ES2374572T3 - Tripéptidos como inhibidores del virus de la hepatitis c. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que n es 1, 2 ó 3; R1 se selecciona entre hidroxi y -NHSO2R7; R2 se selecciona entre hidrógeno, alquenilo, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, y haloalquilo; R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; R4 es hidroxi; R5 se selecciona entre alquenilo, alcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, alquilo, arilalquilo, carboxialquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, hidroxialquilo, y (NRaRb)alquilo; R6 se selecciona entre alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, arilo, cicloalquilo, heterociclilo, (NRaRb)carbonilo, y (NRaRb)sulfonilo; R7 se selecciona entre alquilo, arilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo, y -NRcRd; Ra y Rb se seleccionan independientemente entre alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; y Rc y Rd se seleccionan independientemente entre alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; o Rc y Rd junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico monocíclico de cinco o seis miembros.

Description

Tripéptidos como inhibidores del virus de la hepatitis c

La presente divulgación se refiere en general a compuestos antivirales, y más específicamente se refiere a compuestos que inhiben la función de la proteasa NS3 (también denominada en el presente documento "serina proteasa") codificada por el virus de la hepatitis C (VHC), a composiciones que comprenden dichos compuestos, y a procedimientos para inhibir la función de la proteasa NS3.

El VHC es un patógeno humano principal, que se estima que infecta a 170 millones de personas en todo el mundo aproximadamente cinco veces el número de infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. Una fracción importante de estos individuos infectados por VHC desarrolla una hepatopatía progresiva grave, incluyendo cirrosis y carcinoma hepatocelular.

Actualmente, la terapia del VHC más eficaz emplea una combinación de alfa-interferón y ribavirina, que conduce a una eficacia mantenida en el 40% de los pacientes. Los resultados clínicos recientes demuestran que el alfainterferón pegilado es superior al alfa-interferón no modificado como monoterapia. Sin embargo, incluso con regímenes terapéuticos experimentales que implican combinaciones de alfa-interferón pegilado y ribavirina, una fracción importante de pacientes no tienen una reducción mantenida en la carga vírica. Por lo tanto, existe una necesidad clara y no satisfecha de desarrollar agentes terapéuticos eficaces para el tratamiento de una infección por VHC.

El VHC es un virus ARN de cadena positiva. Basándose en una comparación de la secuencia de aminoácidos deducida y en la amplia similitud de la región no traducida 5', el VHC se ha clasificado como un género separado en la familia Flaviviridae. Todos los miembros de la familia Flaviviridae tienen viriones con envuelta que contienen un genoma de ARN de cadena positiva que codifica todas las proteínas específicas de virus conocidas por traducción de una sola fase de lectura abierta no interrumpida.

Se encuentra una heterogeneidad considerable dentro de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos codificada a lo largo de todo el genoma del VHC. Se han caracterizado seis genotipos principales, y se han descrito más de 50 subtipos. Los genotipos principales del VHC difieren en su distribución mundial, y la importancia clínica de la heterogeneidad genética del VHC continúa siendo difícil de determinar a pesar de numerosos estudios del posible efecto de los genotipos sobre la patogénesis y la terapia.

El genoma de ARN monocatenario del VHC es de aproximadamente 9500 nucleótidos de longitud y tiene una sola fase de lectura abierta (ORF) que codifica una sola poliproteína grande de aproximadamente 3000 aminoácidos. En células infectadas, esta poliproteína se escinde en múltiples sitios por proteasas celulares y virales para producir las proteínas estructurales y no estructurales (NS). En el caso del VHC, la generación de proteínas no estructurales maduras (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) se efectúa por dos proteasas virales. La primera escinde en la unión NS2-NS3; la segunda es una serina proteasa contenida dentro de la región N-terminal de NS3 y media todas las escisiones posteriores cadena abajo de NS3, tanto en cis, en el sitio de escisión NS3-NS4A, como en trans, para los sitios NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B restantes. La proteína NS4A parece servir a múltiples funciones, actuando como cofactor para la proteasa NS3 y contribuyendo posiblemente a la localización de membrana de NS3 y otros componentes de la replicasa viral. La formación del complejo de la proteína NS3 con NS4A es esencial para un procesamiento de poliproteína eficaz, aumentando la escisión proteolítica en todos los sitios. La proteína NS3 también muestra actividades de nucleósido trifosfatasa y ARN helicasa. NS5B es una ARN polimerasa dependiente de ARN que está implicada en la replicación del VHC. Los inhibidores de proteasas NS3/NS4a se conocen del documento WO 2004/113365.

La presente divulgación proporciona compuestos peptídicos que pueden inhibir el funcionamiento de la proteasa NS3, por ejemplo, en combinación con la proteasa NS4A. Además, la presente divulgación describe la administración de una terapia de combinación a un paciente, por la que un compuesto de acuerdo con la presente divulgación, que es eficaz para inhibir la proteasa NS3 del VHC, puede administrarse con otro compuesto que tiene actividad anti-VHC, por ejemplo, un compuesto que es eficaz para inhibir la función de una diana seleccionada de metaloproteasa del VHC, serina proteasa del VHC, polimerasa del VHC, helicasa del VHC, proteína NS4B del VHC, entrada del VHC, ensamblaje del VHC, salida del VHC, proteína NS5A del VHC e IMPDH para el tratamiento de una infección por VHC.

En una realización la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que

n es 1, 2 ó 3;

R1 se selecciona entre hidroxi y -NHSO2R7;

5 R2 se selecciona entre hidrógeno, alquenilo, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, y haloalquilo; R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; R4 es hidroxi; R5 se selecciona entre alquenilo, alcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, alquilo, arilalquilo, carboxialquilo, cianoalquilo,

10 cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, hidroxialquilo, y (NRaRb)alquilo; R6 se selecciona entre alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, arilo, cicloalquilo, heterociclilo, (NRaRb)carbonilo, y (NRaRb)sulfonilo; R7 se selecciona entre alquilo, arilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo, y -NRcRd; Ra y Rb se seleccionan independientemente entre alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, heterociclilo y

15 heterociclilalquilo; y Rc y Rd se seleccionan independientemente entre alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; o Rc y Rd junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico monocíclico de cinco o seis miembros;

con la condición de que cuando R4 es hidrógeno, R3 sea distinto de heterociclilo.

