CN108884146A

CN108884146A - 具有延长的半衰期及降低的配体结合性质的因子viii

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Publication number: CN108884146A
Application number: CN201680078827.1A
Authority: CN
Inventors: P·图雷切克; G·施雷尔克; J·西克曼
Original assignee: Hundred Deep LLC; Hundred Deep Co
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2016-12-05
Publication date: 2018-11-23
Also published as: PH12018501174A1; SG10202004031WA; AR106914A1; TW201731869A; US20170349644A1; IL259760A; WO2017096383A1; CA3007364A1; US20190240295A1; EP3383895A1; EA201891333A1; AU2016362606A1; BR112018011259A2; SG11201804666QA; KR20180088727A; JP2019510022A; MX2018006738A

Abstract

本发明涉及将水溶性聚合物缀合至治疗蛋白质的氧化碳水化合物部分的材料和方法，其包括使氧化碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物在允许缀合的条件下接触。更具体而言，本发明涉及具有延长半衰期和降低的配体结合性质的经修饰的重组因子VIII(FVIII)。

Description

具有延长的半衰期及降低的配体结合性质的因子VIII

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年12月3日提交的美国临时专利申请第62/262,674号的优先权，所述申请以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及用于延长因子VIII(FVIII)的半衰期的材料和方法。

背景技术

在患有A型及B型血友病的人群中对于出血的已认可治疗和/或预防经常包括因子替代疗法。这涉及凝血蛋白诸如因子VIII(FVIII)和因子IX(FIX)的输注(注射至血流中)。这些蛋白质通常来自两个来源：从人血浆分离和在遗传工程化细胞系中表达。因为缺失的凝结因子的替代物并非永久的，所以接受这类治疗的患者必须反复输注因子。

治疗蛋白质诸如FVIII之药理学及免疫学性质可通过化学修饰和与聚合物化合物进行缀合来改进。聚唾液酸(PSA)也称为多聚唾液酸(CA)，是天然产生的多糖。它是具有α(2→8)酮苷键的N-乙酰神经氨酸的均聚物并且在其非还原末端含有邻位二醇基团。此聚合物带有负电荷并且为人体的天然成分。其可容易地从细菌大量地产生并且具有预先确定的物理特性(美国专利第5,846,951号)。细菌产生的PSA是由与在人体中产生的PSA相同的唾液酸单体组成。不同于一些聚合物，PSA为可生物降解的。

多聚唾液酸与过氧化氢酶和天冬酰胺酶的共价偶合已被证明可增加在存在蛋白分解酶或血浆的情况下的酶稳定性。聚唾液酸化与未经修饰天冬酰胺酶的体内比较研究揭示聚唾液酸化可增加酶的半衰期(Fernandes及Gregoriadis,Int J Pharm.2001,217,215-24)。

仍然需要开发用于缀合水溶性聚合物与蛋白质从而改进蛋白质的药效学和/或药代动力学性质，同时将与各种试剂有关的成本降至最低并将对患者接受者的健康风险降至最小的材料和方法。

发明内容

本发明提供用于缀合聚合物与蛋白质以改进蛋白质的体内半衰期、药效学和/或药代动力学性质的材料和方法。

在一个实施方案中，提供一种经修饰的因子VIII(FVIII)。所述经修饰的FVIII包含延长FVIII半衰期并减少经修饰的FVIII与结合FVIII的配体的结合的修饰。示例性配体选自冯威勒布兰德(von Willebrand)因子(VWF)和低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白1(LRP1)。示例性修饰在本文中论述并且包括例如化学修饰，诸如水溶性聚合物的连接。

在示例性实施方案中，经修饰的FVIII为来源于血浆的。在示例性实施方案中，FVIII是由工程化宿主细胞重组产生。在各种实施方案中，经修饰的FVIII包括完整的B结构域。在各种实施方案中，FVIII为全长FVIII并且包括完整的B结构域。

在示例性实施方案中，经修饰的FVIII以与未经修饰的FVIII相比较低的亲和力(KD)结合至VWF和LRP1。

在示例性实施方案中，经修饰的FVIII包含与其缀合的聚唾液酸(PSA)。在这个实施方案中使用的示例性PSA部分具有约20kDa的平均分子量。在示例性实施方案中，PSA具有选自以下的平均分子量：约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40或约50kDa。在示例性实施方案中，PSA具有低的多分散性。示例性PSA缀合物包括介于PSA与FVIII分子之间的氨基氧基连接基。示例性氨基氧基连接基係连接至经修饰的FVIII的氧化碳水化合物。

本发明还提供一种药物组合物。示例性药物制剂包括上述经修饰的FVIII和药学上可接受的载体、稀释剂、盐、缓冲剂和/或赋形剂。

在各种实施方案中，上述经修饰的FVIII具有比聚乙二醇化FVIII更长的体内半衰期。在各种实施方案中，上述经修饰的FVIII具有比聚乙二醇化FVIII更长的体内半衰期，所述聚乙二醇化FVIII缀合至具有与具有较长体内半衰期的缀合FVIII的PSA的平均分子量约相同的平均分子量的PEG部分。在示例性实施方案中，经PSA修饰的FVIII缀合至具有约20kDa的平均分子量的PSA部分并且具有比聚乙二醇化FVIII更长的体内半衰期，所述聚乙二醇化FVIII缀合至具有约20kDa的平均分子量的PEG部分。在各种实施方案中，半衰期长约1、约2或约3倍。在其他各种不同实施方案中，半衰期长约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10倍。

在示例性实施方案中，上述经PSA修饰的FVIII与聚乙二醇化FVIII结合至VWF或LRP1相比以较低的结合亲和力结合至VWF或LRP1，当两种物质的结合在相当的条件下测量时如此。在示例性实施方案中，上述经PSA修饰的FVIII与聚乙二醇化FVIII结合至VWF或LRP1相比以较低的结合亲和力结合至VWF或LRP1，当两种物质的结合在相当的条件下测量时如此，并且PEG与PSA具有大致相同的平均分子量。在各种实施方案中，与聚乙二醇化FVIII结合至VWF或LRP1相比，与VWF或LRP1的结合减少了约0.5倍。在其他各种实施方案中，与聚乙二醇化FVIII与VWF或LRP1的结合相比，与VWF或LRP1的结合减少了约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10倍。

在一个实施方案中，提供一种经修饰的重组FVIII，其包含延长FVIII半衰期并减少所述经修饰的FVIII与选自由VWF及LRP1组成的组的配体的结合的修饰，其中所述修饰包括经由氨基氧基连接基连接至FVIII的PSA。在示例性实施方案中，氨基氧基连接基连接至经修饰的FVIII的氧化碳水化合物，其中经修饰的重组FVIII的体内半衰期比未经修饰的重组FVIII和/或聚乙二醇化重组FVIII更长且其中经修饰的重组FVIII对VWF或LRP1的结合亲和力与未经修饰的重组FVIII和/或聚乙二醇化重组FVIII与VWF或LRP1的结合相比较低。在示例性实施方案中，比较物质包括具有约相同平均分子量的PSA与PEG部分。

本发明进一步提供一种用本发明的经修饰FVIII治疗需要此种治疗的受试者的方法。在示例性实施方案中，向诊断患有与FVIII缺乏或另一种因子(例如FVII、FIX)缺乏有关的疾病或病症的哺乳动物施用本发明的包括所公开的经修饰FVIII的药物组合物。

在示例性实施方案中，本发明提供一种治疗哺乳动物受试者的出血性缺陷的方法。示例性方法包括向需要此种治疗的受试者施用有效减轻或消除出血性缺陷的一种或多种症状的量的上述经修饰的FVIII或其药物组合物。在示例性实施方案中，当每4天不超过一次、每5天不超过一次、每6天不超过一次、每7天不超过一次、每8天不超过一次、每9天不超过一次或每10天不超过一次向受试者施用时，药物制剂的施用实现有效减轻或消除出血性缺陷的一种或多种症状的量。

附图说明

图1示出了表示为R_max的结合信号，其为对于在传感器-芯片固定化VWF的三个不同密度下的PSA-rFVIII组和重新缓冲的rFVIII而言，在饱和时的最大结合计算值。

图2示出了PSA-rFVIII和重新缓冲的rFVIII对LRP1的FVIII蛋白浓度依赖性结合的结果。

图3示出了rFVIII强结合至LRP1，PEG-rFVIII呈现与LRP1的残余缔合，且PEG-rFVIII实际上不能与LRP1缔合。

图4示出了在通过凝血酶活化FVIII之后随时间的FXa产生。

图5示出了重新缓冲的rFVIII及PSA-rFVIII的峰值凝血酶产生曲线的评价结果。

图6示出了重新缓冲的rFVIII及PSA-rFVIII的总凝血酶产生曲线。

图7示出了聚乙二醇化及聚唾液酸化rFVIII在小鼠中与rFVIII相比显示改进的PK参数。

图8示出了聚乙二醇化及聚唾液酸化rFVIII在大鼠中与rFVIII相比显示改进的PK参数。

图9示出了聚乙二醇化及聚唾液酸化rFVIII在猕猴中与rFVIII相比显示改进的PK参数。

具体实施方式

治疗蛋白质的药理学和免疫学性质可通过化学修饰和与诸如聚唾液酸(PSA)的聚合化合物进行缀合来改进。所得缀合物的性质通常在很大程度上视聚合物的结构和大小而定。因此，具有限定和狭窄尺寸分布的聚合物通常在本领域中为优选的。合成聚合物如PEG可容易地制成具有狭窄尺寸分布的，而PSA可以某种方式纯化以便产生具有狭窄尺寸分布的最终PSA制剂。

如本文所述，可溶性聚合物诸如经由聚唾液酸化作用的添加为一种改进诸如FVIII的治疗蛋白质的性质的手段。

治疗蛋白质

凝血蛋白

在一个方面中，本发明的起始材料为凝血蛋白，其可来源于人血浆，或通过重组工程改造技术产生，如以下专利中所述：美国专利第4,757,006号；美国专利第5,733,873号；美国专利第5,198,349号；美国专利第5,250,421号；美国专利第5,919,766号；及EP 306968。另外的近期实例包括美国专利第7,645,860号；美国专利第8,637,640号；美国专利第8,642,737号；及美国专利第8,809,501号。

诸如凝血蛋白的治疗蛋白质由蛋白水解酶快速降解且由抗体中和，所述凝血蛋白包括因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS 13蛋白酶。这种现象缩短其半衰期和循环时间，由此限制其治疗有效性。相对较高的剂量和频繁施用为达到并维持这些治疗凝血蛋白的所需治疗或预防效果所必需。因此，难以获得足够剂量调节且需要频繁静脉内施用对患者的生活方式造成限制。

如本文所述，本发明涵盖凝血蛋白，包括但不限于因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS 13蛋白酶。如本文所用，术语“凝血蛋白”指代展现与特定天然凝血蛋白相关的生物活性的任何因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS 13蛋白酶。

凝血级联分为三个不同区段：内源性、外源性和共同途径(Schenone等人,CurrOpin Hematol.2004,11,272-7)。级联涉及一系列丝氨酸蛋白酶(酶原)和蛋白质辅因子。当需要时，非活性酶原前驱体转化为活性形式，其随后转化级联中的下一酶。

