ES2664231T3

ES2664231T3 - Métodos para replegar G-CSF a partir de cuerpos de inclusión

Info

Publication number: ES2664231T3
Application number: ES13709470.2T
Authority: ES
Inventors: Ferenc FELFÖLDI; Andras Ballagi; János BÉCSI
Original assignee: Richter Gedeon Nyrt
Current assignee: Richter Gedeon Nyrt
Priority date: 2012-03-19
Filing date: 2013-03-18
Publication date: 2018-04-18
Anticipated expiration: 2033-03-18
Also published as: LT2828287T; JP2015512377A; HRP20180234T1; SI2828287T1; CA2867796A1; US9458207B2; NO2828287T3; PL2828287T3; JP6282630B2; WO2013068603A3; CN104540846A; WO2013068603A2; HUP1200172A2; US20150057439A1; HUE036635T2; EP2828287B1; CA2867796C; KR20140142724A; DK2828287T3; EP2828287A2

Abstract

Método para replegar factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) a partir de cuerpos de inclusión, que comprende: a) solubilizar G-CSF en presencia de un agente solubilizante; b) realizar una primera etapa de replegamiento y oxidación, que comprende incubar el G-CSF solubilizado en presencia de un agente oxidante y el agente solubilizante; c) eliminar el agente solubilizante mediante adsorción con resina de intercambio iónico y/o cromatografía de intercambio iónico, y realizar opcionalmente una precipitación con ácido; y d) realizar una segunda etapa de replegamiento, que comprende diluir con un tampón de baja conductividad, o más preferiblemente agua, e incubar el G-CSF de la etapa (c), en el que la segunda etapa de replegamiento se realiza en un tampón de baja conductividad que tiene una conductividad de al menos por debajo de 2mS/cm y durante más de 12 horas.

Description

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Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos nuevos tal como se reivindica para replegar factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). En particular, proporciona métodos nuevos tal como se reivindica para obtener G-CSF activo a partir de cuerpos de inclusión a alto rendimiento, lo que permite la producción industrial de G-CSF purificado.

Un objetivo de la presente invención era proporcionar un procedimiento de producción eficaz a una escala industrial para un principio activo de G-CSF recombinante de alta pureza (hasta grado farmacéutico), considerando las necesidades de calidad, economía y regulatorias. La presente invención proporciona un método nuevo tal como se reivindica para replegar y purificar G-CSF recombinante expresado en cuerpos de inclusión.

La técnica anterior describe varios métodos para solubilizar y replegar G-CSF a partir de cuerpos de inclusión. Tal como se señaló anteriormente (véanse los Antecedentes) la técnica anterior sobre la solubilización y el replegamiento de proteínas de IB (y en particular con respecto a G-CSF) puede dividirse en dos diferentes estrategias principales. El enfoque más clásico es el uso de un agente caotrópico fuerte (desnaturalizante) tal como urea o GuHCl, normalmente en condiciones reductoras y pH alcalino. La segunda estrategia, que también se usa comúnmente en el campo, es el uso de un surfactante fuerte, tal como sarcosilo o ácido laúrico para solubilización. Esporádicamente, también se describió el uso de dodecil sulfato de sodio (SDS), un detergente iónico fuerte, para la solubilización de G-CSF (Devlin 1988).

