ES2542420T3 - Desaturasas de ácidos grasos de hongos - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 15, en el que el polinucleótido es seleccionade entre: a) un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 3; b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2; y c) un polinucleótido que hibrida con una o más de la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2, o un complemento de las mismas, en condiciones de SSC 5X, formamida al 50% y 42ºC.

Description

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desaturasa fúngica. Las células huésped pueden manipularse para expresar un polinucleótido que codifique uno o más polipéptidos desaturasa que catalicen la desaturación de uno o más ácidos grasos.

Algunos aspectos de la invención incluyen diversos polipéptidos desaturasa y polinucleótidos que codifican los mismos. Diversas realizaciones de la invención pueden usar combinaciones de polinucleótidos desaturasa y los polipéptidos codificados que típicamente dependen de la célula huésped, la disponibilidad del sustrato o sustratos, y el producto o productos finales deseados. "Desaturasa" se refiere a un polipéptido que puede desaturar o catalizar la formación de un doble enlace entre carbonos consecutivos de uno o más ácidos grasos para producir un ácido graso mono o poliinsaturado o precursor del mismo. Son de particular interés polipéptidos que pueden catalizar la conversión de ácido esteárico en ácido oleico, ácido oleico en LA, La en ALA, o ALA en SDA, que incluye enzimas que desaturan en las posiciones 12, 15 o 6. El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o modificación post-traduccional (por ejemplo, glucosilación o fosforilación). Las consideraciones para elegir un polipéptido específico que tenga actividad desaturasa incluyen, aunque sin limitación, el pH óptimo del polipéptido, sea el polipéptido una enzima limitante de la velocidad o un componente de la misma, sea la desaturasa usada esencial para la síntesis de un PUFA deseado, y/o sea un cofactor requerido por el polipéptido. El polipéptido expresado preferentemente tiene características que son compatibles con el entorno bioquímico de su localización en la célula huésped. Por ejemplo, el polipéptido puede tener que competir por el sustrato o sustratos.

Los análisis de la Km y la actividad específica de un polipéptido en cuestión pueden considerarse en la determinación de la idoneidad de un polipéptido dado para modificar la producción, nivel o perfil de PUFA en una célula huésped dada. El polipéptido usado en una situación particular es uno que típicamente puede funcionar en las condiciones presentes en la célula huésped pretendida, pero por lo demás puede ser cualquier polipéptido desaturasa que tenga una característica deseada o que sea capaz de modificar la producción relativa, nivel o perfil de uno o más PUFA deseados o cualquier otra característica deseada analizada en el presente documento. El sustrato o sustratos para la enzima expresa pueden producirse por la célula huésped o pueden suministrarse de forma exógena. Para conseguir la expresión, el polipéptido o polipéptidos de la presente invención se codifican por polinucleótidos descritos a continuación.

Los inventores han aislado y producido enzimas de origen fúngico que muestran actividad Δ15-desaturasa. Las fuentes fúngicas incluyen, aunque sin limitación, el género Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus nidulans; el género Botrytis, por ejemplo, Botrytis cinerea; el género Neurospora, por ejemplo, Neurospora crassa; y otros hongos que muestran actividad Δ15-desaturasa. Es de particular interés Δ15-desaturasa de Neurospora crassa. Se determinó que la secuencia de aminoácidos de la Δ15-desaturasa de N. crassa, expuesta en la SEC ID Nº 3 y codificada por la secuencia de nucleótidos en la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2, tiene un peso molecular de aproximadamente 49.123,37 Dalton. La secuencia consiste en 429 aminoácidos; 32 de los cuales son fuertemente básicos (lisina, arginina); 35 de los cuales son fuertemente ácidos (ácido aspártico, ácido glutámico); 170 aminoácidos hidrófobos (alanina, isoleucina, leucina, fenilalanina, triptófano, valina); y 100 aminoácidos polares (asparagina, cisteína, glutamina, serina, treonina, tirosina). La SEC ID Nº 3 tiene un punto isoeléctrico de 7,187; una carga de 1,634 a pH 7,0; una temperatura de fusión de Davis, Botsein, Roth de 89,65ºC y una temperatura de Wallace de 5098,00.

Las secuencias que codifican la Δ15-desaturasa de Neurospora crassa pueden expresarse en plantas, microorganismos o animales transgénicos para realizar mayor síntesis de ALA a partir de LA, así como SDA. También pueden usarse otros polinucleótidos que son sustancialmente idénticos al polinucleótido Δ15-desaturasa de

N. crassa, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos al polipéptido Δ15-desaturasa de N. crassa. "Sustancialmente idéntica" se refiere a una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que muestra en orden de preferencia creciente al menos un 80%, 90% o 95% de identidad con lasecuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la Δ15-desaturasa de N. crassa. Pueden realizarse comparaciones de polipéptidos y polinucleótidos usando software de análisis de secuencia, por ejemplo, el paquete de software Sequence Analysis del paquete GCG Wisconsin (Accelrys, San Diego, CA), MEGAlign (DNAS-tar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis. 53715), y MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, Calif. 95008). Dicho software acopla secuencias similares evaluando los grados de similitud o identidad.

La presente invención abarca desaturasas relacionadas del mismo organismo u otros organismos relacionados. Dichas desaturasas relacionadas incluyen variantes de las Δ15-desaturasas desveladas que existen de forma natural dentro de la misma especie o diferentes especies de hongo. Las desaturasas relacionadas pueden identificarse por su capacidad de funcionar sustancialmente igual que las desaturasas desveladas; es decir, aún son capaces de convertir de forma eficaz LA en ALA y GLA en SDA. Las desaturasas relacionadas también pueden identificarse explorando bases de datos de secuencias para secuencias homólogas a las desaturasas desveladas, hibridación una sonda basada en las desaturasas desveladas con una biblioteca construida a partir del organismo fuente, o por RT-PCR usando ARNm del organismo fuente y cebadores basados en las desaturasas desveladas.

Ciertos aspectos de la invención incluyen variantes y fragmentos de un polipéptido Δ15-desaturasa fúngico y los ácidos nucleicos que lo codifican que retienen actividad desaturasa. En otro aspecto de la invención, puede transferirse un vector que contenga un ácido nucleico, o fragmento del mismo, que contiene un promotor, una secuencia codificante de Δ15-desaturasa y una región de terminación a un organismo en que las regiones promotora

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invención incluir en un vector de ácido nucleico otros elementos de secuencia de nucleótidos que faciliten la clonación, expresión o procesamiento, por ejemplo secuencias que codifican péptidos señal, una secuencia codificante de KDEL, que es necesaria para la retención de proteínas en el retículo endoplasmático o secuencias que codifican péptidos de tránsito que dirigen la Δ15-desaturasa al cloroplasto. Dichas secuencias son conocidas para los especialistas en la técnica. Un péptido de tránsito optimizado se describe, por ejemplo, por Van den Broeck y col. (1985). Se desvelan secuencias señal procariotas y eucariotas, por ejemplo, por Michaelis y col. (1982).

En ciertas realizaciones, los casetes de expresión pueden incluir un casete que proporciona actividad Δ6-y/o Δ15desaturasa, particularmente en una célula huésped que produce o puede aceptar LA o ALA, respectivamente. La producción de ácidos grasos insaturados de tipo omega-6, tales como LA, está favorecida en un organismo huésped que es incapaz de producir ALA. La producción de ALA por el huésped puede eliminarse, reducirse y/o inhibirse inhibiendo la actividad de una Δ15-desaturasa. Esto puede conseguirse por selección convencional, proporcionando un casete de expresión para una Δ15-desaturasa antisentido, alterando un gen diana de Δ15-desaturasa a través de inserción, deleción, sustitución de parte o todo el gen diana, o añadiendo un inhibidor de Δ15-desaturasa. Asimismo, la producción de LA o ALA está favorecida en un microorganismo o animal que tiene actividad Δ6-desaturasa proporcionando un casete de expresión para un transcrito Δ6 antisentido, alterando un gen de Δ6-desaturasa, o mediante el uso de un inhibidor de Δ6-desaturasa.

Los polinucleótidos que codifican desaturasas deseadas pueden identificarse de una diversidad de modos. Como un ejemplo, se explora una fuente de la desaturasa deseada, por ejemplo bibliotecas de ADN genómico o ADNc de Neurospora, con sondas detectable enzimática o químicamente sintetizadas, que pueden prepararse a partir de ADN, ARN, o nucleótidos de origen no natural, o mezclas de los mismos. Las sondas pueden sintetizarse enzimáticamente a partir de polinucleótidos de desaturasas conocidas para procedimientos de hibridación de rigurosidad normal o reducida. Las sondas oligonucleotídicas también pueden usarse para explorar fuentes y pueden basarse en secuencias de desaturasas conocidas, incluyendo secuencias conservadas entre desaturasas conocidas, o en secuencias peptídicas obtenidas de la proteína purificada deseada. Las sondas oligonucleotídicas basadas en secuencias de aminoácidos puede degenerarse para abarcar la degeneración del código genético, o pueden desviarse en favor de los codones preferidos del organismo fuente. Los oligonucleótidos también pueden usarse como cebadores para PCR a partir de ARN transcrito de forma inversa de una fuente conocida o sospechosa; el producto de PCR puede ser el ADNc de longitud completa o puede usarse para generar una sonda para obtener el ADNc de longitud completa deseado. Como alternativa, una proteína deseada puede secuenciarse completamente y realizarse la síntesis total de un ADN que codifique ese polipéptido.

