ES2602792T3

ES2602792T3 - Polipéptidos con actividad de xilanasa

Info

Publication number: ES2602792T3
Application number: ES09834136.5T
Authority: ES
Inventors: Ole Sibbesen; Jens Frisbæk SØRENSEN
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2029-12-23
Also published as: US8765438B2; JP2015163070A; MX2011006640A; CA2747224C; US20120028306A1; UA103215C2; AU2009329608B2; CN102300985A; DK2382310T3; EP2382310A4; JP2012513207A; KR20110117663A; EP2382310B1; US20150024466A1; AU2009329608A1; WO2010072225A1; EA201170879A1; EP2382310A1; MX347545B; US9297002B2

Abstract

Un polipéptido con actividad de xilanasa y que comprende una secuencia de aminoácidos, teniendo dicha secuencia de aminoácidos al menos 75% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID No. 1, y cuyo polipéptido tiene: i) una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición seleccionada entre: 12 y 13; y ii) una o más de otras modificaciones de aminoácidos en una posición seleccionada entre: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175, y 179, en donde dichas posiciones se determinan como la posición correspondiente a la posición de la secuencia de xilanasa de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1 por alineación; en donde dichas modificaciones de aminoácidos en la posición 12 y 13 es una sustitución de de aminoácido a tirosina.

Description

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especificidad de sustrato y ocasionalmente en su mecanismo molecular; dicha clasificación no refleja las características estructurales de estas enzimas.

En un aspecto de la invención, la xilanasa es una enzima clasificada como EC 3.2.1.8. El nombre oficial es endo-1,4beta-xilanasa. El nombre sistemático es 1,4-beta-D-xilan xilanohidrolasa. Otros nombres pueden ser usados, tales como endo-(1-4)-beta-xilanasa; (1-4)-beta-xilan 4-xilanohidrolasa; endo-1,4-xilanasa; xilanasa; beta-1,4-xilanasa; endo-1,4-xilanasa; endo-beta-1,4-xilanasa; endo-1,4-beta-D-xilanasa; 1,4-beta-xilan xilanohidrolasa; beta-xilanasa; beta-1,4-xilan xilanohidrolasa; endo-1,4-beta-xilanasa; beta-D-xilanasa. La reacción catalizada es la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-xilosídicos en xilanos.

Otra clasificación de ciertas enzimas glucósido hidrolasa, tales como endoglucanasa, xilanasa, galactanasa, mananasa, dextranasa y alfa-galactosidasa, en familias basadas en las similitudes de la secuencia de aminoácidos ha sido propuesta hace algunos años. Normalmente caen en 90 familias diferentes: Véase la página web CAZy(ModO) (Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Servidor Carbohydrate-Active Enzymes en: http://afmb.cnrsmrs.fr/~cazy/CAZY/index.html (publicaciones correspondientes: Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrateactive enzymes: an integrated database approach. En "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", HJ. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat y B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12; Coutinho,

P.M.: & Henrissat, B. (1999) La estructura modular de celulasas y otras enzimas carbohidrato-activas: un enfoque de base de datos integrado. En "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation", K. Ohmiya, K. Hayashi,

K.: Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita y T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23).

En un aspecto de la invención, la xilanasa de la invención es una xilanasa de la Familia 11 de Glucósido Hidroliasa (GH). La expresión "de la Familia 11 de Glucósido Hidroliasa (GH)" significa que la xilanasa en cuestión es o puede clasificarse en la Familia 11 de GH.