Cada uno de los métodos de la técnica anterior tiene determinadas desventajas. Tal como se demuestra en experimentos realizados por los inventores, SDS como agente solubilizante no era adecuado porque una eliminación eficaz era difícil, si no imposible. Por ejemplo, cuando se elimina SDS mediante cromatografía en hidroxiapatita cerámica (CHT), cantidades traza de SDS permanecieron unidas a la proteína. SDS no pudo eliminarse completamente. La solubilización con GuHCl (Wingfield 1988, Dietrich 2003, documentos WO2006/097944, EP16301273, EP1837346, WO2010/146599) es problemática por otros motivos. Aunque GuHCl puede eliminarse por diálisis o cromatografía de gel, el método de solubilización de GuHCl requiere posteriormente grandes volúmenes provocado por la necesidad de una fuerte dilución para evitar la agregación de productos intermedios de plegamiento (Rudolph 1990, Rudolph 1996) durante la incubación de replegamiento. Se describieron diluciones de hasta 1:200 (Rudolph 1996). En los métodos de GuHCl sometidos a prueba por los inventores, se confirmó el requisito de una fuerte dilución y se requirió al menos una razón de dilución de 1:50 para rendimientos óptimos usando el método de GuHCl. Este tipo de solubilización requeriría grandes tanques de acero inoxidable para procedimientos a gran escala, lo que no resulta económico.

En lugar de GuHCl, se ha descrito otro desnaturalizante, urea, para su uso en la solubilización de G-CSF. Se aplicaron concentraciones casi saturadas tales como urea 8 M en la técnica anterior (documentos WO98/53072, WO01/87925, WO2006/135176, Khalilzadeh 2008, WO2008096370). Los mismos problemas que los comentados con respecto a GuHCl se aplican también a la urea. Además, el experto en la técnica conoce bien que la presencia de urea, especialmente a pH alcalino, puede favorecer una modificación de proteínas no deseada, tal como desamidación. Además, la presencia de ácido isociánico, que puede generarse a partir de cianato de amonio (que está siempre en equilibro con urea en disolución), da como resultado la carbamilación de grupos amino primarios (Rudolph 1996). Finalmente, también se ha descrito en la técnica que puede haber un beneficio para el rendimiento cuando el inhibidor de la agregación arginina está presente como codesnaturalizante en alta concentración durante el replegamiento (documento EP0219874, Rudolph 1996, Dietrich 2003). Sin embargo, la arginina es un reactivo costoso y sería económicamente deseable abandonar el uso de arginina.

Tal como se mencionó anteriormente, el surfactante sarcosilo también puede usarse para la solubilización de G-CSF a partir de IB. Preferiblemente, se usó sarcosilo al 2% (Zsebo 1986, documentos WO8701132, WO8910932, Lu 1992, Heidari 2001). El sarcosilo es un tensioactivo aniónico con buena solubilidad. Una ventaja de usar sarcosilo es el menor factor de dilución (2 veces en lugar de 50-200 veces para GuHCl/urea) requerido durante la posterior incubación de replegamiento. Otra ventaja es la producción relativamente baja de productos químicos de residuo para el medio ambiente. Sin embargo, cuando se usa el método originalmente descrito, los presentes inventores observaron en sus experimentos rendimientos más bien bajos tras el replegamiento en relación con una variación elevada entre lotes. Surfactantes como el sarcosilo facilitan generalmente la solubilización aumentando la solubilidad de proteínas en general. Puesto que el sarcosilo no desnaturaliza y despliega proteínas como hacen los agentes caotrópicos, proteínas de IB plegadas inicialmente de manera incorrecta no pueden replegarse más tarde; por tanto, el rendimiento debe ser menor cuando se compara con el método de GuHCl/urea.

La presente invención supera las desventajas de la técnica anterior.

Los presentes inventores proporcionan un nuevo método para obtener G-CSF replegado, que aborda los problemas asociados con los métodos de la técnica anterior. Se encontró sorprendentemente que usando una primera etapa de replegamiento oxidativo en presencia de un agente solubilizante, seguido por una etapa de eliminación eficaz del agente solubilizante (por ejemplo, mediante adsorción de resina de intercambio iónico y/o precipitación con ácido y/o cromatografía de intercambio iónico), seguido por una segunda etapa de replegamiento que comprende diluir el G

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comprenden generalmente lisis y disrupción de las células seguido por centrifugación. Los cuerpos de inclusión pueden obtenerse recogiendo las células en un separador (por ejemplo, mediante centrifugación, por ejemplo a 11000 g), alterando mecánicamente las células con un homogeneizador a alta presión (por ejemplo, a aproximadamente 1000 bar) y luego separando los cuerpos de inclusión de residuos celulares en un separador (por

