ES2421207A1

ES2421207A1 - Procedimiento y kit de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino

Info

Publication number: ES2421207A1
Application number: ES201330806A
Authority: ES
Inventors: Aroa SUÁREZ VEGA; Beatriz GUTIÉRREZ GIL; Juan José ARRANZ SANTOS
Original assignee: Universidad de Leon
Current assignee: Universidad de Leon
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2013-08-29
Anticipated expiration: 2033-05-31
Also published as: ES2421207B1

Abstract

Procedimiento y kit de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino. El procedimiento comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen RELN ovino, identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1, en una muestra biológica obtenida de ganado ovino. Dicha identificación puede realizarse amplificando por PCR en dicha muestra un fragmento de ADN situado entre los cebadores con una identidad de al menos 80 % respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3, determinando el número y tamaño de los fragmentos de ADN resultantes de dicha amplificación y realizando un diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar a partir de la información obtenida en el paso anterior.

Description

Procedimiento y kit de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino.

CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención es el diagnóstico de enfermedades genéticas de herencia mendeliana simple (monogénica) en animales domésticos. En particular, la presente invención se refiere a la detección de la mutación responsable de la enfermedad genética denominada lisencefalia con hipoplasia cerebelar en el ganado ovino y al método de determinación del estatus genético de un individuo (sano, portador, enfermo) en relación con esta enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El término lisencefalia significa literalmente “cerebro liso” y engloba a un grupo de malformaciones severas del cerebro causadas por una migración anormal de las neuronas post-mitóticas al córtex en desarrollo. La lisencefalia se caracteriza por la ausencia total (agiria) o parcial (paquigiria) de circunvoluciones cerebrales. Se asocia con un córtex cerebral engrosado y heterotopia neuronal difusa.

Existen diversos tipos de lisencefalia, pero principalmente se clasifican en dos: lisencefalia clásica y lisencefalia pavimentosa. La lisencefalia con hipoplasia cerebelar (LHC) se constituye como una variante de estas, ya que a las malformaciones a nivel del córtex cerebral (que pueden ser de tipo clásica o pavimentosa) se asocia un subdesarrollo del cerebelo. Dentro de la LHC se pueden distinguir seis subtipos.

La base genética de la LHC ovina no ha sido descrita y por tanto no existe actualmente un marcador genético para esta enfermedad del ganado ovino que pueda utilizarse para predecir el estatus de portador o no portador de animales sanos en rebaños en los que se haya identificado la enfermedad.

El procedimiento diagnóstico de la LHC descrito en la presente invención se basa en que en la presente invención se ha identificado una mutación asociada a la enfermedad en un fragmento del gen RELN, que codifica para la proteína Reelina. La Reelina es una proteína extracelular implicada en la migración neuronal postmitótica durante el periodo embrionario que juega un papel clave en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC).

En humanos, mutaciones en el gen RELN provocan una LHC conocida como lisencefalia tipo 2 o síndrome Norman Roberts (OMIM: 257320). En roedores, alteraciones en la reelina o en su cascada de señalización originan el fenotipo reeler. Los roedores reeler han sido ampliamente estudiados tanto por ser un modelo de la enfermedad humana como por su utilidad a la hora del estudio de la migración neuronal y desarrollo del SNC.

El gen RELN está situado en el cromosoma ovino 4 (OAR4), en la región 44.668.137- 45.204.609 pb según la versión Oarv3.1 del genoma ovino. La distribución de exones e intrones a lo largo de las 536.472 Kb del ADN que contiene el gen RELN no se ha determinado anteriormente.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Una realización es un procedimiento de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino que comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen RELN ovino, identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1, en una muestra biológica obtenida de ganado ovino, en adelante procedimiento de la invención.

Los inventores de la presente invención han determinado que el tamaño de la región codificante del gen es de 10383 pb distribuidos en un total de 64 exones.

La secuencia codificante del mARN (CDS) del gen RELN ha sido depositada por los inventores de la presente invención en GenBank con fecha 07/02/2013, obteniéndose para ella el número de acceso KC590614.

