ES2307539T3 - Procedimiento para la correccion de una falta de enlaces disulfuro en moleculas fc. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de preparación de un compuesto farmacológicamente activo, en el que una falta de enlaces en una molécula de fusión de Fc puede evitarse o corregirse, cuyo procedimiento comprende las etapas de (a) preparar un compuesto farmacológicamente activo; (b) tratar el compuesto farmacológicamente activo con un haluro de cobre (II) 10 mM, por lo menos; y (c) aislar el compuesto farmacológicamente activo, en el que el compuesto farmacológicamente activo es una molécula de fusión que comprende un dominio farmacológicamente activo y un dominio Fc.
Description
Procedimiento para la corrección de una falta de
enlaces disulfuro en moléculas Fc.
Las proteínas recombinantes son una clase
emergente de agentes terapéuticos. Tales agentes terapéuticos
recombinantes han dado lugar a avances en la formulación y en la
modificación química de proteínas. Tales modificaciones pueden
proteger a las proteínas terapéuticas, principalmente al bloquear su
exposición a las enzimas proteolíticas. Las modificaciones de las
proteínas pueden aumentar también la estabilidad, el tiempo de
circulación y la actividad biológica de las proteínas terapéuticas.
Un artículo de revisión que describe la modificación de proteínas y
proteínas de fusión, es el de Francis (1992), Focus on Growth
Factors 3:4-10 (Mediscript, Londres).
Una modificación útil es la combinación con el
dominio "Fc" de un anticuerpo. Los anticuerpos comprenden dos
partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido
como "Fab", que se une al antígeno y otro dominio, conocido
como "Fc", que se enlaza a funciones efectoras tales como la
activación del complemento y el ataque por células fagocíticas. El
fragmento Fc posee una semivida sérica larga, mientras que el Fab
tiene vida corta. Capon et al., (1989), Nature 337,
525-31. Cuando son construidos junto con una
proteína terapéutica, un dominio Fc puede proporcionar una semivida
más larga o incorporar funciones tales como unión al receptor de
Fc, unión a proteínas A, fijación del complemento y acaso, incluso,
transferencia placentaria. Id. La Tabla 1 resume el uso de fusiones
de Fc conocidas en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
A pesar de sus ventajas, el uso de moléculas de
fusión con Fc puede estar limitado, por falta de enlaces, en la
expresión en una línea celular deseada. Tales moléculas de fusión
con Fc con falta de enlaces pueden generar una respuesta
inmunitaria in vivo o pueden causar problemas de agregación o
de estabilidad en la producción.
El documento
US-A-4 572 798 describe un método de
oxidación de una proteína recombinante totalmente reducida,
seleccionada entre el grupo que consiste en
interferón-\beta, interleuquina-2
y sus muteínas, en el que cisteínas son oxidadas preferentemente
formando los puentes disulfuro que corresponden a los presente en la
proteína natural.
El documento
US-A-5 654 403 describe una
composición de inmunoglobulina estabilizada que comprende al menos
una inmunoglobulina junto con una cantidad estabilizante de un
agente quelante de iones cobre.
El documento WO 98/48024 describe proteínas de
fusión que comprenden el receptor T II del TGF-beta
ligado a una parte de la cadena constante de una
inmunoglobulina.
La publicación Protein Function, a practical
approach (1997), página 77, protocolo 6, Compilador T.E. Creighton,
Oxford University Press, Oxford, describe un método de
desnaturalización y reducción de proteínas que contienen enlaces
disulfuro.
El documento
EP-A-0 784 093 se refiere a una
proteína de fusión Fc-OPG.
El documento
US-A-5 077 392 se refiere a un
procedimiento para activar proteínas recombinantes.
La presente invención se refiere a un
procedimiento, según las reivindicaciones, mediante el cual la falta
de enlaces en una molécula de fusión de Fc puede ser evitada o
corregida. En una descripción el procedimiento comprende:
- (a)
- preparar una molécula de fusión que comprende (i) un dominio farmacológicamente activo y (ii) un dominio Fc;
- (b)
- tratar la molécula de fusión con un haluro de cobre (II); y
- (c)
- aislar la molécula de fusión tratada.
El haluro de cobre (II) preferido es el
CuCl_{2}. Su concentración es por lo menos, aproximadamente, 10
mM para moléculas de fusión preparadas en E. coli y por lo
menos, aproximadamente, 30 mM para moléculas de fusión preparadas
en células CHO.
Una realización alternativa del procedimiento no
según la invención reivindicada, comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- preparar una molécula de fusión que comprende (i) un dominio farmacológicamente activo y (ii) un dominio Fc;
- (b)
- tratar la molécula de fusión con guanidina.HCl en una concentración aproximadamente 4 M, por lo menos;
- (c)
- aumentar el pH hasta 8,5 aproximadamente; y
- (d)
- aislar la molécula de fusión tratada.
Cada uno de estos procesos puede ser empleado
con muchos dominios farmacológicamente activos. Los dominios
farmacológicamente activos preferidos incluyen: proteínas OPG,
proteínas de leptinas, inhibidores del TNF-\alpha
(por ejemplo, en los que la molécula de fusión es
"etanercept"), inhibidores de IL-1 (por
ejemplo, proteínas de IL-1ra, que son preferidas),
y péptidos imitativos de TPO. También dentro del procedimiento
reivindicado están moléculas en las que el compuesto
farmacológicamente activo es un anticuerpo. El dominio Fc,
preferiblemente, posee una secuencia humana, siendo la más
preferida una secuencia de Fc deriva de IgG1. Una secuencia de Fc
que sirve de ejemplo se muestra en la Figura 5, más adelante en esta
memoria.
Aun cuando en su mayor parte están contemplados
como agentes terapéuticos, los compuestos preparados mediante esta
invención pueden ser útiles también para seleccionar agentes tales.
Por ejemplo, se podría usar un Fc-péptido (por
ejemplo, un péptido del dominio Fc-SH2) en un ensayo
que empleara placas revestidas anti-Fc. El vehículo,
en especial Fc, puede hacer insolubles péptidos solubles y, por
tanto, útiles en diversos ensayos.
Los compuestos preparados mediante el
procedimiento de esta invención pueden ser usados con fines
terapéuticos o profilácticos, formulándolos con excipientes
farmacéuticos apropiados y administrando una cantidad eficaz a un
paciente, tal como un ser humano (u otro mamífero) necesitado de
ello.
\newpage
Numerosos aspectos y ventajas adicionales de la
presente invención se harán evidentes al tomar en consideración las
figuras y la descripción detallada de la invención.
Según la presente invención, se proporciona un
procedimiento para preparar un compuesto farmacológicamente activo,
cuyo procedimiento comprende las etapas de: (a) preparar un
compuesto farmacológicamente activo; (b) reenlazar el compuesto
farmacológicamente activo con haluro de cobre (II) por lo menos 10
mM; y (c) aislar el compuesto farmacológicamente activo, en cuyo
procedimiento el compuesto farmacológicamente activo es una
molécula de fusión que comprende un dominio farmacológicamente
activo y un dominio Fc.
Preferiblemente, el compuesto farmacológicamente
activo comprende un anticuerpo.
Ventajosamente, el compuesto farmacológicamente
activo se prepara en E. coli.
Preferiblemente, el haluro de cobre (II) es
CuCl_{2}.
Alternativamente, el compuesto
farmacológicamente activo se prepara en células CHO.
Ventajosamente, el haluro de cobre (II) es
CuCl_{2}.
Preferiblemente, el CuCl_{2} se usa en una
concentración de al menos 30 mM., aproximadamente.
La presente invención proporciona también un
procedimiento de preparación de un compuesto farmacológicamente
activo, cuyo procedimiento comprende: (a) preparar un compuesto
farmacológicamente activo que comprende un dominio Fc; (b) tratar
el compuesto farmacológicamente activo con guanidina.HCl en una
concentración al menos 4 M, aproximadamente; (c) aumentar el pH
hasta aproximadamente 8,5; y (d) aislar el compuesto
farmacológicamente activo tratado, en cuyo procedimiento el
compuesto farmacológicamente activo es una molécula de fusión que
comprende un dominio farmacológicamente activo y un dominio Fc.
Preferiblemente, el compuesto farmacológicamente
activo comprende un anticuerpo.
Ventajosamente, el compuesto farmacológicamente
activo se prepara en E. coli.
Alternativamente, el compuesto
farmacológicamente activo se prepara en células CHO.
Convenientemente, el pH se reduce a pH 5 en la
etapa (b) del procedimiento.
Ventajosamente, el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de una proteína OPG.
Alternativamente, el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de una proteína leptina.
Alternativamente, el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de un inhibidor del
TNF-\alpha.
Alternativamente, el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de un inhibidor de
IL-1.
Alternativamente, el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de una proteína de
IL-1ra.
Alternativamente, el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de un péptido imitativo de TPO.
Alternativamente, el dominio Fc es un dominio Fc
de IgG1.
Alternativamente, el dominio Fc comprende la
secuencia de SEQ ID NO:2.
Figura 1. Cromatograma de cromatografía líquida
de alta resolución de fase invertida (RP-HPLC) que
muestra la construcción Fc-OPG preparada en E.
coli con y sin tratamiento con CuCl_{2} 10 mM. En una
concentración 10 mM el CuCl_{2} ocasiona la eliminación
irreversible completa del pico posterior de la RP.
Figura 2. Cromatograma de
RP-HPLC que muestra la construcción
Fc-OPG preparada en E. coli, tratada con
CDAP. El peso molecular del pico posterior de la RP aumentó en 52
Da.
Figura 3. Cromatograma de
RP-HPLC que muestra la construcción
Fc-OPG preparada en E. coli, tratada con
CDAP y sometida seguidamente a división básica. La división básica
revela que las cisteínas 148 y 206 habían sido marcadas por el
reactivo CDAP.
Figura 4. Cromatograma de
RP-HPLC que muestra la construcción
Fc-OPG preparada en células CHO con y sin
tratamiento con CuCl_{2} 30 mM. En una concentración 30 mM, el
CuCl_{2} ocasiona la eliminación irreversible completa del pico
posterior de la RP.