Una vez se ha aislado el ADN genómico o ADNc deseado, puede secuenciarse por procedimientos conocidos. Se reconoce en la técnica que dichos procedimientos están sujetos a errores, de modo que la secuenciación múltiple de la misma región es rutinaria y aún se espera que conduzca a tasas medibles de errores en la secuencia deducida resultante, particularmente en regiones que tienen dominios repetidos, estructura secundaria extensiva, o composiciones de bases inusuales, tales como regiones con un alto contenido de bases GC. Cuando surgen discrepancias, puede hacerse re-secuenciación y pueden emplearse procedimientos especiales. Los procedimientos especiales pueden incluir condiciones de secuenciación alterantes usando: diferentes temperaturas; diferentes enzimas; proteínas que alteran la capacidad de los oligonucleótidos de formar estructuras de orden mayor; nucleótidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; diferentes composiciones de gel, por ejemplo añadiendo formamida; diferentes cebadores o cebadores localizados a diferentes distancias desde la región problemática; o diferentes moldes tales como ADN monocatenarios. También puede emplearse secuenciación de ARNm.

Algo de o toda la secuencia codificante de un polipéptido que tiene actividad desaturasa puede ser de una fuente natural. En algunas situaciones, sin embargo, es deseable modificar todo o una parte de los codones, por ejemplo, para potenciar la expresión, empleando codones preferidos por el huésped. Los codones preferidos por el huésped pueden determinarse a partir de los codones de la mayor frecuencia en las proteínas expresadas en la cantidad más grande en una especie de huésped particular de interés. Por tanto, la secuencia codificante para un polipéptido que tiene actividad desaturasa puede sintetizarse por completo o en parte. Todo o partes del ADN también pueden sintetizarse para retirar cualquier secuencia o región desestabilizante de estructura secundaria que estaría presente en el ARNm transcrito. Todo o partes del ADN también pueden sintetizarse para alterar la composición de bases a una más preferente en la célula huésped deseada. Los procedimientos para sintetizar secuencias y poner secuencias juntas están bien establecidos en la bibliografía. Puede emplearse mutagénesis y selección in vitro, mutagénesis dirigida al sitio, u otros medios para obtener mutaciones de genes de desaturasa de origen natural para producir un polipéptido que tenga actividad desaturasa in vivo con parámetros físicos y cinéticos más deseables para funcionar en la célula huésped, tales como semi-vida más larga o un tasa mayor de producción de un ácido graso poliinsaturado deseado.

Una vez se ha obtenido el polinucleótido que codifica un polipéptido desaturasa, se coloca en un vector con capacidad de replicación en una célula huésped, o se propaga in vitro mediante técnicas tales como PCR o PCR larga. Los vectores de replicación pueden incluir plásmidos, fagos, virus, cósmidos y similares. Los vectores deseables incluyen aquellos útiles para mutagénesis del gen de interés o para la expresión del gen de interés en células huésped. La técnica de PCR larga ha hecho posible la propagación in vitro de construcciones grandes, de modo que las modificaciones al gen de interés, tales como mutagénesis o adición de señales de expresión, y

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propagación de las construcciones resultantes puede suceder completamente in vitro sin el uso de un vector de replicación o una célula huésped.

Para la expresión de un polipéptido desaturasa, las regiones funcionales de inicio y terminación de la transcripción y la traducción se unen de forma funcional al polinucleótido que codifica el polipéptido desaturasa. La expresión de la región codificante del polipéptido puede tener lugar in vitro o en una célula huésped. Las regiones de inicio y terminación de la transcripción y la traducción se obtienen de una diversidad de fuentes no exclusivas, incluyendo el polinucleótido a expresar, genes conocidos o sospechosos de tener capacidad de expresión en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química, o de un locus endógeno en una célula huésped.

La expresión en una célula huésped puede realizarse de un modo transitorio o estable. La expresión transitoria puede suceder a partir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula huésped, pero dichas construcciones no se replican y raramente se integran en la célula huésped, o donde la célula huésped no es proliferante. La expresión transitoria también puede conseguirse induciendo la actividad de un promotor regulable unido de forma funcional al gen de interés, aunque dichos sistemas inducibles frecuentemente muestran un bajo nivel basal de expresión. La expresión estable puede conseguirse mediante la introducción de una construcción que puede integrarse en el genoma huésped o que se replica de forma autónoma en la célula huésped. La expresión estable del gen de interés puede seleccionarse a través del uso de un marcador de selección localizado en o transfectado con la construcción de expresión, seguido de selección de células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable resulta de la integración, la integración de construcciones puede suceder aleatoriamente dentro del genoma huésped o puede dirigirse a través del uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma huésped suficiente para dirigir la recombinación con el locus huésped. Cuando las construcciones están dirigidas a un locus endógeno, todas o algunas de las regiones reguladoras de la transcripción y la traducción pueden proporcionarse por el locus endógeno.

Cuando se desea la expresión aumentada del polipéptido desaturasa en el organismo fuente, pueden emplearse varios procedimientos. Pueden introducirse genes adicionales que codifican el polipéptido desaturasa en el organismo huésped. La expresión del locus desaturasa nativo también puede aumentarse a través de recombinación homóloga, por ejemplo insertando un promotor más fuerte en el genoma huésped para causar expresión aumentada, eliminando secuencias desestabilizantes del ARNm o la proteína codificada por deleción de esa información del genoma huésped, o añadiendo secuencias estabilizantes al ARNm (patente de EE. UU. n.º 4.910.141).

Se contempla que puede introducirse más de un polinucleótido codificante de desaturasa o un polinucleótido codificante de más de una desaturasa y propagarse en una célula huésped a través del uso de vectores de expresión episómicos o integrados. Cuando se expresan dos o más genes a partir de vectores de replicación diferentes, es deseable que cada vector tenga un medio diferente de replicación. Cada construcción introducida, se integre o no, debe tener un medio diferente de selección y debe carecer de homología con otras construcciones para mantener la expresión estable y prevenir la redistribución de elementos entre las construcciones. Las elecciones sensatas de regiones reguladoras, medios de selección y procedimientos de propagación de la construcción introducida pueden determinarse experimentalmente de modo que todos los polinucleótidos introducidos se expresen a los niveles necesarios para proporcionar la síntesis de los productos deseados.

Cuando es necesario para la transformación, la secuencia codificante de Δ15-desaturasa de la presente invención puede insertarse en un vector de transformación de plantas, por ejemplo el vector binario descrito por Bevan (1984). Los vectores de transformación de plantas pueden obtenerse modificando el sistema de transferencia génica natural de Agrobacterium tumefaciens . El sistema natural comprende plásmidos Ti grandes (que inducen tumores) que contienen un gran segmento, conocido como ADN T, que se transfiere a plantas transformadas. Otro segmento del plásmido Ti, la región vir, es responsable de la transferencia del ADN T. La región de ADN T está limitada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados los genes que inducen tumor se han delecionado y las funciones de la región vir se utilizan para transferir ADN foráneo limitado por las secuencias límite del ADN T. La región T también contiene un marcador de selección para la resistencia a antibióticos, y un sitio de clonación múltiple para insertar secuencias para transferencia. Dichas cepas modificadas por ingeniería son conocidas como cepas de

A. tumefaciens "desarmadas", y permiten la eficaz transformación de secuencias limitadas por la región T en los genomas nucleares de plantas.

La presente invención encuentra muchas aplicaciones. Sondas basadas en los polinucleótidos de la presente invención pueden encontrar uso en procedimientos para aislar moléculas relacionadas o en procedimientos para detectar organismos que expresan desaturasas. Cuando se usan como sondas, los polinucleótidos u oligonucleótidos deben ser detectables. Esto habitualmente se consigue uniendo un marcador en un sitio interno, por ejemplo mediante incorporación de un resto modificado, o en el extremo 5' o 3'.

Dichos marcadores pueden ser directamente detectables, puede unirse a una molécula secundaria que está marcada de forma detectable, o pueden unirse a una molécula secundaria no marcada y una molécula terciaria marcada de forma detectable; este procedimiento puede prolongarse siempre que sea práctico para conseguir una señal satisfactoriamente detectable sin niveles inaceptables de señal de fondo. Los sistemas secundarios, terciarios,

o de puente pueden incluir el uso de anticuerpos dirigidos contra cualquier otra molécula, incluyendo marcadores u otros anticuerpos, o pueden implicar moléculas cualesquiera que se unan entre sí, por ejemplo un sistema de

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biotina-estreptavidina/avidina. Los marcadores detectables típicamente incluyen isótopos radiactivos, moléculas que producen luz de forma química o enzimática o la alteran, enzimas que producen productos de reacción detectables, moléculas magnéticas, moléculas fluorescentes o moléculas cuya fluorescencia o características emisoras de luz cambian tras la unión. Pueden encontrarse ejemplos de procedimientos de marcaje en la patente de EE. UU. n.º

5.011.770. Como alternativa, la unión de las moléculas diana puede detectarse directamente midiendo el cambio en el calor de la solución en el momento de la unión de la sonda a la diana mediante calorimetría de titulación isotérmica, o recubriendo la sonda o la diana sobre una superficie y detectando el cambio en la dispersión de la luz desde la superficie producida por unión de la diana o la sonda, respectivamente, como puede hacerse con el sistema BIAcore.

Pueden introducirse construcciones que comprenden el gen de interés en una célula huésped por técnicas convencionales. Por conveniencia, una célula huésped que se ha manipulado por cualquier procedimiento para captar una secuencia de ADN o construcción se mencionará como "transformada" o "recombinante" en el presente documento. El huésped objeto tendrá al menos una copia de la construcción de expresión y puede tener dos o más, por ejemplo, dependiendo de si el gen se integra en el genoma, se amplifica, o está presente en un elemento extracromosómico que tiene múltiples números de copia.

