ES2680595T3 - Evaluación cuantitativa para eficacia de ARN mensajero para tapar - Google Patents

Abstract

Un método para cuantificar la eficacia de ARNm para tapar, comprendiendo el método: (1) proporcionar una muestra de ARNm que comprende ARNm tapado y ARNm no tapado; (2) poner en contacto la muestra de ARNm con oligonucleótido de ADN complementario con una secuencia en una región 5' no trasladada del ARNm dentro de 1 o 2 bases desde el tapón o penúltima base no tapada de ARNm bajo condiciones que permitan que el oligonucleótido de ADN se empareje con la secuencia; (3) proporcionar una o más nucleasas que selectivamente degradan el híbrido ADN/ARN, dando como resultado fragmentos tapados y no tapados que comprenden no más de 5 bases del ARNm; (4) separar los fragmentos tapados y no tapados mediante cromatografía; y (5) determinar una cantidad relativa de los fragmentos tapados y no tapados mediante la determinación de áreas pico relativas de la cromatografía de los fragmentos tapados y no tapado, cuantificando así la eficacia de ARNm para tapar.

Description

Evaluación cuantitativa para eficacia de ARN mensajero para tapar

Antecedentes

La terapia con ARN mensajero (“ARNm”) está siendo cada vez una técnica más importante para el tratamiento de una variedad de enfermedades. La terapia ARNm efectiva requiere una administración eficaz del ARNm al paciente y una producción eficiente de la proteína codificada por el ARNm en el cuerpo del paciente. Para optimizar la administración de ARN y la producción de proteína in vivo, típicamente se requiere una tapa adecuada en el extremo 5’ de la construcción, que protege al ARNm de la degradación y facilitar el desplazamiento exitoso de proteínas. Por lo tanto, la caracterización precisa de la eficacia del tapón es particularmente importante para determinar la calidad de ARNm para aplicaciones terapéuticas.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona métodos mejoradas para determinar de manera precisa y cuantitativa la eficacia de tapar de ARNm, en particular ARNm sintetizado in vitro. Como se ha señalado anteriormente, el tapón apropiado es importante para la producción exitosa de proteínas in vivo. Sin embargo, antes de la presente invención, la mayoría de los ensayos con tapones son cualitativos, lo que no es suficiente para evaluar la calidad de un producto terapéutico basado en ARNm y la seguridad y eficacia relacionadas para uso in vivo. De hecho, antes de la presente invención, no hay método disponible que permita la cuantificación de la eficacia para tapar sin alteraciones permanentes del ARNm en una muestra.

Como se describe con detalle más abajo, la presente invención se basa, en parte, en la generación y cuantificación de fragmentos tapados y no tapados mediante cromatografía. Así, la presente invención proporciona una técnica cuantitativa simple, fiable y eficaz para evaluar la eficacia de ARNm para tapar. La presente invención es particularmente útil para el control de calidad durante la fabricación de ARNm y para la caracterización de ARNm como un ingrediente farmacéutico activo (IFA) en productos terapéuticos finales. El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para cuantificar la eficacia de ARNm para tapar, que comprende las etapas de: (1) proporcionar una muestra de ARNm que comrpende ARNm tapado y ARNm no tapado; (2) poner en contacto la muesetra de ARNm con oligonucleótido de ADN complementario con una secuencia en una región 5’ no desplazada del ARNm adyacente al tapón o la base penúltima no tapada de ARNm bajo condiciones que permitan que el oligonucleótido de ADN se empareje con la secuencia; (3) proporcionar una o más nucleasas que selectivamente degradan híbridos de ADN/ARN y/o ARNm no emparejado, dando como resultado fragmentos tapados y no tapados; (4) separar los fragmentos tapados y no tapados mediante cromatografía; y (5) determinar una cantidad relativa de los fragmentos tapados y no tapados, cuantificando así la eficacia de ARNm para tapar.

En algunas realizaciones, los métodos inventivos pueden usarse para cuantificar un tapón que tiene una estructura de la fórmula I:

donde, B es nucleobase; R1 se selecciona de halógeno, OH y OCH3; R2 se selecciona de H, OH y OCH3; R3 es CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3 o nulo; R4 es NH2; R5 se selecciona de OH, OCH3 y un halógeno; n es 1, 2 ó 3; y M es un nucleótido de ARNm.

En algunas realizaciones, la nucleobase es guanina.

En algunas realizaciones, los métodos inventivos de la presente invención pueden usarse para cuantificar un tapón m7G con una estructura de la fórmula II o un tapón no metilado con una estructura de la fórmula III.

donde,

R2 es H o CH3;

R4 es NH2;

R5 es OH u OCH3;

R6 es H o CH3; y

M es un nucleótido de ARNm.

35 donde M es un nucleótido del ARNm.

En algunas realizaciones, la etapa (4) separa además ARN tapado metilado y no metilado. En algunas realizaciones, el tapón metilado comprende metilación en la posición R3 y/o R5 como se muestra en la fórmula I. En algunas realizaciones, un método inventivo de acuerdo con la presente invención incluye además una etapa para determinar cuantitativamente el porcentaje de metilación de ARN tapado.

En algunas realizaciones, un oligonucleótido de ADN adecuado tiene aproximadamente 10-80 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 10-75, 10-70, 10-65, 10-60, 10-55, 10-50, 10-45, 10-40, 10-35, 10-30,

45 10-25, 10-20 o 10-15 nucleótidos de longitud). En algunas realizaciones, un oligonucleótido de ADN adecuado es igual o mayor que aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido de ADN adecuado está flanqueado en uno o ambos lados por uno o más nucleótidos de ARN (por ejemplo, por 1, 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos de ARN).

En algunas realizaciones, un olignucleótido de ADN adecuado es complementario con una secuencia en la región 5’ no desplazada de ARNm en las bases 1, 2, 3, 4 o 5 del tapón o la base penúltima no tapada de ARNm.

En algunas realizaciones, una o más nucleasas que degradan selectivamente híbrido de ADN/ARN y/o ARN no emparejado comprenden RNasa H. En algunas realizaciones, una o más nucleasas que selectivamente

55 híbrido de ADN/ARN y/o ARN no emparejado comprenden una nucleasa que genera fragmentos tapados y no tapados con extremo desafilado. En algunas realizaciones, una o más nucleasas comprenden la nucleasa S1 y/o RNAsa H, u otra 5’ exonucleasa.

En algunas realizaciones, los fragmentos tapados y no tapados de la etapa (3) comprenden no más de 5

bases (por ejemplo, no más de 4, 3, 2 o 1) del ARNm. En algunas realizaciones, los fragmentos tapados y no

tapados de la etapa (3) comprenden no más de 2 bases de ARNm.

En algunas realizaciones, la etapa (4) de los métodos inventivos aquí descritos comprende una etapa de aplicar los fragmentos tapados y no tapados a una columna cromatográfica. En algunas realizaciones, una columna65 cromatográfica adecuada se selecciona del grupo consistente en una columna HPLC de intercambio de anión, una

columna HPLC de intercambio de catión, una columna HPLC de fase inversa, una columna de interacción hidrofóbica, una columna de cromatografía líquida de ultra-resolución, o una columna de exclusión por tamaño.

En algunas realizaciones, la etapa (5) de los métodos inventivos aquí descritos comprende determinar áreas de pico relativo de los fragmentos tapados y no tapados.

En algunas realizaciones, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención se usan para cuantificar la eficacia de ARNm para tapar de una muestra de ARNm sintetizada in vitro.

Entre otras cosas, la presente invención proporciona además composiciones y kits para realizar los métodos inventivos aquí descritos. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un kit para cuantificar la eficacia de ARNm para tapar, que contiene uno o más de: (1) un oligonucleótido de ADN complementario a una secuencia en la región 5’ no desplazada de un ARNm para cuantificarse adyacente a la base penúltima tapada o no tapada de ARNm; (2) uno o más reactivos para emparejar entre ADN y ARN; (3) una o más nucleasas (por ejemplo, ARNasa y/o nucleasa S1) que selectivamente degradan híbrido de ADN/ARN y/o ARNm no emparejado; y (4) uno o más reactivos para realizar cromatografía (por ejemplo, columna cromatográfica).

En otro aspecto más, la presente invención proporciona métodos para fabricar ARNm que comprenden la etapa de cuantificar la eficacia de ARNm para tapar de acuerdo con los métodos inventivos aquí descritos. En algunas realizaciones, los métodos de fabricación de acuerdo con la presente invención contienen una etapa de ajuste de una condición de fabricación en base al resultado de cuantificar la eficacia de tapar de ARNm. En algunas realizaciones, la etapa de cuantificar se realizar antes de liberar un lote de ARNm.

Entre otras cosas, la presente invención proporciona además ARNm fabricado de acuerdo con los métodos aquí descritos.

Como se usan en esta solicitud, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” se usan como equivalentes. Cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente significan que cubren cualquier fluctuación normal apreciada por un experto en la técnica relevante.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos tienen únicamente fines ilustrativos y de ningún modo limitativos.

La FIG. 1 representa una realización ejemplar que comprende la manipulación enzimática de ARNm antes de separación cromatográfica. Se usa una pre-base de oligonucleótido de ADN para emparejar el ARNm adyacente a las estructuras Cap0 o Cap1, si están presentes. Se proporciona una nucleasa para digerir el ARN en el híbrido ADN:ARN, produciendo así un analito con tapón o sin tapón.

La FIG. 2 es un diagrama de estructuras tapadas de ARNm ejemplares y una estructura sin tapar presentes en varias realizaciones de la invención.

La FIG. 3 es un gráfico en barra que demuestra la cuantificación de niveles de proteína alfa-galactosidas (GLA) humana secretada como lo mide ELISA. La proteína detectada es el resultado de su producción a partir de GLA ARNm administrada intravenosamente por medio de una única dosis de nanopartículas lípidas (GLA ARNm encapsulado en 30 ug) seis horas después de la administración.

Definiciones

Con el fin de que la presente invención se entienda más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Las definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se exponen a lo largo de la especificación.

Afinidad: como se conoce en la técnica, “afinidad” es una medida de tensión con la que un ligando particular se enlaza (por ejemplo, se asocia de manera no covalente) y/o la velocidad o frecuencia con la que se desasocia de su pareja. Como es conocido en la técnica, puede utilizarse cualquier variedad de tecnologías para determinar afinidad. En muchas realizaciones, afinidad representa una medida de enlace específico.

Emparejamiento o hibridación: Como aquí se usan, los términos “emparejar”, “hibridación” y equivalentes gramaticales, se refieren a la formación de complejos (también llamados dúplex o híbridos) entre secuencias de nucleótidos que son suficientemente complementarias como para formar complejos por medio de emparejamiento con base de Watson-Crick o emparejamiento con base no canónica. Se apreciará que las secuencias de emparejamiento o hibridación no necesitan ser perfectamente complementarias para proporcionar híbridos estables. En muchas situaciones, los híbridos estables se formarán donde menos de aproximadamente 10% de las bases no coinciden. Por consiguiente, como aquí se usa, el término “complementario” se refiere a una molécula de ácido nucleico que forma un dúplex estable con su complemento bajo condiciones particulares, generalmente donde hay aproximadamente un 90% o más de homología (por ejemplo, aproximadamente 95% o más, aproximadamente 98%

o más o aproximadamente 99% o más de homología). Aquellos expertos en la técnica entienden cómo se estima y ajustas la astringencia de las condiciones de hibridación de tal manera que las secuencias que tengan al menos un nivel deseado de complementariedad se hibriden establemente, mientras aquellas que tengan una menor complementariedad no lo hagan. Para ejemplos de condiciones y parámetros de hibridación véase, por ejemplo, Sambrook, et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 1989, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Press: Plainview, NY y Ausubel, “Current Protocols in Molecular Biology”, 1994, John Wiley & Sons: Secaucus, NJ. Se dice que la complementariedad entre dos moléculas es “completa”, “total” o “perfecta” si todas las bases del ácido nucleico coinciden, y se dice que se “parcial” si es de otra manera.