Figura 5. Secuencias ejemplares de ácido
nucleico y de aminoácidos (SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente) de
un Fc de IgG1 humano que puede usarse en esta invención.
Figura 6. Esquema de reacción que muestra la
cianilación de restos de cisteína en condiciones ácidas con el
reactivo CDAP.
Figura 7. Esquema de reacción que muestra la
división de la cisteína cianilada, por amoniaco. En condiciones
alcalinas y desnaturalizantes (NH_{4}OH 1,5N y GdHCl 4M), la
cadena principal de la proteína sufre división en la unión
carbonil-amida del péptido sobre la cisteína
cianilada. El resultado es un péptido con el extremo
N-terminal amidado y un péptido de iminotiazolidina
(ITZ) que son separados e identificados por CL-EM
(cromatografía líquida-espectro de masas).
Figura 8. Cromatogramas de
RP-HPLC con pesos moleculares determinados por
espectrometría de masas de Fc-OPG (A),
Fc-OPG hecha reaccionar con CuCl_{2} (B), y
Fc-OPG hecha reaccionar con CDAP seguido por
CuCl_{2}, (C).
Figura 9. Cromatogramas de
RP-HPLC del pico principal e isoforma. purificados,
después de reacción con CDAP y división.
Figura 10. Diagrama esquemático de la
construcción Fc-OPG, esquema de división con CDAP y
el enlace disulfuro del dominio Fc ausente que resulta en la
isoforma por RP-HPLC.
Figura 11. HPLC de fase invertida de
Fc-OPG sin tratar (trazo superior) y tratado con
cobre (trazo inferior).
Figura 12. HPLC de exclusión por tamaños de
Fc-OPG después de 2 años de incubación a 29ºC;
Fc-OPG tratado con cobre (trazo inferior) y
FC-OPG sin tratar (trazo superior).
Al producir proteínas terapéuticas mediante
técnicas recombinantes la proteína terapéutica con bastante
frecuencia debe ser reenlazada para llegar a una conformación
activa. En la actualidad, el proceso de reenlace incluye una etapa
de oxidación para formar la estructura disulfuro de la proteína
recombinante producida. Los reactivos comúnmente usados para
catalizar la formación de la estructura disulfuro son los
aminoácidos libres cisteína/cistamina a un pH de
8-9. Además, también puede usarse sulfato de cobre
en una concentración de cobre en el intervalo micromolar. Para el
reenlace de moléculas de fusión de Fc, sin embargo, no puede usarse
el sulfato de cobre debido a los altos niveles de arginina (0,5 M)
que es un agente quelante de Cu^{++}. Los restantes enlaces que
no han producido las estructuras disulfuro son separados,
normalmente, durante el proceso de purificación que sigue. Después
del proceso de purificación de Fc-OPG, por ejemplo,
se aisló un pico posterior mediante cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) de fase invertida (RP). Los resultados obtenidos
(procedentes principalmente de mapas de péptidos y reactivo de
Ellmann) sugirieron que el pico posterior de RP no contenía grupos
tiol libres.
En el curso de desarrollo de formulaciones, los
efectos de cationes mono- y divalentes puede relacionarse con
aumentos en diversas degradaciones químicas. Durante la selección de
Fc-OPG se observó que el CuCl_{2} 1 mM tenía un
efecto espectacular en la reducción de la cantidad del pico
posterior obtenido en la RP. Experimentos subsiguientes han puesto
de manifiesto que se requiere CuCl_{2} 10 mM para la eliminación
irreversible completa del pico posterior de la RP (véase la Figura
1). Se puso de manifiesto que el pico posterior de la RP resultaba
de un disulfuro desapareado mediante el uso del reactivo
tetrafluoroborato de
1-ciano-4-dimetilamino-piridinio
(CDAP). Para cada sulfhidrilo libre, el DCDAP añade un grupo CN o
aumenta el peso molecular en 26 Da. Tratando Fc-OPG
con CDAP y realizando el análisis subsiguiente mediante HPLC/EM se
puso de manifiesto que el peso molecular del pico posterior de la
RP de la construcción Fc-OPG había aumentado en 52
Da, o sea el equivalente de dos grupos sulfhidrilo marcados. (véase
la Figura 2). El peso molecular del pico principal de la RP no
cambió después del tratamiento con CDAP. La división con bases
subsiguiente del pico posterior de la RP cianilado indicó que
solamente las cisteínas 148 y 206 (Figura 3) habían sido marcadas
por el CDAP. El disulfuro, cys148-cys206, que no
está formado en el pico posterior de la RP, es encontrado en la
región CH3, que es el segundo lazo disulfuro de Fc y es el mismo
disulfuro que era difícil de formar en la construcción
Fc-Leptina. Además, el tratamiento previo con
CuCl_{2} seguido de marcado con CDAP, no produce cambio detectable
del peso molecular, lo que apoya la conclusión de que el Cu^{++}
fija el problema del disulfuro en Fc-OPG.
Resultados similares utilizando CuCl_{2} han sido observados para
el Fc-OPG en células CHO (Figura 4) y nos permite
llegar a la conclusión de que la totalidad de nuestras moléculas
recombinantes de Fc tienen la misma dificultad para formar el
enlace disulfuro en la región CH3 de Fc. Sorprendentemente, las
células CHO tienen la misma dificultad en la formación de disulfuro
de Fc, aproximadamente en el mismo grado.
Alternativamente, el proceso podría ser
efectuado como un tratamiento posterior al reenlace. Varios métodos
pueden ser usados para eliminar el pico posterior de la RP. Además
del tratamiento con CuCl_{2}, se observa una separación similar
del pico posterior después de desnaturalización en el seno de
guanidina.HCl con una concentración mínima 4 M y aumento del pH
desde 5,0 a 8,5. Ambos tratamientos apoyan fuertemente la idea de
que están implicados tioles libres que pueden ser convertidos en
disulfuro.
Los términos y expresiones usados en esta
memoria descriptiva se definen como sigue, a menos que se limiten
de otro modo en casos específicos.
La expresión "que comprende" significa que
un compuesto puede incluir aminoácidos adicionales sobre uno de los
dos o ambos extremos N-terminal o
C-terminal de la secuencia dada. Como es lógico,
estos aminoácidos adicionales no deben interferir
significativamente con la actividad del compuesto.
La expresión "Fc nativo" se refiere a una
molécula o una secuencia que comprende la secuencia de un fragmento
de unión no antigénica resultante de la digestión de un anticuerpo
total, tanto si está en forma monomérica o en forma multimérica. La
fuente original de inmunoglobulina del Fc nativo es,
preferiblemente, de origen humano y puede ser cualquiera de las
inmunoglobulinas, aun cuando son preferidas la IgG1 y la IgG2. Los
Fc nativos están constituidos por polipéptidos monoméricos que
pueden estar ligados en formas diméricas o multiméricas mediante
asociación covalente (es decir, enlaces disulfuro) y no covalente.
El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre subunidades
monoméricas de moléculas de Fc natico varía desde 1 a 4, dependiendo
de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o subclase (por ejemplo,
IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2). Un ejemplo de un Fc nativo es un
dímero enlazado por un puente disulfuro que resulta de digestión con
papaína de una IgG (véase la publicación de Ellison et al.,
(1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). La expresión
"Fc nativo" tal como se usa en esta memoria, es genérico para
las formas monomérica, dimérica y multimérica.
La expresión "variante de Fc" se refiere a
una molécula o una secuencia que ha sido modificada partiendo de un
Fc nativo pero que todavía comprende un sitio de unión para el
receptor de salvamento, FcRn. La solicitudes de patentes
internacionales WO 97/34631 (publicada el 25 de Septiembre de 1997)
y WO 96/32478, describen variantes de Fc ejemplares, así como su
interacción con el receptor de salvamento, y están incorporadas en
esta memoria por referencia. Así pues, la expresión "variante de
Fc" comprende una molécula o una secuencia que está humanizada
procedente de un Fc nativo no humano. Además, un Fc nativo comprende
sitios que pueden ser separados debido a que proporcionan
características estructurales o actividad biológica que no son
requeridas para las moléculas de fusión de la presente invención.
Por tanto, la expresión "variante de Fc" comprende una molécula
o una secuencia que carece de uno o más sitios o restos de un Fc
nativo, que afectan o que están implicados en (1) formación de
enlaces disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula huésped
seleccionada, (3) homogeneidad del extremo
N-terminal en la expresión en una célula huésped
seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con complemento,
(6) unión a un receptor de Fc distinto de un receptor de salvamento,
o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).
Variantes de Fc se describen con mayor detalle más adelante en esta
memoria.
La expresión "dominio Fc" engloba moléculas
y secuencias de Fc nativo y de variantes de Fc, según se ha definido
anteriormente. Como con las variantes de Fc y Fc nativos, la
expresión "dominio de Fc" incluye moléculas en forma
monomérica o multimérica, tanto se han sido sometidas a digestión
partiendo de un anticuerpo total o han sido producidas por otros
medios.
El término "multímero" tal como se aplica a
dominios Fc o a moléculas que comprenden dominios Fc, se refiere a
moléculas que poseen dos o más cadenas polipeptídicas asociadas
covalentemente, no covalentemente o por ambas interacciones,
covalente y no covalente. Las moléculas de IgG forman, típicamente,
dímeros; las de IgM, pentámeros; las de IgD, dímeros; y las de IgA,
monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. Pueden formarse
multímeros por usando la secuencia y la actividad resultante de la
fuente de Ig nativa del Fc o por derivatización (según se define
más adelante) de un Fc nativo tal.
El término "dímero" tal como se aplica a
dominios Fc o a moléculas que comprenden dominios Fc, se refiere a
moléculas que poseen dos cadenas polipeptídicas asociadas
covalentemente o no covalentemente.