La célula huésped transformada puede identificarse por selección de un marcador contenido en la construcción introducida. Como alternativa, puede introducirse una construcción marcadora diferente con la construcción deseada, ya que muchas técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en células huésped. Típicamente, los huéspedes transformados se seleccionan por su capacidad de crecer en medio selectivo. Los medios selectivos pueden incorporar un antibiótico o carecer de un factor necesario para el crecimiento del huésped no transformado, tal como un nutriente o factor de crecimiento. Un gen marcador introducido por lo tanto puede conferir resistencia a antibiótico, o codificar un factor de crecimiento o enzima esencial, y permitir el crecimiento en medio selectivo cuando se expresa en el huésped transformado. La selección de un huésped transformado también puede suceder cuando la proteína marcadora expresada puede detectarse, directa o indirectamente. La proteína marcadora puede expresarse sola o como una fusión con otra proteína. La proteína marcadora puede detectarse por su actividad enzimática; por ejemplo, la beta-galactosidasa can convertir el sustrato X-gal en un producto coloreado, y la luciferasa puede convertir la luciferina en un producto emisor de luz. La proteína marcadora puede detectarse por sus características productoras o modificadoras de luz; por ejemplo, la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria emite fluorescencia cuando se ilumina con luz azul. Pueden usarse anticuerpos para detectar la proteína marcadora o una marca molecular en, por ejemplo, una proteína de interés. Las células que expresar la proteína marcadora o marca pueden seleccionarse, por ejemplo, visualmente, o por técnicas tales como FACS o selección usando anticuerpos. De forma deseable, la resistencia a kanamicina y el amino glucósido G418 son de interés, así como la capacidad de crecer en medios que carecen de uracilo, leucina, lisina o triptófano.

Es de particular interés la producción mediada por Δ15-desaturasa de PUFA en células huésped eucariotas. Las células eucariotas incluyen células vegetales, tales como aquellas de plantas de cultivo productoras de aceite, y otras células susceptibles a manipulación genética incluyendo células fúngicas. Las células pueden cultivarse o formarse como parte o todo un organismo huésped incluyendo una planta. En una realización preferida, el huésped es una célula vegetal que produce y/o puede asimilar uno o más sustratos suministrados de forma exógena para una Δ15-desaturasa, y preferentemente produce grandes cantidades de uno o más de los sustratos.

La célula huésped transformada se cultiva en condiciones apropiadas adaptadas para un resultado final deseado. Para células huésped que han crecido en cultivo, las condiciones típicamente se optimizan para producir la mayor producción o más económica de PUFA, que se refiere a la actividad desaturasa seleccionada. Las condiciones del medio que pueden optimizarse incluyen: fuente de carbono, fuente de nitrógeno, adición de sustrato, concentración final del sustrato añadido, forma del sustrato añadido, crecimiento aeróbico o anaeróbico, temperatura de crecimiento, agente inductor, temperatura de inducción, fase de crecimiento en la inducción, fase de crecimiento en la recogida, pH, densidad, y mantenimiento de selección.

Otro aspecto de la presente invención proporciona plantas transgénicas o descendencia de plantas que contienen el ADN aislado de la invención. Se contemplan tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las células vegetales se transforman con un ADN aislado que codifica Δ15-desaturasa por cualquiera de los procedimientos de transformación de plantas descritos anteriormente. La célula vegetal transformada, habitualmente en un cultivo de callo o disco foliar, se regenera en una planta transgénica completa por procedimientos bien conocidos para los especialistas en la técnica (por ejemplo, Horsch y col., 1985). En una realización, la planta transgénica se selecciona entre el grupo que consiste en Arabidopsis thaliana, canola, soja, semilla de soja, semilla de colza, girasol, algodón, cacao, cacahuete, cártamo, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus oleaginosa, maíz, jojoba, árbol de sebo chino, tabaco, plantas frutales, plantas cítricas o plantas que producen nueces y bayas. Como la descendencia de plantas transformadas hereda el polinucleótido que codifica Δ15-desaturasa, pueden usarse las semilla o esquejes de plantas transformadas para mantener la línea de la planta transgénica.

La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para proporcionar plantas transgénicas con un contenido aumentado de ALA y/o SDA. Este procedimiento incluye, por ejemplo, introducir ADN que codifica Δ15desaturasa en células vegetales que carecen de o tienen niveles bajos de ALA o SDA pero contienen LA, y regenerar las plantas con contenido aumentado de ALA y/o SDA a partir de las células transgénicas. En ciertas

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realizaciones de la invención, también puede introducirse un ADN que codifica una Δ6 y/o Δ12-desaturasa en las células vegetales. Dichas plantas pueden comprender también o no actividad Δ6 y/o Δ12-desaturasa endógena. En ciertas realizaciones, se contemplan como el organismo transgénico plantas de cultivo modificadas cultivadas de forma comercial incluyendo, aunque sin limitación, Arabidopsis thaliana, canola, soja, semilla de soja, semilla de colza, girasol, algodón, cacao, cacahuete, cártamo, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus oleaginosa, maíz, jojoba, árbol de sebo chino, tabaco, plantas frutales, plantas cítricas o plantas que producen nueces y bayas.

La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para proporcionar plantas transgénicas que pueden contener niveles elevados de ALA y/o SDA, en el que dichos niveles elevados son mayores que los niveles encontrados en plantas no transformadas. Este procedimiento puede comprender la introducción de uno o más polinucleótidos que codifican Δ15-desaturasa en una planta que carece de o tiene niveles bajo de ALA, pero contiene LA. Pueden construirse vectores de expresión que comprenden ADN que codifica una Δ15-desaturasa, o una Δ15-desaturasa y una Δ6-desaturasa, por procedimiento de tecnología recombinante conocidos para los especialistas en la técnica (Sambrook y col., 1989). En particular, se contemplan como el organismo transgénico plantas de cultivo modificadas cultivadas de forma comercial incluyendo, aunque sin limitación, Arabidopsis thaliana, canola, soja, semilla de soja, semilla de colza, girasol, algodón, cacao, cacahuete, cártamo, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus oleaginosa y maíz.

Para complementación alimentaria, pueden incorporarse los PUFA purificados, plantas o partes de plantas transformadas, o derivados de las mismas, en aceites de cocinado, grasas o margarinas formuladas de modo que en uso normal el destinatario recibiera la cantidad deseada. Los PUFA también pueden incorporarse en fórmulas para bebés, complementos nutritivos u otros productos alimenticios, y pueden encontrar uso como agentes antiinflamatorios o reductores de los niveles de colesterol.

Como se usa en el presente documento, "composición comestible" se define como composiciones que pueden ingerirse por un mamífero tales como productos alimenticios, sustancias nutricionales y composiciones farmacéuticas. Como se usa en el presente documento "productos alimenticios" se refiere a sustancias que pueden usarse o prepararse para su uso como alimentos para un mamífero e incluyen sustancias que pueden usarse en la preparación de alimentos (tales como aceites para freír) o aditivos alimenticios. Por ejemplo, los productos alimenticios incluyen animales usados para consumo humano o cualquier producto de los mismos tales como, por ejemplo, huevos. Los productos alimenticios típicos incluyen aunque sin limitación bebidas (por ejemplo, refrescos, bebidas carbonatadas, bebidas listas para mezclarse), alimentos de infusión (por ejemplo, frutas y hortalizas), salsas, condimentos, aliños de ensalada, zumos de frutas, jarabes, postres (por ejemplo, púdines, gelatina, glaseados y rellenos, productos horneados y postres congelados tales como helados y sorbetes), productos congelados blandos (por ejemplo, natas congeladas blandas, helados congelados blandos y yogures, coberturas congeladas blandas tales como coberturas batidas lácteas o no lácteas), aceites y productos emulsionados (por ejemplo, grasa alimentaria, margarina, mahonesa, mantequilla, aceite de cocinar, y aliños de ensalada) y alimentos de hidratación intermedia (por ejemplo, arroz y piensos para perros).

Además, las composiciones comestibles descritas en el presente documento también pueden ingerirse como un aditivo o complemento contenido en alimentos y bebidas. Éstas pueden formularse junto con una sustancia nutricional tal como diversas vitaminas y minerales e incorporarse en composiciones sustancialmente líquidas tales como bebidas nutritivas, leches de soja y sopas; composiciones sustancialmente sólidas; y gelatinas o usarse en forma de un polvo a incorporarse en diversos alimentos. El contenido del ingrediente eficaz en dicho alimento funcional o para la salud puede ser similar a la dosis contenida en un agente farmacéutico típico.

Los PUFA purificados, plantas o partes de plantas transformadas también pueden incorporarse en pienso de animales, particularmente ganado. De este modo, los propios animales pueden beneficiarse de una alimentación rica en PUFA, mientras que los consumidores humanos de productos alimenticios producidos a partir de dicho ganado pueden beneficiarse también. Se espera en ciertas realizaciones que el SDA se convierta en EPA en animales y por tanto dichos animales pueden beneficiarse de un aumento en EPA mediante el consumo de SDA.