内源性途径需要凝血因子VIII、IX、X、XI及XII。内源性途径的起始发生在前激肽释放素、高分子量激肽原、因子XI(FXI)和因子XII(FXII)暴露于带负电荷的表面时。还需要从血小板分泌的钙离子和磷脂。

外源性途径在血管的血管内腔受到损伤时起始。膜糖蛋白组织因子暴露且接着结合于循环因子VII(FVII)和少量已经存在的其活化形式FVIIa。这种结合促进FVII完全转化为FVIIa且随后在钙及磷脂存在下促进因子IX(FIX)转化为因子IXa(FIXa)与因子X(FX)转化为因子Xa(FXa)。FVIIa与组织因子的结合通过使FVII的底物(FIX和FX)结合位点更接近且通过诱导构形变化而增强蛋白水解活性，从而增强FVIIa的酶促活性。

FX的活化是两条途径的共同点。因子Va(FVa)和Xa与磷脂和钙一起将凝血酶原转化为凝血酶(凝血酶原酶复合物)，凝血酶接着裂解纤维蛋白原形成纤维蛋白单体。单体聚合形成纤维蛋白股束。因子XIIIa(FXIIIa)使这些股束彼此共价键结形成刚性网状物。

FVII转化为FVIIa也由多种蛋白酶催化，所述蛋白酶包括凝血酶、FIXa、FXa、因子XIa(FXIa)和因子XIIa(FXIIa)。对于级联早期的抑制而言，组织因子途径抑制剂靶向FVIIa/组织因子/FXa产物复合物。

因子VIII

凝血因子VIII(FVIII)在血浆中以极低浓度循环，并且与冯威勒布兰德因子(VWF)非共价结合。在止血期间，FVIII从VWF分离并且通过在存在钙和磷脂或细胞膜的情况下增强活化速率来充当活化因子IX(FIXa)介导的FX活化的辅因子。

由凝血酶活化的FVIII与结合至低密度脂蛋白受体蛋白(以下称为“LRP”)有牵连(Yakhyaev,A.等人,Blood,第90卷(增刊1),1997,126-I，其以引用的方式并入本文中)。也已被证明，未活化的FVIII与多功能胞吞受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)相互作用(Lenting,P.J.,Neels,J.G.,van den Berg,B.M.M.,Clijsters,P.P.F.M.,Meijerman,D.W.E.,Pannekoek,H.,van Mourik,J.A.,Mertens,K.及van Zonneveld,A.,-J.J.Biol.Chem.1999,274,23734-23739；WO 00/28021；Saenko,E.L.,Yakhyaev,A.V.,Mikhailenko,I.,Strickland,D.K.及Sarafanov,A.G.J.Biol.Chem.1999,274,37685-37692；以引用的方式并入本文中)。提示此受体在自循环中清除FVIII时发挥作用(Saenko,E.L.等人,同上；Schwarz,H.P.,Lenting,P.J.,Binder,B.,Mihaly,J.,Denis,C.,Domer,F.及Turecek,P.L.Blood 2000,95,1703-1708；以引用的方式并入本文中)。

LRP为低密度脂蛋白(LDL)受体家族的成员，所述家族还包括LDL受体、极低密度脂蛋白受体、载脂蛋白E受体2和巨蛋白(关于评论，参见Neels J.G.,Horn,I.R.,van denBerg,B.M.M.,Pannekoek,H.及van Zonneveld,A.-J.Fibrinolysis Proteolysis 1998,12,219-240；Herz,J.及Strickland,D.K.J.Clin.Invest.2001,108,779-784；以引用的方式并入本文中)。其在包括肝、肺、胎盘和脑的多种组织中表达(Moestrup,S.K.,Gliemann,J.及Pallesen,G.Cell Tissue Res.1992,269,375-382；以引用的方式并入本文中)。受体由非共价地连接至跨膜85-kDa.β.链的胞外515-kDaα链组成(Herz,J.,Kowal,R.C.,Goldstein,J.L.及Brown,M.S.EMBO J.1990,9,1769-1776；以引用的方式并入本文中)。α链含有四个具有不同数目的互补型重复序列的团簇，所述重复序列介导许多结构上和功能上不相关的配体的结合(Moestrup,S.K.,Hotlet,T.L.,Etzerodt,M.,Thogersen,H.C.,Nykjaer,A.,Andreasen,P.A.,Rasmussen,H.H.,Sottrup-Jensen,L.及Gliemann,J.J.Biol.Chem.1993,268,13691-13696；Willnow,T.E.,Orth,K.及Herz,J.J.Biol.Chem.1994,269,15827-15832；Neels,J.G.,van den Berg,B.M.M.,Lookene,A.,Olivecrona,G.,Pannekoek,H.及van Zonneveld,A.-J.J.Biol.Chem.1999,274,31305-31311；以引用的方式并入本文中)。

β链包含跨膜结构域和对内吞作用而言必不可少的短胞质尾。α链是用作大的胞外域并包含三种类型的重复序列：表皮生长因子样结构域、Tyr-Trp-Thr-Asp序列和LDL受体A类结构域。已牵连配体结合中的这些A类结构域存在于四个单独的团簇中，称为团簇I(2个结构域)、团簇II(8个结构域)、团簇III(10个结构域)和团簇IV(11个结构域)。

LRP还结合活化的非酶促辅因子因子VIIIa(Yakhyaev,A.等人,Blood,第90卷,(增刊1),1997,126-I)。已经证明FVIII轻链与重组LRP团簇II和IV相互作用，而没有观察到结合至LRP团簇I和III(Neels,J.G.等人1999同上)。

FVIII合成为具有域结构A1-A2-B-A3-C1-C2之约270-330kD之单链前驱体。当自血浆纯化时(例如，“血浆来源”或“血浆性”)，FVIII由重链(A1-A2-B)及轻链(A3-C1-C2)组成。轻链之分子质量为80kD，而归因于B域内之蛋白分解，重链在90-220kD范围内。

FVIII还被合成为在出血病症中用于治疗用途的重组蛋白。已设计各种体外分析以确定重组FVIII(rFVIII)作为治疗药物的潜在功效。这些分析模拟内源性FVIII的体内效应。FVIII的体外凝血酶治疗引起其促凝血活性的快速增加和随后降低，如体外分析所测量的。这种活化和失活均符合重链和轻链两者中特定的限制性蛋白水解，其改变FVIII中不同结合表位的利用率，例如允许FVIII自VWF上解离并结合至磷脂表面或改变对某些单克隆抗体的结合能力。

FVIII的缺乏或机能不良与最常见的出血病症，A型血友病相关。用于控制A型血友病的首选治疗是以血浆来源或rFVIII浓缩物进行的替换疗法。FVIII水平低于1％的患有严重A型血友病的患者通常接受预防疗法以便在各剂量之间保持FVIII高于1％。考虑到各种FVIII产物在循环中的平均半衰期，这个结果可通常通过每周给予FVIII两至三次来实现。

参考多核苷酸和多肽序列包括例如UniProtKB/Swiss-Prot P00451(FA8_HUMAN)；Gitschier J等人,Characterization of the human Factor VIII gene,Nature,1984,312(5992),326-30；Vehar GH等人,Structure of human Factor VIII,Nature,1984,312(5992),337-42；Thompson AR.Structure and Function of the Factor VIII gene andprotein,Semin Thromb Hemost,2002,2003:29,11-29。

多肽

在一个方面中，本发明的起始材料为蛋白质或多肽。如本文所述，术语治疗蛋白质指代展现与治疗蛋白质相关的生物活性的任何治疗蛋白质分子。在本发明的一个实施方案中，治疗蛋白质分子为全长蛋白质。在一个实施方案中，治疗蛋白质为已经修饰以延长半衰期的FVIII。

所涵盖的治疗蛋白质分子包括全长蛋白质、全长蛋白质的前驱体、全长蛋白质的生物活性亚基或片段，以及这些形式中任何形式的治疗蛋白质的生物活性衍生物和变体。因此，治疗蛋白质包括以下的那些：(1)所具有的氨基酸序列在至少约25、约50、约100、约200、约300、约400或更多个氨基酸的区域上与本文所述的参考核酸或氨基酸序列所编码的多肽具有大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％或更大氨基酸序列同一性；和/或(2)特异性结合至针对包含如本文所述的参考氨基酸序列的免疫原、其免疫原性片段，和/或其保守修饰变体所产生的抗体，例如多克隆或单克隆抗体。

根据本发明，术语“重组治疗蛋白质”包括经由重组DNA技术获得的任何治疗蛋白质。在某些实施方案中，术语包括如本文所述的蛋白质。

如本文所使用，“内源性治疗蛋白质”包括来源于意图接受治疗的哺乳动物的治疗蛋白质。术语还包括从转基因或存在于所述哺乳动物中的任何其他外来DNA转录的治疗蛋白质。如本文所使用，“外源性治疗蛋白质”包括并非来源于意图接受治疗的哺乳动物的凝血蛋白质。

如本文所用，“血浆来源的”、“血浆来源的凝血蛋白”或“血浆性”包括在获自哺乳动物的血液中发现的具有参与凝血途径的性质的蛋白质的所有形式。

如本文所用，“生物活性衍生物”或“生物活性变体”包括分子的具有与所述分子实质上相同功能和/或生物性质(诸如结合性质)和/或相同结构基础(诸如肽骨架或基本聚合单元)的任何衍生物或变体。

诸如“变体”或“衍生物”的“类似物”为与天然产生的分子在结构上实质上相似并且具有相同生物活性的化合物，尽管在某些情况下程度不同。例如，多肽变体指代与参考多肽共享实质上类似的结构且具有相同生物活性的多肽。变体或类似物与所述类似物所来源的天然产生多肽相比基于涉及以下方面的一个或多个突变在其氨基酸序列组成方面有所不同：(i)多肽之一个或多个末端和/或天然产生的多肽序列(例如片段)的一个或多个内部区域的一个或多个氨基酸残基缺失，(ii)在多肽的一个或多个末端(通常为“添加”或“融合”)和/或天然产生的多肽序列的一个或多个内部区域(通常为“插入”)插入或添加一个或多个氨基酸，或(iii)一个或多个氨基酸取代天然产生的多肽序列的其他氨基酸。例如，“衍生物”为一种类型的类似物且指代已经修饰(例如化学修饰)的与参考多肽共享相同或实质上类似的结构的多肽。

变体多肽为一种类型的类似物多肽且包括插入变体，其中一个或多个氨基酸残基添加至本发明的治疗蛋白质氨基酸序列中。插入可位于蛋白质的任一末端或两个末端，和/或可定位于治疗蛋白质氨基酸序列的内部区域中。在任一末端或两个末端具有额外残基的插入变体包括例如融合蛋白质和包含氨基酸标签或其他氨基酸标记的蛋白质。在一个方面中，凝血蛋白分子视情况含有N-末端Met，尤其在分子在诸如大肠杆菌(E.coli)的细菌细胞中重组表达时如此。

在缺失变体中，如本文所述的治疗蛋白质多肽中的一个或多个氨基酸残基被移除。缺失可在治疗蛋白质多肽的一个或两个末端，和/或通过移除治疗蛋白质氨基酸序列内的一个或多个残基来实现。因此，缺失变体包括治疗蛋白质多肽序列的片段。