Aproximadamente: Como aquí se usan, los términos “aproximadamente” o “alrededor de”, cuando se aplican a uno o más valores de interés, se refieren a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, los términos “aproximadamente” o “alrededor de” se refieren a un rango de valores que corresponden a 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente lo contrario a partir del contexto (excepto donde tal número excedería el 100% de un valor posible).

Cromatografía: Como aquí se usa, el término “cromatografía” se refiere a una técnica para separación de mezclas. Típicamente, la mezcla se disuelve en un fluido llamado “fase móvil”, que lo transporta a través de una estructura que mantiene otro material llamada “fase inmóvil”. La cromatografía en columna es una técnica de separación donde la cama inmóvil está dentro de un tubo, esto es, una columna.

Compuesto y Agente: Los términos “compuesto” y “agente” aquí se usan intercambiablemente. Se refieren a una molécula que ocurre de manera natural o no natural (esto es, sintético o recombinante), como una macromolécula biológica (por ejemplo, ácido nucleico, polipéptido o proteína), molécula orgánica o inorgánica, o un extracto hecho de materiales biológicos como bacterias, plantas, hongos o células y tejidos de animales (particularmente mamíferos, incluyendo humanos). El compuesto puede ser una molécula sencilla o un complejo de al menos dos moléculas.

Control: como aquí se usa, el término “control” tiene un significado entendido en la técnica de ser un estándar con el que los resultados se comparan. Típicamente, los controles se usan para aumentar la integridad en experimentos aislando variables con el fin de hacer una conclusión sobre tales variables. En algunas realizaciones, un control es una reacción o ensayo que se realiza simultáneamente con una reacción o ensayo de prueba para proporcionar un comparador. En un experimento, se aplica la “prueba” (esto es, la variable que se está probando”). En el segundo experimento, el “control”, no se aplica la variable que se está probando. En algunas realizaciones, un control es o comprende un registro impreso o guardado de otra manera. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.

Kit: Como aquí se usa, el término “kit” se refiere a un sistema de administración para administrar materiales. Tales sistemas de administración pueden incluir sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o administración de varios reactivos diagnósticos o terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótidos, anticuerpos, enzimas, etc., en los envases apropiados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, tampones, instrucciones escritas para realizar el ensayo, etc.) de una localización a otra. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recipientes (por ejemplo, cajas) que contiene los reactivos relevantes de reacción y/o materiales de soporte. Como aquí se usan, los términos “kit fragmentado” se refieren a sistemas de administración que comprende dos o más envases separados conteniendo cada uno una sub-porción de los componentes del kit total. Los envases pueden administrase al recipiente planeado juntos o por separado. Por ejemplo, un primer envase puede contener una enzima para uso en un ensayo, mientras un segundo envase contiene oligonucleótidos. Los términos “kit fragmentado” pretenden abarcar kits que contienen Reactivos Específicos de Analito (REA) regulados de acuerdo con la sección 520(e) de la Ley Federal de Alimentos, Fármacos y Cosméticos, pero sin limitar a ellos. De hecho, cualquier sistema de administración que comprenda dos o más recipientes separados conteniendo cada uno una sub-porción de los componentes del kit total se incluyen en el término “kit fragmentado”. Sin embargo, un “kit combinado” se refiere a un sistema de administración que contiene todos los componentes en un único envase (por ejemplo, en una única caja alojando cada uno de los componentes deseados”. El término “kit” incluye kits fragmentados y combinados.

Nucleósido: El término “nucleósido” o “nucleobase”, como aquí se usa, se refiere a adenina (“A”), guanina (“G”), citosina (“C”), uracilo (“U”), timina (“T”) y análogos de los mismos unidos a un carbohidrato, por ejemplo, Dribosa (en ARN) o 2’-deoxi-D-ribosa (en ADN), a través de un enlace N-glicosídico entre el carbono anomérico del carbohidrato (átomo de carbono 1’ del carbohidrato) y la nucleobase. Cuando la nucleobase es purina, por ejemplo, A o G, el azúcar de ribosa se une generalmente a la posición N9 del anillo heterocíclico de la purina. Cuando la nucleobase es pirimidina, por ejemplo, C, T o U, el azúcar se une generalmente a la posición N1 del anillo heterocíclico. El carbohidrato puede estar sustituido o no sustituido. Los azúcares de ribosa sustituidos incluyen, aunque no se limitan a, aquellos donde uno o más átomos de carbono, por ejemplo, el átomo de carbono 2’, se sustituye por uno o más de los mismos grupos o grupos diferentes Cl, F, --R, --OR, --NR2 o grupos halógenos, donde cada R es independientemente H, C1-C6-alquilo o C5-C14 arilo. Ejemplos de ribosa incluyen ribosa, 2’deoxiribosa, 2’,3’-dideoxiribosa, 2’-haloribosa, 2’-fluororibosa, 2’-clororibosa y 2’-alquilribosa, por ejemplo,

nucleótidos 2’-O-metil, 4’-alfa-anoméricos, nucleótidos 1’-afla-anoméricos (Asseline et al. NUCL. ACIDS RES., 19:4067-74 991]), 2’-4’-y 3’-4’-unidos y otras modificaciones de azúcar bicíclico “cerrado” o “LNA” (WO 98/22489; WO 98/39352; WO 99/14226).

Nucleótido: El término “nucleótido” como aquí se usa significa un nucleósido en una forma fosforilada (un éster de fosfato de un nucleósido), como una unidad de monómero o dentro de un polímero polinucleótido. “Nucleótido 5’-trifosfato” se refiere a un nucleótido con un grupo de éster trifosfato en la posición 5’, algunas veces indicado como “NTP” o “dNTP” y “ddNTP” para señalar particularmente las características estructurales del azúcar de ribosoma. El grupo de éster trifosfato puede incluir sustituciones de sulfuro por las varias fracciones de oxígeno, por ejemplo, alfa-tio-nucleótido 5’-trifosfato. Los nucleótidos pueden existir en las formas mono-, di-o tri-fosforiladas. Los átomos de carbono de la ribosa presentes en nucleótidos se designan con un carácter principal (‘) para distinguirlos de la numeración de la red central en las bases. Para un análisis de química de polinucleótido y ácido nucleico véase Shabarova, Z., y Bogdanov, A., Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, VCH, Nueva York ,1994.

Ácido nucleico: Los términos “ácido nucleico”, molécula de ácido nucleico”, “polinucleótido” u “oligonucleótido” pueden usarse aquí de manea intercambiable. Se refieren a polímeros de monómeros de nucleótido o análogos de los mismos, como ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) y combinaciones de los mismos. Los nucleótidos pueden ser genómicos, sintéticos o semi-sintéticos en origen. A menos que se establezca lo contrario, los términos abarcan estructuras de tipo de ácido nucleico con redes centrales sintéticas, así como productos de amplificación. Como apreciará un experto en la técnica, la longitud de estos polímeros (esto es, el número de nucleótidos que contiene) puede variar en gran medida, a menudo dependiendo de su función o uso planeado. Los polinucleótidos pueden ser lineales, lineales ramificados o moléculas circulares. Los polinucleótidos también tienen iones contadores asociados, como H+, NH4+, trialquilamonio, Mg+, Na+ y similares. Un polinucleótido puede estar compuesto completamente por deoxiribonucleótidos, completamente por ribonucleótidos, o mezclas quiméricas de los mismos. Los polinucleótidos pueden estar compuestos por nucleobase internucleótido y análogos de azúcar.

En algunas realizaciones, el término “oligonucleótido” aquí se usa para indicar un polinucleótido que comprende entre aproximadamente 5 y aproximadamente 150 oligonucleótidos, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 nucleótidos, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 75 oligonucleótidos, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50 nucleótidos. A lo largo de la especificaicón, siempre que un oligonucleótido esté representado por una secuencia de letras (elegidas, por ejemplo, de las cuatro letras base: A, C, G y T, que indican adenosina, citidina, guanosina y timidina, respectivamente), los olignucleótidos se representan en el orden 5’ y 3’ de izquierda a derecha. Una “secuencia de polinucleótido” se refiere a la secuencia de monómeros de nucleótido a lo largo del polímero. A menos que se indique lo contrario, siempre que se represente una secuencia de polinucleótido, se entenderá que los nucleótidos están en la orientación 5’ a 3’ de izquierda a derecha.

Los ácidos nucleicos, polinucleótidos y oligonucleótidos pueden estar compuestos por bases estándares de nucleótidos o sustituidos por análogos de isoforma de nucleótido, peor no limitarse a las bases iso-C e iso-G, que pueden hibridar más o menos permisiblemente que las bases estándares, y que hibridarán preferentemente con bases análogoas de isoforma compolementaria. Se describen muchas bases de isoforma, por ejemplo, por Benner et al. (1987) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52, 53-63. Los análogos de monómeros de nucleótido que ocurren de manera natural incluyen, por ejemplo, 7-dezaadenina, 7-dezaguanina, 7-deaza-8-azaguanina, 7-deaza-8azaadenina, 7-metilguanina, inosina, nebularina, nitropirrol (Bergstrom, J. Amer. Chem. Soc., 117:1201-1209 [1995], nitroindol, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hixopantina, pseudouridina, pseudocitosina, pseudoisocitosina, 5-propinilcitosina, isocitosina, isoguanina (Seela, patente de Estados Unidos Nº 6.147.199), 7deazaguanina (Seela, patente de Estados Unidos Nº 5.990.303), 2-azapurina (Seela, WO 01/16149), 2-tiopiridina, 6tioguaina, 4-tioltimina, 4-tiouracil, 0-6-metilguanina, N-6-metiladenina, O-4-metiltimina, 5,6-dihidrotimina, 5,6dihidrouracil, 4-metilindol, pirazolo[3,4-D]pirimidinas, “PPG” (Meter, patentes de Estados Unidos Nº 6.143.877 y Nº 6.127.121; Gall, WO 01/38584) y etenoadenina (Fasman (1989) En Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, págs. 385-394, CRC Press, Boca Raton, Fla.).

El término “3” se refiere a una región o posición en un polinucleótido u oligonucleótido 3’ (esto es, corriente abajo) desde otra región o posición en el mismo polinucleótido u oligonucleótido. El término “5’” Se refiere a una región o posición en un polinucleótido u oligonucleótido 5’ (esto es, corriente arriba) desde otra región o posición en el mismo polinucleótido u oligonucleótido. Los términos “final 3’” y “terminal 3’”, como aquí se usan en referencia a una molécula de ácido nucleico, se refieren al final del ácido nucleico que contiene un grupo hidroxilo libre unido al carbono 3’ del azúcar pentosa terminal. Los términos “final 5’” y “terminal 5’”, como aquí se usan en referencia a una molécula de ácido nucleico, se refieren al final del ácido nucleico que contiene un grupo hidroxilo libre unido al carbono 5’ del azúcar pentosa terminal. En algunas realizaciones de la invención, las pre-bases de oligonucleótido comprenden tractos de poli-adenosina en sus terminales 5’.

Diana: Como aquí se usa, el término “diana” se refiere a una molécula de interés.

