[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

ES2403560T3 - Dispositivo microfluídico y procedimientos de utilización del mismo - Google Patents

Dispositivo microfluídico y procedimientos de utilización del mismo Download PDF

Info

Publication number
ES2403560T3
ES2403560T3 ES02786834T ES02786834T ES2403560T3 ES 2403560 T3 ES2403560 T3 ES 2403560T3 ES 02786834 T ES02786834 T ES 02786834T ES 02786834 T ES02786834 T ES 02786834T ES 2403560 T3 ES2403560 T3 ES 2403560T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
reaction
reagent
channels
flow
microfluidic device
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES02786834T
Other languages
English (en)
Inventor
Marc A. Unger
Ian David Manger
Michael Lucero
Yong Yi
Emily Miyashita-Lin
Anja Wienecke
Geoffrey Facer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Standard Biotools Corp
Original Assignee
Fluidigm Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26989636&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2403560(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Fluidigm Corp filed Critical Fluidigm Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2403560T3 publication Critical patent/ES2403560T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/36—Apparatus for enzymology or microbiology including condition or time responsive control, e.g. automatically controlled fermentors
    • C12M1/38—Temperature-responsive control
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B01L3/50851—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates specially adapted for heating or cooling samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F16—ENGINEERING ELEMENTS AND UNITS; GENERAL MEASURES FOR PRODUCING AND MAINTAINING EFFECTIVE FUNCTIONING OF MACHINES OR INSTALLATIONS; THERMAL INSULATION IN GENERAL
    • F16K—VALVES; TAPS; COCKS; ACTUATING-FLOATS; DEVICES FOR VENTING OR AERATING
    • F16K11/00—Multiple-way valves, e.g. mixing valves; Pipe fittings incorporating such valves
    • F16K11/10—Multiple-way valves, e.g. mixing valves; Pipe fittings incorporating such valves with two or more closure members not moving as a unit
    • F16K11/20—Multiple-way valves, e.g. mixing valves; Pipe fittings incorporating such valves with two or more closure members not moving as a unit operated by separate actuating members
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30—Micromixers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00331—Details of the reactor vessels
    • B01J2219/00333—Closures attached to the reactor vessels
    • B01J2219/00337—Valves
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00353—Pumps
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00389—Feeding through valves
    • B01J2219/004—Pinch valves
    • B01J2219/00403—Pinch valves in multiple arrangements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00495—Means for heating or cooling the reaction vessels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/0059—Sequential processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B01L2300/123—Flexible; Elastomeric
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N2035/00346—Heating or cooling arrangements
    • G01N2035/00356—Holding samples at elevated temperature (incubation)
    • G01N2035/00366—Several different temperatures used
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T137/00—Fluid handling
    • Y10T137/206—Flow affected by fluid contact, energy field or coanda effect [e.g., pure fluid device or system]
    • Y10T137/2076—Utilizing diverse fluids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T137/00—Fluid handling
    • Y10T137/2496—Self-proportioning or correlating systems
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T137/00—Fluid handling
    • Y10T137/8593—Systems
    • Y10T137/86292—System with plural openings, one a gas vent or access opening
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T137/00—Fluid handling
    • Y10T137/8593—Systems
    • Y10T137/87249—Multiple inlet with multiple outlet
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/2575—Volumetric liquid transfer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Abstract

Un dispositivo microfluídico (200), que comprende componentes elastoméricos, y que tiene un canal de flujo (204, 702), en el que dicho canal de flujo tiene una pluralidad de canales de flujo ciego (206) que se abren hacia el interior y están en comunicación de fluidos con el canal de flujo, caracterizándose cada canal de flujo ciego por tener una parte de apertura, una parte de canal, y una parte final, y en el que una región del final de cada canal de flujo ciego define un sitio de reacción (208, 706), en el que cada canal de flujo ciego está asociado con una válvula (212) que cuando se cierra aísla el sitio de reacción del canal de flujo, y caracterizado por que las válvulas asociadas con cada una de la pluralidad de canales de flujo ciego en comunicación de fluidos con el canal de flujo están bajo el control de un canal de control común (210, 712) y se cierran o abren de forma coordinada.

