ES2272322T3 - Compuestos de 2-azapurina y su utilizacion. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que se fija sobre un ácido nucleico que consta de un esqueleto, dicho esqueleto tiene insertados grupos heterocíclicos capaces de apareo con nucleobases naturales, por lo menos uno de dichos grupos heterocíclicos es una de las monobases de origen natural, caracterizado porque por lo menos uno de dichos grupos heterocíclicos es un grupo de la fórmula general I Fórmula I en la que W es N, Z se elige entre el grupo formado por N y C con la condición de que - si Z es N, entonces X con independencia de Y se elige entre el grupo formado por N y CR3 e Y con independencia de X se elige entre el grupo formado por N y CR4, y el enlace entre X e Y es un doble enlace y el enlace entre Y y Z es un enlace simple y - si Z es C, entonces X es NR33 e Y se elige entre el grupo formado por N y CR4 y el enlace entre Z e Y es un doble enlace y el enlace entre X e Y es un enlace simple, en la que R1 es -NR5R6, R3 y R4 con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H, -halógeno, -OR13, -SR19, -alquilo C1-C10, -alquenilo C2-C10, -alquinilo C2-C10, -NO2, -NR5R6, -ciano y -C(=O)R11, R11 se elige entre el grupo formado por -OH, -alcoxi C1-C6, -ariloxi C6-C22 y NHR12, R5, R6, R12, R13, R19 y R33 con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H, -alquilo C1-C10, -alque- nilo C2-C10, -alquinilo C2-C10, -arilo C6-C22, un grupo protector y un grupo informante, r y s con independencia entre sí son números enteros de 1 a 18, D es la posición de unión del grupo al resto del compuesto que se fija sobre el ácido nucleico y dichos grupos alquilo, alquenilo y alquinilo están sin sustituir o sustituidos por uno o más restos elegidos entre el grupo formado por -halógeno, -SH, -S-alquilo C1-C6, -alcoxi C1-C6, -OH, -NR5R6, -COR11, -NH-CONR5R6, -NH-CSNR5R6 y -[O-(CH2)r]s-NR5R6.
Description
Compuestos de 2-azapurina y su
utilización.
La presente invención se refiere a un compuesto
que se fija sobre ácido nucleico, que consta de
2-azapurinas, un compuesto útil para la obtención
del compuesto anterior, un producto de la unión de este compuesto,
que se fija sobre el ácido nucleico, con el ácido nucleico, un
método para la determinación de un ácido nucleico empleando dicho
compuesto y diversos usos de los compuestos
2-azapurina.
Algunos compuestos 2-azapurina
ya son conocidos en la técnica. En "Chemistry of Nucleosides and
Nucleotides" (vol. 2, p. 288-297 y p. 319) se
presentan algunos ejemplos de nucleósidos de
2-azapurina. Sin embargo, no se describen
nucleósidos de
7-desaza-2-azapurina.
En "Biochimica et Biophysica Acta"
520, p. 441-451, 1978, se describe la
síntesis enzimática del
2-azaadenosina-5'-difosfato
y del
2-azainosina-5'-difosfato
y su polimerización en homopolímeros empleando
polinucleótido-fosforilasa de E. coli. Este
método es complejo y no es capaz de producir secuencias mixtas.
Además, se han publicado artículos sobre la capacidad de los
homopolímeros de formar complejos de hebra doble y triple con otros
homopolímeros. Los compuestos que, como base, solamente contienen la
2-azaadenosina han demostrado ser sensibles a la luz
UV y lábiles.
En J. Org. Chem. 60,
6262-6269, 1995, se describen la síntesis y las
propiedades biofísicas y biológicas de oligonucleótidos que
contienen la
2-aza-2'-desoxiinosina.
Hay un artículo dedicado a un nucleósido de
2-azainosina, modificado con un grupo protector
especial eliminable fotoquímicamente sobre uno de los átomos de
nitrógeno del anillo. Sin embargo, por la tabla 1 de la página 6266,
se observa que el I^{Az} no diferencia bien entre nucleobases
naturales. Posteriormente se ve además que la estabilidad del par de
bases I^{Az}/G es 13º menor que el par de bases regular C/G y 9º
menor que el par de bases A/T. El reemplazo de C por I^{Az} no
sería, por tanto, adecuado para imitar la estabilidad del par de
bases A/T.
En Liebigs Ann. Chem. 647-651,
1990, se describen la 2-azaadenina y un nucleósido
de metiltioimidazotriazina así como el correspondiente compuesto
metoxi. No se describen fosfatos ni fosforamiditas. Por otro lado,
tampoco se describe la manera de obtener oligonucleótidos que
contengan la 2-aza-adenosina en
posiciones específicas. No se describe su comportamiento de
hibridación. Tampoco se describe el
2-aza-2'-desoxiadenosina-trifosfato.
En J. of Org. Chem., vol. 60, nº 20, páginas
6262-6269, 1995, se describen la síntesis y las
propiedades biofísicas y biológicas de oligonucleótidos que
contienen la
2-aza-2-desoxiinosina.
En "Nucleosides and nucleotides", vol. 14,
nº 3-5, páginas 821-824, se describe
la obtención de oligonucleótidos que contienen la
2-aza-2'-hipoxantina.
En Tetrahedron, vol. 47, nº 42, páginas
8917-8930, 1991, se describe la obtención de
oligonucleótidos que contienen la
2-aza-2'-desoxiinosina.
En "Biochemical Pharmacology", vol. 25, nº
5, páginas 517-521, 1976, se describen nucleósidos
de 2-aza-purinas y se investigan las
citotoxicidades y actividades como sustratos de enzimas que
metabolizan a los nucleósidos de purina, pero no se describen
oligonucleótidos que contengan
2-aza-adenosina ni compuestos útiles
para la síntesis de la misma ni métodos, en los que puedan
utilizarse estos oligonucleótidos.
En J. of Med. Chem., vol. 18, nº 6, páginas
564-567, 1975, se describen nucleósidos de
2-azapurinas.
La síntesis y la evaluación biológica de
imidazopiridazinas y triazolopiridazinas se han descrito en
Bioorganic & Medicinal Chem., vol. 4, nº 10, páginas
1725-1731, 1996 y en J. of Org. Chem., vol. 25, nº
4, páginas 579-582, 1960.
En Liebigs Ann. Chem., nº 7, páginas
647-651, 1990, se describen
2-aza-2'-desoxiadenosinas,
sin embargo no se describen oligonucleótidos que las contengan ni
compuestos útiles para su síntesis ni otros métodos, en los que
puedan utilizarse tales compuestos.
La presente invención es particularmente útil
para las determinaciones de ácidos nucleicos, por ejemplo en
análisis, especialmente en el ámbito
médico-sanitario. Se ha encontrado que los ácidos
nucleicos son analitos útiles para la determinación de la presencia
o ausencia de genes o microorganismos en líquidos del cuerpo humano,
en alimentos o en el medio ambiente. El análisis del ácido nucleico
ha encontrado una amplia utilización después de la introducción de
la amplificación del ácido nucleico, por ejemplo mediante la
reacción en cadena la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR,
véase US-A-4,683,202). De este modo
se dispone de cantidades suficientes de ácidos nucleicos a partir
de cada muestra. Los ácidos nucleicos pueden obtenerse a partir de
esta muestra pretratada empleando un abanico de diferentes técnicas,
en función de la finalidad concreta que se busque. La mayoría de
ensayos requiere el uso de una sonda, que está inmovilizado o es
inmovilizable o está marcada por incorporación de uno o más grupos
informantes (reporter). Un grupo informante tiene la característica
de ser susceptible por sí mismo de ser determinado o puede
reaccionar con reactivos que hagan que la sonda sea determinable
gracias a dicho grupo informante. Por ejemplo, las sondas que están
marcadas con grupos informantes pueden determinarse, al igual que
pueden determinarse los híbridos que contienen dicha sonda y un
ácido nucleico a determinar. En el caso de sondas inmovilizadas, el
híbrido entre la sonda y el ácido nucleico a determinar se determina
en la fase sólida, a la que está fijada la sonda. En una forma
particular de ensayo se determina no solo un ácido nucleico que
tenga una secuencia específica, sino también un gran número de
ácidos nucleicos de secuencias diferentes. A tal fin se inmovilizan
las sondas en manchas diminutas dispuestas sobre una superficie
plana, por ejemplo un vidrio de reloj
(EP-A-0 476 014 y TIBTECH, vol. 15,
465-469, 1997).
El principio básico de emplear ordenamientos
(arrays) de oligonucleótidos se propuso por primera a finales de la
década de los años 1980, cuando se desarrollo el concepto de
determinar una secuencia de DNA por hibridación, cuyo resultado es
un conjunto amplio de oligonucleótidos (SBH, sequencing by
hybridization).
Existen muchas propuestas de incluir grupos
heterocíclicos modificados o no naturales en lugar de las
nucleobases naturales. Un ejemplo de tales grupos no naturales es el
7-desazadGTP que, cuando se introduce en un ácido
nucleico reemplazando al dGTP, reduce la compresión de banda en los
geles de secuenciación (EP-B-0 286
028).
Las determinaciones de ácidos nucleicos en
general tienen el problema de que las posibilidades de apareo entre
bases naturales A y T y C y G tienen estabilidades diferentes. Esto
puede atribuirse a la diferente capacidad de las bases por formar un
enlace de puente de hidrógeno. Por lo tanto, el par de bases
dA-dT tiene dos puentes de hidrógeno, mientras que
el par de bases dG-dC tiene 3 puentes de hidrógeno.
De aquí resultan diferentes temperaturas de fusión de los híbridos
(Tm), en función del contenido de GC. Cuanto mayor es el contenido
de GC, tanto mayor es la Tm. Sin embargo, en los análisis habituales
de ácidos nucleicos sería deseable igualar la Tm de los ácidos
nucleicos de igual longitud, o incluso con independencia de la
longitud de los ácidos nucleicos o la región de fijación, con el
fin de poder aplicar condiciones de hibridación similares en todos
los ensayos. Esto es necesario en particular en los ensayos que
utilizan ordenamientos (array), como es el caso de los conjuntos de
condiciones de hibridación que tienen que ser idénticas para cada
sonda.
Una solución es el uso de temperaturas bajas de
hibridación. En estas condiciones, muchos ácidos nucleicos que
tienen un grado bajo de complementariedad de secuencia base se
fijarán sobre la sonda. Esto se llama fijación inespecífica, que no
permite discriminar entre secuencias similares.
Otra propuesta se refiere al uso de reactivos
químicos en la mezcla de hibridación, por ejemplo la adición de
cloruro de tetrametilamonio (TMAC). Este reactivo reduce la
diferencia entre la estabilidad de los pares de bases
dG-dC y dA-dT, pero el efecto es
insuficiente para los oligonucleótidos cortos. Además, la adición de
sales, como el TMAC puede resultar molesta, si complica la
optimización del ensayo.
Otra propuesta se refiere al uso de diferentes
concentraciones de cada sonda diferentes (inmovilizada) en un mismo
ensayo. Se ha constatado que esto es técnicamente complejo, sino no
imposible, en una superficie de vidrio de reloj.
Otra opción que se ha aplicado es la sustitución
de ribonucleótidos en un oligonucleótido compuesto por
desoxirribonucleótidos y viceversa para la adaptación de la
estabilidad del DNA, Hoheisel, Nucleic Acids Res. 24,
430-432, 1996.
Todas las propuestas conocidas hasta el momento
tienen sus inconvenientes. Por lo tanto sigue habiendo necesidad de
proporcionar sondas, cuya Tm no sea tan dependiente de su contenido
de GC.
En la figura 1 se presenta que el z^{2}A_{d}
es capaz de un apareo de bases con un dG de otra hebra de un ácido
nucleico.
En la figura 2 se representan diferentes
compuestos de la invención, por ejemplo la
2-aza-2'-desoxiadenosina
(2), el trifosfato correspondiente (11), una fosforamidita para la
introducción de la
2-aza-2'-desoxiadenosina
en oligonucleótidos durante la síntesis química automatizada
convencional (10 b) y un H-fosfonato (12).
En la figura 3 se representan compuestos útiles
de la presente invención. Se indica la numeración de purina del
compuesto 2 y la numeración sistemática del compuesto 3.
En la figura 4 se representa un esquema de
síntesis de la
2-aza-2'-desoxi-adenosina.
En la figura 5 se representan compuestos de la
invención.
En la figura 6 se presenta una comparación de la
fijación del z^{2}A_{d} con dG y de dG con isoG_{d} en una
fijación antiparalela.
En la figura 7 se representa que el
z^{2}A_{d} puede fijarse también sobre el isoG_{d} en modo
paralelo, se puede fijar sobre el dC en modo paralelo cuando está
protonado y sobre el isoC_{d} en modo antiparalelo si está
protonado.
Es objeto de la presente invención un compuesto
que se fija sobre ácido nucleico, que consta de un esqueleto, dicho
esqueleto tiene insertados restos heterocíclicos capaces de realizar
un apareo con nucleobases naturales, por lo menos uno de dichos
restos heterocíclicos es una nucleobase de origen natural,
caracterizado porque por lo menos otro de dichos restos
heterocíclicos es un resto de la fórmula general I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
- W
- es N,
- Z
- se elige entre el grupo formado por N y C con la condición de que
- - si
- Z es N, entonces
- \quad
- X con independencia de Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{3} e
- \quad
- Y con independencia de X se elige entre el grupo formado por N y CR^{4},
- \quad
- y el enlace entre X e Y es un doble enlace y el enlace entre Y y Z es un enlace simple y
- - si
- Z es C, entonces
- \quad
- X es NR^{33} e
- \quad
- Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{4} y
- \quad
- el enlace entre Z e Y es un doble enlace y el enlace entre X e Y es un enlace simple,
- R^{1}
- es -NR^{5}R^{6},
R^{3} y R^{4} con independencia
entre sí se eligen entre el grupo formado por -H, -halógeno,
-OR^{13}, -SR^{19}, -alquilo C_{1}-C_{10},
-alquenilo C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -NO_{2}, -NR^{5}R^{6},
-ciano y
-C(=O)R^{11},
- R^{11}
- se elige entre el grupo formado por -OH, -alcoxi C_{1}-C_{6}, -ariloxi C_{6}-C_{22} y NHR^{12},
R^{5}, R^{6}, R^{12},
R^{13}, R^{19} y R^{33} con independencia entre sí se eligen
entre el grupo formado por -H, -alquilo
C_{1}-C_{10}, -alquenilo
C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{22}, un grupo protector y un grupo
informante,
r y s con independencia entre sí
son números enteros de 1 a
18,
- D
- es la posición de unión del grupo al resto del compuesto que se fija sobre el ácido nucleico y
dichos grupos alquilo, alquenilo y alquinilo
están sin sustituir o sustituidos por uno o más restos elegidos
entre el grupo formado por -halógeno, -SH,
-S-alquilo C_{1}-C_{6}, -alcoxi
C_{1}-C_{6}, -OH, -NR^{5}R^{6}, -COR^{11},
-NH-CONR^{5}R^{6},
-NH-CSNR^{5}R^{6} y
-[O-(CH_{2})_{r}]_{s}-NR^{5}R^{6}.
A título de ejemplo se da a continuación una
explicación de la propiedad ventajosa de los compuestos de la
invención mostrándolos en el ejemplo de la
2-aza-2'-desoxiadenosina
(compuesto 2, z^{2}A_{d}) que forma específicamente pares de
bases estables con 2'-desoxiguanosina (dG), pero
pares de bases mucho menos estables con la
2'-desoxitimidina (dT), la
2'-desoxicitidina (dC) y
2'-desoxiadenosina (dA). El nuevo par de bases
(z^{2}A_{d}-dG) tiene una estabilidad similar a
la del par de bases estándar dA-dT.
Con el fin de nivelar la Tm, en un compuesto que
se fija sobre un ácido nucleico uno o más C de una hebra
complementaria de G en el ácido nucleico a determinar podría
reemplazarse por un z^{2}A_{d}. Entonces, el oligonucleótido se
fijaría específicamente sobre la secuencia diana que contiene la dG
opuesta a z^{2}A_{d} pero con la estabilidad de un par de bases
dA-dT y no de un dG-dC. Este
principio general no se limita obviamente al z^{2}A_{d}, porque
las bases que presentan las mismas características en el anillo de 6
eslabones se espera que tengan las mismas propiedades, en base a la
explicación anterior, debido a que contienen una estructura de
2-azapurina. En particular, cuanto más alejada esté
la parte del grupo heterocíclico de la parte que participa en el
apareo de bases, tanto más tolerante será el oligómero con las
modificaciones de la estructura química, por ejemplo la inserción de
grupos en esta parte de los anillos heterocíclicos. En lo que sigue,
cuando se haga una referencia a la base modificada (de la
invención), se hace referencia a un grupo heterocíclico de la
fórmula general I.
La línea discontinua de la fórmula I indica que
hay diversas posibilidades, en función de las definiciones de X, Y y
Z, de localizar un doble enlace. Para los expertos en la materia es
obvia que la elección de una definición específica de Z requerirá
que el doble enlace se sitúe entre Z e Y o bien entre X e Y. Es
evidente además que no puede existir un doble enlace simultáneamente
entre X e Y y entre Y y X.