在取代变体中，治疗蛋白质多肽的一个或多个氨基酸残基被移除并且以替代残基进行了置换。在一个方面中，取代在自然界中为保守的且这种类型的保守取代为本领域中熟知的。或者，本发明涵盖同样为非保守的取代。示例性保守取代描述于Lehninger,[Biochemistry,第2版；Worth Publishers,Inc.,New York(1975),第71-77页]中并且直接在下文阐明。

保守取代

或者，示例性保守取代直接在下文阐明。

保守取代II

多核苷酸

编码本发明治疗蛋白质的核酸包括例如且不限于基因、前mRNA、mRNA、cDNA、多型变体、等位基因、合成及天然产生的突变体。

编码本发明治疗蛋白质的聚核苷酸亦包括但不限于具有以下特征者：(1)在严格杂交条件下与编码如本文所述的参考氨基酸序列的核酸和其保守性修饰变体特异性杂交；(2)具有与如本文所述的参考核酸序列在至少约25个、约50个、约100个、约150个、约200个、约250个、约500个、约1000或更多个核苷酸(至多成熟蛋白质的1218个核苷酸的全长序列)的区域上的核苷酸序列同一性大于约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的核酸序列。示例性“严格杂交”条件包括在50％甲酰胺、5X SSC、20mM Na·PO4，pH 6.8中在42℃下杂交；及在1X SSC中在55℃下清洗30分钟。应理解可基于待杂交的序列的长度和GC核苷酸含量对这些示例性条件作出改变。本领域中的公式标准适合于确定合适的杂交条件。参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)§§9.47-9.51。

“天然产生”的多核苷酸或多肽序列通常来自哺乳动物，包括但不限于灵长类动物，例如人类；啮齿动物，例如大鼠、小鼠、仓鼠；牛、猪、马、绵羊，或任何哺乳动物。本发明的核酸及蛋白质可为重组分子(例如异源分子和编码野生型序列或其变体的分子，或天然产生的分子)。

治疗蛋白质的产生

治疗蛋白质的产生包括在本领域中已知用于执行以下步骤的任何方法：(i)通过遗传工程化来产生重组DNA，(ii)通过例如但不限于转染、电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞中，(iii)培养所述的转化细胞，(iv)例如原构性或在诱导后表达治疗蛋白质，和(v)例如从培养基或通过收获转化的细胞来分离所述凝血蛋白质，以便获得纯化的治疗蛋白质。

在其他方面中，治疗蛋白质通过在特征为可产生药理学上可接受的凝血蛋白质分子的合适原核或真核宿主系统中表达来产生。真核细胞的实例为哺乳动物细胞，诸如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep及HepG2。

多种载体用于制备治疗蛋白质并且选自真核和原核表达载体。用于原核表达的载体的实例包括质粒，诸如但不限于pRSET、pET及pBAD，其中用于原核表达载体中的启动子包括但不限于以下中的一种或多种：lac、trc、trp、recA，或araBAD。用于真核表达的载体的实例包括：(i)用于在酵母中表达的载体诸如但不限于pAO、pPIC、pYES，或pMET，其使用启动子诸如但不限于AOX1、GAP、GAL1，或AUG1；(ii)用于在昆虫细胞中表达的载体诸如但不限于pMT、pAc5、pIB、pMIB，或pBAC，其使用启动子诸如但不限于PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64，或polh，和(iii)用于在哺乳动物细胞中表达的载体诸如但不限于pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3，或pBPV，并且在一个方面中来源于病毒系统的载体诸如但不限于牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒，或逆转录病毒，其使用启动子诸如但不限于CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV，及β-肌动蛋白。

另外的近期实例包括美国专利第7,645,860号；美国专利第8,637,640号；美国专利第8,642,737号；及美国专利第8,809,501号。

施用

在一个实施方案中，本发明的缀合治疗蛋白质可通过注射，诸如静脉内、肌肉内或腹膜内注射进行施用。

为向人或测试动物施用包含本发明的缀合治疗蛋白质的组合物，在一个方面中，组合物包含一种或多种药学上可接受的载体。术语“药学上”或“药学上可接受”指代分子实体和组合物为稳定的，可抑制蛋白质降解诸如聚集并裂解产物，并且另外如下所述在使用本领域中熟知的途径施用时不产生过敏，或其他不良反应。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床上适用的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌及抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂和其类似试剂，包括以上公开的那些试剂。

如本文所使用，“有效量”包括适合于治疗疾病或病症或减轻疾病或病症的症状的剂量。在一个实施方案中，“有效量”包括适合于治疗患有如本文所述的出血病症的哺乳动物的剂量。

组合物可口服、局部、透皮、肠胃外、通过吸入喷雾、阴道、直肠、或颅内注射施用。如本文所使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、脑池内注射，或输注技术。也涵盖通过静脉内、真皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和或手术植入于特定位点来施用。通常，组合物基本上无热原，以及可能对接受者有害的其他杂质。

可以治疗医师选择的剂量水平和模式来执行组合物的单次或多次施用。为了预防或治疗疾病，合适剂量视如上所述的待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和过程、施用药物是出于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的临床史以及对于药物的反应，和主治医师的裁量而定。

本发明还涉及包含有效量的如本文所定义的缀合治疗蛋白质的药物组合物。药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂、盐、缓冲剂或赋形剂。药物组合物可用于治疗以上定义的出血病症。本发明的药物组合物可为溶液或冻干产品。药物组合物的溶液可经受任何适合的冻干过程。

作为另一方面，本发明包括包含本发明的组合物以有利于用于施用至受试者的方式封装的试剂盒。在一个实施方案中，这类试剂盒包含包装于容器诸如密封瓶或器皿中的本文所述的化合物或组合物(例如，包含缀合治疗蛋白质的组合物)，所述容器具有贴附于其上的标签或包含于包装中以描述化合物或组合物在实施所述方法中的用法。在一个实施方案中，试剂盒含有：具有包含缀合治疗蛋白质的组合物的第一容器和具有用于第一容器中的组合物的生理可接受的重构溶液的第二容器。在一个方面中，化合物或组合物以单位剂型来包装。试剂盒还可包括适合于根据特定施用途径来施用组合物的装置。优选地，试剂盒含有描述治疗蛋白质或肽组合物的用法的标签。

水溶性聚合物

在一个方面中，所提供的治疗蛋白质衍生物(即，缀合的治疗蛋白质)结合至水溶性聚合物，其包括但不限于聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、聚三葡萄糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚亚烷基氧化物(PAO)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基甲缩醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基铵(MPC)。在本发明的一个实施方案中，水溶性聚合物是由具有350至120,000Da、500至100,000Da、1000至80,000Da、1500至60,000Da、2,000至45,000Da、3,000至35,000Da、及5,000至25,000Da的分子量范围的唾液酸分子组成。水溶性聚合物的偶合可通过与蛋白质直接偶合或经由连接基分子来执行。化学连接基的一个实例为含有碳水化合物选择性酰肼和巯基反应性马来酰亚氨基团的MBPH(4-[4-N-马来酰亚氨基苯基]丁酸酰肼)(Chamow等人,J Biol Chem 1992,267,15916-22)。其他示例性和优选连接基于下文描述。

同双官能连接基

在示例性实施方案中，水溶性聚合物的偶合经由同双官能连接基进行。在示例性实施方案中，同双官能连接基在交联剂间隔臂的两端处具有相同的反应性基团且具有式Y-L-Y。在示例性实施方案中，同双官能连接基为NH₂[OCH₂CH₂]_n’ONH₂，其中n’＝1-10。在示例性实施方案中，同双官能连接基为NH₂[OCH₂CH₂]₂ONH₂。在示例性实施方案中，同双官能连接基为NH₂[OCH₂CH₂]₄ONH₂。在示例性实施方案中，同双官能连接基为NH₂[OCH₂CH₂]₆ONH₂。在示例性实施方案中，同双官能连接基为NH₂[OCH₂CH₂]₈ONH₂。在示例性实施方案中，同双官能连接基为NH₂[OCH₂CH₂]₁₀ONH₂。

在一个实施方案中，与天然治疗蛋白质产物相比，衍生物保留天然治疗蛋白质产物的完全功能活性，且提供延长的体内半衰期。在一示例性实施方案中，相对于天然凝血蛋白，衍生物保留至少约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、约99、约100,110、约120、约130、约140或约150％生物活性。在示例性实施方案中，相对于天然rFVIII，PSA-rFVIII缀合物获得约70％更大的比放射性。在示例性实施方案中，衍生物和天然凝血蛋白的生物活性是通过发色活性与凝血因子抗原值的比率进行测定(凝血因子:Chr:凝血因子:Ag)。在本发明的示例性实施方案中，构建体的半衰期相对于天然治疗蛋白质的体内半衰期减少或延长约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10倍。

在示例性实施方案中，衍生物，例如，包括如本文所述的PSA的经修饰的FVIII的修饰方式使得降低或以其他方式限制经修饰的FVIII与诸如VWF或LRP1的一种或多种配体相互作用(例如结合)的能力。例如，根据本公开的经修饰的FVIII包括FVIII，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个PSA部分直接连接于其上以分离FVIII的氨基酸或连接于例如FVIII上的碳水化合物部分。如本文所公开，涵盖一种氨基氧基连接基，其中连接经由FVIII碳水化合物部分发生。

在各种实施方案中，经修饰的FVIII对例如VWF和/或LRP1的结合亲和力直接与经修饰的FVIII的半衰期有关。例如，结合至VWF越强，半衰期受到VWF而非受到例如水溶性聚合物的控制越多。以这种方式，更严重地减少VWF结合的修饰将基于与VWF相反由水溶性聚合物赋予的阻止清除的性质而控制半衰期延长。

唾液酸和PSA

PSA由N-乙酰神经氨酸的聚合物(通常均聚物)组成。二级氨基通常承载乙酰基，但是其可替代地承载羟乙酰基。羟基上的可能取代基包括乙酰基、乳酰基、乙基、硫酸酯、及磷酸酯基团。

唾液酸(N-乙酰神经氨酸)的结构

PSA和mPSA通常包含基本上由通过2,8-或2,9-糖苷键或其组合(例如交替2,8-和2,9-键)连接的N-乙酰神经氨酸部分组成的线性聚合物。在尤其优选的PSA和mPSA中，糖苷键为α-2,8。这类PSA和mPSA便利地自多聚唾液酸获得，并且在本文中称为“CA”和“mCA”。典型PSA和mPSA包含至少2个、优选至少5个、更优选至少10个和最优选至少20个N-乙酰神经氨酸部分。因此，其可包含2至300个N-乙酰神经氨酸部分、优选5至200个N-乙酰神经氨酸部分，或最优选10至100个N-乙酰神经氨酸部分。PSA和CA优选基本上不含除N-乙酰神经氨酸以外的糖部分。因此，PSA和CA优选包含至少90％、更优选至少95％和最优选至少98％N-乙酰神经氨酸部分。

部分的氧化

当PSA和CA包含除N-乙酰神经氨酸以外的部分(例如在mPSA和mCA中)时，这些部分优选位于聚合物链的一个或两个末端处。这类“其他”部分可例如为通过氧化或还原自末端N-乙酰神经氨酸部分衍生的部分。

例如，WO-A-0187922描述非还原末端N-乙酰神经氨酸单元通过与过碘酸钠反应而转化为醛基的这类mPSA和mCA。另外，WO 2005/016974描述还原末端N-乙酰神经氨酸单元经受还原以将还原末端N-乙酰神经氨酸单元处的环还原性打开，由此形成邻位二醇基团，继而通过氧化以将邻接的二醇基团转化为醛基的这类mPSA和mCA。

