ES2529736T3 - Composición inmunogénica que comprende una proteína espicular del coronavirus del SARS - Google Patents

Abstract

Composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado o purificado que comprende a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido proteína espicular del virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) SEQ ID NO: 6042, o b) una secuencia de aminoácidos con > 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042, o c) un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042; a condición de que el polipéptido no sea MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAP.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere dos ácidos nucleicos y proteínas del virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS). Estos ácidos nucleicos y proteínas pueden utilizarse en la preparación y fabricación de formulaciones de vacunas para el tratamiento o la prevención del SARS. También se describen reactivos de diagnóstico, kits (que comprenden tales reactivos) y métodos que pueden utilizarse para diagnosticar o identificar la presencia o ausencia de un virus del SARS en una muestra biológica. También se describen métodos para el tratamiento o la prevención del SARS mediante inhibidores virales de molécula pequeña y combinaciones de inhibidores virales de molécula pequeña y kits para el tratamiento del SARS.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En el año 2003 se identificó en Hong Kong, China, y en varios otros países de todo el mundo un brote de un virus respiratorio virulento, actualmente conocido como síndrome respiratorio agudo grave (SARS). Los pacientes presentaban por lo general síntomas que incluían fiebre, tos seca, disnea, dolor de cabeza e hipoxemia. Los aislados del virus del SARS parecen tener homología con al menos el gen de la ARN polimerasa de varios coronavirus conocidos. Se presenta un análisis filogenético de esta homología en Peiris et al., "Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome", Lancet, publicado online el 8 de abril de 2003 en http://image.thelancet.com/extras/03art3477web.pdf. Otros fragmentos secuenciados del genoma del virus del SARS parecen solaparse con el marco de lectura abierto 1b de los coronavirus. Véase, Drosten et al., "Identification of a Novel Coronavirus in Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome", New England Journal of Medicine, publicado online en http://www.nejin.org el 10 de abril de 2003.

El Genome Science Center en la Columbia Británica, Canadá, publicó en su sitio web (http:///www.bcgsc.ca/bioinfo/SARS/) un borrador del montaje del genoma de 29.736 pares de bases de un virus que se creía era un virus del SARS, conocido como aislado TOR2.

El Centro para el Control de Enfermedades (CDC) publicó una secuencia de nucleótidos de una cepa del SARS-CoV en su sitio web (http://www.cdc.gov/ncidod/sars/pdf/nucleoseq.pdf). El CDC también ha publicado un árbol filogenético de las proteínas N, S y M predichas (que se adjuntan como Figura 5). Este árbol coloca el virus del SARS fuera de cualquiera de los grupos de coronavirus anteriormente conocidos.

En el documento WO 2004/089983 se describe un virus de ARN monocatenario de sentido positivo (SARS), esencialmente de mamífero, aislado, dentro del grupo de los coronavirus y componentes del mismo. El número de registro AY323976 (base de datos EMBL) describe la glicoproteína espicular aislada ZJ01 del coronavirus del SARS. Ksiazek et al., 2003 (New England J Med, vol. 348, páginas 1953-1966) describen un nuevo coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave.

Existe una creciente necesidad de vacunas profilácticas o terapéuticas contra el virus del SARS.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado o purificado que comprende: la secuencia de aminoácidos del polipéptido proteína espicular del virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS), SEQ ID NO: 6042, o una secuencia de aminoácidos con > 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042, o un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042; a condición de que el polipéptido no sea MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAP (como se describe en el documento WO 2004/089983).

La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6042, o una secuencia de aminoácidos con > 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042, o un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042; y que comprende adicionalmente un adyuvante. Se definen formas de realización adicionales en las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIGURA 1: Esquema de la organización del genoma del coronavirus.

FIGURA 2: Esquema de los productos génicos ORF1a/ORF1b del coronavirus.

FIGURA 3: Alineamiento de las secuencias polipeptídicas del coronavirus (incluidas,

FIGURA 4: Alineamiento de las secuencias del polipéptido proteína espicular (S), tomadas de la Figura 3, en la región del punto de unión de los dominios S1 y S2, y el sitio de escisión de la proteasa para los coronavirus seleccionados.

FIGURA 5: Árbol filogenético del CDC de la cepa SARS-CoV (Clustalx 1.82, árbol de neighbor-joining).

La Figura 5A muestra el análisis de la proteína N de coronavirus, la Figura 5B muestra el análisis de la proteína S de coronavirus y la Figura 5C muestra el análisis de la proteína M de coronavirus.

FIGURA 6: Etiquetas 229E: coronavirus humano; MEV: virus de la hepatitis murina; TGV: virus de la gastroenteritis transmisible; AIBV: virus de la bronquitis infecciosa aviar; BOVINO: coronavirus bovino; PEDV: virus de la diarrea epidémica porcina.

FIGURA 7: Predicción de superenrollamiento para la SEQ ID NO: 6042, utilizando el programa Coils (Figura 7A) o LeanCoil (Figura 7B).

FIGURA 8: Ejemplo de inserción de un gen de interés indicador en un sitio entre los genes del virus del SARS existentes. Los productos de genes no estructurales pequeños no se representan esquemáticamente.

FIGURA 9: Esquema que representa muestras representativas de replicones del virus del SARS. Los productos de genes no estructurales pequeños no se representan esquemáticamente.

FIGURA 10: Organización del genoma del coronavirus del SARS. Se muestran las regiones replicasa y estructural, junto con los productos predichos de la escisión dentro de ORF1a y ORF1b. También se indican la posición de la secuencia líder (L) del ARN en 5', el tramo de poli(A) en 3' y la consenso de desplazamiento del marco de lectura ribosómico entre ORF1a y ORF1b. Cada recuadro representa un producto proteico. Están sombreados según el nivel de identidad de aminoácidos con las correspondientes proteínas de otros coronavirus. Los genes específicos de SARS están en color blanco. Las posiciones de las 9 secuencias IG de seis bases específicas de SARS (5'-ACGAAC-3’) se indican con flechas.

FIGURA 11: Organización del genoma de los coronavirus representativos del grupo 1 (HCoV-229E, número de registro: AF304460), grupo 2 (virus de la hepatitis del ratón MHV, número de registro: NC_001846), grupo 3 (virus de la bronquitis infecciosa aviar AIBV, número de registro: NC_001451) y coronavirus del SARS. Otros coronavirus completamente secuenciados utilizados en este estudio están disponibles en los siguientes números de registro: virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), AF353511; virus de la gastroenteritis transmisible (TGV), NC_002306; coronavirus bovino (BCoV): AF220295. Los recuadros de color rojo representan genes específicos de grupo. La posición de la secuencia de ARN líder y del tramo de poli(A) también se indica en los genomas donde se notifican. La posición de las secuencias IG específicas se indica mediante círculos de diferentes tonos. En el genoma del SARS, también se descubrieron tres secuencias IG específicas para el coronavirus del grupo 2.

FIGURA 12: Modelo topológico predicho para la proteína espicular anclada a la membrana viral. Se indican los dominios funcional predicho y estructural. Se predijo que la región N-terminal (S1) contenía el dominio de unión al receptor. Se supone que dos regiones con superenrollamiento dentro del dominio S2, parcialmente superpuestas a los motivos con cremallera de leucina, están implicadas en la oligomerización. El dominio hidrófobo es responsable del anclaje a la membrana.

FIGURA 13: Árbol filogenético obtenido a partir del alineamiento de secuencias múltiples de una región interna de 922 pb del gen pol de 12 coronavirus y SARS. Los números en los nudos representan el resultado de un análisis bootstrap y apoyan firmemente las ramificaciones. Las secuencias no disponibles dentro de los genomas de coronavirus completos se han recuperado a partir del GenBank en los siguientes números de registro: virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina (PHEV), AF124988, virus OC43 humano (OC43), AF124989, coronavirus canino (CCV), AF124986, virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV), AF124987, coronavirus del pavo (TCV), AF124991, virus de la sialodacrioadenitis de la rata (SDAV), AF124990.

FIGURA 14: 14A. Árbol no enraizado obtenido a partir del alineamiento de secuencias consenso del dominio S1 del grupo I y grupo II de proteínas espiculares (G1_cons y G2_cons) con las de una proteína espicular del grupo 3 (AIBV) y la proteína espicular del virus del SARS. El número indica el resultado de un análisis bootstrap. Las secuencias utilizadas para generar el perfil de la consenso del grupo 1 son: HCoV-229E, número de registro P15423; virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), número de registro: NP_598310; virus de la gastroenteritis transmisible (TGV), número de registro: NP_058424; coronavirus canino (CCV), número de registro: S41453; virus respiratorio porcino (PRV), número de registro: S24284; virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV), número de registro: VGIH79. Las secuencias utilizadas para generar el perfil de la consenso del grupo 2 son: virus de la hepatitis de ratón (MHV), número de registro: NP_045300; coronavirus bovino (BCoV), número de registro: NP_150077; coronavirus humano OC43, número de registro: P36334; virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina (PHEV), número de registro: AAL80031; para el grupo 3, sólo se utilizó la secuencia de la proteína espicular

del virus de la bronquitis infecciosa aviar (AIBV), número de registro: AAO34396. 14B: Representación esquemática de las posiciones de cisteína en los dominios S1 del grupo 1, 2 y 3, en comparación con la proteína espicular de SARS. Las barras horizontales representan las secuencias de aminoácidos de S1 (en el caso de SARS y AIBV) o los perfiles de las consenso (generados a partir del grupo 1, G1_cons, y del grupo 2, G2_cons). La longitud de las barras no está a escala. Las posiciones relativas de la cisteína se indican mediante barras rectangulares. Sólo se presentan las cisteínas perfectamente conservadas dentro de cada consenso. Las líneas conectan las cisteínas conservadas entre el dominio S1 de SARS y las secuencias consenso, como se muestra.

FIGURA 15: Ilustración de una proteína adhesina A de Neisseria (NadA).

FIGURA 16: Traducción sin procesar del genoma del coronavirus del SARS (marco de lectura +1).

FIGURA 17: Traducción sin procesar del genoma del coronavirus del SARS (marco de lectura +3)

FIGURA 18: Marcos de lectura abiertos de 1b y proteína espicular, separados mediante *.

FIGURA 19: Cromatograma de la etapa de captura del coronavirus del SARS en Matrix Cellufine Sulfate Superformance 150/10. El análisis se realizó en 100 ml de cosecha de coronavirus. El eje Y de la izquierda muestra la absorbancia a 280 nm. El eje Y de la derecha muestra el gradiente (% de B). El eje X muestra el volumen (ml).

FIGURA 20: Fracciones de cromatografía MCS con tinción de plata. Las calles son: (1) marcador; (2) cosecha de células vero con coronavirus; (3) cosecha de células vero con coronavirus, después de filtración de 0,65 µm; (4) flujo que atraviesa la columna; (5) lavado; (6) pico al 20% (pico de virus). Las calles se cargaron con 1 µg de proteína de ensayo.

FIGURA 21: Transferencia de western de las fracciones de cromatografía MCS. Las calles son como las descritas para la Fig. 20.

FIGURA 22: Ultracentrifugación en gradiente de densidad lineal, sacarosa al 15%-60% (SW28, 2 horas, 20.000 rpm). El gráfico muestra la concentración de proteína (■) y la concentración de sacarosa (♦). 23

FIGURA 23: Fracciones del gradiente de densidad con tinción de plata en NuPage 4%-12% Bis-Tris-Ge (Novex), condiciones reducidas, calentadas durante 10 minutos a 70°C. Las calles son: (1) marcador; (2) pico al 20% MCS;

(3) fracción del gradiente de densidad 11; (4) fracción del gradiente de densidad 12; (5) fracción del gradiente de densidad 13; (6) fracción del gradiente de densidad 14; (7) fracción del gradiente de densidad 15; (8) fracción del gradiente de densidad 16; (9) la fracción del gradiente de densidad 17. La mayor parte de las proteínas estaba en las fracciones 15 a 17. Las calles 2, 8 y 9 se cargaron con 1 µg de proteína.

FIGURA 24: Cromatograma de la etapa de captura de coronavirus del SARS en MCS. Los detalles son tal como en la Figura 19, salvo que se utilizaron 200 ml de cosecha.

FIGURA 25: Tinción de plata (izquierda) y transferencia de western (derecha) de las fracciones cromatográficas. Las calles son como las descritas para las Figuras 20 y 21, salvo que la calle (6) es el pico al 5%. El tratamiento antes del SDS-PAGE se realizó a temperatura ambiente durante 30 minutos.

FIGURA 26. Ultracentrifugación en gradiente de densidad, sacarosa al 15%-40% (SW28, 2 horas, 20.000 rpm). El gráfico muestra la concentración de proteína (■) y la concentración de sacarosa (♦).

FIGURA 27: Tinción de plata (izquierda) y transferencia de western (derecha) de las fracciones de ultracentrifugación en gradiente de densidad NuPage 4%-12% Bis-Tris-Ge (Novex), condiciones reducidas. Las calles son: (1) marcador; (2) fracción del gradiente de densidad 6; (3) fracción del gradiente de densidad 7; (4) fracción del gradiente de densidad 8; (5) fracción del gradiente de densidad 9; (6) fracción del gradiente de densidad 10; (7) fracción del gradiente de densidad 15. Las fracciones 7-10 (calles 3-6) contenían proteínas de coronavirus puras. La mayor parte de las impurezas estaba en la fracción 15 (calle 7). Las calles 2, 8 y 9 se cargaron con ~1 µg de proteína. El tratamiento antes del SDS-PAGE se realizó a temperatura ambiente durante 30 minutos.

FIGURA 28: Imagen EM de las fracciones del gradiente de densidad 8 = 10. La Figura 28A muestra la fracción 8; la Figura 28B muestra la fracción 9; la Figura 28C muestra la fracción 10.

FIGURA 29: Constructos de fusión proteína espicular/NadA.

FIGURAS 30 y 31: Los resultados de la expresión en E. coli de S1L, S1L-NadA y S1L-NadΔanclaje. La Figura 30 muestra el análisis de SDS-PAGE de lisados totales de BL21(DE3)/pET, BL21(DE3)/pETS1L y BL21(DE3)/pET-S1L-NadΔanclaje. Las bandas se indican con una flecha, y las tres calles son, de izquierda a derecha: BL21(DE3)/pET; BL21(DE3)/pET-S1L; BL21(DE3)/pETS1L-NadAΔanclaje. La Figura 31 muestra los análisis (39A) SDS-PAGE y (39B) transferencia de western de lisados totales de BL21(DE3)/pET, BL21(DE3)/pET-S1L-NadA

(cultivados en condiciones no inducidas) y BL21(DE3)/pET-S1L-NadA (cultivados en condiciones inducidas). Las bandas se indican con una flecha, y las calles son, de izquierda a derecha: BL21(DE3)/pET; BL21(DE3)/pET-S1L-NadA; BL21(DE3)/pET-S1L-NadA. La transferencia de western muestra la presencia de formas oligoméricas de la proteína.

FIGURA 32: Esquema de clones de la proteína espicular de SARS.

FIGURA 33: Expresión transitoria de proteínas espiculares de SARS (transferencia de western de lisado de células COS7). Cada calle del gel TG SDS al 4%-20% se cargó con 20 µg de lisado celular (1,2 mg en total). Se muestran los anticuerpos marcadores.

FIGURA 34: Análisis de transferencia de western de lisados de células COS7 en gel TG SDS al 4% que muestra el estado de oligomerización de las moléculas de S intracelulares.

FIGURA 35: Análisis de transferencia de western de lisados de células COS7 en gel TG SDS al 4%-20% que muestra la expresión transitoria de las proteínas espiculares de SARS: Las calles son: (1) simulacro, AF; (2) simulacro, DF; (3) nSh, AF; (4) nSh, DF; (5) nShΔTC, AF; (6) nShΔTC, DF. Se cargó cada calle con 5 µl de cada muestra, 400 µl en total. La membrana de transferencia se marcó con anticuerpo contra la proteína con cola de histidinas.

FIGURA 36: Análisis de transferencia de western de medio de células COS7 en gel TG SDS al 4%-20% que muestra la expresión transitoria de las proteínas espiculares de SARS: Se secreta proteína espicular truncada. Las proteínas espiculares se purificaron a partir del medio de cultivo (de una placa de 10 cm), primero mediante una columna ConA y, finalmente, mediante perlas magnéticas de cola de histidinas. Se cargó cada calle con un tercio del material.

FIGURA 37: Análisis de transferencia de western de lisados de células COS7 en gel TG SDS al 4%-20% que muestra la glicosilación de proteínas espiculares de SARS. En las dos membranas de transferencia de la izquierda (calles 1-5), las muestras se sometieron a ebullición en SDS y β-mercaptoetanol; en las dos membranas de transferencia de la derecha (calles 6-11), las muestras estuvieron en SDS solamente, sin ebullición. Las calles 1-8 se marcaron con un anticuerpo monoclonal generado contra la proteína con cola de histidinas; las calles 9-11 se marcaron con anticuerpo de conejo anti-SARS.

FIGURA 38: Efecto de la expresión de la proteína espicular de SARS sobre la viabilidad celular.

FIGURA 39: Análisis de transferencia de western de lisados de células COS7 en geles TG SDS al 4% que muestra el estado de oligomerización de las moléculas de proteína espicular intracelulares. Las transferencias se marcaron con AcMo anti-cola de histidinas.

La fracción de membrana del lisado de células COS7 se fraccionó mediante una columna de exclusión molecular antes de cargar las calles. Las fracciones 7 a 14 muestran bandas con valores de kDa de: 71.000, 1.400, 898, 572, 365, 232, 148 y 99, respectivamente.

FIGURA 40: Fraccionamiento de las células en fracciones acuosa y detergente.

FIGURA 41: Esquema de los constructos para su uso en la preparación de OMV.

FIGURA 42: Constructos HR1 y HR2 de SARS.

FIGURA 43: Protección de la vacuna frente a SARS en modelo de ratón Balb/c.

FIGURA 44: Expresado en proteína espicular en 293 lisados celulares (52A) o sobrenadantes de cultivo de células COS7 (44B) transfectadas. Las proteínas se separaron en geles TG SDS al 4%-20%. El marcador era anti-cola de histidinas, a excepción de las tres calles de la derecha de 44B, en las que el marcador era suero de conejo anti-SARS. En la Figura 44A, las tres calles de la izquierda se trataron con DTT y se sometieron a ebullición, pero no se utilizó ninguno de los tratamientos para las tres calles de la derecha. En la Figura 44B, no se utilizó DTT, pero todas las calles se calentaron a 80°C durante 5 minutos.

FIGURA 45: Transferencia de western de las proteínas espiculares expresadas en células COS7. Las proteínas se incubaron a temperatura ambiente (TA), 80°C o 100°C para comprobar cualquier efecto sobre el peso molecular. La FIGURA 46 muestra experimentos similares en viriones de SARS.

FIGURA 47: Resultados de un experimento de radiomarcado y seguimiento, que muestran la expresión y el procesamiento de la proteína espicular de SARS después de la infección con partículas de replicón de alfavirus. Las células se trataron con o sin EndoH, como se muestra.

FIGURA 48: Efecto del calentamiento sobre trímeros de proteína espicular.

FIGURA 49: Gel teñido con azul de Coomassie de proteínas expresadas en levadura. Las calles son: 1-SeeBlue Standard (10 µl); 2-pAB24 gbl (20 µg); 3-S1 de proteína espicular de SARS c.1 gbl (20 µg); 4-S1 de proteína espicular de SARS c.2 gbl (20 µg); 5-SeeBlue Standard (10 µl); 6-pAB24 ip (5 µl); 7-S1 de proteína espicular de SARS c.1 (5 µl); 8-S1 de proteína espicular de SARS c.2 (5 µl).

FIGURAS 50 a 56: Esquema de la preparación de constructos de expresión en levadura.

FIGURAS 57 a 58: Secuencias expresada en levadura para la proteína espicular.

FIGURA 59: Transferencias de western que muestran la expresión de la proteína espicular de SARS a partir de ARN replicón y partículas de replicón de alfavirus. La Figura 59A se procesó en condiciones no reductoras y a temperatura ambiente (es decir, sin calentamiento), siendo las calles: (1) infección con VEE/SIN-proteína espicular;

(2) infección con VEE/SIN-GFP; (3) transfección de ARN replicón-proteína espicular; (4) transfección de ARN replicón-GFP. La Figura 51B se procesó con viriones de SARS a diferentes temperaturas, como se muestra.

FIGURA 60: inducción de respuestas de anticuerpos en ratones. Los grupos de vacuna son: (1) Virus del SARS inactivado; (2) Proteína espicular recombinante truncada; (3) proteína espicular de longitud completa: ADN+ADN:PLG + Alfavirus; (4), proteína espicular completa: sólo partículas de alfavirus.

FIGURA 61: Unión de anticuerpo monoclonal humano S3.2 a proteína espicular truncada purificada. El eje X muestra la concentración de anticuerpo, y el eje Y muestra la absorbancia ELISA. El resultado de interpolación es 2158,13.

FIGURA 62: Media geométrica de los títulos de ELISA de los anticuerpos inducidos por la proteína espicular de SARS-CoV administrada como diferentes vacunas (de izquierda a derecha: virus inactivado; 3 µg de proteína espicular truncada; 75 µg de ADN que codifica la proteína espicular truncada).

FIGURA 63: Títulos de neutralización después de la inmunización con (izquierda) proteína nSdΔTC o (derecha) ADN que codifica nSdΔTC, administrados en PLG.

FIGURA 64: Correlación entre la unión del antígeno proteína espicular y los anticuerpos neutralizantes

FIGURA 65: Transferencia de western de líneas celulares CHO que expresan la proteína espicular en la forma de longitud completa (izquierda) o en la forma truncada (derecha). Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 4%-12%, con ebullición en DTT y tinción mediante suero policlonal.

FIGURA 66: Componentes estructurales de la glicoproteína espicular de SARS-CoV y constructo de expresión. L indica el péptido líder (residuos 1-13), TM la transmembrana y Cy los segmentos de la cola citoplasmática. No se muestran las colas hexahistidina.

FIGURA 67: Análisis de transferencia de western de proteínas espiculares de SARS expresadas en células COS7. En la Figura 67A, las células COS7 se transfectaron con los constructos plasmídicos indicados y las proteínas expresadas en los lisados celulares 48 horas después de la transfección se analizaron mediante SDS-PAGE (poliacrilamida al 4%-20%) en condiciones de reducción y desnaturalización, visualizándose las proteínas mediante AcMo anti-histidina. En la Figura 67B, las proteínas se recogieron del medio de cultivo celular 48 horas después de la transfección y se purificaron primero mediante una columna ConA y a continuación mediante perlas magnéticas de cola de histidinas. Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE (poliacrilamida al 4%-20%) y se visualizaron mediante suero de conejo anti-SARS.

FIGURA 68: Sensibilidad a Endo H de la proteína espicular truncada en el extremo C-terminal (SΔ) encontrada en lisado celular (calles 1,2) y medio de cultivo (calles 3,4). Las posiciones de la proteína SΔ interna y la proteína SΔ secretada están marcadas con puntas de flecha.

FIGURA 69: Estado oligomérico de la proteína espicular de SARS. Oligómero de proteína S recombinante en las células COS7 transfectadas con el constructo proteína espicular de longitud completa (nSh). Los lisados celulares se trataron con DTT y/o calor como se indica por encima de cada calle. Las diferentes formas de la proteína S en las muestras tratadas y sin tratar se visualizaron mediante SDS-PAGE (poliacrilamida al 4%) y análisis de transferencia de western utilizando AcMo anti-histidina.

FIGURA 70: Efecto de la desnaturalización térmica sobre el estado oligomérico de la proteína S recombinante en ausencia de DTT. Los lisados de células COS7 se calentaron antes de la electroforesis como se indica y las proteínas S se visualizaron como se describe para la Figura 69.

FIGURA 71: Efecto de la desnaturalización térmica sobre el estado oligomérico de la proteína espicular en partículas de viriones de SARS. Se cultivaron SARS-CoV en células Vero, se purificaron y solubilizaron a partir de las

partículas de virión mediante SDS, se desnaturalizaron por calor como se indica y se visualizaron como se describe en la Figura 69, salvo que se utilizó como sonda antisuero de conejo contra el virus purificado.

FIGURA 72: Análisis del estado oligomérico de la proteína espicular del virión de SARS mediante experimento de entrecruzamiento. Las proteínas del virión de SARS solubilizadas se trataron con DMS. Las proteínas del virión sin tratar (-) y tratadas con DMS (+) se desnaturalizaron por calor en ausencia de DTT y se visualizaron mediante PAGE al 4% seguido de tinción con plata.

FIGURAS 73 y 74: Análisis del estado oligomérico de la proteína espicular truncada mediante desnaturalización térmica. La proteína espicular truncada dentro de los lisados de células COS7 (73) o secretada en el medio de cultivo (74) se desnaturalizó por calor como se ha indicado en ausencia de DTT y se visualizó mediante análisis de transferencia de western.

FIGURA 75: Reactividad del oligómero de proteína espicular de longitud completa desglicosilado con anticuerpo conformacional y no conformacional. El oligómero de proteína espicular recombinante de longitud completa se desglicosiló parcialmente con PNGasa F en condiciones no desnaturalizantes y se visualizó mediante transferencia de western utilizando AcMo anti-histidina (calle 1,2,3) o antisuero de conejo contra SARS-CoV purificado (calle 4,5,6).

FIGURA 76: Localización de las proteínas espiculares de SARS expresadas en lisado fraccionado de células COS7 visualizada mediante transferencia de western. Las células se transfectaron con los plásmidos indicados y se lisaron con un homogeneizador Dounce en tampón hipotónico 48 horas después de la transfección. El lisado celular se centrifugó para obtener citosol soluble y la fracción de membrana insoluble que se solubilizó adicionalmente mediante Triton X-100 al 4%. Las proteínas se calentaron con SDS a 80ºC y se analizaron mediante SDS-PAGE (poliacrilamida al 4%-20%) en condiciones reductoras. Las proteínas se visualizaron mediante AcMo anti-histidina. Las fracciones de citosol se cargaron en las calles 1, 3 y 5 y las fracciones de membrana se cargaron en las calles 2, 4 y6.

FIGURA 77: Expresión intracelular y en superficie de proteína espicular recombinante de longitud completa (A,D) o truncada (B,E) en células COS7. Las células se fijaron 48 horas después de la transfección y se trataron con detergente (Cytofix/perm, BD Biosciences) para la inmunofluorescencia intracelular (A,B,C) o con paraformaldehído al 2% para la observación de inmunofluorescencia de la superficie celular (D,E,F) con aumento x40. Como controles se incluyeron células de simulacro de transfección (C,F).

FIGURAS 78-97: SDS-PAGE de proteínas expresadas en E. coli. Tot = proteína total; Sol = fracción de proteína soluble. Las etiquetas son los nombres de las proteínas (Tablas 26-30).

FIGURA 98. Inmunofluorescencia después de la administración del vector que codifica el antígeno N optimizado.

FIGURA 99: Inmunofluorescencia de (A) secuencias de M natural y (B) con optimización de codones.

FIGURA 100: inmunofluorescencia de (A) secuencias de E natural y (B) con optimización de codones.

FIGURAS 101-103: Transferencias de western de células Vero utilizando anticuerpos de conejo obtenidos después de la inmunización con las proteínas espiculares expresadas en E. coli.