Halógeno significa un grupo flúor, cloro, bromo
o yodo. Los grupos halógeno más preferidos son -Cl y -Br.
Los restos alquilo se elige con preferencia
entre grupos alquilo que contienen de 1 a 10 átomos de carbono,
dispuestos en forma lineal, ramificada o cíclica. La longitud actual
del grupo alquilo dependerá de la situación estérica en la posición
específica que ocupa el grupo alquilo. Si hay impedimentos
estéricos, el grupo alquilo será en general más pequeño, siendo más
preferidos el grupo metilo y etilo. Todos los grupos alquilo,
alquenilo y alquinilo puede estar sin sustituir o sustituidos.
Sustitución con heteroátomos, que se ha descrito en páginas
anteriores, proporcionará un aumento de solubilidad en soluciones
acuosas.
Los grupos alquenilo se eligen con preferencia
entre grupos alquenilo que contienen de 2 a 10 átomos de carbono. En
cuanto a las selecciones se aplican consideraciones similares a las
que rigen para los grupos alquilo. Pueden ser también lineales,
ramificados o cíclicos. El grupo alquenilo más preferido es el grupo
etileno.
Los grupos alquinilo tienen con preferencia de 2
a 10 átomos de carbono. Una vez más, estos átomos de carbono pueden
disponerse de manera lineal, ramificada o cíclica. Además puede
haber más de un triple enlace dentro de un grupo alquinilo. El grupo
alquinilo más preferido es el grupo
3-propargilo.
Los grupos alcoxi contienen con preferencia de 1
a 6 átomos de carbono y se unen al resto de la estructura mediante
el átomo de oxígeno. Para el grupo alquilo contenido en los grupos
alcoxi se aplican las mismas consideraciones que rigen para los
grupos alquilo. El grupo alcoxi más preferido es el grupo
metoxi.
Los grupos ariloxi contienen con preferencia de
6 a 20 átomos de carbono. Estos átomos de carbono pueden estar
contenidos en uno o más anillos y también en las cadenas laterales
(por ejemplo, cadenas alquilo) unidas a la estructura aromática. Los
grupos ariloxi preferidos son el grupo fenoxi y el grupo
benzoxi.
Los grupos protectores de O preferidos de
R^{14} son los grupos aroílo, los grupos acilo y los grupos
sililo. Entre ellos, el más preferido es el grupo benzoílo.
Los grupos sililo preferidos son los grupos
trialquilsililo, por ejemplo el trietilsililo.
Cualquier átomo de las definiciones de las
fórmulas presentadas aquí no se limita a un isótopo específico. Por
ello, un átomo de fósforo (P) puede significa el P^{31} normal o
el P^{32} radiactivo o una mezcla de ambos. Lo mismo se aplica al
hidrógeno (H/D/T), al carbono (C), al cloro, bromo, yodo (Cl, Br, I)
y al nitrógeno (N).
El grupo -NR^{5}R^{6} preferido de la
definición de R^{3} y R^{4} es el grupo -NH_{2}. En este caso
es evidente que, durante la síntesis química de los compuestos de la
fórmula I que contienen tal grupo, uno de los átomos de hidrógeno
del grupo amino tendrá que protegerse mediante un grupo protector
idóneo del grupo amino. Tales grupos protectores ya son conocidos de
los expertos en la materia.
Lo mismo se aplica a las definiciones de
R^{1}.
Durante las síntesis químicas, los grupos -OH,
-SH y -NH_{2} (incluidos aquellos grupos que forman parte de un
grupo informante) deberían protegerse con grupos protectores
adecuados. Además, durante la síntesis química, el compuesto se
fijará por conveniencia sobre una fase sólida. En estos casos, las
definiciones de los sustituyentes que se han dado antes deberán
seleccionarse en consonancia.
Un grupo protector es un grupo químico que se
une a un grupo funcional (por ejemplo al oxígeno del grupo
hidroxilo, reemplazando al hidrógeno) para proteger el grupo
funcional de reacciones no deseadas. Un grupo protector se define
además por el hecho de que puede eliminarse posteriormente sin
destruir la actividad biológica de la molécula formada, en este caso
la unión del compuesto que se fija sobre un ácido nucleico y dicho
ácido nucleico. Los expertos en la materia ya conocen los grupos
protectores idóneos. Los grupos protectores especialmente preferidos
por ejemplo para los grupos hidroxilo del extremo 5' de un
nucleótido u oligonucleótido se eligen entre grupos tritilo, por
ejemplo el dimetoxitritilo.
Los grupos protectores preferidos de grupos
amino exocíclicos de la fórmula I son los grupos acilo, los más
preferidos son el grupo benzoílo (Bz), fenoxiacetilo, acetilo o
formilo y el grupo N,N-dialquilformamidina, con
preferencia el grupo dimetil-, diisobutil- y
di-n-butilformamidina.
El compuesto que se fija sobre el ácido nucleico
según la invención tiene con preferencia una longitud inferior a 100
subunidades, con mayor preferencia de 10 a 30 subunidades. Para que
se activo como compuesto que se fija sobre un ácido nucleico, los
sustituyentes deberían elegirse de modo que los enlaces de hidrógeno
con los grupos heterocíclicos del ácido nucleico a fijar estén
activados, con preferencia por un apareo de bases de tipo Watson
Crick y/o del modo indicado en la figura 1. Los compuestos, en los
que los sustituyentes no permiten esta unión preferida de hidrógeno,
pueden ser útiles como compuestos intermedios para la obtención de
compuestos que se fijan sobre ácidos nucleicos. Los compuestos
preferidos que se fijan sobre ácidos nucleicos de la invención son
aquellos que se sintetizan químicamente.
Si el compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico tiene que utilizarse como sonda para la determinación de un
ácido nucleico o se pretende cualquier otra identificación de
compuestos o de ácidos nucleicos, algunos de los sustituyentes
deberán elegirse de modo que contengan un grupo informante. Aunque
pueden insertarse muchos grupos informantes, si se considera útil,
para marcar suficientemente el compuesto de ácido nucleico, es
preferible fijar solamente un número limitado de grupos informantes
sobre una misma subunidad, de modo que el reconocimiento de los
ácidos nucleicos, las afinidades con los ácidos nucleicos y la
solubilidad no resulten afectadas hasta el punto que la sonda deje
de ser útil para los ensayos de hibridación. En un caso muy
preferido se insertarán solamente de 1 a 4 grupos informantes, con
mayor preferencia 1 ó 2 y con preferencia especial solamente un
grupo informante a cada compuesto que se fija sobre un ácido
nucleico. Hay formatos para la determinación del ácido nucleico que
requieren que sobre la sonda se inserte más de un grupo informante.
Un ejemplo de dichos formatos se describe en el documento WO
92/02638. En este caso, uno de los grupos informantes será un emisor
de fluorescencia, mientras que el otro será un absorbente de
fluorescencia.
En general, los grupos informantes son grupos
que convierte al compuesto que se fija sobre el ácido nucleico y a
cualquier ácido nucleico que haya sufrido tal fijación en
distinguible entre el resto del líquido, es decir, la muestra (los
compuestos que se fijas sobre un ácido nucleico y llevan insertado
un grupo informante pueden denominarse también compuestos marcados
que se fijan sobre un ácido nucleico, sondas marcadas o simplemente
sondas). Esta distinción puede efectuarse ya sea seleccionando el
grupo informante entre un conjunto de grupos detectables directa o
indirectamente, ya sea entre un conjunto de grupos inmovilizados o
inmovilizables. Los grupos detectables directamente son por ejemplo
los compuestos fluorescentes, por ejemplo la fluoresceína y sus
derivados, por ejemplo la hexaclorofluoresceína y
hexafluorfluoresceína, rodaminas, psoralenos cuadrados, porfirinas,
partículas fluorescentes, compuestos bioluminiscentes, por ejemplo
los ésteres de acridinio y el luminol, o los colorantes de cianina,
por ejemplo el Cy-5. Los ejemplos de este tipo de
compuestos se describen en el documento EP 0 680 969. Son también
grupos detectables útiles los marcadores de tipo espín, por ejemplo
el TEMPO, los grupos detectables electroquímicamente, ferrocenos,
viologenos, quelatos de metales pesados y marcadores
electroquimioluminiscentes, por ejemplo los complejos de
rutenio-bispiridilo y las naftoquinonas, colorantes
absorbentes, por ejemplo el dabcilo, y complejos activos de
nucleasa, por ejemplo de Fe y Cu. Los grupos detectables
indirectamente son grupos que pueden reconocerse por otro resto o
estructura que está marcada directa o indirectamente. Son ejemplos
de estos grupos detectables indirectamente entre otros los haptenos,
por ejemplo la digoxigenina o la biotina. La digoxigenina puede
reconocerse por ejemplo mediante anticuerpos contra la digoxigenina.
Estos anticuerpos pueden marcarse directamente o bien pueden
reconocerse mediante anticuerpos marcados directamente contra los
anticuerpos (antidigoxigenina). Los formatos basados en el
reconocimiento de la digoxigenina se describen en
EP-B-0 324 474. La biotina puede
reconocerse con avidina y compuestos similares, por ejemplo la
estreptavidina y otros compuestos que se fijan sobre la biotina. Una
vez más, estos compuestos pueden marcarse directa o
indirectamente.
El grupo informante puede ser también una
secuencia de nucleótido que no interfiera con otras secuencias de
nucleótido existentes en la muestra. Además, la secuencia puede
reconocerse con un nucleótido que contenga una secuencia
complementaria. Esta secuencia de nucleótido puede marcarse directa
o indirectamente o puede ser inmovilizable o estar inmovilizada.
Un grupo informante puede ser además una fase
sólida. La inserción del compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico en la fase sólida puede ser de tipo directo o indirecto,
tal como se ha descrito antes con ocasión del grupo detectable.
El marcado directo puede efectuarse con una
unión covalente de un compuesto que se fija sobre un ácido nucleico
y un grupo reactivo existente en la fase sólida, es decir, con
preferencia mediante un engarce. El marcado indirecto puede
realizarse de modo similar al indicado antes para los grupos
detectables. La unión indirecta es con preferencia no covalente por
interacciones bioespecíficas, por ejemplo las elegidas entre el
grupo de hapteno-anticuerpo,
vitamina-receptor y ácido nucleico con su ácido
nucleico complementario. De nuevo, los expertos ya conocen estas
interacciones y su utilización en los ensayos de ácido nucleico.
Las fases sólidas que son útiles para la
inmovilización de la sonda según la invención se eligen con
preferencia entre el grupo formado por el poliestireno, polietileno,
polipropileno, vidrio y TiO_{2}. Los formatos de dichas fases
sólidas pueden elegirse con arreglo a las necesidades de la
instrumentación y del formato del ensayo. Por ejemplo, una fase
sólida puede adoptar la forma de una bola o de un vaso.
El término grupo informante y las formas de
ejecución específicas incluyen con preferencia un engarce (linker),
que se emplea para unir el resto que se pretende utilizar (la fase
sólida actual o el resto fluoróforo) con la posición de unión del
grupo informante. El engarce proporcionará flexibilidad de modo que
el compuesto que se fija sobre el ácido nucleico pueda fijarse sobre
la secuencia del ácido nucleico a determinar sin mayor impedimento
por parte de la fase sólida. Los engarces, en especial los que no
son hidrófobos, por ejemplo los basados en unidades óxido de etileno
consecutivas, se describen por ejemplo en el documento DE 3943522 y
ya son conocidos de los expertos en la
materia.
materia.
De la explicación anterior se desprende que la
invención continuará siendo eficaz incluso cuando el esqueleto de la
sonda no sea un oligonucleótido en sentido estricto. En los últimos
años se han descritos compuestos que se fijan sobre ácidos nucleicos
que tienen propiedades similares a las de los oligonucleótidos, pero
difieren en la estructura. Se considera que el esqueleto o
estructura forman parte en general del compuesto que se fija sobre
el ácido nucleico que lleva las bases, por lo general en forma
lineal, unidas a subunidades idénticas o no idénticas. El esqueleto
más frecuente es el esqueleto de azúcar-fosfato de
los ácidos nucleicos de origen natural (que contienen subunidades
ribonucleósido (RNA), subunidades desoxiribonucleósido (DNA) o
subunidades de ácido nucleico peptídico (PNA)). Por lo tanto, en una
forma preferida de ejecución, el esqueleto contiene restos azúcar y
fosfato. En otra forma preferida de ejecución, la configuración del
azúcar se elige entre el grupo formado por las configuraciones
\alpha-D, \beta-D,
\alpha-L y \beta-L, el compuesto
más preferido contiene por lo menos un resto
2'-desoxi-\beta-D-eritro-pentofuranosilo
y un resto
\beta-D-ribofuranosilo.
\beta-D-ribofuranosilo.
D es con preferencia el glucósido
C-1 de un resto azúcar del compuesto según la
invención. Los compuestos preferidos de la fórmula VI son aquellos,
en los que R^{1} es NH_{2}, W es N, Z es N, Y es C, X es N y
R^{14} es H.
Otros compuestos preferidos que se fijan sobre
ácidos nucleicos contienen por lo menos un grupo de la fórmula I, en
la que R^{1} es el grupo -NR^{5}R^{6}, que son la
2-aza-adenosina o derivados de la
misma. Como derivados de la
2-aza-adenina se consideran aquí los
compuestos que proporcionan un enlace de hidrógeno a través de los
mismos átomos que la 2-aza-adenina
con la G y dG en un ácido nucleico sobre el que se ha fijado el
compuesto de la invención. El grupo más preferido de la fórmula I es
la 2-aza-adenina, insertada al
esqueleto mediante el átomo N^{9}. Estos grupos por un lado
discriminan claramente entre las nucleobases naturales y por otro
lado proporcionan una estabilidad muy similar a la del par de bases
A-T.
El compuesto que se fija sobre el ácido nucleico
deberá construirse de modo que contenga una secuencia de nucleobase
que sea sustancialmente complementaria del ácido nucleico a
determinar o del ácido nucleico sobre el que se pretende establecer
una fijación mediante el apareo de bases. Dado que estos ácidos
nucleicos contendrán habitualmente por lo menos una vez alguna de
las nucleobases de origen natural Ade, Cyt, Gua y Thy o Ura, el
compuesto según la invención que se fija sobre el ácido nucleico
contendrá también una cualquiera de estas cuatro bases. Sin embargo,
según la invención por lo menos uno de los grupos heterocíclicos en
una posición del compuesto que se fija sobre el ácido nucleico
situada enfrente de la G en el ácido nucleico a determinar una vez
se ha reemplazado por la base heterocíclica de la fórmula I. Si
existe más de una G en la secuencia, sobre la que se pretende
hibridar el compuesto que se fija sobre el ácido nucleico, entonces
se eligen con preferencia una cantidad de C del compuesto que se
fija sobre el ácido nucleico igual a la cantidad de grupos
heterocíclicos de la fórmula I que sean necesarios para obtener la
Tm que se busca.
Sin embargo, los compuestos de la invención que
se fijan sobre el ácido nucleico despliegan la misma selectividad de
apareo de bases incluso frente a otros grupos heterocíclicos de la
posición situada enfrente de la posición del compuesto que se fija
sobre el ácido nucleico en el que se halla situado el grupo de la
fórmula I, en especial con respecto a los derivados de G, por
ejemplo c^{7}G_{d}, z^{8}c^{7}G_{d} y z^{8}G_{d}. En
estas denominaciones, c^{7} significa que en la posición 7 habrá
un átomo de carbono y z^{8} significa como es lógico que en la
posición 8 habrá un átomo de nitrógeno. Además, los derivados de G,
que sean reconocidos según la invención, son nucleobases G que
están marcadas por la inserción de grupos detectables e
isoG_{d}.
El ácido nucleico puede contener además un grupo
heterocíclico de la fórmula I propiamente dicho. La base
correspondiente del compuesto que se fija sobre el ácido nucleico se
elegirá con preferencia de modo que, una vez realizado el apareo de
bases con este grupo, sea por ejemplo la dG. El ácido nucleico puede
contener bases naturales y/o no naturales, por ejemplo la
7-desaza-dGTP. Por lo tanto, el
término ácido nucleico se construirá en la presente invención de
forma muy amplia. Son preferidos los ácidos nucleicos que tienen
secuencias mixtas de bases.
El compuesto que se fija sobre el ácido nucleico
según la invención se fijará sobre ácidos nucleicos con preferencia
en modo antiparalelo. Sin embargo, eligiendo cuidadosamente las
nucleobases de un ácido nucleico y/o del compuesto de fijación sobre
el ácido nucleico, se puede forzar la unión para que tenga lugar de
modo paralelo. La hibridación paralela de ácidos nucleicos que
contienen la iso-C y la iso-G se
describen por ejemplo en EP 0 624 161.