El fragmento de ADN identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1 corresponde a una deleción de 31 pb entre las posiciones 5.410 y 5.440 de la secuencia codificante del mARN del gen RELN ovino antes referida (GenBank Acc. no KC590614), correspondiente a las posiciones 44752377 y 44752407 pb en la secuencia de ADN del genoma ovino (Oarv3.1), en el exón 36 del gen. Esta deleción se ha identificado por primera vez en la presente invención como responsable de la lisencefalia con hipoplasia cerebelar en oveja, mediante un estudio comparado de la secuencia codificante de este gen en animales enfermos y sanos.

El procedimiento de la invención permite detectar individuos sanos portadores de la enfermedad. Dichos portadores serán heterocigotos para la deleción de 31 pb localizada en el exón 36 del gen, es decir tendrán una copia del gen completa y otra copia portadora de la delecion.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha detección se realiza con un biosensor o microarray.

Otra realización es el procedimiento de la invención, que comprende:

(a): amplificar por PCR en dicha muestra biológica un fragmento de ADN situado entre los cebadores con una identidad de al menos 80 % respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3,

(b): determinar el número y tamaño de los fragmentos de ADN resultantes de dicha amplificación y

(c): realizar un diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar a partir de la información obtenida en el paso (b).

En la presente solicitud, dicho porcentaje de identidad en una secuencia determinada se calcula teniendo en cuenta que un 80% de identidad significa que un 80% de residuos de la secuencia completa de los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3 son idénticos a los residuos de la secuencia determinada.

Otra realización es el procedimiento de la invención, en el que antes de la etapa (a) se realiza una extracción de ADN de dicha muestra biológica.

La extracción del ADN a partir de estas muestras se puede realizar por métodos como el fenol-cloroformo descrito en Sambrook, 1989 (Sambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); por el método “Salting out” descrito en Miller, 1988 (Miller, S.A. et al, 1988. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic acids research, 16(3), pp. 1215) en el caso del semen o la utilización de Chelex-100 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) para la extracción a partir de muestras de pelo. La extracción del ADN también se puede realizar utilizando Kits comerciales de extracción de ADN, sobre todo para muestras de saliva o de muestras de flujo nasal en las que se parte de una escasa cantidad de células nucleadas.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha identidad de secuencia es de al menos 90%.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dichos cebadores están identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha muestra biológica está seleccionada del grupo compuesto por pelo, tejido, célula o fluido biológico.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicho fluido biológico está seleccionado del grupo compuesto por saliva, leche, suero, plasma sanguíneo, sangre, semen y fluido nasal.

Otra realización es un kit para realizar el procedimiento de la invención, que comprende los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

El procedimiento de la invención constituye un método sencillo, rápido y económico de detección de animales portadores, evitando que animales heterocigotos puedan seleccionarse para reposición en el rebaño y ser incluidos en el programa de mejora correspondiente, hechos que favorecerían la diseminación de la enfermedad.

El procedimiento de la invención puede utilizarse también para la detección de animales portadores en el caso de cruzamientos programados para obtener animales que sirvan como modelo animal en el estudio de la enfermedad.

El procedimiento de la invención puede aplicarse a corderos que presenten síntomas nerviosos compatibles con la enfermedad con el fin de descartarla sin necesidad de realizar una necropsia. Otras enfermedades con síntomas similares son la colibacilosis nerviosa, que en corderos recién nacidos produce delgadez y ataxia.

TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS A continuación se aporta una traducción del texto libre en inglés que aparece en la lista de secuencias.

SEQ ID NO: 1. Fragmento de deleción del gen ovino RELN. SEQ ID NO: 2. Cebador sentido para PCR. SEQ ID NO: 3. Cebador antisentido para PCR. SEQ ID NO: 4. Fragmento del gen salvaje ovino RELN. 188..365 Exón 36 277..307 Fragmento de deleción SEQ ID NO: 5. Fragmento del gen ovino RELN resultante de la deleción. 188..334 Exón 36

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Se muestran los resultados para 5 muestras, de izquierda a derecha, en la tercera y cuarta muestras se obtuvo una única banda de 498 pb, que indica genotipo homocigoto para el alelo salvaje (+/+), y por tanto animales sanos y no portadores; en la segunda muestra se obtuvo una única banda de 467 pb, que indica genotipo homocigoto para la deleción de 31 pb (del/del), únicamente identificable en individuos afectados por la enfermedad.