5 ejemplo, mediante centrifugación, por ejemplo a 11000 g). El sedimento que comprende una gran proporción de cuerpos de inclusión clásicos se lava habitualmente con detergentes. Los cuerpos de inclusión pueden congelarse y almacenarse antes de la solubilización de G-CSF. Se encontró que IB que se separaron de residuos celulares en un separador y se almacenaron en tampón reductor a -80ºC eran estables hasta 8 meses.

10 Los cuerpos de inclusión pueden obtenerse a partir de células microbianas. Los métodos descritos en el presente documento pueden, por tanto, comprender una etapa de extracción de los cuerpos de inclusión a partir de una célula huésped microbiana. La célula huésped microbiana usada para la expresión de G-CSF puede ser una célula de levadura, una célula de hongo filamentoso o una célula bacteriana. En realizaciones preferidas, los microorganismos son bacterias, en realizaciones más preferidas son bacterias gram-negativas, y lo más preferiblemente son E. coli.

15 Los cuerpos de inclusión pueden, por tanto, obtenerse a partir de una célula de E. coli.

G-CSF

“G-CSF” tal como se usa en el presente documento en el contexto de la invención incluye especies ortólogas de G

20 CSF, tales como, por ejemplo, G-CSF humano, G-CSF bovino, etc. La secuencia de aminoácidos de G-CSF humano es (SEQ ID NO: 1):

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25 que, por ejemplo, puede encontrarse en Holloway, 1994, o en el n.º de registro Drugbank DB00099. La secuencia de G-CSF bovino es (SEQ ID NO: 2):

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30 que puede encontrarse, por ejemplo, en la figura 7 del documento US US5849883, o en el n.º de registro PDB: 1BGC-A.

En realizaciones preferidas, el G-CSF es G-CSF de mamífero, en realizaciones particularmente preferidas es G-CSF 35 humano. En algunas realizaciones preferidas, el polipéptido recombinante es metionil-G-CSF (Met-G-CSF), tal como Met-G-CSF humano (r-met-hu-G-CSF = filgrastim). La secuencia de filgrastim es (SEQ ID NO: 3):

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40 Puede proporcionarse igualmente G-CSF bovino como metionil-G-CSF bovino.

“G-CSF” tal como se usa en el presente documento en el contexto de la invención incluye variantes funcionales de

G-CSF. La referencia a “variante” en el presente documento significa referencia a “variante funcional”, a menos que

el contexto indique lo contrario. Una variante de proteína de G-CSF se refiere a una proteína que difiere de la 45 secuencia de proteínas de G-CSF, pero aún tiene la misma actividad biológica (variante funcional). Una “variante” de

proteína de G-CSF se refiere a una proteína que difiere de la secuencia de proteínas de G-CSF de referencia (tal

como la secuencia de G-CSF humano) en uno o más aminoácido(s). Una “variante” puede, alternativamente o

además, tener otras modificaciones tales como, por ejemplo, metilación, pegilación, succinilación, adición de

etiquetas o marcadores, etc. la variante puede ser G-CSF enzimática o químicamente modificado. Puede ser una 50 proteína de fusión fusionada con otro péptido o polipéptido.

En realizaciones preferidas, el G-CSF está pegilado.