FIGURA 104: Expresión de proteínas espiculares en 293 células. Calles: (M) Marcadores; (1) transfectadas con simulacro; (2,6) células que expresan la proteína nS, lisado; (3,7) células que expresan la proteína nSdTC, lisado; (4,8) células que expresan la proteína nS, sobrenadante; (5,9) (4) células que expresan la proteína nSdTC, sobrenadante. Anticuerpo de tinción: (2 a 5) suero de ratón obtenido después de la inmunización con ADN; (6 a 9) suero de conejo obtenido después de la inmunización con virus enteros muertos.

FIGURA 105: Esquema de la organización del genoma de coronavirus.

FIGURA 106: Esquema de los productos génicos ORF1a/ORF1b de coronavirus, incluida la región "*".

FIGURA 107: Transferencia de western de fracciones de purificación de proteasa de SARS.

FIGURA 108: Escisión de DABCYL-EDANS (un péptido marcado fluorescente con un sitio de escisión de proteasa de SARS) mediante proteasa de SARS a diferentes concentraciones. El gráfico muestra las correlaciones actividad/concentración sin proteasa (♦),0,95 uM de proteasa (■) y 2,86 uM de proteasa (●).

En caso de discrepancia entre una secuencia en la lista de secuencias y una secuencia en los dibujos, los dibujos deben tener prioridad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La puesta en práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19ª edición (1995); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, vols. I-IV (D.M. Weir y

C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997); Short Protocols in Molecular Biology, 4ª ed. (Ausubel et al. eds., 1999, John Wiley y Sons); Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2ª ed. (Newton y Graham eds., 1997, Springer Verlag); Peters y Dalrymple, Fields Virology (2ª ed.), Fields et al. (eds.), B.N. Raven Press, Nueva York, NY.

Recientemente se ha identificado el virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) como una nueva especie de virus. La especie de virus del SARS incluye los siguientes aislados.

 dos aislados del virus descritos en Peiris et al. "Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory

syndrome" que Lancet publicó online en http://image.thelancet.com/extras/03art3477web.pdf el 8 de abril de

2003, y las secuencias depositadas en el GenBank en el número de registro AY268070.

 los aislados y las secuencias virales descritos en Drosten et al., "Identification of a Novel Coronavirus in

Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome", New England Journal of Medicine, publicado online en

http://www.nejm.org el 10 de abril de 2003.

 los aislados y las secuencias virales descritos en el sitio web de la red de la OMS, el 25 y 24 de marzo de

2003.

 los aislados y secuencias virales descritos en Tsang et al., "A Cluster of Cases of Severe Acute Respiratory

Syndrome in Hong Kong", New England Journal of Medicine, publicado online en http://www.nejm.org el 31

de marzo de 2003.

 los aislados y las secuencias virales descritos en Poutanen et al., "Identification of Severe Acute

Respiratory Syndrome in Canada", New England Journal of Medicine, publicado online en

http://www.nejm.org el 31 de marzo de 2003.

Tal como se describe en el artículo del Lancet, un polinucleótido de 646 pares de bases del virus del SARS tiene una débil homología con los virus de la familia Cornoaviridae. El artículo del Lancet informa adicionalmente de que una secuencia de aminoácidos deducida (de 215 aminoácidos) de esta secuencia tiene aproximadamente un 57% de homología de secuencia con la ARN polimerasa del coronavirus bovino y el virus de la hepatitis murina. El análisis filogenético de las secuencias de proteínas también se presentan en el artículo del Lancet, y muestran que la secuencia de la polimerasa está más estrechamente relacionada con los coronavirus del grupo II.

Los virólogos expertos en la materia pueden identificar, aislar y/o secuenciar aislados del virus del SARS adicionales. Los virólogos pueden identificar fácilmente nuevos aislados virales como un virus del SARS. Los criterios que un virólogo puede utilizar para identificar nuevos aislados de SARS incluyen: la homología de secuencia del nuevo aislado con aislados del virus del SARS conocidos; la organización genómica similar del nuevo aislado viral con aislados del virus del SARS conocidos; la identidad o similitud inmunológica (serológica) con aislados del virus del SARS conocidos; la patología; y la similitud de la morfología del virión con aislados del virus del SARS conocidos; y la similitud de la morfología de la célula infectada como aquella causada por aislados del virus del SARS conocidos (visualizada, por ejemplo, mediante microscopía electrónica).

Los nuevos aislados de SARS también pueden identificarse por un porcentaje de homología del 99%, 95%, 92%, 90%, 85% u 80% de homología de la secuencia polinucleotídica para regiones genómicas específicas del nuevo virus con la secuencia polinucleotídica para regiones genómicas específicas de los virus del SARS conocidos. Además, los nuevos aislados de SARS pueden identificarse por un porcentaje de homología del 99%, 95%, 92%, 90%, 85% u 80% de homología de la secuencia polipeptídica codificada por el polinucleótido de regiones genómicas específicas del nuevo virus del SARS con la secuencia polipeptídica codificada por los polinucleótidos de regiones específicas del virus del SARS conocido. Estas regiones genómicas pueden incluir regiones (por ejemplo, productos génicos) que por lo general son comunes entre los numerosos coronavirus, así como regiones específicas de grupo (por ejemplo, grupos antigénicos), tales como, por ejemplo, cualquiera de las siguientes regiones genómicas que un virólogo experto en la materia podría identificar fácilmente: región no traducida en 5’ (UTR), secuencia líder, ORF1a, ORF1b, proteína no estructural 2 (NS2), glicoproteína hemaglutinina-esterasa (HE) (también conocida como E3), glicoproteína espicular (S) (también conocida como E2), ORF3a, ORF3b, ORF3x, proteína no estructural 4 (NS4), proteína (de membrana pequeña) de la envoltura (E) (también conocida como sM), glicoproteína de membrana (M) (también conocida como E1), ORF5a, ORF5b, fosfoproteína de la nucleocápside (N), ORF7a, ORF7b, secuencias intergénicas, 3'UTR, o ARN polimerasa dependiente de ARN (pol). El virus del SARS puede tener regiones genómicas identificables con una o más de las regiones genómicas identificadas anteriormente. Un antígeno viral de SARS incluye una proteína codificada por cualquiera de estas regiones genómicas. Un antígeno viral de SARS puede ser una proteína o un fragmento de la misma, que está altamente conservada entre los coronavirus. Un

antígeno viral de SARS puede ser una proteína o fragmento de la misma, que sea específica para el virus del SARS (en comparación con los coronavirus conocidos). (Véanse las Figuras 1-4).

Un experto en la materia también podría reconocer la microscopía electrónica de una célula de mamífero

5 infectada por el virus del SARS. En el artículo del Lancet se muestra la microscopía electrónica de las células infectadas por SARS. Como se analiza en el artículo, la microscopía electrónica de extractos de cultivo celular ultracentrifugados, con tinción negativa (fosfotungstato de potasio al 3%, pH 7,0) de células renales fetales de Rhesus infectadas con SARS muestran la presencia de partículas virales con envoltura pleomórficas de aproximadamente 80 nm-90 nm (intervalo 70 nm-130 nm) de diámetro, con morfología de la superficie compatible con un coronavirus (véase el artículo del Lancet, Figura 1). La microscopía electrónica de cortes finos de células infectadas pone de manifiesto partículas de virus de 55 nm-90 nm de diámetro dentro de vesículas de paredes lisas en el citoplasma (véase el artículo del Lancet, Figura 2B). La microscopía electrónica también puede utilizarse para observar las partículas de virus en la superficie celular. La microscopía electrónica de una muestra de biopsia de pulmón humano representa una morfología viral similar. Véase el artículo del Lancet, Figura 2A.

I. POLIPÉPTIDOS DE SARS

La invención se refiere a proteínas del virus del SARS. Tales polipéptidos se ejemplifican más adelante.

Las dos secuencias de aminoácidos dentro de la Figura 18, separadas por un símbolo *, son las SEQ ID NO: 7188 y 7189.

La SEQ ID NO: 7188 contiene un marco de lectura abierto que comprende la SEQ ID NO: 6042. La invención incluye un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 6042. La invención incluye un polipéptido que

25 comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042. La invención incluye un fragmento de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 6042. La invención incluye una composición inmunogénica que comprende un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 6042, o un fragmento del mismo. La SEQ ID NO: 6042 demuestra homología funcional con una proteína espicular de coronavirus.

Las regiones transmembrana predichas de la SEQ ID NO: 6042 se identifican más adelante.

Hélices transmembrana predichas de la SEQ ID NO: 6042

Las posiciones de secuencia entre paréntesis denominan la región central. Sólo las puntuaciones por 35 encima de 500 se consideran significativas.

Hélices de dentro a fuera: 18 encontradas Hélices de fuera a dentro: 13 encontradas

desde hasta puntuación centro desde hasta puntuación centro

1(1) 16(16) 959 9 1(1) 17(17) 684 10 233 ( 237) 257 ( 252) 905 244 222 ( 222) 240 ( 237) 238 229 345 ( 347) 364 ( 361) 490 354 244 ( 247) 264 ( 264) 613 254 345 ( 354) 369 ( 369) 420 362 349 ( 355) 369 ( 369) 314 362 497 ( 497) 513 ( 513) 239 506 496 ( 496) 511 ( 511) 488 503 573 ( 573) 588 ( 588) 811 580 573 ( 573) 591 ( 591) 712 581 645 ( 648) 666 ( 663) 302 656 650 ( 652) 666 ( 666) 474 659 690 ( 696) 714 ( 711) 428 704 674 ( 679) 702 ( 696) 190 686 857 ( 860) 882 ( 874) 1508 867 691 ( 696) 713 ( 711) 210 704 1031 ( 1031) 1046 ( 1046) 446 1039 866 ( 868) 886 ( 886) 1172 876 1199 ( 1203) 1219 ( 1217) 2667 1210 1198 ( 1201) 1215 ( 1215) 3221 1208

La SEQ ID NO: 6042, la proteína espicular, es un polipéptido expuesto en la superficie. Los cebadores para amplificar el gen de la proteína espicular y fragmentos de la misma, tales como fragmentos que codifican el 55 ectodominio soluble, incluyen las SEQ ID NO: 9753-9763 (Xiao et al. (2003) Biochem Biophys Res Comm

312:1159-1164).

A continuación se presenta la caracterización adicional de la SEQ ID NO: 6042.

La SEQ ID NO: 6042 parece tener una región de señalización N-terminal, seguida de una región expuesta en la superficie, seguida de una región transmembrana seguida de una región de dominio citoplasmático C-terminal.

Dos fragmentos de oligopéptidos de la SEQ ID NO: 6042 que son capaces de inducir anticuerpos contra la proteína espicular son las SEQ ID NO: 7398 y 7399, como describen (con cisteínas C-terminales adicionales) Xiao et al. (2003) Biochem Biophys Res Comm 312:1159-1164. Yang et al., (2004) Nature 428: 561-564, describen truncamientos C-terminales de la proteína espicular, con eliminación de parte de la región citoplasmática, o eliminación hasta e incluyendo la región transmembrana.

Una variante de la SEQ ID NO: 6042 es la SEQ ID NO: 9962. En comparación con la SEQ ID NO: 6042, esta secuencia tiene Ser en el residuo 581 en lugar de Ala, y tiene Phe en el residuo 1152 en lugar de Leu.

La proteína espicular de los coronavirus puede escindirse en dos cadenas separadas S1 y S2. Las cadenas pueden permanecer asociadas conjuntamente para formar un dímero o un trímero.

La proteína espicular parece formar una estructura de hélice alfa en la región transmembrana de la proteína, preferentemente en el dominio S2. Se cree que esta estructura de hélice alfa se asocia con al menos dos proteínas espiculares adicionales para formar un trímero. Las regiones helicoidales o con enrollamiento de la proteína espicular se identifican más adelante. Los superenrollamientos predichos de la SEQ ID NO: 6042 (proteína espicular) se encuentran en los aminoácidos 900-1005 y 1151-1185 (véase la Figura 7).

Se cree que la proteína espicular desempeña un papel integral en la fusión y la infección de los coronavirus con las células hospedadoras de mamífero. El análisis de las proteínas espiculares de coronavirus, así como de proteínas de superficie similares en otros virus, ha identificado al menos dos motivos estructurales, por lo general situados en el dominio S2, asociados con este evento de fusión: repeticiones héptadas (HR) y péptidos de fusión de membrana.

Por lo general se encuentran al menos dos dominios de repetición héptada (HR) hidrófobos 4,3 en el ectodominio del dominio S2 de los coronavirus. Por lo general hay una región de repetición héptada (HR1) situada adyacente a un péptido de fusión, mientras que por lo general hay una segunda región héptada (HR2) situada cerca del extremo C-terminal del dominio S2, cerca del anclaje transmembrana. Las repeticiones héptadas son características de las estructuras con superenrollamiento y se cree que las repeticiones héptadas que se encuentran en las proteínas virales de superficie (tal como la proteína espicular de coronavirus) forman estructuras de haz de hélices que están implicadas en la entrada del virus. Véase Bosch et al., J. Virology (2003) 77: 8801-8811 (la Figura 1B de esta referencia ilustra un alineamiento de las regiones HR1 y HR2 de cinco coronavirus junto con SARS, anotado "HCoV-SARS").

Las repeticiones héptadas contienen generalmente una estructura de repetición de siete aminoácidos, indicada como a-b-c-d-e-f-g, en la que las cadenas laterales hidrófobas de los residuos a y d suelen formar una franja apolar, y las interacciones electrostáticas se encuentran en los residuos e y g. La posición a es con mayor frecuencia Leu, Ile o Ala y la posición d suele ser Leu o Ala. Los residuos e y g son con frecuencia Glu o Gln, destacándose también Arg y Lys en la posición g. Los residuos cargados son comunes a las posiciones b, c y f, ya que estos residuos pueden estar en contacto con un disolvente. Se conocen excepciones a estos parámetros generales. Por ejemplo, a veces se encuentran residuos Pro en la héptada.

Se ha postulado que las secuencias HR1 y HR2 de una cepa de MHV se ensamblan en un complejo similar a un bastoncillo alfa-helicoidal, oligomérico y termoestable, estando las hélices HR1 y HR2 orientadas de manera

antiparalela. Id. En este mismo estudio, se afirmaba que HR2 es un fuerte inhibidor de la entrada del virus en la célula y de la fusión célula-célula.

Se han identificado secuencias HR1 y HR2 en el genoma del virus del SARS. La región HR1 del virus del SARS comprende aproximadamente los aminoácidos 879 a 1005 de la SEQ ID NO: 6042 o fragmentos de la misma capaces de formar al menos una vuelta de hélice alfa. Preferentemente, dichos fragmentos comprenden al menos 7 (por ejemplo, al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49 ó 56) residuos de aminoácidos.

Un fragmento preferente de HR1 comprende los residuos de aminoácidos 879 a 980 de la SEQ ID NO: 6042. Este fragmento preferente es la SEQ ID NO: 7193.

Otro fragmento preferente de HR1 comprende los residuos de aminoácidos 901 a 1005 de la SEQ ID NO: 6042. Este fragmento preferente es la SEQ ID NO: 7194.

La región HR2 del virus del SARS comprende aproximadamente los aminoácidos 1144 a 1201 de la SEQ ID NO: 6042, o fragmentos de la misma capaces de formar al menos una vuelta de hélice alfa. Preferentemente, dichos fragmentos comprenden al menos 7 (por ejemplo, al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49 ó 56) residuos de aminoácidos. Un fragmento preferente de HR2 comprende los aminoácidos 1144 a 1195 de la SEQ ID NO: 6042. Este fragmento preferente es la SEQ ID NO: 7196.

También se cree que las secuencias del péptido de fusión de membranas dentro de la proteína espicular participan en la fusión (y la infección) del virus con una célula hospedadora. Los péptidos de fusión comprenden generalmente de aproximadamente 16 a 26 residuos de aminoácidos que están conservados dentro de las familias de virus. Estos péptidos de fusión de membranas son relativamente hidrófobos y muestran generalmente una distribución asimétrica de la hidrofobicidad cuando adoptan la forma de hélice alfa. También son generalmente ricos en alanina y glicina.

Se han identificado al menos tres regiones hidrófobas del péptido de fusión de membranas dentro de los coronavirus (PEP1, PEP2 y PEP3). Véase, Luo et al., "Roles in Cell-Cell Fusion of Two Conserved Hydrophobic Regions in the Murine Coronavirus Spike Protein", Virology (1998) 244: 483-494. La Figura 1 de este artículo muestra un alineamiento de secuencias del péptido de fusión de membranas del virus de la hepatitis de ratón, coronavirus bovino, virus de la peritonitis infecciosa felina, virus de la gastroenteritis transmisible y virus de la bronquitis infecciosa. Véase también, Bosch et al., "The Coronavirus Spike Protein is a Class I Virus Fusion Protein: Structural and Functional Characterization of the Fusion Core Complex". Journal of Virology (2003) 77(16): 8801-8811.

Se han identificado las secuencias PEP1 (SEQ ID NO: 7197), PEP2 (SEQ ID NO: 7198) y PEP3 (SEQ ID NO: 7199) dentro de la proteína espicular de SARS.

Se cree que las proteínas espiculares de coronavirus (y otras proteínas virales de superficie similares) experimentan un cambio conformacional tras la unión del receptor a la membrana de la célula diana. Se cree que uno o más de los péptidos de fusión de membranas hidrófobos quedan expuestos y que se insertan en la membrana diana como resultado de este cambio conformacional. Se cree que la energía libre que se libera tras el posterior replegamiento de la proteína espicular a su conformación más estable desempeña un papel en la fusión de las membranas viral y celular.

Pueden utilizarse una o más secuencias HR de SARS, preferentemente HR2, o un fragmento de la misma, para inhibir la entrada del virus y la fusión de membranas con una célula hospedadora diana de mamífero.

Como se analiza con más detalle más adelante en la memoria descriptiva, los solicitantes han identificado las similitudes estructurales entre la proteína espicular de SARS y la proteína de superficie de Neisseria meningitidis, NadA (y otras proteínas de adhesión bacterianas similares). Otro medio para facilitar la expresión bacteriana de las secuencias HR incluye añadir las secuencias de anclaje y/o tallo de una proteína similar a NadA al extremo C-terminal de las secuencias HR recombinantes. Las secuencias recombinantes que contienen la secuencia de anclaje bacteriana pueden prepararse preferentemente en vesículas de membrana externa (la preparación de las cuales se analiza con más detalle más adelante en la solicitud). Las secuencias recombinantes a las que les faltan las secuencias de anclaje bacterianas pueden secretarse y aislarse a partir del sobrenadante.

Los ejemplos de constructos que pueden utilizarse en los sistemas de expresión bacterianos se muestran en la FIGURA 42.

Líder NadA (1-29) -HR1 (879-980) -6Xgly -HR2 (1144-1195) -tallo + anclaje NadA (88-405)

Líder NadA (1-29) -HR1 (879-980) -6Xgly -HR2 (1144-1196) -tallo NadA (88-351)

Líder NadA (1-29) -HR1 -HR2 (879-1196) -tallo + anclaje NadA (88-405)

Líder NadA (1-29) -HR1 --HR2 (879-1196) -tallo NadA (88-351)

HR1 -HR2 (879-1196) -tallo NadA (88-351) -6xhis

Líder NadA (1-29) -H1 -HR2 (879-1196) -anclaje NadA (351-405)

Líder NadA (1-29) -HR1-HR2 (879-1196)

La administración de una o más de estas secuencias de fusión de membranas también puede interferir con5 la capacidad de un coronavirus para fusionarse a una membrana de célula hospedadora.

Pueden unirse entre sí dos o más de los péptidos de fusión de membranas de SARS.

La proteína espicular puede producirse por recombinación. La porción alfa-helicoidal de la proteína espicular se asocia con la membrana celular. Preferentemente, las proteínas espiculares forman un trímero dentro de la región transmembrana de fijación.

A continuación se identifican los sitios de N-glicosilación predichos de la SEQ ID NO: 6042:

15 Concordancia Resultado

Posición Potencial del jurado NGlyc

29 NYTQ SEQ ID NO: 7207 0,7751 (9/9) +++

65 NVTG SEQ ID NO: 7208 0,8090 (9/9) +++

109 NKSQ SEQ ID NO: 7209 0,6081 (7/9) +

119 NSTN SEQ ID NO: 7210 0,7039 (9/9) ++

158 NCTF SEQ ID NO: 7211 0,5808 (7/9) +

227 NITN SEQ ID NO: 7212 0,7518 (9/9) +++

269 NGTI SEQ ID NO: 7213 0,6910 (9/9) ++

318 NITN SEQ ID NO: 7214 0,6414 (9/9) ++ 330 NATK SEQ ID NO: 7215 0,6063 (8/9) + 357 NSTF SEQ ID NO: 7216 0,5746 (8/9) + 589 NASS SEQ ID NO: 7217 0,5778 (6/9) + 602 NCTD SEQ ID NO: 7218 0,6882 (9/9) ++ 699 NFSI SEQ ID NO: 7219 0,5357 (7/9) + 783 NFSQ SEQ ID NO: 7220 0,6348 (9/9) ++ 1080 NGTS SEQ ID NO: 7221 0,5806 (7/9) + 1116 NNTV SEQ ID NO: 7222 0,5106 (5/9) + 1176 NESL SEQ ID NO: 7223 0,6796 (9/9) ++

A continuación se identifican los sitios de O-glicosilación predichos:

Residuo No. Potencial Umbral Asignación

Thr 698 0,8922 0,7696 T

Thr 706 0,9598 0,7870 T

Thr 922 0,9141 0,7338 T

Ser 36 0,8906 0,7264 S

Ser 703 0,8412 0,7676 S

Los sitios de fosforilación predichos de la SEQ ID NO: 6042 son Ser-346, Tyr-195 y Tyr-723.

Xiao et al., (2003) Biochem Biophys Res Comm 312:1159-1164, han descrito la expresión y caracterización funcional de la glicoproteína espicular.

Los términos "polipéptido", "proteína" y la expresión "secuencia de aminoácidos" tal como se utilizan en el

55 presente documento se refieren en general a un polímero de residuos de aminoácidos y no están limitados a una longitud mínima del producto. Por lo tanto, quedan incluidos dentro de la definición los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, y similares. Quedan comprendidas en la definición tanto proteínas de longitud completa como fragmentos de las mismas.

Los polipéptidos de la invención pueden prepararse de muchas maneras, por ejemplo, mediante síntesis química (al menos en parte), mediante digestión de polipéptidos más largos utilizando proteasas, mediante traducción a partir del ARN, mediante purificación a partir del cultivo celular (por ejemplo, a partir de la expresión recombinante), a partir del propio organismo (por ejemplo, después del cultivo viral, o directamente de los pacientes), a partir una fuente de línea celular etc. Un método preferente para la producción de péptidos < 40 aminoácidos de 65 longitud implica la síntesis química in vitro (Bodanszky (1993) Principles of Peptide Synthesis (ISBN: 0387564314); Fields et al. (1997) Methods in Enzymology 289: Solid-Phase Peptide Synthesis. ISBN: 0121821900). Resulta

especialmente preferente la síntesis de péptidos en fase sólida, tal como los métodos basados en la química t-Boc o Fmoc (Chan y White (2000) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis ISBN: 0199637245). También puede utilizarse, en parte o en su totalidad, la síntesis enzimática (Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis. ISBN: 0849368413). Como alternativa a la síntesis química, puede utilizarse la síntesis biológica, por ejemplo los polipéptidos pueden producirse mediante traducción. Esto puede llevarse a cabo in vitro o in vivo. Los métodos biológicos en general se limitan a la producción de polipéptidos basados en L-aminoácidos, pero puede utilizarse la manipulación de la maquinaria de traducción (por ejemplo, de moléculas de aminoacil ARNt) para permitir la introducción de D-aminoácidos (o de otros aminoácidos no naturales, tales como yodotirosina o metilfenilalanina, azidohomoalanina, etc.) (Ibba (1996) Biotechnol Genet Ing Rev 13: 197-216). Sin embargo, cuando se incluyen D-aminoácidos resulta preferente utilizar la síntesis química. Los polipéptidos de la descripción pueden tener modificaciones covalentes en el extremo C-terminal y/o N-terminal, particularmente cuando son para la administración in vivo, por ejemplo mediante fijación de acetilo o carboxamida, como en el producto Fuzeon™.

La referencia a polipéptidos y similares incluye también derivados de las secuencias de aminoácidos de la descripción. Tales derivados pueden incluir modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación, y similares. Los derivados de aminoácidos también pueden incluir modificaciones en la secuencia natural, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservadora), siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de los hospedadores que producen las proteínas o errores debidos a la amplificación mediante PCR. Además, pueden realizarse modificaciones que tengan uno o más de los siguientes efectos: reducir la toxicidad; facilitar el procesamiento celular (por ejemplo, la secreción; la presentación de antígenos, etc.); y facilitar la presentación a los linfocitos B y/o linfocitos T.

"Fragmento" o "porción" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido que consiste en sólo una parte de la estructura y secuencia polipeptídica de longitud completa intacta tal como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, un fragmento puede incluir una deleción C-terminal y/o una deleción N-terminal de una proteína.

Una proteína "recombinante" es una proteína preparada mediante técnicas de ADN recombinante como se describe en el presente documento. En general, el gen de interés se clona y a continuación se expresa en organismos transformados, como se describe más adelante. El organismo hospedador expresa el gen extraño para producir la proteína en condiciones de expresión.

Por "aislado" se entiende, cuando se refiere a un polipéptido, que la molécula indicada está separada y diferenciada del organismo completo con el que la molécula se encuentra en la naturaleza o, cuando el polipéptido no se encuentra en la naturaleza, está suficientemente libre de otras macromoléculas biológicas de manera que el polipéptido puede utilizarse para su finalidad prevista. Los polipéptidos de la invención son preferentemente polipéptidos aislados.

Una "composición inmunogénica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una composición que comprende una molécula antigénica en la que la administración de la composición a un sujeto da como resultado el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra la molécula antigénica de interés. La composición inmunogénica puede introducirse directamente en un sujeto receptor, tal como mediante inyección, inhalación, por vía oral, intranasal o cualquier otra vía de administración parenteral, mucosa o transdérmica (por ejemplo, intrarrectal o intravaginal).

La expresión "derivado de" se utiliza para identificar la fuente de la molécula (por ejemplo, una molécula puede derivarse de un polinucleótido, polipéptido, una línea celular inmortalizada puede derivarse de cualquier tejido, etc.).

Un primer polipéptido se "deriva de" un segundo polipéptido si (i) es codificado por un primer polinucleótido derivado de un segundo polinucleótido, o (ii) presenta identidad de secuencia con los segundos polipéptidos según lo descrito anteriormente. Por lo tanto, un polipéptido (proteína) se "deriva de" un virus del SARS concreto si (i) es codificado por un marco de lectura abierto de un polinucleótido de ese virus del SARS, o (ii) presenta identidad de secuencia, según lo descrito anteriormente, con polipéptidos de ese virus del SARS.

Tanto el polinucleótido como las moléculas polipeptídicas pueden derivarse físicamente de un virus del SARS o producirse por recombinación o mediante síntesis, por ejemplo, en base a secuencias conocidas.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender adicionalmente uno o más adyuvantes.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse por vía mucosa. Las vías adecuadas de administración a través de las mucosas incluyen las vías oral, intranasal, intragástrica, pulmonar, intestinal, rectal, ocular y vaginal. La composición inmunogénica puede adaptarse para la administración a través de

las mucosas. Por ejemplo, cuando la composición sea para la administración oral, puede estar en forma de comprimidos o cápsulas, opcionalmente con revestimiento entérico, de líquido, de plantas transgénicas, etc. Cuando la composición sea para la administración intranasal, puede estar en forma de aerosol nasal, gotas nasales, gel o polvo.