富含唾液酸的糖蛋白在人和其他生物体中结合选择素。它们在人流感感染中起重要作用。例如，唾液酸可掩蔽宿主细胞表面上的甘露糖抗原或掩蔽细菌免于暴露于甘露糖结合凝集素。这防止补体的活化。唾液酸还掩蔽倒数第二个半乳糖残基，由此防止糖蛋白通过肝实质细胞上的半乳糖受体的快速清除。

多聚唾液酸(N-乙酰神经氨酸的均聚物)的结构

多聚唾液酸(PSA的亚类)为具有α(2→8)酮苷键的N-乙酰神经氨酸(NANA)的均聚物，且尤其是由具有K1抗原的大肠杆菌的特定菌株产生。多聚唾液酸具有许多生理功能。其为药物和化妆品的重要原料。

聚唾液酸化与未经修饰天冬酰胺酶的体内比较研究揭示聚唾液酸化可增加酶的半衰期(Fernandes和Gregoriadis,Biochimica Biophysica Acta 1997,1341,26-34)。

如本文所使用，“唾液酸部分”包括唾液酸单体或聚合物(“多糖”)，其可溶于水溶液或悬浮液中并且在以药学有效量施用PSA-凝血蛋白质缀合物后，对于哺乳动物几乎没有负面影响，诸如副作用。在一个方面中，聚合物经表征为具有约1、约2、约3、约4、约5、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400或约500个唾液酸单元。在示例性实施方案中，聚唾液酸包括许多个唾液酸单元以使得聚合物具有约20kD的分子重量。在某些方面中，将不同唾液酸单元组合在一个链中。

在本发明的一个实施方案中，多糖化合物的唾液酸部分具有高度亲水性，并且在示例性实施方案中，整个化合物具有高度亲水性。亲水性主要由唾液酸单元的悬垂羧基、以及羟基来赋予。糖单元可含有其他官能基，诸如胺、羟基或硫酸酯基团，或其组合。此等基团可存在于天然产生的糖化合物上，或引入衍生多糖化合物中。

天然产生的聚合物PSA可获得其展示宽的大小分布(例如Sigma C-5762)和高多分散性(PD)的多分散制剂。因为多糖通常在带有共纯化内毒素的固有风险的细菌中产生，所以纯化长唾液酸聚合物链可提高内毒素含量增加的可能性。具有1-4个唾液酸单元的短PSA分子也可合成制备(Kang SH等人,Chem Commun.2000；227-8；Ress DK及Linhardt RJ,Current Organic Synthesis.2004；1:31-46)，由此使高内毒素水准的风险降至最低。然而，现在可制造同样不含内毒素的具有狭窄大小分布和低多分散性的PSA制剂。在一个方面中，特定用于本发明的多糖化合物为由细菌产生者。这些天然产生的多糖中的一些被称为糖脂。在一个实施方案中，多糖化合物实质上不含末端半乳糖单元。

连接方法

治疗蛋白质可通过本领域的技术人员已知的各种技术中的任何技术共价地连接至多糖化合物。在本发明的不同方面中，唾液酸部分结合至治疗蛋白质，例如FIX、FVIII、FVIIa或VWF，例如通过美国专利第4,356,170号中所述的方法，所述专利以引用的方式并入本文中。另外的近期实例包括美国专利第7,645,860号；美国专利第8,637,640号；美国专利第8,642,737号；及美国专利第8,809,501号，所述专利以引用的方式并入本文中。

使PSA与多肽偶合的其他技术也为己知的并且由本发明涵盖。例如，美国专利公布第2007/0282096号描述使例如PSA的胺或酰肼衍生物与蛋白质缀合。另外，美国专利公布第2007/0191597号描述含有用于与受质(例如，蛋白质)的还原末端反应的醛基的PSA衍生物。这些参考文献全部以引用方式并入。

各种方法在美国专利第5,846,951号(全部以引用方式并入)的第7栏第15行至第8栏第5行被公开。示例性技术包括经由凝血蛋白质或多糖任一者上的羧基与凝血蛋白质或多糖的氨基之间的肽键的键合，或凝血蛋白质或多糖的羧基与治疗蛋白质或多糖的羟基之间的酯键。治疗蛋白质借此共价地键结至多糖化合物的另一种键是经由介于凝血蛋白上的游离氨基之间的席夫碱，所述游离氨基通过高碘酸盐氧化作用与多糖的非还原端处形成的醛基反应(Jennings HJ及Lugowski C,J Immunol.1981；127:1011-8；Fernandes AI及Gregoriadis G,Biochim Biophys Acta.1997；1341；26-34)。在一个方面中，所产生的席夫碱通过以NaCNBH₃特异性还原以形成二级胺来稳定化。替代方法是通过在先前氧化之后以NH₄Cl还原性胺化来产生PSA中的末端游离氨基。双官能试剂可用于连接两个氨基或两个羟基。例如，含有氨基的PSA通过如BS3(双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯/Pierce，Rockford，IL)的试剂来与蛋白质的氨基偶合。另外，如磺基-EMCS(N-ε-马来酰亚胺己酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯/Pierce)的异双官能交联试剂用于例如连接胺和硫醇基团。

在示例性实施方案中，制备PSA酰肼并且将其在先前氧化并产生醛官能基之后与蛋白质的碳水化合物部分偶合。

如上所述，治疗蛋白质的游离氨基与唾液酸残基的1-羧基反应以形成肽键或在1-羧酸基团与凝血蛋白质上的羟基或其他合适活性基团之间形成酯键。或者，羧基与脱乙酰化5-氨基形成肽键，或治疗蛋白质分子的醛基与唾液酸残基的N-脱乙酰化5-氨基形成席夫碱。

或者，多糖化合物以非共价方式与治疗蛋白质缔合。例如，在一个方面中，多糖化合物与药学活性化合物经由疏水性相互作用相连接。其他非共价缔合包括静电相互作用，其中带相反电荷的离子彼此吸引。

在各种实施方案中，治疗蛋白质以化学计量的量(例如，1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:7、1:8、1:9或1:10等)与多糖化合物连接或缔合。在各种实施方案中，1-6、7-12或13-20个多糖连接至凝血蛋白。在其他实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个多糖连接至凝血蛋白。

在各种实施方案中，对治疗蛋白质进行修饰以引入糖基化位点(即除天然糖基化位点以外的位点)。可使用本领域中已知的标准分子生物技术完成这种修饰。此外，治疗蛋白质在经由一个或多个糖部分缀合至水溶性聚合物之前可在体内或体外糖基化。此等糖基化位点可充当蛋白质与水溶性聚合物缀合的靶标(美国专利申请第20090028822号、美国专利申请第2009/0093399号、美国专利申请第2009/0081188号、美国专利申请第2007/0254836号、美国专利申请第2006/0111279号，和DeFrees S.等人,Glycobiology,2006,16,9,833-43)。例如，体内不天然糖基化的蛋白质(例如，并非糖蛋白的蛋白质)可如上所述进行修饰。

氨基氧基键

在本发明的一个实施方案中，在制备凝血蛋白的缀合物中采用使羟胺或羟胺衍生物与醛(例如，在通过过碘酸钠进行氧化之后的碳水化合物部分上)反应以形成肟基。例如，首先用诸如过碘酸钠(NaIO₄)的氧化剂对糖蛋白(例如本发明的治疗蛋白质)进行氧化(Rothfus JA和Smith EL.,J Biol Chem 1963,238,1402-10；以及Van Lenten L和AshwellG.,J Biol Chem 1971,246,1889-94)。糖蛋白的过碘酸盐氧化是基于描述在1928年的经典马兰泼拉德(Malaprade)反应，即以过碘酸盐来氧化邻位二醇以形成活性醛基(MalapradeL.,Analytical application,Bull Soc Chim France,1928,43,683-96)。这类氧化剂的其他实例为四乙酸铅(Pb(OAc)4)、乙酸锰(MnO(Ac)3)、乙酸钴(Co(OAc)2)、乙酸铊(TlOAc)、硫酸铈(Ce(SO4)2)(US 4,367,309)或过钌酸钾(KRuO4)(Marko等人,J Am Chem Soc 1997,119,12661-2)。“氧化剂”意谓能够在生理反应条件下使碳水化合物中的邻位二醇氧化，从而产生活性醛基的温和氧化性化合物。

第二步骤为使含有氨基氧基的聚合物与氧化的碳水化合物部分偶合以形成肟键。在本发明的一个实施方案中，这个步骤可在催化量的亲核催化剂苯胺或苯胺衍生物存在下进行(Dirksen A et Dawson PE,Bioconjugate Chem.2008；Zeng Y等人,Nature Methods2009,6,207-9)。苯胺催化作用极大地加速肟连接反应，使得可使用非常低浓度的该等试剂。在本发明的示例性实施方案中，肟键联通过用NaCNBH₃还原形成烷氧基胺键联而稳定化。其他催化剂于下文描述。

关于氨基氧基技术的另外信息可见于以下参考文献中，其各自以全文引用方式并入：EP 1681303A1(HAS化红血球生成素)；WO 2005/014024(聚合物与蛋白质通过肟连接基团而缀合)；WO96/40662(含有氨基氧基的连接基化合物和其在缀合中的应用)；WO 2008/025856(经修饰的蛋白质)；Peri F等人,Tetrahedron 1998,54,12269-78；Kubler-Kielb Jet.Pozsgay V.,J Org Chem 2005,70,6887-90；Lees A等人,Vaccine 2006,24(6),716-29；及Heredia KL等人,Macromoecules 2007,40(14),4772-9。

本公开涵盖将水溶性聚合物与氨基氧基连接基偶合的众多方法。例如，本文描述连接基与诸如PSA的水溶性聚合物的还原或非还原端的偶合。偶合位点(例如，还原端对比非还原端)是通过水溶性聚合物的偶合过程的一个或多个条件(例如，时间和温度)以及状态(例如，天然对比氧化)来确定。在一个实施方案中，氧化的水溶性聚合物诸如PSA是通过在降低的温度(例如，介于2-8℃之间)下进行偶合反应在其非还原端偶合至连接基。在示例性实施方案中，天然(例如非氧化)的水溶性聚合物诸如PSA是通过在较高温度(例如，介于22-37℃之间)下进行偶合反应在其还原端偶合至氨基氧基连接基。上述实施方案在下文和实例中更详细地描述。

如本文所述，氧化的PSA与二氨基氧基连接基的反应展示两个反应：在非还原端处醛基的“快反应”，和在还原端处的“慢反应”。如果天然PSA(其未经氧化且不含活性醛基)在室温下与还原端反应，那么可观察到衍生化的PSA。因此，在各种实施方案中，为了使诸如PSA的水溶性聚合物的还原端处不期望的副反应减至最少，在介于2-8℃之间的温度下进行PSA-氨基氧基连接基试剂制备。

在本公开的示例性实施方案中，提供天然PSA在还原端处的衍生化。如本文所述，天然PSA(其未通过NaIO₄进行氧化且因此在其非还原端不含游离醛基)在室温下与二氨基氧基连接基反应，可在其还原端处观察到PSA的衍生化。这种偶合经由在还原端处的开环和后续肟形成而发生(如上所述的实际副反应和副产物在氨基氧基-PSA试剂中存在的原因)。在示例性实施方案中，用产生至多以下修饰度之天然PSA进行反应：约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98或约99％。在示例性实施方案中，用产生至多约70％的修饰度的天然PSA进行反应。

