JP5441035B2 - 試料解析装置 - Google Patents

Description

本発明は、多数の固体試料と液体試料との組み合わせを簡素な構造で解析できる試料解析装置に関し、具体的には、ガス透過性材料からなる基板、圧力調節機構、及び弁機構を利用した構造で解析できる試料解析装置に関する。好適な例示として、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のガス透過性材料からなる基板に、プライマーが予め塗布・乾燥された反応チャンバと、ＰＤＭＳのガス透過性を利用して溶液を反応チャンバに一定量、導入する機構とが設けられた遺伝子解析用ＰＣＲチップに関する。

ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、「ＰＣＲ」と呼ぶ。）は核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の増幅に用いられる生体分子操作の一つである。配列に対する特異性と極微量の試料から非常に多くの核酸断片のコピーを得ることが可能であることから、生物、臨床診断、法医学検査等の多岐にわたる分野において、配列解析や遺伝子型解析に用いられている。

近年、マイクロ・エレクトロ・メキャニカル・システム（Ｍｉｃｒｏ ｅｌｅｃｔｒｏ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ、ＭＥＭＳ）技術を利用して、従来のＰＣＲ装置を小型化することで、数センチ角のチップ上でＰＣＲを行う技術の開発が盛んになってきている。この小型化されたＰＣＲチップは、従来のＰＣＲ法に比べて、解析時間の短縮、加熱・冷却サイクル時間の短縮、必要なＰＣＲ溶液の量が微量で済む、ＰＣＲの対象となるゲノムを含む試料を前処理する機構を集積化できる等の利点を持つ。重要な利点として、チップ内に作製された多数の微小なＰＣＲ反応器を使って、極微量の試料に含まれる核酸から、多種の配列を標的として増幅できることが挙げられる。チップ上で流路を用いて定量ＰＣＲを並列処理することで、一つの微量な試料に含まれる多数の標的配列を効率良く検出することが期待される。しかし、このＰＣＲチップの開発には、以下に記述するような解決すべき課題がある。

（ＰＣＲチップの複雑化）
ＰＣＲチップでは、プライマーと試料をチップ内で計量し、混合する必要がある。ｎ個の試料に含まれるｍ種類の標的配列を解析するには、チップの中でｍ×ｎのマトリックスを作り、その交点で対応するＰＣＲを行う方法が、大幅に実験の手間を省くことができるため有効である。しかし、これを実現するには、小さなチップ内の各交点でプライマーと試料サンプルを計量し、混合する必要がある。従来の技術では、多数の配管や流路、マイクロバルブやマイクロミキサー等が必要になり、大変複雑な構造になっていた（例えば、非特許文献１〜４を参照）。

そのため複雑な配管、マイクロバルブやポンプを集積化する代わりに、マイクロサイズの流路の特性を利用して毛細管現象でＰＣＲ試薬の送液を行い、計量した報告もある（例えば、非特許文献５）。この非特許文献５に記載の毛細管現象を利用した方法では、流路壁面とＰＣＲ溶液の接触角を最小限にして送液効率を上げるために、ＰＣＲ反応液に界面活性剤を混ぜている。しかし、界面活性剤がＰＣＲ反応を阻害するため、極微量のゲノムを増幅するには向いていない。

（計量・気泡残留の問題）
また、従来のＰＣＲチップでは、反応器内に気泡が残留してしまうことが多い。気泡の発生要因として、（１）液体試料を最初に導入する際の気体の混入が挙げられる。つまり、流路内での小さなゴミ、埃、突起物が原因となって液体試料中に気体が混入されるのである。これはストレートな流路でも発生する。また、（２）ＰＣＲ反応工程に伴うチップの昇温中に液体試料内の溶存ガスが気化することでも発生する。これは、温度上昇に伴い、液体中のガスの溶解度が下がり、溶けきれないガスが気体として現われるからである。さらに、（３）チップ昇温中に樹脂基板（例えば、ＰＤＭＳ）内の溶存ガスが気化して流路壁を介して液体試料中に混入されることでも発生する。

以上のように、気泡の発生は、液体試料の導入時のみならず、ＰＣＲ処理中にも確認されるものであり、残留した気泡はＰＣＲによる計量（定量性）を著しく阻害してしまう。また、遺伝子有無の判定では大きな問題にならないが、ダウン症の診断のように定量性が厳密に要求される場合は致命的である。気泡は温度サイクル中に膨張・収縮を繰り返すので更なる計量誤差を生んでしまう。

（試料溶液の蒸発）
また、チップ内の小さい反応器内において極微量の試料を用いてＰＣＲを実行するためには、反応液の蒸発を防ぐ工夫が必要不可欠である。特にＤＮＡの変性には百度近い温度への昇温を必要とするため、溶液の蒸発は速く、標準的な大気圧下では試料は乾燥し、完全に無くなってしまうこともある（例えば、非特許文献６を参照）。