“Variantes” pueden ser variantes naturales, incluyendo variantes alélicas o variantes de empalme (véase, por 55 ejemplo, Zsebo 1986), incluyendo variantes alélicas, o variantes sintéticamente generadas. Se mostró en la técnica

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preferidas, las dos columnas (AEX+CEX) se conectan directamente y G-CSF se une a la resina de CEX. En algunas realizaciones de la presente invención, la resina de AEX es un intercambiador aniónico débil y preferiblemente lleva grupos funcionales DEAE. Lo más preferiblemente la resina es DEAE Macro-Prep (BioRad, EE.UU.). En algunas realizaciones la carga de muestra se realiza a un valor de pH por debajo de 5, preferiblemente a pH 4,3-4,5, lo más preferiblemente en un tampón de acetato de sodio pH 4,5. En algunas realizaciones de la presente invención, la resina de CEX es un intercambiador catiónico fuerte y preferiblemente lleva grupos funcionales SP. Lo más preferiblemente, la resina es Toyopearl SP-650 (Tosoh, Tokio). En realizaciones preferidas, la elución de G-CSF a partir de la resina de CEX se realiza aumentando el valor de pH en el tampón de elución. Más preferiblemente, la elución se realiza con un gradiente por etapas de pH. En algunas realizaciones el tampón de elución de CEX tiene un pH alcalino, preferiblemente pH 8, lo más preferiblemente el tampón de elución es Tris 20 mM-HCl/pH 8. En la mayoría de realizaciones preferidas, una columna DEAE Macro-Prep se conecta directamente a una columna Toyopearl SP-650, la carga de muestra se realizó en tampón de acetato de sodio pH 4,5 y la elución de G-CSF se realizó mediante una etapa de pH usando tampón Tris-HCl pH 8. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente solubilizante y otras impurezas se eliminan mediante la aplicación secuencial de las siguientes etapas:

a) AEX,

b) precipitación con ácido,

c) AEX, y

d) CEX.

En la etapa a), el agente solubilizante se une a una resina de intercambio aniónico. El material de resina puede eliminarse por filtración. En la etapa b), el pH puede estar por debajo de pH 5, por ejemplo entre 4 y 5. El precipitado puede eliminarse por filtración, en la etapa c), el agente solubilizante residual se une a la resina. G-CSF permanece en el flujo directo. En la etapa d) el G-CSF se une a la resina. El agente solubilizante residual permanece en el flujo directo. Esto puede estar seguido por una etapa de elución de G-CSF unido, o variante funcional del mismo, a partir de la resina de CEX mediante elución por etapas o en gradiente. El tampón de elución puede tener un aumento del pH o de la concentración de sal. Un aumento del pH significa un pH mayor que en la etapa b), es decir un pH por encima de 5, o por encima de 6, o por encima de 7.

Segundo replegamiento (finalización de plegamiento)

Tal como ya se mencionó, se observó sorprendentemente que los rendimientos de G-CSF monomérico, soluble y activo pueden aumentarse significativamente cuando se realiza un segundo ciclo de replegamiento. Los experimentos sugirieron que el G-CSF obtenido usando el método de sarcosilo/CuSO4 “clásico” no estaba totalmente replegado.

La segunda etapa de replegamiento comprende diluir y después incubar el G-CSF parcialmente replegado.

El disolvente preferido para la dilución es un tampón de baja conductividad o más preferiblemente agua. La dilución puede ser una dilución de cinco veces, o cuatro veces, o tres veces o preferiblemente de dos veces. Baja conductividad significa una conductividad de al menos por debajo de 2 mS/cm, más preferiblemente por debajo de 1 mS/cm. Un sistema de tampón adecuado es, por ejemplo, Tris/HCl a concentraciones de Tris 10 mM o por debajo con un valor de pH mayor de 7. También pueden usarse otros tampones con la misma baja conductividad y pH.

Sin querer limitarse a ninguna teoría, los inventores realizaron las siguientes observaciones. Tal como se conocía en la técnica anterior (Lu 1992) la formación del segundo puente disulfuro de G-CSF tiene una cinética relativamente lenta. Productos intermedios no completamente replegados que llevan restos libres de cisteína reducidos corren el riesgo de agregación y/o precipitación (Rudolph 1990, Rudolph 1996). En el caso de G-CSF el producto intermedio con tres cisteínas no apareadas puede existir durante un tiempo más bien largo, según la concentración de Cu2+ y temperaturas (Lu 1992). La agregación y las precipitaciones provocan pérdidas de G-CSF durante las etapas de filtración y cromatografía. Los presentes inventores plantearon la hipótesis de que una eficacia de plegamiento mejorada podría dar como resultado rendimientos mejorados en el procedimiento posterior. Los presentes inventores encontraron que una segunda etapa de replegamiento mejoró el rendimiento.

Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que la incubación durante la segunda etapa de replegamiento a pH ligeramente alcalino es beneficiosa. Esto es particularmente sorprendente dado el hecho de que G-CSF, especialmente filgrastim, es una proteína relativamente hidrófoba que es menos soluble y estable a valores de pH por encima de su pI (5,65). La mejor solubilidad y estabilidad es en medio ácido a pH 4 o menos. Por tanto, procedimientos de purificación clásicos tales como cromatografías se realizan a valores de pH bajos, preferiblemente a pH 4-5,5 en tampones acetato. En cambio, los presentes inventores encontraron que la incubación a un pH alcalino facilita adicionalmente un rendimiento aumentado. Los presentes inventores consideran que el pH alcalino en ausencia de un agente oxidante es importante para la oxidación completa de sulfhidrilos y, por tanto,

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para formar ambos puentes disulfuro naturales de G-CSF.

Por tanto, la segunda etapa de replegamiento puede realizarse a pH alcalino, es decir a un pH de 7 o más. El pH puede estar por encima de 7. La segunda etapa de replegamiento puede realizarse a un pH de entre 7 y 10, o entre 7 y 9, o entre 7 y 8,5, o entre 7 y 8, o entre 7,5 y 10, o entre 7,5 y 9, o entre 7,5 y 8,5, o a un pH de aproximadamente 8 o a un pH de 8.

La incubación de la segunda etapa de replegamiento se realiza en ausencia de agentes solubilizantes.

En realizaciones preferidas:

La segunda etapa de replegamiento puede realizarse, por ejemplo, en uno de los siguientes tampones: fosfato, carbonato, borato, Tris, HEPES, MOPS, HEPPS, EPPS, CAPS, CAPSO, CHES, TES, BES, TAPS, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, tricina, bicina, acetamidoglicina, glicinamida u otras sustancias tampón biocompatibles que tienen una pKa por encima de 7. Un tampón preferido para la segunda etapa de replegamiento es Tris-HCl/pH 8, preferiblemente Tris 10 mM-HCl/pH 8. La segunda etapa de replegamiento puede realizarse, por ejemplo, a una concentración baja de detergente residual, tal como 0,01 mg/ml o menos. La segunda etapa de replegamiento puede realizarse, por ejemplo, a una concentración iónica en la disolución de 0,02 mol/l o menos. La segunda etapa de replegamiento puede realizarse, por ejemplo, a un intervalo de temperatura 0º-20ºC, o 2º-8ºC, o 2º-5ºC. La segunda etapa de replegamiento puede realizarse, por ejemplo, durante un periodo de incubación de al menos 24 h, o más de 24 h, o 30-48 h, o 32-42 h. La segunda etapa de replegamiento puede realizarse a una baja conductividad en la disolución, tal como 0,1-2 mS/cm, o 0,2-1,5 mS/cm, o 0,5-1,0 mS/cm. La segunda etapa de replegamiento puede realizarse con enfriamiento. La segunda etapa de replegamiento puede realizarse con agitación continua. Uno o más de estos parámetros pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones se usa G-CSF parcialmente purificado para la finalización del replegamiento, preferiblemente con una pureza de aproximadamente el 80-90%. Preferiblemente, el replegamiento se completa mediante una incubación del G-CSF parcialmente replegado en un tampón de baja conductividad en condiciones de refrigeración durante más de 12 horas. Preferiblemente, la finalización de replegamiento se realiza a una conductividad por debajo de 2 mS/cm; lo más preferiblemente la conductividad está por debajo de 1 mS/cm. En algunas realizaciones, la finalización de replegamiento se realiza a un valor de pH por encima de 7, preferiblemente a (aproximadamente) pH 8. El tampón para la segunda incubación de plegamiento puede ser Tris 10 mM-HCl, preferiblemente a (aproximadamente) pH 8. En algunas realizaciones, la incubación para el segundo plegamiento se realiza en condiciones de refrigeración, preferiblemente a 2-8ºC. En realizaciones preferidas, el tiempo de incubación del 2º plegamiento es más de 12 horas, más preferiblemente más de 24 horas, lo más preferiblemente 32-42 horas.