En la primera y quinta muestras se obtuvieron dos bandas de 498 y 467 pb, que indican genotipo heterocigoto para la deleción (+/del), correspondiente a animales sanos pero portadores.

MODOS DE REALIZACIÓN PREFERENTE

Ejemplo 1. Diagnóstico genético de animales afectados por lisencefalia con hipoplasia cerebelar y animales portadores de dicha enfermedad

En una explotación ganadera nacieron corderos con incoordinación de movimiento, aunque con un estado de salud bueno. Se examinaron los corderos in vivo y se comprobó que sufrían un proceso neurológico que cursaba con ataxia e incapacidad para mantenerse en la estación.

En la necropsia se observaron alteraciones en el sistema nervioso central. En todos los casos se percibió una marcada ausencia de circunvoluciones cerebrales, con diferencias en cuanto a intensidad entre animales, pero siempre grave, tanto en la cara dorsal como en la ventral del cerebro así como una marcada hipoplasia cerebelar.

Se realizaron análisis anatomopatológicos correspondientes y se descartó la posible implicación de agentes infecciosos (como pestivirus y virus de lengua azul). A continuación se realizó un análisis del pedigrí de los animales afectados mediante marcadores microsatélite siguiendo el protocolo descrito en Glowatzki-Mullis, 2007 (Glowatzki-Mullis, M.L. et al, 2007. Cost-effective parentage verification with 17-plex PCR for goats and 19-plex PCR for sheep. Animal Genetics, 38(1), pp. 86-88). Tanto los análisis anatomopatológicos como los genéticos concluyeron que los animales sufrían lisencefalia con hipoplasia cerebelar.

Extracción del ADN a partir de la muestra biológica obtenida del animal en estudio.

En el presente ejemplo se utilizaron 4 de los corderos enfermos, las madres de los mismos (clasificadas como portadoras) y 41 machos de los que no se conocía el estatus genético. Las muestras utilizadas para la extracción de DNA fueron de sangre en todos los casos. La extracción de DNA se realizó por el método de “Salting out” descrito en Miller, 1988.

Diseño de los cebadores

Los cebadores se diseñaron específicamente con el programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3), a partir de la secuencia del genoma ovino v3.1, y tras la identificación en la misma de los exones identificados tras el análisis de la secuencia de mARN del gen RELN. Así se partió de una región de 498 pb que incluía el Exon36, y 187 bp de la región intrónica anterior y 133 pb de la región intrónica posterior al mismo.

Se seleccionó una pareja de cebadores, cebador sentido, identificado con la secuencia SEQ ID NO: 2 y cebador antisentido, identificado con la secuencia SEQ ID NO: 3.

El tamaño del fragmento amplificado con esta pareja de cebadores fue 498 bp para la secuencia salvaje o no mutada, dicho fragmento incluye la secuencia completa del exón 36 (178 pb), 187 bp de la región intrónica anterior y 133 pb de la región intrónica posterior al mismo. En el caso de la presencia de la deleción de 31 pb el tamaño del amplicón fue 467 pb.

Amplificación del ADN

Se realizó la amplificación del fragmento de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este estudio, las reacciones de PCR estuvieron constituidas por un 80% de lo que denominamos “mezcla”, mientras que otro 20% fue de ADN total (10-30 ng/ml). La “mezcla” estuvo constituida por un 1X de tampón 10X (Gold Applied Biosystem, AB), MgCl2 (de 1,5 μM a 2,5 μM), dNTPs (480 μM), los cebadores diseñados específicamente para la amplificación del fragmento de ADN de interés (0,5 μM), dH2O y la encima polimerasa (AmpliTaq GoldTM de AB) (5 U/ml).

La amplificación se llevó a cabo en un termociclador automático (GeneAmp® PCR System 9700, AB). Los ciclos de temperatura siempre se vieron precedidos de un paso de desnaturalización a 95ºC durante 5 minutos. Posteriormente se realizaron 35 ciclos, estando cada uno compuesto de 3 pasos:

-: Desnaturalización del ADN: 94ºC, 30s.

-: Hibridación de los cebadores con el ADN: 58ºC, 40 s.