この蒸発の問題を回避するために、沸点が１００℃より高く、密度も１．０ｇ／ｃｍ^３以下であるミネラルオイルが、蒸発防止膜として良く用いられる（例えば、特許文献１、非特許文献７，８を参照）。これらの文献に記載の方法は、ピペッティングにより試料の導入を行う開放型のウェル反応器を用いたＰＣＲに適している。しかし、多くの素子を集積化した遺伝子解析用ＰＣＲチップでは、密閉した反応器でＰＣＲが行われるため、ミネラルオイル法で蒸発を防ぐのは難しい。

特開２００７−１７５００６号公報

BioMark Product、「リアルタイムqPCR用ダイナミックアレイ」、［online］、Fluidigm社、［平成２１年１０月２８日検索］、インターネット〈ＵＲＬ：http://www.fluidigm.jp/biomark_qPCR.htm〉 Jian Liu, Carl Hansen,Stephen R. Quake; Solving the "world-to-chip" interface problem with amicrofluidic matrix; Ana.Chem, 75, 4718-4723 David S.Kong, PeterA.Carr, Lu Chen, Shuguang Zhang, Joseph M. Jacobson; Parallel gene synthesis inthe microfluidic device; Nucleic Acids Research, 2007, Vol.35, No.8 Chunsun Zhang, Da Xing,Yuyuan Li; Micropumps, microvalves, and micromixers within PCR microfluidicchips: Advances and trends; Biotechnology Advances 25 (2007) 483-514 N. Ramalingam, Hao-BingLiu, Chang-Chun Dai, Yu Jiang, Hui Wang, Quighui Wang, Kam M Hui, Hai-QingGong; Real-time PCR array chip with capillary-driven sample loading and reactorsealing for point-of-care applications; Biomed Microdevices; Doi 10.1007/s10544-009-9318-4 Chunsun Zhang, Da Xing;Miniaturized PCR chips for nucleic acid amplification and analysis: lastestadvances and future trends; Nucleic Acids Research, 2007, Vol.35, No 13(4233-4237) Neuzil P, Zhang C.Y,Pipper J, Oh S, Zhuo L; Ultra fast miniaturized real-time PCR: 40 cycles inless than six minutes ; Nucleic Acids Research, 2006, Vol.35, No 13 (4233-4237) Xiang Q, Xu B, Fu R, LiD; Real time PCR on disposable PDMS chip with a miniaturized thermal cycler;Biomed. Microdevices, 7, 273-279.

本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、従来の遺伝子解析装置等が有する欠点（例えば、装置構造の複雑化）を排除した試料解析装置を提供することを目的とする。すなわち、多数の試料と標的との組み合わせを簡素な構造で解析できる試料解析装置を提供することを目的とする。

また、本発明は、従来の遺伝子解析装置等が有する別の欠点（例えば、気泡の残留や試料溶液の蒸発）を排除し、試料溶液の厳密な計量が可能な試料解析装置を提供することを目的とする。

また、本発明は、遺伝子解析分野に限らず、固体試料と液体試料との反応を簡素な構造で解析できる試料解析装置を提供することを目的とする。

本願の発明者らは、複数の反応チャンバを備えた基板（またはその一部）にガス透過性材料を選択すれば、圧力増減機構と反応チャンバを直に接続しなくても反応チャンバ内へ試料溶液を導入することができること、反応チャンバの内側に試料溶液の一部（ＰＣＲ法では、各種プライマー）を予め塗布（スポット）して乾燥させておくようにすれば、貯蔵チャンバから各反応チャンバへの試料溶液の導入が簡素な構造で行うことが出来ること、及び、これらの点を組み合わせれば、従来の遺伝子解析装置での問題が一挙に解消され、信頼性の高い遺伝子解析が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。

また、本願発明者は、遺伝子解析に限らず、固体試料と液体試料とを反応させる解析にも上記発案点を応用できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明に係る試料解析装置は、
液体試料を収容可能な少なくとも一つ以上の貯蔵チャンバと、
固体試料が収容された少なくとも一つ以上の反応チャンバと、
貯蔵チャンバと反応チャンバとを連通する液体導入流路と、
反応チャンバ近傍に設けられた排出チャンバと、
を備え、かつ、
反応チャンバと排出チャンバとの間にはガス透過材料を含んだ壁が設けられ、
反応チャンバと排出チャンバとの間に生じた圧力差によって、液体導入流路及び反応チャンバ内のガス並びに液体試料中のガスが壁を通して排出チャンバに吸引されるとともに、貯蔵チャンバから反応チャンバに液体試料が導入・充填され、
反応チャンバは円筒形を成し、
排出チャンバは反応チャンバを同心円状に囲繞した溝を成し、
壁の壁厚は１０μｍ〜５００μｍの範囲にあり、
排出チャンバの圧力は、液体試料を反応チャンバへ導入するために、０．２〜０．９気圧に設定されることを特徴とするものである。

