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ES2525368T3 - IL-6 y receptor de IL-6 humanizados - Google Patents

IL-6 y receptor de IL-6 humanizados Download PDF

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ES2525368T3
ES2525368T3 ES12795905.4T ES12795905T ES2525368T3 ES 2525368 T3 ES2525368 T3 ES 2525368T3 ES 12795905 T ES12795905 T ES 12795905T ES 2525368 T3 ES2525368 T3 ES 2525368T3
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ES
Spain
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mouse
human
gene
humanized
mice
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ES12795905.4T
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Inventor
Li-Hsien Wang
Anthony T. Dore
Sean Stevens
Andrew J. Murphy
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Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

Ratón modificado genéticamente que comprende un reemplazo en un locus de IL-6 de ratón endógeno de un gen de ratón que codifica para IL-6 con un gen humano que codifica para IL-6 humana, en el que el gen humano que codifica para IL-6 humana está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos en el locus de IL-6 de ratón endógeno

Description

E12795905
05-12-2014
DESCRIPCIÓN
IL-6 y receptor de IL-6 humanizados
5 Campo de la invención
Se proporcionan animales no humanos que tienen un reemplazo de los genes de IL-6 y/o receptor de IL-6 animales no humanos endógenos. Se reemplazan los genes de IL-6 y/o receptor de IL-6 del animal no humano, en los loci no humanos endógenos, con genes de IL-6 humano y/o de receptor de IL-6 humanizado que comprenden una secuencia humana. Los animales no humanos que tienen genes de IL-6 humano y/o de receptor de IL-6 humanizado, en los que los animales no humanos no presentan una o más patologías que son características de animales no humanos transgénicos para IL-6 humana.
Antecedentes
15 Se conocen en la técnica ratones transgénicos para un gen de IL-6 humano. Sin embargo, la inserción al azar de un transgén de IL-6 humano en el genoma del ratón da como resultado una expresión escasamente regulada de la proteína IL-6 humana, que se manifiesta por sí misma en una variedad de patologías en tales ratones transgénicos, incluyendo, pero sin limitarse a, plasmocitosis y glomerulonefritis. Como resultado, estos ratones tienen una utilidad limitada.
Existe la necesidad de animales no humanos, por ejemplo, ratones y ratas, que expresen IL-6 humana o humanizada y/o receptor de IL-6 humano o humanizado. Existe la necesidad de tales ratones humanizados que no presenten una o más patologías presentadas por ratones hIL-6 transgénicos.
25
Sumario
En un aspecto, la invención proporciona un ratón modificado genéticamente tal como se define en las reivindicaciones.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar un ratón humanizado, siendo dicho método tal como se define en las reivindicaciones.
Se describen en el presente documento animales murinos modificados genéticamente que expresan un gen de
35 receptor de IL-6 humano (o un gen que codifica para un ectodominio humano y dominios transmembrana e intracelulares de ratón) bajo el control del promotor murino endógeno y/o elementos reguladores murinos endógenos, a partir de un locus de receptor de IL-6 murino endógeno.
También se describe en el presente documento que se proporciona un animal modificado genéticamente (por ejemplo, un animal murino, por ejemplo, un ratón o una rata) que expresa una proteína IL-6 humana, en el que el animal no humano no presenta una patología seleccionada de plasmocitosis, glomerulonefritis, glomeruloesclerosis, glomerulonefritis mesangio-proliferativa, linfoma intestinal, linfoma renal, esplenomegalia, agrandamiento de ganglios linfáticos, agrandamiento del hígado, megacariocitos en la médula ósea, células plasmáticas anómalas compactadas, infiltración de células plasmáticas en el pulmón o el hígado o el riñón, proliferación de células
45 mesangiales en el riñón, sobreexpresión cerebral de IL-6, células microgliales ramificadas en la materia blanca, astrocitosis reactiva en el cerebro, insuficiencia renal, megacariocitos elevados en el bazo, atrofia muscular progresiva (por ejemplo, atrofia muscular progresiva de los gemelos), catepsinas musculares B y B+L elevadas (por ejemplo, alrededor de 20 veces y 6 veces), y una combinación de los mismos.
Se describe en el presente documento un animal no humano que comprende una población de células B normales, población de células B normales que puede ser aproximadamente la misma en número e inmunofenotipo que un animal de tipo natural, por ejemplo, un ratón de tipo natural.
El animal no humano descrito en el presente documento puede ser murino (por ejemplo, un ratón o una rata) y
55 puede expresar IL-6 humana (hIL-6) en suero a un nivel por debajo de aproximadamente 800 pg/ml, por debajo de aproximadamente 700, 600, 500, 400, 300 ó 200 pg/ml. En una realización específica, el animal murino expresa hIL-6 en suero a un nivel de aproximadamente 50 a aproximadamente no más de 200 pg/ml, en otra realización aproximadamente 75-125 pg/ml, en otra realización a aproximadamente 100 pg/ml.
También se describen en el presente documento animales no humanos que expresan hIL-6 y/o hIL-6R, en los que los animales no humanos expresan hIL-6 y/o hIL-6R a partir de un locus de IL-6 no humano endógeno y/o un locus de hIL-6R no humano endógeno. El animal no humano es murino (por ejemplo, ratón o rata).
También se describe en el presente documento un ratón modificado genéticamente que expresa hIL-6 a partir de un
65 locus de IL-6 de ratón endógeno, en el que el gen de IL-6 de ratón endógeno se ha reemplazado con un gen de hIL-6.
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También se describe en el presente documento un ratón que comprende una célula que expresa un receptor de IL-6 (IL-6R) que comprende un ectodominio humano sobre la superficie de la célula. La célula puede ser un linfocito, por ejemplo una célula B.
5 Tal como se describe en el presente documento, pueden delecionarse aproximadamente 6,8 kb en el locus de IL-6 de ratón endógeno, incluyendo los exones 1 a 5 y una secuencia no traducida en 3’, y reemplazarse con aproximadamente 4,8 kb de secuencia génica de IL-6 humana que comprende los exones 1 a 5 del gen de IL-6 humano. Un gen de IL-6 humano descrito en el presente documento comprende los exones 1 a 5 del gen de IL-6 humano de BAC CTD-2369M23 humano.
También se describe en el presente documento un ratón modificado genéticamente que expresa IL-6 a partir de un gen de IL-6 humano, en el que el ratón expresa IL-6 humana en su suero.
15 Se describe en el presente documento suero de ratón que presenta una concentración en suero de IL-6 humana de aproximadamente 25 a aproximadamente 300 pg/ml, de 50 a aproximadamente 250 pg/ml, de 75 a aproximadamente 200 pg/ml o de 100 a aproximadamente 150 pg/ml. También se describen niveles de IL-6 humana en el suero del ratón de aproximadamente 100 pg/ml.
También se describen en el presente documento niveles de un marcador panespecífico de células B en médula ósea del ratón a aproximadamente el mismo que el de un ratón de tipo natural. El nivel de un marcador panespecífico de células B en bazo puede ser aproximadamente el mismo que el de un ratón de tipo natural. Los marcadores panespecíficos de células B descritos en el presente documento incluyen los seleccionados de B220, CD19, CD20, CD22, CD79a, CD79b, L26 y Pax-5 (BSAP).
25 Se describe en el presente documento un ratón modificado genéticamente que expresa hIL-6, en el que el ratón no presenta una característica seleccionada de plasmocitosis, esplenomegalia, agrandamiento de ganglios linfáticos, células plasmáticas anómalas compactadas, y una combinación de los mismos.
El ratón descrito en el presente documento puede comprender un bazo que tiene aproximadamente el mismo peso (por peso corporal) que un ratón de tipo natural. Los ganglios linfáticos de este ratón pueden tener aproximadamente el mismo peso (por peso corporal) que un ratón de tipo natural. Las células plasmáticas de este ratón pueden no presentar plasmocitosis característica de ratones que sobreexpresan IL-6 humana.
35 El ratón descrito en el presente documento puede no presentar glomerulonefritis.
El ratón descrito en el presente documento puede no presentar un nivel de células mesangiales comparable a un ratón de tipo natural.
También se describe en el presente documento un ratón modificado genéticamente que expresa hIL-6 a partir de un locus de IL-6 de ratón endógeno, en el que el gen de IL-6 de ratón endógeno se ha reemplazado con un gen de hIL-6, en el que el ratón no presenta una característica seleccionada de una neuropatología detectable morfológicamente, una astrocitosis reactiva, y una combinación de las mismas. El ratón tal como se describe en el presente documento puede comprender un cerebro que es morfológicamente no distinto de un cerebro de ratón de
45 tipo natural. El ratón tal como se describe en el presente documento puede comprender tejido cerebral que presenta un nivel de astrocitosis reactiva que no es superior al de un ratón de tipo natural.
Se describe en el presente documento un ratón que no expresa IL-6 humana en neuronas. Dicho ratón puede comprender niveles de astrocitos activados que son comparables con niveles de astrocitos activados en un ratón de tipo natural.
Se describe en el presente documento un ratón que comprende células microgliales ramificadas en su materia blanca, en el que las células microgliales ramificadas están presentes en una cantidad equivalente a una cantidad de células microgliales ramificadas en un ratón de tipo natural.
55 Se describe en el presente documento un ratón que no presenta una astrocitosis reactiva. La materia blanca de dicho ratón puede ser morfológicamente no distinta de la materia blanca de un ratón de tipo natural. La materia blanca de dicho ratón puede ser histológicamente no distinta de la materia blanca de un ratón de tipo natural con respecto a la tinción histoquímica de astrocitos reactivos.
Se describe en el presente documento un ratón que comprende un cerebro que es morfológicamente no distinto del cerebro de un ratón de tipo natural. El ratón descrito puede comprender tejido cerebral que presenta un nivel de astrocitosis reactiva que no es superior al de un ratón de tipo natural.
65 Se describe en el presente documento un ratón modificado genéticamente que expresa hIL-6 a partir de un locus de IL-6 de ratón endógeno, en el que el gen de IL-6 de ratón endógeno se ha reemplazado con un gen de hIL-6, en el
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que el ratón no presenta una característica seleccionada de una vida acortada en aproximadamente el 50% o más, insuficiencia renal, hipergammaglobulinemia, megacariocitos elevados en el bazo, megacariocitos elevados en la médula ósea, plasmocitosis de bazo, plasmocitosis de timo, plasmocitosis de ganglios linfáticos, glomerulonefritis, glomeruloesclerosis, y una combinación de los mismos.
5 Los ratones descritos en el presente documento pueden tener una vida que supera las 20 semanas. En una realización, los ratones tienen una vida que supera las 30 semanas, 40 semanas o 50 semanas. Los ratones descritos en el presente documento pueden presentar una vida aproximadamente igual a la de un ratón de tipo natural de la misma variedad.