Para uso farmacéutico (humano o veterinario), las composiciones generalmente pueden administrarse por vía oral pero pueden administrarse por cualquier vía mediante la cual puedan absorberse satisfactoriamente, por ejemplo, por vía parenteral (es decir subcutánea, intramuscular o intravenosa), rectal, vaginal o tópica, por ejemplo, como una pomada o loción cutánea. Los PUFA, plantas o partes de plantas transformadas de la presente invención pueden administrarse solos o en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Cuando están disponibles, las cápsulas de gelatina son la forma preferida de administración oral. La complementación alimentaria como se ha expuesto anteriormente también puede proporcionar una vía oral de administración. Los ácidos insaturados de la presente invención pueden administrarse en formas conjugadas, o como sales, ésteres, amidas o profármacos de los ácidos grasos. La presente invención abarca cualquier sal farmacéuticamente aceptable; son especialmente preferidas las sales de sodio, potasio o litio. También están abarcadas las sales de Nalquilpolihidroxamina, tales como N-metil glucamina, encontradas en la publicación PCT WO 96/33155. Los ésteres preferidos son los ésteres de etilo. Como sales sólidas, los PUFA también pueden administrarse en forma de comprimido. Para administración intravenosa, los PUFA o derivados de los mismos pueden incorporarse en formulaciones comerciales tales como Intralípidos.

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acuerdo con la invención, esto podría usarse para introducir diversos ácidos nucleicos codificantes de desaturasa. La introducción de dichas secuencias puede facilitarse mediante el uso de cromosomas artificiales de bacterias o levaduras (BAC o YAC, respectivamente), o incluso cromosomas artificiales de plantas. Por ejemplo, se desveló el uso de BAC para transformación mediada por Agrobacterium por Hamilton y col. (1996).

Son particularmente útiles para la transformación los casetes de expresión que se han aislado de dichos vectores. Los segmentos de ADN usados para transformar células vegetales generalmente comprenderán, por supuesto, el ADNc, gen o genes que se desea introducir en y expresar en las células huésped. Estos segmentos de ADN pueden incluir adicionalmente estructuras tales como promotores, potenciadores, polienlazadores, o incluso genes reguladores según se desee. El segmento de ADN o gen elegido para introducción celular a menudo codificará una proteína que se expresará en las células recombinantes resultantes produciendo un rasgo investigable o seleccionable y/o que conferirá un fenotipo mejorado a la planta transgénica resultante. Sin embargo, éste puede no ser siempre el caso, y la presente invención también abarca plantas transgénicas que incorporan transgenes no expresados. Los componentes preferidos a incluir probablemente con los vectores usados en la presente invención son los siguientes.

En una realización, la presente invención utiliza ciertos promotores. Ejemplos de dichos promotores que pueden usarse con la presente invención incluyen el 35S CaMV (virus del mosaico de la coliflor), 34S FMV (virus del mosaico de la escrofularia) (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5.378.619), Napina (de Brassica), 7S (de soja), Glob y Lec (de maíz). El promotor de 35S CaMV y promotores que se regulan durante la maduración de la semilla de la planta, son de particular interés para su uso con la presente invención. Todos estos elementos promotores y reguladores de la transcripción, individualmente o en combinación, se contemplan para su uso en los presentes vectores de expresión replicables y son conocidos para los especialistas en la técnica.

El promotor de CaMV 35S se describe, por ejemplo, por Restrepo y col. (1990). Las secuencias reguladoras genéticamente transformadas y mutadas que conducen a expresión específica de semilla también pueden emplearse para la producción de composición modificada de aceite de semilla. Dichas modificaciones de la invención aquí descritas serán obvias para los especialistas en la técnica.

La secuencia de ADN entre el sitio de inicio de la transcripción y el inicio de la secuencia codificante, es decir, la secuencia líder no traducida, también puede influir en la expresión génica. Por tanto se puede desear el empleo de una secuencia líder particular con una construcción de transformación de la invención. Se contempla que las secuencias líder preferidas incluyen aquellas que comprenden secuencias predichas para dirigir la expresión óptima del gen unido, es decir, para incluir una secuencia líder consenso preferida que puede aumentar o mantener la estabilidad del ARNm y evitar el inicio inapropiado de la traducción. La elección de dichas secuencias será conocida para los especialistas en la técnica a la luz de la presente divulgación. Las secuencias que se obtienen de genes que se expresan altamente en plantas serán típicamente preferidas.

Las construcciones de transformación preparadas de acuerdo con la invención típicamente incluirán una secuencia de ADN en el extremo 3' que actúa como señal para terminar la transcripción y permitir la poliadenilación del ARNm producido por las secuencias codificantes unidas de forma funcional a un gen de desaturasa (por ejemplo, ADNc). En una realización de la invención, se usa el terminador nativo de un gen de desaturasa. Como alternativa, un extremo 3' heterólogo puede potenciar la expresión de regiones codificantes de desaturasa. Ejemplos de terminadores considerados útiles incluyen aquellos del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (extremo 3' de nos) (Bevan y col., 1983), el terminador del transcrito T7 del gen de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, el extremo 3’ de los genes de inhibidor I o II de proteasa de patata o tomate y el terminador de CaMV 35S (tml3’) . Pueden incluirse adicionalmente elementos reguladores tales como un intrón Adh (Callis y col., 1987), intrón de la sacarosa sintasa (Vasil y col., 1989) o elemento omega de TMV (Gallie y col., 1989), donde se desee.

Empleando una proteína marcadora de selección o exploración, se puede proporcionar o potenciar la capacidad de identificar transformantes. Los "genes marcadores" son genes que confieren un fenotipo distinto a células que expresan la proteína marcadora y por tanto permiten que dichas células transformadas se distingan de células que no tienen el marcador. Dichos genes pueden codificar un marcador de selección o exploración, dependiendo de si el marcador confiere un rasgo que pueda "seleccionarse" por medios químicos, es decir, a través del uso de un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida o antibiótico), o si es simplemente un rasgo que puede identificarse a través de observación o ensayo, es decir, por "exploración" (por ejemplo, la proteína fluorescente verde). Por supuesto, se conocen en la técnica muchos ejemplos de proteínas marcadoras adecuadas y pueden emplearse en la práctica de la invención.

Se cree que los procedimientos adecuados para la transformación de células vegetales u otras células para su uso con la presente invención incluyen casi cualquier procedimiento por el cual pueda introducirse ADN en una célula, tal como por suministro directo de ADN tal como por transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh y col., 1993), por captación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus y col., 1985), por electroporación (patente de EE. UU. n.º 5.384.253), por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y col., 1990; patente de EE. UU. n.º 5.302.523; y patente de EE. UU. n.º 5.464.765) por transformación mediada por Agrobacterium (patente de EE. UU. n.º 5.591.616 y patente de EE. UU. n.º 5.563.055) y por aceleración de partículas recubiertas con ADN

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(patente de EE. UU. n.º 5.550.318; patente de EE. UU. n.º 5.538.877; y patente de EE. UU. n.º 5.538.880). A través de la aplicación de técnicas tales como éstas, pueden transformarse de forma estable las células de casi cualquier especie de planta, y desarrollarse estas células en plantas transgénicas.

Después de realizar el suministro de ADN exógeno a las células destinatarias, las siguientes etapas generalmente conciernen a la identificación de las células transformadas para cultivo adicional y regeneración de la planta. Para mejorar la capacidad de identificar transformantes, se puede desear el empleo de un gen marcador de selección o exploración con un vector de transformación preparado de acuerdo con la invención. En este caso, entonces generalmente se ensayaría la población celular potencialmente transformada por exposición de las células a un agente o agentes selectivos, o se explorarían las células para el rasgo del gen marcador deseado.

Las células que sobreviven a la exposición al agente selectivo, o las células que se han valorado como positivas en un ensayo de exploración, pueden cultivarse en medos que soporten la regeneración de las plantas. En una realización ejemplar, los medios MS y N6 pueden modificarse incluyendo sustancias adicionales tales como reguladores del crecimiento. Uno de estos reguladores del crecimiento es dicamba o 2,4-D. Sin embargo, pueden emplearse otros reguladores del crecimiento, incluyendo NAA, NAA + 2,4-D o picloram. Se ha descubierto que la mejora del medio de estos modos y similares facilita el crecimiento de células en fases específicas del desarrollo. Los tejidos pueden mantenerse en un medio básico con reguladores del crecimiento hasta que está disponible suficiente tejidos para empezar los esfuerzos de regeneración de la planta, o después de rondas repetidas de selección manual, hasta que la morfología del tejido es adecuada para la regeneración, típicamente al menos 2 semanas, entonces se transfieren a medio propicio para la maduración de los embrioides. Los cultivos se transfieren cada 2 semanas en este medio. El desarrollo de brotes señalizará el momento para la transferencia a medio que carezca de reguladores del crecimiento.

Para confirmar la presencia del ADN exógeno o "transgén(es)" en las plantas en regeneración, puede realizarse una diversidad de ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos de "biología molecular", tales como transferencia de Southern y Northern y PCR™; ensayos "bioquímicos", tales como detección de la presencia de un producto proteico, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA y transferencias de Western) o por función enzimática; ensayos de partes de plantas, tales como ensayos de hojas o raíces; y también, por análisis del fenotipo de la planta regenerada completa.

Además de la transformación directa de un genotipo vegetal particular con una construcción preparada de acuerdo con la presente invención, pueden prepararse plantas transgénicas cruzando una planta que tenga un ADN seleccionado de la invención con una segunda planta que carezca del ADN. También pueden usarse técnicas de reproducción de plantas para introducir múltiples desaturasas, por ejemplo Δ6, Δ12, y/o Δ15-desaturasa(s) en una única planta. De este modo, puede regularse positivamente de forma eficaz la Δ15-desaturasa. Creando plantas homocigóticas para una actividad Δ15-desaturasa y/u otra actividad desaturasa (por ejemplo, actividad Δ6 y/o Δ12desaturasa) pueden aumentarse metabolitos beneficiosos en la planta.