本発明の試料解析装置によれば、固体試料と液体試料との反応を簡素な構造で解析できる。

本発明によれば、特に遺伝子解析分野において従来の装置が有する欠点を排除した試料解析装置（例えば、ＰＣＲチップ）を提供することができる。具体的には、多数の試料と標的との組み合わせを簡素な構造で解析できるＰＣＲチップを提供することができる。また、従来の遺伝子解析装置が有する気泡の残留や試料溶液の蒸発等の問題点を排除したＰＣＲチップを提供することができる。さらに、気泡等の残留が発生しないことに加え、反応チャンバの容積一杯に（つまり定量）試料溶液を充填させることができるため、厳密に計量された溶液を用いてＰＣＲ処理が可能なＰＣＲチップを提供することができる。

本発明の試料解析装置の発明概念（主な構造）を示した図である。 ｍ種類の液体試料とｎ種類の固体試料とを含んだ試料解析装置を示した図である。 本発明の一実施例である遺伝子解析用ＰＣＲチップの分解斜視図を示した図である。（実施例１） 本発明のＰＣＲチップの分解平面図を示した図である。 本発明のＰＣＲチップに設けられた反応チャンバ及び排出チャンバを示した図である。 本発明の反応チャンバへ流入する試料溶液を示した図である。 本発明のＰＣＲチップに設けられた弁機構を示した図である。 反応チャンバと排出チャンバとを画す壁の壁厚Ｄと試料溶液導入時間との関係を示したグラフである。 本発明の他の実施例であるＰＣＲチップの断面構造を示した図である。 熱サイクル試験前後のＰＣＲチップの様子を示した図である。 熱サイクル試験前後のＰＣＲチップの反応チャンバを拡大して示した図である。 ＰＣＲ実行後のＰＣＲチップの様子を示した図である。 ＰＣＲ実行後のＰＣＲチップの反応チャンバを示した蛍光画像である。

以下、本発明を図面に示す実施の形態に基づき説明するが、本発明は、下記の具体的な
実施形態に何等限定されるものではない。

図１は本発明の試料解析装置１の発明概念（主な構造）を示した図である。試料解析装置１は、液体部分（液体試料）２と固体部分（固体試料）３とからなる試料を利用し、双方２，３を接触させることでその化学反応の評価を行うものである。ここで、液体試料２とは、例えば、ＰＣＲ用の調整液から解析部位を特定するもの（プライマーやＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ等）を除いたもの（テンプレートＤＮＡ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等）、遺伝子検査用サンプル、ＲＮＡ検査用サンプル等が挙げられるが、必ずしもこれに限定されない。一方、固体試料３とは、上記のような解析部位を特定するもの、例えばＤＮＡの標的となるプライマー、ＴａｑＭａｎプローブ、基質特異的酵素、抗体等が挙げられるが、必ずしもこれに限定されない。

試料解析装置１は、液体試料２を収容可能な少なくとも一つ以上の貯蔵チャンバ３２（図１では一つ）と、固体試料３が収容された少なくとも一つ以上の反応チャンバ（図１では一つ）と、貯蔵チャンバ３２と反応チャンバ３５とを連通する液体導入流路３４と、反応チャンバ３５近傍に設けられた排出チャンバ３６と、を備える。試料解析装置１には、さらに、反応チャンバ３５と排出チャンバ３６との間にはガス透過材料を含んだ壁Ｗ_ｐが設けられる。そして、試料解析装置１は、反応チャンバ３５と排出チャンバ３６との間に生じた圧力差によって、液体導入流路３４及び反応チャンバ３５内のガス並びに液体試料２中のガスが壁Ｗ_ｐを通して排出チャンバ３６に吸引されるとともに、貯蔵チャンバ３２から反応チャンバ３５に液体試料２を導入・充填することを特徴とする。

また、本発明の試料解析装置１は、反応チャンバ３５と排出チャンバ３６との間に圧力差を発生させる圧力差発生機構をさらに備えてもよい。この圧力差発生機構は、排出チャンバ３６の圧力を減少させる減圧機構であってもよいし、反応チャンバ３５の圧力を加圧する加圧機構であってもよい。なお、以下の実施形態及び実施例では、圧力差発生機構が減圧機構である場合について説明している。減圧機構は、図示のように、例えば、排出ポート３３と、排出ポート３３と排出チャンバ３６とに連結された排出流路３７と、を含み、排出ポート３３から図示しないマイクロポンプ等によって排出チャンバ３６内のガスを排出させることで排出チャンバ３６の減圧を行う。減圧機構は、排出チャンバ３６を減圧することで、壁Ｗ_ｐを通して反応チャンバ３５内のガスを吸引し、貯蔵チャンバ３２から反応チャンバ３５に液体試料２を導入・充填する。

