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ES2386386T3 - Inmunización contra Chlamydia trachomatis - Google Patents

Inmunización contra Chlamydia trachomatis Download PDF

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ES2386386T3
ES2386386T3 ES08075729T ES08075729T ES2386386T3 ES 2386386 T3 ES2386386 T3 ES 2386386T3 ES 08075729 T ES08075729 T ES 08075729T ES 08075729 T ES08075729 T ES 08075729T ES 2386386 T3 ES2386386 T3 ES 2386386T3
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ES
Spain
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protein
chlamydia trachomatis
dna
sequence
seq
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES08075729T
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English (en)
Inventor
Guido Grandi
Giulio Ratti
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GSK Vaccines SRL
Original Assignee
Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
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Publication date
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Priority claimed from GB0218233A external-priority patent/GB0218233D0/en
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Abstract

Una proteína para su uso en el tratamiento o la prevención de infección debida a Chlamydia trachomatis, en laque la proteína es (a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID 255, (b) una proteína quecomprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 50 % o más con la secuenciade aminoácidos de (a), o (c) una proteína que comprende un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos deSEC ID 255.

Description

Inmunización contra Chlamydia trachomatis
CAMPO TÉCNICO
La presente invención está en el campo de la inmunización contra la infección por clamidia, en particular contra la infección por Chlamydia trachomatis.
TÉCNICA ANTERIOR
Chlamydiae son parásitos intracelulares estrictos de células eucariotas que son responsables de infecciones sexualmente transmitidas endémicas y diversos otros síndromes de enfermedad. Ocupan una rama filogénica eubacteriana exclusiva que no tiene estrecha relación con ningún otro organismo conocido - se clasifican en su propio orden (Chlamydiales) que contiene una única familia (Chlamydiaceae) que a su vez contiene un único género (Chlamydia, también denominado en lo sucesivo Chlamydophila). Una característica particular de las Chlamydiae es su ciclo vital único, en el que la bacteria alterna entre dos formas morfológicamente distintas: una forma infecciosa extracelular (cuerpos elementales, CE) y una forma no infecciosa intracelular (cuerpos reticulados, CR). El ciclo vital se completa con la reorganización de CR en CE, que deja la célula huésped alterada lista para infectar más células.
Actualmente se conocen cuatro especies de clamidia - C. trachomatis, C. pneumoniae, C. pecorum y C. psittaci {por ejemplo, refs. 1, 2} - y están disponibles secuencias del genoma {refs. 3 a 9}.
Las serovariantes humanas (“serovares”) de C. trachomatis se dividen en dos biovariantes (“biovares”). Las serovares A-K provocan infecciones epiteliales, principalmente en el tejido ocular (A-C) o aparato genitourinario (DK). Las serovares L1, L2 y L3 son los agentes del linfogranuloma venéreo invasivo (LGV).
Aunque la propia infección por clamidia produce enfermedad, se cree que, en algunos pacientes, la gravedad de los síntomas es en realidad debida a una respuesta inmunitaria huésped anómala. El fallo en eliminar la infección produce estimulación inmunitaria persistente y, en vez de ayudar al huésped, esto produce infección crónica con consecuencias graves que incluyen esterilidad y ceguera {10}. Además, la protección conferida por la infección por clamidia natural es normalmente incompleta, transitoria y específica para cepa.
Debido a la grave naturaleza de la enfermedad, hay un deseo por proporcionar vacunas adecuadas. Éstas pueden ser útiles (a) para la inmunización contra la infección por clamidia o contra enfermedad inducida por clamidia (vacunación profiláctica) o (b) para la erradicación de una infección por clamidia crónica establecida (vacunación terapéutica). Sin embargo, como es un parásito intracelular, la bacteria puede evadir generalmente respuestas inmunitarias mediadas por anticuerpo.
El documento WO 00/34483 investigó diversos polipéptidos para su eficacia en provocar una respuesta inmunitaria contra infección por Chlamydia y sugirió que podía obtenerse protección específica para SWIB.
Se han descrito diversas proteínas antigénicas para C. trachomatis, y la superficie celular en particular ha sido el objetivo de la investigación detallada {por ejemplo, 1, 11}. Estas incluyen, por ejemplo, pgp3 {12, 13, 14}, MOMP {15, documento WO 95/12411}, Hsp60 (GroEL) {16} y Hsp70 (similar a DnaK) {17}. No todas éstas han demostrado ser vacunas eficaces; sin embargo, un objeto de la invención es identificar antígenos de C. trachomatis que provoquen una respuesta inmunitaria durante la infección natural con el fin de proporcionar antígenos e inmunógenos adecuados para su uso en el desarrollo de vacunas. Otro objeto es identificar antígenos útiles para diagnosticar (por ejemplo, inmunodiagnóstico) C. trachomatis.
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN
La referencia 18 desvela diversas proteínas de C. pneumoniae que se verificaron empíricamente como inmunorreactivas, inmunoaccesibles y/o presentes en cuerpos elementales. Estas propiedades de las proteínas no pudieron derivarse de la información de la secuencia genómica. La referencia 18 desvela que estas proteínas pueden usarse en el tratamiento o la prevención de infección debida a bacterias Chlamydia, siendo C. pneumoniae el foco principal. Las proteínas de C. pneumoniae también pueden usarse para tratar o prevenir infección por otras especies de Chlamydia debido a la reactividad cruzada entre especies. C. pneumoniae está estrechamente relacionada con C. trachomatis, como se muestra por las comparaciones del genoma completo {3, 4, 5}.
La presente invención se refiere a la proteína de C. trachomatis CT456 que tiene SEC ID Nº: 255 para su uso en el tratamiento o la prevención de infección debida a bacterias Chlamydia.
Proteínas de C. trachomatis
La invención proporciona una proteína para su uso en el tratamiento o la prevención de infección debida a Chlamydia trachomatis, en la que la proteína es (a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID 255, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen el 50 % o mayor identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de (a), o (c) una proteína que comprende un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de SEC ID 255.
Se describen proteínas que comprenden una o más de las secuencias de aminoácidos de número impar SEC ID 1
261. Una proteína hipotética de secuencia SEC ID Nº 255 se desvela en la base de datos Uniprot número de acceso 084462, 16 de octubre de 2001. También se describen proteínas que comprenden secuencias que comparten al menos el x % de identidad de secuencias con una o más de las secuencias de aminoácidos de número impar (SEC ID 1-261). Dependiendo de la secuencia particular, x es preferentemente el 50 % o más (por ejemplo, 60 %, 70 %,80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más). Éstas incluyen mutantes y variantes alélicas. Normalmente, el 50 % de identidad o más entre dos proteínas se considera que es una indicación de equivalencia funcional. La identidad entre proteínas se determina preferentemente por la homología del algoritmo de búsqueda de Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) usando una búsqueda de huecos afín con los parámetros penalización por hueco abierto=12 y penalización por extensión de hueco=1.
Adicionalmente se describen proteínas que comprenden fragmentos de secuencias de aminoácidos de número impar SEC ID 1-261. Los fragmentos deben comprender al menos n aminoácidos consecutivos de las secuencias y, dependiendo de la secuencia particular, n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200 o más). Preferentemente, los fragmentos comprenden uno o más epítopes de la secuencia. Otros fragmentos preferidos omiten un péptido señal.
Las proteínas de la invención pueden prepararse por diversos medios, por ejemplo, por síntesis química (al menos en parte), digiriendo polipéptidos más largos usando proteasas, por traducción de ARN, por purificación de cultivo celular (por ejemplo, de expresión recombinante o de cultivo de C. trachomatis), etc. La expresión heteróloga en E. coli es una vía preparativa preferida.
Las proteínas de la invención pueden tomar diversas formas, por ejemplo, nativas, fusiones, glicosiladas, no glicosiladas, lipidadas, etc.
Las proteínas de la invención se preparan preferentemente en forma sustancialmente pura (es decir, sustancialmente libres de otras proteínas de C. trachomatis o de células huésped).
Las proteínas de la invención pueden unirse a un soporte sólido. Pueden comprender una marca detectable (por ejemplo, una marca radiactiva o fluorescente, o una marca de biotina).
Ácidos nucleicos de C. trachomatis
La invención proporciona un ácido nucleico para su uso en el tratamiento o la prevención de infección debida a Chlamydia trachomatis, en el que el ácido nucleico es (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID 256, (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 50 % o más con la secuencia de nucleótidos de (a), o (c) un ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 10 nucleótidos consecutivos de SEC ID 256.
Se describen ácidos nucleicos que comprenden una o más de las secuencias de nucleótidos de número par SEC ID 2-262.
También se describen secuencias que comprenden ácidos que comparten al menos el x % de identidad de secuencias con las secuencias de nucleótidos de número par SEC ID 2-262. Dependiendo de la secuencia particular, x es preferentemente del 50 % o más (por ejemplo, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más).
Además, se describe ácido nucleico que puede hibridarse con ácido nucleico que comprende las secuencias de nucleótidos de número par SEC ID 2-262. Las reacciones de hibridación pueden realizarse en condiciones de “rigurosidad” diferente. Condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y publicadas en la materia. Ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente): temperaturas de incubación de 25 ºC, 37 ºC, 50 ºC, 55 ºC y 68 ºC; concentraciones de tampón de 10 X SSC, 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC y sus equivalentes usando otros sistemas tampón; concentraciones de formamida del 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1, 2 ó 15 minutos; y disoluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, o agua desionizada. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado de la invención se hibrida selectivamente bajo condiciones de baja rigurosidad; en otras realizaciones se hibrida selectivamente bajo condiciones de rigurosidad media; en otras realizaciones se hibrida selectivamente bajo condiciones de alta rigurosidad. Un conjunto a modo de ejemplo de condiciones de hibridación de baja rigurosidad es 50 ºC y 10 x SSC. Un conjunto a modo de ejemplo de condiciones de hibridación de rigurosidad media es 55 ºC y 1 x SSC. Un conjunto a modo de ejemplo de condiciones de hibridación de alta rigurosidad es 68 ºC y 0,1 x SSC.
También se proporcionan fragmentos que comprenden ácidos nucleicos de las secuencias de nucleótidos de número par SEC ID 2-262. Éstos debe comprender al menos n nucleótidos consecutivos de las secuencias de C. trachomatis y, dependiendo de la secuencia particular, n es 7 o más (por ejemplo, 10, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 200, 300 o más).
Según otro aspecto, la invención proporciona ácido nucleico que codifica proteínas y fragmentos de proteína de la invención.
La invención proporciona ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a las descritas anteriormente (por ejemplo, para fines antisentido o de sonda).
El ácido nucleico de la invención puede prepararse, por supuesto, de muchas formas, por ejemplo, por síntesis química (al menos en parte), digiriendo polinucleótidos más largos usando enzimas de restricción, a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc, a partir del propio organismo, etc.
El ácido nucleico de la invención puede tomar diversas formas (por ejemplo, monocatenario, bicatenario, lineal, circular, vectores, cebadores, sondas, etc.).
Los ácidos nucleicos de la invención pueden unirse a un soporte sólido (por ejemplo, una perla, placa, filtro, película, portaobjetos, resina, etc.). Los ácidos nucleicos de la invención pueden incluir una marca detectable (por ejemplo, una marca radiactiva o fluorescente, o una marca de biotina). Esto es particularmente útil cuando el polinucleótido va a usarse en las técnicas de detección de ácidos nucleicos, por ejemplo, cuando el ácido nucleico es un cebador o como una sonda para su uso en técnicas tales como PCR, LCR, TMA, NASBA, bADN, etc.
El término “ácido nucleico” incluye ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN y análogos de ADN o ARN tales como aquellos que contienen esqueletos o bases modificados, y también ácidos nucleicos peptídicos (PNA), etc.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden aislarse y obtenerse en pureza sustancial, generalmente distinta de un cromosoma intacto. Normalmente, los polinucleótidos se obtendrán sustancialmente libres de otras secuencias de ácidos nucleicos que se producen naturalmente, teniendo generalmente al menos aproximadamente el 50 % (en peso) de pureza, normalmente al menos aproximadamente el 90 % de pureza.
Los ácidos nucleicos pueden usarse, por ejemplo: para producir polipéptidos; como sondas para la detección de ácido nucleico en muestras biológicas; para generar copias adicionales de los polinucleótidos; para generar ribozimas u oligonucleótidos antisentido; y como sondas de ADN monocatenario o como oligonucleótidos que forman una cadena triple, etc.
La invención proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo, vectores de clonación o de expresión) y células huésped transformadas con los mismos.
Composiciones
Según otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden proteína y/o ácido nucleico según la invención. Estas composiciones son preferentemente composiciones inmunogénicas tales como vacunas, y son adecuadas para fines de inmunización y vacunación. Las vacunas de la invención pueden ser profilácticas o terapéuticas y normalmente comprenderán un antígeno que puede inducir anticuerpos que pueden inhibir (a) la adhesión de clamidia, (b) la entrada de clamidia y/o (c) la replicación satisfactoria dentro de la célula huésped. Las vacunas inducen preferentemente cualquier respuesta de linfocitos T mediada por célula que son necesarias para la eliminación de clamidia del huésped.
La invención también proporciona ácido nucleico o proteína según la invención para su uso como medicamentos (por ejemplo, como vacunas).
La invención también proporciona el uso de ácido nucleico o proteína según la invención en la preparación de un medicamento (por ejemplo, una vacuna o una composición inmunogénica) para tratar o prevenir infección debida a una Chlamydia. Esta será generalmente C. trachomatis pero, debido a la reactividad cruzada entre especies, también puede ser C. pneumoniae, C. pecorum o C. psittaci. Para prevención, el medicamento provoca preferentemente una respuesta inmunitaria que es específica para la forma de CE de Chlamydia; para el tratamiento, el medicamento provoca preferentemente una respuesta inmunitaria que es específica para la forma de CR de Chlamydia.
La invención también proporciona el uso de ácido nucleico o proteína según la invención en la preparación de un medicamento (por ejemplo, una vacuna o una composición inmunogénica) para neutralizar cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis.
La invención también proporciona un procedimiento para tratar (por ejemplo, inmunizar) un paciente (por ejemplo, un ser humano) que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de ácido nucleico o proteína según la invención.
La invención también proporciona un procedimiento de fomentar una respuesta inmunitaria en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad inmunológicamente eficaz de ácido nucleico o proteína según la invención. La respuesta inmunitaria puede implicar producir anticuerpos en el paciente y/o fomentar una respuesta inmunitaria celular (por ejemplo, una respuesta CTL). La respuesta inmunitaria puede ser específica para un CE o una proteína de CR, o para una proteína que se expresa en el citoplasma huésped. Una respuesta de anticuerpos es preferentemente específica para un CE, mientras que una respuesta inmunitaria celular es preferentemente específica para una proteína citoplásmica o, preferentemente, para una proteína de CR.
La invención también proporciona un procedimiento de producción de anticuerpos que reconocen una proteína de la invención que comprende la etapa de administrar a un paciente un cuerpo elemental o cuerpo reticulado de Chlamydia. Los anticuerpos son preferentemente específicos para un CE.
La invención también proporciona un procedimiento de neutralizar infectividad de C. trachomatis que comprende la etapa de administrar a un paciente una proteína, ácido nucleico o anticuerpo de la invención. El procedimiento neutraliza preferentemente infectividad de CE.
La invención también proporciona un procedimiento para detectar un CE o CR de Chlamydia en una muestra biológica que comprende la etapa de poner en contacto un anticuerpo de la invención con la muestra. La muestra podría ser una muestra de sangre, otro fluido corporal o una muestra de tejido. El procedimiento puede usarse para diagnosticar infección por clamidia.
Composiciones inmunogénicas de la invención también pueden incluir uno o más de los siguientes antígenos:
-
un antígeno de proteína de Helicobacter pylori tal como VacA, CagA, NAP, HopX, HopY {por ejemplo, el documento WO98/04702} y/o ureasa.
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un antígeno de proteína del serogrupo B de N. meningitidis tal como aquellos en los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280, WO00/22430, Tettelin y col. (2000) Science 287:1809-1815, Pizza y col. (2000) Science 287:1816-1820 y WO96/29412, prefiriéndose particularmente la proteína de '287' y derivados.
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una preparación de vesícula de la membrana externa (OMV) del serogrupo B de N. meningitidis tal como la desvelada en el documento WO01/52885; Bjune y col. (1991) Lancet 338(8775):1093-1096; Fukasawa y col. (1999) Vaccine 17:2951-2958; Rosenqvist y col. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323-333 etc.
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un antígeno de sacárido del serogrupo A, C, W135 y/o Y de N. meningitidis tal como el oligosacárido desvelado en Costantino y col. (1992) Vaccine 10:691-698 del serogrupo C {véase también Costantino y col. (1999) Vaccine 17:1251-1263}.
-
un antígeno de sacárido de Streptococcus pneumoniae {por ejemplo, Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332; Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v; Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207}.
-
un antígeno del virus de la hepatitis A tal como virus inactivado {por ejemplo, Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188; Iwarson (1995) APMIS 103:321-326}.
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un antígeno del virus de la hepatitis B tal como los antígenos de superficie y/o del núcleo {por ejemplo, Gerlich y col. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80}.
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un antígeno del virus de la hepatitis C {por ejemplo, Hsu y col. (1999) Clin Liver Dis 3:901-915}.
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un antígeno de Bordetella pertussis tal como la holotoxina de Pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 {por ejemplo, Gustafsson y col. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355; Rappuoli y col. (1991) TIBTECH9:232238}.
-
un antígeno diftérico tal como un toxoide diftérico {por ejemplo, capítulo 3 de Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0}, por ejemplo, el mutante CRM197 {por ejemplo, Del Guidice y col. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70}.
-
un antígeno tetánico tal como un toxoide tetánico {por ejemplo, capítulo 4 de Plotkin & Mortimer}.
-
un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B.
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un antígeno de N. gonorrhoeae {por ejemplo, los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280}.
-
un antígeno de Chlamydia pneumoniae {por ejemplo, el documento PCT/IB01/01445; Kalman y col. (1999) Nature Genetics 21:385-389; Read y col. (2000) Nucleic Acids Res 28:1397-406; Shirai y col. (2000) J. Infect. Dis. 181(Suppl 3):S524-S527; documentos WO99/27105; WO00/27994; WO00/37494}.
-
un antígeno de Chlamydia trachomatis {por ejemplo, el documento WO99/28475}.
-
un antígeno de Porphyromonas gingivalis {por ejemplo, Ross y col. (2001) Vaccine 19:4135-4142}.
-
antígeno(s) de la poliomielitis {por ejemplo, Sutter y col. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308;
Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126} tal como IPV o OPV.
-
antígeno(s) de la rabia {por ejemplo, Dreesen (1997) Vaccine 15 Suppl:S2-6} tal como virus inactivado liofilizado {por ejemplo, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998 Jan 16;47(1):12, 19; RabAvert™}.
-
antígenos del sarampión, paperas y/o rubeola {por ejemplo, capítulos 9, 10 y 11 de Plotkin & Mortimer}.
-
antígeno(s) de la gripe {por ejemplo, capítulo 19 de Plotkin & Mortimer} tal como las proteínas de la superficie hemaglutinina y/o neuraminidasa.
-
un antígeno de Moraxella catarrhalis {por ejemplo, McMichael (2000) Vaccine 19 Suppl 1:S101-107}.
-
un antígeno de Staphylococcus aureus {por ejemplo, Kuroda y col. (2001) Lancet 357(9264):1225-1240; véanse también las páginas 1218-1219}.
-
un antígeno de Streptococcus agalactiae {por ejemplo, véase el documento WO02/34771}
-
un antígeno de Streptococcus pyogenes {por ejemplo, véase el documento WO02/34771}
Si se incluye un antígeno de sacárido o de hidrato de carbono, se conjuga preferentemente con una proteína transportadora con el fin de potenciar la inmunogenicidad {por ejemplo, Ramsay y col. (2001) Lancet 357(9251):195196; Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36; Conjugate Vaccines (eds. Cruse y col.) ISBN 3805549326, particularmente vol. 10:48-114, etc.}. Proteínas transportadoras preferidas son toxinas bacterianas o toxoides tales como toxoides diftéricos o tetánicos. El toxoide diftérico CRM197 es particularmente preferido. Otras proteínas transportadoras adecuadas incluyen la proteína de N. meningitidis de la membrana externa {por ejemplo, el documento EP-0372501}, péptidos sintéticos {por ejemplo, los documentos EP-0378881, EP-0427347}, proteínas de choque térmico {por ejemplo, el documento WO93/17712}, proteínas de Pertussis {por ejemplo, los documentos WO98/58668; EP-0471177}, proteína D de H. influenzae {por ejemplo, el documento WO00/56360}, toxina A o B de
C. difficile {por ejemplo, el documento WO00/61761}, etc. Puede usarse cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier ligador adecuado si fuera necesario.