Se describen en el presente documento ratones que presentan un nivel de megacariocitos en el bazo que no es mayor que aproximadamente el nivel de megacariocitos esplénicos de un ratón de tipo natural
Se describen en el presente documento ratones que comprenden órganos linfoides que están desprovistos 15 esencialmente de células plasmocitoides anómalas y dispuestas de manera compacta.
Se describen en el presente documento ratones que presentan niveles en suero de gammaglobulina equivalentes a niveles en suero de gammaglobulina en ratones de tipo natural. Los niveles de α1-y β-globulina en suero de los ratones descritos en el presente documento pueden ser equivalentes a los niveles en suero de α1-y β-globulina de ratones de tipo natural de la misma variedad.
Se describe en el presente documento un ratón modificado genéticamente que expresa IL-6 humana a partir de un locus de IL-6 de ratón endógeno, en el que el gen de IL-6 de ratón endógeno se ha reemplazado con un gen de hIL-6, en el que el ratón no presenta una característica seleccionada de atrofia muscular progresiva, un nivel de
25 catepsina B elevado en comparación con un ratón de tipo natural de la misma variedad, un nivel de catepsina A+B elevado en comparación con un ratón de tipo natural de la misma variedad, un aumento del peso del hígado en comparación con un ratón de tipo natural de la misma variedad, y una combinación de los mismos.
Tal como se describe en el presente documento, el peso del hígado del ratón puede ser de aproximadamente 800900 mg a las 12 semanas.
Se describe en el presente documento un ratón que presenta un nivel de catepsina B a lo largo de toda su vida que no es mayor que aproximadamente el nivel observado en un ratón de tipo natural. Tal como se describe en el presente documento, el ratón presenta un nivel de catepsina A+B a lo largo de toda su vida que no es mayor que
35 aproximadamente el nivel observado en un ratón de tipo natural.
Se describe en el presente documento un ratón que como adulto presenta un peso de los músculos gemelos que está dentro de aproximadamente el 10% del peso de un ratón de tipo natural de la misma variedad. Dicho ratón como adulto puede presentar un peso de los músculos gemelos que es aproximadamente el mismo que el de un ratón de tipo natural.
Se describe en el presente documento un ratón que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína IL-6 humana, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína IL-6 humana reemplaza en su totalidad o en parte una secuencia de nucleótidos endógena que codifica para una proteína IL-6 de ratón
45 endógena.
Se describe en el presente documento un ratón que comprende un reemplazo en un locus de receptor de IL-6 de ratón endógeno de ectodominio de IL-6Rα de ratón con una secuencia de ectodominio de un IL-6Rα humano para formar un gen de IL-6Rα de ser humano/ratón quimérico.
Se describe en el presente documento un gen de IL-6Rα quimérico que está bajo el control de un promotor de ratón y/o elementos reguladores de ratón en el locus de IL-6Rα de ratón endógeno.
Se describe en el presente documento el reemplazo de aproximadamente 35,4 kb de una secuencia que codifica
55 para ectodominio de IL-6Rα de ratón con aproximadamente 45,5 kb de una secuencia que codifica para ectodominio de IL-6R humano.
Se describe en el presente documento una secuencia que codifica para ectodominio de IL-6R humano que abarca el primer codón (ATG) en del exón 1 al exón 8.
Se describe en el presente documento una secuencia de IL-6Rα de ratón colocada que incluye una secuencia contigua que abarca los exones 1 a 8. En una realización específica, se delecionan los exones 1 a 8 y una parte del intrón 8.
65 Se describe en el presente documento un ratón modificado genéticamente que comprende un reemplazo en un
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locus de IL-6 de ratón endógeno de un gen de ratón que codifica para IL-6 con un gen humano que codifica para IL-6 humana, en el que el gen humano que codifica para IL-6 humana está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos en el locus de IL-6 de ratón endógeno.
5 Se describe en el presente documento un gen humano que codifica para IL-6 humana que es un gen de IL-6 humano de BAC ID CTD-2369M23.
Se describe en el presente documento un ratón que expresa un IL-6Rα de ratón. Este ratón puede expresar un IL-6Rα humano. Se describe en el presente documento un IL-6Rα humanizado que comprende un ectodominio humano. También se describe un IL-6Rα humanizado que comprende un dominio transmembrana de ratón y un dominio citoplasmático de ratón. También se describe un ratón que expresa un IL-6Rα humanizado que comprende una humanización de ectodominio pero no dominio transmembrana y/o citosólico.
Se describe en el presente documento un ratón que no presenta una característica seleccionada de plasmocitosis,
15 glomeruloesclerosis, glomerulonefritis, insuficiencia renal, hipergammaglobulinemia, megacariocitos elevados en el bazo, megacariocitos elevados en la médula ósea, esplenomegalia, agrandamiento de ganglios linfáticos, células plasmáticas anómalas compactadas, y una combinación de los mismos.
Se describe en el presente documento un ratón modificado genéticamente que comprende una humanización de un gen de IL-6Rα de ratón endógeno, en el que la humanización comprende un reemplazo de una secuencia que codifica para ectodominio de IL-6Rα de ratón con una secuencia que codifica para ectodominio de IL-6Rα humano en el locus de IL-6Rα de ratón endógeno.
Se describe en el presente documento una secuencia de ratón contigua que comprende los exones de ratón 1 a 8
25 que se reemplaza con un fragmento genómico contiguo de una secuencia de IL-6Rα humana que codifica para un ectodominio de IL-6Rα humano. Se describe en el presente documento un fragmento genómico contiguo de una secuencia de IL-6Rα humana que codifica para el ectodominio de BAC CTD-2192J23.
Se describe en el presente documento un ratón que comprende además un gen de IL-6 humanizado. Se describe en el presente documento un ratón que comprende un reemplazo en un locus de IL-6 de ratón endógeno de un gen de IL-6 de ratón con un gen de IL-6 humano. También se describe un gen de IL-6 humanizado bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos.
Se describe en el presente documento un método para preparar un ratón humanizado, que comprende reemplazar 35 una secuencia génica de ratón que codifica para IL-6 de ratón con un gen humano que codifica para IL-6 humana.
Tal como se describe en el presente documento, el reemplazo puede ser en un locus de IL-6 de ratón endógeno, y el gen humano que codifica para IL-6 humana puede estar unido operativamente a secuencias reguladoras de ratón endógenas.
Se describe en el presente documento un método para preparar un ratón humanizado que comprende reemplazar exones de ratón que codifican para secuencias de ectodominio de IL-6Rα de ratón con un fragmento genómico humano que codifica para secuencias de ectodominio de IL-6Rα humano para formar un gen de IL-6Rα humanizado.
45 Tal como se describe en el presente documento, el reemplazo puede ser en un locus de IL-6Rα de ratón endógeno, y el gen de IL-6Rα humanizado puede estar unido operativamente a secuencias reguladoras de ratón endógenas.
Se describe en el presente documento un ratón modificado genéticamente, que comprende un gen de IL-6Rα humanizado que comprende un reemplazo de una secuencia que codifica para ectodominio de ratón con una secuencia de ectodominio humano, en el que el gen de IL-6Rα humanizado comprende una secuencia transmembrana de ratón y una secuencia citoplasmática de ratón; en el que el ratón comprende además un gen que codifica para una IL-6 humana, en el que el gen que codifica para una IL-6 humana está bajo el control de elementos reguladores de IL-6 de ratón endógenos.
55 Tal como se describe en el presente documento, el ratón puede ser incapaz de expresar un IL-6Rα completamente de ratón e incapaz de expresar una IL-6 de ratón.
Se describen en el presente documento ratones modificados genéticamente que comprenden modificaciones genéticas en su línea germinal.
Tal como se describe en el presente documento, se proporciona un tejido, una célula o un fragmento de membrana de un ratón.
65 Se describe en el presente documento un tejido o una célula de un ratón que expresa una proteína IL-6 humana,
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pero que no expresa una proteína IL-6 de ratón. En una realización, el tejido o la célula es de un ratón que expresa una proteína IL-6Rα humanizada, pero no una proteína IL-6Rα de ratón. En una realización, la proteína IL-6Rα humanizada comprende un ectodominio humano y un dominio transmembrana de ratón y un dominio citosólico de ratón. En una realización, el tejido o la célula es de un ratón que expresa una IL-6 humana, un IL-6Rα humanizado y
5 que no expresa una IL-6 de ratón y no expresa un IL-6Rα que comprende un ectodominio de ratón.
También se describe en el presente documento un complejo ex vivo de una célula de ratón que porta un IL-6Rα humanizado (ectodominio humano y dominio transmembrana de ratón y citoplasmático de ratón) y una IL-6 humana.
10 También se describe en el presente documento un embrión de ratón que comprende una modificación genética tal como se describe en el presente documento.
Se describe en el presente documento un embrión huésped de ratón que comprende una célula donadora que comprende una modificación genética tal como se describe en el presente documento.
15 Se describe en el presente documento una célula de animal no humano pluripotente o totipotente que comprende una modificación genética tal como se describe en el presente documento, en la que la célula puede ser una célula murina o una célula ES.
20 Se describe en el presente documento un óvulo de ratón, en el que el óvulo de ratón comprende un cromosoma de ratón ectópico, en el que el cromosoma de ratón ectópico comprende una modificación genética tal como se describe en el presente documento.
Se describe en el presente documento un ratón, un embrión, un óvulo o una célula que está modificado
25 genéticamente para comprender un gen de IL-6 humano o gen de IL-6Rα humano o humanizado que es de un ratón que es de una variedad C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/OIa. Se describe en el presente documento un ratón que es una variedad 129 seleccionada del grupo que consiste en una variedad que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH,
30 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véase, por ejemplo, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, véase también, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). Se describe en el presente documento un ratón modificado genéticamente que es una mezcla de una variedad 129 mencionada anteriormente y una variedad C57BL/6 mencionada anteriormente. También se describe en el presente documento
35 un ratón que es una mezcla de las variedades 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las variedades BL/6 mencionadas anteriormente. También se describe en el presente documento un ratón en el que la variedad 129 de la mezcla es una variedad 129S6 (129/SvEvTac). También se describe en el presente documento un ratón que es una variedad BALB, por ejemplo, una variedad BALB/c. También se describe en el presente documento un ratón que es una mezcla de una variedad BALB y otra variedad mencionada anteriormente. Se describe en el presente
40 documento un ratón que es un ratón Swiss o Swiss Webster.
Cada uno de los aspectos y las realizaciones descritos en el presente documento pueden usarse juntos, a menos que se excluya o bien explícitamente o bien claramente del contexto de la realización o el aspecto.
45 Breve descripción de los dibujos
La figura 1 proporciona una ilustración, no a escala, de los loci genómicos de IL-6 humana (parte superior) y de ratón (parte inferior). Los exones I, II, III, IV y V (tanto en ser humano como en ratón) se indican mediante recuadros cerrados a la derecha de la figura. Se indican supuestas regiones reguladoras seleccionadas mediante recuadros
50 abiertos a la izquierda de la figura.