Como se ha expuesto anteriormente, puede introducirse un gen de desaturasa seleccionado en una variedad de planta particular por cruce, sin la necesidad de transformar nunca directamente una planta de esa variedad dada. Por lo tanto, la presente invención también no solamente abarca una planta directamente transformada o regenerada a partir de células que se han transformado de acuerdo con la presente invención, sino también la descendencia de dichas plantas. Como se usa en el presente documento el término "descendencia" indica los descendientes de cualquier generación de una planta precursora preparada de acuerdo con la presente invención, en la que la descendencia comprende una construcción de ADN seleccionada preparada de acuerdo con la invención. "Cruzar" una planta para proporcionar una línea de plantas que tenga uno o más transgenes o alelos añadidos respecto a una línea de partida de plantas, como se desvela en el presente documento, se define como las técnicas que provocan que una secuencia particular se introduzca en una línea de plantas por cruce de una línea de partida con una planta donante que comprende un transgén o alelo de la invención. Para conseguir esto se podrían realizar, por ejemplo, las siguientes etapas: (a) plantar semillas de la primera (línea de partida) y segunda (línea de planta donante que comprende un transgén o alelo deseado) plantas precursoras; (b) cultivar las semillas de la primera y segunda plantas precursoras en plantas que albergan flores; (c) polinizar una flor de la primera planta precursora con polen de la segunda planta precursora; y (d) recoger las semillas producidas en la planta precursora que alberga la flor fertilizada.

El retrocruzamiento en el presente documento se define como el procedimiento que incluye las etapas de: (a) cruzar una planta de un primer genotipo que contiene un gen, secuencia de ADN o elemento deseado con una planta de un segundo genotipo que carece de dicho gen, secuencia de ADN o elemento deseado; (b) seleccionar una o más plantas de la descendencia que contienen el gen, secuencia de ADN o elemento deseado; (c) cruzar la planta de la descendencia con una planta del segundo genotipo; y (d) repetir las etapas (b) y (c) con el fin de transferir una secuencia de ADN deseada desde una planta de un primer genotipo hasta una planta de un segundo genotipo.

La introgresión de un elemento de ADN en un genotipo vegetal se define como el resultado del procedimiento de conversión por retrocruzamiento. Un genotipo vegetal en que se ha introducido por introgresión una secuencia de ADN puede mencionarse como genotipo, línea, endogámico, o híbrido convertido por retrocruzamiento. Asimismo un

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genotipo vegetal que carece de la secuencia de ADN deseada puede mencionarse como genotipo, línea, endogámico, o híbrido no convertido.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar realizaciones de la invención. Los ejemplos no cubiertos por el alcance de las reivindicaciones son con fines ilustrativos.

Ejemplo 1

Cepas y condiciones de cultivo

Se obtuvieron Neurospora crassa coincidente de tipo A y Aspergillus nidulans de tipo silvestre Glasgow del Fungal Genetics Stock Center. Los cultivos se cultivaron en medio de Vogel N. (Case y col., Neurospora Newsletter, 8:2526, 1965). Los cultivos líquidos se inocularon con ascosporas y se cultivaron durante tres días a ~15ºC con agitación a 100 RPM. Se recogió el micelio por filtración en un embudo Buchner a través de papel Whatman número 1 y se almacenó a 80ºC para el aislamiento del ARN o se liofilizó directamente para la determinación de la composición de ácidos grasos por cromatografía de gases. La cepa de Saccharomyces cerevisiae usada fue INVSc1, una cepa diploide que es auxotrófica para histidina, leucina, triptófano, y uracilo (Invitrogen). Las células se mantuvieron en medio YPD a 30ºC.

Ejemplo 2

Aislamiento de ARN fúngico

Se aisló el ARN total del micelio fúngico de las 3 cepas descritas en el Ejemplo 1 usando el procedimiento de guanidinio-fenol-cloroformo ácido de Chomczynski y Sacchi, (1987, Tri-Reagent, SIGMA). Este procedimiento proporciona 500 mg de micelio que se tritura en nitrógeno líquido y después se añade a 7 ml de Tri-Reagent. Se añadió cloroformo para separar la fase acuosa de la fase orgánica. El ARN se precipitó con isopropanol, después se lavó con etanol al 70% antes de resuspenderse en agua desionizada.

Ejemplo 3

Clonación de las secuencias de Δ12 y Δ15-desaturasa de N. crassa

En base a las comparaciones de secuencia con las secuencias genómicas de N. crassa, se diseñaron cebadores específicos de gen para amplificar las regiones codificantes de longitud completa de la putativa Δ12-desaturasa (Nc111F2 y Nc111R3) y la putativa Δ15-desaturasa (Nc94F6 y Nc94R8). Los cebadores directos se diseñaron para incluir tres nucleótidos 5’ del sitio de inicio Met

Nc111F2: 5’-AAGATGGCGTCCGTCTCCTCTGCCCTTCCC-3’ (SEC ID Nº 15)

Nc111R3: 5’-TTAGTTGGTTTTGGGGAGCTTGGCAGGCTTG-3’ (SEC ID Nº 16)

Nc94F6: 5’-GCGGCCGCAACATGACGGTCACCACCCGCAGCCA-3’ (SEC ID Nº 17). El sitio NotI añadido al extremo 5’ del oligonucleótido está en cursiva.

Nc94R8: 5’-CCTGCAGGTTACTGGGTGCTCTGAACGGTGTGCG-3’ (SEC ID Nº 18). El sitio Sse83871 añadido al extremo 5’ del oligonucleótido está en cursiva.

El ADNc para N. crassa se preparó usando el kit de amplificación de ADNc Marathon (Clontech Laboratories). Estos cebadores se usaron con ADNc listo para 3’-RACE para amplificar desaturasas putativas usando un sistema de PCR Gene Amp 9700 (PE Applied Biosystems) con las condiciones de ciclo recomendadas. El producto de PCR generado con los oligonucleótidos Nc94F6 y Nc94R8 se ligó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se llamó pMON67004 (FIG. 1). Se secuenció el ADNc y se descubrió que había tres "cajas His", un elemento conservado entre las desaturasas unidas a membrana, presentes en las posiciones de aminoácido 124-128, 160-164, y 359-363.

Cuando se comparan con otras Δ12 y Δ15-desaturasas unidas a membrana, se descubrió que el motivo de caja histidina "HXXHH" final también estaba intacto. Las correspondientes secuencias nucleotídica y polipeptídica para la Δ15-desaturasa (NcD15D) se dan en la SEC ID Nº 2 y la SEC ID Nº 3, respectivamente, y el clon genómico se da en la SEC ID Nº 1. Se digirió pMON67004 con EcoR1 y se ligó en el sitio EcoR1 del vector de expresión en levaduras pYES2/CT para generar pMON77208 (FIG. 2). Para los vectores de transformación de plantas, se digirió pMON67004 con EcoRI, seguido por una reacción de relleno, y después se cortó por Sse8387I. El fragmento génico se ligó en el vector binario, pMON73270, que se digirió por NotI, seguido por una reacción de relleno, y después por Sse8387I. Esto dio lugar al vector pMON77214 (FIG. 4) en que el gen de Δ15-desaturasa, NcD15D, estaba bajo la regulación del promotor específico de semilla de Napina. El fragmento de ADN digerido con EcoRI/Sse8387I también

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se ligó en el vector binario, pMON73273, dando lugar a pMON77217 (FIG. 4), en que NcD15D estaba bajo la regulación del promotor constitutivo de 35S.

El producto de PCR generado con los oligonucleótidos Nc111F2 y Nc111R3 se ligó directamente en pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen) para generar pMON67005 (FIG.7A). Se secuenció el ADNc y se descubrió que había tres "cajas His" presentes en las posiciones de aminoácido 158-162, 194-198, y 394-398. Cuando se comparan con otras Δ12 y Δ15-desaturasas unidas a membrana, se descubrió que el motivo de caja histidina "HXXHH" final también estaba intacto. Las correspondientes secuencias nucleotídica y polipeptídica para la putativa Δ12-desaturasa (NcD12D) se dan en la SEC ID Nº 39 y la SEC ID Nº 40, respectivamente.

Ejemplo 4

Transformación y expresión en levaduras

Se introdujeron las construcciones pMON67005 y pMON77208 en la cepa huésped S. cerevisiae INVSc1 (auxotrófica para uracilo) usando el protocolo PEG/Li Ac como se describe en el manual de Invitrogen para pYES2.1/V5-His-TOPO. Los transformantes se seleccionaron en placas preparadas de medio mínimo SC menos uracilo con glucosa al 2%. Las colonias de transformantes se usaron para inocular 5 ml de medio mínimo SC menos uracilo y glucosa al 2 % y se cultivaron durante una noche a 30ºC. Para la inducción, se sedimentaron las células de levadura en fase estacionaria y se resuspendieron en medio mínimo SC menos uracilo complementado con galactosa al 2% y se cultivaron durante 3 días a 15ºC. Cuando se proporcionaron ácidos grasos exógenos a los cultivos, se añadieron 0,01% de LA (Δ9,12-18:2) con el emulsionante Tergitol al 0,1%. Los cultivos se cultivaron durante 3 días a 15ºC, y posteriormente se recogieron por centrifugación. Los sedimentos celulares se lavaron una vez con tampón TE estéril pH 7,5, para retirar el medio, y se liofilizaron durante 24 h. La cepa huésped transformada con el vector que contenía el gen LacZ se usó como control negativo en todos los experimentos.