Los antígenos de proteínas tóxicas pueden desintoxicarse si fuera necesario (por ejemplo, desintoxicación de toxina de Pertussis por medios químicos y/o genéticos).
Si se incluye un antígeno diftérico en la composición, también se prefiere incluir antígeno tetánico y antígenos de Pertussis. Similarmente, si se incluye un antígeno tetánico, también se prefiere incluir antígenos diftéricos y de Pertussis. Similarmente, si se incluye un antígeno de Pertussis, también se prefiere incluir antígenos diftéricos y tetánicos.
Los antígenos se adsorben preferentemente a una sal de aluminio.
Los antígenos en la composición estarán normalmente presentes a una concentración de al menos 1 µg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra ese antígeno.
La invención también proporciona composiciones que comprenden dos o más proteínas de la presente invención.
Procedimientos
La invención proporciona un procedimiento para producir proteínas de la invención que comprende la etapa de cultivar una célula huésped según la invención en condiciones que induzcan la expresión de proteínas.
La invención proporciona un procedimiento para producir proteína o ácido nucleico de la invención, en el que la proteína o ácido nucleico se sintetiza en parte o en conjunto usando medios químicos.
La invención proporciona un procedimiento para detectar C. trachomatis en una muestra, en el que la muestra se pone en contacto con un anticuerpo que se une a una proteína de la invención.
Sigue un resumen de técnicas convencionales y procedimientos que pueden emplearse con el fin de realizar la invención (por ejemplo, para usar las secuencias desveladas para la inmunización). Este resumen no es una limitación de la invención sino que, más bien, da ejemplos que pueden usarse, pero no se requiere.
General
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la habilidad de la materia. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, por ejemplo, Sambrook Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) y tercera edición (2001); DNA Cloning, volúmenes I y II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente los volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer y Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, segunda edición (Springer-Verlag, N.Y.) y Handbook of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds 1986).
En esta memoria descriptiva se usan abreviaturas estándar para nucleótidos y aminoácidos.
Definiciones
Una composición que contiene X está “sustancialmente libre de” Y cuando al menos el 85 % en peso del X+Y total en la composición es X. Preferentemente, X comprende al menos aproximadamente el 90 % en peso del total de X+Y en la composición, más preferentemente al menos aproximadamente el 95 % o incluso el 99 % en peso.
El término “que comprende” significa “que incluye”, además de “que consiste”, por ejemplo, una composición “que comprende” X pueden consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional a X, tal como X + Y.
El término “heterólogo” se refiere a dos componentes biológicos que no se encuentran juntos en la naturaleza. Los componentes pueden ser células huésped, genes o regiones reguladoras tales como promotores. Aunque los componentes heterólogos no se encuentran juntos en la naturaleza, pueden funcionar juntos, como cuando un promotor heterólogo para un gen está operativamente ligado al gen. Otro ejemplo es cuando una secuencia de clamidia es heteróloga a una célula huésped de ratón. Otro ejemplo serían dos epítopes de proteínas iguales o diferentes que se han ensamblado en una única proteína en una disposición no encontrada en la naturaleza.
Un “origen de replicación” es una secuencia de polinucleótidos que inicia y regula la replicación de polinucleótidos, tal como un vector de expresión. El origen de replicación se comporta como una unidad autónoma de replicación de polinucleótidos dentro de una célula, que puede ser replicación bajo su propio control. Un vector puede necesitar un origen de replicación para replicarse en una célula huésped particular. Con ciertos orígenes de replicación, un vector de expresión puede reproducirse a un alto número de copias en presencia de proteínas apropiadas dentro de la célula. Ejemplos de orígenes son las secuencias autónomamente replicantes que son eficaces en levadura; y el antígeno T vírico, eficaz en células COS-7.
Una secuencia “mutante” se define como secuencia de ADN, ARN o aminoácidos que se diferencia de, pero que tiene identidad de secuencias, con la secuencia nativa o desvelada. Dependiendo de la secuencia particular, el grado de identidad de secuencias entre la secuencia nativa o desvelada y la secuencia mutante es preferentemente superior al 50 % (por ejemplo, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más, calculado usando el algoritmo de Smith-Waterman como se ha descrito anteriormente). Como se usa en el presente documento, una “variante alélica” de una molécula de ácido nucleico, o región, para la que la secuencia de ácidos nucleicos se proporciona en el presente documento es una molécula de ácido nucleico, o región, que se produce esencialmente en el mismo locus en el genoma de otra cepa aislada o segunda cepa aislada y que, debido a la variación natural producida por, por ejemplo, mutación o recombinación, tiene una secuencia de ácidos nucleicos similar, pero no idéntica. Una variante alélica de la región codificante normalmente codifica una proteína que tiene actividad similar a la de la proteína codificada por el gen con la que se está comparando. Una variante alélica también puede comprender una alteración en las regiones sin traducir 5' o 3' del gen, tal como en regiones de control reguladoras (por ejemplo, véase la patente de EE.UU. 5.753.235).
Sistemas de expresión
Las secuencias de nucleótidos de clamidia pueden expresarse en una variedad de diferentes sistemas de expresión; por ejemplo, aquellas usadas con células de mamífero, baculovirus, plantas, bacterias y levadura.
i. Sistemas de mamífero
Los sistemas de expresión de mamífero son conocidos en la técnica. Un promotor de mamífero es cualquier secuencia de ADN que puede unirse a ARN polimerasa de mamífero e iniciar la transcripción en la dirección 3' de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción, que está normalmente situada proximal al extremo 5' de la secuencia codificante, y una caja TATA, normalmente localizada 25-30 pares de bases (pb) en la dirección 5' del sitio de iniciación de la transcripción. Se cree que la caja TATA dirige la ARN polimerasa II para empezar la síntesis de ARN en el sitio correcto. Un promotor de mamífero también contendrá un elemento promotor en la dirección 5', normalmente localizado dentro de 100 a 200 pb en la dirección 5' de la caja TATA. Un elemento promotor en la dirección 5' determina la tasa a la que se inicia la transcripción y pueden actuar en cualquier orientación {Sambrook y col. (1989) “Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells”. En Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed}.
Los genes víricos de mamífero se expresan con frecuencia altamente y tienen una amplia gama de huéspedes; por tanto, las secuencias que codifican los genes víricos de mamífero proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen el promotor temprano del SV40, promotor del LTR del virus de tumor mamario de ratón, promotor tardío principal del adenovirus (Ad MLP) y promotor del virus del herpes simple. Además, las secuencias derivadas de genes no víricos, tales como el gen de la metalotioneína murina, también proporcionan secuencias promotoras útiles. La expresión puede ser tanto constitutiva como regulada (inducible), dependiendo del promotor puede inducirse con glucocorticoide en células sensibles a hormonas.
La presencia de un elemento potenciador (potenciador), combinado con los elementos promotores descritos anteriormente, normalmente aumentará los niveles de expresión. Un potenciador es una secuencia de ADN reguladora que puede estimular la transcripción hasta 1000 veces cuando se liga a promotores homólogos o heterólogos, empezando la síntesis en el sitio de iniciación del ARN normal. Los potenciadores también son activos cuando se sitúan en la dirección 5' o en la dirección 3' del sitio de iniciación de la transcripción, en orientación tanto normal como volcada, o a una distancia superior a 1000 nucleótidos desde el promotor {Maniatis y col. (1987) Science 236:1237; Alberts y col. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2ª ed.}. Los elementos potenciadores derivados de virus pueden ser particularmente útiles, debido a que normalmente tienen una gama de huéspedes más amplia. Ejemplos incluyen el potenciador del gen temprano del SV40 {Dijkema y col. (1985) EMBO J. 4:761} y el potenciador/promotores derivados de la repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous {Gorman y col. (1982) PNAS USA 79:6777} y del citomegalovirus humano {Boshart y col. (1985) Cell 41:521}. Adicionalmente, algunos potenciadores son regulables y se vuelven activos sólo en presencia de un inductor tal como una hormona o ión metálico {Sassone-Corsi y Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis y col. (1987) Science 236:1237}.
Una molécula de ADN puede expresarse intracelularmente en células de mamífero. Una secuencia promotora puede ligarse directamente a la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante siempre será una metionina, que está codificada por el codón de iniciación ATG. Si se desea, el extremo N puede escindirse de la proteína por incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Alternativamente, proteínas extrañas también pueden secretarse de la célula en los medios de crecimiento creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión que comprende un fragmento de la secuencia conductora que proporciona la secreción de la proteína extraña en células de mamífero. Preferentemente, hay sitios de procesamiento codificados entre el fragmento conductor y el gen extraño que pueden escindirse tanto in vivo como in vitro. El fragmento de la secuencia conductora normalmente codifica un péptido señal que comprende aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína de la célula. El conductor tripartito de adenovirus es un ejemplo de una secuencia conductora que proporciona secreción de una proteína extraña en células de mamífero.
Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilación reconocidas por células de mamífero son regiones reguladoras localizadas 3' al codón de terminación de la traducción y, por tanto, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia codificante. El extremo 3' del ARNm maduro se forma por escisión postraduccional específica de sitio y poliadenilación {Birnstiel y col. (1985) Cell 41:349; Proudfoot y Whitelaw (1988) “Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. En Transcription and splicing (ed. B.D. Hames y D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105}. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Ejemplos de señales terminadoras de la transcripción/de poliadenilación incluyen aquellas derivadas del SV40 {Sambrook y col. (1989) “Expression of cloned genes in mammalian cells”. En Molecular Cloning: A Laboratory Manual}.
Normalmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden una secuencia promotora, señal de la poliadenilación y de terminación de la transcripción se ponen juntos en construcciones de expresión. Potenciadores, intrones con sitios de donante y aceptor de corte y empalme funcionales y secuencias conductoras también pueden incluirse en una construcción de expresión, si se desea. Las construcciones de expresión se mantienen frecuentemente en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) que pueden mantenerse establemente en un huésped, tal como células de mamífero o bacterias. Los sistemas de replicación de mamífero incluyen aquellos derivados de virus de animales que requieren factores transactivantes para replicarse. Por ejemplo, plásmidos que contienen los sistemas de replicación de papovavirus tales como SV40 {Gluzman (1981) Cell 23:175} o virus del polioma se replican en número de copias extremadamente alto en presencia del antígeno T vírico apropiado. Ejemplos adicionales de replicones de mamífero incluyen aquellos derivados de virus del papiloma bovino y virus de Epstein-Barr. Adicionalmente, el replicón puede tener dos sistemas de replicón, permitiendo así que se mantengan, por ejemplo, en células de mamífero para la expresión y en un huésped procariota para la clonación y amplificación. Ejemplos de tales vectores lanzadera de bacterias de mamífero incluyen pMT2 {Kaufman y col. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946} y pHEBO {Shimizu y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074}.
El procedimiento de transformación usado depende del huésped que va a transformarse. Los procedimientos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de polinucleótido(s) en liposomas, microinyección directa de ADN en núcleos.
Las líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión son conocidos en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) que incluyen, pero no se limitan a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y varias otras líneas celulares.
ii. Sistemas de baculovirus
El polinucleótido que codifica la proteína también puede insertarse en un vector de expresión de insecto adecuado, y está operativamente ligado a los elementos de control dentro de ese vector. La construcción de vectores emplea técnicas que se conocen en la técnica. Generalmente, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, normalmente un plásmido bacteriano, que contiene tanto un fragmento del genoma de baculovirus como un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen o genes heterólogos que van a expresarse; un baculovirus natural con una secuencia homóloga al fragmento de baculovirus específico en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma de baculovirus); y células huésped de insecto apropiadas y medios de crecimiento.
Después de insertarse la secuencia de ADN que codifica la proteína en el vector de transferencia, el vector y el genoma vírico natural se transfectan en una célula huésped de insecto en la que se permite que el vector y el genoma vírico se recombinen. El virus recombinante encapsidado se expresa y las placas recombinantes se identifican y se purifican. Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión de células de baculovirus/insecto están comercialmente disponibles en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (kit “MaxBac”). Estas técnicas son generalmente conocidas para aquellos expertos en la materia y se describen completamente en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (denominado en lo sucesivo “Summers y Smith”).
Antes de insertarse la secuencia de ADN que codifica la proteína en el genoma de baculovirus, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, conductor (si se desea), secuencia codificante de interés y secuencia de terminación de la transcripción, se ensamblan normalmente en una construcción de sustitución intermedia (vector de transferencia). Esta construcción puede contener un único gen y elementos reguladores operativamente ligados; múltiples genes, cada uno con su conjunto propio de elementos reguladores operativamente ligados; o múltiples genes, regulados por el mismo conjunto de elementos reguladores. Las construcciones de sustitución intermedia se mantienen frecuentemente en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos), que pueden mantenerse establemente en un huésped, tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiéndose así que se mantenga en un huésped adecuado para la clonación y amplificación.
Actualmente, el vector de transferencia más comúnmente usado para la introducción de genes extraños en AcNPVes pAc373. También se han diseñado muchos otros vectores, conocidos para aquellos expertos en la materia. Éstos incluyen, por ejemplo, pVL985, que altera el codón de iniciación de la poliedrina de ATG a ATT, y que introduce un sitio de clonación BamHI de 32 pares de bases en la dirección 3' desde ATT; véase Luckow y Summers, Virology (1989) 17:31.
El plásmido normalmente también contiene la señal de poliadenilación de la poliedrina (Miller y col. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) y un gen de resistencia a ampicilina procariota (amp) y origen de replicación para la selección y propagación en E. coli.
Los vectores de transferencia de baculovirus normalmente contienen un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de ADN que pueda unirse a ARN polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción en la dirección 3' (5' a 3') de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que está normalmente situada proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión a ARN polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus puede también tener un segundo dominio llamado un potenciador que, si está presente, está normalmente distal al gen estructural. La expresión puede ser tanto regulada como constitutiva.
Los genes estructurales, transcritos en abundancia en momentos posteriores en un ciclo de infección vírica, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína de la poliedrina vírica, Friesen y col., (1986) “The Regulation of Baculovirus Gene Expression” en: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walteran Doerfler); EPO Publ. Nos. 127 839 y 155 476; y el gen que codifica la proteína p10, Vlak y col., (1988), J. Gen. Virol. 69:765.
El ADN que codifica secuencias señal adecuadas puede derivarse de genes para proteínas de insecto o baculovirus secretadas tales como el gen de la poliedrina de baculovirus (Carbonell y col. (1988) Gene, 73:409). Alternativamente, como las señales para las modificaciones postraduccionales de células de mamíferos (tales como señal de escisión de péptidos, escisión proteolítica y fosforilación) parecen ser reconocidas por células de insecto, y las señales requeridas para la secreción y acumulación nuclear también parece que se conservan entre las células invertebradas y las células vertebradas, los conductores de origen no insecto, tales como aquellos derivados de genes que codifican interferón  humano, Maeda y col., (1985), Nature 315:592; péptido liberador de gastrina humana, Lebacq-Verheyden y col., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 humana, Smith y col., (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82:8404; IL-3 de ratón, (Miyajima y col., (1987) Gene 58:273); y glucocerebrosidasa humana, Martin y col. (1988) DNA, 7:99, también pueden usarse para proporcionar secreción en insectos.
Un polipéptido o poliproteína recombinante pueden expresarse intracelularmente o, si se expresan con las secuencias reguladoras apropiadas, pueden secretarse. La buena expresión intracelular de proteínas extrañas no infundidas normalmente requiere genes heterólogos que idealmente tienen una secuencia conductora corta que contiene señales de iniciación de la traducción adecuadas que preceden a una señal de iniciación de ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N puede escindirse de la proteína madura por incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Alternativamente, las poliproteínas o proteínas recombinantes que no son naturalmente secretadas pueden secretarse de la célula de insecto creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión que comprende un fragmento de la secuencia conductora que proporciona la secreción de la proteína extraña en insectos. El fragmento de la secuencia conductora normalmente codifica un péptido señal que comprende aminoácidos hidrófobos que dirigen la translocalización de la proteína en el retículo endoplásmico.
Después de la inserción de la secuencia de ADN y/o el gen que codifica el producto de expresión precursor de la proteína, una célula huésped de insecto se co-transforma con el ADN heterólogo del vector de transferencia y el ADN genómico de baculovirus natural - normalmente por co-transfección. El promotor y la secuencia de terminación de la transcripción de la construcción normalmente comprenderán una sección de 2-5 kb del genoma de baculovirus. Los procedimientos para introducir ADN heterólogo en el sitio deseado en el virus de baculovirus son conocidos en la técnica (véanse Summers y Smith, arriba; Ju y col. (1987); Smith y col., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; y Luckow y Summers (1989)). Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el gen de la poliedrina, por recombinación cruzada doble homóloga; la inserción también puede ser en un sitio de enzima de restricción manipulado en el gen de baculovirus deseado. Miller y col., (1989), Bioessays 4:91. La secuencia de ADN, cuando se clona en lugar del gen de la poliedrina en el vector de expresión, está flanqueada tanto en 5' como en 3' por secuencias específicas de la poliedrina y está posicionada en la dirección 3' del promotor de poliedrina.
El vector de expresión de baculovirus recientemente formado se encapsida posteriormente en un baculovirus recombinante infeccioso. La recombinación homóloga se produce a baja frecuencia (entre 1 % y 5 %); por tanto, la mayoría del virus producido después de la cotransfección es todavía virus natural. Por tanto, es necesario un procedimiento para identificar virus recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es un cribado visual que permita distinguir virus recombinantes. La proteína de la poliedrina, que se produce por el virus nativo, se produce a niveles muy altos en los núcleos de células infectadas en momentos posteriores después de la infección vírica. La proteína de la poliedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que también contienen partículas incorporadas. Estos cuerpos de oclusión, de hasta 15 µm de tamaño, son altamente refractivos, haciendo que tengan un aspecto lustroso brillante que es fácilmente visualizado bajo el microscopio óptico. Células infectadas con virus recombinantes carecen de cuerpos de oclusión. Para distinguir virus recombinante de virus natural, el sobrenadante de transfección se siembra en placa sobre una monocapa de células de insecto por técnicas conocidas para aquellos expertos en la materia. Concretamente, las placas se criban bajo el microscopio óptico para la presencia (indicativa de virus natural) o ausencia (indicativa de virus recombinante) de cuerpos de oclusión. “Current Protocols in Microbiology” vol. 2 (Ausubel y col. eds) en 16.8 (sup. 10, 1990); Summers & Smith, arriba; Miller y col. (1989).
Los vectores de expresión de baculovirus recombinantes se han desarrollado para la infección en varias células de insecto. Por ejemplo, los baculovirus recombinantes se han desarrollado para, entre otros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni (documento WO 89/046699; Carbonell y col., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith y col., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; y véase generalmente, Fraser y col. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).
Las células y los medios de cultivo celular están comercialmente disponibles para tanto expresión directa como de fusión de polipéptidos heterólogos en un baculovirus/sistema de expresión; la tecnología de cultivo celular es generalmente conocida para aquellos expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Summers y Smith, arriba.
Las células de insecto modificadas pueden entonces cultivarse en un medio nutritivo apropiado que permita el mantenimiento estable del (de los) plásmido(s) presente(s) en el huésped de insecto modificado. Si el gen del producto de expresión está bajo el control inducible, el huésped puede cultivarse a alta densidad, e inducirse la expresión. Alternativamente, si la expresión es constitutiva, el producto se expresará continuamente en el medio y el medio nutritivo deberá circularse continuamente, a la vez que se extrae el producto de interés y se aumentan los nutrientes agotados. El producto puede purificarse por técnicas tales como cromatografía, por ejemplo, HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc.; electroforesis; centrifugación en gradiente de densidad; extracción en disolvente o similares. Como es apropiado, el producto puede purificarse adicionalmente, según se requiera, de manera que se elimine sustancialmente cualquier proteína de insecto que también es secretada al medio o resulta de la lisis de células de insecto de manera que se proporcione un producto que está al menos sustancialmente libre de residuos huésped, por ejemplo, proteínas, lípidos y polisacáridos.
