ES2693213T3

ES2693213T3 - Epítopos agonistas de HLA-A24 de oncoproteína MUC1-C y composiciones y métodos de uso

Info

Publication number: ES2693213T3
Application number: ES14802730.3T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey Schlom; Kwong-Yok Tsang
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2013-10-23
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2018-12-10
Anticipated expiration: 2034-10-22
Also published as: EP3412304A3; EP3060232B1; JP6788500B2; US20190002513A1; CA2928140A1; US20210253656A1; AU2019203443C1; EP3412304A2; US20200109181A1; US20160251406A1; US10508141B2; EP3060232A2; AU2014340201B2; JP2016540500A; US20230331797A1; CA2928140C; US11732017B2; US11155588B2; AU2019203443A1; US10035832B2

Abstract

Péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en el que el péptido tiene no más de 20 residuos de aminoácido, o en el que opcionalmente el péptido consiste en SEQ ID NO: 1.

Description

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DESCRIPCION

Epitopos agonistas de HLA-A24 de oncoproteina MUC1-C y composiciones y metodos de uso Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente estadounidense provisional n.° 61/894.482, presentada el 23 de octubre de 2013.

Lista de secuencias

Se incorpora como referencia en su totalidad en el presente documento un listado de secuencias de nucleotidos/de aminoacidos presentada de manera simultanea con el presente documento.

Antecedentes de la invencion

MUC1 (CD227) es una glicoproteina de membrana de tipo I que se compone de heterodimeros de una subunidad grande N-terminal (MUC1 -N) unida covalentemente a una subunidad pequena C-terminal (MUC1 -C).

La subunidad N-terminal (MUC1-N) es el dominio extracelular grande, que consiste en la region de numero variable de repeticiones en tandem (VNTR) y la region sin VNTR. MUC1-N se excreta de las celulas y puede hallarse en la circulacion de pacientes con cancer avanzado. MUC1-N se usa como marcador tumoral (CA15.3) en pacientes con cancer de mama (vease Hayes et a/., J. Clin. Oncol., 4: 1542-50 (1986)).

La region C-terminal de MUC1 (MUC1-C) tiene tres partes distintivas: un dominio extracelular pequeno que se une covalentemente a MUC1-N, un unico dominio transmembrana, y una cola citoplasmatica (vease Lan et al., J. Biol. Chem., 265: 15294-9 (1990)). La cola citoplasmatica contiene sitios para la interaccion con proteinas de senalizacion, tales como p-catenina, receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) y Src (vease Li et al., J. Biol. Chem., 276: 35239-42 (2001)). Puesto que estas proteinas estan situadas en la parte basolateral de las celulas sanas, se cree que las interacciones proteina-MUC1 no son importantes. Sin embargo, la perdida de polaridad en celulas tumorales humanas permite que quede la cola citoplasmatica expuesta a las proteinas de senalizacion, y puede producirse interaccion (vease Vermeer et al., Nature, 422: 322-6 (2003)).

Se ha mostrado que la region MUC1-C actua como oncogen, conduciendo a la transformacion de celulas humanas cuando MUC1-C se une a p-catenina (vease Li et al., Oncogene, 22: 6107-10 (2003); Raina et al., Cancer Res., 69: 5133-41 (2009); y Wei et al., Cancer Res., 67: 1853-8 (2007)). Ademas, se ha demostrado que la transfeccion de MUC1-C es suficiente para inducir transformacion y conferir actividades oncogenicas atribuidas previamente a la proteina MUC1 de longitud completa, tales como aumento de la tasa de crecimiento, crecimiento celular independiente de anclaje y resistencia a agentes quimioterapicos (vease Ren et al., Cancer Cell. 5: 163-75 (2004)). Ademas, la senalizacion de MUC1-C activada por c-Src esta implicada en la perturbacion tanto de las uniones adherentes de E-cadherina como las adhesiones focales de integrinas que estimulan la motilidad, invasion y metastasis de celulas cancerosas, lo que sugiere de ese modo un posible papel de MUC1-C en la transicion epitelial a mesenquimatosa (EMT) (vease Hu et al., Expert Rev. Anticancer Ther., 6: 1261-71 (2006)). Tambien se ha hallado que la sobreexpresion de genes relacionados con MUC1 se asocia en gran medida con un mal pronostico en pacientes con cancer de pulmon y de mama y con resistencia a farmacos (veanse Ren et al., citado anteriormente; y Khodarev et al., Cancer Res., 69: 2833-7 (2009)).

Numerosos ensayos clinicos han evaluado MUC1 como posible diana para la terapia con vacunas de una gama de tumores humanos. La mayoria de estos han empleado polipeptidos de la region VNTR. Se mostro que un epitopo agonista (P93L), en comparacion con el epitopo nativo, potenciaba la generacion de celulas T que tambien pueden lisar mas eficazmente celulas tumorales humanas (vease Tsang et al., Cancer Res., 10: 2139-49 (2004)). Se mostro que otros dos posibles epitopos agonistas en esta region potenciaban la produccion de citocinas por celulas T, pero no se notifico destruccion de celulas tumorales (vease Mitchell et al., Cancer Immunol. Immunother., 56: 287-301 (2007)).

Un metodo que se ha mostrado que potencia la capacidad de una vacuna para ser mas eficaz es realizar alteraciones en la secuencia de aminoacidos de supuestos epitopos de celulas T, lo que puede potenciar a su vez la activacion de celulas T y la destruccion por celulas T especificas de celulas tumorales (veanse Grey et al., Cancer Surv., 22: 37-49 (1995); y Terasawa et al., Clin. Cancer Res. 8: 41-53 (2002)). Sin embargo, no todas las sustituciones de un aminoacido de un posible epitopo de linfocito T citotoxico (CTL), conduciran a un epitopo agonista potenciador, y algunas sustituciones conduciran a epitopos antagonistas. Ademas, la generacion de un supuesto epitopo agonista de un antigeno asociado a tumor tambien puede conducir a la potenciacion de la activacion de celulas T mediante la produccion de IFN-y, pero sera inutil a menos que la celula T activada reconozca el epitopo endogeno (nativo) expresado en el contexto del CMH en la superficie de celulas tumorales humanas y, por consiguiente, lise esas celulas tumorales.

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Existe el deseo de identificar nuevos epitopos de linfocitos T citotoxicos (CTL) especificos y epitopos o peptidos agonistas potenciadores de MUC1-C, y de desarrollar composiciones y metodos que usan estos epitopos para el diagnostico y/o tratamiento de cancer.

Breve sumario de la invencion

La invencion proporciona un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la invencion proporciona a un acido nucleico que codifica para el peptido, un vector que comprende el acido nucleico, una celula que comprende el peptido, acido nucleico o vector, y composiciones de los mismos.

En particular, la invencion proporciona una proteina MUC1 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, SEQ iD NO: 16,).

En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion inmunoterapica de MUC1-levadura que comprende (a) un vehiculo de levadura y (b) una proteina de fusion que comprende al menos un antigeno de MUC1, en la que el antigeno de MUC1 comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.

La invencion tambien proporciona una composicion inmunoterapica de MUC1-levadura que comprende (a) un vehiculo de levadura y (b) una proteina de fusion que comprende al menos un antigeno de MUC1, en la que el antigeno de MUC1 comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos el 80% a (i) SEQ iD NO: 16, (ii) posiciones 92-566 de SEQ ID NO: 16, o (iii) una secuencia correspondiente de una proteina MUC1 diferente, y en la que el antigeno de MUC1 comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.

La divulgacion tambien proporciona una composicion inmunoterapica de MUC1-levadura que comprende (a) un vehiculo de levadura y (b) una proteina de fusion que comprende al menos un antigeno de MUC1, en la que el antigeno de MUC1 comprende una secuencia de aminoacidos que difiere de una secuencia de aminoacidos de una proteina MUC1 de tipo natural en al menos una sustitucion de aminoacido en una posicion de secuencia, con respecto a una secuencia de aminoacidos de MUC1 de tipo natural tal como SEQ ID NO: 14, que se selecciona de: T422, P430, T431, S462 y A470.

La invencion tambien proporciona una composicion inmunoterapica de MUC1-levadura para su uso en un metodo de potenciacion de una respuesta inmunitaria frente a un cancer que expresa MUC1 en un huesped que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende el peptido, la proteina, el polinucleotido, acido nucleico, vector, la celula o composicion inmunoterapica de MUC1-levadura al huesped, en la que se potencia la respuesta inmunitaria en el huesped.

La invencion tambien proporciona una composicion inmunoterapica de MUC1-levadura para su uso en un metodo de tratamiento de un cancer que expresa MUC1 en un individuo que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende el peptido, acido nucleico, vector, la celula o composicion inmunoterapica de MUC1-levadura al individuo.

La invencion tambien proporciona una composicion inmunoterapica de MUC1-levadura para su uso en un metodo de reduccion, detencion, reversion o prevencion de la progresion metastasica de cancer en un individuo que tiene un cancer que expresa MUC1 que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende el peptido, acido nucleico, vector, la celula o composicion inmunoterapica de MUC1-levadura al individuo.

La invencion tambien proporciona una composicion inmunoterapica de MUC1-levadura para su uso en un metodo de prevencion o retraso de la aparicion de un cancer que expresa MUC1 en un individuo que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende el peptido, acido nucleico, vector, la celula o composicion inmunoterapica de MUC1-levadura al individuo.

La invencion proporciona ademas un metodo de inhibicion de un cancer que expresa MUC1 en un sujeto que comprende (a) estimular linfocitos obtenidos de un sujeto con una composicion que comprende el peptido, acido nucleico, vector o la celula al huesped para generar linfocitos T citotoxicos ex vivo, y (b) administrar los linfocitos T citotoxicos al sujeto, en el que se inhibe el cancer que expresa MUC1 en el sujeto.

La invencion proporciona un metodo de inhibicion de un cancer que expresa MUC1 en un sujeto que comprende (a) tratar celulas dendriticas obtenidas de un sujeto con una composicion que comprende el peptido, acido nucleico, vector, la celula o composicion inmunoterapica de MUC1-levadura ex vivo, y (b) administrar las celulas dendriticas tratadas al sujeto, en el que se inhibe el cancer que expresa MUC1 en el sujeto.

Adicionalmente, la invencion proporciona la inhibicion de un cancer que expresa MUC1 en un sujeto que comprende (a) aislar celulas dendriticas de PBMC obtenidas de un sujeto, (b) tratar las celulas dendriticas con una composicion que comprende el peptido, acido nucleico, vector, la celula o composicion inmunoterapica de MUC1-levadura ex

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vivo, (c) activar las PBMC obtenidas del sujeto con las celulas dendriticas tratadas ex vivo, y (d) administrar las PBMC activadas al sujeto, en el que se inhibe el cancer que expresa MUC1 en el sujeto.

La invencion proporciona ademas la inhibicion de un cancer que expresa MUC1 en un sujeto que comprende (a) aislar celulas dendriticas de PBMC obtenidas de un sujeto, (b) tratar las celulas dendriticas con una composicion que comprende el peptido, acido nucleico, vector, celula o composicion inmunoterapica de MUC1-levadura ex vivo, (c) activar las PBMC obtenidas de un sujeto con las celulas dendriticas tratadas ex vivo, (d) aislar linfocitos T de las PBMC activadas ex vivo, y (e) administrar los linfocitos T aislados al sujeto, en el que se inhibe el cancer que expresa MUC1 en el sujeto.

La divulgacion proporciona el uso de celulas T sometidas a transferencia adoptiva estimuladas in vitro con una composicion que comprende el peptido, acido nucleico, vector, la celula o composicion inmunoterapica de MUC1- levadura para tratar un cancer, para inhibir un cancer que expresa MUC1 en un sujeto, para reducir, detener, revertir o prevenir la progresion metastasica de cancer en un individuo que tiene cancer, o para prevenir o retrasar la aparicion de un cancer que expresa MUC1.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona un metodo de induccion de una respuesta inmunitaria frente a un cancer que expresa MUC1 en un sujeto que comprende (a) administrar al sujeto un primer vector de poxvirus que comprende un acido nucleico que codifica para la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 y (b) administrar al sujeto un segundo vector de poxvirus que comprende un acido nucleico que codifica para la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. En una realizacion, el acido nucleico que codifica para la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 es un acido nucleico que codifica para una proteina MUC1 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 16).

Descripcion detallada de la invencion

La invencion proporciona peptidos que comprenden un epitopo de linfocitos T citotoxicos (CTL) humanos de la subunidad C-terminal de mucina 1 (MUC1) de antigeno asociado a tumor (TAA) humano y sus analogos, que pueden usarse en vacunas y otras composiciones para la prevencion o el tratamiento terapeutico de cancer, incluyendo, pero sin limitarse a, un cancer que expresa o sobreexpresa MUC1. En particular, la invencion proporciona peptidos que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en la secuencia de aminoacidos de KYHPMSEYAL (SEQ ID NO: 1).

En otra realizacion, la invencion proporciona un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos de MUC1 (es decir, una proteina MUC1) o un fragmento de la misma, en el que uno o mas de los residuos de aminoacido correspondientes se han reemplazado por uno o mas de los epitopos agonistas potenciadores de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 16).

Generalmente, se entiende que un “polipeptido” es un polimero organico lineal que consiste en un gran numero de residuos de aminoacido unidos entre si en una cadena continua, sin ramificacion, que forma parte de, o la totalidad de, una molecula de proteina. Generalmente, se considera que un “peptido” se distingue de una proteina o un polipeptido de longitud completa basandose en el tamano y, en una realizacion, como punto de referencia arbitrario puede entenderse que contiene aproximadamente 50 aminoacidos o menos, mientras que los polipeptidos o las proteinas de longitud completa son generalmente mas largos. Sin embargo, los terminos “peptido” y “polipeptido” pueden usarse de manera indistinta en algunas realizaciones para describir una proteina util en la presente invencion, o puede usarse generalmente el termino “proteina”.

El peptido de la invencion puede tener hasta 20 residuos de aminoacido de longitud. En una realizacion, un peptido de la invencion tiene no mas de 20 (por ejemplo, no mas de 19, no mas de 18, no mas de 17, no mas de 16, no mas de 15, no mas de 14, no mas de 13, no mas de 12, no mas de 11 o no mas de 10) residuos de aminoacido. Los residuos de aminoacido adicionales, si estan presentes, preferiblemente proceden de la proteina MUC1 (por ejemplo, MUC1-C) o se basan en la secuencia de MUC1 tal como se describe en el presente documento. Los residuos de aminoacido adicionales pueden situarse en cualquier extremo o en ambos extremos de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.

Un polipeptido para la expresion en una celula huesped, tal como una levadura, tiene un tamano minimo que puede expresarse de manera recombinante en la celula huesped. Por consiguiente, el polipeptido de la divulgacion que se expresa por la celula huesped tiene preferiblemente al menos 25 aminoacidos de longitud, y tiene normalmente al menos o mas de 25 aminoacidos de longitud, o al menos o mas de 26 aminoacidos, al menos o mas de 27 aminoacidos, al menos o mas de 28 aminoacidos, al menos o mas de 29 aminoacidos, al menos o mas de 30

aminoacidos, al menos o mas de 31 aminoacidos, al menos o mas de 32 aminoacidos, al menos o mas de 33

aminoacidos, al menos o mas de 34 aminoacidos, al menos o mas de 35 aminoacidos, al menos o mas de 36

aminoacidos, al menos o mas de 37 aminoacidos, al menos o mas de 38 aminoacidos, al menos o mas de 39

aminoacidos, al menos o mas de 40 aminoacidos, al menos o mas de 41 aminoacidos, al menos o mas de 42

aminoacidos, al menos o mas de 43 aminoacidos, al menos o mas de 44 aminoacidos, al menos o mas de 45

aminoacidos, al menos o mas de 46 aminoacidos, al menos o mas de 47 aminoacidos, al menos o mas de 48

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aminoacidos, al menos o mas de 49 aminoacidos, o al menos o mas de 50 aminoacidos de longitud, o al menos 2550 aminoacidos de longitud, al menos 30-50 aminoacidos de longitud, o al menos 35-50 aminoacidos de longitud, o al menos 40-50 aminoacidos de longitud, o al menos 45-50 aminoacidos de longitud, aunque pueden expresarse proteinas mas pequenas, y pueden expresarse proteinas considerablemente mas grandes (por ejemplo, cientos de aminoacidos de longitud o incluso unos pocos miles de aminoacidos de longitud).

En otra realizacion, la invencion proporciona un peptido que puede usarse en vacunas y otras composiciones para la prevencion o el tratamiento terapeutico de un cancer que expresa o que sobreexpresa MUC1, en el que el peptido comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoacidos de MUC1 o un fragmento de la misma (por ejemplo, un dominio inmunogenico de la misma), en el que uno o mas de los residuos de aminoacido correspondientes del peptido se han reemplazado (por ejemplo, sustituido) de tal manera que el peptido comprende uno o mas de los epitopos agonistas potenciadores de SEQ ID NO: 1 (es decir, el polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que difiere de una secuencia de aminoacidos de MUC1 nativa, o de tipo natural, en que la secuencia de aminoacidos del peptido comprende uno o mas de los epitopos agonistas potenciadores, lo que implica normalmente la sustitucion de uno, dos, tres aminoacidos o mas en una secuencia de epitopo de tipo natural dada por un aminoacido diferente). En un aspecto de esta realizacion, el peptido puede comprender ademas epitopos agonistas potenciadores de MUC1 adicionales, de los que se describen ejemplos con detalle a continuacion.

En algunas realizaciones de la invencion, se usan peptidos de la invencion como antigenos. Segun la presente invencion, el uso general en el presente documento del termino “antigeno” se refiere a cualquier parte de una proteina (por ejemplo, peptido, proteina parcial, proteina de longitud completa), en el que se produce de manera natural la proteina o se disena o se deriva de manera sintetica, a una composicion celular (celula completa, lisado celular o celulas rotas), a un organismo (organismo completo, lisado o celulas rotas), o a un hidrato de carbono, u otra molecula, o una parte de los mismos. Un antigeno puede provocar una respuesta inmunitaria especifica de antigeno (por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por celulas) frente a antigenos iguales o similares que se encuentran in vitro, in vivo o ex vivo por un elemento del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas T, anticuerpos).

Un antigeno pueden ser tan solo un unico epitopo (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 descrita en el presente documento), un unico dominio inmunogenico o mas grande, y puede incluir multiples epitopos o dominios inmunogenicos. Como tal, el tamano de un antigeno de proteina puede tener tan solo aproximadamente 8-11 aminoacidos (por ejemplo, un peptido) y tener hasta un dominio de una proteina, una proteina de longitud completa, un multimero, una proteina de fusion o una proteina quimerica. Los antigenos utiles en diversas composiciones inmunoterapicas descritas en el presente documento incluyen peptidos, polipeptidos, dominio(s) de proteina (por ejemplo, dominios inmunogenicos), subunidades de proteina, proteinas de longitud completa, multimeros, proteinas de fusion y proteinas quimericas.

Cuando se hace referencia a estimulacion de una respuesta inmunitaria, el termino “inmunogeno” es un subconjunto del termino “antigeno” y, por tanto, en algunos casos, puede usarse indistintamente con el termino “antigeno”. Un inmunogeno, tal como se usa en el presente documento, describe un antigeno que provoca una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por celulas (es decir, es inmunogenico), de tal manera que la administracion del inmunogeno a un individuo produce una respuesta inmunitaria especifica de antigeno frente al mismo o antigenos similares con los que se encuentra el sistema inmunitario del individuo. En una realizacion, el inmunogeno provoca una respuesta inmunitaria mediada por celulas, incluyendo una respuesta de celulas T CD4+ (por ejemplo, TH1, TH2 y/o TH17) y/o una respuesta de celulas T CD8+ (por ejemplo, una respuesta de CTL).

Un “dominio inmunogenico” o “dominio inmunologico” de una proteina dada (polipeptido) puede ser cualquier parte, fragmento o epitopo de un antigeno (por ejemplo, un fragmento o una subunidad de un peptido o un epitopo de un anticuerpo u otro epitopo conformacional) que contiene al menos un epitopo que puede actuar como inmunogeno cuando se administra a un animal. Por tanto, un dominio inmunogenico es mas grande que un unico aminoacido y tiene al menos un tamano suficiente como para contener al menos un epitopo que puede actuar como inmunogeno. Por ejemplo, una unica proteina puede contener multiples dominios inmunogenicos diferentes. No es necesario que los dominios inmunogenicos sean secuencias lineales dentro de una proteina, tal como en el caso de una respuesta inmunitaria humoral, en la que se contemplan dominios conformacionales.

En el presente documento, se define un epitopo como un unico sitio inmunogenico dentro de un antigeno dado que es suficiente para provocar una respuesta inmunitaria cuando se proporciona al sistema inmunitario en el contexto de celulas activadas y/o senales coestimuladoras apropiadas del sistema inmunitario. Dicho de otro modo, un epitopo es la parte de un antigeno que reconocen componentes del sistema inmunitario, y tambien puede denominarse un determinante antigenico. Los expertos en la tecnica reconoceran que los epitopos de celulas T tienen diferente tamano y composicion que los epitopos de celulas B o anticuerpos, y que los epitopos presentados a traves de la ruta del CMH de clase I difieren en tamano y atributos estructurales con respecto a epitopos presentados a traves de la ruta del CMH de clase II. Por ejemplo, los epitopos de celulas T presentados por moleculas de CMH de clase I tienen normalmente entre 8 y 11 aminoacidos de longitud, mientras que los epitopos presentados por moleculas de CMH de clase II estan menos restringidos en cuanto a longitud y pueden tener hasta 25 aminoacidos o mas. Ademas, los epitopos de celulas T tienen caracteristicas estructurales predichas que dependen de las moleculas de CMH especificas a las que se une el epitopo. Los epitopos pueden ser epitopos de

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secuencia lineal o epitopos conformacionales (regiones de union conservadas). La mayor parte de los anticuerpos reconocen epitopos conformacionales.

Un “antigeno diana” es un antigeno que se selecciona especificamente como diana por una composicion inmunoterapica de la invencion (es decir, un antigeno, habitualmente el antigeno nativo, frente al que se desea provocar una respuesta inmunitaria, aunque el antigeno usado en el agente inmunoterapico es un agonista del antigeno nativo). Un “antigeno de cancer”, que tambien se denomina antigeno asociado a tumor (TAA), es un antigeno que comprende al menos un antigeno que esta asociado con un cancer, tal como un antigeno expresado por una celula tumoral, de modo que la seleccion como diana del antigeno tambien selecciona como diana la celula tumoral y/o el cancer. Un antigeno de cancer puede incluir uno o mas antigenos de una o mas proteinas, incluyendo una o mas proteinas asociadas a tumor. En particular, un “antigeno de MUC1” es un antigeno que se deriva, disena o se produce a partir de una proteina MUC1 (incluyendo MUC1-N, MUC1-C o tanto MUC1-N como MUC1-C). Un “antigeno agonista de MUC1” es un antigeno derivado, disenado o producido a partir de una proteina MUC1 (incluyendo MUC1-N, MUC1-C o tanto MUC1-N como MUC1-C) que incluye al menos un epitopo agonista, tal como los epitopos agonistas potenciadores descritos en el presente documento. Los epitopos agonistas potenciadores preferidos de la invencion tienen una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.