ここで、壁Ｗ _ｐ に使用可能なガス透過材料には、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、アクリル系ポリマー、シリコーンゴム、各種エラストマー等が挙げられる。ここで、ＰＤＭＳは、透明性に優れた材料であるため光学解析手法による検知に適しており、生体適合性があるため生体試料分析にも適しており、また、柔軟性に富むことはもちろん、自己吸着性があるので特殊な接合プロセスが不要であり、優れた形状転写性を有し、さらには低価格でもあるため、ＰＣＲチップの構造、作製方法を低コストでより簡単・簡素にすることが可能である。また、耐熱性に優れるために多様な表面改質が可能である。また、反応チャンバ３５、排出チャンバ３６、壁Ｗ_ｐが一枚の基板３１に設けられ、この基板３１自体がガス透過材料からなるものであってもよい（図３、図４を参照）。

図１では本発明の概念を説明するための便宜上、貯蔵チャンバ３２と反応チャンバ３５とを１つのみ示したが、図２に示すように、複数（図２ではｍ個）の貯蔵チャンバ３２と、複数（図２ではｎ個）の反応チャンバ３５とが試料解析装置１に設置されることが好ましく、液体導入流路３４は、一つの貯蔵チャンバ３２から複数の反応チャンバ３５に分岐させる分岐流路３４ａを備えていることが好ましい。

このような構成にすることにより、固体試料（例えば、標的となるｎ種類のプライマー）３をｎ個の反応チャンバ３５に一種類ずつ塗布させておき、ｍ種類の液体試料（細胞や核酸を含んだ溶液）２を貯蔵チャンバ３２に一種類ずつ収容しておけば、一つの試料解析装置１において、ｍ種類×ｎ種類の液体試料２と固体試料３との組み合わせ・反応の評価を簡素な流路構造で達成することが可能になる。

例えば、液体試料２に細胞を含んだ溶液を用いて解析する場合、貯蔵チャンバ３２と反応チャンバ３５との間を連通する液体導入流路３４上に細胞培養チャンバを設けてもよく、これにより、全ての反応チャンバ３５に塗布された固体試料３に対応する数以上の細胞を培養して、反応チャンバ３５の各々に液体試料２を導入することが可能になる。

液体導入流路３４には、流路を開閉する弁機構５が設けられることが好ましく、図２に示すように、それぞれの分岐流路３４ａ上に弁機構５が設けられることが好ましい。このような構成を採用することにより、反応チャンバ３５に一旦導入された液体試料２が、貯蔵チャンバ３２や隣接した反応チャンバ３５へ逆流したり、流出したりする危険性を排除することができる。また、ＰＣＲ解析で必要な熱サイクルにおいて各々の反応チャンバ３５の反応の独立性を担保することが可能になる。

（実施例１）
次に、実際に作製された本発明の試料解析装置１として、遺伝子解析用ＰＣＲチップを例示して説明する。図３はＰＣＲチップ１の分解斜視図を示す。図示のように、ＰＣＲチップ１は、少なくとも一層の弁制御層１０と、少なくとも一層の流路層３０と、これらの間に挟持された薄膜層２０と、を備える。以下に、各々層の構成・機能について詳述する。

（試料解析装置の構成）
図４（ａ）は、弁制御層１０の平面図を示す。弁制御層１０は、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる平板状の基板１１上に、ガス量調節ポート１２と、複数（図４（ａ）では５個）の弁開口部１４と、ガス量調節ポート１２と各々の弁開口部１４とを連通するガス量調節流路１３と、が設けられている。

図４（ｂ）は、流路層３０の平面図を示す。流路層３０は、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる平板状の基板３１上に、液体試料２が一時的に保管される貯蔵チャンバ３２（又は、貯蔵チャンバ３２に連結される液体試料供給ポート）と、液体導入流路３４と、複数（図４（ｂ）では５個）の反応チャンバ３５と、複数（反応チャンバ３５の数に対応した数、つまり５個）の排出チャンバ３６と、排出流路３７と、排出ポート３３と、が設けられている。液体導入流路３４は、貯蔵チャンバ３２から反応チャンバ３５へ液体試料２が供給されるように複数（図４（ｂ）では５本）の分岐流路３４ａに分岐される。反応チャンバ３５は、分岐流路３４ａの突き当たりにある空洞であり、この空洞の内側表面の一部には、液体試料２の標的となるプライマー３が予めスポットされ、乾燥処理されている（つまり、固体試料３が塗布されている）。ＰＤＭＳ基板３１の一部である壁Ｗ_ｐを介して反応チャンバ３５を囲繞するように、排出チャンバ３６が夫々、基板３１上に設けられている。排出チャンバ３６は排出流路３７ａに連結され、排出チャンバ３６で取得されたガスが排出流路３７ａ,３７を介して排出ポート３３から排出される。