20 En otra realización la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (II)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que

n es 1, 2 ó 3; R2 se selecciona entre hidrógeno, alquenilo, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, y haloalquilo;

25 R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; R5 se selecciona entre alquenilo, alcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, alquilo, arilalquilo, carboxialquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, hidroxialquilo, y (NRaRb)alquilo; R6 se selecciona entre alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, arilo, cicloalquilo, heterociclilo,

30 (NRaRb)carbonilo, y -(NRaRb)sulfonilo; R7 se selecciona entre alquilo, arilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo, y -NRcRc; Ra y Rb se seleccionan independientemente entre alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; y Rc y Rd se seleccionan independientemente entre alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo,

35 heterociclilo y heterociclilalquilo; o Rc y Rd junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico monocíclico de cinco o seis miembros.

En otra realización la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (II), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que

n es 1; R2 es alquenilo; R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; R5 es alquilo; R6 es alcoxicarbonilo; y R7 es cicloalquilo.

10 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que

n es 1 ó 2; R2 se selecciona entre hidrógeno, alquenilo, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, y haloalquilo; R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, y heterociclilalquilo; R5 se selecciona entre alquenilo, alcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, alquilo, arilalquilo, carboxialquilo, cianoalquilo,

15 cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, hidroxialquilo, y (NRaRb)alquilo; R6 se selecciona entre alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, arilo, cicloalquilo, heterociclilo, (NRaRb)carbonilo, y -(NRaRb)sulfonilo; R7 se selecciona entre alquilo, arilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo, y -NRcRd; Ra y Rb se seleccionan independientemente entre alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, heterociclilo y

20 heterociclilalquilo; y Rc y Rd se seleccionan independientemente entre alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; o Rc y Rd junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico monocíclico de cinco o seis miembros.

En otra realización la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (III), o una sal farmacéuticamente 25 aceptable del mismo, en la que

n es 1; R2 es alquenilo; R3 se selecciona entre alquenilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, y (cicloalquil)alquilo; R5 es alquilo;

y

En otra realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición comprende además un interferón y ribavirina.

En otra realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, el segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC es un interferón. En otra realización, el interferón se selecciona de interferón alfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón de consenso, interferón alfa 2A e interferón linfoblastoide tau.

En otra realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC se selecciona de interleucina 2, interleucina 6, interleucina 12, un compuesto que aumenta el desarrollo de una respuesta de linfocitos T auxiliares de tipo 1, ARN interferente, ARN antisentido, imiquimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5'monofosfato deshidrogenasa, amantadina y rimantadina.

En otra realización, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un procedimiento de inhibición de la función de serina proteasa del VHC.

En otra realización, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un procedimiento de tratamiento de una infección por VHC en un paciente.

En otra realización, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un procedimiento de tratamiento de una infección por VHC en un paciente, que comprende usar un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC antes de, después de, o simultáneamente con el compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra realización, el segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC es un interferón. En otra realización, el interferón se selecciona de interferón alfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón de consenso, interferón alfa 2A e interferón linfoblastoide tau.

En otra realización, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un procedimiento de tratamiento de una infección por VHC en un paciente, que comprende usar un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC antes de, después de, o simultáneamente con el compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC se selecciona de interleucina 2, interleucina 6, interleucina 12, un compuesto que aumenta el desarrollo de una respuesta de linfocitos T auxiliares de tipo 1, ARN interferente, ARN antisentido, imiquimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5'-monofosfato deshidrogenasa, amantadina y rimantadina.

A menos que en el presente documento se indique específicamente de otra manera, los términos expuestos a continuación tendrán las siguientes definiciones.

Como se usa en el presente documento, las formas singulares, “un”, “una”, “el” y “la” incluyen las referencias plurales, a menos que el contexto claramente dicte lo contrario.

El término “alquenilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de cadena lineal o ramificada de dos a seis átomos de carbono, que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono.

El término “alcoxi”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo unido al resto molecular precursor a través de un átomo de oxígeno.

El término “alcoxialquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos alcoxi.

El término “alcoxicarbonilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alcoxi unido al resto molecular precursor a través de un grupo carbonilo.

El término “alcoxicarbonilalquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos alcoxicarbonilo.

El término “alquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada, que contiene de uno a diez átomos de carbono.

El término “alquilcarbonilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo carbonilo.

El término “alquilsulfonilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo unido al resto molecular precursor a través de un grupo sulfonilo.

El término “arilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo fenilo, o un sistema de anillo condensado bicíclico, en el que uno o ambos de los anillos es un grupo fenilo. Los sistemas de anillo condensado bicíclico consisten en un grupo fenilo condensado a un anillo carbocíclico, aromático o no aromático, de cuatro a seis miembros. Los grupos arilo de la presente divulgación pueden estar unidos al resto molecular precursor a través de cualquiera átomo de carbono sustituible en el grupo. Los ejemplos representativos de grupos arilo incluyen, aunque sin limitación, indanilo, indenilo, naftilo, fenilo y tetrahidronaftilo. Los grupos arilo de la presente divulgación pueden estar opcionalmente sustituido con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes seleccionados independientemente entre alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilo, un segundo grupo arilo, ciano, halo, haloalcoxi, haloalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, hidroxi, hidroxiaquilo, nitro, -NRxRy, (NRxRy)alcoxi, (NRxRy)alquilo, (NRxRy)carbonilo y oxo; en el que el segundo grupo arilo, el heterociclilo y la parte heterociclilo del heterociclilalquilo pueden estar opcionalmente adicionalmente sustituidos con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes seleccionados independientemente entre alcoxi, alquilo, ciano, halo, haloalcoxi, haloalquilo, hidroxi y nitro.

El término “arilalquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos

o tres grupos arilo.

El término “carbonilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a -C(O)-.

El término “carboxi”, como se usa en el presente documento, se refiere a -CO2H.

El término “carboxialquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos carboxi.

El término “ciano”, como se usa en el presente documento, se refiere a -CN.

El término “cianoalquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos ciano.