Debe entenderse que las búsquedas de similitud de la proteína (como ProteinBlast en, por ejemplo, http://toolkit.tuebingen. mpg.de/prot_blast) pueden no ser necesariamente determinar si una secuencia desconocida realmente cae bajo la expresión de un miembro de la familia de xilanasa GH11. Las secuencias de proteínas encontradas usando una búsqueda BLAST podrían tener relativamente una alta identidad/homología y todavía no ser xilanasas reales, y además, no ser xilanasas pertenecientes a GH11. De forma alternativa, las secuencias de proteína pueden tener una identidad de secuencia de aminoácidos primaria relativamente baja y ser todavía un miembro de la familia de xilanasa GH11. Para determinar si una secuencia de proteína desconocida es realmente una proteína xilanasa dentro de la familia GH11, la evaluación tendrá que hacerse, no solo en la similitud de secuencia, sino también en la similitud de la estructura 3D, ya que la clasificación dentro de las familias GH se basa en el plegamiento 3D. Un software que predicirá el plegamiento 3D de una secuencia de proteína desconocida es HHpred (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred). El poder de este software para la predicción de la estructura de la proteína se basa en la identificación de secuencias homólogas con la estructura conocida que se usa como modelo. Esto funciona tan bien porque las estructuras divergen mucho más despacio que las secuencias primarias. Las proteínas de la misma familia pueden tener estructuras muy similares incluso cuando sus secuencias han divergido más allá del reconocimiento.

En la práctica, una secuencia desconocida puede pegarse en el software (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred) en formato FASTA. Habiendo hecho esto, la búsqueda puede ser enviada. El resultado de la búsqueda mostrará una lista de secuencias con estructuras 3D conocidas. Para confirmar que la secuencia desconocida de hecho es una xilanasa de GH11, las xilanasas de GH11 deberían encontrarse dentro de la lista de homólogos con una probabilidad de >90. No todas las proteínas identificadas como homólogos serán caracterizadas como xilanasas GH11, pero algunas sí. Las últimas proteínas son proteínas con una estructura conocida y una caracterización que las identifica bioquímicamente como xilanasas. Las primeras no han sido caracterizadas bioquímicamente como xilanasas GH11. Varias referencias describen este protocolo, tales como Söding J. (2005) “Protein homology detection by HMM-HMM comparison”. Bioinformatics 21, 951-960 (doi:10.1093/bioinformatics/bti125) y Söding J, Biegert A, y Lupas AN. (2005) “The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction”. Nucleic Acids Research 33, W244-W248 (Web Server issue) (doi:10.1093/nar/gki40).

De acuerdo con el sitio Cazy(ModO), las glucósido hidrolasas de la Familia 11 pueden caracterizarse como sigue:

Actividades conocidas: xilanasa (EC 3.2.1.8)

Mecanismo: Retención

Nucleófilo/Base catalítico: Glu (experimental)

Donador de protones catalítico: Glu (experimental)

Estado de la estructura 3D: Plegamiento: β-enrollado

Clan: GH-C

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Según se usa en este documento, "Clan C" se refiere a agrupaciones de familias que comparten un plegamiento tridimensional común y maquinaria catalítica idéntica (véase, por ejemplo, Henrissat, B. y Bairoch, A., (1996) Biochem. J., 316, 695-696).

Según se usa en este documento, "Familia 11" se refiere a una familia de enzimas como se establece en Henrissat y Bairoch (1993) Biochem J., 293,781-788 (véase, también, Henrissat & Davies (1997) Current Opinion in Structural Biol. 1997, &:637-644). Características comunes para los miembros de la familia 11 incluyen una alta homología genética, un tamaño de aproximadamente 20 kDa y un mecanismo catalítico de doble desplazamiento (véase Tenkanen et al., 1992; Wakarchuk et al., 1994). La estructura de las xilanasas de la familia 11 incluye dos grandes βláminas hechas de β-cadenas y α-hélices.

Las xilanasas de la familia 11 incluyen, pero sin limitación, a los siguientes: XynA de Aspergillus niger, XynC de Aspergillus kawachii, XynA de Aspergillus tubigensis, XynA de Bacillus circulans, XynA de Bacilluspunzilus, XynA de Bacillus subtilis, XynA de Neocalliniastix patriciarum, XynB de Streptomyces lividans, XynC de Streptomyces lividans, XynII de Streptomyces therinoviolaceus, XynA de Thermomonospora fusca, Xyn de Trichoderma harzianum, XynI de Tyichoderma reesei, XynII de Trichoderma reesei, Xyn de Trichodermaviride.

Según se usa en este documento, "tipo salvaje" se refiere a una secuencia o una proteína que es nativa o que se da naturalmente.

