MX2011006640A - Polipeptidos con actividad xilanasa. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan polipéptidos con actividad de xilanasa modificados para incrementar la solubilización de salvado y/o la actividad de xilanasa. La modificación comprende modificación de uno o más aminoácidos en la posición 12 ó 13 en combinación con una o más modificaciones de aminoácidos adicionales en la posición 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 ó 179, en donde las posiciones se determinan como la posición que corresponde a la posición de xilanasa de Bacillus subtilis (SEC ID NO: 1).

Description

POLIPEPTIDOS CON ACTIVIDAD XILANASA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con polipéptidos con actividad de xilanasa y usos de los mismos. La presente invención también se relaciona con un método para modificar polipéptidos con actividad de xilanasa para alterar, preferiblemente para incrementar, la actividad de xilanasa y/o la solubilidad de salvado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Durante muchos años, se han utilizado las endo-ß-?, 4-xilanasas (EC 3.2.1.8) (denominadas en la presente como xilanasas) para la modificación de carbohidratos complejos derivados de material de pared de célula vegetal. Es bien sabido en el ámbito que la funcionalidad de las diferentes xilanasas (derivadas de diferentes microorganismos o plantas) difiere enormemente. En base en la información estructura y genética, las xilanasas se han clasificado en diferentes familias de glucósido hidrolasa (GH) (Henrissat, 1991; Coutinho y Henrissat, 1999) . Hasta recientemente, todas las xilanasas conocidas y caracterizadas se encontró que pertenecen a las familias GH10 o GH11. Investigaciones recientes han identificado numerosos tipos adicionales de xilanasas que pertenecen a las familias GH5 , GH7 , GH8 y GH43 (Coutinho y Henrissat, 1999; Collins et al., 2005) . Hasta REF: 221282 ahora, la familia GH11 difiere de todas las demás GH en ser la única familia que consiste únicamente de xilanasas específicas para xilano. La estructura de las xilanasas GH11 se puede describir como estructura tipo ß-Jelly Roll (véase la figura 1, descrita en la presente) .

El documento de E.U.A. 6,682,923 se relaciona con proteínas con actividad de xilanasa y ácidos nucleicos.

Se han realizado estudios amplios que caracterizan la funcionalidad de xilanasas sobre sustratos bien caracterizados y puros (Kormelink et al., 1992) . Estos estudios muestran que diferentes xilanasas tienen requerimientos específicos diferentes con respecto a la sustitución de la estructura principal xilosa de la arabinoxilano (AX) . Algunas xilanasas requieren tres residuos xilosa no sustituidos para hidrolizar la estructura principal xilosa; otros requieren solo uno o dos. Las razones para estas diferencias en la especificidad se considera que se deben a la estructura tridimensional dentro de los dominios catalíticos los que a su vez dependen de la estructura primaria de la xilanasa, es decir, la secuencia de aminoácidos. No obstante, la traducción de estas diferencias en las secuencias de aminoácidos en diferencias en la funcionalidad de las xilanasas, hasta ahora no se ha documentado cuando la xilanasa actúa en un ambiente complejo tal como un material vegetal.

Los sustratos de xilanasa que se encuentran en trigo (harina de trigo) tradicionalmente se han dividido en dos fracciones: el AX que no se pude extraer con agua (WU-AX) y el AX que se puede extraer con agua ( E-AX) . La relación WU-AX: WE-AX es de aproximadamente 70:30 en harina de trigo. Existen numerosas explicaciones respecto a por que existen dos fracciones diferentes de AX. La literatura más antigua (D'Appolonia y MacArthur (1976) y Montgomery y Smith (1955)) describe diferencias muy grandes en el grado de sustitución entre WE-AX y WU-AX. El grado más grande de sustitución se encuentra en WE-AX. Esto se ha utilizado para explicar el motivo por el cual parte del AX es extraíble. El alto grado de sustitución vuelve al polímero soluble, en comparación con un grado de sustitución menor, lo cual puede provocar uniones de hidrógeno entre los polímeros y en consecuencia precipitación.

La diferencia entre la funcionalidad de xilanasas diferentes se ha considerado que se debe a diferencias en especificidad de xilanasa y por lo tanto su preferencia por los sustratos WU-AX o WE-AX .

No obstante, las investigaciones más recientes no encuentran las mismas diferencias amplias entre el grado de sustitución de WE-AX y WU-AX. Por lo tanto pueden ser de importancia otros parámetros diferentes a la especificidad de sustrato de las xilanasas. Estos parámetros pueden ser la preferencia de las xilanasas por E-AX versus WU-AX, determinado por otros medios diferentes a la especificidad de sustrato clásica. Este parámetro se puede encontrar descrito en la literatura como selectividad de sustrato.

En algunas aplicaciones (por ejemplo en horneado) es deseable producir polímeros solubles de peso molecular alto (HMW) a partir de la fracción WU-AX. Los polímeros se han correlacionado con un incremento en el volumen en la elaboración de pan (Rouau, 1993; Rouau et al., 1994 y Courtin et al., 1999) .

En otras aplicaciones, es deseable modificar tanto WU-AX y WE-AX, solubilizar el WU-AX, hacer menor peso molecular, reducir su efecto hidrocoloide , producir oligosacáridos de arabinoxilano, proporcionar acceso a degradación adicional de otros componentes de pared celular (tal como en producción de galletas saladas, separación de harina, aplicación de pienso, producción de bioetanol, prebióticos, etc.).

Todas las características mencionadas antes de las xilanasas utilizadas en diversas aplicaciones se relacionan con el desempeño de las xilanasas y son de gran importancia para obtener la funcionalidad necesaria. No obstante, la selección de las xilanasas que tienen las características correctas para cierta aplicación de manipulación de xilanasas conocidas para obtenerlas, con frecuencia resulta en una molécula de xilanasa menos eficiente, por ejemplo una molécula con baja actividad catalítica (es decir, actividad específica caracterizada por las unidades de moléculas/mg de proteína de xilanasas) . Dado que estas moléculas van a ser utilizadas en aplicaciones comerciales por lo tanto es de gran importancia tener una actividad catalítica tan grande como se pueda. El mejoramiento de esta característica será de una importancia cada vez mayor para obtener la aplicación comercial de estas enzimas en el futuro, debido al uso aumentado de productos secundarios agrícolas tales como salvado de cereal o uso en producción de bioetanol celulósico .

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con el hallazgo sorprendente de que es posible - al modificar un polipéptido con actividad de xilanasa en uno o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de 12 y 13 ; en combinación con una o más modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, en comparación con la secuencia polipeptídica de xilanasa de B. subtilis, que se muestra como la SEC ID NO: 1; incrementar la solubilización de salvado y/o la actividad de xilanasa de la enzima.

Por lo tanto, se ha demostrado por los inventores de la presente invención que es posible producir polipéptidos de xilanasa que tengan actividad de xilanasa y/o solubilízación de salvado aumentados. Esto volverá, por ejemplo, factible hidrolizar la fracción hemicelulósica durante el procesamiento de cereal relacionado con la producción de bioetanol celulósico o permitir una reducción en la cantidad de xilanasa que se requiere para varias aplicaciones tales como pienso para animales, licuefacción de almidón, para repostería u horneado, separación de harinas (molido en húmedo) , producción de prebióticos y producción de papel y pulpa.

En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un polipéptido que tiene actividad de xilanasa y que comprende una secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 75% de identidad con una secuencia de aminoácidos que se selecciona de las SEC ID NOS: 1-22 y polipéptido el cual tiene: i) una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 12 y 13; y ii) una o más modificaciones adicionales de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, en donde las posiciones están determinadas como la posición que corresponde a la posición de la secuencia de xilanasa de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1 por alineación.

En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con un método de identificación de un polipéptido de acuerdo con la invención, el método comprende: (i) preparar un polipéptido que tiene por lo menos 75% de identidad con una secuencia de aminoácidos que se selecciona de las SEC ID NOS: 1-22 y polipéptido el cual tiene una modificación de aminoácidos en una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 12 y 13; y una o más modificaciones adicionales de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, en donde la posición está determinada como la posición que corresponde a la secuencia de xilanasa de B . subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1 por alineación; (ii) comparar la solubilización de salvado y/o la actividad de xilanasa del polipéptido con la solubilización de salvado y/o actividad de xilanasa de la secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre las SEC ID NOS: 1-22 con la cual tiene el porcentaje más alto de identidad; y (iii) seleccionar el polipéptido si tiene solubilización de salvado mejorada y/o actividad de xilanasa mejorada en comparación con la secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre las SEC ID NOS: 1-22 con la cual tiene el porcentaje más alto de identidad.

En un tercer aspecto, la presente invención se relaciona con un método de preparación de un polipéptido de acuerdo con la invención, el método comprende expresar una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido; y opcionalmente aislar y/o purificar el polipéptido después de expresión .

En algunas modalidades el polipéptido se prepara al modificar ya sea una secuencia de aminoácidos polipeptídica en la posición indicada o un codón que codifica para un residuo aminoácido en la posición indicada en una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácido polipeptídica, en donde la posición indicada está determinada con referencia a la secuencia de xilanasa de B. suhtilís mostrada como la SEC ID NO: 1.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un polipéptido que tiene actividad de xilanasa y que comprende una secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 75% de identidad con una secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEC ID NOS: 1-22 y polipéptido el cual tiene i) una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 12 y 13; y ii) una o más modificaciones adicionales de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, en donde la posición está determinada como la posición que corresponde a la posición de la secuencia de xilanasa de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1 por alineación.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un vector que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una célula que ha sido transformada con la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención o el vector que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un organismo hospedador que ha sido transformado con la secuencia nucleotídica que codifica por un polipéptido de acuerdo con la invención o el vector que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición que comprende el polipéptido de conformidad con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición que comprende un polipéptido identificado de acuerdo con los métodos de la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición que comprende un polipéptido preparado de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición que comprende el vector que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición que comprende a la célula que ha sido transformada con la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición que comprende el vector que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición que comprende al organismo que ha sido transformado con la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención o el vector que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención mezclado con un componente no tóxico.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una masa que comprende al polipéptido de acuerdo con la invención o un polipéptido identificado de acuerdo con la invención o un polipéptido preparado de acuerdo con la invención o la secuencia nucleotídica de acuerdo con la invención o el vector de acuerdo con la invención o la célula de acuerdo con la invención o el organismo de acuerdo con la invención mezclados con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la invención .

En un aspecto adicional, la presente invención se polipéptido de acuerdo con la invención o un polipéptido identificado de acuerdo con la invención o un polipéptido preparado de acuerdo con la invención o la secuencia nucleotídica de acuerdo con la invención o el vector de acuerdo con la invención o la célula de acuerdo con la invención o el organismo de acuerdo con la invención mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la invención o una masa de acuerdo con la invención. 38 relaciona con un pienso para animales que comprende al polipéptido de acuerdo con la invención o un polipéptido identificado de acuerdo con la invención o un polipéptido preparado de acuerdo con la invención o la secuencia nucleotíd ca de acuerdo con la invención o el vector de acuerdo con la invención o la célula de acuerdo con la invención o el organismo de acuerdo con la invención mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con. la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición limpiadora que comprende xilanasa. En algunas modalidades, las composiciones limpiadoras son composiciones detergentes de lavandería, mientras que en otras modalidades las composiciones limpiadoras son detergentes para lavava illas . En algunas modalidades adicionales, los detergentes para lavavaj illas son detergentes para lavavaj illas automático. En algunas modalidades adicionales, las composiciones limpiadoras que contienen xilanasa comprenden además una o más enzimas adicionales. En algunas modalidades, las enzimas adicionales se seleccionan de hemicelulasas, celulasas, peroxidasas, proteasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, cutinasas, pectinasas, pectato liasas, mananasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas , arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa y amilasas o mezclas de los mismos. En algunas modalidades, una combinación de enzimas encuentra uso (es decir, una "mezcla") .

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un método para degradar o modificar una pared de célula vegetal, el. método comprende poner en contacto la pared de célula vegetal con el polipéptido de acuerdo con la invención o un polipéptido identificado de acuerdo con la invención o un polipéptido preparado de acuerdo con la invención o la secuencia nucleotídica de acuerdo con la invención o el vector de acuerdo con la invención o la célula de acuerdo con la invención o el organismo de acuerdo con la invención mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un método de procesamiento de un material vegetal, método el cual comprende poner en contacto el material vegetal con el polipéptido de acuerdo con cualquiera de la invención o un polipéptido identificado de acuerdo con la invención o un polipéptido preparado de acuerdo con la invención o la secuencia nucleotídica de acuerdo con la invención o el vector de acuerdo con la invención o la célula de acuerdo con la invención o el organismo de acuerdo con la invención mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el uso del polipéptido de acuerdo con la invención o un polipéptido identificado de acuerdo con la invención o un polipéptido preparado de acuerdo con la invención o la secuencia nucleotídica de acuerdo con la invención o el vector de acuerdo con la invención o la célula de acuerdo con la invención o el organismo de acuerdo con la invención mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la invención en un método de modificación de materiales vegetales.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el uso del polipéptido de acuerdo con la invención o un polipéptido identificado de acuerdo con la invención o un polipéptido preparado de acuerdo con la invención o la secuencia nucleotídica de acuerdo con la invención o el vector de acuerdo con la invención o la célula de acuerdo con la invención o el organismo de acuerdo con la invención mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la invención en cualquiera de uno o más de: horneado, cereales procesados, licuefacción de almidón, producción de bioetanol a partir de material celulósico, pienso para animales, en el procesamiento de madera, mejoramiento del blanqueado de pulpa de madera.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un polipéptido o fragmento del mismo sustancialmente como se describe en lo anterior con referencia a los ejemplos y las figuras.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un método sustancialmente como se describe en la presente con referencia a los ejemplos y las figuras.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición sustancialmente como se describe en lo anterior con referencia a los ejemplos y figuras .

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el uso sustancialmente como se describe en lo anterior con referencia a los ejemplos y las figuras.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Se hará referencia en la presente a las siguientes figuras : La figura 1 muestra xilanasa variante XynA de Bacillus subtilis (T110A) (negro) , la xilanasa variante Xyn2 de Trichoderma reesei (T120A) (gris oscuro) y la xilanasa variante de XynA de Thermomyces lanuginosus (T120A) (gris claro) superpuesta. Los residuos mutados T110 y T120, respectivamente, están resaltados.

La figura 2 muestra una alineación de secuencia múltiple de la SEC ID NO: 1-22 en el programa AlignX (parte del conjunto vector NTI) , con parámetros implícitos para alineación múltiple (castigo de abertura de separación: lOog castigo de extensión de separación 0.05) . Los números a la izquierda de la secuencia representan las SEC ID NOS.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La enzimas xilanasas se han reportado a partir de casi 100 organismos diferentes, que incluyen plantas, hongos y bacterias. Las enzimas xilanasas se clasifican en varios de más de 40 familias de enzimas glucosilhidrolasa. Las enzimas glucosilhidrolasa, las cuales incluyen xilanasas, mananasas, amilasas, ß-glucanasas, celulasas y otras carbohidrasas se clasifican en base en propiedades tales como la secuencia de aminoácidos, la estructura tridimensional y la geometría del sitio catalítico (Gilkes, et al., 1991, Microbiol . Reviews 55: 303-315) .

En un aspecto, la presente invención se relaciona con un polipéptido que tiene actividad de xilanasa y que comprende por lo menos tres, tal como cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos en relación con cualquiera de la secuencia de aminoácidos de las SEC ID NOS: 1-22 y polipéptido el. cual tiene: i) una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 12 y 13; y ii) una o más modificaciones adicionales de aminoácidos adicionales en una posición que se selecciona de: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, en donde las posiciones se determinan como la posición que corresponde a la posición de la secuencia de xilanasa de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1 por alineación.

La posición de un aminoácido particular dentro de un. polipéptido de acuerdo con la presente invención se determina por alineación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido con la SEC ID NO: 1 utilizando la herramienta de alineación de secuencia estándar tal como por alineación de dos secuencias utilizando el algoritmo de Smith-Waterman o con los algoritmos CLUSTALW2 , en donde las secuencias se dice que se alinean cuando la calificación de alineación es la más alta. Las calificaciones de alineación se pueden calcular de acuerdo con los métodos descritos por Wilbur, W. J. y Lipman, D. J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks . Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 80: 726-730. Preferiblemente, los parámetros implícitos se utilizan en el algoritmo ClustalW2 (1.82) castigo por abertura de separación de proteína = 10.0; castigo por extensión de separación de proteína = 0.2; matriz de proteína = Gonnet; Proteína/ADN ENDGAP = -1; Proteína/ADN GAPDIST = 4.

Preferiblemente, una posición de un aminoácido particular dentro de un polipéptido de acuerdo con la presente invención se determina por alineación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido con la SEC ID NO: 1 utilizando el programa AlignX (parte del conjunto vectorNTI) con parámetros implícitos para alineación múltiple (castigo por abertura de separación: 10 og castigo por extensión de separación 0.05). Para algunas modalidades de acuerdo con la presente invención, la alineación se puede realizar utilizando la figura 2 como se describe en la presente. A. menos que se establezca en otro sentido, el término "identidad de secuencias" para aminoácidos, como se utiliza en la presente, se refiere en la identidad de secuencia calculada como [nref - ndif) .100/nref, en donde ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en donde nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos ASTDY QNWT tendrá una identidad de secuencia de 80% con la secuencia ASTGYWQAWT (n¿if = 2 y nref = 10) .

En algunas modalidades, la identidad de secuencia se determina por métodos convencionales, por ejemplo Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl . Math. 2:482, por la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85:2444, utilizando el algoritmo CLUSTAL 2 de Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res 22:467380, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el isconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group) . El algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990, Mol. Biol . 215:403-10) para el cual se puede obtener el programa a través del National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/) también se pueden utilizar. Cuando se utiliza cualquiera de los algoritmos mencionados antes, los parámetros implícitos para el intervalo "ventana), castigo por separación, etc., se utilizan.

El término "modificación", como se utiliza en la presente significa cualquier modificación química a cualquiera de un aminoácido o de la secuencia de aminoácidos del polipéptido seleccionado de las SEC ID NOS: 1-22 así como manipulación genética del ADN que codifica para ese polipéptido. La modificación puede ser sustituciones, supresiones y/o inserciones de uno o más aminoácidos así como sustituciones de una o más cadenas laterales de aminoácidos .

Debe entenderse que "modificación" en un polipéptido dado se relaciona con el polipéptido seleccionado de las SEC ID NOS: 1-22 con la identidad de secuencia de porcentaje más grande para ese polipéptido dado.

La terminología para sustituciones de aminoácidos utilizada en esta descripción es como sigue. La primera letra representa el aminoácido presente de manera natural en una posición de una secuencia particular. El siguiente número representa la posición en relación a la SEC ID NO: 1. La segunda letra representa el aminoácido diferente que va a sustituir al aminoácido natural. Un ejemplo es G13F/Y113D/R122D/Q175L, en donde la glicina en la posición 13 de la SEC ID NO: 1 se sustituye por una fenilalanina y la tirosina en la posición 113 de la SEC ID NO : 1 se sustituye por un ácido aspártico, y la arginina en la posición 122 se sustituye por un ácido aspártico, la glutamina en la posición 175 ha sido sustituida por una leucina, la totalidad de cuatro mutaciones se producen en el mismo polipéptido que tiene actividad de xilanasa.