Las composiciones inmunogénicas de la descripción pueden administrarse por vía parenteral. Las vías adecuadas de administración parenteral incluyen las vías intramuscular (IM), subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, transcutánea y transdérmica (véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 98/20734), así como la administración al espacio intersticial de un tejido. La composición inmunogénica puede adaptarse para la administración parenteral, por ejemplo en forma de inyectable que puede ser estéril y apirógeno.

Las vacunas de la descripción pueden administrarse junto con otros agentes inmunorreguladores. En particular, las composiciones incluirán normalmente un adyuvante. Los adyuvantes adicionales preferentes incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes que se presentan a continuación:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la descripción incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La descripción incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. (por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 del documento Vaccine design: the subunit and adjuvant approach (1995) Powell y Newman. ISBN 0-306-44867-X), o mezclas de diferentes compuestos minerales, adoptando los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), y siendo preferente la adsorción. Las composiciones que contienen minerales también pueden formularse como una partícula de sal metálica. Véase el documento WO00/23105.

B. Emulsiones de aceite

Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la descripción incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 (escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5%, formulados en partículas submicrométricas utilizando un microfluidizador). Véase el documento WO90/14837. Véase también, Frey et al., "Comparison of the safety, tolerability, and immunogenicity of a MF59-adjuvanted influenza vaccine and a non-adjuvanted influenza vaccine in non-elderly adults", Vaccine (2003), 21: 4234-4237.

Los adyuvantes particularmente preferentes para su uso en las composiciones son emulsiones de aceite en agua submicrométricas. Las emulsiones de aceite en agua submicrométricas preferentes para su uso en el presente documento son emulsiones de escualeno/agua que contienen opcionalmente distintas cantidades de MTP-PE, tal como una emulsión de aceite en agua submicrométrica que contiene escualeno al 4%-5% p/v, Tween 80™ (monooleato de polioxietilensorbitán) al 0,25%-1,0% p/v, y/o Span 85™ (trioleato de sorbitán) al 0,25%-1,0%, y, opcionalmente, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isogluatminil-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)etilamina (MTP-PE), por ejemplo, la emulsión de aceite en agua submicrométrica conocida como "MF59" (publicación internacional Nº WO 90/14837; patentes de Estados Unidos Nº 6.299.884 y 6.451.325; y Ott et al., "MF59 -Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. y Newman, M.J. eds.) Plenum Press, Nueva York, 1995, págs. 277-296). MF59 contiene escualeno al 4%-5% p/v (por ejemplo, 4,3%), Tween 80™ al 0,25%-0,5% p/v y Span 85™ al 0,5% p/v y opcionalmente contiene distintas cantidades de MTP-PE, formulados en partículas submicrométricas utilizando un microfluidizador tal como el microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA). Por ejemplo, MTP-PE puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0-500 ng/dosis, más preferentemente 0-250 µg/dosis y lo más preferentemente, 0-100 µg/dosis. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "MF59-0" se refiere a la emulsión de aceite en agua submicrométrica anterior sin MTP-PE, mientras que el término MF59-MTP indica una formulación que contiene MTP-PE. Por ejemplo, "MF59-100" contiene 100 µg de MTP-PE por dosis, y así sucesivamente. MF69, otra emulsión de aceite en agua submicrométrica para su uso en el presente documento, contiene escualeno al 4,3% p/v, Tween 80™ al 0,25% p/v y Span 85™ al 0,75% p/v y opcionalmente MTP-PE. Otra emulsión de aceite en agua submicrométrica es MF75, también conocida como SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80™ al 0,4%, polímero de bloque pluronic L121 al 5% y thr-MDP, también microfluidizada en una emulsión submicrométrica. MF75-MTP indica una formulación de MF75 que incluye MTP, tal como de 100 µg-400 µg de MTP-PE por dosis.

Se describen detalladamente emulsiones de aceite en agua submicrométricas, sus métodos de fabricación y agentes inmunoestimuladores, tales como péptidos muramilo, para su uso en las composiciones, en la publicación internacional Nº WO 90114837 y las patente de EE.UU. Nº 6.299.884 y 6.451.325.

También pueden utilizarse como adyuvantes en la descripción el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA).

C. Formulaciones de saponina

También pueden utilizarse como adyuvantes en la descripción formulaciones de saponina. Las saponinas son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una gran variedad de especies de plantas. La saponina de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina se ha estudiado ampliamente como adyuvante. La saponina también puede obtenerse en el mercado de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (jabonera). Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones lipídicas, tales como los ISCOM.

Se han purificado composiciones de saponina utilizando cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HP-LC) y cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC). Se han identificado fracciones purificadas específicas utilizando estas técnicas, incluidas QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. En la patente de Estados Unidos Nº 5.057.540 se describe un método de producción de QS21. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol (véase el documento WO 96/33739).

Pueden utilizarse combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas denominadas complejos inmunoestimuladores (ISCOM). Los ISCOM incluyen también por lo general un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Puede utilizarse en los ISCOM cualquier saponina conocida. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de entre Quil A, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en los documentos EP 0 109 942, WO 96/11711 y WO 96/33739. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergente adicional. Véase el documento WO00/07621.

Puede encontrarse una revisión del desarrollo de adyuvantes a base de saponina en Barr, et al., "ISCOMs and other saponin based adjuvants", Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32: 247-271. Véase también Sjolander, et al., "Uptake and adjuvant activity of orally delivered saponin and ISCOM vaccines", Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32: 321-338.

D. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso en la descripción incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como:

(1) Derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS)

Tales derivados incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). El 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3 De-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. En el documento EP 0 689 454 se describe una forma de "partícula pequeña" preferente de monofosforil lípido A 3 De-O-acilado. Tales "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para esterilizarse por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros (véase el documento EP 0 689 454). Otros derivados no tóxicos de LPS incluyen miméticos de monofosforil lípido A, tales como derivados de aminoalquil glucosaminida fosfato por ejemplo, RC-529. Véase Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9: 2273-2278.

(2) Derivados de lípido A

Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tales como OM-174. OM-174 se describe por ejemplo en Meraldi et al., "OM-174, a New Adjuvant with a Potential for Human Use, Induces a Protective Response with Administered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242-310 from the circumsporozoite protein of Plasmodium berghei", Vaccine (2003) 21: 2485-2491; y Pajak, et al., "The Adjuvant OM-174 induces both the migration and maturation of murine dendritic cells in vivo", Vaccine (2003) 21: 836-842.

(3) Oligonucleótidos inmunoestimuladores

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para su uso como adyuvantes en la descripción incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia que contiene una citosina no metilada seguida de guanosina y unida por un enlace fosfato). El ARN bicatenario bacteriano o los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o de poli(DG) también han demostrado ser inmunoestimuladores.

Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones con fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Opcionalmente, la guanosina puede reemplazarse con un análogo tal como 2'-desoxi-7-desazaguanosina. Véanse Kandimalla, et al., "Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern: design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles", Nucleic Acids Research (2003) 31(9): 2393-2400; los documentos WO 02/26757 y WO 99/62923 para los ejemplos de posibles sustituciones análogas. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se analiza adicionalmente en Krieg, "CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts?", Nature Medicine (2003) 9(7): 831-835; McCluskie, et al., "Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategies in mice with

hepatitis B surface antigen and CpG DNA", FEMS Immunology and Medical Microbiology (2002). 32: 179-185; el documento WO 98/40100; la patente de Estados Unidos Nº 6.207.646; la patente de Estados Unidos Nº 6.239.116 y la patente de Estados Unidos Nº 6.429.199.

La secuencia CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT. Véase Kandimalla, et al., "Toll-like receptor 9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic CpG DNAs", Biochemical Society Transactions (2003) 31 (parte 3): 654-658. La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria Th1, tal como un ODN CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN CpG-B. Los ODN CpG-A y CpG-B se analizan en Blackwell, et al., "CpG-A-Induced Monocyte IFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulated by Plasmacytoid Dendritic Cell Derived IFN-alpha", J. Immunol. (2003) 170(8): 4061-4068; Krieg, "From A to Z on CpG", TRENDS in Immunology (2002) 23(2): 64-65 y el documento WO 01/95935. Preferentemente, el CpG es un ODN CpG-A.

Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye de manera que el extremo 5’ quede accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótidos CpG pueden estar fijadas en sus extremos 3’ para formar "inmunómeros". Véase, por ejemplo, Kandimalla, et al., "Secondary structures in CpG oligonucleotides affect immunostimulatory activity", BBRC (2003) 306: 948-953; Kandimalla, et al., "Toll-like receptor

9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic GpG DNAs", Biochemical Society Transactions (2003) 31 (parte 3): 664-658; Bhagat et al., "CpG penta-and hexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents" BBRC (2003) 300: 853-861 y el documento WO 03/035836.

(4) Toxinas de ribosilación de ADP y derivados detoxificados de las mismas.

Pueden utilizarse toxinas de ribosilación de ADP bacterianas y derivados detoxificados de las mismas como adyuvantes en la descripción. Preferentemente, la proteína se deriva de E. coli (es decir, enterotoxina termolábil "LT" de E. coli), del cólera ("CT") o de pertussis ("PT"). El uso de toxinas de ribosilación de ADP detoxificadas como adyuvantes para la administración en mucosas se describe en el documento WO 95/17211 y como adyuvante para administración parenteral en el documento WO 98/42375. Preferentemente, el adyuvante es un mutante de LT detoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LTR192G. El uso como adyuvantes de toxinas de ribosilación de ADP y derivados detoxificados las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, puede encontrarse en las siguientes referencias. Beignon, et al., "The LTR72 Mutant of Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia coli Enahnces the Ability of Peptide Antigens to Elicit CD4+ T Cells and Secrete Gamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin", Infection and Immunity (2002) 70(6):3012-3019; Pizza, et al., "Mucosal vaccines: non-toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants", Vaccine (2001) 19:2534-2541; Pizza, et al., "LTK63 and LTR72, two mucosal adjuvants ready for clinical trials", Int. J. Med. Microbiol (2000) 290(4-5):455-461; Scharton-Kersten et al., "Transcutaneous Immunization with Bacterial ADP-Ribosylating Exotoxins, Subunits and Unrelated Adjuvants", Infection and Immunity (2000) 68(9):5306-5313; Ryan et al., "Mutants of Escherichia coli Heat-Labile Toxin Act as Effective Mucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Acellular Pertussis Vaccine: Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity on Th1 and Th2 Cells", Infection and Immunity (1999) 67(12):6270-6280; Partidos et al., "Heat-labile enterotoxin of Escherichia coli and its site-directed mutant LTK63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cell responses to intranasally co-immunized synthetic peptides", Immunol. Lett. (1999) 67(3):209-216; Peppoloni et al., "Mutants of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasal delivery of vaccines", Vaccines (2003) 2(2):285-293; y Pine et al., (2002) "Intranasal immunization with influenza vaccine and a detoxified mutant of heat labile enterotoxin from Escherichia coli (LTK63)" J. Control Release (2002) 85(1-3):263-270. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en los alineamientos de las subunidades A y B de las toxinas de ribosilación de ADP que se presentan en Domenighini et al., Mol. Microbiol (1995) 15(6):1165-1167.

E. Inmunomoduladores Humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la descripción incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo interferón-γ), factor estimulador de colonias de macrófagos, y factor de necrosis tumoral.

F. Bioadhesivos y mucoadhesivos

También pueden utilizarse bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes en la descripción. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado (Singh et al. (2001) J. Cont. Rele.

70:

267-276) o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. También pueden utilizarse quitosano y derivados del mismo como adyuvantes en la descripción. Por ejemplo, el documento WO99/27960.

G.

Micropartículas

También pueden utilizarse micropartículas como adyuvantes en la descripción. Resultan preferentes las micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 µm de diámetro, más preferentemente ~200 nm a

~30 µm de diámetro, y lo más preferentemente ~500 nm a ~10 µm de diámetro) formadas a partir de materiales biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(α-hidroxi ácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida-co-glicólido), tratadas opcionalmente para que tengan una superficie cargada negativamente (por ejemplo con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

H. Liposomas

Los ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes se describen en la patente de Estados Unidos Nº 6.090.406, en la patente de Estados Unidos Nº 5.916.588 y en el documento EP 0 626 169.

I. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno

Los adyuvantes adecuados para su uso en la descripción incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno. WO99/52549. Tales formulaciones incluyen adicionalmente tensioactivos de éster de polioxietilensorbitán en combinación con un octoxinol (WO01/21207), así como tensioactivos de éster o éteres de alquilo polioxietileno en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol (WO01/21152).

Los éteres de polioxietileno preferentes están seleccionados del siguiente grupo: éter de polioxietilen-9-laurilo (laureth 9), éter de polioxietileno-9-esteorilo, éter de polioxietileno-8-esteorilo, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35-laurilo y éter de polioxietileno-23-laurilo.

J. Polifosfaceno (PCPP)

Se describen formulaciones de PCPP, por ejemplo, en Andrianov et al., "Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions", Biomaterials (1998) 19(1-3): 109-115 y Payne et al., "Protein Release from Polyphosphazene Matrices", Adv. Drug. Delivery Review (1998) 31(3): 185-196.

K. Péptidos muramilo

Los ejemplos de péptidos muramilo adecuados para su uso como adyuvantes en la descripción incluyen Nacetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) y Nacetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).

L. Compuestos de imidazoquinolona.

Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes en la descripción incluyen Imiquamod y sus homólogos, descritos adicionalmente en Stanley, "Imiquimod and the imidazoquinolones: mechanism of action and therapeutic potential", Clin Exp Dermatol (2002) 27(7): 571-577 y Jones, "Resiquimod 3M", Curr Opin Investig Drugs (2003) 4(2): 214-218.

M. Virosomas y partículas pseudovirales (VLP)

También puede utilizarse virosomas y partículas pseudovirales (VLP) como adyuvantes en la descripción. Estas estructuras contienen generalmente una o más proteínas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. Son generalmente no patógenas, no replicantes y generalmente no contienen nada del genoma viral natural. Las proteínas virales pueden producirse por recombinación o aislarse a partir de virus completos. Estas proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas de virus de la gripe (tal como HA o NA), virus de la hepatitis B (tal como proteínas del core o de la cápside), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, rotavirus, virus de la fiebre aftosa, retrovirus, virus de Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fago Qß (tales como proteínas de la cubierta), fago GA, fago fr, fago AP205, y Ty (tal como la proteína p1 del retrotransposón Ty). Las VLP se analizan adicionalmente en los documentos WO 03/024480, WO 03/024481 y en Niikura et al., "Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral Vaccine Vehicle Presenting Foreign Epitopes", Virology (2002) 293:273-280; Lenz et al., "Papillomarivurs-Like Particles Induce Acute Activation of Dendritic Cells", Journal of Immunology (2001) 5246-5355; Pinto, et al., "Cellular Immune Responses to Human Papillomavirus (HPV)-16 L1 Healthy Volunteers Immunized with Recombinant HPV-16 L1 Virus-Like Particles", Journal of Infectious Diseases (2003) 188:327-338; y Gerber et al., "Human Papillomavrisu Virus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens when Coadministered with Escherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG", Journal of Virology (2001) 75(10):4752-4760. Los virosomas se analizan adicionalmente en, por ejemplo, Gluck et al., "New Technology Platforms in the Development of Vaccines for the Future", Vaccine (2002) 20:B10-B16.

La descripción también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, pueden utilizarse en la descripción las siguientes composiciones de adyuvantes:

(1)

una saponina y una emulsión de aceite en agua (WO99/11241);

(2)

una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) (véase el documento WO 94/00153);

(3)

una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) + un colesterol;

(4)

una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) (WO98/57659);

(5)

combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (véase las solicitudes de patentes europeas 0835318, 0735898 y 0761231);

(6)

SAF, que contiene escualano al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero de bloque pluronic L121 al 5% y thr-MDP, microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado en vórtex para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula.

(7)

sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno

o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); y

(8)

una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dPML).

Las sales de aluminio y MF59 resultan adyuvantes preferentes para la inmunización parenteral. Las toxinas bacterianas mutantes resultan adyuvantes preferentes para la administración en mucosas.

Como se ha mencionado anteriormente, los adyuvantes adecuados para su uso en la descripción también pueden incluir uno o más de los siguientes:

 enterotoxina termolábil ("LT") de E. coli o mutantes detoxificados de la misma, tales como los mutantes K63

o R72;  toxina del cólera ("CT") o mutantes detoxificados de la misma;  micropartículas (es decir, una partícula de ~100 mm a ~150 µm de diámetro, más preferentemente ~200 nm

a ~30 µm de diámetro, y lo más preferentemente ~500 nm a ~10 µm de diámetro) formadas a partir de materiales biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(α-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona etc.);

 un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno (véase la solicitud de patente internacional WO 99/52549);

 un tensioactivo de éster de polioxietilensorbitán en combinación con un octoxinol (véase la solicitud de patente internacional WO 01/21207) o un tensioactivo de éster o éter de polioxietileno alquilo en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol (véase la solicitud de patente internacional WO 01/21152);

 quitosano (por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 99/27960);  un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, un oligonucleótido CpG) y una saponina (véase la

solicitud de patente internacional WO 00/62800);  ARN bicatenario inmunoestimulador;  compuestos de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, hidroxifosfato de aluminio,

oxihidróxido, ortofosfato, sulfato etc. (por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de Vaccine design: the subunit and adjuvant aproach, eds. Powell y Newman, Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X) (en adelante "Vaccine design"), o mezclas de diferentes compuestos de aluminio, adoptando los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), y resultando preferente la adsorción;

 MF59 (escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5%, formulados en partículas submicrométricas utilizando un microfluidizador) (véase el Capítulo 10 de Vaccine design; véase también la solicitud de patente internacional WO 90/14837);

 liposomas (véanse los capítulos 13 y 14 de Vaccine design);  los ISCOM (véase el Capítulo 23 de Vaccine design);  SAF, que contiene escualano al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero de bloque pluronic L121 al 5% y

thr-MDP, microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado en vórtex para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula (véase el Capítulo 12 de Vaccine design);

 sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™);

 adyuvantes de saponina, tales como QuilA o QS21 (véase el Capítulo 22 de Vaccine design), también

conocido como Stimulon™;  los ISCOM, que pueden estar desprovistos de detergente adicional (WO 00/07621);  adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA);

 citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, EL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones

(por ejemplo interferón-γ), factor estimulador de colonias de macrófagos, factor de necrosis tumoral, etc.

(véanse los capítulos 27 y 28 de Vaccine design);

 monofosforil lípido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL) (por ejemplo, el capítulo 21 de Vaccine design);

 combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (solicitudes de patente

europea 0835318, 0735898 y 0761231);

 oligonucleótidos que comprenden motivos CpG (véase Krieg (2000) Vaccine, 19: 618-622; Krieg (2001)

Curr. Opin. Mol. Ther, 2001, 3: 15-24; los documentos WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810,

WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 y WO 98/52581, etc.), es decir, que contienen al menos un

dinucleótido CG;

 un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno (solicitud de patente internacional WO99/52549);

 un tensioactivo de éster de polioxietilensorbitán en combinación con un octoxinol (solicitud de patente

internacional WO 01/21207) o un tensioactivo de éster o éter de polioxietileno alquilo en combinación con al

menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol (WO 01/21152);

 un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, un oligonucleótido CpG) y una saponina

(WO00/62800);

 un inmunoestimulador y una partícula de sal metálica (solicitud de patente internacional WO00/23105);

 una saponina y una emulsión de aceite en agua (WO 99/11241);

 una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) (WO 98/57659).

También se dispone de otros adyuvantes adecuados para la administración parenteral o a través de las mucosas (por ejemplo, véase el capítulo 7 de Vaccine design: the subunit and adjuvant aproach, eds. Powell y Newman, Plenum Press, 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

Los mutantes de LT resultan adyuvantes preferentes para la administración en mucosas, en particular, los mutantes "K63" y "R72" (por ejemplo, véase la solicitud de patente internacional WO 98/18928), ya que dan como resultado una respuesta inmunitaria potenciada.

Las micropartículas también resultan adyuvantes preferentes para la administración en mucosas. Estas se derivan preferentemente de un poli(α-hidroxiácido), en particular, a partir de una poli(lactida) ("PLA"), un copolímero de D,L-lactida y glicólido o ácido glicólico, tal como un poli(D,L-lactida-co-glicólido) ("PLG" o "PLGA"), o un copolímero de D,L-lactida y caprolactona. Las micropartículas pueden derivarse de cualquiera de diversos materiales de partida poliméricos con diversos pesos moleculares y, en el caso de copolímeros tales como PLG, diversas relaciones lactida:glicólido, cuya selección será en gran medida una cuestión de elección, dependiendo en parte del antígeno coadministrado.

EJEMPLOS

Ejemplo 1-EJEMPLO de un AISLADO DEL VIRUS DEL SARS

Se aisló un virus del SARS a partir de muestras clínicas de un paciente en Fráncfort, Alemania (FRA). El aislado se cultivó en células Vero. Se extrajo el ARN del virus del SARS y se amplificó mediante RT-PCR. Se determinó la secuencia de nucleótidos del genoma viral mediante secuenciación directa del producto de PCR. Se utilizó el análisis informático para predecir las características del genoma, para compararlo con los coronavirus anteriormente conocidos y con la secuencia de diferentes aislados del virus del SARS.

Más concretamente, el aislamiento y la secuencia se realizaron de la siguiente manera. Después del tercer pase del virus del SARS en células Vero, se purificaron las partículas virales mediante ultracentrifugación a partir de sobrenadante de 3x107 células. Se extrajo el ARN viral por el método del triazol (Gibco-BRL). Se transcribió el ARN viral (200 ng) a ADNc con transcriptasa inversa termoestable ARNasaH aviar siguiendo las instrucciones del fabricante (ThermoScript RT System, Invitrogen). En resumen, se utilizaron 50 pmoles de oligo (dT)20 o 25 ng de hexámeros aleatorios para cebar la reacción RT en un volumen final de 20 µl. La amplificación y secuenciación del genoma del SARS se llevaron a cabo mediante secuenciación directa de los productos de PCR obtenidos con: i) cebadores específicos de regiones de homología conservadas encontradas mediante el alineamiento múltiple entre coronavirus conocidos; ii) oligonucleótidos diseñados alrededor de secuencias cortas de aislados de SARS disponibles en la web a través de laboratorios de la red de la OMS; iii) cebadores degenerados para amplificar la mezcla de ADNc con múltiples fragmentos solapantes como productos finales. El cierre de los huecos se realizó mediante PCR de larga distancia con Taq de alta fidelidad (sistema Expand High Fidelity, Roche) utilizando cebadores diseñados en fragmentos seleccionados. Se recogió la secuencia mediante secuenciación por paseo utilizando una química de terminador BigDye (Applied Biosystems) y un secuenciador de ADN automatizado (secuenciador capilar modelo 3700, Applied Biosystems). Después de obtener un primer paso de todo el genoma, se utilizó un conjunto de cebadores directos e inversos para amplificar y secuenciar el genoma de novo utilizando como molde segmentos de ADN de 2 kb como promedio. Las lecturas de los fragmentos solapantes se ensamblaron automáticamente mediante AutoAssembler (Applied Biosystems) y el cóntigo de 29.740 pb se editó manualmente.

El análisis informático de la secuencia se realizó de la siguiente manera. Se utilizó el paquete informático GCG Wisconsin Package (versión 10.0) para el análisis informático de las secuencias de genes y proteínas. Se utilizó el programa PSORT (http://psort.nibb.ac.jp/) para las predicciones de localización. Para el análisis de la estructura secundaria, se aplicó el software PHD disponible en la web en http://cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/. Se utilizó el algoritmo PSI-BLAST para las búsquedas de homología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) utilizando la base de datos de proteínas no redundantes. Se aplicó ClustalW para obtener alineamientos de secuencias múltiples de las secuencias de genes y proteínas. Se utilizó el programa LearnCoil-VMF para predecir las regiones con superenrollamiento en las proteínas espiculares (http://learncoilvmf.lcs.mit.edu/cgi-bin/vmf). Las cremalleras de leucina se predijeron con el programa 2ZIP, disponible en http://2Zip.molgen.mpg.de.

Se realizó el análisis filogenético utilizando el algoritmo de neighbor-joining como se aplica en el programa NEIGHBOR dentro del paquete Phylogeny Inference Package (Phylip) (Felsenstein J 1993, programa distribuido por el autor). El análisis bootstrap se realizó siempre con 100 repeticiones utilizando el programa Seqboot. Los árboles se gestionaron y presentaron utilizando TreeView. Se utilizó el programa HMMER para generar perfiles de secuencias de alineamientos de secuencias múltiples de los dominios S1 de las proteínas espiculares. Posteriormente, se utilizó el programa HMMPFAM para comparar el dominio S1 de la proteína espicular de SARS con los perfiles.

El genoma de este aislado del virus del SARS tiene 29.740 bases de longitud y la estructura global del genoma es similar a la de los tres grupos conocidos de coronavirus. Partiendo del extremo 5’ pueden identificarse una secuencia líder, una región no traducida (UTR) y dos marcos de lectura abiertos solapantes que codifican una poliproteína que contiene las enzimas necesarias para la replicación. Van seguidos de una región que codifica las proteínas estructurales espicular (S), de la envoltura (E), de la matriz (M), de la nucleocápside (N) y ocho ORF adicionales específicos para el virus del SARS. En el extremo 3’ del genoma se encuentra una UTR con un poli(A). La homología global con los grupos de coronavirus 1, 2 y 3 es baja y por lo tanto el virus del SARS pertenece a un nuevo grupo (grupo 4) de coronavirus. Un análisis más detallado de la secuencia de aminoácidos de la proteína espicular muestra que el aislado del virus del SARS está más estrechamente relacionado con el coronavirus del grupo 2.

La secuencia completa del genoma del aislado del virus del SARS tiene 29.740 pb de longitud. La secuencia está disponible en el GenBank y tiene un contenido de GC del 40,8%, comparable con el de los virus conocidos de la misma familia. La estructura del genoma es similar a la de otros coronavirus. Se han pronosticado 14 marcos de lectura abiertos. Las principales características del genoma y de los productos génicos se ilustran y presentan en la Figura 10 y en la Tabla 10. La comparación entre el genoma del SARS y los coronavirus del grupo 1, 2 y 3 se presenta en la Figura 11.

Los nucleótidos 1-73 contienen una secuencia líder de ARN predicha seguida de una región no traducida (UTR) de 197 nucleótidos. La UTR va seguida de dos marcos de lectura abiertos solapantes (ORF1a, ORF1b), que abarcan dos tercios del genoma (nucleótidos 265-21485). Codifican una gran poliproteína, que se predice es procesada por las proteasas virales para generar el complejo replicasa. La parte 3’ del genoma contiene los genes que codifican las cuatro proteínas estructurales (S, proteína espicular, E, proteína de la envoltura, M, glicoproteína de la matriz, y N, proteína de la nucleocápside), y ocho ORF predichos de función desconocida (Figura 10). Finalmente, en el extremo 3’ del genoma, se encontró una segunda UTR de 340 bases, seguida de un tramo de poli(A). Se identificó una supuesta secuencia intergénica (IG), también conocida como secuencia asociada a la transcripción (TAS), que es una característica típica de los coronavirus. La secuencia IG se caracteriza por 6-18 nucleótidos presentes en el extremo 3’ del líder y puede encontrarse delante de cada gen. La secuencia IG desempeña un papel clave en la transcripción del ARN y su regulación. La secuencia IG del virus del SARS está presente en nueve ocasiones en el genoma (Figura 10). Las secuencias de la líder y de la IG son peculiares para cada coronavirus y representan una firma específica para el virus.