Con el fin de obtener la expresión de proteínas, células huésped recombinantes derivadas de los transformantes se incuban en condiciones que permitan la expresión de la secuencia codificante de la proteína recombinante. Estas condiciones variarán, dependiendo de la célula huésped detectada. Sin embargo, las condiciones pueden determinarse fácilmente por aquellos expertos en la materia, basándose en lo que se sabe en la técnica.
iii. Sistemas vegetales
Hay muchos sistemas de expresión genéticos de cultivos de células de plantas y de plantas completas conocidos en la técnica. Sistemas de expresión genéticos celulares de plantas a modo de ejemplo incluyen aquellos descritos en patentes tales como: US 5.693.506; US 5.659.122; y US 5.608.143. Ejemplos adicionales de expresión genética en cultivo de células de plantas se han descrito por Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Las descripciones de péptidos señal de proteínas de plantas pueden encontrarse, además de en las referencias descritas anteriormente, en Vaulcombe y col., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler y col., Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein y col., Gene 55:353-356 (1987); Whittier y col., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel y col., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu y col., Gene 122:247253 (1992). Una descripción de la regulación de la expresión génica de plantas por la fitohormona, ácido giberélico y enzimas secretadas inducidas por ácido giberélico puede encontrarse en R.L. Jones y J. MacMillin, Gibberellins: en Advanced Plant Physiology, Malcolm B. Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, Londres, pág. 21-52. Referencias que describen otros genes metabólicamente regulados: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038(1990); Maas y col., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel y Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1337-1339 (1987).
Normalmente, usando técnicas conocidas en la técnica, una secuencia de polinucleótidos deseada se inserta en un casete de expresión que comprende elementos reguladores genéticos diseñados para el funcionamiento en plantas. El casete de expresión se inserta en un vector de expresión deseado con secuencias de acompañamiento en la dirección 5' y en la dirección 3' del casete de expresión adecuado para la expresión en un huésped de planta. Las secuencias de acompañamiento serán de plásmido u origen vírico y proporcionan características necesarias al vector para permitir que los vectores muevan ADN desde un huésped de clonación original, tal como bacterias, hasta el huésped de planta deseado. La construcción del vector bacteriano/de planta básico preferentemente proporcionará un origen de replicación procariota de amplio intervalo de huéspedes; un marcador de selección procariota y, para transformaciones en Agrobacterium, secuencias de T-ADN para la transferencia mediada por Agrobacterium a cromosomas de planta. Si el gen heterólogo no es fácilmente aceptado para la detección, la construcción también tendrá preferiblemente un gen del marcador de selección adecuado para determinar si una célula de planta ha sido transformada. Una revisión general de marcadores adecuados, por ejemplo, para los miembros de la familia de los pastos, se encuentra en Wilmink y Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11(2):165-185.
También se recomiendan secuencias adecuadas para permitir la integración de la secuencia heteróloga en elgenoma de la planta. Éstas podrían incluir secuencias de transposón y similares para la recombinación homóloga, además de secuencias de Ti que permitan la inserción al azar de un casete de expresión heterólogo en un genoma de la planta. Marcadores de selección procariotas adecuados incluyen resistencia hacia antibióticos tales como ampicilina o tetraciclina. Otras secuencias de ADN que codifican funciones adicionales también pueden estar presentes en el vector, como se conoce en la técnica.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención objeto puede incluirse en un casete de expresión para la expresión de la(s) proteína(s) de interés. Normalmente, sólo tendrán un casete de expresión, aunque sean viables dos o más. El casete de expresión recombinante contendrá, además de la secuencia codificante de proteínas heterólogas, los siguientes elementos, una región promotora, secuencias sin traducir en 5' de la planta, codón de iniciación que depende de si el gen estructural viene equipado o no con uno, y una secuencia de terminación de la transcripción y de la traducción. Sitios de enzimas de restricción únicos en los extremos 5' y 3' del casete permiten la fácil inserción en un vector preexistente.
Una secuencia codificante heteróloga puede ser para cualquier proteína relacionada con la presente invención. La secuencia que codifica la proteína de interés codificará un péptido señal que permite el procesamiento y la translocalización de la proteína, según sea apropiado, y normalmente carecerá de cualquier secuencia que pueda producir la unión de la proteína deseada de la invención a una membrana. Como, en general, la región de iniciación de la transcripción será para un gen que se expresa y se translocaliza durante la germinación, empleando el péptido señal que proporciona la translocalización, también puede proporcionarse una para la translocalización de la proteína de interés. De esta forma, la(s) proteína(s) de interés se translocalizará(n) a partir de las células en las que se expresan y pueden recogerse eficientemente. Normalmente, la secreción en semillas es a través de la capa de aleurona o de epitelio escutelar en el endosperma de la semilla. Aunque no se requiere que la proteína se secrete de las células en las que se produce la proteína, esto facilita el aislamiento y la purificación de la proteína recombinante.
Como la expresión final del producto génico deseado será en una célula eucariota, se desea determinar si cualquier porción del gen clonado contiene secuencias que se procesarán fuera como intrones por la maquinaria de esplicosomas huésped. Si es así, la mutagénesis dirigida a sitio de la región de “intrón” puede realizarse para evitar la pérdida de una parte del mensajero genético como código de intrón falso, Reed y Maniatis, Cell 41:95-105, 1985.
El vector puede microinyectarse directamente en células vegetales usando micropipetas para transferir mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genet, 202:179-185, 1985. El material genético también puede transferirse a la célula de planta usando polietilenglicol, Krens y col., Nature, 296, 72-74, 1982. Otro procedimiento de introducción de segmentos de ácido nucleico es la penetración balística a alta velocidad por pequeñas partículas con el ácido nucleico tanto dentro de la matriz de perlas o partículas pequeñas como sobre la superficie, Klein y col., Nature, 327, 70-73, 1987 y Knudsen y Muller, 1991, Planta, 185:330-336, que enseña que el bombardeo con partículas de endosperma de cebada crea cebada transgénica. Todavía otro procedimiento de introducción serían la fusión de protoplastos con otras entidades, tanto minicélulas, células, lisosomas como otros cuerpos con superficie de lípido fusibles, Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863, 1982.
El vector también puede introducirse en las células vegetales por electroporación (Fromm y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824, 1985). En esta técnica, protoplastos de planta se electroporan en presencia de plásmidos que contienen la construcción de gen. Impulsos eléctricos de intensidad de campo alto permeabilizan reversiblemente las biomembranas permitiendo la introducción de los plásmidos. Los protoplastos de planta electroporados vuelven a formar la pared celular, dividen y forman callo de planta.
Todas las plantas de las que pueden aislarse protoplastos y cultivarse para dar plantas regeneradas completas pueden transformarse por la presente invención de manera que se recuperen plantas completas que contienen el gen transferido. Se sabe que prácticamente todas las plantas pueden regenerarse a partir de células cultivadas o tejidos, que incluyen, pero no se limitan a, todas las especies importantes de caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, frutos y otros árboles, legumbres y verduras. Algunas plantas adecuadas incluyen, por ejemplo, especies de los géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum y Datura.
Los medios para la regeneración varían de especies a especie de plantas, pero generalmente primero se proporciona una suspensión de protoplastos transformados que contienen copias del gen heterólogo. Se forma tejido de callo y pueden inducirse brotes de callo y posteriormente echar raíces. Alternativamente, la formación de embriones puede inducirse a partir de la suspensión de protoplastos. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo contendrán generalmente diversos aminoácidos y hormonas tales como auxina y citocininas. También es ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como trigo y alfalfa. Los brotes y raíces normalmente se desarrollan simultáneamente. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo y de la historia del cultivo. Si estas tres variables están controladas, entonces la regeneración es completamente reproducible y repetible.
En algunos sistemas de cultivo de células de planta, la proteína deseada de la invención puede secretarse o, alternativamente, la proteína puede extraerse de la planta completa. Si la proteína deseada de la invención es secretada en el medio, puede recogerse. Alternativamente, los embriones y las semisemillas sin embrión u otro tejido de planta pueden romperse mecánicamente para que libere cualquier proteína secretada entre células y tejidos. La mezcla puede suspenderse en una disolución de tampón para recuperar proteínas solubles. Entonces, el aislamiento convencional de proteínas y procedimientos de purificación se usará para purificar la proteína recombinante. Parámetros de tiempo, temperatura, pH, oxígeno y volúmenes se ajustarán mediante procedimientos rutinarios para optimizar la expresión y recuperación de proteína heteróloga.
iv. Sistemas bacterianos
Las técnicas de expresión bacteriana son conocidos en la técnica. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN que pueda unirse a ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción en la dirección 3' de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que está normalmente situada proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión a ARN polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor bacteriano pueden también tener un segundo dominio llamado un operador, que puede solapar un sitio de unión a ARN polimerasa adyacente en el que empieza la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción regulada (inducible) negativa, ya que una proteína represora de genes puede unir el operador y así inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede producirse en ausencia de elementos reguladores negativos tales como el operador. Además, la regulación positiva puede lograrse por una secuencia de unión a proteína activadora de genes que, si está presente, está normalmente proximal (5') a la secuencia de unión a ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de genes es la proteína activadora de catabolitos (CAP), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli {Raibaud y col. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173}. Por tanto, la expresión regulada puede ser tanto positiva como negativa, tanto potenciando como reduciendo así la transcripción.
Las secuencias que codifican las enzimas de la vía metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas metabolizantes de azúcares tales como galactosa, lactosa (lac) {Chang y col. (1977) Nature 198:1056} y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) {Goeddel y col. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton y col. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; patente de EE.UU. 4.738.921; documentos EP-A-0036776 y EP-A-0121775}. El sistema promotor de g-laotamasa (bla) {Weissmann (1981) “The cloning of interferon and other mistakes” en Interferon 3 (ed. Gresser)}, bacteriófago lambda PL {Shimatake y col. (1981) Nature 292:128} y los sistemas promotores de T5 {patente de EE.UU. 4.689.406} también proporcionan secuencias promotoras útiles.
Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza también actúan de promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago pueden unirse con las secuencias del operón de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético {patente de EE.UU. 4.551.433}. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor híbrido trp-lac que comprende tanto el promotor trp como las secuencias del operón lac que está regulado por el represor lac {Amann y col. (1983) Gene 25:167; de Boer y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21}. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se producen naturalmente de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unirse a ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor que se produce naturalmente de origen no bacteriano también puede acoplarse a una ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema de ARN polimerasa T7/promotor de bacteriófago es un ejemplo de un sistema de promotor acoplado {Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074}. Además, un promotor híbrido también puede comprender un promotor de bacteriófago y una región de operador de
E. coli (documento EPO-A-0 267 851).
Además de una secuencia promotora en funcionamiento, un sitio de unión a ribosoma eficiente también es útil para la expresión de genes extraños en procariotas. En E. coli, el sitio de unión a ribosoma se llama la secuencia de Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos en la dirección 5' del codón de iniciación {Shine y col. (1975) Nature 254:34}. Se cree que la secuencia de SD promueve la unión de ARNm al ribosoma por el apareamiento de bases entre la secuencia de SD y 3' yde ARNr de E. coli 16S {Steitz y col. (1979) “Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA”. En Biological regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)}. Para expresar genes eucariotas y genes procariotas con sitio de unión a ribosoma débil {Sambrook y col. (1989) “Expression of cloned genes in Escherichia coli”. En Molecular Cloning: A Laboratory Manual}.
Una molécula de ADN puede expresarse intracelularmente. Una secuencia promotora puede ligarse directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N nunca será una metionina, que está codificada por el codón de iniciación ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N pueden escindirse de la proteína por incubación in vitro con bromuro de cianógeno o por tanto incubación in vivo como in vitro con una peptidasa del extremo N de metionina bacteriana (documento EPO-A-0 219 237).
Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa a la expresión directa. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica la porción del extremo N de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se fusiona con el extremo 5' de secuencias codificantes heterólogas. Tras la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de la célula de bacteriófago lambda puede ligarse en el extremo 5' de un gen extraño y expresarse en bacterias. La proteína de fusión resultante retiene preferentemente un sitio para una enzima de procesamiento (factor Xa) para escindir la proteína de bacteriófago del gen extraño {Nagai y col. (1984) Nature 309:810}. Las proteínas de fusión también pueden prepararse con secuencias de los genes lacZ {Jia y col. (1987) Gene 60:197}, trpE {Allen y col. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff y col. (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11} y Chey {documento EP-A-0 324 647}. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o puede no codificar un sitio escindible. Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubiquitina. Una proteína de fusión tal se prepara con la región de ubiquitina que preferentemente retiene un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, proteasa de procesamiento específico de ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. En todo este procedimiento, la proteína extraña nativa puede aislarse {Miller y col. (1989) Bio/Technology 7:698}.
Alternativamente, las proteínas extrañas también pueden secretarse de la célula creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión que comprende un fragmento de la secuencia de péptidos señal que proporciona la secreción de la proteína extraña en bacterias {patente de EE.UU. 4.336.336}. El fragmento de la secuencia señal normalmente codifica un péptido señal que comprende aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína de la célula. La proteína es tanto secretada en los medios de crecimiento (bacterias Grampositivas) como en el espacio periplásmico localizado entre la membrana interna y externa de la célula (bacterias Gram-negativas). Preferentemente, hay sitios de procesamiento que pueden escindirse tanto in vivo como in vitro codificados entre el fragmento del péptido señal y el gen extraño.
El ADN que codifica secuencias señal adecuadas puede derivarse de genes para proteínas bacterianas secretadas tales como el gen de la proteína de la membrana externa de E. coli (ompA) {Masui y col. (1983), en: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb y col. (1984) EMBO J. 3:2437} y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) {Oka y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:72121}. Como ejemplo adicional, la secuencia señal del gen de alfa-amilasa de diversas cepas de Bacillus puede usarse para secretar proteínas heterólogas de B. subtilis {Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; documento EP-A-0 244 042}.
Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por bacterias son regiones reguladoras localizadas 3' con respecto al codón de terminación de la traducción y, por tanto, junto con el promotor flanquean la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción frecuentemente incluyen secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos que pueden formar estructuras de tallo-bucle que ayudan en la terminación de la transcripción. Ejemplos incluyen secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes tales como el gen trp en E. coli, además de otros genes biosintéticos.
Normalmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, secuencia señal (si se desea), secuencia codificante de interés y secuencia de terminación de la transcripción, se ponen juntos en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen frecuentemente en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos), que puede mantenerse establemente en un huésped, tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo así que se mantenga en un huésped procariota tanto para la expresión como para la clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido tanto de alto como de bajo número de copias. Un plásmido de alto número de copias tendrá generalmente un número de copias que oscila de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, y normalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de alto número de copias contendrá preferentemente al menos aproximadamente 10, y más preferentemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Puede seleccionarse un vector con tanto alto como bajo número de copias, dependiendo del efecto del vector y la proteína extraña sobre el huésped.
Alternativamente, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma bacteriano con un vector integrante. Los vectores integrantes normalmente contienen al menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen resultar de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores integrantes construidos con ADN de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (documento EP-A-0 127 328). Los vectores integrantes también pueden comprender secuencias de bacteriófago o de transposón.
Normalmente, las construcciones de expresión extracromosómicas e integrantes pueden contener marcadores de selección para permitir la selección de cepas bacterianas que se han transformado. Los marcadores de selección pueden expresarse en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que hacen que las bacterias sean resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina {Davies y col. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469}. Los marcadores de selección también pueden incluir genes biosintéticos tales como aquellos en las vías biosintéticas de histidina, triptófano y leucina.
Alternativamente, algunos de los componentes anteriormente descritos pueden ponerse juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación comprenden normalmente un marcador de selección que tanto se mantiene en un replicón como se desarrolla en un vector integrante, como se ha descrito anteriormente.
Los vectores de expresión y de transformación, tanto replicones extra-cromosómicos como vectores integrantes, se han desarrollado para la transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis {Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; documentos EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; documento WO 84/04541}, Escherichia coli {Shimatake y col. (1981) Nature 292:128; Amann y col. (1985) Gene 40:183; Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; documentos EP-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 y EP-A-0 136 907}, Streptococcus cremoris {Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655}; Streptococcus lividans {Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655}, Streptomyces lividans {patente de EE.UU. 4.745.056}.
Los procedimientos de introducción de ADN exógeno en huéspedes bacterianos son muy conocidos en la técnica, y normalmente incluyen tanto la transformación de bacterias tratadas con CaCl2 como otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. El ADN también puede introducirse en células bacterianas por electroporación. Los procedimientos de transformación normalmente varían con las especies bacterianas que van a transformarse. Véase, por ejemplo, {Masson y col. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; documentos EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; documento WO 84/04541, Bacillus}, {Miller y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang y col. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter}, {Cohen y col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower y col. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) “An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. En Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer y S. Nicosia); Mandel y col. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia}, {Chassy y col. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus}; {Fiedler y col. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas}; {Augustin y col. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus}, {Barany y col. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) “Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, en: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III); Perry y col. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti y col. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus}.
v. Expresión en levadura
Los sistemas de expresión en levadura también son conocidos para un experto en la materia. Un promotor de levadura es cualquier secuencia de ADN que pueda unirse a ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción en la dirección 3' de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) en ARN. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que está normalmente situada proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión a ARN polimerasa (la “caja TATA”) y un sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor de levadura también puede tener un segundo dominio llamado una secuencia activadora en la dirección 5' (UAS) que, si está presente, es normalmente distal al gen estructural. La UAS permite la expresión regulada (inducible). La expresión constitutiva se produce en ausencia de una UAS. La expresión regulada puede ser tanto positiva como negativa, tanto potenciando como reduciendo así la transcripción.
La levadura es un organismo fermentante con una vía metabólica activa, por tanto las secuencias que codifican enzimas en la vía metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen alcohol deshidrogenasa (ADH) (documento EP-A-0 284 044), enolasa, glucocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH), hexocinasa, fosfofructocinasa, 3-fosfoglicerato mutasa y piruvato cinasa (PyK) (documento EPO-A-0 329 203). El gen PHO5 de la levadura, que codifica fosfatasa ácida, también proporciona secuencias promotoras útiles {Myanohara y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1}.
Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza también funcionan de promotores de levadura. Por ejemplo, las secuencias UAS de un promotor de levadura pueden unirse con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de ADH ligada a la región de activación de la transcripción de GAP (patentes de EE.UU. nº 4.876.197 y 4.880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que consisten en las secuencias reguladoras de tanto los genes ADH2, GAL4, GAL10 como PHO5, combinados con la región de activación de la transcripción de un gen de enzima glicolítica tal como GAP o PyK (documento EP-A-0 164 556). Además, un promotor de levadura puede incluir promotores que se producen naturalmente de origen de no levadura que tienen la capacidad de unirse a ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Ejemplos de tales promotores incluyen, entre otros {Cohen y col. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff y col. (1981) Nature 283:835; Hollenberg y col. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg y col. (1979) “The expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genesin the Yeast Saccharomyces cerevisiae,” en: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis y A. Puhler); Mercerau-Puigalon y col. (1980) Gene 11:163; Panthier y col. (1980) Curr. Genet. 2:109}.
Una molécula de ADN puede expresarse intracelularmente en levadura. Una secuencia promotora puede unirse directamente a la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante siempre será una metionina, que está codificada por el codón de iniciación ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N pueden escindirse de la proteína por incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa a los sistemas de expresión de levadura, además de en sistemas de expresión de mamífero, baculovirus y bacterianos. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica la porción del extremo N de una proteína de levadura endógena, u otra proteína estable, está fusionada con el extremo 5' de secuencias codificantes heterólogas. Tras la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de levadura o de superóxido dismutasa (SOD) humana puede unirse en el extremo 5' de un gen extraño y expresarse en levadura. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o puede no codificar un sitio escindible. Véase, por ejemplo, el documento EP-A0 196 056. Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubiquitina. Una proteína de fusión tal se prepara con la región de ubiquitina que preferentemente retiene un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. Por tanto, en este procedimiento puede aislarse proteína extraña nativa (por ejemplo, el documento WO 88/024066).
Alternativamente, también pueden secretarse proteínas extrañas de la célula en los medios de crecimiento creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión que comprende un fragmento de secuencia conductora que proporciona la secreción en levadura de la proteína extraña. Preferentemente, hay sitios de procesamiento codificados entre el fragmento conductor y el gen extraño que pueden escindirse tanto in vivo como in vitro. El fragmento de la secuencia conductora normalmente codifica un péptido señal que comprende aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína de la célula.