Además de las modificaciones de aminoácidos en los polipéptidos con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención, los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden tener modificaciones de aminoácidos de una naturaleza menor, esto es, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que no afectan de manera significativa el plegamiento y/o actividad de la proteína; supresiones pequeñas, habitualmente de 1 a aproximadamente 30 aminoácidos; extensiones pequeñas amino terminal o carboxilo terminal, tales como un residuo metionina amino terminal; un péptido enlazante pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función, tal como un tracto de poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Los ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Las sustituciones de aminoácidos las cuales generalmente no alteran la actividad específica se conocen en el ámbito y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R. L. Hill, 1979, In The Proteins, Academic Press, New York. Los cambios que se presentan de manera más común son Ala a Ser, Val a lie, Asp a Glu, Thr a Ser, Ala a Gly, Ala a Thr, Ser a Asn, Ala a Val, Ser a Gly, Tyr a Phe, Ala a Pro, Lys a Arg, Asp a Asn, Leu a lie, Leu a Val, Ala a Glu y Asp a Gly.

Además de los 20 aminoácidos estándar, los aminoácidos no estándar (tales como 4-hidroxiprolina, 6-/V-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y a-metil serina) pueden sustituir a los residuos aminoácidos de un polipéptido natural. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético y aminoácidos no naturales pueden estar sustituyendo a los residuos aminoácidos. Los "aminoácidos no naturales" han sido modificados después de síntesis de proteína y/o tienen una estructura química en una o varias de sus cadenas laterales diferente a la de los aminoácidos estándar. Los aminoácidos no naturales se pueden sintetizar químicamente y, de manera preferible, están disponibles comercialmente e incluyen ácido pipecolico, ácido tiazolidino carboxílico, deshidroprolina, 3- y 4 -metilprolina y 3,3-dimetilprolina .

El término "organismo hospedador" como se utiliza en la presente, incluye cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción y similar con una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para los polipéptidos de la presente invención.

Para los presentes propósitos, una xilanasa significa una proteína o un polipéptido que tiene actividad de xilanasa.

La frase "un polipéptido que tiene actividad de xilanasa" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier proteína o polipéptido que tiene actividad en un análisis de xilanasa tal como lo que se describe en la presente .

La actividad de xilanasa se puede medir utilizando cualquier análisis) en el cual se utiliza un sustrato que incluye enlaces endo 1, 4-p-D-xilosídicos en xilanos. El pH y la temperatura utilizados en el análisis se adaptan a la xilanasa en cuestión. Los ejemplos de valores de pH adecuados son 4, 5, 6, 7, 8, 9, lO u ll. Los ejemplos de temperaturas adecuadas son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 u 80°C. Están disponibles diferentes tipos de sustratos para la determinación de actividad de xilanasa, por ejemplo comprimidos Xylazyme (sustrato de silano secado, reticulado, Megazyme, Bray, Irlanda) .

Preferiblemente, la actividad de xilanasa se mide utilizando el siguiente análisis.

ANALISIS DE XILANASA (ACTIVIDAD DE ENDO- ß- 1 , -XILANASA) Se diluyen muestras amortiguador de ácido cítrico (0.1 M) - fosfato ácido disódico (0.2 M), pH 5.0 para obtener aproximadamente DO590 = 0.7 en este análisis. Se preincuban durante 5 minutos a 40°C tres diluciones diferentes de la muestra. En el tiempo = 5 minutos, se agrega un comprimido 1 Xylazyme (sustrato de xilano seco, reticulado, Megazyme, bray, Irlanda) a la solución de enzima en un volumen de reacción de 1 mi. A un tiempo = 15 minutos finaliza la reacción al agregar 10 mi de TRIS 2%/NaOH, pH 12. Se preparan testigos utilizando 100 µ? de amortiguador en vez de solución de enzima. La mezcla de reacción se centrifuga (1500 x g, 10 minutos, 20 °C) y se mide la DO del sobrenadante a 590 nm. Una unidad de xilanasa (XU) se define como la actividad de xilanasa que incrementa la DO590 en 0.025 por minuto.

El sustrato utilizado en el análisis anterior (arabinoxilano reticulado y secado extraído de trigo) es un buen aproximado para el sustrato correspondiente en aplicaciones comerciales.

Las enzimas además se pueden clasificar en base en el manual Enzyme Nomenclature from NC-IUBMB, 1992) , véase el sitio ENZYME en Internet: http://www.expasy.ch/enzyme/. ENZYME es un depositario de información en relación a la nomenclatura de enzimas. Se basa principalmente en las recomendaciones de la Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB) y describe cada tipo de enzima caracterizada para las cuales se ha proporcionado un número EC (Enzyme Commission) (Bairoch A. The ENZYME datábase, 2000, Nucleic Acids res 28:304-305). Esta nomenclatura de enzimas de IUB-MB se basa en su especificidad de sustrato y ocasionalmente en su mecanismo molecular; la clasificación no refleja los rasgos estructurales de estas enzimas.

En un aspecto de la invención, la xilanasa es una enzima clasificada como EC 3.2.1.8. El nombre oficial es endo-1, 4^-xilanasa. El nombre sistemático es 1, 4- -D-xilano xilanohidrolasa . Se pueden utilizar otros nombres tales como endo- (1-4) -ß-xilanasa; (1-4) -ß-xilano 4 -xilanohidrolasa; endo-1, 4 -xilanasa; xilanasa; ß- 1 , 4 -xilanasa; endo-1 , 4 -xilanasa,- endo- -1,4 -xilanasa; endo-1, 4^-D-xilanasa; l,4^-xilano xilanohidrolasa; ß-xilanasa; p-l,4-xilano xilanohidrolasa; endo-1, 4-p-xilanasa; ß-D-xilanasa . La reacción catalizada por la endohidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß-D-xilosídicos en xilanos.

Otra clasificación de algunas enzimas glucósido hidrolasa tales como endoglucanasa, xilanasa, galactanasa, mananasa, dextranasa y a-galactosidasa, en familias basadas en similitudes de secuencia de aminoácidos se ha propuesto hace algunos años . Actualmente se encuentran en noventa familias diferentes: véase el sitio de internet CAZy(ModO) (Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-Active Enzymes server at : http : //afmb . cnrs-mrs . fr/~cazy/CAZY/index . html (documentos correspondientes: Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrateactive enzymes: an integrated datábase approach. En "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering" , HJ. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds . , The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12; Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated datábase approach. En "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation"., K. Ohmya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokio, pp. 15-23).

En un aspecto de la invención, la xilanasa de la invención es una xilanasa de la familia 11 de glucósido hidrolasa (GH) . El término "familia 11 de glucósido hidrolasa (GH) " significa que la xilanasa en cuestión es o se puede clasificar en la familia 11 de GH.

Debe entenderse que las búsquedas de similitud de proteína (como ProteinBlast en por ejemplo, http://toolkit.tuebingen.mpg.de/prot_blast) pueden no necesariamente determinar si una secuencia desconocida en realidad se encuentra bajo el término de un miembro de la familia xilanasa GH11. Las secuencias de proteínas encontradas utilizando la búsqueda blast pueden tener una identidad/homología relativamente alta y aún así no ser en realidad xilanasas, y además, pueden no ser xilanasas que pertenezcan a GH11. De manera alternativa, las secuencias de proteína pueden tener una identidad de secuencia de aminoácido primario relativamente baja y aún así ser miembros de la familia xilanasa GH11. Para determinar si una secuencia de proteína desconocida en realidad es una proteíná xilanasa dentro de la familia GH11, la evaluación se deberá realizar no sólo en cuanto a similitud de secuencia sino también en similitud de estructura tridimensional, dado que la clasificación dentro de las familias GH se basan en el plegamiento tridimensional. Un programa que predecirá eL plegamiento tridimensional de una secuencia de proteína desconocida es HHpred (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred). La capacidad de este programa para predicción de estructura de proteína "se basa en identificación de secuencias homologas con estructuras conocidas que van a ser utilizadas como plantilla. Esto funciona también debido a que las estructuras divergen mucho más lentamente que las secuencias primarias. Las proteínas de la misma familia pueden tener estructuras muy similares incluso cuando sus secuencias presenten divergencias más allá del reconocimiento.

En la práctica, una secuencia desconocida se puede plegar dentro del programa (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred) en formato FASTA. Al hacer esto, la búsqueda se puede enviar. La salida de la búsqueda mostrará una lista de secuencias con estructuras tridimensionales conocidas. Para confirmar que la secuencia desconocida en realidad es una xilanasa GH11, se deben encontrar xilanasas GH11 dentro de la lista de homólogos que tengan una probabilidad de > 90. No todas las proteínas identificadas como homólogos se caracterizarán como xilanasas GH11, pero algunas sí. Estas últimas proteínas son proteínas con una estructura conocida y caracterización bioquímica que las identifica como xilanasas. Las primeras no han sido caracterizadas bioquímicamente como xilanasas GH11. Varias referencias describen este procedimiento, tal como Sóding J. (2005) Protein homology detection by HMM-HMM comparison. Bioinformatics 21, 951-960 (doi : 10.1093/bioinformatics/btil25) y Sóding J, Biegert A, y Lupas A . (2005) The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction. Nucleic Acids Research 33, W244--W248 (Web Server issue) (doi:10.1093/nar/gki40) .

De acuerdo con el sitio Cazy(ModO), las glucósido hidrolasa de la familia 11 se pueden caracterizar como sigue: Actividades conocidas (xilanasa (EC 3.2.1.8) Mecanismo: Retención Nucleófilo/base catalítica: Glu (experimental) Donador de protón catalítico: Glu (experimental) Estado de estructura tridimensional: Plegamiento de rollo ß-jelly.

Clan: GH-C Como se utiliza en la presente, "Clan C" se refiere a agrupamientos de familias los cuales comparten un plegamiento tridimensional común y una máquina catalítica idéntica (véase, por ejemplo, Henrissat, B. and Bairoch, A., (1996) Biochem. J. , 315, 695-696).

Como se utiliza en la presente, la "Familia 11" se refiere a una familia de enzimas como se establece en Henrissat y Bairoch (1993) Biochem J. , 293, 781-788 (véase también, Henrissat y Davies (1997) Current Opinión in Structural Biol . 1997, &.- 637-64 ) . Los rasgos comunes para los miembros de la familia 11 incluyen alta homología genética, un tamaño de aproximadamente 20 kDa y un mecanismo catalítico de desplazamiento doble (véase Tenkanen et al., 1992; Wakarchuk et al., 1994). La estructura de las xilanasas de la familia 11 incluyen dos láminas ß-grandes elaboradas de cadenas ß y hélices OÍ.

Las xilanasas de la familia 11 incluyen pero no se limitan a las siguientes: XynA de Aspergillus niger, XynC de Aspergillus kawachii, XynA de Aspergillus tubigensis, XynA de Bacillus circulans, XynA de Bacillus punzilus, XynA de subtilis de Bacillus, XynA de Neocalliniastix patriciarum, XynB de Streptomyces lividans, XynC de Streptomyces lividans, Xynll de Streptomyces therinoviolaceus, XynA de Thermomonospora fusca, Xyn de Trichoderma harzianum, Xynl de Tychoder a reesei, Xynll de Trichoderma reesei y Xin de Trichodermaviride .

Como se utiliza en la presente, el término "natural" se refiere a una secuencia o una proteína que es nativa o que se encuentra de manera natural.

En otra modalidad particular, la xilanasa de la invención se deriva de una xilanasa bacteriana tal como a partir de una bacteria de (i) el filo de Firmicutes; (ii) la clase de Bacilli; (iii) el orden de Bacillales; (iv) la familia de Paenibacillaceae; o (v) el género de Paenibacillus; incluso de manera más preferible a partir de una bacteria (vi) las especies de Paenibacillus pabuli, Paenibacillus polymyxa o Paenibacillus sp . ; de manera más preferible a partir de las cepas (vii) de Paenibacillus pabuli o Paenibacillus polymyxa.

La expresión "xilanasa derivada de una xilanasa bacteriana" como se utiliza en la presente incluye cualquier aislado de xilanasa natural de la bacteria en cuestión así como variantes o fragmentos de los mismos los cuales retienen actividad de xilanasa.

En una modalidad particular adicional, la xilanasa de la invención se deriva de una xilanasa micótica.

La definición anterior de "derivado de" (en el contexto de xilanasas bacterianas) es aplicable por analogía también a xilanasas micóticas.

Los ejemplos de xilanasas micóticas de glucósido hidrolasa de la familia 11 son aquellas que se derivan de los siguientes géneros micóticos: Aspergillus, Auerobasidium, Ewericella, Fusarium, Gaeumannomyces, Humicola, Lentinula, Magnaporthe, Neocallimastix, Nocardiopsis, Orpinomyces, Paecilomyces, Penicillium, Pichia, Schizophyllum, Talaromyces, Thermomyces, Trichoderma.

Las xilanasas micóticas incluyen xilanasas de levaduras y hongos filamentosos. En modalidades preferidas, la xilanasa se deriva de un hongo de (i) el filo de Ascomicota; (ii) la clase de Pezyzomycotina; (iii) el orden de Eurotiomycetes; (iv) el suborden de Eurotiales,- (v) la familia de Trichocomaceae, preferiblemente el trichocomaceae mitospórico; incluso de manera más preferible de un hongo de (vi) el género Aspergillus; de manera más preferible (vii) cepas de Aspergillus niger. Se entenderá que la definición de las especies mencionadas antes incluyen tanto estados perfectos como imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo anamórficos, sin importar el nombre de la especie mediante el cual se le conoce. Los expertos en el ámbito reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados.

Las cepas de las bacterias y hongos mencionados antes son accesibles fácilmente al público en varias colecciones de cultivos tales como La Colección Americana de Cultivos Tipo ATCC, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) , y la Colección de Cultivos de Patentes del Servicio de Investigación Agrícola del Centro Regional de Investigación del Norte (NRRL) .

Las preguntas en relación a la taxonomía se pueden resolver al consultar una base de datos de taxonomía tal como el Explorador de Taxonomía NCBI, el cual está disponible en el siguiente sitio de Internet: http : //www. ncbi . nlm . nih . gov/Taxonomy/taxonomyhome . html/ . No obstante, preferiblemente la referencia es a los siguientes libros de texto: Dictionary of the Fungí, novena edición, editado por Kirk, P.M. , P. F. Cannon, J. C. David & J.A. Stalpers, CAB Publishing, 2001; y . Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Segunda edición (2005) .

La presente invención se relaciona con una o varias modificaciones en algunas de una o varias posiciones de aminoácidos . Estas posiciones se incluyen con referencia a la secuencia de aminoácidos de B. subtilis que se muestra como la SEC ID NO: 1. En la presente invención, los polipéptidos con actividad de xilanasa tienen una modificación por lo menos en una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 12 y 13; yuna o más modificaciones adicionales de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179 en comparación con la secuencia de B. subtilis que se muestra como la SEC ID NO: 1. Las posiciones equivalentes en otras xilanasas de la familia 11 se pueden encontrar al alinear otras xilanasas de la familia 11 con la SEC ID NO: 1 y determinar cual aminoácido se alinea con el aminoácido específico de la SEC ID NO: 1. Tal alineación y el uso de una secuencia como una primera referencia simplemente es materia de rutina para una persona habitualmente experta en el ámbito .

En un aspecto, una xilanasa variante de acuerdo con la invención que tiene una actividad de solubilización de salvado mejorada la cual es mayor que la que se puede obtener mediante el uso de una xilanasa natural correspondiente o cualquier xilanasa que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID. OS: .-1-22 medida en un "análisis de solubilización de salvado" .

En un aspecto, la xilanasa de acuerdo con la invención tiene una actividad mejorada de solubilización de salvado como resultado de la modificación en una posición que se selecciona de: 12 y 13; en combinación con una o más modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179.

De manera adecuada, la actividad de solubilización de salvado de xilanasa se puede medir utilizando en análisis de solubilización de salvado que se proporciona en la presente. Así, los polipéptidos que tienen actividad de xilanasa .aumentada y/o actividad solubilizante de salvado aumentada se pueden proporcionar. El requerimiento para especificidad hacia el WU-AX es cada vez mayor y más importante dado que muchas aplicaciones están utilizando una concentración elevada de salvado de cereal. La industria de elaboración de masa incrementa la concentración de salvado en muchos productos debido a las preocupaciones de salud y nutricionales , la industria de los alimentos incorpora cantidades cada vez mayores de material de salvado (fibra, granos secados de destilados con materiales solubles (DDGS) ) debido al uso del cereal en la producción de bioetanol por ejemplo. Por lo tanto, resulta útil proporcionar xilanasas nuevas con especificidad aumentada y por lp tanto eficacia para solubilizar este material de salvado.

ANALISIS DE SOLUBILIZACION DE SALVADO Preferiblemente, la solubilidad de salvado se mide utilizando el siguiente análisis. 100 Se prepara una suspensión de salvado de trigo en (0.1 M) amortiguador de fosfato ácido disódico (0.2 ) , pH 5.0 a una concentración de 1.33% de salvado (p/p) . A partir de esta suspensión se transfieren alícuotas de 750 µ? a tubos Eppendorf bajo agitación. Cada tubo de sustrato se precalienta durante 5 minutos a 40°C. A esto se le agregan 250 µ? de solución de enzima lo que constituye la concentración final del sustrato en 1%. Se realizan a partir de cada una de las xilanasas tres diluciones (por duplicado) con concentración de enzima cada vez mayor (0.33, 1.0 y 3.0 g de xilanasa/gramo de salvado) para cada tiempo de determinación (0, 30, 60 y 240 minutos) . Como un testigo se utiliza una solución desnaturalizada por calor de la xilanasa. La reacción se considera finalizada en los tiempos dados, por transferencia de los tubos a un incubador ajustado a 95°C. Las muestras desnaturalizadas por calor se mantienen a 4°C hasta que todas las reacciones de enzima finalizan.

Cuando todas las reacciones de enzima han finalizado, los tubos Eppendorf se centrifugan para obtener un sobrenadante claro. La capacidad de las enzimas para solubilizar salvado se expresa como el incremento en reducción de los grupos de extremo, determinado mediante la utilización de PAHBAH (Lever, 1972) .

Dado que las actividades laterales, tal como la actividad de amilasa pueden interferir con el análisis anterior, el análisis de solubilización de salvado únicamente se debe llevar a cabo sobre muestras de xilanasa purificada (véase ejemplo 2) .

En un aspecto, la xilanasa de acuerdo con la invención tiene una sensibilidad reducida a un inhibidor de xilanasa en comparación con cualquiera de una xilanasa natural, o cualquier otra xilanasa que comprenda una secuencia de aminoácidos que se selecciona de las SEC ID NOS: 1-22.

En un aspecto adicional, la xilanasa de acuerdo con la invención tiene sensibilidad reducida a un inhibidor de xilanasa como un resultado de la modificación en una posición que se selecciona de: 12 y 13; en combinación con una o más modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179. 104 El inhibidor puede ser un inhibidor que se encuentra de manera natural en tejidos vegetales.

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "inhibidor de xilanasa" se refiere a un compuesto, típicamente una proteína cuyo papel es controlar la despolimerización de carbohidratos complejos, tales como arabinoxilano, que se encuentran en las paredes de células vegetales. Estos inhibidores de xilanasa son capaces de reducir la actividad de enzimas de xilanasa como se encuentran de manera natural así como aquellas de origen micótico o bacteriano. Aunque se ha reportado la presencia de inhibidores de xilanasa en semillas de cereal (véase, por ejemplo, McLauchlan et al 1999a; Rouau y Suget 1998) .