Los compuestos preferidos que se fijan sobre
ácidos nucleicos son aquellos, cuyo esqueleto consta de uno o más
restos de la fórmula general II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
- A
- se elige entre el grupo formado por O, S y N-alquilo C_{1}-C_{10},
- L
- se elige entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo y -NR^{22}-,
- T
- se elige entre el grupo formado por oxo, tioxo y selenoxo,
- U
- se elige entre el grupo formado por -OH, -O-grupo informante, -SH, -S-grupo informante, -SeH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alquilo C_{1}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, -(aril C_{6}-C_{14})-alquilo C_{1}-C_{10}, -NR^{23}R^{24} y -O-(alquilo C_{1}-C_{10})-O-(alquilo C_{1}-C_{10})-R^{25}, o en la que -NR^{23}R^{24} junto con N puede formar un anillo heterocíclico de 5 ó 6 eslabones,
- V
- se elige entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo o -NR^{22}-,
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido, -O-alilo, -O-alquinilo y -NH_{2},
- R^{22}
- con independencia de su aparición se elige entre el grupo formado por -H y -alquilo C_{1}-C_{10},
R^{23} y R^{24} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -alquilo
C_{1}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{20}, -(arilo
C_{6}-C_{14})-alquilo
C_{1}-C_{10}, -alquilo
C_{1}-C_{6}-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{26}R^{27}
y un grupo
informante,
- R^{25}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -halógeno, -amino, -alquilamino C_{1}-C_{18}, -COOH, -CONH_{2} y -COO-alquilo C_{1}-C_{4} y un grupo informante,
R^{26} y R^{27} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{6} y -(alcoxi
C_{1}-C_{4})-alquilo
C_{1}-C_{6} y un grupo
informante,
- c
- es un número entero de 2 a 6,
- d
- es un número entero de 0 a 6 y
- B
- un resto de la fórmula I,
en la que cualquier alquilo, alquenilo y
alquinilo puede estar sustituido o sin sustituir,
y cualquier sal de los mismos.
Los significados preferidos de grupos ya
definidos en para la fórmula I se aplican a la fórmula II y a las
fórmulas siguientes, a menos que se indique lo contrario.
Un objeto preferido de la invención es, pues, un
compuesto que se fija sobre un ácido nucleico ya descrito en páginas
anteriores, cuyo esqueleto consta de uno o más restos de la fórmula
general III
en la
que
- A
- se elige entre el grupo formado por O, S y N-alquilo C_{1-}C_{6},
- M
- se elige entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo, -NR^{22}-, -alquilo C_{1}-C_{10}- u -O-(alquilo C_{1}-C_{10})-O- y -S-(alquilo C_{1}-C_{10})-O- y -NR^{22}-(alquilo C_{1}-C_{6})-O-,
- R^{22}
- se elige entre el grupo formado por -H, -alquilo C_{1}-C_{10}, un grupo protector y un grupo informante,
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -alquiniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido, -SH, -alquilmercapto C_{1}-C_{10} y -NH_{2},
- R^{15}
- se elige entre el grupo formado por -H, -alquilo C_{1}-C_{6}, -alquenilo C_{2}-C_{10}, -alquinilo C_{2}-C_{10}, -(alquilo C_{2}-C_{10})-carbonilo, -(alquenilo C_{3}-C_{19})-carbonilo, -(alquinilo C_{3}-C_{19})-carbonilo, -(arilo C_{6}-C_{14})-alquilo C_{1}-C_{10}, una fase sólida y un grupo de la fórmula IV
en la
que
- T
- se elige entre el grupo formado por oxo, tioxo y selenoxo y
- U
- se elige entre el grupo formado por -OH, -O-grupo informante, -SH, -SeH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alquilo C_{1}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, -(arilo C_{6}-C_{14})-alquilo C_{1}-C_{10}, -NR^{23}R^{24} y -O-(alquilo C_{1}-C_{10})-O-(alquilo C_{1}-C_{10})-R^{25} o bien en el que NR^{23}R^{24} junto con N pueden formar un anillo heterocíclico de 5 ó 6 eslabones,
R^{23} y R^{24} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -alquilo
C_{1}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{20}, -(arilo
C_{6}-C_{14})-alquilo
C_{1}-C_{10}, -(alquilo
C_{1}-C_{6})-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{26}R^{27},
- R^{25}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -halógeno, -amino, -alquilamino C_{1}-C_{18}, -COOH, -CONH_{2} y -COO-alquilo C_{1}-C_{4},
R^{26} y R^{27} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{6} y -(alcoxi
C_{1}-C_{4})-alquilo
C_{1}-C_{6},
- R^{29}
- se elige entre el grupo formado por -OR^{30} y -SR^{30},
- R^{30}
- se elige entre el grupo formado por -H, -alquilo C_{1}-C_{10}, -alquenilo C_{2}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, un grupo protector, una fase sólida y un grupo informante
- B
- es el enlace con el resto de la fórmula I,
y las sales de los mismos.
\newpage
En cuanto a las definiciones y preferencias se
aplican los significados concretos mencionados para los
sustituyentes con ocasión de las fórmulas I y II, a menos que se
indique concretamente algo distinto para la fórmula III.
En los compuestos de la fórmula II, R^{14} es
con preferencia hidrógeno. La definición preferida de L es oxi. La
definición preferida de U es -OH y -O-grupo
informante. La definición preferida de V es oxi. La definición
preferida de c es un número entero de 2 a 4 y de d un número entero
de 0 a 2.
Los compuestos de la fórmula II son
especialmente indicados para contener el resto heterocíclico de la
invención como parte integrada (preferiblemente no en uno de los
extremos) del compuesto que se fija sobre el ácido nucleico.
El grupo NR^{23}R^{24} se elige con
preferencia entre el conjunto formado por grupos dialquilamino. En
el caso de que juntos formen un anillo heterocíclico de 5 ó 6
eslabones, se da preferencia al significado de pirrolidinilo o
piperidinilo.
El grupo arilo preferido es el resto fenilo o
naftilo, sin sustituir o sustituidos por uno o más de los
siguientes: amino, -aminoalquilo, -O-alquilo
C_{1}-C_{10}, -S-alquilo
C_{1}-C_{10}, -alquilo
C_{1}-C_{10}, sulfonilo, sulfenilo, sulfinilo,
nitro y nitroso. El grupo arilo más preferido es el grupo fenilo. El
grupo arilalquilo preferido es el grupo bencilo. El grupo
alquilamino preferido es el grupo etilamino. El grupo
-COO-alquilo C_{1}-C_{4}
preferido contiene uno o dos átomos de carbono en el resto alquilo
(ésteres de metilo o de etilo).
Los compuestos que se fijan sobre ácido
nucleico, en los que el grupo de la fórmula I está insertado para
unir, por ejemplo el nucleótido, al extremo 3' del compuesto, son
útiles como compuestos de partida para obtener compuestos de mayor
longitud y/o sondas de extremo marcado. Este grupo de compuestos es
especialmente preferido, porque la posición terminal de las sondas
en general es la más tolerante en lo que respecta a la inserción de
restos químicos.
Un objeto preferido de la invención es un
compuesto que se fija sobre un ácido nucleico, ya definido antes,
que contiene un resto estructural de la fórmula V
en la
que
- A
- se elige entre el grupo formado por O, S y N-alquilo C_{1}-C_{6},
- M'
- se elige entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo, -NR^{22}-, -alquilo C_{1}-C_{10} u -O-(alquilo C_{1}-C_{10})-O- y -S-(alquilo C_{1}-C_{10})-O- y -NR^{22}-(alquilo C_{1}-C_{6})-O-,
- R^{22}
- se elige entre el grupo formado por -H, un grupo protector, un grupo informante y -alquilo C_{1}-C_{10},
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -alquiniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido, -SH, -S-alquilmercapto C_{1}-C_{6} y -NH_{2},
- R^{16}
- se elige entre el grupo formado por -H, -alquilo C_{1}-C_{8}, -alquenilo C_{2}-C_{18}, -alquinilo C_{2}-C_{18}, -(alquilo C_{2}-C_{18})-carbonilo, -(alquenilo C_{3}-C_{19})-carbonilo, -(alquinilo C_{3}-C_{19})-carbonilo, -(arilo C_{6}-C_{14})-alquilo C_{1}-C_{8}, un grupo protector y un compuesto de la fórmula IV
en la
que
- T
- se elige entre el grupo formado por oxo, tioxo y selenoxo,
- U
- se elige entre el grupo formado por -OH, -SH, -SeH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alquilo C_{1}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, -(arilo C_{6}-C_{14})-alquilo C_{1}-C_{10}, -NR^{23}R^{24} y -O-(alquilo C_{1}-C_{10})-O-(alquilo C_{1}-C_{10})-R^{25}, en el que NR^{23}R^{24} junto con N pueden formar un anillo heterocíclico de 5 ó 6 eslabones,
R^{23} y R^{24} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por
-alquilo C_{1}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{20}, -(arilo
C_{6}-C_{14})-alquilo
C_{1}-C_{10}, -(alquilo
C_{1}-C_{6})-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{26}R^{27},
- R^{25}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -halógeno, -amino, -alquilamino C_{1}-C_{18}, -COOH, -CONH_{2} y -COO-alquilo C_{1}-C_{4},
R^{26} y R^{27} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{6} y -(alcoxi
C_{1}-C_{4})-alquilo
C_{1}-C_{6},
- R^{29}
- se elige entre el grupo formado por -OR^{30} y -SR^{30},
- R^{30}
- se elige entre el grupo formado por -H, -alquilo C_{1}-C_{10}, -alquenilo C_{2}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, un grupo protector, una fase sólida y un grupo informante, y
- B
- es el enlace con el resto de la fórmula I,
en los que cualquier alquilo, alquenilo y
alquinilo puede estar sustituido o sin sustituir
y las sales de los mismos.
Estos compuestos son compuestos que pueden
utilizarse como sondas marcadas en su extremo 5'. En lo que respecta
a las definiciones de los sustituyentes, se aplican las definiciones
establecidas anteriormente, a menos que se indique lo contrario.
Un compuesto muy preferido es el compuesto de la
fórmula V, en la que M es O, R^{16} es H y R^{14} se elige
entre el grupo formado por hidrógeno y hidroxilo.
El esqueleto o armazón del compuesto que se fija
sobre el ácido nucleico tiene la función de llevar los heterociclos
para el apareo de bases, de modo que el compuesto pueda fijarse
sobre un ácido nucleico que tenga una secuencia complementaria. El
grado de complementariedad de las bases de origen natural se situará
con preferencia en el intervalo comprendido entre el 70% y el 100%
en un tramo de bases en una fijación que afecta a una región,
porcentaje referido al tramo de igual longitud de la región del
ácido nucleico a unir. Las deleciones e inserciones de subunidades
de cada secuencia se contará, por tanto, en este cálculo como
brechas hasta la siguiente base que encaje y por ello reducen la
complementariedad en una cantidad igual al número de bases
contenidas en dicha brecha.
El esqueleto preferido contiene restos
azúcar-fosfato. Entre ellos son preferidos además
los esqueletos que contienen desoxi-azúcar.
Cada resto del esqueleto que lleve un resto
capaz de apareo de bases con un ácido nucleico de secuencia
complementaria, incluidos los restos de la invención, se llama una
subunidad. Se conocen compuestos que tienen esqueletos mixtos, con
diferentes tipos de subunidades. Recientemente se ha descrito un
nuevo tipo de compuestos no naturales, que se fijan sobre ácidos
nucleicos. Se llaman ácidos nucleicos peptídicos (Peptide Nucleic
Acids, PNA), porque contienen por lo menos un enlace peptídico entre
las subunidades (WO 92/20702). El compuesto que se fija sobre el
ácido nucleico de la presente invención puede tener una longitud
cualquiera. Sin embargo, debido a las conveniencias de la síntesis
química, son preferidos los compuestos de una longitud inferior a
100 subunidades, más preferidos de 10 a 30 subunidades, por ejemplo
los nucleósidos.
El compuesto que se fija sobre el ácido nucleico
de la presente invención de modo similar a los métodos ya
conocidos.
En una primera opción, que es particularmente
indicada para compuestos cortos, se obtienen los compuestos por
síntesis química (oligomerización multietapa) empleando derivados
químicamente activados de las subunidades (monómeros), de los cuales
por lo menos uno contiene la base modificada de la invención. Es
preferible proteger los grupos reactivos de los monómeros, que no
intervienen en el actual paso de reacción de oligomerización,
empleando un grupo protector apropiado. Dichos grupos protectores
son bien conocidos en la técnica y no hay ningún otro cambio
importante en la estrategia de protección y de síntesis, si se
emplean los grupos de la invención.
Una subunidad activada es una subunidad que
contiene un sustituyente especialmente idóneo para la reacción
química con un sustituyente predeterminado de otra subunidad, de la
superficie de una fase sólida o de un oligómero constituido por
subunidades. Las subunidades especialmente indicadas se eligen con
preferencia entre el grupo formado por las fosforamiditas, los
fosfonatos (por ejemplo los metilfosfonatos), fosfotriésteres,
fosfotioatos, fosfoditioatos, boranofosfatos (véase Chem. Commun.
1517-1518, 1999), fosfatos de metilo,
fenilfosfonatos y fosfatos de
etilo.
etilo.
Los sustituyentes predeterminados se eligen con
preferencia entre el grupo formado por -NH_{2}, -SH y -OH.
Otro objeto de la invención es, pues, un método
para la síntesis química de un compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 13 empleando subunidades activadas, dichas
subunidades activadas contienen por lo menos un grupo de la fórmula
I. Existen varias estrategias de síntesis químicas, por ejemplo el
método del fosfotriéster de Narang y col., Meth. Enzymol. 68,
90-99, 1979; el método del fosfodiéster de Brown y
col., Meth. Enzymol. 68, 109-151, 1979; el
método de la dietilfosforamidita de Beaucage y col., Tetrahedron
Lett. 22, 1859-1862, 1981; y el método del
soporte sólido descrito en la patente US 4,458,066 y en Methods in
Molecular Biology, coord. S. Agrawal, vol. 20. Humana Press, Totowa,
NJ, 1993. El método más preferido de síntesis química recurre a la
estrategia de la fosforamidita. Un método especialmente preferido
emplea una subunidad activada de uno o más compuestos de la fórmula
general VII. Este método tiene la ventaja de ser muy conveniente y
es posible obtener con facilidad los reactivos necesarios, por
ejemplo una fosforamidita que contenga un grupo de la fórmula I.
Otro objeto de la invención son, pues, los
compuestos de la fórmula general VII
en la
que
- A
- se elige del grupo formado por O, S y N-alquilo C_{1}-C_{6},
M y M' con independencia entre sí
se eligen entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo,
-NR^{22}-, -alquilo C_{1}-C_{10} u -O-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y -S-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y
-NR^{22}-(alquilo
C_{1}-C_{6})-O-,
- R^{22}
- se elige entre el grupo formado por -H y -alquilo C_{1}-C_{10},
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OR^{31}, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -alquiniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido-NHR^{31}, SR^{31} y -NH_{2},
- R^{31}
- es un grupo protector o un grupo informante,
R^{32} y R^{17} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{10}, -alquenilo
C_{2}-C_{10} y -arilo
C_{6}-C_{22},
- R^{18}
- se elige entre el grupo formado por -alquilo C_{1}-C_{6} sustituido o sin sustituir, -alcoxi C_{1}-C_{6} sin sustituir o -alcoxi C_{1}-C_{6} sustituido una o más veces por un resto elegido entre el grupo formado por -halógeno, -O-nitroariloxi y -ciano y
- B
- es un grupo de la fórmula I.
En una forma preferida de ejecución, el grupo de
la fórmula I en la fórmula VII contiene por lo menos un grupo
informante. Con preferencia especial, el grupo de la fórmula I
contiene exactamente un grupo informante.
Con preferencia especial, en tales compuestos,
en -NR^{5}R^{6} por lo menos uno de R^{5} y R^{6} es un
grupo protector.
\global\parskip0.980000\baselineskip
Otro objeto de la invención son los compuestos
de la fórmula general IX
en la
que
- A
- se elige entre el grupo formado por O, S y N-alquilo C_{1}-C_{6},
M y M' con independencia entre sí
se eligen entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo,
-NR^{22}-, -alquilo C_{1}-C_{10} u -O-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y -S-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y
-NR^{22}-(alquilo
C_{1}-C_{6})-O-,
- R^{22}
- se elige entre el grupo formado por -H y -alquilo C_{1}-C_{10},
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OR^{31}, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -alquiniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido-NHR^{31}, SR^{31} y -NH_{2},
- R^{31}
- es un grupo protector o un grupo informante,
R^{32} y R^{17} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{10}, -alquenilo
C_{2}-C_{10} y -arilo
C_{6}-C_{22},
- R^{18}
- se elige entre el grupo formado por -alquilo C_{1}-C_{6} sustituido o sin sustituir, -alcoxi C_{1}-C_{6} sin sustituir o -alcoxi C_{1}-C_{6} sustituido una o más veces por un resto elegido entre el grupo formado por -halógeno, -nitroariloxi y -ciano y
- B
- es un grupo de la fórmula I
en la
que
- W
- es N,
- Z
- se elige entre el grupo formado por N y C con la condición de que
- - si
- Z es N, entonces
- \quad
- X con independencia de Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{3} e
- \quad
- Y con independencia de X se elige entre el grupo formado por N y CR^{4},
- \quad
- y el enlace entre X e Y es un doble enlace y el enlace entre Y y Z es un enlace simple y
\global\parskip0.990000\baselineskip
- - si
- Z es C, entonces
- \quad
- X es NR^{33} e
- \quad
- Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{4} y
- \quad
- el enlace entre Z e Y es un doble enlace y el enlace entre X e Y es un enlace simple,
- R^{1}
- es -NR^{5}R^{6},
R^{3} y R^{4} con independencia
entre sí se eligen entre el grupo formado por -H, -halógeno,
-OR^{13}, -SR^{19}, -alquilo C_{1}-C_{10},
-alquenilo C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -NO_{2}, -NR^{5}R^{6},
-ciano y
-C(=O)R^{11},
- R^{11}
- se elige entre el grupo formado por -OH, -alcoxi C_{1}-C_{6}, -ariloxi C_{6}-C_{22} y NHR^{12},
R^{5}, R^{6}, R^{12},
R^{13}, R^{19} y R^{33} con independencia entre sí se eligen
entre el grupo formado por -H, -alquilo
C_{1}-C_{10}, -alquenilo
C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{22}, un grupo protector y un grupo
informante,
r y s con independencia entre sí
son números enteros de 1 a
18,
- D
- es la posición de unión del grupo al resto del compuesto que se fija sobre el ácido nucleico y
dichos grupos alquilo, alquenilo y alquinilo
están sin sustituir o sustituidos por uno o más restos elegidos
entre el grupo formado por -halógeno, -SH,
-S-alquilo C_{1}-C_{6}, -alcoxi
C_{1}-C_{6}, -OH, -NR^{5}R^{6}, -COR^{11},
-NH-CONR^{5}R^{6},
-NH-CSNR^{5}R^{6} y
-[O-(CH_{2})_{r}]_{s}-NR^{5}R^{6},
con la condición de que por lo menos uno de
R^{5} y R^{6} en -NR^{5}R^{6} sea un grupo protector.
