de monómeros mediante disolución de hidróxido de sodio a 3,1. Las micropartículas resultantes se separaron bien en disolución acuosa y el potencial zeta de la partícula era de -2,88 mV. Pruebas posteriores mostraron que el pH óptimo es de 2,8-3,3.

EJEMPLO 10

Formación de micropartículas recubiertas con acrilamida

El procedimiento operativo en este ejemplo es idéntico al del ejemplo 5, excepto en que se usó acrilamida al 7% para reemplazar el ácido acrílico.

EJEMPLO 11

Ensamblaje de micropartículas de nanopartículas de óxido de hierro y oro

Se concentró la nanopartícula de Au de 10 nm disponible comercialmente (disponible de BBlnternational, Golden Gate, Ty Glas Ave., Cardiff CF145DX, R.U.) 10 veces usando centrifugación. Se cargó un vial de vidrio con 0,5 ml de disolución 1 mM de dodecanotiol-etanol, 1 ml de nanopartículas de Au concentradas en agua y 1 ml de disolución 10 mM de dodecanotiol-hexano. Se hizo rotar la mezcla durante 24 h. Las nanopartículas de Au modificadas se volvieron moradas y se trasladaron a la fase de hexano. Se recogió la fase de hexano y se almacenó en la nevera hasta su uso. La partícula de magnetita preparada en el ejemplo 2 se diluyó 10 veces en hexano y se mezcló con las nanopartículas de Au modificadas a una razón 1:1. Se añadió 1 ml de la mezcla de partículas a 5 ml de disolución de SDS al 1% y se transformó en una emulsión haciéndola pasar a través de una membrana de 200 nm. Se permitió que se evaporase el hexano durante la noche. Se observaron las partículas al microscopio electrónico de transmisión. La figura 9 mostró que las nanopartículas de Au y magnetita se mezclaron entre sí y ensamblaron para dar partículas de tamaño micrométrico.

EJEMPLO 12

Decoración exterior de micropartículas de óxido de hierro con nanopartículas de Au

Se cargó un vial de vidrio con 0,1 ml de nanopartículas de magnetita preparadas en el ejemplo 2, 0,9 ml de hexano y 0,5 ml de benzofenona 1 mM. Se mezcló bien la disolución antes de añadir 5 ml de disolución de SDS al 1%. Se agitó manualmente la mezcla para preparar emulsiones en bruto. Se hizo pasar la emulsión en bruto a través de una membrana de 200 nm (Whatman, Florham Park, NJ) usando una jeringa. Se permitió que se evaporase el hexano durante 12 h a temperatura ambiente. Se aclararon las partículas resultantes con disolución de RN-10 al 1% tres veces. Se mezclaron las partículas con 5 ml de RN-10 al 1% y 2 ml de acrilamida 5 M. se expuso la mezcla a luz Uv de 20 mW/cm2 durante unos 10 minutos. Las partículas se separaron usando un imán, se aclararon con agua y se resuspendieron en agua. Las nanopartículas de Au de 20 nm (BBInternational, Golden Gate, Ty Glas Ave., Cardiff CF14 5DX, R.U.) se concentraron 3 veces usando centrifugación. Se mezcló aproximadamente 1 ml de las nanopartículas de Au con 0,1 ml de partículas magnéticas modificadas con amina. Se hizo rotar la mezcla durante la noche. Las partículas magnéticas se recogieron con imán, se aclararon con agua y se resuspendieron en 1 ml de agua. Se examinaron las partículas magnéticas modificadas con Au usando un espectrofotómetro UV-Vis y TEM. El TEM mostró que las partículas magnéticas estaban decoradas con nanopartículas de Au en el exterior (figura 10). La medición de espectrofotometría UV-Vis mostró el pico de adsorción característico de las nanopartículas de Au unidas (figura 11).

EJEMPLO 13

Modificación con anticuerpo de ratón anti-M13

Se modificaron las micropartículas preparadas en el ejemplo 1 con IgG de ratón anti-M13 (disponible de Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) usando química de acoplamiento de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC). Se sonicaron una mezcla que contenía 200 |il de partículas, 600 |il de agua, 50 |il de ácido 2-(morfolino)etanosulfónico (MES, disponible de Sigma) 500 mM que tenía un pH de 6,1 y 100 |il del anticuerpo a baja potencia en un baño de hielo. Después de aproximadamente 15 minutos, se añadieron 290 |il de EDAC (disponible de Sigma) a la mezcla y se continuó la sonicación durante 15 minutos adicionales. Se incubó la mezcla resultante en una rueda de rotación durante aproximadamente 1 hora, después de lo cual se lavaron las partículas tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 12 mM. Después del lavado, se añadió conjugado de IgG anti-ratónperoxidasa de rábano picante (HRP) (disponible de KPL, Gaithersburg, MD) a 0,01 mg/ml y se añadió IgG anticonejo-HRP a los grupos de control. Después de incubar las mezclas durante 1 hora, se lavaron las partículas tres veces con disolución de PBS. Se detectó la presencia de HRP añadiendo 1 mg/ml de sal de diamonio de 2,2'-azinobis[ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico] (ABTS) y determinando la absorbancia del producto final verde a aproximadamente 410 nm. Las concentraciones relativas de HRP eran proporcionales a la absorbancia determinada. La figura 12 ilustra la fuerte absorbancia específica de la IgG anti-ratón-HRP y la absorbancia inespecífica mucho más débil de la IgG anti-conejo-HRP por las micropartículas recubiertas.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Método de preparación de micropartículas uniformes, comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar nanopartículas de partida que tienen o bien una superficie hidrófoba o bien una superficie hidrófila, en el que dichas nanopartículas de partida tienen un diámetro de partícula de entre 1 y 100 nm, en el que las nanopartículas de partida comprenden uno o más materiales magnéticos;