在示例性实施方案中，用产生约20％至约99％的修饰度的天然PSA进行反应并且PSA-rFVIII缀合物相对于天然rFVIII获得高约20％至约150％的比活性。在示例性实施方案中，用产生约30％至约90％的修饰度的天然PSA进行反应并且PSA-rFVIII缀合物相对于天然rFVIII获得高约30％至约140％的比活性。在示例性实施方案中，用产生约30％至约80％的修饰度的天然PSA进行反应并且PSA-rFVIII缀合物相对于天然rFVIII获得高约40％至约130％的比活性。在示例性实施方案中，用产生约30％至约70％之修饰度的天然PSA进行反应并且PSA-rFVIII缀合物相对于天然rFVIII获得高约50％至约120％的比活性。在示例性实施方案中，用产生约30％至约60％的修饰度的天然PSA进行反应并且PSA-rFVIII缀合物相对于天然rFVIII获得高约40％至约110％的比活性。在示例性实施方案中，用产生至多约35％的修饰度的天然PSA进行反应并且PSA-rFVIII缀合物相对于天然rFVIII获得高约50％至约120％的比活性。在示例性实施方案中，用产生至多约54％的修饰度的天然PSA进行反应并且PSA-rFVIII缀合物相对于天然rFVIII获得高约50％至约120％的比活性。在示例性实施方案中，用产生至多约58％的修饰度的天然PSA进行反应并且PSA-rFVIII缀合物相对于天然rFVIII获得高约50％至约120％的比活性。在示例性实施方案中，用产生至多约70％的修饰度的天然PSA进行反应并且PSA-rFVIII缀合物相对于天然rFVIII获得高约70％的比活性。

通过13C NMR光谱学确定以下结构作为主要产物

在示例性实施方案中，PSA和mPSA包含至少2个，优选至少5个，更优选至少10且最优选至少20个N-乙酰神经氨酸部分(n)。在示例性实施方案中，n可包含2至300个N-乙酰神经氨酸部分。在示例性实施方案中，n可包含5至200个N-乙酰神经氨酸部分。在示例性实施方案中，n可包含10至100个N-乙酰神经氨酸部分。在示例性实施方案中，聚唾液酸包括许多个唾液酸单元以使得聚合物具有约20kD的分子重量。反应可转移至如葡聚糖和淀粉的其他碳水化合物或含有还原性端基的其他多糖。还涵盖如间甲苯胺或苯胺的亲核催化剂的使用。因此，本文提供使用天然PSA(即无先前氧化)制备氨基氧基-PSA试剂，其随后可用于治疗蛋白质的化学修饰。

因此，在本公开的各种实施方案中，提供以下方法：其中二氨基氧基连接基偶合至诸如氧化的PSA的水溶性聚合物的条件(例如，2-8℃孵育温度)有利于偶合至非还原端或者在一个替代方案中，其中二氨基氧基连接基偶合至诸如天然的非氧化PSA的水溶性聚合物的条件(例如，室温孵育)有利于偶合至还原端。

在本发明的各种实施方案中，根据本文所述的氨基氧基技术与治疗蛋白质(例如，FVIII、FVIIa或FIX)的氧化的碳水化合物部分连接的水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、聚三葡萄糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚亚烷基氧化物(PAO)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基甲缩醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基铵(MPC)。

亲核催化剂

如本文所述，水溶性聚合物与治疗蛋白质的缀合可利用苯胺来催化。苯胺有力地催化醛和酮与胺的水性反应以形成稳定亚胺诸如腙及肟。下图将未经催化的肟连接反应与苯胺催化的肟连接反应进行比较(Kohler JJ,Chem Bio Chem 2009,10,2147-50)：

然而，考虑到与苯胺相关的众多健康风险，需要替代催化剂。本发明提供作为替代肟连接催化剂的苯胺衍生物。这类苯胺衍生物包括但不限于邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、磺氨酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺、和对茴香胺。

在本发明的一个实施方案中，使用间甲苯胺(也称为间甲苯胺、间甲基苯胺、3-甲基苯胺或3-氨基-1-甲基苯)来催化本文所述的缀合反应。间甲苯胺及苯胺具有相似物理性质和基本上相同的pKa值(间甲苯胺：pKa 4.73，苯胺：pKa 4.63)。

本发明的亲核性催化剂适用于肟连接(例如使用氨基氧基键联)或腙形成(例如使用酰肼化学)。在本发明的各种实施方案中，在缀合反应中提供以下浓度的亲核催化剂：约0.1、约0.2、约0.3、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约25、约30、约35、约40、约45、或约50mM。在一个实施方案中，提供约1mM至约10mM的量的亲核催化剂。在本发明的各种实施方案中，缀合反应混合物的pH为约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0及约7.5。在一个实施方案中，pH为约5.5至约6.5。

缀合蛋白质的纯化

在各种实施方案中，已与氧化剂一起孵育的蛋白质和/或根据本公开已与水溶性聚合物进行缀合的治疗蛋白质需要纯化。众多纯化技术为本领域中已知的并且包括但不限于色谱法，诸如离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱或其组合；过滤法(例如，UF/DF)；和沉淀法以及透析程序及上述技术的任何组合(Guide to ProteinPurification,Meth.Enzymology第463卷(由Burgess RR及Deutscher MP编着),第2版,Academic Press 2009)。

功效

在各种实施方案中，鼠模型可用于评价半衰期功效。在各种实施方案中，鼠模型可用于评价半衰期功效。在示例性实施方案中，鼠模型系用于测定PSA修饰的FVIII，其具有比聚乙二醇化FVIII更长的体内半衰期。在示例性实施方案中，鼠模型被用于测定缀合至具有约20kDa的平均分子量的PSA部分的经修饰的FVIII具有比缀合至具有约20kDa的平均分子量的PEG部分的聚乙二醇化FVIII更长的体内半衰期。在示例性实施方案中，在FVIII KO小鼠中的尾夹出血模型被用于测定PSA修饰的FVIII，其具有比聚乙二醇化FVIII更长的体内半衰期。在示例性实施方案中，在FVIII KO小鼠中的颈动脉闭塞模型被用于测定PSA修饰的FVIII，其具有比聚乙二醇化FVIII更长的体内半衰期。在示例性实施方案中，血友病关节出血(关节内穿刺术)的鼠模型被用于测定PSA修饰的FVIII，其具有比聚乙二醇化FVIII更长的体内半衰期。

以下实例不意图对本发明造成限制，而是仅为本发明的特定实施方案的示例。

实例

实例1

同双官能连接基NH₂[OCH₂CH₂]₂ONH₂的制备

同双官能连接基NH₂[OCH₂CH₂]₂ONH₂

根据Boturyn等人(Tetrahedron 1997,53,5485-92)在采用第一胺的修改的加百利合成(Gabriel-Synthesis)的两步有机反应中合成含有两个活性氨基氧基的(3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺)。在第一步骤中，将一个分子的2,2-氯二乙醚与两个分子的内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺在二甲基甲酰胺(DMF)中反应。所需同双官能产物通过乙醇中的肼解作用由所得中间体制备。

实例2

同双官能连接基NH₂[OCH₂CH₂]₄ONH₂的制备

同双官能连接基NH₂[OCH₂CH₂]₄ONH₂

根据Boturyn等人(Tetrahedron 1997,53,5485-92)在采用第一胺的修改的加百利合成的两步有机反应中合成含有两个活性氨基氧基的(3,6,9-三氧杂-十一烷-1,11-二氧基胺)。在第一步骤中，将一个分子的双-(2-(2-氯乙氧基)-乙基)-醚与两个分子的内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺在DMF中反应。所需同双官能产物通过乙醇中的肼解作用由所得中间体制备。

实例3

同双官能连接基NH₂[OCH₂CH₂]₆ONH₂的制备

同双官能连接基NH₂[OCH₂CH₂]₆ONH₂

根据Boturyn等人(Tetrahedron 1997,53,5485-92)在采用第一胺的修改的加百利合成的两步有机反应中合成含有两个活性氨基氧基的(3,6,9,12,15-五氧杂-十七烷-1,17-二氧基胺)。在第一步骤中，使一分子六乙二醇二氯与两分子内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰胺在DMF中反应。所需同双官能产物通过乙醇中的肼解作用由所得中间体制备。

实例4

氨基氧基-PSA试剂的详细合成

3-氧杂-戊烷-1,5二氧基胺根据Botyryn等人(Tetrahedron 1997；53:5485-92)如实例1中概述的两步有机合成中经合成。

步骤1：

向内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(59.0g；1.00当量)在700mL无水N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中添加无水K₂CO₃(45.51g；1.00当量)和2,2-二氯二乙醚(15.84mL；0.41当量)。将反应混合物在50℃下搅拌22h。将混合物在减压下蒸发至干。将残余物悬浮于2L二氯甲烷中并且以饱和NaCl水溶液萃取两次(每次1L)。将二氯甲烷层经Na₂SO₄干燥，接着在减压下蒸发至干并且在高真空中干燥得到64.5g呈白黄色固体形式的3-氧杂戊烷-1,5-二氧-内-2',3'-二羧基二酰亚胺降冰片烯(中间体1)。

步骤2：

向中间体1(64.25g；1.00当量)于800mL无水乙醇中的溶液中添加31.0mL水合肼(4.26当量)。接着使反应混合物回流2小时。通过在减压下蒸发溶剂将混合物浓缩至起始体积的一半。将出现的沉淀物过滤掉。将剩余乙醇层在减压下蒸发至干。将含有粗产物3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺的残余物在真空中干燥以获得46.3g。将粗产物通过管柱色谱(硅胶60；以二氯甲烷/甲醇混合物进行等度洗脱，9/1)进一步纯化获得11.7g纯最终产物3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。

实例5

氨基氧基-PSA的制备

将从Serum Institute of India(Pune,India)获得的1000mg氧化的PSA(MW＝20kD)溶解于16mL 50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0中。接着将170mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺加入反应混合物。在室温下振荡2小时之后，添加78.5mg氰基硼氢化钠并且执行反应18小时隔夜。接着使用以再生纤维素制成的具有5kD截留量的膜(50cm²，Millipore)使反应混合物经受超滤/渗滤程序(UF/DF)。

实例6

采用色谱纯化步骤的氨基氧基-PSA的制备

将从Serum Institute of India(Pune,India)获得的1290mg氧化的PSA(MW＝20kD)溶解于25mL 50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0(缓冲液A)中。接着将209mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺加入反应混合物。在室温下振荡1小时之后，添加101mg氰基硼氢化钠并且执行反应3小时。随后使混合物经受采用Fractogel EMD DEAE 650-M色谱凝胶(管柱尺寸：XK26/135)的弱阴离子交换色谱。反应混合物用110mL缓冲液A稀释并且以1cm/min的流速装载至用缓冲液A预平衡的DEAE管柱上。接着用20CV缓冲液B(20mM Hepes，pH 6.0)以2cm/min的流速洗涤管柱以移除游离的3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺和氰化物。随后用由67％缓冲液B和43％缓冲液C(20mM Hepes，1M NaCl，pH 7.5)组成的不连续梯度洗脱氨基氧基-PSA试剂。将洗脱物使用由聚醚砜制成的5kD膜(50cm²，Millipore)通过UF/DF来浓缩。最终渗滤步骤相对于缓冲液D(20mM Hepes，90mM NaCl，pH 7.4)执行。制剂通过量测总PSA(间苯二酚分析)和总氨基氧基(TNBS分析)以确定修饰度来加以分析表征。此外，测定多分散性以及游离3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺和氰化物。