MUC1 (que tambien puede denominarse “mucina-1”, “antigeno DF3” o “HMFG1”) es una glicoproteina grande expresada por la mayor parte de los tejidos secretores epiteliales en niveles basales y se expresa en altos niveles por tumores malignos con origen en celulas epiteliales. MUC1 se encuentra normalmente con la mayor frecuencia como proteina transmembrana de tipo I, polimorfica con un dominio extracelular grande (tambien denominada subunidad MUC1-N) que incluye numeros variables de repeticiones en tandem (VNTR; normalmente entre 20 y 125 repeticiones) que estan altamente glicosiladas a traves de uniones a O. La proteina MUC1 esta codificada como un unico transcrito, y luego se procesa de manera postraduccional en subunidades, conocidas como MUC1-N y MUC1- C, o subunidades ay P, respectivamente, que luego forman una proteina heterodimerica mediante una fuerte interaccion no covalente de las dos subunidades. MUC1 se escinde en sus subunidades N y C-terminales dentro del dominio de “proteina de esperma de erizo de mar, enterocinasa y agrina” (SEA), un dominio de proteina altamente conservado que se nombro basandose en su identificacion inicial en una proteina del esperma, en enterocinasa y en agrina, y que se encuentra en varias proteinas similares a mucina fuertemente glicosiladas que estan normalmente ancladas a la membrana. La proteina MUC1 se escinde entre residuos de glicina y serina presentes en la secuencia GSVVV, lo que corresponde a las posiciones 1097-1101 de SEQ ID NO: 11, dentro del dominio SEA (Lillehoj et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 307: 743-749 (2003); Parry eta/., Biochem. Biophys. Res. Commun., 283: 715720 (2001); Wreschner et al., Protein Sci., 11: 698-706 (2002)).

La subunidad MUC1-C incluye el dominio extracelular (ED), que se glicosila y se une al ligando de galectina-3, que sirve a su vez como puente para asociar fisicamente MUC1 con el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) y posiblemente otras tirosina cinasas receptoras. MUC1-C tambien comprende un dominio transmembrana (TM) y un dominio citoplasmatico (CD) que contiene varios residuos de tirosina que, cuando se fosforilan, podrian actuar como motivos de union para proteinas con dominios SH2 (para un analisis detallado de la proteina MUC1 y funciones conocidas y supuestas, vease Kufe, Cancer Biol. & Ther., 7: 81-84 (2008)). Algunas variantes de corte y empalme alternativas de MUC1 (conocidas como MUC1/Y y MUC1/X, por ejemplo) son versiones “cortas” de MUC1 que carecen de la mayor parte de MUC1-N, incluyendo la region VNTR grande, pero que incluyen las regiones ED, Tm y CD, asi como el dominio SEA y partes de la region de secuencia senal N-terminal. No puede producirse la escision dentro del dominio SEA en estas versiones cortas.

Se han notificado el aislamiento y la secuenciacion de ADN y ADNc que codifican para MUC1 humana (veanse, por ejemplo, Siddiqui et al., PNAS, 85: 2320-2323 (1998); Abe y Kufe, PNAS, 90: 282-286 (1993); Hareuveni et al., Eur. J. Biochem., 189(3): 475-486 (1990); Gendler et al., J. Biol. Chem., 265(25): 15286-15293 (1990); Lan et al., J. Biol. Chem., 265(25): 15294-15299 (1990); Tsarfaty et al., Gene, 93(2): 313-318 (1990); Lancaster, Biochem. Biophys. Res. Commun., 173(3): 1019-1029 (1990)). Se describe un ejemplo de una proteina precursora de MUC1 humana de longitud completa que contiene las regiones tanto MUC1-N como MUC1-C en el n.° de registro de SwissProt P15941.3 (GI:296439295), y se representa en el presente documento mediante SEQ ID NO: 5. Pueden crearse 10 isoformas de MUC1 diferentes a partir del gen que codifica para SEQ ID NO: 5 mediante corte y empalme de transcrito alternativo. Por ejemplo, una isoforma conocida como MUC1/Y carece de las posiciones 54-1053 de SEQ ID NO: 5. Se describen otras diversas isoformas en la descripcion de la base de datos de esta proteina.

Una variedad de variantes de transcrito de MUC1 se conocen, pero las subunidades, los dominios o las regiones de MUC1 descritos en la SEQ ID NO: 5 a modo de ejemplo anterior pueden identificarse facilmente en las variantes, de tal manera que puede disenarse o producirse un antigeno de MUC1 util en la invencion basandose en una secuencia de MUC1 dada, o una secuencia correspondiente de otra proteina MUC1. Por ejemplo, una secuencia de nucleotidos que codifica para una proteina MUC1 humana se representa en el presente documento mediante SEQ ID NO: 6, que corresponde al n.° de registro de GENBANK® NM_002456.4 (GI: 65301116). SEQ ID NO: 6 codifica para una proteina MUC1 humana de 273 aminoacidos (variante de transcrito 1, tambien conocida como MUC1/ZD), cuya secuencia de aminoacidos se representa en el presente documento como SEQ ID NO: 7 (tambien se encuentra en el n.° de registro de GENBANK® NP_002447.4; GI:65301117). Otra secuencia de nucleotidos que codifica para otra proteina MUC1 humana se representa en el presente documento mediante SEQ ID NO: 8, que corresponde al

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n.° de registro de GENBANK® NM_001018016.1 (GI:67189006). SEQ ID NO: 8 codifica para una proteina MUC1 humana de 264 aminoacidos (variante de transcrito 2, tambien conocida como “MUC1/Y”), cuya secuencia de aminoacidos se representa en el presente documento como SEQ ID NO: 9 (tambien se encuentra en el n.° de registro de GENbAnK® NP_001018016.1; GI:67189007). Otra secuencia de nucleotidos que codifica para otra proteina MUC1 humana se representa en el presente documento mediante SEQ ID NO: 10, que corresponde al n.° de registro de GENBANK® AY327587.1 (GI:33150003). SEQ ID NO: 10 codifica para una proteina MUC1 humana de 264 aminoacidos (variante de transcrito 2, tambien conocida como “MUC1/Y”), cuya secuencia de aminoacidos se representa en el presente documento como SEQ ID NO: 11 (tambien se encuentra en el n.° de registro de GENBANK® AAP97018.1 (GI: 33150004). Otra secuencia de nucleotidos que codifica para otra proteina MUC1 humana se representa en el presente documento mediante SEQ ID NO: 12, que corresponde al n.° de registro de GENBANK® Nm_001018017 (GI:324120954). SEQ ID NO: 12 codifica para una proteina MUC1 humana de 255 aminoacidos (variante de transcrito 3), cuya secuencia de aminoacidos se representa en el presente documento

como SEQ ID NO: 13 (tambien se encuentra en el n.° de registro de GENBANK® NP_001018017.1; GI:67189069).

Aun otra secuencia de aminoacidos de MUC1 de tipo natural a modo de ejemplo se representa en el presente documento mediante SEQ ID NO: 14 (tambien se encuentra en el n.° de registro de GENBANK® NP_001191214). SEQ ID NO: 14 se usa como referencia para algunas de las posiciones de aminoacido de MUC1 descritas en el presente documento, pero los expertos en la tecnica pueden identificar las posiciones correspondientes en otras secuencias de MUC1.

MUC1 humana, incluyendo las proteinas MUC1 humanas y los antigenos de MUC1 descritos en el presente documento, contiene diversos epitopos de celulas T CD4+ y CD8+. Tales epitopos de celulas T se han descrito, por ejemplo, en la patente estadounidense 6.546.643; la patente estadounidense n.° 7.118.738; la patente estadounidense n.° 7.342.094; la patente estadounidense n.° 7.696.306; y publicacion de solicitud de patente estadounidense n.° 2008/0063653, asi como en la publicacion PCT n.° WO 2013/024972, y uno cualquiera o mas de estos epitopos pueden usarse en un antigeno de MUC1 de la presente invencion, incluyendo mediante la adicion, delecion o sustitucion de uno o mas aminoacidos dentro de una secuencia descrita en el presente documento para adaptarse a la secuencia con respecto a la secuencia del epitopo publicada en esa(s) posicion/posiciones.

Se proporcionan en el presente documento ejemplos de antigenos agonistas de MUC1 descubiertos en la presente invencion (veanse los ejemplos). Un peptido util en la presente invencion comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el peptido agonista potenciador de MUC1 representado por SEQ ID NO: 1. Sin embargo, otros epitopos agonistas de MUC1 puede estar incluidos adicionalmente en un antigeno de MUC1 para su uso en la presente invencion. En una realizacion de la divulgacion, un antigeno agonista de MUC1 adecuado para su uso en la presente invencion comprende una proteina MUC1 o polipeptido o peptido de la misma que tiene una secuencia de aminoacidos que difiere de la de la proteina MUC1 de tipo natural (nativa) o polipeptido o peptido de la misma en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones de aminoacido o mas, en las que las sustituciones de aminoacido introducen uno o mas epitopos agonistas de MUC1 en el antigeno. Tales sustituciones de aminoacido pueden incluir sustituciones en las siguientes posiciones de aminoacido, en las que se proporcionan las posiciones de las sustituciones con respecto a una MUC1 de tipo natural que tiene una secuencia de aminoacidos representada por el n.° de registro NP_001191214 (SEQ ID NO: 14) (aunque pueden identificarse facilmente posiciones iguales o equivalentes en cualquier otra secuencia de MUC1 de tipo natural): T93, A161, P162, G169, S170, T171, A392, C406, T422, P430, T431, T444, D445, S460, S462 y/o A470. En una realizacion, la sustitucion es: T93L, A161Y, P162L, G169V, S170Y, T171L, A392Y, C406V, T422K, P430A, T431L, T444L, D445F, S460Y, S462K y/o A470L.

Ademas, un antigeno de MUC1 util en la presente divulgacion puede incluir una o mas mutaciones de aminoacido (sustituciones, inserciones o deleciones) adicionales, por ejemplo, para inactivar o delecionar una funcion biologica natural de la proteina nativa (por ejemplo, para mejorar la expresion o potenciar la seguridad del antigeno). Un ejemplo de tal mutacion es una mutacion inactivante que es una sustitucion en la posicion C404 con respecto a la proteina de tipo natural usando SEQ ID NO: 14 como secuencia de referencia. En un aspecto, la sustitucion inactivante es C404A (con respecto a SEQ ID NO: 14).

El peptido de la invencion puede prepararse mediante cualquier metodo, tal como sintetizando el peptido o expresando un acido nucleico que codifica para una secuencia de aminoacidos apropiada para el peptido en una celula y, en algunas realizaciones, recogiendo el peptido de la celula. En algunas realizaciones, el peptido no se recoge de la celula, tal como en realizaciones de la invencion referidas a una composicion para inmunoterapia basada en levadura, que se describe con detalle a continuacion. Tambien puede usarse una combinacion de tales metodos de produccion de peptidos. Se conocen en la tecnica metodos de sintesis de novo de peptidos y metodos de produccion de manera recombinante de peptidos (veanse, por ejemplo, Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994).

La invencion tambien proporciona una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico

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que codifica para el peptido. La molecula de acido nucleico puede comprender ADN (genomico o ADNc) o ARN, y puede ser mono o bicatenaria. Ademas, la molecula de acido nucleico puede comprender analogos o derivados de nucleotidos (por ejemplo, nucleotidos de inosina o fosforotioato y similares). La secuencia de acido nucleico puede codificar para el peptido solo o como parte de una proteina de fusion. La secuencia de acido nucleico que codifica para el peptido puede proporcionarse como parte de un constructo que comprende la molecula de acido nucleico y elementos que permiten el suministro de la molecula de acido nucleico a una celula, y/o la expresion de la molecula de acido nucleico en una celula. Tales elementos incluyen, por ejemplo, vectores de expresion, promotores y secuencias de control de la transcripcion y/o traduccion. Tales constructos tambien pueden denominarse “moleculas de acido nucleico recombinantes”. Se conocen en la tecnica vectores, promotores, secuencias para la transcripcion/traduccion, y otros elementos adecuados, asi como metodos de preparacion de tales moleculas de acido nucleico y constructos, (por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; y Ausubel et al., citado anteriormente). Aunque la expresion “molecula de acido nucleico” se refiere principalmente a la molecula fisica de acido nucleico y la expresion “secuencia de acido nucleico” se refiere principalmente a la secuencia de nucleotidos en la molecula de acido nucleico, pueden usarse indistintamente las dos expresiones, especialmente con respecto a una molecula de acido nucleico, o una secuencia de acido nucleico, que puede codificar para un peptido o polipeptido. De manera similar, la expresion “molecula de acido nucleico recombinante” se refiere principalmente a una molecula de acido nucleico operativamente unida a un elemento tal como una secuencia de control de la transcripcion, pero puede usarse indistintamente con la expresion “molecula de acido nucleico”.

La invencion proporciona ademas un vector que comprende la molecula de acido nucleico. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen plasmidos (por ejemplo, plasmidos de ADN) y vectores virales, tales como poxvirus, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus, poliovirus, alfavirus, baculovirus y virus Sindbis.

En una primera realizacion, el vector es un plasmido (por ejemplo, plasmido de ADN). El plasmido puede complejarse con quitosano.

En una segunda realizacion, el vector es un poxvirus (por ejemplo, vectores de cordopoxvirus y vectores de entomopoxvirus). Los poxvirus adecuados incluyen ortopox, avipox, parapox, yatapox y moluscipox, viruela del mapache, viruela del conejo, capripox (por ejemplo, viruela ovina), leporipox y suipox (por ejemplo, viruela porcina). Los ejemplos de virus avipox incluyen viruela aviar, viruela de la paloma, viruela del canario, tal como ALVAC, viruela del mainate, viruela desconocida, viruela de la codorniz, viruela del pavo real, viruela del pinguino, viruela del gorrion, viruela del estornino y viruela del pavo. Los ejemplos de ortopoxvirus incluyen viruela (tambien conocida como variola), viruela vacuna, viruela de los simios, vaccinia, ectromelia, viruela del camello, viruela del mapache, y derivados de los mismos.

El termino “virus vaccinia” se refiere a tanto al virus vaccinia de tipo natural como a cualquiera de las diversas cepas atenuadas o aisladas que se aislan posteriormente incluyendo, por ejemplo, vaccinia Ankara modificado (MVA), NYVAC, TROYVAC, Dry-Vax (tambien conocido como virus vaccinia-Wyeth), POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation), virus vaccinia-Western Reserve, virus vaccinia-EM63, virus vaccinia-Lister, virus vaccinia-New York City Board of Health, virus vaccinia-Temple of Heaven, virus vaccinia-Copenhagen, ACAM1000, ACAM2000 y virus vaccinia Ankara-Bavarian Nordic modificado (“MVABN”).

En determinadas realizaciones, el MVA se selecciona del grupo que consiste en MVA-572, depositado en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares de Animales (“ECACC”), los Servicios de Microbiologia de la Agencia de Proteccion de la Salud, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido (“R.U.”), con el numero de deposito ECACC 94012707 el 27 de enero de 1994; MVA-575, depositado en la ECACC con el numero de deposito ECACC 00120707 el 7 de diciembre de 2000; MVA-Bavarian Nordic (“MVA-BN”), depositado en la ECACC con el numero de deposito V00080038 el 30 de agosto de 2000; y derivados de MVA-BN. Se describen vectores de poxvirus a modo de ejemplo adicionales en la patente estadounidense n.° 7.211.432.

Se genero el virus vaccinia MVA mediante 516 pases en serie con fibroblastos de embrion de pollo de la cepa Ankara de virus vaccinia, denominado virus Ankara de corioalantoides (CVA) (vease Mayr et al., Infection, 3: 6-14 (1975)). El genoma del MVA atenuado resultante carece de aproximadamente 31 kilopares de bases de ADN genomico en comparacion con la cepa de CVA parental y esta altamente restringido en cuanto a celula huesped a celulas aviares (vease Meyer et al., J. Gen. Virol., 72: 1031-1038 (1991)). Se mostro en una variedad de modelos animales que el MVA resultante era significativamente avirulento (Mayr et al., Dev. Biol. Stand., 41: 225-34 (1978)). Se ha sometido a prueba esta cepa de MVA en ensayos clinicos como vacuna para inmunizar frente a la viruela en seres humanos (veanse Mary et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B, 167: 375-390 (1987); y Stickl et al., Dtsch. Med. Wschr., 99: 2386-2392 (1974)). Esos estudios implicaron a mas de 120.000 seres humanos, incluyendo pacientes de alto riesgo, y demostraron que en comparacion con vacunas basadas en virus vaccinia, MVA habia disminuido la virulencia o infectividad mientras que todavia podia inducir una buena respuesta inmunitaria especifica. Aunque se prefiere MVA-BN por su mejor perfil de seguridad porque es menos competente en la replicacion que otras cepas de MVA, todos los MVA son adecuados para esta invencion, incluyendo MVA-BN y sus derivados.

Tanto MVA como MVA-BN pueden replicar de manera eficaz su ADN en celulas de mamifero aunque sean avirulentos. Este rasgo es el resultado de perder dos genes de la gama de huespedes importantes entre al menos

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25 mutaciones y deleciones adicionales que se produjeron durante sus pases a traves de fibroblastos de embrion de pollo (veanse Meyer et al., Gen. Virol., 72: 1031-1038 (1991); y Antoine et al., Virol., 244: 365-396 (1998)). En contraposicion a la cepa atenuada Copenhagen (NYVAC) y avipox restringido en cuanto a la gama de huespedes (ALVAC), no se ven afectadas la transcripcion ni temprana ni tardia en MVA, lo que permite la expresion genica continua en la totalidad del ciclo de vida viral (vease Sutter et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 89: 10847-10851 (1992)). Ademas, puede usarse MVA en condiciones de inmunidad de poxvirus preexistente (Ramirez et al., J. Virol., 74: 7651-7655 (2000)).

Tanto MVA como MVA-BN carecen de aproximadamente el 15% (31 kb de seis regiones) del genoma en comparacion con el ancestral virus vaccinia Ankara de corioalantoides (“CVA”). Las deleciones afectan a varios genes de virulencia y de gama de huespedes, asi como el gen para cuerpos de inclusion de tipo A. MVA-BN puede fijarse a y entrar en celulas humanas en las que se expresan muy eficazmente genes codificados por virus. Sin embargo, no se producen el ensamblaje y la liberacion de virus de progenie. MVA-BN se adapta enormemente a celulas de fibroblastos de embrion de pollo primarios (CEF) y no se replica en celulas humanas. En celulas humanas, se expresan genes virales, y no se produce virus infeccioso. A pesar de su alta atenuacion y virulencia reducida, en estudios preclinicos, se ha mostrado que MVA-BN provoca respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares frente a vaccinia y a productos genicos heterologos codificados por genes clonados en el genoma de MVA (veanse Harrer et al., Antivir. Tier., 10(2): 285-300 (2005); Cosma et al., Vaccine, 22(1): 21-29 (2003); Di Nicola et al., Hum. Gene Tier., 14(14): 1347-1360 (2003); y Di Nicola et al., Clin. Cancer Res., 10(16): 5381-5390 (2004)).

La replicacion reproductiva de un virus se expresa normalmente mediante la razon de amplificacion. El termino “razon de amplificacion” se refiere a la razon de virus producido a partir de una celula infectada (“salida”) con respecto a la cantidad usada originariamente para infectar las celulas en primer lugar (“entrada”). Una razon de amplificacion de “1” define un estado de amplificacion en el que la cantidad de virus producido a partir de celulas infectadas es igual a la cantidad usada inicialmente para infectar las celulas, lo que significa que las celulas infectadas son permisivas para la infeccion y reproduccion viral. Una razon de amplificacion de menos de 1 significa que las celulas infectadas producen menos virus que la cantidad usada para infectar las celulas en primer lugar, e indica que el virus carece de la capacidad de replicacion reproductiva, que es una medida de la atenuacion viral.

Por tanto, el termino “no puede producir replicacion reproductiva” significa que un MVA o derivado de MVA tiene una razon de amplificacion de menos de 1 en una o mas lineas celulares humanas, tales como, por ejemplo, la linea celular 293 de rinon embrionario humano (HEK293, que se deposita con el numero de deposito ECACC n.° 85120602), la linea celular de osteosarcoma oseo humano 143B (depositada con el numero de deposito ECACC n.° 91112502), la linea celular de adenocarcinoma cervicouterino humano HeLa (depositada en la Coleccion Americana de Cultivo Tipo (ATTC) con el numero de deposito ATCC n.° CCL-2), y la linea celular de queratinocitos humanos HaCat (vease Boukamp et al., J. Cell Biol., 106(3): 761-71 (1988)).

MVA-BN no se replica de manera reproductiva en las lineas celulares humanas HEK293, 143B, HeLa y HaCat (veanse las patentes estadounidenses n.os 6.761.893 y 6.193.752, y la publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 2002/042480). Por ejemplo, en un experimento a modo de ejemplo, MVA-BN presento una razon de amplificacion de 0,05 a 0,2 en celulas HEK293, una razon de amplificacion de 0,0 a 0,6 en celulas143B, una razon de amplificacion de 0,04 a 0,8 en celulas HeLa, y una razon de amplificacion de 0,02 a 0,8 en celulas HaCat. Por tanto, MVA-BN no se replica de manera reproductiva en ninguna de las lineas celulares humanas HEK293, 143B, HeLa y HaCat. En cambio, la razon de amplificacion de MVA-BN es de mas de 1 en cultivos primarios de celulas de fibroblastos de embrion de pollo (CEF) y en celulas de rinon de hamster recien nacido (BHK, que se deposita con el numero de deposito ATCC n.° CRL-1632). Por tanto, MVA-BN puede propagarse facilmente y amplificarse en cultivos primarios de CEF con una razon de amplificacion por encima de 500, y en celulas BHK con una razon de amplificacion por encima de 50.

Tal como se indico anteriormente, todos los MVA son adecuados para esta invencion, incluyendo MVA-BN y sus derivados. El termino “derivados” se refiere a virus que muestran esencialmente las mismas caracteristicas de replicacion que la cepa depositada ante la ECACC el 30 de agosto de 2000, con el numero de deposito ECACC n.° V00080038 pero que muestra diferencias en una o mas partes de su genoma. Los virus que presentan las mismas “caracteristicas de replicacion” que los virus depositados son virus que se replican con razones de amplificacion similares a la de la cepa depositada en celulas CEF, en celulas BHK y en las lineas celulares humanas HEK293, 143B, HeLa y HaCat.

Cuando el vector es para la administracion a un huesped (por ejemplo, ser humano), el vector (por ejemplo, poxvirus) preferiblemente tiene una baja eficiencia replicativa en una celula diana (por ejemplo, se producen no mas de aproximadamente 1 progenie por celula o, mas preferiblemente, no mas de 0,1 progenie por celula). La eficiencia de replicacion puede determinarse facilmente de manera empirica determinando el titulo viral despues de la infeccion de la celula diana.