Description

Dispositivo microfluídico y procedimientos de utilización del mismo
Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Nº 60/391.529, presentada el 24 de junio de 2002, y de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Nº 60/335.292, presentada el 30 de noviembre de 2001.
Antecedente
Recientemente, se han coordinado esfuerzos para desarrollar y fabricar sistemas microfluídicos para llevar a cabo diversos análisis y síntesis químicos y bioquímicos, tanto en aplicaciones preparativas como analíticas. El fin de preparar dichos dispositivos surge debido a los beneficios significativos que se pueden obtener de la miniaturización con respecto a los análisis y las síntesis llevados a cabo en macroescala. Tales beneficios incluyen una sustancial reducción en el tiempo, coste y en los requisitos de espacio de los dispositivos utilizados para llevar a cabo el análisis o la síntesis. Adicionalmente, los dispositivos microfluídicos tienen el potencial de adaptarse para el uso con sistemas automatizados, proporcionando de esta forma beneficios de reducciones adicionales de costes y la disminución de los errores de los operarios, gracias a una reducción en la implicación humana. Se han propuesto dispositivos microfluídicos para uso en una variedad de aplicaciones, incluyendo, por ejemplo, electroforesis capilar, cromatografía de gases y separaciones celulares.
Sin embargo, se ha frustrado a menudo la obtención de estos beneficios debido a diversas complicaciones asociadas con los dispositivos microfluídicos que se han fabricado. Por ejemplo, muchos de los dispositivos microfluídicos actuales se han fabricado a partir de sustratos basados en sílice; estos materiales son difíciles y complicados de maquinar y los dispositivos preparados a partir de dichos materiales son frágiles. Además, el transporte de fluido a través de muchos dispositivos microfluídicos existentes requiere la regulación de complicados campos eléctricos para transportar los fluidos de una manera controlada a través del dispositivo.
De esta manera, a la vista de los anteriores beneficios que se pueden conseguir con los dispositivos microfluídicos, pero con las actuales limitaciones de los dispositivos existentes, sigue existiendo necesidad de dispositivos microfluídicos diseñados para utilizar en la realización de una variedad de análisis químicos y bioquímicos. Debido a su importancia en la moderna bioquímica, existe una particular necesidad de dispositivos que se puedan utilizar para llevar a cabo reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, teniendo a la vez suficiente versatilidad para el uso también en otros tipos de análisis.
Los dispositivos con la capacidad para llevar a cabo amplificaciones de ácido nucleico podrían tener diversas utilidades. Por ejemplo, dichos dispositivos podrían usarse como herramienta analítica para determinar si un ácido nucleico diana concreto de interés está presente o ausente en una muestra. De esta manera, los dispositivos podrían utilizarse para analizar la presencia de patógenos concretos (por ejemplo, virus, bacterias u hongos), y con fines de identificación (por ejemplo, paternidad y aplicaciones forenses). Dichos dispositivos podrían utilizarse para detectar o caracterizar ácidos nucleicos específicos que se ha demostrado anteriormente que están correlacionados con enfermedades o trastornos genéticos concretos. Cuando se usan como herramientas analíticas, los dispositivos podrían también utilizarse para llevar a cabo los análisis de genotipación y los análisis de expresión génica (por ejemplo, los análisis de expresión génica diferenciales). De forma alternativa, los dispositivos pueden utilizarse de una manera preparativa para amplificar suficiente ácido nucleico para el análisis adicional de dicha secuenciación del producto amplificado, la tipificación celular, la huella genética del ADN y similares. Se pueden utilizar productos amplificados en diversas aplicaciones de ingeniería genética, tales como la inserción en un vector que se puede utilizar a continuación para transformar células para la producción de un producto de proteína deseado
Resumen
Se proporciona en la presente memoria una variedad de dispositivos y procedimientos para llevar a cabo análisis microfluídicos, incluyendo dispositivos que se pueden utilizar para llevar a cabo reacciones de ciclación térmica tales como reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. Los dispositivos difieren de los dispositivos microfluídicos convencionales en que incluyen componentes elastoméricos, en algunos ejemplos, mucho o todo el dispositivo está compuesto por material elastomérico.
Determinados dispositivos están diseñados para llevar a cabo reacciones de ciclación térmica (por ejemplo, la PCR) con dispositivos que incluyen una o más válvulas elastoméricas para regular el flujo de disolución a través del dispositivo. De esta manera, se proporcionan también procedimientos para llevar a cabo las reacciones de amplificación con dispositivos de este diseño.
Los dispositivos incluyen canales de flujo ciego que incluyen una región que funciona como un sitio de reacción. Algunos de esos dispositivos incluyen un canal de flujo formado en el interior de un material elastomérico, y una pluralidad de canales de flujo ciego en comunicación de fluidos con el canal de flujo, con una región de cada canal de flujo ciego definiendo un sitio de reacción. Los dispositivos pueden incluir también uno o más canales de control que se solapan e intersectan cada uno de los canales de flujo ciego, en los que una membrana elastomérica separa en cada intersección el uno o más canales de control de los canales de flujo ciego. La membrana elastomérica de dichos dispositivos está dispuesta para desviarse en o retirarse del canal de flujo ciego en respuesta a una fuerza de actuación. Los dispositivos pueden incluir adicionalmente de forma opcional una pluralidad de canales de protección formados en el interior del material elastomérico y que solapan el canal de flujo y/o uno o más de los sitios de reacción. Los canales de protección están diseñados para tener flujo de fluidos a su través para reducir la evaporación procedente de los canales de flujo y de los sitios de reacción del dispositivo. Adicionalmente, los dispositivos pueden incluir opcionalmente uno o más reactivos depositados en el interior de cada uno de los sitios de reacción.
En determinados dispositivos, el canal de flujo es uno de una pluralidad de canales de flujo, cada uno de los canales de flujo está en comunicación de fluidos con múltiples canales de flujo ciego con ramificaciones procedentes de los anteriores. En los dispositivos de este diseño, en algunos ejemplos, la pluralidad de canales de flujo están interconectados entre sí de tal manera que se puede introducir el fluido en cada uno de los sitios de reacción mediante una única entrada. En otros dispositivos, sin embargo, la pluralidad de canales de flujo están aislados entre sí de tal manera que el fluido introducido en un canal de flujo no puede fluir a otro canal de flujo, y cada canal de flujo comprende una entrada en uno o ambos extremos en los que se puede introducir el fluido.
Otro dispositivo de acuerdo con la presente invención incluye una matriz de sitios de reacción que tiene una densidad de al menos 50 sitios/cm2, formándose normalmente los sitios de reacción en el interior de un material elastomérico. Otros dispositivos pueden tener mayores densidades tales como, por ejemplo, de al menos 250.000 o 1000 sitios/cm2.
Otro dispositivo adicional de acuerdo con la presente invención incluye un sitio de reacción formado en el interior de un sustrato elastomérico, en el cual el reactivo para llevar a cabo una reacción queda inmovilizado de forma covalente. El reactivo puede ser uno o más reactivos para llevar a cabo esencialmente cualquier tipo de reacción. El reactivo en algunos dispositivos incluye reactivos para llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico. De esta manera, en algunos dispositivos, el reactivo comprende un cebador, una polimerasa y uno o más nucleótidos. En otros dispositivos, el reactivo es un molde de ácido nucleico.
Los anteriores dispositivos se pueden utilizar para llevar a cabo numerosos tipos diferentes de reacciones, que incluyen aquellas que implican una regulación de la temperatura, por ejemplo, análisis de termociclación de ácidos nucleicos). Los procedimientos llevados a cabo con determinados dispositivos de tipo canal ciego implican proporcionar un dispositivo microfluídico que comprende un canal de flujo formado en el interior de un material elastomérico; y una pluralidad de canales de flujo ciego en comunicación de fluidos con el canal de flujo, con una región terminal de cada canal de flujo ciego definiendo un sitio de reacción. Se introduce al menos un reactivo en cada uno de los sitios de reacción, y a continuación se detecta la reacción en uno o más de los sitios de reacción. El procedimiento puede incluir opcionalmente el calentamiento del al menos un reactivo en el interior del sitio de reacción. De esta manera, por ejemplo, un procedimiento puede implicar introducir los componentes para una amplificación del ácido nucleico y a continuación termociclar los componentes para formar el producto amplificado.
Otros procedimientos de acuerdo con la presente invención implican proporcionar un dispositivo microfluídico que comprende uno o más sitios de reacción, comprendiendo cada sitio de reacción un primer reactivo para llevar a cabo un análisis que se deposita de forma no covalente en un sustrato elastomérico. A continuación se introduce un segundo reactivo en el uno o más sitios de reacción, en el que el primer y el segundo reactivo se mezclan para formar una mezcla de reacción. Posteriormente se detecta una reacción entre el primer y el segundo reactivo en uno
o más de los sitios de reacción.
Otros procedimientos adicionales de acuerdo con la presente invención implican proporcionar un dispositivo microfluídico que comprende una matriz de sitios de reacción formada en el interior de un sustrato y que tiene una densidad de al menos 50 sitios/cm2. Se introduce al menos un reactivo en cada uno de sol sitios de reacción. A continuación se detecta una reacción en uno o más de los sitios de reacción.
Otros procedimientos más de acuerdo con la presente invención implican proporcionar un dispositivo microfluídico que comprende al menos un sitio de reacción que se forma en el interior de un sustrato elastomérico y una pluralidad de canales de protección formados también en el interior del sustrato elastomérico. Se introduce al menos un reactivo en cada uno de los sitios de reacción y a continuación se calienta en el interior de los sitios de reacción. Se hace fluir un fluido a través de los canales de protección antes o durante el calentamiento para reducir la evaporación procedente de al menos un sitio de reacción, se detecta posteriormente una reacción en el interior de al menos un sitio de reacción.
Se proporcionan también dispositivos adicionales para reducir la evaporación del fluido desde el dispositivo. En general, dichos dispositivos comprenden una cavidad que forma parte de una red microfluídica formada en un sustrato elastomérico; y una pluralidad de canales de protección que solapan la cavidad y están separados de la cavidad por una membrana elastomérica. El canal de protección en dichos dispositivos está dimensionado (i) para permitir el flujo de disolución a su través, y (ii) de tal manera que no existe una reducción sustancial en el flujo de la disolución hacia el interior, hacia el exterior, o a través de la cavidad debido a la deflexión de la(s) membrana(s) tras la aplicación de una fuerza de actuación en los canales de protección. Otros de los mencionados dispositivos incluyen (i) uno o más canales de flujo y/o uno o más sitios de reacción, y (ii) una pluralidad de canales de protección que solapan el sistema microfluídico y se separan del anterior mediante un elastómero, en el que la separación entre los canales de protección es entre 1 µm y 1 mm. En otros dispositivos la separación está entre 5 µm y 500 µm, en otros dispositivos entre 10 µm y 100 µm, y en otros dispositivos adicionales entre 40 µm y 75 µm.
Se proporcionan también composiciones para llevar a cabo los análisis de ácido nucleico en los sitios de reacción de determinados dispositivos microfluídicos. Dichas determinadas composiciones incluyen uno o más de los siguientes: un agente que bloquea los sitios de unión a proteínas o un material elastomérico y un detergente. El agente de bloqueo se selecciona normalmente entre el grupo que consiste en una proteína (por ejemplo, gelatina o albúmina, tal como albúmina de suero bovino (BSA)). El detergente puede ser, por ejemplo, SDS o Triton.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1A es una representación esquemática de un dispositivo a modo de ejemplo con un diseño de matriz de intersección vertical y canales de flujo horizontal.
Las FIGS. 1B-E muestran vistas ampliadas de una parte del dispositivo que se muestra en la FIG. 1A su funcionamiento.
La FIG. 1F es una representación esquemática de otro dispositivo de diseño de matriz a modo de ejemplo que utiliza canales de protección para reducir la evaporación de la muestra.
La FIG. 2 es una vista en planta de un dispositivo de canal ciego a modo de ejemplo.
La FIG. 3A es una vista en planta de otro dispositivo de canal ciego a modo de ejemplo.
La FIG. 3B es una representación esquemática de un dispositivo de canal ciego más complejo basado en la unidad de diseño general representada gráficamente en la FIG. 3A.
La FIG. 3C es una vista ampliada de una región del dispositivo que se muestra en la FIG. 3B, e ilustra la orientación de los canales de flujo de protección en este diseño concreto.
La FIG. 4 es una vista en planta de un dispositivo que utiliza el diseño híbrido.
La FIG. 5 es un diagrama que muestra los tiempos de ascenso y de descenso de la rampa para llevar a cabo una reacción de termociclación.
La FIG. 6 muestra la localización de los reactivos moteados en el interior de los sitios de reacción en un dispositivo de tipo canal ciego que ilustra una alineación adecuada en el interior de los sitios de reacción en las esquinas del dispositivo.
Las FIGS. 7A y 7B son, respectivamente, una vista en sección transversal y un diagrama esquemático de otro dispositivo microfluídico de tipo híbrido y representa el tipo de dispositivo utilizado para llevar a cabo los experimentos descritos en los Ejemplos 1-4.
La FIG. 8 es un gráfico de barras en el que las relaciones FAM/PR1/Control promedio se representan gráficamente para seis reacciones TaqMan diferentes para la β-actina Las reacciones se sometieron a termociclación en el dispositivo microfluídico (chip) que se muestra en la FIG. 7B (barras sólidas y las reacciones Macro TaqMan (barras discontinuas. Los controles son el primer y el cuarto conjuntos de barras que no tienen ADN. Las barras de error son las desviaciones estándar de las relaciones.
La FIG. 9 es un diagrama que representa gráficamente un procedimiento de detección de clavija a modo de ejemplo. Los reactivos se repican de una fuente (por ejemplo, una placa de microvaloración) y a continuación se imprimen poniendo la clavija cargada en contacto con el sustrato. La etapa de lavado consiste en una agitación en agua desionizada seguida por secado a vacío.
La FIG. 10 es un gráfico de barras que representa gráficamente la fuerza de la señal FAM del dispositivo microfluídico (chip) descrito en el Ejemplo 1 (véase la FIG. 7B) basado en los experimentos descritos en el Ejemplo
2. Los datos están en la forma de (señal FAM / señal PR1) escalados por la relación FAM/PR1 para las hileras de
referencia. Las barras de error son la desviación estándar junto a una hilera. Las designaciones “1.3X” y “1X” se
refieren a la concentración de los cebadores y sondas moteados, en relación a sus valores nominales
La FIG. 11 es un gráfico de barras que muestran relaciones VIC/PF1/Control promedio para 9-10 pocillo para las Macro TaqMan (barras discontinuas), y reacciones TaqMan en el dispositivo microfluídico (barras sólidas). Se sometieron a termociclación dos controles negativos (Control) y dos muestras con 100 pg/nl de ADN genómico con componentes de reacción tal como se ha descrito anteriormente con 4x la cantidad estándar de cebador/sonda. Las barras de error representan la desviación estándar de las relaciones promedio.
La FIG. 12 es un gráfico de barras que muestra las relaciones FAM/PR1/Control para cada uno de los pocillos de 101 nl que conectan desde un único canal de flujo de un dispositivo microfluídico (véase la FIG. 7B). La cantidad de ADN genómico era de 0,25 pg/nl, lo que da como resultado un promedio de una copia diana por pocillo.
La FIG. 13 es un gráfico de barras que representa gráficamente las relaciones VIC/PR1/Control promedio para las reacciones SNP de CYP2D6 utilizando el dispositivo microfluídico que se muestra en la FIG. 7B. El alelo 1 /A1-1) es el control positivo de la sonda VIC frente a la referencia del alelo CYP2D6*1 natural. El alelo 2 (Al-2) es el control positivo de la sonda FAM frente al alelo variante o mutante, CYP2D6*3. El control no tiene molde de ADN. Se utilizó ADN genómico tanto a 100 pg/nl como a 20 pg/nl. Las barras de error son las desviaciones estándar de las relaciones.
La FIG. 14 es un gráfico de barras que muestra las relaciones FAM/PR1/Control promedio para las reacciones SNP de CYP2D6 en el dispositivo microfluídico que se muestra en la FIG. 7B. Las muestras son las mismas que las descritas con respecto a la FIG. 13 y en el Ejemplo 3.
La FIG. 15 es un diagrama esquemático del dispositivo microfluídico utilizado para los experimentos en el Ejemplo 4.
La FIG. 16 es un gel de poliacrilamida que contiene el producto de la PCR de las reacciones de la PCR Macro y de la PCR en el dispositivo microfluídico que se muestra en la FIG. 7B. Los resultados en la parte de la izquierda muestran la migración aproximada de los pares de bases de ADN de diferentes longitudes. Las hileras que
contienen bandas intercaladas son marcadores de peso molecular. Las hileras marcadas con “Macro” son los productos de la PCR procedentes de las reacciones Macro a diferentes diluciones. Las bandas marcadas con “En chip” son productos de la PCR generados en el chip. Las hileras que contienen muchas bandas a lo largo del gel son
señales de fondo no específicas.
Descripción detallada
I. Definiciones
A no ser que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el significado que entiende comúnmente una persona experta en la materia a la cual esta invención pertenece. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos utilizados en la presente invención: Singleton y col., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2ª ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5ª ED., R. Rieger y col (eds), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991). Tal como se usa en la presente memoria, los siguientes términos tienen los significados adscritos a los mismos a no ser que se especifique otra cosa.
Un “canal de flujo” se refiere generalmente a un paso de flujo a través del cual puede fluir una disolución.
El término “válvula” a no ser que se indique otra cosa, se refiere a una configuración en la que un canal de flujo y un
canal de control se intersectan y se separan mediante una membrana elastomérica que se puede desviar al interior
o retraerse al exterior del canal de flujo en respuesta a una fuerza de actuación.
Un “canal ciego” o “un canal sin salida” se refieren a un canal de flujo que tiene una entrada pero no una salida separada. De acuerdo con esto, la entrada y salida del flujo de la disolución se produce en la misma localización. El procedimiento de rellenar uno o más canales ciegos se denomina sencillamente algunas veces como “relleno ciego”.
Un “sitio de reacción aislado” se refiere generalmente a un sitio de reacción que no está en comunicación de fluidos
con otros sitios de reacción presentes en el dispositivo. Cuando se usa con respecto a un canal ciego, el sitio de reacción aislado es la región en el extremo del canal ciego que se pueda mediante una válvula asociada con el canal ciego.
Una “vía” se refiere a un canal formado en un dispositivo elastomérico que proporciona acceso de fluidos entre un
puerto externo del dispositivo y uno o más canales de flujo. De esta manera, una vía puede servir como entrada o salida de la muestra.
El término “elastómero” y “elastomérico” tienen su significado general tal como se usa en la técnica. De esta manera,
por ejemplo, Allcock y col. (Contemporary Polymer Chemistry, 2ª Ed.) describen en general los elastómeros como polímeros existentes a una temperatura entre su temperatura de transición vítrea y la temperatura de licuefacción. Los materiales elastoméricos presentan propiedades elásticas porque las cadenas elastoméricas experimentan fácilmente movimiento de torsión para permitir el desenrollado de las cadenas de la estructura en respuesta a una fuerza, volviendo a enrollarse las cadenas de la estructura para asumir la forma anterior en ausencia de la fuerza. En general, los elastómeros se deforman cuando se aplica la fuerza, pero vuelven a su forma original cuando se retira la fuerza. La elasticidad presentada por los materiales elastoméricos se puede caracterizar por su módulo de Young. Los materiales elastoméricos utilizados en los dispositivos microfluídicos dados a conocer en la presente memoria tienen normalmente un módulo de Young de entre aproximadamente 1 Pa – 1 TPa, en otros ejemplos entre aproximadamente 10 Pa – 100 GPa, en otros ejemplos adicionales entre aproximadamente 20 Pa – 1 GPa, en otros ejemplos más entre aproximadamente 50 Pa – 10 Mpa, y en determinados ejemplos entre aproximadamente 100 Pa
– 1 Mpa. Los materiales elastoméricos que tienen un módulo de Young fuera de estos intervalos se pueden también dependiendo de las necesidades de una aplicación particular.
Algunos de los dispositivos microfluídicos descritos en la presente memoria se fabrican a partir de un polímero elastomérico tal como GE RTV 615 (formulación), un elastómero de silicona (familia) reticulado de vinil-silano (tipo). Sin embargo, los presentes sistemas microfluídicos no están limitados a esta formulación, tipo o incluso a esta familia de polímeros; más bien, es adecuado casi cualquier polímero elastomérico. Dada la tremenda diversidad de químicas de polímeros, precursores, procedimientos sintéticos, condiciones de reacción, y aditivos potenciales, existe un gran número de posibles sistemas de elastómeros que se pueden usar para preparar microválvulas y bombas elastoméricas monolíticas. La elección de los materiales depende normalmente de las propiedades de los materiales particulares (por ejemplo, resistencia al disolvente, rigidez, permeabilidad a gases, y/o estabilidad a la temperatura) requeridas para la aplicación que se está llevando a cabo. Se muestran detalles adicionales con respecto al tipo de materiales elastoméricos que se pueden usar en la fabricación de los componentes de los dispositivos microfluídicos dados a conocer en el presente documento en Unger y col. (2000) Science 288: 113-116, y en las Publicaciones PCT WO 02/43615, y WO 01/01025, que se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad para todos los fines.
Los términos “ácido nucleico”, “polinucleótido”, y “oligonucleótido” se usan en la presente memoria para incluir una
forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que incluyen, pero no se limitan a, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. No se pretende distinguir la longitud entre estos términos. Además, estos términos se refieren solo a la estructura primaria de la molécula. De esta manera, en determinadas realizaciones, estos términos pueden incluir ADN tri, bi y monocatenario, así como ARN tri, bi y monocatenario. Incluyen también modificaciones, tales como la metilación y/o la protección, así como las formas no modificadas del polinucleótido. Más
concretamente, los términos “ácido nucleico”, “polinucleótido”, y “oligonucleótido”, incluyen polidesoxirribonucleótidos
(que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N o C-glicósido de una base purina o pirimidina, y otros polímeros que contienen estructuras no nucleotídicas, por ejemplo, polímeros de poliamida (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNA)) y polimorfolino (comercialmente disponibles de Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregón, como Neugene), y otros polímeros de ácidos nucleicos específicos de secuencias sintéticas que proporcionan que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permite el emparejamiento de bases y el apilamiento de bases, tal como se encuentra en el ADN y el ARN.
Una “sonda” es un ácido nucleico capaz de unirse a un ácido nucleico diana de la secuencia complementaria a
través de uno o más tipos de enlaces químicos, usualmente a través del emparejamiento de bases complementarias, normalmente mediante la formación de un enlace de hidrógeno, formando de esta manera una estructura de duplete. La sonda se une o se hibrida a un “sitio de unión a sonda”. Se puede marcar la sonda con una marca detectable para permitir una fácil detección de la sonda, particularmente una vez que la sonda se ha hibridado con su diana complementaria. La marca unida a la sonda puede incluir cualquiera de una variedad de diferentes marcas conocidas en la técnica que se pueden detectar, por ejemplo, por medios químicos o físicos. Las marcas adecuadas que se pueden unir a las sondas incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, marcas de masa, partículas densas a los electrones, partículas magnéticas, marcas de espín, moléculas que emiten quimioluminiscencia, moléculas estereoquímicamente activas, enzimas, cofactores, y sustratos de enzimas. Las sondas pueden variar significativamente en tamaño. Algunas sondas son relativamente cortas. Generalmente, las sondas tienen al menos 7 a 15 nucleótidos de longitud. Otras sondas tienen al menos 20, 30 o 40 nucleótidos de longitud. Otras sondas adicionales son algo más largas, teniendo al menos 50, 60, 70, 80, 90 nucleótidos de longitud. Otras sondas adicionales son más largas aún, y tienen al menos 100, 150, 200 o más nucleótidos de longitud. Las sondas pueden ser de cualquier longitud específica que se encuentre comprendida también dentro de los anteriores intervalos.
Un “cebador” es un polinucleótido monocatenario capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN
dirigida al molde en las condiciones adecuadas (es decir, en presencia de cuatro diferentes nucleósidos trifosfato y un agente de polimerización, tal como ADN o ARN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón adecuado y a una temperatura adecuada. La longitud adecuada de un cebador depende del uso previsto del cebador pero normalmente tiene al menos 7 nucleótidos de longitud y, más normalmente varía de 10 a 30 nucleótidos de longitud. Otros cebadores pueden ser algo más largos, tal como de 30 a 50 nucleótidos de longitud. Las moléculas de cebador cortas requieren generalmente temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde, pero debe de ser lo
suficientemente complementario para hibridarse con el molde. El término “sitio del cebador” o “sitio de unión al cebador” se refiere al segmento del ADN diana al cual se hibrida un cebador. El término “pareja del cebador” significa un conjunto de cebadores que incluye un “cebador en la dirección 5’” 5’ que se hibrida con el complemento del extremo 5’ de la secuencia de ADN que se amplifica y un “cebador en la dirección en la dirección 3” 3’ que se hibrida con el extremo 3’ de la secuencia que se va a amplificar.
Un cebador que es “perfectamente complementario” tiene una secuencia totalmente complementaria para toda la
longitud completa del cebador y no tiene errores de emparejamiento. El cebador es normalmente perfectamente
complementario de una parte (subsecuencia) de la secuencia diana. Un “error de emparejamiento” se refiere a un
sitio en el cual el nucleótido del cebador y el nucleótido de ácido nucleico diana con el cual se alinea no son
complementarios. El término “sustancialmente complementario” cuando se usa en referencia a un cebador significa
que un cebador no es perfectamente complementario con su secuencia diana; en vez de esto, el cebador es solo suficientemente complementario para hibridarse selectivamente con su hebra respectiva en el sitio de unión a cebador deseado.
El término “complementario” significa que un ácido nucleico es idéntico a, o se hibrida selectivamente con, otra molécula de ácido nucleico. Existe selectividad de hibridación cuando se produce una hibridación más selectiva que la ausencia total de especificidad. Normalmente, se producirá la hibridación selectiva cuando exista al menos aproximadamente un 55% de identidad sobre un tramo de al menos aproximadamente 14-25 nucleótidos, preferiblemente al menos 65%, de forma más preferible al menos 75%, y lo más preferible al menos 90%. Preferiblemente, un ácido nucleico se hibrida específicamente al otro ácido nucleico. Véase M. Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12: 203 (1984).
El término “marca” se refiere a una molécula o a un aspecto de una molécula que se puede detectar mediante
técnicas físicas, químicas, electromagnéticas y otras técnicas analíticas relacionadas. Los ejemplos de marcas detectables que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, marcas de masa, partículas densas a electrones, partículas magnéticas, marcas de espín, moléculas que emiten quimioluminiscencia, moléculas electroquímicamente activas, enzimas, cofactores, enzimas unidas a sondas de
ácidos nucleicos y sustratos de enzimas. El término “marcado de forma detectable” significa que un agente se ha
conjugado con una marca o que un agente tiene alguna característica inherente (por ejemplo, tamaño, forma o color) que le permite ser detectado sin tener que conjugarse con una marca separada.
Un “marcador polimórfico” o “sitio polimórfico” es el locus en el cual se produce la divergencia. Los marcadores preferidos tienen al menos dos alelos, produciéndose cada uno a una frecuencia de más de un 1%, y de forma más preferible más de un 10% o un 20% de una población seleccionada. Un locus polimórfico puede ser tan pequeño como un par de bases. Los marcadores polimórficos incluyen polimorfismos de longitud del fragmento de restricción, número variable de repeticiones en tándem (VNTR), regiones hipervariables, minisatélites, repeticiones de dinucleótidos, repeticiones de trinucleótidos, repeticiones de tetranucleótidos, repeticiones de secuencias simples, y elementos de inserción tales como Alu. La primera forma alélica identificada se designa de forma arbitraria como la forma de referencia, y otras formas alélicas se designan como alelos alternativos o alelos variantes. La forma alélica que se produce más frecuentemente en una población seleccionada se denomina algunas veces como la forma natural. Los organismos diploides pueden ser homocigóticos o heterocigóticos para las formas alélicas. Un polimorfismo dialélico tiene dos formas. Un polimorfismo trialélico tiene tres formas.
Un “polimorfismo de nucleótido único” (SNP) se produce en un sitio polimórfico ocupado por un único nucleótido, que
es el sitio de variación entre secuencias alélicas. El sitio está normalmente precedido por y seguido de secuencias muy conservadas del alelo (por ejemplo, secuencias que varían en menos de 1/100 o 1/1000 miembros de las poblaciones). Un polimorfismo de nucleótido único surge normalmente debido a la sustitución de un nucleótido por otro en el sitio polimórfico. Una transición es la sustitución de una purina por otra purina o de una pirimidina por otra pirimidina. Una transversión es la sustitución de una purina por una pirimidina o viceversa. Los polimorfismos de nucleótido único pueden surgir también de un a deleción de un nucleótido o de una inserción de un nucleótido con respecto a un alelo de referencia.
Un “reactivo” se refiere de forma amplia a cualquier agente usado en una reacción. Un reactivo puede incluir un
único agente que se puede vigilar por sí mismo (por ejemplo, una sustancia que se vigila a medida que se calienta) o una mezcla de dos o más agentes. Un reactivo puede estar vivo (por ejemplo, una célula) o no vivo. Los reactivos a modo de ejemplo para una reacción de amplificación del ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, tampones, iones metálicos, polimerasa, cebadores, molde de ácido nucleico, nucleótidos, marcas, colorantes, nucleasas y similares. Los reactivos para las reacciones enzimáticas incluyen, por ejemplo, sustratos, cofactores, enzimas de acoplamiento, tampones, iones metálicos, inhibidores y activadores. Los reactivos para las reacciones basadas en células incluyen, pero no se limitan, células, colorantes específicos de células y ligandos (por ejemplo, agonistas y antagonistas) que se unen a receptores celulares.
Un “ligando” es cualquier molécula para la cual existe otra molécula (es decir, un “antiligando” que se une de forma
específica o no específica al ligando, debido al reconocimiento de alguna parte del ligando por el antiligando.
II. Panorámica general
Se proporcionan en la presente memoria diferentes dispositivos microfluídicos (denominados también algunas veces como chips) que tienen arquitecturas de canal de flujo únicas, así como procedimientos para usar dichos dispositivos para llevar a cabo una variedad de análisis de alto rendimiento. Los dispositivos están diseñados para usar en análisis que requieran un control de la temperatura, especialmente análisis que implican termociclación (por ejemplo, reacciones de amplificación de ácido nucleico). Los dispositivos microfluídicos incorporan determinadas características de diseño que, que proporcionan a los dispositivos una huella genética significativamente más pequeña que muchos dispositivos microfluídicos convencionales, permiten a los dispositivos integrarse fácilmente con otra instrumentación y proporcionan un análisis automatizado.
El dispositivo microfluídico de la presente invención utiliza un diseño denominado de forma típica en la presente
memoria como “canal ciego” o “relleno ciego” que se caracteriza en parte por tener una pluralidad de canales ciegos
que, tal como se ha indicado en la sección de definición, son canales de flujo que tienen un extremo sin salida o aislado de tal manera que la disolución puede solo entrar y salir del canal ciego por un extremo (es decir, no existe una entrada y salida separadas para el canal ciego). Estos dispositivos requieren solo una única válvula para cada canal ciego para aislar una región del canal ciego para formar un sitio de reacción aislado. Durante la fabricación de este tipo de dispositivos, se depositan uno o más reactivos para llevar a cabo un análisis en los sitios de reacción, dando como resultado de este modo una reducción significativa en el número de entradas y salidas. Adicionalmente, los canales ciegos están conectados a una red de canales interconectados de tal manera que todos los sitios de reacción se pueden rellenar a partir de un número, único o limitado, de entradas de muestras. Debido a la reducción en la complejidad en las entradas y las salidas y al uso de una única válvula individual que aísla cada sitio de reacción, aumenta el espacio disponible para los sitios de reacción. De este modo las características de estos dispositivos implican que en cada dispositivo se puede incluir un gran número de sitios de reacción (por ejemplo, de decenas a miles) y pueden conseguir elevadas densidades de sitios de reacción (por ejemplo, sobre 1.000 – 4.000 sitios de reacción/cm2). Individual y colectivamente, estas características se traducen también directamente en una reducción significativa en el tamaño de estos dispositivos en comparación con los dispositivos microfluídicos tradicionales.
Otros dispositivos microfluídicos que se dan a conocer en la presente memoria utilizan un diseño de matriz. En general, los dispositivos microfluídicos de este tipo utilizan una pluralidad de canales de flujo horizontal y vertical que intersectan para definir una matriz de sitios de reacción en los puntos de intersección. De esta manera, los dispositivos de este diseño tienen también una matriz o sitios de reacción, sin embargo existe un gran número de entradas de muestras y las salidas correspondientes para acomodar el número más grande de muestras con este diseño. Un sistema de válvulas denominado arquitectura de matriz de flujo interrumpible permite a la disolución fluir selectivamente con exactitud a través de los canales horizontales o de flujo, permitiendo de esta manera el aislamiento interrumpible de diversos canales de flujo en la matriz. De este modo, aunque los dispositivos de canal ciego están diseñados para llevar a cabo un gran número de análisis en diferentes condiciones con un limitado número de muestras, los dispositivos de matriz se construyen para analizar un gran número de muestras bajo un número limitado de condiciones. Otros dispositivos adicionales son híbridos de estos dos tipos de diseño generales.
Los dispositivos microfluídicos que se describen se caracterizan además en parte por incluir diversos componentes tales como canales de flujo, canales de control, válvulas y/o bombas y materiales elastoméricos. En algunos ejemplos, el dispositivo completo se prepara esencialmente de material elastomérico. Por consiguiente, dichos dispositivos difieren significativamente en la forma y en la función de la mayoría de dispositivos microfluídicos convencionales que están formados de material basado en silicona.
El diseño de los dispositivos les permite ser utilizados en combinación con numerosos sistemas de calentamiento diferentes. De esta manera, los dispositivos son útiles para llevar a cabo diversos análisis que requieren el control de la temperatura. Adicionalmente, aquellos dispositivos microfluídicos para uso en aplicaciones de calentamiento pueden incorporar una característica de diseño adicional para minimizar la evaporación de la muestra desde los sitios de reacción. Los dispositivos de este tipo incluyen en general numerosos canales de protección formados en el interior del dispositivo elastomérico a través de los cuales se puede hacer fluir el agua para aumentar la presión de vapor del agua en el interior del material elastomérico a partir del cual se forma el dispositivo, reduciendo de este modo la evaporación de la muestra procedente de los sitios de reacción.
El formato de matriz de determinados dispositivos significa que los dispositivos pueden alcanzar un elevado rendimiento. En conjunto, las capacidades de rendimiento elevado y control de la temperatura convierten a los dispositivos en útiles para llevar a cabo grandes cantidades de amplificaciones de ácidos nucleicos (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa – PCR). Dichas reacciones se discutirán ampliamente en la presente memoria como ilustrativas de la utilidad de los dispositivos, especialmente para su uso en cualquier reacción que requiera un control de la temperatura. Sin embargo, debe entenderse que los dispositivos no están limitados a estas aplicaciones particulares. Los dispositivos se pueden utilizar en una amplia variedad de otros tipos de análisis o reacciones. Los ejemplos incluyen los análisis de interacciones proteína-ligando e interacciones entre células y diversos compuestos. Se proporcionan ejemplos adicionales más abajo.
III. Estructura general de los dispositivos microfluídicos
A. Bombas y válvulas
Los dispositivos microfluídicos dados a conocer en la presente memoria están construidos normalmente, al menos en parte, a partir de materiales elastoméricos y están construidos mediante técnicas de litografía blanda y multicapa (MSL) y/o procedimientos de encapsulación con capa de sacrificio (véase, por ejemplo, Unger y col (2000) Science
288: 113-116, y Publicación PCT WO 01/01025, ambas se incorporan por referencia en la presente memoria en su totalidad para todos los fines). Utilizando dichos procedimientos, se pueden diseñar dispositivos microfluídicos en los que el flujo de disolución a través de los canales de flujo del dispositivo está controlado, al menos en parte por una membrana o segmento elastomérico. Esta membrana o segmento puede desviarse en o retraerse a partir del canal de flujo con el cual se asocia un canal de control aplicando una fuerza de actuación a los canales de control.
Controlando el grado al cual la membrana se desvía en o se retrae fuera del canal de flujo, se puede retardar el flujo de disolución o bloquearlo completamente a través del canal de flujo. Utilizando combinaciones de control y canales de flujo de este tipo, se puede preparar una variedad de tipos de válvulas y bombas diferentes para regular el flujo de disolución tal como se describe detalle de forma amplia en Unger y col. (2000) Science 288: 113-116, y Publicación PCT WO/02/43615 y WO 01/01025.
Los dispositivos proporcionados en la presente memoria incorporan dichas bombas y válvulas para aislar selectivamente un sitio de reacción en el que los se deja reaccionar a los agentes. Los sitios de reacción pueden estar localizados en cualquiera de las numerosas localizaciones diferentes en el interior del dispositivo. Por ejemplo, en algunos dispositivos de tipo matriz, el sitio de reacción está localizado en la intersección de un conjunto de canales de flujo. En dispositivos de canal ciego, el sitio de reacción está localizado en el extremo del canal ciego.
Si el dispositivo es para utilizarse en las reacciones con control de la temperatura (por ejemplo, reacciones de termociclación), entonces, como se describe en mayor detalle más abajo, el dispositivo elastomérico se fija normalmente a un soporte (por ejemplo, un porta de vidrio). A continuación se puede colocar la estructura resultante sobre una placa de control de la temperatura, por ejemplo, para controlar la temperatura en los diversos sitios de reacción. En el caso de reacciones de termociclación, el dispositivo se puede colocar en cualquiera de las numerosas placas de termociclación.
Puesto que los dispositivos se preparan a partir de materiales elastoméricos que son ópticamente trasparentes de forma relativa, las reacciones se pueden vigilar fácilmente utilizando una variedad de diferentes sistemas de detección en esencialmente cualquier localización en el dispositivo microfluídico. Más normalmente, sin embargo, la detección se produce en el propio sitio de reacción (por ejemplo, en el interior de una región que incluye una intersección de los canales de flujo o en el extremo ciego de un canal de flujo). El hecho de que el dispositivo esté fabricado a partir de materiales sustancialmente trasparentes significa que se pueden utilizar también determinados sistemas de detección con los dispositivos actuales que no se pueden utilizar con los dispositivos microfluídicos basados en silicio tradicionales. Se puede conseguir la detección utilizando detectores que se incorporan en el dispositivo o que se separan del dispositivo pero se alinean con la región del dispositivo que se va a detectar.
B. Canales de protección
Para reducir la evaporación de la muestra y los reactivos desde los dispositivos microfluídicos elastoméricos que se proporcionan en la presente memoria, en los dispositivos se pueden formar una pluralidad de canales de protección. Los canales de protección son similares a los canales de control que normalmente se forman en una capa de elastómero que se solapan a los canales de flujo y/o el sitio de reacción. Por tanto, a diferencia de los canales de control, los canales de protección están separados de los canales de flujo subyacentes y/o los sitios de reacción por una membrana o segmento de material elastomérico. A diferencia de los canales de control, sin embargo, los canales de protección son considerablemente más pequeños en el área de la sección transversal. En general, una membrana con un área más pequeña se desviará menos que una membrana con un área mayor con la misma presión aplicada. Los canales de protección están diseñados para presurizarse y permitir que fluya la disolución (normalmente agua) en el canal de protección. El vapor de agua que se origina procedente del canal de protección puede difundirse en los poros del elastómero adyacente a un canal de flujo o sitio de reacción, aumentando de esta manera la concentración de vapor de agua adyacente al canal de flujo o sitio de reacción y reduciendo la evaporación de la disolución del anterior.
En general, los canales de protección son lo suficientemente pequeños de tal manera que cuando se presurizan, la membrana que separa el canal de protección del canal de flujo subyacente o el sitio de reacción no restringe sustancialmente el flujo de disolución hacia el interior, hacia el exterior, o a través del canal de flujo o el sitio de
reacción que solapa con el canal de protección. Cuando se usa en este contexto, el término “sustancialmente restringido” u otro término similar significa que el flujo de disolución no está reducido hacia el interior, hacia el
exterior o a través del canal de flujo o el sitio de reacción en más de un 40%, normalmente menos de un 30%, normalmente menos de un 20%, y en algunos ejemplo menos de un 10% en comparación con el flujo de disolución hacia el interior, hacia el exterior o a través del canal de flujo o el sitio de reacción en las mismas condiciones, cuando el canal de protección no está presurizado para conseguir que la disolución fluya a su través. Normalmente esto significa que los canales de protección tienen un área de la sección transversal de entre 100 µm2 y 50.000 µm2,
o cualquier área de la sección transversal integral o no integral entre los anteriores. De esta manera, por ejemplo, en algunos casos, el área de la sección transversal es de menos de 50.000 µm2, en otros casos menor de 10.000 µm2, en otros casos adicionales menos de 1.000 µm2, y en otros casos más menos de 100 µm2. Los canales de protección pueden tener cualquiera de una variedad de formas que incluyen, pero no se limitan a, formas circulares, elípticas, cuadradas, rectangulares, hexagonales y octaédricas.
Los canales de protección están diseñados para reducir la evaporación de la muestra y de los reactivos desde el dispositivo durante el tiempo y en las condiciones que se tarda en llevar a cabo una reacción de termociclación de menos del 50%, en otro caso menos de 45%, 40%, 35%, 30%, 35%, 20%, 15%, 10%, 5% o 1%. De esta manera, por ejemplo, se puede llevar a cabo una reacción de la PCR típica que implica 40 ciclos en 120 minutos. El sistema de canal de protección está diseñado para reducir la evaporación durante aproximadamente este marco temporal para el anterior conjunto de límites. Para conseguir este nivel de reducción de la evaporación, los canales de protección anteriores están normalmente presentes a una densidad de al menos 10 líneas/cm2 a 1000 líneas/cm2, o cualquier nivel de densidad integral entre los anteriores. De forma más específica, los canales de protección tienen generalmente al menos 25 líneas/cm2, en otros casos, al menos 50 líneas/cm2, en otros casos más, al menos 100 líneas/cm2, y en otros ejemplos adicionales, al menos 500 líneas/cm2. Para conseguir este nivel de reducción de la evaporación, los canales de protección están normalmente presentes con una separación de entre 1 mm a 1 µm, tal como se ha medido desde el borde exterior de una línea al borde exterior más cercano de la línea adyacente, o cualquier nivel de densidad integral entre los anteriores.
De forma más específica, los canales de protección están generalmente separados de 500 µm a 5 µm, en otros caso, de 100 µm a 10 µm, en otros casos adicionales, de 75 µm a 40 µm. de esta manera, la separación es normalmente de al menos 1 µm, pero es menor de 1 mm, en otros caso, menor de 500 µm, en otros casos adicionales menor de 400 µm, en otros casos más menor de 300 µm, en otros casos, menor de 200 µm, y en otros casos adicionales menor de 100 µm, 50 µm o 25 µm.
Los canales de protección pueden estar conformados como una red independiente de canales o pueden ser canales más pequeños que se derivan de los canales de control. Los canales de control pueden extenderse a través del dispositivo o solo en una región o regiones particulares del dispositivo. Normalmente, los canales de protección se colocan adyacentes y sobre los canales de flujo y los sitios de reacción debido a que estos son las localizaciones principales en las que la evaporación es el riesgo principal. En la FIG. 1C se ilustran las localizaciones a modo de ejemplo de los canales de protección en determinados dispositivos de matriz, y en determinados dispositivos de canal ciego en las FIGS. 3B y 3C, y se describen con mayor detalle más abajo.
La disolución que fluye a través del canal de protección incluye cualquier sustancia que pueda reducir la evaporación del agua. La sustancia puede ser una que aumente la concentración de vapor en agua adyacente a una línea de flujo y/o un sitio de reacción, o una que si bien no aumenta la concentración de vapor de agua, bloquea, sin embargo la evaporación del agua desde de la línea de flujo y/o el sitio de reacción (agente bloqueante). De esta manera, una opción es utilizar esencialmente cualquier disolución acuosa en la que las disoluciones adecuadas al caso incluyen, pero no se limitan a, agua y disolución tamponada (por ejemplo, disolución tamponada TaqMan, y solución salina tamponada con fosfato. Los agentes bloqueantes adecuados incluyen, por ejemplo, aceite mineral.
Los canales de protección se forman normalmente en el elastómero utilizando las técnicas MSL y/o los procedimientos de encapsulación con capa de sacrificio citados anteriormente.
Las siguientes secciones describen con mayor detalle numerosas configuraciones específicas que se pueden utilizar para llevar a cabo una variedad de análisis, que incluyen análisis que requieren un control de la temperatura (por ejemplo, reacciones de amplificación de ácidos nucleicos). Debe entenderse, sin embargo, que estas configuraciones son a modo de ejemplo y que las modificaciones de estos sistemas serán evidentes a los expertos en la técnica.
IV. Diseño de la matriz
A. General
Los dispositivos que utilizan el diseño de la matriz tienen generalmente una pluralidad de canales de flujo vertical y horizontal que se intersectan para formar una matriz de uniones. Debido a que se pueden introducir una muestra y un reactivo (o conjunto de reactivos) diferentes en cada uno de los canales de flujo, se puede ensayar un gran número de muestras frente a un número relativamente grande de condiciones de reacción en un formato de elevado rendimiento. De esta manera, por ejemplo, si se introduce una muestra diferente en cada uno de M canales de flujo vertical diferentes y se introduce un reactivo (o conjunto de reactivos) diferentes en cada uno de N canales de flujo horizontal, a continuación se pueden llevar a cabo M x N reacciones diferentes a la misma vez. Normalmente, los dispositivos de matriz incluyen válvulas que permiten un aislamiento interrumpible de los canales de flujo vertical y horizontal. Dicho de forma diferente, las válvulas se sitúan para permitir un flujo selectivo exactamente a través de los canales de flujo vertical o exactamente a través de los canales de flujo horizontal. Debido a que los dispositivos de este tipo permiten flexibilidad con respecto a la selección del tipo y del número de muestras, así como al número y al tipo de reactivos, estos dispositivos son muy adecuados para llevar a cabo análisis en los que se desea cribar un gran número de muestras frente a un número relativamente grande de condiciones de reacción. Los dispositivos de matriz pueden incorporar opcionalmente canales de protección para ayudar a evitar la evaporación de la muestra y de los reactivos.
B. Diseños y usos a modo de ejemplo
La FIG. 1A proporciona una ilustración de un dispositivo de matriz a modo de ejemplo. Este dispositivo 100 comprende siete canales de flujo vertical 102 y siete canales de flujo horizontal 104 que intersectan para formar una matriz de 49 intersecciones o sitios de reacción 106 diferentes. Este dispositivo particular permite de esta manera hacer reaccionar siete muestras con siete reactivos o conjuntos de reactivos diferentes. Las válvulas de columna 110 que regulan el flujo de la disolución en la dirección vertical pueden controlarse mediante los canales de control 118 que pueden actuar todos en una única entrada 114.
De forma similar, las válvulas de fila 108 regulan el flujo de la disolución en la dirección horizontal; estas están controladas por canales de control 116 que se accionan por una única entrada de control 112. Tal como se muestra en la FIG. 1A, los canales de control 116 que regulan las válvulas de fila 108 varían en anchura dependiendo de la localización. Cuando un canal de control 116 cruza un canal de flujo vertical 102, el canal de control 116 es suficientemente angosto, de tal manera que cuando se acciona no se desvía en el canal de flujo vertical 102 para reducir sustancialmente el flujo de disolución a su través. Sin embargo, la anchura del canal de control 116 aumenta cuando este solapa uno de los canales de flujo horizontal 104; esto hace que la membrana del canal de control sea suficientemente larga para bloquear el flujo de la disolución a través del canal de flujo horizontal 104.