En otra realización particular, la xilanasa de la invención se deriva de una xilanasa bacteriana, tal como a partir de una bacteria de (i) el filium de Firmicutas; (ii) la clase de Bacilli; (iii) el orden de Bacillales; (iv) la familia de Paenibacillaceae; o (v) el género de Paenibacillus; tal como a partir de una bacteria de (vi) las especies de Paenibacillus pabuli, Paenibacillus polymyxa o Paenibacillus sp.; tales como de (vii) cepas de Paenibacillus pabuli o Paenibacillus polymyxa.

La expresión "derivados de xilanasa de una xilanasa bacteriana", según se usa anteriormente en este documento, incluye cualquier xilanasa tipo salvaje aislada a partir de la bacteria en cuestión, así como sus variantes o fragmentos que retienen actividad de xilanasa.

En otra realización particular, la xilanasa de la invención es derivada de una xilanasa fúngica.

La definición anterior de "derivado a partir de" (en el contexto de xilanasas bacterianas) es aplicable por analogía también a xilanasas fúngicas.

Ejemplos de xilanasas fúngicas de la glucósido hidrolasa de la familia 11 son aquellas que pueden derivarse del siguiente género fúngico: Aspergillus, Aureobasidium, Emericella, Fusarium, Gaeumannomyces, Humicola, Lentinula, Magnaporthe, Neocallimastix, Nocardiopsis, Orpinomyces, Paecilomyces, Penicillium, Pichia, Schizophyllum, Talaromyces, Thermomyces, Trichoderma.

Las xilanasas fúngicas incluyen xilanasas fúngicas de levadura y filamentosas. En algunas realizaciones, la xilanasa se deriva de un hongo de (i) el filium de Ascomycota; (ii) la clase de Pezizomycotina; (iii) el orden de Eurotiomycetes;

(iv) el sub-orden de Eurotiales; (v) la familia de Trichocomaceae, preferiblemente el Trichocomaceae mitospórico; o incluso más preferiblemente a partir de un hongo de (vi) el género Aspergillus; más preferiblemente a partir de (vii) cepas de Aspergillus niger. Se entenderá que la definición de las especies anteriormente mencionadas incluye ambos los estados perfectos e imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de las especies por el que sean conocidas. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados.

Las cepas de las bacterias y hongos anteriormente mencionados están fácilmente disponibles para el público en un número de colecciones de cultivo, tal como la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Las cuestiones que se relacionan con la taxonomía pueden resolverse consultando una base de datos de taxonomía, tal como el Navegador de Taxonomía NCBI que está disponible en el siguiente sitio de internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/.

Sin embargo, se hace referencia preferiblemente a los siguientes manuales: Dictionary of the Fungi, 9ª edición, editada por Kirk, P.M., P. F. Cannon, J. C. David & J.A. Stalpers, CAB Publishing, 2001; y Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Segunda edición (2005).

Se describe en este documento también una modificación o modificaciones de una cierta o ciertas posiciones de aminoácidos. Esta posición o posiciones se listan con referencia a la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1. En la presente invención, los polipéptidos con actividad de xilanasa tienen una modificación al menos en una o dos modificaciones de aminoácido en una posición seleccionada entre: 12 y 13; y una o más otras modificaciones de aminoácido en una posición seleccionada entre: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175, y 179 comparado con la secuencia de B. subtilis

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mostrada como SEQ ID No. 1. Las posiciones equivalentes en otras xilanasas de la familia 11 pueden encontrarse alineando otras xilanasas de la Familia 11 con SEQ ID No. 1 y determinando qué aminoácidos se alinean con los aminoácidos específicos de SEQ ID No. 1. Dicho alineamiento y el uso de una secuencia como primera referencia es simplemente una materia de rutina para un experto ordinario en la técnica.

En un aspecto, una variante de xilanasa descrita en este documento tiene una mejor actividad de solubilización del salvado que es mayor que la que puede obtenerse mediante el uso de la correspondiente xilanasa tipo salvaje, o cualquiera xilanasa que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No. 1-22, como se mide en un "ensayo de solubilización de salvado".