Los términos "derivatización" y
"derivado" o "derivatizado", comprenden procesos y
compuestos resultantes, respectivamente, en los que (1) el
compuesto posee una parte cíclica; por ejemplo, una reticulación
entre restos cisteinilo dentro del compuesto, (2) el compuesto está
reticulado o tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el
compuesto posee un resto cisteinilo y forma, por tanto, dímeros
reticulados por cultivo o in vivo; (3) uno o más ligamientos
peptidíicos ha sido reemplazado por un ligamiento no peptidílico;
(4) el extremo N-terminal está reemplazado por
-NRR^{1}, NRC(O)R^{1},
-NRC(O)OR^{1}, -NRS(O)_{2}R^{1},
-NHC(O)NHR, un grupo succinimido, o
benciloxicarbonil-NH- sustituido o sin sustituir, en
cuyas fórmulas R y R^{1} y los sustituyentes del anillo son como
se define más adelante en esta memoria; (5) el extremo
C-terminal ha sido reemplazado por
-C(O)R^{2} ó -NR^{3}R^{4}, en cuyas fórmulas
R^{2}, R^{3} y R^{4} son como se define más adelante en esta
memoria; y (6) compuestos en los que restos individuales de
aminoácidos han sido modificados mediante tratamiento con agentes
capaces de reaccionar con cadenas laterales o restos terminales,
seleccionados. Más adelante, en esta memoria, se describen nuevos
derivados.
El término "péptido" se refiere a moléculas
de 3 a 40 aminoácidos, prefiriéndose moléculas de 3 a 20 aminoácidos
y siendo las más preferidas, moléculas de 6 a 15 aminoácidos.
Péptidos ejemplares pueden ser generados aleatoriamente mediante
cualquiera de los métodos anteriormente citados, llevados en una
biblioteca de exposición de fagos o derivados mediante digestión de
proteínas.
\newpage
La expresión "proteína nativa" se refiere a
una molécula que posee una secuencia de aminoácidos que puede
aislarse desde un organismo sin modificación mediante técnicas de
DNA recombinante u otros métodos.
La expresión "fragmento de proteína" se
refiere a una molécula o una secuencia que comprende solamente una
parte de la secuencia de una proteína nativa pero que retiene
todavía la actividad farmacológica de interés. La expresión
"fragmento de proteína" comprende, por tanto, por ejemplo, el
dominio soluble de un receptor celular (por ejemplo, un receptor
para el factor de la necrosis tumoral).
La expresión "variante de proteína" se
refiere a una molécula o una secuencia que está modificada desde una
proteína nativa pero que todavía retiene la actividad farmacológica
de interés. Así pues, la expresión "variante de proteína"
comprende una molécula o una secuencia en la que restos no nativos
sustituyen a restos nativos, se han añadido restos no nativos o se
han suprimido restos nativos. Cualquier resto nativo puede ser
separado debido a que proporcione características estructurales o
actividad biológica que no son requeridas para la actividad
farmacológica de interés de las moléculas de fusión de la presente
invención. Por tanto, la expresión "variante de proteína"
comprende una molécula o una secuencia que carece de uno o más
sitios o restos de proteína nativas que afectan o que están
implicados en (1) la señalización intracelular, (2) incompatibilidad
con una célula huésped seleccionada, (3) heterogeneidad del extremo
N-terminal en la expresión en una célula huésped
seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con otras proteínas
(por ejemplo, dominios de dimerización), (6) unión a un receptor u
a otra proteína que no afecte a la actividad farmacológica de
interés, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo
(ADCC). Variantes de Fc se describen con detalle adicional más
adelante en esta memoria.
Los términos "derivatización" y
"derivado" o "derivatizado" tal como se usan con respecto
a proteínas, se refieren a proteínas en las que (1) la proteína ha
sido modificada para incluir una parte cíclica; por ejemplo,
reticulación entre restos cisteinilo dentro del compuesto; (2) el
compuesto está reticulado o posee un sitio de reticulación; por
ejemplo, el compuesto posee un resto cisteinilo y por tanto forma
dímeros reticulados en cultivo o in vivo; (3) uno o más
enlaces peptidilo han sido reemplazados por un enlace no peptidilo;
(4) el extremo N-terminal está reemplazado por
-NRR^{1}, NRC(O)R^{1},
-NRC(O)OR^{1}, -NRS(O)_{2}R^{1},
-NHC(O)NHR, un grupo succinimido, o
benciloxicarbonil-NH sustituido o sin sustituir, en
cuyas fórmulas R y R^{1} y los sustituyentes del anillo son como
se define más adelante en esta memoria; (5) el extremo
C-terminal está reemplazado por
-C(O)R^{2} ó -NR^{3}R^{4}, en cuyas fórmulas
R^{2}, R^{3} y R^{4} son como se define más adelante en esta
memoria; y (6) compuestos en los que restos individuales de
aminoácidos han sido modificados por tratamiento con agentes capaces
de reaccionar con cadenas laterales o restos terminales,
seleccionados. Más adelante se describen derivados además de los
descritos.
El término "polipéptido" se refiere a
proteínas nativas, variantes de proteínas, derivados de proteínas,
y fragmentos de proteínas.
La expresión "farmacológicamente activo"
significa que se ha determinado que una sustancia así descrita posee
actividad que afecta a parámetros médicos (por ejemplo, presión
sanguínea, recuento de células sanguíneas, nivel de colesterol) o a
estados de enfermedad (por ejemplo, cáncer). Así, los péptidos
farmacológicamente activos comprenden péptidos agonísticos o
imitativos y antagonísticos, según se define más adelante.
La expresión "proteína OPG" se refiere,
colectivamente, al nuevo miembro de la familia de receptores del
factor de la necrosis tumoral que se describe en la solicitud de
patente internacional WO 97/23614. Las proteínas OPG ejemplares son
polipéptidos que comprenden las secuencias OPG de la rata, el ratón
o los seres humanos, o un consenso de las secuencias de la rata, el
ratón y los seres humanos.
La expresión "inhibidor del
TNF-\alpha" incluye así receptores
solubilizados del TNF, anticuerpos para el TNF, anticuerpos para el
receptor del TNF, inhibidores de la enzima de conversión del
TNF-\alpha (TACE), y otras moléculas que afectan
a la actividad del TNF.
Inhibidores del TNF-\alpha de
diversas clases están descritos en la técnica, incluyendo las
referencias siguientes:
Solicitudes de patentes europeas 308 378; 422
339; 393 438; 398 327; 412 486; 418 014, 417 563, 433 900; 464 533;
512 528; 526 905; 568 928; 663 210; 542 795; 818 439; 664 128; 542
795; 741 707; 874 819; 882 714; 880 970; 648 783; 731 791; 895 988;
550 376; 882 714; 853 083; 550 376; 943 616.
Patentes de EE.UU. Nos. 5.136.021; 5.929.117;
5.948.638; 5.807.862; 5.695.953; 5.834.435; 5.817.822; 5.830.742;
5.834.435; 5.851.556; 5.853.977; 5.359.037; 5.512.544; 5.695.953;
5.811.261; 5.633.145; 5.863.926; 5.866.616;
5.641.673; 5.869.677; 5.869.511; 5.872.146; 5.854.003; 5.856.161; 5.877.222; 5.877.200; 5.877.151; 5.886.010;
5.869.660; 5.859.207; 5.891.883; 5.877.180; 5.955.480; 5.955.476; 5.955.435.
5.641.673; 5.869.677; 5.869.511; 5.872.146; 5.854.003; 5.856.161; 5.877.222; 5.877.200; 5.877.151; 5.886.010;
5.869.660; 5.859.207; 5.891.883; 5.877.180; 5.955.480; 5.955.476; 5.955.435.
Solicitudes de patentes internacionales (WO)
90/13575, 91/03553, 92/01002, 92/13095, 92/16221, 93/07873,
93/21946, 93/19777, 95/34326, 96/28546, 98/27298, 98/30541,
96/38150, 97/18207, 97/15561, 97/12902, 96/25861, 96/12735,
96/11209, 98/39326, 98/39316, 98/38859, 98/39315, 98/42659,
98/39329, 98/43959, 98/45268, 98/47863, 96/33172, 96/20926,
97/37974, 97/37973, 96/35711, 98/51665, 98/43946, 95/04045,
98/56377, 97/12244, 99/00364, 99/00363, 98/57936, 99/01449,
99/01139, 98/56788, 98/56756, 98/53842, 98/52948, 98/52937,
99/02510, 97/43250, 99/06410, 99/06042, 99/09022, 99/08688,
99/07679, 99/09965, 99/07704, 99/06041, 99/37818, 99/37625,
97/11668.
Solicitudes de patentes japonesas (JP) 10147531,
10231285, 10259140 y 10130149, 10316570, 11001481 y
127.800/1991.
127.800/1991.
Solicitud de patente alemana (DE) 19731521.
Solicitudes de patentes británicas (GB) 2 218
101, 2 326 881, 2 246 569.
La expresión "inhibidor de
interleuquina-1" se refiere a un polipéptido
capaz de prevenir específicamente la activación de receptores
celulares para la IL-1, que puede resultar de
diversos mecanismos. Tales mecanismos incluyen la regulación en
descenso de la producción de IL-1, la unión de
IL-1 libre, la interferencia con la unión de
IL-1 a su receptor, la interferencia con la
formación del complejo de receptor de IL-2 (es
decir, la asociación del receptor de IL-1 con la
proteína accesoria del receptor de IL-1), o
interferencia con la modulación de la señalización de
IL-1 después de unión a su receptor. Las clases de
inhibidores de interleuquina-1 incluyen:
Antagonistas del receptor de
interleuquina-1 tal como IL-1ra,
como se describe más adelante;
CDRs o regiones variables enteras de anticuerpos
monoclonales anti-receptor de IL-1
(por ejemplo, documento EP 623674);
Proteínas de unión de IL-1 tales
como receptores solubles de IL-1 (por ejemplo, la
patente de EE.UU. No. 5.492.888, la patente de EE.UU. No. 5.488.032
y la patente de EE.UU. No. 5.464.937, la patente de EE.UU. No.