Durante el funcionamiento, se introducen los reactivos R1-R7 en sus respectivos canales de flujo horizontal 104 y se inyectan las muestras S1-S7 en sus respectivos canales de flujo vertical 102. Los reactivos de cada canal de flujo horizontal 104 se mezclan de esta manera con las muestras de cada uno de los canales de flujo vertical 102 en las intersecciones 106, que en este dispositivo concreto están en la forma de un pocillo o cámara. De esta manera, en el caso específico de una reacción de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, los reactivos necesarios para la reacción de amplificación se introducen en cada uno de los canales de flujo horizontal 104. Se introducen diferentes moldes de ácido nucleico en los canales de flujo vertical 102. En determinados análisis, el cebador introducido como parte de la mezcla de reacción que se introduce en cada uno de los canales de flujo horizontal 104 puede diferir entre los canales de flujo. Esto permite que cada molde de ácido nucleico reaccione con numerosos cebadores diferentes.
Las FIGS. 1B-E muestran vistas en planta ampliadas de los sitios de reacción adyacentes en el dispositivo representado gráficamente en la FIG. 1A para ilustrar más específicamente cómo funciona el dispositivo durante un análisis. A fines de claridad, las intersecciones 106 no se muestran en la forma de pocillos de reacción y se han omitido los canales de control 116, 118, mostrándose de forma exacta las válvulas de columna y fila 110, 108 (recuadros rectangulares). Tal como se muestra en la FIG. 1B, el análisis comienza por el cierre de las válvulas de columna 110 y la apertura de las válvulas de fila 108 para dejar que la disolución fluya a través del canal de flujo horizontal 104 bloqueando a la vez el flujo a través de los canales de flujo vertical 102. A continuación se introduce el reactivo R1 en el canal de flujo horizontal 104 y se hace fluir completamente a través de la longitud del canal de flujo horizontal 104 de tal manera que se rellenan todos los sitios de reacción 106. Se puede conseguir el flujo de la disolución a través del canal horizontal 104 mediante una bomba externa, pero más normalmente se consigue incorporando una bomba peristáltica en el propio dispositivo elastomérico, tal como se describe en detalle, por ejemplo, en Unger y col. (2000) Science 288: 113-116, y en la Publicación PCT WO 01/01025.
Una vez que se ha introducido R1, se cierran las válvulas de fila 108 y se abren las válvulas de columna 102 (véase la FIG. 1C). Esto permite que se introduzcan las muestras S1 y S2 en los canales de flujo vertical 102 para fluir a través de sus respectivos canales de flujo. A medida que las muestras fluyen a través de los canales de flujo vertical 102, expelen R1 desde los sitios de reacción 106, haciendo salir la muestra en los sitios de reacción 106. A continuación, tal como se muestra en la FIG. 1D, las válvulas de fila 108 se abren para dejar que S1 y S2 se difundan y se mezclen con R1. De esta manera, se obtiene una mezcla de la muestra y del reactivo (R1S1 y R1S2) en la región de cada intersección o sitio de reacción 106. Tras dejar un tiempo suficiente para que S1 y S2 se difundan con R1, todas las válvulas de fila y columna 108, 110 se cierran para aislar S1 y S2 en el interior de la región de sus respectivos sitios de reacción 106 y para evitar el entremezclado de S1 y S2 (véase la FIG. 1E). A continuación se dejan reaccionar las mezclas y se detectan las reacciones vigilando la intersección 106 o la región con forma de cruz que incluye la intersección 106. Para el análisis que requieren calentamiento (por ejemplo, termociclación durante las reacciones de amplificación), el dispositivo se coloca en un calentador y se calienta a la vez que las muestras permanecen aisladas.
Se muestra en la FIG. 1F una versión modificada del dispositivo que se muestra en la FIG. 1A. La estructura general comparte muchas similitudes con la representada gráficamente en la FIG. 1A, y elementos comunes en ambas figuras comparten los mismos números de referencia. El dispositivo 150 ilustrado en la FIG. 1F difiere en que las parejas de canales de flujo horizontal 104 se unen en una entrada común 124. Esto permite esencialmente duplicar los conjuntos de reactivos que se introducen en dos canales de flujo adyacentes con exactamente un único sitio de inyección en la entrada 124. El uso de una entrada común se extiende además con respecto a los canales de flujo vertical 102 con una única inyección en la entrada de la muestra 120. De esta manera, con este dispositivo particular, existen esencialmente diez reacciones replicadas para cada combinación particular de muestra y reactivo. Por supuesto, el número de reacciones replicadas puede variarse según se desee alterando el número de canales de flujo vertical y/u horizontal 102, 104 que se unen en una entrada común 120, 124.
El dispositivo que se muestra en la FIG. 1F incluye también una entrada de canal de control separada 128 que regula el canal de control 130 que se puede usar para gobernar el flujo de disolución hacia las salidas 132 y otra entrada de canal de control 132 que regula el canal de control 134 que regula el flujo de la disolución hacia las salidas 136. De forma adicional, el dispositivo 150 incorpora canales de protección 138. En este diseño concreto, los canales de protección 138 están formados como parte de los canales de control 116. Tal como se indica más arriba, los canales de protección 138 son más pequeños que las válvulas de fila 108; por consiguiente, las membranas de los canales de protección 138 no se desvían en los canales de flujo horizontal subyacentes 104 de tal manera que el flujo de la disolución está perturbado.
Finalmente, el diseño que se muestra en la FIG. 1F difiere en que la reacción no se produce en pocillos en la intersección de las líneas de flujo horizontal y vertical, sino en la propia intersección.
V. Diseños de canal ciego
A. General
Los dispositivos que utilizan un diseño de canal ciego tienen determinadas características. En primer lugar, los dispositivos incluyen uno o más canales de flujo a partir de los cuales se derivan uno o más canales ciegos. Tal como se ha indicado anteriormente, la región terminal de dichos canales puede servir como un sitio de reacción. Una válvula formada por un canal de flujo solapante puede hacerse accionar para aislar el sitio de reacción en el extremo del canal ciego, Las válvulas proporcionan un mecanismo para aislar de forma interrumpible los sitios de reacción.
En segundo lugar, la red de canales de flujo en comunicación con los canales ciegos está configurada de tal manera que todos o la mayor parte de los sitios de reacción pueden rellenarse con un único o un limitado número de entradas (por ejemplo, menos de 5 o menos de 10). La capacidad de rellenar un canal de flujo ciego se hace posible debido a que los dispositivos se preparan de material elastomérico. El material elastomérico es lo suficientemente poroso de tal manera que puede escapar aire en el interior de los canales de flujo y los canales ciegos a través de estos poros a medida que se introduce una disolución en los canales. La ausencia de porosidad de los materiales utilizados en otros dispositivos microfluídicos impide el uso del diseño de canal ciego debido a que el aire en un canal ciego no tiene vía de escape a medida que se inyecta la disolución.
Una tercera característica es que uno o más reactivos se depositan de forma no covalente sobre una capa base de elastómero durante la fabricación (véanse más abajo los detalles adicionales sobre el procedimiento de fabricación) en el interior de los sitios de reacción El(los) reactivo(s) está(n) unido(s) de forma no covalente debido a que los reactivos están diseñados para llegar a disolverse cuando la muestra se introduce en el sitio de reacción. Para maximizar el número de análisis, se deposita un reactivo o conjunto de reactivos diferentes en cada uno de los diferentes sitios de reacción.
Determinados dispositivos de canal ciego están diseñados de tal manera que los sitios de reacción se disponen en la forma de una matriz.
De esta manera, en aquellos dispositivos de canal ciego diseñados para llevar a cabo, por ejemplo, reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, uno o más de los reactivos requeridos para llevar a cabo la reacción de extensión se depositan en cada uno de los sitios de reacción durante la fabricación del dispositivo. Dichos reactivos incluyen, por ejemplo, todos o algunos de los siguientes: cebadores, polimerasa, nucleótidos, cofactores, iones metálicos, tampones, colorantes intercalantes y similares. Para maximizar el análisis de alto rendimiento, se depositan diferentes cebadores seleccionados para amplificar diferentes regiones del ADN en cada sitio de reacción. Por consiguiente, cuando se introduce un molde de ácido nucleico en los sitios de reacción por la entrada, se pueden llevar a cabo un gran número de reacciones de extensión en diferentes segmentos del molde. Se puede llevar a cabo la termociclación necesaria para una reacción de amplificación colocando el dispositivo en una placa de termociclación y ciclando el dispositivo entre las diversas temperaturas requeridas.
Los reactivos se pueden inmovilizar de una variedad de maneras. Por ejemplo, en algunos casos uno o más de los reactivos se depositan de forma no covalente en el sitio de reacción, mientras que en otros casos uno o más de los reactivos se unen covalentemente al sustrato en el sitio de reacción. Si se unen covalentemente, los reactivos se pueden unir al sustrato mediante un enlazador. Se puede utilizar una variedad de tipos de enlazadores tales como enlazadores fotoquímicos/fotolábiles, enlazadores termolábiles, y enlazadores que se pueden escindir enzimáticamente. Algunos enlazadores son bifuncionales (es decir, el enlazador contiene un grupo funcional en cada extremo que puede reaccionar con los grupos localizados en el elemento al cual el enlazador se va a unir); los grupos funcionales en cada extremo pueden ser iguales i diferentes. Los ejemplos de enlazadores adecuados que se pueden usar en algunos ensayos incluyen enlazadores de carbono de cadena lineal o ramificada, enlazadores heterocíclicos y enlazadores peptídicos. Están disponibles de Pierce Chemical Company en Rockford, Illinois, una variedad de tipos de enlazadores, y se describen en el documento EPA 188.256; las Patentes de los Estados Unidos Nos 4.671.958, 4.659.839; 4.414.148, 4.669.784, 4.680.338,
4.659.789 y 4.589.071, y en el Eggenweiler, H.M., Pharmaceutical Agent Discovery Today 1998, 3, 552. Los enlazadores NVOC (6 nitroveratriloxicarbonilo) y otros enlazadores relacionados con NVOC son ejemplos de enlazadores fotoquímicos adecuados. Los péptidos que tienen sitios de escisión de la proteasa se describen, por ejemplo, en el documento US 5.382.513.
B. Diseños y usos a modo de ejemplo
La FIG. 2 es una vista en planta simplificada de un dispositivo a modo de ejemplo que utiliza el diseño de canal ciego. El dispositivo 200 incluye un canal de flujo 204 y un conjunto de canales de flujo de derivatización 206 que se derivan del anterior que están formados en un sustrato elastomérico 202. Cada canal de flujo derivatizado 206 termina en un sitio de reacción 208, formando por tanto una matriz de sitios de reacción. El solapamiento de los canales de flujo de derivatización 206 es un canal de control 210 que está separado de los canales de flujo de derivatización 206 por membranas 212. El accionamiento del canal de control 210 da lugar a membranas 212 que se desvían en los canales de flujo de derivatización 206 (es decir, funcionan como una válvula), de esta manera permiten aislar cada sitio de reacción 208 de los otros sitios de reacción.
El funcionamiento de dicho dispositivo implica inyectar una muestra de ensayo en el canal de flujo 204 con una disolución que fluye posteriormente a cada uno de los canales de derivatización 206. Una vez que la muestra ha rellenado cada canal derivatizado 206, se acciona el canal de control 210 para producir la activación de las válvulas/membranas 212 que provocan la desviación en los canales de derivatización 206, cerrando herméticamente por tanto cada uno de los sitios de reacción 208. A medida que la muestra fluye en y permanece en los sitios de reacción 208 disuelve los reactivos anteriormente moteados en cada uno de los sitios de reacción 208. Una vez disueltos, los reactivos pueden reaccionar con la muestra. Las válvulas 212 evitan el entremezclado por difusión de los reactivos disueltos en cada sitio de reacción 208. A continuación se detecta la reacción entre la mezcla y los reactivos, normalmente en el interior del sitio de reacción 208. Las reacciones pueden opcionalmente calentarse tal como se describe en la sección de control de la temperatura más abajo.
La FIG. 3A ilustra un ejemplo de un diseño de canal de flujo ciego algo más complejo. En este diseño particular 300, cada uno de los conjuntos de canales de flujo horizontal 304 se conecta por sus extremos a dos canales de flujo vertical 302. Una pluralidad de canales de flujo de derivatización 306 se extiende desde cada uno de los canales de flujo horizontal 304. Los canales de flujo de derivatización 304 en este diseño particular se intercalan de tal manera que el canal derivatizado 306 unido a cualquier canal de flujo horizontal dado 304 se sitúa entre dos canales de derivatización 306 unidos a un canal de flujo horizontal inmediatamente adyacente 304, o se sitúan entre un canal de flujo derivatizado 306 unido a un canal de flujo inmediatamente adyacente 304 y uno de los canales de flujo vertical 302 de la misma forma que con el diseño representado gráficamente en la FIG. 3A, cada canal de flujo derivatizado 306 termina en un sitio de reacción 308. Consistente también con el diseño que se muestra en la FIG. 3A, un canal de control 310 solapa cada uno de los canales de derivatización y se separa del canal derivatizado subyacente por la membrana 312. El canal de control se acciona en el puerto 316. Los canales de flujo vertical y horizontal 302, 304 están interconectado de tal manera que la inyección de la muestra en la entrada 314 permite a la disolución fluir a través de la red de canales de flujo horizontal y vertical y en último extremo en cada uno de los sitios de reacción 308 mediante los canales de flujo de derivatización 306.
Por tanto, durante el funcionamiento, la muestra se inyecta en la entrada para introducir la disolución en cada uno de los sitios de reacción. Una vez que los sitios de reacción están rellenos, se accionan las válvulas/membranas para atrapar la disolución en el interior de los sitios de reacción presurizando los canales de control en el puerto. Los reactivos depositados anteriormente en los sitios de reacción se vuelven a suspender en el interior de los sitios de reacción, permitiendo por tanto la reacción entre los reactivos depositados y la muestra en el interior de cada sitio de reacción. Las reacciones en el interior de los sitios de reacción se vigilan mediante un detector. De nuevo, las reacciones pueden opcionalmente calentarse de forma controlable de acuerdo con los procedimientos que se muestran en la sección de control de la temperatura, más abajo.
En la FIG. 3B se muestra una versión aún más complicada del diseño general ilustrado en la FIG. 3A. el dispositivo que se muestra en la FIG. 3B es uno en el que se repite múltiples veces la organización unitaria de los canales de flujo horizontal y de derivatización 302 que se muestran en la FIG. 3A. El dispositivo que se muestra en la FIG. 3B ilustra adicionalmente la inclusión de los canales de protección 320 en aquellos dispositivos que se van a utilizar en aplicaciones que implican calentamiento (por ejemplo, termociclación). Una orientación a modo de ejemplo de los canales de protección 320 con respecto a los canales de flujo 304 y a los canales de derivatización 306 se muestra en la vista ampliada de la FIG. 3C. Los canales de protección 320 solapan los canales de derivatización 306 y los sitios de reacción 308. Tal como se ha descrito anteriormente, se hace fluir agua a través de los canales de protección 320 durante el calentamiento del dispositivo 300 para aumentar la concentración local de agua en el dispositivo, reduciendo por tanto la evaporación de agua procedente de la disolución en los canales de flujo 306 y los sitios de reacción 308.
Las características de los dispositivos de canal ciego que se describen al principio de esta sección minimizan la huella genética del dispositivo y permiten que se forme un gran número de sitios de reacción en el dispositivo y que se obtengan elevadas densidades. Por ejemplo, los dispositivos de este tipo que tienen 2500 sitios de reacción se pueden fabricar fácilmente para ajustar en portas de un microscopio estándar (25 mm x 75 mm). Las anteriores características permiten también obtener densidades muy altas de sitios de reacción con dispositivos que utilizan el diseño del canal ciego. Por ejemplo, se pueden obtener fácilmente densidades de al menos 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sitios de reacción/cm2 o cualquier valor integral de densidad entre los anteriores. Sin embargo, determinados dispositivos tienen incluso mayores densidades que varían, por ejemplo, entre 100 y 4000 sitios de reacción o cualquier valor integral de densidad entre los anteriores. Por ejemplo, algunos dispositivos tienen densidades de al menos 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 sitios/cm2. Son también obtenibles dispositivos con densidades muy altas de al menos, 2000, 3000, o 4000 sitios/cm2. Dichas densidades altas se traducen directamente en un gran número de sitios entre los anteriores. Dispositivos de mayor densidad pueden tener incluso más sitios de reacción, tales como al menos 1.000-100.000 sitios de reacción, o cualquier número integral de sitios entre los anteriores. De esta manera, determinados dispositivos tienen al menos 100; 500; 1.000; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; 9.000; 10.000; 20.000, 30.000; 40.000; 50.000; 0 100.000 sitios de reacción dependiendo del tamaño global del dispositivo.
El gran número de sitios y densidades de reacción que se pueden obtener es también una consecuencia de la capacidad para fabricar pocillos o cavidades muy pequeñas. Por ejemplo, las cavidades o pocillos tienen normalmente un volumen de menos de 50 nl; en otros ejemplos, menos de 40 nl, 30 nl, 20 nl o 10 nl; y en otros ejemplos más, menos de 5 nl o 1 nl. Como un ejemplo específico, determinados dispositivos que tienen 300 micrómetros de longitud, 300 micrómetros de anchura y 10 micrómetros de profundidad.
Los dispositivos de canal ciego proporcionados en la presente memoria pueden utilizar determinadas características y metodologías de diseño descritas en las Solicitudes PCT PCT/US01/44549 (publicada como documento WO 02/43615) y el documento PCT/US02/10875 (publicado como documento WO 02/082047), que incluye, por ejemplo, estrategias para rellenar canales sin salida, cebado de líquidos, cebado desgasificado presurizado, así como diversas estrategias para desplazar el gas durante el relleno de canales microfluídicos. Estas publicaciones PCT se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad para todos los fines
VI. Diseños híbridos
Otros dispositivos adicionales son los diseños híbridos de matriz y de relleno ciego. El diseño de dispositivos de este tipo es similar al dispositivo de canal ciego que se muestra en la FIG. 3A, excepto en que cada canal de flujo horizontal está conectado a su(s) propio(s) puerto(s) de entrada, y los canales de flujo horizontal no están interconectado mediante canales de flujo vertical. Por consiguiente, la muestra introducida en cualquier canal de flujo horizontal dado rellena solo el canal de flujo horizontal y los sitios de reacción unidos al anterior. Mientras tanto, en el dispositivo de canal de flujo ciego que se muestra en la FIG. 3A, la muestra puede fluir entre los canales de flujo horizontal 304 a través de los canales de flujo vertical 302.
En la FIG. 4 se muestra un ejemplo de dispositivos de este dispositivo general. El dispositivo 400 comprende una pluralidad de canales de flujo horizontal 404, cada uno de los cuales tiene una pluralidad de canales de flujo de derivatización 406 que se extienden desde este a su propia entrada de la muestra 414. Un canal de control 410 solapa cada uno de los canales de flujo de derivatización 406 y la membrana (válvula) 412 separan el canal de control 410 del canal de flujo de derivatización solapante 406. De la misma forma que con el diseño de canal de flujo ciego, la acción del canal de control en la entrada 416 produce la desviación de las membranas 412 en los canales de flujo de derivatización 406 y el aislamiento de los sitios de reacción 408. En una variación de este diseño, cada canal de flujo horizontal 404 puede incluir una entrada 414 en cada extremo, permitiendo de esta manera introducir la muestra entre ambos extremos.
En algunos casos, los reactivos se depositan en los sitios de reacción durante la fabricación del dispositivo. Esto permite ensayar un gran número de muestras bajo un número relativamente grande de condiciones de reacción en un corto periodo de tiempo sin necesitar adiciones de los reactivos que requieren tiempo tal como se requiere con los dispositivos de matriz. De forma alternativa, se pueden preparar mezclas de reacción antes de la inyección en el chip. Una vez que se inyectan las mezclas, se pueden analizar o tratarse adicionalmente (por ejemplo, calentarse).
Inyectando diferentes muestras en cada canal de flujo horizontal se puede analizar rápidamente un gran número de muestras. Suponiendo que los reactivos se han depositado anteriormente en los sitios de reacción, la presencia del mismo reactivo en cada sitio de reacción asociada con cualquier canal de flujo horizontal dado proporciona una manera fácil de llevar a cabo numerosas reacciones replicadas con cada muestra. Si a su vez, el reactivo en los sitios de reacción difiere de cualquier canal de flujo dado, a continuación cada muestra se expone esencialmente de forma simultánea a una variedad de diferentes condiciones de reacción.
De esta manera, los dispositivos proporcionados en la presente memoria se hacen a medida para una variedad de diferentes tipos de investigaciones. Si una investigación implica cribar un número relativamente grande de diferentes muestras bajo condiciones controladas por el usuario (por ejemplo, 100 muestras frente a 100 reactivos seleccionados por el usuario), entonces, los dispositivos de matriz proporcionan una disolución útil. Si, sin embargo, la investigación implica analizar uno o un número limitado de muestras bajo una amplia variedad de condiciones de reacción (por ejemplo, una muestra frente a 100 condiciones de reacción), entonces, el diseño de canal ciego es útil. Finalmente, si se desea examinar un número relativamente grande de muestras frente a condiciones de reacción definidas sin tener que inyectar reactivos (por ejemplo, 100 muestras frente a 100 reactivos previamente definidos), entonces los dispositivos híbridos son útiles.
VII. Control de la temperatura
A. Dispositivos y componentes
Están disponibles numerosas opciones diferentes de sofisticación variable para controlar la temperatura en el interior de las regiones del dispositivo microfluídico o del dispositivo completo. De esta manera, tal como se usa en la presente memoria, el término controlador de temperatura se entiende ampliamente que se refiere a un dispositivo o elemento que puede regular la temperatura del dispositivo microfluídico completo o en el interior de una parte del dispositivo microfluídico (por ejemplo, en el interior de una región concreta de temperatura o en una o más uniones en una matriz de un dispositivo microfluídico de tipo canal ciego).
Generalmente, los dispositivos se colocan sobre una placa de ciclación térmica para el ciclo térmico del dispositivo Están disponibles de fuentes comerciales una variedad de dichas placas, incluyendo por ejemplo el ThermoHybaid Px2 (Franklin, MA), MJ Research PTC-200 (South San Francisco, CA), Eppendorf Nº de pieza E5331 (Westbury, NY), Techne Nº de pieza 205330 (Princeton, NJ).
5 Para asegurar la fiabilidad de las etapas de ciclación térmica, en determinados dispositivos es útil incorporar sensores que detectan la temperatura en diversas regiones del dispositivo. Una estructura para detectar la temperatura es un termopar. Dicho termopar podría crearse como una película de alambres finos modelados en el material sustrato subyacente, o como alambres incorporados directamente en el propio material elastómero microfabricado.
La temperatura puede medirse también a través de un cambio en la resistencia eléctrica. Por ejemplo, se puede calibrar un cambio en la resistencia de un termistor fabricado sobre un sustrato conductor subyacente utilizando técnicas convencionales para un cambio de temperatura dado. De forma alternativa, un termistor podría insertarse directamente en el material elastómero microfabricado. Otra solución más para la detección de la temperatura mediante la resistencia se describe en Wu y col. en “MEMS Flow Sensors for Nano-fluidic Applications”, Sensors and Actuators A 89 152-158
15 (2001), que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad. Este artículo describe el uso de estructuras de pollisilicio dopadas para controlar y medir la temperatura al mismo tiempo. Para el polisilicio y otros materiales semiconductores, se puede controlar con precisión el coeficiente de resistencia de la temperatura por la identidad y la cantidad de dopante, optimizando por tanto el rendimiento del sensor para una aplicación dada.
Los materiales termocromáticos son otro tipo de estructura disponible para detectar la temperatura en regiones de un dispositivo de amplificación. De forma específica, determinados materiales cambian su color de manera drástica y reproducible a medida que pasan a través de diferentes temperaturas. Dicho material se podría añadir a la disolución a medida que pasa a través de diferentes temperaturas. Podrían formarse sobre el sustrato subyacente materiales termocromáticos o incorporarse en el interior del material elastómero. De forma alternativa, podrían añadirse materiales termocromáticos a la disolución de la muestra en forma de partículas.
25 Otra solución para detectar la temperatura es mediante el uso de una cámara de infrarrojos. Podría utilizarse una cámara de infrarrojos junto con un microscopio para determinar el perfil de temperatura de la estructura de amplificación completa. La permeabilidad del material elastómero a la radiación facilitaría este análisis.
Otra solución adicional para la detección de la temperatura es mediante el uso de sensores piroeléctricos. De forma específica, algunos materiales cristalinos, particularmente aquellos materiales que presentan también comportamiento piezoeléctrico, presentan el efecto piroeléctrico. Este efecto describe los fenómenos por los cuales la polarización de la red cristalina del material, y por tanto el voltaje a través del material, es muy dependiente de la temperatura. Dichos materiales podrían incorporarse sobre el sustrato o el elastómero y utilizarse para detectar la temperatura.
Otros fenómenos eléctricos, tales como la capacitancia y la inductancia, se pueden aprovechar para detectar la temperatura de acuerdo con las realizaciones de la presente invención.
35 B. Verificación de la fiabilidad de la termociclación
Tal como se describe con más detalle en la sección de fabricación más abajo, los dispositivos de canal ciego tienen una capa base sobre la cual se colocan los reactivos. La estructura que comprende las dos capas que contienen los canales de flujo y los canales de control se solapan sobre la capa base de tal manera que los canales de flujo se alinean con los reactivos depositados. El otro lado de la capa base se coloca a continuación sobre un sustrato (por ejemplo, vidrio. Normalmente, el sitio de reacción en el cual se produce la reacción tiene aproximadamente 100.1550 micrómetros por encima de la interfase de sustrato/vidrio. Utilizando ecuaciones conocidas para la difusividad térmica y valores adecuados para los elastómeros y el vidrio utilizado en el dispositivo, se puede calcular el tiempo requerido para la temperatura en el interior del sitio de reacción alcance la temperatura que el controlador busca mantener. Los valores calculados que se muestran en la Tabla 1 demuestran que se puede alcanzar rápidamente
45 esta temperatura, utilizando incluso capas de elastómero y vidrio considerablemente más delgadas que las utilizadas en los dispositivos en los que el sitio de reacción tiene aproximadamente 100-150 micrómetros (es decir, la distancia típica de los dispositivos descritos en la presente memoria).
Tabla 1. Longitudes calculadas de difusión del calor a través de las capas de PDMS y vidrio en los periodos de tiempo indicados
1 segundo
10 segundos 100 segundos
PDMS
400 µm 1, 26 mm 4,0 mm
Vidrio
640 µm 2,0 mm 6,4 mm
VIII. Detección
A. General
Se pueden utilizar numerosas estrategias de detección diferentes con los dispositivos microfluídicos que se proporcionan en la presente memoria. La selección del sistema adecuado se notifica en parte en el tipo de acontecimiento y/o agente que se está detectando. Se pueden diseñar los detectores para detectar numerosos tipos de señales diferentes que incluyen, pero no se limitan a, señales procedentes de radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, partículas densas a electrones, partículas magnéticas, marcas de espín, moléculas que emiten quimioluminiscencia, moléculas electroquímicamente activas, enzimas, cofactores, enzimas unidas a sondas de ácidos nucleicos y sustratos de enzimas.
Las metodologías de detección ilustrativas adecuadas para el uso con los presentes dispositivos microfluídicos incluyen, pero no se limitan a, dispersión de luz, detección de fluorescencia multicanal, absorción de longitud de onda UV y visible, luminiscencia, reflectividad diferencial, y sistema de imagen confocal por barrido láser. Los procedimientos de detección adicionales que se pueden usar en determinadas aplicaciones incluyen técnicas de ensayo de proximidad por centelleo, detección radioquímica, polarización por fluorescencia, espectroscopía de correlación por fluorescencia (FCS), transferencia de energía resuelta por tiempos (TRET), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y variaciones tales como transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET). Las opciones de detección adicionales incluyen la resistencia eléctrica, resistividad, impedancia, y medición del voltaje.
La detección se produce en una “sección de detección”, o “región de detección”. Estos términos y otros términos
relacionados se refieren a la parte de dispositivo microfluídico en la cual se produce la detección. Tal como se ha indicado anteriormente, con los dispositivos que utilizan el diseño del canal ciego, la sección de detección es de forma general el sitio de reacción que está aislado por la válvula asociada con cada sitio de reacción. La sección de detección para dispositivos basados en matriz está normalmente en el interior de las regiones de los canales de flujo que están adyacentes a una intersección, la propia intersección, o una región que abarca la intersección y la región que la circunda.
La sección de detección puede estar en comunicación con uno o más microscopios, diodos, dispositivos de estimulación de la luz (por ejemplo, láseres), tubos fotomultiplicadores, procesadores y combinaciones de los anteriores, que cooperan para detectar una señal asociada con un acontecimiento y/o agente concreto. Con frecuencia, la señal que se detecta es una señal óptica que se detecta en la sección de detección mediante un detector óptico. El detector óptico puede incluir uno o más fotodiodos (por ejemplo, fotodiodos de avalancha), una guía luminosa de fibra óptica, por ejemplo, para un tubo multiplicador, un microscopio, y/o una videocámara (por ejemplo, una cámara CCD).
Los detectores se pueden microfabricar en el interior del dispositivo microfluídico, o pueden ser un elemento separado. Si el detector existe como un elemento separado y el dispositivo microfluídico incluye una pluralidad de secciones de detección, se puede producir la detección en el interior de una única sección de detección en cualquier momento dado. De forma alternativa, se pueden usar sistemas de barrido. Por ejemplo, determinados sistemas automatizados barren la fuente de luz con respecto al dispositivo microfluídico; otros sistemas barren la luz emitida sobre un detector, o incluyen un detector multicanal. Como ejemplo ilustrativo, el dispositivo microfluídico se puede unir a una etapa traducible y barrerse con un objetivo de microscopio. Una señal adquirida de esta manera se enruta a continuación hacia un procesador para la interpretación y el procesamiento de la señal. Se pueden utilizar matrices de tubos fotomultiplicadores. De forma adicional, se pueden utilizar sistemas ópticos que tengan la capacidad de recoger señales de todas las diferentes secciones de detección simultáneamente determinado a la vez la señal procedente de cada sección.
Los detectores externos son útiles porque los dispositivos que se proporcionan son fabricado de forma completa o amplia a partir de materiales que son ópticamente trasparentes en la longitud de onda que se está vigilando. Esta característica permite a los dispositivos descritos en la presente memoria utilizar numerosos sistemas de detección óptica que no son posibles con los dispositivos microfluídicos basados en silicio convencionales.
Un detector puede incluir una fuente de luz para estimular un indicador que genera una señal detectable. El tipo de fuente de luz utilizada depende en parte de la naturaleza del indicador que se está activando. Las fuentes de luz adecuadas incluyen, pero no se limitan a, láseres, diodos láser y lámparas de alta intensidad. Si se utiliza un láser, se puede utilizar el láser para barrido a través de un conjunto de secciones de detección o una única sección de detección. Se pueden fabricar diodos láser en el propio dispositivo microfluídico. De forma alternativa, se pueden fabricar diodos láser en otro dispositivo que se coloca adyacente al dispositivo microfluídico que se está utilizando para llevar a cabo una reacción de ciclación térmica de tal manera que la luz láser procedente del diodo se dirige a la sección de detección.
La detección puede implicar también numerosas soluciones no ópticas. Por ejemplo, el detector puede incluir también un sensor de temperatura, un sensor de conductividad, un sensor potenciométrico (por ejemplo, un electrodo de pH) y/o un sensor amperométrico (por ejemplo, para vigilar las reacciones de oxidación y reducción).
Se pueden utilizar numerosos detectores externos comercialmente disponibles. Muchos de estos son detectores fluorescentes debido a la facilidad de preparación de los reactivos marcados de forma fluorescente. Los ejemplos específicos de detectores que están disponibles incluyen, pero no se limitan a, Applied Precision ArrayWoRx (Applied Precision, Issaquah, WA)).
B. Detección de ácidos nucleicos amplificados
1. Colorantes de intercalación
Se pueden utilizar determinados colorantes de intercalación que solo emiten fluorescencia tras la unión a un ADN bicatenario para detectar el ADN bicatenario amplificado. Los ejemplos de colorantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, SYBRTM y Pico Green (de Molecular Probes, Inc de Eugene, OR), bromuro de etidio, yoduro de propidio, cromomicina, naranja de acridina, Hoescht 33258, Toto-1, Yoyo-1, y DAPI (hidrocloruro de 4’,6-diamidino2-fenilindol). Se proporciona una descripción adicional con respecto al uso de los colorantes de intercalación en Zhu y col., Anal. Chem. 66: 1941-1948 (1994), que se incorpora por referencia en su totalidad.
2. Procedimientos de detección basados en FRET
Los procedimientos de detección de este tipo implican detectar un cambio en la fluorescencia procedente de un fluoróforo donante (indicador) y/o un fluoróforo aceptor (desactivador) en una pareja de fluoróforos donante/aceptor. La pareja de fluoróforos donante y aceptor se selecciona de tal manera que el espectro de emisión del donante solapa el espectro de excitación del aceptor. De esta manera, cuando la pareja de fluoróforos se lleva en el interior con proximidad suficientemente estrecha entre sí, se puede producir la transferencia de energía desde el donante hacia el aceptor. Se puede detectar esta transferencia de energía.
FRET y las reacciones de extensión del molde. Estos procedimientos utilizan generalmente un cebador marcado con un miembro de una pareja donante/aceptor y un nucleótido marcado con el otro miembro de la pareja donante/aceptor. Antes de la incorporación del nucleótido marcado en el cebador durante una reacción de extensión dependiente del molde, el donante y el aceptor están lo suficientemente separados para que no se pueda producir la transferencia de energía. Sin embargo, si el nucleótido marcado se incorpora en el cebador y la separación es suficientemente estrecha, entonces se produce la transferencia de energía y se puede detectar. Estos procedimientos son particularmente útiles para llevar a cabo reacciones de extensión de un único par de bases en la detección de polimorfismos de nucleótidos individuales (véase más abajo) y se describen en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.945.283 y en la Publicación PCT WO 97/22719.
RT-PCR cuantitativa. Se puede utilizar también una variedad de procedimientos de “amplificación en tiempo real” o procedimiento de “PCR cuantitativa en tiempo real” para determinar la cantidad de un ácido nucleico diana presente en una muestra midiendo la cantidad de producto de amplificación formado durante o después del propio procedimiento de amplificación. Los ensayos de la nucleasa fluorogénica son un ejemplo específico de un procedimiento de cuantificación en tiempo real que se puede usar satisfactoriamente con los dispositivos descritos en la presente memoria. Este procedimiento para vigilar la formación del producto de la amplificación implica la medida continua de la acumulación del producto de la PCR utilizando una sonda de oligonucleótidos fluorogénicos marcados por duplicado –una solución denominada frecuentemente en la bibliografía como procedimiento “TaqMan”.
La sonda usada en dichos ensayos es normalmente un polinucleótido corto (ca. 20-25 bases) que está marcado con
dos colorantes fluorescentes diferentes. El término 5’ de la sonda está usualmente unido a un colorante indicador y el término 3’ está unido a un colorante desactivador, aunque los colorantes se pueden unir también en otras
localizaciones en la sonda. La sonda se diseña para tener al menos una complementariedad sustancial de secuencias con el sitio de unión de la sonda en el ácido nucleico diana. Se incluyen también en la mezcla de
reacción cebadores de la PCR en la dirección 5’ y en la dirección 3’ que se unen a las regiones que flanquean el sitio
de unión de la sonda.
Cuando la sonda está intacta, se produce la transferencia de energía entre los dos fluoróforos y los desactivadores desactivan la emisión procedente del indicador. Durante la fase de extensión de la PCR, la sonda se escinde debido
a la actividad de la nucleasa 5’ de una polimerasa de ácido nucleico tal como la polimerasa Taq, liberando por tanto
el indicador del polinucleótido-desactivador y dando como resultado un aumento de la intensidad de emisión del indicador, que se puede medir mediante un detector adecuado.
Un detector que está adaptado de forma específica para medir emisiones de fluorescencia tal como aquellos creados durante un ensayo fluorogénico es el ABI 7700 fabricado por Applied Biosystems, Inc., en Foster City, CA. El software informático proporcionado con el instrumento es capaz de registrar la intensidad de la fluorescencia del indicador y del desactivador durante el curso de la amplificación. Estos valores registrados se pueden utilizar a continuación para calcular el aumento en la intensidad de emisión normalizada del indicador sobre una base continua y cuantificar en última instancia la cantidad de ARNm que se está amplificando.
Se describen detalles adicionales con respecto a la teoría y al funcionamiento de los procedimientos fluorogénicos para la preparación de las determinaciones en tiempo real de la concentración de los productos de la amplificación en las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.210.015 de Gelfand, 5.538.848 de Livak, y col, y 5.863.736 de Haaland, así como en Heid, C.A. y col., Genome Research, 6: 986-994 (1996); Gibson, U.E.M., y col., Genome Research 6: 995-1001 (1996), Holland, P.M., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280, (1991); y Livak, K.J., y col., PCR Methods and Applications 357-362 81995), cada uno de los cuales se incorpora por referencia en su totalidad.
De esta manera, a medida que la reacción de amplificación progresa, una cantidad creciente de colorante llega a unirse y está acompañada por un aumento simultáneo en la señal.
Los colorantes de intercalación tales como los descritos anteriormente se pueden utilizar también en una solución diferente Para los procedimientos de la PCR cuantitativos. Tal como se ha señalado anteriormente, estos colorantes se unen preferentemente a un ADN bicatenario (por ejemplo, SYBR GREEN) y solo generan señal una vez unidos. De esta manera, a medida que una reacción de amplificación progresa, una cantidad creciente de colorante llega a unirse y está acompañada por un aumento simultáneo en la señal que se puede detectar.
Balizas moleculares: Con las balizas moleculares, un cambio en la conformación de la sonda a medida que se hibrida con una región complementaria del producto amplificado da como resultado la formación de una señal
detectable. La propia sonda incluye dos secciones: una sección en el extremo 5’ y la otra sección en el extremo 3’.
Estas secciones flanquean la sección de la sonda que se hibrida con el sitio de unión a la sonda y son complementarias con el otro. Una sección del extremo se une normalmente a un colorante indicador y la otra sección del extremo se une normalmente a un colorante desactivador.
En disolución, las dos secciones terminales pueden hibridarse entre sí para formar un bucle en horquilla. En esta conformación, el colorante indicador y el desactivador están en una proximidad suficientemente cercana de tal manera que la fluorescencia procedente del colorante indicador se desactiva eficazmente por el colorante desactivador. La sonda hibridada, en contraste, da como resultado una conformación linealizada en la que se disminuye la extensión de la desactivación. De esta manera, vigilando los cambios de emisión de los dos colorantes, es posible vigilar de forma indirecta la formación del producto de amplificación. Se describen adicionalmente las sondas de este tipo y los procedimientos para su uso, por ejemplo, en Piatek, A.S., y col., Nat. Biotechnol. 16: 35963 (1998), Tyagi, S. y Kramer, F.R., nature Biotechnology 14: 303-308 (1996); y Tyagi, S. y col., Nat. Biotechnology.
16: 49-53 (1998), cada uno de los cuales se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad para todos los fines.
Invasor: Se utilizaron ensayos de invasor (Third Wave Technologies, (Madison, WI) para la genotipación de SNP y utilizan un oligonucleótido, designado como la sonda señal, que es complementario del ácido nucleico diana (ADN o ARN) o el sitio del polimorfismo. Un segundo oligonucleótido designado como el oligonucleótido invasor contiene la
misma secuencia de nucleótido 5’, pero la secuencia del nucleótido 3’ contiene un polimorfismo del nucleótido. El
oligonucleótido invasor interfiere la unión de la sonda señal con el ácido nucleico diana de tal manera que el extremo
5’ de la sonda señal forma una “solapa” en el nucleótido que contiene el polimorfismo. Este complejo se reconoce
mediante una endonucleasa de estructura específica, denominada la enzima Cleavasa. La enzima Cleavasa escinde la solapa 5’ de los nucleótidos. La solapa liberada se une con una tercera sonda que soporta las marcas FRET, formando por tanto otra estructura de duplete reconocida por la enzima Cleavasa. Durante este tiempo la enzima Cleavasa escinde un fluoróforo apartado de un desactivador y produce una señal fluorescente. Para la genotipación de SNP, la sonda señal se diseñará para hibridar tanto con el alelo de referencia (natural) como con el alelo variante (mutante). A diferencia de la PCR, existe una amplificación lineal de la señal sin amplificación del ácido nucleico. Se proporcionan detalles adicionales suficientes para guiar a un experto en la técnica mediante, por ejemplo, Neri, B.P., y col., Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis 3826: 117-125, 2000).
Nasba: La Amplificación Basada en una Secuencia de Ácido Nucleico (NASB A) es un procedimiento de detección que utiliza ARN como molde. Un cebador complementario del ARN contiene la secuencia del sitio del promotor T7. Se deja unirse a este cebador con el molde de ARN y se añade transcriptasa inversa (TI) para generar la hebra
complementaria desde 3’ a 5’. Se añade posteriormente ARNasa H para la digestión lejos del ARN dejando el ADN
monocatenario después. A continuación se puede unir una segunda copia del cebador al ADN monocatenario y preparar ADN bicatenario. Se añade la ARN polimerasa T7 para generar muchas copias del ARN a partir del sitio del promotor T7 que se ha incorporado a la secuencia de ADNc del primer cebador. Todas las enzimas mencionadas son capaces de funcionar a 41º C (véase, por ejemplo, Compton, J. Nucleic Acid Sequence-based Amplification, Nature 350: 91-91, 1991).
Escorpión. Se describe este procedimiento, por ejemplo, en Thelwell N., y col. Nucleic Acids Research, 28: 37523761, 2000.
3. Detección capacitiva del ADN
Existe una relación lineal entre la concentración del ADN y el cambio en la capacitancia que se evoca mediante el paso de ácidos nucleicos a través de un campo eléctrico de 1 kHz. Se ha encontrado que esta relación es independiente de la especie (véase, por ejemplo, Sohn, y col (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 10687-10690).
De esta manera, en determinados dispositivos, los ácidos nucleicos del interior del canal de flujo (por ejemplo, el canal de flujo sustancialmente circular de la FIG. 1 o las cámaras de reacción de la FIG. 2) se someten a dicho campo para determinar la concentración del producto amplificado. De forma alternativa, la disolución que contiene el producto amplificado se retira y a continuación se somete al campo eléctrico.
IX. Composición de las mezclas para llevar a cabo las reacciones
Las reacciones llevadas a cabo con los dispositivos microfluídicos dados a conocer en la presente memoria se llevan a cabo normalmente con determinados aditivos para potenciar las reacciones. De esta manera, por ejemplo, en el caso de los dispositivos en los que se depositan reactivos, estos aditivos, por ejemplo, se pueden motear con uno o más reactivos en un sitio de reacción. Un conjunto de aditivos son reactivos bloqueantes que bloquean los sitios de unión de la proteína sobre el sustrato elastomérico. Se puede utilizar una amplia variedad de dichos compuestos que incluyen numerosas proteínas diferentes (por ejemplo, gelatina y diversas proteínas de albúmina, tales como albúmina de suero bovino) y glicerol.
Puede ser también útil un aditivo detergente. Se pueden utilizar cualquier de numerosos aditivos detergentes. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a SDS y diversos detergentes Triton.
En el caso específico de reacciones de amplificación del ácido nucleico, se pueden incluir numerosos tipos de aditivos diferentes. Una categoría son los potenciadores que promueven la reacción de amplificación. Dichos aditivos incluyen, pero no se limitan a, reactivos que reducen la estructura secundaria en el ácido nucleico (por ejemplo, betaína), y agentes que reducen los acontecimientos de cebado incorrecto (por ejemplo, cloruro de tetrametilamonio).
Se ha encontrado también al llevar a cabo determinadas reacciones de amplificación que algunas polimerasas proporcionan resultados potenciados. Por ejemplo, aunque se obtuvieron buenos resultados con la polimerasa AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) de Thermus aquaticus, se obtuvieron en algunos ejemplo reacciones mejoradas utilizando la polimerasa DyNazyme de Finnzyme, Espoo, Finlandia. Esta polimerasa procede de la bacteria termófila, Thermus brockianus. Otras polimerasas a modo de ejemplo que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, rTH polimerasa XL, que es una combinación de Thermus thermophilus (Tth) y Thermococcus litoralis (Tli), la arqueobacteria Pyrosoccus woesi (Pwo) hipertermófila y la ADN polimerasa Tgo.
En el Ejemplo 1, más abajo, se proporcionan detalles adicionales con respecto a los aditivos útiles en llevar a cabo reacciones con determinados dispositivos dados a conocer en la presente memoria.
X. Aplicaciones a modo de ejemplo
Debido a que los dispositivos microfluídicos proporcionados en la presente memoria se pueden fabricar para incluir un gran número de sitios de reacción, los dispositivos son útiles en una amplia variedad de procedimientos analíticos y de cribado. En general, los dispositivos se pueden utilizar para detectar reacciones entre especies que reaccionan para formar una señal detectable, o un producto que tras la interacción con otra especie genera una señal detectable. A la vista de su uso con diversos tipos de sistemas de control de la temperatura, los dispositivos se pueden utilizar también en numerosos tipos diferentes de análisis o reacciones que requieren un control de la temperatura.
A. Reacciones de amplificación del ácido nucleico
Los dispositivos dados a conocer en la presente memoria se pueden utilizar para llevar a cabo esencialmente cualquier tipo de reacción de amplificación del ácido nucleico. De esta manera, por ejemplo, las reacciones de amplificación pueden ser amplificaciones lineales (amplificaciones con un único cebador), así como amplificaciones exponenciales (es decir, amplificaciones llevadas a cabo con un conjunto de cebador directo y cebador inverso).
Cuando se utilizan dispositivos de tipo canal ciego para llevar a cabo las reacciones de amplificación del ácido nucleico, los reactivos que se depositan normalmente en el interior de los sitios de reacción son aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo el tipo deseado de reacción. Normalmente, esto significa que se depositan, por ejemplo, algunos o todos de los siguientes, cebadores, polimerasa, nucleótidos, iones metálicos, tampón, y cofactores. La muestra introducida en el sitio de reacción en dichos casos es el molde de ácido nucleico. De forma alternativa, sin embargo, el molde se puede depositar y los reactivos de amplificación hacerse fluir en los sitios de reacción. Tal como se ha descrito más arriba, cuando se utiliza el dispositivo de la matriz para llevar a cabo una reacción de amplificación, las muestras que contienen el molde de ácido nucleico se hacen fluir a través de los canales de flujo vertical y los reactivos de la amplificación a través de los canales de flujo horizontal o viceversa.
Aunque la PCR es quizá la mejor técnica de amplificación conocida, los dispositivos no se limitan a llevar a cabo las amplificaciones de la PCR. Otros tipos de reacciones de amplificación que se pueden llevar a cabo incluyen, pero no se limitan a, (i) reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase Wu y Wallace, Genomics 4: 560 (1989) y Landegren y col., Science 241: 1077 (1998)); (ii) amplificación de la transcripción (véase Kwoh y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86: 1173 (1989)); (iii) replicación autosostenida de la secuencia (véase Guatelli y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990)) y (iv) amplificación de la secuencia basada en ácido nucleico (NASBA) (véase, Sooknanan, R. y Malek, L., Biotecnology 13. 563-65 (1995)). Cada una de las anteriores referencias se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad a todos los fines.
Se puede llevar a cabo la detección del producto amplificado resultante utilizando cualquiera de los procedimientos de detección descritos más arriba para detectar el ADN amplificado.
5 B. Análisis y genotipación de SNP
1. General