Descripción detallada

La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos mejoradas para cuantificar la eficacia de ARNm para tapar. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para cuantificar la eficacia de ARNm para tapar en base a la generación de fragmentos tapados y no tapados, la separación de fragmentos tapados y no tapados mediante cromatografía, y la determinación de la cantidad relativa de fragmentos tapados y no tapados. En algunas realizaciones, los fragmentos tapados y no tapados pueden generarse poniendo en contacto una muestra de ARNm con un oligonucleótido de ADN complementario con una secuencia en la región no trasladada 5’ del ARNm adyacente a la penúltima base tapada o no tapada de ARNm bajo condiciones que permitan que el oligonucleótido de ADN se empareja con la secuencia; y selectivamente degradar híbrido de ADN/ARN y/o ARNm no emparejado por una o más nucleasas (por ejemplo, nucleasa S1, ARNasa H, y/u otra exonucleasa 5’). En algunas realizaciones, un método basado en cromatografía puede además separar ARNm tapado metilado y no metilado y determinar el estado de metilación y el porcentaje de ARNm tapado.

Varias realizaciones de la presente invención son útiles en la cuantificación de la eficiencia de para durante síntesis de ARNm in vitro. Así, la presente invención proporciona una importante técnica de control de calidad para la fabricación de ARNm y, en particular, para evaluar la seguridad, eficacia y viabilidad comercial de ARNms con aplicaciones terapéuticas.

En las siguientes secciones se describen varios aspectos de la invención. El uso de secciones no pretende limitar la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o” a menos que se establezca lo contrario.

Tapado y/o metilación ARNm

Típicamente, ARNm eucariótico tiene una estructura de “tapón” en su terminal 5’, que juega un importante papel en la traslación. Por ejemplo, el tapón juega un papel crucial en el metabolismo de ARNm, y se requiere variar los grados para el procesamiento y maduración de una transcripción de ARNm en el núcleo, transporte de ARNm desde el núcleo al citoplasma, estabilidad de ARNm y una eficiente traslación del ARNm a la proteína. La estructura de tapón de 5’ está incluida en el inicio de síntesis de proteína de ARNms celulares eucarióticos y virales eucarióticos y en el procesamiento y estabilidad de ARNm in vivo (véase, por ejemplo, Shatkin, A. J. CELL, 9: 645653 (1976); Furuichi, et al., NATURE, 266:235 (1977); FEDEREATION OF EXPERIMENTAL BIOLOGISTS SOCIETY LETTER 96: 1-11 (1978); Sonenberg, N., PROGR. NUC. ACID RES MOL BIOL, 35; 173-207 (1988)). Existen proteínas de enlace específico con tapón que son componentes de la maquinaria requerida para el inicio de traslación de un ARNm (véase, por ejemplo, Shatkin, A. J. CELL, 40: 223-24 (1985); Sonenberg, N., PROG. NUC. ACID RES MOL BIOL, 35; 173-207 (1988)). El tapón de ARNm se reconoce por el factor de inicio traslacional Eif4e (Gingras, et al, ANN. REV. BIOCHEM. 68: 913-963 (199); Rhoads, R. E., J. BIOL. CHEM. 274: 30337-3040 (1999)). La estructura de tapón de 5’ también proporciona resistencia a la actividad de exonucleasa 5’ y su ausencia da como resultado una rápida degradación del ARNm (véase, por ejemplo, Ross, J. MOL. BIOL. MED. 5:1-14 (1988); Green,

M. R. et al., CELL, 32: 681-694 (1983)): Ya que las transcripciones primarias de muchos genes celulares eucarióticos y genes virales eucarióticos requieren el procesamiento para retirar secuencias que intervienen (intrones) dentro de las regiones que codifican de estas transcripciones, el beneficio del tapón también se extiende a la estabilización de tal pre-ARNm.

In vitro, ARNs tapados han mostrado que se pueden trasladar de manera más eficiente que las transcripciones no tapadas en una variedad de sistemas de traslación in vitro, como lisado de reticulocito de conejo o sistemas de traslación de germen de trigo (véase, por ejemplo, Shimotohno, K., et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 74: 2734-2738 (1977); Paterson y Rosenberg, NATURE, 279: 692 (1979)). También se cree que este efecto se debe en parte a la protección de ARN de exorribonucleasas presente en el sistema de traslación in vitro, así como a otros factores.

Las estructuras de tapón que ocurren de manera natural comprende una guanosina 7-metil que se une por medio de un puente de trifosfato al extremo 5’ del primer nucleótido trascrito, dando como resultado un tapón dinucleótido de m7G(5’)ppp(5’)N, donde N es cualquier nucleósido. In vivo, el tapón se añade enzimáticamente. El tapón se añade en el núcleo y se cataliza mediante enzima guanilil transferasa. La adición del tapón al final de la terminal de 5’ de ARN ocurre inmediatamente después del inicio de la trascripción. El nucleósido terminal es típicamente una gunosina, y está en la orientación inversa a todos los demás nucleótidos, esto es, G(5’)ppp(5’)GpNpNp.

Una tapón común de ARNm producido mediante transcripción in vitro es m7G(5’)ppp(5’)G, que se ha usado como el tapón dinucleótido en la transciprción con T7 o SP6 ARN polimerasa in vitro para obtener ARNs que tienen una estructura de tapón en su terminal 5’. El método prevaleciente para la síntesis in vivo de ARNm tapado emplea un dinuclétido preformado de la forma m7G(5’)ppp(5’)G (“m7GpppG”) como un iniciador de la transcripción. Una desventaja de usar m7G(5’)ppp(5’)G, un dinucléotido pseudosimétrico, es la propensión de 3’-OH de cualquiera de las fracciones G o m7G para servir como nucleófilo iniciador para alargamiento transcripcional. En otras palabras, la presencia de un 3’-OH en cualquiera de las fracciones m7G y G lleva hasta a la mitad de ARNm incorporando

tapones en una orientación inadecuada. Esto lleva a la síntesis de dos ARNs isoméricos de la forma m7G(5’)pppG(pN)n y G(5’)ppp7G(pN)n, en proporciones aproximadamente iguales, dependiendo de las condiciones iónicas de la reacción de transcripción. Las variaciones en las formas isoméricas pueden afectar de manera negativa a la traslación in vitro y no son deseables para un producto terapéutico homogéneo.

Hasta la fecha, la forma usual de un tapón de dinucleótido sintético usado en experimentos de traslación in vitro es el Análogo de Tapón Anti-Inverso (“ARCA”), que es generalmente un análogo de tapón modificado donde el grupo 2’ o 3’ OH está sustituido por –OCH3. ARCA y los análogos de tapón triple-metilados se incorporan en la orientación delantera. La modificación química de m7G en cualquiera de los grupos 2’ o 3’ OH del anillo de ribosa da como resultado que el tapón se incorpore solamente en la orientación delantera, aunque el grupo 2’ OH no participe en el enlace de fosfodiéster. (Jemielity, J. et al., “Análogos de tapón nuevos anti-reverso con propiedades translaciones superiores”, RNA, 9: 1108-1122 (2003)). El procedimiento selectivo para metilación de guanosina en N7 y 3’ O-metilación y síntesis de 5’ difosfato se ha establecido (Kore, A. y Parmar, G. NUCLEOSIDES, NUCLEOTIDES AND NUCLEIC ACIDS, 25:337-340, (2006) y Kore, A. R. et al., NUCLEOSIDES, NUCLEOTIDES AND NUCLEIC ACIDS, 25(3): 307-14, (2006).

La transcripción de ARN normalmente comienza con un nucleósido trifosfato (normalmente una purina, A o G). La transcripción in vitro normalmente comprende una polimerasa de ARN fago con T7, T3 o SP6, una plantilla de ADN que contiene un promotor de polimerasa fago, nucleótidos (ATP, GTP, CTP y UTP), y un tampón que contiene sal de magnesio. La síntesis de ARN tapado incluye la incorporación de un análogo de tapón (por ejemplo, m7GpppG) en la reacción de transcripción, que en algunas realizaciones se incorpora mediante la adición de guanilil transferasa recombinante. El exceso de m7GpppG a GTP (4:1) aumenta la oportunidad de que cada transcripción tenga un tapón 5’. Kits para tapar ARNm transcrito in vitro están comercialmente disponibles, incluyendo KIT mMESSAGE mMACHINE® (Ambion, Inc., Austin, Tex). Estos kits producirán típicamente 80% de ARN tapado para 20% de ARN no tapado, aunque las producciones de ARN total son menores cuando la concentración de GTP se convierte en el índice que limita cuando se necesita GTP para el alargamiento de la transcripción. Sin embargo, actualmente no hay tecnología /método disponible que permite la cuantificación de la eficiencia para tapar sin alteraciones permanentes de ARNm en una muestra.

Los métodos para estimar la eficacia para tapar son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la polimerasa ARN T7 puede incubarse con un dinucleótido de tapón, los cuatro trifosfato de ribonucleótido, [α-32P]GTP, y una plantilla de ADN corta donde G es el primer ribonuclótidos especificado después del promotor (véase Grudzien, E. et al. “Análogos nuevos de tapón para síntesis in vitro de ARNm con alta eficacia de traslación” RNA, 10: 1479-1487 (204). Cualquier nucleótido en el lado 5’ de un residuo G adquiere un grupo 3’-fosfato con etiqueta 32P después de digestión T2 ARNasa mediante la transferencia del vecino más cercano. La cromatografía por intercambio de anión se usa después para resolver los 3’-nanofosfatos de nucleósido etiquetados, dando como resultado las posiciones internas en el ARN; desde los productos en terminal 5’. Los productos en terminal 5’ son de dos tipos. ARNs sin tapón producen guanosina etiquetada 5’-trifosfato 3’-monofosfato (p3Gp*; donde * indica el grupo de fosfato etiquetado). ARNs con tapón producen varias estructuras en terminal 5’, dependiendo de la naturaleza del tapón análogo usado (m7Gp3Gp* y Gp3 m7Gp* cuando el tapón análogo es m7Gp3G)

Sin embargo, un inconveniente principal de estos métodos es que la muestra entera se hace radiactiva o sino se destruye, y así no puede usarse en posteriores aplicaciones terapéuticas. Aunque en teoría una reacción de cuantificación separada puede realizarse junto a una reacción de síntesis terapéutica, tales disposiciones son inadecuadas. Las muestras simultaneas, pero separadas son inherentemente variables debido al error intra-operario y a las variaciones mínimas en las condiciones de la reacción. Esto se debe particularmente a las cuantificaciones que usan una curva estándar, donde un valor para un punto en la curva estándar en un día dado no puede ser el mismo que el del día siguiente. Para obtener resultados precisos en el cálculo da eficacia para tapar, es deseable usar una muestra representativa tomada de la reacción de síntesis terapéutica, una muestra para la que puede evaluarse una eficacia para tapar en relación con controles y que es representativas de la eficacia para tapar en la reacción de síntesis terapéutica.

Así, la presente invención proporciona métodos mejorados para cuantificar directamente la eficacia para tapar de ARNm en una muestra (por ejemplo, una muestra de alícuota representativas de una reacción de síntesis in vitro). Algunas realizaciones de la invención comprenden métodos cromatográficos de cuantificación de eficacia para tapar de ARNm. Estos métodos se basan en parte en los conocimientos de que la versatilidad de manipulación enzimática puede usarse para aumentar la resolución de separación cromatográfica de polinucleótidos. (FIG. 1). Así, mediante la amplificación de potencia de separación cromatográfica a través de manipulación enzimática, las realizaciones de la invención aumentan la eficacia, calidad y producción de cuantificación. Por ejemplo, no solamente pueden los métodos cromatográficos aquí descritos cuantificar la eficacia para tapar, sino que también pueden proporcionar información sobre la modificación del tapón (por ejemplo, estado de metilación en posiciones particulares del tapón). Así, las realizaciones de la invención pueden cuantificar simultáneamente la eficacia para tapar y la eficacia de las modificaciones del tapón (por ejemplo, eficacia de metilación). Esta cuantificación proporciona una importante caracterización de un producto fármaco de ARNm que tiene un impacto significativo en la producción de proteínas.