5.319.071 y la patente de EE.UU. No. 5.180.812);
CDRs o regiones variables enteras de anticuerpos
monoclonales anti-Il-1 (por ejemplo,
los documentos WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, la patente de
EE.UU. No. 4.935.343, los documentos EP 364778, EP 267611 y EP
220063);
Proteínas accesorias del receptor de
IL-1 y anticuerpos para estas (por ejemplo el
documento WO 96/23067);
Inhibidores de la enzima de conversión de
interleuquina-1 beta (ICE) o caspasa I, que pueden
usarse para inhibir la producción y secreción de
IL-1 beta;
Inhibidores de proteasa de interleuquina.1
beta;
y otros compuestos y proteínas que bloquean
in vivo la síntesis o la liberación extracelular de
IL-1.
Inhibidores de IL-1 que sirven
de ejemplo figuran descritos en la referencias siguientes:
Patentes de EE.UU. Nos. 5.747.444; 5.359.032;
5.608.035; 5.843.905; 5.359.032; 5.866.576; 5.869.660; 5.869.315;
5.872.095; 5.955.480.
Solicitudes de patentes internacionales (WO)
98/21957, 96/09323, 91/17184, 96/40907, 98/32733, 98/42325,
98/44940, 98/47892, 98/56377, 99/03837, 99/06426, 99/06042,
91/17249, 98/32733, 98/17661, 97/08174, 95/34326, 99/36426 y
99/36415.
Solicitudes de patentes europeas (EP) 534978 y
894795.
Solicitud de patente francesa FR 2762514.
Para los fines de la presente invención,
IL-1ra y sus variantes y sus derivados según se
discute más adelante, se denominan colectivamente
"proteína(s) de IL-1ra". Las moléculas
descritas en las referencias anteriores y sus variantes y sus
derivados discutidos más adelante, son denominadas colectivamente
"inhibidores de IL-1".
La expresión "péptido imitativo de TPO"
comprende péptidos que pueden ser identificados o derivados según
ha sido descrito por Cwirla et al., (1997), Science
276:1696-9, Patentes de EE.UU. Nos. 5.869.451 y
5.932.946 y cualquier otra referencia de la Tabla 2, identificados
como tener materia de sujeto imitativo de TPO, así como en la
solicitud de patente de EE.UU. "Thrombopoietic Compounds",
presentada el 22 de Octubre de 1999. Los expertos en la técnica
podrán apreciar que todas estas referencias bibliográficas permiten
seleccionar diferentes péptidos que de hecho
están descritos en ellas, siguiendo los procedimientos operatorios descritos con diferentes colecciones de péptidos.
están descritos en ellas, siguiendo los procedimientos operatorios descritos con diferentes colecciones de péptidos.
La expresión "proteína leptina" se refiere
a la proteína leptina nativa y partes de la proteína leptina nativa
que retienen su actividad antidiabética o
anti-obesidad. Una secuencia de proteína leptina que
puede servir de ejemplo figura descrita en el documento PCT/US
97/23183, presentado el 11 de Diciembre de 1997.
Adicionalmente, sales fisiológicamente
aceptables de los compuestos de esta invención, están también
englobados en esto. Por "sales fisiológicamente aceptables" se
entiende cualesquiera sales que son conocidas o que se descubre más
tarde que son farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos
específicos son: acetato, trifluoroacetato, hidrohaluros tales como
hidrocloruro e hidrobromuro, sulfato, citrato, tartrato, glicolato y
oxalato.
En general. El procedimiento de esta
invención es útil para la preparación de composiciones en las que un
dominio Fc puede unirse a la molécula farmacológicamente activa a
través del extremo N-terminal o el extremo
C-terminal de la molécula. Por tanto, las moléculas
de fusión de Fc de esta invención pueden ser descritas mediante la
fórmula I siguiente:
I(X^{1})_{a}-F^{1}-(X^{2})_{b}
en la
que:
F^{1} es un dominio Fc;
X^{1} y X^{2} están seleccionados, cada uno
independientemente, entre
-(L^{1})_{c}-P^{1} y
-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2};
P^{1} y P^{2} son, cada uno
independientemente, secuencias de péptidos o polipéptidos
farmacológicamente activos;
L^{1} y L^{2} son, cada uno
independientemente, engarces; y
a, b, c y d son, cada uno independientemente, 0
ó 1, con tal que al menos uno de a y b sea 1.
Por tanto, el compuesto I comprende compuestos
preferidos de fórmulas
IIX^{1}-F^{1}
y sus multímeros, en los que
F^{1} está unido al extremo C-terminal de
X^{1};
IIIF^{1}-X^{2}
y sus multímeros, en los que
F^{1} está unido al extremo N-terminal de
X^{2};
IVF^{1}-(L^{1})_{c}-P^{1}
y sus multímeros, en los que
F^{1} está unido al extremo N-terminal de
-(L^{1})_{c}-P_{1};
y
VF^{1}-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}
y sus multímeros, en los que
F^{1} está unido al extremo N-terminal de
-L^{1}-P^{1}-L^{2}-P^{2}.
Péptidos. Muchos péptidos pueden ser
usados en asociación con la presente invención. De interés
particular son los péptidos que imitan la actividad de EPO, TPO,
hormona del crecimiento, G-CSF,
GM-CSF, IL-1ra, leptina, CTLA4,
TRAIL, TGF-\alpha y TGF-\beta.
También son de interés antagonistas de péptidos, en particular los
que poseen acción antagonista respecto a la actividad de TNF,
leptina, cualquiera de las interleuquinas (IL-1, 2,
3,.....), y proteínas implicadas en la activación del complemento
(por ejemplo, C3b). Estos péptidos pueden ser descubiertos mediante
métodos que están descritos en las referencias bibliográficas
citadas en esta memoria descriptiva y en otras referencias.
Exposición de fagos, en particular, es útil para
generar péptidos para usar en la presente invención. Se ha
establecido que puede usarse la selección por afinidad a partir de
colecciones de péptidos aleatorios, para identificar ligandos
peptídicos para cualquier sitio de un producto génico. Dedman et
al., (1993), J. Biol. Chem. 268:23025-30. La
exposición de fagos es especialmente bien adecuada para identificar
péptidos que se unen a tales proteínas de interés como receptores
de la superficie celular o cualesquiera proteínas que posean
epítopos lineales. Wilson et al./1998), Can. J. Microbiol.
44: 313-29; Kay et al. (1998), Drug Disc.
Today, 3:370-8. Tales proteínas han sido revisadas
extensamente por Herz et al. en J. Receptor and Signal
Transduction Res. 17(5): 671-776. Tales
proteínas de interés son preferidas para usar en esta invención.
Numerosos péptidos de interés figuran descritos en la solicitud de
patente de EE.UU. titulada "Modified Peptides as Therapeutic
Agentes", presentada el 22 de octubre de 1999.
Polipéptidos. Son conocidos en la técnica
numerosos polipéptidos adecuados para usar en la presente invención.
Las proteínas adecuadas incluyen hormonas (por ejemplo, la hormona
del crecimiento), citoquinas (por ejemplo, IL-1ra)
y receptores solubles (por ejemplo, los receptores I y II del factor
de la necrosis tumoral). Son péptidos que sirven de ejemplo los
indicados en la Tabla 1 (véase anteriormente).
Fusión de Fc. Un dominio Fc puede
fusionarse al extremo N-terminal o
C-terminal de la molécula farmacológica activa o a
ambos extremos N y C terminales.
Como se ha indicado anteriormente, las variantes
de Fc son vehículos adecuados dentro del alcance de esta invención.
Un Fc nativo puede ser modificado extensamente para formar una
variante de Fc según esta invención, con tal que se mantenga la
unión al receptor de salvamento; véanse, por ejemplo los documentos
WO 97/34631 y WO 96/32478. En tales variantes de Fc, pueden
separarse uno o más sitios de un Fc nativo que proporcionen
características estructurales o actividad funcional no requeridas
por las moléculas de fusión de esta invención. Pueden separarse
estos sitios, por ejemplo, sustituyendo o suprimiendo restos,
insertando restos en el sitio, o truncando partes que contengan el
sitio. Los restos insertados o sustituidos pueden ser también
aminoácidos alterados, tales como imitativos de péptidos o
D-aminoácidos. Las variantes de Fc pueden ser
deseables por diversas razones, varias de las cuales se describen
más adelante. Las variares de Fc que sirven de ejemplo incluyen
moléculas y secuencias en las que:
- 1.
- Sitios implicados en la formación de puentes disulfuro son separados. Tal separación puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína, presentes en la célula huésped empleada para producir las moléculas de la invención. Para esta finalidad, el segmento que contiene cisteína situado en el extremo N-terminal puede ser truncado o pueden suprimirse los restos de cisteína o sustituirse con otros restos de otros aminoácidos (por ejemplo, alanilo, serilo). En particular, puede truncarse el segmento de 20 aminoácidos de extremo N-terminal de la SEQ ID NO:2 o suprimirse o sustituirse los restos de cisteína de las posiciones 7 y 10 de la SEQ ID NO: 2. Incluso cuando son separados restos de cisteína, los dominios Fc de una sola cadena pueden formar todavía un dominio Fc dimérico que se mantiene unido no covalentemente.
- 2.
- Un Fc nativo es modificado para hacerle más compatible con una célula huésped seleccionada. Por ejemplo, puede separarse la secuencia PA cerca del extremo N-terminal de un Fc nativo, lo que puede reconocerse mediante una enzima de digestión en E. coli tal como prolina iminopeptidasa. También puede añadirse un resto de metionina del extremo N-terminal en especial cuando la molécula es expresada recombinantemente en una célula bacteriana tal como E. coli. El dominio Fc de SEQ ID NO:2 (Figura 5) es una de tales variantes de Fc.
- 3.
- Una parte del extremo N-terminal de un Fc nativo es separado para evitar heterogeneidad del extremo N-terminal cuando es expresado en una célula huésped seleccionada. Para este fin, puede suprimirse cualquiera de los primeros 20 restos de aminoácidos situados en el extremo N-terminal, en particular los situados en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5.
- 4.