Muchas enfermedades vinculadas a modificaciones del genoma, tanto del organismo hospedador como de los organismos infecciosos, son la consecuencia de un cambio en un pequeño número de nucleótidos, que implica con frecuencia un cambio en un único nucleótido. Dichos cambios en un único nucleótido se denominan polimorfismos 10 de nucleótido único o sencillamente SNP, y el sitio en el que se produce el SNP se denomina normalmente un sitio polimórfico. Los dispositivos descritos en la presente memoria pueden utilizarse para determinar la identidad de un nucleótido presente en dichos sitios polimórficos. Como extensión de esta capacidad, los dispositivos se pueden utilizar en análisis de genotipación. La genotipación implica la determinación de que cualquier organismo diploide (es decir, un organismos con dos copias de cada gen) contiene dos copias de un alelo de referencia (un homocigoto del 15 tipo de la referencia), una copia de cada uno de la referencia y un alelo variante (es decir, un heterocigoto), o contiene dos copias del alelo variante (es decir, un homocigoto del tipo de la variante). Cuando se lleva a cabo un análisis de genotipación, se pueden utilizar los procedimientos de la presente invención para integrar un único sitio variante. Sin embargo, tal como se describe de forma adicional a continuación en la sección sobre el multiplexado, se pueden usar también los procedimientos para determinar el genotipo de un individuo en muchos loci diferentes,
20 tanto en el mismo gen como en diferentes genes o en sus combinaciones.
Los dispositivos que se van a utilizar para llevar a cabo los análisis de genotipación están diseñados para utilizar sitios de reacción de un tamaño adecuado para asegurar desde un punto de vista estadístico que una copia de cada uno de los dos alelos de un sujeto diploide está presente en el sitio de reacción a concentraciones trabajables. Por otra parte, un análisis podría dar lugar a resultados que sugieran que un heterocigoto es un homocigoto
25 sencillamente debido a que una copia del segundo alelo no está presente en el sitio de reacción. La Tabla 2 siguiente indica el número de copias del genoma presentes en un volumen de reacción de 1 nl en diversas concentraciones de ADN a modo de ejemplo que se pueden utilizar con los dispositivos descritos en la presente memoria.
Tabla 2: Número de copias de genoma presentes en un volumen de 1 nl a la concentración de ADN indicada.
Volumen (nl)
[ADN] (µg/µl) N
1
0,33 100
1
0,10 32
1
0,05 16
1
0,01 3
1
0,003
1
De forma general, debido al reparto estocástico de la muestra, el número de copias presentes antes de una reacción de amplificación determina al comienzo la probabilidad de error en la medida. Los análisis de genotipación que utilizan determinados dispositivos se llevan a cabo normalmente con muestras que tienen una concentración de ADN de aproximadamente 0,10 µg/µl, aunque los actuales inventores han desarrollado reacciones TaqMan de forma
35 satisfactoria a concentraciones en las que existe un único genoma por sitio de reacción.
2. Procedimientos
Se pueden llevar a cabo los análisis de genotipación utilizando una variedad de disoluciones diferentes. En estos
procedimientos, es generalmente suficiente obtener un resultado “si” o un “no”, es decir, la detección necesita
únicamente ser capaz de responder a la pregunta de si un alelo dado está presente. De esta manera, se pueden
40 llevar a cabo análisis solamente con los cebadores o nucleótidos necesarios para detectar la presencia de un alelo potencial en un sitio polimórfico. Sin embargo, más normalmente, se incluyen cebadores y polinucleótidos para detectar la presencia de cada alelo potencialmente en el sitio polimórfico. Siguen ejemplos de disoluciones adecuadas.
Reacciones de extensión de un único par de bases (SBPE). Las reacciones SBPE son una técnica específicamente
45 desarrollada para llevar a cabo análisis de genotipación. Aunque se han desarrollado numerosos ensayos SPBE, la solución general es muy similar. Normalmente, estos ensayos implican hibridar un cebador que es complementario
de un ácido nucleico diana de tal manera que el extremo 3’ del cebador está inmediatamente a 5’ del sitio de la
variante o es adyacente al anterior. La extensión se lleva a cabo en presencia de uno o más nucleótidos no extensibles que son complementarios de los nucleótido(s) que ocupan el sitio de la variante y una polimerasa. El nucleótido no extensible es un análogo de nucleótido que evita la extensión adicional por la polimerasa una vez incorporado en el cebador. Si el(los) nucleótido(s) no extensible(s) marcado(s) es complementario con el nucleótido
en el sitio de la variante, entonces un nucleótido no extensible marcado se incorpora en el extremo 3’ del cebador
para generar un producto de extensión marcado. Por tanto, los cebadores extendidos proporcionan una indicación de cuál nucleótido está presente en el sitio de la variante de un ácido nucleico diana. Dichos procedimientos y procedimientos relacionados se describen, por ejemplo, en las Patentes Nos 5.846.710, 6.004.744, 5.888.819, 5.856.092; y 5.710.028; y en el documento WO 92/16657.
Se puede detectar la detección de los productos extendidos utilizando la disolución de detección FRET descrita más arriba para las reacciones de extensión, en la sección de detección. De esta manera, por ejemplo, utilizando los dispositivos descritos en la presente memoria, se introdujeron una mezcla de reacción que contenía un cebador marcado con un miembro de un fluoróforo donante/aceptor, de uno a cuatro nucleótidos marcados no extensibles (marcados de forma diferente si se incluyó más de un nucleótido no extensible), y polimerasa (o previamente moteada) en un sitio de reacción. A continuación se introdujo una muestra que contenía un molde de ADN en el sitio de reacción para dejar que se produjera la extensión del molde. Se detectó cualquier producto de extensión formado por la formación de una señal FRET (véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 5.945.283 y la Publicación PCT WO 97/22719). Las reacciones pueden someterse a termociclación opcionalmente utilizando los procedimientos de control de la temperatura y el equipo descrito anteriormente.
PCR cuantitativa. Se puede llevar a cabo también el análisis de genotipación utilizando los procedimientos de la PCR cuantitativa descritos anteriormente. En este caso, se incluyeron sondas marcadas de forma diferente complementarias de cada una de las formas alélicas como reactivos, junto con cebadores, nucleótidos y polimerasa. Sin embargo, se pueden llevar a cabo reacciones solo con una única sonda, aunque esto puede crear ambigüedad debido a que la falta de señal es debida a la ausencia de un alelo concreto o sencillamente a una reacción fallida. Para el caso bialélico típico en el que son posibles dos alelos para un sitio polimórfico, se incluyeron en la mezcla de reacción de manera normal dos sondas marcadas de forma diferente, cada una perfectamente complementaria con uno de los alelos, junto con los cebadores de la amplificación, nucleótidos y polimerasa. La muestra que contenía el ADN diana se introdujo en el sitio de reacción. Si está presente el alelo con el cual una sonda es complementaria en el ADN diana, se produce la amplificación, dando como resultado por tanto una señal detectable, tal como se describe en la detección anterior. Basándose en cuál de las diferentes señales diferenciales se obtiene, se puede determinar la identidad del nucleótido en el sitio polimórfico. Si se detectan ambas señales, entonces, ambos alelos están presentes. Se llevó a cabo la termociclación durante la reacción tal como se describe más arriba en la sección de control de la temperatura.
B. Análisis de la expresión génica
1. General
El análisis de la expresión génica implica determinar el nivel al cual se expresan uno o más genes en una célula concreta. La determinación puede ser cualitativa, pero generalmente es cuantitativa. En un análisis de expresión génica diferencial, se compararon los niveles del (de los) gen(es) en una célula (por ejemplo, una célula de prueba) con los niveles de expresión de los mismos genes en otra célula (célula control). Se puede hacer una amplia variedad de dichas comparaciones. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, la comparación entre células sanas y enfermas, entre células procedentes de un individuo tratado con un fármaco y células de otro individuo no tratado, entre células expuestas a una sustancia tóxica concreta y células no expuestas, y así sucesivamente. Los genes cuyos niveles de expresión varían entre las células de prueba y de control pueden servir como marcadores y/o dianas para la terapia. Por ejemplo, si se encuentra que un determinado grupo de genes está regulado en exceso en células enfermas más bien que en células sanas, dichos genes pueden servir como marcadores de la enfermedad y pueden utilizarse potencialmente como la base para las pruebas diagnósticas. Estos genes podrían ser también dianas. Una estrategia para tratar la enfermedad puede incluir procedimientos que den como resultado la reducción de la expresión de los genes regulados en exceso.
El diseño de los dispositivos dados a conocer en la presente memoria es útil para facilitar una variedad de análisis de la expresión génica. Debido a que los dispositivos contienen un gran número de sitios de reacción, se pueden ensayar un gran número de genes y/o muestras al mismo tiempo. Utilizando los dispositivos de canal de flujo ciego, por ejemplo, se pueden determinar los niveles de expresión de cientos o miles de genes al mismo tiempo. Estos dispositivos facilitan también loa análisis diferenciales de la expresión génica. Con el diseño de la matriz, por ejemplo, una muestra obtenida a partir de una célula sana puede ensayarse en un canal de flujo, desarrollándose con una muestra procedente de una célula enferma en un canal inmediatamente adyacente. Este rasgo potencia la facilidad de detección y la fiabilidad de los resultados debido a que las dos muestras se hacen avanzar en el mismo dispositivo al mismo tiempo y en las mismas condiciones.
2. Preparación y concentración de la muestra
Para medir el nivel de transcripción (y por tanto el nivel de expresión) de un gen o genes, se obtuvo una muestra de ácido nucleico que comprendía un(os) transcritos de ARNm del gen(es) o de fragmentos del gen, o los ácidos nucleicos derivados del(de los) transcrito(s) de ARNm. Un ácido nucleico derivado de un transcrito de ARNm se 5 refiere a un ácido nucleico para cuya síntesis el transcrito de ARNm o una subsecuencia del mismo ha servido en última instancia como molde. De esta manera, un ADNc inverso transcrito a partir de un ARNm, un ARN transcrito a partir de este ADNc, un ADN amplificado procedente del ADNc, un ARN transcrito a partir del ADN amplificado, se derivan todos del transcrito de ARNm y la detección de dichos productos derivados es indicadora de la presencia y/o abundancia del transcrito original en una muestra. De esta manera, las muestras adecuadas incluyen, pero no se
10 limitan a, transcritos de ARNm del gen o genes, el ADNc inverso transcrito a partir del ARNm, el ARNc transcrito a partir del ADNc, el ADN amplificado procedente de los genes, el ARN transcrito a partir del ADN amplificado.
En algunos procedimientos, una muestra de ácido nucleico es el ARNm total aislado de una muestra biológica; en otros casos, la muestra de ácido nucleico es el ARN total procedente de una muestra biológica. El término “muestra biológica”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una muestra obtenida de un organismo o de los
15 componentes de un organismo, tales como células, tejidos y fluidos biológicos. En algunos procedimientos, la muestra procede de un paciente humano. Dichas muestras incluyen esputo, sangre, células de la sangre (por ejemplo, glóbulos blancos), tejido o muestras de biopsia de aguja fina, orina, fluido peritoneal, y fluido pleural, o células procedentes de los anteriores. Las muestras biológicas pueden incluir también secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas a fines histológicos. A menudo se proporcionan dos muestras a fines de
20 comparación. Las muestras pueden ser, por ejemplo, de diferentes tipos de células o tejidos, procedentes de diferentes individuos o de la misma muestra original sometida a dos tratamientos diferentes (por ejemplo, tratada con fármacos y control).
Para la purificación de dichas muestras de ARN puede utilizarse cualquier técnica de aislamiento del ARN que no seleccione frente al aislamiento del ARNm. Por ejemplo, se describen en detalle procedimientos de aislamiento y 25 purificación de ácidos nucleicos en los documentos WO 97/10365, WO 97/27317, Capítulo 3 de las Laboratory Techniques in biochemistry and Molecular Biology. Hybridization With Nucleic Acid Probes, Parte 1. Theory and Nucleic Acid Preparation, (P. Tijssen, ed.) Elsevier, N.Y. (1993), Capítulo 3 de las Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, parte 1. Theory and Nucleic Acid Preparation (P. Tijssen, Ed.) Elsevier, N.Y. (1993); y Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold
30 Spring harbar Press, N.Y., (1989); Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel, F.M. y col., eds) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1987-1993). Se pueden procesar fácilmente grandes cantidades de muestras de tejido utilizando las técnicas conocidas en la materia, incluyendo, por ejemplo, el procedimiento de aislamiento del ARN en una única etapa de Chomczynski, P. descrito en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.843.155.
En los análisis de expresión génica que utilizan los dispositivos que se describen, un factor significativo que afecta a
35 los resultados es la concentración de ácido nucleico en la muestra. En un número bajo de copias, el ruido está relacionado con la raíz cuadrada del número de copias. De esta manera, el nivel de error que se considera aceptable controla el número de copias requerido. El número de copias requerido en el volumen de muestra concreto proporciona la concentración de ADN requerido. Aunque no es necesariamente óptimo, se pueden llevar a cabo reacciones de cuantificación con un nivel de error de hasta un 50%, pero preferiblemente es menor.
40 Suponiendo un volumen de 1 nanolitro, en la Tabla 3 se muestran las concentraciones de ADN requeridas para conseguir un nivel de error concreto. Como se puede observar, volúmenes de 1 nanolitro tales como los utilizados con determinados dispositivos tienen suficientes copias de los productos de expresión génica a las concentraciones que son trabajables con dispositivos microfluídicos.
Tabla 3. Expresión génica – Cantidad de ADN
Error (%)
N (Copia Nº) Volumen (nl) [ADN] (10-12 M)
2
2500 1 4,2
10
100 1 0,17
25
16 1 0,027
50
4 1 0,0066
Un cálculo adicional demuestra que determinados dispositivos proporcionados en la presente memoria que utilizan un sitio de reacción de 1 nanolitro contienen ADN suficiente para conseguir resultados de expresión precisos. De forma específica, un procedimiento de preparación del ARNm típico da como resultado aproximadamente 10 µg de ARNm. Se ha demostrado que normalmente existen de 1 a 10.000 copias de cada ARNm por célula. De los ARNm 50 que se expresan en el interior de cualquier célula dada, aproximadamente los cuatro mensajes más comunes comprenden aproximadamente un 13% de los niveles de ARNm total. De esta manera, dichos mensajes muy
expresados comprenden 1,3 µg de ARNm (cada uno tiene 4 x 10-12 moles o aproximadamente 2,4 x 1012 copias). A la vista de los anteriores intervalos de expresión, se espera que estén presentes mensajes raros a un nivel de aproximadamente 2 x 10-8 copias. Si un análisis normalizado de la muestra de ARNm se disuelve en 10 µl, la concentración del mensaje raro es aproximadamente de 2 x 107 copias/µl; esta concentración corresponde a 20.000 copias por pocillo de 1 nl (o 4 x 1011 M).
3. Procedimientos
Puesto que los análisis de la expresión implican normalmente un análisis cuantitativo, la detección se consigue normalmente utilizando uno de los procedimientos de la PCR cuantitativa en tiempo real descritos anteriormente. De esta manera, si se utiliza una disolución TaqMan, los reactivos que se introducen (o se motean previamente) en los sitios de reacción pueden incluir uno o todos de los siguientes: cebador, sonda marcada, nucleótidos y polimerasa. Si se utiliza un colorante de intercalación, la mezcla del reactivo incluye normalmente uno o todos de los siguientes: cebador, nucleótidos, polimerasa, y colorante de intercalación.
D. Multiplexado
Los dispositivos basados en matriz descritos en la presente memoria (véanse, por ejemplo, las FIGS. 1A, 1F, 2, 3A y 3B y el texto que las acompaña) están diseñados de forma inherente para llevar a cabo un gran número de reacciones de amplificación al mismo tiempo. Esta característica, sin embargo, puede ampliarse además de forma fácil tras llevar a cabo análisis múltiples (por ejemplo, análisis de genotipación y expresión) en el interior de cada sitio de reacción.
Se pueden llevar a cabo amplificaciones multiplexadas incluso en el interior de un único sitio de reacción utilizando, por ejemplo, una pluralidad de cebadores, cada uno de los cuales es específico de un ácido nucleico diana concreto de interés, durante el procedimiento de ciclación térmica. La presencia de los diferentes productos amplificados se puede detectar utilizando sondas marcadas de forma diferente para llevar a cabo una reacción RT-PCR cuantitativa
o utilizando balizas moleculares marcadas de forma diferente (véase más arriba). En dichas disoluciones, cada sonda marcada de forma diferente se diseña para hibridarse solo con una diana amplificada concreta. Mediante una acertad elección de las diferentes marcas que se utilizan, se pueden llevar a cabo análisis en los que las diferentes marcas se excitan y/o detectan a diferentes longitudes de onda en una única reacción. Las directrices adicionales con respecto a la selección de las marcas fluorescentes apropiadas que son adecuadas en dichas disoluciones incluyen: Fluorescence Spectroscopy (Pesce y col., Eds) Marcel Dekker, Nueva York, (1971), White y col., Fluorescence Analysis. A Practical Approach, Marcel Dekker, Nueva York, (1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2ª ed., Academic Press, Nueva York, (1971); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules, Academic Press, Nueva York, (1976); Indicators (Bishop, Ed.). Pergamon Press, Oxford, 19723; y Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular, Eugene (1992).
Se pueden llevar a cabo opcionalmente análisis de genotipación múltiple y de la expresión en cada sitio de reacción. Si se utilizan procedimientos de la PCR cuantitativa tales como TaqMan, entonces se incluyen cebadores para amplificar diferentes regiones de un ADN diana de interés en el interior de un único sitio de reacción. Se utilizan sondas marcadas de forma diferente para cada región para distinguir el producto que se forma.
E. Análisis de ácidos no nucleicos.
Aunque útiles para llevar a cabo una amplia variedad de análisis de ácidos nucleicos, se pueden utilizar también los dispositivos en otras numerosas aplicaciones. Tal como se ha indicado al principio, los dispositivos se pueden utilizar para analizar esencialmente cualquier interacción entre dos o más especies que genere una señal detectable o un producto de reacción que se puede hacer reaccionar con un reactivo de detección que genera una señal tras la interacción con el producto de reacción.
De esta manera, por ejemplo, los dispositivos se pueden utilizar en numerosas aplicaciones de cribado para identificar los agentes de ensayo que tienen una actividad deseada concreta. Como ejemplo específico, se pueden utilizar los dispositivos para cribar compuestos por su actividad como sustrato o inhibidor de una o más enzimas. En dichos análisis, el compuesto de ensayo y otros reactivos de ensayo enzimáticos necesarios (por ejemplo, tampón, iones metálicos, cofactores y sustratos) se introducen (si no se han depositado anteriormente) en el sitio de reacción. A continuación se introduce la muestra de enzima y se detecta la reacción (si el compuesto de ensayo es un sustrato) o la inhibición de la reacción (si el compuesto de ensayo es un inhibidor). Dichas reacciones o la inhibición se pueden llevar a cabo mediante técnicas normalizadas, tales como vigilando de forma directa o indirecta la pérdida de sustrato y/o la apariencia del producto.
Se pueden utilizar también dispositivos con canales de flujo y sitios de reacción suficientemente grandes para llevar a cabo ensayos celulares para detectar la interacción entre una célula y uno o más reactivos. Por ejemplo, determinados análisis implican la determinación de si un tipo de célula concreto está presente en una muestra. Un ejemplo para llevar a cabo esto es utilizar colorantes específicos de células que reaccionan de forma preferente con determinados tipos de células. De esta manera, se pueden introducir dichos colorantes en los sitios de reacción y añadirse las células. Se puede detectar la tinción de las células utilizando técnicas microscópicas normalizadas. Como otra ilustración, se pueden cribar compuestos de ensayo para su capacidad de estimular o inhibir una respuesta celular, tal como una ruta de transducción de la señal. En dicho análisis, se introduce el compuesto de ensayo en un sitio y a continuación se añade la célula. Se comprueba a continuación el sitio de reacción para detectar la formación de la respuesta celular.
Se muestra una descripción adicional de los dispositivos y aplicaciones relacionadas con dichos dispositivos en la solicitud Provisional de los Estados Unidos en tramitación y de propiedad compartida Nº 60/335.292, presentada el 30 de noviembre de 2002, que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad a todos los fines.
XI. Fabricación
A. Aspectos generales
Tal como se ha aludido al principio, los dispositivos microfluídicos que se proporcionan se construyen por lo general utilizando técnicas de litografía blanda única y multicapa (MSL) y/o procedimientos de encapsulación con capa de sacrificio. La disolución MSL básica implica filtrar una serie de capas elastoméricas sobre un molde micromaquinado, eliminando las capas procedentes del molde y a continuación fusionando las capas juntas. En la disolución de capa de sacrificio, los modelos de fotorresistencia se depositan dondequiera que se desea un canal. Estas técnicas y su uso en la producción de dispositivos microfluídicos se describe en detalle, por ejemplo, en Unger y col. (2000) Science 288. 113-116, en Chou, y col. (2000) “Integrated Elastomer Fluidic Lab-on-a-chip-Surface Patterning and DNA Diagnostic, en Proceeding of the Solid State Actuator and Sensor Worksop, Hilton Head, S.C.; y en la Publicación PCT WO 01/01025, cada uno de los cuales se incorpora por referencia en su totalidad en la presente memoria a todos los fines.
De forma breve, los anteriores procedimientos de fabricación implican inicialmente fabricar moldes madre para las capas superiores (por ejemplo, la capa elastomérica con los canales de control) sobre deflectores de silicio mediante fotolitografía con fotorresistencia (Shipley SJR 5740): las alturas de los canales se pueden controlar de forma precisa mediante la velocidad de revestimiento de giro. Se forman canales fotorresistentes exponiendo la fotorresistencia a la luz UV seguido por revelado: El procedimiento de reflujo térmico y el tratamiento de protección se consiguen normalmente tal como ha sido descrito por M.A. Unger, H.-P. Chou, T. Throsen, A. Scherer y S.R. Quake, Science (2000) 288: 113, que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad. Un elastómero de silicona mixto bicomponente (GE RTV 615) se hace girar a continuación en la parte inferior del molde y se vierte sobre la parte superior del molde, respectivamente. Aquí, se puede utilizar también el revestimiento de giro para controlar el espesor de la parte inferior de la capa de fluido polimérico. La capa superior parcialmente endurecida se despega de la parte inferior del molde madre de silicio, este dispositivo RTV se trata normalmente con HCl (0,1 N, 30 min a 80º C). Este tratamiento actúa para escindir algunos de los enlaces Si-O-Si, exponiendo por tanto los grupos hidroxi que hacen los canales más hidrófilos.
El dispositivo puede a continuación opcionalmente sellarse de forma hermética a un soporte. El soporte puede fabricarse de esencialmente cualquier material, aunque la superficie debe ser plana para asegurar un buen cierre hermético, y el cierre hermético formado se debe principalmente a fuerzas adhesivas. Los ejemplos de soportes adecuados incluyen vidrio, plásticos y similares.
Los dispositivos formados de acuerdo con el procedimiento anterior dan como resultado la formación en el sustrato (por ejemplo, un porta de vidrio) de una pared del canal de flujo. De forma alternativa, el dispositivo una vez retirado del molde madre se cierra herméticamente con una fina membrana elastomérica de tal manera que el canal de flujo queda encerrado totalmente en material elastomérico. El dispositivo elastomérico resultante puede a continuación unirse opcionalmente a un soporte sustrato.
B. Dispositivos que utilizan un diseño de canal ciego
1. Formación de la capa
Los dispositivos microfluídicos basados en el diseño del canal ciego en el que los reactivos se depositan en los sitios de reacción durante la fabricación están formados normalmente por tres capas. La capa inferior es la capa tras la cual se depositan los reactivos. La capa inferior se puede formar a partir de diversos materiales elastoméricos tal como se describe en las referencias citadas anteriormente sobre los procedimientos MLS. Normalmente, el material es un elastómero de polidimetilsiloxano (PMDS). Basándose en la disposición y en la localización de los sitios de reacción que se desean para el dispositivo particular, se pueden determinar las localizaciones en la capa inferior en las cuales deben motearse los reactivos adecuados. Debido a que el PMDS es hidrófobo, las motas acuosas depositadas retroceden para formar una mota pequeña. Los reactivos depositados se depositan de tal manera que no se forma un enlace covalente entre el reactivo y la superficie del elastómero debido a que, tal como se ha descrito al principio, se pretende que los reactivos se disuelvan en la disolución de la muestra una vez esta se introduce en el sitio de reacción.
Las otras dos capas del dispositivo son la capa en la que se forman los canales de flujo y la capa en la que se forman los canales de control y de forma opcional, los canales de protección. Estas dos capas se preparan de acuerdo con los procedimientos generales que han mostrado al principio de esta sección. La estructura de dos capas resultante se coloca a continuación sobre la parte superior de la primera capa sobre la cual los reactivos se han depositado. Un ejemplo específico de la composición de las tres capas es como sigue (relación del componente A al componente B): primera capa (capa muestra) 30:1 (en peso); segunda capa (capa del canal de flujo) 30:1 y tercera capa (capa control) 4:1. Se anticipa, sin embargo que se pueden utilizar también otras composiciones y relaciones de componentes elastoméricos.
Durante este procedimiento, los sitios de reacción se alinean con los reactivos depositados de tal manera que los reactivos se sitúan en el interior del sitio de reacción adecuado. La FIG. 6 es un conjunto de fotografías tomadas desde las cuatro esquinas de un dispositivo; estas fotografías demuestran que los reactivos depositados pueden alinearse con precisión en el interior de los sitios de reacción utilizando la anterior disolución. Estas fotografías muestran los canales de protección y el sitio de reacción localizados en el extremo del canal de flujo de derivatización. El círculo blanco indica la localización del reactivo depositado en el sitio de reacción. Tal como se ha indicado, cada mora de reactivo está comprendida en el interior de los confines del sitio de reacción.
2. Moteado
Los reactivos se pueden depositar utilizando cualquiera de los numerosos moteadores de reactivos comercialmente disponibles y utilizando una variedad de técnicas de moteado establecidas. Los ejemplos de moteador adecuado que se pueden utilizar en la preparación de los dispositivos incluyen moteadores de clavija, moteadores acústicos, micropipeteadores automatizados, bombas electroforéticas, dispositivos de impresión de chorro de tinta, impresoras de gota de tinta, y determinadas bombas osmóticas. Los ejemplos de moteadores comercialmente disponibles incluyen: Cartesian Technologies MicroSys 5100 (Irvine, CA), Hitach SPBIO (Alameda, CA), Genetix Q-Array (Reino Unido); Affymetrix 417 (Santa Clara, CA) y Packard Bioscience SpotArray (Meriden, CT). En general, se depositan motas muy pequeñas de reactivos; normalmente, normalmente, se depositan motas de menos de 10 nl, en otros casos, menos de 5 nl, 2 nl o 1 nl, y en otros casos más, menos de 0,5 nl, 0,25 nl, 0 o,1 nl.
Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar adicionalmente determinados aspectos de los dispositivos y procedimientos que se dan a conocer en la presente memoria. Los ejemplos no se consideran como limitantes de la presente invención.
Ejemplo 1
Evaluaciones de la fuerza de la señal
I. Introducción
El objetivo de este conjunto de experimentos era demostrar que se pueden llevar a cabo reacciones de la PCR con un dispositivo microfluídico del diseño que se muestra en la presente memoria con una fuerza de la señal superior en un 50% a la reacción Macro TaqMan
II. Dispositivo microfluídico
Un dispositivo microfluídico de tres capas, fabricado utilizando el procedimiento MSL, se diseñó y fabricó para llevar a cabo los experimentos descritos en el siguiente ejemplo. La FIG. 7A muestra una vista de la sección transversal del dispositivo. Tal como se muestra, el dispositivo 700 incluye una capa 722 en la que se forman los canales de flujo. Esta capa de fluido 722 se empareda entre una capa de solapamiento 720 que incluye las capas de control y de protección y la capa de sellado subyacente 724. La capa de sellado 724 forma un lado de los canales de flujo. La estructura de tres capas resultante se prefija a un sustrato 726 (en este ejemplo, un porta o cubre), que proporciona rigidez estructural, aumento de la conductividad térmica, y ayuda a evitar la evaporación de la parte inferior del dispositivo microfluídico 700.
La FIG. 7B muestra una vista esquemática del diseño de los canales de flujo en la capa de flujo 722 y de los canales de control y el canal de protección en la capa de control/protección 720. El dispositivo 700 consiste en diez canales de flujo independiente 702, cada uno con su propia entrada 708, y canales ciegos de derivatización 704, teniendo cada canal ciego 704 un sitio de reacción 706 de 1 nl. El dispositivo 700 contiene una red de líneas de control 712, que aísla los sitios de reacción 706 cuando se aplica una presión suficiente. Se incluyen también una serie de canales de protección 716 para evitar la evaporación del líquido fuera de los sitios de reacción 706, el fluido se introduce mediante la entrada 718.
II. Configuración experimental
Se llevó a cabo una reacción de la PCR utilizando los cebadores de la β-actina y la sonda TaqMan en el dispositivo 700 para amplificar el exón 3 del gen de la β-actina procedente del ADN genómico de un varón humano (Promega, Madison WI). La reacción TaqMan consiste en los siguientes componentes: 1x Tampón A de TaqMan (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,01 M, Referencia Pasiva 1 60 nM (PR1), pH 8,3); MgCl 3,5-4,0 mM; dATP 200 nM, dCTP, dGTP, dUTP 40 nM; cebador directo y cebador inverso de la β-actina 300 nM; sonda de β-actina marcada con FAM 200 nM; 0,01U/µl de AmpEraseUNG (Applied Biosystems, Foster City, CA); 0,1-0,2U/µl de DyNAzyme (Finnzyme, Espoo, Finlandia); Triton-x-100 al 0,5% (Sigma, St. Louis, MO); 0,8 µg/µl de gelatina (Calbiochem, San Diego, CA); Glicerol al 5,0% (Sigma, St. Louis, MO); H2O y ADN genómico de varón. Se añadieron los componentes de la reacción para producir un volumen total de reacción de 25 µl. Se incluyeron controles negativos (Control) compuestos por todos los componentes de la reacción de TaqMan, excepto el ADN en cada conjunto de reacciones de la PCR.
Una vez que se prepararon las muestras de la reacción TaqMan y de Control, se inyectaron en el dispositivo microfluídico 700 utilizando la punta de la pipeta cargada unida a una jeringuilla de 1 ml. La punta de la pipeta se rellenó con las muestras de reacción y a continuación se insertó en la vía de fluido 708. Los canales de flujo 702 se rellenaron manualmente aplicando una contrapresión a la jeringuilla hasta que se rellenaron todos los canales ciegos completos 704 y los sitios de reacción 706. Las líneas de control 712 se rellenaron con agua desionizada y se presurizaron a 15-20 psi (103,4-137,9 kPa) después de que se cargaran todas las muestras en las líneas de flujo 702, 704. Se accionaron las líneas de control presurizadas 712 para cerrar las válvulas y aislar las muestras en pocillos 706 de 1 nl. Los canales de protección (716) se rellenaron a continuación con agua presurizada y presurizada a 5-7 psi (34,5-48,3 kPa). Se colocó el aceite mineral (15 µl) Sigma en la placa plana de un termociclador y a continuación se colocó el dispositivo microfluídico/cubre 700 en el termociclador. A continuación se sometió a termociclación el dispositivo microfluídico 700 utilizando una rampa inicial y un perfil de termociclación tanto de tres etapas como de dos etapas.
1.
Rampa inicial a 95º C y mantener durante 1 minuto (1,0º C/s a 75º C, 0,1º C/s a 95º C.
2.
Tres etapas de termociclación durante 40 ciclos (92º C durante 30 s, 54º C durante 30 segundos y 72º C durante 1 min).
3.
Dos etapas de termociclación durante 40 ciclos (92º C durante 30 segundos y 60º C durante 60 s.).
Se colocaron tubos MicroAmp (Applied Biosystems, Foster City, CA) con la mezcla de reacción restante, designadas como reacciones Macro TaqMan para distinguirlas de las reacciones llevadas a cabo en el dispositivo microfluídico, en el GenAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y se sometieron a termociclación en el modo 9600. Las reacciones Macro TaqMan sirvieron como controles macroscópicos de las reacciones llevadas a cabo en el dispositivo microfluídico. El protocolo de termociclación se configuró para que correspondiera con el del dispositivo microfluídico, excepto en que la velocidad inicial de la rampa no se controló para las reacciones TaqMan.
Una vez que se ha completado la termociclación, se despresurizaron las líneas de control y de protección y se transfirió el chip sobre un porta de vidrio (VWR, West Chester, PA). A continuación se colocó el chip en un Array WoRx Scanner (Applied Precision, Issaquah, WA) con un vehículo modificado. Se midió la intensidad de la fluorescencia para tres diferentes longitudes de onda: 475/510 nm (FAM), 510/560 nm (VIC), y 580/640 nm (Referencia Pasiva 1 (PR1). Se utilizó el software Array Works para la imagen de fluorescencia en el dispositivo microfluídico y para medir las intensidades de la señal y de fondo de cada pocillo de 1 nl. Los resultados se analizaron a continuación utilizando un archivo de Microsoft Excel para calcular la relación FAM/PR1 para las reacciones TaqMan de la β-actina. Para la Macro TaqMan convencional, se determinaron las muestras positivas para el ADN diana usando los cálculos descritos en el protocolo proporcionado por el fabricante (Protocolo Taqman del Kit del Reactivo de la PCR). Se calculó la fuerza de la señal dividiendo la relación FAM/PR1 de las muestras por la relación FAM/PR1 de los controles. Se definió una reacción satisfactoria como una relación de la muestra por encima del nivel umbral de confianza del 99%.
III. Resultados
Inicialmente, se usó la AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) en las reacciones TaqMan y se produjeron relaciones FAM/PR1/Control de 1,5-2,0, en comparación con las relaciones de la reacción Macro TaqMan de 5,0-14,0. Aunque los resultados fueron positivos, se deseaba un aumento en la fuerza de la señal. Por tanto, se sustituyó la polimerasa AmpliTaq Gold con la polimerasa DyNAzyme debido a su termoestabilidad aumentada, corrección, y resistencia a las impurezas. Se utilizó una concentración de la Macro Taqman DyNAzyme normalizada de 0,025U/µl en los experimentos microfluídicos. Esta polimerasa cambia las relaciones FAM/ROX/Control de la DyNAzyme producida de 3,5-5,8. Se mejoró la fuerza de la señal, pero fue difícil conseguir resultados consistentes. Debido a que se sabe que algunas proteínas se adhieren a PDMS, se aumentó la concentración de la polimerasa y se incluyeron aditivos modificadores superficiales. Se probaron dos concentración es aumentadas de DyNAzyme, 8x (0,2 U/µl) y 4x (0,1 U/µl) la concentración normalizada para la Macro TaqMan, con 100 pg o 10 pg de ADN genómico por nl en el dispositivo microfluídico. Se añadieron Gelatina, Glicerol y Triton-x100 al 0,5% para evitar la unión de la polimerasa al PDMS. En la FIG. 8 se muestran los resultados de las reacciones en el dispositivo microfluídico (chip) y los controles de la Macro TaqMan.
Las relaciones de la reacción TaqMan microfluídica varían de 4,9-8,3, mientras que las reacciones TaqMan varían de 7,7-9,7. Por tanto, la fuerza de la señal de las reacciones Taqman en el chip es de hasta un 87% de las reacciones Macro TaqMan. No hubo diferencia significativa entre 4x o 8x DyNAzyme. Los resultados demuestran que se pueden llevar a cabo las reacciones de la PCR con más de un 50% de fuerza en la señal, cuando se comparan con las reacciones Macro TaqMan, en los dispositivos microfluídicos. Los resultados han sido consistentes a lo largo de cuatro intentos.
Ejemplo 2
Reactivos de moteado
I. Introducción
El objetivo del experimento era demostrar reacciones de moteado de la PCR satisfactorias en un dispositivo
microfluídico. El término “moteado” en este contexto, se refiere a la colocación de gotículas pequeñas de reactivos
(motas) sobre un sustrato que a continuación se ensambla para llegar a ser parte de un dispositivo microfluídico. Los reactivos moteados son generalmente un subconjunto de la mezcla de reactivos requerida para levar a cabo la PCR.
II. Procedimiento
A. Moteado de reactivos
Se llevó a cabo el moteado rutinario de los reactivos mediante un procedimiento de impresión por contacto. Los reactivos se repicaron a partir de un conjunto de pocillos fuente sobre clavijas metálicas, y se depositaron poniendo en contacto las clavijas con un sustrato diana. Este procedimiento de impresión se reseña adicionalmente en la FIG.9. Tal como se muestra, los reactivos se repicaron a partir de una fuente (por ejemplo, placas de microvaloración), y a continuación se imprimieron poniendo la clavija cargada en contacto con el sustrato. La etapa de lavado consta de agitación en agua desionizada seguida por secado a vacío. El sistema utilizado para imprimir las motas de reactivo es un Cartesian Technologies MicroSys 5100 (Irvine, CA), que emplea clavijas marcadas TeleChem “ChipMaker”, aunque se pueden utilizar otros sistemas tal como se ha descrito más arriba.
Las clavijas empleadas son 4 clavijas Telechem ChipMaker, que incorporan una ranura de expansión electrofresada (véase la FIG. 9) para aumentar el volumen de captación (y por tanto, el número de motas imprimibles). En las condiciones de funcionamiento empleadas (normalmente, una humedad relativa del 75% y una temperatura de aproximadamente 25º C), se imprimieron más de cien motas por clavija, por ciclo de carga. En las condiciones Anteriores, el volumen de reactivos moteados sobre el sustrato PDMS es del orden de 0,1 nl.
Las dimensiones de la punta de la clavija son 125 x 125 µm. La mota final de reactivo seco es sustancialmente más pequeña que esta (tan pequeña como 7 µm de diámetro), además, el tamaño de la clavija define un límite más pequeño para que la separación de la mota sea fácilmente conseguible. La separación conseguible determina el paso de pocillo a pocillo más pequeño en el dispositivo final. Utilizando dicho dispositivo y los procedimientos anteriores, se han conseguido matrices con separaciones de 180 µm. las matrices desarrolladas en los chips de trabajo tienen separaciones de 600 a 1300 micrómetros.
Se llevó a cabo el moteado utilizando solo una clavija a la vez. El sistema en uso, sin embargo, tiene un cabezal de clavija que puede acomodar hasta 32 clavijas. La impresión de un chip de tamaño normalizado (dimensiones de la matriz del orden de 20 x 25 mm) tarda alrededor de 5 minutos.
B. Ensamblaje de los chips moteados
Las capas de flujo y de control de los dispositivos de la PCR se ensamblan de acuerdo con los procedimientos MSL habituales descritos anteriormente. El diseño del dispositivo microfluídico es el mismo que uno descrito en el Ejemplo 1. En paralelo, una capa de sustrato compuesta de PDMS de 150 µm de espesor con una relación de componentes A:B de 30:1 se formó revistiendo mediante giro una oblea de silicio sin grabar, y a continuación se endureció durante 90 minutos a 80º C.
La capa de sustrato endurecido sin grabar de PDMS (capa de sellado/sustrato 724 de la FIG. 7A) sirve como diana para el moteado del reactivo. Los modelos de motas se imprimen sobre el sustrato, que es todavía la oblea sin grabar. Los reactivos moteados para las reacciones de la PCR fueron los cebadores y las sondas, específicos del gen concreto que se va a amplificar. El reactivo moteado incluyó una relación volumétrica 1:1:1 de cebador directo de la β-actina 300 nM (FP), cebador inverso de la β-actina 300 nM (RP), y sonda de la β-actina 200 nM (Prb). En algunos casos, es útil afinar la química concentrando la mezcla moteada. Se ha encontrado que ajustando las concentraciones de tal manera que las concentraciones del cebador y la sonda son iguales a, o ligeramente mayores que los valores normales de la receta macroscópica, se da lugar a resultados consistentemente buenos. Por tanto, el reactivo moteado se concentra para ser 3 veces y 4 veces la concentración de la macrorreación. Se llevó a cabo la concentración de los reactivos en un Centrivap calentado y una centrífuga evacuada y no se alteran las relaciones relativas FP:RP:Prb. El aumento de la concentración de motas dio como resultado una concentración final correcta cuando los reactivos se volvieron a suspender en un volumen de reacción. Los reactivos moteados no necesitan limitarse a cebadores y sondas, ni se deben motear los tres (FP, RP y Prb). Se pueden llevar a cabo aplicaciones en las que solo la sonda, o incluso uno de los cebadores, se motean. Se han llevado a cabo experimento en los que los conjuntos de muestras de cebador/sonda moteadas fueron la β-actina de TaqMan y ARNasa-p de TaqMan.
Tras el procedimiento de moteado sobre la capa de sustrato, se alinearon el flujo combinado y las capas de control /es decir, las capas 720 y 722 de la FIG. 7A) con el modelo de mota y se pusieron en contacto. Se utilizó un endurecimiento adicional a 80º C, durante 60-90 minutos, para unir el sustrato al resto del chip. Después que se había ensamblado el chip, se inyectaron los componentes restantes de la reacción de la PCR (descrito en el Ejemplo 1) en los canales de flujo del chip y se sometió a termociclación el chip tal como se ha descrito en el Ejemplo 1.
III. Resultados
Se han llevado a cabo de forma satisfactoria y repetible las reacciones de la PCR utilizando dispositivos en los se motean las moléculas del cebador (cebadores directo e inverso) y la sonda: En la FIG. 10 se muestra un ejemplo de datos procedente de un chip en el que se ha llevado a cabo satisfactoriamente una reacción. Los reactivos moteados han dado como resultado reacciones de la PCR satisfactorias tal como se ha definido en el Ejemplo 1. Se han llevado a cabo reacciones satisfactorias utilizando protocolos de termociclación de 2 etapas y 3 etapas.
Ejemplo 3
Genotipación
I. Introducción
El objetivo de los siguientes experimentos fue demostrar que se pueden llevar a cabo experimentos de genotipación utilizando un dispositivo o chip microfluídico tal como se describe en la presente memoria. De forma específica, estos experimentos se diseñaron para determinar si las reacciones llevadas a cabo en el dispositivo tenían suficiente sensibilidad y para asegurar que se pueden llevar a cabo los diferentes conjuntos de cebador/sonda, además de la β-actina, en el dispositivo microfluídico.
II. Procedimientos/Resultados
A. Experimento de la ARNasa P
Se llevaron a cabo las reacciones TaqMan de la ARNasa P (Applied Biosystems; Foster City, CA) en un dispositivo microfluídico tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 para demostrar que los diferentes conjuntos de cebador/sonda producen resultados detectables. Las reacciones de la ARNasa P requieren también un mayor nivel de sensibilidad debido a que el conjunto de cebador/sonda de la ARNasa P detecta una única copia del gen (2 copias/genoma) en contraste con el conjunto de cebador/sonda de la β-actina. El conjunto de la β-actina detecta una única copia del gen de la β-actina y algunos pseudogenes, que en conjunto suman un total de 17 copias por genoma. Se llevaron a cabo las reacciones de la ARNasa P con los mismos componentes tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, con la excepción de que el conjunto de cebador/sonda de la β-actina se sustituyó con el conjunto de cebador/sonda de la ARNasa P. Además, el conjunto de cebador/sonda de la ARNasa P se utilizó a 4x el valor recomendado por el fabricante para potenciar la señal de fluorescencia. Se conjugó el colorante VIC con la sonda para la ARNasa P y se focalizó el análisis sobre las relaciones VIC/PR1. En la FIG. 11 se muestran los resultados de uno de cuatro experimentos.
Las relaciones VIC/PR1/Control para las reacciones Macro TaqMan son 1,23. Las relaciones correspondientes para las reacciones TaqMan en el dispositivo microfluídico son 1,11 y 1,21. Las relaciones de las muestras de ADN genómico en el dispositivo microfluídico están por encima del 99% de confianza del nivel umbral. Además, la fuerza de la señal de las reacciones TaqMan en el dispositivo microfluídico es del 50% y del 93,7% de las reacciones Macro TaqMan. Las reacciones TaqMan control en el dispositivo microfluídico tienen desviaciones estándar de 0,006 y 0,012, demostrando consistencia en las reacciones a través del dispositivo microfluídico. Por tanto, se determinó que las reacciones Taqman en el chip eran suficientemente sensibles para detectar 2 copias por genoma.
B. Experimento de dilución del ADN
Para determinar adicionalmente la sensibilidad de las reacciones TaqMan en el dispositivo microfluídico, se ensayaron diluciones de ADN genómico utilizando el conjunto de cebador/sonda de la β-actina. Las composiciones de reacción se compusieron generalmente tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 utilizando 4x DyNazyme y diluciones de ADN genómico. El ADN genómico se diluyó a 0,25 pg/nl, que corresponde a aproximadamente 1 copia por nl. En la FIG. 12 se muestra el resultado de una dilución en serie.
De acuerdo con una distribución de Poisson, el 37% del número total de pocillos debe ser negativo si el número diana promedio es uno. Los números de pocillos 5, 6 y 7 están por debajo del umbral calculado y, por tanto, negativo. Esto sugiere que las reacciones TaqMan de la β-actina en el chip microfluídico pueden detectar un promedio de una copia por nl. Por tanto, la sensibilidad de las reacciones en el dispositivo microfluídico es suficiente para llevar a cabo los experimentos de genotipación.
C. Experimento de genotipación
Debido a que la TaqMan en el dispositivo microfluídico es capaz de detectar números diana bajos, se llevó a cabo elensayo de genotipación del SNP (Polimorfismo de Nucleótido Único) utilizando el kit de Discriminación Alélica Predeterminada (Applied Biosystems; Foster City, CA) frente al gen del citocromo P450 de CYP2D6. El kit contiene un conjunto de cebador y dos sondas; FAM marcada para el alelo natural o de referencia, CYP2D6*1, y VIC marcada para el alelo mutante o variante CYP2D6*3. Se ensayaron productos de la PCR como controles positivos para cada alelo junto con el ADN genómico en el dispositivo utilizando las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 1. En las FIGS. 13 y 14 se muestran los resultados de un experimento. Se ha repetido el experimento al menos tres veces para validar los resultados y para demostrar la fiabilidad.
Tal como se muestra en la FIG. 13, el ADN de Al-1 (Alelo 1, alelo natural CYP2D6*1) y genómico (100 pg/nl) produjeron una relación VIC/PR1/Control promedio de 3,5 y 2,2, respectivamente, indicando que el ADN genómico era positivo para el alelo natural CYP2D6*1: Estos valores están por encima del límite umbral para las reacciones. La fuerza de la señal de las reacciones TaqMan en el dispositivo microfluídico es del 59% y el 40% de los controles de la Macro TaqMan, respectivamente. Al-2 (Alelo 2, el alelo mutante o variante CYP2D6*3), que debe ser negativo en el canal VIC, mostro algo de señal sobre el control (1.5) debido posiblemente al escape de fluorescencia FAM en el canal VIC del detector. Se puede minimizar el escape con un procedimiento de detección mejorado.
El control positivo de Al-2 proporciona una relación FAM/PR1/Control promedio de 3,0, que era el 37% de la señal de la Macro TaqMan y estaba por encima del límite umbral calculado (véase la FIG. 14). Las muestras genómicas fueron negativas para el alelo mutante CYP2D6*3, un resultado esperado debido a que la frecuencia del alelo CYP2D6*3 es baja. De nuevo, parece que existe algún escape de la sonda VIC de Al-1 en el canal FAM del detector. Globalmente, las reacciones de detección de SNP fueron satisfactorias en el dispositivo microfluídico.
Ejemplo 4
Verificación de la PCR mediante electroforesis en gel
I. Introducción
Como un procedimiento alternativo para demostrar que se producía la amplificación del ADN en el dispositivo microfluídico, se llevó a cabo un experimento para detectar el producto de la PCR mediante electroforesis en gel. Las composiciones de las reacciones de la PCR fueron tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, excepto en que se omitió la sonda TaqMan y el cebador directo de la β-actina se conjugó con FAM.
II. Procedimiento
A. Dispositivo microfluídico
Se diseñó un dispositivo microfluídico de tres capas, fabricado utilizando el procedimiento MSL, y fabricado a su vez para llevar a cabo los experimentos descritos en este ejemplo, la FIG. 15 muestra una vista esquemática del diseño. El dispositivo 1500 consiste generalmente de una región de la muestra 1502 y una región control 1504, La región de la muestra 1502 contiene trescientos cuarenta y uno sitios de reacción de 1 nl 1508 representados por rectángulos dispuestos junto al canal de flujo 1506, que incluye una vía de entrada 1510 y una vía de salida 1512. La región control 1504 contiene tres canales de flujo control 1514 conteniendo cada uno diez sitios de reacción de 1 nl 1518, representados también por los rectángulos y una vía de entrada 1516. Una red de líneas de control 1522 aísla cada sitio de reacción 1508, 1518, cuando se aplica una presión suficiente a la vía de entrada 1524. Se incluyen una serie de canales de protección 1520 para evitar la evaporación del líquido de los sitios de reacción 1508, 1518. El dispositivo es un dispositivo de tres capas tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 (véase la FIG. 7A). El chip completo se coloca sobre un cubre.
B. Configuración experimental
Se cargó el dispositivo microfluídico 1500 y se sometió a termociclación utilizando el perfil de temperatura 3 descrito en el Ejemplo 1. La muestra de reacción restante se sometió a termociclación en el GeneAmp 9700 con el mismo perfil de termociclación que para el dispositivo microfluídico 1500. Los productos de reacción se recuperaron después que se completó la termociclación. Para recuperar el ADN amplificado, se inyectaron 3 µl de agua en la vía de entrada de la muestra 1506 y se retiraron 3-4 µl de producto de la vía de salida 1512. Los productos de reacción procedentes del dispositivo 1500 y de la reacción Macro se trataron con 2 µl de ExoSAP-IT (USB, Cleveland, OH) que está compuesto de ADN Exonucleasa y Fosfatasa Alcalina de Camarón, para eliminar los nucleótidos y cebadores en exceso. El producto Macro se diluyó desde 1.10 a 1:106. El producto procedente del dispositivo 1500 se deshidrató y se volvió a suspender en 4 µl de formamida.
III. Resultados
Se analizaron ambos productos, junto con los controles negativos, sobre un gel de poliacrilamida. La FIG.15 muestra los resultados de la electroforesis en gel. En la FIG.16 se observa una banda de ADN de tamaño adecuado de 294 pares de bases de longitud.
Los productos procedentes de las reacciones Macro se muestran a la izquierda del gel y corresponden a aproximadamente 294 pares de base, el tamaño esperado del producto de la PCR de la β-actina. Los controles negativos carecen del producto de la PCR. De forma similar, el producto derivado procedente del dispositivo proporciona el producto de la PCR de la β-actina esperado. Por tanto, se amplificó el ADN diana en el dispositivo microfluídico.