Estos compuestos pueden utilizarse al igual que
los de la fórmula VII para la síntesis química.
Otro objeto de la invención son los compuestos
de la fórmula general X,
en la
que
M y M' con independencia entre sí
se eligen entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo,
-NR^{22}-, -alquilo C_{1}-C_{10} u -O-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y -S-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y
-NR^{22}-(alquilo
C_{1}-C_{6})-O-,
- R^{22}
- se elige entre el grupo formado por -H y -alquilo C_{1}-C_{10},
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OR^{31}, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -alquiniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido-NHR^{31}, SR^{31} y -NH_{2},
- R^{31}
- es un grupo protector o un grupo informante,
- B
- es un grupo de la fórmula I
en la
que
- W
- es N,
- Z
- se elige entre el grupo formado por N y C con la condición de que
- - si
- Z es N, entonces
- \quad
- X con independencia de Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{3} e
- \quad
- Y con independencia de X se elige entre el grupo formado por N y CR^{4},
- \quad
- y el enlace entre X e Y es un doble enlace y el enlace entre Y y Z es un enlace simple y
- - si
- Z es C, entonces
- \quad
- X es NR^{33} e
- \quad
- Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{4} y
- \quad
- el enlace entre Z e Y es un doble enlace y el enlace entre X e Y es un enlace simple,
- R^{1}
- es -NR^{5}R^{6},
R^{3} y R^{4} con independencia
entre sí se eligen entre el grupo formado por -H, -halógeno,
-OR^{13}, -SR^{19}, -alquilo C_{1}-C_{10},
-alquenilo C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -NO_{2}, -NR^{5}R^{6},
-ciano y
-C(=O)R^{11},
- R^{11}
- se elige entre el grupo formado por -OH, -alcoxi C_{1}-C_{6}, -ariloxi C_{6}-C_{22} y NHR^{12},
R^{5}, R^{6}, R^{12},
R^{13}, R^{19} y R^{33} con independencia entre sí se eligen
entre el grupo formado por -H, -alquilo
C_{1}-C_{10}, -alquenilo
C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{22}, un grupo protector y un grupo
informante,
r y s con independencia entre sí
son números enteros de 1 a
18,
- D
- es la posición de unión del grupo al resto del compuesto que se fija sobre el ácido nucleico y
dichos grupos alquilo, alquenilo y alquinilo
están sin sustituir o sustituidos por uno o más restos elegidos
entre el grupo formado por -halógeno, -SH,
-S-alquilo C_{1}-C_{6}, -alcoxi
C_{1}-C_{6}, -OH, -NR^{5}R^{6}, -COR^{11},
-NH-CONR^{5}R^{6},
-NH-CSNR^{5}R^{6} y
-[O-(CH_{2})_{r}]_{s}-NR^{5}R^{6}.
Estos compuestos son también útiles para la
síntesis química.
En otra opción, que es más adecuada para
oligómeros largos y los basados en esqueletos naturales, los
oligómeros se obtienen por vía enzimática. En este caso se hace
reaccionar un oligómero de partida con una polimerasa y se une un
trifosfato o un trifosfato modificado, por ejemplo un monofosfato o
un monofosfato modificado, a un extremo del oligómero, alargando de
este modo a dicho oligómero. Los expertos en la materia conocen
también diversos formatos posibles para este método, por ejemplo la
estrategia del desplazamiento de la mella (nick translation) o la
extensión simple con cebador (J. Sambrook, E.F. Fritsch, T.
Maniatis, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press 1989).
Por ejemplo, la incorporación del z^{2}A_{d}
a la secuencia del DNA puede realizarse por métodos convencionales,
p.ej. mediante la incorporación del
z^{2}A_{d}-5'-trifosfato (11)
catalizada por la polimerasa.
\newpage
Otro objeto de la invención es, pues, un método
para la síntesis enzimática de un compuesto que se fija sobre un
ácido nucleico según la invención que consiste en hacer reaccionar
una subunidad trifosfato con un cebador empleando como molde un
ácido nucleico para el alargamiento del cebador, dicha subunidad
trifosfato contiene un grupo heterocíclico de la fórmula I. La
subunidad trifosfato tiene con preferencia la fórmula VI.
Otro objeto de la presente invención son, pues,
los compuestos de la fórmula general VI
en la
que
- A
- se elige entre el grupo formado por O, S y N-alquilo C_{1}-C_{6},
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, O-grupo protector, S-grupo protector, NH-grupo protector, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido, -SH, -S-alquilmercapto C_{1}-C_{6} y -NH_{2},
R^{15} y R^{16} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{8}, -alquenilo
C_{2}-C_{18}, -alquinilo
C_{2}-C_{18}, -(alquilo
C_{2}-C_{18})-carbonilo,
-(alquenilo
C_{3}-C_{19})-carbonilo,
-(alquinilo
C_{3}-C_{19})-carbonilo, -(arilo
C_{6}-C_{14})-alquilo
C_{1}-C_{8}, un grupo protector y un compuesto
de la fórmula
IV
en la
que
- T
- se elige entre el grupo formado por oxo, tioxo y selenoxo,
- U
- se elige entre el grupo formado por -OH, -SH, -SeH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alquilo C_{1}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, -(arilo C_{6}-C_{14})-alquilo C_{1}-C_{10}, -NR^{23}R^{24} y -O-(alquilo C_{1}-C_{10})-O-(alquilo C_{1}-C_{10})-R^{25}, o en el que NR^{23}R^{24} junto con N pueden formar un anillo heterocíclico de 5 ó 6 eslabones,
R^{23} y R^{24} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por
-alquilo C_{1}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{20}, -(arilo
C_{6}-C_{14})-alquilo
C_{1}-C_{10}, -(alquilo
C_{1}-C_{6})-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{26}R^{27},
- R^{25}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -halógeno, -amino, -alquilamino C_{1}-C_{18}, -COOH, -CONH_{2} y -COO-alquilo C_{1}-C_{4},
R^{26} y R^{27} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{6} y -(alcoxi
C_{1}-C_{4})-alquilo
C_{1}-C_{6},
- R^{29}
- se elige entre el grupo formado por -OR^{30} y -SR^{30},
- R^{30}
- se elige entre el grupo formado por -H, -alquilo C_{1}-C_{10}, -alquenilo C_{2}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, un grupo protector, un difosfato y un grupo informante, y
\newpage
M y M' con independencia entre sí
se eligen entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo,
-NR^{22}-, -alquilo C_{1}-C_{10} u -O-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y -S-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y
-NR^{22}-(alquilo
C_{1}-C_{6})-O-,
- R^{22}
- se elige entre el grupo formado por -H y -alquilo C_{1}-C_{10},
- B
- es un resto de la fórmula I,
en la que los restos alquilo, alquenilo y
alquinilo pueden estar sustituidos o sin sustituir y en la que por
lo menos uno de R^{15} y R^{16} no es un grupo de la fórmula IV
con la condición de que
MR^{16}, MR^{15} y R^{14} no
sean simultáneamente -OH si R^{1} es -NH_{2} y si se cumple
que
- W y X e Y y Z es N, o
- W y X y Z es N e Y es CR^{4}, o
- W e Y y Z es N y X es CR^{3}.
Con preferencia especial, en estos compuestos,
-MR^{16} es un grupo trifosfato y -MR^{15} es OH. El compuesto
más preferido es uno, en el que R^{14} es -OH.
Estos compuestos son en especial compuestos, en
los que el resto heterocíclico de la invención no ocupa la posición
terminal del compuesto que se fija sobre el ácido nucleico.
Son compuestos preferidos aquellos, en los que M
es oxi o sulfanodiilo, R^{16} es un compuesto de la fórmula IV, en
la que U es -OH, T es oxo o tioxo, R^{29} es -OR^{30} y R^{30}
es un grupo disfosfato y las sales de los mismos.
Son especialmente preferidos los compuestos de
la fórmula VIII
en la
que
- PPP
- es un grupo trifosfato,
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido y -NH_{2}, y
- B
- es un grupo de la fórmula I,
con la condición de que R^{14} no sea OH si B
es 2-azaadenina.
En otra forma preferida de ejecución, el grupo
de la fórmula I de los compuestos de la fórmula VII se elige entre
el grupo formado por los grupos de la fórmula I, en los que se
cumple que
- W es N, Z es N, Y es N y X es CR^{3}, o
- W es N, Z es C, Y es N y X es CR^{3}, o
- W es N, Z es N, Y es N y X es N.
Otro objeto de la invención es un método para
síntesis enzimática de un compuesto que se fija sobre un ácido
nucleico de la invención que consiste en hacer reaccionar una unidad
trifosfato con un cebador utilizando un molde de ácido nucleico para
el alargamiento del cebador, dicha subunidad trifosfato contiene un
grupo heterocíclico de la fórmula I.
\newpage
Con mayor preferencia, este método utiliza como
subunidad trifosfato un compuesto de la fórmula VIII ya definida
anteriormente.
Los compuestos de las fórmulas generales VI, VII
y VIII pueden obtenerse a partir de compuestos fácilmente
disponibles. En una primera forma de ejecución, los compuestos de la
fórmula VI caracterizados por el hecho de que el átomos de la
posición 2 (numeración de purina) se obtienen seleccionando el
compuesto correspondiente que tenga un átomo de carbono en esta
posición (con preferencia en el que MR^{15} es OH y M'R^{16} es
OH y R^{1} es NH_{2}), haciéndolo reaccionar con
2-cloroacetaldehído, rompiendo el anillo pirimidina
aplicando condiciones básicas y cerrándolo nuevamente utilizando
nitrito sódico y después hidrolizando el anillo imidazol
introducido por el aldehído. Con esta reacción se consigue
reemplazar el átomo de carbono de la posición 2 por un átomo de
nitrógeno.
Después se hace reaccionar este compuesto con
reactivos para insertar grupos protectores y/o grupos activadores,
por ejemplo fosforamiditas o fosfatos, sobre los grupos hidroxilo
que se quieren utilizar para la oligomerización. Los métodos para
insertar grupos protectores, por ejemplo el grupo dimetoxitritilo,
son conocidos en general de los expertos en la materia. También es
conocida en la técnica la inserción de grupos mono-, di- y
trifosfato.
En una forma preferida de ejecución, el método
para la obtención de un compuesto de la fórmula VII, en la que
R^{1} es un grupo amino protegido, M'R^{31} es un grupo
protector de O y MPR^{18}NR^{32}R^{17} es un grupo
O-fosforamidita, un compuesto de la fórmula VI, en
la que M'R^{16} y MR^{15} son en cada caso OH y R^{1} es
NH_{2}, se somete a condiciones para proteger el grupo amino, con
preferencia mediante un grupo protector dialquilaminometilideno,
después se hace reaccionar con reactivos para proteger el grupo
hidroxilo de la posición 5' y entonces se hace reaccionar con un
fosfano activado para obtener la fosforamidita. El compuesto
resultante de la fórmula VII puede utilizarse para la síntesis
química de introducción directa de la
2-aza-purina. El grupo protector de
R^{1} se eliminará durante la síntesis química.
Para una síntesis alternativa de la
2-aza-2'-desoxiadenosina
véase N. Yamaji, M. Kato, Chemistry Lett. 311-314,
1975).
Con los métodos anteriores es posible
principalmente introducir solamente un monómero que contenga el
resto de la invención, y también más de uno, si el caso lo requiere.
La reducción máxima de la T_{m} se consigue cuando se reemplazan
todos los C de la región de fijación. Esto permite un ajuste fino de
la Tm. Obviamente puede haber otros C en otras regiones, que no
intervienen en el apareo de bases con el ácido nucleico a
determinar.
Los compuestos de las fórmulas de I a VIII, en
los que cualquiera de los sustituyentes R^{1}, R^{2}, R^{3} y
R^{4} se eligen entre el grupo formado por halógeno, en especial
Cl, ciano o SR^{19} son útiles como productos intermedios para la
síntesis de compuestos, en los que estos sustituyentes se eligen
entre el grupo formado por -NR^{5}R^{6} y -OR^{13}, con
preferencia -NR^{5}R^{6}. Los productos intermedios pueden
convertirse en los productos finales mediante reacciones de
sustitución.
Otro objeto de la invención es un método para la
determinación de un ácido nucleico, que consta de los pasos de:
- proporcionar una muestra, de la que se
sospecha que contiene dicho ácido nucleico,
- proporcionar un compuesto que se fija sobre un
ácido nucleico según la reivindicación I, que es esencialmente
complementario de una parte o de todo dicho ácido nucleico,
- poner en contacto dicha muestra con dicho
compuesto que se fija sobre el ácido nucleico, en condiciones en las
que pueda tener lugar tal unión,
- determinar el producto de tal fijación que se
forma con dicho ácido nucleico y dicho compuesto que se fija sobre
él, como medida de la presencia de dicho ácido nucleico.
Los métodos para la determinación de ácidos
nucleicos ya son conocidos en general en la técnica, véase Sambrook
y col. (lugar citado). Pueden adaptarse fácilmente al uso de sonda
de la presente invención. El compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico se fijará con preferencia sobre el ácido nucleico en
solución, porque la reacción es más rápida que en fase sólida. Es
claro para los expertos en la materia el método para determinar la
Tm del híbrido del ácido nucleico a determinar y la sonda antes de
la construcción de un ensayo y de su resultado general. Después de
haberse determinado una vez, los expertos verán con claridad el modo
de elegir condiciones similares en cada ensayo empleando el mismo
analito de ácido nucleico.
Tal determinación se iniciará proporcionando una
muestra, de la que se sospecha que contiene el ácido nucleico a
determinar. La muestra puede someterse a los pasos de adaptar los
ácidos nucleicos a una forma apropiada, por ejemplo mediante lisado
de las células, que puedan contener los ácidos nucleicos, de lo
contrario no sería posible su determinación. Además, los pasos de
proporcionar la muestra pueden abarcar los pasos de purificar los
ácidos nucleicos a determinar de otros componentes de la muestra
original, que pudieran interferir en la determinación. Tales
componentes podrían ser enzimas que, si el ácido nucleico se extrae
de las células, podrían digerir o degradar dicho ácido nucleico, por
ejemplo las RNasas. Es preferido además eliminar de los ácidos
nucleicos los componentes de la muestra original que pudieran
afectar la amplificación de los ácidos nucleicos.
Existen diversas posibilidades de ejecución de
los métodos para la determinación de ácidos nucleicos empleando el
compuesto de fijación sobre ácidos nucleicos de la invención. En un
primer grupo, el compuesto que se fija sobre el ácido nucleico se
emplea en forma de sonda detectable. En este caso, el compuesto que
se fija sobre el ácido nucleico contendrá un grupo informante
detectable. Cualquier híbrido formado con el compuesto que se fija
sobre el ácido nucleico y un ácido nucleico puede determinarse
gracias al grupo informante detectable. Este grupo de ensayos puede
dividirse en dos grupos, uno es el formado por los ensayos
homogéneos y el otro es formado por los heterogéneos. En los
ensayos heterogéneos se determina con preferencia el híbrido
(producto resultante de la fijación), cuando este está unido a una
fase sólida. Esta forma de ejecución tiene la ventaja de que puede
eliminarse fácilmente del híbrido el exceso de sonda y de otros
componentes, con lo cual se facilita la determinación. El híbrido
formado puede quedar anclado sobre la fase sólida ya sea mediante
enlace covalente, no covalente, específico o no específico. Hay
varias formas de ejecución que son conocidas por los expertos en la
materia.