- Son separados uno o más sitios de glicosilación. Los restos que están, típicamente, glicosilados (por ejemplo, asparagina) pueden conferir respuesta citolítica. Tales restos pueden ser suprimidos o sustituidos con restos sin glicosilar (por ejemplo, alanina).
- 5.
- Sitios implicados en interacción con complemento, tal como el sitio de unión C1q, son separados. Por ejemplo, puede suprimirse o sustituirse la secuencia EKK de IgG1 humana. El reclutamiento de complemento puede no ser ventajoso para las moléculas de esta invención y por tanto pueden ser evitados con una variante de Fc tal.
- 6.
- Son separados sitios que afectan a la unión a receptores de Fc distintos de un receptor de salvamento. Un Fc nativo puede tener sitios de interacción con ciertos glóbulos blancos que no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención y por tanto pueden ser separados.
- 7.
- El sitio ADCC es separado. Los sitios ADCC son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) con respecto a sitios ADCC de IgG1. Estos sitios, asimismo,. no son necesarios para las moléculas de fusión de la presente invención y por tanto pueden ser separados.
- 8.
- Cuando el Fc nativo es derivado desde un anticuerpo no humano, el Fc nativo puede ser humanizado. Típicamente, para humanizar un Fc nativo, pueden sustituirse restos seleccionados del Fc nativo no humano, por restos que son encontrados, normalmente, en el Fc nativo humano. Técnicas para la humanización de anticuerpos son conocidas en la técnica.
Engarces. Es opcional un grupo de
"engarce". Cuando se encuentra presente, la estructura química
no es crítica, dado que sirve, principalmente, como espaciador. El
engarce está formado, preferiblemente, por aminoácidos enlazados
por uniones peptídicas. Por tanto, en realizaciones preferidas, el
engarce está constituido por 1 a 20 aminoácidos enlazados por
uniones peptídicas, en las que los aminoácidos están seleccionados
entre los 20 aminoácidos naturales. Algunos de estos aminoácidos
pueden estar glicosilados, como es bien sabido por los expertos en
la técnica. En una realización más preferida, los 1 a 20 aminoácidos
están seleccionados entre glicina, alanina, prolina, asparagina,
glutamina y lisina. Aún más preferiblemente, un engarce está
formado por una mayoría de aminoácidos que está sin impedir
estéricamente, tales como glicina y alanina. Así pues, los engarces
preferidos son poliglicinas, poli(Gly-Ala), y
polialaninas. Otros ejemplos específicos de engarces son:
- (Gly)_{3}Lys(Gly)_{4};
- (Gly)_{3}AsnGlySer(Gly)_{2};
- (Gly)_{3}Cys(Gly)_{4}; y
- GlyProAsnGlyGly.
Para explicar la nomenclatura anterior, por
ejemplo, (Gly)_{3}Lys(Gly)_{4} significa
Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly.
Son preferidas también las combinaciones de Gly y Ala. Los engarces
indicados en esta memoria son ejemplares; los engarces dentro del
alcance de esta invención pueden ser mucho más largos y pueden
incluir otros restos.
También son posibles engarces de tipo no
peptídico. Por ejemplo, podrían usarse engarces de alquilo tales
como -NH-(CH_{2})_{5}-C(O)-, en
los que s=2-20. Estos engarces de alquilo pueden
estar sustituidos, además, por cualquier grupo no impedido
estéricamente tal como un grupo acilo inferior (por ejemplo,
C_{1}-C_{6})alquilo inferior, halógeno
(por ejemplo, Cl, Br), CN, NH_{2}, fenilo, etc. Un engarce de tipo
no peptídico que sirve de ejemplo es un engarce PEG
en el que n es tal que el engarce
posee un peso molecular de 100 a 5000 kD, preferiblemente 100 a 500
kD. Los engarces de tipo peptídico pueden ser alterados para formar
derivados del mismo modo que se ha descrito
anteriormente.
Derivados. Los inventores contemplan
asimismo derivatizar el péptido, polipéptido y/o la parte FC de los
compuestos. Tales derivados pueden mejorar las características de
solubilidad, absorción, semivida biológica y semejantes, de los
compuestos. Los restos pueden, alternativamente, eliminar o atenuar
efectos secundarios indeseables de los compuestos, y semejantes.
Los derivados que sirven de ejemplo, incluyen compuestos en los
que:
- 1.
- El compuesto o alguna parte del mismo es cíclica. Por ejemplo, puede modificarse la parte farmacológicamente activa (es decir, péptido o polipéptido) para que contenga dos o más restos Cys (por ejemplo, en el engarce), que pudieran ciclarse mediante la formación de puentes disulfuro. Para citas a referencias bibliográficas sobre la preparación de derivados ciclados, véase la Tabla 2.
- 2.
- El compuesto está reticulado o es hecho capaz de reticulación entre moléculas. Por ejemplo, puede modificarse la parte farmacológicamente activa para que contenga un resto Cys y ser capaz por ello de formar un puente disulfuro intermolecular con una molécula semejante. El compuesto ser reticulado también a través de su extremo C-terminal, como en la molécula que se indica a continuación:
- 3.
- Uno o más engarces (uniones) [-C(O)NR-] es reemplazado por un engarce no peptidílico. Son engarces no peptídilicos que pueden servir de ejemplo -CH_{2}-carbamato[-CH_{2}-OC(O)NR-], fosfonato, -CH_{2}-sulfonamida[CH_{2}-S(O)_{2}NR-], urea[-NHC(O)NH-], -CH_{2}-amina secundaria, y péptido alquilado[-C(O)NR^{6}]- en cuya fórmula R^{6} es alquilo inferior.
- 4.
- El extremo N-terminal está derivatizado. Típicamente, el extremo N-terminal puede acilarse o modificarse a una amina sustituida. Los grupos derivados del extremo N-terminal que sirven de ejemplo incluyen -NRR^{1} (distinto de -NH_{2}), -NRC(O)R^{1}, -NRC(O)OR^{1}, -NRS(O)_{2}R^{1}, -NHC(O)NHR^{1}, succinimida, o benciloxicarbonil-NH-(CBZ-NH-), en cuyas fórmulas R y R^{1} son, cada uno independientemente, hidrógeno o alquilo inferior, y en las que el anillo fenilo puede estar sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo de C_{1}-C_{4}, alcoxi de C_{1}-C_{4}, cloro y bromo.
- 5.
- El extremo C-terminal libre es derivatizado. Típicamente, el extremo C-terminal es esterificado o amidado. Grupos derivados del extremo C-terminal que sirven de ejemplo incluyen, por ejemplo, -C(O)R^{2}, en cuya fórmula R^{2} es alcoxi inferior o -NR^{3}R^{4} en cuya fórmula R^{3} y R^{4} son, independientemente, hidrógeno o alquilo de C_{1}-C_{8} (preferiblemente alquilo de C_{1}-C_{4}).
- 6.
- Un puente disulfuro está reemplazado con otro resto de reticulación, preferiblemente más estable, (por ejemplo, un grupo alquileno).véanse, por ejemplo, las publicaciones de Bhatnagar et al., (1996), J. Med. Chem. 39:3814-9; Alberts et al., (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9.
- 7.
- Uno o más restos individuales de aminoácidos han sido modificados. Se conocen diversos agentes de derivatización que reaccionan específicamente con cadenas laterales o restos terminales seleccionados, según se describe con detalle más adelante.
Restos lisinilo o restos del extremo amino
terminal pueden hacerse reaccionar con anhídrido succínico u otros
anhídridos de otros ácidos carboxílicos, que inviertan la carga de
los restos lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar
restos que contienen grupo amino en posición alfa incluyen
imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de
piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido
trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea,
2,4-pentanodiona, y reacción con glioxilato
catalizada con transaminasa.
Los restos arginilo pueden ser modificados por
reacción con uno cualquiera o con una combinación de varios
reactivos convencionales, que incluyen fenilglioxal,
2,3-butanodiona,
1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La
derivatización de restos arginilo requiere que la reacción sea
llevada en cabo en condiciones alcalinas debido al alto pKa del
grupo funcional de la guanidina. Además, estos reactivos pueden
reaccionar con los grupos de lisina así como con el grupo amino en
posición épsilon de la arginina.
La modificación específica de restos tirosilo ha
sido estudiada extensamente, con interés particular en la
introducción de marcas espectrales en los restos tirosilo por
reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano.
Lo más común es usar N-acetilimidizol y
tetranitrometano para formar especies de tirosila
O-acetiladas y derivados nitrados en posición 3,
respectivamente.
Los grupos carboxilo de las cadenas laterales
(aspartilo o glutamilo) pueden ser modificados selectivamente por
reacción con carbodiimidas
(R'-N=C=N-R') tales como la
1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida
o la
1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida.
Además, los restos aspartilo y glutamilo pueden ser convertidos en
restos asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.
Los restos glutaminilo y asparaginilo pueden ser
desamidados dando lugar a los restos glutamilo y aspartilo
correspondientes. Alternativamente, estos restos son desamidados en
condiciones ligeramente ácidas. Cualquiera de las dos formas de
estos restos caen dentro del alcance de esta invención.
Los restos cisteinilo pueden ser reemplazados
por restos de aminoácidos u otros restos o bien para eliminar la
unión disulfuro o, al revés, estabilizar la reticulación. Véase la
publicación de Bhatnagar et al., (1996), J. Med. Chem.
39:3814-9.
La derivatización con agentes bifuncionales es
útil para reticular los péptidos o sus derivados funcionales dando
lugar a una matriz de soporte insoluble en agua o a otros vehículos
macromoleculares. Los agentes de reticulación comúnmente usados
incluyen, por ejemplo, el
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
el glutaraldehído, ésteres de la
N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con el
ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres
homobifuncionales, con inclusión de ésteres disuccinimidílicos
tales como el 3,3'-ditiobis(propionato de
succinimilo), y maleimidas bifuncionales tales como la
bis-N-maleimido-1,8-octano.