Claims (49)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un dispositivo microfluídico (200), que comprende componentes elastoméricos, y que tiene un canal de flujo (204, 702), en el que dicho canal de flujo tiene una pluralidad de canales de flujo ciego (206) que se abren hacia el interior y están en comunicación de fluidos con el canal de flujo, caracterizándose cada canal de flujo ciego por tener una parte de apertura, una parte de canal, y una parte final, y en el que una región del final de cada canal de flujo ciego define un sitio de reacción (208, 706), en el que cada canal de flujo ciego está asociado con una válvula (212) que cuando se cierra aísla el sitio de reacción del canal de flujo, y caracterizado por que las válvulas asociadas con cada una de la pluralidad de canales de flujo ciego en comunicación de fluidos con el canal de flujo están bajo el control de un canal de control común (210, 712) y se cierran o abren de forma coordinada.
  2. 2.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 1, en el que el canal de control solapa e intersecta cada canal de flujo ciego (204), en el que la válvula (212) separa el canal de control del canal de flujo ciego en cada intersección, y en el que dicha válvula comprende un material elastomérico dispuesto para desviarse en o retirarse del canal de flujo ciego en respuesta a una fuerza de acción.
  3. 3.
    Un dispositivo microfluídico de cualquier reivindicación anterior, en el que el canal de flujo (204) es uno de una pluralidad de canales de flujo (304, 404, 702), cada canal de flujo por separado está en comunicación de fluidos con una pluralidad de canales de flujo ciego que se derivan de los anteriores, en el que las válvulas asociadas con un canal de flujo individual están bajo el control de un canal de control común (310, 410, 712) y se cierra o abre de forma coordinada.
  4. 4.
    El dispositivo microfluídico de la reivindicación 3 en el que la pluralidad de canales de flujo está dispuesta de tal manera que los canales de flujo son sustancialmente paralelos entre sí.
  5. 5.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 3, en el que la pluralidad de canales de flujo (304) está interconectada entre sí de tal manera que se puede introducir fluido en cada uno de los sitios de reacción mediante una única entrada (314).
  6. 6.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 5, en el que:
    la pluralidad de canales de flujo comprende.
    (i)
    una pluralidad de canales de flujo vertical;
    (ii)
    una pluralidad de canales de flujo horizontal, estando un extremo de cada canal de flujo horizontal en comunicación de fluidos con uno de los canales de flujo vertical y estando el otro extremo de cada canal de flujo horizontal en comunicación de fluidos con otro de los canales de flujo vertical, en el que el fluido puede fluir desde un canal de flujo horizontal a otro canal de flujo horizontal mediante los canales de flujo vertical. los canales de flujo de derivatización son sustancialmente perpendiculares a los canales de flujo horizontal.
  7. 7.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 5, en el que los canales de flujo ciego (306) que se derivan de los canales de flujo adyacentes (304) están intercalados entre sí.
  8. 8.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 3, en el que la pluralidad de canales de flujo (404) están aislados entre sí de tal manera que el fluido introducido en un canal de flujo no puede fluir a otro canal de flujo, y cada canal de flujo comprende una única entrada (414) en un extremo en el que se puede introducir el fluido.
  9. 9.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 3, en el que cada uno de una pluralidad de canales de flujo tiene dos extremos, la pluralidad de canales de flujo están aislados entre sí de tal manera que el fluido introducido en un canal de flujo no puede fluir a otro canal de flujo, y cada canal de flujo comprende una entrada localizada en cada extremo.
  10. 10.
    Un dispositivo microfluídico de cualquier reivindicación anterior que comprende además una pluralidad de canales de protección (716) formados en el interior del material elastomérico y que solapa uno o más de los canales de flujo o ramificación y/o uno o más de los sitios de reacción
  11. 11.
    Un dispositivo microfluídico de cualquier reivindicación anterior, que comprende además uno o más reactivos depositados en el interior de cada uno de los sitios de reacción, en el que opcionalmente, el reactivo o reactivos se depositan de forma no covalente.
  12. 12.
    Un dispositivo microfluídico de cualquier reivindicación anterior que comprende una matriz de sitios de reacción que tiene una densidad de al menos 50 sitios/cm2.
  13. 13.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 12, en el que la matriz de sitios de reacción se forma en el interior de un material elastomérico.
  14. 14.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que la densidad es al menos de 250 sitios/cm2, preferiblemente al menos 500 sitios/cm2, por ejemplo, al menos 1000 sitios/cm2.
  15. 15.
    Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que cada sitio de reacción está formado en el interior de un sustrato elastomérico y comprende un reactivo para llevar a cabo depositado de forma no covalente en el anterior.
  16. 16.
    Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en el que cada sitio de reacción está formado en el interior de un sustrato elastomérico y comprende un reactivo para llevar a cabo una reacción depositado de forma covalente en el anterior.
  17. 17.
    un dispositivo microfluídico de la reivindicación 16, en el que el reactivo está unido al sustrato mediante un enlazador, en el que opcionalmente, el enlazador es:
    (i)
    un enlazador fotolábil; o
    (ii)
    un enlazador termolábil.
  18. 18.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 15, en el que el reactivo comprende uno o más reactivos para llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico, en el que opcionalmente, el reactivo comprende:
    (i)
    un cebador, polimerasa y/o uno o más nucleótidos, o
    (ii)
    un molde de ácido nucleico.
  19. 19.
    Un dispositivo microfluídico de cualquier reivindicación anterior en el que el material elastomérico tiene un módulo de Young en el intervalo de 20 Pa a 1 GPa.
  20. 20.
    Un procedimiento para llevar a cabo un análisis, que comprende:
    (a) proporcionar un dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19;
    (b) introducir una disolución en cada uno de los sitios de reacción, en el que la disolución comprende al menos un reactivo;
    (c)
    aislar los sitios de reacción cerrando dichas válvulas asociadas con los sitios de reacción;
    (d)
    detectar una reacción en uno o más de los sitios de reacción aislados.
  21. 21.
    Un procedimiento de la reivindicación 20, que comprende además calentar el al menos un reactivo en el interior de los sitios de reacción.
  22. 22.
    Un procedimiento de la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el que el al menos un reactivo comprende una mezcla de reacción, en el que opcionalmente la mezcla de reacción comprende:
    (i)
    los componentes de una reacción de amplificación del ácido nucleico; o
    (ii)
    los componentes de un ensayo de actividad de la enzima.
  23. 23.
    Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que el al menos un reactivo se mezcla con un reactivo depositado en cada uno de los sitios de reacción para formar una mezcla de reacción, en el que el opcionalmente el al menos un reactivo comprende.
    (i)
    un molde de ácido nucleico y el reactivo depositado comprenden uno o más componente de una reacción de amplificación del ácido nucleico, o
    (ii)
    uno o más componentes de una reacción de amplificación del ácido nucleico y del reactivo depositado comprenden un molde de ácido nucleico.
  24. 24.
    Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23:
    en el que el canal de flujo es uno de una pluralidad de canales de flujo, estando cada uno en comunicación de fluidos con múltiples canales de flujo ciego; y en el que la pluralidad de canales de flujo están interconectados con otro de tal manera que se puede introducir el fluido en cada uno de los sitios de reacción mediante una única entrada, el al menos un reactivo se introduce mediante una única entrada.
  25. 25.
    Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que existen al menos 100 sitios de reacción, en el que opcionalmente existen al menos 1.000 sitios de reacción, preferiblemente al menos 10.000 sitios de reacción, por ejemplo, al menos 100.000 sitios de reacción.
  26. 26.
    Un procedimiento de la reivindicación 24 o la reivindicación 25, en el que un primer agente se introduce mediante la única entrada en cada uno de los sitios de reacción y se deposita un segundo reactivo en cada uno de los sitios de reacción, diferentes sitios de reacción que tienen diferentes segundos reactivos, dando como resultado por tanto una reacción diferente que implica el primer reactivo en cada uno de los diferentes sitios de reacción, en el que opcionalmente, los diferentes segundos reactivos comprenden diferentes cebadores de ácido nucleico y el al menos un reactivo comprende un molde de ácido nucleico.
  27. 27.
    Un procedimiento de la reivindicación 20, en el que:
    el al menos un canal de flujo es uno de una pluralidad de canales de flujo, estando cada uno de los canales de flujo en comunicación de fluidos con uno o más de los canales de flujo ciego; la pluralidad de canales de flujo están aislados entre sí de tal manera que el fluido introducido en un canal de flujo no puede fluir a otro canal de flujo; y la introducción comprende introducir por separado el al menos un reactivo en cada uno de la pluralidad de canales de flujo.
  28. 28.
    Un procedimiento de la reivindicación 27, en el que:
    se introduce un primer reactivo en cada canal de flujo; los sitios de reacción en comunicación de fluidos con cada canal de flujo contienen un segundo reactivo, difiriendo los segundos reactivo entre los sitios de reacción en comunicación de fluidos con los diferentes canales de flujo; la introducción comprende introducir el primer reactivo en cada uno de los canales de flujo, en el que opcionalmente los diferentes segundos reactivos comprenden diferentes cebadores de ácido nucleico y el primer reactivo comprende un molde de ácido nucleico.
  29. 29.
    Un procedimiento de la reivindicación 20 en el que:
    los sitios de reacción del dispositivo microfluídico de la etapa (a) comprenden un primer reactivo para llevar a cabo un análisis, y dicho primer reactivo se deposita de forma no covalente sobre un sustrato elastomérico; el primer reactivo y el reactivo en disolución se mezclan para formar una mezcla de reacción tras la introducción de disolución de acuerdo con la etapa (b), y la reacción detectada está entre el primer reactivo y el reactivo de la disolución.
  30. 30.
    Un procedimiento de la reivindicación 29, que comprende además calentar la mezcla de reacción.
  31. 31.
    Un procedimiento de la reivindicación 29 o la reivindicación 30, en el que la introducción del segundo reactivo da lugar a la suspensión del primer reactivo en el sitio de reacción.
  32. 32.
    Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, en el que el uno o más sitios de reacción es una matriz de sitios de reacción.
  33. 33.
    Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en el que el análisis es un análisis de ácido nucleico, el primer reactivo es un reactivo que interactúa con un ácido nucleico y el segundo reactivo es un ácido nucleico de prueba, en el que opcionalmente el análisis es una reacción de amplificación del ácido nucleico, el primer reactivo comprende uno o más reactivos para llevar a cabo la reacción de amplificación del ácido nucleico y el segundo reactivo es un molde de ácido nucleico.
  34. 34.
    Un procedimiento de la reivindicación 33, en el que:
    los sitios de reacción son una matriz de sitios de reacción; diferentes reactivos de amplificación del ácido nucleico están presente en diferentes sitios de reacción; y se introduce el mismo molde de ácido nucleico en cada uno de los sitios de reacción.
  35. 35.
    Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 22, 23, 33 y 34 en el que el procedimiento comprende además someter a termociclación la mezcla de reacción.
  36. 36.
    Un procedimiento de la reivindicación 29, en el que el análisis es un análisis de proteínas, el primer reactivo es un potencial ligando de proteínas, y el segundo reactivo es una proteína de prueba, en el que opcionalmente, el potencial ligando de proteínas se selecciona entre el grupo que consiste en una proteína, un anticuerpo, un sustrato de enzima, un cofactor enzimático, y un inhibidor enzimático.
  37. 37.
    Un procedimiento de la reivindicación 29, en el que el análisis es un análisis celular, el primer reactivo es un reactivo que reacciona potencialmente con la célula, y el segundo reactivo es una célula de ensayo.
  38. 38.
    Un procedimiento de la reivindicación 33 en el que el primer reactivo comprende además uno o más aditivos seleccionados entre el grupo que consiste en gelatina, glicerol y un detergente.
  39. 39.
    Un procedimiento de la reivindicación 20 en el que dicho dispositivo microfluídico comprende una matriz de sitios de reacción formada en el interior de un sustrato y que tiene una densidad de al menos 50 sitios/cm2.
  40. 40.
    Un procedimiento de la reivindicación 39, en el que la matriz tiene una densidad de al menos 250 sitios/cm2, preferiblemente en el que la matriz tiene una densidad de al menos 500 sitios/cm2, por ejemplo, de al menos 1000 sitios/cm2.
  41. 41.
    Un procedimiento de la reivindicación 20 en el que dicho dispositivo microfluídico comprende al menos un sitio de reacción que está formado en el interior de un sustrato elastomérico y una pluralidad de canales de protección formados también en el interior del sustrato elastomérico y en el que dicho procedimiento comprende:
    (c)
    (i) calentar el al menos un reactivo en el interior de al menos uno de los sitios de reacción; y
    (c)
    (ii) hacer fluir un fluido a través de los canales de protección antes o durante el calentamiento para reducir la evaporación procedente del al menos un sitio de reacción.
  42. 42.
    Un procedimiento de la reivindicación 41, en el que:
    la introducción comprende introducir un molde de ácido nucleico en el al menos un sitio de reacción, a la vez que el molde de ácido nucleico se mezcla con uno o más reactivos de amplificación del ácido nucleico en el al menos un sitio de reacción el calentamiento comprende someter a termociclación el molde de ácido nucleico y los reactivos de amplificación para formar un producto amplificado; la detección comprende detectar el producto amplificado.
  43. 43.
    Un procedimiento de la reivindicación 41 o la reivindicación 42, en el que:
    (i)
    el fluido es una disolución acuosa; o
    (ii)
    el fluido es un compuesto hidrófobo, opcionalmente un aceite.
  44. 44.
    Un dispositivo microfluídico de las reivindicaciones 1 a 18 que comprende:
    (a)
    una cavidad que es parte de una red microfluídica formada en un sustrato elastomérico; y
    (b)
    una pluralidad de canales de protección que solapan la cavidad y se separan de la cavidad mediante una membrana elastomérica, en el que cada canal de protección está dimensionado (i) para permitir a la disolución fluir a su través, y (ii) de tal manera que no existe una reducción sustancial en el flujo de la disolución dentro, fuera o a través de la cavidad debido a la desviación de la(s) membrana(s) tras la aplicación de una fuerza de acción a los canales de protección.
  45. 45.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 44, en el que la cavidad es:
    (i)
    un canal de flujo; o
    (ii)
    una cámara de reacción
  46. 46.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 44 o la reivindicación 45 en el que los canales de protección tienen un área de la sección transversal de menos de 50.000 µm2, en el que opcionalmente el área de la sección transversal es menor de 10.000 µm2, preferiblemente menor de 1.000 µm2, por ejemplo, menor de 100 µm2.
  47. 47.
    un dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende:
    (a)
    un sistema microfluídico que comprende uno o más canales de flujo y/o uno o más sitios de reacción; y
    (b)
    una pluralidad de canales de protección que solapas el sistema microfluídico y se separan del anterior mediante un elastómero, en el que la separación borde a borde entre los canales de protección es de entre 1 µm y 1 mm.
  48. 48.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 47, en el que la separación es de entre 5 µm y 500 µm, en el que opcionalmente la separación es de entre 10 µm y 100 µm, preferiblemente entre 40 µm y 75 µm.
  49. 49.
    Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 18 en el que el reactivo comprende además uno o más aditivos seleccionados entre el grupo seleccionado entre gelatina, glicerol y un detergente.
ES02786834T 2001-11-30 2002-11-27 Dispositivo microfluídico y procedimientos de utilización del mismo Expired - Lifetime ES2403560T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33529201P 2001-11-30 2001-11-30
US335292P 2001-11-30
US39152902P 2002-06-24 2002-06-24
US391529P 2002-06-24
PCT/US2002/038363 WO2003048295A1 (en) 2001-11-30 2002-11-27 Microfluidic device and methods of using same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2403560T3 true ES2403560T3 (es) 2013-05-20