（ＰＣＲチップの作製方法）
以上のような構成のＰＣＲチップ１の作製方法の一例を示す。まず、シリコン基板にＳＵ８−２１００（ＭＩＣＲＯ ＣＨＥＭ社製）をスピンコート、ソフトベーク、及び露光等して、各層の所望形状に対応したモールドを作成する。その次に、ＰＤＭＳをモールドに流し込み、７５℃及び９０分の条件でベークすると、弁制御層１０、流路層３０がそれぞれ完成する。ＰＤＭＳは自己吸着性があるので、これを利用して、ＰＤＭＳからなる各層１０、２０、３０を結合してＰＣＲチップ１を完成させることができる。なお、弁制御層１０と薄膜層２０との間は、単に物理的に接触させただけでは結合力が弱いため、表面の濡れ性を改質し、化学的に修飾を加えることができるＯ_２プラズマ処理をさらに追加して結合力を向上することが好ましい。

（反応チャンバの構造及びガス透過性を利用した液体試料の導入方法）
次に、一例として、ＰＣＲチップ１内の反応チャンバ３５及びその周辺部の具体的な構造を、図５を参照しながら説明する。図５（ａ）は反応チャンバ３５及びその周辺部の斜視図を示し、図５（ｂ）は反応チャンバ３５及びその周辺部の平面図を示す。

図示の反応チャンバ３５は、基板３１上に設けられ、底の有る円筒状を成している。また、液体試料２を各々の反応チャンバ３５に運搬する分岐流路３４ａは矩形断面を有した溝形状をなし、反応チャンバ３５の円筒中心に向かって延びている。また、排出チャンバ３６は、円筒状の反応チャンバ３５を同心円状に囲繞するように反応チャンバ３５の外側に設けられ、矩形断面を有した溝形状を成している。反応チャンバ３５と排出チャンバ３６との間は、壁厚Ｄを有した壁Ｗ_ｐによって区画されている。なお、排出チャンバ３６に連結された排出流路３７ａは矩形断面を有した溝であり、反応チャンバ３５から離れるように延びている。

なお、本実施例で説明した流路層３０の基板３１に形成された各要素（反応チャンバ３５、排出チャンバ３６、分岐流路３４ａ等）の上側は、薄膜層２０によって覆われ、密閉される。

排出チャンバ３６は、通常、ガス（例えば空気）で満たされており、解析時には、排出ポート３３に接続された図示しないマイクロポンプが排出チャンバ３６内の空気を吸引することで、排出チャンバ３６が減圧される。そうすると、壁Ｗ_ｐはガス透過性があるため、反応チャンバ３５及び分岐流路３４ａ内のガス（例えば空気）を壁Ｗ_ｐ、排出チャンバ３６、排出流路３７ａ、及び排出ポート３３を介して、ＰＣＲチップ１の外側に排出される。これにより、内側表面の一部にプライマー３が予め塗布された反応チャンバ３５に液体試料２が導入され、液体試料２内の気泡は除去され、液体試料２のみが反応チャンバ３５に充填されることになり、より厳密に計量された極微量の液体試料２を反応チャンバ３５に導入することができる。なお、図６は、実物の反応チャンバ３５にメチルグリーンで染色した液体試料２が導入・充填されていく様子を示した画像である。

図８は、反応チャンバ３５と排出チャンバ３６との間の壁Ｗ_ｐの壁厚Ｄ（単位：ｍｍ）と、液体試料２が反応チャンバ３５へ完全に導入されるまでの時間（単位：秒）と、の関係を示した図である。ここで、壁Ｗ_ｐに生じる差圧ΔＰは約０．５気圧に設定した。この図から分かるように、壁厚Ｄを大きくする程、導入時間が長くなり、Ｄ＝０．６ｍｍのときには約１４００秒（約２３分）程度が要することがわかる。なお、差圧ΔＰの値を大きく取れば導入時間は減り（図示のプロットラインは全体的に下がり）、差圧ΔＰの値を小さく取れば導入時間はさらに要する（図示のプロットラインは全体的に上がる）傾向となる。なお、現時点でＰＣＲチップ１に通常使用されるマイクロポンプの吸引圧力は０．２〜０．９気圧であるため、壁厚Ｄは１０μｍ〜５００μｍの範囲に設定することが好ましい。１０μｍ未満にすると、減圧によって壊れやすくなる。

なお、実施例１の円筒状の反応チャンバ３５の好適な直径φは、φ＝２０μｍ〜５ｍｍの範囲が好ましい。直径φを下限未満にすると、液体試料２の蒸発の影響が顕著になるとともに蛍光等の信号が十分に検知されなくなり、直径φを上限より大きくすると、マイクロ流体用ＰＣＲチップにおいて多数の反応チャンバ３５を搭載できなくなってしまう。

ところで、液体試料２の導入を促進するため、図４（ｂ）に示すように、液体導入流路３４に一端が連結された分岐流路３４ｂ、分岐流路３４ｂの他端が連結された分岐チャンバ３４ｃ、分岐チャンバ３４ｃを囲繞する排出チャンバ３６ｂ、排出チャンバ３６ｂと排出流路３７とを連通する排出流路３７ｂをさらに設けるようにしてもよい。これにより、反応チャンバ３５へ連結する分岐流路３４ａの夫々の入口まで、液体試料２をより早く、より均一に牽引することが可能になる。