El término “cicloalquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de anillo de hidrocarburo monocíclico, bicíclico o tricíclico saturado, que tiene de tres a catorce átomos de carbono y cero heteroátomos. Los ejemplos representativos de los grupos cicloalquilo incluyen, aunque sin limitación, ciclopropilo, ciclopentilo, biciclo[3.1.1]heptilo y adamantilo. Los grupos cicloalquilo de la presente divulgación pueden estar opcionalmente sustituidos con uno, dos, tres o cuatro sustituyentes seleccionados independientemente entre alquenilo, alcoxi, alquilo, halo, haloalcoxi y haloalquilo.

El término “(cicloalquil)alquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos cicloalquilo.

Los términos “halo” y “halógeno”, como se usan en el presente documento, se refieren a F, Cl, Br e I.

El término “haloalcoxi”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo haloalquilo unido al resto molecular precursor a través de un átomo de oxígeno.

El término “haloalquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos, tres o cuatro átomos de halógeno.

El término “heterociclilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anillo de cinco, seis o siete miembros que contiene uno, dos o tres heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno, y azufre. El anillo de cinco miembros tiene de cero a dos dobles enlaces, y los anillos de seis, siete miembros tienen de cero a tres dobles enlaces. El término “heterociclilo” incluye también grupos bicíclicos en los que el anillo de heterociclilo está condensado a un anillo carbocíclico, aromático o no aromático, de cuatro a seis miembros u otro grupo heterociclilo monocíclico. Los grupos heterociclilo de la presente divulgación pueden estar unidos también al resto molecular precursor a través de un átomo de carbono o un átomo de nitrógeno en el grupo. Los ejemplos de grupos heterociclilo incluyen, aunque sin limitación, benzotienilo, furilo, imidazolilo, indolinilo, indolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo, oxazolilo, piperazinilo, piperidinilo, pirazolilo, piridinilo, pirrolidinilo, pirrolopiridinilo, pirrolilo, tiazolilo, tienilo y tiomorfolinilo. Los grupos heterociclilo de la presente divulgación puede estar opcionalmente sustituidos con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes seleccionados independientemente entre alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilo, arilo, ciano, halo, haloalcoxi, haloalquilo, un segundo grupo heterociclilo, heterociclilalquilo, hidroxi, hidroxialquilo, nitro, -NRxRy, (NRxRy)alcoxi, (NRxRy)alquilo, (NRxRy) carbonilo y oxo; en el que el arilo, el segundo grupo heterociclilo y la parte heterociclilo del heterociclilalquilo pueden esta opcionalmente adicionalmente sustituidos con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes seleccionados independientemente entre alcoxi, alquilo, ciano, halo, haloalcoxi, haloalquilo, hidroxi y nitro.

El término “heterociclilalquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos heterociclilo.

El término “hidroxi”, como se usa en el presente documento, se refiere a -OH.

El término “hidroxialquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos hidroxi.

El término “-NRaRb”, como se usa en el presente documento, se refiere a dos grupos, Ra y Rb, que están unidos al resto molecular precursor a través de un átomo de nitrógeno. Ra y Rb se seleccionan independientemente entre alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil) alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo.

El término “(NRaRb)alquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos NRaRb.

El término “(NRaRb)carbonilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo NRaRb unido al resto molecular precursor a través de un grupo carbonilo.

El término “(NRaRb)sulfonilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo NRaRb unido al resto molecular precursor a través de un grupo sulfonilo.

El término “-NRcRd”, como se usa en el presente documento, se refiere a dos grupos Rc y Rd, que están unidos al resto molecular precursor a través de un átomo de nitrógeno. Rc y Rd se seleccionan independientemente entre alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; o Rc y Rd, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico monocíclico de cinco o seis miembros.

El término “-NRxRy”, como se usa en el presente documento, se refiere a dos grupos, Rx y Ry, que pueden estar unidos al resto molecular precursor a través de un átomo de nitrógeno. Rx y Ry se seleccionan independientemente entre hidrógeno y alquilo.

El término “(NRxRy)alcoxi”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo (NRxRy)alquilo unido al resto molecular precursor a través de un átomo de oxígeno.

El término “(NRxRy)alquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos -NRxRy.

El término (NRxRy)carbonilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -NRxRy unido al resto molecular precursor a través de un grupo carbonilo.

El término “nitro”, como se usa en el presente documento, se refiere a -NO2,

El término “oxo”, como se usa en el presente documento, se refiere a =O.

El término “sulfonilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a -SO2-.

Los compuestos de la presente divulgación pueden existir como las sales farmacéuticamente aceptables. La expresión “sal farmacéuticamente aceptable”, como se usa en el presente documento, representa sales o formas zwitteriónicas de los compuestos de la presente divulgación, que son solubles o dispersables en agua o aceite, que dentro del alcance del juicio médico son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de pacientes sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, que corresponden a una relación beneficio/riesgo razonable, y son eficaces para su uso pretendido. Las sales pueden prepararse durante el aislamiento y purificación final de los compuestos, o por separado, haciendo reaccionar un átomo de nitrógeno adecuado con un ácido adecuado. Las sales de adición de ácidos representativas incluyen acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, alcanforato, alcanforsulfuonato, digluconato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, formiato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, mesitilensulfonato, metanosulfonato, naftilensulfonato, nicotinato, 2naftalenosulfonato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilproprionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tricloroacetato, trifluoroacetato, fosfato, glutamato, bicarbonato, para-toluenosulfonato y undecanoato. Los ejemplos de ácidos que pueden emplearse para formar las sales de adición farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos, tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico, y ácidos orgánicos, tales como oxálico, maleico, succínico y cítrico.

Las sales de adición básicas pueden prepararse durante el aislamiento y purificación final de los compuestos, haciendo reaccionar un grupo carboxi con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico, o con amoniaco o una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Los cationes de las sales farmacéuticamente aceptables incluyen litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio, así como cationes de amina cuaternaria no tóxicos, tales como amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, dietilamina, etilamina, tributilamina, piridina, N,N-dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, diciclohexilamina, procaína, dibencilamina, N,N-dibencilfenetilamina, y N,N’-dibenciletilendiamina. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina y piperazina.