La región estructural

El análisis de la secuencia de nucleótidos en la parte 3’ del genoma del SARS identificó 12 marcos de lectura abiertos predichos. Están codificados en 8,2 kb y comprenden las cuatro proteínas estructurales S, E, M y N, comunes para todos los coronavirus y ocho ORF predichos, que son específicos para este virus (Figura 11). Las secuencias IG específicas de SARS cadena arriba de la mayoría de los ORF (Figuras 10 y 11) sugieren que es probable que la mayoría de los genes se transcriban de manera independiente. Curiosamente, las secuencias idénticas a las IG del grupo 2 también están presentes en el extremo de la líder del ARN y delante del gen que codifica la proteína de la matriz y de ORF 10.

La proteína espicular es una glicoproteína de tipo I, que forma las grandes espículas en la superficie del virión y es responsable de la unión al receptor y de la fusión de membranas. (Gallagher (2001) Adv Exp Med Biol

494: 183-92). La proteína tiene 1.255 residuos de longitud con 17 sitios de N-glicosilación predichos. Tiene un péptido líder de 13 aa y una secuencia de anclaje a la membrana C-terminal de 17 aa (1202-1218).

Algunas (MHV, HCoV-OC43, AIBV y BCoV), pero no todas (TGV, FIPV, HCoV-229E) las proteínas espiculares de coronavirus se escinden de manera proteolítica en dos subunidades, S1 y S2. Se supone que S1 forma la cabeza bulbosa, que permanece unida de manera no covalente al anclaje de membrana C-terminal. La escisión está mediada por una secuencia de aminoácidos básicos, que se asemeja a la secuencia consenso para un sitio de escisión de furina. (Garten et al., Biochimie 1994; 76(3-4): 217-225). Sin embargo, en el caso de este aislado del virus del SARS, no fue posible identificar una secuencia de este tipo, lo que implica que es poco probable que la proteína S de este aislado del virus del SARS se escinda durante la maduración. Las predicciones de la estructura secundaria indican que la arquitectura global de la proteína espicular está conservada dentro de todos los coronavirus conocidos. El dominio S1 está formado principalmente por láminas beta y es probable que adopte un plegamiento globular, mientras que en el dominio S2 se predicen amplias regiones alfa helicoidales. Además, el programa LearnCoil-VMF, diseñado específicamente para identificar regiones de tipo con superenrollamiento en las proteínas de fusión de membranas virales, predice dos superenrollamientos dentro de S2, que abarcan los aminoácidos 900-1005 y 1151-1185, respectivamente (Figura 12). Ambas regiones con superenrollamiento contienen un motivo con cremallera de leucina, que también está presente en las proteínas espiculares de todos los coronavirus. Se sabe que las cremalleras de leucina promueven la oligomerización de proteínas; puesto que las proteínas espiculares de TGV y MHV forman heterotrímeros (Delmas et al., J Virol 1990; 64(11): 5367-5375) (Godeke, et al., J Virology 2000; 74(3): 1566-1571) es concebible que en el SARS las cremalleras de leucina desempeñen un papel en la promoción y/o estabilización de una estructura cuaternaria similar. La proteína espicular desempeña un papel importante en la biología de los coronavirus porque el dominio S1 contiene el dominio de unión al receptor y los epítopos neutralizantes del virus, mientras que el dominio S2 está implicado en el proceso de fusión de membranas, que es esencial para la infectividad del virus. Como era de esperar, alineamientos de secuencias múltiples de diferentes proteínas espiculares mostraron un importante grado de variabilidad dentro del dominio S1, mientras que S2 está más conservado.

La proteína de la envoltura E es un polipéptido muy corto de 76 aa, implicado en la morfogénesis de la envoltura del virión. (Godet et al., Virology 1992; 188(2): 666-675). El análisis informático predice un dominio transmembrana largo cerca del extremo N-terminal y dos sitios de N-glicosilación. El nivel de similitud de aminoácidos con otros coronavirus es muy bajo y la mejor homología es con la pequeña proteína de la envoltura del virus de la gastroenteritis transmisible (TGV).

La glicoproteína de la matriz (M) es un polipéptido de 221 residuos con un peso molecular predicho de 25 kDa. El análisis informático predice una topología que consiste en un ectodominio aminoterminal corto, tres segmentos transmembrana y un extremo carboxilo terminal situado en el lado interior de la envoltura viral. Análogamente a la glicoproteína de la matriz del TGV, la del virus de la bronquitis infecciosa aviar (AIBV) y la de la cepa MHV-2 hipervirulenta, la glicoproteína M de SARS está N-glicosilada en el extremo N-terminal. La proteína M de SARS muestra mayor similitud con los virus del grupo 2 (Tabla 11).

Por último, la proteína de la nucleocápside N es una fosfoproteína de 397 residuos de longitud que interactúa con el ARN genómico viral para formar la nucleocápside. El nivel de conservación con respecto a otros coronavirus es bajo, variando del 26,9% de identidad con respecto al HCoV-229E al 37,4% de identidad con respecto al coronavirus bovino (BCoV) (Tabla 11). Se ha llevado a cabo el análisis de epítopos de la proteína de la nucleocápside (Li et al. (2003) Geno Prot & Bioinfo 1: 198-206) en el que se situó el sitio del epítopo en el extremo C-terminal de la proteína.

Además de las proteínas fundamentales anteriormente indicadas, muchos virus expresan un conjunto de otros péptidos, que generalmente son prescindibles para la viabilidad, pero que pueden influir en el potencial de infectividad del virus. (de Haan et al., Virology 2002; 296(1): 177-189). Estas proteínas están conservadas generalmente dentro de los miembros del mismo serogrupo, pero difieren profundamente entre los grupos. Por esta razón, se denominan generalmente proteínas específicas de grupo. Los miembros del grupo 1, representado en el presente documento por HCoV-229E, tienen dos genes específicos de grupo situados entre los genes S y E y a veces uno o dos ORF cadena abajo del gen N, precediendo a la región UTR 3’ del genoma. Los virus del grupo 2, siendo MHV el prototipo, tienen dos genes específicos de grupo (2a y HE) entre ORFlb y S, así como otros dos entre los genes S y E. Por último, los virus del grupo 3, representados por el prototipo AIBV, tienen dos genes específicos de grupo entre S y E, y otros dos entre los genes M y N.

A excepción de la hemaglutinina esterasa HE, para la que se han demostrado las actividades hemaglutinante y enzimática acetil esterasa, todos los demás ORF específicos de grupo codifican proteínas cuya función aún no ha sido establecida.

Curiosamente, la disposición de los genes específicos en el genoma del SARS es peculiar y los ORF predichos no presentan una homología significativa con los ORF presentes en los demás coronavirus, ni con ninguna otra proteína conocida de diferentes organismos. Al igual que los virus del grupo 1 y 3, el SARS carece de la hemaglutinina HE y no contiene ningún ORF entre el ORFlb y el gen S. Además, dos ORF predichos (ORF3 y ORF4) están codificados en la región entre S y E, y están superpuestos en la mayor parte de su longitud. ORF3 tiene una secuencia IG de 2 pb cadena arriba del codón de inicio ATG. A diferencia de los demás grupos, SARS contiene cinco ORF predichos en la región entre los genes M y N. ORF7 se encuentra 10 bases cadena abajo del

codón de terminación del gen M, y tiene una secuencia IG 155 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio ATG. Del mismo modo, ORF8 y ORF10 presentan una IG inmediatamente cadena arriba de sus codones de inicio ATG. Por otro lado, los extremos 5’ de ORF9 y ORF11 apenas se superponen con los genes flanqueantes, y por esta razón no necesitan una IG para activar la transcripción. ORF12 se superpone totalmente con el gen N y comparte una homología muy baja con una proteína de 22 kDa del virus MHV, codificada en la región correspondiente.

A pesar de la ausencia de indicios de una posible localización y función que se deriva de la similitud de secuencias, ORF3, ORF7 y ORF8 contienen segmentos hidrófobos, lo que sugiere la asociación con estructuras de membrana. Además, ORF3, el más largo entre el gen específico de SARS, es el único que codifica un péptido que contiene un gran número de sitios de O-glicosilación predichos (Tabla 11). Se han identificado sitios de N-glicosilación predichos en ORF3, ORF11 y ORF12.

Hay dos ORF más cortos en las regiones no estructurales.

Análisis filogenético

En el pasado, se ha utilizado la frecuencia de sustitución en 922 bases conservadas del gen pol de once coronavirus de los tres diferentes serogrupos para demostrar que la variabilidad dentro de los miembros de cada serogrupo es mucho menor que entre miembros de diferentes serogrupos, confirmando los agrupamientos serológicos descritos anteriormente. (Stephensen et al., Virus Res 1999; 60(2): 181-9). Se utilizó la región de 922 pb del gen pol de SARS y se alineó con el mismo fragmento de otros 12 coronavirus. El árbol obtenido mostró que el virus del SARS es distinto de los otros tres grupos de coronavirus (Figura 13). Se obtuvieron resultados similares utilizando las secuencias de aminoácidos de longitud completa de pol, 3CL proteasa y helicasa de la región de la replicasa y las de la proteína espicular y las glicoproteínas de la matriz de la región estructural (datos no mostrados). Estos datos confirmaron que todo el genoma del virus del SARS se agrupa en un nuevo grupo (grupo 4) de coronavirus.

Para obtener más resolución de posibles relaciones evolutivas se realizó el análisis utilizando secuencias consenso de los dominios predichos de las proteínas. En particular, se generaron secuencias consenso del dominio S1 de la proteína espicular del grupo 1 y del grupo 2 y a continuación se compararon con el dominio S1 de la proteína espicular de SARS. No pudo generarse ninguna consenso a partir del grupo 3, ya que sólo se conoce la proteína espicular de AIBV. Curiosamente, el árbol construido a partir del alineamiento de S1 de SARS con la consenso generada a partir de los dos grupos de proteínas espiculares era diferente de la de la Figura 13, y mostró una relación mucho más estrecha entre SARS y los coronavirus del grupo 2 (Figura 14A). Un análisis posterior mostró que 19 de las 20 cisteínas presentes en el dominio S1 de SARS están conservadas espacialmente con la secuencia consenso del grupo 2, mientras que sólo cinco se mantienen dentro de las secuencias del grupo 1 y del grupo 3 (Figura 14B). Dado el papel fundamental que desempeñan las cisteínas en el plegamiento de las proteínas, es probable que el dominio S1 del SARS y los coronavirus del grupo 2 compartan una organización espacial similar.

Variabilidad de secuencias entre los coronavirus del SARS

Se comparó la secuencia de FRA con los cuatro genomas completos de SARS disponibles en la web. Se detectaron un total de 30 mutaciones. Nueve de estas mutaciones eran silenciosas mientras que 21 dieron como resultado sustituciones de aminoácidos (Tabla 12). Dentro de ORF1a, se detectaron tres mutaciones silenciosas y siete productivas. En ORF1b, había cinco mutaciones silenciosas y tres productivas. Una de las mutaciones productivas era originada por dos sustituciones de nucleótidos que daban como resultado un único cambio de aminoácido. Se localizaron cinco cambios en la proteína espicular, cuatro de ellos eran productivos y uno silencioso. Dos mutaciones productivas estaban en ORF3 y en la glicoproteína de la matriz M. Había una mutación productiva en ORF10 y en la proteína de la nucleocápside N.

La diferencia global entre FRA y TOR2 era de nueve nucleótidos que daba como resultado dos mutaciones silenciosas y siete cambios de aminoácidos. La diferencia entre FRA y Urbani es de 12 nucleótidos, que da como resultado cinco mutaciones silenciosas y siete cambios de aminoácidos. Para CUHK, 16 nucleótidos eran diferentes, cinco de los cuales eran mutaciones silenciosas. Para FRA y HKU, 14 cambios de nucleótidos dieron como resultado cuatro mutaciones silenciosas y nueve productivas.

EJEMPLO 2 -Inmunización de ratones con virus del SARS inactivado (a modo de referencia)

Se inmunizó a los ratones por vía subcutánea los días 0, 14 y 28 con 5 µg de partículas de SARS-CoV inactivado con BPL (BPL-SARS-CoV), en solitario o junto con alumbre o MF59 como adyuvantes. Se recogió el suero los días 0 (preinmunización), 13 (después de la primera inmunización), 28 (después de la segunda) y 35 (1 semana después de la tercera inmunización). Se evaluaron los anticuerpos neutralizantes para bloquear la infección por SARS-CoV de células Vero in vitro. Después de 3 inmunizaciones, los títulos de neutralización se encontraban en el intervalo de 1:100-1:1.000, que son niveles similares a los presentes en el suero de pacientes convalecientes de SARS. Como se muestra en la siguiente tabla, la vacuna sin adyuvante inducía el anticuerpo neutralizante después de la tercera inmunización, y la potencia de esta vacuna se potenciaba significativamente al incluir los

adyuvantes, apareciendo los anticuerpos neutralizantes después de la segunda inmunización y aumentando los títulos globales después de la tercera inmunización:

Inmunógeno

Título de neutralización

pre

post 1ª post 2ª post 3ª

BPL-SARS-CoV+MF59 (5 µg)

< 1:20 < 1:20 1:158 1:630

BPL-SARS-CoV+alumbre (5 µg)

< 1:20 < 1:20 1:67 1:612

BPL-SARS-CoV (5 µg)

< 1:20 < 1:20 < 1:20 1:71

PBS

< 1:20 < 1:20 < 1:20 < 1:20

EJEMPLO 3 -Inmunización de ratones Balb/c con virus del SARS inactivado (a modo de referencia)

Se ha desarrollado un modelo de ratón Balb/c para la infección por SARS (Subbarao et al. (2004), J. Virol,

78: 3572-77). En este modelo, se inocularon por vía intranasal a ratones Balb/c 104 DICT50 de virus. 48 horas después de la inoculación, pudo detectarse un aumento de 2 log en el título de virus DICT50 en los pulmones de los ratones infectados. Aunque la replicación del virus se detecta fácilmente, los ratones no presentan síntomas de la enfermedad del SARS y eliminan espontáneamente el virus una semana después de la inoculación. Una disminución del título de virus en los animales previamente inmunizados en comparación con los animales de control demuestra un efecto protector de la vacuna en evaluación.

En este ejemplo, se inmuniza a cuatro ratones Balb/c por grupo tres veces con 5 µg de SARS-CoV inactivado con BPL (días 0,14, 28), en solitario o en combinación con MF59 y se provocan con 104 DICT50 de SARS-CoV el día 43. Dos días después de la provocación con el virus, se sacrifica a los ratones y se cuantifica el SARS-CoV a partir de los cornetes nasales (NT) y los pulmones y se mide el título de virus medio para cada ratón. Los grupos de control recibieron PBS en solitario, o una vacuna antigripal (FLU) con o sin adyuvante MF59. Los datos fueron los siguientes (véase también la Figura 43), donde se ensayaron cuatro ratones por grupo y los títulos de virus se expresan como log10 DICT50 por gramo de tejido:

Inmunógeno

Replicación del virus en los pulmones de ratones provocados Replicación del virus en los cornetes nasales de ratones provocados

# infectados/ # ensayados

Título de virus medio (± EE) # infectados/ # ensayados Título de virus medio (± EE)

PBS

4/4 6,3 ± 0,3 3/4 2,8 ± 0,35

MF-59 en solitario

4/4 6,1 ± 0,13 3/4 3,0 ± 0,38

Vacuna FLU (5 µg)

4/4 6,3 ± 0,07 3/4 2,9 ± 0,36

Vacuna FLU (5 µg) + MF-59

4/4 6,0 ± 0,19 4/4 3,0 ± 0,11

BPL-SARS-CoV (5 µg)

¼ 1,6 ± 0,13 * 0/4 No detectado **

BPL-SARS-CoV (5 µg) + MF-59

0/4 No detectado * 0/4 No detectado **

La prueba de la t de Student bilateral, en comparación con los ratones inmunizados con PBS, mostró: * P <0,00001 o ** P = 0,025

Como se muestra, el virus no pudo detectarse en los ratones inmunizados con BPL-SARS-CoV. El límite inferior de detección de virus infeccioso en una suspensión al 10% p/v de homogeneizado de pulmón fue 1,5 log10 DICT50/g, y en una suspensión al 5% p/v de cornetes nasales el límite fue 1,8 log10 DICT50/g. Los títulos virales en los mamíferos inmunizados se encontraban por lo tanto por debajo de estos valores umbral.

Por lo tanto, la vacuna de SARS-CoV inactivado fue muy eficaz en la prevención de la infección por el virus, ya que sólo uno de los ocho ratones inmunizados con la vacuna, con o sin adyuvante MF59, estaba infectado. No se observó una protección similar en los grupos de control de diluyente PBS, adyuvante MF59 o vacuna antigripal con o sin adyuvante.

Se evaluaron los títulos de neutralización de los sueros de los animales del estudio de provocación dos semanas después de la primera inmunización, una semana después de la segunda inmunización y una semana después de la tercera inmunización. Los ratones inmunizados con la vacuna con adyuvante MF59 ya habían desarrollado un título de neutralización de 1:71 después de la segunda inmunización, que aumentó a 1:588 después de la tercera inmunización, mientras que los ratones que recibieron la vacuna sin adyuvante no tenían actividad de neutralización después de la segunda inmunización y un título de neutralización de 1:64 después de la tercera inmunización. Los sueros de los ratones en cada uno de los grupos de control no presentaron actividad de neutralización. Estos datos demuestran claramente no sólo la capacidad de la vacuna de SARS-CoV inactivado para inducir niveles protectores de anticuerpos neutralizantes contra SARS, sino también un efecto beneficioso de la formulación de la vacuna con adyuvante para títulos de neutralización elevados.

EJEMPLO 4 -Preparación de OMV que comprenden antígenos virales de SARS (a modo de referencia)

Se transfectó E. coli con un plásmido de interés (que codifica un antígeno viral de SARS). Las colonias individuales que albergaban el plásmido de interés se cultivaron durante toda la noche a 37°C en 20 ml de cultivo líquido de LB/Amp (100 µg/ml). Las bacterias se diluyeron 1:30 en 1,0 litro de medio de nueva aportación y se cultivaron a 30°C o 37°C hasta que la DO550 alcanzó 0,6-0,8. Se indujo la expresión de proteína recombinante con IPTG a una concentración final de 1,0 mM. Después de incubación durante 3 horas, se recogieron las bacterias por centrifugación a 8.000 x g durante 15 minutos a 4°C y se resuspendieron en 20 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) e inhibidores de proteasa completos (Boehringer-Mannheim™). Todos los procedimientos posteriores se realizaron a 4°C o en hielo.

Las células se rompieron por sonicación utilizando un Branson Sonifier 450 y se centrifugaron a 5.000 x g durante 20 minutos para sedimentar las células sin romper y los cuerpos de inclusión. El sobrenadante, que contenía las membranas y los residuos celulares, se centrifugó a 50.000 g (Beckman Ti50, 29.000 rpm) durante 75 minutos, se lavó con Bis-Tris propano 20 mM (pH 6,5), NaCl 1,0 M, glicerol al 10% (v/v) y se sedimentó de nuevo a 50.000 g durante 75 minutos. Se resuspendió el sedimento en Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), Sarkosyl al 2,0% (v/v), inhibidor de proteasa completo (EDTA 1,0 mM, concentración final) y se incubó durante 20 minutos para disolver la membrana interna. Se sedimentaron los residuos celulares por centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos y se centrifugó el sobrenadante a 75.000 g durante 75 minutos (Beckman Ti50, 33.000 rpm). Se lavaron las vesículas de membrana externa con Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) y se centrifugaron a 75.000 x g durante 75 minutos o durante toda la noche. Por último, se resuspendieron las OMV en 500 µl de Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), glicerol al 10% v/v. Se calculó la concentración de proteína mediante un ensayo de Bradford convencional (Bio-Rad), mientras que la concentración de proteína de la fracción de membrana interna se determinó con el ensayo de proteínas DC (Bio-Rad). Se analizaron diversas fracciones del procedimiento de aislamiento mediante SDS-PAGE.

EJEMPLO 5 –Inmunogenicidad, programa de dosificación y vía de administración para la proteína espicular recombinante en ratones

Puede evaluarse la inmunogenicidad, la vía y la dosificación de las proteínas espiculares recombinantes de la invención en ratones mediante el siguiente protocolo detallado. Preferentemente, el antígeno administrado provocará títulos de anticuerpos neutralizantes al menos en el intervalo de 1/100-1/1.000. Pueden ensayarse dosis crecientes de antígeno en el intervalo de 5 µg a 20 µg del antígeno proteína espicular recombinante en solitario o mezclado con un volumen igual de MF59-citrato, administrado SC o IM a ratones anestesiados en 100 µl de inóculo. Los grupos de ratones Balb/c, 6 por tratamiento, se sensibilizan el día 0 y se refuerzan el día 14 y 28.

Grupo

Tratamiento Dosis/vía Intervalo de muestreo Número de ratones

1-3

proteína espicular rec. 20, 10, 5 µg/SC 7, 21, 35, 42 d 6 por nivel de dosis

4-6

proteína espicular rec. 20, 10, 5 µg/SC 7 6 por nivel de dosis

7-9

proteína espicular rec. 20, 10, 5 µg/IM 7, 21, 35, 42 d 6 por nivel de dosis

10-12

proteína espicular rec. 20, 10, 5 µg/IM 7 6 por nivel de dosis

13-15

espicular rec. -MF59 20, 10, 5 µg/SC 7, 21, 35, 42 d 6 por nivel de dosis

16-18

espicular rec. -MF59 20, 10, 5 µg/SC 7 6 por nivel de dosis

19-21

espicular rec. -MF59 20, 10, 5 µg/IM 7, 21, 35, 42 d 6 por nivel de dosis

22-24

espicular rec. -MF59 20, 10, 5 µg/IM 7 6 por nivel de dosis

25

MF59 NA/SC 7, 21, 35, 42 d 6 + 6 (sac d 7 y 42)

27

MF59 NA/IM 7, 21, 35, 42 d 6 + 6 (sac d 7 y 42)

29

Solución salina NA/SC 7, 21, 35, 42 d 6 + 6 (sac d 7 y 42)

31

Solución salina NA/IM 7, 21, 35, 42 d 6 + 6 (sac d 7 y 42)

También puede utilizarse este protocolo para evaluar el perfil de Th1/Th2 de la respuesta inmunitaria específica inducida por la proteína espicular recombinante. Los títulos de anticuerpos neutralizantes y específicos contra proteína espicular se evaluarán los días 7, 21 y 35; el isotipo IgG2a frente a IgG1 de los anticuerpos específicos contra proteína espicular se determinará los días 21 y 35; la proliferación in vitro de células de los ganglios linfáticos y linfocitos T esplénicos contra la proteína espicular recombinante se determinará los días 7 y 42, respectivamente; la producción de IFN-γ e IL-4 por los linfocitos T esplénicos contra la proteína espicular recombinante de SARS-CoV se evaluará el día 42. Se recogerá sangre periférica los días 7, 21, 35; células de los ganglios linfáticos el día 7, y células esplénicas el día 42. Los títulos de anticuerpos neutralizantes y específicos contra proteína espicular y los isotipos se determinarán mediante inhibición de la infección por SARS-CoV de células Vero y mediante ELISA, respectivamente. La proliferación de células de los ganglios linfáticos y esplénicas se determinará mediante absorción de 3[H]-timidina. Las frecuencias de linfocitos T esplénicos productores de IFN-γ e IL-4, se determinarán mediante ELISPOT y FACS.

EJEMPLO 6 -Inmunogenicidad, programa de dosificación y vía de administración para las proteínas espiculares en conejos

Puede evaluarse la inmunogenicidad, la vía y la dosificación de las proteínas espiculares recombinantes de la invención en conejos mediante el siguiente protocolo detallado. Pueden ensayarse dosis crecientes en el intervalo de 5 µg a 40 µg del antígeno proteína espicular recombinante en solitario o mezclado con un volumen igual de MF59-citrato, administrado SC o IM a animales anestesiados en 200 µl de inóculo. Se inmunizará a grupos de conejos hembra albinos de raza New Zealand, 10 por tratamiento, como se muestra en la siguiente tabla. Se sensibilizará a los animales el día 0 y se les reforzará los días 14 y 28. Se recogerá sangre periférica los días 7, 21 y

35. Los títulos de anticuerpos neutralizantes y específicos contra proteína espicular se determinarán mediante inhibición de la infección por SARS-CoV de células Vero y mediante ELISA, respectivamente.

Grupo

Tratamiento Dosis/vía Intervalo de muestreo Número de conejos

1-4

proteína espicular de longitud completa 40, 20, 10, 5 µg/SC 7, 21, 35 d 10 por nivel de dosis

5-8

proteína espicular de longitud completa 40, 20, 10, 5 µg/IM 7, 21, 35 d 10 por nivel de dosis

9-12

proteína espicular truncada 40, 20, 10, 5 µg/SC 7, 21, 35 d 10 por nivel de dosis

13-16

proteína espicular truncada 40, 20, 10, 5 µg/IM 7, 21, 35 d 10 por nivel de dosis

17-20

proteína espicular de longitud completa -MF59 40, 20, 10, 5 µg/SC 7, 21, 35 d 10 por nivel de dosis

21-24

proteína espicular de longitud completa -MF59 40, 20, 10, 5 µg/IM 7, 21, 35 d 10 por nivel de dosis

25-28

proteína espicular truncada MF59 40, 20, 10, 5 µg/SC 7, 21, 35 d 10 por nivel de dosis

29-32

proteína espicular truncada MF59 40, 20, 10, 5 µg/IM 7, 21, 35 d 10 por nivel de dosis

33

MF59 NA/SC 7, 21, 35 d 10

34

MF59 NA/IM 7, 21, 35 d 10

35

solución salina NA/SC 7, 21, 35 d 10

36

solución salina NA/IM 7, 21, 35 d 10

EJEMPLO 7 -Inmunogenicidad y programa de dosificación de proteína espicular recombinante en hurones

Puede evaluarse la inmunogenicidad y la dosificación de las proteínas espiculares recombinantes de la invención en hurones mediante el siguiente protocolo detallado. Se inmunizará a tres grupos de hurones, 6 por tratamiento, con proteína espicular de SARS-CoV recombinante de líneas celulares CHO, en solitario o mezclada con un volumen igual de MF59-citrato, administrada SC a los animales anestesiados en 200 µl de inóculo. Se ensayará la vacuna contra la proteína espicular recombinante a la dosis que inducía los títulos más altos de anticuerpos neutralizantes en ratones el día 35 después del segundo refuerzo. Se sensibilizará a los animales el día 0 y se les reforzará el día 14 y 28. Se recogerá sangre periférica los días 7, 21 y 35. Se determinarán los títulos de anticuerpos neutralizantes y específicos contra proteína espicular mediante inhibición de la infección por SARS-CoV de células Vero y mediante ELISA, respectivamente.