El ADN que codifica secuencias señal adecuadas puede derivarse de genes para proteínas de levadura secretada tales como los genes para invertasa (documentos EP-A-0012873; JPO 62.096.086) y factor A (patente de EE.UU. 4.588.684). Alternativamente, también existen conductores de origen de no levadura, tales como un conductor de interferón, que proporcionan secreción en levadura (documento EP-A-0060057).
Una clase preferida de conductores de la secreción son aquellos que emplean un fragmento del gen del factor alfa de levadura que contiene tanto una secuencia señal “pre” como una región “pro”. Los tipos de fragmentos de factor alfa que pueden emplearse incluyen el conductor del factor alfa de pre-pro de longitud completa (aproximadamente 83 residuos de aminoácidos), además de conductores del factor alfa truncados (normalmente aproximadamente 25 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos) (patentes de EE.UU. 4.546.083 y 4.870.008; documento EP-A-0 324 274). Conductores adicionales que emplean un fragmento del factor alfa que proporciona la secreción incluyen conductores del factor alfa híbridos preparados con una presecuencia de una primera levadura, pero una pro-región de un segundo factor alfa de levadura (por ejemplo, véase el documento WO 89/02463).
Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por levadura son regiones reguladoras localizadas en 3' con respecto al codón de terminación de la traducción y, por tanto, junto con el promotor flanquean la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Ejemplos de secuencia terminadora de la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas por levadura, tales como aquellas que codifican enzimas glicolíticas.
Normalmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, conductor (si se desea), secuencia codificante de interés y secuencia de terminación de la transcripción, se ponen juntos en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen frecuentemente en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos), que puede mantenerse establemente en un huésped, tal como levadura
o bacterias. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo así que se mantenga, por ejemplo, en levadura para la expresión y en un huésped procariota para la clonación y amplificación. Ejemplos de tales vectores lanzadera de bacterias para levadura incluyen YEp24 {Botstein y col. (1979) Gene 8:17-24}, pCl/l {Brake y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4646} y YRp17 {Stinchcomb y col. (1982) J. Mol. Biol. 158:157}. Además, un replicón puede ser un plásmido tanto de alto como de bajo número de copias. Un plásmido de alto número de copias tendrá generalmente un número de copias que oscila de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, y normalmente aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de alto número de copias tendrá preferentemente al menos aproximadamente 10, y más preferentemente al menos aproximadamente 20. Puede seleccionarse un vector tanto con alto como con bajo número de copias, dependiendo del efecto del vector y la proteína extraña sobre el huésped. Véase, por ejemplo, Brake y col., arriba.
Alternativamente, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma de levadura con un vector integrante. Los vectores integrantes normalmente contienen al menos una secuencia homóloga al cromosoma de levadura que permite que el vector se integre, y preferentemente contienen dos secuencias homólogas que flanquean la construcción de expresión. Las integraciones parecen resultar de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma de levadura {Orr-Weaver y col. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245}. Un vector integrante puede dirigirse a un locus específico en levadura seleccionando la secuencia homóloga apropiada para la inclusión en el vector. Véase Orr-Weaver y col., arriba. Una o más construcciones de expresión pueden integrarse, afectando posiblemente los niveles de proteína recombinante producida {Rine y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750}. Las secuencias cromosómicas incluidas en el vector pueden producirse tanto como un único segmento en el vector, que produce la integración del vector entero, como dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromosoma y que flanquean la construcción de expresión en el vector, que pueden producir la integración estable de sólo la construcción de expresión.
Normalmente, las construcciones de expresión extracromosómicas e integrantes pueden contener marcadores de selección para permitir la selección de cepas de levadura que se han transformado. Los marcadores de selección pueden incluir genes biosintéticos que pueden expresarse en la levadura huésped tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 y ALG7, y el gen de resistencia a G418, que confiere resistencia en células de levadura a tunicamicina y G418, respectivamente. Además, un marcador de selección adecuado también puede proporcionar levadura con la capacidad de cultivarse en presencia de compuestos tóxicos tales como metal. Por ejemplo, la presencia de CUP1 permite que la levadura se cultive en presencia de iones cobre {Butt y col. (1987) Microbiol, Rev. 51:351}.
Alternativamente, algunos de los componentes anteriormente descritos pueden ponerse juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación comprenden normalmente un marcador de selección que tanto se mantiene en un replicón como se desarrolla en un vector integrante, como se ha descrito anteriormente.
Los vectores de expresión y de transformación, tanto replicones extracromosómicos como vectores integrantes, se han desarrollado para la transformación en muchas levaduras. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes levaduras: Candida albicans {Kurtz y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142}, Candida maltosa {Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141}. Hansenula polymorpha {Gleeson y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302}, Kluyveromyces fragilis {Das y col. (1984) J. Bacteriol. 158:1165}, Kluyveromyces lactis {De Louvencourt y col. (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg y col. (1990) Bio/Technology 8:135}, Pichia guillerimondii {Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141}, Pichia pastoris {Cregg y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; patente de EE.UU. nº 4.837.148 y 4.929.555}, Saccharomyces cerevisiae {Hinnen y col. (1978) PNAS USA 75:1929; Ito y col. (1983) J. Bacteriol. 153:163}, Schizosaccharomyces pombe {Beach y Nurse (1981) Nature 300:706} y Yarrowia lipolytica {Davidow y col. (1985) Curr. Genet. 10:380471 Gaillardin y col. (1985) Curr. Genet. 10:49}.
Los procedimientos de introducción de ADN exógeno en huéspedes de levadura son muy conocidos en la técnica, y normalmente incluyen tanto la transformación de esferoplastos como de células de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación normalmente varían con las especies de levadura que van a transformarse. Véase, por ejemplo, {Kurtz y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Candida}; {Gleeson y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula; {Das y col. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt y col. (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg y col. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces}; {Cregg y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; patentes de EE.UU. nº 4.837.148 y 4.929.555; Pichia}; {Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75;1929; Ito y col. (1983) J. Bacteriol. 153:163 Saccharomyces}; {Beach y Nurse (1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces}; {Davidow y col. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin y col. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia}.
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender polipéptidos y/o ácidos nucleicos de la invención. Las composiciones farmacéuticas comprenderán una cantidad terapéuticamente eficaz de tanto polipéptidos, anticuerpos como polinucleótidos de la invención reivindicada.
El término “cantidad terapéuticamente eficaz” como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección deseada, o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable. El efecto puede detectarse, por ejemplo, por marcadores químicos o niveles de antígeno. Los efectos terapéuticos también incluyen la reducción en los síntomas físicos tales como la disminución de la temperatura corporal. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del tamaño y salud del sujeto, la naturaleza y grado de la afección, y los agentes terapéuticos o combinación de agentes terapéuticos seleccionados para administración. Por tanto, no es útil especificar una cantidad eficaz exacta de antemano. Sin embargo, la cantidad eficaz para una situación dada puede determinarse por experimentación rutinaria y está dentro del criterio del profesional clínico.
Para los fines de la presente invención, una dosis eficaz será de aproximadamente 0,01 mg/kg a 50 mg/kg o 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de las construcciones de ADN en el individuo al que se administra.
Una composición farmacéutica también puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a un vehículo para la administración de un agente terapéutico, tal como anticuerpos o un polipéptido, genes y otros agentes terapéuticos. El término se refiere a cualquier vehículo farmacéutico que por sí mismo no induce la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, y que puede administrarse sin excesiva toxicidad. Vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácido poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos. Tales vehículos son muy conocidos para aquellos expertos en la materia.
En esto pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión meticulosa de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
Los vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, en tales vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento del pH y similares. Normalmente, las composiciones terapéuticas se preparan como inyectables, tanto como disoluciones líquidas como suspensiones; también puede prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. Los liposomas están incluidos dentro de la definición de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Procedimientos de administración
Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos que van a tratarse pueden ser animales; en particular, pueden tratarse sujetos humanos.
La administración directa de las composiciones se llevará generalmente a cabo mediante inyección, tanto subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente como intramuscularmente, o se administrarán al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse a una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), agujas y pistolas de genes o hipoesprays. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de múltiples dosis.
Vacunas
Las vacunas según la invención pueden ser tanto profilácticas (es decir, para prevenir la infección) como terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad después de la infección).
Tales vacunas comprenden inmunizar antígeno(s), inmunógeno(s), polipéptido(s), proteína(s) o ácido nucleico, normalmente en combinación con “vehículos farmacéuticamente aceptables,” que incluyen cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Vehículos adecuados son macromoléculas grandes lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tales como gotitas de aceite o liposomas) y partículas de virus inactivos. Tales vehículos son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Adicionalmente, estos vehículos pueden actuar de agentes inmunoestimulantes (“adyuvantes”). Además, el antígeno o inmunógeno puede conjugarse con un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de difteria, tétanos, cólera, patógenos de H. pylori, etc.
Adyuvantes preferidos para potenciar la eficacia de la composición incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alumbre) tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como muramilpéptidos (véase más adelante) o componentes de la pared celular bacteriana) tales como, por ejemplo, (a) MF59™ (documento WO 90/14837; Capítulo 10 en Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), que contiene 5 % de escualeno, 0,5 % de Tween 80 y 0,5 % de Span 85 (que opcionalmente contiene diversas cantidades de MTP-PE (véase más adelante), aunque no se requieren) formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene 10 % de escualeno, 0,4 % de Tween 80, 5 % de polímero L121 bloqueado con plurónico y thr-MDP (véase más adelante) tanto microfluidizado en una emulsión submicrométrica como agitado con vórtex para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula, y (c) sistema de adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene 2 % de escualeno, 0,2 % de Tween 80 y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); (3) pueden usarse adyuvantes de saponina tales como Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir de los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (4) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (5) citocinas tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; y (6) otras sustancias que actúan de agentes inmunoestimulantes para potenciar la eficacia de la composición. Se prefieren alumbre y MF59™.
Como se menciona anteriormente, los muramilpéptidos incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-Disoglutamina (thr-MDP), N-acelil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-Disoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
Las composiciones inmunogénicas (por ejemplo, el antígeno inmunizante/inmunógeno/polipéptido/proteína/ácido nucleico, vehículo farmacéuticamente aceptable y adyuvante) normalmente contendrán diluyentes tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento del pH y similares pueden estar presentes en tales vehículos.
Normalmente, las composiciones inmunogénicas se preparan como inyectables, tanto como disoluciones líquidas como suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para potenciar el efecto adyuvante, como se trata anteriormente bajo vehículos farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de los polipéptidos antigénicos o inmunogénicos, además de cualquier otro de los componentes anteriormente mencionados, según se necesite. Por “cantidad inmunológicamente eficaz” se indica que la administración de esa cantidad a un individuo, tanto en una dosis única como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo que va a tratarse, el grupo taxonómico del individuo que va a tratarse (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico práctico en la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse por ensayos rutinarios.
Las composiciones inmunogénicas se administran convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección, tanto subcutáneamente, intramuscularmente como transdérmicamente/transcutáneamente (por ejemplo, el documento WO98/20734). Formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de múltiples dosis. La vacuna puede administrarse conjuntamente con otros agentes inmunorreguladores.
Como una alternativa a las vacunas basadas en proteínas puede emplearse vacunación con ADN {por ejemplo, Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:211-283; Donnelly y col. (1997) Annu Rev Immunol 15:617648; véase más adelante en el presente documento].
Vehículos de administración de genes
Los vehículos de terapia génica para la administración de construcciones que incluyen una secuencia codificante de un agente terapéutico de la invención que va a administrarse al mamífero para la expresión en el mamífero pueden administrarse tanto localmente como sistémicamente. Estas construcciones pueden usar enfoques de vector vírico o no vírico en modalidad in vivo o ex vivo. La expresión de tal secuencia codificante puede inducirse usando promotores endógenos o heterólogos de mamífero. La expresión de la secuencia codificante in vivo puede ser tanto constitutiva como regulada.
La invención incluye vehículos de administración de genes que pueden expresar las secuencias de ácidos nucleicos contempladas. El vehículo de administración de genes es preferentemente un vector vírico, y más preferentemente un vector retrovírico, adenovírico, vírico adenoasociado (AAV), de virus del herpes o alfavírico. El vector vírico también puede ser un vector vírico de astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, parvovirus, picornavirus, poxvirus o togavirus. Véanse generalmente Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy 6:185-193; y Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153.
Los vectores retrovíricos son muy conocidos en la técnica y los presentes inventores contemplan que cualquier vector de terapia génica retrovírico puede emplearse en la invención, que incluye los retrovirus de tipo B, C y D, retrovirus xenotrópicos (por ejemplo, NZB-X1, NZB-X2 y NZB9-1 (véase O'Neill (1985) J. Virol. 53:160), retrovirus politrópicos, por ejemplo, MCF y MCF-MLV (véase Kelly (1983) J. Virol. 45:291), espumavirus y lentivirus. Véase RNA Tumor Viruses, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.
Las porciones del vector de terapia génica retrovírico pueden derivarse de diferentes retrovirus. Por ejemplo, las LTR de retrovectores pueden derivarse de un virus del sarcoma murino, un sitio de unión a ARNt de un virus del sarcoma de Rous, una señal de encapsidación de un virus de la leucemia murina y un origen de la síntesis de la segunda cadena de un virus de la leucosis aviar.
Estos vectores retrovíricos recombinantes pueden usarse para generar partículas de vectores retrovíricos competentes para la transducción introduciéndolos en líneas celulares de encapsidación apropiadas (véase la patente de EE.UU. 5.591.624). Los vectores de retrovirus pueden construirse para integración específica de sitio en ADN de células huésped por incorporación de una enzima integrasa quimérica en la partícula retrovírica (véase el documento WO96/37626). Es preferible que el vector vírico recombinante sea un virus recombinante defectuoso en la replicación.
Líneas celulares de encapsidación adecuadas para su uso con los vectores de retrovirus anteriormente descritos son muy conocidas en la técnica, se preparan fácilmente (véanse los documentos WO95/30763 y WO92/05266) y pueden usarse para crear líneas celulares productoras (también llamadas líneas celulares de vector o “VCL”) para la producción de partículas de vectores recombinantes. Preferentemente, las líneas celulares de encapsidación se preparan a partir de células parentales humanas (por ejemplo, células HT1080) o líneas celulares parentales de visón, que elimina la inactivación en suero humano.
Los retrovirus preferidos para la construcción de vectores de terapia génica retrovírica incluyen virus de la leucosis aviar, virus de la leucemia bovina, virus de la leucemia murina, virus inductor de focos en célula de visón, virus del sarcoma murino, virus de la reticuloendoteliosis y virus del sarcoma de Rous. Virus de la leucemia murina particularmente preferidos incluyen 4070A y 1504A (Hartley y Rowe (1976) J Virol 19:19-25), Abelson (ATCC nº VR999), Friend (ATCC nº VR-245), Graffi, Gross (ATCC nº VR-590), Kirsten, virus del sarcoma de Harvey y virus de la leucemia murina de Rauscher (ATCC nº VR-998) y Moloney (ATCC nº VR-190). Tales retrovirus pueden obtenerse a partir de repositorios o colecciones tales como la Colección americana de cultivos tipo (“ATCC”) en Rockville, Mariland, o aislarse de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles.
Vectores de terapia génica retrovíricos conocidos a modo de ejemplo empleables en la presente invención incluyen aquellos descritos en las solicitudes de patente GB2200651, EP0415731, EP0345242, EP0334301, WO89/02468; WO89/05349, WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, WO93/25698, WO93/25234, WO93/11230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825, WO95/07994, US 5.219.740, US 4.405.712, US 4.861.719, US 4.980.289, US 4.777.127, US 5.591.624. Véanse también Vile (1993) Cancer Res 53:3860-3864; Vile (1993) Cancer Res 53:962-967; Ram (1993) Cancer Res 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:493-503; Baba (1993) J Neurosurg 79:729-735; Mann (1983) Cell 33:153; Cane (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6349; y Miller (1990) Human Gene Therapy 1.
Los vectores de terapia génica adenovíricos humanos también son conocidos en la técnica y pueden emplearse en la presente invención. Véanse, por ejemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 y Rosenfeld (1991) Science 252:431, y los documentos WO93/07283, WO93/06223 y WO93/07282. Vectores de terapia génica adenovíricos conocidos a modo de ejemplo empleables en la presente invención incluyen aquellos descritos en los documentos anteriormente referenciados y en los documentos WO94/12649, WO93/03769, WO93/19191, WO94/28938, WO95/11984, WO95/00655, WO95/27071, WO95/29993, WO95/34671, WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506, WO93/06223, WO94/24299, WO95/14102, WO95/24297, WO95/02697, WO94/28152, WO94/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, WO94/18922 y WO95/09654. Alternativamente, puede emplearse la administración de ADN ligado a adenovirus muerto como se describe en Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-154. Los vehículos de administración de genes de la invención también incluyen vectores de virus asociados a adenovirus (AAV). Ejemplos importantes y preferidos de tales vectores para su uso en la presente invención son los vectores basados en AAV-2 desvelados en Srivastava, documento WO93/09239. Los vectores de AAV más preferidos comprenden las dos repeticiones invertidas de AAV en las que las D-secuencias nativas se modifican por sustitución de nucleótidos, de forma que al menos 5 nucleótidos nativos y hasta 18 nucleótidos nativos, preferentemente al menos 10 nucleótidos nativos hasta 18 nucleótidos nativos, lo más preferentemente 10 nucleótidos nativos, son retenidos y el resto de los nucleótidos de la D-secuencia están delecionados o sustituidos con nucleótidos no nativos. Las D-secuencias nativas de las repeticiones terminales invertidas de AAV son secuencias de 20 nucleótidos consecutivos en cada repetición terminal invertida de AAV (es decir, hay una secuencia en cada extremo) que no participan en la formación de HP. El nucleótido de sustitución no nativa puede ser cualquier nucleótido distinto del nucleótido encontrado en la D-secuencia nativa en la misma posición. Otros vectores de AAV a modo de ejemplo empleables son pWP-19, pW N-1, ambos de los cuales se desvelan en Nahreini (1993) Gene 124:257-262. Otro ejemplo de un vector de AAV tal es psub201 (véase Samulski (1987) J. Virol. 61:3096). Otro vector de AAV a modo de ejemplo es el vector de ITR de D doble. La construcción del vector de ITR de D doble se desvela en la patente de EE.UU.
5.478.745. Todavía otros vectores son los desvelados en la patente de EE.UU. de Carter 4.797.368 y la patente de EE.UU. de Muzyczka 5.139.941, la patente de EE.UU. de Chartejee 5.474.935 y el documento de Kotin WO94/288157. Todavía otro ejemplo de un vector de AAV empleable en la presente invención es SSV9AFABTKneo, que contiene el potenciador de AFP y el promotor de albúmina y dirige la expresión predominantemente en el hígado. Su estructura y construcción se desvelan en Su (1996) Human Gene Therapy 7:463-470. Vectores de terapia génica de AAV adicionales se describen en los documentos US 5.354.678, US 5.173.414, US 5.139.941 y US 5.252.479.
Los vectores de terapia génica de la invención también incluyen vectores de herpes. Ejemplos importantes y preferidos son vectores del virus del herpes simple que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de timidina cinasa tal como los desvelados en los documentos US 5.288.641 y EP0176170 (Roizman). Vectores del virus del herpes simple a modo de ejemplo adicionales incluyen HFEM/ICP6-LacZ desvelado en el documento WO95/04139 (Wistar), pHSVlac descrito en Geller (1988) Science 241:1667-1669 y en los documentos WO90/09441 y WO92/07945, VHS Us3::pgC-lacZ descrito en Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 y VHS 7134, 2 RH 105 y GAL4 descritos en el documento EP 0453242 (Breakefield), y aquellos depositados en la ATCC con los números de acceso ATCC VR-977 y ATCC VR-260.
También se contemplan vectores de terapia génica del alfavirus que pueden emplearse en la presente invención. Vectores del alfavirus preferidos son vectores del virus Sindbis. Togavirus, virus del bosque de Semliki (ATCC VR67; ATCC VR-1247), virus de Middleberg (ATCC VR-370), virus de río Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; (ATCC VR-532), y aquellos descritos en las patentes de EE.UU. 5.091.309, 5.217.879 y WO92/10578. Más particularmente, son empleables aquellos vectores de alfavirus descritos en el documento de EE.UU. nº de serie 08/405.627 presentada el 15 de marzo de 1995, los documentos WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, US 5.091.309 y US 5.217.879. Tales alfavirus pueden obtenerse de repositorios o colecciones tales como la ATCC en Rockville, Mariland, o aislarse de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles. Preferentemente se usan vectores de alfavirus con citotoxicidad reducida (véase el documento USSN 08/679640).