Las realizaciones cromatográficas de la invención pueden usarse para cuantificar cualquiera de la estructura de tapón y los análogos de tapón aquí descritos, así como varias modificaciones dentro de los tapones. Las realizaciones particulares utilizan la actividad biológica natural de nucleasas específicas para proporcionar información cuantitativa de eficacia para tapar y eficacia de metilación de la base guanina del tapón (por ejemplo, posición N-7). Las realizaciones adicionales pueden también cuantificar simultáneamente la metilación de la posición 2’-O del anillo de ribosa para la base penúltima (estructura Cap1, véase la FIG. 2). Las realizaciones de la invención pueden usarse para cuantificar la eficacia para tapar de una amplia variedad de especies de ARN, incluyendo ARNm trascrito in vitro, ARNm eucariótico aislado y ARN viral.

La manipulación enzimática se facilita a través del uso de un oligonucleótido de ADN complementario a una secuencia en la región 5’ no trasladada del ARN adyacente al tapón o a la base penúltima no tapada de ARNm. (FIG. 1). El oligonucleótido de ADN se añade a una muestra de ARNm que comprende ARNm tapado y ARNm no tapado bajo condiciones que permiten que el oligonucléotido de ADN se empareje con la secuencia especificada en la región no trasladada. Después se proporciona una nucleasa, que degrada selectivamente híbrido ADN/ARN y/o ARN no emparejado, dando como resultado fragmentos 5’ tapados y no tapados. (FIG. 1). En algunas realizaciones, al menos una parte del fragmento tiene doble hebra. En algunas realizaciones, la parte con doble hebra es al menos parcialmente un híbrido ARN:ARN. En algunas realizaciones, la parte con doble hebra es al menos parcialmente un híbrido ADN: ARN. Los fragmentos que resultan del tratamiento con nucleasa pueden ser con final desafilado o escalonado. En algunas realizaciones, los fragmentos tienen entre 2 y 20 nucleótidos (incluyendo un nucleótido tapón si está presente); esto es, fragmentos que resultan de tratamiento de nucleasa pueden tener 20 nucleótidos, 19 nucleótidos, 18 nucleótidos, 17 nucleótidos, 16 nucleótidos, 15 nucleótidos, 14 nucleótidos, 13 nucleótidos, 12 nucleótidos, 11 nucleótidos, 10 nucleótidos, 9 nucleótidos, 8 nucleótidos, 7 nucleótidos, 6 nucleótidos, 5 nucleótidos, 4 nucleótidos, 3 nucleótidos o 2 nucleótidos. En algunas realizaciones, los fragmentos tapados y no tapados no comprenden más de 5 bases de ARNm. En algunas realizaciones, los fragmentos tapados y no tapados no comprenden más de 2 bases del ARNm.

Los fragmentos tapados y no tapados después se resuelven (esto es, se separan uno del otro) mediante cromatografía. La cantidad de fragmentos tapados y no tapados puede después cuantificarse mediante técnicas de cromatografía cuantitativa, por ejemplo, integración de pico HPLC.

Las realizaciones de la invención no están limitadas por el tipo o tamaño de oligonucleótido de ADN. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende entre 10-80 nucleótidos; por ejemplo, 10 nucleótidos, 15 nucleótidos, 20 nucleótidos, 25 nucleótidos, 30 nucleótidos, 35 nucleótidos, 40 nucleótidos, 45 nucleótidos, 50 nucleótidos o más. El tamaño del oligonucleótido de ADN puede seleccionarse para generar un fragmento tapado (si está presente) del tamaño deseado. El oligonucleótido de ADN puede también estar diseñado para hibridar con cualquier región de la región 5’ no trasladada dependiendo de dónde se desee la división; esto es, puede estar posicionado dentro de la región 5’ no trasladada para producir un fragmento tapado (si está presente) de cualquier tamaño. En particular, un oligonucleótido adecuadamente diseñado que comprende una tramo pequeño de bases de ADN (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 nucleótidos) flanqueados por bases de ARN (por ejemplo, 1-15) en cada lado (esto es, “gapmer”) puede emparejarse con el analito de ARNm. El diseño de tal oligonucleótido para enlazarse con las bases complementar4ias de la región 5’ no trasladada del ARNm permite seleccionar la división por medio del reconocimiento del híbrido ADN/ARN de ARNasa H. Similarmente, un oligonucleótido adecuadamente diseñado puede comprender un tramo pequeño de bases de ADN (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 nucleótidos) flanqueados por bases de ARN (por ejemplo, 1-15).

En realizaciones preferentemente, el oligonucleótido está diseñado para enlazarse directamente adyacente al tapón y/o penúltima base de la construcción de ARN, permitiendo que las bases divididas resultantes consistan en las dos (o pocas) bases iniciales de la construcción de ARNm. Sin desear estar ligado a ninguna teoría particular, se cree deseable producir pequeños fragmentos tapados y no tapados con el fin de mejorar la resolución de la cromatografía; esto es, mejorar la separación de fragmentos tapados y no tapados y cuantificar cantidades relativas. Hablando en líneas generales, cuanto más pequeño sea el fragmento, mejores son la separación y cuantificación. En algunas realizaciones, la primera base del oligonucleótido de ADN se enlaza en la penúltima base de ARNm. En algunas realizaciones, la primera base del oligonucleótido de ADN se enlaza adyacente a la penúltima base de ARNm (esto es, en M de la fórmula 1). En algunas realizaciones, la primera base del oligonucleótido de ADN se enlaza al menos 2 nucleótidos, al menos 3 nucleótidos, al menos 4 nucleótidos, al menos 5 nucleótidos, al menos 6 nucleótidos, al menos 7 nucleótidos, al menos 8 nucleótidos, al menos 9 nucleótidos o al menos 10 nucleótidos desde la base penúltima de ARNm.

Las realizaciones de la invención no están limitadas por la identidad de la nucleasa. Puede usarse cualquier nucleasa capaz de dividir o digerir al menos una hebra de un híbrido ADN:ARN. Como se ha mencionado anteriormente, pueden usarse múltiples nucleasas en una única reacción para efectuar la producción de un fragmento tapado o producir tanto un fragmento tapado (si está presente) como un fragmento tapado con punta desafilada. En algunas realizaciones, una nucleasa adecuada es RNasa H o una enzima con actividad bioquímica del tipo de ARNasa H-. RNasas H son una familia de enzimas ubicuos que está dividida en dos subtipos filogenéticos distintos, Tipo 1 y Tipo 2, pudiéndose usar cualquiera de ellos en realizaciones particulares. Las

RNasas H están unificadas por la habilidad común para enlazar ARN de único hebra que se hibrida con ADN de única hebra complementario, y después degrada la parte de ARN del híbrido ARN:ADN. Mientras las RNasas H se han implicad en la réplica de ADN y la recombinación y reparación, sus papeles fisiológicos no se entienden por completo. In vitro, las enzimas también se enlazaron con ADN de doble hebra, ADNss, ARNss y ARNds, aunque con menores afinidades del enlace con híbridos ARN:ADN. Debido a la ubicuidad de la enzima, hay varias secuencias para RNasa H conocidas en la bibliografía, cada una de las cuales variandoo en sus secuencias de aminoácido. La patente de Estados Unidos Nº 5.268.289 desvela una RNasa H termoestable, como lo hace la patente de Estados Unidos Nº 5.500.370. La patente de Estados Unidos Nº 6.376.661 devela una RNasa humana H y composiciones y usos de la misma. La patente de Estados Unidos Nº 6.001.652 desvela una RNasa H humana de tipo 2. La patente de Estados Unidos Nº 6.071.734 desvela RNasa H de polimerasa HBV. Todas estas RNasas H pueden usarse en una o más realizaciones de la invención.

En algunas realizaciones, una nucleasa adecuada es nucleasa S1. En algunas realizaciones, se usan múltiples nucleasas; por ejemplo, RNasa H y una nucleasa S1. Las nucleasas adicionales que pueden utilizarse, solas o en combinación, en realizaciones de la invención incluyen Benzonase®, Nuclease P1, Fosfodiesterasa II, RNasa A, y RNasa T1. En algunas realizaciones comprenden además la adición de un nucleasa de ADN de única hebra para producir o modificar finalmente el fragmento. En algunas realizaciones, puede ser desearse calentar la muestra (por ejemplo, a aproximadamente 60 ºC) o aplicar la muestra a una columna cromatográfica calentada con el fin de efectuar la producción de los fragmentos tapados.

La muestra tratada con nucleasa se aplica después a una columna cromatográfica para separar fragmentos separados de no separados. Además de separar los fragmentos separados de los no separados, la cromatografía puede resolver y cuantificar un tapón metilado de un tapón de guanina no metilado. En algunas realizaciones, una base penúltima metilada (2’-O-base metilada) pueden separarse (resolverse) y cuantificarse de un tapón no metilado en esa posición. Los protocolos actuales de cromatografía pueden diferenciarse como tantas combinaciones de las especies que pueden surgir del proceso sintético in vitro. Más abajo se analizan varios aspectos de realizaciones cromatográficas.

Tapones ARNm

Los métodos inventivos aquí descritos están dispuestos a cuantificación de cualquier tipo de tapón de ARNm. En algunas realizaciones, el tapón tiene una estructura de la fórmula I:

donde B es una nucleobase, R1 se selecciona de un halógeno, OH y OCH3, R2 se selecciona de H, OH y OCH3, R3 es CH3, CH2CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3 o nulo, R4 es NH2, R5 se selecciona de OH, OCH3 y un halógeno, n es 1, 2 o 3 y M es un nucleótido, esto es, la tercera base de ARNm. En realizaciones particulares, B es guanina, pero puede ser cualquier nucleobase. En algunas realizaciones, el tapón es m7G(5’)ppp(5’)G donde un residuo 2’-O-metilo está presente en el grupo 2’ OH del anillo de ribosa de la base 1 (esto es, en la posición R5 de la Fórmula 1).

Los análogos del tapón pueden ser o comprender cualquier base “G” modificada (por ejemplo, uno o más nucleótidos de guanina modificados). Los análogos de tapón adecuados incluyen, pero no se limitan a, estructuras químicas seleccionadas del grupo consistente en m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; análogos de tapón no metilados (por ejemplo, GpppG); análogo de tapón dimetilado (por ejemplo, m2,7GpppG), análogo de tapón trimetilado (por ejemplo, m2,2,7GpppG), análogos de tapón simétricos dimetilados (por ejemplo, m7GpppG7G) o análogos de tapón anti inverso (por ejemplo, ARCA, m7,2’OmeGpppG, m7,2’dGpppG, m7,3’OmeGpppG, m7,3’dGpppG y sus derivados tetrafosfato) (véase, por ejemplo, Jemielity, J. et al. “Novel “anti-reverse” cap analogs with superior translational properties”, ARN, 9: 1108-1122 (2003)).

En una realización preferente, el tapón es un guanilato 7-metilo (“m7G”) unido por medio de un puente de trifosfato al extremo 5’ del primer nucleótido transcrito, dando como resultado m7G(5’)ppp(5’)N, donde N es cualquier nucleósido. Una realización preferente de un tapón m7G utilizado en realizaciones de la invención es m7G(5’)ppp(5’)G.