Ademas de la molecula de acido nucleico que codifica para el peptido que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en al menos un epitopo agonista potenciador de MUC1 descrito en el presente documento), un vector util en la invencion (por ejemplo, un plasmido o un vector viral) tambien puede comprender una secuencia de

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acido nucleico que codifica para una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF), citocinas y/o moleculas que pueden potenciar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, antigenos asociados a tumor adicionales). Los antigenos asociados a tumor adicionales (TAA, tambien denominado antigenos de cancer) adicionales incluyen, pero no se limitan a, 5-a-reductasa, a- fetoproteina (AFP), AM-1, APC, April, gen de antigeno de melanoma B (BAGE), p-catenina, Bc112, bcr-abl, Brachyury, cA-125, caspasa-8 (CaSp-8 tambien conocida como FLICE), catepsinas, CD 19, CD20, CD21/receptor del complemento 2 (Cr2), CD22/BL-CAM, CD23/FceRII, CD33, CD35/receptor del complemento 1 (CR1), CD44/PGP-1, CD45/antigeno comun leucocitario (LCA), CD46/proteina cofactor de membrana (MCP), CD52/CAMPATH-1, CD55/factor acelerador de la degradacion (DAF), CD59/protectina, CDC27, CDK4, antigeno carcinoembrionario (CEA), c-myc, ciclooxigenasa-2 (cox-2), delecionada en el gen de cancer colorrectal (DCC), DcR3, E6/E7, CGFR, EMBp, Dna78, farnesil transferasa, factor de crecimiento de fibroblastos-8a (FGF8a), factor de crecimiento de fibroblastos-8b (FGF8b), FLK-1/KDR, receptor de acido folico, G250, familia de genes de antigeno de melanoma G (familia de GAGE), gastrina 17, hormona liberadora de gastrina, gangliosido 2 (GD2)/gangliosido 3 (GD3)/gangliosido-monoacido sialico-2 (GM2), hormona liberadora de gonadotropina (Gn-RH), UDP- GlcNAc:R1Man(a1-6)R2 [GlcNAc a Man(a1-6)] p1,6-W-acetilglucosaminiltransferasa V (GnT V), GP1, gp100/Pme117, gp-100-in4, gp15, gp75/proteina relacionada con tirosina-1 (gp75/TRP-1), gonadotropina corionica humana (hCG), heparanasa, Her2/neu, virus de tumor de mama humano (HMTV), proteina de choque termico de 70 kiloDalton (HSP70), transcriptasa inversa-telomerasa humana (hTERT), receptor 1 del factor de crecimiento similar a insulina (lGFR-1), receptor de interleucina-13 (IL-13R), oxido nitrico sintasa inducible (iNOS), Ki67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA, LKLR-FUT, familia que codifica para el antigeno de melanoma (familia de MAGE, incluyendo al menos MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3 y MaGE-4), mamaglobina, MAP 17, Melan-A/antigeno de melanoma reconocido por celulas T-1 (MArT-1), mesotelina, MIC A/B, las MT-MMP, mucina, antigeno especifico de testiculos NY-ESO-1, osteonectina, p15, P170/MDR1, p53, p97/melanotransferrina, PAI-1, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), pPA, PRAME, probasina, progenipoyetina, antigeno prostatico especifico (PSA), antigeno prostatico especifico de membrana (PSMA), RAGE-1, Rb, RCAS1, Ras mutado, SART-1, familia de SSX, STAT3, STn, TAG- 72, factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante-beta (TGF-P), timosina- beta-15, factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a), TP1, TRP-2, tirosinasa, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ZAG, p16INK4 y glutation-S-transferasa (GST), asi como versiones modificadas de los mismos (por ejemplo, CEA-6D).

En el caso de un vector viral, el acido nucleico que codifica para el peptido, asi como cualquier otro gen exogeno, se insertan preferiblemente en un sitio o una region (region de insercion) en el vector (por ejemplo, poxvirus) que no afecta a la viabilidad viral del virus recombinante resultante. Tales regiones pueden identificarse facilmente sometiendo a prueba segmentos de ADN viral para regiones que permiten la formacion recombinante sin afectar gravemente a la viabilidad viral del virus recombinante.

El gen de timidina cinasa (TK) es una region de insercion que puede usarse facilmente y esta presente en muchos virus. En particular, se ha encontrado el gen TK en todos los genomas de poxvirus examinados. Se describen sitios de insercion adicionales adecuados en la publicacion de solicitud de patente internacional WO 2005/048957. Por ejemplo, en la viruela aviar, las regiones de insercion incluyen, pero no se limitan a, el fragmento BamHI J, el fragmento EcoRI-HindIII, el fragmento BamHI, el fragmento EcoRV-HindIII, los sitios de insercion de secuencia unica larga (LUS) (por ejemplo, FPV006/FPV007 y FPV254/FPV255), el sitio de insercion de FP14 (FPV060/FPV061), y el sitio de insercion de 43K (FPV107/FPV108). En vaccinia, los sitios de insercion incluyen, pero no se limitan a, 44/45, 49/50 y 124/125.

Cuando el vector es un virus de viruela aviar recombinante que comprende un acido nucleico que codifica para el peptido y/u otro(s) gen(es) exogeno(s) (por ejemplo, que codifica(n) para una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras), el acido nucleico que codifica para el peptido puede insertarse en una region (por ejemplo, la region FP14), y el/los gen(es) exogeno(s) puede(n) insertarse en otra region (por ejemplo, la region BamHI J).

El vector de la invencion puede incluir promotores y elementos reguladores adecuados, tales como un elemento regulador de la transcripcion o un potenciador. Los promotores adecuados incluyen el promotor temprano de SV40, un promotor de RSV, la LTR de retrovirus, el promotor mayor tardio de adenovirus, el promotor I precoz de CMV humano, y diversos promotores de poxvirus, tales como el promotor Pr7.5K, el promotor 30K, el promotor 40K, el promotor I3, el promotor Prs, el promotor PrsSynIIm, el promotor PrLE, el promotor temprano/tardio sintetico (sE/l), el promotor HH, el promotor 11K y el promotor Pi. Aunque los promotores seran normalmente promotores constitutivos, tambien pueden usarse promotores inducibles en los vectores de la invencion. Tales sistemas inducibles permiten la regulacion de la expresion genica.

En una realizacion de la invencion, tambien se proporciona en el presente documento una celula que comprende (1) el peptido (2) una molecula de acido nucleico que codifica para el peptido, y/o (3) un vector que comprende la molecula de acido nucleico. Las celulas adecuadas incluyen celulas procariotas y eucariotas, por ejemplo, celulas de mamifero, levaduras, hongos distintos de levaduras, y bacterias (tales como E. coli). La celula puede usarse in vitro, tal como para investigacion o para la produccion del peptido, o la celula puede usarse in vivo. En una realizacion, la

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celula es una celula de levadura, que puede usarse para proporcionar un componente de vehiculo de levadura de la composicion para inmunoterapia basada en levadura tal como se describe en el presente documento. En otra realizacion, la celula puede ser una celula presentadora de antigeno pulsada con peptido. Las celulas presentadoras de antigeno adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulas dendriticas, linfocitos B, monocitos, macrofagos, y similares.

En una realizacion, la celula es una celula dendritica. Pueden aislarse celulas dendriticas de diferentes etapas de maturacion basandose en marcadores de expresion de superficie celular. Por ejemplo, las celulas dendriticas maduras tienen menor capacidad para capturar nuevas proteinas para la presentacion pero tienen una capacidad mucho mayor de estimulacion de celulas T en reposo para que crezcan y se diferencien. Por tanto, las celulas dendriticas maduras pueden ser de importancia. Pueden identificarse celulas dendriticas maduras por su cambio en la morfologia y por la presencia de diversos marcadores. Tales marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores de superficie celular tales como B7.1, B7.2, CD40, CD11, CD83 y CMH de clase II. Alternativamente, puede identificarse la maduracion observando o midiendo la produccion de citocinas proinflamatorias.

Pueden recogerse celulas dendriticas y analizarse usando tecnicas y dispositivos de clasificacion celular y citofluorografia normales, tales como un clasificador de celulas activado por fluorescencia (FACS). Estan disponibles comercialmente anticuerpos especificos para antigenos de superficie celular de diferentes etapas de maduracion de celulas dendriticas.

En una realizacion, la celula es una levadura (por ejemplo, Saccharomyces). Por consiguiente, la invencion tambien proporciona una composicion inmunoterapica basada en levadura que comprende (a) un vehiculo de levadura y (b) un antigeno que comprende a MUC1 peptido de la invencion (tambien denominada generalmente en el presente documento “composicion para inmunoterapia con levadura”, “producto para inmunoterapia con levadura”, “composicion inmunoterapica con levadura”, “vacuna basada en levadura”, o derivados de estas expresiones). Una composicion inmunoterapica basada en levadura que contiene un antigeno de MUC1 puede denominarse mas especificamente “composicion inmunoterapica de MUC1-levadura” o derivados de la misma tal como se indico anteriormente. Una “composicion inmunoterapica” es una composicion que provoca una respuesta inmunitaria suficiente para lograr al menos un beneficio terapeutico en un sujeto. Una “composicion inmunoterapica basada en levadura” (y derivados de la misma) se refiere a una composicion que incluye un componente de vehiculo de levadura y un componente de antigeno, y puede provocar o inducir una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta inmunitaria celular, incluyendo sin limitacion una respuesta inmunitaria celular mediada por celulas T. La respuesta inmunitaria incluye generalmente tanto una respuesta inmunitaria innata como una respuesta inmunitaria adaptativa, y se genera tanto frente al componente de levadura como frente al componente de antigeno (una respuesta inmunitaria especifica de antigeno). Preferiblemente, la composicion inmunoterapica basada en levadura, cuando se administra a un individuo, proporciona al menos un beneficio protector, preventivo o terapeutico al individuo. En un aspecto, una composicion inmunoterapica basada en levadura util en la invencion puede inducir una respuesta inmunitaria mediada por celulas T CD8+ y/o por CD4+ y en un aspecto, respuesta inmunitaria mediada por celulas T CD8+ y una por CD4+, particularmente frente a un antigeno diana (por ejemplo, un antigeno de cancer, y preferiblemente frente a MUC1). Una respuesta inmunitaria CD4+ puede incluir respuestas inmunitarias TH1, respuestas inmunitarias TH2, respuestas inmunitarias TH17, o cualquier combinacion de las anteriores. Una respuesta inmunitaria CD8+ puede incluir una respuesta de linfocitos T citotoxicos (CTL). En un aspecto, una composicion inmunoterapica basada en levadura modula el numero y/o la funcionalidad de celulas T reguladoras (Treg) en un sujeto.

Tal como se describio anteriormente, una composicion para inmunoterapia basada en levadura de la invencion incluye (a) un vehiculo de levadura y (b) al menos un antigeno de cancer que comprende un antigeno de MUC1 o dominio inmunogenico del mismo, en la que el antigeno de MUC1 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, al menos un epitopo agonista potenciador de MUC1 que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada de SEQ ID NO: 1. El antigeno de cancer se expresa por (es decir, de manera recombinante), se fija a, se carga en o se mezcla con el vehiculo de levadura.

En algunas realizaciones, el antigeno de cancer, antigeno de MUC1, o dominio inmunogenico del mismo se proporciona como una proteina de fusion. Por ejemplo, se han descrito varias proteinas MUC1 y proteinas de fusion en la publicacion PCT n.° WO 2013/024972. Tales proteinas y proteinas de fusion pueden modificarse adicionalmente para que incorporen los epitopos agonistas potenciadores de la presente invencion. En algunas realizaciones, el antigeno de cancer y el antigeno de MUC1 son el mismo elemento. En algunas realizaciones, el antigeno de cancer incluye otros antigenos, incluyendo otros antigenos de cancer (tambien denominados en el presente documento antigenos asociados a tumor o TAA) ademas del antigeno de MUC1. En un aspecto de la invencion, una proteina de fusion util como un antigeno de cancer puede incluir dos o mas antigenos, por ejemplo, un antigeno de MUC1 y otro antigeno de cancer (TAA) que no es un antigeno de MUC1, o dos antigenos de MUC1 diferentes. En un aspecto, la proteina de fusion puede incluir dos o mas dominios inmunogenicos de uno o mas antigenos, tales como dos o mas dominios inmunogenicos de un antigeno de MUC1, o dos o mas epitopos de uno o mas antigenos, tales como dos o mas epitopos de un antigeno de MUC1. Una variedad de otros antigenos de cancer o TAA se conocen en la tecnica y se describen en otra parte en el presente documento.

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Un ejemplo de un antfgeno de MUC1 que es util en una composicion para inmunoterapia basada en levadura de la invencion comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16. SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoacidos de una proteina de fusion que comprende un antfgeno de MUC1 para su uso en una composicion para inmunoterapia basada en levadura, en la que el antfgeno de MUC1 es una proteina agonista de MUC1 de longitud completa correspondiente a una proteina MUC1 de tipo natural excepto por (a) la introduccion de 15 sustituciones de aminoacido para formar varios epitopos agonistas dentro de la proteina, incluyendo el epitopo agonista potenciador de SEQ ID NO: 1 y (b) una unica sustitucion de aminoacido que es una mutacion inactivante. SEQ ID NO: 16 incluye las siguientes secuencias en el siguiente orden del extremo N-terminal al C-terminal: (1) una secuencia lider de factor alfa de SEQ ID NO:17 (correspondiente a las posiciones 1-89 de SEQ ID NO: 16); (2) una secuencia ligadora de Thr-Ser para facilitar la clonacion (correspondiente a las posiciones 90-91 de SEQ ID NO: 16); (3) una proteina agonista de MUC1 de longitud completa correspondiente a una proteina de tipo natural excepto por la introduccion de las 15 sustituciones agonistas de aminoacido mencionadas anteriormente y una sustitucion inactivante (correspondiente a las posiciones 92-566 de SEQ ID NO: 16) y (4) una cola de histidina hexapeptidica (correspondiente a las posiciones 567-572 de SEQ ID NO: 16).

SEQ ID NO: 16 esta codificada por la secuencia de nucleotidos representada por SEQ ID NO: 15 (con optimizacion de codones para la expresion en levadura). La secuencia lider alfa (correspondiente a las posiciones 1-89 de SEQ ID NO: 16) podria sustituirse por una secuencia N-terminal diferente disenada para conferir resistencia a la degradacion proteasomica y/o estabilizar la expresion, tal como el peptido representado por SEQ ID NO: 19 o un peptido N-terminal de una secuencia lider alfa de levadura diferente, tal como SEQ ID NO: 18, o por una secuencia senal de MUC1. La cola C-terminal de hexahistidina es opcional y facilita la identificacion y/o purificacion de la proteina.

En comparacion con la proteina MUC1 de tipo natural usada como molde, la secuencia de SEQ ID NO: 16 contiene las siguientes sustituciones de aminoacido: (se facilitan las posiciones de sustitucion con referencia a SEQ ID NO: 16 con referencia adicional entre parentesis a la ubicacion de la sustitucion en una MUC1 de tipo natural representada por el n.° de registro NP_001191214 correspondiente a SEQ ID NO: 14): T184L (posicion 93 en MUC1 de tipo natural), A232Y (posicion 161 en MUC1 de tipo natural), P233L (posicion 162 en MUC1 de tipo natural), G240v (posicion 169 en MUC1 de tipo natural), S241Y (posicion 170 en mUc1 de tipo natural), T242L (posicion 171 en MUC1 de tipo natural), A483Y (posicion 392 en MUC1 de tipo natural), C495A (posicion 404 en MUC1 de tipo natural) C497V (posicion 406 en MUC1 de tipo natural), T513K (posicion 422 en MUC1 de tipo natural), P521A(posicion 430 en MUC1 de tipo natural), T522L (posicion 431 en MUC1 de tipo natural), T535L (posicion 444 en MUC1 de tipo natural), D536F (posicion 445 en MUC1 de tipo natural), y S551Y (posicion 460 en MUC1 de tipo natural). La sustitucion C495A (posicion 404 en la proteina MUC1 de tipo natural) es la mutacion inactivante; el resto de las sustituciones son para producir epitopos agonistas.

SEQ ID NO: 16 comprende el peptido agonista potenciador denominado en el presente documento SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 esta ubicada en las posiciones 513-522 de SEQ ID NO: 16.

El antfgeno de MUC1 para inmunoterapia basada en levadura representado por SEQ ID NO: 16 contiene epitopos agonistas para varios tipos de HLA diferentes, incluyendo A2, A3 y A24, haciendo que sea un antfgeno versatil y unico para seleccionar como diana tumores en una variedad de individuos con un cancer que expresa MUC1.

Un antfgeno de MUC1 util en la composicion para inmunoterapia basada en levadura de la presente invencion tambien incluye antigenos que tienen una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16 en la longitud completa de la proteina de fusion o en un fragmento definido de SEQ ID NO: 16 (por ejemplo, un dominio inmunologico o dominio funcional (dominio con al menos una actividad biologica)) que forma parte de la proteina, incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones 92-566 de SEQ ID NO: 16 (el antfgeno de MUC1 dentro de SEQ ID NO: 16).

Resulta sencillo usar las partes correspondientes de cualquiera de las proteinas MUC1 que se derivan u obtienen a partir de secuencias o fuentes distintas de las ejemplificadas en el presente documento, y particularmente a partir de secuencias o fuentes dentro de la misma especie animal, para crear peptidos, polipeptidos y proteinas de fusion que tienen una estructura global similar o igual a la de los peptidos, polipeptidos y proteinas de fusion descritos en el presente documento. A modo de ejemplo, puede identificarse facilmente una secuencia correspondiente en una proteina MUC1 humana dada de cualquier fuente que corresponde a las posiciones 92-566 de SEQ ID NO: 16 usando procedimientos o herramientas de alineacion de secuencias simples. Por tanto, las secuencias con diferencias menores y/o conservativas con respecto a las secuencias ejemplificadas en el presente documento estan abarcadas expresamente por la presente invencion.

Tal como se analizo anteriormente, las secuencias de expresion N-terminal y las C-terminales, tales como las descritas anteriormente con respecto a la proteina de fusion de SEQ ID NO: 16 son opcionales, pero pueden seleccionarse de varias secuencias diferentes para mejorar o ayudar en la expresion, estabilidad, y/o permitir la identificacion y/o purificacion de la proteina. Por ejemplo, una secuencia sintetica N-terminal a modo de ejemplo que potencia la estabilidad de expresion de un antfgeno en una celula de levadura y/o impide la modificacion

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postraduccional de la proteina en la levadura incluye la secuencia M-A-D-E-A-P (representada en el presente documento por SEQ ID NO: 19). En otras realizaciones, el antigeno de MUC1 se une en el extremo N-terminal a una proteina de levadura, tal como una secuencia prepro de factor alfa (tambien denominada la secuencia lider senal de factor alfa, cuya secuencia de aminoacidos se ejemplifica en el presente documento por SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18). Se conocen en la tecnica otras secuencias para la secuencia prepro de factor alfa de levadura y estan abarcadas para su uso en la presente invencion. Ademas, se conocen en la tecnica muchos promotores diferentes adecuados para su uso en levadura. Ademas, pueden introducirse secuencias ligadoras intermedias cortas (por ejemplo, peptidos de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoacido) entre partes de una proteina de fusion que comprenden un antigeno de MUC1 por una variedad de motivos, incluyendo la introduccion de sitios de enzima de restriccion para facilitar la clonacion, como sitios de escision para proteasas fagosomicas del huesped, para acelerar el procesamiento de proteinas o antigenos, y para la manipulacion futura de los constructos.

Para su uso en realizaciones de la invencion referidas a levadura, puede usarse cualquier promotor de levadura adecuado y los expertos en la tecnica conocen una variedad de tales promotores. Los promotores para la expresion en Saccharomyces cerevisiae incluyen, pero no se limitan a, promotores de genes que codifican para las siguientes proteinas de levadura: alcohol deshidrogenasa I (ADH1) o II (ADH2), CUP1, fosfoglicerato cinasa (PGK), triosa fosfato isomerasa (TPI), factor de elongacion traduccional EF-1 alfa (TEF2), gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; tambien denominada TDH3, para triosa fosfato deshidrogenasa), galactocinasa (GAL1), galactosa-1- fosfato uridil-transferasa (GAL7), UDP-galactosa epimerasa (GAL10), citocromo c1 (CYC1), proteina Sec7 (SEC7) y fosfatasa acida (PHO5), incluyendo promotores hibridos tales como los promotores ADH2/GAPDHy CYC1/GAL10, e incluyendo el promotor ADH2/GAPDH, que se induce cuando las concentraciones de glucosa en la celula son bajas (por ejemplo, aproximadamente del 0,1 a aproximadamente el 0,2 por ciento), asi como el promotor CUP1 y el promotor TEF2. Asimismo, se conocen varias secuencias de activacion anteriores (UAS), tambien denominadas potenciadores. Las secuencias de activacion anteriores para la expresion en Saccharomyces cerevisiae incluyen, pero no se limitan a, las UAS de genes que codifican para las siguientes proteinas: PCK1, TPI, TDH3, CYC1, ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 y GAL10, asi como otras UAS activadas por el producto genico de GAL4, usandose la UAS de ADH2 en un aspecto. Puesto que la UAS de ADH2 se activa por el producto genico de ADR1, puede ser preferible sobreexpresar el gen de ADR1 cuando un gen heterologo se une operativamente a la UAS de ADH2. La secuencias de terminacion de la transcripcion para la expresion en Saccharomyces cerevisiae incluyen las secuencias de terminacion de los genes de factor a, GAPDH y CYC1.

Las secuencias de control de la transcripcion para expresar genes en levaduras metiltroficas incluyen las regiones de control de la transcripcion de los genes que codifican para alcohol oxidasa y formiato deshidrogenasa.

Segun la presente invencion, un “vehiculo de levadura” usado en una composicion para inmunoterapia basada en levadura es cualquier celula de levadura (por ejemplo, una celula completa o intacta) o un derivado de la misma (vease a continuacion) que puede usarse junto con uno o mas antigenos, dominios inmunogenicos de los mismos, o epitopos de los mismos en una composicion inmunoterapica basada en levadura de la invencion (por ejemplo, una composicion terapeutica o profilactica). Por tanto, el vehiculo de levadura puede incluir, pero no se limita a, un microorganismo de levadura intacta (completa) vivo (es decir, una celula de levadura que tiene todos sus componentes incluyendo una pared celular), un microorganismo de levadura intacta destruido (muerto) o inactivado, derivados de levadura intacta incluyendo un esferoplasto de levadura (es decir, una celula de levadura que carece de pared celular), un citoplasto de levadura (es decir, una celula de levadura que carece de pared celular y nucleo), un fantasma de levadura (es decir, una celula de levadura que carece de pared celular, nucleo y citoplasma), un extracto subcelular de membrana de levadura o fraccion del mismo (tambien denominado particula de membrana de levadura y previamente como particula de levadura subcelular), cualquier otra particula de levadura, o una preparacion de pared de celula de levadura.

Los esferoplastos de levadura se producen normalmente mediante digestion enzimatica de la pared de celula de levadura. Se describe un metodo de este tipo, por ejemplo, en Franzusoff et al., Met. Enzymol., 194: 662-674 (1991). Los citoplastos de levadura se producen normalmente mediante enucleacion de celulas de levadura. Se describe un metodo de este tipo, por ejemplo, en Coon, Natl. Cancer Inst. Monogr., 48: 45-55 (1978). Los fantasmas de levadura se producen normalmente mediante el resellado de una celula permeabilizada o lisada y pueden contener, pero no es necesario, al menos algunos de los organulos de esa celula. Se describe un metodo de este tipo, por ejemplo, en Franzusoff et al., J. Biol. Chem., 258, 3608-3614 (1983) y Bussey et al., Biochim. Biophys. Acta, 553: 185-196 (1979). Una particula de membrana de levadura (extracto subcelular de membrana de levadura o fraccion del mismo) se refiere a una membrana de levadura que carece de citoplasma o nucleo natural. La particula puede ser de cualquier tamano, incluyendo tamanos que oscilan entre el tamano de una membrana de levadura natural y microparticulas producidas mediante sonicacion u otros metodos de rotura de membrana que conocen los expertos en la tecnica, seguido por resellado. Se describe un metodo para producir extractos subcelulares de membrana de levadura, por ejemplo, en Franzusoff et al., Met. Enzymol., 194, 662-674 (1991). Tambien pueden usarse fracciones de particulas de membrana de levadura que contienen partes de membrana de levadura y, cuando el antigeno u otra proteina se expresa de manera recombinante por la levadura antes de la preparacion de las particulas de membrana de levadura, el antigeno u otra proteina de interes. Pueden portarse antigenos u otras proteinas de interes en el interior de la membrana, o bien sobre la superficie de la membrana, o combinaciones de los mismos (es decir, la proteina puede estar tanto en el interior como en el exterior de la membrana y/o abarcar la membrana de la particula

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de membrana de levadura). En una realizacion, una particula de membrana de levadura es una partfcula de membrana de levadura recombinante que puede ser una membrana de levadura intacta, rota, o rota y resellada que incluye al menos un antigeno deseado u otra proteina de interes en la superficie de la membrana o integrada al menos parcialmente dentro de la membrana. Un ejemplo de una preparacion de pared de celula de levadura es una preparacion de paredes de celula de levadura aisladas que portan un antigeno en su superficie o al menos parcialmente integrado dentro de la pared celular de tal manera que la preparacion de pared de celula de levadura, cuando se administra a un sujeto, estimula una respuesta inmunitaria deseada frente a una diana patologica.