La figura 2 muestra la respuesta de fase aguda (nivel de mSAA) en presencia o ausencia de trementina en ratones de tipo natural, ratones con IL-6R de ectodominio humanizado y ratones con genes de IL-6 e IL-6R humanizados.
55 La figura 3 muestra la respuesta de fase aguda dependiente de trementina (SAA) en ratones de tipo natural en ausencia o presencia de anticuerpo anti-IL-6R de ratón (izquierda); y la respuesta de fase aguda dependiente de trementina en ratones con IL-6/IL-6R humanizado en ausencia o presencia de anticuerpo anti-IL-6R humano (derecha).
60 La figura 4 muestra el análisis de FACS para células B esplénicas de ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural; panmarcador de células B.
La figura 5 muestra el análisis de FACS para células T esplénicas de ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural; células T auxiliares y células T citotóxicas.
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La figura 6 muestra el análisis de FACS para células esplénicas de ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural; Ly6G/C(Gr1).
La figura 7 muestra el análisis de FACS para células esplénicas de ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural; 5 células NK y granulocitos (Ly6Ghi+/CD11bhi+).
La figura 8 muestra el análisis de FACS para células B sanguíneas de ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural; panmarcador de células B.
La figura 9 muestra el análisis de FACS para células T sanguíneas de ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural; células T auxiliares y células T citotóxicas.
La figura 10 muestra el análisis de FACS para células mieloides sanguíneas de ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural; células Gr1+.
15 La figura 11 muestra el análisis de FACS para células mieloides sanguíneas de ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural; CD11b frente a Ly6G/C(Gr1).
La figura 12 muestra el análisis de FACS para células mieloides sanguíneas de ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural; células DX5 frente a CD11b.
La figura 13 muestra el análisis de FACS de IgM/CD24/B220 de médula ósea para ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural. Parte superior: progresión normal en médula ósea. Parte inferior: análisis de FACS para tipo natural, heterocigotos para hIL-6 y homocigotos para hIL-6 (tinción de IgM).
25 La figura 14 muestra el análisis de FACS de IgM/CD24/B220 de médula ósea para ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural. Parte superior: progresión normal en médula ósea. Parte inferior: análisis de FACS para tipo natural, heterocigotos para hIL-6 y homocigotos para hIL-6 (tinción de CD24).
La figura 15 muestra el análisis de FACS de CD43 y B220 de médula ósea para ratones con IL-6 humanizada y de tipo natural. Parte superior: progresión normal en médula ósea. Parte inferior: análisis de FACS para tipo natural, heterocigotos para hIL-6 y homocigotos para hIL-6 (tinción de CD43).
Descripción detallada
35 IL-6 e IL-6R
El receptor de IL-6 (IL-6R) se caracterizó hace tiempo como un receptor para un factor estimulador de células B (BSF-2 o factor estimulador de células B 2; también, BCDF o factor de diferenciación de células B) responsable de la inducción de células B para que sinteticen inmunoglobulina (Yamasaki et al. (1988) Cloning and Expression of the Human Interleukin-6(BSF-2/IFNβ 2) Receptor, Science 241: 825-828). La IL-6 se describió por primera vez como interferón-β2 como resultado de su descubrimiento durante una búsqueda de una proteína inducida por virus denominada interferón-β, tratando fibroblastos humanos con ARNbc poli(I)poli(C) para inducir una respuesta antiviral (Weissenbach et al. (1980) Two interferon mRNAs in human fibroblasts: In vitro translation and Escherichia coli
45 cloning studies, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77 (12): 7152-7156; Keller et al. (1996) Molecular and Cellular Biology of Interleukin-6 and Its Receptor, Frontiers in Bioscience 1: d340-357).
El ADNc humano codifica para una proteína de 468 aminoácidos que tiene una secuencia señal de 19 meros y un dominio citoplasmático de aproximadamente 82 aminoácidos que carece de un dominio tirosina cinasa (véase, ídem). El extremo N-terminal (ectodominio) de la proteína tiene un dominio de superfamilia de Ig de aproximadamente 90 aminoácidos, un dominio de 250 aminoácidos entre el dominio de superfamilia de Ig y la membrana, un dominio que abarca la membrana de aproximadamente 28 aminoácidos (véase, ídem). El ectodominio del receptor se une a su ligando IL-6, que desencadena la asociación con gp130 en la membrana y es este complejo el que realiza la transducción de señales; el dominio citoplasmático no transduce según se notifica
55 ninguna señal (Taga et al. (1989) Interleukin-6 Triggers the Association of Its Receptor with a Possible Signal Transducer, gp130, Cell 58: 573-581). De hecho, una forma soluble de IL-6R que carece de un dominio citoplasmático puede asociarse con IL-6 y unirse a gp130 sobre la superficie de una célula y transducir de manera eficaz la señal (ídem).
La homología de hIL-6R y mIL-6R al nivel de proteína es de sólo aproximadamente el 54%; el dominio transmembrana tiene una homología de aproximadamente el 79%, mientras que el dominio citoplasmático tiene una homología de aproximadamente el 54% (Sugito et al. (1990)).
El ligando natural para el IL-6R, IL-6, se aisló por primera vez de cultivos de células T transformadas con VLTH-1
65 (véase, Hirano et al. (1985) Purification to homogeneity and characterization of human B cell differentiation factor (BCDF or BSFp-2), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5490-5494). Se clonó un ADNc humano para el gen de IL-6 al
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menos dos veces, una vez como BSF-2 (véase, Hirano et al. (1086) Complementary DNA from a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin, Nature 324: 73-76) y una vez como IFNβ 2 (véase, Zilberstein et al. (1986) Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines, EMBO 5: 2529-2537), aunque se ha demostrado desde entonces
5 que la IL-6 humana recombinante no presenta actividad de IFN detectable.
La IL-6 humana es una proteína de 184 aminoácidos que presenta una homología de sólo aproximadamente el 42% con IL-6 de ratón, aunque la organización genómica de los genes humano y de ratón es básicamente la misma, y las regiones promotoras de los genes humano y de ratón comparten un tramo de 400 pb que está altamente conservado
10 (véase, Tanabe et al. (1988) Genomic Structure of the Murine IL-6 Gene: High Degree Conservation of Potential Regulatory Sequences between Mouse and Human, J. Immunol. 141 (11): 3875-3881).
El gen de IL-6 humano tiene aproximadamente 5 kb (Yasukawa et al. (1987) Structure and expression of human B cell stimulatory factor-2 (BSC-2/IL-6) gene, EMBO J. 6 (10): 2939-2945), mientras que el gen de IL-6 de ratón tiene 15 aproximadamente 7 kb (Tanabe et al. (1988) Genomic Structure of the Murine IL-6 Gene: High Degree Conservation of Potential Regulatory Sequences between Mouse and Human, J. Immunol. 141 (11): 3875-3881). Los genes de IL-6 humano y de ratón comparten según se notifica una secuencia flanqueante en 5’ altamente conservada importante para la regulación. Se muestra un diagrama esquemático de los loci genómicos de IL-6 humano y de ratón en la figura 1 (no a escala). Los exones I, II, III, IV y V (tanto en ser humano como en ratón) se indican 20 mediante recuadros cerrados a la derecha de la figura. Se indican supuestas regiones reguladoras seleccionadas mediante recuadros abiertos a la izquierda de la figura. Las supuestas regiones reguladoras para seres humanos son, de izquierda a derecha, un elemento de glucocorticoide desde -557 hasta -552; una secuencia de núcleo potenciador de IFN desde -472 hasta -468; un elemento de glucocorticoide desde -466 hasta -461; una región rica en AT desde -395 hasta -334, un sitio de unión a AP-1 consenso desde -383 hasta -277; una secuencia de núcleo 25 potenciador de IFN desde -253 hasta -248; un motivo que contiene GGAAA desde -205 hasta -192; una secuencia de homología a SRE de c-fos desde -169 hasta -82 que contiene una secuencia de núcleo potenciador de IFN, un elemento de respuesta a AMPc, un motivo de GGAAA, una caja CCAAT y una región rica en GC; y un sitio de unión a AP-1 desde -61 hasta -55; y una caja CCAAT desde -34 hasta -30. Las supuestas regiones reguladoras para ratón son, de izquierda a derecha, una región rica en GC desde -553 hasta -536, un elemento de glucocorticoide desde 30 -521 hasta -516 y desde -500 hasta -495; un tramo de ADN-Z desde -447 hasta -396; un sitio de unión a AP-1 que se solapa con una secuencia de núcleo potenciador de IFN desde -277 hasta -288, un motivo GGAAA que se solapa con una secuencia de núcleo potenciador de IFN desde -210 hasta -195; una región de homología a SRE de c-fos desde -171 hasta -82 que contiene un elemento de respuesta a AMPc, un motivo GGAAA que se solapa con una secuencia de núcleo potenciador de IFN y una región rica en GC; y un sitio de unión a AP-1 desde -61 hasta -55.
35 Los codones de ratón I-V tienen longitudes de 19, 185, 114, 150 y 165, respectivamente. Las longitudes de intrones de ratón son: I-II, 162 pb; II-III, 1253 pb; III-IV, 2981 pb; IV-V, 1281 pb. Los codones humanos I-V tienen longitudes de 19, 191, 114, 147 y 165. Las longitudes de intrones humanos son I-II, 154; II-III, 1047; III-IV, 706; IV-V, 1737. Los datos de la organización genómica son de Tanabe et al. (1988) y Yasukawa et al. (1987) Structure and expression of human B cell stimulatory factor-2 (BSF-2/IL-6) gene, EMBO J. 9 (10): 2939-2945.
40 Podría ser razonable suponer que los genes de IL-6 humano y de ratón parecen estar regulados de manera similar basándose en la similitud de su secuencia flanqueante en 5’. Una variedad de tipos de células presentan expresión de IL-6 potenciada en respuesta a IL-1, TNF, PDGF, IFNβ, suero, poli(I)poli(C) y cicloheximida (véase, Tanabe et al. (1988). La IL-6 en seres humanos media en la respuesta de fase aguda, hematopoyesis, diferenciación de células B,
45 activación, crecimiento y/o diferenciación de células T y/o activación de una variedad de tipos de células (por ejemplo, hepatocitos, fibroblastos, células endoteliales, neuronas, células hipofisarias, linfomas, mielomas, carcinomas de mama, células NK, macrófagos, osteoclastos, etc.) (revisado en, por ejemplo, Heinrich et al. (1990), Kishimoto et al. (1989) y Keller et al. (1996); Sugita et al. (1990) Functional Murine Interleukin Receptor with Intracisternal A Particle Gene Product at its Cytoplasmic Domain, J. Exp. Med. 171: 2001-2009).