En algunas realizaciones, ARNm no está tapado. (FIG. 2A). ARNm no tapado puede estar presente en una muestra (esto es, como resultado de tapado incompleto en una reacción de transcripción in vitro) y/o puede usarse

un control para cuantificar el nivel de especies no tapadas en una muestra. En algunas realizaciones, el tapón tiene una estructura Cap0 (FIG. 2B). La estructura Cap0 carece de un residuo 2’-O-metilo de la ribosa unido a las bases 1 y 2. En algunas realizaciones, el tapón tiene una estructura Cap1. (FIG. 2C). Las estructuras Cap1 tiene un residuo 2’-O-metil en la base 1. En algunas realizaciones, el tapón tiene una estructura Cap2. Las estructuras Cap2 tienen un residuo 2’-O-metilo unido a ambas bases 1 y 2.

En la técnica son conocidos una variedad de análogos de tapón m7G, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Estos incluyen el m7GpppG descrito anteriormente, así como los análogos de tapón ARCA, 3’-OCH3 y 2’-OHC3 (Jemielity, J. et al., RNA, 9: 1108-1122 (2003)). Los análogos de tapón adicionales para su uso en realizaciones de la invención incluyen análogos de tetrafosfato dinucleósido bencilados N7 (descritos en Grudzien, E. et al, RNA, 10: 1479-1487 (2004)), análogos de tapón de fosforotioato (descritos en Grudzien-Nogalska, E., et al., ARN, 13: 1745-1755 (2007)), y análogos de tapón (incluyendo análogos de tapón biotinilado) descritos en las patentes de Estados Unidos Nº 8.093.367 y 8.304.529.

Producción de ARNm tapados

Los ARNm tapados para los métodos cuantitativos aquí desvelados pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica.

En algunas realizaciones, ARNm tapado se produce mediante transcripción in vitro, originalmente desarrollada por Krieg y Melton (METHODS ENZYMOL., 1987, 155: 397-415) para la síntesis de ARN usando una polimerasa fago de ARN. Típicamente estas reacciones incluyen al menos una polimerasa fago ARN (T7, T3 o SP6), una plantilla de ADN que contiene un promotor de polimerasa fago, nucleótidos (ATP, CTP, GTP y UTP), y un tampón que contiene una sal de magnesio. Las producciones de síntesis se ARN pueden optimizase aumentando las concentraciones de nucleótido, ajustando las concentraciones de magnesio e incluyendo pirofosfatasa inorgánica (Patente de Estados Unidos Nº 5.256.555; Gurevich, et al., ANAL. BIOCHEM. 195: 207-213 (1991); Sampson, J. R. y Uhlenbech, O. C., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 85, 1033-1037 (1988); Wyatt, J. R. et al., BIOTECHNIQUES, 11: 764-769 (1991). Algunas realizaciones utilizan kits comerciales para síntesis a gran escala de transcripciones in vitro (por ejemplo, MEGAscript®, Ambion). El ARN sintetizado en estas reacciones se caracteriza normalmente por un nucleótido en terminal 5’ que tiene un trifosfato en la posición 5’ de la ribosa. Típicamente, dependiendo de la combinación de polimerasa de ARN y promotor usada, este nucleótido es una guanosina, aunque puede ser una adenosina (véase, por ejemplo, Coleman, T. M., et al., NUCLEIC ACIDS RES.,

32: e14 (2004). En estas reacciones, los cuatro nucleótidos se incluyen típicamente en concentraciones equimolares y ninguno de ellos es limitativo.

Algunas realizaciones de la invención son reacciones de lote, esto es, todos los componentes se combinan y después se incuban a aproximadamente 37 ºC para promover la polimerización del ARN hasta que la reacción termina. Típicamente, una reacción de lote se usa por conveniencia y para obtener tanto ARN como sea necesario a partir de tales reacciones para los experimentos. En algunas realizaciones, se usa un sistema “de lote alimentado” (véase, por ejemplo, JEFFREY A. KERN, BATCH AND FED-BATCH STRATEGIES FOR LARGE-SCALE PRODUCTION OF RNA IN VITRO TRANSACTION (Universidad de Colorado) (1997) para aumentar la eficacia de la reacción de transcripción in vitro. Todos los componentes se combinan, pero después se añaden cantidades adicionales de algunos de los reactivos conforme avanza el tiempo, como nucleótidos y magnesio, para intentar mantener condiciones constantes de reacción. Además, en algunas realizaciones, el pH de la reacción puede mantenerse en 7,4 controlándolo con el paso del tiempo y añadiendo KOH cuando sea necesario.

Para sintetizar un ARN tapado mediante transcripción in vitro, un análogo de tapón (por ejemplo, N-7 metil GpppG; esto es, m7GpppG) se incluye en la reacción de transcripción. En algunas realizaciones, la polimerasa de ARN incorporará el análogo de tapón tan fácilmente como cualquiera de los otros nucleótidos; esto es, no hay preferencia para el análogo de tapón. En algunas realizaciones, el análogo de tapón se incorporará en la terminal 5’ mediante la enzima guanilil transferasa. En algunas realizaciones, el análogo de tapón se incorporará solamente en la terminal 5’ porque no tiene un 5’ trifosfato. En algunas realizaciones, que usan una polimerasa T7, T3 y SP6 ARN, el nucleótido +1 de sus respectivos promotores es normalmente un residuo G y si tanto GTP como m7GpppG están presentes en concentraciones iguales en la reacción de transcripción, entonces cada uno tiene la misma oportunidad de incorporarse en la posición +1. En algunas realizaciones, m7GpppG está presente en estas reacciones en concentraciones mayores en varias veces que GTP para aumentar las posibilidades de que una transcripción tenga un tapón 5’. En algunas realizaciones, se usa un kit mMESSAGE mMACHINE® (Cat. #1344, Ambion, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, donde se recomienda que la proporción de tapón con GTP sea 4:1 (6 mM: 1,5 mM). En algunas realizaciones, cuando la proporción del análogo del tapón con GTP aumenta en la reacción, la proporción de ARN tapado con no tapado aumenta proporcionalmente. Las consideraciones de la eficacia para tapar deben equilibrarse con consideraciones de producción. El aumento de la proporción de análogo de tapón con GTP en la reacción de transcripción produce menores producciones del ARN total debido a que la concentración de GTP se vuelve limitativa cuando tiene la concentración total de tapón y GTP constante. Así, la producción final de ARN depende de la concentración de GTP, que es necesaria para el alargamiento de la transcricpión. Los otros nucleótidos (ATP, CTP, UTP) están presentes en exceso.

En realizaciones particulares, ARNm se sintetiza mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmido que codifica un gen de elección. En algunas realizaciones, la transcripción in vitro incluye la adición de una estructura de tapón 5’, Cap1 (Figura 2C) que tiene un residuo 2’-O-metilo en el grupo 2’OH del anillo de ribosa de base 1, mediante conjugación enzimática de GTP por medio de guanilil transferasa. En algunas realizaciones, la transcripción in vitro incluye la adición de una estructura de tapón 5’, Cap0 (Figura 2B), que carece del residuo 2’-O-metilo, mediante conjugación enzimática de GTP por medio de guanilil transferasa. En algunas realizaciones, la transcripción in vitro incluye la adición del tapón 5’ de cualquiera de las estructuras de tapón aquí desveladas mediante conjugación enzimática de GTP por medio de guanilil transferasa. En algunas realizaciones, una cola de 3’ poli(A) de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud (como lo determina la electroforesis de gel) se incorporó a través de la adición de ATP junto con la polimerasa PolyA. En algunas realizaciones, la cola poli(A) tiene aproximadamente 100-250 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la cola poli(A) tiene aproximadamente 50-300 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, los productos de transcripción in vitro incluyen regiones no trasladadas 5’ y 3’.

Separación cromatográfica

Las realizaciones de la invención utilizan cromatografía para proporcionar fragmentos tapados y no tapados altamente resueltos (por ejemplo, con resolución de base sencilla). Los fragmentos pueden resolverse de manera eficiente mediante cromatografía de capa fina (“LTC”) o cromatografía líquida de alta eficacia (“HPLC”). En el contexto de la presente invención, el término “HPLC” incluye varios métodos HPLC así como métodos de cromatografía líquida de presión baja o normal, que pueden usarse para realizar algunas realizaciones de la invención. En algunas realizaciones, los fragmentos pueden resolverse mediante una o más de cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía líquida de alta eficacia (SEC-HPLC) y/o cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) (por ejemplo, usando columnas de sílice unido a octadecilo (C18), y realizada en un pH ácido con TFA como un ion contador). En algunas realizaciones de la invención, el pico principal en la cromatografía es los fragmentos de ARNm tapados. Los parámetros que pueden alterarse u optimizarse para aumentar la resolución incluyen condiciones de gradiente, modificador orgánico, ion contador, temperatura, tamaño de poro de columna y tamaño de partícula, composición de disolvente y velocidad de flujo.

Los métodos cuantitativos aquí descritos pueden incluir una o más etapas de cromatografía por intercambio de ion-HPLC (por ejemplo, intercambio de anión-HPLC y/o intercambio de catión-HPLC). Como será bien conocido por aquellos expertos en la técnica, los intercambiadores de ion (por ejemplo, intercambiadores de ion y/o intercambiadores de catión) pueden basarse en varios materiales con respecto a la matriz, así como los grupos cargados unidos. Por ejemplo, pueden usarse las siguientes matrices, donde los materiales pueden ser más o menos entrecruzado: con base de agarosa (como Sepharose™ CL-6B, Sepharose™ Fast Flow y Sepharose™ High Performance), con base de celulosa (como DEAE Sephacel®), con base de dextrano (como SEPHADEX®), con base de sílice y con base de polímero sintético.

La resina de intercambio de ion puede prepararse de acuerdo con métodos conocidos. Típicamente, un tampón de equilibrio, que permite que la resina se una a sus iones contadores, puede pasar a través de la resina de intercambio de ion antes de cargar la muestra o composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes en la resina. Convenientemente, el tampón de equilibrio puede ser el mismo que el del tampón de carga, pero no es necesario. En una realización opcional de la invención, la resina de intercambio de ion puede regenerarse con un tampón de regeneración después de la elución del polipéptido, de manera que la columna pueda reusarse. En general, la concentración de sal y/o pH del tampón de generación pueden ser tales que sustancialmente todos los contaminantes y el polipéptido de interés se eluyan de la resina de intercambio de ion. En general, el tampón de regeneración tiene una alta concentración de sal para eluir contaminantes y fragmentos de la resina de intercambio de ion.

Algunas realizaciones de la invención incluyen, por ejemplo, someter a muestra a cromatografía de intercambio de anión. Los análisis de alta resolución de fragmento de nucleótido pueden realizarse como se describe en Ausser, W. A., et al., “Análisis de alta resolución y purificación de nucleótidos sintéticos con HPLC fuerte de intercambio de anión”, BIOTECHNIQUES, 19: 136-139 (1995), aquí incorporado como referencia. Para la resina de intercambio de anion, los grupos cargados que están covalentemente unidos a la matriz pueden ser, por ejemplo, dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE), y/o amonio cuaternario (Q). En algunas realizaciones, la resina de intercambio de anión empleada es una columna Q Sepharose. La cromatografía de intercambio de anión puede realizarse, por ejemplo, usando por ejemplo Q Sepharose™ Fast Flow, Q Sepharose™ High Performance, Q Sepharose™ XL, Capto™ Q, DEAE, TOYOPEARL Gigacap® Q, Fractogel® TMAE (trimetilaminoetilo, una resina de amonio cuaternario), Eshmuno™ Q, Nuvia™ Q, or UNOsphere™ Q. Pueden usarse otros intercambiadores de anión dentro del alcance de la invención, incluyendo, aunque sin limitar a, resinas de amina cuaternaria, o "Q-resinass" (por ejemplo, Capto™-Q, Q-Sepharose®, QAE Sephadex®); resinas de dietilaminaminoetano (por ejemplo, DEAE-Trisacryl®, DEAE Sepharose®, DEAE benzoilatado naftoilatado, dietilaminoetilo Sephacel®); resinas Amberjet®; resinas Amberlyst®; resinas Amberlite® (e.g., Amberlite® IRA-67, Amberlite® fuertemente básica, Amberlite® débilmente básica), resina de colestiramina, resinas ProPac® (por ejemplo ProPac® SAX-10, ProPac® WAX-10, ProPac® WCX-10); resinas TSK-GEL® (por ejemplo TSKgel DEAE-NPR; TSKgel DEAE-5PW); y resinas Acclaim®.