McLauchlan et al (1999a) describen el aislamiento y caracterización de una proteína a partir de trigo que se une e inhibe dos xilanasas de la familia 11. De igual manera, el documento O 98/49278 demuestra el efecto del extracto de harina de trigo sobre la actividad de un grupo de xilanasas microbianas, la totalidad de las cuales se clasifican como» xilanasas de la familia 11. Debyser et al., (1999) también describe que las endoxilanasas de Aspergillus niger y Bacillus subtilis, las cuales son ambos miembros de las xilanasas de la familia 11 se inhiben por el inhibidor de xilanasa de trigo denominado TAXI. McLauchlan et al (1999b) describen que los extractos de harinas comerciales tales como trigo, cebada, centeno y maíz son capaces de inhibir xilanasas tanto de la familia 10 como de la familia 11.

El inhibidor . de xilanasa puede ser cualquier inhibidor de xilanasa adecuado. A modo de ejemplo, el inhibidor de xilanasa puede ser el inhibidor descrito en WO-A-98/49278 y/o el inhibidor de xilanasa descrito por Rouau, X. y Surget, A. (1998) , McLauchlan, R. , et al. (1999) y/o el inhibidor de xilanasa descrito en la solicitud de patente del Reino Unido número 9828599.2 (presentada el 23 de diciembre de 1998) , la solicitud de patente del Reino Unido número 9907805.7 (presentada el 6 de abril de 1999) y la solicitud de patente del Reino Unido número 9908645.6 (presentada el 15 de abril de 1999) .

Los inhibidores descritos en la técnica anterior también se pueden utilizar en análisis para determinar la sensibilidad de un polipéptido variante de la invención a inhibidores de xilanasa. También se pueden utilizar como se describe en lo siguiente para modular la funcionalidad de una xilanasa .

ANALISIS DE INHIBIDOR DE XILANASA Preferiblemente, la actividad de inhibición de xilanasa se mide utilizando el siguiente análisis.

Se mezclan 100 µ? de preparación de inhibidor (que contiene diversas concentraciones de inhibidor de xilanasa (para cuantificación véase la cuantificación de inhibidor de xilanasa, más adelante) ) , 250 µ? de solución de xilanasa (que contiene 12 XU de xilanasa/ml) y 650 µ? de amortiguador (amor iguador de ácido cítrico 0.1 M-fosfato ácido disódico 0.2 M, BSA 1% (Sigma-Aldrich, Estados Unidos), pH 5.0). La mezcla se termoestablece durante 5 minutos a 40.0°C. A un tiempo = 5 minutos se agrega una tableta de Xylazyme. En un tiempo = 15 minutos de finaliza la reacción al agregar 10 mi de 2% de TRIS/NaOH, pH 12. La mezcla de reacción se centrifuga (1500 x g, 10 minutos, 20°C) y el sobrenadante se mide a 590 nm. Se calcula la inhibición de xilanasa como actividad residual en % en comparación con el testigo.

El inhibidor endo- ß -1 , 4 -xilanasa endógeno utilizado se puede obtener de harina de trigo. El inhibidor es un dipéptido que tiene un peso molecular (MW) de aproximadamente 40 kDa (medido por SDS-PAGE o espectrometría de masas) y un pl de aproximadamente 8 a aproximadamente 9.5. El análisis de secuencia hasta ahora ha mostrado que el inhibidor tiene una secuencia que se presenta como la SEC ID NO: 24 o es altamente homologa a esta.

Se puede encontrar en el ejemplo 3 un método para cuantificar la concentración de inhibidor en una preparación de inhibidor dada.

Los testigos se preparan de la misma manera pero sustituyendo la solución de inhibidor con agua.

La presente invención también se relaciona con secuencias nucleotídicas que codifican para un polipéptido de acuerdo con la invención que comprende una secuencia nucleotídica unida operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Un polinucleótido que codifica por un polipéptido de la presente invención se puede manipular de diversas maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de los polinucleótidos antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Son bien conocidas en el ámbito las técnicas para modificar secuencias de polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante .

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia nucleotídica la cual es reconocida por una célula hospedadora para expresión de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales las cuales median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia nucleotídica la cual muestra actividad transcripcional en la célula hospedadora de elección que incluye promotores mutantes, truncados e híbridos y se puede obtener de genes que codifican para polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula hospedadora.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de construcción de ácido nucleico de la presente invención, especialmente en una célula hospedadora bacteriana son los promotores que se obtienen del operón lac de E. coli, el gen para agarasa (dagA) , de Streptomyces coelicolor, el gen para levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, el gen para -amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, el gen para amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, el gen para -amilasa de Bacillus amyloliquefaciens, el gen para penicilinasa (penP) de Bacillus licheniformis, los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis y el gen para ß-lactamasa procariótico (Villa-Kamaroff et al., 1978, Procedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25) . Los promotores adicionales se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora micótica filamentosa son promotores que se obtienen de los genes de amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la a-amilasa neutra de Aspergillus niger, la a-amilasa estable al ácido de Aspergillus niger, la glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, la acetamidasa de Aspergillus nidulans, la amiloglucosidasa de Fusarium venenatu (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900) , proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), ß-glucosidasa de Trichoderma reseei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reseei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reseei, endoglucanasa I de Trichoderma reseei, endoglucanasa II de Trichoderma reseei, endoglucanasa III de Trichoderma reseei, endoglucanasa IV de Trichoderma reseei, endoglucanasa V de Trichoderma reseei, xilanasa I de Trichoderma reseei, xilanasa II de Trichoderma reseei, ß-xilosidasa de Trichoderma reseei así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes de a-amilasa neutra de Aspergillus niger y tiosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae) ; y mutantes, formas truncadas y promotores híbridos de los mismos.

En un hospedador de levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes de enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cereyisiae, galactocinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa ( PI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotionina (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae y 3 - fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para células hospedadoras de levadura se describe por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula hospedadora para finalizar la transcripción. La secuencia terminadora está unida operablemente a la parte 3 ' terminal de la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido. Cualquier terminador el cual sea funcional en la célula hospedadora de elección se puede utilizar en la presente invención.

Los terminadores para células hospedadoras de hongos filamentosos se pueden obtener de los genes de amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, a-glucosidasa de Aspergillus niger y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum. Los terminadores para células hospedadoras de levadura se pueden obtener a partir de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células hospedadoras de levadura se describen por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm el cual es importante para traducción por la célula hospedadora. La secuencia líder está unida operablemente a la parte 51 terminal de la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido. Cualquier secuencia líder que es funcional en la ' célula hospedadora de elección se puede utilizar en la presente invención.

Los líderes para células hospedadoras micóticas filamentosas se pueden obtener de los genes de amilasa TAKA de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans .

Los líderes adecuados para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3 - fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae .

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia unida operablemente a la parte 31 terminal de la secuencia nucleotídica la cual, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedadora como una señal para agregar residuos poliadenosina al AR m transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación la cual sea funcional en la célula-hospedadora de elección se puede utilizar en la presente invención .

Las secuencias de poliadenilación para células hospedadoras de hongos filamentosos se pueden obtener de los genes para amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Apergillus nidulans, proteasa similar a tripsina de Fusariu oxysporum y a-glucosidasa de Aspergillus niger.

Las secuencias de poliadenilación útiles para células hospedadoras de levadura se describen por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una región codificante para un péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos unida a la parte amino terminal de un polipéptido y que dirige al polipéptido codificado a la vía secretora de las células. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia nucleotídica puede contener de manera inherente una región codificante de péptido señal unido de manera natural en un marco de lectura de traducción dentro del segmento de la región codificante el cual codifica para el polipéptido secretado. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal la cual es extraña a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal extraño se puede requerir cuando la secuencia codificante no contiene de manera natural una región codificante de péptido señal. De manera alternativa, la región codificante de péptido señal extraña simplemente puede sustituir a la región codificante de péptido señal natural con el fin de incrementar la secreción del polipéptido. No obstante, se puede utilizar en la presente invención cualquier región codificante de péptido señal la cual dirija el polipéptido expresado a la vía secretora de una célula hospedadora de elección, es decir, para que sea secretada al medio de cultivo.

Las regiones codificantes de péptido señal eficaces para células hospedadoras bacterianas son las regiones codificantes de péptido señal que se obtienen de los genes de amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, a-amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, ß-lactamasa de Bacillus lic eniformis, proteasas neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermopilus y prsA de Bacillus subtilis . Los péptidos señal adicionales se describen en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Las regiones codificantes de péptido señal eficaces para células hospedadoras de hongos filamentosos son las regiones codificantes de péptido señal que se obtienen de los genes de amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizo ucor miehei, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, y lipasa de Humicola lanuginosa.

Los péptidos señal útiles para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes del factor a de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae . Otras regiones codificantes de péptido señal útiles se describen por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una región codificante polipeptidica que codifique para una secuencia de aminoácidos colocada en la parte amino terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o, en algunos casos, como zimógeno) . Un propolipéptido generalmente es inactivo y se puede convertir a un polipéptido activo maduro por separación catalítica o autocatalítica del péptido a partir del propolipéptido. La región codificante para propéptido se puede obtener de genes de proteasa alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, proteasa neutra (nprF) de Bacillus subtilis, factor a de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor meihei y lacasa de Myceliophtora. thermophila (WO 95/33836) .

Cuando están presentes ambas regiones, de péptido y propéptido en la parte amino terminal de un polipéptido, la región del propéptido se coloca cercana a la parte amino terminal de un polipéptido y la región de péptido señal se coloca cercana a la parte amino terminal de la región de propéptido .

También puede ser deseable agregar secuencias reguladoras las cuales permiten la regulación de la expresión del polipéptido en relación al crecimiento de la célula hospedadora. Los ejemplos de sistema reguladores son aquellos los cuales provocan la expresión del gen que va a ser activado o desactivado en respuesta a un estímulo químico o físico que incluye la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tec y tip. En levadura se puede utilizar el sistema ADH2 o GAL1. En hongos filamentosos, el promotor -amilasa TAKA, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae se pueden utilizar como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas las cuales permiten la amplificación de genes. En sistemas eucarióticos estos incluyen el gen para dihidrofolato reductasa el cual se amplifica en presencia de metotrexato y los genes para metalotioneína los cuales se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido puede estar unida operablemente con la secuencia reguladora.

La presente invención también se relaciona con vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucle .tido que codifica para el polipéptido de la presente invención, un promotor y señales de detención transcripcionales y traduccionales . Los diversos ácidos nucleicos y las secuencias de control descritas en la presente se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante el cual puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido en estos sitios. De manera alternativa, una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de la presente invención se puede expresar al insertar la secuencia nucleotídica o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia en un vector apropiado para expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de manera que la secuencia codificante se une operablemente con las secuencias de control apropiadas para expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo un plásmido o virus) el cual se puede someter adecuadamente a procedimientos de ADN recombinantes y puede llevar a cabo la expresión de la secuencia nucleotídica. La selección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la cual se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados.

Los vectores pueden ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector el cual existe como una- entidad-extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De manera alternativa, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas en los cuales se ha integrado. Además, se puede utilizar un vector único a un plásmido o dos o más vectores o plásmidos los cuales juntos contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora o un transposón .

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables los cuales permiten la selección fácil de las células transformadas, transíectadas , transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocida o resistencia a virus, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos y similares.

Los ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis o marcadores los cuales confían en resistencia a antibióticos tales como resistencia a ampicilina, kanamicina, cloramfenicol o tetraciclina . Los marcadores adecuados para células hospedadoras de levadura son ADE2 , HIS3, LEU2 , LYS2 , MET3 , TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para uso en células hospedadoras de hongos filamentosos incluyen, pero no se limitan a amdS (acetamidasa) , argB (ornitina carbamoiltransíerasa) , bar (fosfinotricina acetiltransferasa) , hph (higromicina fosfonotransferasa) , niaD (nitrato reductasa) , pyrG (orotidina-51 -fosfato descarboxilasa) , sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa) así como equivalentes de los mismos. En algunas modalidades, los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces higroscopicus se utilizan en una célula de Aspergillus .

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o varios elementos que permiten la integración del vector en el genoma de las células hospedadoras o la replicación autónoma del vector en la célula, independiente del genoma. Para integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector se puede basar en la secuencia de polinucleótidos que codifica para el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para integración en el genoma por recombinación homologa o no homologa. De manera alternativa, el vector puede contener secuencias nucleotídicas adicionales para dirigir la integración por recombinación homologa en el genoma de la célula hospedadora en uno o varios lugares precisos en uno o varios de los cromosomas. Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración preferiblemente deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, por ejemplo 100 a 10,000 pares de bases, preferiblemente 400 a 10,000 pares de bases y de manera más preferible 800 a 10,000 pares de bases las cuales tienen un alto grado de identidad con la secuencia objetivo correspondiente para incrementar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia objetivo en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias nucleotídicas no codificantes o codificantes. Por otra parte, el vector se puede integrar en el genoma de la célula hospedadora por recombinación no homologa. Para replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie la replicación autónoma la cual funcione en una célula. Los términos "origen de replicación" o "replicador plasmídico" se definen en la presente como una secuencia nucleotídica que permite que un plásmido o vector se replique in. vivo.

Los ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184, que permiten la replicación en E. coli y pUBl 10, pE194, pTA1060 y ???ß?, que permiten la replicación en Bacillus .

Los ejemplos de orígenes de replicación para uso en células hospedadoras de levadura son el origen de replicación 2 micrón, ARS1, ARS4 , la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6.

Los ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15:9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 00/24883.

Se pueden insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en la célula hospedadora para incrementar la producción del producto del gen. Un incremento en el número de copias del polinucleótido se puede obtener al integrar por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o al incluir un gen marcador seleccionadle amplificable con el polinucleótido cuando las células contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionadle y de esta manera las copias adicionales del polinucleótido se pueden seleccionar al cultivar las células en presencia de un agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos en lo anterior para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por una persona experta en el ámbito (véase, por ejemplo Sambrook et al., 1989, supra) .

La presente invención también se relaciona con células hospedadoras recombinantes, que comprenden un polinucleótido que codifica para el polipéptido de la presente invención los cuales se utilizan venta osamente en la producción recombinante de los polipéptidos . Un vector que comprende un polinucleótido que codifica para el polipéptido de la presente invención se introduce en una célula hospedadora de manera que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante, como se describe anteriormente. El término "célula hospedadora" abarca cualquier descendencia de una célula de origen que no sea idéntico a la célula de origen debido a mutaciones que se presentan durante la replicación. La selección de una célula hospedadora en gran medida dependerá del gen que codifica para el polipéptido y su fuente.

La célula hospedadora puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo un procariote o un microorganismo no unicelular, · por ejemplo un eucariote . Los microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias grampositivas que incluyen pero que no se limitan a células de Bacillus , por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens. Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis ; o una célula de Streptomyces , por ejemplo, Streptomyces lividans y Streptomyces murinus , a bacterias gramnegativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En un aspecto, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis . En otro aspecto, la célula de Bacillus es Bacillus alkalophilic . La introducción de un vector en una célula hospedadora bacteriana se puede llevar a cabo, por ejemplo, por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohén, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115) , utilizando células competentes (véase, por ejemplo Young y Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829 o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (véase, por ejemplo Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751), o conjugación (véase, por ejemplo Koehler y Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278) .

La célula hospedadora también puede ser una eucariota tal como una célula de mamífero, de insecto, de planta o de hongo.

En un aspecto, la célula hospedadora es una célula de hongo. Como se utiliza en la presente "hongo" (Fungi) incluye los fila Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota (como se definen por Hawksworth et al., In, Ainsworth y Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) así como los Oomycota (como se mencionan en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra). En otro aspecto, las células hospedadoras micóticas son células de levadura. De la manera en que se utiliza en la presente, el término "levadura" incluye levaduras ascosporógenas (endomicetales) , levaduras basidioesporogenas y levaduras que pertenecen a los hongos imperfectos (Blastomycetes) . Dado que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, para propósitos de esta invención levadura se definirá como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A. , Passmore, S. M., y Davenport, R.R., eds, Soc . App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

En un aspecto adicional, la célula hospedadora de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

En un aspecto particular, la célula hospedadora de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces . cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto, la célula hospedadora de levadura es una célula de iluyveromyces lactis. En otro aspecto, la célula hospedadora de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

En otro aspecto, la célula hospedadora de hongos es una célula de hongo filamentoso. El término "hongos filamentosos" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., 1995, supra) . Los hongos filamentosos generalmente están caracterizados por pared micelial constituida de quitina, celulosa, glucano, quitosana, mañano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento de hifas y el catabolismo de carbono es aeróbico obligatorio. En contraste, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por gemación de un tallo unicelular y el metabolismo de carbono puede ser fermentativo.

En otro aspecto, la célula hospedadora micótica filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasldium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Hu icola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilo yces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderm .

En otro aspecto, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otro aspecto, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium colmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporu , Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochrou , Fusarium sprotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum. En otro aspecto, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Hu icola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride . Las células micóticas se pueden transformar por un procedimiento que involucra formación de protoplasto, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida por sí misma. Los procedimientos adecuados para transformación de células hospedadoras de Aspergillus ? Trichoderma se describen en el documento EP 238 023 y en Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Los métodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y WO 96/00787. Las levaduras se pueden transformar utilizando los procedimientos descritos en Becker y Guarente, En Abelson, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Acaderay of Sciences EUA 75; 1920.

La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende: (a) cultivar una célula, la cual está en forma natural, es capaz de producir el polipéptido bajo condiciones que llevan a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. Preferiblemente, la célula es del género Aspergillus y de manera más preferible Aspergillus fumigatus.

La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende: (a) cultivar una célula hospedadora bajo condiciones que llevan a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos bien conocidos en el ámbito. Por ejemplo, la célula se puede cultivar en un cultivo de matraz de agitación y fermentación a pequeña escala o a gran escala (que incluye fermentaciones continua, por lotes, de alimentación por lotes o en estado sólido) en termentadores de laboratorio o industriales que funcionan en un medio adecuado bajo condiciones que permiten que el polipéptido se exprese y/o aisle. El cultivo se lleva a cabo en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en el ámbito. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales y se pueden preparar de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo en catálogos de American Type Culture Collection) . Si el polipéptido es secretado en el medio nutritivo, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado al medio, se puede recuperar de lisados de células.

Los polipéptidos se pueden detectar utilizando métodos conocidos en el ámbito que sean específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto de enzima o la desaparición de un sustrato de enzima.

Por ejemplo, se puede utilizar un análisis de enzima para determinar la actividad del polipéptido como se describe en la presente.

El polipéptido resultante se puede recuperar utilizando métodos conocidos en el ámbito. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutriente por procedimientos convencionales que incluyen, pero que no se limitan a centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación. Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por una diversidad de procedimientos conocidos en el ámbito que incluyen, pero que no se limitan a cromatografía (por ejemplo intercambio de iones, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y exclusión de tamaño) , procedimientos electroforéticos (por ejemplo enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo precipitación con sulfato de amonio) , SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.

En un aspecto, por lo menos una, tal como dos, tal como tres, tal como cuatro modificaciones de aminoácido son sustituciones de aminoácidos.

En un aspecto, todas las modificaciones de aminoácidos en el polipéptido de acuerdo con la invención son sustituciones de aminoácidos.

En un aspecto, por lo menos uno, tal como dos, tal como tres, tal como cuatro modificaciones de aminoácidos son una supresión de aminoácidos.

En un aspecto, todas las modificaciones de aminoácidos en el polipéptido de acuerdo con la invención son supresiones de aminoácidos.

En un aspecto, por lo menos uno, tal como dos, tal como tres, tal como cuatro modificaciones de aminoácidos son una inserción de aminoácidos.