Los agentes de derivatización tales como el
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato
proporcionan intermedios fotoactivables que son capaces de formar
reticulaciones en presencia de la luz. Alternativamente, se emplean
para la inmovilización de proteínas, matrices reactivas insolubles
en agua tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno
y los sustratos reactivos descritos en las patentes de EE.UU. Nos.
3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537 y
4.330.440.
Los grupos carbohidrato (oligosacáridos) pueden
ser unidos convenientemente a sitios que se sabe que son sitios de
glicosilación existentes en proteínas. En general, los
oligosacáridos enlazados a O son unidos a restos de serina (Ser) o
treonina (Thr) mientras que los oligosacáridos enlazados a N se unen
a restos de asparagina (Asn) cuando estos restos forman parte de la
secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X
puede ser cualquier aminoácido con excepción de prolina. X es,
preferiblemente, uno de los 19 aminoácidos naturales distintos de
prolina. Las estructuras de los oligosacáridos enlazados a N o
enlazados a O y los restos de azúcares encontrados en cada uno de
los tipos, son diferentes. Un tipo de azúcar que es encontrado
comúnmente en ambos es el ácido N-acetilneuramínico
(al que se hace referencia como ácido siálico). El ácido siálico es,
habitualmente, el resto terminal de ambos oligosacáridos, enlazados
a N y enlazados a O, y en virtud de su carga negativa pueden
comunicar propiedades ácidas al compuesto glicosilado. Tal sitio o
sitios pueden incorporarse en el engarce de los compuestos de esta
invención y son, preferiblemente, glicosilados por una célula
durante la producción recombinante de los compuestos polipeptídicos
(por ejemplo, en células de mamífero tales como CHO, BHK, COS). Sin
embargo, tales sitios pueden ser glicosilados, además, mediante
procedimientos sintéticos o semi-sintéticos
conocidos en la técnica.
Otras posibles modificaciones incluyen la
hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos
hidroxilo de restos serilo o treonilo, la oxidación del átomo de
azufre de la Cisteína, la metilación de los grupos amino en
posición alfa de las cadenas laterales de la lisina, arginina e
histidina. Creighton, Proteins; Structure and Molecule Properties
(W.H. Freeman and Co., San Francisco). páginas 79-86
(1983).
Los compuestos preparados por el procedimiento
de la presente invención pueden ser cambiados también al nivel del
DNA. La secuencia de DNA de cualquier parte del compuesto puede ser
cambiada para dar lugar a codones más compatibles con la célula
huésped escogida. Para el E. coli, que es la célula huésped
preferida, son conocidos en la técnica codones optimizados. Pueden
sustituirse codones para eliminar sitios de restricción o incluir
sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar en el
procesamiento del DNA en la célula huésped seleccionada. Las
secuencias de DNA del vehículo, el engarce y los péptidos, pueden
modificarse para incluir cualquiera de los cambios de secuencia
anteriores.
Los compuestos preparados por el procedimiento
de esta invención, pueden prepararse en gran medida en células
huésped transformadas usando técnicas de DNA recombinante. Para
hacer esto, se prepara una molécula de DNA recombinante que
codifica el péptido. Son bien conocidos en la técnica métodos de
preparación de tales moléculas de DNA. Por ejemplo, secuencias que
codifican los péptidos podrían escindirse desde DNA usando enzimas
de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de DNA
podría ser sintetizada usando técnicas de síntesis química, tales
como el método del fosforamidato. Asimismo, podría utilizarse una
combinación de estas técnicas.
Esta invención contempla también que un vector
sea capaz de expresar las moléculas en un hospedante adecuado. El
vector comprende la molécula de DNA que codifica la molécula ligada
operativamente a secuencias apropiadas de control de la expresión.
Métodos para efectuar este ligamiento operativo, o bien antes o bien
después de insertar la molécula de DNA en el vector, son bien
conocidos en la técnica. Las secuencias de control de la expresión
incluyen promotores, activadores, intensificadores, operadores,
sitios de unión ribosómicos, señales de iniciación, señales de
detención, señales de terminación, señales de poliadenilación y
otras señales implicadas en el control de la transcripción o de la
traducción.
El vector que resulta, que tiene comprendida en
él la molécula de DNA, se usa para transformar un hospedante
apropiado. Esta transformación puede llevarse a cabo usando métodos
conocidos en la técnica.
Puede usarse en la práctica de esta invención
cualquiera de un gran número de células huésped bien conocidas y
que se encuentran disponibles. La selección de un hospedante
particular depende de diversos factores reconocidos por la técnica.
Estos factores incluyen, por ejemplo, compatibilidad con el vector
de expresión escogido, toxicidad de los péptidos codificados por la
molécula de DNA, velocidad de transformación, facilidad de
recuperación de los péptidos, características de la expresión,
bio-seguridad y costos. Debe alcanzarse un
equilibrio entre estos factores con el entendimiento de que no
todos los hospedantes pueden ser igualmente eficaces para la
expresión de una secuencia particular de DNA. Dentro de estas pautas
generales, los hospedantes de tipo microbiano útiles incluyen
bacterias (tales como E. coli so.), levaduras (tales como
Saccharomyces sp.) y otras células de hongos, insectos, plantas,
mamíferos (con inclusión del hombre), en cultivo, u otros
hospedantes conocidos en la técnica.
Seguidamente, la célula transformada es
cultivada y purificada. Las células huésped pueden ser cultivadas
en condiciones convencionales de fermentación para que los
compuestos deseados sean expresados. Tales condiciones de
fermentación son bien conocidas en la técnica. Finalmente, los
péptidos son purificados partiendo del cultivo mediante métodos
bien conocidos en la técnica.
Los compuestos pueden prepararse también
mediante métodos sintéticos. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de
síntesis en fase sólida. Son bien conocidos en la técnica métodos
adecuados, e incluyen los descritos por Merrifield (1973), en Chem.
Polypeptides, páginas 335-61 (Katsoyannis y
Panayotis compiladores); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc.
85:2149; Davis et al., (1985), Biochem. Intl.
10:394-414; Stewart y Young (1969), Solid Phase
Peptide Synthesis; patente de EE.UU. No. 3.941.763; Finn et
al., (1976), The Proteins (3ª edición) 2:
105-253; y Erickson et al. (1976), The
Proteins (3ª Edición) 2: 257-527. La síntesis en
fase sólida es la técnica preferida de preparación de péptidos
individuales dado que es el método más eficaz de preparación de
péptidos pequeños desde el punto de vista del costo.
Los compuestos que contienen péptidos
derivatizados o que contienen grupos no peptídicos, pueden ser
sintetizados mediante técnicas de la química orgánica bien
conocidas.
En general. Los compuestos producidos
mediante el procedimiento de esta invención poseen actividad
farmacológica que resulta desde las moléculas farmacológicamente
activas a las que está unido el Fc. La actividad de estos
compuestos puede medirse mediante ensayos conocidos en la
técnica.
Además de los usos terapéuticos, los compuestos
producidos mediante el procedimiento de la presente invención,
pueden ser útiles también para diagnosticar enfermedades
caracterizadas por la disfunción de una proteína de interés
asociada. En una realización, un método de detección en una muestra
biológica de una proteína de interés (por ejemplo, un receptor)
capaz de ser activada, comprende las etapas de (a) poner en contacto
la muestra con un compuesto producido mediante el procedimiento de
esta invención, y (b) detectar la activación de la proteína de
interés por el compuesto. Las muestras biológicas incluyen muestras
de tejidos, células intactas o sus extractos. Los compuestos
producidos mediante el procedimiento de esta invención pueden ser
usados como parte de un kit de diagnóstico para detectar la
presencia de sus proteína de interés asociadas, de una muestra
biológica. Tales kits emplean los compuestos producidos mediante el
procedimiento de la presente invención que poseen una marca unida
para permitir la detección. Los compuestos son útiles para
identificar proteínas de interés, normales o anormales. Para los
compuestos imitativos de EPO, por ejemplo, la presencia de una
proteína anormal de interés existente en una muestra biológica,
puede ser indicativa de trastornos tales como la anemia de Diamond
Blackfan, en la que se cree que el receptor de EPO es
disfuncional.
En general. La presente invención
proporciona asimismo métodos de uso de composiciones farmacéuticas
de los compuestos. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser
para administrar por inyección, o para administrar por vía oral,
pulmonar, nasal, transdérmica u otros formas de administración. En
general, la invención incluye composiciones farmacéuticas que
comprenden cantidades eficaces de un compuesto producido mediante el
procedimiento de la invención, junto con diluyentes, agentes
conservantes, agentes solubilizantes, agentes emulsionantes,
coadyuvantes y/o excipientes, farmacéuticamente aceptables. Tales
composiciones incluyen diluyentes de diversos contenidos de agentes
tamponantes (por ejemplo, Tris-HCl, acetato,
fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y
agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, polisorbato 80),
antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico, metabisulfito sódico),
conservantes (por ejemplo, timerosol, alcohol bencílico) y
sustancias de voluminosidad (por ejemplo, lactosa, manitol);
incorporación del material en preparaciones en partículas de
compuestos polímericos tales como poli(ácido láctico), poli(ácido
glicólico), etc., o en liposomas. También puede usarse ácido
hialurónico, y esto puede ocasionar el efecto de favorecer la
duración sostenida en la circulación. Tales composiciones pueden
tener influencia sobre el estado físico, la solubilidad, la
velocidad de liberación in vivo, y la velocidad de
aclaramiento de las proteínas y derivados presentes. Véase, por
ejemplo la publicación Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª
Edición, (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18042) páginas
1435-1712. Las composiciones pueden prepararse en
forma líquida o pueden estar en forma de un polvo seco, tal como en
forma liofilizada. También se contemplan formulaciones implantables
de cesión prolongada, como las formulaciones transdérmicas.
Formas de administración a los pulmones.
También se contempla aquí la administración a los pulmones de las
moléculas de fusión de Fc (o sus derivados). La proteína (o su
derivado) se suministra a los pulmones de un mamífero al tiempo que
se produce la inhalación, y atraviesa el revestimiento epitelial del
pulmón pasando a la corriente sanguínea. (Otros informes de esto
incluyen las publicaciones de Adjei et al., Pharma. Res.