50 Sin embargo, en la práctica, los ratones transgénicos para IL-6 humana presentan una colección de patologías sustanciales y debilitantes, reflejando una pleiotropía significativa del gen de IL-6. Los ratones transgénicos que comprenden un fragmento de 6,6 kb que contiene el gen de IL-6 humano y un potenciador µ (Eµ) producen altas concentraciones de hIL-6 y niveles de IgG1 extremadamente altos (de 120 a 400 veces por encima de ratones de
55 tipo natural), reflejando una desregulación de IL-6 que va acompañada por plasmocitosis, glomerulonefritis mesangio-proliferativa y altos niveles de megacariocitos en la médula ósea (Suematsu et al. (1989) IgG1 plasmacytosis in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 7547-7551). La regulación aberrante de IL-6 y/o IL-6R está asociada con mielomas, plastocitomas, artritis reumatoide, enfermedad de Castleman, glomerulonefritis proliferativa mesangial, mixoma cardiaco, neoplasias de células plasmáticas, psoriasis y otros
60 trastornos (véase, Kishimoto, T. (1989) The Biology of Interleukin-6, Blood 74 (1): 1-10; Sugita et al. (1990); también, Hirano et al. (1990) Biological and clinical aspects of interleukin 6, Immunology Today 11 (12): 443-449)). La IL-6 también está implicada en el sostenimiento de los niveles de andrógenos intraprostáticos durante el tratamiento de privación de andrógenos de pacientes con cáncer de próstata mediante un mecanismo paracrino y/o autocrino, proporcionando posiblemente un crecimiento de tumor de próstata resistente a la castración (Chun et al. (2009)
65 Interleukin-6 Regulates Androgen Synthesis in Prostate Cancer Cells, Clin. Cancer Res. 15: 4815-4822).
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La proteína humana se codifica como una proteína de 212 aminoácidos, en forma madura una proteína de 184 aminoácidos tras la escisión de una secuencia señal de 28 aminoácidos. Contiene dos sitios de N-glucosilación y dos de O-glucosilación, y la IL-6 humana está fosforilada en algunas células. La proteína de ratón se codifica como una proteína de 211 aminoácidos, en forma madura una proteína de 187 aminoácidos tras la escisión de una
5 secuencia señal de 23 aminoácidos. Están presentes sitios de O-glucosilación, pero no sitios de N-glucosilación (véanse revisiones sobre IL-6, por ejemplo, Heinrich et al. (1990) Interleukin-6 and the acute phase response, Biochem. J. 265: 621-636.).
La función de IL-6 es pleiotrópica. El receptor de IL-6 se encuentra sobre células B activadas pero según se notifica no sobre células B en reposo. En cambio, la IL-6R se encuentra sobre células T en reposo y según se notifica puede promover la diferenciación, activación y proliferación de células T, incluyendo la diferenciación de células T en linfocitos T citotóxicos en presencia de IL-2.
Ratones con ectodominio de IL-6R/IL-6 humanizado y respuesta de fase aguda mediada por IL-6
15 En seres humanos, la IL-6 induce la respuesta de fase aguda. Estudios tempranos con hepatocitos humanos establecieron que la IL-6 induce proteínas de fase aguda tales como, por ejemplo, proteína C reactiva (CRP) y amiloide A sérico (SAA) de una manera dependiente de la dosis y dependiente del tiempo (revisado en Heinrich et al. (1990) Interleukin-6 and the acute phase response, Biochem. J. 265: 621-636). Por tanto, animales no humanos, por ejemplo, ratones o ratas, que comprenden genes de IL-6 e IL-6R humanizados son sistemas útiles para medir la respuesta de fase aguda mediada por IL-6 humana. Tales animales también son útiles para determinar si una sustancia induce una respuesta de fase aguda mediada por IL-6, exponiendo un animal con IL-6/IL-6R humanizado tal como se describe en el presente documento a la sustancia, y midiendo un nivel de una o más proteínas de respuesta de fase aguda (o ARN). En una realización, el animal humanizado se expone a la sustancia en presencia
25 de un antagonista de un IL-6R humano, y se mide un nivel de una o más proteínas de respuesta de fase aguda (o ARN), en el que una reducción en un nivel de una proteína de respuesta de fase aguda (o ARN) en presencia del antagonista de IL-6R humano indica una respuesta de fase aguda mediada por IL-6R humano.
La IL-6 humana puede unirse tanto a IL-6R humano como a IL-6R de ratón; IL-6 de ratón se une a IL-6R de ratón pero no a IL-6R humano (sin unión de mIL-6 a hIL-6R detectable, mientras que hIL-6 puede competir con mIL-6 por la unión a mIL-6R; Coulie et al. (1989) High-and low-affinity receptors for murine interleukin 6. Distinct distribution on B and T cells, Eur. J. Immunol. 19: 2107-211); véase también, por ejemplo, Peters et al. (1996) The Function of the Soluble Interleukin 6 (IL-6) Receptor In Vivo: Sensitization of Human Soluble IL-6 Receptor Transgenic Mice Towards IL-6 and Prolongation of the Plasma Half-life of IL-6, J. Exp. Med. 183: 1399-1406). Por tanto, células humanas que
35 portan hIL-6R en un ratón (por ejemplo, en un trasplante xenogénico) no pueden basarse en mIL-6 endógena para llevar a cabo funciones mediadas por IL-6, incluyendo pero sin limitarse al papel de desarrollo de linfocitos o células sanguíneas por IL-6 (por ejemplo, hematopoyesis, activación de células B, activación de células T, etc.).
En un sistema in vivo mixto que comprende un gen de IL-6 de ratón de tipo natural y un gen de IL-6R humano (pero no un gen de IL-6R de ratón), no se espera que un inductor de respuesta de fase aguda induzca niveles detectables de proteínas de fase aguda que indicarían una respuesta de fase aguda. Sin embargo, un ratón humanizado tal como se describe en el presente documento, que comprende un gen de IL-6 humanizado y un gen de IL-6R que comprende una secuencia de ectodominio humanizado responderá a un inductor de respuesta de fase aguda y presentará proteínas de respuesta de fase aguda en suero. Ratones de tipo natural para IL-6/IL-6R sometidos a
45 prueba para detectar proteínas de fase aguda en presencia o ausencia del inductor de fase aguda trementina mostraron un aumento dependiente de trementina en las proteínas de fase aguda. Ratones con gen de IL-6 humanizado, pero no IL-6R, no mostraron respuesta de fase aguda en presencia de trementina. Pero ratones que portaban tanto un gen de IL-6 humano como un gen de IL-6R con un ectodominio humanizado presentaron una fuerte respuesta de fase aguda (figura 2). La respuesta de fase aguda mediada por IL-6 era dependiente de IL-6 tanto en ratones de tipo natural (figura 3, parte superior) como en ratones con ectodominio de IL-6R/IL-6 humanizado (figura 3, parte inferior), tal como se evidencia por la capacidad del anticuerpo anti-IL-6R apropiado para suprimir la respuesta de fase aguda a una dosis de anticuerpo suficientemente alta. Por tanto, una doble humanización de IL-6 e IL-6R recapitula la respuesta de fase aguda mediada por IL-6 de tipo natural con respecto a proteínas de fase aguda séricas.
55 Ratones modificados genéticamente
Se proporcionan ratones modificados genéticamente que expresan una IL-6 humana y/o un receptor de IL-6 humanizado a partir de loci de ratón endógenos, en los que el gen de IL-6 de ratón endógeno y/o el gen receptor de IL-6 de ratón endógeno se han reemplazado con un gen de IL-6 humano y/o una secuencia humana que comprende una secuencia que codifica para un ectodominio de un receptor de IL-6 humano. Los ratones modificados genéticamente expresan la IL-6 humana y/o el receptor de IL-6 humanizado a partir de loci endógenos humanizados que están bajo el control de promotores de ratón y/o elementos reguladores de ratón. El/los reemplazo(s) en los loci de ratón endógenos proporciona(n) animales no humanos que expresan IL-6 humana y un receptor de IL-6
65 humanizado de manera que no da como resultado la colección de patologías sustanciales observadas en ratones transgénicos para IL-6 conocidas en la técnica.
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Se conocen en la técnica ratones transgénicos que expresan IL-6 humana. Sin embargo, padecen generalmente patologías significativas que limitan gravemente su utilidad. Los ratones humanizados tal como se describen en el presente documento expresan una IL-6 humana y/o un receptor de IL-6 humanizado bajo el control de elementos
5 reguladores de ratón endógenos en loci de IL-6 e IL-6Rα de ratón endógenos. Estos ratones, en cambio, presentan patrones de expresión con respecto a estos genes que son diferentes de los ratones transgénicos conocidos en la técnica.
El reemplazo de genes no humanos en un animal no humano con secuencias humanas o genes humanos homólogos u ortólogos, en el locus no humano endógeno y bajo el control de elementos reguladores y/o promotores endógenos, puede dar como resultado un animal no humano con cualidades y características que pueden ser sustancialmente diferentes de un animal deficiente y además transgénico típico. En el animal deficiente y además transgénico típico, se elimina o se daña un locus endógeno y se inserta un transgén completamente humano en el genoma del animal y presumiblemente se integra al azar en el genoma. Normalmente, se desconoce la ubicación del
15 transgén integrado; la expresión de la proteína humana se mide mediante la transcripción del gen humano y/o ensayo de proteínas y/o ensayo funcional. Se supone aparentemente que la inclusión en el transgén humano de secuencias humanas en el sentido de 5’ y/o en el sentido de 3’ es suficiente para proporcionar apoyo adecuado para la expresión y/o regulación del transgén independientemente de dónde termina el transgén en el genoma del animal. Pero en muchos casos el transgén con elementos reguladores humanos se expresa de una manera que no es fisiológica o por lo demás no es satisfactoria, y puede ser realmente perjudicial para el animal. En cambio, los inventores demuestran que un reemplazo con una secuencia humana en un locus endógeno bajo el control de elementos reguladores endógenos proporciona un patrón de expresión fisiológicamente apropiado y un nivel que da como resultado un animal humanizado útil cuya fisiología con respecto al gen reemplazado es valiosa y apropiada y en contexto con la fisiología del animal humanizado.
25 Óvulos de ratón fertilizados en los que se inyecta un constructo que tiene el promotor H2 de CMH de clase I y un intrón de β-globina que dirige la expresión de un gen de IL-6 de ratón de 695 pb producen según se notifica ratones que expresan de manera constitutiva IL-6 de ratón a niveles relativamente altos (en comparación con ratones de tipo natural) (véase, Woodrofe et al. (1992) Long-Term Consequences of Interleukin-6 Overexpression in Transgenic Mice, DNA and Cell Biology 11 (8): 587-592). Pero estos ratones son propensos a desarrollar linfomas asociados con los intestinos, ganglios linfáticos y riñón, así como depósitos esplénicos de amiloide. También presentan maduración de células B anómala (véase, Woodrofe et al., ídem), de modo que se ven comprometidos los estudios de la función de células B. En cambio, ratones tal como se describe en el presente documento que comprenden un reemplazo del gen de IL-6 de ratón con un gen de IL-6 humano en el locus de IL-6 de ratón no son propensos a
35 desarrollar estos linfomas, y los ratones presentan poblaciones de células B aparentemente normales.