（弁機構の構成・動作）
次に、本発明のＰＣＲチップ１の弁機構５の一例を具体的に説明する。弁機構５は、弁制御層１０と、薄膜層２０と、流路層３０と、に設けられた構造によって所望の機能が達成される（図３、図４（ａ）、図７を参照）。図７に示すように、例えば立方空間を成す弁開口部１４が弁制御層１０に形成されており、この弁開口部１４の下方には、薄膜層２０及び分岐流路３４ａが敷設されている。分岐流路３４ａ上には、弁開口部１４の対応位置に、弁開口部１４より面積が小さい中実立方体状の突起３４_ｖが設けられている。

例えば、ＰＣＲ解析前、反応チャンバ３５への液体試料２の導入・充填後、又はＰＣＲ熱サイクルの時点では、図示しない流量調節手段によって、ガス量調節ポート１２及びガス量調節流路１３を通って弁開口部１４内へガス（例えば空気）が流入され、薄膜層２０で蓋をされた弁開口部１４は加圧される。これによって、図７（ｂ）に示すように、薄膜層２０は流路層３０側に撓んで突起３４_ｖの上面で固定され、ひいては、分岐流路３４ａを突起３４_ｖの位置にて閉じることになる。

一方、液体試料２を反応チャンバ３５へ導入する際には、図示しない流量調節手段によって、弁開口部１４内のガスを、ガス量調節流路１３及びガス量調節ポート１２を介して、ＰＣＲチップ１から排出され、薄膜層２０で蓋をされた弁開口部１４は減圧される。これによって、図７（ａ）に示すように、薄膜層２０は弁制御層１０側に撓んで弁開口部１４の内側上面で固定され、ひいては、分岐流路３４ａを開放することになる。

なお、弁制御層１０、薄膜層２０、流路層３０を例えば図４に示すように平面が同寸法の基板を用いれば、容易に弁開口部１４と分岐流路３４との位置合わせが行え、弁機構５を形成することが可能になる（図４（ｃ）を参照）。

以上、具体的な構成を示しながらガス透過性を利用した反応チャンバ３５への液体試料２の導入方法を説明したが、反応チャンバ３５、排出チャンバ３６、弁開口部１４等の要素の形状や構造は上記例示に限定されるものではない。例えば、排出チャンバ３６は、反応チャンバ３５を同心円状に囲繞する溝形状に限定されず、反応チャンバ３５を上下に所定距離だけ離れた空間であってもよい。

（実施例２）
次に本発明の他の実施例を説明する。図９（ａ）は実施例１のＰＣＲチップ１の断面構造を示し、図９（ｂ）は実施例２のＰＣＲチップ１の断面構造を示す。弁制御層１０と流路層３０がそれぞれ二層に分かれていること、及び、ガスバリア層４０ａ，４０ｂ，４０ｃ，４０ｄ，４０ｅ，４０ｆが層間に挿入されている以外の構成は実施例１と同様であり、その他の構成の説明は省略する。

実施例１の各層１０，２０，３０は上述の通りＰＤＭＳからなりガスを透過させるものであるが、例えば弁機構５によって圧縮されたガスが基板１１や薄膜層２０を透過して、分岐流路３４ａ、反応チャンバ３５等を流れる液体試料２に気泡を混入させる場合や、ＰＣＲ熱サイクル時に液体試料２が蒸発し、反応チャンバ３５に導入される前に上下の基板１１，３１からガスがリークしてしまう場合がある。従って、ガスバリア層４０（図では４０ａ，４０ｂ，４０ｃ，４０ｄ，４０ｅ，４０ｆ）のいずれかを図示のような各層間の位置に敷設している。ガスバリア層４０の材料として、例えば、パリレン、ＰＶＡ、不飽和ポリエステル、ＨＤＰＥ、ガラス等が挙げられる。図９の符号４０ｆに示すように、ＰＣＲチップ１の外側にガスバリア層４０を設ける場合には硬いガラスを使用するのが好ましい。なお、ＰＶＡは柔らかい材料であるためＰＶＡをガスバリア層４０として用いる場合は、弁制御層１０の基板１１ａ，１１ｂ間や流路層３０の基板３１ａ，３１ｂ間に配置することが好ましい（図の符号４０ａ、４０ｅ）。なお、ガスバリア層４０を他の層１０、２０、３０に結合させる際には、Ｏ_２プラズマ処理を施すことが好ましい。

（実施例３）
液体試料２に蒸発抑制剤４を添加させた以外の点は、実施例１の構成と同様である。蒸発抑制剤４としてグリセロール、エチレングリコール、ショ糖、トレハロースが挙げられる。ＰＣＲにおける熱サイクルでは、９５℃前後に過熱するステップが存在し、このとき、液体試料２が蒸発してしまい、ＰＣＲ検知に必須の量の液体試料２が得られない場合がある。しかしながら、上記のような蒸発抑制剤４を液体試料２に添加させておくことで液体試料２の沸点を数℃上げることが可能になり、熱サイクルを終えても十分な量の液体試料２を反応チャンバ３５内に残留させることができる。