En un aspecto, todas las modificaciones de aminoácidos en el polipéptido de acuerdo con la invención son inserciones de aminoácidos.

En algunas modalidades, la identidad de secuencia del polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención se mide en relación a la SEC ID NO: 1, en donde la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 1 comprende además una secuencia de péptido señal tal como su secuencia de péptido señal natural.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B . subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: 12F, 13Y, 15Y, 34K, 54Q, 54W, 77V, 77M, 77Y, 77L, 77S, 811, 821, 99Y, 104W, 110A, 113D, 113A, 114F, 114D, 114Y, 118V, 122F, 122D, 141Q, 154R, 159D, 162E, 162D, 164F, 166F, 175L, 175K, 175E, 175Y y 179Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: G12F, G13Y, I15Y, G34K, N54Q, I77V, I77M, I177Y, I77L, I77S, V81I, K99Y, T104W, T110A, Y113D, Y113A, N114F, N114D, N114Y, I118V, R122F, R122D, N141Q, , K154R, N159D, S162E, S162D, 164F, Y166F, Q175L, Q175K, Q175E, Q175Y y S179Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de conformidad con la invención tiene por lo menos 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 ó 95% de identidad con la secuencia con la cual tiene el porcentaje más grande de identidad seleccionado en las SEC ID NO: 1-22. 168 En algunas modalidades, el polipéptido de acuerdo con la invención tiene un plegamiento enrollado ß-jelly.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido en donde una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de 12 y 13 es una sustitución de aminoácidos.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido en donde la modificación de aminoácido en la posición 12 es una sustitución de aminoácido con cualquiera de un residuo aminoácido diferente que se selecciona del grupo que consiste de: isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, cisteína, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptofano, valina, prolina, serina, tirosina, arginina e histidina .

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido en donde la modificación de aminoácido en la posición 13 es una sustitución de aminoácido con cualquiera de un residuo aminoácido diferente que se selecciona del grupo que consiste de: isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, cisteína, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptofano, valina, prolina, serina, tirosina, arginina e histidina .

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido en donde la modificación de aminoácido en la posición 12 es una sustitución con cualquiera de los residuos aminoácidos diferentes que se seleccionan del grupo que consiste de: fenilalanina y tirosina.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido en donde la modificación de aminoácido en la posición 13 es una sustitución con cualquiera de los residuos aminoácidos diferentes que se seleccionan del grupo que consiste de: fenilalanina y tirosina.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene un número total de aminoácidos menor de 250, por ejemplo menor de 240, por ejemplo menor de 230, por ejemplo menor de 220, por ejemplo menor de 210, por ejemplo menor de 200 aminoácidos por ejemplo en el intervalo de 160 a 240, por ejemplo en el intervalo de 160 a 220 aminoácidos.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o más modificaciones en cualquiera de una o más posiciones de aminoácidos: 12, 13, 34, 77, 81, 99, 104, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 y 175, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo de: 12F, 13Y, 13F, 110A, 122D, 113A, 13Y, 54Q, 54 , 123D, 175L, 122F, 34K, 99Y, 104W, 141Q, 154R, 159D, 175K, 811, 166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77S, 77V y 77Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B . subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo de: G12F, G13Y, G13F, N54Q, T110A, R122D, Y113A, G13Y, Y113D, Q175L, R122F, G34K, K99Y, T104W, N141Q, K154R, N159D, Q175K, V81I, Y166F, S162E, S162D, 164F, N114D, N114Y, N114F, I118V, I77L, I77M, I77S, I77V e I77Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o más modificaciones en cualquiera de una o más posiciones de aminoácidos: 12, 13, 99, 104, 110, 113, 122, 141, 154, 159 y 175, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o varias sustituciones en las posiciones de aminoácidos: 13 y 122, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID- O: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o más modificaciones en cualquiera de una o más posiciones de aminoácidos: 114 y 166, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende además una o más sustituciones en cualquiera de una o más posiciones de aminoácidos: 114 y 166, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o varias sustituciones en por lo menos cuatro de las siguientes posiciones de aminoácidos: 12, 13, 99, 104, 110, 113, 114, 122, 141, 154, 159, 166 y 175, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido de acuerdo con la invención comprende una o varias sustituciones en las posiciones de aminoácidos: 13, 113 y 122, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o varias sustituciones en las posiciones de aminoácidos: 12, 113 y 122, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o varias sustituciones en las posiciones de aminoácidos: 13, 113, 122, y 175, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: 12F, 13Y, 99Y, 104W, 110A, 113D, 114D, 114F, 122F, 154R, 159D, 166F, 175K y 175L, una o Varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido tiene por lo menos cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos en comparación co la secuencia seleccionada de entre la SEC ID NO: 1-22 con la cual tiene la identidad más grande.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es un polipéptido en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido tiene por lo menos nueve o diez sustituciones de aminoácidos .

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene actividad de solubilización de salvado.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención está en forma aislada.

El término "aislado", como se utiliza en la presente, significa que el polipéptido está por lo menos sustancialmente libre de por lo menos otro componente adicional con el cual la secuencia se asocia de manera natural en la naturaleza.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una actividad de xilanasa mejorada en comparación con la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1, medida en un análisis de actividad de xilanasa.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una actividad de xilanasa mejorada como resultado de la modificación en una posición que se selecciona de 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una actividad mejorada de solubilización de salvado en comparación con la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1 medida en un análisis de actividad de solubilización de salvado.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una actividad mejorada de solubilización de salvado como resultado de la modificación en una posición que se selecciona de 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B . subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene sensibilidad reducida a un inhibidor de xilanasa.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una secuencia de aminoácidos que comprende modificaciones en posiciones que se seleccionan de la lista que consiste de: a) 13/110/113/122/154/159/175; b) 13/99/104/110/113/122/154/159/166/175; e) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; d) 13/110/113/122/175; e) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; f) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; g) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; h) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; i) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; j) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; k) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ; 1) 13/113/122/175; m) 13/81/99/104/110/113/122/154/159/175; n) 13/110/113/122/164/175; o) 13/110/113/122/162/175; P) 13/110/113/122/175; q) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; r) 13/113/122/175; s) 12/113/122/175; t) 13/113/122/175; u) 13/34/110/113/122/175; v) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; w) 13/99/104/113/122/175 ; x) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; y) 13/99/104/110/113/118/122/154/159/175; z) 13/15/113/122/175; aa) 13/110/113/122/162/175; bb) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ; cc) 13/99/104/110/113/122/141/154/159/175; dd) 13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175; ee) 13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175; ff) 13/54/99/104/110/113/114/122/154/159/175; gg) 13/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175; y hh) 13/54/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175; una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis que se muestra como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una secuencia de aminoácidos que comprende sustituciones de aminoácidos que se seleccionan de la lista que consiste de: 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; 13Y/99Y/104 /110A/113D/122F/154R/159D/166F/ 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/ 13Y/110A/113D/122F/175L; 13Y/99Y/104 /110A/113D/122F/154R/159D/175L; 13Y/99Y/l04W/llOA/ll3D/l22F/l54R/l59Djl75K; 13Y/99Y/104 /110A/113D/114D/122F/154R/159D/ 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/ 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/ 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/ 13Y/77L/99Y/104 /110A/113D/122F/154R/159D/ 13Y/81I/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/- 13Y/81I/99Y /104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; 13Y/110A/113D/122D/175L; q) 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; r) 13F/113D/122D/175L; S) 12F/113D/122F/175L; t) 13Y/113D/122F/175L; u) 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; V) 13Y/77V/99Y/104 /110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; w) 13Y/99Y/104 /113D/122D/175L; x) 13Y/77M/99Y/104 /110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; y) 13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/ 175L; z) 13Y/15Y/113D/122D/175L; aa) 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; bb) 13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; CC) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/ 175L; dd) 13Y/54Q/99Y /104W/110A/113D/122F/141Q/154R/ 159D/175L; ee) 13Y/54 /99Y/104 /110A/113D/122F/141Q/154R/ 159D/175L; ff) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/ 159D/175L; gg) 13Y/99Y/104 /110A/113D/114F/122F/141Q/154R/ 159D/175L; y hh) 13Y/54Q/99Y/104 /110A/113D/114F/122F/141Q/ 154R/159D/175L; una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B . subtilis que se muestra como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido de acuerdo con la invención tiene una secuencia de aminoácidos la cual consiste de sustituciones de aminoácidos que se seleccionan de la lista que consiste de: a) 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; b) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/ 175L; c) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/ 175L; 13Y/110A/113D/122F/175L; 13Y/99Y/104 /110A/113D/122F/154R/159D/175L; 13Y/99Y/104 /110A/113D/122F/154R/159D/175K; 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/ 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/ 13Y/99Y /104 /110A/113D/114D/122F/154R/159D/ 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/ 13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 13Y/113D/122D/175L; 13Y/811/ 99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 13Y/110A/113D/122D/164F/175L; 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; 13Y/110A/113D/122D/175L; 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 13F/113D/122D/175L; 12F/113D/12D2/175L; 13Y/113D/122F/175L; 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; 13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 13Y/99Y/104W/113D/122D/175L; 13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 13Y/99Y/104 /110A/113D/118V/122F/154R/159D/ 13Y/15Y/113D/122D/175L; aa) 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; y bb) 13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; ce) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/ 175L; dd) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/ 159D/175L; ee) 13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/ 159D/175L; ff) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/ 159D/175L; gg) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/ 159D/175L; y hh) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/ 154R/159D/175L; una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, que consiste de sustituciones de aminoácidos que se seleccionan de la lista que consiste de: a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/ Y166F/Q175L; C) G13Y/K99Y/T104 /T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/ N159D/Q175L; d) G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/ Q175L; f) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/ Q175K; g) G13Y/ 99Y/T104 /T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/ N159D/Q175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/ N159D/Q175L; i) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; j) G13Y/K99Y/T104 /T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/ N159D/Q175K; k) G13Y/I77L/K9.9Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; 1) G13Y/Y113D/R122D/Q175L; ra) G13Y/V81I/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; n) G13Y/T110A/Y113D/R122D/ 164F/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; p) G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L; q) G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; r) G13F/Y113D/R122D/Q175L; S) G12F/Y113D/R122D/Q175L; t) G13Y/Y113D/R122F/Q175L; u) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; v) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; w) G13Y/ 99Y/T104 /Y113D/R122D/Q175L; x) G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/I118V/R122F/K154R/ N159D/Q175L; z) G13Y/I15Y/Y113D/R122D/Q175L; aa) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; y bb) G13Y/177S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L ce) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/ N159D/Q175L; dd) G13Y/N54Q/K99Y/T104 /T110A/Y113D/R122F/N141Q/ K154R/N159D/Q175L; ee) G13Y/N54 /K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/141Q/ K154R/N159D/175L; ff) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/ K154R/N159D/Q175L; gg) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/ - 8 - K154R/N 159D/Q175L; y hh) G13Y/54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/ 141Q/K154R/N159D/Q175L.

En algunas modalidades, el polipéptido de acuerdo con la invención tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 que comprende sustituciones de aminoácidos que se seleccionan de la lista que consiste de: a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/ Y166F/Q175L; C) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/ N159D/Q175L; d) G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/ Q175L; f) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/ Q175K; g) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/ N159D/Q175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/ N159D/Q175L; i) G13Y/K99Y/T104 /T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; j ) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/ N159D/Q175K; k) G13Y/I77L/K99Y/T1 4W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; 1) G13Y/Y113D/R122D/Q175L; m) G13Y/V81I/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; n) G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; P) G13Y/T110A/Y113-D/R122D/Q175L; q) G13Y/I77Y/K99Y/T104 /T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; r) G13F/Y113D/R122D/Q175L s) G12F/Y113D/R122D/Q175L t) G13Y/Y113Y/Y122Y/1175L u) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; v) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; w) G13Y/K99Y/T104W/Y113D/R122D/Q175L; X) G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/I118V/R122F/K154R/ N159D/Q175L; z) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; aa) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; y bb) G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L CC) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/ N159D/Q175L; dd) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/ K154R/N159D/Q175L; ee) G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/141Q/ K154R/N159D/175L; ff) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/ K154R/N159D/Q175L; gg) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y1-13D/N114F/R122F/141Q/ K154R/N 159D/Q175L; y hh) G13Y/54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/ 141Q/K154R/N159D/Q175L.

En algunas modalidades de la presente invención, el polipéptido con actividad de xilanasa se utiliza para aplicaciones a gran escala.

Preferiblemente, el polipéptido con actividad de xilanasa se produce en una cantidad desde 1 g por litro hasta aproximadamente 100 g por litro del volumen de cultivo celular total después del cultivo del organismo hospedador.

La presente invención también se relaciona con una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de xilanasa y/o secuencias nucleotídicas que codifican para un polipéptido qué tiene actividad de xilanasa, como se describe en la presente.

La composición de la presente invención puede llevar a un aroma mejorado, sabor, suavidad, consistencia, textura, cuerpo, sensación en la boca, firmeza, viscosidad, fractura de gel, estructura y/o propiedades organolépticas y de nutrición de productos para el consumo que contiene la composición. Además, la composición de la presente invención también se puede utilizar en combinación con otros componentes o productos para consumo para poder suministrar las mejoras.

Aunque se prefiere que la composición de la presente invención se utilice para mejorar el aroma, sabor, suavidad, consistencia, textura, cuerpo, sensación en la boca, firmeza, viscosidad, fractura de gel, estructura, suavidad de la superficie y/o propiedades organolépticas y nutrición de productos para consumo que contienen la composición - la presente invención también abarca el uso de la composición de la presente invención como un componente de combinaciones farmacéuticas con otros componentes para suministrar el beneficio médico o fisiológico al consumidor.

En consecuencia, la composición de la presente invención se puede utilizar en combinación con otros componentes .

Los ejemplos de otros componentes incluyen uno o más de: espesantes, agentes gelificantes , emulsificantes, aglutinantes, modificadores de cristal, edulcorantes (que incluye edulcorantes artificiales) , modificadores de reología, estabilizantes, antioxidantes, colorantes, enzimas, portadores, vehículos, excipientes, diluyentes, agentes lubricantes, agentes saborizantes , material colorante, agentes que mejoran la suspensión, desintegrantes, aglutinantes de granulación, etc. Estos otros componentes pueden ser naturales . Los otros componentes se pueden preparar mediante el uso de técnicas químicas y/o enzimáticas .

Como se utiliza en la presente, el término "agente espesante o gelificante" , como se utiliza en este documento se refiere a un producto que evita la separación o que disminuye o evita el movimiento de partículas, ya sea gotitas de líquidos inmiscibles, aire o sólidos insolubles. El espesamiento se produce cuando las moléculas hidratadas individuales provocan un incremento a la viscosidad, disminuyendo la separación. La gelificación se produce cuando las moléculas hidratadas se enlazan para formar una red tridimensional que atrapa a las partículas inmovilizándolas de esta manera.

El término "estabilizante", como se utiliza en la presente, define como un ingrediente o combinación de ingredientes que mantienen un producto (por ejemplo un producto alimenticio) evitando que cambie con respecto al tiempo .

El término "emulsificante" , como se utiliza en la - 5 - presente, se refiere a un ingrediente (por ejemplo un ingrediente de producto alimenticio) que evita la separación de emulsiones. Las emulsiones son dos sustancias inmiscibles, una presente forma de gotitas, contenida dentro de otra. Las emulsiones pueden consistir de aceite en agua, en donde la gotita o la fase dispersada es aceite y la fase continua es agua; o agua en aceite, en donde el agua se vuelve la fase dispersada y la fase continua es aceite. Las espumas, las cuales son gas en líquido y suspensiones, las cuales son sólido a líquido, también se pueden estabilizar mediante el uso de emulsificantes . La aireación se puede producir en un sistema trifásico en donde el aire es atrapado por aceite líquido y después se estabiliza por cristales de grasa aglomerados estabilizados con un emulsificante . Los emulsificantes tienen un grupo polar con una afinidad por agua (hidrofílica) y un grupo no polar el cual es atraído al aceite (lipofílico) . Son absorbidos en los límites de las dos sustancias, lo que proporciona una película interfacial que actúa para estabilizar la emulsión. Las propiedades hidrofílicas/lipofílicas de los emulsificantes son afectadas por la estructura de la molécula. Estas propiedades se identifican por el valor de balance hidrofílico/lipofílico (HLB, por sus siglas en inglés) . Valor en bajos de HLB indican o mayores tendencias lipofílicas las cuales se utilizan para estabilizar emulsiones agua en aceite. Valores altos de HLB se asignan a emulsificantes hidrofílieos, típicamente utilizados en emulsiones aceite en agua. Estos valores se derivan de sistemas sencillos. Debido a que los elementos con frecuencia contienen otros ingredientes que afectan las propiedades de emulsificación, los valores HLB no siempre son una guía confiable para selección de un emulsificante .

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "aglutinante" se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente alimenticio) que une al producto junto a través de una reacción física o química. Durante la "elación" por ejemplo se absorbe agua, proporcionando un efecto de unión. No obstante, los aglutinantes también pueden absorber otros líquidos tales como aceites, manteniéndolos dentro del producto. En el contexto de la presente invención, los aglutinantes típicamente se utilizan en productos sólidos o de baja humedad, por ejemplo productos de panadería; pasteles, donas, pan y otros.

El término "modificador de cristal", como se utiliza en la presente, se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente alimenticio) que altera la cristalización de la grasa o el agua. La estabilización de cristales de hielo es importante por dos motivos . El primero se relaciona directamente con la estabilidad del producto desde un punto de vista de separación. Cuanto más ciclos de congelamiento/recalentamiento se llevan a cabo de un producto, más grande se vuelven los cristales de hielo. Estos cristales grandes pueden descomponer la estructura del producto, ya sea por un proceso natural, como en el caso de las paredes de las células o el cual es creado, por "elación". Debido a que el agua ya no puede ser retenida en el lugar, el producto puede presentar sinéresis o trasudado, después de recalentamiento.

En segundo lugar, en el caso de un producto el cual es consumido congelado, estos cristales grandes pueden resultar en una sensación en la boca arenosa, indeseable.

Los "portadores" o "vehículos" significan materiales adecuados para administración del compuesto e incluyen cualquiera de los materiales conocidos en el ámbito tales como, por ejemplo, cualquier líquido, gel, solvente, diluyente líquido, solubilizante o similar el cual es no tóxico y el cual no interactúa con componente alguno de la composición de una manera perjudicial.

Los ejemplos de portadores nutricionalmente aceptables incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina, aceites vegetales, polietilenglicoles , propilenglicol , liposomas, azúcares, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos , ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácido graso, ásteres de ácido graso de petróleo, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Los ejemplos de excipientes incluyen uno o más de: celulosa microcristalina y otras celulosas, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico, glicina, almidón, azúcar de leche y polietilenglicoles de peso molecular alto.

Los ejemplos de desintegrantes incluyen uno o más de: almidón (preferiblemente almidón de maíz, de papa o de tapioca) , glicolato de almidón de sodio, croscarmelosa de sodio y algunos silicatos complejos.

Los ejemplos de aglutinantes de granulación incluyen uno o más de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) , hidroxipropilcelulosa (HPC) , sacarosa, maltosa, gelatina y goma acacia.

Los ejemplos de agentes lubricantes incluyen uno o más de: estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco.

Los ejemplos de diluyentes incluyen uno o más de: agua, etanol, propilenglicol y glicerina y combinaciones de los mismos.

Los otros componentes pueden ser utilizados de manera simultánea (por ejemplo cuando se encuentran mezclados juntos o incluso cuando se suministran por rutas diferentes) o secuencialmente (por ejemplo, se pueden suministrar por rutas diferentes) .