实例7

在无还原步骤下氨基氧基-PSA的制备

将从Serum Institute of India(Pune,India)获得的573mg氧化的PSA(MW＝20kD)溶解于11.3mL 50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0(缓冲液A)中。接着将94mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺加入反应混合物。接着在室温下振荡5h之后，使混合物经受使用FractogelEMD DEAE 650-M色谱凝胶(管柱尺寸：XK16/105)的弱阴离子交换色谱步骤。反应混合物用50mL缓冲液A稀释并且以1cm/min的流速装载至用缓冲液A预平衡的DEAE管柱上。接着用20CV缓冲液B(20mM Hepes，pH 6.0)以2cm/min的流速洗涤管柱以移除游离的3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺和氰化物。用由67％缓冲液B和43％缓冲液C(20mM Hepes，1M NaCl，pH 7.5)组成的不连续梯度洗脱氨基氧基-PSA试剂。将洗脱物使用由聚醚砜制成的5kD膜(50cm²，Millipore)通过UF/DF来浓缩。最终渗滤步骤相对于缓冲液D(20mM Hepes，90mM NaCl，pH7.4)执行。制剂通过量测总PSA(间苯二酚分析)和总氨基氧基(TNBS分析)以确定修饰度来加以分析表征。此外，测定多分散性以及游离3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。

实例8

在亲核催化剂间甲苯胺存在下在无还原步骤下氨基氧基-PSA的制备

将从Serum Institute of India(Pune,India)获得的573mg氧化的PSA(MW＝20kD)溶解于9mL 50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0(缓冲液A)中。接着将94mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺加入此溶液中。随后将2.3mL 50mM间甲苯胺储备溶液添加至此反应混合物中。接着在室温下振荡2h之后，使混合物经受使用Fractogel EMD DEAE 650-M色谱凝胶(管柱尺寸：XK16/105)的弱阴离子交换色谱步骤。反应混合物用50mL缓冲液A稀释并且以1cm/min的流速装载至用缓冲液A预平衡的DEAE管柱上。接着用20CV缓冲液B(20mM Hepes，pH 6.0)以2cm/min的流速洗涤管柱以移除游离3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺及氰化物。用由67％缓冲液B和43％缓冲液C(20mM Hepes，1M NaCl，pH 7.5)组成的不连续梯度洗脱氨基氧基-PSA试剂。将洗脱物使用由聚醚砜制成的5kD膜(50cm²，Millipore)通过UF/DF来浓缩。最终渗滤步骤相对于缓冲液D(20mM Hepes，90mM NaCl，pH 7.4)执行。制剂通过量测总PSA(间苯二酚分析)和总氨基氧基(TNBS分析)以测定修饰度来加以分析表征。此外，测定多分散性以及游离3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。

实例9

氨基氧基-PSA试剂之制备

根据实例4-8制备氨基氧基-PSA试剂。渗滤之后，将产物在-80℃下冷冻并且冻干。冻干之后，将试剂溶解于合适体积的水中并且用于经由碳水化合物修饰来制备PSA-蛋白质缀合物。

实例10

使用氨基氧基-PSA和间甲苯胺作为亲核催化剂的rFVIII的聚唾液酸化

方法1：

将50mg rFVIII转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中并稀释以获得1mg/mL的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO₄以获得200μM的最终浓度。在黑暗中，在轻柔振荡下，在室温下进行氧化30min。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应持续60min。使溶液经受用缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl₂，pH 7.0)平衡的具有20mL体积的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。接着用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl₂、1M NaCl，pH 7.0)洗脱氧化的rFVIII。收集含有rFVIII之洗脱份。测定(Coomassie,Bradford)蛋白质含量并且用反应缓冲液调节至1mg/mL并通过逐滴添加0.5M HCl调节至pH 6.0。接着添加50倍摩尔过量的具有20kD的MW(如上所述)的氨基氧基-PSA试剂，随后添加间甲苯胺作为亲核催化剂(最终浓度：10mM)。在室温下，在轻柔振荡下，在黑暗中进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量的氨基氧基-PSA试剂。通过添加含有乙酸铵(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)的缓冲液使反应混合物的电导率升至130mS/cm并且装载至用80mL苯基琼脂糖FF(GE Healthcare,Fairfield,CT)填充的管柱上，所述管柱是用50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.9预平衡。随后，用50mM含有5mM CaCl₂的Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最终，收集含有PSA-rFVIII的洗脱份并且通过使用由再生纤维素制成的30kD膜(88cm²，Millipore)经受UF/DF。制剂通过测量总蛋白(Coomassie,Bradford)和FVIII发色活性加以分析表征。与天然rFVIII相比，PSA-rFVIII缀合物显示>70％的比活性。

方法2：

将58mg在Hepes缓冲液(50mM HEPES、约350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.1％聚山梨醇酯80，pH 7.4)中的重组因子VIII(rFVIII)溶于反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中以得到1.0+/-0.25mg/mL的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5NHCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后，在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液以得到200μM的浓度。在T＝+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5min。接着在T＝+22+/-2℃下在15分钟内通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)以得到反应混合物中10mM的最终浓度且孵育60+/-5min来终止反应。

氧化的rFVIII通过EMD TMAE(M)(Merck)上的阴离子交换色谱进一步纯化。用缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl₂，pH 6.5)稀释混合物以得到5ms/cm的电导率。使用1.5cm/min的流速将此溶液装载到具有10mL的管柱体积的IEX管柱(床高：5.4cm)上。随后用5CV的缓冲液A与缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl₂、1.0M NaCl，pH 7.0)的92:8混合物(w/w)洗涤(流速：1.5cm/min)这个管柱。接着用缓冲液A与缓冲液B的50:50(w/w)混合物洗脱氧化的rFVIII，接着5CV的缓冲液B的洗脱后步骤。通过使用1.0cm/min的流速进行洗脱步骤。

随后，在15分钟的最长时间(t)内在轻柔搅拌下将50倍摩尔过量的氨基氧基-聚唾液酸(PSA-ONH₂)试剂添加至含有纯化的氧化rFVIII的洗脱物。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)以得到10mM的最终浓度。在轻柔振荡下，在T＝+22+/-2℃的温度(T)下，在黑暗中孵育反应混合物120+/-10min。

所获得的PSA-rFVIII缀合物使用苯基琼脂糖FF低sub树脂(GE Healthcare)通过疏水性相互作用色谱(HIC)纯化，将所述树脂装填至由GE Healthcare制造的管柱中，其中床高(h)为15cm且所得管柱体积(CV)为81mL。

通过添加50mM含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙(pH 6.9)的Hepes缓冲液，向反应混合物中掺加乙酸铵。将两体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合并且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/min的流速装载至HIC管柱上，接着使用>3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙，pH 6.9)的洗涤步骤。

对于反应副产物和抗离液盐的移除而言，用>5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes、3M氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.9)以2cm/min的流速在上向流模式下进行第二洗涤步骤。接着，使用40％洗涤缓冲液2(50mM Hepes、1.5M氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.9)及60％洗脱缓冲液(20mMHepes、5mM氯化钙，pH 7.5)的不连续梯度，以1cm/min的流速在下向流模式下进行纯化的PSA-rFVIII缀合物的洗脱。在UV 280nm下监测PSA-rFVIII缀合物的洗脱并且在<4CV内收集含有缀合物的洗脱物。在相同条件下用>3CV洗脱缓冲液进行洗脱后步骤以将少量和/或未经修饰的rFVIII从主要产物中分离。

最终，使用由再生纤维素制成的具有分子量截止30kD的膜(88cm²，Millipore)，通过超滤/渗滤(UF/DF)浓缩纯化的缀合物。

将通过使用这个程序制备的缀合物通过测量总蛋白、FVIII发色活性加以分析表征并且通过测量PSA含量(间苯二酚检测)测定聚唾液酸程度。对于所获得的缀合物，计算比活性>50％且PSA程度>5.0。

方法3：

将50mg rFVIII转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中并稀释以获得1mg/mL的蛋白质浓度。添加50倍摩尔过量的具有20kD的MW(如上所述)的氨基氧基-PSA试剂，随后添加间甲苯胺作为亲核催化剂(最终浓度：10mM)及NaIO₄(最终浓度：400μM)。在室温下，在轻柔振荡下，在黑暗中进行偶合反应2小时。随后，在室温下用半胱氨酸(最终浓度：10mM)淬灭反应持续60min。接着通过添加含有乙酸铵(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵，pH 6.9)的缓冲液使反应混合物的电导率升至130mS/cm并且装载至用80mL苯基琼脂糖FF(GE Healthcare,Fairfield,CT)填充的管柱上，所述管柱是用50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％Tween80，pH 6.9预平衡。随后，用50mM Hepes、5mM氯化钙，pH 7.5洗脱缀合物。最终，收集含有PSA-rFVIII的洗脱份并且通过使用由再生纤维素制成的30kD膜(88cm²,Millipore)经受UF/DF。制剂通过测量总蛋白(Bradford)和FVIII发色活性加以分析表征。与天然rFVIII相比，PSA-rFVIII缀合物显示≥70％的比活性。

方法4：

将50mg在50mM Hepes缓冲液(50mM HEPES、约350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.1％聚山梨醇酯80，pH 7.4)中的重组因子VIII(rFVIII)溶于反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.0)中以得到1.0+/-0.25mg/mL的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。

随后，在15分钟的最长时间(t)内在轻柔搅拌下将50倍摩尔过量的氨基氧基-聚唾液酸(PSA-ONH₂)试剂添加至此rFVIII溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM)以得到10mM的最终浓度。最终，添加40mM高碘酸钠水溶液以得到400μM的浓度。

在轻柔振荡下，在T＝+22+/-2℃的温度(T)下，在黑暗中孵育反应混合物120+/-10min。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)以得到反应混合物中10mM的最终浓度且孵育60+/-5min来终止反应。

对于反应副产物和抗离液盐的移除而言，用>5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes、3M氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.9)以2cm/min的流速在上向流模式下进行第二洗涤步骤。接着，使用40％洗涤缓冲液2(50mM Hepes、1.5M氯化钠、5mM氯化钙，pH 6.9)及60％洗脱缓冲液(20mMHepes、5mM氯化钙，pH 7.5)的不连续梯度，以1cm/min的流速在下向流模式下进行纯化的rFVIII缀合物的洗脱。在UV 280nm下监测PSA-rFVIII缀合物的洗脱并且在<4CV内收集含有缀合物的洗脱物。在相同条件下用>3CV洗脱缓冲液进行洗脱后步骤以将少量和/或未经修饰的rFVIII从主要产物中分离。