Grupo

Tratamiento Dosis/vía Intervalo de muestreo Número de hurones

1 y 2

proteína espicular rec. Y µg o 2Y µg /SC 7, 21, 35 d 6

3 y 4

proteína espicular rec. + MF59 Y µg o 2Y µg /SC 7, 21, 35 d 6

5

Solución salina NA/SC 7, 21, 35 d 6

A continuación, puede utilizarse los 3 grupos de hurones, 6 animales por grupo, utilizados para los estudios de inmunogenicidad anteriormente indicados, para evaluar la eficacia protectora de la proteína espicular recombinante en la protección de los animales vacunados frente a la infección y/o la enfermedad. Se provocará a los animales anestesiados dos semanas después del último refuerzo por vía intratraqueal con 106 unidades de dosis infectiva de cultivo tisular (DICT50) de la cepa Utah DE SARS-CoV. Se evaluará la infección por SARS-CoV tomando frotis nasales, faríngeos y rectales de los animales durante 20 días después de la provocación como se ha descrito (12). Se evaluará la presencia de SARS-CoV en los materiales de muestra mediante RT-PCR y el ensayo de infección de células Vero. Se controlará a los animales para detectar signos clínicos de la enfermedad del SARS evaluando el tiempo de sueño, la temperatura, los síntomas respiratorios, la diarrea, el peso corporal y la supervivencia. Se determinará la protección por la magnitud y duración de la supresión viral y por la duración y gravedad de los síntomas de la enfermedad y los porcentajes de animales supervivientes.

EJEMPLO 8: Expresión de la proteína espicular para la vacunación

La glicoproteína espicular de SARS-CoV se expresó tanto en la forma de longitud completa como en la truncada, mediante los constructos nSh y nShΔTC pCMVIII descritos anteriormente, ambos con colas hexahistidina. Se evaluaron los constructos vectores para la expresión 48 horas después de la transfección en 293 células y células COS7. La proteína espicular de longitud completa (nSh) se detectó mediante transferencia de western sólo en el lisado celular, pero no en los medios de cultivo (Figura 44).

La mayor parte de la proteína espicular de longitud completa de SARS-CoV se expresó en células COS7 transfectadas transitoriamente como una glicoproteína de alto peso molecular que corrió a 540 kDa en geles no reductores (Figura 45). La gp540 es termolábil como se indica mediante la disociación completa en formas monoméricas (gp170 y gp180) por ebullición, pero era resistente al tratamiento con DTT. Estos datos sugieren que la proteína espicular recombinante se asocia de forma no covalente en un homotrímero (gp540). La presencia de proteína espicular en asociación homotrimérica también se confirmó en partículas purificadas e inactivadas de viriones del SARS-CoV. El análisis de las proteínas del virión mediante transferencia de western en las mismas condiciones utilizadas para la caracterización de la proteína espicular recombinante generó resultados esencialmente idénticos (Figura 46).

EJEMPLO 9: Procesamiento de la proteína espicular

Con el fin de caracterizar el procesamiento de la proteína espicular, se infectaron células BHK-21 con partículas de replicón de alfavirus que expresaban la proteína espicular de longitud completa de SARS-CoV. A las 6 horas después de la infección con una MOI de 5, las células infectadas se marcaron durante 1 hora con L-[35S]metionina/cisteína y se les hizo seguimiento durante un máximo de 4 horas. La proteína espicular marcada con [35S] se inmunoprecipitó mediante suero de conejo anti-SARS y se digirió con Endo-H. Se analizaron las proteínas digeridas y no digeridas mediante SDS-PAGE (poliacrilamida al 4%). Como se muestra en la Figura 47, la proteína espicular de longitud completa se sintetiza como una glicoproteína con alto contenido de manosa sensible a Endo-H (gp170, una forma del RE) que se somete a modificación hasta una glicoproteína resistente a Endo-H con oligosacáridos complejos (gp180, una forma del Golgi). La conversión de gp170 en la forma gp180 tiene lugar en 2 horas (Figura 48).

EJEMPLO 10: Selección de líneas celulares CHO para la expresión de la proteína espicular

Los métodos para la derivación de líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) que expresan de forma estable glicoproteínas de la envoltura viral conformacionalmente intactas, apropiadamente glicosiladas y que se unen de manera eficaz a anticuerpos neutralizantes están bien establecidos para el VIH y el VHC (Srivastava et al. (2002) J Virol. 76: 2835-47; Srivastava et al. (2003) J Virol 77: 11244-259; Heile et al. (2000) J Virol 74: 6885-92). Pueden aplicarse las mismas técnicas a SARS-CoV, para generar dos líneas celulares CHOK-1 estables diferentes que producen las proteínas espiculares de SARS de longitud completa o truncada. Las proteínas espiculares pueden expresarse utilizando los constructos descritos en el presente documento, pero sin las colas hexahistidina. Estas proteínas pueden compararse por su capacidad para producir anticuerpos neutralizantes en los animales inmunizados, así como por sus niveles de expresión en células CHOK-1.

Puede utilizarse un vector pCMV3 que expresa la proteína espicular para la derivación de líneas celulares CHOK-1 estables, que contiene el potenciador/promotor de CMV, resistencia a la ampicilina y un gen de resistencia a neomicina atenuado y unido a DHFR con fines de selección. Pueden producirse líneas celulares estables utilizando el sistema de selección con neomicina en las células CHOK-1. Los clones pueden secuenciarse para verificar la integridad del inserto, y pueden realizarse transfecciones transitorias utilizando reactivo de transfección con poliamina Trans-LT1 (PanVera Corp., Madison, WI) para evaluar el nivel de expresión y también la integridad de la proteína expresada mediante ELISA y análisis de transferencia de western.

Se seleccionarán células CHO iniciales para que estén libres de riesgos y contaminantes TSE/BSE según las normas reglamentarias pertinentes. Para construir las líneas celulares, los procedimientos implican la transfección, el cribado primario con medio selectivo, seguido de subclonación para asegurar la pureza de las líneas celulares. Los sobrenadantes celulares pueden ensayarse utilizando un ELISA de captura de antígeno para cuantificar los niveles de expresión en todas las fases de selección y amplificación. Para la expresión de la proteína espicular de longitud completa, pueden cribarse células fijadas en metanol para la expresión interna mediante tinción de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo de conejo anti-SARS. Pueden emplearse mediciones sucesivas en la fase de expansión en matraz T75 para asegurar la estabilidad de los niveles de expresión. La masa molecular y la integridad de las proteínas expresadas pueden comprobarse mediante PAGE en condiciones naturales y reductoras y de desnaturalización, seguido de inmunohibridación.

Los vectores pCMV3 que expresan proteínas espiculares de SARS-CoV en las formas de longitud completa

o truncada pueden introducirse en las células CHOK-1 utilizando el reactivo Trans-LT-1 y medios no selectivos. 24-48 horas después de la transfección, dependiendo de la densidad celular, las células se dividen en una relación

1:5 y el medio puede cambiarse a un medio selectivo que contenga neomicina a 500 µg/ml. Cualquier suero bovino utilizado en estos procedimientos será de fuentes libres de TSE que cumplan las normas reglamentarias. Diez a catorce días más tarde, pueden recogerse las colonias individuales y transferirse a placas de 96 pocillos y cultivarse

en medio no selectivo completo. Cuando aproximadamente el 80% de los pocillos alcancen la confluencia, pueden cribarse los sobrenadantes de 24 horas mediante ELISA de captura de la proteína espicular. Para la expresión inicial de proteína espicular de longitud completa, las células pueden fijarse con metanol y cribarse mediante tinción de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo de conejo anti-SARS. Después de haber eliminado las líneas celulares con baja expresión y haya menos de 20-30 líneas celulares, a continuación pueden utilizarse ELISA de captura y transferencias de western para determinar el nivel de expresión después de la lisis celular. Puede sedimentarse una porción de cada línea celular, pesarse y lisarse en tampón de lisis Triton al 1% para determinar los niveles de expresión. Pueden expandirse de tres a cuatro clones que produzcan los niveles más altos de la proteína espicular en la estructura y conformación correctas, a biorreactores de tres litros y adaptarse a condiciones de cultivo en suspensión con baja concentración de suero para la producción a mayor escala.

El ensayo ELISA de captura de antígeno para la proteína espicular de SARS puede realizarse utilizando placas de 96 pocillos de fondo plano recubiertas con 250 ng por pocillo de inmunoglobulina purificada obtenida a partir de suero de conejos inmunizados con el virus del SARS inactivado. Se añaden y se incuban durante 2 horas a 37°C muestras de lisado o sobrenadante. Se hace reaccionar el antígeno unido contra suero SARS+ve combinado o anticuerpo monoclonal de alta afinidad humano o de ratón contra la proteína espicular de SARS y se detecta utilizando un segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa específico de especie apropiado. Las placas se desarrollan utilizando sustrato TMB (Pierce, Rockford, IL), se leen a una longitud de onda de 450 nm, y la concentración de proteína por ml de muestra se obtiene a partir de una curva patrón (DO frente a concentración de proteína) en base a diluciones en serie de una concentración conocida de proteína espicular recombinante.

El análisis de inmunohibridación se realizará también siguiendo los métodos convencionales descritos por Srivastava et al. (2002) supra. En resumen, se analizan 10 µl-20 µl de la muestra en SDS PAGE al 4%-20% en condiciones no reductoras/de desnaturalización con calentamiento suave. A continuación, se transfieren las proteínas a membranas de nitrocelulosa y se hacen reaccionar contra suero policlonal de conejo anti-proteína espicular, seguido de anti-Ig de conejo conjugado con Alexa 688 (Molecular Probes, Oregón). Las membranas de transferencia se escanean utilizando un sistema de formación de imágenes por infrarrojos.

Las líneas celulares candidatas con mayor expresión se cribarán para la estabilidad y la expresión de la proteína espicular en biorreactores de perfusión a pequeña escala (3 litros). Los clones candidatos se evaluarán adicionalmente para el nivel de expresión, así como la integridad de la proteína expresada, y, posteriormente, se ensayarán para la estabilidad de la expresión en ausencia de selección. Los clones seleccionados también se ensayarán para el mantenimiento de la integridad de la secuencia de ADN del gen de la proteína espicular de SARS integrado. Para controlar rápidamente los niveles de expresión en matraces pequeños y en los cultivos de evaluación de tres litros, se ha desarrollado un proceso basado en lectina (lectina de Gluvanthus nivalis) para aislar la proteína espicular de SARS hasta un grado de pureza que permite la semicuantificación y la caracterización de la proteína en sobrenadante CHO. Se obtendrá proteína espicular de longitud completa a partir de células extraídas con detergente Triton X-100 y a continuación capturadas en lectina GNA, seguido de cromatografía de hidroxiapatita y SP. A continuación, se caracteriza la proteína eluída mediante: (1) electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y tinción con Coomassie, (2) inmunohibridación con sueros de conejo anti-SARS, (3) caracterización estructural utilizando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), así como análisis de espectrometría de masas mediante MALDI-TOF.

La productividad de la línea celular CHO que expresa la proteína espicular de SARS debe ser de al menos 2 mg/l y para la proteína espicular de longitud completa será de 3 mg/100 g de células, a una densidad celular en estado estacionario. El rendimiento de un biorreactor de 2,5 litros, el día 45, será ~1.000 mg de proteína bruta.

EJEMPLO 11: Purificación de la proteína espicular para vacunas para seres humanos

Para purificar la proteína espicular de SARS con el fin de producir material de calidad GMP para su uso en seres humanos, se utiliza el siguiente proceso básico, realizándose todas las etapas a 2°C-8°C: el material de partida, sobrenadante de cultivo de células CHO concentrado (20-30X) se descongela y se filtra a través de una membrana de 0,45 µm; este material está muy contaminado con proteínas del cultivo, así como ADN; la primera etapa de purificación es la cromatografía de afinidad mediante Gluvanthus nivalis (GNA), una lectina que reconoce preferentemente los carbohidratos que contienen manosa terminal; las proteínas glicosiladas, incluida la proteína espicular de SARS, quedan capturadas y las proteínas no glicosiladas, así como el ADN, no se unen a esta columna; la columna de GNA va seguida de dos etapas de cromatografía operadas en el modo de flujo que atraviesa la columna; el intercambiador de aniones, DEAE, e hidroxiapatita cerámica (cHAP); DEAE une algunas proteínas del sobrenadante contaminantes y el ADN, mientras que cHAP une cualquier proteína sérica contaminante; la proteína espicular de longitud completa se purifica a partir del sedimento celular; las células se lisan con Triton X-100 y a continuación la proteína espicular de longitud completa se captura en lectina GNA, seguido de cromatografía de hidroxiapatita y SP.

La proteína espicular de SARS purificada puede tratarse adicionalmente para eliminar los virus adventicios: inactivación viral a pH 3,5 durante 1 hora; a continuación, se concentra la muestra y se somete a diafiltración en un

tampón a pH 4 y, por último, se captura la proteína purificada mediante resina SP; la proteína espicular se une a esta resina y muchos virus pasan.

La proteína espicular se eluye, se concentra y se somete a diafiltración en tampón de formulación. A continuación, este producto formulado a granel se filtra a través de una membrana de eliminación de virus DV50 seguido de filtración a través de una membrana de 0,2 µm. El material a granel formulado se introduce en recipientes adecuados, por ejemplo, en viales de 3,0 ml, en una campana de flujo laminar de clase 100.

Los análisis durante el proceso en cada etapa de la purificación incluyen la concentración de proteínas, la endotoxina (LAL), la carga biológica y la recuperación.

Antes de la administración a seres humanos, un ensayo de potencia evaluará la capacidad específica de la vacuna en un ensayo in vitro o in vivo para lograr una respuesta determinada. La inmunogenicidad in vivo se determinará administrando a grupos de 10 ratones diferentes dosis de antígeno proteico. Se analizarán los sueros para la presencia de anticuerpos IgG utilizando un ELISA. El criterio de aprobación se basará en el número de animales tratados con la vacuna que son seropositivos en comparación con un patrón de referencia. Otros ensayos incluyen la seguridad general, la esterilidad, la pureza, la identidad de la vacuna (mediante un ELISA específico para la proteína espicular), y la cantidad y concentración de proteína (procedimiento de absorbancia espectrofotométrica UV en base a la absorbancia molar de los aminoácidos aromáticos).

El ensayo de estabilidad se realizará sobre la sustancia farmacéutica a granel y en el producto del recipiente final. El producto a granel se evaluará a temperaturas de -60°C (condiciones recomendadas de almacenamiento), 25 ±2°C y 40 ±2°C protegido de la luz, en los instantes de tiempo de 0, 3, 6, 9, 12 meses. El producto del recipiente final se ensayará a temperaturas de -60°C, y se invertirá a 5 ±3°C, 25 ±2°C y 40 ±2°C en los instantes de tiempo de 0, 3, 6, 9, 12 meses. Los ensayos que indican la estabilidad pueden incluir el aspecto, el pH, el contenido de proteínas, SDS-PAGE, HPLC de exclusión por tamaño, y la integridad del recipiente/cierre, realizado en muestras individuales de material a granel y viales por triplicado del material del recipiente final.

La proteína purificada de esta manera puede evaluarse en ratones, conejos y hurones como se describe en, y en base a los resultados de, los ejemplos 4, 5, 8 y 9 anteriores.

Se realizarán experimentos iniciales en ratones para determinar el programa y la dosis óptima de la proteína espicular GMP necesarios para inducir los niveles más altos de anticuerpos neutralizantes, con títulos al menos en el intervalo de 1/100-1/1.000. La proteína espicular se ensayará en el intervalo de 5 µg a 40 µg, en solitario o mezclada con un volumen igual de MF59-citrato, en ratones anestesiados, en 100 µl de inóculo. Se inmunizará a grupos de ratones Balb/c, 10 por tratamiento. Se sensibilizará a los animales el día 0 y se les reforzará los días 14 y 28. Los criterios de valoración secundarios serán comparar la cinética de neutralización frente a los títulos de anticuerpos específicos contra proteína espicular y evaluar el perfil de Th1/Th2 de la respuesta inmunitaria específica. Los títulos de anticuerpos neutralizantes y específicos contra proteína espicular se evaluarán los días 7, 21 y 35, y los meses 2, 3, 4, y 5 después de la sensibilización; los títulos de IgG2a e IgG1 de anticuerpos específicos contra proteína espicular se determinarán los días 21 y 35, y los meses 2, 3, 4 y 5 después de la sensibilización; la proliferación y la producción de IFN-γ e IL-4 por los linfocitos T esplénicos contra la proteína espicular recombinante de SARS-CoV se evaluarán el día 42 y al final del quinto mes. Se recogerá sangre periférica los días 7, 21 y 35, y los meses 2, 3, 4 y 5 después de la sensibilización; las células esplénicas el día 42 y al final del quinto mes. Los isotipos y títulos de anticuerpos neutralizantes y específicos contra proteína espicular se determinarán mediante inhibición de la infección por SARS-CoV de células Vero y mediante ELISA, respectivamente. La proliferación de células esplénicas se determinará mediante absorción de 3[H]-timidina. Las frecuencias de linfocitos T CD4+ esplénicos productores de IFN-γ e IL-4 se determinarán mediante análisis ELISPOT y FACS.

A continuación, se determinará en hurones el programa y la dosificación óptima de la vacuna contra la proteína espicular recombinante. En base a los resultados en ratones, se ensayará la vacuna contra la proteína espicular que inducía los títulos más altos de anticuerpos neutralizantes contra una dosis dos veces mayor de la proteína espicular recombinante proporcionada en la misma formulación. Se inmunizará SC a tres grupos de hurones, 6 por tratamiento, anestesiados, con 200 µl de inóculo. Se sensibilizará a los animales el día 0 y se les reforzará los días 14 y 28. Se recogerá sangre periférica los días 7, 21 y 35. Los títulos de anticuerpos neutralizantes y específicos contra proteína espicular se determinarán mediante inhibición de la infección por SARS-CoV de células Vero y mediante ELISA, respectivamente. De manera similar a los estudios anteriores con hurones, se utilizará cada grupo de animales para evaluar la eficacia de la vacuna en la protección de los animales inmunizados frente a la infección y/o la enfermedad.

La inmunogenicidad y eficacia de la vacuna candidata también se evaluarán en primates no humanos. Se inmunizará a tres grupos de macacos Cynomolgus adultos, 4 por tratamiento, con la proteína espicular de SARS-CoV recombinante, sola o mezclada con un volumen igual de MF59-citrato, administrada SC a los animales anestesiados, en 500 µl de inóculo. La vacuna contra la proteína espicular se ensayará a la dosis que inducía los títulos más altos de anticuerpos neutralizantes en hurones el día 35. Se sensibilizará a los animales el día 0 y se les reforzará las semanas 3 y 6. Se recogerá sangre periférica las semanas 1, 4 y 7. Un criterio de valoración

secundario será evaluar el perfil de Th1/Th2 de la respuesta inmunitaria específica, según lo descrito anteriormente (títulos de anticuerpos neutralizantes y específicos contra proteína espicular, frecuencias de linfocitos T CD4+ de sangre periférica productores de IFN-γ e IL-4 en respuesta a la proteína espicular recombinante, evaluados las semanas 1, 4 y 7).

Por último, se llevarán a cabo ensayos de seguridad/inmunogenicidad, con aumento escalonado de la dosis, controlados con placebo, en fase I en seres humanos, para la vacuna contra el SARS recombinante IM con adyuvante MF59. El ensayo evaluará la seguridad y las respuestas inmunitarias en adultos sanos después de la inmunización con dosis crecientes de la vacuna recombinante contra SARS con adyuvante MF59, administradas por vía intramuscular. Se administrarán tres/cuatro inmunizaciones los meses 0, 1, 6. El ensayo será con enmascaramiento y controlado con placebo. Los sujetos se asignaron al azar en cada nivel de dosis. Los parámetros de respuesta inmunitaria a medir incluyen anticuerpos neutralizantes séricos, anticuerpos ELISA y linfocitos T CD4+ productores de IFN-γ de sangre periférica mediante tinción de citocinas intracelulares:

Grupo

Vacuna Dosis de antígeno (µg) Programa de administración Nº de sujetos tratados Nº de sujetos con placebo (MF59) Intervalo de muestreo

A1

50 0,1,6 meses 18 6 0, 1, 2, 6, 7 meses

A2

100 0,1,6 meses 18 6 0, 1, 2, 6, 7 meses

EJEMPLO 12: Comparación de virus inactivado y proteína espicular purificada

Pueden compararse la inmunogenicidad y eficacia de la vacuna del virus inactivado y la proteína espicular purificada en primates no humanos. Se inmunizará a tres grupos de macacos Cynomolgus adultos, 4 por tratamiento, con la proteína espicular de SARS-CoV recombinante a partir de líneas celulares CHO o con BPL-SARS-COV, proporcionada a la dosis y formulación que inducían los títulos más altos de anticuerpos neutralizantes en los experimentos de provocación de inmunogenicidad anteriores, administrada SC a los animales anestesiados, en 500 µl de inóculo. Se sensibilizará a los animales el día 0 y se les reforzará las semanas 3 y 6. Se recogerá sangre periférica las semanas 1, 4, 7. Un criterio de valoración secundario será evaluar el perfil de Th1/Th2 de la respuesta inmunitaria específica, como se ha descrito anteriormente.

Grupo

Tratamiento Dosis/vía Intervalo de muestreo Nº de macacos

1

Proteína espicular rec.+ o -MF59 Y µg /SC 1, 4, 7 s 4

2

BPL-SARS-CoV + o -MF59 Y µg/SC 1, 4, 7 s 4

3

Solución salina NA/SC 1, 4, 7 s 4

EJEMPLO 13: Expresión en levaduras

La levadura es un sistema de expresión eucariota útil y barato. Las proteínas expresadas en levadura se utilizan en vacunas recombinantes contra el virus de la hepatitis B, y los antígenos recombinantes de SARS también pueden expresarse en levaduras con fines de preparación de vacunas. La expresión en levaduras también es conveniente para la producción de antígenos para preparar anticuerpos monoclonales y policlonales, o para su uso en ensayos serológicos.

Se clonaron la proteína de la nucleocápside (N) y dos versiones diferentes de la glicoproteína espicular (S) del coronavirus del SARS cepa FRA (AY310120) para su expresión en S. cerevisiae:

N de SARS: aa 1-422 (coordenadas 28120-29388 de cepa AY310120) Fig.57

Proteína espicular de SARS: aa 14 -1195 (dominio transmembrana y cola citoplasmática suprimidos) Fig.58

Proteína espicular de SARS: aa 14-662 (dominio S1)

Para crear el constructo S1, el punto de partida fue un fragmento XhoI-NotI de aproximadamente 3733 pb que codifica la glicoproteína espicular de longitud completa. Se utilizó PCR para amplificar el gen de longitud completa en dos trozos: XbaI-BlnI de 2440 pb y BlnI-SalI de 1306 pb. Estos fragmentos se subclonaron en vectores comerciales (Novagen): pT7Blue2 XbaI-BlnI (extremo 5’ de la glicoproteína espicular) y pT7Blue2 BlnI-SalI (extremo 3' de la glicoproteína espicular; Figura 50), respectivamente. Se utilizaron los siguientes cebadores en las reacciones de PCR posteriores: Spk-1 (5’) SEQ ID NO: 9785; Spk-2 (5’) SEQ ID NO: 9786; Spk-3 (5’) SEQ ID NO: 9787; Spk-4 (5’) SEQ ID NO: 9788.

Se transformaron células competentes de E. coli HB101 con el producto de ligación de PCR y se sembraron en placas de agar Luria, que contenían 100 µg/ml de ampicilina. Se identificaron los clones deseados mediante análisis de ADN “miniscreen”. Después de la verificación de secuencias y la amplificación del plásmido de los subclones deseados, era deseable eliminar el sitio SalI interno presente en la porción XbaI-BlnI de la secuencia de la proteína espicular con el fin de facilitar la futura clonación en el vector de expresión de levadura (BamHI-SalI). Por lo tanto, se preparó un vector CelII-MfeI a partir del subclón pT7Blue2 XbaI-BlnI (extremo 5’ de la proteína espicular)

para eliminar una secuencia de 143 pb que contenía el sitio SalI. A continuación se ligaron oligonucleótidos fosforliados por quinasa DS1-6 (SEQ ID NO: 9789-9794) en el vector CelII-MfeI para reemplazar los143 pb que se eliminaron para mutar el sitio SalI (sin cambios de aa), creando pT7Blue2.XbaIBlnIΔsal.

Los insertos de glicoproteína espicular XbaI-BlnI 5’ (de pT7Blue2.XbaI-BlnI ΔSal) y el BlnI-SalI 3' (de pT7Blue2 BlnI-SalI) se purificaron en gel y se ligaron en el vector p893-1 XbaI-SalI (un vector derivado de pLitmus 38 (New England Biolabs) con la secuencia líder del factor alfa clonado en los sitios BamHI-SalI del MCS). La secuencia codificante de la proteína espicular de SARS de longitud completa resultante se denominó p893-1.SARS Spike 1255#9 (Figura 50).

Se transformaron células competentes de E. coli HB101 con el producto de ligación de reemplazo oligo y se sembraron en placas de agar Luria, que contenía 100 µg/ml de ampicilina. Los clones deseados se identificaron mediante análisis de ADN “miniscreen”. Después de la verificación de secuencia de los clones positivos, se eligió pT7Blue2 Xba-Bln ΔSal para su uso como molde para las reacciones de PCR para amplificar el fragmento Xba-Sal de 1967 pb de S1 de la proteína espicular. A continuación, se subclonó el fragmento en el vector p893-1 XbaI-Sal, se verificó la secuencia y se le denominó p893-1.Spike S1 #11 (Figura 51).

Con el fin de clonarla en el vector de expresión de S. cerevisiae, pBS24.1, el extremo 5’ de la secuencia S1 tuvo que modificarse de XbaI a HindIII para permitir la ligación con el extremo HindIII 3' del fragmento de promotor ADH2/GAPDH BamHI-HindIII. A partir de pT7Blue2 Xba-BlnΔSal (descrito anteriormente) se purificó en gel un fragmento de 1943 pb AgeI-SalI. Este fragmento se ligó junto con un par sintético de oligonucleótidos fosforilados por quinasa de 30 pb HindIII-AgeI (S1-1+S1-2 creando el sitio HindIII 5' necesario) en el vector de subclonación comercial pSP72 HindIII-SalI (denominado pSP72.SARS Spike S1 #2; Figura 51). S1-1 tenía la SEQ ID NO: 9795 y S1-2 tenía la SEQ ID NO: 9796.

Después de la verificación de secuencias del clon positivo a partir del análisis de ADN “miniscreen”, el fragmento HindTII-SalI se purificó en gel. El fragmento de promotor BamHI-HindIII ADH2/GAPDH de 1365 pb se ligó junto con el fragmento HindIII-SalI S1 de 1973 pb en el vector pBS24.1 BamHI-SalI creando el plásmido de expresión obtenido por ingeniería genética pd.SARS Spike S1 #2 (Figura 52).

Se transformó una cepa de S. cerevisiae AD3 con pd.SARS Spike S1 #2 y se comprobaron los transformantes individuales para la expresión después del empobrecimiento de glucosa en el medio. La proteína recombinante se expresó a altos niveles en la levadura, tal como se detectó mediante tinción con azul de Coomassie. En particular, las células de levadura se transformaron con el plásmido de expresión de S1 de SARS mediante el kit S.c. EasyComp™ Transformation Kit de Invitrogen. La expresión en muestra en la Figura 49.