En los ensayos llamados homogéneos, el híbrido
no queda anclado sobre la fase sólida, sino que tiene que
determinarse directa o indirectamente en solución. Un ejemplo
preferido de tales ensayos se describe en el documento
EP-0 543 942. En este ensayo, el compuesto que se
fija sobre el ácido nucleico de la invención es especialmente útil
como sonda. Dado que los ensayos aludidos pueden requerir un ajuste
fino de las temperaturas de fusión de los cebadores y de las sondas
empleados en estos ensayos, será especialmente útil la presente
invención, ya que utiliza la modulación de una temperatura de fusión
del híbrido formado por el ácido nucleico a determinar o los
productos de amplificación del mismo y la sonda. Esto es
especialmente útil porque se conserva la selectividad, ya que la Tm
se reduce eligiendo un oligonucleótido
(n-x)-mero en lugar de un
oligonucleótido n-mero.
Otro objeto de la invención es, pues, un método
para la determinación de la presencia, ausencia o cantidad de un
ácido nucleico en una muestra, que consiste en los pasos:
- proporcionar cebadores, un primer cebador es
esencialmente complementario de una primera secuencia de fijación de
dicho ácido nucleico y un segundo cebador es esencialmente
complementario de una secuencia de fijación de un complemento de
este ácido nucleico y una sonda que es complementaria del ácido
nucleico o del complemento del mismo entre las secuencias de
fijación de dichos cebadores, dicha sonda está marcada en diferentes
subunidades por lo menos con dos grupos informantes diferentes,
- someter dicha muestra con dichos cebadores y
dicha sonda a condiciones que favorecen la extensión de dichos
cebadores y separar dichos grupos informantes entre sí mediante la
desintegración de la sonda y
- determinar el grado de desintegración de la
sonda mediante por lo menos uno de dichos grupos informantes,
en el que por lo menos uno de dichos cebador y/o
sonda es un compuesto que se fija sobre ácido nucleico, ya definido
antes. El punto de fusión de los cebadores y de la sonda se elegirá
de tal manera que las Tm sean similares, pero la Tm de la sonda es
más alta que las de los cebadores.
En otra forma de ejecución, el compuesto que se
fija sobre el ácido nucleico de la invención puede utilizarse como
sonda inmovilizable o inmovilizada para la fijación de cualquier
ácido nucleico sobre una fase sólida. Los modos de fijación del
compuesto se han descrito anteriormente. En un ensayo es posible
inmovilizar el compuesto antes de ponerlo en contacto con la muestra
o durante la puesta en contacto de la muestra con una fase sólida, o
incluso después del contacto de la muestra con la fase sólida. En
cada uno de estos casos, el ácido nucleico a determinar se fijará
sobre la fase sólida y, con preferencia, cualquier sustituyente de
la muestra que no tenga de determinarse podrá eliminarse de la fase
sólida por lavado, mientras que los compuestos y el ácido nucleico
permanecerán fijados a ella. A continuación puede determinarse el
híbrido fijado sobre la fase sólida por métodos ya conocidos, por
ejemplo empleando una sonda marcada con un marcador detectable, ya
descrita antes, o por determinación directa del híbrido, por ejemplo
poniendo en contacto el híbrido con los colorantes intercalados y
midiendo el cambio en la fase sólida.
En otra forma de ejecución, la sonda
inmovilizada se emplea para aislar o purificar un ácido
nucleico.
En otra forma preferida de ejecución se utiliza
un compuesto que se fija sobre un ácido nucleico que por un lado
está anclado sobre una fase sólida y por otra está marcado con un
grupo informante detectable. En este caso, el marcador es con
preferencia un grupo, cuyas propiedades detectables cambian cuando
el ácido nucleico a determinar se fija sobre la sonda. Una vez más,
estos compuestos ya son conocidos en la técnica.
Los expertos en la materia serán capaces de
diseñar la secuencia de un compuesto que se fija sobre un ácido
nucleico si conocen la secuencia del ácido nucleico sobre el que se
fija el compuesto que se pretende unir. En casi todos los casos, el
ácido nucleico tendrá una secuencia que contenga las cuatro bases
naturales de ácido nucleico. En este caso es preferible elegir todas
las bases que, una vez unidas a un tramo particular del ácido
nucleico, se colocan en posiciones capaces de apareo de bases de C,
A y T del ácido nucleico con G, T y A, respectivamente. Sin embargo,
estas bases pueden reemplazarse por otros bases equivalentes para
el apareo con las bases mencionadas del ácido nucleico. La base, que
está en una posición capaz de apareo con G del ácido nucleico, se
sustituirá ahora una o varias veces en el compuesto que se fija
sobre el ácido nucleico por un grupo de la fórmula I. Tal como se
describe en esta invención, el grupo de I puede tener también un
apareo de bases con otros restos, por ejemplo para forzar la
orientación de la fijación del modo antiparalelo (normal) a la
orientación paralela (no natural).
Otro objeto de la presente invención es el uso
de la 2-azapurina de la fórmula I en un compuesto
que se fija sobre el ácido nucleico como sustituto de la citosina,
en especial para la fijación de ácidos nucleicos, cuyas bases no
estén formadas exclusivamente por G.
Otro objeto de la presente invención es el uso
de la 2-azapurina de la fórmula I en reacciones de
hibridación de sondas con el ácido nucleico como base en la posición
de apareo de bases de la sonda con la G del ácido nucleico.
Otro objeto de la presente invención es un
producto de la unión de por lo menos un compuesto que se fija sobre
un ácido nucleico de la invención y un ácido nucleico, el compuesto
que se fija sobre el ácido nucleico y el ácido nucleico se unen
entre sí mediante apareo de bases en una orientación paralela o
antiparalela. El producto de esta unión contiene una molécula de
ácido nucleico y una molécula del compuesto que se fija sobre el
ácido nucleico, que forma un dúplex, o el producto de la unión puede
contener tres hebras, con lo cual será un tríplex. El tríplex puede
contener dos moléculas del compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico y una hebra de ácido nucleico o puede contener un compuesto
que se fija sobre un ácido nucleico y dos moléculas de ácido
nucleico. Cualquier tipo de tríplex que se forme dependerá de la
concentración y de la complementariedad del compuesto que se fija
sobre el ácido nucleico y dicho ácido nucleico.
La presente invención proporciona la posibilidad
de elegir Tm similares para un gran número de sondas provistas de
secuencias diferentes. Por tanto, un objeto particular de la
invención son los métodos, con los que se aíslan y se determinan
simultáneamente los ácidos nucleicos de diferentes secuencias.
En una primera forma de ejecución, este método
es un método llamado múltiplex de aislamiento o determinación de
ácidos nucleicos. En esta forma de ejecución se ponen en contacto
sondas, cada una de las cuales contiene una secuencia complementaria
de una secuencia de uno de los ácidos nucleicos (por ejemplo, los
ácidos nucleicos de diferentes virus, por ejemplo el HCV, HIV y HBV)
que tiene una T_{m} adaptada según la invención (una o varias
sondas contienen un grupo de la fórmula I), con la muestra, de la
que se sospecha que contiene dichos ácidos nucleicos. Según sea el
formato, los diferentes ácidos nucleicos podrán determinarse a
través de los híbridos formados con las sondas, ya sea en forma de
suma, ya sea de modo independiente.
Una segunda forma de ejecución se basa en los
ordenamientos de las sondas. En especial, un objeto de la invención
es un método para la determinación de la presencia o ausencia de
ácidos nucleicos, cada uno de los cuales contiene una secuencia
particular, en una muestra, que consta de los pasos de
- poner en contacto dicha muestra con una fase
sólida que tenga inmovilizado sobre su superficie los compuestos que
se fijan sobre ácidos nucleicos, cada uno de ellos tiene una
secuencia complementaria de la de dichas secuencias concretas de
dichos ácidos nucleicos;
- determinar sobre dicha fase sólida la
formación de híbridos que contengan un ácido nucleico con una
secuencia particular y el compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico que contiene la secuencia complementaria,
caracterizado porque por lo menos uno de dichos
compuestos que se fijan sobre ácidos nucleicos es un compuesto, que
consta de un esqueleto, dicho esqueleto tiene insertados grupos
heterocíclicos capaces de apareo con nucleobases naturales, por lo
menos uno de dichos grupos heterocíclicos es una nucleobase de
origen natural, caracterizado porque por lo menos uno de dichos
grupos heterocíclicos es un grupo de la fórmula general I.
Los métodos de este tipo son útiles cuando se
ensaya una muestra simultáneamente para detectar la presencia o
ausencia de ácidos nucleicos, por ejemplo una batería de diferentes
especies bacterianas. De este modo es posible no solo analizar una
especie tras otra, de modo discontinuo, sino también recibir
simultáneamente información de secuencia de diferentes ácidos
nucleicos. Estos tipos de métodos son conocidos en general en la
técnica. Sin embargo, en la presente invención se ha encontrado que
los compuestos que se fijan sobre ácidos nucleicos de la invención
son particularmente útiles para este tipo de ensayos, ya que la
temperatura de fusión puede ajustar a un valor muy similar para los
compuestos que se fijan sobre ácidos nucleicos de diferentes
secuencias y/o longitudes. Es evidente que para lograr temperaturas
de fusión similares de cada uno de los compuestos que se fijan sobre
ácidos nucleicos, no todos estos compuestos diferentes tienen que
modificarse según la invención, sino que los expertos en la materia
sabrán modificar justamente aquellos compuestos que no se comportan
como los demás, por ejemplo por tener temperaturas de fusión mucho
más elevadas que las temperaturas de fusión de otros compuestos que
se hallan en la misma fase sólida. Con cada C que se reemplaza según
la invención, la T_{m} bajará entre 3 y 6ºC, con preferencia
entre 4 y 5ºC. Los expertos en la materia tendrán al respecto, si se
compara con la tecnología de chip actualmente conocida, una mayor
flexibilidad para elegir secuencias concretas utilizadas para la
fijación de diferentes ácidos nucleicos. Por ejemplo, hasta el
presente se ha determinado que un contenido elevado de
G-C en tales regiones de ácidos nucleicos impide que
dichas regiones puedan utilizarse como regiones diana en ensayos
basados en sondas complementarias de tales regiones. Según la
presente invención, ahora pueden utilizarse en este tipo de ensayos
incluso estas regiones, que pueden ser muy específicas del ácido
nucleico a determinar.
Los ensayos que recurren a la tecnología del
ordenamiento son conocidos en general por los expertos en la
materia, por ejemplo por el documento
EP-A-0 476 014. Estas fases sólidas
son con preferencia soportes planos. Sobre su superficie, separados
solamente por ordenamientos de superficie, cada uno de los
ordenamientos tiene fijada una sonda que posee una secuencia
diferente, dirigida a una secuencia específica concreta de un ácido
nucleido. En función de las necesidades del ensayo actual, la
secuencia de la muestra será esencialmente complementaria de una (o
más) de las secuencias particulares contenidas en dicho ácido
nucleico a determinar. Durante el ensayo, cada ácido nucleico
encontrará la sonda de la superficie, sobre la que tiene que
fijarse. La determinación de la formación de híbridos en cada
ordenamiento sobre la fase sólida permite la determinación de la
presencia o ausencia de ácidos nucleicos que contienen una secuencia
particular, basándose en un cambio de una propiedad de este
ordenamiento específico. La evaluación de estos cambios se realizará
con preferencia con la asistencia de un programa computerizado, que
detecta qué secuencia particular está presente en un ordenamiento
concreto. Un chip puede contener de 2 a miles, o incluso millones
de de ordenamientos, cada uno de ellos está unido a un compuesto que
se fija sobre un ácido nucleico que tiene una secuencia específica,
que puede ser única. Sin embargo, es posible también determinar de
un grupo de diferentes ácidos nucleicos, cada uno de los cuales
tiene una secuencia en común, empleando precisamente un compuesto
que se fija sobre un ácido nucleico que es relativamente
inespecífico y de este modo la fijación de diferentes secuencias o
la selección de la secuencia de los compuestos que se fijan sobre el
ácido nucleico, por ejemplo la que se dirige a la secuencia que está
presente en diferentes ácidos nucleicos.
En una secuencia estrategia, ligeramente
diferente, tales ordenamientos pueden utilizarse para determinar la
secuencia de un ácido nucleico aplicando el método llamado
"sequencing by hybridization". En este modo, la muestra
contendrá con preferencia ácidos nucleicos que en su mayoría tienen
la misma secuencia. Esto puede lograrse aislando la secuencia de una
mezcla, en la que están contenidos o enriqueciéndolos mediante una
amplificación "in vitro" o "in vivo". La
secuencia de los compuestos que se fijan sobre ácido nucleicos
anclado sobre la fase sólida se seleccionará de modo que, juntos,
contengan la secuencia de abarca a la secuencia que se pretende
determinar en el ácido nucleico. Dentro de esta secuencia, las
secuencias de cada compuesto que se fija sobre un ácido nucleico se
solapará con una o más bases. En el paso de determinación de este
método se detectará a cuál de estas secuencias parciales se unirá el
ácido nucleico, cuál será la que ocurra de forma exclusiva
(idealmente), si una secuencia complementaria de la secuencia
parcial está contenida en un ácido nucleico a determinar. La
evaluación del resultado del ensayo se realizará con preferencia
media un ordenador. De este modo, el ordenador determinará entre
las secuencias parciales que están aparentemente contenidas en la
secuencia a determinar, en qué serie tendrá que ordenarse dentro del
ácido nucleico total. Especialmente en este tipo de ensayos es
especialmente útil la presente invención, porque esta estrategia
requiere que sobre la superficie se haya anclado un número elevado
de compuestos que se fijen sobre ácidos nucleicos, que no siempre
puede tener en cuenta los problemas que surgen por un contenido
elevado de G-C. En la presente invención es posible,
por tan-
to, secuenciar simultáneamente incluso ácidos nucleicos que tienen secuencias de contenido bajo y elevado de G-C.
to, secuenciar simultáneamente incluso ácidos nucleicos que tienen secuencias de contenido bajo y elevado de G-C.
Es obvio para los expertos en la materia que
cualquier compuesto aquí descrito puede estar presente en algún
grado en forma de tautómeros y de sales. Estos tautómeros y sales,
con preferencia las sales alcalinas, con preferencia especial las
sales sódicas, están comprendidas dentro de la definición de las
fórmulas y son objetos de la presente invención.
La presente invención se ilustra con mayor
detalle mediante los ejemplos siguientes.
Monómeros: Cromatografía flash (FC): a 0,5 bar
con gel de sílice 60 (Merck, Darmstadt, Alemania). Sistema de
disolventes para la FC y la cromatografía de capa fina (CCF):
CH_{2}Cl_{2}-MeOH 85:15 (A),
EtOAc-MeOH 3:1 (B),
CH_{2}Cl_{2}-MeOH 80:20 (C),
CH_{2}Cl_{2}-HOAc-MeOH 17:1:3
(D), CH_{2}Cl_{2}-MeOH 9:1 (E),
CH_{2}Cl_{2}-acetona 85:15 (F). Se recogen las
muestras con un colector de fracciones UltroRac II (LKB Instruments,
Suecia). Puntos de fusión: aparato Büchi SMP-20
(Büchi, Suiza). Espectros UV: espectrofotómetro
U-3200 (Hitachi, Japón). Espectros RMN:
espectrómeros AC-250 y AMX-500
(Bruker, Alemania); los valores \delta se refieren al patrón
interno de Me_{4}Si o externo de H_{3}PO_{4}. Se registran los
espectros de fluorescencia en H_{2}O en un espectrofotómetro de
fluorescencia F-4500 (Hitachi, Japón). Los
microanálisis se realizan en el Mikroanalytisches Laboratorium
Beller (Gottingen, Alemania).
Oligonucleótidos: Se sintetizan los
oligonucleótidos con un sintetizador del tipo ABI 392 DNA (Applied
Biosystems, Alemania) según el método estándar, aplicando el modo
"trityl-off", excepto para los
oligodesoxinucleótidos sin modificar, que se sintetizan aplicando el
modo "trityl-on". Los rendimientos de fijación
de fosforamiditas modificadas son por lo general del 95% en promedio
(seguimiento de la conductividad de tritilo). Los oligómeros
modificados destritilados se purifican por cromatografía de
intercambio iónico en una columna Dionex Nucleopac
PA-100 HPLC (4 x 250 mm, P/N 043010, Dionex GmbH,
Idstein, Alemania) aplicando el gradiente siguiente: 5 min 5% 0,01 M
NaOH/1,5 M LiCl acuoso (X) en 0,01 M NaOH (Y); 25 min
5-30% Y en X; 10 min 30-5% Y en X; 5
min 5% Y en X. El aparato HPLC de intercambio iónico: detector de
UV/VIS L-4250, bomba inteligente
L-6250 e integrador D-2500
(Merck-Hitachi, Alemania). Se purifican los
oligonucleótidos tritilados no modificados por HPLC en
RP-18 empleando el aparato y procedimiento
siguientes: columna RP-18 de 250 x 4 mm (Merck,
Alemania); aparato de HPLC de Merck-Hitachi que
consta de un cromatógrafo de líquidos 655 A-12 con
un monitor UV de longitud de onda variable 655 A y un
cromato-integrador D-2000
(Merck-Hitachi, Darmstadt, Alemania); gradientes de
0,1 M (Et_{3}NH)OAc (pH 7,0)/MeCN 95:5 (U) y MeCN (V);
gradiente I: 0-50 min 0-50% V en U,
caudal = 1 ml/min; gradiente II: 0-20 min
0-20% V en U, 20-40 min
20-40% V en U, caudal 1 ml/min. La destritilación se
realiza tratando los oligómeros purificados con una solución de
ácido dicloroacético al 2,5% en CH_{2}Cl_{2} (1 ml) durante 5
min. Después de la neutralización con Et_{3}N, concentración a
sequedad y posterior co-evaporación con MeOH, se
purifican de nuevo los oligómeros por HPLC en columna
RP-18 empleando el dispositivo recién mencionado.