Los sistemas de vector de ADN tales como los sistemas de expresión en capas eucariotas también son útiles para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Véase el documento WO95/07994 para una descripción detallada de sistemas de expresión en capas eucariotas. Preferentemente, los sistemas de expresión en capas eucariotas de la invención se derivan de vectores de alfavirus y lo más preferentemente de vectores víricos de Sindbis.
Otros vectores víricos adecuados para su uso en la presente invención incluyen aquellos derivados del virus de la poliomielitis, por ejemplo, ATCC VR-58 y aquellos descritos en Evans, Nature 339 (1989) 385 y Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115; rinovirus, por ejemplo, ATCC VR-1110 y aquellos descritos en Arnold (1990) J Cell Biochem L401; virus de la viruela tales como el virus de la viruela del canario o el virus de la variolovacuna, por ejemplo, ATCC VR-111 y ATCC VR-2010 y aquellos descritos en Fisher-Hoch (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; en los documentos US 4.603.112 y US 4.769.330 y WO89/01973; virus SV40, por ejemplo, ATCC VR-305 y aquellos descritos en Mulligan (1979) Nature 277:108 y Madzak (1992) J Gen Virol 73:1533; virus de la gripe, por ejemplo, ATCC VR-797 y virus recombinantes de la gripe producidos empleando técnicas de genética inversa como se describen en el documento US 5.166.057 y en Enami (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:3802-3805; Enami & Palese (1991) J Virol 65:2711-2713 y Luytjes (1989) Cell 59:110, (véanse también McMichael (1983) NEJ Med 309:13 y Yap (1978) Nature 273:238 y Nature (1979) 277:108); virus de la inmunodeficiencia humana como se describe en el documento EP-0386882 y en Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; virus del sarampión, por ejemplo, ATCC VR-67 y VR-1247 y aquellos descritos en el documento EP0440219; virus de Aura, por ejemplo, ATCC VR-368; virus de Bebaru, por ejemplo, ATCC VR-600 y ATCC VR-1240; virus de Cabassou, por ejemplo, ATCC VR-922; virus de Chikungunya, por ejemplo, ATCC VR-64 y ATCC VR-1241; virus de Fort Morgan, por ejemplo, ATCC VR-924; virus de Getah, por ejemplo, ATCC VR-369 y ATCC VR-1243; virus de Kyzilagach, por ejemplo, ATCC VR-927; virus de Mayaro, por ejemplo, ATCC VR-66; virus de Mucambo, por ejemplo, ATCC VR-580 y ATCC VR-1244; virus de Ndumu, por ejemplo, ATCC VR-371; virus de Pixuna, por ejemplo, ATCC VR-372 y ATCC VR-1245; virus de Tonate, por ejemplo, ATCC VR-925; virus de Triniti, por ejemplo, ATCC VR-469; virus de Una, por ejemplo, ATCC VR-374; virus de Whataroa, por ejemplo, ATCC VR-926; virus Y62-33, por ejemplo, ATCC VR-375; virus de O'Nyong, virus de la encefalitis oriental, por ejemplo, ATCC VR-65 y ATCC VR-1242; virus de la encefalitis occidental, por ejemplo, ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 y ATCC VR-1252; y coronavirus, por ejemplo, ATCC VR-740 y aquellos descritos en Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med
121:190.
La administración de las composiciones de la presente invención en células no se limita a los vectores víricos anteriormente mencionados. Pueden emplearse otros procedimientos y medios de administración tales como, por ejemplo, vectores de expresión de ácidos nucleico, ADN condensado policatiónico ligado o sin ligar a adenovirus muerto solo, por ejemplo, véase el documento US nº de serie 08/366.787 presentada el 30 de diciembre de 1994 y Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154, ADN ligado de ligando, por ejemplo, véase Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987, vehículos de células de administración de células eucariotas, por ejemplo, véase el documento US nº de serie 08/240.030 presentada el 9 de mayo de 1994 y el documento US nº de serie 08/404.796, deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizados, pistola de partículas de transferencia de genes de mano como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.149.655, radiación ionizante como se describe en los documentos US5.206.152 y en WO92/11033, neutralización de carga nucleica o fusión con membranas celulares. Enfoques adicionales se describen en Philip (1994) Mol Cell Biol 14:2411-2618 y en Woffendin (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1581-1585.
Puede emplearse la transferencia de genes mediada por partículas, por ejemplo, véase el documento de EE.UU. nº de serie 60/023.867. Brevemente, la secuencia puede insertarse en vectores convencionales que contienen secuencias de control convencionales para la expresión de alto nivel, y luego incubarse con moléculas de transferencia de genes sintéticas tales como cationes de unión a ADN polimérico como polilisina, protamina y albúmina, ligados a ligandos que eligen células como diana tales como asialo-orosomucoide, como se describe en Wu & Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432, insulina como se describe en Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40:253-263, galactosa como se describe en Plank (1992) Bioconjugate Chem 3:533-539, lactosa o transferrina.
También puede emplearse ADN desnudo. Los procedimientos de introducción de ADN desnudo a modo de ejemplo se describen en los documentos WO 90/11092 y US 5.580.859. La eficiencia de captación puede mejorarse usando perlas de látex biodegradables. Las perlas de látex recubiertas de ADN se transportan eficientemente en células después de la iniciación de la endocitosis por las perlas. El procedimiento puede mejorarse adicionalmente por tratamiento de las perlas para aumentar la hidrofobia y así facilitar la rotura del endosoma y liberación del ADN en el citoplasma.
Los liposomas que pueden actuar de vehículos de administración de genes se describen en los documentos US 5.422.120, WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 y EP-524.968. Como se describe en el documento USSN 60/023.867, en la administración no vírica, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido pueden insertarse en vectores convencionales que contienen secuencias de control convencionales para la expresión de alto nivel, y luego se incuban con moléculas de transferencia de genes sintéticas tales como cationes de unión a ADN poliméricos como polilisina, protamina y albúmina, ligados a ligandos que eligen células como diana tales como asialo-orosomucoide, insulina, galactosa, lactosa o transferrina. Otros sistemas de administración incluyen el uso de liposomas para encapsular ADN que comprende el gen bajo el control de una variedad de promotores específicos de tejido o ubicuamente activos. Otra administración no vírica adecuada para su uso incluye sistemas de administración mecánica tales como el enfoque descrito en Woffendin y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24):11581-11585. Además, la secuencia codificante y el producto de expresión de tal pueden administrarse mediante la deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizados. Otros procedimientos convencionales para la administración de genes que pueden usarse para la administración de la secuencia codificante incluyen, por ejemplo, uso de pistola de partículas de transferencia de genes de mano, como se describe en el documento US 5.149.655; uso de radiación ionizante para activar el gen transferido, como se describe en los documentos US 5.206.152 y WO92/11033.
Los vehículos de administración de genes de liposomas y policatiónicos a modo de ejemplo son aquellos descritos en los documentos US 5.422.120 y 4.762.915; en los documentos WO 95/13796; WO94/23697; y WO91/14445; en el documento EP0524968; y en Stryer, Biochemistry, páginas 236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.
Una composición de polinucleótido puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un vehículo de terapia génica, como el término se ha definido anteriormente. Para los fines de la presente invención, una dosis eficaz será de aproximadamente 0,01 mg/kg a 50 mg/kg o 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de las construcciones de ADN en el individuo al que se administra.
Procedimientos de administración
Una vez formuladas, las composiciones de polinucleótido de la invención pueden administrarse (1) directamente al sujeto; (2) administrarse ex vivo, a células derivadas del sujeto; o (3) in vitro para la expresión de proteínas recombinantes. Los sujetos que van a tratarse pueden ser mamíferos o aves. Por tanto, también pueden tratarse sujetos humanos.
La administración directa de las composiciones se llevará generalmente a cabo mediante inyección, tanto subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente como intramuscularmente, o se administrarán al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse a una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), agujas y pistolas de genes o hipoesprays. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de múltiples dosis.
Los procedimientos para la administración ex vivo y la reimplantación de células transformadas en un sujeto son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, el documento WO93/14778. Ejemplos de células útiles en aplicaciones ex vivo incluyen, por ejemplo, citoblastos, particularmente hematopoyéticos, linfocitos, macrófagos, células dendríticas o células tumorales.
Generalmente, la administración de ácidos nucleicos para aplicaciones tanto ex vivo como in vitro puede llevarse a cabo por los siguientes procedimientos, por ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del ADN en núcleos, todos muy conocidos en la técnica.
Composiciones farmacéuticas de polinucleótidos y polipéptidos
Además de los vehículos y sales farmacéuticamente aceptables descritos anteriormente, los siguientes agentes adicionales pueden usarse con composiciones de polinucleótidos y/o polipéptidos.
A. Polipéptidos
Un ejemplo son polipéptidos que incluyen, sin limitación: asialo-orosomucoide (ASOR); transferrina; asialoglicoproteínas; anticuerpos; fragmentos de anticuerpos; ferritina; interleucinas; interferones, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de citoblastos y eritropoyetina. También pueden usarse antígenos víricos, tales como proteínas de la envuelta. Por tanto, proteínas de otros organismos invasivos tales como el péptido de 17 aminoácidos de la proteína circumsporozoito de Plasmodium falciparum conocida como RII.
B. Hormonas, vitaminas, etc.
Otros grupos que pueden incluirse son, por ejemplo: hormonas, esteroides, andrógenos, estrógenos, hormona tiroidea o vitaminas, ácido fólico.
C. Polialquilenos, polisacáridos, etc.
Por tanto, el polialquilenglicol puede incluirse con los polinucleótidos/polipéptidos deseados. En una realización preferida, el polialquilenglicol es polietilenglicol. Además, pueden incluirse mono-, di- o polisacáridos. En una realización preferida de este aspecto, el polisacárido es dextrano o DEAE-dextrano. Por tanto, quitosano y poli(lactida-co-glicolida).
D. Lípidos y liposomas
El polinucleótido/polipéptido deseado también puede encapsularse en lípidos o encapsidarse en liposomas antes de la administración al sujeto o a células derivadas del mismo.
La encapsulación de lípidos se realiza generalmente usando liposomas que pueden unirse establemente o ser atrapados y retener el ácido nucleico. La relación de polinucleótido condensado con respecto a preparación de lípido puede variar, pero generalmente será aproximadamente 1:1 (mg de ADN:micromoles de lípido), o más de lípido. Para una revisión del uso de liposomas como vehículos para la administración de ácidos nucleicos véase Hug y Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527.
Las preparaciones liposómicas para su uso en la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (positivamente cargadas), aniónicas (negativamente cargadas) y neutras. Se ha mostrado que los liposomas catiónicos median en la administración intracelular de ADN de plásmido (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416); ARNm (Malone (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081); y factores de transcripción purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192), en forma funcional.
Los liposomas catiónicos están fácilmente disponibles. Por ejemplo, liposomas de N[1,2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,Ntrietilamonio (DOTMA) están disponibles bajo la marca registrada Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand Island, NY, (véase, también, Felgner, arriba). Otros liposomas comercialmente disponibles incluyen transfectace (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger). Pueden prepararse otros liposomas catiónicos a partir de materiales fácilmente disponibles usando técnicas muy conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; el documento WO90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas de DOTAP (1,2bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano).
De manera similar, los liposomas aniónicos y neutros están fácilmente disponibles, tales como de Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), o pueden prepararse fácilmente usando materiales fácilmente disponibles. Tales materiales incluyen fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), entre otros. Estos materiales también pueden mezclarse con los materiales de partida de DOTMA y DOTAP en relaciones apropiadas. Los procedimientos para preparar liposomas usando estos materiales son muy conocidos en la técnica.
Los liposomas pueden comprender vesículas multilaminares (MLV), vesículas unilaminares pequeñas (SUV) o vesículas unilaminares grandes (LUV). Los diversos complejos de liposoma-ácido nucleico se preparan usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101:512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer & Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraley (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348); Enoch & Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:145; y Schaefer-Ridder (1982) Science 215:166.
E. Lipoproteínas
Además, las lipoproteínas pueden incluirse con el polinucleótido/polipéptido que va a administrarse. Ejemplos de lipoproteínas que van a usarse incluyen: quilomicrones, HDL, IDL, LDL y VLDL. También pueden usarse mutantes, fragmentos o fusiones de estas proteínas. Por tanto, pueden usarse modificaciones de lipoproteínas que se producen naturalmente, tales como LDL acetilado. Estas lipoproteínas pueden elegir como diana la administración de polinucleótidos a células que expresan receptores de lipoproteínas. Preferentemente, si las lipoproteínas están incluidas con el polinucleótido que va a administrarse, en la composición no se incluye otro ligando que elige diana.
Las lipoproteínas que se producen naturalmente comprenden un lípido y una porción de proteína. La porción de proteína se conoce como apoproteínas. En la presente, las apoproteínas A, B, C, D y E han sido aisladas e identificadas. Al menos dos de éstas contienen varias proteínas, designadas por número romanos, AI, AII, AIV; CI, CII, CIII.
Una lipoproteína puede comprender más de una apoproteína. Por ejemplo, los quilomicrones que se producen naturalmente comprenden A, B, C y E, con el tiempo estas lipoproteínas pierden A y adquieren apoproteínas C y E. VLDL comprende apoproteínas A, B, C y E, LDL comprende apoproteína B; HDL comprende apoproteínas A, C y E.
El aminoácido de estas apoproteínas es conocido y se describe en, por ejemplo, Breslow (1985) Annu Rev. Biochem 54:699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J Biol Chem 261:12918; Kane (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2465; y Utermann (1984) Hum Genet 65:232.
Las lipoproteínas contienen una variedad de lípidos que incluyen triglicéridos, colesterol (libre y ésteres) y fosfolípidos. La composición de los lípidos varía en las lipoproteínas que se producen naturalmente. Por ejemplo, los quilomicrones comprenden principalmente triglicéridos. Una descripción más detallada del contenido de lípidos de lipoproteínas que se producen naturalmente puede encontrarse, por ejemplo, en Meth. Enzymol. 128 (1986). La composición de los lípidos se elige para ayudar en la conformación de la apoproteína para la actividad de unión a receptores. La composición de los lípidos también puede elegirse para facilitar la interacción hidrófoba y la asociación con la molécula de unión a polinucleótidos.
Las lipoproteínas que se producen naturalmente pueden aislarse de suero, por ejemplo, por ultracentrifugación. Tales procedimientos se describen en Meth. Enzymol. (arriba); Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454-5460 y Mahey (1979) J Clin. Invest 64:743-750. Las lipoproteínas también pueden producirse por procedimientos in vitro o recombinantes por expresión de los genes de apoproteína en una célula huésped deseada. Véase, por ejemplo, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15:403 y Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30: 443. Las lipoproteínas también pueden comprarse de proveedores comerciales, tales como Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, EE.UU. Otra descripción de lipoproteínas puede encontrarse en Zuckermann y col., documento PCT/US97/14465.
F. Agentes policatiónicos
Los agentes policatiónicos pueden incluirse, con o sin lipoproteína, en una composición con el polinucleótido/polipéptido deseado que va a administrarse.
Los agentes policatiónicos presentan normalmente una carga positiva neta a pH fisiológico relevante y pueden neutralizar la carga eléctrica de ácidos nucleicos para facilitar la administración a una localización deseada. Estos agentes tienen aplicaciones tanto in vitro, ex vivo como in vivo. Los agentes policatiónicos pueden usarse para administrar ácidos nucleicos a un sujeto vivo tanto intramuscularmente, subcutáneamente, etc.
Lo siguiente son ejemplos de polipéptidos útiles como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina, poliornitina y protamina. Otros ejemplos incluyen histonas, prolaminas, albúmina de suero humano, proteínas de unión a ADN, proteínas cromosómicas de no histona, proteínas de la envuelta de virus de ADN tales como φX174, los factores de transcripción también contienen dominios que se unen ADN y, por tanto, pueden ser útiles como agentes de condensación de ácidos nucleicos. Brevemente, factores de transcripción tales como C/CEBP, c-jun, c-fos, Asp-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP y TFIID contienen dominios básicos que se unen a secuencias de ADN.
Agentes policatiónicos orgánicos incluyen: espermina, espermidina y purtrescina.
Las dimensiones y las propiedades físicas de un agente policatiónico pueden extrapolarse de la lista anterior para la construcción de otros agentes policatiónicos de polipéptido o para producir agentes policatiónicos sintéticos.
Agentes policatiónicos sintéticos que son útiles incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano, polibreno. Lipofectin™ y lipofectAMINE™ son monómeros que forman complejos policatiónicos cuando se combinan con polinucleótidos/polipéptidos.
Hibridación de ácidos nucleicos
La “hibridación” se refiere a la asociación de dos secuencias de ácidos nucleicos entre sí por medio de enlaces de hidrógeno. Normalmente, una secuencia se fijará a un soporte sólido y la otra estará libre en disolución. Entonces, las dos secuencias se pondrán en contacto entre sí en condiciones que favorezcan los enlaces de hidrógeno. Factores que afectan estos enlaces incluyen: el tipo y el volumen de disolvente; temperatura de reacción; tiempo de hibridación; agitación; agentes para bloquear la unión no específica de la secuencia en fase líquida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO); concentración de las secuencias; uso de compuestos para aumentar la tasa de asociación de secuencias (sulfato de dextrano o polietilenglicol); y la rigurosidad de las condiciones de lavado tras la hibridación. Véase Sambrook y col. {arriba}, vol. 2, cap. 9, pág. 9.47 a 9.57.
La “rigurosidad” se refiere a las condiciones en una reacción de hibridación que favorecen la asociación de secuencias muy similares con respecto a secuencias que se diferencian. Por ejemplo, la combinación de temperatura y concentración de sales debería elegirse de aproximadamente 120 a 200 ºC por debajo de la Tm calculada del híbrido en estudio. Las condiciones de temperatura y sal pueden determinarse frecuentemente empíricamente en experimentos preliminares en los que muestras de ADN genómico inmovilizadas sobre filtros se hibridan con la secuencia de interés y luego se lavan en condiciones de diferentes rigurosidades. Véase Sambrook y col. en la página 9.50.
Variables a considerar cuando se realiza, por ejemplo, una transferencia Southern son (1) la complejidad del ADN que se transfiere y (2) la homología entre la sonda y las secuencias que se detectan. La cantidad total del (de los) fragmento(s) que va(n) a estudiarse puede variar una magnitud de 10, de 0,1 a 1 µg para un plásmido o digestión de fago a 10-9 a 10-8 g para un gen de una única copia en un genoma eucariota altamente complejo. Para reducir la complejidad de polinucleótidos pueden usarse tiempos de transferencia, hibridación y exposición sustancialmente más cortos, una cantidad más pequeña de polinucleótidos de partida y menor actividad específica de sondas. Por ejemplo, un gen de levadura de una única copia puede detectarse con un tiempo de exposición de sólo 1 hora empezando con 1 pg de ADN de levadura, transfiriendo durante dos horas e hibridando durante 4-8 horas con una sonda de 108 cpm/µg. Para un gen de mamífero de una única copia, un enfoque conservativo empezaría con 10 µg de ADN, transferencia durante la noche e hibridación durante la noche en presencia del 10 % de sulfato de dextrano usando una sonda de más de 108 cpm/µg, produciendo un tiempo de exposición de 24 horas.
Varios factores pueden afectan la temperatura de fusión (Tm) de un híbrido de ADN-ADN entre la sonda y el fragmento de interés y, por consiguiente, las condiciones apropiadas para hibridación y lavado. En muchos casos, la sonda no es al 100 % homóloga al fragmento. Otras variables comúnmente encontradas incluyen la longitud y contenido de G+C total de las secuencias de hibridación y la fuerza iónica y contenido de formamida del tampón de hibridación. Los efectos de todos estos factores pueden aproximarse por una única ecuación:
Tm = 81 + 16,6(log10Ci) + 0,4[% de (G+C)]·0,6(% de formamida) - 600/n-1,5(% de desapareamiento)
en la que Ci es la concentración de sales (iones monovalentes) y n es la longitud del híbrido en pares de bases (ligeramente modificadas a partir de Meinkoth & Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284).