Como se utiliza en la presente, el término "componente adecuado para consumo animal o humano" significa un compuesto el cual es o se puede agregar a la composición de la presente invención como un suplemento el cual puede ser de beneficio nutricional, un sustituto de fibra o obtener un efecto generalmente benéfico para el consumidor. Los ingredientes pueden ser utilizados en una amplia variedad de productos que requieren gelificación, texturizado, estabilizado, suspensión, formación de película y estructurado, retención de jugosidad, sin agregar viscosidad innecesaria. Preferiblemente, los ingredientes serán capaces de mejorar la vida de anaquel y estabilidad del cultivo viable .

A modo de ejemplo, los componentes pueden ser prebióticos tales como alginato, goma de xantano, pectina, goma de algarrobo (LBG, por sus siglas en inglés) , inulina, goma guar, galacto-oligosacárido (GOS, por sus siglas en inglés) , fructo-oligosacárido (FOS, por sus siglas en inglés) , lactosacarosa, oligosacáridos de soya, palatinosa, isomalto-oligosacáridos , gluco-oligosacáridos y xilo-oligosacáridos .

La composición de la presente invención se puede utilizar como -o en la preparación de- un alimento. Aquí, el término "alimento" se utiliza en un sentido amplio -y abarca alimento para humanos así como alimento para animales (es decir, pienso) . En un aspecto preferido, el alimento es para consumo humano.

El alimento puede estar en forma de una solución o como un sólido - dependiendo del uso y/o modo .de aplicación y/o modo de administración.

Cuando se utiliza como -o en la preparación de- un alimento -tal como un alimento funcional-, la composición de la presente invención se puede utilizar junto con uno o más de: un portador nutricionalmente aceptable, un diluyente nutricionalmente aceptable, un excipiente nutricionalmente aceptable, un adyuvante nutricionalmente aceptable, un ingrediente nutricionalmente activo.

La composición de la presente invención se puede utilizar como un ingrediente de alimentos.

Como se utiliza en la presente, el término "ingrediente de alimentos" incluye una formulación la cual es o se puede agregar como alimentos funcionales o productos alimenticios, como un suplemento nutricional y/o como un suplemento de fibra. El término ingrediente alimenticio, como se utiliza en la presente, también se refiere a formulaciones las cuales pueden ser utilizadas en bajas concentraciones en una amplia variedad de productos que requieren gelificación, texturizado, estabilización, suspensión, formación de película y estructurado, retención de jugosidad y sensación mejorada en la boca, sin agregar viscosidad.

El ingrediente alimenticio puede estar en forma de una solución o como un sólido -dependiendo del uso y/o modo de aplicación y/o modo de administración.

La composición de la presente invención puede ser -o se puede agregar a- suplementos alimenticios.

La composición de la presente invención puede ser -o se puede agregar a- alimentos funcionales.

Como se utiliza en la presente, el término "alimento funcional" significa un alimento el cual es capaz de proporcionar no solo un efecto nutricional y/o satisfacción de sabor sino que también es capaz de suministrar un efecto benéfico adicional al consumidor.

En consecuencia, los alimentos funcionales habitualmente son alimentos que tienen componentes o ingredientes (tales como los descritos en la presente) incorporados en los mismos que imparten al alimento una función específica - por ejemplo un beneficio médico o fisiológico) diferente del efecto puramente nutricional.

Aunque no hay definición legal de un alimento funcional, la mayoría de los países con un interés en esta área concuerdan en que son alimentos comercializados que tienen efectos específicos para la salud.

Algunos alimentos funcionales son nutracéuticos . Aquí, el término "nutracéutico" significa un alimento el cual es capaz de proporcionar no solo el efecto nutricional y/o una satisfacción de sabor sino también es capaz de suministrar un efecto terapéutico (u otro efecto benéfico) al consumidor. Los nutracéuticos se encuentran entre las líneas tradicionales que dividen a los alimentos y la medicina.

Las investigaciones han sugerido que los consumidores enfatizan más alimentos funcionales que afirman relacionarse con enfermedades cardíacas. La prevención de cáncer es otro aspecto de la nutrición el cual interesa a los consumidores en gran medida, pero de manera interesante, esta es un área que los consumidores sienten que pueden ejercer y por lo menos controlar. De hecho, de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, por lo menos 35% de los casos de cáncer están relacionados con la dieta. Además, las quejas respecto a la osteoporosis , la salud del intestino y los efectos de la obesidad también son factores claves que es probable que induzcan a compras de alimentos funcionales e impulsen el desarrollo del mercado.

La composición de la presente invención se puede utilizar en la preparación dé productos alimenticios tales como uno o más de: jamones, mermeladas, jaleas, productos lácteos (tales como leche o queso) , productos de carne, productos de aves de corral, productos de pescado y productos de panadería .

A modo de ejemplo, la composición de la presente invención se puede utilizar como ingredientes de bebidas sin alcohol, un jugo de fruta o una bebida que comprende proteína de suero, té sanos, bebidas de cacao, bebidas de leche y bebidas con bacterias ácido lácticas, yogurt y yogurt para beber, queso, helado, sorbetes y postres, confiterías, pasteles y pastelillos, mezclas de tortas, alimentos de refrigerio, cereales de desayuno, fideos instantáneos y fideos en taza, sopas instantáneas y sopas en taza, alimentos balanceados y bebidas, edulcorantes, barras de refrigerios con textura mejorada, barras de fibra, rellenos de fruta estables al horneado, glaseados de cuidado, relleno de panadería de chocolate, relleno con sabor a torta de queso, relleno de torta con sabor a frutas, pasteles y donas glaseadas, relleno de panadería estable al calor, cremas de relleno de panadería instantáneas, relleno para galletas dulces, relleno de panadería listo para usarse, relleno con calorías reducidas, bebidas nutricionales para adultos, bebidas acidificadas de soya/jugo, bebidas de chocolate asépticas/purificadas, mezclas de barras, polvos de bebida, soya/palma fortificado con calcio y leche de chocolate, bebida de café fortificado con calcio.

Una composición de acuerdo con la presente invención puede ser utilizada adicionalmente como un ingrediente en productos alimenticios tales como la salsa de queso americana, un agente contra la formación de torta para - 4 - queso gratinado y rallado, un producto de aderezo para frituras, queso crema, un aderezo untable combinado en seco crema acida libre de grasa, crema para batir láctea congelada/recalentada, una .parte superior batida estable al congelamiento/recalentamiento, queso tipo cheddar natural bajo en grasa y ligero, yogurt estilo suizo bajo en grasa, postres congelados sellados y barras novedosas, helado en empaque duro, etiquetas amigables, economía mejorada y bienestar de helados en empaque duro, helados bajos en grasa,-helados suaves, salsa de barbacoa, salsa de queso para sumergir, aderezo de queso cottage, salsa tipo Alfredo de mezclado seco, salsa de queso mixta, salsa de tomate mixta seca y otros.

Para algunos aspectos, preferiblemente el producto alimenticio es una bebida.

Para algunos aspectos, preferiblemente el producto alimenticio es un producto de panadería tal como pan, pan dulce, bollos o galletas dulces.

La presente invención también proporciona un método para preparar un alimento o un ingrediente de alimento, el método comprende xilanasa producida por el procedimiento de la presente invención o la composición de acuerdo con la presente invención con otro ingrediente alimenticio. El método para preparar un ingrediente alimenticio también es otro aspecto de la presente invención.

En un sentido general, un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la invención se puede utilizar para solubilizar y/o degradar material de pared celular vegetal insoluble que contiene arabinoxilano, alterar, por ejemplo reducir, la viscosidad derivada de la presencia de hemicelulosa o arabinoxilano en una solución o sistema que comprende material de pared celular vegetal. Típicamente, los materiales de pared celular vegetal comprenderán uno o más inhibidores de xilanasa.

Específicamente, un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la invención se puede utilizar en procesar materiales vegetales para uso como materiales alimenticios, tal como pienso para animales, en producción de almidón, en horneado, en producción de bio-etanol a partir de material celulósico y en el procesamiento de pulpa de madera para producir papel.

Un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la invención se puede utilizar para procesar materiales vegetales tales como cereales que se utilizan en productos alimenticios que incluyen pienso para animales. Como se utiliza en la presente, el término "cereal" significa cualquier clase de grano utilizado para alimento y/o cualquier pasto que produce este grano tal como, pero sin limitarse a cualquiera de trigo, trigo molido, cebada, maíz, sorgo, centeno, avena, tritical y arroz o combinaciones de los mismos. En una modalidad preferida, el cereal es cereal de trigo.

El xilano en el alimento y/o suplemento de pienso se modifica al poner en contacto el xilano con el péptido que tiene actividad de xilanasa de la presente invención.

Como se utiliza en la presente, el término "poner en contacto" incluye pero no se limita a rociar, recubrir, impregnar o estratificar el alimento y/o el suplemento de pienso con el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la presente invención.

En una modalidad, el alimento y/o el suplemento de pienso la presente invención se puede preparar al mezclar el polipéptido que tiene actividad de xilanasa directamente con un alimento y/o suplemento alimenticio. A modo de ejemplo, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa puede ponerse en contacto (por ejemplo, mediante rociado) sobre un alimento basado en cereal y/o un suplemento de pienso tal como trigo molido, maíz o avena de soya.

También es posible incorporar el polipéptido que tiene actividad de xilanasa en un segundo alimento (si es diferente) y/o pienso o agua para beber en la cual después se agrega al alimento y/o suplemento de pienso de la presente invención. En consecuencia, no es esencial que el polipéptido tenga actividad de xilanasa proporcionada por la presente invención en la medida en que se incorpore en el alimento basado en cereal y/o el suplemento de pienso mismo, aunque la incorporación forma un aspecto particularmente preferido de la presente invención.

En una modalidad de la presente invención, el alimento y/o suplemento de pienso se puede combinar con otros componentes de alimento 'y/o pienso para producir un alimento y/o pienso basado en cereal. Los otros componentes de alimento y/o pienso pueden incluir uno o más suplementos de enzimas adicionales (preferiblemente termoestables) , vitamina de alimentos y/o suplementos de pienso, minerales de alimento y/o suplementos de pienso y aminoácidos de alimento y/o suplementos de pienso. El alimento y/o suplemento de pienso resultante (combinado) comprende posiblemente varios tipos diferentes de compuestos que después se pueden mezclar en una cantidad apropiada con el otro alimento y/o componentes de pienso tal como cereal y suplementos de proteína para formar un alimento humano y/o pienso para animales.

En una modalidad preferida, el alimento y/o suplemento de pienso de la presente invención se puede preparar al mezclar diferentes enzimas que tienen las actividades apropiadas para producir la mezcla de enzimas. A modo de ejemplo, un alimento basado en cereal y/o un suplemento de pienso formado, por ejemplo a partir de trigo molido o maíz se puede poner en contacto (por ejemplo mediante aspersión) ya sea de manera simultánea o secuencial con la enzima xilanasa y otras enzimas que tienen actividades apropiadas. Estas enzimas pueden incluir pero no se limitan a cualquiera de uno o más de una amilasa, una glucoamilasa, una mananasa, una galactosidasa, una fitasa, una lipasa, una fosfolipasa, una galactolipasa, una glucanasa, una arabinofuranosidasa, una feruliolesterasa, una pectinasa,- una proteasa, una glucosa oxidasa, una hexosa oxidasa y una xilanasa. Las enzimas que tienen las actividades deseadas pueden mezclarse, por ejemplo, con la xilanasa de la presente invención ya sea antes del contacto de estas enzimas con un alimento basado en cereal y/o un suplemento de pienso, o alternativamente las enzimas se pueden poner en contacto de manera simultánea o secuencial en tal suplemento basado en cereal. El alimento y/o suplemento después, ha su vez, se mezcla con un alimento basado en cereal y/o un pienso para preparar el alimento y/o pienso final. También es posible formular el alimento y/o suplemento de pienso como una solución de las actividades de enzima individuales y después mezclar esta solución con un material de alimento y/o pienso antes de procesar el suplemento de alimento y/o pienso en pellas o como un macerado.

La presente invención proporciona el uso de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la invención en un procedimiento para preparar un producto alimenticio. Los productos de pastelería (horneados) típicos de acuerdo con la presente invención incluyen pan -tales como pan de caja, rollos, bollos, bases para pizza, etc- rosquillas, tortillas, pasteles, galletas dulces, panecillos, galletas saladas, etc. La preparación de los productos alimenticios tales como productos de panadería es bien conocido en la técnica. La producción de masa-, por ejemplo, se describe en el ejemplo 4. El uso de un polipéptido que tenga actividad de xilanasa de la invención para alterar el desempeño de horneado se describe en el ejemplo 4.

Un polipéptido que tenga actividad de xilanasa de la invención también se puede utilizar en producción de almidón a partir de materiales vegetales derivados de cereales y tubérculos tales como papas .

Un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la invención también se puede utilizar en procesamiento de pulpa de madera, por ejemplo en la preparación de papel.

Procesamiento de material celulósico para producción de bio-etanol Un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la invención también se puede utilizar en la hidrólisis de material vegetal celulósico para producción de azúcares fermentables a bio-etanol.

En algunas modalidades particulares el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene una actividad de xilanasa óptima a temperaturas de - - procesamiento de masa tal como el intervalo de aproximadamente 20 ' a aproximadamente 40°C. En algunas modalidades el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención es inactivado durante el procedimiento de horneado.

En algunas modalidades alternativas el polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con la invención tiene termoestabilidad aumentada y/o una temperatura óptima en comparación con la enzima natural correspondiente para retener actividad después del tratamiento con calor. Ambas características son conocidas por las personas expertas en el ámbito .

EJEMPLOS EJEMPLO 1 EJEMPLO 1 - MUTAGÉNESIS DIRIGIDA A SITIO DE XILANASAS Y EXPRESIÓN Los mutantes específicos de la xilanasa de Bacillus subtilis se obtienen utilizando una construcción que comprende el sitio de unión de ribosoma de pET24a (ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacat) fusionado al gen para xilanasa natural, sin secuencia de señal (atggctagcacagactactggcaa tggtaa) y se transfiere al vector pCRBlunt (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) . Esto resulta en la expresión constitutiva de xilanasa en células TOP10 (InVitrogen) después de transformación con el vector construido, con la condición de que la orientación del gen sea en la dirección "en el sentido de las manecillas del reloj". La mutación dirigida al sitio en el gen después se obtiene mediante el uso del equipo de mutagénesis "QuickCange" (Stratagene, La Jolla, CA, USA) de acuerdo con el procedimiento de los fabricantes. Los mutantes se verifican por secuenciado. Se obtiene producción suficiente de los mutantes verificados por crecimiento de las células TOP10 transformadas a escala de 1 1.

Ejemplo 2 - Estudios de solubilización de salvado de mutantes de xilanasa Utilizamos salvado de trigo como sustrato para evaluar la actividad específica de las variantes de xilanasa dado que esto se utiliza en aplicaciones comerciales.

Sustrato de salvado Por medio del ejemplo, el salvado puede ser salvado de trigo obtenido de molido en seco de trigo utilizando un molino automático Chopin CD a escala de laboratorio (Chopin Technologies, Francia) utilizando el ajuste y las condiciones proporcionadas para el proveedor, para molido de trigo en harina de trigo y salvado. La fracción de salvado que se obtiene se puede utilizar como sustrato en el análisis de solubilización de salvado, en este ejemplo se utiliza trigo como la fuente de cereal.

Análisis de solubilización de salvado: Se prepara una suspensión de salvado de trigo en amortiguador (0.1 M) - fosfato ácido disódico (0.2 ) , pH 5.0 a una concentración de 1.33% de salvado (p/p) . A partir de esta suspensión se transfieren alícuotas de 750 1 a tubos Eppendorph, bajo agitación. Cada tubo de sustrato se precalienta durante 5 minutos a 40°C. Después de esto se agregan 250 µ? de solución de enzima, estableciendo una concentración final de sustrato de 1%. Se producen tres diluciones (por duplicado) a partir de cada una de las xilanasas, con una concentración de enzima cada vez mayor (0.33; 1.0 y 3.0 µg de xilanasa/gramo de salvado) para cada momento de determinación (0, 30, 60 y 240 minutos) . Como un testigo se utiliza solución desnaturalizada por calor de la xilanasa. La reacción finaliza en los tiempos indicados o transferencia de los tubos a un incubador ajustado a 95°C. Las muestras desnaturalizadas por calor se mantienen a 4°C hasta que finalizan todas las reacciones enzimáticas. Cuando han finalizado todas las reacciones enzimáticas, los tubos Eppendorph se centrifugan para obtener un sobrenadante claro. La capacidad de las enzimas para solubilizar salvado se expresa como incremento en la DO410, determinado por el incremento al reducir los grupos de extremo utilizando reactivos PAHBAH (Lever, 1972) .

Brevemente, al reducir los grupos de extremo se hacen reaccionar con PAHBAH formando un producto de reacción con color el cual puede ser cuantificado a una densidad óptima DO410.

El análisis de solubilización de salvado anterior es sensible a actividad secundaria de enzimas activas en almidón residual en el sustrato de salvado.

Procedimiento de purificación de xilanasa de Bacillus subtilis Se cosechan por centrifugación (20 minutos, 3500 x h, 20°C) células E. coli TOP10 que tienen expresada la xilanasa, y se resuspenden en Tris 50 mmM, EDTa 2 mM, pH 7.4. Las células se abren por adición de 1 mg/ml de lisozima (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, US, cat . No. 100831), agitación de la suspensión durante 2 horas a temperatura ambiente, congelamiento y recalentamiento seguido por sonicado. Se ajusta el pH a 4.0 utilizando HC1 1 M seguido por centrifugación (20 minutos, 3500 x g, 20°C) . El sobrenadante que contiene xilanasa se le extrae la sal utilizando columnas de eliminación de sal PD-10 desechable (Amersham Bioscience, Suecia) equilibradas y eluidas con acetato de sodio 50 mM, pH 4.5. La muestra sin sal se carga en una columna de 10 mi SOURCE 158S (Amersham Bioscience, Suecia) pre-equilibrada con acetato de sodio 50 mM, pH 4.5. La columna después se lava con amortiguador de equilibrio y se eluye con un gradiente lineal de NaCl (acetato de sodio 50 mM, 0-0.35 M de NaCl, pH 4.5). Las fracciones que contienen actividad de xilanasa se acumulan y se utilizan para análisis posterior.

Se pueden adaptar procedimiento similares para variantes de xilanasa derivadas de XynA de cepas diferentes de Bacillus subtilis que tengan una pl significativamente diferente de XynA de Bacillus subtilis.

TABLA 1.