Gradiente: 0-30 min 0-20% V en U,
30-35 min 20% V en U, 35-40 min 20
0% V en U, 40-45 min 0% V en U. La posterior
desalinización se realiza para todos los oligonucleótidos en una
columna RP-19 de HPLC (4 x 100 mm) empleando el
aparato recién descrito. Disolvente para la adsorción: H_{2}O,
disolvente para la desorción: MeOH-H_{2}O 3:2.
Caudal general: 1 ml/min. Los espectros de masas
MALDI-TOF los oligonucleótidos se registran en un
aparato de fabricación propia, empleando una irradiación láser UV a
337 nm durante 3 nseg.
Se realiza la hidrólisis enzimática de los
oligómeros del modo descrito en Helv. Chim. Acta 81,
1139-1155, 1998, pero utilizando un caudal de 0,6
ml/min. Se efectúa la cuantificación de los constituyentes sobre la
base de los picos de las áreas, que se dividen por los coeficientes
de extinción del nucleósidos (valores \varepsilon_{260}: dA
15400, dC 7300, dG 11400, dT 8800, z^{2}A_{d} 8200). Para la
hidrólisis enzimática de los oligonucleótidos se utilizan la
fosfodiesterasa de veneno de víbora (EC 3.1.15.1, Crotallus
durissus) y la fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1, E. coli),
suministradas por Roche Diagnostics GmbH.
Determinación de las curvas de fusión y
termodinámica: Los perfiles de absorbancia frente a temperatura se
miden en espectrofotómetros Cary 1 o 1E (Varian, Australia) con un
controlador termoeléctrico de tipo Cary. Los valores de la T_{m}
se miden en la celdilla de referencia con un resistor
Pt-100 y los datos termodinámicos (\DeltaHº,
\DeltaSº, \DeltaGº_{298}) se calculan con el programa MeltWin
3.0. Se registran los espectros de dicroísmo circular (CD) en un
espectropolarímetro Jasco 600 (Jasco, Japón), un baño controlado con
un termostato (Lauda RCS-6) en una cubeta de 1
cm.
Se disuelve la
2'-desoxiadenosina monohidratada (1) (5,0 g, 20
mmoles) en un tampón 1 M de acetato sódico acuoso (pH
4,5-5,0, 110 ml) por calentamiento a
40-50ºC. Se añade a la solución de cloroacetaldehído
(solución al 50% en agua, 7,7 moles/l, 25 ml) y se agita la mezcla
reaccionante a temperatura ambiente durante 70 h. Se concentra la
solución amarilla por evaporación a sequedad, se disuelve el residuo
en MeOH y se filtra para eliminar la sal inorgánica. Después de
lavar con MeOH se reúnen los líquidos filtrados y se concentran los
líquidos de lavado con vacuo a 40-50ºC. Se aplica el
residuo a FC (gel de sílice 60H, columna: 20 x 6 cm). Elución con
CH_{2}Cl_{2}-MeOH (85:15), obteniéndose una
fracción principal, a partir de la cual por evaporación del
disolvente y posterior cristalización en MeOH-EtOAc
se aísla el compuesto 5 (3,86 g, 70%) en forma de cristales
incoloros, de p.f. = 138-141ºC. CCF (gel de sílice,
EtOAc-MeOH = 3:1): R_{f} = 0,4. UV (MeOH):
\lambda_{máx} = 275 (7300), 265 (7600), 258 (6600), 229 nm
(35700). RMN-H^{1} (DMSO[D_{6}]) \delta
= 2,39 (m, 1H, H_{\alpha}-C(2')); 2,70 (m,
1H, H_{\beta}-C(2')); 3,57 (m, 1H,
H_{a}-C(5')); 3,67 (m, 1H,
H_{b}-C(5')); 3,88 (m, 1H,
H-C(4'); 4,43 (m, 1H,
H-C(3')); 4,99 (t, 1H, ^{3}J(H,H) =
5,2 Hz, 5'-OH); 5,38 (d, 1H, ^{3}J(H,H) =
3,8 Hz, 3'-OH); 6,47 (pt, 1H, ^{3}J(H,H) =
6,2 Hz, H-C(1')); 7,55 (s, 1H,
H-C(11); 8,07 (s, 1H, HC(10); 8,53 (s,
1H, H-C(2)); 9,29 (s, 1H,
H-C(8)).
Se trata el compuesto 5 (3,85 g, 14 mmoles) con
NaOH acuoso 1 N (60 ml) a temperatura ambiente durante una noche. Se
ajusta el pH de la mezcla reaccionante a 7 por adición de HCl acuoso
2N y se concentra, obteniéndose un jarabe. Se disuelve este en MeOH
absoluto, se filtra el NaCl precipitado y se lava con MeOH. Se
reúnen los líquidos filtrados y de lavado y se concentran. Se aplica
el residuo a FC (gel de sílice 60H, columna: 20 x 6 cm). Por elución
con CH_{2}Cl_{2}-MeOH (C) se obtiene una zona
principal, a partir de la cual se obtiene el compuesto 6 (2,70 g,
73%) en forma de espuma incolora que se utiliza para las reacciones
siguientes sin más purificación. Se cristaliza una muestra analítica
en MeOH-EtOAc para obtener cristales esféricos
incoloros; de p.f. = 91-93ºC (descomp.). CCF (gel de
sílice, CH_{2}Cl_{2}-HOAc-MeOH =
17:1:3): R_{f} = 0,22. UV (MeOH): \lambda_{máx} = 271 nm
(12800). RMN-H^{1} (DMSO[D_{6}]) \delta
= 2,21 (m, 1H, H_{\alpha}-C(2')); 2,47 (m,
1H, H_{\beta}-C(2')); 3,57 (m, 2H,
H_{2}-C(5')); 3,84 (m, 1H,
H-C(4')); 4,36 (m, 1H,
H-C(3')); 6,00 (pt. 1H. ^{3}J(H,H) =
6,5 Hz, H-C(1')); 6,60 (ancha s. NH_{2});
7,13 (s, 2H, H-C(4) +
H-C(5)); 7,55 (s, 1H,
H-C(2)); 8,16 (s, NH).
Se trata una solución del compuesto 6 (4,50 g,
17 mmoles) en una solución acuosa de HOAc al 80% con nitrito sódico
(1,17 g, 17 mmoles) en un baño de agua-hielo durante
1 h. Se concentra la mezcla reaccionante, obteniéndose un jarabe.
Este se disuelve en H_{2}O y se concentra repetida por evaporación
para eliminar el HOAc. Se aplica el residuo a FC (gel de sílice 60H,
columna: 20 x 6 cm). Por elución con
CH_{2}Cl_{2}-MeOH (85:15) y concentración se
obtiene el compuesto 7 (2,50 g, 53%); p.f. =
151-152ºC (descomp.). CCF (gel de sílice,
CH_{2}Cl_{2}-MeOH, 4:1): R_{f} = 0,5. UV
(MeOH): \lambda_{máx} = 282 nm (3100), 268 (3200), 238 nm
(37900). RMN-H^{1} (DMSO[D_{6}])
\delta = 2,54 (m, 1H, H_{\alpha}-C(2'));
2,85 (m, 1H, H_{\beta}-C(2')); 3,97 (m,
2H, H_{2}-C(5')); 4.00 (m, 1H,
H-C( 4')); 4,50 (m, 1H,
H-C(3')); 4,96 (t, 1H, ^{3}J(H,H) =
5,4 Hz, 5'-OH); 5,41 (d, 1H, ^{3}J(H,H) =
4,3 Hz, 3'-OH); 6,69 (pt, 1H, ^{3}J(H,H) =
6,3 Hz, H-C(1')); 7,85 (d, 1H,
^{3}J(H,H) = 1,1 Hz, H-C(11)); 8,75
(d, 1H, ^{3}J(H,H) = 1,1 Hz,
H-C(10); 8,95 (s, 1H,
H-C(8)). Análisis elemental calculado del
C_{11}H_{12}N_{6}O_{3} (276,25): C 47,83, H 4,38, N 30,42;
hallado: C 47,71, H 4,32, N 30,32.
Se disuelve el compuesto 7 (0,56 g, 2 mmoles) en
tampón acetato sódico acuoso 1M (pH 4,0-4,5; 120 ml)
por calentamiento a 40-50ºC. A esta solución se le
añade la N-bromosuccinimida (2,8 g, 16 mmoles) y se
agita la mezcla reaccionante a temperatura ambiente durante una
noche. Se concentra la mezcla reaccionante y se introduce en una
columna de intercambio iónico Dowex lx8 (3 x 12 cm, forma OH^{-}).
Por elución con H_{2}O (250 ml) se obtiene el compuesto 2 (0,19 g,
38%) en forma de agujas incoloras, que descomponen por encima de
185ºC. El producto de reacción es idéntico a una muestra auténtica
en todos los aspectos^{[21]}.
Ejemplo
5
(Referencia)
7-(2-desoxi-\beta-D-eritro-pentofuranosil)-7H-imidazo[4,5-d][1,2,3]-triazin-4-ona
(2-aza-2'-desoxiinosina,
(3))
Se disuelve el compuesto 2 (19 mg, 0,076 mmoles)
en H_{2}O y se le añade la adenosina-desaminasa (2
\mug, de intestino de ternera, disuelta en glicerina). Se agita la
mezcla reaccionante a temperatura ambiente durante 18 h hasta que el
compuesto 2 desparezca por completo (seguimiento de la reacción por
UV) y después se concentra a sequedad en un concentrador SpeedVac.
UV (H_{2}O): \lambda_{máx} = 247 (5500), 290 nm (6200).
RMN-H^{1} (D_{2}O): \delta = 2,49 (m, 1H,
H_{\alpha}-C(2')); 2,75 (m, 1H,
H_{\beta}-C(2')); 3,41, 3,50 (2m, 2H,
H_{2}-C(5')); 4,03 (m, 1H, HC(4'));
4,51 (m, 1H, H-C(3')); 6,43 (pt, 1H,
^{3}J(H,H) = 3,2 Hz, H-C(1')); 8,31
(s, 1H, H-C(8)).
Se concentra el compuesto 2 (125 mg, 0,5 mmoles)
por co-evaporación dos veces con piridina anhidra.
Se suspende el residuo en piridina anhidra y se trata con cloruro de
trimetilsililo (0,5 ml, 4 mmoles). Después de unos pocos minutos de
agitación se forman una solución transparente. Se agita la mezcla
reaccionante a temperatura ambiente durante 2 h. A continuación se
añade cloruro de benzoílo (0,25 ml, 2 mmoles) y se prosigue la
agitación durante 2 h más. Se enfría la mezcla reaccionante en un
baño de agua-hielo y se le añade H_{2}O (1 ml).
Después de 10 min se trata la mezcla reaccionante con NH_{3}
acuoso concentrado (0,8 ml) y se deja en reposo durante 30 min más.
Se concentra la mezcla a sequedad, se trata con H_{2}O y se extrae
con EtOAc (3 X 20 ml). Se reúnen los extractos, se secan
(Na_{2}SO_{4}) y se introducen en una columna de gel de sílice
(3 X 15 cm). Se efectúa la elución con CH_{2}Cl_{2} (150 ml) y
después con CH_{2}Cl_{2}-MeOH (9:1). Se
concentran a sequedad las fracciones que contienen nucleósido y se
cristaliza el compuesto 8 en MeOH-H_{2}O,
obteniéndose agujas incoloras (135 mg, 76%), de p.f. =
208-210ºC (descomp. > 170ºC). CCF (gel de sílice,
CH_{2}Cl_{2}-MeOH 9:1): R_{f} = 0,31. UV:
(MeOH al 10% en agua): \lambda_{máx} = 233 (15600), 276 nm
(16400). RMN-H^{1} (DMSO[D_{6}]):
\delta = 2,97 (2m, 2H, H_{2}-C(2')); 3,69
(m, 2H, H_{2}-C(5')); 4,00 (m, 1H,
H-C(4')); 4,57 (m, 1H,
H-C(3')); 5,07 (t, 1H, ^{3}J(H,H) =
4,8 Hz, 5'-OH); 5,49 (d, 1H, ^{3}J(H,H) =
4,0 Hz, 3'-OH); 6,72 (t, 1H, ^{3}J(H,H) =
6,5 Hz, H-C(1')); 7,61-7,78
(m, 4H, aromático-H), 8,16 (d, 2H,
aromático-H); 9,09 (s, 1H,
H-C(8)); 11,84 (s, 1H, N-H).
Análisis elemental calculado del C_{16}H_{16}N_{6}O_{4}
(356,3): C 52,93, H 4,41, N 23,38; hallado: C 52,68, H 4,39, N
23,07.
A una suspensión agitada del compuesto 2 (63 mg,
0,25 mmoles) en MeOH (5 ml) se le añade el dimetilacetal de la
N,N-dimetilformamida (120 mg, 0,5 mmoles). Se
continúa la agitación a temperatura ambiente durante 2 h. Se
concentra la mezcla reaccionante a sequedad y se adsorbed sobre gel
de sílice. Por cromatografía flash en una columna de gel de sílice
(3 X 10 cm) con CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y después con
CH_{2}Cl_{2}-MeOH (9:1) se obtienen agujas
incoloras (MeOH-H_{2}O, 65 mg, 85%), de p.f. =
173-175ºC. CCF (gel de sílice,
CH_{2}Cl_{2}-MeOH = 9:1): R_{f} = 0,28. UV:
(MeOH al 10% en H_{2}O): \lambda_{máx} = 234 (13250), 319 nm
(29500). RMN-H^{1} (DMSO[D_{6}]):
\delta = 2,84 (2m, 2H, H-C(2')); 3,17, 3,25
(2s, 2H, N-CH_{3}); 3,60 (m, 2H,
H_{2}-C(5')); 3,92 (m, 1H,
H-C(4')); 4,47 (m, 1H, HC(3')); 5,05
(t, 1H, ^{3}J(H,H) = 4,9 Hz, 5'-OH); 5,39
(d, 1H, ^{3}J(H,H) = 4,0 Hz, 3'-OH); 6,55
(t, 1H, ^{3}J(H,H) = 6,6 Hz,
H-C(1')); 8,79 (s, 1H, N=CH); 9,08 (s, 1H,
H-C(8)). Análisis elemental calculado del
C_{12}H_{17}N_{7}O_{3} (307,3): C 46,90, H 5,58, N 31,90;
hallado: C 46,55, H 5,68, N 31,66.
Del modo descrito para el compuesto 9a pero
empleando el dimetilacetal de la
N,N-diisobutilformamida. Cristales incoloros (72%),
de p.f. = 138-140ºC. CCF (gel de sílice,
CH_{2}Cl_{2}-MeOH = 9:1): R_{f} = 0,40. UV
(MeOH al 10% en agua): \lambda_{máx} 236 (10100), 325 nm
(25850). RMN-H^{1} (DMSO[D_{6}]):
\delta = 0,88, 0,94 (2d, 12H, CH_{3}); 1,95, 2,20 (2m, 2H, CH);
2,80 (2m, 2H, H_{2}-C(2'));
3,30-3,74 (m, 6H,
H_{2}-C(5') y 2 CH_{2}); 4,00 (m, 1H,
H-C(4')); 4,45 (m, 1H,
H-C(3')); 5,03 (t, 1H, ^{3}J(H,H) =
4,9 Hz, 5'-OH); 5,37 (d, 1H, ^{3}J(H,H) =
4,0 Hz, 3'-OH); 6,54 (t, 1H, ^{3}J(H,H) =
6,4 Hz, H-C(1')); 8,78 (s, 1H, N=CH); 9,10
(s, 1H, H-C(8)). Análisis elemental calculado
del C_{18}H_{29}N_{7}O_{3} \cdot 1/2 H_{2}O (400,5): C
53,99, H 7,55, N 24,48; hallado: C 53,65, H 7,62, N 24,11.
Se obtiene del modo descrito para el compuesto
9a pero empleando el dimetilacetal de la
N,N-di-n-butilformamida.
Agujas incoloras (75%), de p.f. = 107-109ºC. CCF
(gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}-MeOH = 9:1):
R_{f} = 0,42. UV: (MeOH al 10% en agua): \lambda_{máx} = 235
(10200), 325 nm (25700). RMN-H^{1}
(DMSO[D_{6}]): \delta = 0,93 (t, 6H, CH_{3}), 1,33,
1,64, 3,70 (3m, 12H, -CH_{2}-); 2,45, 2,80 (2m, 2H,
H_{2}-C(2')); 3,60 (m, 2H,
H_{2}-C(5')); 3,92 (m, 1H,
H-C(4')); 4,48 (m, 1H, HC(3')); 5,04
(t, 1H, ^{3}J(H,H) = 5,8 Hz, 5'-OH); 5,39
(d, 1H, 3(H,H) = 4,0 Hz, 3'-OH); 6,55 (pt,
1H, ^{3}J(H,H) = 6,3 Hz, H-C(1'));
8,78 (s, 1H, N=CH); 9,08 (s, 1H, HC(8)). Análisis elemental
calculado del C_{18}H_{29}N_{7}O_{3} (391,5): C 55,23, H
7,47, N 25,05; hallado: C 55,36, H 7,66, N 24,97.