Family

ID=26989636

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02786834T Expired - Lifetime ES2403560T3 (es) 2001-11-30 2002-11-27 Dispositivo microfluídico y procedimientos de utilización del mismo

Country Status (7)

Country Link
US (5) US7118910B2 (es)
EP (2) EP1463796B1 (es)
JP (2) JP4355210B2 (es)
AU (1) AU2002351187A1 (es)
CA (1) CA2467587A1 (es)
ES (1) ES2403560T3 (es)
WO (1) WO2003048295A1 (es)

Families Citing this family (338)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6048734A (en) 1995-09-15 2000-04-11 The Regents Of The University Of Michigan Thermal microvalves in a fluid flow method
US6221654B1 (en) 1996-09-25 2001-04-24 California Institute Of Technology Method and apparatus for analysis and sorting of polynucleotides based on size
US6833242B2 (en) * 1997-09-23 2004-12-21 California Institute Of Technology Methods for detecting and sorting polynucleotides based on size
US7056661B2 (en) * 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US7144616B1 (en) 1999-06-28 2006-12-05 California Institute Of Technology Microfabricated elastomeric valve and pump systems
US8709153B2 (en) 1999-06-28 2014-04-29 California Institute Of Technology Microfludic protein crystallography techniques
DE60000109T2 (de) * 1999-06-28 2002-11-07 California Institute Of Technology, Pasadena Elastomerische mikropumpen- und mikroventilsysteme
US7459022B2 (en) 2001-04-06 2008-12-02 California Institute Of Technology Microfluidic protein crystallography
US7306672B2 (en) 2001-04-06 2007-12-11 California Institute Of Technology Microfluidic free interface diffusion techniques
US6432290B1 (en) 1999-11-26 2002-08-13 The Governors Of The University Of Alberta Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems
US7867763B2 (en) 2004-01-25 2011-01-11 Fluidigm Corporation Integrated chip carriers with thermocycler interfaces and methods of using the same
US7351376B1 (en) 2000-06-05 2008-04-01 California Institute Of Technology Integrated active flux microfluidic devices and methods
US7087414B2 (en) * 2000-06-06 2006-08-08 Applera Corporation Methods and devices for multiplexing amplification reactions
EP1334347A1 (en) 2000-09-15 2003-08-13 California Institute Of Technology Microfabricated crossflow devices and methods
AU2002230524A1 (en) 2000-11-16 2002-05-27 California Institute Of Technology Apparatus and methods for conducting assays and high throughput screening
US6692700B2 (en) 2001-02-14 2004-02-17 Handylab, Inc. Heat-reduction methods and systems related to microfluidic devices
US7323140B2 (en) 2001-03-28 2008-01-29 Handylab, Inc. Moving microdroplets in a microfluidic device
US6852287B2 (en) 2001-09-12 2005-02-08 Handylab, Inc. Microfluidic devices having a reduced number of input and output connections
US7829025B2 (en) 2001-03-28 2010-11-09 Venture Lending & Leasing Iv, Inc. Systems and methods for thermal actuation of microfluidic devices
US8895311B1 (en) 2001-03-28 2014-11-25 Handylab, Inc. Methods and systems for control of general purpose microfluidic devices
US7010391B2 (en) 2001-03-28 2006-03-07 Handylab, Inc. Methods and systems for control of microfluidic devices
EP1384022A4 (en) 2001-04-06 2004-08-04 California Inst Of Techn AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID USING MICROFLUIDIC DEVICES
WO2002083852A2 (en) * 2001-04-10 2002-10-24 Bioprocessors Corporation Microfermentor device and cell based screening method
EP1463796B1 (en) 2001-11-30 2013-01-09 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
US7691333B2 (en) 2001-11-30 2010-04-06 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
EP2666849A3 (en) 2002-04-01 2014-05-28 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
US20070065808A1 (en) * 2002-04-17 2007-03-22 Cytonome, Inc. Method and apparatus for sorting particles
US6808075B2 (en) 2002-04-17 2004-10-26 Cytonome, Inc. Method and apparatus for sorting particles
US9943847B2 (en) 2002-04-17 2018-04-17 Cytonome/St, Llc Microfluidic system including a bubble valve for regulating fluid flow through a microchannel
US6976590B2 (en) 2002-06-24 2005-12-20 Cytonome, Inc. Method and apparatus for sorting particles
US7452712B2 (en) 2002-07-30 2008-11-18 Applied Biosystems Inc. Sample block apparatus and method of maintaining a microcard on a sample block
US7998699B2 (en) 2002-08-15 2011-08-16 University Of South Florida Early detection of pathogens in blood
AU2003282875A1 (en) 2002-09-25 2004-04-19 California Institute Of Technology Microfluidic large scale integration
US8220494B2 (en) 2002-09-25 2012-07-17 California Institute Of Technology Microfluidic large scale integration
JP5695287B2 (ja) 2002-10-02 2015-04-01 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 微小流体の核酸解析
EP2194147B1 (en) 2002-12-04 2015-07-22 Applied Biosystems, LLC Multiplex amplification of polynucleotides
GB0302302D0 (en) * 2003-01-31 2003-03-05 Glaxo Group Ltd Microfluidic apparatus and method
EP1611353B1 (en) * 2003-02-24 2012-07-11 Medipacs, Inc. Pulse activated actuator pump system
IL154677A0 (en) * 2003-02-27 2003-09-17 Univ Bar Ilan A method and apparatus for manipulating an individual cell
US6970240B2 (en) * 2003-03-10 2005-11-29 Applera Corporation Combination reader
US7041481B2 (en) 2003-03-14 2006-05-09 The Regents Of The University Of California Chemical amplification based on fluid partitioning
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
US7476363B2 (en) 2003-04-03 2009-01-13 Fluidigm Corporation Microfluidic devices and methods of using same
JP5419248B2 (ja) 2003-04-03 2014-02-19 フルイディグム コーポレイション マイクロ流体装置およびその使用方法
US7604965B2 (en) 2003-04-03 2009-10-20 Fluidigm Corporation Thermal reaction device and method for using the same
US8828663B2 (en) 2005-03-18 2014-09-09 Fluidigm Corporation Thermal reaction device and method for using the same
US20050145496A1 (en) * 2003-04-03 2005-07-07 Federico Goodsaid Thermal reaction device and method for using the same
EP1620203A2 (en) * 2003-04-10 2006-02-01 U.S. Genomics, Inc. Manipulation of polymers in a microchannel
AU2004240944A1 (en) 2003-05-20 2004-12-02 Fluidigm Corporation Method and system for microfluidic device and imaging thereof
US8597597B2 (en) 2003-06-26 2013-12-03 Seng Enterprises Ltd. Picoliter well holding device and method of making the same
US9200245B2 (en) * 2003-06-26 2015-12-01 Seng Enterprises Ltd. Multiwell plate
US7888110B2 (en) * 2003-06-26 2011-02-15 Seng Enterprises Ltd. Pico liter well holding device and method of making the same
EP3718635A1 (en) 2003-07-31 2020-10-07 Handylab, Inc. Processing particle-containing samples
EP1654387B1 (en) 2003-08-15 2009-05-06 University of South Florida Materials and methods for capture of pathogens and removal of aurintricarboxylic acid from a sample
US20070015289A1 (en) * 2003-09-19 2007-01-18 Kao H P Dispenser array spotting
US20050226779A1 (en) * 2003-09-19 2005-10-13 Oldham Mark F Vacuum assist for a microplate
US20050233472A1 (en) * 2003-09-19 2005-10-20 Kao H P Spotting high density plate using a banded format
US20050226771A1 (en) * 2003-09-19 2005-10-13 Lehto Dennis A High speed microplate transfer
US20050221358A1 (en) * 2003-09-19 2005-10-06 Carrillo Albert L Pressure chamber clamp mechanism
US7396677B2 (en) 2003-11-07 2008-07-08 Nanosphere, Inc. Method of preparing nucleic acids for detection
KR100580639B1 (ko) * 2003-12-30 2006-05-16 삼성전자주식회사 미세유체 검출을 위한 형광검출기
US7407799B2 (en) * 2004-01-16 2008-08-05 California Institute Of Technology Microfluidic chemostat
EP1561823A1 (de) * 2004-02-04 2005-08-10 Biotez Berlin-Buch GmbH Verfahren zum Nachweis von Einzelnukleotid-polymorphismen (SNP) in Genen des Arzneimittelmetabolismus und Testkit zur Durchführung des Verfahrens
US20070095393A1 (en) * 2004-03-30 2007-05-03 Piero Zucchelli Devices and methods for programmable microscale manipulation of fluids
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
US20050227350A1 (en) * 2004-04-13 2005-10-13 Agency For Science, Technology And Research Device and method for studying cell migration and deformation
WO2005107938A2 (en) * 2004-05-02 2005-11-17 Fluidigm Corporation Thermal reaction device and method for using the same
US8852862B2 (en) 2004-05-03 2014-10-07 Handylab, Inc. Method for processing polynucleotide-containing samples
CA2994321C (en) 2004-05-03 2023-08-08 Handylab, Inc. A microfluidic device and methods for processing polynucleotide-containing samples
US7622296B2 (en) 2004-05-28 2009-11-24 Wafergen, Inc. Apparatus and method for multiplex analysis
CN103884698B (zh) * 2004-06-07 2017-04-12 先锋生物科技股份有限公司 用于微流体器件的光学透镜系统和方法
WO2006005371A1 (en) * 2004-07-13 2006-01-19 Commissariat A L'energie Atomique Microfluidic device for performing a plurality of reactions and uses thereof
CA2475456A1 (en) * 2004-07-20 2006-01-20 Biophys, Inc. Method and device to optimize analyte and antibody substrate binding by least energy adsorption
CA2475240A1 (en) * 2004-07-20 2006-01-20 Biophys, Inc. Method and device to measure dynamic internal calibration true dose response curves
KR101214780B1 (ko) 2004-09-15 2012-12-21 인터젠엑스 인크. 미세유동 장치
GB0421529D0 (en) 2004-09-28 2004-10-27 Landegren Gene Technology Ab Microfluidic structure
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
EP1526372A3 (en) * 2004-11-02 2005-05-04 Agilent Technologies, Inc. Microfluidic system with adjustment for an optical detection
US20060094028A1 (en) * 2004-11-04 2006-05-04 Welch Allyn, Inc. Rapid diagnostic assay
US20080264863A1 (en) 2004-12-03 2008-10-30 California Institute Of Technology Microfluidic Sieve Valves
WO2006071470A2 (en) * 2004-12-03 2006-07-06 California Institute Of Technology Microfluidic devices with chemical reaction circuits
US9260693B2 (en) 2004-12-03 2016-02-16 Cytonome/St, Llc Actuation of parallel microfluidic arrays
KR100682920B1 (ko) 2005-01-20 2007-02-15 삼성전자주식회사 다중 바이오어세이용 미세유체 칩 및 그 제조방법
JP4643277B2 (ja) * 2005-01-24 2011-03-02 株式会社島津製作所 反応容器、遺伝子多型検出方法及び装置
ATE480324T1 (de) 2005-01-25 2010-09-15 Seng Entpr Ltd Mikrofluidische vorrichtung zur untersuchung zellen
US20060246493A1 (en) 2005-04-04 2006-11-02 Caliper Life Sciences, Inc. Method and apparatus for use in temperature controlled processing of microfluidic samples
US7883669B2 (en) 2005-04-20 2011-02-08 Fluidigm Corporation Analysis engine and database for manipulating parameters for fluidic systems on a chip
WO2007044091A2 (en) * 2005-06-02 2007-04-19 Fluidigm Corporation Analysis using microfluidic partitioning devices
JP2009501938A (ja) * 2005-07-18 2009-01-22 ユー．エス． ジェノミクス， インコーポレイテッド サンプルの調製および分析のための微小流動による方法および微小流動装置
US20070042406A1 (en) * 2005-07-18 2007-02-22 U.S. Genomics, Inc. Diffusion mediated clean-up of a target carrier fluid
US20070128083A1 (en) * 2005-07-18 2007-06-07 U.S. Genomics, Inc. Microfluidic methods and apparatuses for sample preparation and analysis
US20070054293A1 (en) * 2005-08-30 2007-03-08 California Institute Of Technology Microfluidic chaotic mixing systems and methods
EP1938101A2 (en) * 2005-09-13 2008-07-02 Fluidigm Corporation Microfluidic assay devices and methods
WO2007044917A2 (en) * 2005-10-11 2007-04-19 Handylab, Inc. Polynucleotide sample preparation device
US20070105206A1 (en) * 2005-10-19 2007-05-10 Chang Lu Fluidic device
WO2007052245A1 (en) 2005-11-03 2007-05-10 Seng Enterprises Ltd. Method and device for studying floating, living cells
US7913928B2 (en) 2005-11-04 2011-03-29 Alliant Techsystems Inc. Adaptive structures, systems incorporating same and related methods
US20080210748A1 (en) 2005-11-30 2008-09-04 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware, Systems and methods for receiving pathogen related information and responding
US20080241935A1 (en) 2007-03-27 2008-10-02 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Methods for pathogen detection
US20080241000A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-02 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Systems for pathogen detection
EP2364774A3 (en) 2006-01-11 2014-06-04 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic Devices And Methods Of Use In The Formation And Control Of Nanoreactors
EP2423334A3 (en) 2006-02-02 2012-04-18 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Non-invasive fetal genetic screening by digital analysis
JP5063616B2 (ja) 2006-02-03 2012-10-31 インテジェニックス インコーポレイテッド マイクロ流体デバイス
US7815868B1 (en) 2006-02-28 2010-10-19 Fluidigm Corporation Microfluidic reaction apparatus for high throughput screening
US10900066B2 (en) 2006-03-24 2021-01-26 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US8883490B2 (en) 2006-03-24 2014-11-11 Handylab, Inc. Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system
US8088616B2 (en) 2006-03-24 2012-01-03 Handylab, Inc. Heater unit for microfluidic diagnostic system
US7998708B2 (en) 2006-03-24 2011-08-16 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
ES2692380T3 (es) 2006-03-24 2018-12-03 Handylab, Inc. Método para realizar PCR con un cartucho con varias pistas
US11806718B2 (en) 2006-03-24 2023-11-07 Handylab, Inc. Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system
CN100392316C (zh) * 2006-03-27 2008-06-04 博奥生物有限公司 控制液体在微管路中连续流动的流路结构
EP2016193A2 (en) * 2006-04-20 2009-01-21 The Regents Of The University Of California Device for quantification of radioisotope concentrations in a micro-fluidic platform
US8828661B2 (en) 2006-04-24 2014-09-09 Fluidigm Corporation Methods for detection and quantification of nucleic acid or protein targets in a sample
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
EP2530168B1 (en) 2006-05-11 2015-09-16 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic Devices
US8137912B2 (en) 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
EP2029779A4 (en) 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
US7629124B2 (en) * 2006-06-30 2009-12-08 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Real-time PCR in micro-channels
WO2008079440A2 (en) 2006-07-10 2008-07-03 Medipacs, Inc. Super elastic epoxy hydrogel
US9012390B2 (en) 2006-08-07 2015-04-21 Raindance Technologies, Inc. Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
US8656949B2 (en) 2006-08-15 2014-02-25 University Of Maryland College Park Microfluidic devices and methods of fabrication
US8055034B2 (en) 2006-09-13 2011-11-08 Fluidigm Corporation Methods and systems for image processing of microfluidic devices
EP2075584B1 (en) * 2006-10-19 2012-04-11 Sekisui Chemical Co., Ltd. Microanalysis measuring apparatus and microanalysis measuring method using the same
US8842422B2 (en) 2006-10-23 2014-09-23 ACCO Brands Corporation Security apparatus
US7868354B2 (en) * 2006-11-08 2011-01-11 Duke University GaN-based nitric oxide sensors and methods of making and using the same
WO2008061165A2 (en) 2006-11-14 2008-05-22 Handylab, Inc. Microfluidic cartridge and method of making same
US9114398B2 (en) * 2006-11-29 2015-08-25 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Device and method for digital multiplex PCR assays
WO2008067552A2 (en) * 2006-11-30 2008-06-05 Fluidigm Corporation Method and apparatus for biological sample analysis
EP1931158B1 (en) * 2006-12-08 2013-04-10 Samsung Electronics Co., Ltd. Apparatus and method for selecting frame structure in multihop relay broadband wireless access communication system
EP2125219B1 (en) * 2007-01-19 2016-08-10 Fluidigm Corporation High precision microfluidic devices and methods
JP2010516281A (ja) 2007-01-22 2010-05-20 ウェハージェン，インコーポレイテッド 高スループット化学反応用装置
US10001496B2 (en) 2007-01-29 2018-06-19 Gearbox, Llc Systems for allergen detection
US8617903B2 (en) 2007-01-29 2013-12-31 The Invention Science Fund I, Llc Methods for allergen detection
EP2109666A4 (en) 2007-02-05 2011-09-14 Integenx Inc MICROFLUIDIC AND NANOFLUIDIC DEVICES, SYSTEMS, AND APPLICATIONS
WO2008097559A2 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
US20090227005A1 (en) * 2007-03-27 2009-09-10 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Methods for pathogen detection
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
DE102007019389B4 (de) * 2007-04-23 2015-01-22 Single Temperiertechnik Gmbh Formwerkzeugtemperiersystem, Vorrichtung mit Formwerkzeugtemperiersystem und Verfahren zum Temperieren einer Vorrichtung sowie zur Herstellung der Vorrichtung
JP5045268B2 (ja) 2007-06-28 2012-10-10 ソニー株式会社 反応処理装置
US8182763B2 (en) 2007-07-13 2012-05-22 Handylab, Inc. Rack for sample tubes and reagent holders
US8133671B2 (en) 2007-07-13 2012-03-13 Handylab, Inc. Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples
EP3741869A1 (en) 2007-07-13 2020-11-25 Handylab, Inc. Polynucleotide capture materials and methods of using same
US20090136385A1 (en) 2007-07-13 2009-05-28 Handylab, Inc. Reagent Tube
US8287820B2 (en) 2007-07-13 2012-10-16 Handylab, Inc. Automated pipetting apparatus having a combined liquid pump and pipette head system
US9618139B2 (en) 2007-07-13 2017-04-11 Handylab, Inc. Integrated heater and magnetic separator
US9186677B2 (en) 2007-07-13 2015-11-17 Handylab, Inc. Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples
USD621060S1 (en) 2008-07-14 2010-08-03 Handylab, Inc. Microfluidic cartridge
US8105783B2 (en) 2007-07-13 2012-01-31 Handylab, Inc. Microfluidic cartridge
US8016260B2 (en) 2007-07-19 2011-09-13 Formulatrix, Inc. Metering assembly and method of dispensing fluid
EP3770275A1 (en) 2007-07-23 2021-01-27 The Chinese University of Hong Kong Determining a fetal aneuploidy
US20100112590A1 (en) 2007-07-23 2010-05-06 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing Fetal Chromosomal Aneuploidy Using Genomic Sequencing With Enrichment
US9410892B2 (en) * 2007-08-30 2016-08-09 Cornell University Nanoscale optofluidic devices for molecular detection
CA2698545C (en) * 2007-09-07 2014-07-08 Fluidigm Corporation Copy number variation determination, methods and systems
DK2215209T3 (en) 2007-10-30 2018-09-03 Complete Genomics Inc DEVICE FOR HIGH-THROUGHPUT SEQUENCE OF NUCLEIC ACIDS
CA2705213C (en) * 2007-11-07 2016-10-04 The University Of British Columbia Microfluidic device and method of using same
US9145540B1 (en) 2007-11-15 2015-09-29 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
US9975118B2 (en) 2007-11-15 2018-05-22 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
WO2009073734A2 (en) 2007-12-03 2009-06-11 Medipacs, Inc. Fluid metering device
US9551026B2 (en) 2007-12-03 2017-01-24 Complete Genomincs, Inc. Method for nucleic acid detection using voltage enhancement
KR20110030415A (ko) 2008-01-22 2011-03-23 인터젠엑스 인크. 만능 샘플 제조 시스템 및 집적 분석 시스템에서의 용도
WO2009100449A1 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Fluidigm Corporation Dynamic array assay methods
FR2928209B1 (fr) * 2008-03-03 2011-04-22 Rhodia Operations Procede et installation de determination d'au moins un parametre d'une transformation physique et/ou chimique
EP3093502B1 (en) * 2008-03-11 2018-07-04 Sekisui Chemical Co., Ltd. Micro fluid device
EP2280905B1 (en) 2008-04-11 2016-07-06 Fluidigm Corporation Multilevel microfluidic systems and methods
US8961902B2 (en) * 2008-04-23 2015-02-24 Bioscale, Inc. Method and apparatus for analyte processing
WO2010005738A1 (en) * 2008-06-16 2010-01-14 Duke University Chemical sensors and methods for making and using the same
USD618820S1 (en) 2008-07-11 2010-06-29 Handylab, Inc. Reagent holder
USD787087S1 (en) 2008-07-14 2017-05-16 Handylab, Inc. Housing
EP4047367A1 (en) 2008-07-18 2022-08-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting target analytes with droplet libraries
US12038438B2 (en) 2008-07-18 2024-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
CN104043490A (zh) 2008-07-25 2014-09-17 弗卢丁公司 用于制造集成流体芯片的方法和系统
WO2010017210A1 (en) 2008-08-07 2010-02-11 Fluidigm Corporation Microfluidic mixing and reaction systems for high efficiency screening
WO2010024485A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Apparatus and method for multiple immunoassays on a chip
ES2620294T3 (es) 2008-09-20 2017-06-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Diagnóstico no invasivo de la aneuploidia fetal por secuenciación
US12090480B2 (en) 2008-09-23 2024-09-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Partition-based method of analysis
US9598725B2 (en) 2010-03-02 2017-03-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Emulsion chemistry for encapsulated droplets
US8633015B2 (en) 2008-09-23 2014-01-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Flow-based thermocycling system with thermoelectric cooler
US10512910B2 (en) 2008-09-23 2019-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based analysis method
US9492797B2 (en) 2008-09-23 2016-11-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US9764322B2 (en) 2008-09-23 2017-09-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for generating droplets with pressure monitoring
US11130128B2 (en) 2008-09-23 2021-09-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection method for a target nucleic acid
US9132394B2 (en) 2008-09-23 2015-09-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US9417190B2 (en) 2008-09-23 2016-08-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
US8951939B2 (en) 2011-07-12 2015-02-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel
US8709762B2 (en) 2010-03-02 2014-04-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for hot-start amplification via a multiple emulsion
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US8082810B2 (en) * 2008-09-29 2011-12-27 Ysi Incorporated Microfluidic elastic micro-aliquotter
US9186128B2 (en) 2008-10-01 2015-11-17 Covidien Lp Needle biopsy device
US8968210B2 (en) 2008-10-01 2015-03-03 Covidien LLP Device for needle biopsy with integrated needle protection
US9332973B2 (en) 2008-10-01 2016-05-10 Covidien Lp Needle biopsy device with exchangeable needle and integrated needle protection
US9782565B2 (en) 2008-10-01 2017-10-10 Covidien Lp Endoscopic ultrasound-guided biliary access system
US11298113B2 (en) 2008-10-01 2022-04-12 Covidien Lp Device for needle biopsy with integrated needle protection
US8377307B2 (en) * 2008-10-08 2013-02-19 The Regents Of The University Of California Process for sorting dispersed colloidal structures
RU2385940C1 (ru) * 2008-10-23 2010-04-10 Общество с ограниченной ответственностью "ВИНТЕЛ" Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления
CN102301002A (zh) 2008-11-12 2011-12-28 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 使用外来体来确定表现型的方法和系统
US8672532B2 (en) 2008-12-31 2014-03-18 Integenx Inc. Microfluidic methods
US8058630B2 (en) * 2009-01-16 2011-11-15 Fluidigm Corporation Microfluidic devices and methods
US8100293B2 (en) 2009-01-23 2012-01-24 Formulatrix, Inc. Microfluidic dispensing assembly
US9958442B2 (en) * 2009-02-11 2018-05-01 Duke University Sensors incorporating antibodies and methods of making and using the same
WO2010111231A1 (en) 2009-03-23 2010-09-30 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
SG174617A1 (en) 2009-04-02 2011-10-28 Fluidigm Corp Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids
AU2010239292A1 (en) * 2009-04-21 2011-11-24 Advandx, Inc. Multiplex analysis of cells, particles, and other analytes
US8790916B2 (en) 2009-05-14 2014-07-29 Genestream, Inc. Microfluidic method and system for isolating particles from biological fluid
WO2010141326A1 (en) 2009-06-02 2010-12-09 Integenx Inc. Fluidic devices with diaphragm valves
EP3586945A3 (en) 2009-06-05 2020-03-04 IntegenX Inc. Universal sample preparation system and use in an integrated analysis system
US8551787B2 (en) * 2009-07-23 2013-10-08 Fluidigm Corporation Microfluidic devices and methods for binary mixing
US8012770B2 (en) * 2009-07-31 2011-09-06 Invisible Sentinel, Inc. Device for detection of antigens and uses thereof
EP2280034A1 (de) * 2009-07-31 2011-02-02 Bayer MaterialScience AG Elektromechanischer Wandler mit einem Polymerelement auf Basis einer Mischung aus Polyisocyanat und Isocyanat-funktionellem Prepolymer und einer Verbindung mit mindestens zwei isocyanatreaktiven Hydroxygruppen
US9605298B2 (en) * 2009-08-06 2017-03-28 Cornell University Device and methods for molecular analysis
JP6155418B2 (ja) 2009-09-02 2017-07-05 バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド 多重エマルジョンの合体による、流体を混合するためのシステム
US9238102B2 (en) 2009-09-10 2016-01-19 Medipacs, Inc. Low profile actuator and improved method of caregiver controlled administration of therapeutics
SG169918A1 (en) 2009-10-02 2011-04-29 Fluidigm Corp Microfluidic devices with removable cover and methods of fabrication and application
WO2011042564A1 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Universite De Strasbourg Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
JP5441035B2 (ja) * 2009-11-06 2014-03-12 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 試料解析装置
WO2011066588A1 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Fluidigm Corporation Microfluidic device regeneration
US8584703B2 (en) * 2009-12-01 2013-11-19 Integenx Inc. Device with diaphragm valve
US8574842B2 (en) 2009-12-22 2013-11-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct molecular diagnosis of fetal aneuploidy
US10837883B2 (en) 2009-12-23 2020-11-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
US9500186B2 (en) 2010-02-01 2016-11-22 Medipacs, Inc. High surface area polymer actuator with gas mitigating components
JP5691187B2 (ja) * 2010-02-10 2015-04-01 ソニー株式会社 核酸増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
EP2534267B1 (en) 2010-02-12 2018-04-11 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5808349B2 (ja) 2010-03-01 2015-11-10 カリス ライフ サイエンシズ スウィッツァーランド ホールディングスゲーエムベーハー セラノーシスのためのバイオマーカー
US20110225809A1 (en) * 2010-03-17 2011-09-22 Alan Francis Daher Apparatus for removably attaching an item to a surface
JP2013524169A (ja) 2010-03-25 2013-06-17 クァンタライフ・インコーポレーテッド 液滴によるアッセイ用の検出システム
CA2767114A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet transport system for detection
JP2013524171A (ja) 2010-03-25 2013-06-17 クァンタライフ・インコーポレーテッド 液滴ベースのアッセイのための液滴の発生
JP2013526852A (ja) 2010-04-06 2013-06-27 カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス 疾患に対する循環バイオマーカー
US8512538B2 (en) 2010-05-28 2013-08-20 Integenx Inc. Capillary electrophoresis device
EP2596347B1 (en) 2010-07-22 2017-09-06 Hach Company Alkalinity analysis using a lab-on-a-chip
US8763642B2 (en) 2010-08-20 2014-07-01 Integenx Inc. Microfluidic devices with mechanically-sealed diaphragm valves
WO2012024658A2 (en) 2010-08-20 2012-02-23 IntegenX, Inc. Integrated analysis system
EP2609476B1 (en) 2010-08-23 2022-04-20 Life Technologies Corporation Temperature control of chemical detection system
WO2012030878A1 (en) 2010-08-31 2012-03-08 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Composition and method for in-system priming microfluidic devices
WO2012045012A2 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
WO2012054933A2 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Fluidigm Corporation Universal probe assay methods
CN103429331B (zh) 2010-11-01 2016-09-28 伯乐生命医学产品有限公司 用于形成乳液的系统
AU2012211141B2 (en) 2011-01-27 2016-11-03 Invisible Sentinel, Inc. Analyte detection devices, multiplex and tabletop devices for detection of analytes, and uses thereof
WO2012109600A2 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
US9266104B2 (en) * 2011-02-11 2016-02-23 Raindance Technologies, Inc. Thermocycling device for nucleic acid amplification and methods of use
EP2675819B1 (en) 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
US12097495B2 (en) 2011-02-18 2024-09-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for detecting genetic material
EP2686449B1 (en) 2011-03-18 2020-11-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assays with combinatorial use of signals
US9168531B2 (en) 2011-03-24 2015-10-27 Fluidigm Corporation Method for thermal cycling of microfluidic samples
ES2617599T3 (es) 2011-04-15 2017-06-19 Becton, Dickinson And Company Termociclador microfluídico de exploración en tiempo real y métodos para termociclado sincronizado y detección óptica de exploración
EP2702175B1 (en) 2011-04-25 2018-08-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
US9644231B2 (en) 2011-05-09 2017-05-09 Fluidigm Corporation Nucleic acid detection using probes
SG194722A1 (en) 2011-05-09 2013-12-30 Fluidigm Corp Probe based nucleic acid detection
JP4934750B1 (ja) * 2011-05-31 2012-05-16 株式会社メトラン ポンプユニット、呼吸補助装置
WO2012167142A2 (en) 2011-06-02 2012-12-06 Raindance Technolgies, Inc. Enzyme quantification
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
EP2734843A2 (en) 2011-07-18 2014-05-28 President and Fellows of Harvard College Engineered microbe-targeting molecules and uses thereof
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
WO2013019751A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Bio-Rad Laboratories, Inc., Library characterization by digital assay
CN106996984B (zh) 2011-09-30 2018-11-27 贝克顿·迪金森公司 组合试剂条
USD692162S1 (en) 2011-09-30 2013-10-22 Becton, Dickinson And Company Single piece reagent holder
US20150136604A1 (en) 2011-10-21 2015-05-21 Integenx Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
US10865440B2 (en) 2011-10-21 2020-12-15 IntegenX, Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
US10837879B2 (en) 2011-11-02 2020-11-17 Complete Genomics, Inc. Treatment for stabilizing nucleic acid arrays
CN104040238B (zh) 2011-11-04 2017-06-27 汉迪拉布公司 多核苷酸样品制备装置
JP6262152B2 (ja) 2012-02-03 2018-01-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 分子診断試験の分布及び試験間のコンパチビリティ判断のための外部ファイル
EP3627140A1 (en) 2012-02-29 2020-03-25 Fluidigm Corporation Methods, systems, and devices for multiple single-cell capturing and processing using microfluidics
US9045803B2 (en) 2012-02-29 2015-06-02 Abbott Molecular Inc. Hepatitis B virus typing and resistance assay
EP2823308B1 (en) 2012-03-09 2019-05-22 Invisible Sentinel, Inc. Methods and compositions for detecting multiple analytes with a single signal
JP2015510956A (ja) 2012-03-14 2015-04-13 メディパックス インコーポレイテッド 過剰反応性分子を含むスマートポリマー材料
US9803239B2 (en) 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
WO2013155531A2 (en) 2012-04-13 2013-10-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sample holder with a well having a wicking promoter
WO2013166855A1 (en) * 2012-05-07 2013-11-14 Capitalbio Corporation Microfluidic device with integrated pneumatic microvalve
US9840732B2 (en) 2012-05-21 2017-12-12 Fluidigm Corporation Single-particle analysis of particle populations
US9180449B2 (en) 2012-06-12 2015-11-10 Hach Company Mobile water analysis
EP2875078B1 (en) 2012-07-18 2017-12-20 President and Fellows of Harvard College Modification of surfaces for simulataneous repellency and targeted binding of desired moieties
TWI481446B (zh) * 2012-09-17 2015-04-21 Univ Nat Taiwan 數位微流體操控裝置及操控方法
US10942184B2 (en) 2012-10-23 2021-03-09 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
WO2014068408A2 (en) 2012-10-23 2014-05-08 Caris Life Sciences Switzerland Holdings, S.A.R.L. Aptamers and uses thereof
USD768872S1 (en) 2012-12-12 2016-10-11 Hach Company Cuvette for a water analysis instrument
CA2895847C (en) 2012-12-19 2019-01-08 Caris Science, Inc. Compositions and methods for aptamer screening
CN105164246B (zh) 2013-03-15 2018-09-25 富鲁达公司 用于分析定义的多细胞组合的方法和设备
US20140323819A1 (en) * 2013-04-29 2014-10-30 Elwha LLC, a limited liability company of the State of Delaware Multi-parameter test units for initial indication of medical symptoms
EP3008201B1 (en) 2013-06-12 2019-08-07 The General Hospital Corporation Methods for multiplexed detection of target molecules and uses thereof
KR20160080815A (ko) 2013-08-28 2016-07-08 카리스 라이프 사이언스 스위스 홀딩스 게엠베하 올리고뉴클레오티드 프로브 및 이의 용도
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
EP3071333A4 (en) 2013-11-18 2017-11-15 IntegenX Inc. Cartridges and instruments for sample analysis
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
EP3912986B1 (en) 2013-12-18 2023-12-13 President and Fellows of Harvard College Crp capture/detection of bacteria
EP3090063B1 (en) 2013-12-31 2019-11-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detection of latent retrovirus
WO2015187227A2 (en) 2014-03-13 2015-12-10 Duke University Electronic platform for sensing and control of electrochemical reactions
US8820538B1 (en) 2014-03-17 2014-09-02 Namocell LLC Method and apparatus for particle sorting
GB2544198B (en) 2014-05-21 2021-01-13 Integenx Inc Fluidic cartridge with valve mechanism
EP3209410A4 (en) 2014-10-22 2018-05-02 IntegenX Inc. Systems and methods for sample preparation, processing and analysis
EP3839061B1 (en) 2014-10-27 2022-12-07 King Abdullah University Of Science And Technology Methods and systems for identifying ligand-protein binding sites
US9717644B2 (en) 2014-12-22 2017-08-01 John H. Shadduck Wearable sensing and actuator systems, and methods of use
US10364467B2 (en) 2015-01-13 2019-07-30 The Chinese University Of Hong Kong Using size and number aberrations in plasma DNA for detecting cancer
EP3247675A4 (en) * 2015-01-23 2018-07-04 Neofluidics LLC A microfluidic serial dilution platform based well-plate using an oil-free immiscible phase driven by manual or electronic pipettors
EP3253911B1 (en) 2015-02-04 2021-01-20 The University Of British Columbia Methods and devices for analyzing particles
CN107407685B (zh) 2015-02-20 2021-08-03 宝生物工程（美国)有限公司 快速精确分配、可视化和分析单个细胞的方法
CA2979361A1 (en) 2015-03-09 2016-09-15 Caris Science, Inc. Method of preparing oligonucleotide libraries
US10233491B2 (en) 2015-06-19 2019-03-19 IntegenX, Inc. Valved cartridge and system
AU2016287499B2 (en) 2015-06-29 2022-08-04 Caris Science, Inc. Therapeutic oligonucleotides
WO2017019918A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Caris Science, Inc. Targeted oligonucleotides
EP3331557B1 (en) 2015-08-04 2021-04-07 Duke University Genetically encoded intrinsically disordered stealth polymers for delivery and methods of using same
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
US11752213B2 (en) 2015-12-21 2023-09-12 Duke University Surfaces having reduced non-specific binding and antigenicity
EP3313978B1 (en) * 2016-01-08 2024-02-28 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Polymerase chain reaction device
EP3313977B1 (en) 2016-01-29 2020-08-19 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Sample-reagent mixture thermal cycling
WO2017161357A1 (en) 2016-03-18 2017-09-21 Caris Science, Inc. Oligonucleotide probes and uses thereof
EP3248681A1 (en) * 2016-05-23 2017-11-29 ETH Zurich Microfluidic device defining an array of sample chambers
EP3464597B1 (en) 2016-05-25 2022-08-03 Caris Science, Inc. Oligonucleotide probe selection method and uses thereof
US11467156B2 (en) 2016-06-01 2022-10-11 Duke University Nonfouling biosensors
CA3020629A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 Takara Bio Usa, Inc. Multi-z imaging and dispensing with multi-well devices
JP2020500150A (ja) 2016-09-23 2020-01-09 デューク ユニバーシティ 下限臨界溶液温度挙動を有する非反復かつ非構造的ポリペプチド
WO2018132732A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Duke University Genetically encoded lipid-polypeptide hybrid biomaterials that exhibit temperature triggered hierarchical self-assembly
JP7372150B2 (ja) * 2017-02-02 2023-10-31 ユニバーシティ オブ メリーランド，カレッジ パーク 堅牢なマイクロ流体試料デジタル化のためのトラップアレイ
WO2018200896A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Neofluidics, Llc Fluidic devices with reaction wells and uses thereof
WO2018213320A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Duke University Recombinant production of hybrid lipid-biopolymer materials that self-assemble and encapsulate agents
US11680083B2 (en) 2017-06-30 2023-06-20 Duke University Order and disorder as a design principle for stimuli-responsive biopolymer networks
CN110770355A (zh) * 2017-07-31 2020-02-07 凸版印刷株式会社 核酸检测方法及检测用试剂
EP3665262A4 (en) 2017-08-09 2021-09-01 Neofluidics, LLC DEVICES AND METHODS FOR BIOLOGICAL TESTING
CA3082074A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Neofluidics, Llc Integrated fluidic circuit and device for droplet manipulation and methods thereof
EP3829622A4 (en) 2018-08-02 2022-05-11 Duke University DUAL AGONIST FUSION PROTEINS
EP3870369A4 (en) 2018-10-26 2022-11-09 Neofluidics, LLC FLUID DEVICES HAVING REACTION WELLS AND THROAT CHANNEL AND USES THEREOF
JP7462632B2 (ja) 2018-11-30 2024-04-05 カリス エムピーアイ インコーポレイテッド 次世代分子プロファイリング
US11512314B2 (en) 2019-07-12 2022-11-29 Duke University Amphiphilic polynucleotides
CN112337414A (zh) 2019-08-09 2021-02-09 胡桃钳医疗公司 微流体设备及其使用方法
EP4054423A1 (en) 2019-11-07 2022-09-14 Smylio Inc. Saliva collection and testing system
JP2023504270A (ja) 2019-12-02 2023-02-02 カリス エムピーアイ インコーポレイテッド 汎がんのプラチナ反応予測子
US20230212647A1 (en) * 2020-05-29 2023-07-06 Seer, Inc. Systems and methods for rapid identification of proteins
WO2022040495A1 (en) * 2020-08-21 2022-02-24 Duke University Microfluidic assay device
EP3960292A1 (en) * 2020-09-01 2022-03-02 Roche Diagnostics GmbH System and method for separating an aqueous liquid into at least two cavities
CN112080806B (zh) * 2020-10-23 2024-02-20 江苏吉诺思美精准医学科技有限公司 一种毛细管96孔板的血浆游离dna建库方法
WO2023023533A1 (en) 2021-08-19 2023-02-23 Luminex Corporation Digital amplification assay analysis method
CN113996356A (zh) * 2021-10-27 2022-02-01 北京京东方技术开发有限公司 微流控芯片及其制作方法、医疗检测设备
WO2023108014A1 (en) 2021-12-07 2023-06-15 Luminex Corporation Methods and compositions for nucleic acid analysis