En un aspecto, la xilanasa descrita en este documento tiene una mejor solubilización de la actividad del salvado como resultado de la modificación en una posición seleccionada entre: 12 y 13; en combinación con una o más modificaciones de aminoácido en una posición seleccionada entre: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175, y 179.

De forma adecuada, la actividad solubilizadora del salvado de xilanasa puede medirse usando el ensayo de solubilización de salvado proporcionado en este documento. Por tanto, pueden proporcionarse polipéptidos con mayor actividad de xilanasa y/o mayor actividad solubilizadora del salvado.

El requerimiento para la especificidad hacia el WU-AX es cada vez más y más importante, ya que muchas aplicaciones están usando una concentración elevada de salvado de cereal. La industria de fabricación del pan incrementa la concentración de salvado en muchos productos, debido a asuntos de salud y nutricionales y la industria alimenticia incorpora cantidades crecientes de material de salvado (fibra, Destilados de Granos Secos con Agentes Solubles (DDGS)) debido al uso de cereales en la producción de bioetanol, por ejemplo. Es, por tanto, ventajoso proporcionar nuevas xilanasas con mayor especificidad y, por tanto, la eficacia en la solubilización de este material de salvado.

Ensayo de solubilización del salvado

Preferiblemente, la solubilidad del salvado se mide usando the siguiente ensayo.

Una suspensión de salvado de trigo en tampón (0,1 M) hidrógeno-fosfato de di-sodio (0,2 M), pH 5,0 se prepara a una concentración de 1,33% de salvado (p/p). A partir de esta suspensión, se transfieren alícuotas de 750 ml a tubos eppendorph con agitación. Cada tubo de sustrato se pre-calienta durante 5 minutos a 40°C. A partir de ahí, se añaden 250 ml de solución enzimática, haciendo la concentración final del sustrato el 1%. Tres diluciones (por duplicado) se preparan a partir de cada una de las xilanasas, incrementando la concentración enzimática (0,33; 1,0 y 3,0 mg xilanasa/gramos de salvado) en cada tiempo de determinación (0, 30, 60 y 240 minutos). Como control, se usa una solución desnaturalizada por calor de la xilanasa. La reacción se termina a los tiempos dados, transfiriendo los tubos a un incubador ajustado a 95°C. Las muestras desnaturalizadas por calor se mantienen a 4°C hasta que todas las reacciones enzimáticas se terminan. Cuando todas las reacciones enzimáticas se terminan, los tubos Eppendorph se centrifugan para obtener un sobrenadante claro. La capacidad de las enzimas para solubilizar el salvado se expresa como el incremento en reducir los grupos terminales como se determina usando PAHBAH (Lever, 1972).

Ya que las actividades secundarias, tal como la actividad de amilasa, puede interferir con el ensayo anterior, el ensayo de solubilización del salvado debería solo llevarse a cabo en muestras de xilanasa purificada (véase Ex. 2).

En un aspecto, la xilanasa de acuerdo con la invención tiene una menor sensibilidad frente al inhibidor de xilanasa cuando se compara con cualquier xilanasa tipo salvaje, o cualquiera xilanasa que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID No. 1.

En un aspecto más, la xilanasa descrita en este documento tienen una menor sensibilidad frente al inhibidor de xilanasa como resultado de la modificación en una posición seleccionada entre: 12 y 13; en combinación con una o más modificaciones de aminoácido en una posición seleccionada entre: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175, y 179.

El inhibidor puede ser un inhibidor encontrado en la naturaleza en tejidos de plantas.

Según se usa en este documento, la expresión "inhibidor de xilanasa" se refiere a un compuesto, típicamente una proteína, cuyo papel es controlar la despolimerización de carbohidratos complejos, tal como arabinoxilano, encontrados en la pared celular de las plantas. Estos inhibidores de xilanasa son capaces de reducir la actividad de enzimas xilanasas encontradas en la naturaleza así como aquellas de origen fúngico o bacteriano. La presencia de los inhibidores de xilanasa se ha mostrado en semillas de cereales (véase, por ejemplo, McLauchlan et al 1999a; Rouau y Suget 1998).