(b) suspender dichas nanopartículas de partida en una primera fase fluida para proporcionar una suspensión de las nanopartículas de partida en dicha primera fase fluida, en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófobo si las nanopartículas iniciales son hidrófobas, y en el que dicha primera fase fluida comprende un disolvente hidrófilo si las nanopartículas iniciales son hidrófilas;

(c) mezclar la suspensión formada en la etapa (b) con una segunda fase fluida en la que la primera fase fluida no es miscible, produciendo de ese modo una emulsión de gotas de la suspensión formada en la etapa (b) dispersas en la segunda fase fluida, en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase acuosa si la primera fase fluida comprende nanopartículas de partida hidrófobas en suspensión en un disolvente hidrófobo, y en el que dicha segunda fase fluida comprende una fase hidrófoba si la primera fase fluida comprende nanopartículas de partida hidrófilas en suspensión en un disolvente hidrófilo;

(d) evaporar suficiente cantidad de disolvente hidrófobo o hidrófilo de la emulsión para autoensamblar nanopartículas para formar micropartículas en suspensión ahora en la segunda fase fluida; (e) proporcionar un monómero polimerizable a la segunda fase fluida; y

(f) polimerizar el monómero polimerizable para proporcionar una capa de polímero sobre las micropartículas;

en el que las micropartículas recubiertas tienen un núcleo magnético que comprende más del 50% de la masa de la partícula, en el que el núcleo magnético es la nanopartícula desnuda sin sus recubrimientos hidrófobos o hidrófilos y sin un recubrimiento polimérico; y

en el que el tamaño de las micropartículas recubiertas oscila entre 0,01 y 10 |im.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el método comprende las etapas de:

(a) proporcionar nanopartículas de partida que tienen una superficie hidrófoba y un diámetro de partícula de entre 1 y 100 nm;

(b) suspender dichas nanopartículas de partida en un disolvente hidrófobo para proporcionar una suspensión de las nanopartículas de partida;

(c) mezclar la suspensión formada en la etapa (b) con una fase acuosa en la que la suspensión no es miscible, produciendo de ese modo una emulsión de gotas de la suspensión formada en la etapa (b) dispersas en la fase acuosa;

(d) evaporar suficiente cantidad de disolvente hidrófobo de la emulsión para ensamblar micropartículas a partir de las nanopartículas, en el que después de la evaporación las micropartículas se suspenden en la fase acuosa;

(e) proporcionar un monómero polimerizable a la fase acuosa; y

(f) polimerizar el monómero polimerizable para proporcionar una capa de polímero sobre las micropartículas.
3. Método según la reivindicación 2, en el que dichas nanopartículas de partida comprenden un material paramagnético.
4. Método según la reivindicación 2, en el que dichas nanopartículas de partida comprenden magnetita o maghemita.
5. Método según la reivindicación 2, en el que dicho método incluye además proporcionar un iniciador de polimerización al monómero polimerizable antes de la polimerización mediante la adición de iniciador de polimerización al disolvente hidrófobo antes de preparar la emulsión en la etapa (c).
6. Método según la reivindicación 2, en el que dicho método incluye además proporcionar un monómero soluble en disolvente hidrófobo añadiendo el monómero al disolvente hidrófobo antes de preparar la emulsión en la etapa (c).
7. Método según la reivindicación 2, en el que dicho método incluye además la etapa de dimensionar la emulsión producida en la etapa (c) para proporcionar una emulsión en la que al menos el 95% de las gotas de disolvente hidrófobas dispersas se dimensionan entre 2 y 10 |im.
8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha etapa de dimensionamiento comprende hacer pasar la emulsión a través de una membrana.
9. Método según la reivindicación 2, en el que dicho disolvente hidrófobo y la fase acuosa forman una emulsión al exponerse a un esfuerzo de cizallamiento.
10. Método según la reivindicación 9, en el que el medio acuoso es viscoelástico.
11. Método según la reivindicación 2, en el que dicho método incluye además la etapa de funcionalizar la capa de polímero de las micropartículas.
12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha funcionalización comprende proporcionar receptores biológicos a la capa de polímero.
13. Método según la reivindicación 11, en el que dicha funcionalización comprende proporcionar nanopartículas a la capa de polímero.