Cualquier cepa de levadura puede usarse para producir un vehiculo de levadura de la presente invencion, o usarse de otro modo como celula huesped en la presente invencion. Las levaduras son microorganismos unicelulares que pertenecen a una de tres clases: ascomicetos, basidiomicetos y hongos imperfectos. Una consideracion para la seleccion de un tipo de levadura para su uso como modulador inmunitario es la patogenicidad de la levadura. En una realizacion, la levadura es una cepa no patogenica tal como Saccharomyces cerevisiae. La seleccion de una cepa de levadura no patogenica minimiza cualquier efecto adverso al individuo al que se le administra el vehiculo de levadura. Sin embargo, puede usarse levadura patogenica si la patogenicidad de la levadura puede anularse mediante cualquier medio conocido por un experto en la tecnica (por ejemplo, cepas mutantes). Segun un aspecto de la presente invencion, se usan cepas de levadura no patogenicas.

Los generos de cepas de levadura que pueden usarse en la invencion incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces, Candida (que puede ser patogenica), Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces y Yarrowia. En un aspecto, los generos de levadura se seleccionan de Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia o Schizosaccharomyces, y en un aspecto, se usa Saccharomyces. Las especies de cepas de levadura que pueden usarse en la invencion incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe, y Yarrowia lipolytica. Ha de apreciarse que varias de estas especies incluyen una variedad de subespecies, tipos, subtipos, etc. que se pretende que esten incluidos dentro de las especies mencionadas anteriormente. En un aspecto, las especies de levadura usadas en la invencion incluyen S. cerevisiae, C. albicans, H. polymorpha, P. pastoris y S. pombe. S. cerevisiae es util ya que es relativamente facil de manipular y “generalmente reconocida como segura” o “GRAS” para su uso como aditivos alimentarios (GRAS, regla 62FR18938 propuesta por la FDA, 17 de abril de 1997). Una realizacion de la presente invencion es una cepa de levadura que puede replicar plasmidos hasta un numero de copias particularmente alto, tal como una cepa de S. cerevisiae cir°. La cepa de S. cerevisiae es una cepa tal que puede soportar vectores de expresion que permiten que se expresen una o mas diana(s) antigenica(s) y/o proteina(s) de fusion de antigeno y/u otras proteinas a altos niveles. Otra cepa de levadura que es util en la invencion es Saccharomyces cerevisiae W303a. Ademas, puede usarse cualquier cepa de levadura mutante en la presente invencion, incluyendo las que presentan modificaciones postraduccionales reducidas de expresadas antigeno dianas u otras proteinas, tales como mutaciones en las enzimas que extienden la glicosilacion unida a N. En un aspecto de la invencion, se produce una composicion para inmunoterapia basada en levadura es usando una cepa de levadura mutante que produce el antigeno de MUC1 como proteina subglicosilada en comparacion con el mismo antigeno producido por la cepa de tipo natural (con glicosilacion normal). Tal antigeno de MUC1 puede ser mas similar a antigenos de MUC1 expresados por celulas tumorales, que pueden procesarse entonces en epitopos unicos de celulas T por celulas presentadoras de antigeno, potenciando por tanto la respuesta antitumoral especifica.

En general, el vehiculo de levadura y antigeno(s) y/u otros agentes pueden asociarse mediante cualquier tecnica descrita en el presente documento. En un aspecto, el vehiculo de levadura se carga de manera intracelular con el/los antigeno(s) y/u otros agente(s) o agente(s) adicional(es) que van a incluirse en la composicion. En otro aspecto, el/los antigeno(s) y/o agente(s) se une(n) de manera covalente o de manera no covalente al vehiculo de levadura. En aun otro aspecto, el vehiculo de levadura y el/los antigeno(s) y/o agente(s) se asocian mediante mezclado. En otro aspecto, el/los antigeno(s) y/o agente(s) se expresan de manera recombinante por el vehiculo de levadura o por la celula de levadura o esferoplasto de levadura del que se deriva el vehiculo de levadura (si el vehiculo de levadura es distinto de una celula intacta completa o un esferoplasto).

En una realizacion, una celula de levadura usada para preparar el vehiculo de levadura se transfecta con una molecula de acido nucleico heterologa que codifica para un peptido (por ejemplo, el antigeno) de tal manera que el peptido se exprese por la celula de levadura. Tal levadura tambien se denomina en el presente documento levadura recombinante o un vehiculo de levadura recombinante. La celula de levadura puede formularse entonces con un excipiente farmaceuticamente aceptable y se administra directamente a un individuo, se almacena para su administracion posterior a un individuo, o se carga en una celula dendritica, que entonces puede administrarse a su vez a un individuo. La celula de levadura tambien puede destruirse, o puede derivatizarse tal como mediante la formacion de esferoplastos, citoplastos, fantasmas o particulas subcelulares de levadura, cualquiera de los cuales puede estar seguido por almacenar, administrar directamente a un individuo, o cargar la celula o derivado en una celula dendritica. Los esferoplastos de levadura tambien pueden transfectarse directamente con una molecula de acido nucleico recombinante (por ejemplo, se produce el esferoplasto a partir de una levadura completa, y luego se transfecta) para producir un esferoplasto recombinante que expresa el antigeno. Pueden usarse celulas de levadura

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o esferoplastos de levadura que expresan de manera recombinante el/los antigeno(s) para producir un vehiculo de levadura que comprende una citoplasto de levadura, un fantasma de levadura, o una particula de membrana de levadura o particula de pared de celula de levadura, o fraccion de los mismos.

El numero de antigenos y/u otras proteinas que van a producirse por un vehiculo de levadura de la presente invencion es cualquier numero de antigenos y/u otras proteinas que puedan producirse razonablemente por un vehiculo de levadura, y normalmente oscila entre al menos uno y al menos aproximadamente 6 o mas, incluyendo entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6 antigenos y/u otras proteinas.

Se logra la expresion de un antigeno u otras proteinas en un vehiculo de levadura de la presente invencion usando tecnicas que conocen los expertos en la tecnica. En resumen, se inserta una molecula de acido nucleico que codifica para al menos un antigeno deseado u otra proteina en un vector de expresion de tal manera que la molecula de acido nucleico se une operativamente a una secuencia de control de la transcripcion para poder efectuar la expresion o bien constitutiva o bien regulada de la molecula de acido nucleico cuando se transforma en una celula huesped de levadura. Las moleculas de acido nucleico que codifican para uno o mas antigenos y/u otras proteinas pueden estar en uno o mas vectores de expresion operativamente unidos a una o mas secuencias de control de la expresion. Secuencias de control de la expresion particularmente importantes son aquellas que controlan la iniciacion de la transcripcion, tales como secuencias de activacion promotoras y anteriores. Se han descrito anteriormente promotores adecuados para su uso en levadura.

La transfeccion de una molecula de acido nucleico en una celula (por ejemplo, celula de levadura) segun la presente invencion puede lograrse mediante cualquier metodo mediante el que puede introducirse una molecula de acido nucleico en la celula e incluye, pero no se limita a, difusion, transporte activo, sonicacion en bano, electroporacion, microinyeccion, lipofeccion, adsorcion y fusion de protoplastos. Pueden integrarse moleculas de acido nucleico transfectadas, en un cromosoma de levadura o mantenerse en vectores extracromosomicos usando tecnicas que conocen los expertos en la tecnica. Se dan a conocer ejemplos de vehiculos de levadura que portan tales moleculas de acido nucleico con detalle en el presente documento. Tal como se comento anteriormente, tambien pueden producirse citoplasto de levadura, fantasma de levadura y particulas de membrana de levadura o preparaciones de pared celular de manera recombinante transfectando microorganismos de levadura intacta o esferoplastos de levadura con moleculas de acido nucleico deseadas, produciendo el antigeno en los mismos, y luego manipulando adicionalmente los microorganismos o esferoplastos usando tecnicas que conocen los expertos en la tecnica para producir citoplasto, fantasma o extracto subcelular de membrana de levadura o fracciones de los mismos que contienen antigenos deseados u otras proteinas.

Las condiciones eficaces para la produccion de vehiculos de levadura recombinantes y expresion del antigeno y/u otra proteina por el vehiculo de levadura incluyen un medio eficaz en el que puede cultivarse una cepa de levadura. Un medio eficaz es normalmente un medio acuoso que comprende fuentes asimilables de hidratos de carbono, nitrogeno y fosfato, asi como sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas y factores de crecimiento. El medio puede comprender nutrientes complejos o puede ser un medio minimo definido. Pueden cultivarse cepas de levadura de la presente invencion en una variedad de recipientes, incluyendo, pero sin limitarse a, biorreactores, matraces Erlenmeyer, tubos de ensayo, placas de microtitulacion y placas de Petri. Se lleva a cabo el cultivo a una temperatura, un pH y contenido de oxigeno apropiados para la cepa de levadura. Tales condiciones de cultivo estan bastante dentro de la experiencia de un experto habitual en la tecnica (vease, por ejemplo, Guthrie et al. (eds.), Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego (1991)). Por ejemplo, en un protocolo, pueden inocularse cultivos liquidos que contienen un medio adecuado usando cultivos obtenidos a partir de placas iniciadoras y/o cultivos iniciadores de composiciones para inmunoterapia basadas en MUC1- levadura, y se hacen crecer durante aproximadamente 20 h a 30°C, con agitacion a 250 rpm. Entonces pueden expandirse los cultivos primarios para dar cultivos mas grandes segun se desee. La expresion de proteina a partir de vectores con los que se transformaron las levaduras (por ejemplo, expresion de MUC1) puede ser constitutiva si el promotor utilizado es un promotor constitutivo, o puede inducirse mediante la adicion de las condiciones de induccion apropiadas para el promotor si el promotor utilizado es un promotor inducible (por ejemplo, sulfato de cobre en el caso del promotor CUP1). En el caso de un promotor inducible, puede iniciarse la induccion de la expresion de proteina despues de haberse hecho crecer el cultivo hasta una densidad celular adecuada, que puede estar en aproximadamente 0,2 YU/ml o mayores densidades.

Un ejemplo no limitativo de un medio adecuado para el cultivo de una composicion para inmunoterapia basada en levadura de la invencion es el medio U2. El U2 medio comprende los siguientes componentes: 15 g/l de glucosa, 6,7 g/l de base nitrogenada de levadura que contiene sulfato de amonio, y 0,04 mg/ml de cada uno de histidina, triptofano y adenina, y 0,06 mg/ml de leucina. Otro ejemplo no limitativo de un medio adecuado para el cultivo de composicion para inmunoterapia basada en levadura de la invencion es el medio UL2. El medio UL2 comprende los siguientes componentes: 15 g/l de glucosa, 6,7 g/l de base nitrogenada de levadura que contiene sulfato de amonio, y 0,04 mg/ml de cada uno de histidina, triptofano y adenina.

En algunas realizaciones de la invencion, las levaduras se hacen crecer en condiciones de pH neutro (a veces tambien denominadas condiciones “DEC” o “Dec”). Tal como se usa en el presente documento, el uso general del termino “pH neutro” se refiere a un intervalo de pH de entre aproximadamente pH 5,5 y aproximadamente pH 8, y en

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un aspecto, entre aproximadamente pH 6 y aproximadamente 8. Un experto en la tecnica apreciara que pueden producirse fluctuaciones menores (por ejemplo, de decimas o centesimas) cuando se mide con un pHmetro. Como tal, el uso de pH neutro para hacer crecer celulas de levadura significa que se hacen crecer las celulas de levadura en pH neutro durante la mayoria del tiempo que estan en cultivo. En una realizacion, se hacen crecer levaduras en un medio mantenido a un nivel de pH de al menos 5,5 (es decir, no se permite que el pH del medio de cultivo disminuya por debajo de pH 5,5). En otro aspecto, se hacen crecer levaduras a un nivel de pH mantenido a aproximadamente 6, 6,5, 7, 7,5 u 8. En un aspecto, se mantiene el pH neutro usando un tampon adecuado para crear un medio de crecimiento o cultivo tamponado. El uso de un pH neutro en levadura en cultivo fomenta varios efectos biologicos que son caracteristicas deseadas para usar la levadura como vehiculos para inmunomodulacion. Por ejemplo, el cultivo de la levadura en pH neutro permite un buen crecimiento de la levadura sin efecto negativo sobre el tiempo de generacion de celulas (por ejemplo, ralentizacion del tiempo de duplicacion). Puede continuar haciendose crecer la levadura hasta altas densidades sin perder su flexibilidad de pared celular. El uso de un pH neutro permite la produccion de levaduras con paredes celulares flexibles y/o levaduras que son mas sensibles a las enzimas de digestion de pared celular (por ejemplo, glucanasa) a todas las densidades de recogida. Este rasgo es deseable porque las levaduras con paredes celulares flexibles pueden inducir respuestas inmunitarias diferentes o mejoradas en comparacion con levaduras hechas crecer en condiciones mas acidas, por ejemplo, fomentando la secrecion de citocinas por celulas presentadoras de antigeno que han fagocitado la levadura (por ejemplo, citocinas de tipo TH1 incluyendo, pero sin limitarse a, IFN-y, interleucina-12 (IL-12) e IL-2, asi como citocinas proinflamatoria tales como IL-6). Ademas, se proporciona una accesibilidad a los antigenos ubicados en la pared celular mediante tales metodos de cultivo. En otro aspecto, el uso de pH neutro para algunos antigenos permite la liberacion de antigeno unido con enlaces disulfuro mediante tratamiento con ditiotreitol (DTT) lo que no es posible cuando se cultiva tal levadura que expresa antigeno en medios a menor pH (por ejemplo, pH 5). En un ejemplo no limitativo del uso de condiciones de pH neutro para cultivar levaduras para su uso en la presente invencion, el medio UL2 descrito anteriormente se tampona usando, por ejemplo, 4,2 g/l de Bis-Tris.

En una realizacion, se usa el control de la cantidad de glicosilacion de levadura para controlar la expresion de antigenos por la levadura, particularmente en la superficie. La cantidad de glicosilacion de levadura puede afectar a la inmunogenicidad y antigenicidad del antigeno, particularmente uno expresado en la superficie, puesto que los restos de azucar tienden a ser voluminosos. Como tal, la existencia de los restos de azucar en la superficie de la levadura y su impacto en el espacio tridimensional alrededor del/de los antigeno(s) diana debe considerarse en la modulacion de levadura segun la invencion. Puede usarse cualquier metodo para reducir o aumentar la cantidad de glicosilacion de la levadura, si se desea. Por ejemplo, podria usarse una cepa mutante de levadura que se ha seleccionado para que tenga baja glicosilacion (por ejemplo, mutantes mnn1, och1 y mnn9), o podria eliminarse mediante mutacion de las secuencias aceptoras de glicosilacion en el antigeno diana. Alternativamente, podrian usarse levaduras con patrones de glicosilacion abreviados, por ejemplo, Pichia. Tambien puede tratarse la levadura usando metodos que reducen o alteran la glicosilacion.

En una realizacion de la presente invencion, como alternativa a la expresion de un antigeno de manera recombinante en el vehiculo de levadura, se carga un vehiculo de levadura de manera intracelular con el peptido y/u otras moleculas que sirven como antigeno y/o son utiles como agentes inmunomoduladores o modificadores de la respuesta biologica segun la invencion. Posteriormente, el vehiculo de levadura, que contiene ahora el antigeno y/u otras proteinas de manera intracelular, puede administrarse a un individuo o, alternativamente, cargarse en un portador tal como una celula dendritica, que puede administrarse a su vez a un individuo. Pueden insertarse peptidos y proteinas directamente en vehiculos de levadura de la presente invencion mediante tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica, tal como mediante difusion, transporte activo, fusion de liposomas, electroporacion, fagocitosis, ciclos de congelacion-descongelacion y sonicacion en bano. Los vehiculos de levadura que pueden cargarse directamente con peptidos, proteinas, hidratos de carbono, u otras moleculas incluyen levaduras intactas, asi como esferoplastos, fantasmas o citoplastos, que pueden cargarse con antigenos y otros agentes despues de su produccion. Alternativamente, pueden cargarse levaduras intactas con el antigeno y/o agente, y luego pueden prepararse a partir de las mismas esferoplastos, fantasmas, citoplastos o particulas subcelulares. Puede cargarse cualquier numero de antigenos y/u otros agentes en un vehiculo de levadura en esta realizacion, desde al menos 1, 2, 3, 4 o cualquier numero entero hasta cientos o miles de antigenos y/u otros agentes, tal como se proporcionaria mediante la carga de un microorganismo o partes del mismo, por ejemplo.

En otra realizacion de la presente invencion, un antigeno y/u otro agente se une fisicamente al vehiculo de levadura. La union fisica del antigeno y/u otro agente al vehiculo de levadura puede lograrse mediante cualquier metodo adecuado en la tecnica, incluyendo metodos de asociacion covalente y no covalente que incluyen, pero no se limitan a, reticular quimicamente el antigeno y/u otro agente a la superficie exterior del vehiculo de levadura o unir biologicamente el antigeno y/u otro agente a la superficie exterior del vehiculo de levadura, tal como usando un anticuerpo u otra pareja de union. La reticulacion quimica puede lograrse, por ejemplo, mediante metodos que incluyen union a glutaraldehido, marcaje de fotoafinidad, tratamiento con carbodiimidas, tratamiento con productos quimicos que pueden unirse por enlaces disulfuro, y tratamiento con otros productos quimicos de reticulacion convencionales en la tecnica. Alternativamente, puede ponerse en contacto un producto quimico con el vehiculo de levadura que altera la carga de la bicapa lipidica de la membrana de levadura o la composicion de la pared celular de modo que es mas probable que la superficie exterior de la levadura se fusione o se una a antigenos y/u otro agente que tiene caracteristicas de carga particulares. Tambien pueden incorporarse agentes de direccionamiento

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tales como anticuerpos, peptidos de union, receptores solubles y otros ligandos en un antigeno como proteina de fusion o asociarse de otro modo con un antigeno para la union del antigeno al vehiculo de levadura.

Cuando el antigeno u otra proteina se expresa en o se une fisicamente a la superficie de la levadura, pueden seleccionarse cuidadosamente, en un aspecto, brazos espaciadores para optimizar la expresion o el contenido de antigeno u otra proteina en la superficie. El tamano del/de los brazo(s) espaciador(es) puede afectar a que cantidad del antigeno u otra proteina queda expuesta para la union en la superficie de la levadura. Por tanto, dependiendo de que antigeno(s) u otra(s) proteina(s) este(n) usandose, un experto en la tecnica seleccionara un brazo espaciador que efectua un espaciado apropiado para el antigeno u otra proteina en la superficie de la levadura. En una realizacion, el brazo espaciador es una proteina de levadura de al menos 450 aminoacidos. Se han analizado brazos espaciadores con detalle anteriormente.

En aun otra realizacion, el vehiculo de levadura y el antigeno u otra proteina se asocian entre si mediante un mecanismo mas pasivo, inespecifico o de union no covalente, tal como mezclando suavemente el vehiculo de levadura y el antigeno u otra proteina entre si en un tampon u otra formulacion adecuada (por ejemplo, mezcla).

En una realizacion, puede molerse levadura intacta (con o sin expresion de antigenos heterologos u otras proteinas) o procesarse de manera que se produzcan preparaciones de pared de celula de levadura, particulas de membrana de levadura o fragmentos de levadura (es decir, no intacta) y los fragmentos de levadura pueden dotarse, en algunas realizaciones, de o administrarse con otras composiciones que incluyen antigenos (por ejemplo, vacunas de ADN, vacunas de subunidades de proteina, patogenos muertos o inactivados, vacunas de vectores virales) para potenciar respuestas inmunitarias. Por ejemplo, puede usarse tratamiento enzimatico, tratamiento quimico o fuerza fisica (por ejemplo, cizallamiento mecanico o sonicacion) para romper la levadura en partes que se usan como adyuvante.

En una realizacion de la invencion, los vehiculos de levadura utiles en la invencion incluyen vehiculos de levadura que se han destruido o inactivado. La destruccion o inactivacion de levaduras puede lograrse mediante cualquiera de una variedad de metodos adecuados conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la inactivacion por calor de levaduras es un modo convencional de inactivar levaduras, y un experto en la tecnica puede monitorizar los cambios estructurales del antigeno diana, si se desea, mediante metodos convencionales conocidos en la tecnica. Alternativamente, pueden usarse otros metodos de inactivacion de levaduras, tal como metodos quimicos, electricos, radiactivos o de UV. Vease, por ejemplo, la metodologia dada a conocer en libros de texto sobre cultivo de levaduras convencionales tales como Methods of Enzymology, Vol. 194, Cold Spring Harbor Publishing (1990). Cualquiera de las estrategias de inactivacion usadas debe tener en cuenta la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria del antigeno diana y preservar tal estructura para optimizar su inmunogenicidad.

Pueden formularse vehiculos de levadura en composiciones o productos para inmunoterapia basados en levadura de la presente invencion usando varias tecnicas que conocen los expertos en la tecnica. Por ejemplo, pueden secarse vehiculos de levadura mediante liofilizacion. Tambien pueden prepararse formulaciones que comprenden vehiculos de levadura empaquetando levaduras en una torta o un comprimido, tal como se realiza para la levadura usada en operaciones de panificacion o elaboracion de cerveza. Ademas, pueden mezclarse vehiculos de levadura con un excipiente farmaceuticamente aceptable, tal como un tampon isotonico que tolera un huesped o una celula huesped. Los ejemplos de tales excipientes incluyen agua, solucion salina, solucion de Ringer, disolucion de dextrosa, solucion de Hank, y otras disoluciones salinas acuosas fisiologicamente equilibradas. Tambien pueden usarse vehiculos no acuosos, tales como aceites fijos, aceite de sesamo, oleato de etilo o trigliceridos. Otras formulaciones utiles incluyen suspensiones que contienen agentes potenciadores de la viscosidad, tales como carboximetilcelulosa sodica, sorbitol, glicerol o dextrano. Los excipientes tambien pueden contener cantidades minoritarias de aditivos, tales como sustancias que potencian la isotonicidad y estabilidad quimica. Los ejemplos de tampones incluyen tampon fosfato, tampon bicarbonato y tampon Tris, mientras que los ejemplos de conservantes incluyen timerosal, m u o-cresol, formalina y alcohol bencilico. Las formulaciones convencionales pueden ser o bien preparaciones inyectables liquidas o bien solidos que pueden llevarse a un liquido adecuado como suspension o disolucion para inyeccion. Por tanto, en una formulacion no liquida, el excipiente puede comprender, por ejemplo, dextrosa, albumina serica humana, y/o conservantes a los que puede anadirseles agua esteril o solucion salina antes de la administracion.

El peptido, acido nucleico, vector o la celula puede aislarse. El termino “aislado” tal como se usa en el presente documento abarca compuestos o composiciones que se han retirado de un entorno biologico (por ejemplo, una celula, un tejido, medio de cultivo, liquido corporal, etc.) o se ha aumentado de otro modo su pureza en cualquier grado (por ejemplo, aislado de un medio de sintesis). Las composiciones y los compuestos aislados pueden ser, por tanto, sinteticos o producirse de manera natural.