Para el análisis de ácidos grasos, la extracción de los lípidos de la levadura siguió los procedimientos descritos previamente. En resumen, se extrajeron los sedimentos celulares liofilizados con 15 ml de metanol y 30 ml de cloroformo que contenía 100 g de tridecanoína. Después de la extracción, los lípidos de la levadura se saponificaron primero, y se metilaron los ácidos grasos liberados. Después se analizó la distribución de los ésteres metílicos de ácido graso por cromatografía de gases (CG) usando un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 5890 II Plus (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) equipado con un detector de ionización por llama y una columna capilar de sílice condensada (Supelcomega; 50 m x 0,25 mm, d.i., Supelco, Bellefonte, PA).

En la levadura transformada con el vector de expresión que contiene LacZ como control, no se midió LA o ALA

(18:3) en líneas cultivadas en ausencia de LA añadido. En la levadura transformada con un vector de expresión que contiene NcD15D o BnD15D, en ausencia de LA añadido, no se acumuló ALA. En la levadura transformada con un vector de expresión que contiene NcD12D, sin LA añadido, se acumuló LA hasta el 22% de los ácidos grasos, indicativo de actividad D12D. Cuando se añadió LA a la línea de levadura que expresa NcD15D, el ALA comprometió el 1% de los ácidos grasos. En la línea de levadura que expresa la Δ15-desaturasa de Brassica napus (BnD15D), el ALA comprometió el 0,2% de los ácidos grasos después de la adición de LA. En el control de LacZ, no se detectó ALA después de la adición de LA.

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TABLA 1 Datos de expresión en levaduras

% de ácidos grasos en levaduras

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16:1 18:0 18:1 18:2 18:3

Construcción

Identidad Sustrato FA añadido % % % % % %

pMON77208

NcD15D ninguno 13,96 48,33 5,06 29,07 0,02 0,02

pMON67003

BnD15D ninguno 13,22 48,15 5,18 29,82 0,00 0,00

PMON67005

NcD12D ninguno 15,24 47,95 5,18 10,3 22,3 0

LacZ

LacZ

ninguno 14,01 49,61 5,27 27,29 0,02 0,01

pMON77208

NcD15D 18:2 18,34 25,98 5,94 16,09 30,30 1,04

pMON67003

BnD15D 18:2 18,45 26,19 5,91 16,26 30,61 0,20

LacZ

LacZ

18:2 19,26 18,87 6,00 10,82 42,47 0,01

Ejemplo 5

Transformación de Arabidopsis con NcD15D

Este ejemplos describe la transformación y regeneración de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan una secuencia codificante heteróloga de Δ15-desaturasa. Se cultivaron plantas de Arabidopsis sembrando semillas en macetas de 10,16 centímetros que contenían agua por ósmosis inversa (ROW) y MetroMix 200 saturado (The SCOTTS Co., Columbus, OH). Las plantas se transformaron por vernalización colocando las macetas en cajoneras, cubiertas con una cúpula de humedad, en una cámara de crecimiento a 4-7ºC, con 8 horas de luz/día durante 4-7 días. Las cajoneras se transfirieron a una cámara de crecimiento a 22ºC, 55% de humedad relativa, y 16 horas de luz/día a una intensidad promedio de 160-200 ~Mol/s*m2. Después de la germinación, la cúpula se levantó y se deslizó hacia atrás 2,54 cm para permitir la circulación suave de aire sin desecación. La cúpula de humedad se retiró cuando se hubieron formado las verdaderas hojas. Las plantas se regaron en la parte inferior, según lo necesario, con ROW hasta 2-3 semanas después de la germinación. Las plantas se regaron en la parte inferior, según lo necesario, con solución PLANTEX 18-18-15 (Plantex Corporation Ottawa, Canadá) a 50 ppm de N2. Las macetas se redujeron de modo que permaneciera 1 planta por maceta a las 2-3 semanas después de la germinación. Una vez las plantas comenzaron a florecer, se recortó la inflorescencia principal para alentar el crecimiento de tallos axilares de floración.

Se introdujeron los vectores de transformación pMON77214 y pMON77217 en la cepa de Agrobacterium tumefaciens ABI usando metodología bien conocida en la técnica. Se obtuvieron plantas transgénicas de A. thaliana como se describe por Bent y col. (1994) o Bechtold y col. (1993). En resumen, se cultivaron cultivos de Agrobacterium que contenían los vectores binarios pMPON77214 o pMON77217, durante una noche en LB (bactotriptona al 10%, extracto de levadura al 5%, y NaCl al 10% con kanamicina (75 mg/l), cloranfenicol (25 mg/l), y espectinomicina (100 mg/l)). El cultivo bacteriano se centrifugó y se resuspendió en sacarosa al 5% + Silwet-77 al 0,05%. La parte aérea de plantas completas de A. thaliana (~5-7 semanas de edad) se sumergió en la solución resultante durante 2-3 segundos. El exceso de solución se retiró transfiriendo las plantas a toallas de papel. Las plantas sumergidas se colocaron de lado en una cajonera cubierta y se transfirieron a una cámara de crecimiento a 19ºC. Después de 16 a 24 horas, se retiró la cúpula y las plantas se pusieron derechas. Cuando las plantas alcanzaron la madurez, se privaron de agua durante 2-7 días antes de recoger las semillas. La semilla recogida se pasó a través de un tamiz de malla de acero inoxidable.

Para seleccionar los transformantes, la semilla se colocó en medio agar que contenía 50 mg/l de glifosato. Los plantones verdes se rescataron y trasplantaron en macetas de 10,16 cm y se cultivaron en las condiciones descritas anteriormente. Se recogieron las hojas para el análisis de ácidos grasos cuando la roseta estuvo en fase de 4 hojas. Después de la liofilización, se analizaron los ácidos grasos de las hojas como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 6

Expresión funcional de clones de N. crassa

Para evaluar la especificidad funcional del clon de N. crassa D15D, se clonó la región codificante de pMON67004 en un vector de expresión de plantas en que el promotor constitutivo de 35S dirige la expresión del transgén. La

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construcción resultante, pMON77217, se transformó en A. thaliana y se analizaron las hojas de plantas T2 transformadas para la composición de ácidos grasos. En líneas no transformadas, aproximadamente el 20% de los ácidos grasos eran LA, y aproximadamente el 48% ALA. En dos eventos independientes de transformación de A. thaliana, los niveles de LA estaban reducidos hasta aproximadamente el 3% y el 5%, y los niveles de ALA estaban aumentados hasta el 65% y el 63%, respectivamente, lo que indica actividad Δ15-desaturasa in planta. Estos datos se resumen en la Tabla 2. Los controles se denominan como CONT.

TABLA 2 Contenido de ácidos grasos de hojas de Arabidopsis

EVENTO

16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 (LA) 18:3(ALA)

CONT 1

14,9 0,8 1,4 4,8 19,7 48,2

CONT 2

15,3 0,9 1,4 5,1 20,5 49,2

CONT 3

14,5 0,9 1,4 5,1 19,6 49,5

ATG174

15,6 1,0 1,6 4,6 15,4 51,9

AT G717

15,3 0,7 1,4 4,2 17,9 52,1

AT G716

14,9 0,6 1,6 3,1 15,8 55,1

ATG718

15,3 0,8 1,8 4,0 5,4 63,7

AT G709

17,0 0,9 1,9 4,3 3,5 64,0

Para evaluar la especificidad funcional del clon de N. crassa D15D para dirigir la producción de ALA en semillas, se

10 clonó la región codificante de pMON67004 en un vector de expresión específico de semilla en que el promotor de Napina dirige la expresión del transgén. La construcción resultante, pMON77217, se transformó en A. thaliana y se analizaron las semillas de plantas T2 transformadas para la composición de ácidos grasos. En líneas no transformadas, aproximadamente el 26% de los lípidos de las semillas estaban presentes como LA, y aproximadamente el 18% como ALA. En dos eventos independientes de transformación de A. thaliana, los niveles

15 de ácido LA estaban reducidos hasta aproximadamente el 14% y el13 %, y los niveles de ácido ALA estaban aumentados hasta el 26% y el 30%, respectivamente, lo que indica actividad Δ15-desaturasa en las semillas. Los datos se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3 Contenido de ácidos grasos de semillas de Arabidopsis

EVENTO

16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 (LA) 18:3 (ALA)

Control

6,86 0,39 2,94 14,7 27,95 17,75

Control

7,11 0,37 3,33 15,22 26,48 18,11

G709

7,1 0,37 3,13 13,16 24,58 20,85

G711

7,08 0,37 3,16 13,49 24,24 21,07

G705

7,75 0,38 3,09 12,62 19,26 26,3

G707

8,12 0,36 2,98 14,2 15,71 29,74

20 Estos resultados indican que la proteína codificada por el ADNc de Neurospora NcD15D es una Δ15-desaturasa funcional en plantas y puede dirigir la síntesis de ALA en hojas y en semillas.

Ejemplo 7 Actividad de la Δ15-desaturasa de Neurospora crassa en canola

Se transformaron líneas con la construcción pMON77214, que contiene la Δ15-desaturasa de Neurospora dirigida 25 por el promotor de Napina. Se transformaron ambas variedades de canola Quantum y Ebony y se incluyeron

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La producción de ALA a niveles mayores del ~12% de ácidos grasos en las semillas en estas líneas fue indicativa de la actividad Δ15-desaturasa heteróloga. El mayor nivel de ALA observado a partir de esta transformación fue en la línea BN_G1395, que contiene un 30,17% de ALA.