Se han notificado ratones (C57BL/6) transgénicos para hIL-6 debido a una inserción al azar de una longitud de 6,6 kb (fragmento de BamHI-Pvu II) de ADN humano que contiene el gen de hIL-6 acoplado con un potenciador de IgM (véase, Suematsu et al. (1989) IgG1 plasmocytosis in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86: 7547-7551). Los ratones expresan hIL-6 a entre 800 pg/ml y 20.000 pg/ml en suero, mientras que los ratones de tipo natural expresan normalmente sólo aproximadamente 100 pg/ml de IL-6. Los ratones presentan un aumento de Ig sérica (de 120 a 400 veces con respecto a ratones de tipo natural) y una disminución de albúmina a medida que envejecen. Los ratones padecen una plasmocitosis masiva, presentan esplenomegalia y agrandamiento de ganglios linfáticos, así como la presentación de células plasmáticas y aumento de megacariocitos en la médula ósea. Tras la
45 inspección, lo que parece que son ganglios linfáticos agrandados son en su lugar masas de células plasmáticas anómalas compactadas. Tanto el bazo como el timo presentan proliferación masiva de células plasmáticas, que también se infiltran en partes del pulmón, el hígado y el riñón. El riñón en estos ratones también presenta proliferación de células mesangiales estimulada por IL-6 típica de glomerulonefritis mesangio-proliferativa. De manera similar, ratones (BALB/c) transgénicos para un ADNc de hIL-6 recortado dirigido por un promotor de H-2Ld de ratón insertado aleatoriamente en el genoma presentan plasmocitosis grave (véase, Suematsu et al. (1992) Generation of plasmacytomas with the chromosomal translocation t(12;15) in interleukin 6 transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 232-235). Aunque los ratones C57BL/6 que sobreexpresan hIL-6 no desarrollan plasmocitomas trasplantables (no presentan plasmocitosis), los ratones BL/6 transgénicos sometidos a retrocruzamiento con ratones BALB/c sí que los desarrollan según se notifica.
55 La transgénesis al azar de un ADNc de hIL-6 dirigido por un promotor del gen de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) da como resultado según se notifica sobreexpresión de hIL-6 en el sistema nervioso central del ratón, lo que también conduce a patologías significativas (véase, Campbell et al. (1993) Neurologic disease induced in transgenic mice by cerebral overexpression of interleukin 6, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10061-10065). Estos ratones presentan astrocitosis reactiva y neuropatología extensas que resultan de la expresión de IL-6 en el SNC debido a la pérdida de control como resultado de la integración al azar de un transgén de IL-6 en un locus de transcripción aparentemente permisivo para el SNC. Aunque la expresión de ADNc de hIL-6 unido a 3’-UTR de β-globina y dirigido por un promotor de enolasa específica de neuronas microiinyectado en óvulos de ratón fertilizados (F1 C57BL/6 x BALB/c) produjo ratones con una vida normal y sin defectos neurológicos aparentes que expresaban hIL-6 en
65 neuronas pero no en otras partes (véase, Fattor et al. (1994) IL-6 Expression in Neurons of Transgenic Mice Causes Reactive Astrocytosis and Increase in Ramified Microglial Cells But No Neuronal Damage, Eur. J. Neuroscience 7:
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2441-2449), los ratones presentaban altos niveles (de 20 a 30 veces superiores al tipo natural) de astrocitos activados y agrandados con aumento de procesos por todo el cerebro, así como un aumento de 10 a 15 veces de células microgliales ramificadas en materia blanca. Por tanto, la expresión en el cerebro de IL-6 conduce según se notifica a estados que oscilan entre astrocitosis reactiva y neuropatología manifiesta y profunda.
5 La microinyección en óvulos fertilizados de un cruzamiento F1 de ratones C57BL/6x“DBAII” de un ADNc de hIL-6 de 639 pb unido a 3’-UTR de β-globina y un promotor MT-1 de ratón produjo según se notifica un ratón transgénico en el que el gen de hIL-6 se integró aleatoriamente y produjo un ratón debilitado y enfermo que muere joven por insuficiencia renal (véase Fattori et al. (1994) Blood, Development of Progressive Kidney Damage and Myeloma
10 Kidney in Interleukin-6 Transgenic Mice, Blood 63 (9): 2570-2579). Los ratones transgénicos perecieron a las 12-20 semanas y presentaban niveles elevados de α1y β-globulinas en plasma, hipergammaglobulinemia, megacariocitos elevados en el bazo (3 veces superiores al tipo natural) y la médula ósea, plasmocitosis de órganos linfoides (bazo, timo y ganglios linfáticos) caracterizada por células plasmocitoides anómalas y dispuestas de manera compacta, y glomerulonefritis que conduce a glomeruloesclerosis similar a mieloma múltiple.
15 La microinyección en óvulos fertilizados de un ratón C57BL/6J de un ADNc de hIL-6 dirigido por H-2Ld provocó atrofia muscular progresiva dependiente de IL-6 en ratones, caracterizada en parte por un peso de los músculos gemelos significativamente inferior en ratones transgénicos en comparación con controles de peso coincidente, una diferencia que mejoró mediante tratamiento con un antagonista de IL-6 (véase, Tsujinaka et al. (1996) Interleukin 6
20 Receptor Antibody Inhibits Muscle Atrophy and Modulates Proteolytic Systems in Interleukin 6 Transgenic Mice, J. Clin. Invest. 97 (1): 244-249). A las 12 semanas estos ratones presentaban niveles de hIL-6 en suero de más de
600.000 pg/ml. Los ratones transgénicos también tenían hígados que pesaban aproximadamente 1.242 mg, en comparación con hígados control que pesaban aproximadamente 862 mg. Los ratones transgénicos tratados con antagonista de IL-6 tenían hígados que pesaban aproximadamente 888 mg. Las catepsinas musculares B y B+L
25 eran significativamente superiores (20 veces y 6,2 veces) en ratones transgénicos que en controles, fenómeno que se eliminó en ratones transgénicos tratados con un antagonista de IL-6. Se estimó que los ARNm de catepsina B y L eran aproximadamente del 277% y el 257%, respectivamente, en comparación con ratones de tipo natural; la diferencia se redujo significativamente con el tratamiento con antagonista de IL-6.
30 Los ratones que comprenden un minigén de hIL-6 dirigido por un promotor de H-2Ld de CMH de clase I de ratón y un minigén de hIL-6R dirigido por un promotor de β-actina de pollo, y un gen de gp130, presentaban patologías típicas de ratones transgénicos para hIL-6 (por ejemplo, hipergammaglobulinemia, esplenomegalia, glomerulonefritis proliferativa mesangial, infiltración linfoide en el pulmón) así como hipertrofia ventricular (Hirota et al. (1995) Continuous activation of gp130, a signal-transducing receptor component for interleukin 6-related cytokines, causes
35 myocardial hypertrophy in mice, Proc. Natl Acad. Sci. USA 92: 4862-4866). Se cree que la hipertrofia ventricular está mediada por una activación continua de gp130 (ídem). El papel de IL-6 es según se notifica ayudar a fortalecer el complejo de receptor de citocinas e inducir la dimerización de gp130, que es el componente de transducción de señales responsable de transducir la señal de IL-6 (Paonessa et al. (1995) Two distinct and independent sites on IL6 trigger gp130 dimer formation and signalling, EMBO J. 14 (9): 1942-1951). Se cree que el complejo activado es un
40 hexámero compuesto por dos IL-6, cada IL-6 unida a un IL-6Rα y dos gp130 (cada IL-6 contiene dos sitios de unión a gp130 independientes) que presenta una estequiometría 2:2:2, en el que la dimerización de gp130 provoca la activación de JAK-Tyk tirosina cinasas, la fosforilación de factores de transcripción de la familia de STAT y gp130 y otros sustratos intracelulares (ídem; Stahl, N. (1994) Association and Activation of Jak-Tyk Kinases by CNTF-LIF-OSM-IL-6 β Receptor Components, Science 263: 92-95), lo que concuerda con un modelo general de formación del
45 complejo de receptor de citocinas (véase, Stahl, N. y Yancopoulos, G. (1993) The Alphas, Betas, and Kinases of Cytokine Receptor Complexes, Cell 74: 587-590; Davis et al. (1993) LIFERβ y gp130 as Heterodimerizing Signal Transducers of the Tripartite CNTF Receptor, Science 260: 1805-1808; Murakami et al. (1993) IL-6-Induced Homodimerization of gp130 and Associated Activation of a Tyrosine Kinase, Science 2601808-1810).
50 Los ratones transgénicos para sIL-6R humano dirigido por un promotor de PEP carboxicinasa de rata e IL-6 humana dirigida por un promotor de metalotioneína-1 de ratón son según se notifica notablemente más pequeños que ratones transgénicos para IL-6 humana sola o sIL-6R humano solo (Peters et al. (1997) Extramedullary Expansion of Hematopoietic Progenitor Cells in Interleukin(IL-)-6-sIL-6R Double Transgenic Mice, J. Exp. Med. 185 (4): 755-766), lo que se refleja en grasa corporal reducida y peso reducido (20-25 g frente a 40 g). Los ratones transgénicos dobles
55 según se notifica también presentan agrandamiento del bazo (5 veces) e hígado (2 veces) en comparación con según se notifica los pesos de órganos normales para ratones transgénicos individuales, aparentemente debido a la proliferación extramedular de células hematopoyéticas de bazo e hígado pero no médula ósea, así como megacariocitos elevados en el bazo e infiltrados plasmacelulares en todos los órganos parenquimales (ídem). Los transgénicos dobles también presentan hígados con un aumento de aproximadamente 200 veces a
60 aproximadamente 300 veces de granulocitos, macrófagos, células progenitoras y células B en comparación con transgénicos individuales; en cambio, los ratones transgénicos individuales para IL-6 presentaban menos aumentos de macrófagos (15 veces) y células B (45 veces) (ídem). Los extraordinarios hallazgos se deben presumiblemente a la estimulación del crecimiento y la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas mediante la activación de la transducción de señales de gp130 (ídem).
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Además, los ratones transgénicos dobles (hIL-6 dirigida por promotor de metalotionina de ratón/hIL-6R dirigido por promotor de PEP carboxicinasa de rata) presentan una hiperplasia hepatocelular que es según se notifica idéntica a la hiperplasia regenerativa nodular humana con proliferación de hepatocitos sostenida, lo que sugiere fuertemente que IL-6 es responsable de tanto la proliferación de hepatocitos como la transformación hepatocelular patógena
5 (Maione et al. (1998) Coexpression of IL-6 and soluble IL-6R causes nodular regenerative hyperplasia and adenomas of the liver, EMBO J. 17 (19): 5588-5597). Debido a que la hiperplasia hepatocelular no se observa según se notifica en ratones transgénicos individuales para hIL-6 y que hIL-6 puede unirse a mIL-6R, el hallazgo puede parecer paradójico hasta que se considera que el transgénico doble puede dar como resultado niveles superiores de hIL-6 complejada con IL-6R soluble (en este caso, hIL-6R soluble), complejo que es un inhibidor más potente que IL6 sola (ídem).