McLauchlan et al. (1999a) describen el aislamiento y la caracterización de una proteína a partir de trigo que se une e inhibe dos xilanasas de la familia-11. De la misma forma, el documento WO 98/49278 muestra el efecto de un extracto de harina de trigo sobre la actividad de un grupo de xilanasas microbianas todas las cuales son clasificadas

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posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una

: o más sustituciones de aminoácido seleccionadas entre el grupo que consiste en: 12F, 13Y, 15Y, 34K, 54Q, 54W, 77V, 77M, 77Y, 77L, 77S, 81I, 82I, 99Y, 104W, 110A, 113D, 113A, 114F, 114D, 114Y, 118V, 122F, 122D, 141Q, 154R, 159D, 162E, 162D, 164F, 166F, 175L, 175K, 175E, 175Y, y 179Y, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

: o más sustituciones de aminoácido seleccionadas entre el grupo que consiste en: G12F, G13Y, I15Y, G34K, N54Q, I77V, I77M, I77Y, I77L, I77S, V81I, V82I, K99Y, T104W, T110A, Y113D, Y113A, N114F, N114D, N114Y, I118V, R122F, R122D, N141Q, K154R, N159D, S162E, S162D, 164F, Y166F, Q175L, Q175K, Q175E, Q175Y, y S179Y, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene al menos 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 o 95% de identidad con la secuencia con la cual tiene el porcentage más alto de identidad seleccionada entre SEQ ID No. 1-22.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene un plegamiento β enrrollado.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido, en donde la una o dos modificaciones de aminoácido en una posición seleccionada entre 12 y 13 es una sustitución de aminoácido.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido, en donde las modificaciones de aminoácido en la posición 12 es una sustitución de aminoácido a cualquier resto de aminoácido diferente seleccionado entre el grupo que consiste en: isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, cisteína, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptófano, valina, prolina, serina, tirosina, arginina, e histidina.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido, en donde las modificaciones de aminoácido en la posición 13 son una sustitución de aminoácido a cualquier resto de aminoácido diferente seleccionado entre el grupo que consiste en: isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, cisteína, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptófano, valina, prolina, serina, tirosina, arginina, e histidina.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido, en donde las modificaciones de aminoácido en la posición 12 son una sustitución a cualquier resto de aminoácido diferente seleccionado entre el grupo que consiste en: fenilalanina y tirosina.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido, en donde las modificaciones de aminoácido en la posición 13 son una sustitución a cualquier resto de aminoácido diferente seleccionado entre el grupo que consiste en: fenilalanina y tirosina.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene un total de números de aminoácidos de menos que 250, tal como menos que 240, tal como menos que 230, tal como menos que 220, tal como menos que 210, tal como menos que 200 aminoácidos, tal como en el intervalo de 160 a 240, tal como en el intervalo de 160 a 220 aminoácidos.

: o más modificaciones en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácido: 12, 13, 34, 77, 81, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 y 175, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

: o más sustituciones de aminoácido seleccionadas entre el grupo que consiste en: 12F, 13Y, 13F, 110A, 122D, 113A, 13Y, 54Q, 54W, 113D, 175L, 122F, 34K, 99Y, 104W, 141Q, 154R, 159D, 175K, 81I, 166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77S, 77V, y 77Y, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

: o más sustituciones de aminoácido seleccionadas entre el grupo que consiste en: G12F, G13Y, G13F, N54Q, T110A, R122D, Y113A, G13Y, Y113D, Q175L, R122F, G34K, K99Y, T104W, N141Q, K154R, N159D, Q175K, V81I, Y166F, S162E, S162D, W164F, N114D, N114Y, N114F, I118V,, I77L, I77M, I77S, I77V, y I77Y, siendo determinadas