最终，使用由再生纤维素制成的具有分子量截止30kD的膜(88cm²，Millipore)，通过超滤/渗滤(UF/DF)浓缩经纯化的缀合物。

通过使用这个程序制备的缀合物通过测量总蛋白、FVIII发色活性加以分析表征并且通过测量PSA含量(间苯二酚分析)测定聚唾液酸程度。

分析数据(6个连续批料的平均值)：

过程产率(Bradford)：58.9％

过程产率(FVIII发色)：46.4％

比活性：(FVIII发色/mg蛋白质)：4148IU/mg

比活性(起始材料的％)：79.9％

PSA程度(mol/mol)：8.1

实例11

二氨基氧基连接基与天然PSA之偶合

这个实例描述使用天然PSA(即，无先前氧化)制备氨基氧基-PSA试剂的程序，其可用于治疗蛋白质的化学修饰。

a)在周围温度下的偶合

将从Serum Institute of India(Pune,India)获得的52.2mg天然PSA(MW＝20kD)溶解于1.05mL 50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0中。接着将10.3mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺(连接分子)逐滴添加至反应混合物中。在黑暗中，在轻柔搅拌下在室温下孵育反应2h。

b)在升高温度下的偶合

将从Serum Institute of India(Pune,India)获得的52.2mg天然PSA(MW＝20kD)溶解于1.05mL 50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0中。接着将10.3mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺(连接分子)逐滴添加至反应混合物中。在黑暗中，在轻柔搅拌下在室温下孵育反应2h。接着使温度增至32-37℃并且再孵育反应混合物14h。

c)在升高温度和增加的连接基过量下的偶合

将从Serum Institute of India(Pune,India)获得的52.2mg天然PSA(MW＝20kD)溶解于1.05mL 50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0中。接着将10.3mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺(连接分子)逐滴添加至反应混合物中。在黑暗中，在轻柔搅拌下在室温下孵育反应2h。接着将26.3mg3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺逐滴添加至反应中，使温度增至32-37℃并且再孵育反应混合物14h。

d)PSA衍生物的纯化

孵育完成之后，在点a-c处产生的反应混合物通过广泛透析加以纯化。因此，将反应混合物的样品装载至Slide-A-Lyzer透析盒(0-5-3mL，MWCO 3.5kD,reg.cellulose,Pierce)中并且根据以下模式针对10mM磷酸盐缓冲液pH 8.0加以透析：

在室温下对500mL缓冲液进行2h

在4℃下对500mL缓冲液进行12h

为了浓缩至初始样品体积，在室温下用50mL‘Slide-A-Lyzer ConcentratingSolution for Dialysis’1h。

因此，准备将纯化的氨基氧基-PSA用于根据例如以上实例11、12、14和17-31的蛋白质缀合反应。同样，本文所述的任何水溶性聚合物均可如这个实例中所述偶合至氨基氧基连接基，且接着如以上实例中所述缀合至蛋白质上。

制剂通过测量总PSA(间苯二酚分析)和总氨基氧基(TNBS分析)以确定修饰度来加以分析表征。对于制剂(a)，测定的修饰度(MD)为0.35，对于(b)，MD＝0.54且对于(c)，MD＝0.58。此外，测量多分散性以及游离3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。对于所有制剂，多分散性均低于1.15且游离连接基的含量低于0.15摩尔％的PSA浓度。

对于在还原端处经修饰的PSA，通过¹³C NMR光谱法确定以下结构。

实例12

采用色谱纯化步骤在4℃下氨基氧基-PSA的制备

在详细分析表征室温下制备的氨基氧基-PSA试剂期间，NMR研究(参见，例如美国临时申请第61/647,814号，其以引用的方式全部并入本文中)揭示用二氨基氧基连接基的氧化的PSA的衍生化是由两个不同反应组成：在PSA的非还原端处醛基的快反应额在PSA的还原端处醛基(以半缩酮形式)的慢反应。后一反应可被视为对于试剂生产而言有待避免的不期望的副反应。

因此，已如本实例中所述优化制备氨基氧基-PSA试剂的过程。如果所述过程在室温下进行，那么还原端仅发生至显著程度。因此，过程加以调整并且在2-8℃下进行。通过在2-8℃下进行全过程(化学反应和通过IEX的PSA试剂的纯化)，在PSA的还原端处的副反应实质上得以减少。这个过程变化由此产生具有较高品质的试剂。

程序

将从Serum Institute of India(Pune,India)获得的1290mg氧化的PSA(MW＝20kD)溶解于25mL 50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0(缓冲液A)中。接着将209mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺添加至反应混合物中并且在黑暗中，在轻柔搅动下在2-8℃下孵育1小时。

在孵育以后，混合物经受采用Fractogel EMD DEAE 650-M色谱凝胶(管柱尺寸：XK26/135)的弱阴离子交换色谱步骤，在2-8℃的温度下在低温室中进行。反应混合物用预冷却的缓冲液A(110mL)稀释并且以1cm/min的流速装载至用缓冲液A预平衡的DEAE管柱上。接着用20CV缓冲液B(20mM Hepes，pH 6.0)以2cm/min的流速洗涤管柱以移除游离的3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。将氨基氧基-PSA试剂以由67％缓冲液B及43％缓冲液C(20mMHepes，1M NaCl，pH 7.5)组成的不连续梯度洗脱。将洗脱物使用由聚醚砜制成的5kD膜(50cm2，Millipore)通过UF/DF来浓缩。制剂通过测量总PSA(间苯二酚分析)和总氨基氧基(TNBS分析)以确定修饰度来加以分析表征。最终制剂中的PSA浓度为46.0mg/mL且修饰度为83.5％。此外，测定的多分散性值为1.131。另外，测量的游离的3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺的浓度为0.22μg/mL(0.07mol％的PSA)。

因此，纯化的氨基氧基-PSA备用于根据例如以上实例11、12、14和17-31的缀合反应中。

实例13

聚唾液酸化rFVIII的合成(大规模)

根据实例9中概述的方法(稍微加以修改)以大规模聚唾液酸化rFVIII。出于此目的，将1.5g rFVIII在如所述的Hepes缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中聚唾液酸化(蛋白质浓度：1.1mg/mL/通过萤光分析所测定)。接着使用苯基琼脂糖FF低sub树脂(GE Healthcare)通过疏水性相互作用色谱纯化产物。接着，使用由再生纤维素制成的具有分子量截止30kD的膜，通过超滤/渗滤(UF/DF)浓缩洗脱物。随后将浓缩物施加于尺寸排阻色谱管柱(Superose 6制备级/GE Healthcare)上。此程序是用作最终精制步骤以将潜在杂质自产物中分离。最终，再次通过UF/DF(再生纤维素/分子量截止30kD)浓缩纯化的缀合物(“PSA-rFVIII”)。使用此方法，在GMP条件下制备BDS以制造用于临床I期研究的材料：批次D、批次E和批次F。

实例14

通过表面等离子体共振(SPR)的VWF-FVIII结合亲和力的测定

如下使用Biacore仪器(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)分析VWF-FVIII结合亲和力。

在CM5生物传感器芯片的流通槽上以三个密度固定源自血浆的VWF(pdVWF，Diagnostica Stago,Asnières sur Seine,France)。用电泳缓冲液(10mM Hepes、150mMNaCl、0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)将研究性FVIII样品稀释成一系列五种稀释液(0.18至5nM FVIII，根据给定的蛋白质值)，接着使用“单循环”模式以50μL/min的恒定流速施加于芯片。缔合时间为4min且解离时间为10min。在每次循环之后，从芯片(“再生”)中移除FVIII并且用新的FVIII样品重复实验。使用‘Bioevaluation’程序的朗缪尔模型测定缔合和解离常数。测定以下动力学参数：缔合速率常数ka、解离速率常数kd和平衡解离常数KD。还通过评估Rmax(饱和时的最大结合计算值)测定结合。由三个不同VWF固定水准的平均值计算动力学结果。

Biacore技术用于测定VWF与FVIII之间的复合体形成的动力学。出于此目的，将源自血浆的VWF以三个不同水准固定于传感器芯片表面上并且将研究性PSA-rFVIII和rFVIII重新缓冲至以上实例13中所述的缓冲液中(“重新缓冲的FVIII”)。在单循环模式下以五个不同浓度注射样品。使用Biacore T200设备的“Bioevaluation”程序的朗缪尔模型测定缔合和解离常数，假定固定化的VWF与FVIII之间有均相1:1相互作用。

表1概括了描述VWF-FVIII相互作用的动力学参数，其中ka为缔合速率常数，kd为解离速率常数且KD为平衡解离常数(＝kd/ka)。为了进一步评价和数据比较，计算不同样品组的平均值及3SD用于KD。

表1.

VWF-FVIII结合的动力学参数

相互作用动力学在临床前BDS批次(平均KD 0.28nM)与临床1期BDS批次(平均KD0.28nM)之间，和临床前FDP批次(平均KD 0.31nM)与临床1期FDP批次(KD 0.37nM)之间是相似的。对于重新缓冲的rFVIII，KD值在0.26与0.37nM范围内且因此与PSA-rFVIII相当。

图1展示表示为Rmax的结合信号，其为对于在传感器芯片固定的VWF的三个不同密度下的PSA-rFVIII组和重新缓冲的rFVIII而言，饱和时的最大结合计算值。PSA-rFVIII和重新缓冲的rFVIII均显示VWF浓度依赖性相互作用，在PSA-rFVIII临床前与临床期BDS和FDP批次之间无相关差异。与重新缓冲的rFVIII相比，PSA-rFVIII的结合明显减少了大约50％。这被视为rFVIII的PSA修饰的结果，由此产生rFVIII缀合物，其中由PSA遮蔽用于VWF的特异性结合表位。

有趣且不同于与重新缓冲的rFVIII相比在PSA-rFVIII下观察到的上述结合性质的是，PEG-rFVIII(聚乙二醇化rFVIII蛋白)也显示减少的与VWF的结合，但不如PSA-rFVIII明显。

实例15

通过表面等离子体共振(SPR)的FVIII-LRP1受体相互作用的测定

根据制造商说明书将LRP1(α2-巨球蛋白受体/CD91)受体(BioMac,Leipzig,Germany)固定于Biacore仪器(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)的CM4传感器芯片的流通槽上。接着使用“kinject”模式将研究性FVIII样品的一系列稀释液(21至357nM，根据给定的蛋白质值)施加于芯片，允许FVIII的缔合10min且解离5min。在每次循环之后，从芯片(“再生”)中移除FVIII并且用新的FVIII样品重复实验。使用‘Bioevaluation’程序的朗缪尔模型测定缔合和解离常数，假定均相1:1相互作用。测定以下动力学参数：缔合速率常数ka、解离速率常数kd和平衡解离常数KD。在缔合期之后还通过测定信号(反应单位)评价结合。由三个不同流通槽的平均值计算动力学结果。

使用如上所述的Biacore技术测定PSA-rFVIII对清除受体LRP1的结合亲和力。在样品的稀释系列中测试结合，从10稀释至100μg/mL(对应于21至357nM)。因此对于PSA-rFVIII BDS批次和重新缓冲的rFVIII而言分析为可能的，但对于FDP批次则不可能，此是由于此等样品的低蛋白质浓度。测定以下参数：ka为缔合速率常数，kd为解离速率常数且KD为平衡解离常数(＝kd/ka)。为了进一步评价和数据比较，计算不同样品组的平均值及3SD用于KD。

表2概括了PSA-rFVIII临床前和临床1期BDS和重新缓冲的rFVIII与LRP1受体之间的相互作用的动力学参数。相互作用动力学在临床前(平均KD)与临床1期BDS批次(平均KD)之间是相似的。此外，结合动力学在PSA-rFVIII与重新缓冲的rFVIII之间是相似的。由于一般表面等离子体共振检测和动力学结合参数评价的较高变化性，所以在若干样品之间KD的变化不被视为生物学相关的并且概括证实了PSA-rFVIII临床前与临床1期批次具有相似性质。

表2.