(1990) 7:565-9; de Adjei et al., (1990),
Internatl. J. Pharmaceutics 63:135-44 (acetato de
leuprolida); de Braquet et al., (1989), J. Cardiovasc,
Pharmacol. 13 (suplemento 5):s.143-146
(endotelina-1); de Hubbard et al. (1989),
Annals Int. Med. 3:206-12
(antitripsina-\alpha1); de Smith et al.,
(1989), J. Clin. Invest. 84:1145-6
(proteinasa-\alpha1); de Oswein et al.,
(Marzo, 1990), "Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp.
Drug. Delivery II, Keystone, Colorado (hormona del crecimiento
humano, recombinante); de Debs et al., (1988), J. Immunol.
140: 3482-8 (Interferón-\gamma y
factor \alpha de la necrosis tumoral) y de Platz et al.,
patente de EE.UU. No. 5.284.656 (factor estimulante de colonias de
granulocitos).
Está contemplado para usar en la práctica de
esta invención, una amplia variedad de dispositivos mecánicos
diseñados para administración al pulmón de productos terapéuticos,
que incluyen, aun cuando no se limita a ellos, nebulizadores,
inhaladores de dosis medidas e inhaladores de polvos, todos los
cuales son familiares a los expertos en la técnica. Algunos
ejemplos específicos de dispositivos de que se dispone en el
comercio, adecuados para la práctica de esta invención, son: el
nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis,
Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical
Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medidas
Ventolin, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, North
Carolina; y el inhalador de polvos Spinhaler, fabricado por Fisons
Corp., Bedford, Massachusetts.
Todos estos dispositivos requieren el uso de
formulaciones adecuadas para la distribución del compuesto.
Típicamente, cada una de las formulaciones es específica para el
tipo de dispositivo empleado y puede llevar consigo el uso de un
material propulsor apropiado, además de diluyentes, adyuvantes y/o
excipientes, útiles en terapia.
El compuesto debe prepararse del modo más
ventajoso en forma de partículas con un tamaño medio de partícula
menor que 10 micrómetros, lo más preferible 0,5 a 5 micrómetros,
para la administración más eficaz a la parte distal del pulmón.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables
incluyen hidratos de carbono tales como trehalosa, manitol, xilitol,
sacarosa, lactosa y sorbitol Ptros ingredientes para usar en las
formulaciones incluyen DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Pueden usarse
tensioactivos naturales o sintéticos. Puede usarse PEG (incluso
aparte de su uso en la derivatización de la proteína o análogo).
Pueden usarse dextranos tal como el ciclodextrano. Pueden usarse
sales biliares y otros intensificadores afines. Pueden usarse
celulosa y derivados de celulosa. Pueden usarse aminoácidos, tales
como los usados en la formulación de una solución amortiguadora.
Asimismo está contemplado el uso de liposomas,
microcápsulas o microesferas, de complejos de inclusión u otros
tipos de excipientes o vehículos.
Las formulaciones adecuadas para usar con un
nebulizador, o bien a chorro o ultrasónico, comprenderán,
típicamente, el compuesto disuelto en agua en una concentración de,
aproximadamente, 0,1 a 25 mg de proteína biológicamente activa por
ml de solución. La formulación puede incluir también un tampón y un
azúcar simple (por ejemplo, para estabilizar las proteínas y
regular la presión osmótica). La formulación de un nebulizador puede
contener también un tensioactivo, para reducir o evitar la
formación de agregados de la proteína inducida en la superficie,
causada por la atomización de la solución al formarse el
aerosol.
Las formulaciones para usar con un dispositivo
inhalador de dosis medidas comprenderá, en general, un polvo
finamente dividido que contiene el compuesto, suspendido en un
agente propulsor con ayuda de un tensioactivo. El agente propulsor
puede ser cualquier material convencional empleado para esta
finalidad, tal como un clorofluorcarbono, un
hidroclorofluorcarbono, un hidrofluorcarbono, o un hidrocarburo,
incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano,
diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano,
o sus combinaciones. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato
de sorbitan y lecitina de soja. También puede ser útil como
tensioactivo el ácido oleico.
Las formulaciones para su distribución desde un
dispositivo inhalador de polvo, comprenderán un polvo seco,
finamente dividido, que contiene el compuesto de la invención y
puede incluir también un agente de voluminosidad, tal como lactosa,
sorbitol, sacarosa, manitol, trehalosa o xilitol, en cantidades que
facilitan la dispersión del polvo desde el dispositivo, por
ejemplo, 50 a 90% del peso de la formulación.
Formas de distribución nasal. También se
contempla la distribución nasal de la molécula de fusión de Fc. La
distribución nasal permite el paso de la proteína a la corriente
sanguínea directamente, después de administrar el producto
terapéutico a la nariz, sin necesidad de depositar el producto en el
pulmón. Las formulaciones para distribución nasal incluyen las
preparadas con dextrano o ciclodextrano. También está contemplada la
distribución mediante transporte a través de otras membranas
mucosas.
Dosificación. El régimen de dosificación
implicado en un método de tratamiento de las condiciones
anteriormente descritas, será determinado por el facultativo que
las atienda, tomando en consideración los diversos factores que
modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la edad, el
estado, el peso, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de
una infección, el tiempo de administración y otros factores
clínicos. En general, el régimen diario debe estar en el intervalo
de 0,1-1000 microgramos del compuesto de la
invención por kilo de peso, de preferencia 0,1-150
microgramos por kilogramo.
Las descripciones que siguen son ilustrativas en
vez de limitativas.
Identificación de cisteínas en una construcción
de Fc-Osteoprotegerina por marcado con CDAP y
división inducida en medio alcalino, con análisis por
CL-EM. (Cromatografía
líquida-Espectro de masas).
Finalidad. Ensayar cisteínas en una
construcción de Fc-Osteoprotegerina mantenida en
medio ácido y determinar su localización.
Métodos. Se empleó el reactivo
tetrafluoroborato de
1-ciano-4-dimetilamino-piridinio
(CDAP) para cianilar selectivamente grupos sulfhidrilo libres,
estables, a pH 4. Las reacciones de cianilación fueron analizadas
mediante HPLC asociada con análisis de espectro de masas
(CL-EM). Se usó HPLC de fase invertida para separar
los picos de componentes desde las muestras nativas y hechas
reaccionar con CDAP. Las muestras de la fase invertida fueron
recogidas, introducidas en una solución acuosa de hidróxido amónico
mas hidrocloruro de guanidina y analizadas seguidamente mediante
CL-EM.
Resultados: El análisis de
Fc-Osteoprotegerina mediante HPLC de fase invertida
dio dos picos. La CL-EM de la reacción primaria con
CDAP reveló cianilación selectiva de dos grupos sulfhidrilo en un
pico que representa, aproximadamente, el 10% del material
proteínico; el pico que representa aproximadamente el 90% del
material no había sido cianilado después de reacción con CDAP. El
análisis por CL-EM de las isoformas tratadas con
hidróxido amónico/guanidina, detalló la localización de dos grupos
sulfhidrilo de cisteína libres.
Conclusiones. Una forma de
Fc-Osteoprotegerina separable por HPLC de fase
invertida contiene dos grupos sulfhidrilo libres. El CDAP es un
reactivo eficaz para caracterizar los grupos sulfhidrilo libres de
proteínas, en condiciones ácidas.
Fc-OPG, una construcción de la
citoquina natural Osteoprotegerina (OPG), se encuentra bajo
investigación clínica para determinar su utilidad en el tratamiento
de la osteoporosis. La Fc-OPG es una proteína
homodimérica, de peso molecular alto(91 kD), que contiene 24
cisteínas en cada secuencia del monómero. Todas las cisteínas
existentes en el dímero están asociadas covalentemente por medio de
24 enlaces disulfuro (o cistina). Estos enlaces covalentes
desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la estructura
terciaria y cuaternaria de la proteína. Por consiguiente, las
cisteínas desapareadas pueden dar por resultado una disminución de
la actividad biológica, tener efectos inmunógenos o ser un
precursor de inestabilidad adicional física y química (oxidación y
agregación).
La monitorización del estado de las cadenas
laterales de cisteína - en la forma disulfuro, de cistina, o
sulfhidrilo, de cisteína. se lleva a cabo, comúnmente, marcando los
grupos sulfhidrilo libres con un fluoróforo o un marcador de peso
molecular, específicos de tioles, en condiciones alcalinas. Dada la
naturaleza lábil de los grupos sulfhidrilo de la cisteína y de los
grupos disulfuro de la cistina en medio acuoso alcalino (pKa \sim
8), la detección cuantitativa de sulfhidrilo de cisteína libre esta
sujeta a inexactitud que resulta de la reducción de cistina a pH
alto y la formación de disulfuro relacionada con la cisteína. Los
métodos de marcado en condiciones alcalinas pueden no ser adecuados
para estimar los grupos sulfhidrilo de cisteína libres, presentes en
formulaciones ácidas de proteínas.
Se observó que una isoforma de
Fc-OPG, separable por HPLC de fase invertida, era
reactiva al añadir una solución acuosa de CuCl_{2}. Después de la
reacción con CuCl_{2} la isoforma eluyó con el mismo tiempo de
retención que el pico principal del cromatograma de fase invertida.
La naturaleza de esta reactividad llevó a la especulación de que la
isoforma era representativa de grupos sulfhidrilo libres existentes
en la proteína, que se habían convertido en cistina por medio de un
compuesto de cobre como oxidante. Numerosas técnicas fueron
empleadas para comparar el número de grupos sulfhidrilo de cisteína
libres, presentes en el pico principal frente a la isoforma. No se
encontraron diferencias. Una característica común a todas las
técnicas, fue el uso de condiciones de reacción de neutra a
alcalina.