Condiciones particularmente preferidas para la finalización del plegamiento (2º replegamiento), basadas en diversos experimentos de optimización, son las mostradas en la tabla I debajo de la columna “2º replegamiento”.

Purificación final (etapa(s) de pulido)

La combinación descrita anteriormente de una primera y una segunda etapa de replegamiento da como resultado rendimientos aumentados de G-CSF monomérico activo.

Opcionalmente, y según el uso previsto del G-CSF obtenido, pueden realizarse procedimientos posteriores después, tales como una o más etapas de pulido. Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender además una o más etapas de pulido. La(s) etapa(s) de pulido da(n) como resultado purificación adicional del G-CSF replegado tras la segunda etapa de replegamiento.

Los procedimientos posteriores subsiguientes (pulido) pueden comprender el uso de cromatografías de AEX y CEX, u otros métodos usados en la técnica para pulido/purificación de G-CSF, tales como, HIC, IMAC, SEC o RP-HPLC (véanse las referencias de la sección Antecedentes). La(s) etapa(s) de pulido también puede(n) comprender combinaciones de dos o más de estos métodos.

Tras la segunda etapa de plegamiento, la pureza de G-CSF es normalmente del 80-90% (tabla III). Esto no cumple con una calidad farmacéutica. Si el producto va a usarse como principio farmacéutico activo, se realiza al menos una etapa de pulido adicional para lograr la pureza deseada. Una etapa de pulido de este tipo elimina contaminantes residuales que resultan del huésped o del procedimiento. Además, se elimina cualquier sustancia relacionada con el producto e impurezas relacionadas.

AEX

El pulido posterior puede comprender una o más etapas de AEX. La etapa de pulido puede comprender AEX.

El experto en la técnica puede seleccionar un AEX adecuado. La selección de la resina puede realizarse basándose en el rendimiento de separación, tiempos de procedimiento, robustez de la limpieza, reproducibilidad, capacidad de

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unión, uniformidad entre lotes, y economía global, etc deseados.

En realizaciones preferidas, se usa el grupo funcional DEAE. El experto en la técnica apreciará que además del grupo funcional, la naturaleza de la estructura principal de la resina de AEX así como el tamaño de las perlas necesita considerarse. En realizaciones particularmente preferidas, se usa una matriz basada en derivados de metacrilato (por ejemplo Macro-Prep® y Toyopearl®). Una matriz de este tipo mostró una resolución y reproducibilidad particularmente buenas. Los materiales de metacrilato son más rígidos y tienen mejores ciclos de vida que, por ejemplo, las matrices de agarosa reticuladas usadas con frecuencia (por ejemplo Sepharose®). Puesto que AEX puede usarse ahora en un modo de unión (en contraste con la etapa previa para la eliminación de agentes solubilizantes), pueden usarse condiciones de elución selectivas, o bien proporcionadas por un aumento de la concentración de sal por etapas o en gradientes, o bien disminuyendo el pH en el tampón de elución por etapas o en gradientes.

Los materiales de la resina de AEX se han comentado anteriormente.