Como se usa en el presente documento, la expresión "actividad anti-VHC" significa que el compuesto es eficaz para inhibir la función de una diana seleccionada de metaloproteasa del VHC, serina proteasa del VHC, polimerasa del VHC, helicasa del VHC, proteína NS4B del VHC, entrada del VHC, ensamblaje del VHC, salida del VHC, proteína NS5A del VHC e IMPDH para el tratamiento de una infección por VHC.

La expresión "compuestos de la divulgación", y expresiones equivalentes, pretende abarcar compuestos de fórmula (I), y enantiómeros, diastereómeros, sales y solvatos farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, hidratos de los mismos. De forma similar, las referencias a intermedios pretenden abarcar sus sales y solvatos cuando el contexto así lo permita.

El término "paciente" incluye tanto seres humanos como otros mamíferos.

La expresión "composición farmacéutica" significa una composición que comprende un compuesto de la divulgación en combinación con al menos un vehículo farmacéutico adicional, es decir, adyuvante, excipiente o vehículo, tal como diluyentes, agentes conservantes, cargas, agentes reguladores del flujo, agentes disgregantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes saporíferos, agentes perfumantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes lubricantes y agentes de dispensación, dependiendo de la naturaleza del modo de administración y de las formas de dosificación. Pueden usarse los ingredientes enumerados en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1999), por ejemplo.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de pacientes sin una toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivos en proporción con una relación riesgo/beneficio razonable.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad total de cada componente activo que es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el paciente, por ejemplo, una reducción mantenida en la carga vírica. Cuando se aplica a un principio activo individual administrado en solitario, la expresión se refiere a ese ingrediente en solitario. Cuando se aplica a una combinación, la expresión se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya se administren en combinación, en serie o simultáneamente.

El término "tratar" se refiere a: (i) prevenir que aparezca una enfermedad, trastorno o afección en un paciente que pueda estar predispuesto a la enfermedad, trastorno y/o afección pero al que todavía no se le haya diagnosticado que la tenga; (ii) inhibir la enfermedad, trastorno o afección, es decir, detener su evolución; y/o (iii) aliviar la enfermedad, trastorno o afección, es decir, causando la regresión de la enfermedad, trastorno y/o afección.

El término "resto" con referencia a un aminoácido o derivado de aminoácido significa un radical derivado del aaminoácido correspondiente por eliminación del hidroxilo del grupo carboxi y un hidrógeno del grupo de aaminoácido. Por ejemplo, los términos Gln, Ala, Gly, Ile, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar y Tyr representan los "restos" de L-glutamina, L-alanina, glicina, L-isoleucina, L-arginina, L-ácido aspártico, L-fenilalanina, L-serina, Lleucina, L-cisteína, L-asparagina, sarcosina y L-tirosina, respectivamente.

La expresión "cadena lateral" con respecto a un aminoácido o resto de aminoácido significa un grupo unido al átomo de carbono a del a-aminoácido. Por ejemplo, la cadena lateral de grupo R para la glicina es hidrógeno, para la alanina es metilo, para la valina es isopropilo. Para los grupos R específicos o cadenas laterales de los aaminoácidos se hace referencia a A.L. Lehninger's text on Biochemistry (véase el capítulo 4).

Cuando se usan para nombrar los compuestos de la presente divulgación, las designaciones P1', P1, P2, P2*, P3 y P4, como se usan en el presente documento, mapean las posiciones relativas de los restos de aminoácidos de una unión a inhibidor de proteasas respecto a la unión del sustrato de escisión peptídico natural. La escisión se produce en el sustrato natural entre P1 y P1', donde las posiciones no prima designan los aminoácidos partiendo del extremo C-terminal del sitio de escisión natural del péptido que se extienden hacia el extremo N-terminal; mientras que las posiciones prima surgen del extremo N-terminal de la designación de sitio de escisión y se extienden hacia el extremo C-terminal. Por ejemplo, P1' se refiere a la primera posición lejos del extremo a la derecha del C-terminal del sitio de escisión (es decir, primera posición del N-terminal); mientras que P1 comienza la numeración desde el lado a la izquierda del sitio de escisión C-terminal, P2: segunda posición desde el C-terminal, etc.). (Véase Berger A.

y Schechter I., Transactions of the Royal Society London series (1970), B257, 249-264]. La siguiente figura muestra las designaciones para los compuestos de la presente divulgación.

Existen centros asimétricos en los compuestos de la presente divulgación. Por ejemplo, los compuestos pueden incluir el elemento ciclopropilo P1 de fórmula

en la que cada C1 y C2 representa un átomo de carbono asimétrico en las posiciones 1 y 2 del anillo de ciclopropilo. Independientemente de otros posibles centros asimétricos en otros segmentos de los compuestos, la presencia de estos dos centros asimétricos significa que los compuestos pueden existir como mezclas racémicas de

10 diastereómeros, tales como los diastereómeros en los que R2 está configurado como syn respecto a la amida o syn respecto al carbonilo como se muestra a continuación.

Debe entenderse que la divulgación abarca todas las formas isoméricas estereoquímicas, o mezclas de las mismas, que poseen la capacidad de inhibir la proteasa VHC. Los estereoisómeros individuales de los compuestos pueden prepararse sintéticamente a partir de materiales de partida disponibles en el mercado que contienen centros quirales, o por preparación de mezclas de productos enantioméricos, seguido de separación tal como conversión a una mezcla de diastereómeros seguido de separación o recristalización, técnicas cromatográficas o separación directa de enantiómeros en columnas cromatográficas quirales. Los compuestos de partida de estereoquímica particular están disponibles en el mercado o pueden fabricarse o resolverse por procedimientos conocidos en la técnica.

Ciertos compuestos de la presente divulgación pueden existir también en diferentes formas conformacionales estables que pueden ser separables. La asimetría torsional debido a la rotación restringida alrededor de un enlace sencillo asimétrico, por ejemplo debido a impedimentos estéricos o tensión del anillo, puede permitir la separación de diferentes confórmeros. La presente divulgación incluye cada isómero conformacional de estos compuestos y mezclas de los mismos.