Para expresar la proteína Spike 1195, que no contiene la región transmembrana (TM) o cola citoplasmática que están presentes en el constructo de SARS de longitud completa, se realizó la siguiente serie de manipulaciones genéticas:

A partir de pT7Blue2 BlnI-SalI # 11 (descrito anteriormente) se purificó en gel un fragmento BlnI-DraI de 1056 pb. Este fragmento se ligó con un par sintético de oligonucleótidos fosforilados por quinasa DraI-SalI de 68 pb (DRS1+2; SEQ ID NO: 9797 y 9798) en un vector pT7Blue2 BlnI-SalI (Figura 53). Se transformaron células competentes de E. coli HB101 con el producto de ligación de reemplazo oligo y se sembraron en placas de agar Luria, que contenía 100 µg/ml de ampicilina. Los clones deseados se identificaron mediante análisis de ADN “miniscreen”. Después de la confirmación de secuencias, el clon se denominó pT7Blue2 BlnI-Sal Spike 1195 #7. El fragmento BlnI-SalI de 1126 pb que codificaba el extremo 3’ de Spike 1195 se purificó en gel (Fig. 53).

Con el fin de generar el fragmento XbaI-SalI Spike 1195, se aisló el fragmento XbaI-PciI de 3109 pb a partir de p893-1.SARS Spike 1255 #9 (descrito anteriormente) y un fragmento PciI-SalI de 457 pb de pT7Blue2.SARS Spike 1195 #7 (descrito anteriormente). Los dos fragmentos se clonaron en el vector p893-1 XbaI-SalI, creando el plásmido p893-1.SARS Spike 1195 #34 (Figura 54).

Para clonar Spike 1195 de SARS en el vector de expresión de Saccharomyces cerevisisae pBS24.1, fue necesario modificar el extremo 5’ de la Spike 1195 de SARS de XbaI a HindIII, como se hizo para el clon de expresión de S1 de la proteína espicular descrito anteriormente. Para empezar, se aisló el fragmento AgeI-BlnI de 2416 pb de p893-1.SARS Spike 1195 #34. Este fragmento se ligó con los oligonucleótidos de 30 pb HindIII-AgeI sintéticos (descritos anteriormente para generar la proteína S1 para la expresión en S. cerevisiae) en el vector pT7Blue2 HindIII-BlnI. Se transformaron células competentes de E. coli HB101 con el producto de ligación de reemplazo oligo y se sembraron en placas de agar Luria, que contenía 100 µg/ml de ampicilina. Los clones deseados se identificaron mediante análisis de ADN “miniscreen”. Después de la verificación de secuencias del clon positivo y la amplificación plasmídica de pT7Blue2.SARS 1195 5’ HindIII-BlnI #10 (Figura 55), se aisló un fragmento HindIII-NcoI de 402 pb y el fragmento Ncoi-BlnI de 2044 pb (Figura 55). Fue necesario realizar el aislamiento de HindIII-BlnI en dos etapas para evitar problemas de clonación relacionados con el sitio HindIII interno situado en el nucleótido número 1319 de la proteína Spike 1195.

Para ensamblar el casete de expresión BamHI-SalI de Spike 1195 en el vector pBS24.1, se transformaron células competentes de E. coli HB101 con el BamHI-HindIII (promotor ADH2/GAPDH), fragmento de 402 pb HindIII-NcoI, NcoI-BlnI de 2044 pb y los fragmentos de 1126 pb BlnI-SalI en el vector pBS24.1 BamHI SalI. Las muestras se sembraron en placas de agar Luria, que contenían 100 µg/ml de ampicilina. El clon deseado se identificó mediante análisis de ADN “miniscreen”, creando así el pd.SARS Spike 1195 #10 obtenido por ingeniería genética (Figura 56).

Se transformó una cepa de S. cerevisiae AD3 con pd.SARS Spike 1195 #10 y se comprobaron los transformantes individuales para la expresión después del empobrecimiento de glucosa en el medio. La proteína recombinante se detectó mediante tinción con azul de Coomassie. En particular, las células de levadura se transformaron con el plásmido de expresión SARS 1195 utilizando el kit S.c. EasyCompT™ Transformation Kit Invitrogen.

14: EJEMPLO 14: Expresión en líneas celulares de mamífero

Se amplificaron fragmentos de ADNc que contenían el ORF de la proteína S de 1.255 aminoácidos, mediante RT-PCR a partir de ARN viral de SARS (aislado Frankfurt) cultivado en células Vero. Los fragmentos de PCR amplificados se clonaron en el vector pBlueScript, se secuenciaron y se ensambló la secuencia consenso de la proteína espicular para crear un clon de la proteína espicular de SARS de longitud completa, pBSnSh. La transcripción in vitro de pBSnSh seguida de la traducción en un lisado de reticulocitos de conejo dio como resultado la producción de un solo polipéptido con una masa molecular calculada de ~140 kDa.

El inserto de este plásmido se volvió a clonar mediante XhoI y NotI en un vector de expresión de mamífero pCMVIII (Srivastava et al. (2003) J. Virol 77: 11.244-11259) para crear un constructo, nSh (Fig. 66A). Un fragmento de PCR que contenía una proteína espicular de 1.195 aminoácidos, a la que se le había suprimido el dominio transmembrana (TM) y la cola citoplasmática rica en cisteína (Cy) se amplificó y se clonó en el vector pCMVIII para generar el constructo nShΔTC (Figura 66B). Ambos constructos se marcaron con seis residuos de histidina en el extremo C-terminal con el fin facilitar su caracterización. El fragmento XhoI/NotI sin cola de histidinas también se subclonó en la cadena principal del vector del replicón de alfavirus pVCRchim2.1 para su uso en la producción de un híbrido de partícula de replicón de alfavirus que expresa la proteína S. La producción y caracterización de las partículas de vector de alfavirus de replicación defectuosa se realizó esencialmente según lo descrito anteriormente (Perri et al. (2003) J. Virol. 77: 10394-10403; Polo et al. (1999) PNAS USA. 96: 4598-4603). Las partículas de vector de alfavirus resultantes se denominaron VEE/SIN.

Se mantuvieron células COS7 y células BHK-21 en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero de ternera fetal al 10% a 37°C y CO2 en aire al 5%. Se transfectaron células COS7 con plásmidos de expresión (nSh, nShΔTC) mediante un kit de transfección (TransIt-COS, Mirus) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células se lavaron una vez con PBS enfriado en hielo y se lisaron con tampón de lisis 1x (MOPS 20 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM y Triton X-100 al 1%) que contenía inhibidor de proteasa Complete Mini (Roche). Después de una incubación de 30 minutos en hielo, se clarificaron los residuos por centrifugación. El lisado clarificado se purificó o se utilizó directamente en la transferencia de western.

Para purificar las proteínas espiculares secretadas, se recogió el medio de las células transfectadas y se sometió a centrifugación a 12.000 rpm durante 10 minutos para eliminar los residuos celulares. El medio clarificado se aplicó a una columna ConA-agarosa (Vector Lab). La columna se lavó a fondo con tampón fosfato sódico 20 mM, a continuación se eluyeron las proteínas unidas con α-D-manopiranósido de metilo (MMP) 1 M, NaCl 1 M en tampón fosfato sódico 20 mM. Las fracciones de la columna que contenían las proteínas espiculares de SARS-CoV se aplicaron al sistema de purificación de proteínas MagneHis (Promega) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante.

Para el análisis de transferencia de western, las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 4%-20% y a continuación se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen). La membrana se bloqueó en tampón de bloqueo (leche desnatada al 5% y Tween 20 al 0,1% en PBS) y se incubó con el anticuerpo indicado a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavó y se hibridó con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Biosource) seguido de quimioluminiscencia (sistema ECL, Amersham) y se expuso mediante películas de rayos X. Los anticuerpos utilizados fueron un anticuerpo monoclonal de ratón anti-histidina (AcMo anti-cola de histidinas, Novagen), un anticuerpo antipéptido policlonal de conejo contra la proteína espicular de SARS-CoV (SmPab, Abgent) o sueros de conejo anti-SARS (2BE) obtenidos mediante inmunización de conejos con virión del SARS-CoV purificado. Este último tiene un título de neutralización del cultivo celular de 1/2.500. A menos que se indique lo contrario, se utilizó el anticuerpo a 1/1.000 para anticuerpo anti-histidina y SmPab y a 1/10.000 para los sueros de conejo anti-SARS.

Algunas proteínas espiculares se trataron con péptido-N glicosidasa F (PNGasa F). Los lisados celulares se diluyeron en SDS al 0,5% y β-mercaptoetanol al 1% y se desnaturalizaron a 100°C durante 10 minutos. Después de una dilución de factor 2 con NP-40 al 1% en fosfato sódico 50 mM (pH 7,5), las muestras se trataron con PNGasa F (NEB) a 37°C durante 1 hora. Las muestras tratadas con enzimas se analizaron mediante SDS-PAGE al 4%-12% en

condiciones reductoras. Para una digestión parcial con la PNGasa, los lisados celulares se diluyeron con fosfato sódico 50 mM (pH 6,0) que contenía Triton-X al 0,75% y se trataron con PNGasa F (Calbiochem) a 37°C durante 3 horas. Las muestras tratadas con enzimas se analizaron mediante SDS-PAGE al 4%-20% en condiciones no reductoras.

Las transferencias de western de las células 48 horas después de la transfección se muestran en la Figura

67. La proteína S se detectó en los lisados celulares como un doblete con un peso molecular calculado de ~170 kDa-180 kDa, cuando el lisado se sometió a ebullición y se analizó en condiciones de SDS-PAGE reductoras (Fig. 67A, calle 3). Este doblete parece ser el resultado de la glicosilación diferencial de un producto polipeptídico puesto que el pre-tratamiento del lisado celular con PNGasa F redujo el doblete a una sola especie de ~140 kDa (Fig. 67A, calle 4). Este es el tamaño esperado predicho a partir de la secuencia de aa para un producto polipeptídico intacto de longitud completa. Este experimento indica que la S de SARS-CoV de longitud completa se expresa en células de mamífero como un solo polipéptido no escindido, pero en dos formas glicosiladas de manera diferenciada, gp170 y gp180 respectivamente. A diferencia de las dos glicoformas de S codificadas por la secuencia de longitud completa, ninguna de las cuales fue secretada, el producto proteico SΔ se detectó tanto en los lisados celulares (Fig. 67A, calle 5), como en el medio de cultivo celular (Fig. 67B, calle 3) como una sola especie de ~160 kDa.

Con el fin de caracterizar adicionalmente el procesamiento intracelular de la proteína S, y como se ha descrito anteriormente, se infectaron células BHK21 con partículas de alfavirus defectuosas que expresaban la S de longitud completa. 6 horas después de la infección con una MOI de 5, las células infectadas se marcaron con radiactividad durante 1 hora con L-[35S] metionina/cisteína y se les hizo seguimiento durante 2 ó 4 horas. La proteína S marcada con L-[35S] se inmunoprecipitó utilizando el antisuero de conejo generado contra el virus purificado inactivado y, a continuación, se digirió con Endo H. El tratamiento con Endo H implicaba la dilución con un tampón de muestra (fosfato sódico 50 mM, SDS al 0,1%, DTT 50 mM, pH 6,0) y ebullición durante 5 minutos. Después de la desnaturalización, las muestras se diluyeron adicionalmente con Triton-X 100 al 0,75% y se trataron con endoglicosidasa H (Endo H) siguiendo el protocolo del fabricante (Calbiochem) durante 3 horas a 37°C. Se añadieron muestras tratadas con enzimas con tampón de carga en gel que contenía DTT y SDS al 0,1%, y se analizaron mediante SDS-PAGE al 8%.

Tanto las proteínas digeridas como las no digeridas se sometieron a ebullición en SDS y se analizaron mediante SDS-PAGE reductora (Figura 47). Después de un pulso de 1 hora, la proteína S se puso de manifiesto como un único componente gp170 que era sensible a Endo H (calles 1 y 2). Tras un seguimiento de 2 horas, estuvo presente una nueva especie (gp180) junto con gp170 en proporciones aproximadamente iguales (calle 3). Después de un seguimiento de 4 horas, la especie gp180 era el componente de la proteína S dominante (calle 5) que ahora era resistente a Endo H (calles 5 y 6). Estos datos son coherentes con el hecho de que gp170 sea una glicoproteína residente en el RE que contiene alta concentración de cadenas de manosa y correspondiéndose gp180 con una glicoproteína procesada en el Golgi que contiene oligosacáridos complejos resistentes a Endo H.

También se ensayó la sensibilidad a Endo H de la proteína SΔ con supresión del extremo C-terminal purificada a partir de medios de cultivo celulares. Como se muestra en la Figura 68, la SΔ observada dentro de los lisados celulares resultó ser sensible a Endo H (calles 1 y 2), mientras que la SΔ secretada en los medios de cultivo celular era resistente a Endo H (calles 3 y 4). Este resultado es coherente con el hecho de que esta glicoproteína sea sintetizada en una forma inmadura en el RE antes de la transferencia al Golgi donde se añade el carbohidrato complejo y a continuación se secreta la proteína.

Como ya se ha descrito, la proteína S expresada en células COS7 se detectó como un doblete gp170/gp180 en los análisis de transferencia de western de lisados celulares que se desnaturalizaron totalmente por ebullición en presencia de DTT. Sin embargo, la mayoría de la proteína S se detectó como una glicoproteína de alto peso molecular en el intervalo de 440 kDa-669 kDa cuando el mismo lisado celular no se desnaturalizaba por calor antes del análisis de transferencia de western mediante SDS-PAGE (Fig. 69, calle 1). La especie de ~500 kDa era resistente a tratamiento con DTT 10 mM (calle 3) y no se disociaba en la forma monomérica a menos que el lisado fuese primero desnaturalizado por calor a 100°C (calle 4). Por el contrario, la forma oligomérica de una proteína de ensayo (tiroglobulina) cuya estructura cuaternaria se mantiene mediante enlaces disulfuro se transformó en la forma de subunidad por el tratamiento con DTT 10 mM. Estos datos sugieren que la forma oligomérica de ~500 kDa de la proteína S no está unida por enlaces disulfuro y es termolábil. Para confirmar la sensibilidad al calor de la especie de ~500 kDa de la proteína S, se repitió el experimento de desnaturalización térmica pero sin DTT. Como se muestra en la Figura 70, la desnaturalización térmica de la proteína de ~500 kDa a 100°C por sí sola era suficiente para transformarla en las formas monoméricas gp170/180 (calle 4). Mediante una etapa de desnaturalización térmica a 80°C, la forma de ~500 kDa y las formas monoméricas pudieron detectarse en una proporción similar (calle 3).

Con el fin de investigar adicionalmente si esta especie de ~500 kDa representa un oligómero de la proteína S en conformación natural, se realizó un análisis comparativo con glicoproteína S derivada de viriones derivada de cultivos de células Vero. Los viriones purificados se solubilizaron en SDS al 1% antes de los análisis de transferencia de western después del SDS-PAGE. La presencia del oligómero de la proteína espicular de ~500 kDa se confirmó en las partículas de viriones (Fig. 71, calle 1). Además, la desnaturalización térmica de los viriones solubilizados

produjo la misma conversión de oligómero a monómero que se observa con la S recombinante de longitud completa (calles 2, 3). Se analizó adicionalmente la naturaleza oligomérica de la S del virión en un experimento de entrecruzamiento. Se trataron alícuotas de virión inactivado de fracciones del gradiente de sacarosa con SDS al 10% a una concentración final del 1% y se sometieron a dilución de factor 2 con trietanolamina-HCl 0,2 M (pH 8, Sigma); a continuación, se añadió suberimidato de dimetilo (DMS; Pierce Chemical Co.) a partir de una solución recién preparada (10 mg/ml en trietanolamina-HCl 0,2 M) a una concentración final de 3,3 mg/ml. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se concentraron las muestras con Centricon-30 y se analizaron mediante tinción con plata después de electroforesis en un gel de poliacrilamida al 4%. Las proteínas del virión no tratadas y entrecruzadas con DMS se desnaturalizaron por calor, y se analizó el efecto del calor en el mantenimiento de la estructura del oligómero mediante SDS-PAGE y tinción con plata (Figura 72). En ausencia de entrecruzamiento, la desnaturalización térmica dio como resultado la sustitución de la especie de proteína espicular de ~500 kD con las especies monoméricas. Por el contrario, en las proteínas entrecruzadas, los niveles de las especies de ~500 kD y monoméricas no cambiaron significativamente después del calentamiento. Estos datos apoyan el hecho de que la proteína de ~500 kD es un oligómero de las proteínas monoméricas de S que están unidas de forma no covalente. Después del entrecruzamiento y la ebullición, la especie de ~500 kD migró como una forma difusa algo más lenta que la forma no tratada. Este cambio de la movilidad se debe probablemente a un cambio estructural resultado de la ebullición. Además, pudo observarse una especie de proteína menor de ~300 kD, que puede representar un dímero de S no disociado.

Para calcular con mayor precisión el tamaño de la especie de S de ~500 kDa recombinante expresada en células COS7, se fraccionó un lisado de células COS7 que contenía el oligómero de la proteína S mediante cromatografía en columna de exclusión por tamaño. La mayor parte del oligómero de ~500 kDa co-eluyó con una proteína marcadora de 572 kDa. En conjunto, estos experimentos sugieren que la especie de S de ~500 kDa observada en los lisados de células COS7 es probablemente un homotrímero del monómero de la proteína S.

El estado oligomérico de la proteína espicular SΔ también se examinó después de la expresión en células COS7. Como se muestra en la Figura 73, las proteínas SΔ recombinantes presentes en los lisados celulares también se detectaron en formas de alto peso molecular del intervalo de ~500 kDa cuando el lisado no se calentaba antes del análisis SDS-PAGE y de transferencia de western (calle 1). Sin embargo, la eficacia de oligomerización por parte de la proteína SΔ intracelular parece ser mucho menor (<10%) en comparación con la de la proteína S de longitud completa en las mismas condiciones de análisis de western. Un ensayo de sensibilidad al calor en esta proteína de ~500 kDa mostró que el oligómero de SΔ era más termolábil que el oligómero de S de longitud completa, como se demuestra por la conversión > 90% de todas las especies de ~500 kDa en formas Sd monoméricas a 80°C (calle 2). Además (Figura 74), la mayoría de la proteína SΔ secretada se encontró en forma monomérica, siendo la especie de ~500 kD apenas detectable (y sólo detectable cuando la proteína se cargaba en exceso para el análisis de western) (calle 1). A una temperatura superior a 80°C, todas las proteínas SΔ secretadas se detectaron como monómeros (calles 2, 3).

La proteína de ~500 kDa está glicosilada, y se investigó el efecto de la desglicosilación sobre su unión a los anticuerpos. Se trató el lisado de COS7 recombinante con PNGasa F en condiciones no desnaturalizantes (como se ha descrito anteriormente) y se analizó mediante transferencia de western. Como se muestra en la Figura 75, la desglicosilación no influyó en la unión del anticuerpo AcMo anti-histidina al oligómero de S tratado (calles 2, 3). Sin embargo, la reactividad se vio comprometida con el antisuero de conejo generado contra el virus purificado (calle 6). Este antisuero se une a la S derivada de viriones en los análisis de transferencia de western sólo cuando se omite el DTT de la muestra para SDS-PAGE, lo que indica que reconoce principalmente un(os) epítopo(s) conformacional(es) discontinuo(s). Este antisuero también ha demostrado tener un título elevado de anticuerpos neutralizantes virales. Su falta de unión a la S recombinante desglicosilada sugiere que el carbohidrato contribuye activamente a la estructura natural de orden superior del oligómero del polipéptido S.

La diferencia entre la proteína S recombinante y la SΔ es la presencia o ausencia de los dominios TM y rico en Cys en el extremo C-terminal. Esta diferencia predice que la S de longitud completa debería encontrarse asociada con la fracción de membrana, mientras que Sd estaría en la fracción soluble tras la lisis de las células transfectadas. Por lo tanto, se lisaron células transfectadas con nSh o nShΔTC en condiciones hipotónicas y la fracción de citosol soluble se separó de la fracción de membrana insoluble por centrifugación (Figura 40). Como se muestra en la Figura 76, la proteína S se encontró en la fracción de membrana (DF) como una especie de ~500 kDa y como especies de 180 kDa/170 kDa (calle 4), pero no pudo detectarse en la fracción de citosol soluble (AF) (calle 3). Sin embargo, la proteína SΔ truncada se encontró como una especie monomérica (gp170) en ambas fracciones (calles 5, 6). Esto indica que los dominios Tm y rico en Cys C-terminales son necesarios para el anclaje de la proteína S a la membrana celular.

La localización celular de las proteínas S y SΔ en las células COS7 se analizó mediante microscopía de inmunofluorescencia indirecta. 48 horas después de la transfección, se fijaron las células directamente con paraformaldehído al 2% sin detergente para la tinción de superficie celular o se trataron con detergente seguido de solución Cytofix/Cytoperm para la tinción intracelular. A continuación, se tiñeron las células fijadas con sueros de conejo anti-SARS (2BE) y anticuerpo conjugado con FITC. Las células transfectadas con nSh presentaron focos de proteína S que indicaba su localización en el Golgi (Figura 77A), mientras que las células transfectadas con nShΔTC

presentaron una distribución uniforme de la proteína SΔ en todo el citoplasma que indicaba su localización en el RE (Figura 77B). Aunque la proteína S completa también se observó en la superficie de las células transfectadas en células no fijadas (Figura 77D), la SΔ era indetectable en la superficie celular (Figura 77E). Estos resultados indican el papel desempeñado por los dominios TM y rico en Cys en el anclaje de la proteína S a la membrana plasmática. Aunque es probable que la región TM sola sea la responsable del anclaje a la membrana, queda por determinar el potencial papel desempeñado por la región rica en Cys.

La proteína S de longitud completa recombinante de SARS es por lo tanto una glicoproteína unida a N con un peso molecular estimado de 170-180.000 kDa. La desglicosilación con PNGasa F dio como resultado un polipéptido del tamaño esperado para el polipéptido codificado no escindido (140 kDa). Tanto la expresión transitoria como la estable del gen de S de SARS-CoV de longitud completa en diversas células de mamífero, incluidas las líneas celulares COS7, 293, BHK21 y Huh7, produjeron sistemáticamente un doblete de proteína S (gp170/180) como se detecta en los análisis de transferencia de western. Los análisis de radiomarcado y seguimiento de las células transfectadas demostró que la proteína S de SARS-CoV se sintetizaba inicialmente como una especie gp170 sensible a Endo H seguida de la aparición gradual de una forma gp180 resistente a Endo H, supuestamente como resultado de la adición de carbohidrato complejo dentro del aparato de Golgi.

La proteína S recombinante no se secretaba en el medio de cultivo celular a menos que se suprimiesen los 60 aminoácidos C-terminales que contenían la región TM y la cola rica en Cys.

Se investigó la estructura cuaternaria de la proteína S recombinante de longitud completa mediante tratamiento de entrecruzamiento, desnaturalización térmica y análisis de fraccionamiento por tamaño. Los datos de los resultados son coherentes con la proteína S recombinante que existe como un homotrímero de ~500 kDa. Análisis similares de S derivada de viriones produjeron los mismos resultados. Se ha informado acerca de una estructura trimérica de este tipo para otros virus de ARN con envoltura: la hemaglutinina HA del virus de la gripe, el heterodímero E1-E2 de los alfavirus y la proteína G del virus de la estomatitis vesicular. Las incubaciones en condiciones reductoras indican que la estructura trimérica de la S de SARS-CoV está asociada de manera no covalente, y que es muy estable. Los oligómeros de S presentes en el lisado celular demostraron ser resistentes a la reducción mediante DTT 10 mM, tratamiento detergente con SDS al 1% y desnaturalización térmica de hasta 60°C. La incubación a una temperatura superior a >80°C dio como resultado la disociación del complejo trimérico como demuestra la disminución de trímero con el aumento concomitante en las bandas de monómero. La aparición inducida por la temperatura de la gp170 altamente manosilada (forma monomérica del RE), así como la gp180 glicosilada compleja (forma monomérica del Golgi) sugiere que la trimerización puede ocurrir antes del transporte de la proteína espicular monomérica a la región media del aparato de Golgi. Esto es coherente con otros informes para TGEV, la HA del virus de la gripe y las proteínas G del virus de la estomatitis vesicular. Con estas proteínas, se informó que la trimerización tenía lugar antes de la adición de los oligosacáridos complejos en el aparato de Golgi.

Se encontró la forma de S truncada en el extremo C-terminal en el lisado celular en las formas oligomérica y monomérica con una frecuencia del 10% y del 90%, respectivamente. La proteína truncada secretada en el medio se encontró totalmente glicosilada y estaba básicamente toda en forma monomérica. Se llegó a la conclusión de que los 60 aminoácidos C-terminales de la glicoproteína S contienen una región de anclaje a la membrana que influye en la eficacia de trimerización. En la trimerización de la proteína S, es posible que la región C-terminal sea necesaria para iniciar el evento y que las estructuras tricatenarias con superenrollamiento en el dominio del tallo de S2 proporcionen una fuerza estabilizadora adicional como se observa en el oligómero de HA del virus de la gripe.

EJEMPLO 15: Células CHO para la expresión de la proteína espicular

Se prepararon líneas celulares CHO que expresaban de forma estable las proteínas espiculares de SARS-CoV de longitud completa o truncada. Se obtuvieron varias líneas celulares CHO transfectadas de forma estable, y la Figura 65 muestra los datos de la transferencia de western de un panel de clones representativos.

EJEMPLO 16: Expresión en E. coli

Todos los ORF de SARS-CoV (Figura 10, Tabla 10) se clonaron en el vector pET y SE expresaron como proteínas de fusión con cola de histidinas C-terminal en E. coli. Las proteínas menores de 16 kD también se expresaron como proteínas de fusión con GST (glutation S transferasa) N-terminal utilizando el vector pGEX.

Nsp1 y Nsp2, las dos proteínas de SARS-CoV con actividad proteolítica, no se expresaron como proteínas de longitud completa debido a la toxicidad en E. coli. Los respectivos genes se clonaron en cambio en diferentes porciones con el fin de separar los residuos catalíticos (Cys833/His994 para Nsp1; His41/Cys145 para Nsp2) en las proteínas recombinantes resultantes: Nsp1A de los nucleótidos 2719-5214 de AY310120; Nsp1B del nucleótido 5218-7371; NsplC del nucleótido 7372-9984; Nsp2A del nucleótido 9985-10416; Nsp2B del nucleótido 10476-10902.

Nsp9 se dividió en dos porciones: Nsp9A del nucleótido 13371-14756; Nsp9B del nucleótido 14757-16166.

La matriz (M), ORF3 y ORF7 contienen respectivamente tres, dos y un dominio transmembrana. Estas proteínas se expresaron como proteínas de deleción con exclusión de los primeros 100 aminoácidos (M y ORF3) o los primeros 18 aminoácidos (ORF7) que incluyen las regiones hidrófobas.

Las secuencias clonadas se muestran en la Tabla 26.