En el diseño de un experimento de hibridación, algunos factores que afectan la hibridación de ácidos nucleicos pueden alterarse convenientemente. La temperatura de la hibridación y lavados y la concentración de sales durante los lavados son lo más fácil de ajustar. Como la temperatura de hibridación aumenta (es decir, la rigurosidad), es menos probable que la hibridación se produzca entre cadenas que son no homólogas y, como resultado, disminuya el ruido. Si la sonda radiomarcada no es completamente homóloga al fragmento inmovilizado (como es frecuentemente el caso en la familia del gen y en experimentos de hibridación entre especies), la temperatura de hibridación debe reducirse, y aumentará el ruido. La temperatura de los lavados afecta la intensidad de la banda de hibridación y el grado de ruido de un modo similar. La rigurosidad de los lavados también aumenta al disminuir las concentraciones de sales.
En general, temperaturas de hibridación convenientes en presencia de 50% % de formamida son 42 ºC para una sonda con del 95 % al 100 % de homología con el fragmento diana, 37 ºC para el 90 % al 95 % de homología, y 32 ºC para el 85 % al 90 % de homología. Para menores homologías, el contenido de formamida debería reducirse y consecuentemente ajustarse la temperatura usando la ecuación anterior. Si la homología entre la sonda y el fragmento diana no es conocida, el enfoque más simple es empezar con condiciones de hibridación como de lavado que son no rigurosas. Si no se observan bandas específicas o alto ruido después de la autorradiografía, el filtro puede lavarse a alta rigurosidad y volverse a exponer. Si el tiempo requerido para la exposición hace que este enfoque sea poco práctico, deberían probarse en paralelo varias rigurosidades de hibridación y/o lavado.
Ensayos de sondas de ácido nucleico
Procedimientos tales como PCR, ensayos de sondas de ADN ramificadas o técnicas de transferencia que usan sondas de ácido nucleico según la invención pueden determinar la presencia de ADNc o ARNm. Se dice que una sonda se “hibrida” con una secuencia de la invención si puede formar un dúplex o complejo bicatenario que es suficientemente estable para ser detectado.
Las sondas de ácido nucleico se hibridarán con las secuencias de nucleótidos de clamidia de la invención (que incluyen hebras codificantes tanto no codificantes). Aunque muchas secuencias de nucleótidos diferentes codificarán la secuencia de aminoácidos, se prefiere la secuencia de clamidia nativa debido a que es la secuencia real presente en células. El ARNm representa una secuencia codificante y, por tanto, una sonda debería ser complementaria a la secuencia codificante; el ADNc monocatenario es complementario al ARNm, y, por tanto, una sonda de ADNc debería ser complementaria a la secuencia no codificante.
La secuencia de la sonda no necesita ser idéntica a la secuencia de clamidia (o su complemento); alguna variación en la secuencia y longitud puede conducir a un aumento de la sensibilidad del ensayo si la sonda de ácido nucleico puede formar un dúplex con nucleótidos diana, que pueden detectarse. Por tanto, la sonda de ácido nucleico puede incluir nucleótidos adicionales para estabilizar el dúplex formado. La secuencia de clamidia adicional también puede ser útil como marca para detectar el dúplex formado. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos no complementaria puede unirse al extremo 5' de la sonda, siendo el resto de la secuencia de la sonda complementaria a una secuencia de clamidia. Alternativamente, bases no complementarias o secuencias más largas pueden estar intercaladas en la sonda, siempre que la secuencia de la sonda tenga complementariedad suficiente con una secuencia de clamidia con el fin de hibridarse con la misma y así formar un dúplex que pueda detectarse.
La longitud y la secuencia exactas de la sonda dependerán de las condiciones de hibridación tales como temperatura, condición de sales y similares. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia del analito, la sonda de ácido nucleico normalmente contiene al menos 10-20 nucleótidos, preferentemente 15-25, y más preferentemente  30 nucleótidos, aunque puede ser más corta que esto. Cebadores cortos generalmente requieren temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde.
Las sondas pueden producirse mediante procedimientos de síntesis tales como el procedimiento de triéster de Matteucci y col. {J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185}, o según Urdea y col. {Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 7461}, o usando 5 sintetizadores de oligonucleótidos automatizados comercialmente disponibles.
La naturaleza química de la sonda puede seleccionarse según preferencia. Para ciertas aplicaciones, ADN o ARN son apropiados. Para otras aplicaciones, las modificaciones pueden incorporar, por ejemplo, modificaciones del esqueleto tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, pueden usarse para aumentar la semivida in vivo, alterar la afinidad del ARN, aumentar la resistencia a nucleasa, etc. {por ejemplo, Agrawal & lyer (1995) Curr. Opin. Biotechnol 6:12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14:376-387}; también pueden usarse análogos tales como ácidos nucleicos peptídicos {por ejemplo, véase Corey (1997) TIBTECH 15:224-229; Buchardt y col. (1993) TIBTECH 11:384-386}.
Alternativamente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es otro medio muy conocido para detectar pequeñas cantidades de ácidos nucleicos diana. El ensayo se describe en: Mullis y col. {Meth. Enzymol. (1987) 155:335-350}; patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202. Dos “cebadores” se hibridan con los ácidos nucleicos diana y se usan para cebar la reacción. Los cebadores pueden comprender secuencias que no se hibridan con la secuencia de la amplificación diana (o su complemento) para ayudar con la estabilidad del dúplex o, por ejemplo, para incorporar un sitio de restricción conveniente. Normalmente, tal secuencia flanqueará la secuencia de clamidia deseada.
Una polimerasa termoestable crea copias de ácidos nucleicos diana de los cebadores usando los ácidos nucleicos diana originales como molde. Después de generarse una cantidad umbral de ácidos nucleicos diana por la polimerasa, pueden detectarse por procedimientos más tradicionales tales como transferencias Southern. Si se usa el procedimiento de transferencia Southern, la sonda marcada se hibridará con la secuencia de clamidia (o su complemento).
Por tanto, el ARNm o ADNc puede detectarse por técnicas de transferencia tradicionales descritas en Sambrook y col. {arriba}. ARNm, o ADNc generado a partir de ARNm usando una enzima polimerasa, pueden purificarse y separarse usando electroforesis en gel. Entonces, los ácidos nucleicos sobre el gel se transfieren sobre un soporte sólido, tal como nitrocelulosa. El soporte sólido se expone a una sonda marcada y luego se lava para eliminar cualquier sonda sin hibridar. A continuación, los dúplex que contienen la sonda marcada se detectan. Normalmente, la sonda se marca con un resto radiactivo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1 a 44 muestran datos de los Ejemplos 1 a 44. Si una figura es de un gel, el carril 1 está a la izquierda de la figura.
Para transferencias Western se probaron dos muestras para cada proteína. El carril izquierdo en un par usó tiras de membrana teñidas con sueros pre-inmunes mientras que el carril derecho usó tiras de membrana teñidas con sueros inmunes. En las transferencias Western en las Figuras 1 a 5, 35B, 37B, 38B y 39, los marcadores están a 66, 45, 30, 20,1 y 14,4 kDa. En las transferencias Western en las Figuras 6 a 16, 20B, 23C, 24D, 27E, 38A, 40, 41, 42 y 43, los marcadores están a 172,6, 111,4, 79,6, 61,3, 49,0, 36,4, 24,7, 19,2 y 13,1 kDa.
En las transferencias Western en las Figuras 1 a 5, los carriles 2 y 3 muestran sueros de control producidos contra antígenos de control de fusión con GST. En las transferencias Western en las Figuras 1 a 5, los carriles 4 y 5 contienen sueros de control producidos contra antígenos de control marcados con His.
Los marcadores de bajo peso molecular se ejecutan en el carril 1 de los geles de purificación.
MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
La Tabla I facilita los nombres de proteínas de C. pneumoniae de la referencia 18, los números de acceso de GenBank y títulos para aquellas proteínas, los números de acceso de GenBank y títulos para las proteínas de C. trachomatis correspondientes descritas en el presente documento y números de SEC ID (SEC ID 1-262, siendo los números impares secuencias de aminoácidos y siendo los números pares secuencias de nucleótidos) para estas proteínas de C. trachomatis. Éstas pueden expresarse y usarse de las mismas formas que se describen en la referencia 18 para las proteínas de C. pneumoniae correspondientes. Las proteínas de C. trachomatis son útiles para fines de diagnóstico e inmunogénicos. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Pueden usarse diversas pruebas para evaluar la inmunogenicidad in vivo de las proteínas de la invención. Por ejemplo, las proteínas pueden expresarse recombinantemente y usarse para cribar sueros de pacientes por inmunotransferencia. Una reacción positiva entre la proteína y el suero del paciente indica que el paciente ha organizado previamente una respuesta inmunitaria a la proteína en cuestión, es decir, la proteína es un inmunogén. Este procedimiento también puede usarse para identificar proteínas inmunodominantes.
La proteína recombinante también puede usarse convenientemente para preparar anticuerpos, por ejemplo, en unratón. Éstos puede usarse para la confirmación directa de que una proteína se localiza sobre la superficie celular de
C. trachomatis (por ejemplo, usando los anticuerpos en una transferencia Western contra Chlamydia intacta). El anticuerpo marcado (por ejemplo, marcado fluorescente para FACS) puede incubarse con bacterias intactas y la presencia de la marca sobre la superficie bacteriana confirma la localización de la proteína. Las figuras de FACS muestran un perfil de dispersión de la preparación de Chlamydia usada en el ensayo, el desplazamiento del pico obtenido cuando los anticuerpos contra el antígeno recombinante se unen a las células de clamidia (área abierta = muestra de control; área rellena = muestra reaccionada con anticuerpo), análisis estadístico de Kolmogorov-Smirnov cuantitativo (K-S) y salida del software de análisis de FACS.
Ejemplo 1
Se expresó CT242 (SEC ID 57 y SEC ID 58) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión con GST (Figura 1A; carriles 4 y 5, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 42,4 kDa) como una proteína de fusión marcada con His (Figura 1B; carriles 2-4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 16,4 kDa).
La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 1C: marcada con His: carriles 12 y 13; fusión con GST: carriles 20 y 21). El carril 12 muestra tiras de membrana teñidas con sueros pre-inmunes para CT242 marcada con His mientras que el carril 13 muestra tiras de membrana teñidas con sueros inmunes para CT242 marcada con His. El carril 20 muestra tiras de membrana teñidas con sueros pre-inmunes para CT242 de fusión con GST mientras que el carril 21 muestra tiras de membrana teñidas con sueros inmunes para CT242 de fusión con GST.
Estos experimentos muestran que CT242 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 2
Se expresó CT045 (SEC ID 71 y SEC ID 72) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 2A; carriles 4-6, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 55,8 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 2B, carriles 8 y 9) y para análisis de FACS (Figura 2C, valor de K-S 16,81).
Estos experimentos muestran que CT045 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 3
Se expresó CT381 (SEC ID 105 y SEC ID 106) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión con GST (Figura 3A; carriles 2 y 3, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 52,7 kDa) como una proteína de fusión marcada con His (Figura 3A; carriles 7-9, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 26,7 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 3B: marcada con His: carriles 6 y 7; fusión con GST: carriles 16 y 17) y para análisis de FACS (Figura 3C: marcada con GST, valor de K-S 35,98; Figura 3D: marcada con His, valor de K-S 32,54).
Estos experimentos muestran que CT381 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 4
Se expresó CT396 (SEC ID 107 y SEC ID 108) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión con GST (Figura 4A; carriles 6 y 7, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 99,5 kDa) como una proteína de fusión marcada con His (Figura 4B; carriles 5-7, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 73,5 kDa). La proteína marcada con His recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 4C, carriles 14 y 15). La proteína marcada con His recombinante y la proteína de fusión con GST también se usaron para análisis de FACS (Figura 4D: marcada con His, valor de K-S 34,50; Figura 4E: fusión con GST, valor de K-S 32,76).
Estos experimentos muestran que CT396 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 5
Se expresó CT398 (SEC ID 111 y SEC ID 112) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión con GST (Figura 5A; carriles 8 y 9, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 54,8 kDa) como una proteína de fusión marcada con His (Figura 5B; carriles 8-10, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 28,8 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 5C: marcada con His: carriles 10 y 11; fusión con GST: carriles 18 y 19) y para análisis de FACS (Figura 5D: fusión con GST, valor de K-S 31,24; Figura 5E: marcada con His, valor de K-S 26,10).
Estos experimentos muestran que CT398 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 6
Se expresó CT089 (SEC ID 61 y SEC ID 62) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión con GST (Figura 6C: carril 2, cromatografía fracción 1, peso molecular esperado 70,8 kDa) como una proteína de fusión marcada con His (Figura 6C: carriles 3, 4 y 5, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 44,8 kDa). Las proteínas recombinantes se usaron para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 6A: fusión con GST: carriles 14 y 15; marcada con His: carriles 16 y 17) y para análisis de FACS (Figura 6B: marcada con His, valor de K-S 26,59).
Estos experimentos muestran que CT089 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 7
Se expresó CT443 (SEC ID 125 y SEC ID 126) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His. La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 7A: carriles 10 y 11) y para análisis de FACS (Figura 7B: valor de K-S 21,28).
Estos experimentos muestran que CT443 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 8
Se expresó CT541 (SEC ID 149 y SEC ID 150) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión con GST (Figura 8C: carriles 2 y 3, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 51,6 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 8A: carriles 6 y 7) y para análisis de FACS (Figura 8B: valor de K-S 9,94).
Estos experimentos muestran que CT541 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 9
Se expresó CT547 (SEC ID 151 y SEC ID 152) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión con GST (Figura 9D: carriles 4 y 5, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 58,3 kDa) como una proteína de fusión marcada con His. La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 9A: marcada con His: carriles 20 y 21) y para análisis de FACS (Figura 9B: fusión con GST, valores de K-S 14,60 y 15,57; Figura 9C: marcada con His, valor de K-S 28,21).
Estos experimentos muestran que CT547 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 10
Se expresó CT587 (SEC ID 189 y SEC ID 190) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 10C: carriles 5, 6 y 7, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 47,5 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 10A: carriles 12 y 13) y para análisis de FACS (Figura 10B: marcada con His, valor de K-S 20,85).
Estos experimentos muestran que CT587 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 11
Se expresó CT266 (SEC ID 77 y SEC ID 78) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 11C: carriles 11 y 12, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 44,1 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 11A: carriles 4 y 5) y para análisis de FACS (Figura 11B: valor de K-S 21,29).
Estos experimentos muestran que CT266 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 12
Se expresó CT444 (SEC ID 127 y SEC ID 128) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión con GST (Figura 12B: carriles 2 y 3, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 87,3 kDa) y como una proteína de fusión marcada con His (Figura 12C: carriles 3 y 4, fracciones de cromatografía 2 y 3, peso molecular esperado 9,0 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 12A: carriles 16 y 17) y para análisis de FACS (Figura 12D: marcada con GST: valor de K-S 14,98; Figura 12E: marcada con His: valor de K-S 13,28).
Estos experimentos muestran que CT444 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 13
Se expresó CT559 (SEC ID 199 y SEC ID 200) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína marcada con His (Figura 13C: carriles 2, 3 y 4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 34,9 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 13A: carriles 6 y 7) y para análisis de FACS (Figura 13B: valor de K-S 23,21).
Estos experimentos muestran que CT559 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 14
Se expresó CT681 (SEC ID 155 y SEC ID 156) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 14C: carriles 5 y 6, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 41,8 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 14A: carriles 10 y 11) y para análisis de FACS (Figura 14B: valor de K-S 34,66).
Estos experimentos muestran que CT681 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 15
Se expresó CT713 (SEC ID 201 y SEC ID 202) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 15B: carriles 4, 5 y 6; fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 35,4 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 15A: carriles 12 y 13) y para análisis de FACS (Figura 15C: valor de K-S 25,82).
Estos experimentos muestran que CT713 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 16
Se expresó CT823 (SEC ID 229 y SEC ID 230) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 16C: carriles 7, 8 y 9, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 53,9 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 16A: carriles 14 y 15) y para análisis de FACS (Figura 16B: valor de K-S 26,62).
Estos experimentos muestran que CT823 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 17
Se expresó CT114 (SEC ID 243 y SEC ID 244) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 17; carriles 6 y 7, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 48,5 kDa).
Ejemplo 18
Se expresó CT198 (SEC ID 43 y SEC ID 44) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 18A; carril 6, cromatografía fracción 1, peso molecular esperado 56,3 kDa). La proteína recombinante marcada con His se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron para análisis de FACS (Figura 18B).
Estos experimentos muestran que CT198 está presente en sólo parte de una población heterogénea de CE (como normalmente son las preparaciones de clamidia). Si está presente, es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 19
Se expresó CT241 (SEC ID 55 y SEC ID 56) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 19: carril 4, cromatografía fracción 3, peso molecular esperado 85,3 kDa).
Ejemplo 20
Se expresó CT350 (SEC ID 27 y SEC ID 28) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión marcada con His (Figura 20A: carriles 2, 3 y 4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 61,3 kDa) como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 20A: carriles 7, 8 y 9, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 87,3 kDa). Las proteínas recombinantes se usaron para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 20B: marcada con His, carriles 4 y 5; marcada con GST, carriles 8 y 9).
Ejemplo 21
Se expresó CT351 (SEC ID 25 y SEC ID 26) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 21: carriles 2 y 3, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 76,1 kDa).
Ejemplo 22
Se expresó CT391 (SEC ID 251 y SEC ID 252) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 22: carriles 8 y 9, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 32,6 kDa).
Ejemplo 23
Se expresó CT077 (SEC ID 65 y SEC ID 66) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 23: carriles 2 y 3, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 59,7 kDa) y como una proteína de fusión marcada con His. La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 23C: carriles 6 y 7) y para análisis de FACS (Figura 23B, marcada con His: valor de K-S 9,17).
Estos experimentos muestran que CT077 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 24
Se expresó CT181 (SEC ID 245 y SEC ID 246) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 24A: carril 4, cromatografía fracción 1, peso molecular esperado 50,1 kDa) y como una proteína de fusión marcada con His (Figura 24B: carriles 2, 3 y 4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 32,0 kDa). La proteína recombinante marcada con GST se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 24D, carriles 4 y 5 (indicados por una flecha)) y para análisis de FACS (Figura 24C, valor de K-S 7,62).
Estos experimentos muestran que CT181 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 25
Se expresó CT589 (SEC ID 185 y SEC ID 186) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 25A: carriles 4 y 5, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 89,4 kDa) como una proteína de fusión marcada con His (Figura 25B: carriles 2 y 3, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 63,4 kDa). La proteína recombinante marcada con His se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron para análisis de FACS (Figura 25C).
Estos experimentos muestran que CT589 está presente en sólo parte de una población heterogénea de CE (como normalmente son las preparaciones de clamidia). Si está presente, es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 26
Se expresó CT597 (SEC ID 179 y SEC ID 180) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 26A: carriles 5 y 6, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 36,0 kDa) como una proteína de fusión marcada con His (Figura 26B: carriles 2, 3 y 4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 10,3 kDa).
Ejemplo 27
Se expresó CT623 (SEC ID 163 y SEC ID 164) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 27A: carriles 3 y 4, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 71,8 kDa) como una proteína de fusión marcada con His (Figura 27B: carriles 2, 3 y 4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 45,8 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 27E: marcada con GST, carril 4 (indicado por una flecha); marcada con His, carril 13 (indicado por una flecha)) y para análisis de FACS (Figura 27C: marcada con GST: valor de K-S 15,89; Figura 27D: marcada con His: valor de K-S 20,27).
Estos experimentos muestran que CT623 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 28
Se expresó CT700 (SEC ID 261 y SEC ID 262) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 28A: carriles 5, 6 y 7, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 73,7 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron para análisis de FACS (Figura 28B: valor de K-S 8,72).
Estos experimentos muestran que CT700 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 29
Se expresó CT761 (SEC ID 217 y SEC ID 218) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 29A: carriles 6 y 7, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 63,9 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron para análisis de FACS (Figura 29B, valor de K-S 11,45).
Estos experimentos muestran que CT761 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 30
Se expresó CT415 (SEC ID 117 y SEC ID 118) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 30: carriles 3 y 4, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 55,4 kDa).
Ejemplo 31
Se expresó CT454 (SEC ID 253 y SEC ID 254) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 31: carriles 2 y 3, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 56,2 kDa).
Ejemplo 32
Se expresó CT467 (SEC ID 129 y SEC ID 130) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 32: carriles 3 y 4, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 65,6 kDa).
Ejemplo 33
Se expresó CT551 (SEC ID 257 y SEC ID 258) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión marcada con His (Figura 33A: carriles 5, 6 y 7, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 34,1 kDa) como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 33B: carriles 4 y 5, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 60,1 kDa).