Para varias de las líneas que expresan pMON77214, se determinaron los ácidos grasos en semillas individuales y las líneas se avanzaron a la siguiente generación. Como se esperaba, los niveles de ALA aumentaron hasta casi 2 veces los de las semillas individuales respecto a las combinaciones, indicativo de homocigosidad para los transgenes en segregantes individuales dentro de cada silicua. En la línea BN_1296, la semilla R1 combinada contenía el 25,04% de ALA. En la semilla individual superior de esta línea (BN_G1296-14), se observó el 48,2% de ALA. Los niveles de ALA en 200 semi-semillas, ordenados desde el más bajo hasta el más alto de ALA, se muestran en la FIG. 3.

Ejemplo 8

Clonación de la secuencia de Δ15-desaturasa de A. nidulans y las secuencias de Δ12 y Δ15-desaturasa de B. cinerea

En base a las comparaciones de secuencia con la secuencia genómica de A. nidulans, se diseñaron cebadores específicos de gen para amplificar las regiones codificantes de longitud completa de la putativa Δ15-desaturasa (AnD15-F1 y AnD15-R1). El cebador directo se diseñó para incluir tres nucleótidos 5’ del sitio de inicio Met.

imagen10

Los cebadores oligonucleotídicos BcD12F1 y BcD12R1 se diseñaron a partir de una secuencia genómica parcial (clon gDNA parcial propiedad de Monsanto encontrado con BLASTALL) para amplificar las regiones codificantes de longitud completa de Δ12-desaturasa de B. cinerea. El cebador degenerado D15D-R9 se diseñó para amplificar cualquier Δ15-desaturasa putativa de B. cinerea en una reacción 5’-RACE. El oligonucleótido BCD15-F1 se diseñó para una reacción 3’ RACE del producto de PCR generado a partir del oligonucleótido D15D-R9. Los oligonucleótidos BcD15F3 y BcD15R1 F se diseñaron para amplificar la región codificante de longitud completa de una Δ15-desaturasa putativa de B. cinerea.

SEC ID Nº 25

SEC ID Nº 26

SEC ID Nº 27

SEC ID Nº 28

SEC ID Nº 29

SEC ID Nº 30 El ADNc para A. nidulans y B. cinerea se prepararon usando el kit GeneRacer (Invitrogen). Estos cebadores se usaron con ADNc listo para 3’-RACE para amplificar desaturasas putativas usando un sistema de PCR Gene Amp 9700 (PE APPLIED BIOSYSTEMS) con las condiciones de ciclo recomendadas. El producto de PCR que codifica la Δ15-desaturasa de A. nidulans se generó con los oligonucleótidos AnD15-F1 y AnD15-R1, se ligó en pYES2.1-TOPO (Invitrogen) y se llamó pMON67010 (FIG. 7B). Se secuenció el ADNc y se descubrió que había tres "cajas His", un elemento conservado entre las desaturasas unidas a membrana, presentes en las posiciones de aminoácido 93-97, 129-133, y 327-331. Las correspondientes secuencias nucleotídica y polipeptídica para la putativa Δ15desaturasa (AnD15D) se dan en la SEC ID Nº 4 y la SEC ID Nº 5, respectivamente.

Se amplificó un ADNc que codifica la Δ12-desaturasa de B. cinerea por PCR con los oligonucleótidos BcD12F1 y BcD12R1 y posteriormente se ligó directamente en pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen) para generar pMON67022 (FIG. 7D). Se secuenció el ADNc y se descubrió que había tres "cajas His", un elemento conservado entre las desaturasas unidas a membrana, presentes en las posiciones de aminoácido 155-159, 191-195, y 390-394. Las secuencias nucleotídica y polipeptídica correspondientes para la putativa Δ12-desaturasa (BcD12D) se dan en la SEC ID Nº 31 y la SEC ID Nº32, respectivamente.

Para clonar una Δ15-desaturasa de B. cinerea se generó un oligonucleótido degenerado basado en una alineación de secuencia de aminoácidos de las Δ12 y Δ15-desaturasas de N. crassa, y Aspergillus sp. Se realizó una reacción 5’-RACE usando un kit GeneRacer (Invitrogen, Carlsbad CA) siguiendo las condiciones recomendadas por el

imagen11

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un inserto de ADN T parcial único que ha perdido todo el ADN del inserto entre el límite izquierdo y las 51 pares de bases terminales de la región codificante de la Δ12-desaturasa de Mortierella alpina (por ejemplo, las últimas 51 pb de la SEC ID Nº 41). Es notable que en la línea de alto SDA/bajo GLA el ácido oleico está a niveles casi de tipo silvestre mientras que en las líneas de alto SDA/alto GLA, el ácido oleico se reduce en aproximadamente 2,5 veces con respecto al tipo silvestre. Las líneas que presentan el genotipo de alto SDA/alto oleico están resaltadas con gris.

TABLA 7 Resultados de porcentaje de área relativa (porcentaje en peso aprox.) de semillas R1 individuales de BN_G1190

Línea

Composición de ácidos grasos (porcentaje en peso)

N.º

SA OA LA GLA ALA SDA

1

1,29 64,94 19,96 0 9,07 0

2

1,53 65,62 16,5 0 10,01 0

3

1,4 61,38 20,02 0 11,78 0,02

4

1,78 65,09 17,67 0,02 9,22 0,15

5 6 7

1,53 2,01 1,8 60,94 61,95 59,54 7,8 3,55 14,13 7,1 4,2 12,34 5,5 4,47 12,81 5,23 5,79 9-2

8

2,16 25,6 17,86 19,69 18,91 9,28

9

1,9 61,92 4,71 3,25 12,71 9,34

10 11

4,79 2,81 22,52 61,55 14,36 29,86 9,84 3,92 2,79 11,89 10,29 10,46

12

2,07 61,13 4,36 4,37 10,9 10,47

13

1,57 59,75 4,27 3,3 13,01 11

14

1,89 63,95 3,54 2,88 10,29 11,09

15

1,95 62,9 4 3,53 10,35 11,29

16

2,04 60,91 4,2 3,2 12,16 11,37

17

2,37 49,02 7,68 12,6 9,45 11,48

18

1,88 62,52 3,41 4,25 9,09 11,79

19

2,4 25,65 16,6 17,6 18,36 12,03

20

3,31 25,5 16,45 16,69 18,76 12,12

21

5,64 20,98 12,57 29,74 10,03 12,17

22

2,51 24,55 15,7 17,28 19,83 12,23

23

2,62 25,54 15,55 18,14 18,87 12,45

24

3,35 22,96 14,87 23,38 14,62 12,98

25

2,2 24,61 15,99 17,98 18,5 13,61

26

1,62 58,5 3,48 3,09 12,36 13,66

27

3,77 24,48 14,69 18,4 16,75 13,85

28

2,51 23,72 15,35 16,53 19,8 14,24

29

2,46 24,04 13,81 18,61 19,94 14,31

30

2,44 23,63 14,82 20,44 16,85 14,35

31

1,85 64,75 1,94 2,85 7,01 14,55

32

2,04 19,45 14,32 15,63 25,95 14,73

33

2,24 23,34 14,79 18,9 18,22 14,84

34

3,55 23,16 12,92 21,86 15,59 15,12

35

3,17 24,94 12,74 18,41 16,98 15,26

36

2,36 21,79 14,57 23,35 13,99 15,38

37

2,55 23,14 14,94 19,56 17,3 15,39

38

2,53 23,44 14,99 16,32 19,84 15,46

39 40

2,09 2,22 58,1 61,6 2,87 3,21 11,23 2,44 3-32 8,34 15,52 15,58

41

4,1 23,71 13,78 17,72 18,09 15,63

42

2,34 22,81 13,35 19,72 19,09 15,67

43

3,71 21,49 13,43 22,95 14,94 15,98

44

4,05 23,04 13,77 20,1 15,43 16,18

45

2,57 24,02 12,05 19,87 17,05 16,46

46

2,09 62,09 1,98 3,08 7,06 16,75

47

3,17 21,82 13,7 16,23 21,06 16,82

48

4,07 22,52 12,25 19,85 16,27 16,86

49

2,46 22,48 12,5 20,28 17,02 17,66

50

2,78 24,11 11,17 18,82 17,75 18,59

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Para evaluar adicionalmente la actividad de la Δ15-desaturasa de Neurospora crassa en combinación con las Δ6 y Δ12-desaturasas de M. alpina, se volvieron a transformar líneas homocigóticas para la construcción pCGN5544 (que contiene las Δ6 y Δ12-desaturasas de M. alpina), que contenía hasta un 35% de GLA en los aceites de semilla, con la construcción pMON77214 que contenía NcD15D. Se analizaron combinaciones de veinte semillas de 11 plantas R0. El LA, ALA, SDA y GLA en estas líneas se muestran en la Tabla 8.

TABLA 8 Resultados del análisis de porcentaje de área relativa (porcentaje en peso aprox.) de semillas R1 combinadas

Línea LA ALA SDA GLA Control Ebony 16,05 8,7 0 0 Control Ebony 17,46 9,05 0 0 BN_1569 21,19 11 0,11 30,1 BN_1561 25,35 14,7 1,57 6,03 BN_1566 29,26 14,03 1,75 9,04 BN_1564 17,92 26,51 2,33 4,5 BN_1644 24,25 16,1 4,05 16,64 BN_1527 22 15,97 4,17 10,44 BN_1563 20,13 17,26 4,52 12,11 BN_1609 22,46 23,76 5,22 11,39 BN_1622 9,1 15,77 6,33 5,23 BN_1680 21,47 19,19 11,19 19,07 BN_1624 12,95 22,1 17,95 18,11

Ejemplo 11

10 Actividad de la Δ15-desaturasa de Neurospora crassa en combinación con la Δ6-desaturasa de Mortierella alpina

Se evaluó la actividad de la Δ15-desaturasa de Neurospora crassa en combinación con la Δ6-desaturasa de Mortierella alpina transformando canola con la construcción pMON77215 (FIG. 7F), que contiene las dos desaturasas bajo el control del promotor de la Napina. Este vector se construyó digiriendo pCGN5536 (patente de

15 EE. UU. n.º 6.459.018 B1), que contiene el promotor de Napina dirigiendo la expresión de la Δ6-desaturasa de M. alpina (MaD6D), con NotI y después ligando el fragmento del casete de expresión en el sitio Not I del vector binario, pMON70660, para formar pMON77212. El plásmido pMON77215 se construyó digiriendo pMON77214 con PmeI y AscI y después ligando el fragmento del casete de expresión de Napina-NcD15D resultante en los sitios SwaI y AscI de pMON77212, para dar una construcción que contenía tanto MaD6D como NcD15D.