Este ejemplo presenta la caracterización de la
isoforma usando el reactivo tetrafluoroborato de
1-ciano-4-dimetilamino-piridinio
(CDAP). La detección e identificación de restos de cisteína
desapareados presentes en medio ácido, se hace posible mediante la
cianilación de grupos sulfhidrilo de cisteína libres por el reactivo
CDAP (Figura 6) y subsiguiente escisión de la unión peptídica en
los restos de cisteína cianilados (Figura 7).
La construcción de Fc-OPG puede
prepararse mediante procedimientos conocidos en la técnica. El CDAP
puede adquirirse de Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO).
RP-HPLC: Las muestras
fueron inyectadas en una columna Zorbax 300SB C8 de 4,6 mm x 25 cm,
y eluídas con un gradiente de TFA al 0,1% y TFA al 0,1% en ACN al
90%, a 60ºC, en un cromatógrafo Hewlett-Packard 1100
ó 1090, a 215 nm.
Espectrometría de masas de
electropulverización: Toda la espectrometría de masas se llevó a
cabo en un espectrómetro AP 100 de
Perkin-Elmer/Sciex usando condiciones consistentes
con la ionización de péptidos y proteínas.
Tratamiento con cobre: Diez mg/ml de
proteína en acetato sódico 10 mM y sorbitol al 5%, se trataron con
CuCl_{2} 50 mM (pH final \sim4).
Condiciones de cianilación: Se preparó
una solución de 50 mg/ml de CDAP en el seno de HCl 0,5 M. Se añadió
50 \mul de la solución de CDAP a 500 \mul de una solución de 10
mg/ml de proteína, en el seno de acetato (10 mM) de pH 5 y sorbitol
al 5%. Se añadió 5 \mul de NaOH 0,1 N a la mezcla de
proteína-CDAP y se agitó con formación de
vórtice.
Condiciones de división: La proteína
cianilada se separó del material nativo mediante HPLC de fase
invertida y se recogieron ambos picos. Las fracciones fueron
reducidas en volumen, en vacío, en aproximadamente dos tercios y
luego se trataron con una solución de NH_{4}OH 1,5 M, GdHCl 4 M, y
se calentó a 37ºC durante 90 minutos.
La cianilación de dos grupos sulfhidrilo de la
cisteína en la construcción Fc-OPG pudo dar un
aumento de masa de 50 daltons, resultante de la adición de dos
grupos cianuro de 26 daltons. y la pérdida supuesta de dos protones
desde las cadenas laterales de la cisteína. La cianilación selectiva
de la isoforma de la RP-HPLC es evidente en el
aumento de masa de \sim 50 daltons detectado para tal pico; la
masa del pico principal no se modificó. La naturaleza de la
isoforma fue indicada posteriormente por la observación de que la
isoforma no respondía más a la adición de CuCl_{2}. Una pareja de
cisteínas cianiladas no podía ser competente para la formación de
puentes disulfuro por oxidación con CuCl_{2} (Figura 8).
El esquema de división observado para la
isoforma hecha reaccionar con CDAP y tratada con hidróxido amónico
se diferenciaba grandemente del del pico principal. La reacción de
división de la isoforma produjo tres picos diferentes y la reacción
del pico principal dio por resultado un pico (Figura 9) La
espectrometría de masas de los productos de división de la isoforma
estableció su identidad (Tabla 1). El pico de masa 22.720 unidades
de masa atómica (uma) estaba relacionado con u n fragmento de la
molécula que consistía en la secuencia completa de aminoácidos del
extremo C terminal de la última cisteína de la secuencia de Fc
(Figura 9, pico 2). La masa encontrada para el pico 3 de la Figura
4, 6.616,8 uma, es equivalente a la masa de un lazo de disulfuro del
domino Fc correspondiente a la secuencia de Fc encontrada en el
extremo N-terminal para el fragmento determinado
para el pico 2. El pico 4 (Figura 9) está relacionado con el
fragmento restante de la construcción Fc-OPG. Estos
resultados revelan dos grupos sulfhidrilo de cisteína libres en el
dominio Fc de uno de los dos monómeros (Figura 10).
En experimentos subsiguientes, la isoforma de la
RP-HPLC se convirtió en el pico principal en
condiciones alcalinas desnaturalizantes (resultados no indicados).
Aparentemente, la formación de cistina en la isoforma era lo
bastante rápida en estas condiciones alcalinas para quedar sin
detectar mediante otras técnicas (reacción de Ellman y mapeo de
péptidos) La especificidad del sitio y la compatibilidad del CDAP en
condiciones ácidas para marcar restos de cisteína, hizo posible la
caracterización de esta isoforma de proteína.
Una isoforma de Fc-OP separable
mediante HPLC de fase invertida, contiene dos grupos sulfhidrilo
libres. La detección de grupos sulfhidrilo libres de cisteína de
una proteína, puede complicarse por su naturaleza transitoria en
las condiciones alcalinas usadas típicamente para el análisis. El
CDAP es un reactivo eficaz para caracterizar los grupos sulfhidrilo
libres de proteínas, en condiciones ácidas.
Finalidad. Se observaron diferencias
importantes en la estabilidad de Fc-OPG en función
del tratamiento con cobre de proteína en masa, en que la
construcción Fc-OPG tratada con cobre era
significativamente más estable que la construcción
Fc-OPG que no lo había sido. Específicamente, la
construcción Fc-OPG que no había sido tratada con
cobre era más propensa a agregación que la Fc-OPG
tratada con iones cobre. Se cree que la estabilidad mejorada de la
construcción Fc-OPG es debida a la conversión de una
fracción inestable de la Fc-OPG con estructura
incompleta de disulfuro, en una forma con unión disulfuro intacta,
por tratamiento con iones cobre.
Métodos. Cromatografía de fase invertida:
La cromatografía de fase invertida se llevó a cabo en un sistema de
HPLC 1100 ó 1090 de Hewlett-Packard, equipado con un
detector de una disposición de diodos y regulado por el soporte
lógico Chemstation Software. Las muestras de Fc-OPG
fueron analizadas sobre una columna 300SB Zorbax, de 4,6 mm x 25
cm). La columna se equilibra inicialmente con tampón A al 90% (agua
de calidad para HPLC conteniendo TFA al 0,1%). Las muestras fueron
eluídas con un gradiente lineal de tampón B al 4,2%/min
(acetonitrilo, 90%, agua de calidad para HPLC, 10% y TFA al 0,1%)
durante 6 minutos y luego tampón B al 0,11%/min durante 37 minutos.
La columna se calentó a 60ºC y la elución se monitorizó a 215 nm,
con un caudal de 0,5 ml/min. Ambas construcciones de
Fc-OPG, tratada con cobre y sin tratar con cobre (10
mg/ml) fueron formuladas en el seno de acetato sódico 10 mM, pH
5,0, que contenía sorbitol al 5%, Las muestras fueron incubadas a
29ºC y analizadas transcurrido el tiempo.
Conclusiones. Como se ha indicado
anteriormente, el CuCl_{2} cataliza la formación de cistina a
partir de dos cisteínas desapareadas de la construcción
Fc-OPG. Los perfiles en la cromatografía de fase
invertida de una preparación de Fc-OPG después de
tratamiento con cobre frente a una que no había sido tratada, están
comparados en la Figura 11. El pico posterior prominente en el
cromatograma de la muestra sin tratar es debido a la población de
moléculas de Fc-OPG con cisteínas desapareadas. La
estabilidad de estas preparaciones de Fc-OPG fue
examinada en función del tratamiento con cobre, mediante HPLC de
exclusión por tamaños. Los cromatogramas de muestras de
Fc-OPG sin tratar con cobre y tratadas con cobre,
incubadas a 29ºC durante 2 años, se muestran en la Figura 12; un
aumento de agregados de alto peso molecular y picos de dímero, son
evidentes en la muestra sin tratar.
Las abreviaturas empleadas en esta memoria
descriptiva se definen como sigue, a menos que se defina de otro
modo en casos específicos.
- CDAP
- tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridinio
- HPLC
- cromatografía líquida de alta resolución
- ITZ
- iminotiazolidina
- OPG
- osteoprotegerina
- RP
- fase invertida
- TNF
- factor de la necrosis tumoral
- TPO
- trombopoyetina
Habiendo sido totalmente descrita la invención,
será evidente para una persona de experiencia ordinaria en la
técnica que pueden llevarse a cabo muchos cambios y modificaciones
en la misma sin apartarse de la invención tal como se expone en
esta memoria.
<110> AMGEN INC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA CORREGIR FALTAS
DE ENLACES DISULFURO EN MOLÉCULAS DE Fc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A-584
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> A ser cedida
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-11-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/165,188
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-11-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 684
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (684)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Un procedimiento de preparación de un
compuesto farmacológicamente activo, en el que una falta de enlaces
en una molécula de fusión de Fc puede evitarse o corregirse, cuyo
procedimiento comprende las etapas de
(a) preparar un compuesto farmacológicamente
activo;
(b) tratar el compuesto farmacológicamente
activo con un haluro de cobre (II) 10 mM, por lo menos; y
(c) aislar el compuesto farmacológicamente
activo,
en el que el compuesto farmacológicamente activo
es una molécula de fusión que comprende un dominio
farmacológicamente activo y un dominio Fc.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el compuesto farmacológicamente activo comprende un
anticuerpo.
3. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el compuesto farmacológicamente activo se prepara en
E. coli.
4. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el haluro de cobre (II) es
CuCl_{2}.
5. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
la reivindicación 2, en el que el compuesto farmacológicamente
activo se prepara en células CHO.
6. El procedimiento según la reivindicación 5,
en el que el haluro de cobre (II) es CuCl_{2}.
7. El procedimiento según la reivindicación 6,
en el que el CuCl_{2} se usa en una concentración 30 mM, por lo
menos.
8. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de una proteína OPG.
9. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de una proteína leptina.
10. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de un inhibidor del
TNF-\alpha.
11. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de un inhibidor de
IL-1.
12. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de una proteína de
IL-1ra.
13. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el dominio farmacológicamente
activo comprende la secuencia de un péptido imitativo de TPO.
14. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el dominio Fc es el dominio Fc de
IgG1.
15. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el dominio Fc comprende la
secuencia de SEQ ID NO: 2.
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