El experto en la técnica puede elegir los métodos de pulido posteriores adecuados, según las condiciones usadas previamente, tales como el tampón, etc. Por ejemplo, en realizaciones preferidas, la segunda etapa de replegamiento se realiza en tampón de baja conductividad a aproximadamente pH 8. Esto es una situación inicial ideal para una etapa de pulido de AEX en el modo de unión y permitiría eliminación adicional de contaminantes y un intercambio de tampón fácil a un tampón de pH bajo, si se desea, en el que G-CSF es más soluble y más estable.

CEX

El pulido posterior puede comprender una o más etapas de pulido mediante CEX. La etapa de pulido puede comprender CEX.

Como alternativa (o adicionalmente) a una etapa de AEX, también puede usarse una cromatografía CEX como etapa de pulido eficaz. Para este método se requiere una adaptación del pH a pH inferior a 5,5 antes de cargar la muestra para permitir una cromatografía en el modo de unión, lo cual es importante para obtener una separación de proteínas suficiente. El grupo de intercambio catiónico funcional y la matriz pueden seleccionarse según los mismos criterios que los mencionados para AEX. En realizaciones preferidas, se usan grupos funcionales SP y CM en estructuras principales de metacrilato (Toyopearl®, Macro-Prep®). En realizaciones particularmente preferidas, se usa Toyopearl CM-650, más preferiblemente se usa Toyopearl SP-650.

Anteriormente se han mencionado materiales de resina de CEX.

Una vez unido a la resina de CEX, puede eluirse G-CSF con condiciones selectivas, o bien proporcionadas aumentando la concentración de sal en etapas o gradientes o bien aumentando el pH en el tampón de elución en etapas o gradientes.

El experto sabe cómo optimizar la resolución de una cromatografía.

En algunas realizaciones, una etapa de cromatografía, AEX o CEX, es suficiente para lograr la calidad deseada del producto de G-CSF.

En otras realizaciones, el procesamiento posterior comprende dos o más etapas de pulido. Por ejemplo, el pulido puede comprender dos o más etapas de cromatografía. Por tanto, si se desea o es necesario, pueden realizarse dos

o más etapas de pulido por intercambio iónico. Cuando se usan dos etapas de pulido, se prefiere usar AEX seguido por CEX. En tal caso, ambas etapas se realizan en modo de unión. Una ventaja de este orden es que se obtiene G-CSF a un pH ácido al final, lo que por ejemplo permite el almacenamiento a largo plazo de G-CSF concentrado. Se demostró que el uso de dos etapas de pulido mediante IEX daba como resultado una pureza particularmente alta (tabla IV).

La(s) etapa(s) de pulido posterior(es) da(n) como resultado una pureza de G-CSF de al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 98,5%, el 99% o el 99,5%.

Para el cálculo de la pureza según la presente invención (véase el ejemplo 13) se usaron cromatogramas de HPLC, que se integraron para el pico principal (áreas). Cualquier “impureza” restante son las denominadas “impurezas relacionadas con el producto”, lo que significa que son moléculas de G-CSF con modificaciones, tales como oxidación (diferentes especies), desamidación, dimerización, agregación o isomerizaciones no aclaradas estructuralmente hasta ahora (tabla IV). Evidentemente, estas sustancias relacionadas con el producto sólo están presentes en trazas. Debe observarse que en las preparaciones de G-CSF finalmente purificadas las “impurezas relacionadas con el procedimiento”, tales como HCP, ADN o endotoxinas bacterianas sólo pueden detectarse a niveles en ppm muy bajos o no pueden detectarse en absoluto (tabla IV). Tal pureza se describirá en otra parte como homogeneidad aparente. Los métodos analíticos para la determinación de la pureza se divulgan en el ejemplo

13. La figura 3 muestra un ejemplo de un cromatograma de SEC-HPLC de un lote de G-CSF purificado (3B) en

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comparación con una especialidad farmacéutica aprobada en la UE comercialmente adquirida usada como referencia (3A). Pueden observarse trazas de agregados a la izquierda del pico principal. El pico a la derecha del pico principal está provocado por el disolvente y no una impureza. Estos cromatogramas destacan la calidad suficiente del G-CSF, incluso para grado farmacéutico, purificado según los métodos descritos.