Family Cites Families (348)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2002A (en) * 1841-03-12 Tor and planter for plowing
US2008A (en) * 1841-03-18 Gas-lamp eok conducting gas pkom ah elevated buhner to one below it
US2005A (en) * 1841-03-16 Improvement in the manner of constructing molds for casting butt-hinges
US2656508A (en) * 1949-08-27 1953-10-20 Wallace H Coulter Means for counting particles suspended in a fluid
US3560754A (en) * 1965-11-17 1971-02-02 Ibm Photoelectric particle separator using time delay
US3570515A (en) * 1969-06-19 1971-03-16 Foxboro Co Aminar stream cross-flow fluid diffusion logic gate
NL7102074A (es) * 1971-02-17 1972-08-21
US3984307A (en) * 1973-03-05 1976-10-05 Bio/Physics Systems, Inc. Combined particle sorter and segregation indicator
FR2287606A1 (fr) * 1974-10-08 1976-05-07 Pegourie Jean Pierre Circuits logiques pneumatiques et leurs circuits integres
JPS5941169B2 (ja) 1975-12-25 1984-10-05 シチズン時計株式会社 エラストマ−ヒヨウジソウチ
US4153855A (en) 1977-12-16 1979-05-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Method of making a plate having a pattern of microchannels
US4245673A (en) * 1978-03-01 1981-01-20 La Telemechanique Electrique Pneumatic logic circuit
US4344064A (en) * 1979-12-06 1982-08-10 Western Electric Co., Inc. Article carrying a distinctive mark
US4434704A (en) * 1980-04-14 1984-03-06 Halliburton Company Hydraulic digital stepper actuator
GB2097692B (en) 1981-01-10 1985-05-22 Shaw Stewart P D Combining chemical reagents
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
DE3377484D1 (en) 1982-04-19 1988-09-01 Nissan Motor Method for controlling reduction ratio of continuously variable transmission with acceleration compensation
US4707237A (en) * 1982-09-09 1987-11-17 Ciba Corning Diagnostics Corp. System for identification of cells by electrophoresis
US4585209A (en) * 1983-10-27 1986-04-29 Harry E. Aine Miniature valve and method of making same
US4581624A (en) * 1984-03-01 1986-04-08 Allied Corporation Microminiature semiconductor valve
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
ATE66469T1 (de) 1985-01-14 1991-09-15 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
US4963498A (en) * 1985-08-05 1990-10-16 Biotrack Capillary flow device
US5164598A (en) 1985-08-05 1992-11-17 Biotrack Capillary flow device
US5140161A (en) * 1985-08-05 1992-08-18 Biotrack Capillary flow device
US4675300A (en) * 1985-09-18 1987-06-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Laser-excitation fluorescence detection electrokinetic separation
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
US4669784A (en) 1986-02-24 1987-06-02 Palmer Grasse Oscillated head and connecting element, with bearing support, for floor stripping machine
US5088515A (en) * 1989-05-01 1992-02-18 Kamen Dean L Valve system with removable fluid interface
US4786165A (en) 1986-07-10 1988-11-22 Toa Medical Electronics Co., Ltd. Flow cytometry and apparatus therefor
US5525464A (en) * 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
EP0304184B1 (en) 1987-07-31 1994-10-12 Gen-Probe Incorporated Assay for polynucleotides employing oligonucleotides to eliminate undesirable cross reactions
EP0314469B1 (en) 1987-10-27 1993-06-23 Fujitsu Limited Process and apparatus for preparation of single crystal of biopolymer
US4843155A (en) 1987-11-19 1989-06-27 Piotr Chomczynski Product and process for isolating RNA
US4936465A (en) * 1987-12-07 1990-06-26 Zoeld Tibor Method and apparatus for fast, reliable, and environmentally safe dispensing of fluids, gases and individual particles of a suspension through pressure control at well defined parts of a closed flow-through system
US5354695A (en) 1992-04-08 1994-10-11 Leedy Glenn J Membrane dielectric isolation IC fabrication
US4908112A (en) * 1988-06-16 1990-03-13 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Silicon semiconductor wafer for analyzing micronic biological samples
US5132012A (en) 1988-06-24 1992-07-21 Hitachi, Ltd. Liquid chromatograph
US4898582A (en) 1988-08-09 1990-02-06 Pharmetrix Corporation Portable infusion device assembly
US5032381A (en) * 1988-12-20 1991-07-16 Tropix, Inc. Chemiluminescence-based static and flow cytometry
US5856092A (en) 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
US4992312A (en) * 1989-03-13 1991-02-12 Dow Corning Wright Corporation Methods of forming permeation-resistant, silicone elastomer-containing composite laminates and devices produced thereby
CH679555A5 (es) 1989-04-11 1992-03-13 Westonbridge Int Ltd
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
JPH04501449A (ja) 1989-06-14 1992-03-12 ウエストンブリッジ　インターナショナル　リミティド マイクロポンプ
US5100627A (en) * 1989-11-30 1992-03-31 The Regents Of The University Of California Chamber for the optical manipulation of microscopic particles
US5171132A (en) 1989-12-27 1992-12-15 Seiko Epson Corporation Two-valve thin plate micropump
US5091652A (en) * 1990-01-12 1992-02-25 The Regents Of The University Of California Laser excited confocal microscope fluorescence scanner and method
AU7340891A (en) 1990-02-24 1991-09-18 Hatfield Polytechnic Higher Education Corporation (U.K.) Biorheological measurement
DE4006152A1 (de) 1990-02-27 1991-08-29 Fraunhofer Ges Forschung Mikrominiaturisierte pumpe
US5770029A (en) 1996-07-30 1998-06-23 Soane Biosciences Integrated electrophoretic microdevices
US5858188A (en) 1990-02-28 1999-01-12 Aclara Biosciences, Inc. Acrylic microchannels and their use in electrophoretic applications
US5750015A (en) * 1990-02-28 1998-05-12 Soane Biosciences Method and device for moving molecules by the application of a plurality of electrical fields
US5126022A (en) * 1990-02-28 1992-06-30 Soane Tecnologies, Inc. Method and device for moving molecules by the application of a plurality of electrical fields
US5096388A (en) 1990-03-22 1992-03-17 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Microfabricated pump
GB9008044D0 (en) 1990-04-09 1990-06-06 Hatfield Polytechnic Higher Ed Microfabricated device for biological cell sorting
SE470347B (sv) * 1990-05-10 1994-01-31 Pharmacia Lkb Biotech Mikrostruktur för vätskeflödessystem och förfarande för tillverkning av ett sådant system
DE69106240T2 (de) 1990-07-02 1995-05-11 Seiko Epson Corp Mikropumpe und Verfahren zur Herstellung einer Mikropumpe.
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US6074818A (en) 1990-08-24 2000-06-13 The University Of Tennessee Research Corporation Fingerprinting of nucleic acids, products and methods
JP3111319B2 (ja) 1990-08-31 2000-11-20 ウエストンブリッジ・インターナショナル・リミテッド 位置検出器を備えた弁及び前記弁を組み込んだマイクロポンプ
US5846710A (en) 1990-11-02 1998-12-08 St. Louis University Method for the detection of genetic diseases and gene sequence variations by single nucleotide primer extension
ATE244065T1 (de) 1990-12-06 2003-07-15 Affymetrix Inc Verfahren und reagenzien für immobilisierten polymersynthese in sehr grossem masstab
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
US5888819A (en) 1991-03-05 1999-03-30 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through primer extension
WO1992016657A1 (en) 1991-03-13 1992-10-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method of identifying a nucleotide present at a defined position in a nucleic acid
WO1992019960A1 (en) 1991-05-09 1992-11-12 Nanophore, Inc. Methods for the electrophoretic separation of nucleic acids and other linear macromolecules in gel media with restrictive pore diameters
DE4119955C2 (de) * 1991-06-18 2000-05-31 Danfoss As Miniatur-Betätigungselement
US5164558A (en) 1991-07-05 1992-11-17 Massachusetts Institute Of Technology Micromachined threshold pressure switch and method of manufacture
JP3328300B2 (ja) * 1991-07-18 2002-09-24 アイシン精機株式会社 流体制御装置
US5307186A (en) * 1991-08-09 1994-04-26 Sharp Kabushiki Kaisha Liquid crystal light valve having capability of providing high-contrast image
DE4135655A1 (de) 1991-09-11 1993-03-18 Fraunhofer Ges Forschung Mikrominiaturisierte, elektrostatisch betriebene membranpumpe
US5265327A (en) 1991-09-13 1993-11-30 Faris Sadeg M Microchannel plate technology
US6569382B1 (en) 1991-11-07 2003-05-27 Nanogen, Inc. Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices
GB2264296B (en) 1992-02-07 1995-06-28 Zortech Int Microporous thermal insulation material
GB2264496B (en) 1992-02-25 1995-10-25 Us Energy Sizing of fragments from a nucleic acid sequence
US5558998A (en) * 1992-02-25 1996-09-24 The Regents Of The Univ. Of California DNA fragment sizing and sorting by laser-induced fluorescence
JPH05236997A (ja) * 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
JP2740705B2 (ja) * 1992-04-08 1998-04-15 本田技研工業株式会社 流体式トルクコンバータの特性シミュレーション方法および装置
US5587128A (en) 1992-05-01 1996-12-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification devices
US5726026A (en) * 1992-05-01 1998-03-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale sample preparation device and systems for determination and processing of analytes
US5498392A (en) * 1992-05-01 1996-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification device and method
US5486335A (en) * 1992-05-01 1996-01-23 Trustees Of The University Of Pennsylvania Analysis based on flow restriction
US5304487A (en) * 1992-05-01 1994-04-19 Trustees Of The University Of Pennsylvania Fluid handling in mesoscale analytical devices
DE4220077A1 (de) 1992-06-19 1993-12-23 Bosch Gmbh Robert Mikropumpe
US5710028A (en) 1992-07-02 1998-01-20 Eyal; Nurit Method of quick screening and identification of specific DNA sequences by single nucleotide primer extension and kits therefor
US5284568A (en) 1992-07-17 1994-02-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Disposable cartridge for ion selective electrode sensors
US5629147A (en) * 1992-07-17 1997-05-13 Aprogenex, Inc. Enriching and identifying fetal cells in maternal blood for in situ hybridization
US5639423A (en) 1992-08-31 1997-06-17 The Regents Of The University Of Calfornia Microfabricated reactor
US5364742A (en) 1992-09-21 1994-11-15 International Business Machines Corporation Micro-miniature structures and method of fabrication thereof
DE69327389T2 (de) * 1992-10-29 2000-06-15 Altera Corp., San Jose Verfahren zum Prüfen von Entwürfen für programmierbare Logikschaltungen
US5477474A (en) 1992-10-29 1995-12-19 Altera Corporation Computer logic simulation with dynamic modeling
JP2812629B2 (ja) * 1992-11-25 1998-10-22 宇宙開発事業団 結晶成長セル
US5290240A (en) 1993-02-03 1994-03-01 Pharmetrix Corporation Electrochemical controlled dispensing assembly and method for selective and controlled delivery of a dispensing fluid
US5400741A (en) 1993-05-21 1995-03-28 Medical Foundation Of Buffalo, Inc. Device for growing crystals
US5681024A (en) * 1993-05-21 1997-10-28 Fraunhofer-Gesellschaft zur Forderung der angerwanden Forschung e.V. Microvalve
SE501713C2 (sv) 1993-09-06 1995-05-02 Pharmacia Biosensor Ab Ventil av membrantyp, speciellt för vätskehanteringsblock med mikroflödeskanaler
US5642015A (en) 1993-07-14 1997-06-24 The University Of British Columbia Elastomeric micro electro mechanical systems
US5659171A (en) 1993-09-22 1997-08-19 Northrop Grumman Corporation Micro-miniature diaphragm pump for the low pressure pumping of gases
WO1995009988A1 (en) 1993-10-04 1995-04-13 Research International, Inc. Micromachined filters and flow regulators
US5512131A (en) * 1993-10-04 1996-04-30 President And Fellows Of Harvard College Formation of microstamped patterns on surfaces and derivative articles
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
CH689836A5 (fr) 1994-01-14 1999-12-15 Westonbridge Int Ltd Micropompe.
EP0670489A3 (de) * 1994-03-03 1996-03-06 Ciba Geigy Ag Vorrichtung und Verfahren zur Trennung fluider Substanzen.
US5580523A (en) 1994-04-01 1996-12-03 Bard; Allen J. Integrated chemical synthesizers
US5587081A (en) 1994-04-26 1996-12-24 Jet-Tech, Inc. Thermophilic aerobic waste treatment process
DE69527585T2 (de) 1994-06-08 2003-04-03 Affymetrix, Inc. Verfahren und Vorrichtung zum Verpacken von Chips
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US6001229A (en) * 1994-08-01 1999-12-14 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Apparatus and method for performing microfluidic manipulations for chemical analysis
DE4433894A1 (de) 1994-09-22 1996-03-28 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren und Vorrichtung zur Ansteuerung einer Mikropumpe
DE69531430T2 (de) 1994-10-07 2004-07-01 Bayer Corp. Entlastungsventil
US5496009A (en) * 1994-10-07 1996-03-05 Bayer Corporation Valve
US5695934A (en) * 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
DE4437274C2 (de) 1994-10-18 1998-11-05 Inst Chemo Biosensorik Analytselektiver Sensor
US5571410A (en) 1994-10-19 1996-11-05 Hewlett Packard Company Fully integrated miniaturized planar liquid sample handling and analysis device
US5500071A (en) * 1994-10-19 1996-03-19 Hewlett-Packard Company Miniaturized planar columns in novel support media for liquid phase analysis
US5641400A (en) * 1994-10-19 1997-06-24 Hewlett-Packard Company Use of temperature control devices in miniaturized planar column devices and miniaturized total analysis systems
DE4438785C2 (de) 1994-10-24 1996-11-07 Wita Gmbh Wittmann Inst Of Tec Mikrochemische Reaktions- und Analyseeinheit
US5788468A (en) * 1994-11-03 1998-08-04 Memstek Products, Llc Microfabricated fluidic devices
WO1996015576A1 (en) 1994-11-10 1996-05-23 David Sarnoff Research Center, Inc. Liquid distribution system
US5632876A (en) * 1995-06-06 1997-05-27 David Sarnoff Research Center, Inc. Apparatus and methods for controlling fluid flow in microchannels
US5665070A (en) 1995-01-19 1997-09-09 I-Flow Corporation Infusion pump with magnetic bag compression
JP3094880B2 (ja) 1995-03-01 2000-10-03 住友金属工業株式会社 有機化合物の結晶化制御方法およびそれに用いる結晶化制御用固体素子
US5775371A (en) 1995-03-08 1998-07-07 Abbott Laboratories Valve control
US6227809B1 (en) * 1995-03-09 2001-05-08 University Of Washington Method for making micropumps
US5876187A (en) 1995-03-09 1999-03-02 University Of Washington Micropumps with fixed valves
US5608519A (en) * 1995-03-20 1997-03-04 Gourley; Paul L. Laser apparatus and method for microscopic and spectroscopic analysis and processing of biological cells
US5661222A (en) * 1995-04-13 1997-08-26 Dentsply Research & Development Corp. Polyvinylsiloxane impression material
US5757482A (en) * 1995-04-20 1998-05-26 Perseptive Biosystems, Inc. Module for optical detection in microscale fluidic analyses
US5976822A (en) 1995-05-18 1999-11-02 Coulter International Corp. Method and reagent for monitoring apoptosis and distinguishing apoptosis from necrosis
DE19520298A1 (de) 1995-06-02 1996-12-05 Bayer Ag Sortiervorrichtung für biologische Zellen oder Viren
US5716852A (en) * 1996-03-29 1998-02-10 University Of Washington Microfabricated diffusion-based chemical sensor
US5589136A (en) 1995-06-20 1996-12-31 Regents Of The University Of California Silicon-based sleeve devices for chemical reactions
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
CA2183478C (en) * 1995-08-17 2004-02-24 Stephen A. Carter Digital gas metering system using tri-stable and bi-stable solenoids
US6130098A (en) 1995-09-15 2000-10-10 The Regents Of The University Of Michigan Moving microdroplets
US5726751A (en) * 1995-09-27 1998-03-10 University Of Washington Silicon microchannel optical flow cytometer
US6132580A (en) * 1995-09-28 2000-10-17 The Regents Of The University Of California Miniature reaction chamber and devices incorporating same
US20020068357A1 (en) * 1995-09-28 2002-06-06 Mathies Richard A. Miniaturized integrated nucleic acid processing and analysis device and method
US5958344A (en) 1995-11-09 1999-09-28 Sarnoff Corporation System for liquid distribution
JPH09149799A (ja) 1995-11-30 1997-06-10 Hitachi Ltd 核酸の分析方法又は検査方法、及び核酸の分析装置又は検査装置
US5705018A (en) 1995-12-13 1998-01-06 Hartley; Frank T. Micromachined peristaltic pump
IL124967A (en) 1995-12-18 2000-07-26 Univ Washington Method for nucleic acid analysis using fluorescence resonance energy transfer
KR100207410B1 (ko) 1995-12-19 1999-07-15 전주범 광로 조절 장치의 제조방법
JP2002515738A (ja) 1996-01-23 2002-05-28 アフィメトリックス，インコーポレイティド 核酸分析法
US5863502A (en) 1996-01-24 1999-01-26 Sarnoff Corporation Parallel reaction cassette and associated devices
US5660370A (en) * 1996-03-07 1997-08-26 Integrated Fludics, Inc. Valve with flexible sheet member and two port non-flexing backer member
WO1997036681A1 (en) 1996-04-03 1997-10-09 The Perkin-Elmer Corporation Device and method for multiple analyte detection
US5942443A (en) 1996-06-28 1999-08-24 Caliper Technologies Corporation High throughput screening assay systems in microscale fluidic devices
US5867266A (en) * 1996-04-17 1999-02-02 Cornell Research Foundation, Inc. Multiple optical channels for chemical analysis
US5726404A (en) 1996-05-31 1998-03-10 University Of Washington Valveless liquid microswitch
FR2749663B1 (fr) * 1996-06-07 1998-07-31 Bio Merieux Carte d'analyse a usage unique comprenant un conduit d'ecoul ement de liquides
US5863801A (en) * 1996-06-14 1999-01-26 Sarnoff Corporation Automated nucleic acid isolation
US5779868A (en) * 1996-06-28 1998-07-14 Caliper Technologies Corporation Electropipettor and compensation means for electrophoretic bias
BR9710054A (pt) 1996-06-28 2000-01-11 Caliper Techn Corp Aparelhos para separar compostos de teste para um efeito sobre um sistema bioquìmico e para detectar ummefeito de um composto de teste sobre um sistema bioquìmico, processos de determinação de se uma amostra contém um composto capaz de afetar um sistema bioquìmico, de separação de uma pluralidade de compostos de teste para um efeito sobre um sistema bioquìmico e usos de um sistema microfluido e de um substrato de ensaio.
NZ333345A (en) * 1996-06-28 2000-09-29 Caliper Techn Corp Electropipettor and compensation for electrophoretic bias during electroosmotic microfluid transport
US5800690A (en) * 1996-07-03 1998-09-01 Caliper Technologies Corporation Variable control of electroosmotic and/or electrophoretic forces within a fluid-containing structure via electrical forces
EP0913507A4 (en) * 1996-07-15 2002-03-13 Sumitomo Metal Ind PLANT FOR CRYSTAL GROWTH AND THE METHOD FOR CRYSTAL GROWTH USING THIS METHOD
US5699157A (en) 1996-07-16 1997-12-16 Caliper Technologies Corp. Fourier detection of species migrating in a microchannel
CA2262012A1 (en) 1996-07-26 1998-02-05 Genzyme Corporation Whole cell assay
US5802856A (en) 1996-07-31 1998-09-08 Stanford University Multizone bake/chill thermal cycling module
US6136212A (en) * 1996-08-12 2000-10-24 The Regents Of The University Of Michigan Polymer-based micromachining for microfluidic devices
WO1998008931A1 (en) 1996-08-26 1998-03-05 Princeton University Reversibly sealable microstructure sorting devices
US5832165A (en) 1996-08-28 1998-11-03 University Of Utah Research Foundation Composite waveguide for solid phase binding assays
WO1998010267A1 (en) 1996-09-04 1998-03-12 Technical University Of Denmark A micro flow system for particle separation and analysis
US5738799A (en) 1996-09-12 1998-04-14 Xerox Corporation Method and materials for fabricating an ink-jet printhead
US6221654B1 (en) * 1996-09-25 2001-04-24 California Institute Of Technology Method and apparatus for analysis and sorting of polynucleotides based on size
US5858187A (en) * 1996-09-26 1999-01-12 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Apparatus and method for performing electrodynamic focusing on a microchip
US5854684A (en) 1996-09-26 1998-12-29 Sarnoff Corporation Massively parallel detection
US6056428A (en) * 1996-11-12 2000-05-02 Invention Machine Corporation Computer based system for imaging and analyzing an engineering object system and indicating values of specific design changes
US5971355A (en) 1996-11-27 1999-10-26 Xerox Corporation Microdevice valve structures to fluid control
WO1998035376A1 (en) 1997-01-27 1998-08-13 California Institute Of Technology Mems electrospray nozzle for mass spectroscopy
US6376971B1 (en) * 1997-02-07 2002-04-23 Sri International Electroactive polymer electrodes
US7034432B1 (en) 1997-02-07 2006-04-25 Sri International Electroactive polymer generators
CA2281205A1 (en) * 1997-02-12 1998-08-13 Eugene Y. Chan Methods and products for analyzing polymers
US6117634A (en) * 1997-03-05 2000-09-12 The Reagents Of The University Of Michigan Nucleic acid sequencing and mapping
US5904824A (en) * 1997-03-07 1999-05-18 Beckman Instruments, Inc. Microfluidic electrophoresis device
JP2001521622A (ja) 1997-04-04 2001-11-06 カリパー テクノロジーズ コーポレイション 閉ループ生化学分析器
US6235471B1 (en) 1997-04-04 2001-05-22 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
US6143496A (en) 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
CN1105914C (zh) * 1997-04-25 2003-04-16 卡钳技术有限公司 改进了通道几何结构的微型流体装置
US5863736A (en) 1997-05-23 1999-01-26 Becton, Dickinson And Company Method, apparatus and computer program products for determining quantities of nucleic acid sequences in samples
US5876946A (en) * 1997-06-03 1999-03-02 Pharmacopeia, Inc. High-throughput assay
US5922604A (en) * 1997-06-05 1999-07-13 Gene Tec Corporation Thin reaction chambers for containing and handling liquid microvolumes
US5869004A (en) * 1997-06-09 1999-02-09 Caliper Technologies Corp. Methods and apparatus for in situ concentration and/or dilution of materials in microfluidic systems
US5888778A (en) * 1997-06-16 1999-03-30 Exact Laboratories, Inc. High-throughput screening method for identification of genetic mutations or disease-causing microorganisms using segmented primers
US6303389B1 (en) 1997-06-27 2001-10-16 Immunetics Rapid flow-through binding assay apparatus and method therefor
AU8492998A (en) 1997-07-16 1999-02-10 Diversified Scientific, Inc. Method for acquiring, storing and analyzing crystal images
US6073482A (en) 1997-07-21 2000-06-13 Ysi Incorporated Fluid flow module
US5932799A (en) 1997-07-21 1999-08-03 Ysi Incorporated Microfluidic analyzer module
US5972639A (en) * 1997-07-24 1999-10-26 Irori Fluorescence-based assays for measuring cell proliferation
US6375871B1 (en) * 1998-06-18 2002-04-23 3M Innovative Properties Company Methods of manufacturing microfluidic articles
US5876675A (en) * 1997-08-05 1999-03-02 Caliper Technologies Corp. Microfluidic devices and systems
US5965410A (en) * 1997-09-02 1999-10-12 Caliper Technologies Corp. Electrical current for controlling fluid parameters in microchannels
JP2001516573A (ja) 1997-09-18 2001-10-02 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 抗微生物化合物のスクリーニング方法
TW352471B (en) 1997-09-20 1999-02-11 United Microelectronics Corp Method for preventing B-P-Si glass from subsiding
US7214298B2 (en) 1997-09-23 2007-05-08 California Institute Of Technology Microfabricated cell sorter
US6833242B2 (en) 1997-09-23 2004-12-21 California Institute Of Technology Methods for detecting and sorting polynucleotides based on size
US6540895B1 (en) * 1997-09-23 2003-04-01 California Institute Of Technology Microfabricated cell sorter for chemical and biological materials
AU9673198A (en) * 1997-10-02 1999-04-27 Aclara Biosciences, Inc. Capillary assays involving separation of free and bound species
US5842787A (en) 1997-10-09 1998-12-01 Caliper Technologies Corporation Microfluidic systems incorporating varied channel dimensions
US5836750A (en) 1997-10-09 1998-11-17 Honeywell Inc. Electrostatically actuated mesopump having a plurality of elementary cells
US5958694A (en) * 1997-10-16 1999-09-28 Caliper Technologies Corp. Apparatus and methods for sequencing nucleic acids in microfluidic systems
US6345502B1 (en) * 1997-11-12 2002-02-12 California Institute Of Technology Micromachined parylene membrane valve and pump
US6174675B1 (en) * 1997-11-25 2001-01-16 Caliper Technologies Corp. Electrical current for controlling fluid parameters in microchannels
US6089534A (en) 1998-01-08 2000-07-18 Xerox Corporation Fast variable flow microelectromechanical valves
US6269846B1 (en) 1998-01-13 2001-08-07 Genetic Microsystems, Inc. Depositing fluid specimens on substrates, resulting ordered arrays, techniques for deposition of arrays
WO1999036714A2 (en) 1998-01-20 1999-07-22 Triconex, Incorporated Two out of three voting solenoid arrangement
US6167910B1 (en) * 1998-01-20 2001-01-02 Caliper Technologies Corp. Multi-layer microfluidic devices
EP1054735B1 (de) 1998-02-11 2003-05-28 Institut Für Physikalische Hochtechnologie E.V. Miniaturisierter temperaturzonen flussreaktor
US6018616A (en) * 1998-02-23 2000-01-25 Applied Materials, Inc. Thermal cycling module and process using radiant heat
US5997961A (en) 1998-03-06 1999-12-07 Battelle Memorial Institute Method of bonding functional surface materials to substrates and applications in microtechnology and antifouling
AU3491299A (en) 1998-04-14 1999-11-01 Lumenal Technologies, L.P. Test cartridge with a single inlet port
AU763433B2 (en) * 1998-05-22 2003-07-24 California Institute Of Technology Microfabricated cell sorter
US6246330B1 (en) 1998-05-29 2001-06-12 Wyn Y. Nielsen Elimination-absorber monitoring system
JPH11352409A (ja) * 1998-06-05 1999-12-24 Olympus Optical Co Ltd 蛍光検出装置
WO2000000678A1 (en) 1998-06-26 2000-01-06 University Of Washington Crystallization media
US6406921B1 (en) 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
US6576478B1 (en) 1998-07-14 2003-06-10 Zyomyx, Inc. Microdevices for high-throughput screening of biomolecules
US6132685A (en) * 1998-08-10 2000-10-17 Caliper Technologies Corporation High throughput microfluidic systems and methods
JP4274399B2 (ja) 1998-09-17 2009-06-03 アドヴィオン バイオシステムズ インコーポレイテッド 一体化モノリシックマイクロ加工したエレクトロスプレーと液体クロマトグラフィーのシステムおよび方法
US6146842A (en) 1998-09-21 2000-11-14 Mitotix, Inc. High-throughput screening assays utilizing metal-chelate capture
US6605472B1 (en) 1998-10-09 2003-08-12 The Governors Of The University Of Alberta Microfluidic devices connected to glass capillaries with minimal dead volume
US6149787A (en) 1998-10-14 2000-11-21 Caliper Technologies Corp. External material accession systems and methods
RU2143343C1 (ru) 1998-11-03 1999-12-27 Самсунг Электроникс Ко., Лтд. Микроинжектор и способ изготовления микроинжектора
US6541539B1 (en) * 1998-11-04 2003-04-01 President And Fellows Of Harvard College Hierarchically ordered porous oxides
US6958865B1 (en) 1998-11-12 2005-10-25 California Institute Of Technology Microlicensing particles and applications
US6062261A (en) * 1998-12-16 2000-05-16 Lockheed Martin Energy Research Corporation MicrofluIdic circuit designs for performing electrokinetic manipulations that reduce the number of voltage sources and fluid reservoirs
US6887693B2 (en) 1998-12-24 2005-05-03 Cepheid Device and method for lysing cells, spores, or microorganisms
US6361671B1 (en) * 1999-01-11 2002-03-26 The Regents Of The University Of California Microfabricated capillary electrophoresis chip and method for simultaneously detecting multiple redox labels
US6150119A (en) 1999-01-19 2000-11-21 Caliper Technologies Corp. Optimized high-throughput analytical system
AU3508600A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Orchid Biosciences, Inc. Microstructures for use in biological assays and reactions
US6749814B1 (en) 1999-03-03 2004-06-15 Symyx Technologies, Inc. Chemical processing microsystems comprising parallel flow microreactors and methods for using same
US6171850B1 (en) * 1999-03-08 2001-01-09 Caliper Technologies Corp. Integrated devices and systems for performing temperature controlled reactions and analyses
JP2002537854A (ja) 1999-03-08 2002-11-12 メルク フロスト カナダ アンド カンパニー タンパク質チロシンホスファターゼの無傷細胞アッセイ
US6500323B1 (en) 1999-03-26 2002-12-31 Caliper Technologies Corp. Methods and software for designing microfluidic devices
DE60034033T2 (de) 1999-04-06 2007-12-06 University of Alabama, Birmingham Research Foundation, Birmingham Vorrichtung zum screening von kristallisierungsbedingungen in lösungen zur kristallzüchtung
US6346373B1 (en) 1999-05-05 2002-02-12 Merck Frosst Canada & Co., Whole cell assay for cathepsin K activity
GB9911095D0 (en) 1999-05-13 1999-07-14 Secr Defence Microbiological test method and reagents
US6225109B1 (en) * 1999-05-27 2001-05-01 Orchid Biosciences, Inc. Genetic analysis device
CA2370623C (en) * 1999-06-08 2004-07-20 Medical Research Group, Inc. Method and apparatus for infusing liquids using a chemical reaction in an implanted infusion device
US6296673B1 (en) 1999-06-18 2001-10-02 The Regents Of The University Of California Methods and apparatus for performing array microcrystallizations
US7459022B2 (en) 2001-04-06 2008-12-02 California Institute Of Technology Microfluidic protein crystallography
US8550119B2 (en) 1999-06-28 2013-10-08 California Institute Of Technology Microfabricated elastomeric valve and pump systems
US6899137B2 (en) 1999-06-28 2005-05-31 California Institute Of Technology Microfabricated elastomeric valve and pump systems
US6929030B2 (en) 1999-06-28 2005-08-16 California Institute Of Technology Microfabricated elastomeric valve and pump systems
US7144616B1 (en) 1999-06-28 2006-12-05 California Institute Of Technology Microfabricated elastomeric valve and pump systems
DE60000109T2 (de) * 1999-06-28 2002-11-07 California Institute Of Technology, Pasadena Elastomerische mikropumpen- und mikroventilsysteme
US7306672B2 (en) 2001-04-06 2007-12-11 California Institute Of Technology Microfluidic free interface diffusion techniques
US6533914B1 (en) * 1999-07-08 2003-03-18 Shaorong Liu Microfabricated injector and capillary array assembly for high-resolution and high throughput separation
DE19933614C1 (de) 1999-07-17 2000-11-30 Moeller Gmbh Kontaktsystem mit einem zweiarmigen Kontaktarm
AU6117700A (en) 1999-07-23 2001-02-13 Board Of Trustees Of The University Of Illinois, The Microfabricated devices and method of manufacturing the same
WO2001007061A1 (en) 1999-07-27 2001-02-01 Smithkline Beecham Corporation Whole cell assay
US6977145B2 (en) 1999-07-28 2005-12-20 Serono Genetics Institute S.A. Method for carrying out a biochemical protocol in continuous flow in a microreactor
WO2001009595A2 (en) 1999-08-02 2001-02-08 Emerald Biostructures, Inc. Method and system for creating a crystallization results database
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
GB9923324D0 (en) 1999-10-01 1999-12-08 Pyrosequencing Ab Separation apparatus and method
DE29917313U1 (de) 1999-10-01 2001-02-15 MWG-BIOTECH AG, 85560 Ebersberg Vorrichtung zur Durchführung chemischer oder biologischer Reaktionen
CA2388528A1 (en) * 1999-11-04 2001-05-10 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US6875619B2 (en) * 1999-11-12 2005-04-05 Motorola, Inc. Microfluidic devices comprising biochannels
US6866785B2 (en) * 2001-08-13 2005-03-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Photopolymerized sol-gel column and associated methods
AU2001240040A1 (en) * 2000-03-03 2001-09-17 California Institute Of Technology Combinatorial array for nucleic acid analysis
US6541071B1 (en) * 2000-03-23 2003-04-01 Corning Incorporated Method for fabricating supported bilayer-lipid membranes
US6358387B1 (en) * 2000-03-27 2002-03-19 Caliper Technologies Corporation Ultra high throughput microfluidic analytical systems and methods
AU2001251218B2 (en) * 2000-03-31 2006-06-29 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Protein crystallization in microfluidic structures
US7279146B2 (en) 2003-04-17 2007-10-09 Fluidigm Corporation Crystal growth devices and systems, and methods for using same
US7867763B2 (en) 2004-01-25 2011-01-11 Fluidigm Corporation Integrated chip carriers with thermocycler interfaces and methods of using the same
US20050118073A1 (en) 2003-11-26 2005-06-02 Fluidigm Corporation Devices and methods for holding microfluidic devices
US7351376B1 (en) 2000-06-05 2008-04-01 California Institute Of Technology Integrated active flux microfluidic devices and methods
EP1328803B1 (en) * 2000-06-14 2005-09-07 The Board Of Regents, The University Of Texas System Systems and methods for cell subpopulation analysis
US6885982B2 (en) * 2000-06-27 2005-04-26 Fluidigm Corporation Object oriented microfluidic design method and system
US6829753B2 (en) 2000-06-27 2004-12-07 Fluidigm Corporation Microfluidic design automation method and system
JP3542550B2 (ja) 2000-07-19 2004-07-14 本田技研工業株式会社 燃料電池用シールの成形方法
US6301055B1 (en) * 2000-08-16 2001-10-09 California Institute Of Technology Solid immersion lens structures and methods for producing solid immersion lens structures
EP1334347A1 (en) 2000-09-15 2003-08-13 California Institute Of Technology Microfabricated crossflow devices and methods
US6787339B1 (en) 2000-10-02 2004-09-07 Motorola, Inc. Microfluidic devices having embedded metal conductors and methods of fabricating said devices
EP1322936A2 (en) * 2000-10-03 2003-07-02 California Institute Of Technology Microfluidic devices and methods of use
US6508988B1 (en) * 2000-10-03 2003-01-21 California Institute Of Technology Combinatorial synthesis system
US7678547B2 (en) * 2000-10-03 2010-03-16 California Institute Of Technology Velocity independent analyte characterization
US7097809B2 (en) 2000-10-03 2006-08-29 California Institute Of Technology Combinatorial synthesis system
US6827095B2 (en) * 2000-10-12 2004-12-07 Nanostream, Inc. Modular microfluidic systems
EP1336097A4 (en) 2000-10-13 2006-02-01 Fluidigm Corp SAMPLE INJECTION SYSTEM USING A MICROFLUIDIC DEVICE, FOR ANALYSIS DEVICES
DE60103924T2 (de) * 2000-11-06 2005-07-14 Nanostream, Inc., Pasadena Mikrofluidische durchflussregelvorrichtung
WO2002065005A1 (en) 2000-11-06 2002-08-22 California Institute Of Technology Electrostatic valves for microfluidic devices
AU2002248149A1 (en) 2000-11-16 2002-08-12 Fluidigm Corporation Microfluidic devices for introducing and dispensing fluids from microfluidic systems
AU2002230524A1 (en) 2000-11-16 2002-05-27 California Institute Of Technology Apparatus and methods for conducting assays and high throughput screening
US6736978B1 (en) 2000-12-13 2004-05-18 Iowa State University Research Foundation, Inc. Method and apparatus for magnetoresistive monitoring of analytes in flow streams
US20050196785A1 (en) 2001-03-05 2005-09-08 California Institute Of Technology Combinational array for nucleic acid analysis
JP2004523243A (ja) 2001-03-12 2004-08-05 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 非同期性塩基伸長によってポリヌクレオチド配列を分析するための方法および装置
US7005493B2 (en) 2001-04-06 2006-02-28 Fluidigm Corporation Polymer surface modification
EP1392484B1 (en) 2001-04-06 2013-06-12 California Institute Of Technology High throughput screening of crystalization of materials
US6752922B2 (en) 2001-04-06 2004-06-22 Fluidigm Corporation Microfluidic chromatography
US20020164816A1 (en) 2001-04-06 2002-11-07 California Institute Of Technology Microfluidic sample separation device
US6802342B2 (en) 2001-04-06 2004-10-12 Fluidigm Corporation Microfabricated fluidic circuit elements and applications
EP1384022A4 (en) 2001-04-06 2004-08-04 California Inst Of Techn AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID USING MICROFLUIDIC DEVICES
US6677131B2 (en) * 2001-05-14 2004-01-13 Corning Incorporated Well frame including connectors for biological fluids
US7318912B2 (en) * 2001-06-07 2008-01-15 Nanostream, Inc. Microfluidic systems and methods for combining discrete fluid volumes
US6847153B1 (en) * 2001-06-13 2005-01-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Polyurethane electrostriction
US6444318B1 (en) * 2001-07-17 2002-09-03 Surmodics, Inc. Self assembling monolayer compositions
US7075162B2 (en) 2001-08-30 2006-07-11 Fluidigm Corporation Electrostatic/electrostrictive actuation of elastomer structures using compliant electrodes
JP2005505441A (ja) 2001-10-08 2005-02-24 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 微小加工レンズ、その製造の方法および応用
WO2003031066A1 (en) * 2001-10-11 2003-04-17 California Institute Of Technology Devices utilizing self-assembled gel and method of manufacture
US6627076B2 (en) 2001-10-19 2003-09-30 Sandia National Laboratories Compact microchannel system
EP1463796B1 (en) 2001-11-30 2013-01-09 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
US7691333B2 (en) * 2001-11-30 2010-04-06 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
US6662818B2 (en) 2002-02-01 2003-12-16 Perseptive Biosystems, Inc. Programmable tracking pressure regulator for control of higher pressures in microfluidic circuits
US6581441B1 (en) 2002-02-01 2003-06-24 Perseptive Biosystems, Inc. Capillary column chromatography process and system
EP2666849A3 (en) 2002-04-01 2014-05-28 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
US7312085B2 (en) * 2002-04-01 2007-12-25 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
US7059348B2 (en) 2002-05-13 2006-06-13 Fluidigm Corporation Drug delivery system
US8168139B2 (en) 2002-06-24 2012-05-01 Fluidigm Corporation Recirculating fluidic network and methods for using the same
AU2003282875A1 (en) 2002-09-25 2004-04-19 California Institute Of Technology Microfluidic large scale integration
JP5695287B2 (ja) * 2002-10-02 2015-04-01 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 微小流体の核酸解析
GB0302302D0 (en) 2003-01-31 2003-03-05 Glaxo Group Ltd Microfluidic apparatus and method
US7041481B2 (en) 2003-03-14 2006-05-09 The Regents Of The University Of California Chemical amplification based on fluid partitioning
US8828663B2 (en) 2005-03-18 2014-09-09 Fluidigm Corporation Thermal reaction device and method for using the same
JP5419248B2 (ja) * 2003-04-03 2014-02-19 フルイディグム コーポレイション マイクロ流体装置およびその使用方法
US7476363B2 (en) * 2003-04-03 2009-01-13 Fluidigm Corporation Microfluidic devices and methods of using same
US20050145496A1 (en) 2003-04-03 2005-07-07 Federico Goodsaid Thermal reaction device and method for using the same
US7604965B2 (en) 2003-04-03 2009-10-20 Fluidigm Corporation Thermal reaction device and method for using the same
AU2004240944A1 (en) 2003-05-20 2004-12-02 Fluidigm Corporation Method and system for microfluidic device and imaging thereof
JP2007506943A (ja) 2003-07-28 2007-03-22 フルイディグム コーポレイション マイクロ流体装置用の画像処理方法およびシステム
US7042649B2 (en) 2003-08-11 2006-05-09 California Institute Of Technology Microfabricated rubber microscope using soft solid immersion lenses
US7413712B2 (en) * 2003-08-11 2008-08-19 California Institute Of Technology Microfluidic rotary flow reactor matrix
WO2005054441A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 California Institute Of Technology Device for immobilizing chemical and biomedical species and methods of using same
US7407799B2 (en) * 2004-01-16 2008-08-05 California Institute Of Technology Microfluidic chemostat
US20050195785A1 (en) * 2004-03-08 2005-09-08 Pentax Corporation Image signal processing device
CN103884698B (zh) 2004-06-07 2017-04-12 先锋生物科技股份有限公司 用于微流体器件的光学透镜系统和方法
US20080264863A1 (en) 2004-12-03 2008-10-30 California Institute Of Technology Microfluidic Sieve Valves
WO2006071470A2 (en) 2004-12-03 2006-07-06 California Institute Of Technology Microfluidic devices with chemical reaction circuits
US7883669B2 (en) 2005-04-20 2011-02-08 Fluidigm Corporation Analysis engine and database for manipulating parameters for fluidic systems on a chip
US20070054293A1 (en) 2005-08-30 2007-03-08 California Institute Of Technology Microfluidic chaotic mixing systems and methods
US8206975B2 (en) 2005-10-28 2012-06-26 California Institute Of Technology Method and device for regulating fluid flow in microfluidic devices
US20070248971A1 (en) 2006-01-26 2007-10-25 California Institute Of Technology Programming microfluidic devices with molecular information
EP1987358A4 (en) 2006-01-26 2013-12-04 California Inst Of Techn MECHANICAL TRAPPING OF MOLECULAR INTERACTIONS
US7815868B1 (en) 2006-02-28 2010-10-19 Fluidigm Corporation Microfluidic reaction apparatus for high throughput screening
US8828661B2 (en) 2006-04-24 2014-09-09 Fluidigm Corporation Methods for detection and quantification of nucleic acid or protein targets in a sample
US8055034B2 (en) * 2006-09-13 2011-11-08 Fluidigm Corporation Methods and systems for image processing of microfluidic devices
WO2008067552A2 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Fluidigm Corporation Method and apparatus for biological sample analysis
WO2008082385A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Carrier Corporation Uninterruptable power supply for water pump
EP2125219B1 (en) 2007-01-19 2016-08-10 Fluidigm Corporation High precision microfluidic devices and methods
US7974380B2 (en) 2007-05-09 2011-07-05 Fluidigm Corporation Method and system for crystallization and X-ray diffraction screening
CA2698545C (en) * 2007-09-07 2014-07-08 Fluidigm Corporation Copy number variation determination, methods and systems
US9487822B2 (en) 2008-03-19 2016-11-08 Fluidigm Corporation Method and apparatus for determining copy number variation using digital PCR
US8058630B2 (en) 2009-01-16 2011-11-15 Fluidigm Corporation Microfluidic devices and methods