Ejemplo 34
Se expresó CT567 (SEC ID 195 y SEC ID 196) en E. coli. El producto recombinante se purificó tanto como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 34A: carriles 8 y 9, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 44,0 kDa) como una proteína de fusión marcada con His (Figura 34B: menos 7 y 8, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 18,3 kDa).
Ejemplo 35
Se expresó CT569 (SEC ID 193 y SEC ID 194) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 35A: carriles 2, 3 y 4, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 11,2 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 35B: carriles 8 y 9, indicados con una flecha).
Ejemplo 36
Se expresó CT647 (SEC ID 169 y SEC ID 170) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con GST (Figura 36: carriles 6 y 7, fracciones de cromatografía 1 y 2, peso molecular esperado 45,7 kDa).
Ejemplo 37
Se expresó CT600 (SEC ID 173 y SEC ID 174) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His (Figura 37A: carriles 5, 6 y 7, fracciones de cromatografía 1, 2 y 3, peso molecular esperado 19,5 kDa). La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 37B, carriles 10 y 11, indicados por una flecha) y para análisis de FACS (Figura 37C, valor de K-S 10,46).
Estos experimentos muestran que CT600 es una proteína expuesta a la superficie e inmunoaccesible, y que es un inmunogén útil. Estas propiedades no son evidentes de la secuencia sola.
Ejemplo 38
Se expresó CT279 (SEC ID 247 y SEC ID 248) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con GST como una proteína de fusión marcada con His. La proteína marcada con His recombinante y la proteína marcada con GST recombinante se usaron para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en transferencia Western (Figura 38A: marcada con His: carril 5 (indicado por una flecha); Figura 38B: marcada con GST: carriles 12 y 13 (indicados por una flecha)).
Ejemplo 39
Se expresó CT560 (SEC ID 259 y SEC ID 260) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His. La proteína marcada con His recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 39: carriles 6 y 7 (indicados por una flecha)).
Ejemplo 40
Se expresó CT389 (SEC ID 249 y SEC ID 250) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con GST. La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 40: carriles 16 y 17 (indicados por una flecha)).
Ejemplo 41
Se expresó CT456 (SEC ID 255 y SEC ID 256) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con GST. La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 41: carriles 2 y 3 (indicados por una flecha)).
Ejemplo 42
Se expresó CT622 (SEC ID 161 y SEC ID 162) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His. La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 42: carril 9 (indicado por una flecha)).
Ejemplo 43
Se expresó CT759 (SEC ID 213 y SEC ID 214) en E. coli. El producto recombinante se purificó como una proteína de fusión marcada con His. La proteína recombinante se usó para inmunizar ratones cuyos sueros se usaron en una transferencia Western (Figura 43: carriles 8 y 9 (indicados por una flecha)).
Ejemplo 44
Se realizaron ensayos de neutralización in vitro, que muestran la capacidad de sueros obtenidos de ratones que han sido inmunizados con las diferentes proteínas recombinantes de la presente invención para inhibir infectividad de C. trachomatis para células eucariotas en cultivo, usando células LLCMK2 (epiteliales de riñón de mono Rhesus). Se prepararon diluciones cuádruples seriadas de sueros policlonales de ratón en tampón SP (sacarosa-fosfato). Los antisueros de ratón para CE completos se usaron como control positivo y los sueros pre-inmunes y tampón SP solo se usaron como controles negativos. Los CE purificados de C. trachomatis (serovar D) se diluyeron en tampón SP para contener 3x105 UFI/ml, y 10 µl de esta suspensión se añadieron a cada dilución de suero en un volumen final de 100 µl. Se dejó que la interacción anticuerpo-CE continuara durante 30 min a 37 ºC. Entonces, 100 µl de mezcla de reacción de cada muestra se añadieron a la parte superior de monocapas de células LLCMK2 lavadas con PBS, en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se centrifugaron a 805 x g durante 1 hora a 37 ºC. Todos los sueros y los controles se examinaron en muestras duplicadas. Después de eliminar el inóculo en exceso, las células se aclararon una vez con PBS, se repusieron 200 µl de medio DMEM complementado con 20 % de SBF y 1 µg/ml de cicloheximida y se incubaron a 37 ºC durante 48 horas. Las células se fijaron con metanol y las inclusiones citoplásmicas típicas generadas por la infección intracelular continuada por clamidia se tiñeron con un anticuerpo monoclonal anti-clamidia conjugado con fluoresceína (Meridian Diagnostics). A diluciones y relaciones de CE con respecto a célula huésped adecuadas, el número de inclusiones observadas se considera que es igual al número de clamidias viables que pudieron establecer inicialmente de modo satisfactorio una infección de células huésped (éstas se llaman Unidades Formadoras de Inclusión, UFI). Las inclusiones marcadas con fluoresceína se contaron en cuatro campos microscópicos por pocillo a un aumento de 40X. La inhibición de la infectividad debida a la interacción con el anticuerpo se calculó como reducción en porcentaje en UFI medias con respecto al control de SP (tampón solo). Según la práctica común, los sueros se etiquetaron como “neutralizantes” si pudieron producir una reducción del 50 % o superior en la infectividad; sin embargo, considerando la complejidad del ensayo de cribado completo (por ejemplo, un cambio de célula huésped, o cepa aislada de clamidia, o una variación en las condiciones medioambientales en la preparación del inóculo infeccioso), los sueros que pueden inhibir la infectividad de CE a un menor grado también deberían considerarse como candidatos a vacuna para el estudio adicional. La Figura 44A muestra un ejemplo de un resultado obtenido de un suero positivo para neutralización mientras que la Figura 44B muestra un ejemplo de un resultado obtenido de un suero negativo para neutralización.
Se llevaron a cabo ensayos de neutralización in vitro usando sueros obtenidos de ratones inmunizados con las proteínas recombinantes mencionadas en el Ejemplo 1 a 10, 13-22, 24-26 y 29-37. Los resultados se presentan en la Tabla II. Estos resultados indican que CT045, CT242, CT381, CT396, CT398, CT467, CT547, CT587 y CT681 son todos candidatos particularmente buenos para vacunas para prevenir la infección por C. trachomatis. Estas propiedades no son evidentes de las secuencias solas.
En experimentos adicionales, los sueros producidos contra C. trachomatis se probaron contra CE de C. pneumoniae para la actividad de neutralización cruzada. El procedimiento fue como se ha descrito anteriormente, pero los CE purificados de C. pneumoniae se diluyeron en tampón SP para contener 3x106 UFI/ml, y 10 µl de esta suspensión se añadieron a cada dilución de suero en un volumen final de 100 µl. Los sueros obtenidos usando CT242 y CT467 pudieron neutralizar de forma cruzada CE de C. pneumoniae.
REFERENCIAS
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{10} Ward (1995) Apmis. 103:769-96.
{11} Moulder (1991) Microbiol Rev 55(1):143-190. 5 {12} Comanducci y col. (1994) Infect Immun 62(12):5491-5497.
{13} Documento EP-A-0499681
{14} Solicitud de patente internacional WO95/28487
{15} Murdin y col. (1993) Infect Immun 61:4406-4414
{16} Cerrone y col. (1991) Infect Immun 59(1):79-90. 10 {17} Raulston y col. (1993) J. Biol. Chem. 268:23139-23147.
{18} Solicitud de patente internacional WO02/02606.
TABLA I
Ref. 18
Número de acceso y anotación de C. pneumoniae Número de acceso y anotación de C. trachomatis SEC ID
cp0010
gi|4376729|gb|AAD18590.1| Familia de la proteína G de la membrana externa polimórfica gi|3329346|gb|AAC68469.1| Proteína G de la membrana externa putativa 1,2
cp0014
gi|4376729|gb|AAD18590.1| Familia de la proteína G de la membrana externa polimórfica gi|3329346|gb|AAC68469.1| Proteína G de la membrana externa putativa 3, 4
cp0015
gi|4376731|gb|AAD18591.1| Familia de la proteína G/I de la membrana externa polimórfica gi|3329346|gb|AAC68469.1| Proteína G de la membrana externa putativa 5, 6
cp0016
gi|4376731|gb|AAD18591.1| Familia de la proteína G/I de la membrana externa polimórfica gi|3329350|gb|AAC68472.1| Proteína I de la membrana externa putativa 7, 8
cp0017
gi|4376731|gb|AAD18591.1| Familia de la proteína G/I de la membrana externa polimórfica gi|3329346|gb|AAC68469.1| Proteína G de la membrana externa putativa 9, 10
cp0018
gi|4376733|gb|AAD18593.1| Familia de la proteína G de la membrana externa polimórfica gi|3328840|gb|AAC68009.1| Proteína A de la membrana externa putativa 11, 12
cp0019
gi|4376731|gb|AAD18591.1| Familia de la proteína G/I de la membrana externa polimórfica gi|3329346|gb|AAC68469.1| Proteína G de la membrana externa putativa 13, 14
cp0468
gi|4376754|gb|AAD18611.1| Proteína de la membrana externa polimórfica (desplazamiento de marco con C gi|3329344|gb|AAC68467.1| Proteína E de la membrana externa putativa 15, 16
cp6260
gi|4376260|gb|AAD18163.1| Familia de la proteína G de la membrana externa polimórfica gi|3329346|gb|AAC68469.1| Proteína G de la membrana externa putativa 17, 18
cp6262
gi|4376262|gb|AAD18165.1| Proteína hipotética gi|3328765|gb|AAC67940.1| Proteína hipotética 19, 20
cp6269
gi|4376269|gb|AAD18171.1| Proteína hipotética gi|3328825|gb|AAC67995.1| Proteína hipotética 21, 22
(continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación)
Ref. 18
Número de acceso y anotación de C. pneumoniae Número de acceso y anotación de C. trachomatis SEC ID
cp6270
gi|4376270|gb|AAD18172.1| Familia de la proteína G de la membrana externa polimórfica gi|3329350|gb|AAC68472.1| Proteína I de la membrana externa putativa 23, 24
cp6272
gi|4376272|gb|AAD18173.1| OMP predicha {péptido conductor: membrana externa} gi|3328772|gb|AAC67946.1| Proteína hipotética 25, 26
cp6273
gi|4376273|gb|AAD18174.1| OMP predicha {péptido conductor} gi|3328771|gb|AAC67945.1| Proteína hipotética 27, 28
cp6296
gi|4376296|gb|AAD18195.1| Proteína hipotética gi|3326520|gb|AAC67712.1| Ribulosa-P epimerasa 29, 30
cp6362
gi|4376362|gb|AAD18254.1| Proteína hipotética de la familia YbbP gi|3328401|gb|AAC67602.1| Proteína hipotética 31, 32
cp6372
gi|4376372|gb|AAD18263.1| Peptidasa señal I gi|3328410|gb|AAC67610.1| Peptidasa señal I 33, 34
cp6397
gi|4376397|gb|AAD18286.1| Proteína hipotética CHLPS gi|3328506|gb|AAC67700.1| Proteína hipotética CHLPS 35, 36
cp6402
gi|4376402|gb|AAD18290.1| Familia ACR gi|3328505|gb|AAC67699.1| Familia ACR 37, 38
cp6419
gi|4376419|gb|AAD18305.1| Proteína hipotética CT149 gi|3328551|gb|AAC67740.1| Posible hidrolasa 39, 40
cp6446
gi|4376446|gb|AAD18330.1| Proteína de unión a oligopéptido gi|3329261|gb|AAC68390.1| Proteína hipotética 41, 42
cp6466
gi|4376466|gb|AAD18348.1| Proteína de unión a oligopéptido gi|3328604|gb|AAC67790.1| Proteína de unión a oligopéptido 43, 44
cp6467
gi|4376467|gb|AAD18349.1| Proteína de unión a oligopéptido gi|3328604|gb|AAC67790.1| Proteína de unión a oligopéptido 45, 46
cp6468
gi|4376468|gb|AAD18350.1| Unión a oligopéptido gi|3328539|gb|AAC67730.1| Proteína de unión a oligopéptido 47, 48
cp6469
gi|4376469|gb|AAD18351.1| Polisacárido de proteína de unión a oligopéptido gi|3328579|gb|AAC67766.1| Proteína de unión a oligopéptido permeasa 49, 50
cp6520
gi|4376520|gb|AA018398.1| Familia de repetición hidrolasa-invasina gi|3328526|gb|AAC67718.1| Familia de repetición hidrolasa-invasina de polisacáridos predicha 51, 52
cp6567
gi|4376567|gb|AAD18441.1| Proteína C de la membrana de inclusión gi|3328642|gb|AAC67825.1| Proteína C de la membrana de inclusión 53, 54
cp6576
gi|4376576|gb|AAD18449.1| Análogo de Omp85 gi|3328651|gb|AAC67834.1| Análogo de Omp85 55, 56
cp6577
gi|4376577|gb|AAD18450.1| (Proteína de la membrana externa similar a OmpH) gi|3328652|gb|AAC67835.1| (Proteína de la membrana externa similar a OmpH) 57, 58
cp6601
gi|4376601|gb|AAD18472.1| Respuesta D baja en calcio gi|3328486|gb|AAC67681.1| Respuesta D baja en calcio 59, 60
cp6602
gi|4376602|gb|AAD18473.1| Respuesta E baja en calcio gi|3328485|gb|AAC67680.1| Respuesta E baja en calcio 61, 62
Ref. 18
Número de acceso y anotación de C. pneumoniae Número de acceso y anotación de C. trachomatis SEC ID
cp6607
gi|4376607|gb|AAD18478.1| Superfamilia de la fosfolipasa D gi|3328479|gb|AAC67675.1| Superfamilia de la fosfolipasa D {péptido conductor (33)} 63, 64
cp6615
gi|4376615|gb|AAD18485.1| Proteína hipotética YojL gi|3328472|gb|AAC67668.1| Proteína hipotética 65, 66
cp6624
gi|4376624|gb|AAD18493.1| Familia de unión a proteínas de soluto gi|3328461|gb|AAC67658.1| Familia de unión a proteínas de soluto 67, 68
cp6639
gi|4376639|gb|AAD18507.1| Proteína de secreción fragelar gi|3328453|gb|AAC67651.1| Proteína de secreción fragelar 69, 70
cp6664
gi|4376664|gb|AAD18529.1| Leucil aminopeptidasa A gi|3328437|gb|AAC67636.1| Leucil aminopeptidasa A 71, 72
cp6672
gi|4376672|gb|AA018537.1| Proteína de dominio CBS (homóloga a hemolisina) gi|3328667|gb|AAC67849.1| Proteína hipotética que contiene dominios CBS 73, 74
cp6679
gi|4376679|gb|AAD18543.1| Proteína hipotética CT253 gi|3328664|gb|AAC67846.1| Proteína hipotética 0 75, 76
cp6696
gi|4376696|gb|AAD18559.1| Proteína hipotética CT266 gi|3328678|gb|AAC67859.1| Proteína hipotética 77, 78
cp6717
gi|4376717|gb|AAD18579.1| Superfamilia de la fosfolipasa D gi|3328698|gb|AAC67877.1| Superfamilia de la fosfolipasa D 79,80
cp6727
gi|4376727|gb|AAD18588.1| Familia de la proteína G/I de la membrana externa polimórfica gi|3329346|gb|AAC68469.1| Proteína G de la membrana externa putativa 81, 82
cp6728
gi|4376728|gb|AAD18589.1| Familia de la proteína G de la membrana externa polimórfica gi|3329346|gb|AAC68469.1| Proteína G de la membrana externa putativa 83,84
cp6729
gi|4376729|gb|AAD18590.1| Familia de la proteína G de la membrana externa polimórfica gi|3329350|gb|AAC68472.1| Proteína I de la membrana externa putativa 85, 86
cp6731
gi|4376731|gb|AAD18591.1| Familia de la proteína G/I de la membrana externa polimórfica gi|3329350|gb|AAC68472.1| Proteína I de la membrana externa putativa 87, 88
cp6733
gi|4376733|gb|AAD18593.1| Familia de la proteína G de la membrana externa polimórfica gi|3328840|gb|AAC68009.1| Proteína A de la membrana externa putativa 89, 90
cp6735
gi|4376735|gb|AAD18594.1| Familia de la proteína A/I (truncada) de la membrana externa polimórfica gi|3328840|gb|AAC68009.1| Proteína A de la membrana externa putativa 91, 92
cp6736
gi|4376736|gb|AAD18595.1| Familia de la proteína G de la membrana externa polimórfica gi|3329346|gb|AAC68469.1| Proteína G de la membrana externa putativa 93,94
cp6737
gi|4376737|gb|AAD18596.1| Familia de la proteína H de la membrana externa polimórfica gi|3329347|gb|AAC68470.1| Proteína H de la membrana externa putativa 95, 96
cp6751
gi|4376751|gb|AAD18608.1| Familia de la proteína E de la membrana externa polimórfica gi|3329344|gb|AAC68467.1| Proteína E de la membrana externa putativa 97, 98
Ref. 18
Número de acceso y anotación de C. pneumoniae Número de acceso y anotación de C. trachomatis SEC ID
cp6752
gi|4376752|gb|AAD18609.1| Familia de la proteína E de la membrana externa polimórfica gi|3329344|gb|AAC68467.1| Proteína E de la membrana externa putativa 99,100
cp6753
gi|4376753|gb|AAD18610.1| Familia de la proteína E/F de la membrana externa polimórfica gi|3329344|gb|AAC68467.1| Proteína E de la membrana externa putativa 101, 102
cp6757
gi|4376757|gb|AAD18613.1| Proteína hipotética gi|3328701|gb|AAC67880.1| ATPasa de la superfamilia de bucle PP 103,10 4
cp6767
gi|4376767|gb|AAD18622.1| Proteína de unión a arginina periplásmica gi|3328806|gb|AAC67977.1| Proteína de unión a arginina 105, 106
cp6790
gi|4376790|gb|AAD18643.1| Proteína 70 de choque térmico gi|3328822|gb|AAC67993.1| HSP-70 107, 108
cp6802
gi|4376802|gb|AAD18654.1| Proteína hipotética CT427 gi|3328857|gb|AAC68024.1| Proteína hipotética 109,11 0
cp6814
gi|4376814|gb|AAD18665.1| Proteína hipotética CT398 gi|3328825|gb|AAC67995.1| Proteína hipotética 111,11 2
cp6829
gi|4376829|gb|AAD18679.1| Familia de la proteína A de la membrana polimórfica gi|3328840|gb|AAC68009.1| Proteína A de la membrana externa putativa 113, 114
cp6830
gi|4376830|gb|AAD18680.1| Familia de la proteína B de la membrana polimórfica gi|3328841|gb|AAC68010.1| Proteína B de la membrana externa putativa 115,11 6
cp6832
gi|4376832|gb|AAD18681.1| Proteína de unión a soluto gi|3328844|gb|AAC68012.1| Proteína de unión a soluto 117, 118
cp6834
gi|4376834|gb|AAD18683.1| (Proteasa de transporte de metales) gi|3328846|gb|AAC68014.1| (Proteína de transporte de metales) 119, 120
cp6847
gi|4376847|gb|AAD18695.1| Proteína rica en cisteína de kDa específica para la cola gi|3328872|gb|AAC68040.1| Proteasa específica para la cola 121,12 2
cp6848
gi|4376848|gb|AAD18696.1| 15 OMP gi|3328873|gb|AAC68041.1| Proteína rica en cisteína de 15 kDa 123,12 4
cp6849
gi|4376849|gb|AAD18697.1| Rica en cisteína de 60 kDa gi|3328874|gb|AAC68042.1| OMP rica en cisteína de 60 kDa 125,12 6
cp6850
gi|4376850|gb|AAD18698.1| Lipoproteína rica en cisteína de 9 kDa gi|3328876|gb|AAC68043.1| Lipoproteína rica en cisteína de 9 kDa 127, 128
cp6878
gi|4376878|gb|AAD18723.1| Sensor IncA de 2 componentes gi|3328901|gb|AAC68067.1| Histidina cinasa del sensor del sistema regulador de 2 componentes 129, 130
cp6879
gi|4376879|gb|AAD18724.1| Similitud con CHLPS gi|3328451|gb|AAC67649.1| Proteína hipotética 131, 132
cp6884
gi|4376884|gb|AAD18729.1| Proteína hipotética CT471 gi|3328905|gb|AAC68071.1| Proteína hipotética 133,13 4
cp6886
gi|4376886|gb|AAD18731.1| Familia YidD gi|3328908|gb|AAC68073.1| Proteína hipotética 135, 136
cp6890
gi|4376890|gb|AAD18734.1| Proteína hipotética CT476 gi|3328911|gb|AAC68076.1| Proteína hipotética 137,13 8
Ref. 18
Número de acceso y anotación de C. pneumoniae Número de acceso y anotación de C. trachomatis SEC ID
cp6892
gi|4376892|gb|AAD18736.1| Oligopéptido permeasa gi|3328913|gb|AAC68078.1| Histidina cinasa de sensor 139, 140
cp6894
gi|4376894|gb|AAD18738.1| Lipoproteína de unión a oligopéptido gi|3328915|gb|AAC68080.1| Lipoproteína de unión a oligopéptido 141, 142
cp6900
gi|4376900|gb|AAD18743.1| Proteína de unión a glutamina gi|3328922|gb|AAC68086.1| Proteína de unión a glutamina 143, 144
cp6909
gi|4376909|gb|AAD18752.1| Proteasa gi|6578107|gb|AAC68094.2| Proteasa 145,14 6
cp6952
gi|4376952|gb|AAD18792.1| Apolipoproteína N-acetiltransferasa gi|3328972|gb|AAC68136.1| Apolipoproteína N-acetiltransferasa 147,14 8
cp6960
gi|4376960|gb|AAD18800.1| Peptidil-prolil cistrans isomerasa de tipo FKBP gi|3328979|gb|AAC68143.1| Peptidil-prolil cis-trans isomerasa de tipo FKBP 149,15 0
cp6968
gi|4376968|gb|AAD18807.1| Proteína hipotética CT547 gi|3328986|gb|AAC68149.1| Proteína hipotética 151, 152
cp6969
gi|4376969|gb|AAD18808.1| Proteína hipotética CT548 gi|3328987|gb|AAC68150.1| Proteína hipotética 153,15 4
cp6998
gi|4376998|gb|AAD18834.1| Proteína de la membrana externa principal gi|3329133|gb|AAC68276.1| Proteína de la membrana externa principal 155,15 6
cp7005
gi|4377005|gb|AAD18841.1| Proteína D de secreción de YopC/Gen gi|3329125|gb|AAC68269.1| Proteínas de translocación de proteínas Yop probables 157,15 8
cp7015
gi|4377015|gb|AAD18851.1| Dominio FHA; (homología con adenilato ciclasa) gi|3329115|gb|AAC68259.1| (Dominio FHA; homología con adenilato ciclasa) 159,16 0
cp7033
gi|4377033|gb|AAD18867.1| Homólogo_1 de 76 kDa a CHLPN (CT622) gi|3329069|gb|AAC68226.1| Homólogo de 76 kDa de CHLPN 161,16 2
cp7034
gi|4377034|gb|AAD18868.1| Homólogo_2 de 76 kDa de CHLPN (CT623) gi|6578109|gb|AAC68227.2| Homólogo de 76 kDa de CHLPN 163, 164
cp7035
gi|4377035|gb|AAD16869.1| Proteína de la membrana integral gi|3329071|gb|AAC68228.1| Proteína de la membrana integral 165, 166
cp7072
gi|4377072|gb|AAD18902.1| Proteína hipotética CT648 gi|3329097|gb|AAC68825.1| Proteína hipotética 167,16 8
cp7073
gi|4377073|gb|AAD18903.1| Proteína hipotética CT647 gi|3329096|gb|AAC68824.1| Proteína hipotética 169, 170
cp7085
gi|4377085|gb|AAD18914.1| Proteína hipotética CT605 gi|3329050|gb|AAC68208.1| Proteína hipotética 171,17 2
cp7090
gi|4377090|gb|AAD18919.1| Lipoproteína asociada a peptidoglicano gi|3329044|gb|AAC68202.1| Lipoproteína asociada a peptidoglicano 173, 174
cp7091
gi|4377091|gb|AAD18920.1| Transportador de macromoléculas gi|3329043|gb|AAC68201.1| Componente de un sistema transportador de macromoléculas 175, 176
cp7092