LRP1-FVIII结合的动力学参数

图2示出了PSA-rFVIII和重新缓冲的rFVIII对LRP1的FVIII蛋白浓度依赖性结合。将FVIII蛋白浓度针对结合信号(表示为反应单位)绘图。PSA-rFVIII和重新缓冲的rFVIII均显示FVIII浓度依赖性相互作用，在PSA-rFVIII的临床前与临床1期BDS批次之间无相关差异。与重新缓冲的rFVIII相比，PSA-rFVIII的结合明显减少。这被视为rFVIII的PSA修饰的结果，由此产生rFVIII缀合物，其中由PSA遮蔽用于LRP1的特异性结合表位。

有趣地，比较rFVIII的结合活性，PEG-rFVIII和PSA-rFVIII显示rFVIII强结合LRP1，PEG-rFVIII呈现与LRP1的残余缔合，且PEG-rFVIII实际上不能与LRP1缔合(图3)。

实例16

FIXa辅因子活性的测定

使用FIXa辅因子活性分析体外评价PSA-rFVIII的tenase复合体内的FVIII的FIXa辅因子活性。这个分析提供对FXa产生的动力学性质的详细理解。根据其给定效力将样品稀释至1.0IU/mL的FVIII活性并且测量凝血酶活化之后的FXa产生时程。

图4示出了在通过凝血酶活化FVIII之后FXa随时间的产生。所有PSA-rFVIII和重新缓冲的rFVIII批次均显示时间依赖性FXa产生，仅在批次之间有较小差异(图4，图A-D)。组平均值(图4，图E)的比较证实了PSA-rFVIII临床前和临床1期BDS与FDP批次具有相似性质。在重新缓冲的rFVIII与PSA-rFVIII之间观察到FXa产生曲线中的一些差异(图4，图E)，例如，重新缓冲的rFVIII显示稍微较少的最大FXa产生。

为了在定量基础上评价各个样品组之间的可比性，通过测定曲线的线性部分的斜率来计算FX活化的最大速率。结果展示于表3中。对于直接比较而言，评价个别批次之间的相对差异和临床前BDS或FDP批次的算术平均值(表4)。个别临床1期BDS批次与临床前BDS批次的平均值之间的相对差异≤11％，证实了两个样品组的可比性。临床1期PSA-rFVIII FDP与临床前FDP的平均值之间的差异≤11％，再次证明了其相似的特征。各个PSA-rFVIII组与重新缓冲的rFVIII的平均值的相对比较展示于表5中。差异≤6％，由此证明PSA-rFVIII与重新缓冲的rFVIII具有相似的FXa产生动力学性质。

表3.

FVIII的凝血酶预活化之后的FXa产生参数

表4.

FXa产生参数：临床前PSA-rFVIII BDS与FDP批次的平均值的相对差异

表5.

FXa产生参数：在PSA-rFVIII组与重新缓冲的rFVIII之间的相对差异

用法	最大速率(％)
		重新缓冲的rFVIII(平均值，n＝4)	＝100
PSA-rFVIII BDS临床前(平均值，n＝3)	105
		PSA-rFVIII FDP临床前(平均值，n＝3)	106
PSA-rFVIII BDS GMP临床1期(平均值，n＝3)	95
		PSA-rFVIII FDP GMP临床1期(n＝1)	94

实例17

凝血酶产生分析(TGA)

TGA为一种研究在类似A型血友病患者的情况的环境中的凝血酶产生的特定方法。含有<1％的FVIII的缺乏FVIII的人血浆补充有增加量的PSA-rFVIII(0.01至1IU/mL，基于其给定效力)。通过添加少量与磷脂微胞复合的重组人组织因子至血浆中以模拟小血管壁损伤来开始反应。

通过比较曲线的峰值凝血酶的浓度依赖性增加来评价凝血酶产生(图5)。PSA-rFVIII和重新缓冲的rFVIII均在峰值凝血酶中显示FVIII浓度依赖性增加，仅在个别批次之间有极小变化(图5，图A至D)。组平均值(图5，图E)的比较证实了PSA-rFVIII临床前和临床1期BDS与FDP批次具有相似性质。在重新缓冲的rFVIII与PSA-rFVIII之间观察到峰值凝血酶产生的差异(图5，图E)。

为了更全面评价，进行定量比较。表6概括了在所测试的不同FVIII浓度下量测的凝血酶峰值。通过计算每个凝血酶峰值的曲线下面积(AUC)比较地分析样品。此外，计算个别PSA-rFVIII临床1期BDS/FDP批次的凝血酶峰值的AUC与临床前BDS/FDP批次的算术平均值的相对差异。

个别临床1期BDS批次的值与临床前BDS批次的平均值的相对差异≤9％，证实了两个样品组之间的可比性。对于临床1期FDP，临床前FDP的平均值的差异≤4％，再次展示了高度相似的特征。

峰值凝血酶产生曲线(图5)的评价对于重新缓冲的rFVIII显示比PSA-rFVIII稍微较高的凝血酶产生。因为在若干PSA-rFVIII组的AUC计算值与重新缓冲的rFVIII的平均值中的相对差异≤14％，所以这个结果被视为具有较小相关性并且同实际生理相关差异相比与固有分析变化更相关。

通过测定总凝血酶产生进一步评价凝血酶产生。所研究的PSA-rFVIII和重新缓冲的rFVIII BDS的所有样品在总凝血酶产生中均显示相似的FVIII浓度依赖性增加，其中在组之间有极小差异(图6)。与峰值凝血酶产生相比，PSA-rFVIII与重新缓冲的rFVIII之间的差异甚至更低。

表6.

提高FVIII批次的能力的浓度依赖性峰值凝血酶

表7.

峰值凝血酶产生能力-平均临床前PSA-rFVIII BDS与FDP批次的相对差异

表8.

峰值凝血酶产生能力-在PSA-rFVIII组与重新缓冲的rFVIII之间的相对差异

实例18

在血友病小鼠中PSA-rFVIII、PEG-rFVIII和rFVIII的药代动力学的比较

在FVIII敲除小鼠中测量PSA-rFVIII、PEG-rFVIII和rFVIII的药代动力学。经由尾静脉施用200IU FVIII/kg体重的注射剂。在限定时间点之后处死6只小鼠的组并且制备枸橼酸钠血浆。用发色活性分析测量血浆中的FVIII活性。如图7和表9所示，聚乙二醇化和聚唾液酸化rFVIII与rFVIII相比显示改进的PK参数(HL增加约2)。在大鼠(图8)和猕猴(图9)中观察到类似结果。(为了允许不同研究之间的比较，将数据针对1U/kg的常用剂量进行归一化)。

表9.

实例19

PSA-rFVIII体内功效

在FVIII KO小鼠中在尾夹出血模型中测量PSA-rFVIII的功效。施用200IU FVIII活性/kg，接着在注射PSA-rFVIII之后18-54小时，横断尾尖。测量失血量，并且数据证实如由PK研究所期望的PSA-rFVIII的较长功效。PSA-rFVIII控制出血持续大约rFVIII两倍之久。

也在FVIII KO小鼠中在颈动脉闭塞模型中测量功效。施用200IU FVIII活性/kg，接着用氯化铁诱发颈动脉病变。测量达到血管闭塞的时间，并且与以上结果一致，数据证实如由PK研究所期望的PSA-rFVIII的较长功效。在FVIII KO小鼠中观察到PSA-rFVIII比rFVIII大约2倍更长的存活。

最终，评价血友病关节出血(关节内穿刺术)的鼠模型中PEG-rFVIIII和PSA-rFVIII的作用。用经修饰的rFVIII(即PEG-rFVIII和PSA-rFVIII)进行的治疗在鼠模型中展示持续至少rFVIII的两倍之久。

Claims

1.一种经修饰的因子VIII(FVIII)，其包含延长FVIII半衰期并减少所述经修饰的FVIII与选自由以下组成的组的配体的结合的修饰：冯威勒布兰德因子(VWF)和低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白1(LRP1)。

2.如权利要求1所述的经修饰的FVIII，其中所述经修饰的FVIII为来源于血浆的。

3.如权利要求1所述的经修饰的FVIII，其中所述经修饰的FVIII为重组的。

4.如权利要求3所述的经修饰的FVIII，其中所述经修饰的FVIII为全长FVIII并且包括完整的B结构域。

5.如权利要求1所述的经修饰的FVIII，其中所述FVIII以与未经修饰的FVIII相比较低的亲和力(KD)结合至VWF和LRP1。

6.如权利要求1所述的经修饰的FVIII，其中所述修饰包含聚唾液酸(PSA)。

7.如权利要求6所述的经修饰的FVIII，其中所述PSA具有选自由大约20kDa组成的组的平均分子尺寸。

8.如权利要求6或7所述的经修饰的FVIII，其中所述PSA具有低的多分散性。

9.如权利要求6-8中任一项所述的经修饰的FVIII，其中所述PSA包含氨基氧基连接基。

10.如权利要求9所述的经修饰的FVIII，其中所述氨基氧基连接基连接至所述经修饰的FVIII的氧化碳水化合物。

11.一种药物组合物，其包含如权利要求1-10中任一项所述的经修饰的FVIII和药学上可接受的载体、稀释剂、盐、缓冲剂或赋形剂。

12.如权利要求6-10中任一项所述的经修饰的FVIII，其中所述半衰期比聚乙二醇化FVIII的更长。

13.如权利要求12所述的经修饰的FVIII，其中所述半衰期长约1、2或3倍。

14.如权利要求6-10中任一项所述的经修饰的FVIII，其中所述结合至VWF或LRP1与聚乙二醇化FVIII结合至VWF或LRP1相比是减少的。

15.如权利要求11所述的经修饰的FVIII，其中所述结合至VWF或LRP1与聚乙二醇化FVIII结合至VWF或LRP1相比减少了0.5倍。

16.一种经修饰的重组FVIII，其包含延长FVIII半衰期并减少所述经修饰的FVIII与选自由VWF及LRP1组成的组的配体的结合的修饰，其中所述修饰包含具有氨基氧基连接基的PSA，且其中所述氨基氧基连接基连接至所述经修饰的FVIII的氧化碳水化合物；

其中所述经修饰的重组FVIII的半衰期比未经修饰的重组FVIII和/或聚乙二醇化重组FVIII的更长；并且

其中VWF或LRP1由所述经修饰的重组FVIII的结合与VWF或LRP1由未经修饰的重组FVIII和/或聚乙二醇化重组FVIII的结合相比是减少的。

17.如权利要求1-10和12-16中任一项所述的经修饰的FVIII，其中向诊断患有与FVIII缺乏有关的疾病或病症的哺乳动物施用所述经修饰的FVIII。

18.一种治疗哺乳动物的出血性缺陷的方法，其包括以下步骤：向所述哺乳动物施用有效减轻或消除所述出血性缺陷的一种或多种症状的量的如权利要求1-10和12-16中任一项所述的经修饰的FVIII或如权利要求11所述的药物组合物。