El peptido, acido nucleico, vector o la celula puede formularse como una composicion (por ejemplo, composicion farmaceutica) que comprende el peptido, acido nucleico, vector o la celula y un portador (por ejemplo, un portador farmaceutica o fisiologicamente aceptable). Ademas, el peptido, acido nucleico, vector, la celula o composicion de la invencion puede usarse en los metodos descritos en el presente documento solos o como parte de una formulacion farmaceutica.

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La composicion (por ejemplo, composicion farmaceutica) puede comprender mas de un peptido, acido nucleico, vector o una celula o composicion de la invencion. Los vectores y las composiciones de la invencion pueden incluir ademas o pueden administrarse con (de manera concurrente, de manera secuencial o de manera intermitente con) cualquier otro agente o composicion o protocolo que sea util para prevenir o tratar cancer o cualquier compuesto que trate o mejore cualquier sintoma de cancer, y particularmente canceres asociados con la expresion o sobreexpresion de MUC1. Por ejemplo, la composicion puede comprender uno o mas de otros farmacos o agentes farmaceuticamente activos. Los ejemplos de tales otros farmacos o agentes farmaceuticamente activos que pueden ser adecuados para su uso en la composicion farmaceutica incluyen agentes anticancerigenos (por ejemplo, agentes quimioterapicos o radioterapicos), antimetabolitos, hormonas, antagonistas de hormonas, antibioticos, farmacos antivirales, farmacos antifungicos, ciclofosfamida, y combinaciones de los mismos. Los agentes anticancerigenos adecuados incluyen, sin limitacion, agentes de alquilacion, antagonistas de folato, antagonistas de purina, antagonistas de pirimidina, venenos del huso, inhibidores de topoisomerasa, agentes inductores de apoptosis, inhibidores de la angiogenesis, podofilotoxinas, nitrosoureas, cisplatino, carboplatino, interferon, asparginasa, tamoxifeno, leuprolida, flutamida, megestrol, mitomicina, bleomicina, doxorubicina, irinotecan, Taxol, geldanamicina (por ejemplo, 17-AAG), y diversos peptidos y anticuerpos anticancerigenos conocidos en la tecnica.

Los agentes de alquilacion a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, mostazas de nitrogeno (por ejemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, melfalan, mostaza de uracilo o clorambucilo), alquilsulfonatos (por ejemplo, busulfano), nitrosoureas (por ejemplo, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina o dacarbazina). Los antimetabolitos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, analogos de acido folico (por ejemplo, metotrexato), analogos de pirimidina (por ejemplo, 5-fluorouracilo (5-FU) o citarabina) y analogos de purina (por ejemplo, mercaptopurina o tioguanina). Las hormonas y antagonistas de hormonas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, adrenocorticosteroides (por ejemplo, prednisona), progestagenos (por ejemplo, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de magestrol), estrogenos (por ejemplo, dietilestilbestrol y etinilestradiol), antiestrogenos (por ejemplo, tamoxifeno) y androgenos (por ejemplo, proprionato de testosterona y fluoximesterona). Otros agentes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina o vindesina), epipodofilotoxinas (por ejemplo, etoposido o teniposido), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina, plicamicina o mitomicina C), enzimas (por ejemplo, L-asparaginasa), complejo de coordinacion de platino (por ejemplo, cis-diamina-dicloroplatino II tambien conocido como cisplatino), ureas sustituidas (por ejemplo, hidroxiurea), derivados de metilhidrazina (por ejemplo, procarbazina) y supresores corticosuprarrenales (por ejemplo, mitotano y aminoglutetimida).

Los agentes quimioterapicos que pueden administrarse de manera concurrente, de manera secuencial o de manera intermitente con las composiciones y los vectores dados a conocer en el presente documento incluyen Adriamycin, Alkeran, Ara-C, busulfano, CCNU, carboplatino, cisplatino, Cytoxan, daunorubicina, DTIC, 5-FU, fludarabina, Hydrea, idarubicina, ifosfamida, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, mostaza de nitrogeno, Taxol (u otros taxanos, tales como docetaxel), Velban, vincristina, VP-16, gemcitabina (Gemzar), Herceptin, irinotecan (Camptosar, CPT-11), Leustatin, Navelbine, Rituxan STI-571, Taxotere, topotecan (Hycamtin), Xeloda (capecitabina), Zevelin, enzalutamida (MDV-3100 o XTANDI™) y calcitriol. Los inmunomoduladores y/o citocinas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, AS-101 (Wyeth-Ayerst Labs.), bropirimina (Upjohn), interferon gamma (Genentech), GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos; Genetics Institute), IL-2 (Cetus o Hoffman- LaRoche), globulina inmunitaria humana (Cutter Biological), IMREG (de Imreg de New Orleans, La.), SK&F 106528, factor de necrosis tumoral (TNF)-a y TNF-p.

Otros agentes, composiciones o protocolos (por ejemplo, protocolos terapeuticos) que son utiles para el tratamiento de cancer junto con los peptidos, acidos nucleicos, vectores, celulas y composiciones de la invencion incluyen, pero no se limitan a, extirpacion quirurgica de un tumor, radioterapia, trasplante alogenico o autologo de celulas madre, transferencia adoptiva de celulas T y/o terapias dirigidas contra el cancer (por ejemplo, farmacos de molecula pequena, productos biologicos o terapias con anticuerpos monoclonales que seleccionan como diana especificamente moleculas implicadas en el crecimiento y la progresion tumorales, incluyendo, pero sin limitarse a, moduladores selectivos de receptores de estrogenos (SERM), inhibidores de aromatasa, inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores de serina/treonina cinasa, inhibidores de histona desacetilasa (HDAC), activadores de receptores de retinoides, estimuladores de la apoptosis, inhibidores de la angiogenesis, inhibidores de poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP), o inmunostimuladores).

El agente activo adicional (por ejemplo, agente quimioterapico) puede administrarse antes de, de manera concurrente con (incluyendo simultaneamente), de manera alterna con, de manera secuencial, o despues de la administracion con las composiciones y los vectores dados a conocer en el presente documento. En determinadas realizaciones, se administran uno o mas (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) agentes quimioterapicos en combinacion con las composiciones y los vectores dados a conocer en el presente documento. Por ejemplo, cuando se administra a un individuo junto con quimioterapia o una terapia dirigida contra el cancer, puede desearse administrar las composiciones para inmunoterapia basadas en levadura durante el “descanso” entre dosis de quimioterapia o terapia dirigida contra el cancer, para maximizar la eficacia de las composiciones para inmunoterapia. La extirpacion quirurgica de un tumor puede preceder con frecuencia a la administracion de una composicion para inmunoterapia basada en levadura, pero puede tener lugar una cirugia adicional o primaria durante o despues de la administracion

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de una composicion para inmunoterapia basada en levadura.

El agente activo adicional puede administrarse solo o en una composicion. El agente activo adicional puede formularse mediante su inclusion en un vector (por ejemplo, plasmido o vector viral), en liposomas (tecemotide, que tambien se conoce como STIMUVAX™, vacuna liposomal BLP25 o L-BLP25), o en nanoparticulas (por ejemplo, la nanotecnologia VERSAMUNE™).

El portador puede ser cualquiera de los usados convencionalmente y esta limitado solamente por consideraciones fisicoquimicas, tales como solubilidad y falta de reactividad con el/los compuesto(s) activo(s), y por la via de administracion. Los expertos en la tecnica conocen bien portadores farmaceuticamente aceptables descritos en el presente documento, por ejemplo, vehiculos, adyuvantes, excipientes y diluyentes, y estan facilmente disponibles para el publico. Se prefiere que el portador farmaceuticamente aceptable sea uno que es quimicamente inerte con respecto al/a los agente(s) activo(s) y uno que no tiene efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.

La eleccion del portador estara determinada en parte por el peptido, acido nucleico, vector particular, la celula o composicion de los mismos de la invencion y otros agentes activos o farmacos usados, asi como por el metodo particular usado para administrar el vector o la composicion.

La composicion puede comprender adicional o alternativamente una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras. Puede usarse cualquier molecula inmunoestimuladora/reguladora adecuada, tal como interleucina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, IL-15/IL-15Ra, IL-15/IL-15Ra-Fc, interferon (IFN)-y, factor de necrosis tumoral (TNF)-a, B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-2, LFA-3, CD70, CD-72, RANTES, G-CSF, GM- CSF, OX-40L, 41 BBL, anticuerpo anti-CTLA-4, inhibidor de IDO, anticuerpo anti-PDL1, anticuerpo anti-PD1, y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, la composicion comprende una combinacion de B7.1, ICAM-1 y LFA-3 (tambien denominado TRICOM). La una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras pueden administrarse en forma de un vector (por ejemplo, un vector viral recombinante, tal como un vector de poxvirus) que comprende un acido nucleico que codifica para una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras. Por ejemplo, la una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras (por ejemplo, IL-12) pueden administrarse en forma de un plasmido de ADN con o sin quitosano. Alternativamente, la una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras pueden administrarse como proteina (por ejemplo, proteina recombinante), tal como una proteina (por ejemplo, IL-12 recombinante) a la que se le anadio quitosano. Tambien pueden administrarse una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras en combinacion con, o de manera concurrente con, una composicion para inmunoterapia basada en levadura de la invencion.

En una realizacion de la invencion, la composicion comprende un primer vector recombinante que comprende el acido nucleico que codifica para el peptido de la invencion y el segundo vector recombinante que comprende un acido nucleico que codifica para B7.1, ICAM-1 y LFA-3. En otra realizacion, el acido nucleico que codifica para el peptido de la invencion y el acido nucleico que codifica para B7.1, ICAM-1 y LFA-3 estan en el mismo vector recombinante. El primer y/o el segundo vectores pueden comprender adicionalmente un acido nucleico que codifica para otro antigeno asociado a tumor (por ejemplo, CEA), una version modificada del mismo (por ejemplo, CEA-6D), o un epitopo del mismo.

Por ejemplo, el vector recombinante puede ser un vector de avipox (por ejemplo, virus de viruela del canario o un virus de viruela aviar) que comprende el acido nucleico que codifica para el peptido de la invencion y acidos nucleicos que codifican para un polipeptido de B7-1, un polipeptido de ICAM-1 y un polipeptido de LFA-3. Alternativamente, el vector recombinante puede ser un virus ortopox que comprende el acido nucleico que codifica para el peptido de la invencion y acidos nucleicos que codifican para un polipeptido de B7-1, un polipeptido de ICAM-1 y un polipeptido de LFA-3.

En otra realizacion de la invencion, la composicion comprende una composicion para inmunoterapia basada en levadura tal como se describe en el presente documento, en la que la composicion para inmunoterapia basada en levadura comprende un vehiculo de levadura y al menos un antigeno que comprende el peptido de la invencion.

La invencion proporciona un metodo de transduccion de celulas dendriticas con la composicion, y opcionalmente moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras, tales como por ejemplo, B7-1, ICAM-1 y LFA-3. En un aspecto de la invencion, se administran celulas dendriticas transducidas con la composicion de peptido al huesped para generar una respuesta inmunitaria, tal como la activacion de una respuesta de celulas T citotoxicas.

La invencion proporciona una composicion, un vector o composiciones inmunoterapicas de MUC1-levadura para su uso en metodos de tratamiento de un sujeto que padece o es susceptible a un tumor que expresa MUC1 y/o que potencia una respuesta inmunitaria frente a un cancer que expresa MUC1 y/o que inhibe un cancer que expresa MUC-1. En una primera realizacion, la composicion de la invencion, un vector o composicion inmunoterapica de MUC1-levadura para su uso en estos metodos comprenden administrar una cantidad terapeuticamente eficaz del vector o la composicion a un sujeto. El vector o la composicion de la invencion puede usarse para prevenir el desarrollo de un cancer que expresa MUC1, particularmente en un individuo que corre un mayor riesgo de

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desarrollar tal cancer que otros individuos, o para tratar un paciente aquejado de un cancer que expresa MUC1. El vector o la composicion de la invencion es util para prevenir la aparicion de tales canceres, detener la progresion de tales canceres o eliminar tales canceres. Mas particularmente, el vector o la composicion de la invencion puede usarse para prevenir, inhibir o retrasar el desarrollo de tumores que expresan MUC1, y/o para prevenir, inhibir o retrasar la migracion tumoral y/o la invasion tumoral de otros tejidos (metastasis) y/o generalmente para prevenir o inhibir la progresion de cancer en un individuo. El vector o la composicion de la invencion tambien puede usarse para mejorar al menos un sintoma del cancer, tal como la reduccion de la carga tumoral en el individuo; la inhibicion del crecimiento tumoral en el individuo; el aumento de la supervivencia del individuo; y/o la prevencion, inhibicion, reversion o retraso de la progresion del cancer en el individuo. El vector o la composicion de la invencion puede usarse para tratar un sujeto con cancer que expresa MUC1 en cualquier estadio.

En una segunda realizacion, la composicion inmunoterapica de MUC1-levadura de la invencion es para su uso en metodos que comprenden tratar celulas dendriticas obtenidas de un sujeto con la cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion, y administrar las celulas dendriticas tratadas al sujeto.

En una tercera realizacion, la composicion inmunoterapica de MUC1-levadura de la invencion es para su uso en metodos que comprenden (a) aislar celulas dendriticas de PBMC obtenidas de un sujeto, (b) tratar las celulas dendriticas con la cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion ex vivo, (c) activar las PBMC obtenidas del sujeto con las celulas dendriticas tratadas ex vivo, y (d) administrar las PBMC activadas al sujeto.

En una cuarta realizacion, la composicion inmunoterapica de MUC1-levadura es para su uso en metodos de la invencion que comprenden un metodo para inhibir un cancer que expresa MUC1 en un sujeto que comprende (a) aislar celulas dendriticas de PBMC obtenidas de un sujeto, (b) tratar las celulas dendriticas con la cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion ex vivo, (c) activar las PBMC obtenidas del sujeto con las celulas dendriticas tratadas ex vivo, (d) aislar linfocitos T de las PBMC activadas ex vivo, y (e) administrar los linfocitos T aislados al sujeto.

La divulgacion tambien proporciona el uso de celulas T sometidas a transferencia adoptiva estimuladas in vitro con uno o mas de la cantidad terapeuticamente eficaz del peptido, polipeptido, acido nucleico, vector, la celula o composicion de los mismos para inhibir un cancer que expresa MUC1 en un sujeto.

El tratamiento (por ejemplo, inhibicion de un cancer que expresa MUC y/o potenciacion de una respuesta inmunitaria frente a un cancer que expresa MUC1) comprende, pero no se limita a, la destruccion de celulas tumorales, la reduccion de la carga tumoral, la inhibicion del crecimiento tumoral, la reduccion del tamano del tumor primario, la reduccion del numero de lesiones metastasicas, el aumento de la supervivencia del individuo, el retraso, la inhibicion, detencion o prevencion de la aparicion o el desarrollo de cancer metastasico (tal como mediante el retraso, la inhibicion, detencion o prevencion de la aparicion o el desarrollo de la migracion tumoral y/o la invasion tumoral de tejidos fuera del cancer primario y/u otros procesos asociados con la progresion metastasica del cancer), el retraso o la detencion de la progresion del cancer primario, la mejora de respuestas inmunitarias frente al tumor, la mejora de respuestas inmunitarias de memoria a largo plazo frente a los antigenos tumorales, y/o la mejora de la salud general del individuo. Se apreciara que puede producirse la muerte de celulas tumorales sin una disminucion sustancial del tamano tumoral debido a, por ejemplo, la presencia de celulas de soporte, vascularizacion, matrices fibrosas, etc. Por consiguiente, aunque se prefiere la reduccion del tamano tumoral, no se requiere en el tratamiento de cancer.

El cancer que expresa MUC1 puede ser cualquier cancer que expresa MUC1 incluyendo, pero sin limitarse a, carcinomas humanos (tales como de ovario, mama, intestino delgado, estomago, rinon, vejiga, utero, testiculo, pancreas, colorrectal, pulmon, tiroides, gastrico, de cabeza y cuello, prostata, esofago, y otros canceres con origen en celulas epiteliales), incluyendo canceres primarios y metastasicos y tumores malignos hematopoyeticos tales como linfomas, leucemias y mielomas (por ejemplo, mieloma multiple, leucemia linfocitica cronica (CLL), linfoma mielogeno multiple (MML), leucemia mieloide aguda (AML), celulas B transformadas con virus de Epstein-Barr (EBV), linfomas de Burkitt y de Hodgkin y algunos linfomas no Hodgkin de celulas B).

El vector o la composicion puede administrarse al huesped mediante cualquier metodo. Por ejemplo, el peptido o acido nucleico que codifica para el peptido (por ejemplo, como vector) puede introducirse en una celula (por ejemplo, en un huesped) mediante cualquiera de diversas tecnicas, tales como poniendo en contacto la celula con el peptido, el acido nucleico, o una composicion que comprende el acido nucleico como parte de un constructo, tal como se describe en el presente documento, lo que permite el suministro y la expresion del acido nucleico. Se conocen en la tecnica protocolos especificos para introducir y expresar acidos nucleicos en celulas (vease, por ejemplo, Sambrook et al. (eds.), citado anteriormente; y Ausubel et al., citado anteriormente).

Una composicion para inmunoterapia basada en levadura de la invencion puede administrarse mediante diversos metodos aceptables, incluyendo, pero sin limitarse a, administracion intravenosa, administracion intraperitoneal, administracion intramuscular, administracion intraganglionar, administracion intracoronaria, administracion intraarterial (por ejemplo, en una arteria carotida), administracion subcutanea, suministro transdermico, administracion intratraqueal, administracion intraarticular, administracion intraventricular, inhalacion (por ejemplo,

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aerosol), administracion intracraneal, intraespinal, intraocular, auricular, intranasal, oral, pulmonar, impregnacion de un cateter e inyeccion directa en un tejido. En un aspecto, las vias de administracion incluyen: intravenosa, intraperitoneal, subcutanea, intradermica, intraganglionar, intramuscular, transdermica, inhalada, intranasal, oral, intraocular, intraarticular, intracraneal e intraespinal. El suministro por via parental puede incluir las vias intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intrapulmonar, intravenosa, subcutanea, por cateter auricular y cateter venoso. El suministro por via auricular puede incluir gotas oticas, el suministro por via intranasal puede incluir gotas nasales o inyeccion intranasal, y el suministro por via intraocular puede incluir colirios. El suministro en aerosol (inhalacion) tambien puede realizarse usando metodos convencionales en la tecnica (vease, por ejemplo, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 189: 11277-11281 (1992)). En un aspecto, una composicion inmunoterapica basada en levadura de la invencion se administra por via subcutanea. En un aspecto, la composicion inmunoterapica basada en levadura se administra directamente en un medio tumoral.

Se conocen en la tecnica metodos adecuados de administracion de vectores o composiciones a huespedes (sujetos). El huesped (sujeto o individuo) puede ser cualquier huesped adecuado, tal como un mamifero (por ejemplo, un roedor, tal como un raton, una rata, un hamster o una cobaya, un conejo, gato, perro, cerdo, una cabra, vaca, un caballo, primate o ser humano).

Por ejemplo, el vector (por ejemplo, de poxvirus recombinante) puede administrarse a un huesped mediante la exposicion de celulas tumorales al peptido, acido nucleico o vector ex vivo o mediante inyeccion del vector en el huesped. El vector (por ejemplo, de poxvirus recombinante) o la composicion puede administrarse directamente (por ejemplo, administrarse localmente) mediante inyeccion directa en la lesion cancerosa o el tumor o mediante aplicacion topica (por ejemplo, con un portador farmaceuticamente aceptable).

El vector o la composicion puede administrarse solo o en combinacion con adyuvantes, incorporado en liposomas (tal como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.643.599, 5.464.630, 5.059.421 y 4.885.172), incorporado en nanoparticulas (por ejemplo, la nanotecnologia VERSAMUNE™), administrado con citocinas, administrado con modificadores de la respuesta biologica (por ejemplo, interferon, interleucina-2 (IL-2), administrado con factores estimulantes de colonias (CSF, GM-CSF y GCSF), y/o administrado con otros reactivos en la tecnica que se sabe que potencian la respuesta inmunitaria.

Los ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen alumbre, sales de aluminio, fosfato de aluminio, hidroxido de aluminio, silice de aluminio, fosfato de calcio, adyuvante incompleto de Freund, saponinas, tales como QS21 (un adyuvante inmunologico derivado de la corteza del arbol de Sudamerica Quillaja saponaria Molina), monofosforil- lipido A (MLP-A) y adyuvante RIBI DETOX™.

Un adyuvante particularmente preferido para su uso en la invencion es la citocina GM-CSF. Se ha mostrado que GM-CSF es un adyuvante de vacuna eficaz porque potencia el procesamiento y la presentacion de antigeno por celulas dendriticas. Algunos estudios experimentales y clinicos sugieren que GM-CSF recombinante puede reforzar la inmunidad del huesped dirigida a una variedad de inmunogenos.

Puede administrarse GM-CSF usando un vector viral (por ejemplo, vector de poxvirus) o como proteina aislada en una formulacion farmaceutica. Puede administrarse GM-CSF al huesped antes, durante o despues de la administracion inicial del vector o la composicion para potenciar la respuesta inmunitaria especifica de antigeno en el huesped. Por ejemplo, puede administrarse proteina GM-CSF recombinante al huesped cada dia de la vacunacion con el vector o la composicion y durante cada uno de los siguientes 3 dias (es decir, un total de 4 dias). Puede usarse cualquier dosis adecuada de GM-CSF. Por ejemplo, pueden administrarse al dia 50-500 pg (por ejemplo, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, y los intervalos entremedias) de GM-CSF recombinante. El GM-CSF puede administrarse mediante cualquier metodo adecuado (por ejemplo, por via subcutanea) y, preferiblemente, se administra en o cerca del sitio de vacunacion de un huesped con la composicion de vector del mismo.

En una realizacion, el peptido de la invencion puede conjugarse con peptidos auxiliares o con moleculas portadoras grandes para potenciar la inmunogenicidad del peptido. Estas moleculas incluyen, pero no se limitan a, peptido de virus influenza, toxoide tetanico, epitopo CD4 de toxoide tetanico, exotoxina A de Pseudomonas, poli-L-lisina, una cola lipidica, secuencia senal de reticulo endoplasmatico (ER), y similares.

El peptido de la invencion tambien puede conjugarse con una molecula de inmunoglobulina usando metodos aceptados en la tecnica. La molecula de inmunoglobulina puede ser especifica para un receptor de superficie presente en celulas tumorales, pero ausente o en cantidades muy bajas en celulas normales. La inmunoglobulina tambien puede ser especifica para un tejido especifico (por ejemplo, tejido de mama, ovario, colon o prostata). Tal conjugado peptido-inmunoglobulina permite dirigir el peptido a una celula y/o un tejido especifico.

El vector o la composicion se administra a un huesped (por ejemplo, mamifero, tal como un ser humano) en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmunitaria especifica de MUC1, preferiblemente una respuesta inmunitaria celular. La eficacia del vector como inmunogeno puede determinarse mediante parametros in vivo o in vitro tal como se conoce en la tecnica. Estos parametros incluyen, pero no se limitan a, ensayos de citotoxicidad especificos de antigeno, regresion de tumores que expresan MUC1 o epitopos de MUC1, inhibicion de celulas

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cancerosas que expresan MUC1 o epitopos de MUC1, produccion de citocinas, y similares.

Puede administrarse cualquier dosis adecuada del vector o la composicion a un huesped. La dosis apropiada variara dependiendo de factores tales como la edad del huesped, su peso, altura, sexo, estado medico general, historial medico previo, progresion de la enfermedad y carga tumoral y puede determinarla un medico clinico. Por ejemplo, en una realizacion de la divulgacion, el peptido puede administrarse en una dosis de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 10 mg (por ejemplo, de 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, y los intervalos entremedias) mediante vacunacion del huesped (por ejemplo, mamifero, tal como un ser humano), y preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 5 mg por vacunacion. Pueden proporcionarse varias dosis (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas, por ejemplo, a lo largo de un periodo de semanas o meses). En una realizacion de la divulgacion, se proporciona una dosis al mes durante 3 meses.