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la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

o más modificaciones en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácido: 12, 13, 99, 104, 110, 113, 122, 141, 154, 159 y 175, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende la sustitución o sustituciones en las posiciones de aminoácido: 13 y 122, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende además una o más modificaciones en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácido: 114 y 166, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende además una o más sustituciones en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácido: 114 y 166, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una sustitución o sustituciones en al menos cuatro de las siguientes posiciones de aminoácido: 12, 13, 99, 104, 110, 113, 114, 122, 141, 154, 159, 166, y 175, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una sustitución o sustituciones en las posiciones de aminoácido: 13, 113, y 122, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una sustitución o sustituciones en las posiciones de aminoácido: 12, 113, y 122, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una sustitución o sustituciones en las posiciones de aminoácido: 13, 113, 122, y 175, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

o más sustituciones de aminoácido seleccionadas entre el grupo que consiste en: 12F, 13Y, 99Y, 104W, 110A, 113D, 114D, 114F, 122F, 154R, 159D, 166F, 175K, y 175L, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácido comparado con la secuencia seleccionada entre SEQ ID No. 1-22 con la que tiene la identidad más alta.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene al menos nueve o diez sustituciones de aminoácido.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene actividad de solubilización de salvado.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es en forma aislada.

El término "aislado", como se usa en este documento significa que el polipéptido está al menos sustancialmente libre de al menos un otro componente con el que la secuencia está naturalmente asociada en la naturaleza.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una mejor actividad de xilanasa comparado con la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1 según se mide en un ensayo de actividad de xilanasa.

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En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una mejor actividad de xilanasa como resultado de la modificación en una posición seleccionada entre 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175, y 179, siendo determinadas la posición

o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como

SEQ ID No. 1. En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una mejor actividad de solubilización del salvado comparado con la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1 según se mide en un ensayo de actividad de solubilización del salvado.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una mejor actividad de solubilización del salvado como resultado de la modificación en la posición seleccionada entre 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175, y 179, siendo determinadas la posición o las posiciones como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ ID No. 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una menor

sensibilidad respecto a un inhibidor de xilanasa. En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una secuencia de aminoácidos que comprende modificaciones en las posiciones seleccionadas a partir de la lista que consiste en:

a) 13/110/113/122/154/159/175; b) 13/99/104/110/113/122/154/159/166/175; c) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; d) 13/110/113/122/175; e) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; f) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; g) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; h) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; i) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; j) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; k) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; l) 13/113/122/175; m) 13/81/99/104/110/113/122/154/159/175; n) 13/110/113/122/164/175; o) 13/110/113/122/162/175; p) 13/110/113/122/175; q) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; r) 13/113/122/175; s) 12/113/122/175; t) 13/113/122/175; u) 13/34/110/113/122/175; v) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; w)13/99/104/113/122/175; x) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175;

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Modificaciones hechas a SEQ. ID Nº 1: Pendiente OD/h OD máxima Pendiente relativafrente a BS1 OD Máx. relativafrente a BS1 Pendiente relativafrente a BS3 OD Máx. relativafrente a BS3

G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q17 5L;: 0,38 1,15 169 169 235 235

G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L;: 0,37 1,12 164 164 229 229

G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L;: 0,37 1,11 162 162 226 226

G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K;: 0,37 1,11 162 162 226 226

G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q1 75K: 0,35 1,05 153 153 214 214

G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q17 5L: 0,35 1,04 152 152 212 212

G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q1 75L: 0,34 1,02 149 149 208 208

G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q17 5K: 0,33 0,98 144 144 201 201

G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L: 0,31 0,93 136 136 190 190

G13Y/Y113D/R122F/Q175L: 0,30 0,91 133 133 186 186

G13Y/V81I/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175 L: 0,29 0,87 128 128 178 178

G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L: 0,28 0,83 121 121 169 169

G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L: 0,28 0,83 121 121 169 169

G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L: 0,27 0,82 119 119 167 167

G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175 L;: 0,27 0,80 117 117 163 163

G13F/Y113D/R122D/Q175L: 0,26 0,78 114 114 160 160

G12F/Y113D/R122D/Q175L: 0,26 0,78 114 114 160 160

G13F/Y113D/R122D/Q175L: 0,25 0,74 109 109 152 152

G13F/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L: 0,25 0,74 108 108 150 150

G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175 L: 0,23 0,69 101 101 141 141