En contraposición a ratones que son transgénicos para IL-6 humana, los ratones con IL-6 humanizada que comprenden un reemplazo en un locus de IL-6 de ratón endógeno, que conservan elementos reguladores de ratón pero que comprenden una humanización de la secuencia que codifica para IL-6, no presentan las patologías graves
15 de los ratones de la técnica anterior. Los ratones modificados genéticamente que eran heterocigotos u homocigotos para hIL-6 eran normales macroscópicamente.
Se determinó el inmunofenotipo de ratones con un gen de IL-6 humanizado (MAID 760) tal como se describe en los ejemplos y se encontró que tenían números de células B normales en análisis de FACS (linfocitos separados) de células B de bazo usando un panmarcador de células B (CD445R(B220)) (figura 4). Para el bazo, los ratones de tipo natural presentaban un 63% de células B; los ratones heterocigotos para hIL-6 presentaban un 63% de células B; y los ratones homocigotos para hIL-6 en el locus de ratón endógeno presentaban un 63% de células B. Los números de células B para ratones homocigotos para hIL-6 inmunizados con TNP-KLH también eran normales (el 65% para el tipo natural y el 61% para homocigotos para hIL-6).
25 Las células T esplénicas también eran aproximadamente las mismas que en el tipo natural (figura 5). Los porcentajes de células T esplénicas para T auxiliares/T citotóxicas eran, para el tipo natural el 20%/40% (razón de 1,4:1); para heterocigotos para hIL-6 el 23%/14% (razón de 1,6:1); para homocigotos para hIL-6 el 21%/15% (razón de 1,4:1) (los marcadores fueron CD8a-APC; CD4-FITC). Los ratones homocigotos para hIL-6 inmunizados con TNP-KLH presentaban números de células T esplénicas similares a ratones de tipo natural, es decir, T auxiliares/T citotóxicas eran el 22%/20% (razón de 1,1:1) en comparación con el 21%/19% para el tipo natural (también una razón de 1,1:1).
Los ratones con IL-6 humanizada también presentaban niveles aproximadamente normales de células NK
35 esplénicas en el análisis de FACS (CD11b y DX5) (figura 7). Los heterocigotos para hIL-6 presentaban un 2,2% de células NK y los homocigotos para hIL-6 presentaban un 1,8% de células NK, mientras que los ratones de tipo natural presentaban un 2,4% de células NK. Tras la inmunización con TNP-KLH, los homocigotos presentaban un 1,6% de células NK esplénicas, mientras que los ratones de tipo natural presentaban un 2,1% de células NK esplénicas.
Los ratones con IL-6 humanizada también presentaban niveles normales de células Ly6G/C(Gr1) esplénicas (figura 6). Los heterocigotos para hIL-6 presentaban un 7,0% de células GR1+ (el 1,3% de Gr1hi); los homocigotos presentaban un 6,8% de células Gr1+ (el 0,9% de Gr1hi), mientras que los ratones de tipo natural presentaban un 8,0% de células Gr1+ (el 1,8% de Gr1hi). Los homocigotos para IL-6 inmunizados (inmunizados con TNP-KLH)
45 presentaban un 11% de células Gr1+ (el 4,0% de Gr1hi), mientras que los ratones de tipo natural presentaban un 10% de células Gr1+ (el 3,0% de Gr1hi).
Los ratones con IL-6 humanizada también presentaban números de células B y T sanguíneas normales en el análisis de FACS (figura 8 y figura 9). FACS con un panmarcador de células B (CD445R(B220)) reveló que los ratones homocigotos para hIL-6 presentaban un 52% de células B en comparación con el 53% del tipo natural; los heterocigotos presentaban un 38% (un promedio de dos tinciones diferentes del 29% y el 47%). Los ratones homocigotos para hIL-6 inmunizados con TNP-KLH dieron números de células B similares (el 43%, en comparación con el 45% para los ratones de tipo natural).
55 Los ratones con IL-6 humanizada presentaban números de células T sanguíneas normales en el análisis de FACS tal como se mide mediante tinción de CD8a y CD4. Los ratones heterocigotos para hIL-6 presentaban números de T auxiliares/T citotóxicas del 39%/26% (razón de 1,5:1); los ratones homocigotos para hIL-6 presentaban números de Th/Tc del 24%/20% (razón de 1,2:1), mientras que ratones de tipo natural presentaban números de Th/Tc del 26%/20% (razón de 1,3:1). Los ratones homocigotos para hIL-6 inmunizados con TNP-KLH tenían números de Th/Tc del 29%/21% (razón de 1,4:1), mientras que ratones inmunizados de tipo natural tenían números de Th/Tc del 28%/23% (1,2:1).
Los ratones con IL-6 humanizada también presentaban números de células mieloides en sangre que eran similares a los ratones de tipo natural tal como se mide mediante análisis de FACS de sangre de ratón inmunizado y sin 65 tratamiento previo teñida con Ly6G/C(Gr1) y CD11b, así como CD11b y DX5 (figura 10, figura 11 y figura 12). Los ratones heterocigotos para hIL-6 presentaban un % de células Gr+ del 10,8%, los homocigotos del 6,9%, mientras
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que los ratones de tipo natural presentaban un 9,7%. Homocigotos para hIL-6 inmunizados presentaban números de M1(Ly6G/C(Gr) de 101-104)/M2(tinción de Ly6G/C(Gr) de aproximadamente 102-103) del 43%/34%, mientras que los ratones de tipo natural tenían números del 45%/38%. Los gráficos de FACS de CD11b (eje vertical) frente a Ly6G/C (eje horizontal) para ratones homocigotos para hIL-6 inmunizados mostraron un porcentaje de células en los
5 cuadrantes (superior izquierdo/superior derecho/inferior derecho) del 16%/8%/3%, que eran idénticos a los números de cuadrantes del tipo natural inmunizados.
Los ratones con IL-6 humanizada inmunizados con TNP-KLH homocigotos presentaban gráficos de FACS de tinción de CD11b frente a DX5(NK) que eran similares a los ratones de tipo natural inmunizados. El análisis de cuadrantes de gráficos de FACS de sangre (CD11b eje vertical, DX5(NK) eje horizontal) reveló números de los cuadrantes superior izquierdo/superior derecho/inferior derecho del 9,5%/17%/10% para homocigotos para hIL-6 y del 6,5%/17,3%/14% para ratones de tipo natural.
Los ratones con IL-6 humanizada presentaban una respuesta de isotipo que era esencialmente la misma que la
15 observada en ratones de tipo natural. Los niveles de IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE e IgM tempranos y finales eran aproximadamente los mismos que los observados en ratones de tipo natural. En un experimento, la IgM final era ligeramente superior en ratones humanizados; la IgG3 final también estaba elevada en ratones humanizados.
El desarrollo de células B en ratones con hIL-6 sin tratamiento previo era esencialmente indistinguible del desarrollo en ratones de tipo natural basándose en el análisis de FACS de la tinción de IgM/CD24/B220 de médula ósea (figura 13). La determinación de inmunofenotipos de ratones inmunitarios reveló que las poblaciones de marcadores para diversos tipos de células en la progresión del desarrollo de células B eran esencialmente normales en ratones con hIL-6. La progresión de células a partir de células madre hematopoyéticas, progenitores linfoides comunes, células proB, células preB y células B inmaduras y maduras es normal en ratones con hIL-6 (figura 14 y figura 15).
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Ejemplos
Ejemplo 1: Reemplazo del gen de IL-6 de ratón endógeno con el gen de hIL-6
El gen de IL-6 humano de 4,8 kb que contiene los exones 1 a 4 del gen de IL-6 humano reemplazó a 6,8 kb del locus del gen de IL-6 murino.
Se construyó un constructo de selección como diana para reemplazar el gen de IL-6 de ratón con el humano en una única etapa de selección como diana usando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véase, 35 Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21 (6): 652-659). Se obtuvieron ADN de IL-6 de ratón y humana a partir del clon de RPCI23 de cromosoma artificial bacteriano (BAC) 368C3, y a partir del clon de CTD de BAC 2369M23, respectivamente. En resumen, un constructo de selección como diana linealizado con Notl generado mediante clonación por reparación de huecos que contiene brazos de homología en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ de IL-6 de ratón que flanquean una secuencia de IL-6 humana de 4,8 kb que se extiende desde ATG en el exón 1 hasta el exón 5 con 16 nucleótidos de secuencia en el sentido de 3’ (coordenadas genómicas: NCBIh37.1: ch7:22.766.882 a 22.771.637) y un casete de selección floxed neo, se sometió a electroporación en células madre embrionarias (ES) de ratón F1 H4 (híbrido F1 C57BL/6 x 129). Se sometieron a electroporación adicionalmente células ES correctamente seleccionadas como diana (MAID 790) con un vector de expresión de Cre transitorio para eliminar el
45 casete de selección de fármaco. Se introdujeron clones de células ES seleccionadas como diana sin casete de fármaco (MAID 1428) en un embrión de ratón en el estadio de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (véanse, las patentes estadounidenses n. os 7.294.754, 7.576.259, 7.659.442 y Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25 (1): 91-99). Se identificaron VELOCIMICE® (ratones F0 completamente derivados de la célula ES donadora) que portan el gen de IL-6 humanizado mediante genotipado para detectar la pérdida del alelo de ratón y la ganancia del alelo humano usando una modificación del ensayo de alelos (véase, Valenzuela et al. (2003)).