20 Se determinó el contenido de ácidos grasos de combinaciones de 10 transformantes de canola R0 individuales. Los niveles de SA, OA, LA, ALA, SDA y GLA se muestran en la siguiente Tabla 9. La línea de control fue Ebony (SP30052). Las semillas combinadas de una mayoría de los eventos transgénicos producidos contenían SDA medible y en el 25% de los eventos (10 de 40) el SDA se acumuló hasta más del 10% de los ácidos grasos.

25

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TABLA 9 Resultados de porcentaje de área relativa (porcentaje en peso aprox.) de semillas R1 combinadas de pMON77215

Evento ID

SA OA Ácido graso (porcentaje en peso) LA GLA ALA SDA

Control Ebony

1,43 66,47 16,85 0 8,7 0

BN_G2463

1,98 63,51 17,96 0,13 9,9 0,1

BN_G2444

1,62 60,61 19,58 0,13 11,38 0,36

BN_G2443

1,47 59,39 17,8 3,42 10,2 1,1

BN_G1700

1,69 65,41 11,8 7,79 4,93 1,69

BN_G2082

1,84 59,51 16,72 4,45 10,16 1,73

BN_G2316

2,19 66,1 11.4S9 7,17 4,24 2,24

BN_G2083

1,89 61,57 12,61 7,29 7,02 2,28

BN_G2413

1,97 64,12 9,74 1,58 11,09 4,63

BN_G2317

2,74 66,72 6,92 0,44 10,42 5,13

BN_G2412

2,31 61,63 8,48 1,66 13,6 5,21

BN_G2315

2,91 64,38 10,22 0,91 6,07 5,28

BN_G2028

1,91 61,48 10,25 2,2 11,59 5,59

BN_G2357

2,51 64,17 8,28 0,85 10,42 5,62

BN_G2027

2,13 53,72 12,39 2,6 15,72 5,78

BN_G2360

2,51 62,75 9,47 4,89 7,17 5,84

BN_G2390

3,2 63,66 8,44 0,5 10,2 5,88

BN_G2029

1,78 61,89 10,41 1,44 11,12 6,35

BN_G2414

2,07 57,13 11 2,36 14,07 6,44

BN_G2416

2,26 65,01 7,17 0,83 11,86 6,45

BN_G2250

2,19 61,99 8,8 1,93 9,72 6,6

BN_G1698

1,82 68,26 6,4 3,76 6,55 6,65

BN_G2356

2,82 62,46 11,52 1,75 6,99 6,84

BN_G1937

2 56,02 10,92 2,24 12,6 7,81

BN_G2319

1,99 58,47 9,63 5,86 9,05 7,91

BN_G1699

1,74 64,72 7,85 2,46 8,1 8,29

BN_G2359

2,96 64,17 7,09 2,05 7,67 8,88

BN_G2460

2,54 62,4 5,33 1,43 11,43 9,63

BN_G2409

3,27 57,85 9,71 3,97 7,44 9,87

BN_G2318

2,54 61,04 7,6 2,37 8,43 9,99

BN_G2358

2,76 62,33 5,88 2,06 8,72 10,08

BN_G1697

2,58 63,63 4,49 5,11 6,18 10,29

BN_G1803

1,13 55,27 9,21 4,08 12,73 10,29

BN_G2391

2,83 58,33 11,45 2,42 6,6 10,57

BN_G1859

2,33 52,66 9,71 2,98 12,19 11,03

BN_G2389

2,54 59,21 6,97 3,88 8,07 11,84

BN_G1860

2,22 51,02 9,49 4,62 10,5 13,44

BN_G2410

3,24 55,96 7,03 3,1 8,88 13,82

BN_G2445

2,77 57,67 6,21 2,78 9,62 14,14

BN_G2361

2,31 56,5 8,86 3,77 6,48 14,78

Los datos de ácidos grasos de semillas individuales del evento BN_G1860, incluyendo tanto homocigotos como heterocigotos, se muestran a continuación en la Tabla 10. En un caso, se observaron hasta un 19% de SDA, un 10% de ALA, un 7% de LA, un 48% de ácido oleico y un 5% de GLA.

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TABLA 10 Resultados de porcentaje de área relativa (porcentaje en peso aprox.) de semillas R1 individuales de pMON77215 de BN_G1860

Evento ID

SA OA Ácido graso (porcentaje en peso) LA GLA ALA SDA

BN_G1860-1

1,57 65,11 16,5 0 10,47 0,01

BN_G 1860-2

1,4 57,32 19,05 0 15,3 0,02

BN_G 1860-3

1,74 60,16 19,44 0 11,95 0,03

BN_G 1860-4

1,77 56,85 8,11 6,79 9,11 9,96

BN_G 1860-5

2,37 57,88 5,26 2,94 12,72 11,48

BN_G 1860-6

1,72 60,18 5,03 2,87 11,42 11,71

BN_G 1860-7

2,53 55,86 9,31 6,08 5,96 12,23

BN_G 1860-8

2,21 56,83 7,48 5,93 8,52 12,38

BN_G 1860-9

2,12 60,21 4,83 2,8 10,13 12,43

BN_G1860-10

3,12 56,6 10,33 4,54 4,5 12,48

BN_G1860-11

2,2 53,64 12,32 5,54 4,73 12,88

BN_G1860-12

2,25 55,58 10,53 5,07 5,42 13,53

BN_G1860-13

2,03 57,57 7,08 4,19 8,15 13,69

BN_G1860-14

1,76 54,42 7,16 6,43 8,99 13,77

BN_G1860-15

2,77 57,4 8,5 4,17 5,73 13,78

BN_G1860-16

1,43 55,39 9,93 5,62 6,38 13,82

BN_G1860-17

2,91 53,02 10,79 4,34 5,89 13,92

BN_G1860-18

1,92 60,27 3,72 1,96 10,7 13,92

BN_G1860-19

1,85 59,6 4,72 2,56 9,85 14,16

BN_G 1860-20

2,45 58,84 6,51 3,66 6,88 14,22

BN_G 1860-21

1,88 57,95 5 2,85 10,56 14,42

BN_G 1860-22

1,91 55,15 6,02 5,3 9,2 14,75

BN_G 1860-23

3,01 59,08 5,36 2,88 7,33 14,85

BN_G 1860-24

2,94 56,48 6,78 3,95 7,83 14,86

BN_G 1860-25

2,34 53,88 8,64 4,49 6,42 14,94

BN_G 1860-26

2,75 52,92 7,04 4,38 9,4 14,96

BN_G 1860-27

1,7 57,28 4,41 2,99 10,74 15,05

BN_G 1860-28

2,3 53,15 9,42 5,79 6,53 15,29

BN_G 1860-29

2,9 54,49 6,2 3,73 7,92 15,38

BN_G 1860-30

1,8 58,02 4 2,41 10,67 15,42

BN_G1860-31

2,67 54,97 7,32 4,68 7,92 15,44

BN_G 1860-32

2,31 56,01 5,09 4,34 9,93 15,47

BN_G 1860-33

2,18 55,92 8,83 4,06 5,46 15,54

BN_G 1860-34

2,38 54,85 8,52 4,01 5,76 15,56

BN_G 1860-35

1,99 58,89 4,14 2,09 9,74 15,58

BN_G 1860-36

2,87 55,91 6,55 2,8 7,37 15,66

BN_G 1860-37

2,35 53,18 8,89 4,73 6,45 15,71

BN_G 1860-38

3,15 51,6 10,29 4,85 5,68 15,78

BN_G 1860-39

2,31 55,68 6,08 4,52 7,81 15,92

BN_G 1860-40

3,26 54,62 6,54 3,55 7,53 16,19

BN_G1860-41

2,09 56,03 6,27 4,04 7,56 16,35

BN_G 1860-42

2,33 53,62 6,48 5,35 7,97 16,62

BN_G 1860-43

2,37 57,86 5,24 2,81 7,32 16,77

BN_G 1860-44

2,04 51,3 11,41 5,03 5,09 16,94

BN_G 1860-45

2,1 53,32 8,75 4,04 6,44 17,12

BN_G 1860-46

2,14 53,01 6,85 4,3 7,82 17,16

BN_G 1860-47

2,42 50,96 7,83 4,13 7,91 17,44

BN_G 1860-48

1,94 49,97 10,64 4,78 5,74 17,84

BN_G 1860-49

1,46 55,32 4,57 2,67 9,98 18

BN_G 1860-50

2,41 47,66 6,83 5,46 9,91 19,23

Ejemplo 12 Optimización de codones de la secuencia de la Δ15-desaturasa de N. crassa para maíz

29

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Claims (1)

1. imagen1

   imagen2

   imagen3

   imagen4

   imagen5