Las fases móviles típicas para cromatografía de intercambio aniónico incluyen soluciones relativamente polares, como agua, acetonitrilo, alcoholes orgánicos como metanol, etanol e isopropanol o soluciones que contienen 2-(N-morfolino)-ácido etanosulfónico (MES). Así, en ciertas realizaciones, la fase móvil incluye aproximadamente 0%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o aproximadamente 100% de solución polar. En ciertas realizaciones, la fase móvil comprende desde aproximadamente 1% a aproximadamente 100%, desde aproximadamente 5% a aproximadamente 95%, desde aproximadamente 10% a aproximadamente 90%, desde aproximadamente 20% a aproximadamente 80%, desde aproximadamente 30% a aproximadamente 70%, desde aproximadamente 40% a aproximadamente 60% de solución polar en cualquier tiempo dado durante el curso de la separación.

En algunas realizaciones, las muestras se someten a cromatografía por intercambio de catión, por ejemplo, cromatografía por intercambio de catión sulfopropilo (SP). En una realización típica, la cromatografía por intercambio de catión comprende cromatografía por intercambio de catión sulfopropilo (SP), pero pueden usarse otras membranas o resinas de cromatografía de catión, por ejemplo, una membrana MUSTANG™S, una resina S-Sepharose™, o una resina Blue Sepharose™. La cromatografía por intercambio de catión puede realizarse a una temperatura óptima para mejorar el enlace diana y/o reducir el enlace con impurezas.

En algunas realizaciones, las muestras se someten a cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). La cromatografía de interacción hidrofóbica utiliza la atracción de una molécula dada a un medio polar o no polar, y en términos de ácido nucleico, esta propensión está gobernada por la hidrofobicidad o hidrofilicidad de nucleótidos y modificaciones en los mismos. Así, los ácidos nucleicos se fraccionan en base a sus varios grados de atracción a una matriz hidrofóbica, típicamente un soporte inerte con brazos enlace de alquilo de 2-18 carbonos en longitud de cadena. La fase inmóvil consiste en pequeños grupos no polares (butio, octilo o fenilo) unidos a una red central de polímero hidrofílico (por ejemplo, Sepharose™ entrecruzada, dextrano o agarosa). En algunas realizaciones, la cromatografía de interacción hidrofóbica incluye cromatografía de fenilo. En otras realizaciones, la cromatografía de interacción hidrofóbica incluye cromatografía de butilo o cromatografía de octilo.

En algunas realizaciones, los fragmentos se resuelven mediante HPLC en fase inversa. HPLC en fase inversa consiste de una fase inmóvil no polar y una fase móvil moderadamente polar. En algunas realizaciones, la fase inmóvil es una sílice que se ha tratador, por ejemplo, con RMe2SiCl, donde R es un grupo de alquilo de cadena recta como C18H37 o C8H17. El tiempo de retención es por lo tanto más largo para las moléculas que son más no polares por naturaleza, lo que permite que las moléculas polares se eluyan más rápidamente. El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y ser reduce con la adición de disolvente más hidrofóbico. Las características de la molécula de ARN específica como un analito pueden jugar un papel importante en sus características de retención. En general, un analito que tiene grupos funcionales no polares (por ejemplo, grupo de metilo) da como resultado un tiempo de retención más largo porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula. Los protocolos para alta resolución de especies de ARN que usan HPLC en fase inversa, que pueden adaptarse para uso en realizaciones de la invención, son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, publicación pre-concesión de Estados Unidos 2010/0048883; Gilar, M., “Análisis y purificación de oligonucleótidos en fase inversa mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa con selección de fotodiodo y espectrometría de masa”, ANAL. BIOCHEM., 298: 196-206 (2001).

Las realizaciones particulares de la invención utilizan combinaciones de las varias separaciones cromatográficas aquí descritas. Por ejemplo, las realizaciones particulares de la invención pueden utilizar cromatografía con pares de ion en fase inversa, por lo que las separaciones se basan en hidrofobicidad y en el número de aniones asociados con la molécula, que pueden usarse para purificar fragmentos en una única fase de HPLC. Las matrices pueden tener base de sílice (por ejemplo, Murray et al, ANAL. BIOCHEM. 218: 177-184 (1994)). Las resinas no porosas de polímero inerte pueden usarse en realizaciones particulares (véase, por ejemplo, Huber,

C. G., “Cromatografía líquida de alta resolución de oligonucleótidos en copolímeros no porosos alquilados estirenodivinilbenceno”, ANAL. BIOCHYEM., 212: 351-358 (1993)). Otras combinaciones pueden ser igualmente efectivas y deben evaluarse en términos del tamaño del fragmento y las modificaciones que se busquen resolver.

En algunas realizaciones, el perfil de eficacia para tapar y/o el perfil de metilación pueden determinarse mediante cromatografía de intercambio de anión fuerte usando un sistema HPLC. En general, ARNm no tapado se adsorbe en la carga fija positiva de una columna de intercambio de anión fuerte y un gradiente de fuerza iónica en aumente que usa una fase móvil a una velocidad de flujo predeterminada eluye las especies tapadas (la tapa que tiene una carga positiva) desde la columna en proporción con la fuerza de su interacción iónica con la columna positivamente cargada. Las especies no tapadas con carga más negativa (más ácidas) se eluyen más tarde que las especies tapadas con carga menos negativa (menos ácidas).

En ciertas realizaciones, los fragmentos tapados se caracterizan por el perfil de metilación asociada con el fragmento. Típicamente, los perfiles de metilación reflejan y cuantifican la eficacia de metilación de la base de guanina del tapón (posición N-7). Las realizaciones adicionales pueden también cuantificar simultáneamente la metilación de la posición 2’-O del anillo de ribosa para la penúltima base (estructura Cap1). En algunas realizaciones, un perfil de metilación puede determinarse realizando HPLC en fase inversa, sola o en combinación

con cromatografía de intercambio de ion. En algunas realizaciones, un “perfil de metilación” se refiere a un conjunto de valores que representan la cantidad de fragmento tapado metilado que se eluye de una columna en un punto en el momento después de la adición a la columna de una fase móvil. Como se ha descrito anteriormente, el tiempo de retención para tapones metilados y penúltimos nucleótidos, que son más no polares por naturaleza, aumenta en relación con moléculas polares, que eluyen más fácilmente. El tiempo de retención puede aumentar por la adición de un disolvente polar a la fase móvil y reducirse por la adición de un disolvente más hidrofóbico.

En algunas realizaciones, la cromatografía líquida de ultra alta resolución (“UPLC”) se usa para resolver fragmentos tapados y no tapados, y opcionalmente para proporcionar información cuantitativa adicional sobre estados de metilación. UPLC generalmente se refiere a técnicas de HPLC que usan tamaños de partícula de resina inferiores a aproximadamente 2,5 µm, que proporciona una significativa adquisición en eficacia incluso a mayores velocidades de flujo y a velocidades lineales. Al usar partículas pequeñas, la capacidad de velocidad y pico (número de picos resueltos por unidad de tiempo) pueden extenderse. Tales técnicas utilizan principios cromatográficos para realizar separaciones usando columnas empaquetadas con partículas más pequeñas y/o mayores velocidades de flujo para mayor velocidad, con resolución y sensibilidad superiores. (véase, por ejemplo, Swartz, M. E., “Cromatografía líquida de ultra alta resolución (UPLC): una introducción”, SEPARATION SCIENCE REDEFINED (2005)).

En ciertas realizaciones, la resolución cromatográfica (por ejemplo, HPLC) puede combinarse con espectrometría de masa (“MS”). Los métodos LC-MS son conocidos en la técnica para separación e identificación de oligonucleótidos usando tampones acuosos trietilamonio-hexafluoroisopropilalcohol (TEA HFIP) compatibles con detección de MS (Apffel, A. et al. “Nuevo procedimiento apra el uso de HPLC-ESI MS para el análisis de nucleótidos y oligonucleótidos”, J. CHROMATOGR. A, 777: 3-21 (1997)). Alternativamente, puede usarse una fase móvil de trietilamonio bicarbonato para la separación de oligonucleótidos con la adición de acetonitrilo post-columna al eluyente. El tampón que se empareja con ion pueden elegirse para dar la mejor sensibilidad de detección de MS.

El análisis cuantitativo de fragmentos tapados también puede realizarse usando columna HPLC en fase inversa empaquetada con 2,5 µm de sorbente C18 completamente poroso, como se describe en Gilar, M., ANAL. BIOCHEM., 298: 196-206 (2001). Los parámetros que pueden optimizarse para mejorar la transferencia de masa de oligonucleótidos en la fase inmóvil incluyen temperatura elevada, tamaño pequeño de partícula de sorbente, y velocidad de flujo lenta en fase móvil. Puede usarse un tampón de trietilamonio acetato (TEAA) con detección de UV y una fase móvil optimizada de TEA-HFIP para la separación de LC-MS y la caracterización de fragmentos tapados.

En algunas realizaciones, la cuantificación de fragmentos tapados y el estado de metilación de los mismos se consiguen mediante integración automatizada de la respectiva área pico en la cromatografía HPLC. Los datos pueden presentarse como valor porcentual de área, que se refiere al porcentaje de un área de pico integrada de la especie particular en relación con el área de pico integrada total de todo el cromatógrafo.

En algunas realizaciones, la cuantificación de fragmentos tapados y no tapados puede conseguirse a través de otros métodos apropiados, por ejemplo, detección basada en espectrometría de masa (MS). Se contempla que un experto en la técnica puede reconocer métodos aplicables adicionales para cuantificar fragmentos tapados y no tapados como aquí se describe.

Kits

La presente divulgación proporciona además kits que comprenden varios reactivos y materiales útiles para realizar los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención. Los procedimientos cuantitativos aquí descritos pueden realizarse en laboratorios de diagnóstico, laboratorios experimentales, o laboratorios comerciales. La divulgación proporciona kits que pueden usarse en estos diferentes escenarios.

Por ejemplo, lo materiales y reactivos para cuantificar la eficacia para tapar de ARNm en una muestra de ARNm mediante manipulación enzimática y separación cromatográfica pueden montarse juntos en un kit. En ciertas realizaciones, un kit inventivo comprende columnas cromatográfica y opcionalmeten agentes para separar fragmentos tapados de ARNm en la columna, e instrucciones de uso del kit de acuerdo con un método de la invención.

Cada kit comprende preferentemente el reactivo que representa el procedimiento específico. Así, para detectar/cuantificar la eficacia para tapar de ARNm, los kits pueden comprender un reactivo de ácido nucleico de secuencia diseñada que se empareja específicamente adyacente a un tapón de ARNm de una diana. Los kits también pueden comprender nucleasas para la producción de los fragmentos tapados; por ejemplo, RNasa H y/o S1 nucleasa. Los kits pueden además incluir transcripción in vitro y reactivos para tapar, enzimas e instrucciones para usar los mismos.