Se concentra el compuesto 9c (390 mg, 1 mmol)
por co-evaporación dos veces con piridina y se
disuelve el residuo aceitoso en piridina anhidra (6 ml). A
continuación se añade el cloruro de
4,4'-dimetoxitrifenilmetilo (450 mg, 1,3 mmoles) y
se agita la mezcla reaccionante a temperatura ambiente durante 2 h.
A continuación se añade el MeOH (0,2 mL) y se continúa la agitación
durante 15 min. Se vierte la mezcla reaccionante sobre 15 ml de una
solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% y se extrae esta dos veces con
CH_{2}Cl_{2} (30 ml, cada vez). Se reúnen los extractos
orgánicos, se secan con Na_{2}SO_{4}, se concentran y se adsorbe
el residuo sobre gel de sílice. Se introduce este en una columna de
gel de sílice 60H (4 X 14 cm) y se cromatografía con un gradiente de
CH_{2}Cl_{2}-acetona (del 0 al 25% de acetona,
volumen total = 600 ml). Se recogen las fracciones que contienen
nucleósido y se concentran por evaporación, obteniéndose el
compuesto 10a en forma de espuma sólida (560 mg, 81%). CCF: (gel de
sílice, CH_{2}Cl_{2}-acetona = 85:15): R_{f} =
0,15. RMN-H^{1} (DMSO[D_{6}]): \delta =
0,93 (t, 6H, CH_{3}); 1,34, 1,63, 3,75 (3m, 12H, -CH_{2}-); 2,95
(2m, 2H, H-C(2')); 3,51 (m, 2H,
H_{2}-C(5')); 3,63, 3,69 (2s, 6H,
OCH_{3}); 4,01 (m, 1H, H-C(4')); 4,59 (m,
1H, H-C(3')); 5,45 (d, 1H,
^{3}J(H,H) = 4,1 Hz, 3'-OH); 6,57 (pt, 1H,
^{3}J(H,H) = 6,2 Hz, H-C(1'));
6,60-7,30 (m, 13H, fenil-H); 8,71
(s, 1H, N=CH), 9,07 (s, 1H, H-C(8)).
Análisis elemental calculado del C_{39}H_{47}N_{7}O_{5} (693,8): C 67,51; H 6,83; N 14,13; hallado: C 67,15, H 6,82, N 14,13.
Análisis elemental calculado del C_{39}H_{47}N_{7}O_{5} (693,8): C 67,51; H 6,83; N 14,13; hallado: C 67,15, H 6,82, N 14,13.
A una solución del compuesto 10a (300 mg, 0,43
mmoles) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (20 ml) se le añaden en
atmósfera de argón la N,N-diisopropiletilamina (145
\mul, 0,88 mmoles) y la
cloro-(2-cianoetoxi)-N,N-diisopropilaminofosfina
(143 \mul, 0,62 mmoles). Después de agitar a temperatura ambiente
durante 20 min se añade una solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% (15
ml) y se extrae la mezcla con CH_{2}Cl_{2} (2 x 30 ml). Se seca
la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}), se filtra y se concentra. Por
FC (gel de sílice, columna de 5 x 10 cm, CH_{2}Cl_{2}/acetona =
85:15) se obtiene una mezcla de diastereoisómeros del compuesto
epigrafiado (300 mg, 78%). CCF (gel de sílice,
CH_{2}Cl_{2}/acetona = 85:15): R_{f} = 0,71, 0,80.
RMN-P^{31} (CDCl_{3}): 149,962, 150,223.
A una solución de
5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-6-N-((di-n-butilamino)metileno)-2-aza-2'-desoxiadenosina
(300 mg, 0,43 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} anh. (20 ml) y se le
añaden (i-Pr)_{2}EtN (145 \mul, 0,88
mmoles) y
cloro-(2-cianoetoxi)(diisopro-
pilamino)fosfina (143 \mul, 0,62 mmoles). Después de agitar a t.amb. durante 20 min se añade una solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% (15 ml) y se extrae la mezcla con CH_{2}Cl_{2} (2 x 30 ml). Se seca la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}), se filtra y se concentra. Por FC (gel de sílice, columna 5 x 10 cm, CH_{2}Cl_{2}/acetona = 85:15) se obtiene una mezcla de diastereoisómeros NR-411 (300 mg, 77%). CCF (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/acetona = 85:15): R_{f} = 0,71, 0,80, RMN-P^{31} (CDCl_{3}): 149,962, 150,223.
pilamino)fosfina (143 \mul, 0,62 mmoles). Después de agitar a t.amb. durante 20 min se añade una solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% (15 ml) y se extrae la mezcla con CH_{2}Cl_{2} (2 x 30 ml). Se seca la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}), se filtra y se concentra. Por FC (gel de sílice, columna 5 x 10 cm, CH_{2}Cl_{2}/acetona = 85:15) se obtiene una mezcla de diastereoisómeros NR-411 (300 mg, 77%). CCF (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/acetona = 85:15): R_{f} = 0,71, 0,80, RMN-P^{31} (CDCl_{3}): 149,962, 150,223.
La síntesis de compuestos que se fijan sobre
ácidos nucleicos utilizando los monómeros del ejemplo 12.
Se realiza la síntesis del modo descrito en la
sección general.
Determinación de ácidos nucleicos empleando
sondas con arreglo al ejemplo 13
Se construyen los dos oligonucleótidos
5'-d(TAGGTCAATACT) y
5'-d(AGTATTGACCTA) para formar un híbrido
estable con un valor T_{m} de 47ºC. Se utiliza este dúplex como
patrón para estudiar la influencia de las bases modificadas en la
estructura y la estabilidad del dúplex. De la tabla 1 se desprende
que el reemplazo de un dA - dT central por un par de bases
z^{2}A_{d} - dT reduce la T_{m} del dúplex en 5º; el
intercambio de los pares de bases revela una disminución de la
T_{m} en 10º. La reducción de la estabilidad del dúplex es
obviamente independiente de la posición de par de bases reemplazado:
el dúplex que tiene dos pares de bases z^{2}A_{d} - dT
consecutivos presenta la misma T_{m} que el dúplex, en el que los
pares de bases modificados están separados por tres pares normales.
La estabilidad del dúplex sigue disminuyendo linealmente cuando
aumento el número de pares de bases z^{2}A_{d} - dT; el
oligonucleótido que contiene cuatro pares modificados tiene una
T_{m} de solamente 28ºC. Este resultado está en un contraste
sorprendente con los valores hallados en oligonucleótidos en los que
los restos dA se reemplazan por
8-aza-2'-desoxiadenosina;
aquí la introducción incluso de cuatro restos z^{8}A_{d} en
lugar de dA no ejerce influencia alguna en la estabilidad del
dúplex.
Tal como se desprende de la tabla 1, la Tm de un
oligonucleótido que en la posición 7 tenga un par de bases
G-C (último renglón de la tabla 1) tiene una Tm de
54ºC. Reemplazando dos C de estos pares de bases por
2-aza-adenina se obtiene una Tm de
46ºC (7 dúplex). La misma Tm está presente cuando estos pares de
bases artificiales se reemplazan por el par de bases natural
A-T (primer dúplex). Además, el dúplex que tiene un
par de bases mixto 2-aza-adenina/G y
A-T (tercer dúplex). De la tabla 1 se puede deducir
también que el reemplazo de un par de bases G-C por
un par de bases artificial de la presente invención reduce la Tm
entre 3 y 5ºC, con preferencia 4ºC.
Los resultados recién descritos se obtienen en
dúplex de orientación de cadena antiparalela. Sin embargo, el mismo
resultado se encuentra también en los dúplex de oligonucleótido de
una polaridad de hebra paralela. La orientación de la cadena del DNA
de origen natural es antiparalela (aps). Esta orientación puede
volverse en paralela cuando el dúplex contiene pares de bases
isoG_{d}-dC y/o
isoMe^{5}C_{d}-dG (Helv. Chim. Acta 80,
73-85, 1997). Dado que el apareo de dA y dT es
ambiguo, cualquier DNA natural podrá hibridarse en modo paralelo
cuando la segunda hebra contenga las bases isoguanina, isocitosina,
adenina y timina. Como ejemplo, un dúplex recogido en la tabla 1.
Cuando en este dúplex se reemplazan dos pares de bases dA - dT por
z^{2}A_{d} - dT, se determina una reducción del valor T_{m} de
10º, que es idéntico a los resultados obtenidos con los
correspondientes dúplex de oligonucleótidos antiparalelos.
Los datos de la T_{m} recogidos en la tabla 1
presentan otro rasgo interesante de las propiedades de apareamiento
de bases de z^{2}A_{d} (2). Estimulados por el hallazgo de que
el reemplazo de un par de bases central destabilizante
z^{2}A_{d} - dT por z^{2}A_{d}-dG aumenta el
valor de T_{m} del oligómero volviendo al valor del dúplex sin
modificar (T_{m} = 46ºC), hemos investigado las estabilidades de
dúplex de los oligómeros que contienen apareos defectuosos
(mismatches).
A tal fin se sintetizan oligodesoxinucleótidos,
en los que dos restos z^{2}A_{d} centrales se colocan en
posición opuesta a dos restos dT, dA, dC o dG. En todos los casos,
excepto para los dúplex que contienen
z^{2}A_{d}-dG, el valor T_{m} disminuye
significativamente, del modo más pronunciado en el oligómero que
tiene dos pares z^{2}A_{d}-dC. Sin embargo, este
nucleótido presenta casi el mismo valor que el dúplex sin modificar.
Esto nos urgió a proponer un par de bases
z^{2}A_{d}-dG, tal como se indica en la figura 1
y figura 6 (motivo I). Por lo tanto, la presente invención puede
utilizarse en ensayos, en los que los ácidos nucleicos deberían
discriminarse recurriendo a apareos defectuosos (mismatches).
Estos hallazgos sobre el peculiar apareo de
bases de la
2-aza-2'-desoxiadenosina
implica que este nucleósido presenta propiedades de apareo similares
a las de la 2'-desoxiisoguanosina (isoG_{d}),
tanto más por cuanto ambos presentan modelos similares de enlace de
hidrógeno dador-aceptor, cuando asumen una forma
tautómera ceto/H-N(3) de la
2'-desoxiisoguanosina (figura 6, motivo II).
Obviamente, esta última forma un par de bases
purina-purina con la
2'-desoxiguanosina de oligodesoxinucleótidos que
tienen polaridad antiparalela de hebras, pero pares de bases
significativamente más débiles con la dC y la dT y, en particular,
con la dA.
Con la ayuda de estos resultados hemos
anticipado que, en los oligonucleótidos de orientación paralela, la
2-aza-2'-desoxiadenosina
formará un par de bases con la isoG_{d} (figura 7, motivo III) en
condiciones neutras así como con la dC protonada (figura 7, motivo
V) de dúplex de orientación antiparalela. Por otro lado, con la
2'-desoxiisocitidina protonada se podría formar un
par de bases antiparalelo con arreglo al motivo estructural VI
representado en la
figura 7.
figura 7.
Claims (29)
1. Un compuesto que se fija sobre un ácido
nucleico que consta de un esqueleto, dicho esqueleto tiene
insertados grupos heterocíclicos capaces de apareo con nucleobases
naturales, por lo menos uno de dichos grupos heterocíclicos es una
de las monobases de origen natural, caracterizado porque por
lo menos uno de dichos grupos heterocíclicos es un grupo de la
fórmula general I
en la
que
- W
- es N,
- Z
- se elige entre el grupo formado por N y C con la condición de que
- - si
- Z es N, entonces
- \quad
- X con independencia de Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{3} e
- \quad
- Y con independencia de X se elige entre el grupo formado por N y CR^{4},
- \quad
- y el enlace entre X e Y es un doble enlace y el enlace entre Y y Z es un enlace simple y
- - si
- Z es C, entonces
- \quad
- Xes NR^{33} e
- \quad
- Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{4} y
- \quad
- el enlace entre Z e Y es un doble enlace y el enlace entre X e Y es un enlace simple,
en la
que
- R^{1}
- es -NR^{5}R^{6},
R^{3} y R^{4} con independencia
entre sí se eligen entre el grupo formado por -H, -halógeno,
-OR^{13}, -SR^{19}, -alquilo C_{1}-C_{10},
-alquenilo C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -NO_{2}, -NR^{5}R^{6},
-ciano y
-C(=O)R^{11},
- R^{11}
- se elige entre el grupo formado por -OH, -alcoxi C_{1}-C_{6}, -ariloxi C_{6}-C_{22} y NHR^{12},
R^{5}, R^{6}, R^{12},
R^{13}, R^{19} y R^{33} con independencia entre sí se eligen
entre el grupo formado por -H, -alquilo
C_{1}-C_{10}, -alquenilo
C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{22}, un grupo protector y un grupo
informante,
r y s con independencia entre sí
son números enteros de 1 a
18,
- D
- es la posición de unión del grupo al resto del compuesto que se fija sobre el ácido nucleico y
dichos grupos alquilo, alquenilo y alquinilo
están sin sustituir o sustituidos por uno o más restos elegidos
entre el grupo formado por -halógeno, -SH,
-S-alquilo C_{1}-C_{6}, -alcoxi
C_{1}-C_{6}, -OH, -NR^{5}R^{6}, -COR^{11},
-NH-CONR^{5}R^{6},
-NH-CSNR^{5}R^{6} y
-[O-(CH_{2})_{r}]_{s}-NR^{5}R^{6}.
2. El compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico de la reivindicación 1, en el que el esqueleto contiene
restos azúcar y fosfato.
\newpage
3. Un compuesto que se fija sobre un ácido
nucleico de la reivindicación 2, en el que la configuración de
azúcar se elige entre el grupo formado por las configuraciones
\alpha-D, \beta-D,
\alpha-L y \beta-L.
4. El compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico de la reivindicación 3, en el que el resto azúcar es un
resto
2'-desoxi-\beta-D-eritropentofuranosilo.
2'-desoxi-\beta-D-eritropentofuranosilo.
5. El compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones
1-4, en el que el esqueleto contiene uno o más
restos de la fórmula general II
en la
que
- A
- se elige entre el grupo formado por O, S y N-alquilo C_{1}-C_{10},
- L
- se elige entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo y -NR^{22}-,
- T
- se elige entre el grupo formado por oxo, tioxo y selenoxo,
- U
- se elige entre el grupo formado por -OH, -O-grupo informante, -SH, -S-grupo informante, -SeH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alquilo C_{1}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, -(aril C_{6}-C_{14})-alquilo C_{1}-C_{10}, -NR^{23}R^{24} y -O-(alquilo C_{1}-C_{10})-O-(alquilo C_{1}-C_{10})-R^{25}, o en la que -NR^{23}R^{24} junto con N puede formar un anillo heterocíclico de 5 ó 6 eslabones,
- V
- se elige entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo y -NR^{22}-,
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido, -O-alilo, -O-alquinilo y -NH_{2},
- R^{22}
- con independencia de su aparición se elige entre el grupo formado por -H y -alquilo C_{1}-C_{10},
R^{23} y R^{24} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -alquilo
C_{1}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{20}, -(arilo
C_{6}-C_{14})-alquilo
C_{1}-C_{10}, -alquilo
C_{1}-C_{6}-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{26}R^{27}
y un grupo
informante,
- R^{25}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -halógeno, -amino, -alquilamino C_{1}-C_{18}, -COOH, -CONH_{2} y -COO-alquilo C_{1}-C_{4} y un grupo informante,
R^{26} y R^{27} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{6} y -(alcoxi
C_{1}-C_{4})-alquilo
C_{1}-C_{6} y un grupo
informante,
- c
- es un número entero de 2 a 6,
- d
- es un número entero de 0 a 6 y
- B
- un resto de la fórmula I,
en la que cualquier alquilo, alquenilo y
alquinilo puede estar sustituido o sin sustituir.
6. El compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico de la reivindicación I, en el que R^{1} es -NH_{2}.
7. El compuesto de ácido nucleico de la
reivindicación 1, que contiene por lo menos un grupo informante.