Se utilizó una estrategia de dos etapas para amplificar las secuencias clonadas. En la primera etapa, la amplificación de fragmentos de ADN que contenían más de un gen o un solo gen utilizó como molde el ADNc secuenciado. Se amplificaron once secuencias de ADNc: (1) un fragmento, denominado amplC1, que incluía los genes que codificaban la proteína E, la proteína M, orf 7-8-9-10; (2) un fragmento, denominado amplC2, que incluía los genes que codificaban orf 3-4; (3) un fragmento, denominado amplC5, que incluía los genes que codificaban las proteínas Nsp12 y Nsp13; (4) el gen de Nsp11; (5) los genes de P28 y P65; (6) la porción de genes de Nsp1B y NsplC; (7) un fragmento, denominado amplC9, que incluía los genes que codifican las proteínas Nsp2 y Nsp3; (8) un fragmento, denominado amplNsp4-7, que incluía los genes que codificaban las proteínas Nsp4, Nsp5, Nsp6, Nsp7 y para la amplificación de la porción del gen Nsp9A; (9) la porción del gen de Nsp 9B y el gen de Nsp10; (10) un fragmento, denominado amplCO, que incluía los genes que codificaban proteínas Orf11, la nucleocápside (N) y Orf12; (11) la porción del gen de Nsp1A. Los cebadores utilizados en esta primera etapa se proporcionan en la Tabla

27.

En la segunda etapa, se realizó la amplificación de genes individuales utilizando como moldes fragmentos de ADN de la primera etapa de amplificación. Los cebadores se muestran en la Tabla 28.

De las proteínas de las que se observó expresión, ésta fue en forma soluble o de cuerpos de inclusión (insoluble). La purificación continuó en el material apropiado. Tabla 29 muestra el peso molecular de los fragmentos expresados de los ORF de SARS-CoV, si se clonaron (+ o -), si se observó que el fragmento clonado era expresado (+ o -) y la forma de la proteína que se eligió para la purificación.

Cuando una proteína era un producto soluble con cola de histidinas, se sembró en estrías y se cultivó una sola colonia durante toda la noche a 37°C en una placa de agar LB/Amp (100 µg/ml). Se inoculó una colonia aislada de esta placa en 20 ml de medio líquido LB/Amp (100 µg/ml) y se cultivó durante toda la noche a 37°C con agitación. El cultivo de una noche se diluyó 1:30 en 1,0 l de medio líquido LB/Amp (100 µg/ml) y se dejó crecer a la temperatura óptima (30°C ó 37°C) hasta que la DO550nm alcanzó 0,6-0,8. Se indujo la expresión de la proteína recombinante mediante la adición de IPTG (concentración final 1,0 mM) y se incubó el cultivo durante otras 3 horas. Las bacterias se recogieron por centrifugación a 8.000 x g durante 15 minutos a 4°C. El sedimento bacteriano se resuspendió en 10 ml de tampón A frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 10 mM, pH 8,0). Las células se rompieron mediante sonicación (o prensa francesa) en hielo cuatro veces durante 30 segundos a 40 W utilizando un sonicador Branson 450 y se centrifugaron a 13.000 x g durante 30 minutos a 4°C. Los sobrenadantes se mezclaron con 150 µl de Ni2+-resina (previamente equilibrada con tampón A) y se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La resina era Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia), preparada según el protocolo del fabricante. La preparación por lotes se centrifugó a 700 x g durante 5 minutos a 4°C y se desechó el sobrenadante. La resina se lavó dos veces (por lotes) con 10 ml de tampón A durante 10 minutos, se resuspendió en 1,0 ml de tampón A y se cargó en una columna desechable. Se siguió lavando la resina con tampón A a 4°C hasta que la DO280nm del flujo que atraviesa la columna alcanzó 0,02-0,01. La resina se lavó adicionalmente con tampón B frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 20 mM, pH 8,0) hasta que la DO280nm del flujo que atraviesa la columna alcanzó 0,02-0,01. La proteína de fusión con histidinas se eluyó por adición de 700 µl de tampón de elución C frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 250 mM, pH 8,0) y las fracciones se recogieron hasta que la DO280nm indicó que se había obtenido toda la proteína recombinante. Se analizaron alícuotas de 20 µl de cada fracción de elución mediante SDS-PAGE. Las concentraciones de proteínas se calcularon mediante el ensayo de Bradford.

Cuando una proteína se observaba como producto insoluble, los cuerpos de inclusión se purificaban de la siguiente manera: homogeneizar las células (5 g de peso húmedo) en 25 ml de Tris HCl 0,1 M pH 7, EDTA 1 mM, a 4°C mediante un Ultraturrax (10.000 rpm); añadir 1,5 mg de lisozima por gramo de células; mezclar brevemente con un Ultraturrax e incubar a 4°C durante 30 minutos; utilizar sonicación o homogeneización a alta presión para romper las células; para digerir el ADN, añadir MgCl2 a una concentración final de 3 mM y ADNasa a una concentración final de 10 ug/ml e incubar 30 minutos a 25°C. Añadir a la solución 0,5 volúmenes de EDTA 60 mM, Triton X-100 al 6%, NaCl 1,5 M pH 7,0, e incubar durante 30 minutos a 4°C; centrifugación a 31.000 g durante 10 minutos a 4°C; resuspender el sedimento en 40 ml de Tris HCl 0,1 M pH 7,0, EDTA 20 mM mediante Ultraturrax; centrifugación a

31.000 g durante 10 minutos a 4°C; almacenar el sedimento de cuerpos de inclusión a -20°C.

Los resultados de la expresión se muestran en las Figuras 78 a 97. Los ejemplos de pureza y rendimiento se proporcionan en la Tabla 30.

EJEMPLO 17: Retención del epítopo crítico sobre el antígeno proteína espicular truncada

Se ensayó un anticuerpo monoclonal humano con actividad de neutralización en un ensayo ELISA para la reactividad con la proteína espicular truncada purificada. En resumen, se recubrieron placas de ELISA con la forma truncada de la proteína espicular a una concentración de 1 µg/ml (100 µl/pocillo) incubando las placas durante toda la noche a 4°C. Se lavaron las placas, se bloquearon los sitios de unión no específicos y a continuación se añadieron diferentes diluciones del anticuerpo y se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, se lavaron las placas y el anticuerpo unido se detectó utilizando anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) y un sustrato apropiado. Se registró la densidad óptica a 405 mm de cada pocillo mediante un lector de ELISA. Los datos se muestran en la Figura 61 y demuestran claramente que el epítopo neutralizante reconocido por el AcMo está conservado y expuesto en la proteína espicular truncada recombinante.

EJEMPLO 18: Diferentes vacunas contra la proteína espicular

Se utilizó proteína espicular truncada purificada para inmunizar ratones y se determinó el nivel de anticuerpos de unión inducidos contra la proteína espicular truncada, mediante ensayo ELISA. En resumen, se inmunizó a un grupo de 10 ratones con 3 µg de proteína espicular truncada con adyuvante MF59 a intervalos de 0, 4 y 8 semanas. Se recogieron muestras de suero de estos animales y se ensayaron para los anticuerpos inducidos por la proteína espicular truncada en un ensayo ELISA. Se inmunizó a un grupo adicional de 8 ratones con 75 µmg de ADN que codificaba la forma truncada de la proteína espicular en partículas de PLG a intervalos de 0, 4 y 13 semanas, se recogieron los sueros y se analizaron como se ha indicado anteriormente para los anticuerpos anti-proteína espicular.

El perfil de anticuerpos de unión inducidos en cada grupo se representó como la media geométrica de los títulos (GMT). En comparación con una vacuna de ADN plasmídico que expresa el antígeno proteína espicular truncada y administrada utilizando una formulación de micropartículas PLG, la proteína espicular truncada purificada fue significativamente más potente para la inducción de fuertes respuestas de anticuerpos. La comparación adicional con las respuestas de anticuerpos inducidas por BPL-SARS-CoV inactivado (que ya habían demostrado ser protectoras) en la misma cepa de ratón puso de manifiesto que la magnitud de las respuestas de anticuerpos inducidas por la proteína espicular truncada purificada y la vacuna de virus inactivados están en el mismo intervalo (Figura 62).

También se evaluó el potencial de neutralización de los anticuerpos inducidos por la proteína espicular truncada recombinante, o el ADN plasmídico que expresa el mismo antígeno proteína espicular. Los valores de GMT obtenidos en ambos grupos se muestran en la Figura 63. A partir de estos datos, parece que la proteína purificada es significativamente más eficaz en la inducción de respuestas de anticuerpos neutralizantes contra la proteína espicular de SARS-CoV. Además, los títulos de neutralización por lo general inducidos por la proteína espicular truncada purificada son comparables con los títulos de neutralización inducidos por una vacuna inactivada contra el SARS-CoV.

La Figura 64 muestra una comparación de los niveles de anticuerpo de unión (ELISA, eje X) con los títulos de neutralización (eje Y). En general, existe una muy buena correlación entre los anticuerpos de unión y neutralizantes. La agrupación inferior izquierda muestra las relaciones 2 semanas después de la tercera inmunización con la vacuna de ADN; la agrupación superior derecha muestra las relaciones 2 semanas después de la segunda inmunización con la vacuna de proteína. Ambas formas de vacuna muestran una correlación constante.

En otros experimentos, se estudió la capacidad de una vacuna de ADN para invocar una respuesta inmunitaria en ratones. Se inmunizó a los ratones con el plásmido pCMV-nSdTC, libre o con micropartículas de PLG. A continuación, se utilizó el suero de los ratones como anticuerpo de tinción contra 293 células cultivadas que habían sido transfectadas con la proteína espicular, de longitud completa o truncada. Se centrifugaron las células antes del ensayo y se lisó el sedimento. Se ensayó el anticuerpo contra el sobrenadante del cultivo y contra el lisado celular. Como se muestra en la Figura 104, el suero de ratón fue capaz de detectar la proteína espicular en el lisado de las células que expresaban la proteína espicular de longitud completa y en el sobrenadante de las células que expresaban la proteína espicular truncada. Los resultados fueron comparables a la tinción observada cuando se utilizaba suero de conejo obtenido tras la inmunización con virus muertos enteros. Por lo tanto, pueden inducirse anticuerpos anti-proteína espicular mediante el uso de la vacunación con ADN.

EJEMPLO 19: Casetes de expresión en pCMV

La secuencia del plásmido pCMVKm2 se proporciona como la SEQ ID NO: 9923. Se insertaron en este vector básico los genes que codifican la proteína espicular en su forma de longitud completa (proteína espicular nS de SARS de pCMVKm2; SEQ ID NO: 9921) o en su forma ΔTC (proteína espicular nSΔTC de SARS de pCMVKm2; SEQ ID NO: 9922).

Se inmunizó a los ratones con estos vectores, y con vectores similares que codificaban las proteínas N, M o

E. También se prepararon vectores que codificaban las mismas proteínas pero con uso de codones optimizados. Los codones se optimizaron para la expresión eficaz en seres humanos a partir de la secuencia de FRA (GenBank: AY310120).

Después de la administración, pudo detectarse la expresión de las proteínas mediante inmunofluorescencia en todos los casos. Por ejemplo, la Figura 98 muestra los resultados de inmunofluorescencia (utilizando suero de conejo anti-SARS) después de la administración del vector que codifica el antígeno N optimizado, que pone de manifiesto un elevado nivel de expresión. Los ratones que recibieron el vector de control en solitario no presentaron fluorescencia.

La Figura 99 compara la inmunofluorescencia (utilizando el anticuerpo anti-M de Abgent) de la secuencia natural de M (99A) o la secuencia de M con codones optimizados (107B). Del mismo modo, la Figura 100 compara la inmunofluorescencia (utilizando el anticuerpo anti-E de Abgent) de la secuencia natural de E (100A) o la secuencia de E con codones optimizados (100B).

Se inmunizó a cuatro grupos de ratones (8 ratones por grupo) con: (1) proteínas espicular nS, espicular truncada nSdTC y N de SARS; (2) pCMV-SARS-nSdTC: ADN+ADN-PLG las semanas 0, 4 y 13; (3) CMV-nS: ADN+ADN-PLG+VEE/SIN Rep las semanas 0, 4 y 9; (4) VEE/SIN Rep-SARS-nS tres veces las semanas 0, 4 y 13. Los sueros de todos los grupos reconocían las proteínas nS y nSdTC de SARS, y también presentaron unión al virus y actividad de neutralización.

EJEMPLO 20: Escisión de la proteína espicular

Para investigar el efecto de la escisión proteolítica sobre la proteína espicular de SARS-CoV, ésta se expresó en diversas formas en E. coli, incluidas: (1) S1-S2 de longitud completa; (2) S1 en solitario; (3) HR1 héptada; y (4) HR2 héptada. Las proteínas expresadas se utilizaron para generar inmunosueros de conejo, que a continuación se utilizaron para la visualización de las transferencias de western de células Vero, infectadas o no infectadas con SARS-CoV.

La Figura 101 muestra una transferencia de western utilizando una dilución 1:10.000 de anticuerpo generado contra el dominio S1 o los dominios S1-S2 no escindidos. La Figura 102 muestra una transferencia de western utilizando una dilución 1:10.000 de anticuerpo generado contra cada una de las cuatro proteínas. La diferencia en la reactividad del antígeno resulta evidente.

La Figura 103 muestra datos similares. Se ensayó cada suero contra cuatro calles, siendo las cuatro calles de izquierda a derecha: (a) suero a una dilución de 1:500, células infectadas con SARS-CoV; (b) suero a una dilución de 1:500, células no infectadas (c) suero a una dilución de 1:2.500, células infectadas con SARS-CoV; (d) suero a una dilución de 1:2.500, células no infectadas. Una vez más, la diferencia en la reactividad del antígeno resulta evidente.

Las Figuras 101-103 muestran que la proteína espicular existe en diversas formas en las células Vero infectadas, con tamaños de aproximadamente 75 kDa, 90 kDa, 180 kDa y >250 kDa. La proteína espicular se escinde (al menos parcialmente) intracelularmente o después de la liberación de las partículas.

Si se inhibe la escisión enzimática de la proteína espicular del coronavirus de la hepatitis de ratón, también se inhibe la fusión célula-célula (formación de sincicios), pero no la fusión virus-célula (de Haan et al. (2004) J Virol). Se observaron sincicios in vivo en los pulmones de pacientes infectados por el SARS, pero no se observan en cultivos de células Vero del SARS-CoV. Por lo tanto, puede utilizarse la inhibición de la escisión de la proteína espicular para prevenir la formación de sincicios y la patología relacionada, a pesar de que la infectividad viral pueda no estar bloqueada.

Tabla 11: Homologías de proteínas entre el SARS y otros coronavirus

Los números indican el porcentaje de identidad de aminoácidos entre las proteínas de SARS y los productos génicos correspondientes de otros coronavirus. Los pares más conservadas están en negrita; se subrayan los pares más variables.

grupo 1

grupo 2 grupo 3

Proteínas

229E TGV PEDV MHV BCoV AIBV

REGIÓN REPLICASA

proteína líder p28

<20 <20 <20 27 <20 <20

homóloga de p65

<20 23 23 <20 20 <20

nsp1 (PLP proteasa)

25,5 25,8 25,4 29 30 25

nsp2 (3CL proteasa)

40,4 43,8 44,6 50 48,4 41

nsp3

30 27 29,4 34,2 35,5 28,5

nsp4

38,6 42,2 39,8 47,5 46,1 37,3

nsp5

48,2 42,9 43,9 46,8 47,3 38,7

nsp6

45,1 38,9 45,1 45,1 46,9 39,8

nsp7

53,8 54,5 56,1 56,2 55,4 58,3

nsp9 (polimerasa)

59,8 59,6 60 67,3 66,9 62,4

nsp10 (helicasa)

60,7 62 62,3 67,2 68,6 58,9

nsp11

52,3 53,7 52,3 57,6 57,6 52

nsp12

43,1 43 45,4 45,9 45 40,2

nsp13

56,4 54,4 55,3 63 65 53,4

REGIÓN ESTRUCTURAL

Proteína espicular (S)

28,8 31,6* 30,3 31,1 31 32,7*

Envoltura (E)

33* 27,9 20 23 26,5 23,2

Glicoproteína de matriz (M)

30,6 32,5 34,8 40,8 41,9 32,5

Nucleocápside (N)

26,9 30,1 29,5 37,3 37,4 31,5

* Estos tres alineamientos se obtuvieron solamente en un fragmento de la proteína completa.

Tabla 12: Diferencias de nucleótidos y aminoácidos entre cinco aislados de SARS

FRA*

TOR2* Urbani* CUHK* HKU*

posiciónº

base/ aminoácido base/ aminoácido base/ aminoácido base/ aminoácido base/ aminoácido

ORF1a

2557 A/Thr G/Ala G/Ala G/Ala G/Ala

2601

T/Val C

7746

G/Pro T

7919

C/Ala T/Val

7930

G/Asp A/Asn

8387

G/Ser C/Thr

8416

G/Arg C/Thr

9404

T/Val C/Ala

9479

T/Val C/Ala

11448

T/Ile C C C C

13494

GT/Val AG/Ser

16622

C/Ala T

17564

T/Asp C/Glu

ORF1b

17846 C/Arg T

18065

G/Lys A

18965

A/Ile T T T T

19064

A/Glu G G

19084

T/Ile C/Thr C/Thr C/Thr C/Thr

FRA*

TOR2* Urbani* CUHK* HKU*

posiciónº

base/ aminoácido base/ aminoácido base/ aminoácido base/ aminoácido base/ aminoácido

Proteína espicular

21721 G/Gly A/Asp

22222

T/Ile C/Thr

23220

T/Ser G/Ala

24872

T/Leu C

24933

T/Phe C/Leu C/Leu C/Leu C/Leu

ORF3

25298 G/Gly A/Arg

25569

T/Met A/Lys

matriz

26600 T/Val C/Ala C/Ala C/Ala

26857

T/Ser C/Pro

ORF10

27827 T/Cys C/Arg

nucleocápside

28268 T/Ile C/Thr C/Thr C/Thr C/Thr

* FRA de coronavirus del SARS (número de registro AY310120) TOR2 de coronavirus del SARS (número de registro AY274119) Urbani de coronavirus del SARS (número de registro AY278741) CUHK-W1 de coronavirus del SARS (número de registro AY278554) HKU-39849 de coronavirus del SARS (número de registro AY278491) ° La posición se basa en la secuencia de FRA.

TABLAS 13-25: Predicciones para el epítopo T para la SEQ ID NO: 6042. Se realizaron predicciones para el epítopo en la dirección http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html utilizando una puntuación mínima de 0,5 y la matriz BIMAS, seleccionándose un máximo de 20 resultados. El análisis puso de manifiesto epítopos 9-meros y 10-meros.