gi|4377092|gb|AAD18921.1| Proteína hipotética CT598 gi|3329042|gb|AAC68200.1| Proteína hipotética 177, 178
cp7093
gi|4377093|gb|AAD18922.1| Proteína transportadora de biopolímeros gi|3329041|gb|AAC68199.1| Proteína transportadora de biopolímeros 179, 180
Ref. 18
Número de acceso y anotación de C. pneumoniae Número de acceso y anotación de C. trachomatis SEC ID
cp7094
gi|4377094|gb|AAD18923.1| Transportador de macromoléculas gi|3329040|gb|AAC68198.1| Transportador de polisacáridos 181, 182
cp7101
gi|4377101|gb|AAD18929.1| Proteína hipotética CT590 gi|3329033|gb|AAC68192.1| Proteína hipotética 183,18 4
cp7102
gi|4377102|gb|AAD18930.1| Proteína hipotética CT589 gi|3329032|gb|AAC68191.1| Proteína hipotética 185,18 6
cp7106
gi|4377106|gb|AAD18933.1| Proteína hipotética gi|3328796|gb|AAC67968.1| Proteína hipotética 187, 188
cp7111
gi|4377111|gb|AAD18938.1| Enolasa gi|3329030|gb|AAC68189.1| Enolasa 189,19 0
cp7127
gi|4377127|gb|AAD18953.1| Proteína D de secreción general gi|3329013|gb|AAC68174.1| Proteína D de secreción general 191,19 2
cp7130
gi|4377130|gb|AAD18956.1| OMP predicha {péptido conductor} gi|3329010|gb|AAC68171.1| OMP predicha 193, 194
cp7132
gi|4377132|gb|AAD18958.1| Proteína hipotética CT567 gi|3329008|gb|AAC68169.1| Proteína hipotética 195,19 6
Cp7133
gi|4377133|gb|AAD18959.1| Proteína hipotética CT566 gi|3329007|gb|AAC68168.1| Proteína hipotética 197,19 8
Cp7140
gi|4377140|gb|AAD18965.1| Translocalización J de Yop gi|3329000|gb|AAC68161.1| Lipoproteína J de translocalización de proteínas Yop 199,20 0
Cp7170
gi|4377170|gb|AAD18992.1| Proteína B de la membrana externa gi|3329169|gb|AAC68308.1| Análogo a proteína de la membrana externa 201, 202
Cp7177
gi|4377177|gb|AAD18998.1| Proteína de anillo M flagelar gi|3329175|gb|AAC68314.1| Proteína de anillo M flagelar 203, 204
Cp7182
gi|4377182|gb|AAD19003.1| Proteína hipotética CT724 gi|3329181|gb|AAC68319.1| Proteína hipotética 205, 206
Cp7184
gi|4377184|gb|AAD19005.1| Proteína en forma de bastón gi|3329183|gb|AAC68321.1| Proteína en forma de bastón 207, 208
Cp7193
gi|4377193|gb|AAD19013.1| Proteína hipotética CT734 gi|3329192|gb|AAC68329.1| Proteína hipotética 209, 210
Cp7206
gi|4377206|gb|AAD19025.1| Posible fosfoproteína CHLTR gi|3329204|gb|AAC68339.1| Posible fosfoproteína CHLTR 211, 212
Cp7222
gi|4377222|gb|AAD190401.1| Muramidasa (familia de repetición de invasina) gi|3329221|gb|AAC68354.1| Muramidasa (familia de repetición de invasina) 213, 214
Cp7223
gi|4377223|gb|AAD19041.1| Proteína FtsW de la división celular gi|3329222|gb|AAC68355.1| Proteína FtsW de la división celular 215, 216
Cp7224
gi|4377224|gb|AAD19042.1| Peptidoglicano transferasa gi|3329223|gb|AAC68356.1| Peptidoglicano transferasa 217, 218
Cp7225
gi|4377225|gb|AAD19043.1| Muramato-Alaligasa y D-Ala-D-Ala-ligasa gi|3329224|gb|AAC68357.1| UDP-Nacetilmuramato-alanina-ligasa 219, 220
Cp7248
gi|4377248|gb|AA019064.1| Disulfuro de tiorredoxina isomerasa gi|3329244|gb|AAC68375.1| Disulfuro de tiorredoxina isomerasa 221, 222
Ref. 18
Número de acceso y anotación de C. pneumoniae Número de acceso y anotación de C. trachomatis SEC ID
Cp7261
gi|4377261|gb|AA019076.1| Proteína hipotética CT788-{péptido conductorperiplásmico gi|3329253|gb|AAC68383.1| {péptido conductor (60)-periplásmico } 223,22 4
Cp7280
gi|4377280|gb|AAD19093.1| Familia de la insulinasa/proteasa III gi|3329273|gb|AAC68402.1| Familia de la insulinasa/proteasa III 225, 226
Cp7287
gi|4377287|gb|AA019099.1| Familia de la proteína D de la membrana externa putativa gi|3329279|gb|AAC66408.1| Proteína D de la membrana externa putativa 227, 228
Cp7306
gi|4377306|gb|AAD19116.1| Serina proteasa DO gi|3329293|gb|AAC68420.1| Serina proteasa DO 229,23 0
Cp7342
gi|4377342|gb|AAD19149.1| ABC transportadora permeasa gi|3329327|gb|AAC68451.1| ABC transportadora permeasa – proteína de la biosíntesis de pirimidina 231, 232
Cp7347
gi|4377347|gb|AAD19153,1| Proteína hipotética CT858 gi|6578118|gb|AAC68456.2| Proteasa predicha que contiene dominios IRBP y DHR 233, 234
Cp7353
gi|4377353|gb|AAD19159.1| Proteína hipotética CT863 gi|329337|gb|AAC68461.1| Proteína hipotética 235,23 6
Cp7367
gi|4377367|gb|AAD19171.1| OMP predicha gi|3328795|gb|AAC67967.1| Proteína hipotética 237, 238
Cp7408
gi|4377408|gb|AAD19209.1| Proteína hipotética gi|3328795|gb|AAC67967.1| Proteína hipotética 239, 240
Cp7409
gi|4377409|gb|AAD19210.1| Protein de la membrana externa predicha (CT371) gi|3328795|gb|AAC67967.1| Proteína hipotética 241, 242
gi|4376411|gb|
gi|3328512|gb|AAC67705.1| Proteína hipotética 243, 244
gi|4376508|gb|
gi|3328585|gb|AAC67772.1| Proteína hipotética 245, 246
gi|4376710|gb|
gi|3328692|gb|AAC67872.1| NADH (ubiquinona) oxidorreductasa, gamma 247, 248
gi|4376777|gb|
gi|3328815|gb|AAC67986.1| Proteína hipotética 249, 250
gi|4376782|gb|
gi|3328817|gb|AAC67988.1| Proteína hipotética 251,25 2
gi|4376863|gb|
gi|3328887|gb|AAC68054.1| Arginil ARNt transferasa 253, 254
gi|4376866|gb|
gi|3328889|gb|AAC68056.1| Proteína hipotética 255, 256
gi|4376972|gb|
gi|3328991|gb|AAC68153.1| D-Ala-D-Ala carboxipeptidasa 257, 258
gi|4377139|gb|
gi|3329001|gb|AAC68162.1| Proteína hipotética 259,26 0
gi|4371154|gb|
gi|3329154|gb|AAC68295.1| Proteína hipotética 261,26 2
TABLA II
CT
Tipo de fusión 50 % de título de neutralización % de neutralización de la infectividad de CE para cultivos de células LLCMK2 a diluciones de suero especificadas
1/40
1/160 1/640 1/2560
CT045
HIS 1:160 32 50 18
CT089
HIS 44 37 0
GST
6 25 37
CT114
HIS 0 18
CT181
GST 19 0
CT198
HIS 19 0 13
CT241
HIS 5 42
CT242
HIS 1:100 58 45 0
GST
46 24 40
CT350
GST 0 39
CT351
HIS 1 5
CT381
HIS 1:450 67 56 48
GST
24 0 0
CT391
HIS 0 14
CT396
HIS 1:300 55 62 35
GST
8 33 25
CT398
HIS 1:640 57 45 50
GST
1:> 640 68 60 60
CT415
GST 21 21
CT427
HIS 25 13 3 13 3
CT443
HIS 25 25
CT454
HIS 16 4
CT467
GST 1:1100 65 67 62 48
CT541
GST 10 24 13
CT547
HIS 1:40 50 13 18
GST
0 0 18
CT551
HIS 5 11
CT559
HIS 20 23
CT567
0 26
CT569
HIS 0 5
CT587
HIS 1:1200 51 61 56 42
(continuación)
CT
Tipo de fusión 50 % de título de neutralización % de neutralización de la infectividad de CE para cultivos de células LLCMK2 a diluciones de suero especificadas
1/40
1/160 1/640 1/2560
CT589
HIS 37 21
GST
0 33
CT597
GST 0 4
CT600
HIS 0 11
CT647
GST 15 0
CT681
HIS 1:160 95 53
CT713
HIS 10 10
CT761
GST 0 16
CT823
HIS 5 23
NN-GST
0 0 0
NN-HIS
0 0 0
LISTA DE SECUENCIAS
<110> NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS S.R.L.
<120> INMUNIZACIÓN CONTRA CHLAMYDIA TRACHOMATIS
<130> P049248EP
<140> EP 02790667.6
<141> 2002-12-12
<140> PCT/IB02/05761
<141> 2002-12-12
<150> GB 0129732.4
<151> 2001-12-12
<150> GB 0218233.5
<151> 2002-08-06
<150> GB 0218924.9
<151> 2002-08-14
<160> 262
<170> SeqWin99, versión 1.02
<210> 1
<211> 1013
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 1
<210> 2
<211> 3042
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 2
<210> 3
<211> 1013
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 3
<210> 4
<211> 3042
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 4
<210> 5
<211> 1013
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 5
<210> 6
<211> 3042
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 6
<210> 7
<211> 878
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 7
<210> 8
<211> 2637
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 8
<210> 9
<211> 1013
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 9
<210> 10
<211> 3042
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 10
<210> 11
<211> 975
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 11
<210> 12
<211> 2928
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 12
<210> 13
<211> 1013
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 10
<400> 13
<210> 14
<211> 3042
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 14
<210> 15
<211> 964
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 15
<210> 16
<211> 2895
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 16
<210> 17
<211> 1013
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 17
<210> 18
<211> 3042
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 18
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 19
<210> 20
<211> 366
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 20
<210> 21
<211> 254
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
<400> 21
<210> 22
<211> 765
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 22
<210> 23
<211> 878
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 23
<210> 24
<211> 2637
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 24
<210> 25 10 <211> 697
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 25
<210> 26
<211> 2094
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 26
<210> 27
<211> 566
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
<400> 27
<210> 28
<211> 1701
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 28
<210> 29
<211> 233
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 29
<210> 30
<211> 702
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 30
<210> 31
<211> 264
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 31
<210> 32
<211> 795
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 32
<210> 33
<211> 628
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
<400> 33
<210> 34
<211> 1887
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 34
<210> 35
<211> 262
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 35
<210> 36
<211> 789
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 36
<210> 37
<211> 251
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 37
<210> 38
<211> 756
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 38
<210> 39
<211> 315
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
<400> 39
<210> 40
<211> 948
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 40
<210> 41
<211>
163 10 <212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 41
<210> 42
<211> 492
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 42
<210> 43
<211>
518 10 <212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 43
<210> 44
<211> 1557 <212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<210> 45
<211> 518
<212> PRT 10 <213> Chlamydia trachomatis
<400> 45
<210> 46
<211> 1557
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 46
<210> 47
<211> 426
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
<400> 47
<210> 48
<211> 1281
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 48
<210> 49
<211> 529
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
<400> 49
<210> 50
<211> 1590
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 50
<210> 51
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<212> PRT
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Chlamydia trachomatis 15
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<212> PRT
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<212> ADN
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<212> PRT
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Chlamydia trachomatis 15
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<210> 204
<211> 1005
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 204
<210> 205
<211> 174
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 205
<210> 206
<211> 525
<212> ADN
<213>
Chlamydia trachomatis 15
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<210> 207 5 <211> 379
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
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<210> 208
<211> 1140
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
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<211> 221
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis 15
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<211> 666
<212> ADN
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<210> 211
<211> 821
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 211
<210> 212
<211> 2466
<212> ADN
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<210> 213
<211> 245
<212> PRT
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<212> ADN
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<210> 215
<211> 385
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
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<211> 1158
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
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<211> 352 10 <212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 217
<210> 218
<211> 1059
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
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<211> 803
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
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<211> 2412
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
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<211> 164
<212> PRT
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<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
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<211> 166
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
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<211> 501
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 224
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<211> 956
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
<400> 225
<210> 226
<211> 2871
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 226
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<211> 1531
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
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<210> 228
<211> 4596
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 228
<210> 229
<211> 497
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
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<211> 1494
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 230
10 <210> 231
<211> 589
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
15 <400> 231
<210> 232
<211> 1770
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 232
<210> 233
<211> 601
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 233
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<211> 1806
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
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<211> 482
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
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<211> 1449
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 236
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<211> 261
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
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<210> 238
<211> 786
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 238
<210> 239
<211> 261
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 239
<210> 240
<211> 786
<212> ADN
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<400> 240
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<211> 261
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 241
<210> 242
<211> 786
<212> ADN
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<211> 486
<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
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<211> 1461
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
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<212> PRT
<213>
Chlamydia trachomatis 15
<400> 245
<210> 246
<211> 711
<212> ADN
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<400> 246
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<211> 316
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 247
<210> 248
<211> 951
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 248
10 <210> 249
<211> 408
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
15 <400> 249
<210> 250
<211> 1227
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
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<210> 251
<211> 335
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
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<210> 252
<211> 1008
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
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<210> 253 10 <211> 563
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
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<210> 254
<211> 1692
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 254
<210> 255
<211> 1005
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 255
<210> 256
<211> 3018
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 256
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<211> 343
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 257
<210> 258
<211> 1032
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 258
<210> 259
<211> 278
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 259
<210> 260
<211> 837
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 260
<210> 261
<211> 441
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 261
<210> 262
<211> 1326
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 262

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una proteína para su uso en el tratamiento o la prevención de infección debida a Chlamydia trachomatis, en la que la proteína es (a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID 255, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 50 % o más con la secuencia de aminoácidos de (a), o (c) una proteína que comprende un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de SEC ID 255.
  2. 2.
    Un ácido nucleico para su uso en el tratamiento o la prevención de infección debida a Chlamydia trachomatis, en el que el ácido nucleico es (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID 256, (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 50 % o más con la secuencia de nucleótidos de (a), o (c) un ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 10 nucleótidos consecutivos de SEC ID 256.
  3. 3.
    Una proteína de la reivindicación 1 o un ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que el tratamiento o la prevención comprende provocar una respuesta inmunitaria que es específica para un cuerpo elemental de Chlamydia.
  4. 4.
    Una proteína como se define en la reivindicación 1 o un ácido nucleico como se define en la reivindicación 2, en la que el tratamiento o la prevención comprende neutralizar cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis.
  5. 5.
    Una composición inmunogénica que comprende una proteína y un adyuvante, en la que la proteína es (a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID 255, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 50 % o más con la secuencia de aminoácidos de (a), o (c) una proteína que comprende un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de SEC ID 255.
  6. 6.
    Una composición inmunogénica que comprende un ácido nucleico y un adyuvante, en la que el ácido nucleico es
    (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID 256, (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 50 % o más con la secuencia de nucleótidos de (a), o (c) un ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 10 nucleótidos consecutivos de SEC ID
  7. 256.
  8. 7.
    La composición de la reivindicación 5 o la reivindicación 6 para su uso como producto farmacéutico.
  9. 8.
    Una composición de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, o un anticuerpo que reconoce una proteína como se define en la reivindicación 1 para su uso en un procedimiento de neutralización de infectividad de C. trachomatis en un paciente.
  10. 9.
    Una composición de la reivindicación 5 o la reivindicación 6 para su uso en un procedimiento de inmunización de un paciente contra Chlamydia trachomatis.
  11. 10.
    Una composición de la reivindicación 5 o la reivindicación 6 para su uso en un procedimiento de producción de anticuerpos específicos para cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis.
  12. 11.
    Un cuerpo elemental de Chlamydia trachomatis para su uso en un procedimiento de producción de anticuerpos en un paciente que reconocen una proteína como se define en la reivindicación 1.
  13. 12.
    Un procedimiento para detectar un cuerpo elemental de Chlamydia trachomatis en una muestra biológica, que comprende la etapa de poner en contacto la muestra con un anticuerpo que reconoce una proteína como se define en la reivindicación 1.
  14. 13.
    Uso de una proteína como se define en la reivindicación 1 o un ácido nucleico como se define en la reivindicación 2 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infección debida a
    Chlamydia trachomatis.
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