Also Published As

Publication number Publication date
EP1463796A4 (en) 2006-03-08
US7118910B2 (en) 2006-10-10
US20130065773A1 (en) 2013-03-14
EP1463796A1 (en) 2004-10-06
EP1463796B1 (en) 2013-01-09
US7820427B2 (en) 2010-10-26
JP2005512031A (ja) 2005-04-28
US8163492B2 (en) 2012-04-24
JP4355210B2 (ja) 2009-10-28
US20110053784A1 (en) 2011-03-03
JP2009178167A (ja) 2009-08-13
WO2003048295A1 (en) 2003-06-12
US20070004031A1 (en) 2007-01-04
EP2360234B1 (en) 2015-07-22
US20030138829A1 (en) 2003-07-24
US20070004033A1 (en) 2007-01-04
EP2360234A1 (en) 2011-08-24
AU2002351187A1 (en) 2003-06-17
CA2467587A1 (en) 2003-06-12
US9643178B2 (en) 2017-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2403560T3 (es) Dispositivo microfluídico y procedimientos de utilización del mismo
US10131934B2 (en) Thermal reaction device and method for using the same
CA2521171C (en) Microfluidic devices and methods of using same
US8007746B2 (en) Microfluidic devices and methods of using same
US7867454B2 (en) Thermal reaction device and method for using the same
US7837946B2 (en) Microfluidic device and methods of using same
EP2371453A1 (en) Microfluidic device
CA2807591C (en) Microfluidic devices and methods of using same
US20180243741A1 (en) Thermal reaction device and method for using the same