Se identificaron clones de células ES correctamente seleccionadas como diana mediante un ensayo de pérdida de
55 alelo nativo (LONA) (Valenzuela et al. 2003) en el que se determinó el número de copias del gen IL6 nativo, no modificado mediante dos reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativas (qPCR) TaqMan™ específicas para secuencias en el gen IL6 de ratón que se seleccionaron como diana para la deleción. Los ensayos de qPCR comprendían los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5’ a 3’): cebador directo en el sentido de 5’, TTGCCGGTTT TCCCTTTTCT C (SEQ ID NO: 1); cebador inverso en el sentido de 5’, AGGGAAGGCC GTGGTTGTC (SEQ ID NO: 2); sonda en el sentido de 5’, FAM-CCAGCATCAG TCCCAAGAAG GCAACT-BHQ (SEQ ID NO: 3); cebador directo en el sentido de 3’, TCAGAGTGTG GGCGAACAAA G (SEQ ID NO: 4); cebador inverso en el sentido de 3’, GTGGCAAAAG CAGCCTTAGC (SEQ ID NO: 5); sonda en el sentido de 3’, FAM-TCATTCCAGG CCCTTCTTAT TGCATCTG-BHQ (SEQ ID NO: 6); en los que FAM se refiere a la sonda fluorescente 5-carboxifluoresceína y BHQ se refiere al extintor de fluorescencia del tipo extintor de agujero negro (Biosearch
65 Technologies). Se combinó el ADN purificado de clones de células ES que han captado e incorporado el vector de selección como diana en sus genomas con la mezcla madre de expresión génica TaqMan™ (Life Technologies)
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según las sugerencias del fabricante en una placa de PCR de 384 pocillos (placa de reacción de 384 pocillos óptica MicroAmp™, Life Technologies) y se sometió a ciclado en un instrumento Prism 7900HT de Applied Biosystems, que recoge los datos de fluorescencia durante el transcurso de las PCR y determina un ciclo umbral (Ct), el ciclo de PCR fraccionado en el que la fluorescencia acumulada alcanza un umbral preestablecido. Se ejecutaron las qPCR 5 específicas de IL6 en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ y dos qPCR para genes de referencia no seleccionados como diana para cada muestra de ADN. Se calcularon las diferencias en los valores de Ct (ΔCt) entre cada qPCR específica para IL6 y cada qPCR de gen de referencia, y entonces se calculó la diferencia entre cada ΔCt y la mediana de ΔCt para todas las muestras sometidas a ensayo para obtener los valores de ΔΔCt para cada muestra. Se calculó el número de copias del gen IL6 en cada muestra a partir de la siguiente fórmula: número de copias = 2 • 2-ΔΔCt. Un gen correctamente seleccionado como diana, que ha perdido una de sus copias nativas, tendrá un número de copias de gen IL6 igual a uno. La confirmación de que la secuencia del gen de IL6 humano reemplazó a la secuencia del gen de IL6 de ratón delecionada en el alelo humanizado se confirmó mediante un ensayo de qPCR TaqMan™ que comprende los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5’ a 3’): el cebador directo humano, CCCCACTCCACTGGAATTTG (SEQ ID NO: 7); el cebador inverso humano,
15 GTTCAACCACAGCCAGGAAAG (SEQ ID NO: 8); y la sonda humana, FAM-AGCTACAACTCATTGGCATCCTGGCAA-BHQ (SEQ ID NO: 9).
Se usó el mismo ensayo de LONA para someter a ensayo el ADN purificado de biopsias de cola para ratones derivados de las células ES seleccionadas como diana para determinar sus genotipos de IL6 y confirmar que el alelo de IL6 humanizado se había transmitido a través de la línea germinal. Se crían dos crías heterocigotas para el reemplazo para generar un ratón que es homocigoto para el reemplazo del gen de IL-6 de ratón endógeno por el gen de IL-6 humano. Para la determinación de fenotipos, se usan crías que son homocigotas para el reemplazo.
La unión en el sentido de 5’ del locus murino y la secuencia que contiene el gen de hIL-6 se diseña para que esté
25 dentro de 5’-AATTAGAGAG TTGACTCCTA ATAAATATGA GACTGGGGAT GTCTGTAGCT CATTCTGCTC TGGAGCCCAC CAAGAACGAT AGTCAATTCC AGAAACCGCT ATGAACTCCT TCTCCACAAG TAAGTGCAGG AAATCCTTAG CCCTGGAACT GCCAGCGGCG GTCGAGCCCT GTGTGAGGGA GGGGTGTGTG GCCCAGG (SEQ ID NO: 10), en la que el nucleótido de ratón final antes del primer nucleótido del gen humano es la “T” en CCGCT, y el primer nucleótido de la secuencia humana es la primera “A” en ATGAA. La unión en el sentido de 3’ de la secuencia que contiene el gen de hIL-6 y el locus murino se diseña para que esté dentro de 5’-TTTTAAAGAA ATATTTATAT TGTATTTATA TAATGTATAA ATGGTTTTTA TACCAATAAA TGGCATTTTA AAAAATTCAG CAACTTTGAG TGTGTCACGC TCCCGGGCTC GATAACTATA ACGGTCCTAA GGTAGCGACT CGAGATAACT T3’ (SEQ ID NO: 11), en la que el nucleótido final de la secuencia humana está con la “G” final en TCACG y el primer nucleótido de la secuencia de ratón es la primera “C” en CTCCC; la región de unión en el sentido de 3’ también
35 contenía un sitio IoxP en el extremo 3’ (cuyo comienzo se muestra) para la eliminación de un casete neo dirigido por el promotor de ubiquitina floxed. La unión del casete neo con el locus de IL-6 de ratón se diseña para que esté dentro de 5’-TATACGAAGT TATCCTAGGT TGGAGCTCCT AAGTTACATC CAAACATCCT CCCCCAAATC AATAATTAAG CACTTTTTAT GACATGTAAA GTTAAATAAG AAGTGAAAGC TGCAGATGGT GAGTGAGA (SEQ ID NO: 12), en la que la “C” final de AGCTC es el nucleótido final del casete neo; el primer nucleótido del genoma de ratón tras el casete es la “C” inicial de CTAAG.
Ejemplo 2: Determinación de inmunofenotipos de ratones con hIL-6 inmunizados y sin tratamiento previo: células B
Se analizaron ratones homocigotos para el reemplazo del gen de hIL-6 para determinar células B (DC445R(B220).
45 Se tiñeron fracciones de linfocitos separados de preparaciones de células de bazo de ratones con hIL-6 inmunizados (TNP-KLH) y sin tratamiento previo y se determinó su inmunofenotipo usando citometría de flujo. El análisis de FACS mostró que el porcentaje de células B de la preparación de células de bazo tal como se mide mediante tinción de CD45R(B220)-FITC era aproximadamente el mismo (el 63% de células) para las preparaciones a partir de heterocigotos para hIL-6 y homocigotos para hIL-6 de tipo natural sin tratamiento previo. Para ratones inmunizados, las células B representaban aproximadamente el 65% de las células totales de la preparación de células de bazo en ratones de tipo natural, y aproximadamente el 61% de las células totales en homocigotos para hIL-6. Los bazos de ratones con hIL-6 (tanto sin tratamiento previo como inmunizados) contienen una población de células B que es aproximadamente del mismo tamaño que la población de células B esplénicas en ratones de tipo natural.
55 Se tiñó médula ósea de heterocigotos para hIL-6 y homocigotos para hIL-6 de tipo natural con marcadores de células B (CD45R(B220)-APC, CD24(HSA)-PE o CD43 conjugado con un colorante y/o IgM (IgM-FITC). El desarrollo de células B en médula ósea de ratones normales se verá reflejado en marcadores de superficie a medida que la células progresa desde células madre hasta células pro-B tempranas hasta células pro-B tardías, hasta células pre-B grandes hasta células pre-B pequeñas hasta células B inmaduras y finalmente hasta células B maduras. Las células pro-B progenitoras de linfocitos comunes expresarán CD45R, y en fases posteriores expresarán IgM como células B inmaduras y posteriormente como maduras. Por tanto, las células B teñidas con CD45R y teñidas con anti-IgM deben revelar un patrón característico del desarrollo de células B. La médula ósea de homocigotos y heterocigotos para hIL-6 presentaba un patrón de tinción de CD45R(B220)-APC y anti-IgM-FITC que era esencialmente indistinguible de la médula ósea de tipo natural, mostrando poblaciones de células B que se teñían de
65 manera positiva para CD45R(B220) e IgM, o CD45R(B220) solo. Las subpoblaciones de células B en médula ósea de ratones con hIL-6 reveladas mediante tinción de FACS eran similares a aquéllas en ratones de tipo natural (tabla
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1; véase también la figura 13).
Tabla 1. Células B en médula ósea de ratones sin tratamiento previo
Ratón de tipo natural (%)
Ratón con hIL-6
Heterocigoto (%)
Homocigoto (%)
CLP-ProB
40 29 32
PreB-B inmaduras
12,3 19,3 15,3
B maduras
6,4 6,5 6,7
La tinción para CD24 (véase la figura 14) reveló el patrón (normal) mostrado en la tabla 2, indicando un desarrollo normal en la médula ósea.
Tabla 2. Células B en médula ósea de ratones sin tratamiento previo
Ratón de tipo natural (%)
Ratón con hIL-6
Heterocigoto (%)
Homocigoto (%)
HSC-CLP en desarrollo
46,6 46 43
CLP maduras/ProB tempranas
10,2 9,0 10,1
ProB tardías, PreB, B inmaduras
7,2 11,6 10,7
B maduras
14,1 14,9 17
La tinción para CD43 (véase la figura 15) reveló el patrón (normal) mostrado en la tabla 3, indicando un desarrollo normal en la médula ósea.
Tabla 3. Células B en médula ósea de ratones sin tratamiento previo
Ratón de tipo natural (%)
Ratón con hIL-6
Heterocigoto (%)
Homocigoto (%)
Células PreBll-B inmaduras
28,4 21,4 21,2
Células B maduras
8,1 11,5 8,0
ProB-PreBl
3,4 4,3 4,7
Por tanto, la determinación de inmunofenotipos de ratones con hIL-6 sin tratamiento previo reveló que el desarrollo de células B en tales ratones es esencialmente normal.
15 Ejemplo 3: Reemplazo de la secuencia génica de ectodominio de IL-6Rα de ratón endógeno con la secuencia génica de ectodominio de hIL-6Rα
El gen de IL-6Rα humano de 45 kb que contiene los exones 1 a 8 del gen de IL-6Rα humano reemplazó a 35,4 kb del locus del gen de IL-6Rα murino. Se conservaron los exones 9 y 10 de ratón; sólo se humanizaron los exones 1
20 8. En total, se reemplazaron 35.384 nt de la secuencia de ratón por 45.047 nt de la secuencia humana.
Se construyó un constructo de selección como diana para reemplazar el gen de IL-6Rα de ratón con el humano en una única etapa de selección como diana usando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véase, Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression 25 analysis, Nature Biotech, 21 (6): 652-659). Se obtuvieron ADN de IL-6Rα de ratón y humano a partir del clon de RPCI-23 de cromosoma artificial bacteriano (BAC) 125J8, y a partir del clon de CTD de BAC 2192J23, respectivamente. En resumen, un constructo de selección como diana linealizado con Notl generado mediante clonación por reparación de huecos que contiene brazos de homología en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ de IL-6Rα de ratón que flanquean una secuencia de IL-6Rα humana de 45 kb que se extiende desde ATG en el exón 1 30 hasta el exón 8 con 69 nucleótidos de secuencia en el sentido de 3’ y un casete de selección floxed neo, se sometió a electroporación en células madre embrionarias (ES) de ratón F1 H4 (híbrido F1 C57BL/6 x 129). Se sometieron a electroporación adicionalmente células ES correctamente seleccionadas como diana (MAID 794) con un vector de expresión de Cre transitorio para eliminar el casete de selección de fármaco. Se introdujeron clones de células ES seleccionadas como diana sin casete de fármaco (MAID 1442) en un embrión de ratón en el estadio de 8 células 35 mediante el método VELOCIMOUSE® (véanse, las patentes estadounidenses n.os 7.294.754, 7.576.259, 7.659.442 y
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Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25 (1): 91-99). Se identificaron VELOCIMICE® (ratones F0 completamente derivados de la célula ES donadora) que portan el gen de IL-6Rα humanizado mediante genotipado para detectar la pérdida del alelo de ratón y la ganancia del alelo humano usando una modificación del ensayo de
5 alelos (véase, Valenzuela et al. (2003)).