Actividad de solubilización de salvado de xilanasas expresado, a densidad óptica máxima, como índice de pendiente de mutantes de xilanasa, densidad óptica relativa y pendiente en comparación con xilanasa BS1 (la enzima de Bacillus subtilis mostrada como la SEC ID No. 1) y la xilanasa BS3 (variante de Bacillus subtilis mostrada como SEC ID No. 23) Modificaciones reafeadas a la SEC ID pendiente DO pendiente DO pendiente DO NO: 1 deDO/h máxima relativa máxima relativa a máxima respecto a relativa BS3 relativa BS1 respecto a respecto a BS1 BS3 ninguno (BS1) 023 0.68 100 100 140 140 D11F/R122D(BS3) 0.16 0.49 72 72 100 100 G13Y T110A/Y113D/ 0.40 1.19 173 173 242 242 R122D/K154R/N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W 0.39 1.18 172 172 241 241 fl"HQA/Y113D/R122F/ 4Y/R122BK154R/N 159D/L175K G13Y/I177L/K99Y/T 0.31 0.93 136 136 190 190 103W/T"HQ W113 D/R122F/K154 / 159D/Q175L G13Y/Y113Q/R122 0.30 0.91 133 133 186 186 D/Q175L G13Y/V81I/K99Y/T 0.29 0.87 128 128 178 178 104W T11QA/Y113 D/R122F/K154R/N 159D/Q175L G13Y/T119 113 0.28 0.83 121 121 169 169 175L G13YmiQA/Y113 028 0.83 121 121 169 169 D/R122D/S162D/Q 175L G13Y/T110/VY113 0.27 0.82 119 119 167 167 DR122DO175L G13Y/I77Y/K99Y T 0.27 0.80 117 117 163 163 104\?G110?/?113 D/R122F/F154R/N 159D/Q175L G13FY113DR122 0.26 0.78 114 114 160 160 D/Q175L G12F/Y113D/R122 026 0.78 114 114 160 160 D/Q175L G13Y/Y113D/R122 0.25 0.74 109 109 152 152 F/Q175L G13Y/G34KmiOA 0.25 0.74 108 108 150 150 /Y113D/R122D/Q1 75L G13Y/l177VK99Y T 0.23 0.69 101 101 141 141 KMW/T11QW113 DR122F/K154R/ 159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W 0.22 0.67 98 98 138 138 75L G13Y/l177M/K99Yn" 0.22 0.67 98 98 137 137 104W/T11QA/Y113 D/R122F/K154R/ 159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W 0.21 0.63 92 92 128 128 /ri10 W113D/l11 8V/R122F/K154R/N 159D/Q175L G13Y/I15Y/Y113D/ 0.20 0.60 87 87 122 122 R122CVQ175L G13Y/T110A/Y113 0.18 0.53 78 78 109 109 DR122D/S162E/Q 175L - - Ejemplo 3 - Prueba de actividad de xilanasa e inhibición relativa por inhibidores de xilanasa de cereal Los mutantes del ejemplo 2 se prueban para actividad de xilanasa y sensibilidad relativa a un inhibidor de xilanasa por los procedimientos que se presentan a continuación y de acuerdo con las siguientes enseñanzas.

Análisis de xilanasa (actividad de endo-ß-?, 4-xilanasa) Las muestras se diluyen en amortiguador de ácido cítrico (0.1 M) - fosfato ácido disódico (0.2 M) , pH 5.0 para obtener aproximadamente DO590 = 0.7 en este análisis. Tres diluciones diferentes de la muestra se preincuban durante 5 minutos a 40 °C. En un tiempo = 5 minutos, se agrega una tableta de Xylazyme (sustrato de xilano seco y reticulado, Megazyme, Bray, Irlanda) a la solución de enzima en un volumen de reacción de 1 mi. En un tiempo = 15 minutos, la reacción finaliza al agregar 10 mi de 2% de TRIS/NaOH, pH 12. Se preparan testigos utilizando 1000 µ? de amortiguador en vez de solución de enzima. La mezcla de reacción se centrifuga (1500 x g, 10 minutos, 20°C) y la DO del sobrenadante se mide a 590 nm. Una unidad de xilanasa (XU) se define como la actividad de xilanasa que aumenta la DO590 con 0.025 por minuto.

Determinación de actividad específica: La densidad óptica a 280 nm de las muestras purificadas se mide para determinar la concentración de. proteína xilanasa. Se utilizó una D02so específica calculada teóricamente (Gasteiger et al., 2003) de 0.25 unidades/mg x mi para el cálculo de actividad específica de las variantes derivadas de XynA -de Bacillus subtilis . La actividad de xilanasa se determinó como se describe en lo anterior.

Análisis de inhibidor de xilanasa Se mezclaron 100 µ? de preparación de inhibidor (que contiene diversas concentraciones de inhibidor de xilanasa (para cuantificación, véase la cuantificación de inhibidor de xilanasa más adelante) ) , 250 µ? de solución de xilanasa (que contiene 12 XU de xilanasa/ml) y 650 µ? de amortiguador (amortiguador de ácido cítrico 0.1 M- fosfato ácido disódico 0.2 M, BSA 1% (Sigma-Aldrich, Estados Unidos), pH 5.0). La mezcla se termoestablece durante 5 minutos a 40.0°C. A un tiempo = 5 minutos se agregó una tableta de Xylazyme (sustrato de xilano seco, reticulado, Megazyme, Bray, Irlanda) . En un tiempo = 15 minutos se finaliza la reacción al agregar 10 mi de 2% de TRIS/NaOH, pH 12. La mezcla de reacción se centrifuga (1500 x g, 10 minutos, 20°C) y el sobrenadante se mide a 590 nm. Se calcula la inhibición de xilanasa como actividad residual, en %, en comparación con el testigo. Se preparan testigos de la misma manera pero sustituyendo la solución de inhibidor con agua.

Cuantificación de inhibidor de xilanasa: 1 XIU .(unidad de inhibidor de xilanasa) se define como la cantidad de inhibidor que disminuye 1 XU de la xilanasa XynA de Bacillus subtilis (SEC UD NO: 1) a 0.5 XU bajo las condiciones descritas a continuación. 250 µ? de solución de xilanasa contiene 12 XU/ml, aproximadamente 100 µ? de solución de inhibidor de xilanasa y amortiguador Mcllvaine, pH 5, para alcanzar un volumen de reacción de 1000 µ? se preincuba durante 5 minutos a 40°C. At t = 5 minutos, se agrega una tableta de Xylazyme a la mezcla de reacción. At t = 15 minutos se finaliza la reacción por adición de 10 mi de 2% de TRIS/NaOH, pH 12. La solución se filtra y la absorbancia de sobrenadante se mide a 590 nm. Al seleccionar varias concentraciones diferentes de inhibidor en el análisis anterior, es posible crear una gráfica de DO versus concentración de inhibidor. Utilizando la pendiente (a) y la intercepción (b) a partir de esta gráfica y la concentración de la xilanasa, es posible calcular la cantidad de XIU en una solución de inhibidor dada (ecuación 1) .

Ecuación 1 XIU = ((b/2)/-a)/x X = unidades de xilanasa (XU) en el análisis Preparación de inhibidor: Se elabora una preparación de inhibidor crudo (que contiene tanto TAXI como XIP, denominada en lo siguiente como - - preparación de inhibidor) a partir de 1 kg harina de trigo (Triticum aestivum) . La preparación de inhibidor se extrae de la harina utilizando agua en una relación 1:3 (p/p) seguido por centrifugación (3500 x g, 20 minutos, 4°C). El extracto se mantiene a 65°C durante 40 minutos, se centrifuga (3500 x g, 20 minutos, 4°C) y se elimina la sal utilizando columnas de eliminación de sal desechables PD-10 (Amersham Bioscience, Suecia) , preequilibradas con amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH 7. Se determina la concentración de TAXI en la preparación de inhibidor como se ha descrito antes. El procedimiento para purificación y cuantificación de TAXI se describe en otra parte (Sibbesen and Sorensen, 2001) . A modo de ejemplo únicamente, el TAXI en la preparación puede ser la SEC ID NO: 24 o una secuencia que tenga 90% de identidad con la misma.

TABLA 2 Actividad de xilanasa (XU/mg) y sensibilidad de inhibidor de xilanasa de mutantes indicados como actividad de xilanasa residual a concentraciones de inhibidor de xilanasa cada vez mayores (XIU/ml análisis) Modificaciones realizadas a la SEC ID Actividad % de % de % de NO: 1 específica, actividad actividad actividad XU/mg @ 5.6 @ 33.5 50 XlU/ml XIU/ml XIU/ml Ninguno (B51 ) 23.000 29 G12F/Y1 13D/R122D/Q175L 19.077 100 G113F Y1 13D/R122D/Q175L 32.425 100 90 G13Y/Y1 13D/R122D/Q175L 34.058 86 G13Y/T1 10A Y1 13D/R122D/Q175L 59.571 50 G 13Y/K199Y/T104W/Y113D/R122D/ 35.883 80 Q175L G13Y/I15Y/Y113D/R122D/Q175L 37.773 76 G13Y/Y113D/R122F/Q175L 33.566 90 G 13Y/T1 10A/Y1 13D/R122F/Q175L 53.885 65 G13Y/G34K/T1 10A/Y1 13D/R122D/ 15.876 97 Q175L G13Y/ 99Y/T104W/T1 10A/Y1 13D/ 47.975 72 R122F/K154R/N159D/Q175K G13Y/V811/K99Y/T104W T1 10A/Y1 13D 41.791 46 /R122F/K154R/N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W/T1 10??? 13D/ 53.331 68 R122F/K154R/N 159D Y166F/Q175L G 13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/ 54.924 32 N159D/Q175L G13?/?99??? 04W/T1 10A/Y1 13D/ 54.81 1 64 R122F/K154R/N159D/Q175L G13YY/T1 10A/Y113D/R122D/S162E 55.249 44 /Q175L G13Y T1 10A Y113D/R122D/S162D/ 52.735 40 - - Q175L G13Y/T1 10A/Y1 13D/R122D/W164F 51.884 29 /Q175L G13Y/K99Y/T104VWT1 10A/Y113D/ 47.445 79 N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L G13Y/ 99Y/T104W/T1 10A/Y1 13D/ 46.263 78 N114Y/R122F/ 154R/N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W/T1 10A/Y1 13D/ 42.077 79 N114F/R122F/K154R/N 159D/Q 175L G13Y/K99Y/T104W/T1 10A/Y1 13D/ 27.363 79 1118V/R122F/K154R/N 159D/Q175L G 13Y/K99Y/T104W/T1 10A/Y1 13D/ 35.906 84 N114Y/R122F/K154R/N159D/L175K G 13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/ 46.939 79 N 114D/R122F/K154R/N 159D/L175 G13Y/I77L/K99Y/T104VWT1 10A/Y113D 48.177 75 /R122F/K154R/N159D/Q175L G13Y/I77M/ 99Y/T104W T1 10A/Y113 28.412 46 D/R122F/K154R/N159D/Q175L G13Y/I77S/K99Y T104W T1 10A/Y1 13D 12.003 20 /R122F/F154R/N 159D/Q175L G13Y/l77V/K99Ym 04W/T1 10A/Y1 13D 35.907 45 /R122F/K154R/N159D/Q175L G 13Y/I77Y/K99Y/T104W/T1 10A/Y113D 33.236 37 /R122F/K154R/ 159D/Q175L - - Ejemplo 4 - Desempeño de mutantes en panadería Se realizó trabajo de panadería utilizando una receta de rollo danés a pequeña escala (tabla 3) utilizando harina de trigo o harina de molido de trigo completo.

TABLA 3 - Receta utilizada para la producción de pan ingredientes mini escala mi o g harina 50 levadura seca 1 sal 0.8 azúcar 0.8 agua 400BU - 2% Nota: el agua es el agua de absorción aproximadamente 400BU determinada por análisis Farinograph de harina (es decir, una absorbancia de 400 horneadas - agua agregada de acuerdo con determinación de absorción de agua utilizando el equipo Brabrender Farinograph, Brabrender, Alemania) . Si las enzimas se agregan a la masa, se agregan como solución liquida y por sustitución de la misma cantidad de agua.

ELABORACION DE MASA Y HORNEADO La harina y los ingredientes secos se mezclan durante un minuto en un equipo de 50 gramos Farinograph - - (Brabrender, Duisburg, Alemania) , posteriormente se agrega agua y se continúa mezclando durante otros cinco minutos.

Después de mezclar, se pesan cuatro grupos de masa, cada uno contiene 10 gramos de harina. Estos se moldean en pan utilizando moldeado manual. Los panes se colocan en bandejas de horneado y se colocan en un recipiente sellado (con una tapa) y se deja que reposen a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después los panes se prueban a 34 °C, 85% de humedad relativa (hr) durante 45 minutos y finalmente se hornean a 230°C durante cinco minutos en un horno Bago (Bago-line, Fáborg, Dinamarca) .

Los panes se enfrían durante 20 minutos antes de la evaluación (peso, medición de volumen, migas y condición cruj iente) .

TABLA 4 - DESEMPEÑO DE HORNEADO DE MOTANTES - VOLUMEN DE PAN (ML/G) E INCREMENTO DE VOLUMEN RELATIVO CON COMPARACIÓN CON EL CONTROL (SIN ENZIMAS AGREGADAS) Y BS3 (SEC ID NO: 1 CON LAS MODIFICACIONES D11F Y R122D) EL CUAL MUESTRA UN DESEMPEÑO DE HORNEADO SUPERIOR EN COMPARACIÓN CON LA XILANASA NATURAL XYNA DE Bacillus sub . (SEC ID NO: 1) Modificaciones Volumen del pan @ Incremento Incremento realizadas a la SEC ID 0.04 rag/kg de de volumen de volumen NO: 1 harina relativo relativo versus versus control, % BS3, % G13Y/G34K/T110A/Y113D/ 4,22 41.89 20 R122D/Q175L G13Y/K99Y/T104W/T110A/ 2.90 21.93 7.54 Y113D/R122F/K154R/N159 D/Q175L G13Y/V81I/K99Y/T104W/T 2.80 ' 18.02 4.09 110A/Y113D/R122F/K154R /N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104 /T110A/ 2.82 18.86 4.83 Y113D/R122F/K154R/N159 D/Y166F/Q175L G13Y/T110A/Y113D/R122F 2.81 18.08 4.15 /K154R/N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W/T110A/ 2.89 21.74 7.24 Y113D/R122F/K154R/N159 D/Q175L G13Y/T110A/Y113D/R122F 2.75 13.55 1.99 /S612E/Q175L G13Y/T110A/Y113D/R122D 2.82 15.54 4.48 /S162D/Q175L G13Y/T110A/Y113D/R122D 2.78 14.02 3.10 /W164F/Q175L G13Y/K99Y/T104W/T110A/ 2.81 16.44 4.11 Y113D/N114D/R122F/K154 R/N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W/T110A/ 2.73 13.26 1.26 Y113D/N114Y/R122F/K154 R/N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104 /T110A/ 2-80 16.22 3.74 Y113D/N114F/R122F/K154 R/N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W/T110A/ 2.83 17.58 4.95 Y113D/I118V/R122F/K154 R/N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W/T110A/ 2.89 20.65 7.34 Y113D/N114Y/R122F/K154 R/N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W/T110A/ 2.77 14.73 2.63 Y113D/R122F/K154R/N159 D/Q175L G13Y/I77L/K99Y/T104 /T 2.81 15.08 4.32 110A/Y113D/R122F/K154R /N159D/Q175L G13Y/I177M/K99Y/T104W/ 2.70 12.43 0.17 T110A/Y113D/R122F/K154 R/N159D/Q175L G13Y/I177S/K99Y/T104 / 2.53 5.40 (6.09) T110A/Y113D/R122F/K154 R/N159D/Q175L G13Y/I177V/K99Y/T104W/ 2.60 8.19 (3.63) T110A/Y113D/R122F/K154 R/N159D/Q175L G13Y/I177Y/K99Y/T104W/ 2.73 13.81 1.38 T110A/Y113D/R122F/K154 R/N159D/Q175L EJEMPLO 5 - ACTIVIDAD DE VARIANTES DE XILANASA EN SUSTRATO INSOLUBLE EN AGUA VERSUS SUSTRATO INSOLUBLE Las variantes de xilanasa de BACSU_XynA y TRIRE_Xyn2 se generan utilizando mutagénesis dirigida al sitio de xilanasas y expresión en E. coli.

Análisis para determinar actividad en sustrato que no se puede extraer de agua, WU-AX act. (sustrato insoluble) .

Las muestras se diluyen en amortiguador de ácido cítrico (0.1 M) -¦ fosfato ácido disódico (0.2 M), pH 5.0 para obtener aproximadamente DO590 = 0.7 en este análisis. Se preincuban tres diluciones diferentes en la muestra durante 5 - - minutos a 40°C. En un tiempo = 5 minutos, se agrega una tableta Xylazyme (sustrato de xilano seco, reticulado, Megazyme, Bray Irlanda) a la solución de enzima y en un volumen de reacción de 1 mi. En un tiempo = 15 minutos finaliza la reacción al agregar 10 mi de 2% de TRIS/NaOH, pH 12. Se preparan testigos utilizando 1000 µ? de amortiguador en vez de solución de enzima. La mezcla de reacción se centrifuga (1500 x g, 10 minutos, 20 °C) y se mide la densidad óptica del sobrenadante a 590 nm. La unidad de xilanasa (WU-AX act) se define como la actividad de xilanasa que incrementa la DO590 en 0.025 por minuto.

El sustrato (arabinoxilano reticulado y secado extraído de trigo) utilizado en el análisis anterior es un buen aproximado del sustrato correspondiente en aplicaciones comerciales.

Se utilizó el siguiente análisis para determinar actividad sobre sustrato extraíble en agua (XE-AX act (sustrato soluble) .

El método utilizado es una versión modificada del método descrito por Lever (Lever, M. Analytical Biochemistry . 47, 273-279, 1972) . Se utiliza arabinoxilano de trigo soluble (viscosidad media, asequible de Megazyme, Bray Irlanda) como sustrato en un sistema amortiguador que contiene NaOAc 50 mM, pH 5. La concentración del sustrato es 0.5%. Se mide la actividad de xilanasa al cuantificar la formación de extremos reductores utilizando reactivos PAHBAH. La cantidad de extremos reductores formados y por lo tanto la actividad de xilanasa se determina a partir de una curva estándar de xilosa. En la presente se refiere como XE-AX act .

Estructuras -principales utilizadas para desarrollar variantes nuevas : La tabla 5 muestra estructuras principales de variantes de xilanasa utilizadas. Y5 corresponde a la SEC ID NO: 2.

ID Variante #154 BACSU_XynA- G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L #160 BACSU_XynA- G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L Y5 TRIRE_Xyn2-T2C/T28C/K58R/+191D Y5 TRIRE_Xyn2-T2C/T28C/K58R/T120A/+191D T120A Las mutaciones introducidas y los resultados obtenidos se ilustran en la tabla 6.

TABLA 6. MUTACIONES INTRODUCIDAS Y RESULTADOS OBTENIDOS. LAS ESTRUCTURAS PRINCIPALES UTILIZADAS ESTAN EN NEGRILLAS Mutante WU-AX act E-AX act WU-AX/WE-AX #154/N141Q 1.965 13 146 #154/N54Q/N141Q 1.611 10 159 #160/N54Q 1.203 7 161 #160/N141Q 1.785 10 175 #154/N54W/N141Q 824 7 118 #160/N54W/N141Q 1.005 6 169 Y5/S63W 918 25 36 Y5 35,550 1.487 24 #154 10.350 106 98 #160 5.400 34 157 Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior se incorporan en la presente como referencia. Diversas modificaciones y variaciones a los métodos descritos y sistema de la presente invención serán evidentes para los expertos en el ámbito sin apartarse del alcance y espíritu de la presente invención. Aunque la presente invención se ha descrito en relación con modalidades preferidas específicas, debe entenderse que la invención, como se reivindica, no debe considerarse como limitada indebidamente a las modalidades específicas. En realidad, diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención los cuales son obvios para los expertos en los campos de bioquímica y biotecnología se pretende que se encuentren dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones .

LISTADO DE SECUENCIAS (LOS . AMINOÁCIDOS EN NEGRILLAS SON AMINOÁCIDOS , LOS CUALES CORRESPONDEN A T110 DE LA SEC ID NOi 1) ; Secuencia de aminoácidos de la xilanasa natural de Bacillus subtilis madura (SEC ID NO: 1) : ASTDYWQNWTDGGGIVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFWGKGWTTGSPFRT INYNAG WAPNGNGYLTLYGVVTRSPUEYYWDSWGTYRPTGTYKGTV SDGGTYDIYTT TRYNAPSIDGDRTTFTQYWSVRQSKRPTGSNATITFSNHVNAWKSHG NLGSNWAYQV MA TEGYQSSGSSNVTVW Secuencia de aminoácidos de la xilanasa Trichoderma reesei madura (SEC ID NO: 2) , también denominada en la presente como Y5 : QCIQPGTGYN NGYFYSYWN DGHGG VTYCNG PGGQFSVN WSNSG N FVGGKG WQPGTKN RVINFSGSYNPNGNSYLSVYGWSRNPLIEYYIVENFGTYNPSTGATKLGEVTSDGSVYDIY RTQRVNQPSIIGTATFYQYWSVRRNHRSSGSVNTANHFNAWAQQGLTLGTMDYQIVAVE GYFSSGSASrrVSD Secuencia de aminoácidos de la xilanasa natural XynA de Thermomyces lanuginosus madura (SEC ID NO: 3) QTTPNSEGWHDGYYYSWWSDGGAQATYTNLEGGTYEISWGDGGNLVGGKGWNPGLNA RAIHFEGVYQPNGNSYLAVYGWTRNPLVEYYIVENFGTYDPSSGATDLGTVECDGSIYRLG KTTRVNAPSIDGTQTFDQYWSVRQDKRTSGTVQTGCHFDAWARAGLNVNGDHYYQIVA TEGYFSSGYARITVADVG Streptomyces viridosporus madura (SEC ID NO : 4) WTDAQGTVS M DLGSGGTYSTQ W RNTG N F VAG KG WSTGG RKTVN YSGTFN PSG N A YLT LYGWTTGPUEYYIVDNWGTYRPTGKYKGTVTSDGGTYDIYKTTRYNAPSIEGTKTFDQYW SVRQSKRTGGTITSGNHFDAWARNGMNLGN HNYMIMATEGYQSSGSSTITV SEC ID NO: 5 (gi | 139868 | sp | P18429.1 | XYNA BACSU_RecName : Completo = Endo-1, 4 -beta-xilanasa A: Corto = Xilanasa A: Nombre alternativo: Completo = 1, 4-p-D-xilano y xilanohidrolasa A: MFKFKKNFLVGLSAALMSISLFSATASAASTDYWONWTDGGGIVNAVNGSGGNYSVNW SNTGNFWGKGWTTGSPFRTINYNAGVWAPNGNGYLTLYGWTRSPLIEYYVVDSWGTYR PTGTYKGTVKSDGGTYDIYTTTRYNAPSIDGDRTTFTOYWSVROSKRPTGSNATITFSNH VNAW SHGMNLGSNWAYOVMATEGYOSSGSSNVTVW SEC ID NO: 6 (gi | 2302074 | emb | CAA03092.1 | producto protelnico no denominado [no identificado] ) : MRO KLTLILAFLVCFALTLPAEIIOAQIVTDNSIGNHDGYDYEFWKDSGGSGTMILNHGG TFSAOWNNVNNILFRKGK FNETOTHOOVGNMSINYGANFOPNGNAYLCVYGWTVDPLV EYYIVDSWGNWRPPGATP GTITVDGGTYDIYETLRVNOPSIKGIATFKOYWSVRRSKRT SGTISVSNHFRAWENLG NMGKMYEVALTVEGYOSSGSANVYSNTLRINGNPLSTISND ESITLDKNN SEC ID NO: 7 (gi I 167246404 I gb |ABZ24364.1 I Secuencia 5 de la patente de E.U.A. 7314743) : MVSFTSLLAASPPSRASCRPAAEVESVAVEKROTIOPGTGYNNGYFYSYWNDGHGGVTYT NGPGGOFSVNWSNSGNFVGGKGWOPGT NKVINFSGSYNPNGNSYLSVYGWSRNPLIE YYIVENFGTYNPSTGAT LGEVTSDGSVYDIYRTORVNQPSIIGTATFYOYWSVRRNHRSS GSVNTANHFNAWAOOGLTLGTMDYOIVAVEGYFSSGSASITVS SEC ID NO: 8 (gi | 5969551 | g |AAE10889.1 | Secuencia 2 de la patente de E.U.A. 5817500) : MVGFTPVAU^ALAATGALAFPAGNATELE ROTTPNSEGWHDGYYYSWWSDGGAOATYT NLEGGTYEISWGDGGNLVGGKGWNPGLNARAIHFEGVYOPNGNSYLAVYGWTRNPLVEY YIVENFGTYDPSSGATDLGTVECDGSIYRLGKTTRVNAPSIDGTOTFDOYWSVROD RTS GTVOTGCHFDAWARAGLNVNGDHYYOIVATEGYFSSGYARITVADVG SEC ID NO: 9 (gi | 76Q59070 | emb | CAJ30753.1 | producto de proteína no denominado [Paenibacillus pabuli] ) : MFKFGKKLLTWLAASMSFGVFAATTGATDYWONWTDGGGTVNAVNGSGGNYSVNWO NTGNFWGKGWTYGTPNR VNYIMAGVFSPSGNGYLTFYGWTRNALIEYYWDNWGTYRP TGTYKGTVTSDGGTYDIYTTMRYNOPSIDGYSTFPOYWSVRQSKRPIGVNSQITFONHVN AWASKGMYLGNSWSYOVMATEGYOSSGSSNVTVW SEC ID NO: 10 (gi | 74197761 | em | CAJ29666.1] producto de proteína no denominado [Bacillus halodurans] ) : M FKFVTKVLTVVIAATISFCLSAVPASANTYWOYWTDGGGTVN ATNG PGG NYSVTWRDT GNFWGKGWEIGSPNRTIHYNAGVWEPSGNGYLTLYGWTRNOLIEYYVVDNWGTYRPTG THRGTWSDGGTYDIYTTMRYNAPSIDGTOTFOOFWSVROSKRPTGNNVSITFSNHVNA WRNAGMNLGSSWSYOVLATEGYOSSGRSNVTVW SEC ID NO: 11 (gil4756811 | em | CAB42305.1] producto de proteína no denominado [no identificado] ) : MROKKLTFILAFLVCFALTLPAEIIOAOIVTDNSIGNHDGYDYEFWKDSGGSGTMILIMHGG TFSAOWNNVNNILFRKGKKFNETOTHOOVGNMSINYGANFOPNGNAYLCVYGWTVDPLV EYYIVDSWGNWRPPGATP GTnVDGGTYDIYETLRVNOPSIKGIATFKOYWSVRRSKRT SGTISVSNHFRAWENLG NMGKMYEVALTVEGYOSSGSANVYSNTLRINGNPLSTISND KSITLD NN SEC ID NO: 12 (gi | 2293951 | em | CAA02246.1] producto de proteína no denominado [Bacillus subtilis] Bacillus subtilis: (documento de E.U.A. 5,306633)) : MF FK KFLVGLTAAFMSISMFSATASAAGTDYWONWTDGGGTVNAVNGSGGNYSVNW SNTGNFWGKGWTTGSPFRTINYNAGVWAPrjGNGYLTLYGWTRSPLIEYYVVDSWGTYR PTGTYKGTVKSDGGTYDIYTTTRYNAPSIDGDNTTFTOYWSVROSKRPTGSNAAITFSNH VNAW SHGMNLGSNWAYOVLATEGYKSSGSSNVTVW SEC ID NO: 13 (gi | 42688917 | gb | AAS31735.1 | Secuencia 14 de la patente de E.U.A. 6682923)) : MNLRKLRLLFVMCIGLTLILTAVPAHARTITNNEMGNHSGYDYELW DYGNTSMTLNNGG AFSAGWNNIGNALFRKG FDSTRTHHOLGNISINYNASFNPGGNSYLCVYGWTOSPLAE YYIVDSWGTYRPTGAY GSFYADGGTYDIYETTRVNOPSIIGIATF QYWSVROTKRTSGT VSVSAHFR WESLGMP G MYETAFTVEGYOSSGSANVMTNOLFIGN · SEC ID NO: 14 (gi | 10040204 | emb | CAC07798.1 | producto de proteína no denominado [Penicillium funicolosum] ) : MKLFLAAIVLCATAATAFPSELAORAAGDLSKROSITTSOTGTNNGYYYSFWTNGGGEVTY TNGDNGEYSVT /VVDCGDFTSGKGWNPANAOTVTYSGEFNPSGNAYLAWGWTTDPLVE YYILESYGTYNPSSGLTSLGQVTSDGGTYDIYSTORVNOPSIEGTSTFNOYWSVRTEKRVG GTVTTAN H FAAW KALG LEM GTYN YM IVSTEG YESSG SSTITVS SEC ID NO: 15 [gi | 2302074 | emb | CAA03092.1 | producto de proteína no denominado [no identificado]) : OIVTDNSIGNHDGYDYEFWKDSGGSGTMILNHGGTFSAOWNNVNNILFRKGKKFNETOT HOOVGNMSINYGANFOPNGNAYLCVYGWTVDPLVEYYIVDSWGNWRPPGATPKGTITVD GGTYDIYETLRVNOPSI GIATFKOYWSVRRSKRTSGTISVSNHFRAWENLGMNMGKMY EVALTVEGYOSSGSANVYSNTLRINGNPLSTISNDESITLD NN SEC ID NO: 16 (gi 1167246404 | gb | ABZ24364.11 Secuencia 5 de la patente de E.U.A. 7314743) : O^OPGTGymGYF/Sy\NmG GGVTYTNGPGGOFS fi\NSNSGNFVGGKG\NOPGTKfi KVINFSGSYNPNGNSYLSVYGWSRNPÜEYYIVENFGTYNPSTGATKLGEVTSDGSVYDIY RTORVNQPSHGTATFYOYWSVRRNHRSSGSVNTANHFNAWAOQGLTLGTMDYQIVAVE GYFSSGSASITVS SEC ID NO: 17 (gi | 76059070 | em | CAJ30753.1 | producto de proteína no denominado [Paenibacillus pabuli] ) : TDYWONWTDGGGTVNAVNGSGGNYSVNWONTGNFWG GWTYGTPNRWNYNAGVF SPSGNGYLTFYGWTRNALIEYYVVDNWGTYRPTGTY GTVTSDGGTYDIYTTMRYNOPSI DGYSTFPOYWSVROSKRPIGVNSOITFONHVNAWASKGMYLGNSWSYOVMATEGYOSS GSSNVTVW SEC ID NO: 18 (gi | 74197761 | emb | CAJ29666.1 | producto de proteína no denominado [Bacillus halodurans] ) : NTYWOYWTDGGGTVNATNGPGGNYSVTWRDTGNFWG GWEIGSPNRTIHYNAGVWE PSG NGYLTLYG WTRNOU EYYWDN WGTYRPTGTH RGTVVSDGGTYDIYTTM RYN APSI D GTQTFQQFWSVRQS RPTGNNVSITFSNHVNAWRNAGMNLGSSWSYOVLATEGYOSSG RSNVTVW SEC ID NO: 19 (gi | 4756811 | em | CAB42305.1 | producto de proteína no denominado) : OIVTDNSIGN HDGYDYEFW DSGGSGTMILNHGGTFSAOWNNVNNILFRKGKKFNETOT HQOVGNMSINYGANFOPNGNAYLCVYGWTVDPLVEYYIVDSWGNWRPPGATPKGTITVD GGTYDIYETLR OPSI GIATF OYWSVR SKRTSG?SVSNHF AWENLGM MGKMY EVALTVEGYOSSGSANVYSNTLRINGNPLSTISNDKS-TLDKNN SEC ID NO: 20 (gi | 2293951 | emb | CAA02246.1 | producto de proteína no denominado [Bacillus subtilis] Bacillus subtilis: (documento de E.U.A. 5306633)) : AGTDYWONWTDGG6TVNAVNGSGGNYSVNW5NTGNFWG GWTTGSPFRTINYNAGV WAPNGNGYLTLYGWTRSPLIEYYWDSWGTYRPTGTYKGTVKSDGGTYDIYTTTRYNAPS ÍDGDNTTFTOYWSVROS RPTGSNAAITFSIMHVNAWKSHGMNLGSNWAYOVLATEGYK SSGSSNVTVW SEC ID NO: 21 (gi | 42688917 | gb |AAS31735.11 Secuencia. 14 de la patente de E.U.A. 6682923)) : RTITNNEMGNHSGYDYELW DYGNTSMTLNNGGAFSAGWNNIGNALFRKGKKFDSTRT HHOLGNISINYNASFNPGGNSYLCVYGWTOSPLAEYYIVDSWGTYRPTGAYKGSFYADGG TYDIYETTRVNOPSIIGIATFKOYWSVROTKRTSGTVSVSAHFRKWESLGMPMGKMYETA FTVEGYOSSGSAIMVMTNOLFIGN SEC ID NO: 22 (gi | 10040204 | emb | CAC07798.1 | producto de proteína no denominado [Penicillium funiculosu ] ) : AFPSEUVORAAGDI^KROSITTSQTGTNNGYYYSFWTNGGGEVTYTNGDNGEYSVTWVD CGDFTSGKGWNPANAOTVTYSGEFNPSGNAYLAVYGWTTDPLVEYYILESYGTYNPSSGL TSLGOVTSDGGTYDIYSTORVNOPSIEGTSTFNOYWSVRTEKRVGGTVTTANHFAAWKA LGLEMGTYNYMIVSTEGYESSGSSTITVS SEC ID NO: 23 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante BS3 de xilanasa de Bacillus subtilis madura (natural con mutaciones D11F/R122D) : ASTDYWQ WTFGGGIV AVNGSGG YSVNWS TG FVVGKGWTTGSPF ?NY AG WAPNGNGYLTLYGWTP^PLIEYYWDSWGTYRPTGTYKGTVKSDGGTYDIYTTTRYNAPS IDGDDTTFTQYWSVRQSKRPTGSNATITFSNHVNAWKSHGMNLGSNWAYQVMATEGYQ SSGSSNVTVW La SEC ID NO: 24 muestra la secuencia inhibidora de xilanasa de trigo madura.- - - MPPVLLLVLAASLVALPSCQSLPVLAPVTKDPATSLYTIPFHDGASLVLDVAGPLVWSTCDG GQPPAEIPCSSPTCLLANAYPAPGCPAPSCGSDKHDKPCTAYPYNPVSGACAAGSLSHTRF VANTTDGSKPVS VNVGVLAACAPS LLASLPRGSTGVAGLANSGLALPAQVASAQKVAN RFLLCLPTGGPGVAIFGGGPVPWPQFTQSMPYTPLVTKGGSPAHYISARSIWGDTRVPVP EGALATGGV LSTRLPYVLLRPDVYRPLMDAFT ALAAQHANGAPVARAVEAVAPFGVCY DTKTLGNNLGGYAVPNVQLGLDGGSDWTMTGKNS VDVKQGTACVAFVEMKGVAAGD GRAPA VILGGAQMEDFVLDFD EKKRLGFSRLPHFTGCGGL SEC ID NO: 25 (Secuencia 11 del documento de E.U.A. 6, 682, 923) : ASTDWWENWTIGGGIVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFDVAKGWTTGSPFRTINYNÁGV WAPNGWGELELYGWTRSPLIEYLWDSWGTNRPTGTY GTVKSDGGTYDIYTDTRYNYP SEDGDRTTMTQYSSVRQSKRPTGSNATITFTNHVNAWKSHGMNLGSNWAYQD ATEGY QSSGSSNVTVW MODALIDADES DE LA INVENCION 1. Un polipéptido que tiene actividad de xilanasa y que comprende una secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 75% de identidad con una secuencia de aminoácidos que se selecciona de las SEC ID NOS: 1-22 y polipéptido el cual tiene: i) una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 12 y 13; y ii) una o más modificaciones adicionales de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179; en donde las posiciones están determinadas como la posición que corresponde a la posición de la secuencia de - 1 - xilanasa de 23. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1 por alineación. 2. Un polipéptido que tiene actividad de xilanasa y que comprende una secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 75% de identidad con una secuencia de aminoácidos que se selecciona de las SEC ID NOS: 1-22 y polipéptido el cual tiene: iii) una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 12 y 13; y iv) una o más modificaciones adicionales de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 34, 77, 81, 82, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 159, 162, 164, 166 y 175; en donde las posiciones están determinadas como la posición que corresponde a la posición de la secuencia de xilanasa de B . subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1 por alineación. 3. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 ó 2, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 4. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 ó 2, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: 12F, 13Y, 15Y, 34K, 77V, 77M, 77Y, 77L, 77S, 811, 821, 99Y, 104W, 110A, 113D, 113A, 114F, 114D, 114Y, 118V, 122F, 122D, 154R, 159D, 162E, 162D, 164F, 166F, 175L, 175K, 175E, 175Y y 179Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 5. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-3, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: G12F, G13Y, I15Y, G34K, I77V, I77M, I77Y, I77L, I77S, V81I, V82I, K99Y, T104W, T110A, Y113D, Y113A, N114F, N114D, N114Y, I118V, R122F, R122D, K154R, N159D, S162E, S162D, 164F, Y166F, Q175L, Q175K, Q175E, Q175Y y S179Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 6. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-4, en donde el polipéptido tiene por lo menos 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 ó 95% de identidad con la secuencia con la cual tiene el porcentaje más alto de identidad seleccionado de la SEC ID NO: 1-22. 7. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, que tiene un pliegue ß-jelly roll. 8. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-6, en donde una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de 12 y 13 es una sustitución de aminoácido. 9. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-7, en donde la modificación de aminoácido en la posición 12 es una sustitución de aminoácido con cualquier residuo aminoácido diferente que se selecciona del grupo que consiste de: isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, cisteína, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptofano, valina, prolina, serina, tirosina, arginina e histidina . 10. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de l s modalidades 1-8, en donde la modificación de aminoácido en la posición 13 es una sustitución de aminoácido con cualquier residuo aminoácido diferente que se selecciona del grupo que consiste de: isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, cisteína, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptofano, valina, prolina, serina, tirosina, arginina e histidina . 11. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-9, en donde la modificación de aminoácido en la posición 12 es una sustitución con cualquiera de los residuos aminoácidos diferentes que se seleccionan del grupo que consiste de: fenilalanina y tirosina. 12. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-10, en donde la modificación de aminoácido en la posición 13 es una sustitución con cualquiera de los residuos aminoácidos diferentes que se seleccionan del grupo que consiste de: fenilalanina y tirosina. 13. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-11, que tiene un número total de aminoácidos menor de 250, tal como menor de 240, tal como menor de 230, tal como menor de 220, tal como menor de 210, tal como menor de 200 aminoácidos, tal como en el intervalo de 160 a 240, tal como en el intervalo de 160 a 220 aminoácidos . 14. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-12, que comprende una o más modificaciones en cualquiera de una o más posiciones de aminoácidos: 12, 13, 34, 77, 81, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 y 175, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 15. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-13, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: 12F, 13Y, 13F, 110A, 122D, 113A, 13Y, 113D, 175L, 122F, 34K, - - 99Y, 104W, 154R, 159D, 175K, 811, 166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, . 77L, 77M, 77S, 77V y 77Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 16. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-14, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: G12F, G13Y, G13F, T110A, R122D, Y113A, G13Y, Y113D, Q175L, R122F, G34K, K99Y, T104W, K154R, N159D, Q175K, B81I, Y166F, S162E, S162D, W164F, N114D, N114Y, N114F, I118V, I77L, I77 , I77S, I77V e I77Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 17. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-15, que comprende una o más modificaciones en cualquiera de una o más posiciones de aminoácidos: 12, 13, 99, 104, 110, 113, 122, 141, 154, 159 y 175, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 18. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-16, que comprende una o varias sustituciones en las posiciones de aminoácidos: 13 y 122, una o varias de las posiciones están determinadas como la - - posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 19. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16-17, que comprende además una o más modificaciones en cualquiera de una o más posiciones de aminoácidos: 114 y 166, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B . subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 20. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16-17, que comprende además una o más sustituciones en cualquiera de una o más posiciones de aminoácidos: 114 y 166, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B . subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 21. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-17, que comprende una o varias sustituciones en por lo menos cuatro de las siguientes posiciones de aminoácidos: 12, 13, 99, 104, 110, 113, 114, 122, 141, 154, 159, 166 y 175 una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 22. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-20, que comprende una o varias sustituciones en las posiciones de aminoácidos: 13, 113 y 122, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 23. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-20, que comprende una o varias sustituciones en las posiciones de aminoácidos: 12, 113 y 122, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B . subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 24. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-21, que comprende una o varias sustituciones en las posiciones de aminoácidos: 13, 113, 122 y 175, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 25. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-23, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: 12F, 13Y, 99Y, 104W, 110A, 113D, 114D, 114F, 122F, 154R, 159D, 166F, 175K y 175L, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 26. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-24, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido tiene por lo menos cinco, seis, siete, ocho, - 1 - nueve o diez sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia que se selecciona de entre las SEC ID NOS: 1-22 con la cual tiene la mayor identidad. 27. El polipéptido de acuerdo con la modalidad 25, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido tiene por lo menos nueve o diez sustituciones de aminoácidos. 28. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-26, que tiene actividad de solubilización de salvado. 29. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-27, en forma aislada. 30. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-28 que tiene una actividad de xilanasa mejorada en comparación con la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1 medida en un análisis de actividad de xilanasa. 31. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-29, que tiene una actividad de xilanasa mejorada como resultado de la modificación en una posición que se selecciona de 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 32. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-30 que tiene una actividad de solubilización de salvado mejorada en comparación con la secuencia de aminoácidos de B . s btilis mostrada como la SEC ID NO: 1, medida en un análisis de actividad de solubilización de salvado. 33. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-31, que tiene una actividad de solubilidad de salvado mejorada como resultado de la modificación en la posición que se selecciona de 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 34. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-32, que tiene una sensibilidad reducida a un inhibidor de xilanasa. 35. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-33, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende modificaciones en las posiciones que se seleccionan de la lista que consiste de: a) 13/110/113/122/154/159/175; b) 13/99/104/110/113/122/154/159/166/175; e) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; d) 13/110/113/122/175; e) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; - - f ) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; g) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ; h) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; i) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; j) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; k) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; 1) 13/113/122/175; m) 13/81/99/104/110/113/122/154/159/175; n) 13/110/113/122/164/175; O) 13/110/113/122/162/175; p) 13/110/113/122/175; q) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; r) 13/113/122/175; S ) 12/113/122/175; t) 13/113/122/175; u) 13/34/110/113/122/175; v) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; w) 13/99/104/113/122/175; x) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; y) 13/99/104/110/113/118/122/154/159/175; z) 13/15/113/122/175; aa) 13/110/113/122/162/175; y bb) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; cc) 13/99/104/110/113/122/141/154/159/175; dd) 13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175; ee) 13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175; ff) 13/54/99/104/110/113/114/122/154/159/175; gg) 13/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175; y hh) 13/54/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175 ; una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis que se muestra como la SEC ID NO: 1. 36. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-34, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende sustituciones de aminoácidos que se seleccionan de la lista que consiste de: a) 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; b) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/ 175L; c) 13Y/99Y/104 /110A/113D/114F/122F/154R/159D/ 175L; d) 13Y/110A/113D/122F/175L; e) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; f) 13Y/99Y/l04W/ll0A/113D/122F/l54R/159Djl75K; g) 13Y/99Y/104 /110A/113D/114D/122F/154R/159D/ 175K; h) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/ 175L; i) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/ 175L; j ) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/ 175K; k) 13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; 1) 13Y/113D/122D/175L;. m) 13Y/81I/99Y /104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; n) 13Y/110A/113D/122D/164F/175L; O) 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; p) 13Y/110A/113D/122D/175L; q) 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; r) 13F/113D/122D/175L; S) 12F/113D/12D2/175L; t) 13Y/113D/122F/175L; u) 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; v) 13Y/77V/99Y/104 /110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; w) 13Y/99Y/104 /113D/122D/175L; X) 13Y/77M/99Y/104 /110A/113D/122F/154R/159D/175L; y) 13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/ 175L; 2) 13Y/15Y/113D/122D/175L; aa) 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; bb) 13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; ce) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/ 175L; dd) 13Y/54Q/99Y /104W/110A/113D/122F/141Q/154R/ 159D/175L; ee) 13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/ 159D/175L; ff) 13Y/54Q/ 9Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/ 159D/175L; gg) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/ 159D/175L; y hh) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/ 154R/159D/175L; una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis que se muestra como la SEC ID NO: 1. 37. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-35, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos la cual consiste de las sustituciones de aminoácidos que se seleccionan de la lista que consiste de: a) 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; b) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/ 175L; C) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/ 175L; d) 13Y/110A/113D/122F/175L; e) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; f) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K; g) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/ 175K; h) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/ 175L; i) 13Y/99Y /104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/ 175L; j ) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/ 175K; k) 13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; 1) 13Y/113D/122D/175L; m) 13Y/81I/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; n) 13Y/110A/113D/122D/164F/175L; O) 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; p) 13Y/110A/113D/122D/175L; q) 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; r) 13F/113D/122D/175L; - - s) 12F/113D/12D2/175L; t) 13Y/113D/122F/175L; u) 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; v) 13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; w> 13Y/99Y/104 /113D/122D/175L; x) 13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; y) 13Y/99Y/104 /110A/113D/118V/122F/154R/159D/ 175L; z) 13Y/15Y/113D/122D/175L; aa) 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; y bb) 13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/ 175L; ce) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/ 175L; dd) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/ 159D/175L; ee) 13Y/54W/99Y/104 /110A/113D/122F/141Q/154R/ 159D/175L; ff) 13Y/54Q/99Y/104 /110A/113D/114F/.122F/154R/ 159D/175L; gg) 13Y/99Y/104 /110A/113D/114F/122F/141Q/154R/ 159D/175L; y hh) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/ 154R/159D/175L, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 38. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-36, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 1 la cual consiste de sustituciones de aminoácidos que se seleccionan de la lista que consiste de: a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/ 99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/ Y166F/Q175L; c) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/ N159D/Q175L; d) G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/ Q175L; f) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/ Q175K; g) G13Y/K99Y/T104 /T110A/Y113D/N114D/R122F/ 154R/ N159D/Q175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/ N159D/Q175L; i) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; j ) G13Y/K99Y/T104 /T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/ N159D/Q175K; k) G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; 1) G13Y/Y113D/R122D/Q175L; m) G13Y/V81I/K99Y/T104 /T110A/Y113D/R122F/K154R/ -· N159D/Q175L; n) G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; p) G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L; q) G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; r) G13F/Y113D/R122D/Q175L; s) G12F/Y113D/R122D/Q175L; t) G13Y/Y113D/R122F/Q175L; u) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; v) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; w) G13Y/K99Y/T104 /Y113D/R122D/Q175L; x) G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/I118V/R122F/K154R/ N159D/Q175L; z) G13Y/I15Y/Y113D/R122D/Q175L; aa) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; y bb) G13Y/177S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L ce) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/ N159D/Q175L; dd) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/ K154R/N159D/Q175L; ee) G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/141Q/ K154R/N159D/175L; ff) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/ K154R/N159D/Q175L; gg) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/ K154R/N 159D/Q175L; y hh) G13Y/54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/ 141Q/K154R/N159D/Q175L. 39. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-37, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, el cual consiste de las sustituciones de aminoácidos que se seleccionan de la lista que consiste de: a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/K99Y/T104 /T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/ Y166F/Q175L; C) G13Y/K99Y/T104 /T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/ N159D/Q175L; d) G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; - - e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/-N159D/Q175L; f ) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/-N159D/Q175K; g) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/ N159D/Q175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/-K154R/N 159D/Q175L; i) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R /N159D/Q175L; j ) G13Y/K99Y/T104 /T110A/Y113D/N114Y/R122F/-K154R/N159D/Q175K; k) G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q175L; 1) G13Y/Y113D/R122D/Q175L; m) G13Y/V81I/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R-/N159D/Q175L; n) G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; P) G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L; q) G13Y/I77Y/K99Y /T104W/T110A/Y113D/R122F/ K154R/N159D/Q175L; r) G13F/Y113D/R122D/Q175L s) G12F/Y113D/R122D/Q175L t) G13Y/Y113D/R122F/Q175L u) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; v) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/ N159D/Q17SL; w) G13Y/K99Y/T104W/Y113D/R122D/Q175L; x) G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/ N159D/Q175L; y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/I118V/R122F /K154R/N 159D/Q175L; z) G13Y/I15Y/Y113D/R122D/Q175L; aa) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; y bb) G13Y/I775/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R /N159D/Q175; ce) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/ N141Q/K154R/N159D/Q175L; dd) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/ N141Q/K154RjN 159D/Q175L; ee) G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/ 141Q/K154R/N159D/175L; ff) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F /R122F/K154R/N159D/Q175L; gg) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F /141Q/K154R/N159D/Q175L; Y hh) G13Y/54Q/K99Y/T104 /T110A/Y1133D/N114F/ R122F/141Q/K154R/N159D/Q175L. 40. Un método de identificación de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-38, el método comprende : (i) preparar un polipéptido que tiene por lo menos 75% de identidad con una secuencia de aminoácidos que se selecciona de las SEC ID NO: 1-22 y polipéptido el cual tiene una modificación de aminoácidos en uno o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 12 y 13; y una o más modificaciones adicionales de aminoácidos adicionales en una posición que se selecciona de 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179; en donde la posición se determina como la posición correspondiente de la secuencia de xilanasa de B . subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1 por alineación; (ii) comparar la solubilización de salvado y/o la actividad xilanasa del polipéptido con la solubilización de salvado y/o la actividad de xilanasa de la secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre las SEC ID NOS: 1-22 con la cual tiene el porcentaje de identidad más grande; y (iii) seleccionar el polipéptido si tiene una solubilización de salvado mejorada y/o actividad de xilanasa mejorada en comparación con la secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre las SEC ID NOS: 1-22 con la cual tiene el porcentaje de identidad más alto. 41. Un método de preparación de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-38, el método - - comprende expresar una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido; y opcionalmente aislar y/o purificar el polipéptido después de la expresión. 42. El método de acuerdo con la modalidad 40, en donde el polipéptido se prepara al modificar ya sea una secuencia de aminoácidos polipeptídica en la posición que se selecciona de 12 y 13 o un codón que codifica para un residuo aminoácido en la posición que se selecciona de entre 12 y 13, en donde la posición 12 y 13 está determinada con referencia a la secuencia de xilanasa B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1. 43. Una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 38. 44. Un vector que comprende la secuencia nucleotídica de acuerdo con la modalidad 42. 45. Una célula que ha sido transformada con la secuencia nucleotídica de la modalidad 42 o el vector de la modalidad 43. 46. Un organismo hospedador que ha sido transformado con la secuencia nucleotídica de la modalidad 42 o el vector de la modalidad 43. 47. Una composición que comprende el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-38 o un polipéptido identificado de acuerdo con cualquiera de la - - modalidad 39 o un polipéptido preparado de acuerdo con las modalidades 40-41 de la secuencia nucleotídica de acuerdo con la modalidad 42 o el vector de acuerdo con la modalidad 43 o la célula de acuerdo con la modalidad 44 o el organismo de acuerdo con la modalidad 45 mezclado con un componente no tóxico . 48. Una masa que comprende el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-38 o un polipéptido identificado de acuerdo con la modalidad 39 o un polipéptido preparado de acuerdo con las modalidades 40-41 o la secuencia nucleotídica de acuerdo con la modalidad 42 o el vector de acuerdo con la modalidad 43 o la célula de acuerdo con la modalidad 44 o el organismo de acuerdo con la modalidad 45 mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la modalidad 46. 49. Un producto de panadería que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-38 o un polipéptido identificado de acuerdo con la modalidad 39 o un polipéptido preparado de acuerdo con las modalidades 40-41 o una secuencia nucleotídica de acuerdo con la modalidad 42 o el vector de acuerdo con la modalidad 43 o la célula de acuerdo con la modalidad 44 o el organismo de acuerdo con la modalidad 45 mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la modalidad 46 o una masa de acuerdo con la modalidad 47. - - 50. Pienso . para animales que comprende el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-38 o un polipéptido identificado de acuerdo con la modalidad 39 o un polipéptido preparado de acuerdo con las modalidades 40-41 o la secuencia nucleotídica de acuerdo con la modalidad 42 o el vector de acuerdo con la modalidad 43 o la célula de acuerdo con la modalidad 44 o el organismo de acuerdo con la modalidad 45 mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la modalidad 46. 51. Composiciones limpiadoras que comprenden el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-38 o un polipéptido identificado de acuerdo con la modalidad 39 o un polipéptido preparado de acuerdo con las modalidades 40-41. 52. Un método de degradación o modificación de la pared celular de una planta, método el cual comprende poner en contacto la pared celular de la planta con el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-38 o un polipéptido identificado de acuerdo con la modalidad 39 o un polipéptido preparado de acuerdo con las modalidades 40-41 de la secuencia nucleotídica de acuerdo con la modalidad 42 o el vector de acuerdo con la modalidad 43 o la célula de acuerdo con la modalidad 44 o el organismo de acuerdo con la modalidad 45 mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la modalidad 46. - - 53. Un método de procesamiento de material vegetal, método el cual comprende poner en contacto el material vegetal con el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-38 o un polipéptido identificado de acuerdo con la modalidad 39 o un polipéptido preparado de acuerdo con las modalidades 40-41 o la secuencia nucleotídica de acuerdo con la modalidad 42 o el vector de acuerdo con la modalidad 43 o la célula de acuerdo con la modalidad 44 o el organismo de acuerdo con la modalidad 45, mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la modalidad 46. 54. El uso del polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-38 o un polipéptido identificado de acuerdo con la modalidad 39 o un polipéptido preparado de acuerdo con las modalidades 40-41 o la secuencia nucleotídica de acuerdo con la modalidad 42 o el vector de acuerdo con la modalidad 43 o la célula de acuerdo con la modalidad 44 o el organismo de acuerdo con la modalidad 45 mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la modalidad 46 en un método de modificación de los materiales vegetales . 55. El uso del polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-38 o un polipéptido identificado de acuerdo con la modalidad 39 o un polipéptido preparado de acuerdo con las modalidades 40-41 o la secuencia - - n clqotídica de acuerdo con la modalidad 42 o el vector de acuerdo con la modalidad 43 o la célula de acuerdo con la modalidad 44 o el organismo de acuerdo con la modalidad 45 mezclado con un componente no tóxico o una composición de acuerdo con la modalidad 46 en cualquiera de uno o más que se seleccionan independientemente de: horneado, procesamiento de cereales, licuefacción de almidón, producción de bioetanol a partir de material celulósico, pienso para animales, en procesamiento de madera, mejoramiento del blanqueado de la pulpa de madera y como una composición limpiadora. 56. Un polipéptido o fragmento del mismo sustanciamlente como se describe en lo anterior con referencia a los ejemplos y figuras. 57. Un método sustancialmente como se describe en lo anterior con referencia a los ejemplos y figuras. 58. Una composición sustancialmente como se describe en lo anterior con referencia a los ejemplos y figuras . 59. Un uso sustancialmente como se describe en lo anterior con referencia a los ejemplos y figuras.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polipéptido que tiene actividad de xilanasa y que comprende una secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 75% de identidad con una secuencia de aminoácidos que se selecciona de las SEC ID NOS: 1-22 caracterizado porque tiene: i) una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 12 y 13; y ii) una o más modificaciones adicionales de aminoácidos en una posición que se selecciona de: 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179; en donde las posiciones están determinadas como la posición que corresponde a la posición de la secuencia de xilanasa de B . subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1 por alineación .