Tabla 16: Epítopos para la SEQ ID NO: 6042

HLA A1 -9 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

5625

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

846 SEQ ID NO: 8041 2,22% 125

2

798 SEQ ID NO: 8042 1,6% 90

3

787 SEQ ID NO: 8043 0,88% 50

4

1178 SEQ ID NO: 8044 0,8% 50

5

637 SEQ ID NO: 8045 0,8% 45

6

557 SEQ ID NO: 8046 0,44% 25

7

1020 SEQ ID NO: 8047 0,44% 25

8

282 SEQ ID NO: 8048 0,32% 18

9

1241 SEQ ID NO: 8049 0,24% 13,5

10

466 SEQ ID NO: 8050 0,22% 12,5

11

727 SEQ ID NO: 8051 0,2% 11,25

12

706 SEQ ID NO: 8052 0,17% 10

13

324 SEQ ID NO: 8053 0,16% 9

14

752 SEQ ID NO: 8054 0,16% 9

15

54 SEQ ID NO: 8055 0,13% 7,5

16

554 SEQ ID NO: 8056 0,13% 7,5

17

590 SEQ ID NO: 8057 0,12% 6,75

18

569 SEQ ID NO: 8058 0,08% 5

19

613 SEQ ID NO: 8059 0,08% 5

20

90 SEQ ID NO: 8060 0,08% 4,5

HLA A1 -10 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

5625

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

1241 SEQ ID NO: 8061 4,8% 270

2

967 SEQ ID NO: 8062 0,8% 45

3

1010 SEQ ID NO: 8063 0,48% 27

4

426 SEQ ID NO: 8064 0,44% 25

5

809 SEQ ID NO: 8065 0,44% 25

6

1178 SEQ ID NO: 8066 0,44% 25

7

787 SEQ ID NO: 8067 0,22% 12,5

8

958 SEQ ID NO: 8068 0,22% 12,5

9

727 SEQ ID NO: 8069 0,2% 11,25

10

610 SEQ ID NO: 8070 0,17%

10

11

12 SEQ ID NO: 8071 0,13% 7,5

12

1181 SEQ ID NO: 8072 0,12% 6,75

13

373 SEQ ID NO: 8073 0,11% 6,25

14

602 SEQ ID NO: 8074 0,11% 6,25

15

20 SEQ ID NO: 8075 0,04% 2,5

16

32 SEQ ID NO: 8076 0,04% 2,5

17

53 SEQ ID NO: 8077 0,04% 2,5

18

400 SEQ ID NO: 8078 0,04% 2,5

19

557 SEQ ID NO: 8079 0,04% 2,5

20

667 SEQ ID NO: 8080 0,04% 2,5

HLA A3 -9 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

12150

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

768 SEQ ID NO: 8081 0,82% 100

2

808 SEQ ID NO: 8082 0,49% 60

3

85 SEQ ID NO: 8083 0,24% 30

4

663 SEQ ID NO: 8084 0,24% 30

5

1245 SEQ ID NO: 8085 0,14% 18

6

288 SEQ ID NO: 8086 0,09% 12

7

50 SEQ ID NO: 8087 0,08% 10

8

320 SEQ ID NO: 8088 0,07% 9

9

402 SEQ ID NO: 8089 0,07%

9

10

798 SEQ ID NO: 8090 0,07% 9

11

902 SEQ ID NO: 8091 0,06% 8,1

12

364 SEQ ID NO: 8092 0,05% 6,75

13

297 SEQ ID NO: 8093 0,04% 6

14

992 SEQ ID NO: 8094 0,04% 6

15

38 SEQ ID NO: 8095 0,03% 4,5

16

249 SEQ ID NO: 8096 0,03% 4,5

17

706 SEQ ID NO: 8097 0,03% 4,05

18

1204 SEQ ID NO: 8098 0,03% 4,05

19

1178 SEQ ID NO: 8099 0,03% 4

20

343 SEQ ID NO: 8100 0,02% 3,6

HLA A3 -10 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

12150

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

255 SEQ ID NO: 8101 1,48% 180

2

180 SEQ ID NO: 8102 0,55% 67,5

3

768 SEQ ID NO: 8103 0,49% 60

4

1177 SEQ ID NO: 8104 0,49% 60

5

380 SEQ ID NO: 8105 0,24% 30

6

100 SEQ ID NO: 8106 0,18% 22,5

7

786 SEQ ID NO: 8107 0,16% 20

HLA A3 -10 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

12150

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

8

1217 SEQ ID NO: 8108 0,16% 20

9

207 SEQ ID NO: 8109 0,14% 18

10

1183 SEQ ID NO: 8110 0,14% 18

11

38 SEQ ID NO: 8111 0,09% 12

12

52 SEQ ID NO: 8112 0,09%

12

13

8 SEQ ID NO: 8113 0,06% 8

14

679 SEQ ID NO: 8114 0,06% 8

15

73 SEQ ID NO: 8115 0,05% 6,75

16

1204 SEQ ID NO: 8116 0,05% 6,075

17

50 SEQ ID NO: 8117 0,04% 6

18

774 SEQ ID NO: 8118 0,04% 6

19

845 SEQ ID NO: 8119 0,04% 6

20

214 SEQ ID NO: 8120 0,04% 5,4

HLA A24 -9 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

1596,672

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

1118 SEQ ID NO: 8121 19,84% 316,8

2

51 SEQ ID NO: 8122 18,78% 300

3

161 SEQ ID NO: 8123 18,78% 300

4

434 SEQ ID NO: 8124 18,78% 300

5

365 SEQ ID NO: 8125 13,77% 220

6

736 SEQ ID NO: 8126 12,52% 200

7

620 SEQ ID NO: 8127 7,51% 120

8

1068 SEQ ID NO: 8128 7,51% 120

9

817 SEQ ID NO: 8129 3,75% 60

10

336 SEQ ID NO: 8130 3,44% 55

11

687 SEQ ID NO: 8131 3,13% 50

12

254 SEQ ID NO: 8132 2,34% 37,5

13

627 SEQ ID NO: 8133 1,87% 30

14

950 SEQ ID NO: 8134 1,75% 28

15

28 SEQ ID NO: 8135 1,56% 25

16

408 SEQ ID NO: 8136 1,56% 25

17

159 SEQ ID NO: 8137 1,31% 21

18

1166 SEQ ID NO: 8138 1,26% 20,16

19

45 SEQ ID NO: 8139 1,25% 20

20

185 SEQ ID NO: 8140 1,25%

20

HLA A24 -10 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

1596.672

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

438 SEQ ID NO: 8141 27,55% 440

2

489 SEQ ID NO: 8142 22,54% 360

3

254 SEQ ID NO: 8143 18,78% 300

4

354 SEQ ID NO: 8144 11,27% 180

5

406 SEQ ID NO: 8145 11,27% 180

6

1047 SEQ ID NO: 8146 11,27% 180

7

473 SEQ ID NO: 8147 7,51% 120

8

350 SEQ ID NO: 8148 6,26% 100

9

769 SEQ ID NO: 8149 6,26% 100

10

193 SEQ ID NO: 8150 5,63% 90

11

479 SEQ ID NO: 8151 3,13% 50

12

0 SEQ ID NO: 8152 2,70% 43,2

13

813 SEQ ID NO: 8153 1,87% 30

HLA A24 -10 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

1596.672

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

14

739 SEQ ID NO: 8154 1,50% 24

15

782 SEQ ID NO: 8155 1,50% 24

16

1186 SEQ ID NO: 8156 1,31% 21

17

910 SEQ ID NO: 8157 1,05% 16,8

18

128 SEQ ID NO: 8158 0,93% 15

19

183 SEQ ID NO: 8159 0,93% 15

20

1069 SEQ ID NO: 8160 0,93% 15

HLA A 0201 -9 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

3925227,1

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

1041 SEQ ID NO: 8161 0,01% 484,2379773

2

981 SEQ ID NO: 8162 0,00% 382,536

3

957 SEQ ID NO: 8163 0,00% 342,4606344

4

896 SEQ ID NO: 8164 0,00% 232,6931712

5

1173 SEQ ID NO: 8165 0,00% 201,447432

6

733 SEQ ID NO: 8166 0,00% 171,86796

7

410 SEQ ID NO: 8167 0,00% 135,45252

8

786 SEQ ID NO: 8168 0,00% 119,463012

9

150 SEQ ID NO: 8169 0,00% 102,17550222

10

1 SEQ ID NO: 8170 0,00% 94,98737754

11

595 SEQ ID NO: 8171 0,00% 93,239424

12

1095 SEQ ID NO: 8172 0,00% 89,41779

13

1166 SEQ ID NO: 8173 0,00% 87,58584

14

845 SEQ ID NO: 8174 0,00% 79,642008

15

734 SEQ ID NO: 8175 0,00% 73,47672

16

802 SEQ ID NO: 8176 0,00% 71,872056

17

1213 SEQ ID NO: 8177 0,00% 71,872056

18

105 SEQ ID NO: 8178 0,00% 50,232

19

939 SEQ ID NO: 8179 0,00% 49,13352

20

130 SEQ ID NO: 8180 0,00% 48,732354

HLA A 0201 -10 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

3925227,1

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

372 SEQ ID NO: 8181 0,04% 1896,33528

2

410 SEQ ID NO: 8182 0,02% 1134,00849744

3

162 SEQ ID NO: 8183 0,01% 685,3897512

4

1076 SEQ ID NO: 8184 0,01% 640,90320525

5

1196 SEQ ID NO: 8185 0,01% 623,742666372

6

353 SEQ ID NO: 8186 0,01% 446,7384576

7

50 SEQ ID NO: 8187 0,00% 375,97824

8

733 SEQ ID NO: 8188 0,00% 271,863864

9

130 SEQ ID NO: 8189 0,00% 235,6873848

10

415 SEQ ID NO: 8190 0,00% 185,679

11

297 SEQ ID NO: 8191 0,00% 177,496704

12

1 SEQ ID NO: 8192 0,00% 152,42160582

13

56 SEQ ID NO: 8193 0,00% 110,013876

14

732 SEQ ID NO: 8194 0,00% 101,0988

15

6 SEQ ID NO: 8195 0,00% 98,26704

16

261 SEQ ID NO: 8196 0,00% 91,60164

17

1040 SEQ ID NO: 8197 0,00% 76,98537

18

928 SEQ ID NO: 8198 0,00% 71,2908

19

1188 SEQ ID NO: 8199 0,00% 69,81282

20

1094 SEQ ID NO: 8200 0,00% 52,5987

HLA A 1101 -9 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

36

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

402 SEQ ID NO: 8201 25% 9

2

902 SEQ ID NO: 8202 22,5% 8,1

3

288 SEQ ID NO: 8203 11,11% 4

4

85 SEQ ID NO: 8204 6,66% 2,4

5

706 SEQ ID NO: 8205 6,66% 2,4

6

456 SEQ ID NO: 8206 5,55% 2

7

920 SEQ ID NO: 8207 5,55% 2

8

535 SEQ ID NO: 8208 5% 1,8

9

364 SEQ ID NO: 8209 3,33% 1,2

10

438 SEQ ID NO: 8210 3,33% 1,2

11

798 SEQ ID NO: 8211 3,33% 1,2

12

808 SEQ ID NO: 8212 3,33% 1,2

13

937 SEQ ID NO: 8213 3,33% 1,2

14

956 SEQ ID NO: 8214 3,33% 1,2

15

557 SEQ ID NO: 8215 2,77% 1

16

1218 SEQ ID NO: 8216 2,77% 1

17

784 SEQ ID NO: 8217 2,5% 0,9

18

249 SEQ ID NO: 8218 2,22% 0,8

19

768 SEQ ID NO: 8219 2,22% 0,8

20

1178 SEQ ID NO: 8220 2,22% 0,8

HLA A 1101 -10 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

36

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

38 SEQ ID NO: 8221 13,33% 4,8

2

807 SEQ ID NO: 8222 12,5% 4,5

3

100 SEQ ID NO: 8223 11,11% 4

4

380 SEQ ID NO: 8224 11,11%

4

5

767 SEQ ID NO: 8225 10% 3,6

6

533 SEQ ID NO: 8226 8,33% 3

7

967 SEQ ID NO: 8227 6,66% 2,4

8

919 SEQ ID NO: 8228 5,55% 2

9

305 SEQ ID NO: 8229 5% 1,8

10

211 SEQ ID NO: 8230 3,33% 1,2

11

511 SEQ ID NO: 8231 3,33% 1,2

12

1177 SEQ ID NO: 8232 3,33% 1,2

13

429 SEQ ID NO: 8233 2,77% 1

14

758 SEQ ID NO: 8234 2,77% 1

15

797 SEQ ID NO: 8235 2,5% 0,9

16

255 SEQ ID NO: 8236 2,22% 0,8

17

986 SEQ ID NO: 8237 2,22% 0,8

18

1157 SEQ ID NO: 8238 2,22% 0,8

19

170 SEQ ID NO: 8239 1,66% 0,6

20

893 SEQ ID NO: 8240 1,66% 0,6

HLA B7 -9 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

5400

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

200 SEQ ID NO: 8241 1,48% 80

2

1243 SEQ ID NO: 8242 1,48% 80

3

123 SEQ ID NO: 8243 0,74% 40

4

248 SEQ ID NO: 8244 0,66% 36

5

1036 SEQ ID NO: 8245 0,66% 36

6

494 SEQ ID NO: 8246 0,37% 20

7

495 SEQ ID NO: 8247 0,37% 20

HLA B7 -9 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

5400

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

8

523 SEQ ID NO: 8248 0,37% 20

9

842 SEQ ID NO: 8249 0,37% 20

10

932 SEQ ID NO: 8250 0,37% 20

11

274 SEQ ID NO: 8251 0,33% 18

12

588 SEQ ID NO: 8252 0,22%

12

13

656 SEQ ID NO: 8253 0,22% 12

14

657 SEQ ID NO: 8254 0,22% 12

15

767 SEQ ID NO: 8255 0,22% 12

16

911 SEQ ID NO: 8256 0,22% 12

17

939 SEQ ID NO: 8257 0,22% 12

18

1007 SEQ ID NO: 8258 0,22% 12

19

1170 SEQ ID NO: 8259 0,22% 12

20

1206 SEQ ID NO: 8260 0,22% 12

HLA B7 -10 meros

Puntuación máxima posible utilizando este tipo de molécula

5400

Clasificación

Posición de partida Secuencia % de puntuación máxima Puntuación

1

505 SEQ ID NO: 8261 4,44% 240

2

312 SEQ ID NO: 8262 3,70% 200

3

141 SEQ ID NO: 8263 1,11% 60

4

1006 SEQ ID NO: 8264 0,66% 36

5

411 SEQ ID NO: 3265 0,44% 24

6

122 SEQ ID NO: 8266 0,37% 20

7

134 SEQ ID NO: 8267 0,37% 20

8

184 SEQ ID NO: 8268 0,37% 20

9

367 SEQ ID NO: 8269 0,37% 20

10

402 SEQ ID NO: 8270 0,37% 20

11

494 SEQ ID NO: 8271 0,37% 20

12

560 SEQ ID NO: 8272 0,37% 20

13

626 SEQ ID NO: 8273 0,37% 20

14

931 SEQ ID NO: 8274 0,37% 20

15

956 SEQ ID NO: 8275 0,37% 20

16

1117 SEQ ID NO: 8276 0,37% 20

17

1169 SEQ ID NO: 8277 0,37% 20

18

1196 SEQ ID NO: 8278 0,37% 20

19

247 SEQ ID NO: 8279 0,22% 12

20

273 SEQ ID NO: 8280 0,22% 12

TABLA 26: Secuencias clonadas para la expresión en E. coli

ORF

Longitud ADN, pb Clonación

pET

pGEX

P28

537 NdeI/XhoI

P65

1917 NheI/HindIII

Nsp1A

2495 NheI/XhoI

Nsp1B

2153 NdeI/XhoI

Nsp1C

2612 NdeI/XhoI

Nsp2A

431 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

Nsp2B

426 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

Nsp3

870 NdeI/XhoI

Nsp4

249 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

Nsp5

594 NheI/XhoI

Nsp6

339 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

Nsp7

417 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

Nsp9A

1385 NheI /XhoI

Nsp9B

1409 NdeI/XhoI

Nsp10

1803 Nhel/XhoI

Nsp11

1581 NdeI/XhoI

Nsp12

1038 NdeI/HindIII

Nsp1A3

897 NdeI/XhoI

Proteína espicular (S1)

1946 NdeI/XhoI

Proteína espicular (S2)

1598 NdeI/XhoI

Proteína espicular (S1-S2)

3545 NdeI/XhoI

HR1

287 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

HR2

146 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

ORF30100

525 NdeI/XhoI

ORF4

465 NdeI/XhoI

Envoltura (E)

231 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

Matriz (M)Δ100

366 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

ORF7Δ18

137 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

ORF8

369 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

ORF9

135 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

ORF10

120 NheI/XhoI BamHI/XhoI

ORF11

255 NdeI/XhoI BamHI/XhoI

Nucleocápside (N)

1269 NdeI/EcoRI

ORF12

297 NdeI/EcoRI BamHI/EcoRI

TABLA 29: Clonación, purificación y expresión en E. coli

ORF de SARS CoV

P.M. Kd clonación Expr. purificación como

P28

19,7 + + his sol

P65

70,3 + + his sol

Nsp1A (N-term)

91,6 + + his ins

Nsp1B (core)

80,8 + -

Nsp1C (C-term)

95,3 + -

Nsp2A (N-term)

15,8 + + his ins

Nsp2B (C-term)

15,5 + + his sol

Nsp3

31,9 + +

Nsp4

9,1 + + his sol

Nsp5

21,8 + + his sol

Nsp6

12,4 + + his sol

Nsp9A (N-term)

15,3 + -

Nsp9B (C-term)

51,6 + + his ins

Nsp10

66 -

Nsp11

58 - -

Nsp12

38 -

Nsp13

32,7 + + his ins

Proteína espicular (S1-his)

71,3 + + his ins

Proteína espicular (S2-his)

58,6 + -

Proteína espicular (S1S2-his)

130 + + his ins

HR1

11 + + his ins

HR2

5,4 + + his sol

ORF3 Δ1001

19,1 + -

ORF4

16,9 + + his ins (trímero)

Envoltura (E)

34,3 + + qst ins (IB)

Matriz (M) Δ100

13,3 + + his ins

ORF7Δ182

31 + + gst sol

ORF8

39,5 + gst ins (IB)

ORF9

30,8 + + gst sol

ORF10

30,3 + + gst ins (IB)

ORF11

35,2 + + gst ins (IB)

Nucleocápside (N)

43,6 + + his ins

ORF12

36,7 + + his ins

Tabla 30: Expresión en E. coli, pureza y rendimiento

Proteína

Marcador Pureza (%) Rendimiento (mg/l)

Nsp2A (N-term)

His 95 1,7

Nsp2B (C-term)

His 95 4,1

Nsp4

His 95 12,6

Nsp5

His 95 5,88

Nsp6

His 95 8,1

P28

His 95 1

P65

His 80 0,553

HR2

His 95 11,9

HR1

His 80 2,64

Nsp1A

His 95 0,267

Proteína espicular S1-S2

His 80 0,381

Matriz M

His 85 12,4

ORF7

GST 85 4,9

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS

7188-7189

Secuencias de componente de la figura 25

7194

Aminoácidos 901-1005 de la SEQ ID NO: 6042

7196

Aminoácidos 1144-1196 de la SEQ ID NO: 6042

7197-7199

Regiones del péptido de fusión de membranas

7207-7223

Sitios de N-glicosilación dentro de la SEQ ID NO: 6042

7307-7308

Fragmentos de la SEQ ID NO: 6042

7398-7399

Fragmentos antigénicos de la SEQ ID NO: 6042

9785-9798

Oligonucleótidos utilizados para la expresión en S. cerevisiae

9921-9923

Vectores pCMVKm2

9962

Variante de proteína espicular

<210> 6042

<211> 1255

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 6042

35

<210> 7188 <211> 2712 <212> PRT <213> Coronavirus del SARS <400> 7188

45

55

<210> 7189

<211> 1257 45 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7189

<210> 7193

<211>

102 15 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7193

<210> 7196

<211>

52 25 <212> PRT

45

Ile Asp Arg Leu Ile Thr 100 <210> 7194 <211> 105 <212> PRT <213> Coronavirus del SARS <400> 7194

55

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7196

<210> 7197 45 <211> 19

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7197

<210> 7198

<211> 17

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7198

<210> 7199

<211> 20

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7199

25 <210> 7207

<211> 4

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7207

35

<210> 7208 <211> 4 <212> PRT <213> Coronavirus del SARS

<400> 7208

45

<210> 7209

<211> 4

<212> PRT 55 <213> Coronavirus del SARS

<400> 7209

65 <210> 7210

<211> 4

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7210

<210> 7211

<211> 4

<212>

PRT 15 <213> Coronavirus del SARS

<400> 7211

<210> 7214

<211> 4

<212>

PRT 55 <213> Coronavirus del SARS

25

<210> 7212 <211> 4 <212> PRT <213> Coronavirus del SARS

<400> 7212

35

<210> 7213 <211> 4 <212> PRT <213> Coronavirus del SARS

45

<400> 7213

<400> 7214

<210> 7215

<211> 4

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7215

<210> 7216 15 <211> 4

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7216

25

<210> 7217 <211> 4 <212> PRT <213> Coronavirus del SARS

<400> 7217

35

<210> 7218

<211> 4

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

45 <400> 7218

<210> 7219 55 <211> 4

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7219

<210> 7220

<211> 4

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

15 <400> 7220

<210>

7221 25 <211> 4

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7221

<210> 7223

<211> 4

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7223

<210>

7307 65 <211> 649

35

<210> 7222 <211> 4 <212> PRT <213> Coronavirus del SARS

<400> 7222

45

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7307

<210> 7308 45 <211> 533

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7308

<210> 7398

<211> 16

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 7398

<210> 7399

<211> 15

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

35 <400> 7399

<210> 8041

<211> 9 45 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8041

<210> 8042

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8042

<210> 8043

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8043

15 <210> 8044

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8044

<210> 8045

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8045

<210> 8046

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8046

55 <210> 8047

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8047

<210> 8048

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8048

15 <210> 8049

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8049

<210> 8050

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8050

<210> 8051

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

45 <400> 8051

<210> 8052 55 <211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8052

<210> 8053

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8053

15 <210> 8054

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8054

<210> 8055

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8055

<210> 8056

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

45 <400> 8056

<210> 8057

<211> 9 55 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8057

<210> 8058

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8058

<210> 8059 15 <211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8059

<210> 8060

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8060

<210> 8061

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

45 <400> 8061

<210> 8062

<211>

10 55 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8062

<210> 8063

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8063

<210> 8064

<211>

10 15 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8064

<210> 8065

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8065

<210> 8066

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8066

<210> 8067

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

55 <400> 8067

<210> 8068

<211> 10

<212> PRT 65 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8068

<210> 8069

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8069

<210> 8070

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

25 <400> 8070

<210> 8071

<211>

10 35 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8071

<210> 8072

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8072

<210> 8073

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8073

<210> 8074

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8074

<210> 8075

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8075

<210> 8076

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8076

<210> 8077

<211>

10 45 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8077

<210> 8078

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8078

<210> 8079

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8079

<210> 8080

<211>

10 15 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8080

<210> 8081

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8081

<210> 8082

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

45 <400> 8082

<210> 8083

<211> 9

<212> PRT 55 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8083

65 <210> 8084

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8084

<210> 8085

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8085

<210> 8086

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8086

<210> 8087

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8087

<210> 8088

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8088

<210> 8089

<211> 9 65 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8089

<210> 8090

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

15 <400> 8090

<210> 8091

<211> 9

<212> PRT 25 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8091

<210> 8092 35 <211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8092

<210> 8093

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8093

<210> 8094

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8094

<210> 8095

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8095

<210> 8096

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8096

<210> 8097

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

35 <400> 8097

<210> 8098

<211> 9 45 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8098

55 <210> 8099

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8099

<210> 8100

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8100

<210> 8101

<211> 10 15 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8101

<210> 8102

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8102

<210> 8103

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8103

<210> 8104 55 <211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8104

<210> 8105

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8105

<210> 8106

<211> 10 15 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8106

25 <210> 8107

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8107

<210> 8108

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8108

<210> 8109

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8109

<210> 8110

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8110

<210> 8111

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8111

<210> 8112

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

25 <400> 8112

<210> 8113

<211> 10

<212> PRT 35 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8113

<210> 8114 45 <211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8114

<210> 8115

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8115

<210> 8116

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8116

<210> 8117

<211> 10 15 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8117

<210> 8118

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8118

<210> 8119

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8119

<210> 8120

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

55 <400> 8120

<210> 8121

<211> 9

<212>

PRT 65 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8121

<210> 8122

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8122

<210> 8123

<211> 9

<212>

PRT 25 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8123

35 <210> 8124

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8124

<210> 8125

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8125

<210> 8126

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

65 <400> 8126 <210> 8127

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8127 15

<210> 8128

<211> 9

<212> PRT 25 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8128

<210> 8129 35 <211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8129

<210> 8130

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8130

<210> 8131

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8131

<210> 8132

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8132

<210> 8133

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

25 <400> 8133

<210> 8134

<211> 9 35 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8134

45 <210> 8135

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8135

<210> 8136

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8136

<210> 8137

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8137

<210> 8138

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8138

<210> 8139

<211> 9

<212> PRT 35 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8139

45 <210> 8140

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8140

<210> 8141

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8141

<210> 8142

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8142

<210> 8143

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

25 <400> 8143

<210> 8144

<211> 10

<212> PRT 35 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8144

<210> 8145 45 <211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8145

<210> 8146

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8146

<210> 8147

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8147

<210> 8148

<211> 10 15 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8148

25 <210> 8149

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8149

<210> 8150

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

45 <400> 8150

<210> 8151

<211> 10

<212> PRT 55 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8151

65 <210> 8152

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8152

<210> 8153

<211> 10

<212> PRT 15 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8153

<210> 8154 25 <211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8154

<210> 8155

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8155

<210> 8156

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8156

<210> 8157

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

65 <400> 8157

<210> 8158

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8158

<210> 8159

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8159

<210> 8160

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

35 <400> 8160

<210> 8161

<211> 9

<212> PRT 45 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8161

55 <210> 8162

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8162

<210> 8163

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

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<210> 8164

<211> 9 15 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

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<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

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<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

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<211> 9

<212> PRT 55 <213> Coronavirus del SARS

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<213> Coronavirus del SARS

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<212> PRT 15 <213> Coronavirus del SARS

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<213> Coronavirus del SARS

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<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

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<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

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<213> Coronavirus del SARS

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<211> 9

<212> PRT 15 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8174

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<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

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<213> Coronavirus del SARS

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<213> Coronavirus del SARS

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<212>

PRT 65 <213> Coronavirus del SARS

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<213> Coronavirus del SARS

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<212>

PRT 25 <213> Coronavirus del SARS

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<213> Coronavirus del SARS

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<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

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<213> Coronavirus del SARS

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<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

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<212> PRT

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<210>

8187 45 <211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8187

<210> 8188

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8188

<210> 8189

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8189

<210>

8190 15 <211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8190

<210> 8191

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8191

<210> 8192

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

45 <400> 8192

<210> 8193

<211> 10

<212> PRT 55 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8193

<210> 8194 65 <211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8194

<210> 8195

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

15 <400> 8195

25 <210> 8196

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8196

<210> 8197

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8197

<210> 8198

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

55 <400> 8198

<210> 8199

<211> 10

<212> PRT 65 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8199

<210> 8200

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8200

<210> 8201

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

25 <400> 8201

<210> 8202

<211> 9 35 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8202

<210> 8203

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8203

<210> 8204

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8204

<210> 8205

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8205

<210> 8206

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

25 <400> 8206

<210> 8207

<211> 9 35 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8207

<210> 8208

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8208

<210> 8209

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8209

<210> 8210

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8210

<210> 8211

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8211

<210> 8212 35 <211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8212

<210> 8213

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8213

<210> 8214

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

65 <400> 8214

<210> 8215

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8215

<210> 8216

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

25 <400> 8216

<210> 8217

<211> 9 35 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8217

<210> 8218

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8218

<210> 8219

<211> 9

<212>

PRT 65 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8219

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<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

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<210> 8221

<211> 10

<212>

PRT 25 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8221

35 <210> 8222

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8222

<210> 8223

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8223

<210> 8224

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8224

<210> 8225

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8225

<210> 8226

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8226

<210> 8227 35 <211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8227

<210> 8228

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8228

<210> 8229

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

65 <400> 8229

<210> 8230

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8230

<210> 8231

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

25 <400> 8231

<210> 8232

<211> 10 35 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8232

<210> 8233

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8233

<210> 8234

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8234

<210> 8235

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8235

<210> 8236

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

25 <400> 8236

<210> 8237

<211> 10

<212> PRT 35 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8237

45 <210> 8238

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8238

<210> 8239

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8239

<210> 8240

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8240

<210> 8241

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8241

<210> 8242

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8242

<210> 8243

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

55 <400> 8243

<210>

8244 65 <211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8244

<210> 8245

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8245

<210>

8246 25 <211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8246

<210> 8247

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8247

<210> 8248

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

55 <400> 8248

<210> 8249

<211> 9 65 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8249

<210> 8250

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

15 <400> 8250

<210> 8251

<211> 9 25 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8251

<210> 8252

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8252

<210> 8253

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8253

<210> 8254

<211> 9

<212>

PRT 65 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8254

<210> 8255

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8255

<210> 8256

<211> 9

<212>

PRT 25 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8256

<210> 8257 35 <211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8257

<210> 8258

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8258

<210> 8259

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

65 <400> 8259

<210> 8260

<211> 9

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8260

<210> 8261

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

25 <400> 8261

<210> 8262

<211> 10

<212> PRT 35 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8262

45 <210> 8263

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8263

<210> 8264

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8264

<210> 8265

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

15 <400> 8265

<210> 8266

<211> 10 25 <212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8266

<210> 8267

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8267

<210> 8268

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8268

<210> 8269

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8269

<210> 8270

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8270

<210> 8271

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8271

<210> 8272

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

35 <400> 8272

<210> 8273

<211> 10

<212> PRT 45 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8273

<210>

8274 55 <211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8274

<210> 8275

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8275

<210>

8276 15 <211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8276

<210> 8277

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8277

<210> 8278

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

45 <400> 8278

<210> 8279

<211> 10

<212> PRT 55 <213> Coronavirus del SARS

<400> 8279

65 <210> 8280

<211> 10

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 8280

15

<210> 9785 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 9785 agatcttcta gataaaagaa gtgaccttga ccggt gcacc ac

42

25

<210> 9786 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 9786 agatctccta ggcattcgcc atattgcttc atgaagccag catcagcgag

50

35

<210> 9787 <211> 49 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 9787 agat ct cct a ggtgatatta atgctaggga cctcatttgt gcgcagaag

49

45

<210> 9788 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

55

<400> 9788 agatctgtcg act cat t at g tgtaatgtaa tttgacaccc t t gag <210> 9789 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial 45

<220> <223> Oligonucleótido

65

<400> 9789 tgagcatgtt gatacttctt t at gagt gcga cat t cct at t ggag 44

5

<210> 9790 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido

<400> 9790 ctggcatttg tgctagttac catacagttt ctttattac

39

15

<210> 9791 <211> 58 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido

<400> 9791 gt agt act ag ccaaaaat ct attgtggctt atactatgtc tttaggtgct gat agt t c

58

25

<210> 9792 <211> 52 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido

<400> 9792 aattgaacta tcagcaccta aagacat agt at aagccaca atagattttt gg

52

35

<210> 9793 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido

<400> 9793 ct agt act ac gt aat aaaga aact gt at gg t aact ag

37

45

<210> 9794 <211> 53 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido

55

<400> 9794 cacaaat gcc agctccaata ggaatgtcgc act cat aaga agt at caaca t gc <210> 9795 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial 53

<220> <223> Oligonucleótido

65

<400> 9795 agcttacaaa acaaaat gag t gacct t ga 29

5

<210> 9796 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido

<400> 9796 ccggt caagg t cact cat t t t gt t t t g t a

29

15

<210> 9797 <211> 68 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido

<400> 9797

<210> 9798

<211> 72

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 9798

<210> 9921

<211> 8098 45 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector pCMVKm2 o

<400> 9921

35

<210> 9922 <211> 7918 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Vector pCMVKm2 o <400> 9922

45

55

35

<210> 9923 <211> 4333 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Vector pCMVKm2 o <400> 9923

45

55

<211> 1255

<212> PRT

<213> Coronavirus del SARS

<400> 9962

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Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado o purificado que comprende

   a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido proteína espicular del virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) SEQ ID NO: 6042, o b) una secuencia de aminoácidos con > 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042, o c) un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042; a condición de que el polipéptido no sea MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAP.

2. 2.

   Composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado o purificado que comprende

   a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6042, o b) una secuencia de aminoácidos con > 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042, o c) un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042; y que comprende adicionalmente un adyuvante.

3. 3.

   Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el polipéptido comprende: (a) una secuencia de aminoácidos con > 85% o > 90% o > 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6042.

4. 4.

   Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el polipéptido comprende un fragmento de al menos 25, o al menos 40, o al menos 100 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6042.

5. 5.

   Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido está aislado y purificado a partir del virus del SARS.

6. 6.

   Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido está producido mediante expresión recombinante.

7. 7.

   Composición según la reivindicación 6, en la que el fragmento comprende cualquiera de las secuencias polipeptídicas proporcionadas en las SEQ ID NO: 7197, 7198, 7199 y 8041-8280.

8. 8.

   Composición según la reivindicación 6 en la que el polipéptido es una proteína de fusión.

9. 9.

   Composición según la reivindicación 8, en la que la proteína de fusión comprende uno o más de los siguientes:

   a) el dominio S1 (SEQ ID NO: 7307), b) dominio S2 (SEQ ID NO: 7308), c) la región de unión al receptor del dominio S1, d) las regiones dominio de oligomerización del dominio S2, e) la región cremallera de leucina del dominio S2, f) la región de anclaje a la membrana del dominio S2, g) la región dominio hidrófobo del dominio S2 h) la región cola citoplasmática del dominio S2, y/o i) cualquiera de las secuencias polipeptídicas proporcionadas en las SEQ ID NO: 7193-7194, 7196-7199, 7207-7223, 7398, 7399 y 8041-8280.

10. 10.

    Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que el polipéptido está en forma oligomérica.

11. 11.

    Composición según la reivindicación 10, en la que el oligómero está en forma trimérica.

12. 12.

    Composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, en la que la proteína de fusión comprende

    a) una secuencia marcadora, b) una segunda proteína del virus del SARS, c) una proteína de un virus no SARS, d) una proteína bacteriana y/o e) un adyuvante.

13. 13.

    Composición según la reivindicación 12, en la que la proteína de un virus no SARS se deriva de un coronavirus, virus de la gripe, rinovirus, virus de la parainfluenza (PIV), virus respiratorio sincicial (RSV), adenovirus y/o metapneumovirus.

14. 14.

    Composición según la reivindicación 12, en la que la proteína bacteriana es una proteína de adhesión bacteriana

    o fragmento de la misma, tal como NadA, YadA, UspA2 o una proteína similar a NadA.

15. 15. Composición según la reivindicación 2, o según las reivindicaciones 3-14 cuando dependen de la reivindicación

    2, en la que el adyuvante está seleccionado de entre: sales minerales, emulsiones de aceite, formulaciones de

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    saponina, derivados bacterianos o microbianos, inmunomoduladores humanos, bioadhesivos o mucoadhesivos, micropartículas, liposomas, formulaciones de éter de polietileno y éster de polietileno, PCPP, péptidos muramilo,

    compuestos de imidazoquinolona y/o virosomas o partículas pseudovirales.

16. 16. Composición según la reivindicación 15, en la que el adyuvante es una toxina de ribosilación de ADP bacteriana

    detoxificada, una forma doble mutante no tóxica de toxoides de Bordella pertussis, quitosano, MF59, aluminio, una

    sal de aluminio o un inmunomodulador de molécula pequeña (SMIP).

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