Ciertos compuestos de la presente divulgación pueden existir en forma zwitteriónica, y la presente divulgación incluye cada forma zwitteriónica de estos compuestos y mezclas de los mismos.

Cuando es posible que, para su uso en terapia, cantidades terapéuticamente eficaces de un compuesto de fórmula (I), así como sales farmacéuticamente aceptables del mismo, puedan administrarse como un compuesto químico en bruto, es posible presentar el ingrediente activo como una composición farmacéutica. Por consiguiente, la divulgación proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades terapéuticamente eficaces del compuesto de fórmula (I), o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, y uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los compuestos de fórmula (I), y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, son como se han descrito anteriormente. El vehículo o vehículos, diluyente o diluyentes o excipiente o excipientes deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación, y no perjudiciales para el destinatario de la misma. De acuerdo con otro aspecto de la divulgación se proporciona también un procedimiento para la preparación de una formulación farmacéutica mezclando un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, con uno o más vehículos, diluyentes, o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las formulaciones farmacéuticas pueden presentarse en forma de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada del ingrediente activo por dosis unitaria. Los niveles de dosificación entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 250 miligramos por kilogramo (“mg/kg”) de peso corporal por día, preferentemente entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día de los compuestos de la divulgación son típicos en una monoterapia para la prevención y tratamiento de una enfermedad mediada por VHC. Típicamente, las composiciones farmacéuticas de esta divulgación se administrarán de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces por día o, como alternativa, como una infusión continua. Dicha administración puede usarse como una terapia crónica o aguda. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con los materiales de soporte para producir una forma de dosificación sencilla variarán dependiendo de la afección a tratar, la gravedad de la afección, el tiempo de administración, la vía de administración, la velocidad de excreción del compuesto empleado, la duración del tratamiento y la edad, género, peso y estado del paciente. Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o subdosis, como se ha citado anteriormente en el presente documento, o una fracción apropiada de las mismas, de un ingrediente activo. Generalmente, el tratamiento se inicia con pequeñas dosificaciones sustancialmente menores de la dosis óptima del compuesto. Posteriormente, la dosificación aumenta en pequeños incrementos hasta que se alcanza el efecto óptimo en las circunstancias concretas. En general, el compuesto se administra más deseablemente a un nivel de concentración que generalmente dará resultados antiviralmente eficaces sin provocar ningún efecto secundario dañino o perjudicial.

Cuando las composiciones de esta divulgación comprenden una combinación de un compuesto de la divulgación y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional normalmente están presentes a niveles de dosificación entre aproximadamente el 10% y el 150% y, más preferentemente, entre aproximadamente el 10 y el 80% de la dosificación administrada normalmente en un régimen de monoterapia.

Las formulaciones farmacéuticas pueden estar adaptadas para administración por cualquier vía apropiada, por ejemplo por vía oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual o transdérmica), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intracutánea, intramuscular, intraarterial, intrasinovial, intraexternal, intratecal, intralesional, intravenosa, o inyecciones intradérmicas o infusiones). Dichas formulaciones pueden prepararse por cualquier procedimiento conocido en la técnica farmacéutica, por ejemplo asociando el ingrediente activo con el vehículo o vehículos o excipiente o excipientes.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas, tales como cápsulas o comprimidos; polvos o gránulos, soluciones o suspensiones, en líquidos acuoso o no acuosos; espumas o batidos comestibles; emulsiones líquidas de aceite en agua o emulsiones de agua en aceite.

Por ejemplo, para administración oral en forma de un comprimido o cápsula, el componente de fármaco activo puede combinarse con un vehículo inerte farmacéuticamente aceptable, no tóxico, tal como etanol, glicerol, agua y similares. Los polvos se preparan triturando el compuesto a un tamaño fino adecuado, y mezclando con un vehículo farmacéutico triturado análogamente, tal como un carbohidrato comestible tal como, por ejemplo, almidón o manitol. Los aromatizantes, conservantes, dispersantes y agentes colorantes pueden estar presentes también.

Las cápsulas se fabrican preparando una mezcla en polvo, como se ha descrito anteriormente, y llenando las vainas de gelatina formadas. Pueden añadirse emolientes y lubricantes, tales como sílice coloidal, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio o polietilenglicol sólido a la mezcla en polvo antes de la operación de llenado. Puede añadirse también un agente disgregante o de solubilización, tal como agar-agar, carbonato de calcio o carbonato sódico, para mejorar la disponibilidad del medicamento cuando se ingiere la cápsula.

Además, cuando se desea o es necesario, pueden incorporarse también los aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes adecuados a la mezcla. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o betalactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto o alginato sódico, carboximetilcelulosa, polietilenglicol y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen oleato sódico, cloruro sódico y similares. Los disgregantes incluyen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, goma de xantano y similares. Los comprimidos se formulan, por ejemplo, preparando una mezcla en polvo granulando o fabricación de formas en bruto, añadiendo un lubricante y disgregante, y comprimiendo hasta formar comprimidos. Una mezcla en polvo se prepara mezclando el compuesto, triturado adecuadamente, con un diluyente o base como se ha descrito anteriormente y, opcionalmente, con un aglutinante tal como carboximetilcelulosa y alginato, gelatina o polivinilpirrolidona, una solución retardante tal como parafina con acelerador de resorción, tal como una sal cuaternaria y/o un agente de absorción, tal como bentonita, caolín o fosfato dicálcico. La mezcla en polvo puede granularse humedeciendo con un aglutinante, tal como un jarabe, pasta de almidón, mucílago de goma arábiga o soluciones de materiales celulósicos o poliméricos, y forzándolo a través de un tamiz. Como una alternativa a la granulación, una mezcla en polvo puede hacerse pasar a través de la máquina de comprimidos y el resultado son formas en bruto formadas de forma imperfecta, que se rompen en gránulos. Los gránulos pueden lubricarse para evitar que se peguen a los troqueles de formación de comprimidos mediante la adición de ácido esteárico, una sal de estearato, talco o aceite mineral. La mezcla lubricada se comprime después en comprimidos. Los compuestos de la presente divulgación pueden combinarse también con un vehículo inerte que fluye libremente y comprimirse en comprimidos directamente sin pasar por las etapas de granulación o fabricación de formas en bruto. Puede proporcionarse un revestimiento protector transparente u opaco, que consiste en un revestimiento de sellado de goma laca, un revestimiento de azúcar o material polimérico y un revestimiento de pulido de cera. Los colorantes pueden añadirse a estos revestimientos para distinguir diferentes dosificaciones unitarias.