-: Síntesis de ADN: 72ºC, 40 s.

El último ciclo finalizó en todos los casos con una extensión final de 10 minutos a 72ºC.

Separación y visualización del fragmento o fragmentos amplificados por electroforesis en gel de agarosa

Se utilizó un gel de agarosa al 2% (100 ml de TBE 1X y 2 g de agarosa) al que previamente se añadió 4 μl de RedSafe (iNtRON Biotechnology). El tampón TBE 1X se obtuvo a partir de una preparación previa de TBE 10X (TrisBase 54 g; Ácido Bórico: 27,5 g; EDTA 0.5 M 40 mL y agua mQ hasta 1L).

El gel se introdujo en una cubeta horizontal de electroforesis con 700 ml de tampón TBE 1X.

En cada pocillo del gel se cargaron 8 μl del producto de PCR y 4 μl de tampón de carga Ficoll. Asimismo, se utilizó uno de los pocillos de cada fila para cargar un marcador tamaño que nos permitió determinar con exactitud el tamaño de las muestras. El marcador utilizado fue el XIV de 100 pb (Roche Diagnostic S.L.) que contiene 15 fragmentos de ADN de doble cadena comprendidos entre 100 a 1500 pb y una banda adicional de 2642 pb.

En el inicio de la electroforesis se aplicó un voltaje de 100 V que se mantuvo constante durante 45 minutos.

Posteriormente se visualizaron las bandas amplificadas en un transiluminador de luz ultravioleta. Los resultados obtenidos permitieron agrupar las muestras en los siguientes grupos:

-: muestras con una sola banda de 498 pb, correspondientes al genotipo homocigoto no mutado, es decir, a animales sanos y no portadores de la enfermedad.

-: muestras con una sola banda de 467 pb, correspondientes a animales homocigotos para la deleción, es decir, a animales afectados por la enfermedad y

-: muestras con una doble banda de 467 y 498 pb, correspondientes al genotipo heterocigoto para la deleción, es decir, a animales sanos pero portadores de la enfermedad.

En la Figura 1 se muestran un resultado representativo de este ejemplo, en el que se muestran los resultados obtenidos para muestras obtenidas de 5 animales diferentes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino que comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen RELN ovino, identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1, en una muestra biológica obtenida de ganado ovino.

5 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende:

(a)

amplificar por PCR en dicha muestra biológica un fragmento de ADN situado entre los cebadores con una identidad de al menos 80 % respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3,

(b)

determinar el número y tamaño de los fragmentos de ADN resultantes de dicha amplificación y

(c)

realizar un diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar a partir de la información obtenida en el paso 10 (b).
3.

Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que antes de la etapa (a) se realiza una extracción de ADN de dicha muestra biológica.
4.

Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha identidad de secuencia es de al menos 90%.

15 5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que dichos cebadores están identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha detección se realiza con un biosensor o microarray.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dicha muestra biológica 20 está seleccionada del grupo compuesto por pelo, tejido, célula o fluido biológico.
8.

Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que dicho fluido biológico está seleccionado del grupo compuesto por saliva, leche, suero, plasma sanguíneo, sangre, semen y fluido nasal.
9.

Kit para realizar el procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

SEQUENCE LISTING

<110> UNIVERSIDAD DE LEÓN

<120> PROCEDIMIENTO Y KIT DE DIAGNÓSTICO DE LISENCEFALIA CON HIPOPLASIA CEREBELAR EN GANADO OVINO

<130> P3745/2013

<160> 5

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<222> 1..31

<223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Ovine RELN gene deletion fragment"/organism="Artificial Sequence"

<400> 1 gatgtaagtt cccattgaaa tcatctttaa g 31

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<222> 1..20

<223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Sense PCR primer"/organism="Artificial Sequence"

<400> 2 ttgccttctc cggtttaatg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<222> 1..20

<223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Antisense PCR primer"/organism="Artificial Sequence"

<400> 3

agggatttgt gatgctggac 20

<210> 4

<211> 498

<212> DNA

<213> Ovis aries

<220>

<221> source

<222> 1..498

<223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Wild type ovine RELN gene fragment"/organism="Ovis aries"

<220>

<221> exon

<222> 188..365

<223> /note="Exon 36"