Los kits u otros artículos de fabricación de acuerdo con la invención pueden incluir uno o más recipientes para contener varios reactivos. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas (por

ejemplo, jeringas pre-llenadas), ampollas. El recipiente puede estar formado por una variedad de materiales tales como cristal o plástico.

Los kits de la presente divulgación pueden incluir niveles adecuados de control o muestras de control para

5 determinar los niveles de control como aquí se describe. En algunas realizaciones, los kits de la invención pueden incluir instrucciones para usar el kit de acuerdo con uno o más métodos de la invención y pueden comprender instrucciones para transcripción in vitro y tapar.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Síntesis de ARNm

ARN de luciferasa de luciérnaga (FFL) y eritropoyetina humana (EPO) se sintetizaron mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN de plásmido que codificaba cada respectivo gen. La transcripción in

15 vitro incluyó la adición de una estructura 5’, Cap1, que tiene un residuo de metilo 2’-O-en el grupo 2’ OH del anillo de ribosa de base 1, mediante conjugación enzimática de GTP a través de guanilil transferasa. Una cola 3’ poli(A) de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud (como lo determina la electroforesis de gel) se incorporó a través de la adición de ATP junto con polimerasa PolyA (véase las condiciones de reacción detalladas más abajo). El producto de la transcripción in vitro incluyó las regiones no trasladadas 5’ y 3’, que están representadas como X e Y, respectivamente, en las secuencias más abajo.

ARNm de eritropoyetina humana (EPO) (SEQ ID NO: 1)

ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) optimizada con codón (SEQ ID NO: 2).

Las secuencias UTR 3’ y 5’ para X1/Y1 y X2/Y2 fueron las siguientes:

55 La síntesis de ARNm se realizaó bajo condiciones completas libres de ARNasa. Todos los tubos, viales, puntas de pipetas, tampones, etc., se necesitaron libres de nucleasa. ARN mensajero se sintetizó de una plantilla de ADN alineada. Para producir la construcción precursora de ARNm deseada (IVT), se preparó una mezcla de ≈ug de ADN alineado, rNTPs (3,33 mM), DTT (10 mM), polimerasa ARN T7, inhibidor de ARNasa, pirofosfatasa y tampón de reacción (10x, 800mM Hepes ) (pH 8,0), 20 mM Espermidina, 250mM MgCl2, pH 7,7) con agua libre de RNasa hasta un volumen final de 2,24 ml. La mezcla de la reacción se incubó a 37 ºC durante entre 20-120 minutos. Después de la finalización, la mezcla se trató con DNasa I durante 15 minutos adicionales y se enfrió como correspondió.

El producto de ARNm purificado de la etapa IVT anteriormente mencionada se desnaturalizó aa 65 ºC 65 durante 10 minutos. Por separado, partes de GTP (20 mM), S-adenosil metionina, inhibidor de ARNasa, 2’-O

metiltransferasa y guanilil transferasa se mezclan juntos con el tampón de reacción (10x, 500mM Tris-HCl (pH 8,0), 60mM KCl, 12,5mM MgCl2) hasta una concentración final de 8,3 ml. Después de la desnaturalización, el ARNm se enfrió en hielo y después se añadió a la mezcla de reacción. La solución combinada se incubó a 37 ºC durante 20-90 minutos. Después de su finalización, se añadieron las alícuotas de ATP (20mM), polimerasa PolyA y el tampón de reacción de cola (10x, 500mM Tris-HCl (pH 8,0) 2,5M NaCl, 100mM MgCl2), y la mezcla de reacción total se incubó más a 37 ºC durante aproximadamente 20-45 minutos. Después de su finalización, la mezcla de reacción final se enfrió y se purificó como correspondía.

Ejemplo 2: Cuantificación cromatográfica de la eficacia para tapar

Este ejemplo demuestra la cuantificación cromatográfica de tapar, así como la metilación. Específicamente, se diseña un oligonucleótido de ADN con veinte bases y se sintetiza para ser complementario a 5’UTR de un ARNm tapado sintetizado in vitro, enlazándose específicamente dentro de una o dos bases desde el tapón 5’, y preferentemente enlazándose adyacente al penúltimo del ARNm (esto es, en el tercer nucleótido desde el extremo 5’, cuyos dos últimos nucleótidos son nucleótidos tapón). El enlace del oligonucleótido de ADN en el 5’ UTR adyacente al tapón establece una región bien definida de híbrido ADN:ARN que es susceptible de división mediada por ARNasa H. En algunas realizaciones, el oligonucleótido de ADN está flanqueado en cada extremo por 1-15 nucleótidos de ARN. En algunas realizaciones, el oligonucleótido de ADN está flanqueado en el extremo 30 por 1-15 nucleótidos de ARN.

ARNasa H se añade a una solución muestra de ARN que comprende ARNm sintetizado in vitro hibridado. El ARNasa H divide el ARNm tapado sintetizado in vitro en la región del híbrido ADN:ARN, produciendo de este modo un fragmento tapado. En ciertas realizaciones, esta división se realiza usando una nucleasa S1 u otra nucleasa para crear un fragmento con extremo desafilado marcado en el extremo 5’ por el tapón de analitos de elección. El fragmento tiene preferentemente una longitud de 2-10 nucleótidos, incluyendo los nucleótidos del tapón. En general, esto proceso proporciona una molécula más pequeña con una mayor resolución de la presencia del tapón y la modificación del tapón.

Después de la división, la solución de ARN se carga en una columna cromatográfica adecuada para análisis cuantitativo de ARN tapado versus no tapado. En una realización ejemplar, la columna es una columna HPLC de intercambio de anión, y los fragmentos se purifican mediante adaptación de métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Wincott, F. et al, “Síntesis, desprotección, análisis y purificación de ARN y ribozimas), NUCLEIC ACIDS RES 23: 2677-2684 (1995); Anderson, A. C., et al, “Purificación HPLC de ARN para cristalografía y NMR”. ARN, 2; 110-117, (1996)). La cantidad de fragmentos tapados en la muestra se determina integrando picos cromatográficos correspondientes a las especies tapadas y no tapadas. Los datos pueden proporcionarse en forma de ára de pico o proporción de área de pico tapada con no tapada.

Actualmente, usando mismo método para análisis se evalúa la metilación porcentual del tapón de guanina en la posición N-7. Incluso más, cuando se sintetiza un diseño de estructura “Cap 1”, se pueden separar especies que se metilan en la posición 2’-O del anillo de ribosa de la penúltima base (FIG. 2). La medición de nucleótidos metilados por HPLC puede conseguirse mediante una variedad de métodos, incluyendo los métodos que incorporan detección electroquímica; véase, por ejemplo, Park y Ames (PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 85: 7467-7479 (1988)). Esta metodología proporciona una potente combinación de evaluaciones de tapón cuantitativo, así como evaluación de metilación cuantitativa.

Ejemplo 3: Evaluación de tapón ARNm 5’ o producción de proteína in vivo

En este ejemplo, evaluamos el impacto de tapón de ARNm 5’ o producción de proteína in vivo y su impacto potencial en la eficacia de terapia basada en ARNm. Específicamente, evaluamos el impacto de tapón de 5’ en la producción in vivo de alfa-galactosidasa A (alfa-Gal A), que es deficiente en la enfermedad de Fabry. La enfermedad de Fabry es una enfermedad de almacenamiento lisosómico hereditaria ligada al cromosoma X caracterizada por discapacidad severa renal, angioqueratomas y anomalías cardiovasculares, incluyendo aumento ventricular e insuficiencia de la válvula mitral. La enfermedad de Fabry también afecta al sistema nervioso periférico, provocando episodios de agonía y dolor punzante en las extremidades. La enfermedad de Fabry está causada por una deficiencia en la enzima alfa-galactosidasa A (alfa-Gal A). Alfa-Gal A es la glicohidrolasa lisosómica que divide las fracciones de la terminal alfa-galactosil de varios glicoconjugados. La enfermedad de Fabry da como resultado un bloqueo del catabolismo del glicosfingolípido neutral, ceramida tirhexosida (CTH), y acumulación de este sustrato de enzima dentro de las células en el flujo sanguíneo.

El cADN y el gen que codifica alfa-Gal A humano, GLA, se han aislado y secuenciado. Alfa-Gal A humano se expresa como un polipéptido de 429 aminoácidos, de los cuales los 31 aminoácidos de terminal N son el péptido señal. La enzima humana se ha expresado en células de ovario de hámster chino (CHO) (Desnick et al., patente de Estados Unidos Nº 5.356.804; Ioannou et al, J. CELL BIOL., 119: 1137 (1992)); y células de insecto (Calhoun et al., WO 90/11353).

Los individuos que sufren de enfermedad de Fabry pueden ser tratados mediante terapia de sustitución de enzima por alfa-Gal A humano (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos Nº 6.458.574, incorporada aquí como referencia). Técnicas adicionales que modulan o complementan la deficiencia de expresión de Alfa-Gal A, y así mejorar la deficiencia subyacente, serán útiles en el desarrollo de terapias apropiadas para trastornos asociados.

5 Tales técnicas incluyen métodos de administración intracelular de ácidos nucleicos (por ejemplo, GLA ARNm) que son capaces de corregir los defectos genéticos existentes y/o proporcionar funciones beneficiosas a una o más células diana. Después de la administración exitosa a tejidos y células diana, las composiciones y los ácidos nucleicos realizan una transfección de la célula diana y los ácidos nucleicos (por ejemplo, GLA ARNm) puede trasladarse al producto genético de interés (por ejemplo, alfa-GAL A) o de otra manera puede modular/regular la presión o expresión del producto genético de interés. Tales métodos se han descrito previamente; véase, por ejemplo, publicación pre-concesión de Estados Unidos 2011/0244026.

En este ejemplo, evaluamos el impacto del tapón 5’ en la producción de proteínas in vivo. GLA ARNm humano se sintetizó mediante transcripción in vivo a partir de una plantilla de ADN de plásmido que codificaba un

15 gen, que fue seguido de la adición de una estructura de tapón 5’, bien Cap0 o Cap1 (Fechter, P. et al., J. GEN. VIROLOGY, 86: 1239-1249 (2005)). También se añadió una cola 3’ poli(A) de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud como lo determina la electroforesis de gel. Las regiones 5’ y 3’ no trasladadas presentes en GLA ARNm se presentan como X e Y en SEQ ID NO: 7, como se indica más abajo:

Alfa-galactosidasa (GLA) ARNm (SEQ ID NO: 7):

Alfa-galactosidasa optimizada con coldón con inserción de PolyA (CO-GLA-PolyA) también se utiliza en algunas realizaciones (SEQ ID NO: 8):

El GLA ARNm se almacenó en agua en una concentración final de 1 mg/Ml A -80 ºC hasta el momento de uso. Todas las concentraciones de ARNm se determinaron mediante absorción (γmáx 260 mm).