（実施例４）
実施例２のガスバリア層４０を実施例１の装置構成に追加するとともに、実施例３の蒸発抑制剤４を液体試料２に添加したものである。

（熱サイクル試験結果）
図１０に実施例１のＰＣＲチップ１を用いた熱サイクル試験結果を示す。図１０（ａ）は熱サイクル試験前のＰＣＲチップ１の反応チャンバ３５の画像を示す。液体試料２には、着色されていない水を用いた。この図から明らかなように、液体試料２が反応チャンバ３５に夫々、完全に満たされていることがわかる。図１０（ｂ）は熱サイクル試験後の反応チャンバ３５の画像を示す。ここで、熱サイクル試験とは、ＰＣＲチップ１を９５℃で１０分間保持するステップ１と、ＰＣＲチップ１を９５℃で１５秒間保持した後、６５℃で６０秒間保持するステップ２と、４℃で維持するステップ３からなり、ステップ２を３０回繰り返す試験である。図１０（ｂ）の画像から、液体試料２は反応チャンバ３５に残留するものの、半分近い量の液体試料２が無くなっていることが確認できる。

図１１は、実施例４のＰＣＲチップ１を用いた熱サイクル試験結果を示す。図１１（ａ）及び（ｂ）は、熱サイクル試験前及び試験後のＰＣＲチップ１の反応チャンバ３５の画像を示す。熱サイクル試験の内容は上述した実施例１の試験内容と同様である。なお、液体試料２にはメチルグリーンで着色された水を用いた。これらの図を比較して明らかなように、熱サイクル試験を終えても液体試料２は蒸発しておらず、気泡も確認されなかった。

（ＰＣＲ試験結果）
図１２は、実施例２のＰＣＲチップ１を用いたＰＣＲ試験後の反応チャンバ３５の
画像を示す。液体試料２として、１０ｘＢｕｆｆｅｒ（５μｌ）、各２ｍＭ（なお、Ｍ＝ｍｏｌ／ｌ）のｄＮＴＰ（５μｌ）、２５ｍＭのＭｇＣｌ_２（７μｌ）、５Ｕ／μｌ（なお、Ｕ＝ｕｎｉｔｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標））（１．２５μｌ）、１０ｎｇ／μｌのヒト遺伝子ＤＮＡ（１μｌ）、及び水（３０．７５μｌ）を含んだ溶液を用意し、ＰＣＲチップ１に供給した。このＰＣＲチップ１の反応チャンバ３５には、固体試料３として、３μＭのフォワードプライマー、３μＭのリバースプライマー、及び２μＭのＴａｑＭａｎプローブ（Ｂｅｔａ Ａｃｔｉｎ Ｐｒｏｂｅ）とを含んだ溶液が予めスポットされている。（実施例２に係る液体試料２の各成分についての詳細は以下の表１を参照）。このＰＣＲチップ１に以下のＰＣＲ処理を行った。ＰＣＲ処理は、具体的には、９５℃で１０分間保持するステップ１と、ＰＣＲチップ１を９５℃で１５秒間保持した後、６０℃で６０秒間保持するステップ２と、２５℃で維持するステップ３からなり、ステップ２を３０回繰り返す試験である。図１２の画像から明らかなように、ＰＣＲ処理後に液体試料２が反応チャンバ３５内に残留するもののＰＣＲ処理中に多少蒸発していることがわかる。

図１３は、実施例４に係るＰＣＲチップ１を用いてＰＣＲ試験を行った後の反応チャンバ３５の蛍光画像を示す。なお、実施例４に係る液体試料２として、図１３（ｂ）の液体試料２には、実施例２で説明した液体試料２とほぼ同様の成分であるが、実施例２に係る液体試料２において添加されていた水（３０．７５μｌ）に替えて、グリセロール（つまり蒸発抑制剤４）と水とを含んだ溶液（水：１５μｌ、グリセロール：１５．７５μｌ、計３０．７５μｌ）が添加されている点のみ異なる。一方、図１３（ａ）の液体試料２は、図１３（ｂ）との比較のため実施例２に係る液体試料２（表１参照）に含まれていたヒト遺伝子ＤＮＡ（１μｌ）を除去し、その除去した分量も水に置換したものである（従って、実施例２における水との比較において、図１３（ａ）では、水：１６μｌ、グリセロール：１５．７５μｌ、計３１．７５μｌ）。なお、ＰＣＲ処理は図１２で説明した内容と同様である。図１３（ａ）（ｂ）ともに、ＰＣＲ処理後も反応チャンバ３５がその容積全体に液体試料２で満たされていることがわかる。なお、図１３（ａ）は液体試料２が蛍光発光していないが、図１３（ｂ）は液体試料２が蛍光発光している。これは、図１３（ａ）に示した反応チャンバ３５には、ベータアクチン遺伝子を含むヒト遺伝子ＤＮＡが存在していなかった為にＰＣＲが行われず、図１３（ｂ）に示した反応チャンバ３５には、ベータアクチン遺伝子を含むヒト遺伝子ＤＮＡが存在し、ＰＣＲ反応が起こって特定の遺伝子領域が増幅され、その結果としてＴａｑｍａｎプローブにより蛍光物質の反応が蛍光画像に現われたのである。これにより、特定の遺伝子配列の有無を本発明の試料解析装置１を用いて解析できることが分かる。