<220>

<221> variation

<222> 277..307

<223> /note="Deletion fragment"

<400> 4 ttgccttctc cggtttaatg cccaagtgat cataaaaaat gatctcagtc gatataagag 60

gaaacatgat atgtgttaga agacagtaac agtatataca ataatatatc atctgaacag 120

aaatgtatct atgtggagca ttgagaaaag acaggaattt cagtgctagt gaacagtctt 180

atctgacccc tttaaaaatg agcgatgttc cagacttgat ggtttcacca ttcagattcc 240

ccctctctgc accatacact tcaggccaaa ggtcgggatg taagttccca ttgaaatcat 300

ctttaagaat cgagggtaga ggaataacag gaacacagta ggctccacca aagccccggt 360

cacacctaag gaaaaaaatg agtggagaaa aggcattata tgtcatgaga tcaagatact 420

atctttcttt ttgcattaca aaaaaagaaa ctgccaattt cattaactta cacacagcgt 480

ccagcatcac aaatccct 498

<210> 5

<211> 467

<212> DNA

<213> Ovis aries

<220>

<221> source

<222> 1..467

<223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Ovine RELN gene fragment resulting from deletion"/organism="Ovis aries"

<220>

<221> exon

<222> 188..334

<223> /note="Exon 36"

<400> 5 ttgccttctc cggtttaatg cccaagtgat cataaaaaat gatctcagtc gatataagag 60 gaaacatgat atgtgttaga agacagtaac agtatataca ataatatatc atctgaacag 120 aaatgtatct atgtggagca ttgagaaaag acaggaattt cagtgctagt gaacagtctt 180 atctgacccc tttaaaaatg agcgatgttc cagacttgat ggtttcacca ttcagattcc 240 ccctctctgc accatacact tcaggccaaa ggtcggaatc gagggtagag gaataacagg 300 aacacagtag gctccaccaa agccccggtc acacctaagg aaaaaaatga gtggagaaaa 360 ggcattatat gtcatgagat caagatacta tctttctttt tgcattacaa aaaaagaaac 420 tgccaatttc attaacttac acacagcgtc cagcatcaca aatccct 467

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 201330806

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 31.05.2013

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : G01N33/48 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A

WO 2012003353 A2 (UNIV YALE et al.) 05.01.2012, reivindicaciones. 1-9

A

WO 2008030065 A1 (MACROGEN INC et al.) 13.03.2008, reivindicaciones. 1-9

A

JP 2004081001 A (MITSUBISHI CHEM CORP et al.) 18.03.2004, recuperado de WPI, resumen. 1-9

A

WO 03091426 A1 (SPECTRAL GENOMICS INC et al.) 06.11.2003, reivindicaciones. 1-9

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 08.08.2013

Examinador I. Rueda Molíns Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201330806

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) G01N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, STN, TXT

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201330806

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 08.08.2013

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones 1-9 Reivindicaciones SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones 1-9 Reivindicaciones SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201330806

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

WO 2012003353 A2 (UNIV YALE et al.) 05.01.2012

D02

WO 2008030065 A1 (MACROGEN INC et al.) 13.03.2008

D03

JP 2004081001 A (MITSUBISHI CHEM CORP et al.) 18.03.2004

D04

WO 03091426 A1 (SPECTRAL GENOMICS INC et al.) 06.11.2003
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (artículos 6 y 8 Ley 11/1986)

En las reivindicaciones 1-8, de la solicitud de patente, se reivindica un procedimiento de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino, que comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen RELN ovino, identificado por la secuencia SEQ ID NO:1, en una muestra biológica obtenida de ganado. En la reivindicación 9, se reivindica un kit para la realización de dicho procedimiento.

Se ha efectuado una búsqueda de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1, reivindicada en la solicitud de patente, esa secuencia no se ha encontrado en el estado de la técnica. Los documentos D01-D04 divulgan diferentes métodos de detección de lisencefalia. En ninguno de los citados documentos se refleja un procedimiento de diagnóstico de lisencefalia como el que se reivindica en la solicitud de patente. Por tanto, las reivindicaciones 1-9 presentan novedad y actividad inventiva, según lo establecido en los artículos 6 y 8 de la Ley 11/1986.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/4