8. El compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico de la reivindicación 1, en el que el esqueleto contiene un
resto de la fórmula general III
en la
que
- A
- se elige entre el grupo formado por O, S y N-alquilo C_{1-}C_{6},
- M
- se elige entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo, -NR^{22}-, -alquilo C_{1}-C_{10}- u -O-(alquilo C_{1}-C_{10})-O- y -S-(alquilo C_{1}-C_{10})-O- y -NR^{22}-(alquilo C_{1}-C_{6})-O-,
- R^{22}
- se elige entre el grupo formado por -H, -alquilo C_{1}-C_{10}, un grupo protector y un grupo informante,
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -alquiniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido, -SH, -alquilmercapto C_{1}-C_{10} y -NH_{2},
- R^{15}
- se elige entre el grupo formado por -H, -alquilo C_{1}-C_{6}, -alquenilo C_{2}-C_{10}, -alquinilo C_{2}-C_{10}, -(alquilo C_{2}-C_{10})-carbonilo, -(alquenilo C_{3}-C_{19})-carbonilo, -(alquinilo C_{3}-C_{19})-carbonilo, -(arilo C_{6}-C_{14})-alquilo C_{1}-C_{10}, una fase sólida y un grupo de la fórmula IV
en la
que
- T
- se elige entre el grupo formado por oxo, tioxo y selenoxo y
- U
- se elige entre el grupo formado por -OH, -O-grupo informante, -SH, -SeH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alquilo C_{1}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, -(arilo C_{6}-C_{14})-alquilo C_{1}-C_{10}, -NR^{23}R^{24} y -O-(alquilo C_{1}-C_{10})-O-(alquilo C_{1}-C_{10})-R^{25} o bien en el que NR^{23}R^{24} junto con N pueden formar un anillo heterocíclico de 5 ó 6 eslabones,
R^{23} y R^{24} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -alquilo
C_{1}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{20}, -(arilo
C_{6}-C_{14})-alquilo
C_{1}-C_{10}, -(alquilo
C_{1}-C_{6})-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{26}R^{27},
- R^{25}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -halógeno, -amino, -alquilamino C_{1}-C_{18}, -COOH, -CONH_{2} y -COO-alquilo C_{1}-C_{4},
R^{26} y R^{27} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{6} y -(alcoxi
C_{1}-C_{4})-alquilo
C_{1}-C_{6},
- R^{29}
- se elige entre el grupo formado por -OR^{30} y -SR^{30},
- R^{30}
- se elige entre el grupo formado por -H, -alquilo C_{1}-C_{10}, -alquenilo C_{2}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, un grupo protector, una fase sólida y un grupo informante
- B
- es el enlace con el resto de la fórmula I,
en la que cualquier alquilo, alquenilo y
alquinilo puede estar sustituido o sin sustituir.
9. El compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 y 6, en el
que dicho esqueleto contiene un resto de la fórmula V,
en la
que
- A
- se elige entre el grupo formado por O, S y N-alquilo C_{1}-C_{6},
- M'
- se elige entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo, -NR^{22}-, -alquilo C_{1}-C_{10} u -O-(alquilo C_{1}-C_{10})-O- y -S-(alquilo C_{1}-C_{10})-O- y -NR^{22}-(alquilo C_{1}-C_{6})-O-,
- R^{22}
- se elige entre el grupo formado por -H, un grupo protector, un grupo informante y -alquilo C_{1}-C_{10},
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -alquiniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido, -SH, -S-alquilmercapto C_{1}-C_{6} y -NH_{2},
- R^{16}
- se elige entre el grupo formado por -H, -alquilo C_{1}-C_{8}, -alquenilo C_{2}-C_{18}, -alquinilo C_{2}-C_{18}, -(alquilo C_{2}-C_{18})-carbonilo, -(alquenilo C_{3}-C_{19})-carbonilo, -(alquinilo C_{3}-C_{19})-carbonilo, -(arilo C_{6}-C_{14})-alquilo C_{1}-C_{8}, un grupo protector y un compuesto de la fórmula IV
en la
que
- T
- se elige entre el grupo formado por oxo, tioxo y selenoxo,
- U
- se elige entre el grupo formado por -OH, -SH, -SeH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alquilo C_{1}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, -(arilo C_{6}-C_{14})-alquilo C_{1}-C_{10}, -NR^{23}R^{24} y -O-(alquilo C_{1}-C_{10})-O-(alquilo C_{1}-C_{10})-R^{25}, en el que NR^{23}R^{24} junto con N pueden formar un anillo heterocíclico de 5 ó 6 eslabones,
R^{23} y R^{24} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -alquilo
C_{1}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{20}, -(arilo
C_{6}-C_{14})-alquilo
C_{1}-C_{10}, -(alquilo
C_{1}-C_{6})-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{26}R^{27},
- R^{25}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -halógeno, -amino, -alquilamino C_{1}-C_{18}, -COOH, -CONH_{2} y -COO-alquilo C_{1}-C_{4},
R^{26} y R^{27} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{6} y -(alcoxi
C_{1}-C_{4})-alquilo
C_{1}-C_{6},
- R^{29}
- se elige entre el grupo formado por -OR^{30} y -SR^{30},
- R^{30}
- se elige entre el grupo formado por -H, -alquilo C_{1}-C_{10}, -alquenilo C_{2}-C_{10}, -arilo C_{6}-C_{22}, un grupo protector, una fase sólida y un grupo informante, y
- B
- es el enlace con el resto de la fórmula I,
en los que cualquier alquilo, alquenilo y
alquinilo puede estar sustituido o sin sustituir.
10. El compuesto de la reivindicación 9, en el
que M' es O, R^{16} es H y R^{14} se elige entre el grupo
formado por -H y -OH.
11. Un compuesto de la fórmula VII
en la
que
- A
- se elige del grupo formado por O, S y N-alquilo C_{1}-C_{6},
M y M' con independencia entre sí
se eligen entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo,
-NR^{22}-, -alquilo C_{1}-C_{10} u -O-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y -S-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y
-NR^{22}-(alquilo
C_{1}-C_{6})-O-,
- R^{22}
- se elige entre el grupo formado por -H y -alquilo C_{1}-C_{10},
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OR^{31}, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -alquiniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido-NHR^{31}, SR^{31} y -NH_{2},
- R^{31}
- es un grupo protector o un grupo informante,
R^{32} y R^{17} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{10}, -alquenilo
C_{2}-C_{10} y -arilo
C_{6}-C_{22},
- R^{18}
- se elige entre el grupo formado por -alquilo C_{1}-C_{6} sustituido o sin sustituir, -alcoxi C_{1}-C_{6} sin sustituir o -alcoxi C_{1}-C_{6} sustituido una o más veces por un resto elegido entre el grupo formado por -halógeno, -O-nitroariloxi y -ciano y
- B
- es un grupo de la fórmula I,
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
\newpage
- W
- es N,
- Z
- se elige entre el grupo formado por N y C con la condición de que
- - si
- Z es N, entonces
- \quad
- X con independencia de Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{3} e
- \quad
- Y con independencia de X se elige entre el grupo formado por N y CR^{4},
- \quad
- y el enlace entre X e Y es un doble enlace y el enlace entre Y y Z es un enlace simple y
- - si
- Z es C, entonces
- \quad
- X es NR^{33} e
- \quad
- Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{4} y
- \quad
- el enlace entre Z e Y es un doble enlace y el enlace entre X e Y es un enlace simple,
en la
que
- R^{1}
- es NR^{5}R^{6},
R^{3} y R^{4} con independencia
entre sí se eligen entre el grupo formado por -H, -halógeno,
-OR^{13}, -SR^{19}, -alquilo C_{1}-C_{10},
-alquenilo C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -NO_{2}, -NR^{5}R^{6},
-ciano y
-C(=O)R^{11},
- R^{11}
- se elige entre el grupo formado por -OH, -alcoxi C_{1}-C_{6}, -ariloxi C_{6}-C_{22} y NHR^{12},
R^{5}, R^{6}, R^{12},
R^{13}, R^{19} y R^{33} con independencia entre sí se eligen
entre el grupo formado por -H, -alquilo
C_{1}-C_{10}, -alquenilo
C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{22}, un grupo protector y un grupo
informante,
r y s con independencia entre sí
son números enteros de 1 a
18,
- D
- es la posición de unión del grupo al resto del compuesto que se fija sobre el ácido nucleico y
dichos grupos alquilo, alquenilo y alquinilo
están sin sustituir o sustituidos por uno o más restos elegidos
entre el grupo formado por -halógeno, -SH,
-S-alquilo C_{1}-C_{6}, -alcoxi
C_{1}-C_{6}, -OH, -NR^{5}R^{6}, -COR^{11},
-NH-CONR^{5}R^{6},
-NH-CSNR^{5}R^{6} y
-[O-(CH_{2})_{r}]_{s}-NR^{5}R^{6},
con la condición de que por lo menos uno de
R^{5} y R^{6} del -NR^{5}R^{6} sea un grupo protector.
12. Un compuesto de la reivindicación 11, en el
que dicho grupo de la fórmula I contiene por lo menos un grupo
informante.
13. Un compuesto de la reivindicación 11, en el
que dicho grupo de la fórmula I se elige entre el grupo formado por
grupos de la fórmula I, en los que se cumple que:
- W es N, Z es N, Y es N y X es CR^{3}, o
- W es N, Z es C, Y es N y X es CR^{3}, o
- W es N, Z es N, Y es N y X es N.
14. El producto de la fijación de por lo menos
un compuesto que se fija sobre un ácido nucleico de una cualquiera
de las reivindicaciones de 1 a 9 y un ácido nucleico, uniéndose
entre sí el compuesto que se fija sobre el ácido nucleico y el ácido
nucleico mediante un apareo de bases de orientación paralela o
antiparalela.
15. Un método para la determinación de un ácido
nucleico, que consta de los pasos:
- proporcionar una muestra, de la que se
sospecha que contiene dicho ácido nucleico,
- proporcionar un compuesto que se fija sobre un
ácido nucleico según la reivindicación I, que es esencialmente
complementario de una parte o de todo dicho ácido nucleico,
- poner en contacto dicha muestra con dicho
compuesto que se fija sobre el ácido nucleico, en condiciones en las
que pueda tener lugar tal unión,
- determinar el producto de tal fijación que se
forma con dicho ácido nucleico y dicho compuesto que se fija sobre
él, como medida de la presencia de dicho ácido nucleico.
16. Un método de la reivindicación 15, en el que
cualquiera de los grupos de la fórmula I de dicho compuesto que se
fija sobre un ácido nucleico de la reivindicación 1 está situado en
dicho compuesto para realizar un apareo de bases con un resto G de
dicho ácido nucleico.
17. Uso de una 2-azapurina de la
fórmula I según la reivindicación 1 en un compuesto que se fija
sobre un ácido nucleico como sustituta de la citosina.
18. Uso de una 2-azapurina de la
fórmula I según la reivindicación 1 en reacciones de hibridación de
sondas con ácidos nucleicos como base en una posición de apareo de
las bases de la sonda con G del ácido nucleico.
19. Un método para la síntesis química de un
compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10
utilizando subunidades activadas, dichas subunidades activadas
contienen por lo menos un grupo de la fórmula I.
20. Un método de la reivindicación 19, en el que
por lo menos una subunidad es un compuesto según una cualquiera de
las reivindicaciones de 11 a 13.
21. Un método para la síntesis enzimática de un
compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, que
consiste en hacer reaccionar una subunidad trifosfato con un cebador
empleando como molde un ácido nucleico para el alargamiento del
cebador, dicha subunidad trifosfato contiene un grupo heterocíclico
de la fórmula I.
22. Un método según la reivindicación 21, en el
que dicha subunidad trifosfato tiene la fórmula VIII
en la
que
- PPP
- es un grupo trifosfato,
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido y -NH_{2}, y
- B
- es un grupo de la fórmula I, en la que W es N y en la que R^{1} es NR^{5}R^{6}, y en la que R^{5} y R^{6} son restos definidos en la reivindicación 1.
23. Un método para la determinación de la
presencia o ausencia de ácidos nucleicos, cada uno de los cuales
contiene una secuencia particular, en una muestra, que consiste en
los pasos de:
- poner en contacto dicha muestra con una fase
sólida que tenga inmovilizado sobre su superficie los compuestos que
se fijan sobre ácidos nucleicos, cada uno de ellos tiene una
secuencia complementaria de la de dichas secuencias concretas de
dichos ácidos nucleicos;
- determinar sobre dicha fase sólida la
formación de híbridos que contengan un ácido nucleico con una
secuencia particular y el compuesto que se fija sobre el ácido
nucleico que contiene la secuencia complementaria,
caracterizado porque por lo menos uno de
dichos compuestos que se fijan sobre ácidos nucleicos es un
compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a
10.
24. Un método para la determinación de la
presencia, ausencia o cantidad de un ácido nucleico en una muestra,
que consiste en los pasos de:
- proporcionar cebadores, un primer cebador es
esencialmente complementario de una primera secuencia de fijación de
dicho ácido nucleico y un segundo cebador es esencialmente
complementario de una secuencia de fijación de un complemento de
este ácido nucleico y una sonda que es complementaria del ácido
nucleico o del complemento del mismo entre las secuencias de
fijación de dichos cebadores, dicha sonda está marcada en diferentes
subunidades por lo menos con dos grupos informantes diferentes,
- someter dicha muestra con dichos cebadores y
dicha sonda a condiciones que favorecen la extensión de dichos
cebadores y separar dichos grupos informantes entre sí mediante la
desintegración de la sonda y
- determinar el grado de desintegración de la
sonda mediante por lo menos uno de dichos grupos informantes,
caracterizado porque por lo menos uno de
dichos cebador y/o sonda es un compuesto que se fija sobre ácido
nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10.
25. Un compuesto de la fórmula general VIII
en la
que
- PPP
- es un grupo trifosfato,
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OH, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido y -NH_{2}, y
- B
- es un grupo de la fórmula I, en la que W es N y en la que R^{1} es NR^{5}R^{6}, y en la que R^{5} y R^{6} son restos definidos en la reivindicación 1.
26. Un compuesto de la reivindicación 25, en el
que -M-R^{16} es un grupo trifosfato y
-M-R^{15} es -OH.
27. Un compuesto de la reivindicación 26, en el
que R^{14} es -OH.
28. Un compuesto de la reivindicación 25, en el
que R^{14} es -H y R^{1} no es OH.
29. Un compuesto de la fórmula general IX
en la
que
- A
- se elige entre el grupo formado por O, S y N-alquilo C_{1}-C_{6},
M y M' con independencia entre sí
se eligen entre el grupo formado por oxi, sulfanodiilo,
-NR^{22}-, -alquilo C_{1}-C_{10} u -O-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y -S-(alquilo
C_{1}-C_{10})-O- y
-NR^{22}-(alquilo
C_{1}-C_{6})-O-,
- R^{22}
- se elige entre el grupo formado por -H y -alquilo C_{1}-C_{10},
\global\parskip0.950000\baselineskip
- R^{14}
- se elige entre el grupo formado por -H, -OR^{31}, -alcoxi C_{1}-C_{10}, -alqueniloxi C_{2}-C_{10}, -alquiniloxi C_{2}-C_{10}, -halógeno, -azido-NHR^{31}, SR^{31} y -NH_{2},
- R^{31}
- es un grupo protector o un grupo informante,
R^{32} y R^{17} con
independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por -H,
-alquilo C_{1}-C_{10}, -alquenilo
C_{2}-C_{10} y -arilo
C_{6}-C_{22},
- R^{18}
- se elige entre el grupo formado por -alquilo C_{1}-C_{6} sustituido o sin sustituir, -alcoxi C_{1}-C_{6} sin sustituir o -alcoxi C_{1}-C_{6} sustituido una o más veces por un resto elegido entre el grupo formado por -halógeno, -nitroariloxi y -ciano y
- B
- es un grupo de la fórmula I
en la
que
- W
- es N,
- Z
- se elige entre el grupo formado por N y C con la condición de que
- - si
- Z es N, entonces
- \quad
- X con independencia de Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{3} e
- \quad
- Y con independencia de X se elige entre el grupo formado por N y CR^{4},
- \quad
- y el enlace entre X e Y es un doble enlace y el enlace entre Y y Z es un enlace simple y
- - si
- Z es C, entonces
- \quad
- X es NR^{33} e
- \quad
- Y se elige entre el grupo formado por N y CR^{4} y
- \quad
- el enlace entre Z e Y es un doble enlace y el enlace entre X e Y es un enlace simple,
- R^{1}
- es -NR^{5}R^{6},
R^{3} y R^{4} con independencia
entre sí se eligen entre el grupo formado por -H, -halógeno,
-OR^{13}, -SR^{19}, -alquilo C_{1}-C_{10},
-alquenilo C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -NO_{2}, -NR^{5}R^{6},
-ciano y
-C(=O)R^{11},
- R^{11}
- se elige entre el grupo formado por -OH, -alcoxi C_{1}-C_{6}, -ariloxi C_{6}-C_{22} y NHR^{12},
R^{5}, R^{6}, R^{12},
R^{13}, R^{19} y R^{33} con independencia entre sí se eligen
entre el grupo formado por -H, -alquilo
C_{1}-C_{10}, -alquenilo
C_{2}-C_{10}, -alquinilo
C_{2}-C_{10}, -arilo
C_{6}-C_{22}, un grupo protector y un grupo
informante,
r y s con independencia entre sí
son números enteros de 1 a
18,
- D
- es la posición de unión del grupo al resto del compuesto que se fija sobre el ácido nucleico y
dichos grupos alquilo, alquenilo y alquinilo
están sin sustituir o sustituidos por uno o más restos elegidos
entre el grupo formado por -halógeno, -SH,
-S-alquilo C_{1}-C_{6}, -alcoxi
C_{1}-C_{6}, -OH, -NR^{5}R^{6}, -COR^{11},
-NH-CONR^{5}R^{6},
-NH-CSNR^{5}R^{6} y
-[O-(CH_{2})_{r}]_{s}-NR^{5}R^{6},
con la condición de que por lo menos uno de
R^{5} y R^{6} de -NR^{5}R^{6} sea un grupo protector.
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