Los fluidos orales, tales como solución, jarabes y elixires pueden prepararse en forma de una unidad de dosificación, de manera que la cantidad dada contenga una cantidad predeterminada de compuesto. Los jarabes pueden prepararse disolviendo el compuesto en una solución acuosa aromatizada, mientras que los elixires se preparan mediante el uso de un vehículo no tóxico. Pueden añadirse también solubilizadores y emulsionantes, tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados y éteres de polioxoetilen sorbitol, conservantes, aditivos de aroma tales como aceite de menta o edulcorantes naturales o sacarina u otros edulcorantes artificiales, y similares.

Cuando sea apropiado, las formulaciones de la unidad de dosificación para administración oral pueden estar microencapsuladas. La formulación puede prepararse también para prolongar o sostener la liberación, tal como por ejemplo por recubrimiento o embebido de un material particulado en polímeros, ceras o similares.

Los compuestos de fórmula (I), y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, pueden administrarse en forma de sistemas de administración de liposomas, tal como pequeñas vesículas unilamelares, grandes vesículas unilamelares y vesículas multilamelares. Los liposomas pueden formarse a partir de una diversidad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidil-colinas.

Los compuestos de fórmula (I), y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, pueden administrarse también mediante el uso de anticuerpos monoclonales como vehículos individuales, a los que están acopladas las moléculas de compuesto. Los compuestos pueden estar acoplados también con polímeros solubles como vehículos de fármaco dirigibles. Dichos polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamidafenol, polihidroxietilaspartamidafenol, o polietilenoxidepolilisina, sustituido con restos palmitoílo. Adicionalmente, los compuestos pueden estar acoplados a una clase de polímeros biodegradables útiles para conseguir la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo ácido poliláctico, poliépsilon caprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloque reticulados anfipáticos de hidrogeles.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración transdérmica pueden presentarse como parches discretos destinados a permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un periodo de tiempo prolongado. Por ejemplo, el ingrediente activo puede suministrarse desde el parche por iontoforesis, como se describe de forma general en Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986).

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica pueden formularse como pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles o aceites.

Para tratamientos del ojo u otros tejidos externos, por ejemplo la boca y la piel, las formulaciones se aplican preferentemente como una pomada o crema tópica. Cuando se formulan como una pomada, el ingrediente activo puede emplearse con una base de pomada parafínica o miscible en agua. Como alternativa, el ingrediente activo puede formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua o una base de agua en aceite.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administraciones tópicas al ojo incluyen gotas para los ojos en las que el ingrediente activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica en la boca incluyen pastillas, grageas y enjuagues bucales.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración rectal pueden presentarse en forma de supositorios

o como enemas.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal, en las que el vehículo es un sólido, incluyen un polvo fino, que tiene un tamaño de partícula por ejemplo en el intervalo de 20 a 500 micrómetros, que se administra de una manera en que se toma una calada, es decir, por inhalación rápida a través del pasaje nasal desde un recipiente del polvo mantenido cerca de la nariz. Las formulaciones adecuadas, en las que el vehículo es un líquido, para administración como una pulverización nasal o gotas nasales, incluyen soluciones acuosas o de aceite del ingrediente activo.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración por inhalación incluyen polvos o neblinas de partículas finas, que pueden generarse mediante diversos tipos de aerosoles presurizados, nebulizadores o insufladores de dosis medida.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración vaginal pueden presentarse en forma de pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del destinatario pretendido; y suspensiones estériles acuosas o no acuosas, que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes unidosis o multidosis, por ejemplo ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que solo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. La inyección extemporánea de soluciones y suspensiones puede prepararse para polvos estériles, gránulos y comprimidos.

Debe entenderse que, además de los ingredientes mencionados particularmente anteriormente, las formulaciones pueden incluir otros agentes, convencionales en la técnica que con respecto al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo aquellos adecuados para administración oral, pueden incluir agentes aromatizantes.

Ciertos compuestos inhibidores de VHC ilustrativos que pueden administrarse con los compuestos de la presente divulgación incluyen aquellos desvelados en las siguientes publicaciones: WO 02/04425 A2 publicado el 17 de enero de 2002, WO 03/007945 A1 publicado el 30 de enero de 2003, WO 03/010141 A2 publicado el 6 de febrero de 2003, WO 03/010142 A2 publicado el 6 de febrero de 2003, WO 03/010143 A1 publicado el 6 de febrero de 2003, WO 03/000254 A1 publicado el 3 de enero de 2003, WO 01/32153 A2 publicado el 10 de mayo de 2001, WO 00/06529 publicado el 10 de febrero de 2000, WO 00/18231 publicado el 6 de abril de 2000, WO 00/10573 publicado el 2 de marzo de 2000, WO 00/13708 publicado el 16 de marzo de 2000, WO 01/85172 A1 publicado el 15 de noviembre de 2001, WO 03/037893 A1 publicado el 8 de mayo de 2003, WO 03/037894 A1 publicado el 8 de mayo de 2003, WO 03/037895 A1 publicado el 8 de mayo de 2003, WO 02/100851 A2 publicado el 19 de diciembre de 2002, WO La Tabla 1 a continuación muestra algunos ejemplos ilustrativos de compuestos que pueden administrarse con los compuestos de la presente divulgación. Los compuestos de la divulgación pueden administrarse con otros compuestos con actividad anti-VHC en terapia combinada, conjuntamente o por separado, o combinando los compuestos en una composición.

Tabla 1 (continuación)

02/100846 A1 publicado el 19 de diciembre de 2002, EP 1256628 A2 publicado el 13 de noviembre de 2002, WO 99/01582 publicado el 14 de enero de 1999, WO 00/09543 publicado el 24 de febrero de 2000.