Cuando el vector es un vector viral, una dosis adecuada puede incluir aproximadamente de 1 x 105 a

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aproximadamente 1 x 10 unidades formadoras de placas (UFP) (por ejemplo, 1 x 10, 1 x 10, 1 x 10, 1 x 10, 1 x 1010, 1 x 1011, y los intervalos entremedias), aunque puede administrarse una dosis mayor o menor a un huesped. Por ejemplo, pueden administrarse aproximadamente 2 x 108 UFP (por ejemplo, en un volumen de aproximadamente 0,5 ml).

Las celulas de la divulgacion (por ejemplo, celulas T citotoxicas) pueden administrarse a un huesped en una dosis de entre aproximadamente 1 x 105 y 2 x 1011 celulas (por ejemplo, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, y los

intervalos entremedias) por infusion. Las celulas pueden administrarse en, por ejemplo, una a tres infusiones (por ejemplo, una, dos o tres). Ademas de la administracion de las celulas, puede administrarse al huesped un modificador de la respuesta biologica, tal como interleucina 2 (IL-2). Cuando las celulas que van a administrarse son celulas T citotoxicas, la administracion de la celulas T citotoxicas puede estar seguida por la administracion del peptido, polipeptido, acido nucleico, vector o la composicion de los mismos con el fin de sensibilizar las celulas T citotoxicas para expandir adicionalmente el numero de celulas T in vivo.

En general, una dosis unica adecuada de una composicion inmunoterapica basada en levadura de la invencion es una dosis que puede proporcionar eficazmente un vehiculo de levadura y el antigeno de MUC1 a un tipo dado de celula, tejido o region del cuerpo del paciente en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria especifica de antigeno frente a uno o mas antigenos o epitopos de MUC1, cuando se administran una o mas veces a lo largo de un periodo de tiempo adecuado. Por ejemplo, en una realizacion, una dosis unica de una MUC1- levadura de la presente invencion es de desde aproximadamente 1 x 105 hasta aproximadamente 5 x 107 equivalentes de celula de levadura por kilogramo de peso corporal del organismo al que esta administrandosele la composicion. Una unidad de levadura (YU, yeast unit) son 1 x 107 celulas de levadura o equivalentes de celula de levadura. En un aspecto, una dosis unica de un vehiculo de levadura de la presente invencion es de desde aproximadamente 0,1 YU (1 x 106 celulas de levadura o equivalentes de celula de levadura) hasta aproximadamente 100 YU (1 x 109 celulas) por dosis (es decir, por organismo) incluyendo cualquier dosis intermedia, en incrementos de 0,1 x 106 celulas (es decir, 1,1 x 106, 1,2 x 106, 1,3 x 106, etc.). En una realizacion, una dosis adecuada incluye dosis entre 1 YU y 40 YU y, en un aspecto, entre 10 YU y 40 YU o entre 10 YU y 80 YU En una realizacion, las dosis se administran en diferentes sitios en el individuo pero durante el mismo periodo de dosificacion. Por ejemplo, puede administrarse una dosis de 40 YU inyectando dosis de 10 YU en cuatro sitios diferentes en el individuo durante un periodo de dosificacion. La invencion incluye la administracion de una cantidad de la composicion para inmunoterapia de MUC1-levadura (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20 Yu o mas) en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sitios diferentes o mas en un individuo para formar una dosis unica.

Cuando las celulas que van a administrarse son celulas dendriticas, la cantidad de celulas dendriticas administradas al sujeto variara dependiendo del estado del sujeto y debe determinarse mediante la consideracion de todos los factores apropiados por parte del facultativo. Preferiblemente, se utilizan de aproximadamente 1x106 a aproximadamente 1x1012 celulas dendriticas (por ejemplo, aproximadamente 1x107, aproximadamente 1x108, aproximadamente 1x109, aproximadamente 1x1010 o aproximadamente 1x1011 incluyendo los intervalos entremedias de cualquiera de los numeros de celulas descritos en el presente documento) para seres humanos adultos. Estas cantidades variaran dependiendo de la edad, el peso, la talla, el estado, sexo del sujeto, el tipo de tumor que va a tratarse, la via de administracion, si el tratamiento es regional o sistemico, y otros factores. Los expertos en la tecnica deben poder derivar facilmente dosificaciones y pautas posologicas apropiadas para adaptarse a las circunstancias y necesidades especificas del sujeto.

La invencion proporciona un metodo de generacion de linfocitos T citotoxicos especificos de peptido in vivo, ex vivo o in vitro mediante la estimulacion de linfocitos con una cantidad eficaz del vector o la composicion con una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/o adyuvantes o en una formulacion liposomal. Los linfocitos pueden ser linfocitos de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, sangre periferica, tejidos tumorales, ganglios linfaticos y derrames, tales como liquido pleural o liquido ascitico.

Los linfocitos T citotoxicos especificos de peptido de MUC1 son inmunorreactivos con MUC1. Preferiblemente, los linfocitos T citotoxicos inhiben la aparicion de celulas tumorales y cancer e inhiben el crecimiento, o la destruccion, de celulas tumorales que expresan MUC1 o epitopos de la misma. Los linfocitos T citotoxicos, ademas de ser

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especificos de antfgeno, pueden estar restringidos a CMH de clase I. En una realizacion, los linfocitos T citotoxicos estan restringidos a CMH de clase I, HLA-A24. Los linfocitos T citotoxicos tienen preferiblemente un fenotipo CD8+.

En una realizacion, se estimulan linfocitos obtenidos del huesped ex vivo con la composicion para generar linfocitos T citotoxicos. Los linfocitos T citotoxicos pueden administrarse al huesped para potenciar una respuesta inmunitaria frente al cancer, inhibiendo de ese modo el cancer. Por consiguiente, la invencion proporciona una composicion inmunoterapica de MUCI-levadura para su uso en un metodo de inhibicion de cancer en un huesped que comprende (a) (a) estimular linfocitos obtenidos de un sujeto con la composicion para generar linfocitos T citotoxicos, y (b) administrar los linfocitos T citotoxicos al huesped, en la que se inhibe el cancer.

En otra realizacion, se estimulan linfocitos dentro del huesped mediante la administracion al huesped del vector o la composicion para generar linfocitos T citotoxicos, linfocitos T citotoxicos que potencian una respuesta inmunitaria frente al cancer, inhibiendo de ese modo el cancer.

La invencion incluye un protocolo de sensibilizacion y refuerzo. En particular, en una realizacion referida a peptidos y vectores de la invencion, el protocolo incluye una “sensibilizacion” inicial con una composicion que comprende uno o mas vectores recombinantes que codifican para el peptido de la invencion y opcionalmente una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antigenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA), versiones modificadas de los mismos, y epitopos inmunogenicos de los mismos, seguida por uno o preferiblemente multiples “refuerzos” con una composicion que contiene el peptido de la invencion o uno o mas vectores de poxvirus que codifican para el peptido de la invencion y opcionalmente una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antigenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA), versiones modificadas de los mismos, y epitopos inmunogenicos de los mismos.

En esta realizacion, la vacunacion de sensibilizacion inicial puede comprender uno o mas vectores. En una realizacion, se usa un unico vector (por ejemplo, vector de poxvirus) para el suministro del peptido de la invencion y una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antigenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA), versiones modificadas de los mismos, y epitopos inmunogenicos de los mismos. En otra realizacion, dos o mas vectores (por ejemplo, vectores de poxvirus) comprenden la vacunacion de sensibilizacion, que se administra simultaneamente en una unica inyeccion.

Las vacunaciones de refuerzo tambien pueden comprender uno o mas vectores (por ejemplo, vectores de poxvirus). En una realizacion, un unico vector se usa para el suministro del peptido de la invencion y la una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antigenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA), versiones modificadas de los mismos, y epitopos inmunogenicos de los mismos de la vacunacion de refuerzo. En otra realizacion, dos o mas vectores comprenden la vacunacion de refuerzo, que se administran simultaneamente en una unica inyeccion.

Pueden usarse diferentes vectores (por ejemplo, vectores de poxvirus) para proporcionar un protocolo de sensibilizacion/refuerzo heterologo usando vectores que portan diferentes conjuntos de moleculas terapeuticas para inoculaciones en diferentes intervalos de tiempo. Por ejemplo, en una combinacion de sensibilizacion/refuerzo heterologa, se usa una primera composicion de vector de ortopox para la sensibilizacion, y se usa una segunda composicion de vector de avipox para el refuerzo.

La pauta posologica de los vectores (por ejemplo, vectores de poxvirus) implica normalmente la administracion repetida del vector de refuerzo. El vector de refuerzo puede administrarse 1 -3 veces (por ejemplo, 1, 2 o 3 veces) en cualquier periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, cada 2-4 semanas) durante cualquier intervalo de tiempo adecuado (por ejemplo, 6-12 semanas para un total de al menos 5 a 15 vacunaciones de refuerzo). Por ejemplo, la vacunacion primaria puede comprender un vector de vaccinia o MVA recombinante seguido por multiples vacunaciones de refuerzo con un vector de avipox. En una realizacion particular, el huesped recibe una vacunacion con el vector de sensibilizacion, seguida cada 2 semanas despues de eso por el vector de refuerzo para 6 refuerzos, seguido cada 4 semanas despues de eso por el vector de refuerzo, y continuando con el vector de refuerzo durante un periodo de tiempo que depende de la progresion de la enfermedad.

La presente invencion tambien incluye el suministro (administracion, inmunizacion, vacunacion) de una composicion inmunoterapica basada en levadura de la invencion a un sujeto o individuo. El proceso de administracion puede realizarse ex vivo o in vivo, pero se realiza normalmente in vivo. Se han descrito anteriormente vias de administracion adecuadas y dosis unicas adecuadas para composiciones inmunoterapicas basadas en levadura. Tras una dosis inicial (original o de sensibilizacion) de una composicion inmunoterapica basada en levadura, se administran “dosis de refuerzo” o “refuerzos” de una composicion inmunoterapica basada en levadura, por ejemplo, cuando la respuesta inmunitaria frente al antfgeno ha menguado o segun sea necesario para proporcionar una respuesta inmunitaria o inducir una respuesta de memoria frente a un antfgeno o antigeno(s) particular(es). Las dosis de refuerzo pueden administrarse separadas aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas, o mensualmente, quincenalmente, trimestralmente, anualmente, y/o en incrementos de unos pocos o varios anos despues de la administracion original (la dosis de sensibilizacion), dependiendo del estado del individuo que este tratandose y el objetivo de la terapia en el momento de la administracion (por ejemplo, tratamiento profilactico, activo, de mantenimiento). En una realizacion, la pauta posologica es una en la que se administran dosis de

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composicion inmunoterapica basada en levadura al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o mas a lo largo de un periodo de tiempo de desde semanas, hasta meses, hasta anos. En una realizacion, se administran las dosis semanalmente o quincenalmente o cada tres semanas o mensualmente para 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dosis o mas, seguidas por dosis semanalmente, quincenalmente, cada tres semanas o mensualmente segun sea necesario para lograr el tratamiento deseado preventivo o terapeutico para el cancer. Pueden administrarse dosis de refuerzo adicionales a intervalos similares o mas largos (de meses o anos) como terapia de mantenimiento o remision, si se desea.

La divulgacion proporciona ademas un kit que, en una realizacion, tiene al menos un primer vector recombinante (por ejemplo, vector de poxvirus) que tiene incorporado en su genoma o parte del mismo un acido nucleico que codifica para el peptido de la invencion en un portador farmaceuticamente aceptable. El primer vector recombinante (por ejemplo, vectores de poxvirus) tambien puede comprender uno o mas acidos nucleicos que codifican para una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antigenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA), versiones modificadas de los mismos, y epitopos inmunogenicos de los mismos. Ademas del primer vector recombinante, el kit puede tener un segundo vector recombinante que comprende uno o mas acidos nucleicos que codifican para una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antigenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA), versiones modificadas de los mismos, y epitopos inmunogenicos de los mismos en un portador farmaceuticamente aceptable. El kit proporciona ademas recipientes, agujas para inyeccion e instrucciones sobre como usar el kit. En otra realizacion de la divulgacion, el kit proporciona ademas un adyuvante tal como GM-CSF y/o instrucciones para su uso de un adyuvante disponible comercialmente con los componentes del kit.

La divulgacion tambien incluye un kit que comprende cualquiera de las composiciones inmunoterapicas basadas en levadura descritas en el presente documento, o cualquiera de los componentes individuales de tales composiciones descritas en el presente documento. Los kits pueden incluir reactivos adicionales e instrucciones o indicaciones por escrito para el uso de cualquiera de la composiciones de la invencion para prevenir o tratar cancer asociado con o caracterizado por la expresion o sobreexpresion de MUC1.

Tal como se analizo anteriormente, el vector o la composicion puede administrarse a un huesped por diversas vias incluyendo, pero sin limitarse a, subcutanea, intramuscular, intradermica, intraperitoneal, intravenosa e intratumoral. Cuando se administran multiples administraciones, las administraciones pueden ser en uno o mas sitios en un huesped y, en el caso de inmunoterapia basada en levadura, puede administrarse una dosis unica dividiendo la dosis unica en partes iguales para la administracion en uno, dos, tres, cuatro sitios o mas en el individuo.

La administracion del vector o la composicion puede ser “profilactica” o “terapeutica”. Cuando se proporciona de manera profilactica, el vector o la composicion se proporciona por adelantado a la formacion del tumor, o la deteccion del desarrollo de tumores que expresan MUC1, con el objetivo de la prevencion, inhibicion o el retraso del desarrollo de tumores que expresan MUC1; y/o la prevencion, inhibicion o el retraso de metastasis de tales tumores y/o generalmente la prevencion o inhibicion de la progresion de cancer en un individuo, y generalmente para permitir o mejorar la capacidad del sistema inmunitario del huesped para luchar contra un tumor que es susceptible de desarrollar el huesped. Por ejemplo, los huespedes con susceptibilidad hereditaria de cancer son un grupo preferido de pacientes tratados con tal inmunizacion profilactica. La administracion profilactica del vector o la composicion previene, mejora o retrasa el cancer que expresa MUC1. Cuando se proporciona de manera terapeutica, el vector o la composicion se proporciona en o despues del diagnostico del cancer que expresa MUC1, con el objetivo de mejorar el cancer, tal como mediante la reduccion de la carga tumoral en el individuo; la inhibicion del crecimiento tumoral en el individuo; el aumento de la supervivencia del individuo; y/o la prevencion, inhibicion, reversion o retraso de la progresion del cancer en el individuo.

Cuando ya se le ha diagnosticado al huesped el cancer o cancer metastasico que expresa MUC1, puede administrarse el vector o la composicion junto con otros tratamientos terapeuticos tales como quimioterapia, extirpacion quirurgica de un tumor, tratamiento con terapia dirigida contra el cancer, trasplante alogenico o autologo de celulas madre, transferencia adoptiva de celulas T, otras inmunoterapias y/o radioterapia.

En una realizacion preferida, la administracion del vector o la composicion a un huesped da como resultado una celula huesped que expresa el peptido de la invencion y opcionalmente una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antigenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA), versiones modificadas de los mismos, y epitopos inmunogenicos de los mismos que se coadministraron. El peptido de la invencion (es decir, antigeno de MUC1) puede expresarse en la superficie celular de la celula huesped infectada. La una o mas moleculas inmunoestimuladoras/reguladoras y/u otros antigenos asociados a tumor (por ejemplo, CEA), versiones modificadas de los mismos, y epitopos inmunogenicos de los mismos pueden expresarse en la superficie celular o pueden secretarse activamente por la celula huesped. La expresion tanto del antigeno de MUC1 como de la molecula inmunoestimuladora/reguladora proporciona el peptido restringido a CMH necesario a celulas T especificas y la senal apropiada a las celulas T para ayudar en el reconocimiento de antigeno y la proliferacion o expansion clonal de celulas T especificas de antigeno. El resultado global es una regulacion por incremento del sistema inmunitario. Preferiblemente, la regulacion por incremento de la respuesta inmunitaria es un aumento de linfocitos citotoxicos y/o linfocitos T auxiliares especificos de antigeno, que pueden destruir o inhibir el crecimiento de una celula cancerosa (por ejemplo, de cancer de mama, cancer de ovario, cancer de colon, cancer de pulmon, cancer de

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tiroides, cancer gastrico, cancer de cabeza y cuello o cancer de prostata).

Existe una variedad de formulaciones adecuadas de la composicion farmaceutica para su uso en los metodos de la invencion. Las siguientes formulaciones para administracion parenteral, subcutanea, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal son a modo de ejemplo y no son limitativas en modo alguno. Un experto en la tecnica apreciara que se conocen estas vias de administracion del vector o la composicion de la invencion, y, aunque puede usarse mas de una via para administrar un compuesto particular, una via particular puede proporcionar una respuesta mas inmediata y mas eficaz que otra via.

Las formulaciones inyectables se encuentran entre aquellas formulaciones que se prefieren segun la presente invencion. Los requisitos para portadores farmaceuticos eficaces para composiciones inyectables los conocen bien los expertos habituales en la tecnica (veanse, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Filadelfia, PA, Banker and Chalmers, eds., paginas 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Inyectable Drugs, Toissel, 4a ed., paginas 622-630 (1986)).

Las formulaciones adecuadas para administracion parenteral incluyen disoluciones para inyeccion esteriles isotonicas, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos y solutos que hacen que la formulacion sea isotonica con la sangre del receptor pretendido, y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. El vector o la composicion puede administrarse en un diluyente fisiologicamente aceptable en un portador farmaceutico, tal como un liquido o una mezcla de liquidos esteril, incluyendo agua, solucion salina, disoluciones acuosas de dextrosa y azucares relacionados, un alcohol, tal como etanol, isopropanol o alcohol hexadecilico, glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfoxido, cetales de glicerol, tales como 2,2- dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, eteres, tales como polietilenglicol 400, un aceite, un acido graso, un ester o glicerido de acido graso, o un glicerido de acido graso acetilado con o sin la adicion de un tensioactivo farmaceuticamente aceptable, tal como un jabon o un detergente, agente de suspension, tal como pectina, carbomeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmaceuticos.

Los aceites, que pueden usarse en formulaciones parenterales, incluyen vaselina, aceites animales, vegetales y sinteticos. Los ejemplos especificos de aceites incluyen de cacahuete, soja, sesamo, semilla de algodon, maiz, oliva, vaselina y mineral. Los acidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen acido oleico, acido estearico y acido isoestearico. El oleato de etilo y miristato de isopropilo son ejemplos de esteres de acidos grasos adecuados.

Los jabones adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen sales de acido graso de metal alcalino, de amonio y de trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes cationicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetildialquilamonio y haluros de alquilpiridinio, (b) detergentes anionicos tales como, por ejemplo, alquil, aril y olefinosulfonatos, alquil, olefino, eter y monoglicerido-sulfatos, y sulfosuccinatos, (c) detergentes no ionicos tales como, por ejemplo, oxidos de amina grasa, alcanolamidas de acido graso y copolimeros de polioxietileno-polipropileno, (d) detergentes anfoteros tales como, por ejemplo, alquil-b-aminopropionatos, y sales de amonio cuaternario de 2-alquil-imidazolina, y (e) mezclas de los mismos.

Pueden usarse conservantes y tampones. Con el fin de minimizar o eliminar la irritacion en el sitio de inyeccion, tales composiciones pueden contener uno o mas tensioactivos no ionicos que tienen un equilibrio hidrofilo-lipofilo (HLB) de desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones oscilara normalmente entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 15% en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen esteres de acido graso de polietileno-sorbitano, tales como monooleato de sorbitano y los aductos de alto peso molecular de oxido de etileno con una base hidrofoba, que se forma mediante la condensacion de oxido de propileno con propilenglicol.

Las formulaciones parenterales pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitaria o dosis multiples, tales como ampollas y viales, y pueden almacenarse en condiciones de secado por congelacion (liofilizadas) que requieren solamente la adicion del excipiente liquido esteril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones para inyeccion extemporaneas a partir de polvos, granulos y comprimidos esteriles.

Las composiciones inmunoterapicas basadas en levadura de la invencion se administran de la manera mas normal sin adyuvante u otros portadores y como formulacion inyectable de la composicion basada en levadura en un simple excipiente farmaceuticamente aceptable, tal como PBS u otro tampon.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invencion pero, por supuesto, no debe interpretarse que limitan su alcance en modo alguno.

EJEMPLO 1

Este ejemplo describe el analisis de epitopos agonistas de HLA-A24 de MUC1-C.

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I. Materiales y metodos

Pacientes - se usaron PBMC de dos pacientes con cancer de prostata incluidos en un ensayo clinico descrito previamente de la vacuna de PSA-TRICOM en combinacion con ipilimumab (Madan et al., Lancet Oncol., 13: 501 -8 (2012)). Una junta de revision institucional del Centro Clinico de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) habia aprobado los procedimientos, y se obtuvo el consentimiento informado segun la Declaracion de Helsinki.

Peptidos - Se barrio la secuencia de aminoacidos de MUC1 para detectar coincidencias con motivos consenso para peptidos de union a HLA-A24. Se uso el algoritmo informatico desarrollado por Parker et al. para clasificar posibles peptidos de union a CMH segun la disociacion en la mitad del tiempo predicha de complejos de peptido/CMH (Parker eta/., J. Immunol., 152: 163-75 (1994)). American Peptide Company (Sunnyvale, CA) sintetizo analogos peptidicos de 9 meros y de 10 meros a partir de la region MUC1-C de MUC1 con sustituciones de aminoacido individuales para aumentar la afinidad de union (tabla 1). La pureza de los peptidos fue >90%.

Tabla 1. Peptidos de union a HLA-A24 de MUC1 y posibles agonistas con union predicha y ensayo de union de celulas T2.

Peptido: Posicion SecuenciaA Union predicha*

C6: 462-471 TYHPMSEYPT (SEQ ID NO: 3) 6

C6A: KYHPMSEYAL (SEQ ID NO: 1) 480

C7: 502-510 SYTNPAVAA (SEQ ID NO: 4) 5

C7A: KYTNPAVAL (SEQ ID NO: 2) 400

ALos aminoacidos que se cambiaron para generar un epitopo agonista estan en negrita.

*Union predicha basandose en el motivo notificado (Parker et al., citado anteriormente); estimacion de puntuacion de la mitad del tiempo de disociacion de una molecula que contiene esta secuencia.

Ensayos de afinidad y avidez - A pesar de numerosos intentos para establecer ensayos de union para peptidos de HLA-A24 usando celulas T2-A24, no pudieron establecerse ensayos fiables. Por tanto, se evaluaron estos peptidos basandose solamente en la capacidad para lisar celulas pulsadas con el peptido correspondiente y celulas tumorales que expresan el peptido nativo.

Establecimiento de lineas de celulas T - Se uso una version modificada del protocolo descrito por Tsang et al., J. Natl. Cancer Inst., 87: 982-90 (1995), para generar CTL especificos de MUC1. Se pulsaron DC autologas irradiadas, con 20 pg/ml de peptido durante 2 horas, y luego se anadieron PBMC a una razon de 10:1. Despues de 3 dias, se anadio IL-2 humana (20 unidades Cetus/ml). Se reestimularon las celulas cada 7 dias. Despues de la tercera estimulacion in vitro, se reestimularon las celulas usando celulas B transformadas con virus Epstein-Barr autologas como celulas presentadoras de antigeno a una razon de 2:1, y se mantuvieron en medio que contenia IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (5 ng/ml).