Las formulaciones adecuadas para administración in vivo de GLA Cap0 ARNm, GLA Cap1 ARNm, GLA ARNm y otros controles incluyen una mezcla de lípidos con múltiples componentes de varias proporciones que emplean uno o más lípidos catiónicos, lípidos ayudantes y lípidos PEGilados. Los lípidos catiónicos pueden incluir (pero no exclusivamente) DOTAP^(1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J; Palmer, L.; Bremmer, K.; MacLachlan, I., “La saturación de lípido catiónico influyen en la administración intracelular de ácidos nucleicos encapsulados”, J. CONTR. REL. 107: 276-287 (2005)), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C. et al. "Diseño racional de lípidos catiónicos para administración de RNAsi”, NATURE BIOTECH., 28: 172-176 (2010)), C12-200 (Love, K.T. et al. “Materiales de tipo lípido para dosis baja en silencio de genes in vivo”, PROC NATL ACAD SCI., USA, 107: 18641869 (2010)), HGT4003, ICE, con base de dialquilamino, con base de imidazol, con base de guanidino, etc. Los lípidos ayudantes pueden incluir (aunque no exclusivamente), DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetalonamina), DPPE (1,2-dipalmitoil-snglicero-3-fosfoetalonamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetalonamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3fosfo-(1’-rac-glicerol)), colesterol, etc. Los lípidos PEGilados pueden incluir (aunque no exclusivamente) una cadena de glicol de poli(etileno) de hasta 5 kDa de longitud covalente unida a un lípido con cadenas de alquilo de longitud C6-C20. La encapsulación de ARNm se calculó realizando el ensayo Ribogreen con y sin la presencia de 0.1% Triton-X 100. Los tamaños de partículas (dispersión de luz dinámica (DLS)) y potenciales zeta se determinaron usando un instrumento Malvern Zetasizer instrument en soluciones 1x PBS y 1mM KCl, respectivamente.

Las alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/mL de C12-200, DOPE, Chol y DMG-PEG2K se mezclaron y diluyeron con etanol hasta conseguir un volumen final de 3 mL. Por separado, una solución acuosa amortiguada (10 mM citrato/150 mm NaCl, pH 4,5) de CO-GLA ARNm (Cap 0 y Cap 1) se prepararon a partir de un suniminstro de 1 mg/mL. La solución de lípido se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para producir una suspensión final en 20% etanol. La suspensión resultante de nanopartículas se filtró, diafiltró con 1 x PBS (pH 7,4), concentró y almacenó a 2-8 ºC. Concentración final = 0,72 mg/mL GLA ARNm (encapsulado). Zave = 85,5 nm (Dv(50) = 61,9 nm; Dv(90) = 113 nm):

Para determinar si el tipo de tapón incorporado en GLA ARNm influía en la producción de proteínas cuando el ARNm se encapsuló en lípido con base C12-200, se realizó un experimento donde ratones de tipo salvaje (CD-1) se inyectaron con especies de GLA ARNm tapadas y posteriormente se controlaron para producción de proteína humana GLA. Las especies ARNm tapadas incluyeron Cap0 (no metilado en la posición 20-O) y Cap1 (metilado en 2’-O).

Los estudios precedentes se realizaron usando ratones machos CD-1 de aproximadamente 6-8 semanas de edad al inicio de cada experimento. Las muestras se introdujeron mediante una inyección en la vena de la cola con un único bolo de una dosis total equivalente de 30 microgramos de GLA encapsulado, EPO, FIX o AIAT ARNm.

Las concentraciones de suero de proteína GLA se determinaron a las seis horas. Todos los animales fueron sometidos a eutanasia mediante asfixia con CO2 6 horas después de la administración de dosis (± 5%) seguido de toracotomía y recogida de sangre cardiaca terminal. La sangre total (volumen máximo obtenible) se recogió mediante pinchazo cardiaco en animales que han sido sometidos a eutanasia en tubos separadores de suero, se dejó coagular a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, centrifugó a 22 ºC ±5 ºC a 9300 g durante 10 minutos, y el suero se extrajo. Para recogida intermedia de sangre a las seis horas, se recogió aproximadamente 4050 µL de sangre total por medio de pinchazo en vena facial o en un corte en la cola. Las muestras recogidas de los animales sin tratamiento se usaron como niveles GLA de referencia para comparación de animales de estudio. El hígado y bazo de cada ratón se cultivó, dividió en tres partes y almacenó en 10% formalina neutral amortiguada o se congelaron rápidamente y almacenaron a 80 ºC.

La producción de proteína humana GLA se midió mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (“ELISA”). Los procedimientos estándares de ELISA fueron seguidos por el empleo de anti-Replagal G-188 IgG de oveja como el anticuerpo de captura con anti-Replagal IgG de conejeo con el anticuerpo secundario (detección). IgG anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) se usó para la activación de la solución 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB). La reacción se enfrió usando 2N H2SO4 después de 20 minutos. La detección se controló mediante absorción (450 nm) en un instrumento Molecular Device Flex Station. El suero de ratón no tratado y proteína humana Replagal® se usaron como controles negativo y positivo, respectivamente.

Como se ilustra en la FIG. 3, después de la inyección intravenosa de especies tapadas de CO-GLA ARNm cargadas en las nanopartículas lípidas con base C12-200, pudo detectase un nivel sustancial de proteína humana GLA en suero de ratones después de 6 horas. Notablemente, hubo un aumento impresionante y estadísticamente significativo en la producción de proteínas cuando se empleó ARNm con una estructura Cap1 versus la estructura de Cap0. Estos resultados demostraron la importancia de tener la habilidad para caracterizar y cuantificar las eficacias para tapar y metilar del proceso de síntesis de ARNm.

Equivalentes y alcance

Aquellos expertos en la técnica reconocen, o son capaces de confirmar el uso de no más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención aquí descrita. El alcance de la presente invención no pretende limitarse a la descripción anterior, pero sí a lo que se establece en las reivindicaciones adjuntas.

En las reivindicaciones artículos tales como “un”, “una”, “uno”, “el”, “la” pueden significar uno o más de uno a menos que se indique lo contrario o a menos que sea evidente de otra manera a partir del contexto. Así, por ejemplo, la referencia a “un anticuerpo” incluye una pluralidad de esos anticuerpos, y la referencia a “la célula” incluye referencia a una o más células conocidas por aquellos expertos en la técnica, etcétera. Las reivindicaciones

o las descripciones que incluyen “o” entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechos si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, empleados en, o son relevantes de otra manera para un producto o proceso dado a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otra manera a partir del contexto. La invención incluye realizaciones donde exactamente un miembro del grupo está presente, empleado en, o relevante de otra manera para un producto o proceso dado. La invención incluye realizaciones donde más de uno, o todos los miembros del grupo se presentan, se emplean en, o son relevantes de otra manera para un producto o proceso dado. Además, se entenderá que la invención abarca todas las variantes, combinaciones y permutaciones donde una o más limitaciones, elementos, oraciones, términos descriptivos, etc., de una o más reivindicaciones enumeradas se introduce en otra reivindicación. Por ejemplo, cualquier reivindicación que sea dependiente de otra reivindicación puede modificarse para incluir una o más limitaciones encontradas en cualquier otra reivindicación que sea dependiente de la misma reivindicación base.

Donde los elementos se presentan como listas, por ejemplo, en formato de grupo Markush, se entenderá que cada subgrupo de elementos también se desvela, y cualquier elemento o elementos pueden retirarse del grupo. Debería entenderse que, en general, donde la invención, o aspectos de la invención, se refieren a que comprenden elemento, características, etc, particulares, ciertas realizaciones de la invención o aspectos de la invención consistente en, o consisten esencialmente en, tales elementos, características, etc. Para fines de simplicidad esas realizaciones no se han expuesto específicamente aquí in haec verba. Se señala que el término “comprender” pretende estar abierto y permite la inclusión de elementos o etapas adicionales.

Donde se dan rangos, los extremos se incluyen. Además, se entenderá que a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otra manera a partir del contexto y aquel experto en la técnica entienda, los valores que se expresan como rangos pueden asumir cualquier valor específico o sub-rango dentro de los rangos del estado en diferentes realizaciones de la invención, hasta la décima parte de unidad del límite más bajo del rango, a menos que el contexto claramente dicte lo contrario.

Las publicaciones analizadas anteriormente y a lo largo del texto se proporcionan solamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Aquí nada debe interpretarse como una

admisión de que los inventores no están autorizados para anteceder tal divulgación en virtud de la divulgación anterior.

Otras realizaciones

5 Aquellos expertos en la técnica apreciarán fácilmente que lo precedente representa meramente ciertas realizaciones preferentes de la invención.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para cuantificar la eficacia de ARNm para tapar, comprendiendo el método:

   (1) proporcionar una muestra de ARNm que comprende ARNm tapado y ARNm no tapado;

   5 (2) poner en contacto la muestra de ARNm con oligonucleótido de ADN complementario con una secuencia en una región 5’ no trasladada del ARNm dentro de 1 o 2 bases desde el tapón o penúltima base no tapada de ARNm bajo condiciones que permitan que el oligonucleótido de ADN se empareje con la secuencia;

   (3)

   proporcionar una o más nucleasas que selectivamente degradan el híbrido ADN/ARN, dando como resultado fragmentos tapados y no tapados que comprenden no más de 5 bases del ARNm;

   (4)

   separar los fragmentos tapados y no tapados mediante cromatografía; y

   (5)

   determinar una cantidad relativa de los fragmentos tapados y no tapados mediante la determinación de áreas pico relativas de la cromatografía de los fragmentos tapados y no tapado, cuantificando así la eficacia de ARNm para tapar.

2. 2. El método de la reivindicación 1, donde el tapón tiene una estructura de la fórmula I:

   donde,

   B es una nucleobase, opcionalmente donde la nucleobase es guanina; R1 se selecciona de halógeno, OH y OCH3; R2 se selecciona de H, OH y OCH3; R3 es CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3 o nulo; R4 es NH2; R5 se selecciona de OH, OCH3 y un halógeno; n es 1, 2 o 3; y M es un nucleótido de ARNm.
3. 3. El método de la reivindicación 2, donde el tapón es un tapón m7G con una estructura de la fórmula II o un tapón no metilado con una estructura de la fórmula III.

   donde,

   R2 es H o CH3; R4 es NH2; R5 es OH u OCH3; R6 es H o CH3; y M es un nucleótido de ARNm o

   donde M es un nucleótido del ARNm.

4. 4.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la etapa (4) separa además ARN tapado metilado y no metilado.

5. 5.

   El método de la reivindicación 5 donde el tapón metilado comprende metilación en la posición R3 y/o R5.

6. 6.

   El método de la reivindicación 5 o 6, done el método comprende además una etapa para determinar cuantitativamente el porcentaje porcentual de ARN tapado.

   15 7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el oligonucleótido de ADN tiene 10-80 nucleótidos de longitud.

7. 8.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el oligonucleótido está flanqueado en ambos lados por uno o más nucleótidos de ARN.

8. 9.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde una o más nucleasas comprende (i) RNasa H y/o

   (ii) una nucleasa que genera fragmentos tapados y no tapados con extremo desafilado, opcionalmente donde la nucleasa es nucleasa S1, ARNasa, H u otra exonucleasa 5’.

   25 10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde los fragmentos tapados y no tapados no comprenden más de 2 bases del ARNm.

9. 11.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la etapa (4) comprende una etapa de aplicar los fragmentos tapados y no tapados a una columna cromatográfica.

10. 12.

    El método de la reivindicación 11, donde la columna cromatográfica se selecciona del grupo consistente en una columna HPLC de intercambio de anión, una columna HPLC de intercambio de catión, una columna HPLC en fase inversa, una columna de interacción hidrofóbica, una columna de cromatografía líquida de ultra-resolución, o una columna de exclusión por tamaño.

11. 13.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde la muestra de ARNm se sintetiza in vitro.

12. 14.

    Un método para fabricar ARNm que comprende una etapa de cuantificar la eficacia de ARNm para tapar de acuerdo con un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

13. 15.

    El método de la reivindicación 14, donde el método comprende una etapa de ajustar una condición de fabricación en base al resultado de cuantificar la eficacia de ARNm para tapar y/o donde la etapa de cuantificación se realiza antes de liberar un lote de ARNm.