Se identificaron clones de células ES correctamente seleccionadas como diana mediante un ensayo de pérdida de alelo nativo (LONA) (Valenzuela et al. 2003) en el que se determinó el número de copias del gen IL6 nativo, no modificado, mediante dos reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativas (qPCR) TaqMan™ específicas para 10 secuencias en el gen IL6 de ratón que se seleccionaron como diana para la deleción. Los ensayos de qPCR comprendían los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5’ a 3’): cebador directo en el sentido de 5’, GCCCTAGCAT GCAGAATGC (SEQ ID NO: 13); cebador inverso en el sentido de 5’, AAGAGGTCCC ACATCCTTTG C (SEQ ID NO: 14); sonda en el sentido de 5’, CCCACATCCA TCCCAATCCT GTGAG (SEQ ID NO: 15); cebador directo en el sentido de 3’, GAGCTTGCCC CCAGAAAGG (SEQ ID NO: 16); cebador inverso en el 15 sentido de 3’, CGGCCACATC TCTGGAAGAC (SEQ ID NO: 17); sonda en el sentido de 3’, CATGCACTGC CCCAAGTCTG GTTTCAGT (SEQ ID NO: 18). Se combinó ADN purificado de clones de células ES que han captado e incorporado el vector de selección como diana en sus genomas con la mezcla madre de expresión génica TaqMan™ (Life Technologies) según las sugerencias del fabricante en una placa de PCR de 384 pocillos (placa de reacción de 384 pocillos óptica MicroAmp™, Life Technologies) y se sometió a ciclado en un instrumento Prism 20 7900HT de Applied Biosystems, que recoge los datos de fluorescencia durante el transcurso de las PCR y determina un ciclo umbral (Ct), el ciclo de PCR fraccionado en el que la fluorescencia acumulada alcanza un umbral preestablecido. Se ejecutaron las qPCR específicas de IL-6Rα en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ y dos qPCR para genes de referencia no seleccionados como diana para cada muestra de ADN. Se calcularon las diferencias en los valores de Ct (ΔCt) entre cada qPCR específica para IL-6Rα y cada qPCR de gen de referencia, y entonces se 25 calculó la diferencia entre cada ΔCt y la mediana de ΔCt para todas las muestras sometidas a ensayo para obtener los valores de ΔΔCt para cada muestra. Se calculó el número de copias del gen IL6 en cada muestra a partir de la siguiente fórmula: número de copias = 2 • 2-ΔΔCt. Un gen correctamente seleccionado como diana, que ha perdido una de sus copias nativas, tendrá un número de copias del gen de IL-6Rα igual a uno. La confirmación de que la secuencia génica de IL-6Rα humano reemplazó a la secuencia génica de IL-6Rα de ratón delecionada en el alelo
30 humanizado se confirmó mediante un ensayo de qPCR TaqMan™ que comprende los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5’ a 3’): el cebador directo humano, GGAGAGGGCA GAGGCACTTA C (SEQ ID NO: 19); el cebador inverso humano, GGCCAGAGCC CAAGAAAAG (SEQ ID NO: 20); y la sonda humana, CCCGTTGACT GTAATCTGCC CCTGG (SEQ ID NO: 21).
35 Se usó el mismo ensayo de LONA para someter a ensayo el ADN purificado de biopsias de cola para ratones derivados de las células ES seleccionadas como diana para determinar sus genotipos de IL-6Rα y confirmar que el alelo de IL-6Rα humanizado se había transmitido a través de la línea germinal. Se crían dos crías heterocigotas para el reemplazo para generar un ratón que es homocigoto para el reemplazo del gen de IL-6Rα de ratón endógeno por el gen de IL-6Rα humano (ectodominio). Para la determinación de fenotipos, se usan crías que son homocigotas
40 para el reemplazo.
La unión en el sentido de 5’ del locus murino y la secuencia que contiene el gen de hIL-6Rα se diseña para que esté dentro de 5’-CGAGGGCGAC TGCTCTCGCT GCCCCAGTCT GCCGGCCGCC CGGCCCCGGC TGCGGAGCCG CTCTGCCGCC CGCCGTCCCG CGTAGAAGGA AGCATGCTGG CCGTCGGCTG CGCGCTGCTG GCTGCCCTGC 45 TGGCCGCGCC GGGAGCGGCG CTGGCCCCAA GGCGCTGCCC TGCGCAGGGT AAGGGCTTCG G (SEQ ID NO: 22), en la que el nucleótido de ratón final antes del primer nucleótido del gen humano es la “C” en GAAGC, y el primer nucleótido de la secuencia humana es la primera “A” en ATGCT. La unión en el sentido de 3’ de la secuencia que contiene el gen de hIL-6 y el locus murino se diseña para que esté dentro de 5’-CAAGATTATT GGAGTCTGAA ATGGAATACC TGTTGAGGGA AATCTTTATT TTGGGAGCCC TTGATTTCAA TGCTTTTGAT TCCCTATCCC 50 TGCAAGACCC GGGCTCGATA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGACTCGAG ATAACTTC-3’ (SEQ ID NO: 23), en la que el nucleótido final de la secuencia humana está con la “A” final en CAAGA y el primer nucleótido de la secuencia de ratón es la primera “C” en CCCGG; la región de unión en el sentido de 3’ también contenía un sitio IoxP en el extremo 3’ para la eliminación de un casete neo dirigido por el promotor de ubiquitina floxed. El primer nucleótido del sitio loxp es la primera “A” en ATAAC. La unión del casete neo con el locus de IL-6Rα de ratón se
55 diseña para que esté dentro de 5’-TATACGAAGT TATCCTAGGT TGGAGCTCTA CTCCATATGC TCACTTGCCG TTGTTTGCTA CGATACGGTG AGGCCCGTGC GAAGAGTGGC ACAGATCAGG AGGCTTATGT GGTCAGTCCA CAGTATGGC (SEQ ID NO: 24), en la que la “C” final de AGCTC es el nucleótido final del casete neo; el primer nucleótido del genoma de ratón tras el casete es la “T” inicial de TACTC.

Claims (16)

  1. E12795905
    05-12-2014
    REIVINDICACIONES
    1. Ratón modificado genéticamente que comprende un reemplazo en un locus de IL-6 de ratón endógeno de un gen de ratón que codifica para IL-6 con un gen humano que codifica para IL-6 humana, en el que el gen humano que
    5 codifica para IL-6 humana está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos en el locus de IL-6 de ratón endógeno.
  2. 2.
    Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 1, en el que el gen humano que codifica para IL-6 humana comprende los exones 1 a 5 del gen de IL-6-humano encontrado en el cromosoma artificial bacteriano CTD2369M23.
  3. 3.
    Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 1, en el que el ratón expresa un IL-6Rα de ratón.
  4. 4.
    Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 1, en el que el ratón expresa un IL-6Rα humanizado en
    15 el que el gen de IL-6Rα de ratón endógeno se ha reemplazado con una secuencia humana que comprende una secuencia que codifica para un ectodominio de un IL-6Rα humano.
  5. 5.
    Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 1, en el que el ratón no presenta una característica seleccionada de plasmocitosis, glomeruloesclerosis, glomerulonefritis, insuficiencia renal, hipergammaglobulinemia, megacariocitos elevados en el bazo, megacariocitos elevados en la médula ósea, esplenomegalia, agrandamiento de ganglios linfáticos, células plasmáticas anómalas compactadas, y una combinación de los mismos.
  6. 6.
    Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 4, en el que el IL-6Rα humanizado comprende un
    ectodominio humano. 25
  7. 7.
    Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 6, en el que el IL-6Rα humanizado comprende un dominio transmembrana de ratón y un dominio citoplasmático de ratón.
  8. 8.
    Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 1, en el que el ratón comprende una célula que expresa un IL-6Rα que comprende un ectodominio humano sobre la superficie de la célula.
  9. 9.
    Ratón modificado genéticamente, que comprende una humanización de un gen de IL-6Rα de ratón endógeno, en el que la humanización comprende un reemplazo de una secuencia que codifica para ectodominio de IL-6Rα de ratón con una secuencia que codifica para ectodominio de IL-6Rα humano en el locus de IL-6Rα de ratón endógeno,
    35 y en el que el gen de IL-6Rα humanizado está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos.
  10. 10.
    Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 9, en el que se reemplaza una secuencia de ratón contigua que comprende los exones de ratón 1 a 8 con un fragmento genómico contiguo de una secuencia de IL-6Rα humana que codifica para un ectodominio de IL-6Rα humano.
  11. 11.
    Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 10, en el que el fragmento genómico contiguo de la secuencia de IL-6Rα humano que codifica para el ectodominio se encuentra en el cromosoma artificial bacteriano CTD-2192J23.
    45 12. Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 9, que comprende además un gen de IL-6 humanizado que comprende un reemplazo en un locus de IL-6 de ratón endógeno de un gen de ratón que codifica para IL-6 con un gen humano que codifica para IL-6 humana.
  12. 13.
    Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 12, en el que el gen de IL-6 humanizado está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos.
  13. 14.
    Método para preparar un ratón humanizado, que comprende reemplazar una secuencia génica de ratón que codifica para IL-6 de ratón con un gen humano que codifica para IL-6 humana de modo que el gen de IL-6 humano está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos.
    55
  14. 15.
    Método para preparar un ratón humanizado, que comprende reemplazar todos los exones de ratón que codifican para secuencias de ectodominio de IL-6Rα de ratón con un fragmento genómico humano que codifica para ectodominio de IL-6Rα humano para formar un gen de IL-6Rα humanizado, en el que el gen de IL-6Rα humanizado está bajo el control de elementos reguladores de ratón endógenos.
  15. 16.
    Ratón modificado genéticamente que comprende un gen de IL-6Rα humanizado que comprende un reemplazo de una secuencia que codifica para ectodominio de ratón con una secuencia de ectodominio humano, en el que el gen de IL-6Rα humanizado comprende una secuencia transmembrana de ratón y una secuencia citoplasmática de ratón; en el que el ratón comprende además un gen que codifica para una IL-6 humana, en el que los genes que
    65 codifican para IL-6 humana e IL-6Rα humanizado están bajo el control de elementos reguladores de ratón
    17
    E12795905
    05-12-2014
    endógenos.
  16. 17. Ratón modificado genéticamente según la reivindicación 16, en el que el ratón no expresa un IL-6Rα de ratón y no expresa una IL-6 de ratón.
    18
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