Deteccion de citocinas - Se incubaron celulas B autologas pulsadas con peptidos a diferentes concentraciones (25, 12,5, 6,25 y 3, 13 y 1,56 pg/ml) con lineas de celulas T especificas de MUC1 a una razon de 2:1 durante 24 horas. Se analizaron los sobrenadantes para detectar IFN-y mediante ELISA (Invitrogen, Frederick, MD).

Cultivos de celulas tumorales - Se adquirieron la linea celular de carcinoma de pancreas ASPC-1 (HLA-A3neg, HLA- A24neg, MUC1+), la linea celular de cancer de colon SW620 (HLA-A24+, MUC1+) y la linea celular de cancer de prostata PC3 (HLA-A24+, MUC1+) de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA). Todos los cultivos celulares carecian de micoplasma y se mantuvieron en medio completo (RPMI 1640 complementado con suero de ternera fetal al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml y L-glutamina 2 mM) (Mediatech, Herndon, VA). Se obtuvieron celulas K562-A2.1 del Dr. C. Britten (Universidad Johannes Gutenberg, Maguncia, Alemania), y se mantuvieron en medio completo complementado con 0,5 mg/ml de G418 (Mediatech, Manassas, VA).

Ensayo de citotoxicidad, inhibicion de diana fria y bloqueo de anticuerpos de lisis de celulas tumorales - Para determinar la destruccion mediada por celulas T, se uso un ensayo de liberacion de 111 indio durante 16 horas (Tsang et al., J. Natl. Cancer Inst., 87: 982-90 (1995)). Se marcaron 2x106 celulas diana con 60 pCi de oxido de 111In (GE Health Care, Vienna, VA) a 37°C durante 20 minutos, y se usaron a 3000 celulas/pocillo en placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos. Se anadieron celulas T a diferentes razones. Se realizaron todos los ensayos en medio RPMI sustituido con suero AB humano al 10% (Omega Scientific, Tarzana, CA), glutamina y antibioticos (Mediatech, Manassas, VA). Se determino la liberacion inmediata incubando celulas diana con medio solo, y se determino lisis completa incubando con Triton X-100 al 2,5%. Se calculo la lisis usando la formula:

Lisis (%) = liberacion observada (cpm) - liberacion espontanea (cpm) x 100 liberacion completa (cpm) - liberacion espontanea (cpm)

Se realizo un ensayo de inhibicion de diana fria anadiendo celulas K562-A2.1 o K562-A3, con o sin pulsado anterior

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con el peptido correspondiente, a una razon de 1:10 a los pocillos (Tsang et al., J. Natl. Cancer Inst., 87: 982-90 (1995)). Se realizo el bloqueo de anticuerpos preincubando celulas tumorales con 10 pg/ml de anticuerpo anti-HLA- A24 o anticuerpo de control de isotipo (UPC10).

II. Analisis

El algoritmo para peptidos de union a HLA-A24 clase I en la region MUC1-C no revelo agentes de union a A24 potenciales. Los cambios en los residuos de anclaje revelaron el potencial para tres agonistas de HLA-A24. Se realizaron estudios con dos de estos agonistas (C6A y C7A, tabla 1). El tercer agonista potencial no se describe puesto que una linea de celulas T generada con este tercer agonista potencial no liso celulas tumorales.

Los intentos para generar lineas de celulas T con el peptido nativo designado como C6 fueron insatisfactorios usando PBMC de dos pacientes con cancer vacunados diferentes. Sin embargo, podrian generarse lineas de celulas T a partir de estos mismos pacientes usando APC pulsadas con el peptido agonista correspondiente, C6A (SEQ ID NO: 1).

Se evaluo la linea de celulas T derivada de APC pulsadas con el peptido C6A para determinar lisis frente a dos lineas de celulas tumorales MUC1+, HLA-A24+ diferentes (SW620; cancer de colon y PC3; cancer de prostata) y la linea celular de cancer de pancreas ASPC-1 (MUC1+, HLA-A24neg). Se observo la lisis de ambas lineas celulares HLA-A24+ (vease la tabla 2) en contraposicion a la linea HLA-A24neg.

Tabla 2. Lineas de celulas T especificas de epitopo agonista y nativo de MUC1 lisan celulas tumorales que expresan MUC1 nativa y HLA-A24.

Linea de celulas T: Razon E:T SW620 MUC1+HLAA24+ PC3 MUC1+HLA- A24+ ASPC-1 MUC1+HLAA24neg

T-C6: 25:1 ND ND ND

12,5:1: ND ND ND

T-C6A: 25:1 41,2 35,5 2,4

12,5:1: 26,0 22,8 1,9

T-C7: 25:1 22,2 ND 0

12,5:1: 13,7 ND ND

T-C7A: 25:1 41,9 22,6 3,4

12,5:1: 32,6 ND 2,1

Los resultados se expresan como lisis espontanea en porcentaje (%). Se realizaron los ensayos a 2 razones de efector (E) con respecto a diana (T, target).

ND: no disponible_________________________________________________________________

La linea de celulas T derivada con el peptido C7 nativo crecio escasamente, pero estaban disponibles suficientes celulas para evaluar esta linea de celulas T en un ensayo de citotoxicidad usando la linea celular de cancer de colon SW620. Tal como puede observarse en la tabla 3, la linea de celulas T derivada con el peptido agonista C7A liso celulas SW620 de manera mas eficiente que la linea de celulas T derivada con el peptido C7 nativo. Ninguna linea de celulas T liso la linea de celulas tumorales ASPC-1. La adicion de un anticuerpo anti-HLA-A24 redujo enormemente la lisis de celulas tumorales, demostrando de ese modo la restriccion a CMH de la lisis para ambas lineas de celulas T especificas C6A y C7A (tabla 3).

Tabla 3. Lineas de celulas T especificas de epitopo agonista de HLA-A24 de MUC1 lisan lineas de celulas tumorales que expresan MUC1 nativa de manera restringida a HLA.

Linea de celulas T: Bloqueo % de lisis de SW620 MUC1+HLAA24+ % de lisis de PC3 MUC1+HLA-A24+

T-C6A: - 41,2 22,8

Anticuerpo anti-HLA-A24: 14,6 10,2

Control de isotipo: 37,0 20,1

T-C7A: - 22,7 22,6

Anticuerpo anti-HLA-A24: 8,6 3,1

Control de isotipo: 17,9 19,7

Los resultados se expresan como % de lisis especifica. Se realizaron los ensayos a una razon E:T de 25:1 excepto para la lisis de T-C6A de celulas PC3, que se realizo a una razon E:T de 12,5:1.______

La estimulacion de la linea de celulas T generada con el peptido agonista C6A produjo altos niveles (pg/ml/105 celulas) de IFN-y (2.651), GM-CSF (>10.000), IL-8 (>10.000) y TNF-a (372), y bajos niveles (<50) de IL-2, IL-6, IL-10 e IL-12.

Pudieron generarse lineas de celulas T del mismo paciente usando APC autologas pulsadas con los peptidos

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agonista C7A o nativo C7. Cada linea celular se estimulo luego durante 24 horas con celulas B pulsadas o bien con el peptido nativo C7 o bien con el peptido agonista C7A, y se analizaron los niveles de citocinas en el sobrenadante.

Tal como se muestra en la tabla 4, la linea de celulas T generada con el peptido nativo produjo mas citocina de tipo I IFN-y cuando se estimulo con el agonista C7A frente al peptido C7 nativo. Adicionalmente, cuando se estimulo la linea de celulas T generada con el peptido agonista C7A con tanto peptidos nativos como agonistas, se produjo mas IFN-y, GM-CSF, IL-8, IL-10 y TNF-a mediante estimulacion con APC pulsadas con peptido agonista C7A frente al peptido nativo C7 (tabla 4).

Tabla 4. Lineas de celulas T especificas de epitopo agonista de HLA-A24 de MUC1 producen citocinas de tipo I tras la estimulacion.

Linea de celulas T: Peptido IFN-y gm-csf IL-2 TNFa IL-8 IL-6 IL-10

T-C6A: C6A 3060 1277 3630 1021 11,8 7,6 16,4

T-C7: C7 750 237 <2,4 21 6,8 6,4 25

C7A: 1279 300 <2,4 30 7,3 7,7 45

T-C7A: C7 680 215 <2,4 30 112 <2,4 92

C7A: 2000 910 <2,4 70 360 40 375

Los resultados se expresan como pg/ml/2,5x105 celulas T. Para los experimentos con T-C7 y T-C7A, los

niveles de IL-12p70 e IL-13 fueron <100 pg/ml para los epitopos nativos y agonistas.

Los resultados de estos estudios respaldan la utilidad terapeutica de epitopos agonistas de MUC1-C en el contexto de la invencion descrita en el presente documento, incluyendo el uso de peptidos solos, en celulas dendriticas, con formulacion de adyuvante clasica o novedosa, o con una gama de adyuvantes biologicos, o citocinas tales como IL- 12, GM-CSF o IL-15. Estos peptidos agonistas tambien pueden usarse para activar celulas T in vitro en enfoques de terapia adoptiva de celulas T. Los receptores de celulas T dirigidos contra estos epitopos agonistas tambien pueden usarse en estudios de transferencia adoptiva de celulas T modificadas por ingenieria genetica. Tambien pueden emplearse peptidos mas largos o la propia proteina MUC1 que contiene los epitopos agonistas tal como se describe en el presente documento. Finalmente, pueden emplearse vacunas basadas en vector recombinante, que codifican para el transgen de MUC1 e incluyen las secuencias para estos epitopos agonistas.

EJEMPLO 2

Este ejemplo demuestra la produccion de una composicion inmunoterapica agonista de MUC1 basada en levadura que comprende SEQ ID NO: 1 y conocida como GI-6108.

Se modificaron por ingenieria levaduras (Saccharomyces cerevisiae) para expresar un antigeno agonista de MUC1 humana bajo el control del promotor inducible de cobre, CUP1, produciendose una composicion para inmunoterapia agonista de MUC1-levadura. El antigeno agonista de MUC1 comprende el peptido agonista potenciador de SEQ ID NO: 1, y se diseno usando un antigeno de MUC1 de tipo natural y de longitud completa que tiene el n.° de registro NP_001191214 (SEQ ID NO: 14) aunque podrian utilizarse otras proteinas MUC1 de tipo natural para disenar agonistas similares.

En resumen, se produjo una proteina de fusion que comprendia un antigeno agonista de MUC1 como un unico polipeptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en marco desde el extremo N-terminal al C- terminal, representado por SEQ ID NO: 16: (1) una secuencia lider de factor alfa de SEQ ID NO: 17 (correspondiente a las posiciones 1-89 de SEQ ID NO:16); (2) una secuencia ligadora de Thr-Ser (correspondiente a las posiciones 90-91 de SEQ ID NO: 16); (3) una proteina agonista de MUC1 de longitud completa correspondiente a una proteina de tipo natural excepto por la introduccion de 15 sustituciones de aminoacido agonistas y una sustitucion inactivante (correspondiente a las posiciones 92-566 de SEQ ID NO: 16) y (4) una cola de histidina hexapeptidica (correspondiente a las posiciones 567-572 de SEQ ID NO: 16). SEQ ID NO: 16 esta codificada por la secuencia de nucleotidos representada por SEQ ID NO: 15 (con codones optimizados para la expresion en levadura). La secuencia lider alfa (correspondiente a las posiciones 1-89 de SEQ ID NO: 16) podria sustituirse por una secuencia N-terminal diferente disenada para conferir resistencia a la degradacion proteasomica y/o estabilizar la expresion, tal como el peptido representado por SEQ ID NO: 19, o un peptido N-terminal de una secuencia lider alfa de levadura diferente tal como SEQ ID NO: 18, o mediante una secuencia senal de MUC1. La cola C-terminal de hexahistidina es opcional, y facilita la identificacion y/o purificacion de la proteina. En comparacion con la proteina MUC1 de tipo natural usada como molde, la secuencia de SEQ ID NO: 16 contiene las siguientes sustituciones de aminoacido: (se facilitan las posiciones de sustitucion con referencia a SEQ ID NO: 16 con referencia adicional entre parentesis a la

ubicacion de la sustitucion en una MUC1 de tipo natural representada por el n.° de registro NP_001191214

identificado como SEQ ID NO: 14): T184L (posicion 93 en MUC1 de tipo natural), A232Y (posicion 161 en MUC1 de tipo natural), P233L (posicion 162 en MUC1 de tipo natural), G240V (posicion 169 en MUC1 de tipo natural), S241Y (posicion 170 en MUC1 de tipo natural), T242L (posicion 171 en MUC1 de tipo natural), A483Y (posicion 392 en MUC1 de tipo natural), C495A (posicion 404 en MUC1 de tipo natural), C497V (posicion 406 en MUC1 de tipo

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natural), T513K (posicion 422 en MUC1 de tipo natural), P521A (posicion 430 en MUC1 de tipo natural), T522L (posicion 431 en MUC1 de tipo natural), T535L (posicion 444 en MUC1 de tipo natural), D536F (posicion 445 en MUC1 de tipo natural) y S551Y (posicion 460 en MUC1 de tipo natural). La sustitucion C495A (posicion 404 en la proteina MUC1 de tipo natural) es la mutacion inactivante; el resto de las sustituciones son para producir epitopos agonistas. SEQ ID NO: 16 comprende el peptido agonista potenciador denominado en el presente documento SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 esta ubicada en las posiciones 513-522 de SEQ ID NO: 16. La composicion para inmunoterapia basada en levadura que comprende la levadura completa Saccharomyces cerevisiae que expresa la proteina de fusion de SEQ ID NO: 16 se denomina en el presente documento GI-6108.

Se transfecto un plasmido que contenia antigeno agonista de MUC1 para GI-6108 en la levadura W303a y se seleccionaron transformantes despues de 3 dias de crecimiento a 30°C sobre agar de medio minimo de uridina (UDA, uridine dropout agar). Se volvieron a sembrar en franjas colonias individuales sobre placas con agar de medio minimo de uridina y leucina (ULDA, uridine and leucine dropout agar) y se incubaron a 30°C durante 4 dias adicionales para seleccionar celulas con elevado numero de copias de plasmido.

Se retiro una unica colonia de GI-6108 de la placa con ULDA y se uso para inocular 25 ml de medio liquido UL2 (cultivo iniciador). Tambien se inoculo medio UL2 con pH tamponado que contenia 4,2 g/l de Bis-Tris (BT-UL2) con GI-6108 para evaluar este producto inmunoterapico basado en levadura producido en las condiciones de fabricacion a pH neutro (la levadura resultante denominada en el presente documento “GI-6108-DEC”). El cultivo en medio UL2 con pH tamponado expone los p-glucanos en la pared de la celula de levadura y se cree que modifica las respuestas inmunitarias celulares inducidas por la levadura como resultado de la modificacion de las interacciones con receptores de dectina en celulas presentadoras de antigeno. Por consiguiente, las levaduras GI-6108 son estructural y funcionalmente diferentes de las levaduras GI-6108-DEC. Se incubaron los cultivos iniciadores con agitacion a 30°C hasta una densidad de ~3 YU/ml, y luego se usaron para inocular un cultivo intermedio hasta 0,3 YU/ml. Se hicieron crecer los cultivos intermedios hasta una densidad de 3 YU/ml, y luego se usaron para inocular cultivos finales hasta una densidad de 0,04 YU/ml. Se hicieron crecer los cultivos finales hasta una densidad de 3 YU/ml, y luego se trataron con sulfato de cobre 0,5 mM durante 3 h a 30°C para inducir la expresion de antigeno agonista de MUC1.

Se lavaron las celulas inducidas, una vez con PBS, se destruyeron termicamente a 56°C durante 1 h, y luego se lavaron tres veces en PBS. Se midio el contenido de proteina total de las celulas destruidas termicamente, mediante el ensayo de Amidoschwarz y se midio el contenido de antigeno agonista mediante inmunotransferencia de tipo Western, con un anticuerpo monoclonal que reconoce una cola epitopica de hexahistidina C-terminal. Se determino la cantidad de antigeno mediante interpolacion frente a una curva patron que comprendia su proteina HCV NS3 marcada.

Los resultados mostraron que la levadura GI-6108 expreso bastante el antigeno en el medio UL2, y se estimo que el contenido de antigeno para GI-6108 era de aproximadamente 2531 Ng/YU (datos no mostrados). La expresion de antigeno por la levadura GI-6108-DEC (es decir, GI-6108 hecha crecer en medio BT-UL2, condiciones de pH neutro) fue demasiado baja como para dar como resultado una cuantificacion precisa mediante inmunotransferencia de tipo Western (datos no mostrados). No obstante, se usaron tanto GI-6108 como GI-6108-DEC en los experimentos descritos en el ejemplo 3.

EJEMPLO 3

Este ejemplo demuestra que composiciones para inmunoterapia de MUC1-levadura de la invencion conocidas como GI-6108 y GI-6108-DEC pueden activar celulas T especificas de MUC1.

tineas de celulas T - T-3-P93L es una linea de celulas T especifica de MUC-1 que reconoce especificamente el peptido agonista de MUC1, indicado como P93L, en el contexto de HLA-A2. P93L es un peptido que abarca las posiciones 92-101 de una proteina MUC1-C de longitud completa (por ejemplo, ATWGQDVTSV, que corresponde a las posiciones 92-101 de SEQ ID NO: 14) excepto porque la treonina en la posicion 2 de este peptido (posicion 93 de las posiciones 92-101 de SEQ ID NO: 14) se sustituye por una leucina, creando de ese modo un peptido agonista. P93L se une a HLA-A2 a mayores niveles que el peptido nativo (de tipo natural), y es un mejor inductor de celulas T especificas de MUC1 que el peptido nativo (mayor produccion de citocinas TH1) (vease la publicacion de solicitud de patente estadounidense n.° 2008/0063653). La linea de celulas T T-3-P93L puede lisar especificamente dianas tumorales positivas para HLA-A2 y positivas para MUC1 in vitro. Esta linea de celulas T es especifica para una parte de MUC1 que esta dentro de la subunidad MUC1 -N.

La celula T C1A es una linea de celulas T especifica de MUC-1 que reconoce especificamente el peptido agonista de MUC1, indicado como C1A, en el contexto de HLA-A2. C1A es un peptido que abarca las posiciones 392-401 de una proteina MUC1 de longitud completa (por ejemplo, ALAIVYLIAL, que corresponde a las posiciones 392-401 de SEQ ID NO: 14) excepto porque la alanina en la posicion 1 de este peptido (posicion 392 de SEQ ID NO: 14) se sustituye por una tirosina, creando de ese modo un peptido agonista.

La celula T C2A T es una linea de celulas T especifica de MUC-1 que reconoce especificamente el peptido agonista

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de MUC1, indicado como C2A, en el contexto de HLA-A2. C2A es un peptido que abarca las posiciones 397-406 de una protema MUC1 de longitud completa (por ejemplo, YLIALAVCQC; que corresponde a las posiciones 397-406 de SEQ ID NO: 14) excepto porque la cistefna en la posicion 10 de este peptido (posicion 406 de SEQ ID NO: 14) se sustituye por una valina, creando de ese modo un peptido agonista.

La celula T C3A es una lfnea de celulas T especffica de MUC-1 que reconoce especfficamente el peptido agonista de MUC1, indicado como C3A, en el contexto de HLA-A2. C3A es un peptido que abarca las posiciones 460-468 de una protema MUC1 de longitud completa (por ejemplo, SLSYTNPAV, que corresponde a las posiciones 460-468 de SEQ ID NO: 14) excepto porque la serina en la posicion 1 de este peptido (posicion 460 en SEQ ID NO: 14) se sustituye por una tirosina, creando de ese modo un peptido agonista.

La celula T V1A es una lfnea de celulas T especffica de MUC-1 que reconoce especfficamente el peptido agonista de MUC1, indicado como VNTR-3, en el contexto de HLA-A2. V1A es un peptido que abarca las posiciones 150-158 de una protema MUC1 de longitud completa (por ejemplo, STAPPAHGV, que corresponde a las posiciones 150-158 de SEQ ID NO: 14) excepto porque la serina en la posicion 1 de este peptido (posicion 150 de SEQ ID NO: 14) se sustituye por una tirosina, y la treonina en la posicion 2 de este peptido (posicion 151 de SEQ ID NO: 14) se sustituye por una leucina, creando de ese modo un peptido agonista.

La celula T V2A es una lfnea de celulas T especffica de MUC-1 que reconoce especfficamente el peptido agonista de MUC1, indicado como VNTR-5, en el contexto de HLA-A2. V2A es un peptido que abarca las posiciones 141-149 de una protema MUC1 de longitud completa (por ejemplo, APDTRPAPG, que corresponde a las posiciones 141-149 de SEQ ID NO: 14) excepto porque la alanina en la posicion 1 de este peptido (posicion 141 de SEQ ID NO: 14) se sustituye por una tirosina, y la prolina en la posicion 2 de este peptido (posicion 142 de SEQ ID NO: 14) se sustituye por una leucina, creando de ese modo un peptido agonista.

La celula T C5A es una lfnea de celulas T especffica de MUC-1 que reconoce especfficamente el peptido agonista de MUC1, indicado como C5A, en el contexto de HLA-A3. C5A es un peptido que abarca las posiciones 443-451 de una protema MUC1 de longitud completa (por ejemplo, STDRSPYEK, que corresponde a las posiciones 443-451 de SEQ ID NO: 14) excepto porque la treonina en la posicion 2 de este peptido (posicion 444 de SEQ ID NO: 14) se sustituye por una leucina, y el aspartato en la posicion 3 de este peptido (posicion 445 de SEQ ID NO: 14) se sustituye por una fenilalanina, creando de ese modo un peptido agonista.

La celula T C6A es una lfnea de celulas T especffica de MUC-1 que reconoce especfficamente el peptido agonista de MUC1, indicado como C6A, en el contexto de HLA-A24. C6A es un peptido que abarca las posiciones 422-431 de una protema MUC1 de longitud completa (por ejemplo, TYHPMSEYPT; que corresponde a las posiciones 422-431 de SEQ ID NO: 14) excepto porque la treonina en la posicion 1 de este peptido (posicion 422 de SEQ ID NO: 14) se sustituye por una tirosina, la prolina en la posicion 9 de este peptido (posicion 430 de SEQ ID NO: 14) se sustituye por una alanina, y la treonina en la posicion 10 de este peptido (posicion 431 de SEQ ID NO:14) se sustituye por una leucina, creando de ese modo un peptido agonista. Esta lfnea de celulas T tambien se describe en el ejemplo 1.

Se uso una version modificada del protocolo descrito por Tsang et a/., J. Natl. Cancer Inst., 87: 982-90 (1995), se uso para generar CTL especfficos de MUC1. Se pulsaron DC autologas irradiadas, con 20 pg/ml de peptido durante 2 horas, y luego se anadieron PBMC a una razon de 10:1. Despues de 3 dfas, se anadio IL-2 humana (20 unidades Cetus/ml). Se reestimularon las celulas cada 7 dfas. Despues de la tercer estimulacion in vitro (IVS), se reestimularon las celulas usando celulas B transformadas con virus Epstein-Barr autologas como celulas presentadoras de antfgeno a una razon de 2:1, y se mantuvieron en medio que contenfa IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (5 ng/ml).