以上説明したように、本発明の試料解析装置によれば、固体試料と液体試料との反応を簡素な構造で解析できる。

本発明によれば、特に遺伝子解析分野において従来の装置が有する欠点を排除した試料解析装置（例えば、ＰＣＲチップ）を提供することができる。具体的には、多数の試料と標的との組み合わせを簡素な構造で解析できるＰＣＲチップを提供することができる。また、従来の遺伝子解析装置が有する気泡の残留や試料溶液の蒸発等の問題点を排除したＰＣＲチップを提供することができる。さらに、気泡等の残留が発生しないことに加え、反応チャンバの容積一杯に（つまり定量）試料溶液を充填させることができるため、厳密に計量された溶液を用いてＰＣＲ処理が可能なＰＣＲチップを提供することができる。

本発明は、固体試料と液体試料とを反応させる種々の化学反応の解析の他、マイクロ流体チップ、例えばＰＣＲチップ、を用いた遺伝子解析の研究や臨床診断分野において利用することができる。特に、有核赤血球を用いた胎児診断への適用が期待される。

１ 試料解析装置（遺伝子解析装置、ＰＣＲチップ）
２ 液体試料
３ 固体試料（プライマー）
４ 蒸発抑制剤
５ 弁機構
１０ 弁制御層
１１ 基板
１２ ガス量調節ポート
１３ ガス量調節流路
１４ 弁開口部
２０ 薄膜層
３０ 流路層
３１ 基板
３２ 貯蔵チャンバ
３３ 排出ポート
３４ 液体導入流路
３４ａ 分岐流路
３４_ｖ 分岐流路上の突起
３５ 反応チャンバ
３６ 排出チャンバ
３７ 排出流路
４０（４０ａ，４０ｂ，４０ｃ，４０ｄ，４０ｅ，４０ｆ） ガスバリア層
Ｗ_ｐ 壁

Claims (8)

1. 液体試料を収容可能な少なくとも一つ以上の貯蔵チャンバと、
   固体試料が収容された少なくとも一つ以上の反応チャンバと、
   前記貯蔵チャンバと前記反応チャンバとを連通する液体導入流路と、
   前記反応チャンバ近傍に設けられた排出チャンバと、
   を備え、かつ、
   前記反応チャンバと前記排出チャンバとの間にはガス透過材料を含んだ壁が設けられ、
   前記反応チャンバと前記排出チャンバとの間に生じた圧力差によって、前記液体導入流路及び前記反応チャンバ内のガス並びに前記液体試料中のガスが前記壁を通して前記排出チャンバに吸引されるとともに、前記貯蔵チャンバから前記反応チャンバに前記液体試料が導入・充填され、
   前記反応チャンバは円筒形を成し、
   前記排出チャンバは反応チャンバを同心円状に囲繞した溝を成し、
   前記壁の壁厚は１０μｍ〜５００μｍの範囲にあり、
   前記排出チャンバの圧力は、前記液体試料を前記反応チャンバへ導入するために、０．２〜０．９気圧に設定されることを特徴とする試料解析装置。
2. 前記反応チャンバと前記排出チャンバとの間に圧力差を発生させる圧力差発生機構をさらに備え、前記圧力差発生機構は、前記排出チャンバの圧力を減少させる減圧機構であることを特徴とする請求項１に記載の試料解析装置。
3. 前記液体導入流路は、一つの前記貯蔵チャンバから複数の前記反応チャンバに分岐させる分岐流路を備えることを特徴とする請求項１又は２に記載の試料解析装置。
4. 前記液体導入流路は、流路を開閉する弁機構を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の試料解析装置。
5. 前記液体試料には、蒸発抑制剤が添加されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の試料解析装置。
6. 前記液体導入流路と前記反応チャンバの近傍にガスバリア層が設けられ、前記壁にはガスバリア層が設けられていないことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の試料解析装置。
7. 前記ガス透過性材料がポリジメチルシロキサンであることを特徴する請求項１〜６のいずれかに記載の試料解析装置。
8. 前記液体試料は、核酸溶液を含み、
   前記固体試料は、前記反応チャンバに予め塗布・乾燥されたプライマーを含み、
   ＰＣＲ解析に用いられることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の試料解析装置。