G13Y/K99Y/T104W/Y113D/R122D/Q175L: 0,22 0,67 98 98 138 138

G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175 L: 0,22 0,67 98 98 137 137

G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/I118V/R122F/K154R/N159D/Q17 5L: 0,21 0,63 92 92 128 128

G13Y/I115Y/Y113D/R122D/Q175L: 0,20 0,60 87 87 122 122

G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L: 0,18 0,53 78 78 109 109

Ejemplo 3 – Análisis de la actividad de xilanasa y de la inhibición relativa por inhibidores de xilanasa de cereal

Los mutantes del Ejemplo 2 se analizaron para probar la actividad de xilanasa y la sensibilidad relativa respecto a un inhibidor de xilanasa mediante los protocolos presentados más abajo y de acuerdo con las siguientes indicaciones. Ensayo de xilanasa (actividad de endo-β-1,4-xilanasa)

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Tabla 4 Comportamiento del horneado de mutantes – incremento de volumen de pan (ml/g) y volumen relativo comparado con el control (sin enzima añadida) y BS3 (SEQ ID No. 1 con las modificaciones D11F y R122D) que muestran un comportamiento de horneado superior comparado con la xilanasa tipo salvaje de XynA de Bacillus sub. (SEQ ID No. 1).

Modificaciones hechas a Seq ID No 1: Vol. de pan @ 0,04 mg/kg de harina Incremento de vol. relativo vs. control, % Incremento de vol. relativo vs. BS3, %

G13Y/G34K/T110A/ Y113D/R122D/Q175L: 4,22 41,89 20

G13Y/K99Y/T104W/ T110A/Y113D/R122F/ K154R/N159D/Q175K: 2,90 21,93 7,54

G13Y/V81I/K99Y/ T104W/T110A/Y113D/ R122F/K154R/N159D/ Q175L: 2,80 18,02 4,09

G13Y/K99Y/T104W/ T110A/Y113D/R122F/ K154R/N159D/Y166F/ Q175L: 2,82 18,86 4,83

G13Y/T110A/Y113D/ R122D/K154R/N159D/ Q175L: 2,81 18,08 4,15

G13Y/K99Y/T104W/ T110A/Y113D/R122F/ K154R/N159D/Q175L: 2,89 21,74 7,24

G13Y/T110A/Y113D/ R122D/S162E/Q175L: 2,75 13,55 1,99

G13Y/T110A/Y113D/ R122D/S162D/Q175L: 2,82 15,54 4,48

G13Y/T110A/Y113D/ R122D/W164F/Q175L: 2,78 14,02 3,10

G13Y/K99Y/T104W/ T110A/Y113D/N114D/ R122F/K154R/N159D/ Q175L: 2,81 16,44 4,11

G13Y/K99Y/T104W/ T110A/Y113D/N114Y/ R122F/K154R/N159D/ Q175L: 2,73 13,26 1,26

G13Y/K99Y/T104W/ T110A/Y113D/N114F/ R122F/K154R/N159D/ Q175L: 2,80 16,22 3,74

G13Y/K99Y/T104W/ T110A/Y113D/I118V/ R122F/K154R/N159D/ Q175L: 2,83 17,58 4,95

G13Y/K99Y/T104W/ T110A/Y113D/N114Y/ R122F/K154R/N159D/ Q175K: 2,89 20,65 7,34

G13Y/K99Y/T104W/ T110A/Y113D/N114D/ R122F/K154R/N159D/ Q175K: 2,77 14,73 2,63

G13Y/I77L/K99Y/ T104W/T110A/Y113D/ R122F/K154R/N159D/ Q175L: 2,81 15,08 4,32

G13Y/I77M/K99Y/ T104W/T110A/Y113D/ R122F/K154R/N159D/ Q175L: 2,70 12,43 0,17

G13Y/I77S/K99Y/ T104W/T110A/Y113D/ R122F/K154R/N159D/ Q175L: 2,53 5,40 (6,09)

G13Y/I77V/K99Y/ T104W/T110A/Y113D/ R122F/K154R/N159D/ Q175L: 2,60 8,19 (3,63)

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Claims

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