En un primer experimento, se cultivaron celulas dendrfticas (DC) de un donante humano normal para HLA-A2 durante 48 horas con: (1) medio solo (Medio); (2) levadura GI-6106-DEC (una composicion inmunoterapica de MUC1-levadura de control positivo hecha crecer en condiciones de pH neutro, descrita previamente en la publicacion PCT n.° WO 2013/024972); (3) levadura GI-6108 (una composicion inmunoterapica de MUC1-levadura de la invencion descrita en el ejemplo 2 que expresa un antfgeno de MUC1 que comprende epftopos agonistas de HLA-A2, HLA-A3 y HLA-A24); (4) GI-6108-DEC (una composicion inmunoterapica de MUC1-levadura de la invencion que expresa un antfgeno de MUC1 que comprende epftopos agonistas de HLA-A2, HLA-A3 y HLA-A24 que se hizo crecer en condiciones de pH neutro tambien tal como se describe en el ejemplo 2); y (5) GI-Vec (control de levadura), una levadura que comprende un vector vacfo (sin insercion de antfgeno de MUC1). Luego se usaron las DC tratadas como celulas presentadoras de antfgeno (APC) para evaluar su capacidad para estimular las lmeas de celulas T especfficas de mUc1 , restringidas a HLA-A2, P93L, C1A, C2A, C3A, V1A y V2A (razon de celulas T:DC = 10:1). Tambien se incluyo un control “sin celulas T” para cada conjunto de DC. Se recogieron sobrenadantes de cultivo de 24 horas y se examinaron para determinar la secrecion de interferon-y (IFN-y). Se muestran los resultados en la tabla 5, expresados como la cantidad de IFN-y producida por las celulas T en pg/ml.

Tabla 5. Produccion de IFN-y por celulas T de HLA-A2 especfficas de MUC1 estimuladas con DC humanas (HLA-A2) tratadas con constructos de agonista de MUC1 -levadura (GI-6108 y GI-6108-DEC)

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DC tratadas con:: Celulas T P93L Celulas T C1A Celulas T C2A Celulas T C3A Celulas T V1A (VNTR-3) Celulas T V2A (VNTR-5) Sin celulas T

Medio: <15,6 <15,6 <15,6 <15,6 <15,6 <15,6 <15,6

GI-6106-DEC (control positivo) HLA-A2/A3: 1572 103 1603 321 266 148 <15,6

GI-6108 HLA- A2/A3/A24: 1528 50 1607 272 153 55 <15,6

GI-6108-DEC HLAA2/A3/A24: 1165 40 1514 147 81 75 <15,6

GI-Vec (levadura de control): <15,6 17 <15,6 <15,6 36 28 <15,6

Razon DC:levadura = 1:10. Se expresan los resultados en pg/ml 2 x 104 DC: 2 x 105 celulas T en 1 ml

Tal como se muestra en la tabla 5, las celulas dendriticas tratadas con GI-6108, produjeron tanto en condiciones habituales (GI-6108) como condiciones de pH neutro (GI-6108-DEC), y que expresan varios epitopos agonistas de MUC1 diferentes, pudieron estimular celulas T especificas de MUC1, restringidas a HLA-A2 para producir cantidades importantes de IFN-y de manera y a un nivel similares al control positivo.

En un segundo experimento, se cultivaron DC de un donante humano normal para HLA-A3 o HLA-A24 durante 48 horas con: (1) medio solo (Medio); (2) levadura GI-6106-DEC; (3) levadura GI-6108; (4) GI-6108-DEC; y (5) GI-Vec (control de levadura). Luego se usaron las DC tratadas como APC para evaluar su capacidad para estimular la linea de celulas T especificas de MUC1, restringidas a HLA-A3, C5A o la linea de celulas T especificas de MUC1, restringidas a HLA-A24, C6A (razon de celulas T:DC = 10:1). Tambien se incluyo un control “sin celulas T” para cada conjunto de DC. Se recogieron sobrenadantes de cultivo de 24 horas y se examinaron para determinar la secrecion de IFN-y. Se muestran los resultados en la tabla 6, expresados como la cantidad de IFN-y producida por las celulas T en pg/ml.

Tabla 6. Produccion de IFN-y por celulas T especificas de MUC1 estimuladas con DC humanas (HLA-A3/HLA-A24) tratadas con constructos de agonista de MUC1 -levadura (GI-6108 y GI-6108-DEC)

DC tratadas con:: Linea de celulas T C5A (P483A) HLA-A3 Linea de celulas T C6A (P-462A) HLA-A24 Sin celulas T

Medio: <15,6 <15,6 <15,6

GI-6106-DEC (control positivo) HLA-A2/A3: 4230 1048 <15,6

GI-6108 HLA- A2/A3/A24: 3664 2938 <15,6

GI-6108-DEC HLA- A2/A3/A24: 3211 2590 <15,6

GI-Vec (control de levadura): <15,6 <15,6 <15,6

Razon DC:levadura = 1:10. Se expresan los resultados en pg/ml de IFN-y 2 x 104 DC: 2 x 105 celulas T en 1 ml

Tal como se muestra en la tabla 6, celulas dendriticas tratadas con GI-6108, produjeron tanto en condiciones convencionales (GI-6108) como en condiciones de pH neutro (GI-6108-DEC), y que expresan los epitopos agonistas de MUC1 A3 y A24, pudieron estimular tanto celulas T especificas de MUC1, restringidas a HLA-A3 como celulas T especificas de MUC1, restringidas a HLA-A24 para producir cantidades importantes de IFN-y de manera y a un nivel similares al control positivo.

Estos datos indican que una linea de celulas T especificas de HLA-A24 de MUC1 establecida usando epitopo agonista de HLA-A24 de MUC1 C6A puede activarse con DC humanas (positivas para HLA-A24) tratadas con constructos de agonista de MUC1-levadura (GI-6108 y GI-6108-DEC) que contienen epitopos agonistas HLA-de A2/A3/A24 de MUC1 y producen altos niveles de IFN-y. Adicionalmente, estos datos indican que el epitopo agonista de HLA-A24 de linea de celulas T especificas de MUC1 puede activarse mediante el epitopo nativo de HLA-A24 puesto que vector GI-6106-DEC no contiene el epitopo agonista de HLA-A24 de MUC1.

EJEMPLO 4

Este ejemplo describe un ensayo clinico de fase 1 en sujetos con cancer positivo para MUC1.

Se realiza un ensayo clinico de fase 1 abierto, de ampliacion a escala de la dosis usando una composicion para inmunoterapia de MUC1-levadura conocida como GI-6108 descrita en el ejemplo 2 (hecha crecer o bien en

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condiciones habituales o bien en condiciones de pH neutro). A 12-24 sujetos con un tumor positivo para MUC1 que puede ser positivo para HLA-A2, HLA-A3 o HLA-A24 se les administra la composicion para inmunoterapia de MUC1- levadura en un protocolo de ampliacion a escala de cohortes de dosis secuenciales que utiliza intervalos de dosis de 4 YU (1 YU x 4 sitios), 16 YU (4 YU x 4 sitios), 40 YU (10 YU x 4 sitios) y 80 YU (20 YU x 4 sitios) administrados por via subcutanea. La inmunoterapia con MUC1-levadura se administra a intervalos de 2 semanas durante 3 meses, y luego mensualmente, o se administra mensualmente. Se selecciona una cohorte de expansion de pacientes (n=10) a la dosis tolerada maxima (MTD) o a la mejor dosis observada para su estudio adicional. Los resultados monitorizan la seguridad como criterio de valoracion principal, y como criterios de valoracion secundarios, respuestas de celulas T especificas de antigeno (por ejemplo, celulas T CD8+ especificas de MUC1 que aparecen o que se expanden con el tratamiento) asi como actividad clinica.

Se espera que GI-6108 sea segura y se tolere bien sin toxicidades importante. Ademas, se espera que GI-6108 produzca respuestas de celulas T especificas de MUC1 que aparecen con el tratamiento o una mejora de respuestas de celulas T de nivel inicial especificas de MUC1 en un numero estadisticamente significativo de pacientes. Tambien se espera que algunos pacientes tengan una enfermedad estabilizada.

EJEMPLO 5

Este ejemplo demuestra que epitopos agonistas de HLA-A24 de MUC1-C pueden activar celulas especificas de MUC1.

Se activo una linea de celulas T de HLA-A24 especificas de MUC1 establecida usando el epitopo agonista de HLA- A24 de MUC1, C6A con DC humanas positivas para HLA-A24 transfectadas con vectores de poxvirus (MVA) que contenian epitopos agonistas de MUC1, de HLA-A2/A3 de MUC1 (MVA-mBN-CV301). En particular, se trataron las DC humanas con 10 MOI de o bien (1) el clon 73 de MVA-mBN336 o bien (2) el clon 77 de MvA-mBN336 y se produjeron altos niveles de IFN-y (vease la tabla 7).

Tabla 7. Pueden activarse celulas T especificas de epitopo agonista de HLA-A24 de MUC1 (C6A) con DC humanas (positivas para HLA-A24) transfectadas con vectores MVA-mBN-CV-301 y producir altos niveles de IFN-y

DC tratadas con:: Linea de celulas T especifica de epitopo agonista de HLA-A24 de MUC1 (C6A) Sin celulas T

Medio: 33,0 <15,6

clon 73 de MVA-mBN336 (que contiene epitopos agonistas de HLA-A2/A3 de MUC1 y epitopo nativo de HLA-A24): 1034 24,6

clon 77 de MVA-mBN336 (que contiene epitopos agonistas de HLA-A2/A3 de MUC1 y epitopo nativo de HLA-A24): 996 22,4

Se expresan los resultados en pg/ml de IFN-y 2 x 104 DC: 2 x 105 celulas T en 1 ml

Tal como se muestra en la tabla 7, pueden activarse lineas de celulas T especificas de epitopo agonista de HLA-A24 de MUC1 por el epitopo nativo de HLA-A24 puesto que los vectores MVA-mBN-CV301 no contienen el epitopo agonista de HLA-A24 de MUC1.

El uso de los terminos “un(o)” y “una” y “el/la” y “al menos uno” y referentes similares en el contexto de la descripcion de la invencion (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) ha de interpretarse que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otro modo en el presente documento o lo contradiga claramente el contexto. El uso del termino “al menos uno” seguido por una lista de uno o mas elementos (por ejemplo, “al menos uno de A y B”) ha de interpretarse que significa un elemento seleccionado de los elementos enumerados (A o B) o cualquier combinacion de dos o mas de los elementos enumerados (A y B), a menos que se indique de otro modo en el presente documento o lo contradiga claramente el contexto. Los terminos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” han de interpretarse como terminos abiertos (es decir, que significan “que incluyen, pero sin limitarse a”,) a menos que se indique de otro modo. La mencion de intervalos de valores en el presente documento pretende servir meramente como metodo abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor independiente que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique de otro modo en el presente documento, y cada valor independiente se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionase individualmente en el presente documento. Todos los metodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otro modo en el presente documento u lo contradiga claramente el contexto de otro modo. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionado en el presente documento, pretende meramente ilustrar mejor la invencion y no representa una limitacion del alcance de la invencion a menos que se reivindique de otro modo. No

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debe interpretarse que ningun lenguaje en la memoria descriptiva indica que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la puesta en practica de la invencion.

Se describen realizaciones preferidas de esta invencion en el presente documento, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invencion. Pueden resultar evidentes variaciones de esas realizaciones preferidas para los expertos habituales en la tecnica tras la lectura de la descripcion anterior. Los inventores esperan que los expertos en la tecnica empleen tales variaciones segun sea apropiado, y los inventores pretenden que se ponga en practica la invencion de otro modo a como se describe especfficamente en el presente documento. Por consiguiente, esta invencion incluye todas las modificaciones y equivalentes del contenido mencionado en las reivindicaciones adjuntas a la misma segun lo permita la legislacion aplicable. Ademas, cualquier combinacion de los elementos descritos anteriormente en todas las variaciones posibles de los mismos esta abarcada por la invencion a menos que se indique de otro modo en el presente documento o lo contradiga claramente el contexto de otro modo.

Lista de secuencias

<110> LOS ESTADOS UNIDOS DE AMERICA, REPRESENTADOS POR EL SECRETARIO DEPARTAMENTO DE SALUD Y SERVICIOS HUMANOS

<120> Epftopos agonistas de HLA-A24 de oncoprotefna MUC1-C y composiciones y metodos de uso

<130> E-520-2013/0-PCT-01

<150> Documento US 61/894.482 <151 >

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211 > 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido sintetico <400> 1

Lys Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Ala Leu 15 10

<210>2 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido sintetico <400> 2

Lys Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Leu 1 5

<210>3 <211 > 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido sintetico <400> 3

10

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20

Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr 15 10

<210>4 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido sintetico <400> 4

Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala 1 5

<210>5 <211> 1255 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 5

imagen1

Leu

Thr

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Pro

Ser

Val

Trp

Ser

110

Pro

Val

Pro

Ser

190

Leu Thr 15

Pro Gly Ser Ser Ser His

Thr Leu 80

Gly Gin 95

Thr Thr

Ala Pro

Asp Thr

Thr Ser 160

Ala His 175

Thr Ala

Claims

REIVINDICACIONES

5
2.
3.

10 4.

15 5.

1. Peptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, en el que el peptido tiene no mas de 20 residuos de aminoacido, o en el que opcionalmente el peptido consiste en SEQ ID NO: 1.

Acido nucleico que codifica para el peptido segun la reivindicacion 1.

Vector que comprende el acido nucleico segun la reivindicacion 2.

Celula que comprende (i) uno o mas de los peptidos segun la reivindicacion 1, (ii) uno o mas de los acidos nucleicos segun la reivindicacion 2, o (iii) uno o mas los vectores segun la reivindicacion 3, opcionalmente en la que opcionalmente la celula es humana, y/o en la que opcionalmente la celula es una celula presentadora de antigeno o celula tumoral.

Composicion que comprende:

(a) uno o mas de (i) los peptidos segun la reivindicacion 1, (ii) los acidos nucleicos segun la reivindicacion 2, (iii) los vectores segun la reivindicacion 3, o (iv) las celulas segun la reivindicacion 4, y

20 (b) un portador farmaceuticamente aceptable, opcionalmente que comprende ademas una molecula

inmunoestimuladora/reguladora, en la que opcionalmente la molecula inmunoestimuladora/reguladora se selecciona del grupo que consiste en interleucina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, IL-15/IL15Ra, IL-15/IL- 15Ra-Fc, interferon (IFN)-y, factor de necrosis tumoral (TNF)-a, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, CD70, RANTES, G-CSF, OX-40L, 41 BBL, anticuerpo anti-CTLA-4, inhibidor de IDO, anticuerpo anti-PDL1, 25 anticuerpo anti-PD1, y combinaciones de los mismos o en la que opcionalmente la molecula

inmunoestimuladora se selecciona del grupo que consiste en (i) un plasmido que codifica para IL-12 complejada con quitosano y (ii) IL-12 recombinante mezclada con quitosano.
6. Composicion segun la reivindicacion 5, que comprende ademas un farmaco quimioterapico, agente 30 radiactivo, antimetabolito, hormona, antagonista de hormona, antibiotico, farmaco antiviral, farmaco

antifungico, ciclofosfamida, o una combinacion de los mismos, o un agente de alquilacion, antagonista de folato, antagonista de purina, antagonista de pirimidina, veneno del huso, inhibidor de topoisomerasa, agente inductor de apoptosis, inhibidor de la angiogenesis, podofilotoxina, nitrosourea, cisplatino, carboplatino, interferon, asparginasa, tamoxifeno, leuprolida, flutamida, megestrol, mitomicina, bleomicina, 35 doxorubicina, irinotecan, Taxol, geldanamicina, o una combinacion de los mismos, o

Adriamycin, Alkeran, Ara-C, busulfano, CCNU, carboplatino, cisplatino, Cytoxan, daunorubicina, DTIC, 5- FU, fludarabina, Hydrea, idarubicina, ifosfamida, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, mostaza de nitrogeno, Taxol, Velban, vincristina, VP-16, gemcitabina, Herceptin, irinotecan, Leustatin, 40 Navelbine, Rituxan STI-571, Taxotere, topotecan, capecitabina, Zevelin, enzalutamida, calcitriol, o una

combinacion de los mismos.
7. Composicion segun la reivindicacion adyuvantes, opcionalmente en la que 45 alumbre, sales de aluminio, fosfato de aluminio

adyuvante incompleto de Freund, QS21, MPL-A

5 o la reivindicacion 6, que comprende ademas uno o mas uno o mas adyuvantes se selecciona del grupo que consiste en

hidroxido de aluminio, silice de aluminio, fosfato de calcio, RIBI DETOX™, y combinaciones de los mismos.
8. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, que comprende ademas un factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GMCSF), opcionalmente que comprende ademas

50 liposomas.
9. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, para su uso en un metodo de potenciacion de una respuesta inmunitaria frente a un cancer que expresa MUC1 en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion segun una cualquiera de las

55 reivindicaciones 5-8 al sujeto, en la que se potencia la respuesta inmunitaria en el sujeto.
10. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, para su uso en un metodo de inhibicion de un cancer que expresa MUC1 en un sujeto que comprende:

60 (a) estimular linfocitos obtenidos de un sujeto con la composicion segun una cualquiera de las

reivindicaciones 5-8 para generar linfocitos T citotoxicos ex vivo, y

(b) administrar los linfocitos T citotoxicos al sujeto,

65

o

(a) tratar celulas dendrfticas obtenidas de un sujeto con la composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 5-8 ex vivo, y

(b) administrar las celulas dendrfticas tratadas al sujeto,

5

o

(a) aislar celulas dendrfticas de PBMC obtenidas de un sujeto,

10 (c) tratar las celulas dendrfticas con la composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 5-8 ex

vivo,

(d) activar las PBMC obtenidas del sujeto con las celulas dendrfticas tratadas ex vivo, y 15 (e) administrar las PBMC activadas al sujeto,

o

(a) aislar celulas dendrfticas de PBMC obtenidas de un sujeto,

20

(b) tratar las celulas dendrfticas con la composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 5-8 ex vivo,

25

(c) activar las PBMC obtenidas del sujeto con las celulas dendrfticas tratadas ex vivo,

(d) aislar linfocitos T de las PBMC activadas ex vivo, y

30
11.

35

40 12.

(e) administrar los linfocitos T aislados al sujeto,

en la que se inhibe el cancer que expresa MUC1 en el sujeto.

Composicion inmunoterapica de MUC1-levadura, en la que la composicion inmunoterapica comprende:

(a) un vehiculo de levadura; y

(b) una proteina de fusion que comprende al menos un antigeno de mucina-1 (MUC1),

en la que el antigeno de MUC1 comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. Composicion inmunoterapica de MUC1-levadura, en la que la composicion inmunoterapica comprende: (a) un vehiculo de levadura; y

(b) una proteina de fusion que comprende al menos un antigeno de MUC1, en la que el antigeno de MUC1 45 comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos el 80% a (i) SEQ ID NO: 16, (ii)

posiciones 92-566 de SEQ ID NO: 16, o (iii) una secuencia correspondiente de una proteina MUC1 diferente, y en la que el antigeno de MUC1 comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, opcionalmente en la que el antigeno de MUC1 comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos el 95% a (i) SEQ ID NO: 16, (ii) posiciones 92-566 de SEQ ID NO:16, o (iii) una secuencia 50 correspondiente de una proteina MUC1 diferente, y en la que el antigeno de MUC1 comprende la

secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
13. Composicion inmunoterapica de MUC1-levadura segun la reivindicacion 12, en la que el antigeno de MUC1 comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos el 95% a las posiciones 92-566 de 55 SEQ ID NO: 16, opcionalmente en la que el antigeno de MUC1 consiste en las posiciones 92-566 de SEQ

ID NO: 16.
14. Composicion inmunoterapica de MUC1-levadura segun la reivindicacion 12 o la reivindicacion 13, en la que la proteina de fusion comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16.

60
15. Composicion inmunoterapica de MUC1-levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en la que el vehiculo de levadura es una levadura completa, y/o

en la que la proteina de fusion se ha expresado por la levadura y/o 65

en la que el vehiculo de levadura se ha inactivado por calor, y/o

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

en la que el vehiculo de levadura procede de Saccharomyces cerevisiae, y/o

en la que la composicion inmunoterapica se ha producido cultivando una levadura completa que expresa el antigeno de MUC1 en un medio que se mantuvo a un nivel de pH de entre 5,5 y 8.
16. Composicion inmunoterapica de MUCI-levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, para su uso en un metodo de reduccion de la carga tumoral, inhibicion del crecimiento tumoral y/o aumento de la supervivencia de un individuo que tiene un cancer que expresa MUC1, que comprende administrar al individuo la composicion inmunoterapica de MUC1-levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, opcionalmente en la que se detecta la expresion de MUC1 en el cancer del individuo en el momento en que se administra por primera vez la composicion, y/o en la que el individuo esta tratandose o se ha tratado con al menos una terapia adicional para el cancer, opcionalmente en la que la al menos una terapia adicional se selecciona de quimioterapia, terapia dirigida contra el cancer, radioterapia, transferencia adoptiva de celulas T, y/o la administracion de una o mas composiciones inmunoterapicas adicionales.
17. Composicion inmunoterapica de MUC1-levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, para su uso en un metodo de prevencion o retraso de la aparicion de un cancer que expresa MUC1, que comprende administrar a un individuo la composicion inmunoterapica de MUC1-levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en la que opcionalmente no se ha detectado cancer en el individuo, en la que opcionalmente el individuo corre un alto riesgo de desarrollar cancer.
18. Composicion inmunoterapica de MUC1-levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, para su uso segun la reivindicacion 16 o la reivindicacion 17, en la que el cancer tiene su origen en celulas epiteliales, o en la que el cancer se selecciona del grupo que consiste en: cancer de mama, cancer de intestino delgado, cancer de estomago, cancer de pancreas, cancer de rinon, cancer de vejiga, cancer de utero, cancer de ovario, cancer de testiculo, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de prostata, melanoma, cancer de esofago, leucemia mielogena multiple (MML), leucemia linfocitica cronica (CLL), leucemia mieloide aguda (AML), linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, canceres de tejidos secretores, y canceres metastasicos de los mismos.
19. Composicion inmunoterapica de MUC1-levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, para su uso en

el tratamiento de un cancer, o

la reduccion, detencion, reversion o prevencion de la progresion metastasica de cancer en un individuo que tiene cancer, o la prevencion o el retraso de la aparicion de un cancer que expresa MUC1.
20. Proteina MUC1 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
21. Vector segun la reivindicacion 3 para su uso en un metodo de induccion de una respuesta inmunitaria frente a un cancer que expresa MUC1 en un sujeto, en el que el vector es un vector de poxvirus, que comprende:

(a) administrar al sujeto un primer vector de poxvirus que comprende un acido nucleico que codifica para el peptido segun la reivindicacion 1; y

(b) administrar al sujeto un segundo vector de poxvirus que comprende un acido nucleico que codifica para el peptido segun la reivindicacion 1,

induciendo de ese modo una respuesta inmunitaria frente a un cancer que expresa MUC1 en el sujeto,

en el que opcionalmente los vectores de poxvirus primero y segundo comprenden un acido nucleico que codifica para la proteina MUC1 segun la reivindicacion 11 y/o

en el que opcionalmente los vectores de poxvirus primero y segundo comprenden ademas un acido nucleico que codifica para el antigeno carcinoembrionario (CEA).
22. Vector segun la reivindicacion 3, para su uso segun la reivindicacion 21, en el que los vectores de poxvirus primero y segundo comprenden ademas un acido nucleico que codifica para uno o mas moleculas coestimuladoras, en el que opcionalmente la una o mas moleculas coestimuladoras se seleccionan de B7.1, ICAM-1 y LFA-3.
23. Vector segun la reivindicacion 3, para su uso segun la reivindicacion 21 o la reivindicacion 22, en el que el primer vector de poxvirus es un virus vaccinia y el segundo vector de poxvirus es un virus de viruela aviar, o

en el que el primer vector de poxvirus es un virus vaccinia Ankara modificado (MVA) y el segundo vector de poxvirus es un virus de viruela aviar, en el que opcionalmente el virus MVA es MVA-BN, y/o

en el que los vectores de poxvirus primero y segundo se administran al sujeto en un protocolo de 5 sensibilizacion-refuerzo.