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 y 179, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

3. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: 12F, 13Y, 15Y, 34K, 77V, 77M, 77Y, 77L, 77S, 811, 821, 99Y, 104W, 110A, 113D, 113A, 114F, 114D, 114Y, 118V, 122F, 122D, 154R, 159D, 162E, 162D, 164F, 166F, 175L, 175K, 175E, 175Y y 179Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

4. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, caracterizado porque comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: G12F, G13Y, I15Y, G34K, I77V, I77M, I77Y, I77L, I77S, V81I, V82I, K99Y, T104W, T110A, Y113D, Y113A, N114F, N114D, N114Y, I118V, R122F, R122D, K154R, N159D, S162E, S162D, 164F, Y166F, Q175L, Q175K, Q175E, Q175Y y S179Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.

5. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, caracterizado porque el polipéptido tiene por lo menos 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 ó 95% de identidad con la secuencia con la cual tiene el porcentaje más alto de identidad seleccionado de la SEC ID NOS : 1-22.

6. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, caracterizado porque que tiene un pliegue ß-jelly roll.

7. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, caracterizado porque una o dos modificaciones de aminoácidos en una posición que se selecciona de 12 y 13 es una sustitución de aminoácido.

8. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, caracterizado porque la modificación de aminoácido en la posición 12 es una sustitución de aminoácidos con cualquier residuo aminoácido diferente que se selecciona del grupo que consiste de: isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, cisteína, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptofano, valina, prolina, serina, tirosina, arginina e histidina.

9. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, caracterizado porque la modificación de aminoácido en la posición 13 es una sustitución de aminoácidos con cualquier residuo aminoácido diferente que se selecciona del grupo que consiste de: isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, cisteína, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptofano, valina, prolina, serina, tirosina, arginina e histidina.

10. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, caracterizado porque la modificación de aminoácido en la posición 12 es una sustitución con cualquiera de los residuos aminoácidos diferentes que se seleccionan del grupo que consiste de: fenilalanina y tirosina.

11. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, caracterizado porque la modificación de aminoácido en la posición 13 es una sustitución con cualquiera de los residuos aminoácidos diferentes que se seleccionan del grupo que consiste de: fenilalanina y tirosina.

12. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11, caracterizado porque tiene un número total de aminoácidos menor de 250, tal como menor de 240, tal como menor de 230, tal como menor de 220, tal como menor de 210, tal como menor de 200 aminoácidos, tal como en el intervalo de 160 a 240, tal como en el intervalo de 160 a 220 aminoácidos.

13. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12, caracterizado porque comprende una o más modificaciones en cualquiera de una o más posiciones de aminoácidos: 12, 13, 34, 77, 81, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 y 175, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis 5 mostrada como la SEC ID NO: 1.

14. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13, caracterizado porque comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: 12F, 13Y, 13F, 110A, 10 122D, 113A, 13Y, 113D, 175L, 122F, 34 , 99Y, 104W, 154R, 159D, 175K, 811, 166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77S, 77V y 77Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis !5 mostrada como la SEC ID NO: 1.

15. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, caracterizado porque comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: G12F, G13Y, G13F, 20 T110A, R122D, Y113A, G13Y, Y113D, Q175L, R122F, G34K, K99Y, T104W, K154R, N159D, Q175K, B81I, Y166F, S162E, S162D, W164F, N114D, N114Y, N114F, I118V, I77L, I77M, I77S, I77V e I77Y, una o varias de las posiciones están determinadas como la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos de B. 25 subtilis mostrada como la SEC ID NO: 1.