En algunas realizaciones de la presente invención, el G-CSF completamente replegado se purifica adicionalmente al comprender una o más cromatografías de intercambio iónico.

Preferiblemente, las cromatografías de intercambio iónico comprenden una cromatografía de intercambio aniónico seguida por una cromatografía de intercambio catiónico.

En algunas realizaciones, G-CSF parcialmente purificado que tiene una pureza de aproximadamente el 80-90% se purifica adicionalmente hasta una pureza de más del 95% usando dos etapas de pulido: AEX y CEX.

En algunas realizaciones, la etapa de AEX va seguida por la etapa de CEX. Preferiblemente, ambas etapas se realizan en modo de unión.

Usando los métodos descritos en el presente documento, puede obtenerse G-CSF a calidad de grado farmacéutico. Tales preparaciones de G-CSF son adecuadas para aplicaciones terapéuticas o pueden usarse como productos intermedios para posteriores conjugaciones, por ejemplo con polietilenglicol.

En un aspecto la invención proporciona un procedimiento para la purificación de G-CSF. El procedimiento también puede usarse para eliminar los agentes solubilizantes entre la primera y la segunda etapa de replegamiento comentadas en el presente documento. En el presente documento se proporciona un procedimiento para la purificación de G-CSF y/o eliminación de un agente de solubilización usado para la solubilización de G-CSF a partir de cuerpos de inclusión, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas:

e) cromatografía de intercambio aniónico llevada a cabo en condiciones en las que G-CSF se une a la resina; y

f) elución de G-CSF unido mediante elución por etapas o en gradiente usando un tampón de elución con un pH disminuido o una concentración de sal aumentada; y

g) cromatografía de intercambio catiónico llevada a cabo en condiciones en las que G-CSF se une a la resina; y

h) elución de G-CSF unido mediante elución por etapas o en gradiente usando un tampón de elución con pH o concentración de sal aumentados.

“pH disminuido/aumentado” o “concentración de sal aumentada” se refieren al tampón usado para la elución en comparación con el tampón para el equilibrado de columna, carga de muestra o lavado.

Con respecto a AEX y CEX, anteriormente se han comentado condiciones y materiales adecuados. En realizaciones preferidas, el procedimiento se caracteriza porque los polímeros de estructura principal de las resinas de intercambio aniónico y catiónico, ambos comprenden derivados de metacrilato.

En algunas realizaciones los grupos funcionales de la resina de AEX son grupos dietilaminoetilo (DEAE).

En algunas realizaciones los grupos funcionales de la resina de CEX son grupos carboximetilo (CM).

En algunas realizaciones los polímeros de estructura principal de las resinas de intercambio aniónico y catiónico no comprenden agarosa reticulada, tal como por ejemplo Sepharose®.

En realizaciones preferidas los polímeros de estructura principal de las resinas de AEX y/o CEX de intercambio aniónico y/o catiónico comprenden derivados de metacrilato.

En realizaciones más preferidas la resina de AEX es DEAE Macro-Prep (BioRad) y la resina de CEX es Toyopearl CM-650 (Tosoh).

En algunas realizaciones la columna de AEX se equilibra con tampón de baja conductividad a pH superior a 7, preferiblemente con Tris-HCl 10 mM/pH 8.

En algunas realizaciones el G-CSF se eluye de la columna de AEX aumentando la concentración de sal, preferiblemente con un gradiente, lo más preferiblemente con un gradiente lineal. Preferiblemente la elución se realiza con un gradiente lineal de NaCl en tampón Tris HCl/pH 8.

En algunas realizaciones, antes de la etapa de CEX, se ajusta el valor de pH del G-CSF eluido de la columna de AEX, preferiblemente se ajusta el pH a un pH inferior a 5,5, lo más preferiblemente a (aproximadamente) pH 4,5.

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Claims

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