Nombre comercial

Tipo de inhibidor o diana Compañía de origen

Omega IFN

IFN-w BioMedicines Inc., Emeryville, CA

BILN-2061

Inhibidor de serina proteasa Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim, Alemania

Summetrel

Antiviral Endo Pharmaceuticals Holdings Inc., Chadds Ford, PA

Roferon A

IFN-a2a F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza

Pegasys

IFN-a2a PEGilado F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza

Pegasys y Ribavirin

IFN-a2a PEGilado/ribavirina F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza

CellCept

Inmunosupresor de IgG de VHC F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza

Wellferon

IFN-an1 linfoblastoide GlaxoSmithKline plc, Uxbridge, Reino Unido

Albuferon-a

Albúmina IFN-a2b Human Genome Sciences Inc., Rockville, MD

Levovirin

Ribavirina ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA

IDN-6556

Inhibidor de caspasa Idun Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA

IP-501

Antifibrótico Indevus Pharmaceuticals Inc., Lexington, MA

Actimmune

INF-y InterMune Inc., Brisbane, CA

Infergen A

IFN alfacon-1 InterMune Pharmaceuticals Inc., Brisbane, CA

ISIS 14803

Antisentido ISIS Pharmaceuticals Inc, Carlsbad, CA/Elan Phamaceuticals Inc., Nueva York, NY

JTK-003

Inhibidor de RdRp Japan Tobacco Inc., Tokio, Japón

Pegasys y Ceplene

IFN-a2a PEGilado/inmunomodulador Maxim Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA

Ceplene

Inmunomodulador Maxim Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA

Civacir

Inmunosupresor de IgG de VHC Nabi Biopharmaceuticals Inc., Boca Raton, FL

Intron A y Zadaxin

IFN-a2b/a1-timosina RegeneRx Biopharmiceuticals Inc., Bethesda, MD/ SciClone Pharmaceuticals Inc, San Mateo, CA

Levovirin

Inhibidor de IMPDH Ribapharm Inc., Costa Mesa, CA

Viramidine

Inhibidor de IMPDH Ribapharm Inc., Costa Mesa, CA

Heptazyme

Ribozima Ribozyme Pharmaceuticals Inc., Boulder, CO

Intron A

IFN-a2b Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ

PEG-Intron

IFN-a2b PEGilado Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ

Rebetron

IFN-a2b/ribavirina Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ

Ribavirin

Ribavirina Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ

PEG-Intron/Ribavirin

IFN-a2b PEGilado/ribavirina Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ

Zadazim

Inmunomodulador SciClone Pharmaceutical Inc., San Mateo, CA

Nombre comercial

Tipo de inhibidor o diana Compañía de origen

Rebif

IFN-11a Serono, Geneva, Suiza

IFN-ß and EMZ701

IFN-1 y EMZ701 Transition Therapeutics Inc., Ontario, Canadá

T67

Inhibidor de 1-tubulina Tularik Inc., South San Francisco, CA

VX-497

Inhibidor de IMPDH Vertex Pharmaceuticals Inc., Cambridge, MA

VX-950/LY-570310

Inhibidor de serina proteasa Vertex Pharmaceuticals Inc., Cambridge, MA/Eli Lilly and Co. Inc., Indianapolis, IN

Omniferon

IFN-a natural Viragen Inc., Plantation, FL

XTL-002

Anticuerpo monoclonal XTL Biopharmaceuticals Ltd., Rehovot, Israel

Los compuestos de la divulgación pueden usarse también como reactivos de laboratorio. Los compuestos pueden ser instrumentos para proporcionar herramientas de investigación para diseñar ensayos de replicación viral,

5 validación de sistemas de ensayo animal y estudios biológicos para potenciar adicionalmente el conocimiento de los mecanismos de la enfermedad por VHC. Adicionalmente, los compuestos de la presente divulgación son útiles para establecer o determinar el sitio de unión de otros compuestos antivirales, por ejemplo inhibición competitiva.

Los compuestos de la presente divulgación pueden usarse también para tratar o prevenir la contaminación viral de los materiales y, por lo tanto, reducir el riesgo de infección viral del personal del laboratorio médico o de los

10 pacientes que entran en contacto con dichos materiales, por ejemplo, sangre, tejido, instrumentos y prendas quirúrgicas, instrumentos y prendas de laboratorio, y aparatos y materiales de recogida o transfusión de sangre.

La presente divulgación pretende abarcar compuestos que tienen la formula (I) cuando se preparan por procedimientos sintéticos o por procedimientos metabólicos, incluyendo aquellos que ocurren en el cuerpo humano o animal (in vivo) o procedimientos que ocurren in vitro.

15 Las abreviaturas usadas en la presente solicitud, incluyendo particularmente los esquemas ilustrativos y los ejemplos que siguen, las conocen bien los expertos en la materia. Algunas de las abreviaturas usadas son las siguientes: CDI para 1,1’-carbonildiimidazol; THF para tetrahidrofurano; DBU para 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno; TFA para ácido trifluoroacético; HATU para O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio fosfato; PyBOP para hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio; MeI para yoduro de metilo; Boc o BOC para terc

20 butoxicarbonilo; OtBu para terc-butoxi; TBME para terc-butil metil éter; Et3N para trietilamina; DMSO para dimetilsulfóxido; OAc para acetato; DPPA para difenilfosforil azida; Me para metilo; TBAF para fluoruro de tetrabutilamonio; DMAP para 4-N,N-dimetilaminopiridina; tBuLi para terc-butillitio; LiHMDS para hexametildisilazida de litio; Tle para terc-butilleucina, denominada también terc-butil glicina; 4-BiphMgBr para bromuro de 4bifenilmagnesio; DCM para diclorometano; MeO para metoxi; EDAC o EDC para clorhidrato de 1-(3

25 dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; y HOBt para 1-hidroxibenzotriazol.

Los materiales de partida útiles para sintetizar los compuestos de la presente divulgación son conocidos por los expertos en la materia y pueden fabricarse fácilmente o están disponibles en el mercado.

Los siguientes procedimientos expuestos a continuación se proporcionan para fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la divulgación reivindicada. Se reconocerá que puede ser necesario preparar dicho compuesto

30 en el que un grupo funcional está protegido usando un grupo protector convencional y retirar después el grupo protector para proporcionar un compuesto de la presente divulgación. Los detalles relacionados con el uso de los grupos protectores de acuerdo con la presente divulgación son conocidos por los expertos en la materia.

Los compuestos de la presente divulgación, por ejemplo, pueden sintetizarse de acuerdo con un procedimiento general como se ilustra en el Esquema I (en el que CPG es un grupo protector de carboxilo y APG es un grupo

35 protector de amino).

Esquema I

Brevemente, P1’, P1, P2, P3 y P4 pueden unirse mediante técnicas de acoplamiento de péptido bien conocidas. Los grupos P1’, P1, P2, P3 y P4 pueden unirse juntos en cualquier orden, siempre y cuando el compuesto final corresponda a péptidos de la divulgación. Por ejemplo, P3 puede estar unido a P2-P1; o P1 unido a P3-P2.

Generalmente, los péptidos se alargan por desprotección del grupo a-amino del resto N terminal y acoplamiento del grupo carboxilo no protegido del siguiente aminoácido N protegido adecuadamente a través de una unión peptídica usando los procedimientos descritos. Este procedimiento de desprotección y acoplamiento se repite hasta que se obtiene la secuencia deseada. Este acoplamiento puede realizarse con los aminoácidos constitutivos de una manera por etapas, como se representa en el Esquema I.

El acoplamiento entre dos aminoácidos, un aminoácido y un péptido o dos fragmentos peptídicos puede realizarse usando procedimientos de acoplamiento convencionales, tales como el procedimiento de azida, el procedimiento mixto de anhídrido carbónico-ácido carboxílico (cloroformiato de isobutilo), el procedimiento de carbodiimida (diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida, o carbodiimida soluble en agua), el procedimiento del éster activo (p-nitrofenil éster, imido éster N-hidroxisuccínico), el procedimiento K con reactivo de Woodward, procedimiento con carbonildiimidazol, reactivos de fósforo o procedimientos de oxidación-reducción. Algunos de estos procedimientos (especialmente el procedimiento con carbodiimida) pueden potenciarse añadiendo 1-hidroxibenzotriazol o 4-DMAP. Estas reacciones de acoplamiento pueden realizarse en solución (fase líquida) o fase sólida.

Más explícitamente, la etapa de acoplamiento implica el acoplamiento de deshidratación de un carboxilo libre de un reactante con el grupo amino libre de otro reactante en presencia del agente de acoplamiento para formar una unión de enlace de amida. Las descripciones de dichos agentes de acoplamiento se encuentran en los libros de texto generales de química de péptidos, por ejemplo M. Bodanszky, "Peptide Chemistry", 2ª ed. rev., Springer-Verlag, Berlín, Alemania, (1993). Los ejemplos de agentes de acoplamiento adecuados son N,N’-diciclohexilcarbodiimida, 1hidroxibenzotriazol en presencia de N,N’-diciclohexilcarbodiimida o N-etil-N’-[(3-dimetilamino)propil]carbodiimida. Un agente de acoplamiento práctico y útil es el hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)-tris-(dimetilamino)fosfonio disponible en el mercado, por sí mismo o en presencia de 1-hidroxibenzotriazol o 4-DMAP. Otro agente de acoplamiento práctico y útil es el tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N, N’,N’-tetrametiluronio, disponible en el mercado. Otro agente de acoplamiento práctico y útil más es el hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotrizol-1-il)N,N,N’,N’-tetrametiluronio disponible en el mercado.

La reacción de acoplamiento se realiza en un disolvente inerte, por ejemplo diclorometano, acetonitrilo o dimetilformamida. Un exceso de una amina terciaria, por ejemplo diisopropiletilamina, N-metilmorfolina, Nmetilpirrolidina o 4-DMAP se añade para mantener la mezcla de reacción a un pH de aproximadamente 8. La temperatura de reacción normalmente varía entre 0 ºC y 50 ºC y el tiempo de reacción normalmente varia entre 15 minutos y 24 horas.

Los grupos funcionales de los aminoácidos constitutivos generalmente deben estar protegidos durante las reacciones de acoplamiento para evitar la formación de enlaces indeseados. Los grupos protectores que pueden usarse se muestran, por ejemplo, en Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, Nueva York y "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 3, Academic Press, Nueva York (1981).

El grupo a-amino de cada aminoácido a acoplar a la cadena peptídica en crecimiento debe estar protegido (APG). Puede usarse cualquier grupo protector conocido en la técnica. Los ejemplos de dichos grupos incluyen: 1) grupos acilo, tales como formilo, trifluoroacetilo, ftalilo y p-toluenosulfonilo; 2) grupos carbamato aromáticos, tales como benciloxicarbonilo (Cbz o Z) y benciloxicarbonilos sustituidos y 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc); 3) grupos carbamato alifáticos, tales como terc-butiloxicarbonilo (Boc), etoxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo y aliloxicarbonilo; 4) grupos alquil carbamato cíclicos, tales como ciclopentiloxicarbonilo y adamantiloxicarbonilo; 5) grupos alquilo, tales como trifenilmetilo y bencilo; 6) trialquilsililos, tales como trimetilsililo; y 7) grupos que contienen tiol, tales como feniltiocarbonilo y ditiasuccinoílo.

En una realización, el grupo protector de a-amino es Boc o Fmoc. Muchos derivados de aminoácido protegidos adecuadamente para la síntesis de péptidos están disponibles en el mercado.

El grupo protector de a-amino del resto aminoacídico recientemente añadido se escinde antes del acoplamiento del siguiente aminoácido. Cuando se usa el grupo Boc, los procedimientos de elección son ácido trifluoroacético puro o en diclorometano, o HCl en dioxanos o en acetato de etilo. La sal de amonio resultante se neutraliza después antes del acoplamiento, o in situ, con soluciones básicas tales como tampones acuosos o aminas terciarias en diclorometano, acetonitrilo o dimetilformamida. Cuando el grupo Fmoc se usa, los reactivos de elección son piperidina o piperidina sustituida en dimetilformamida, pero puede usarse cualquier amina secundaria. Las desprotección se realiza a una temperatura entre 0 ºC y temperatura ambiente (ta o TA), normalmente 20-22 ºC.

Cualquiera de los aminoácidos que tienen funcionalidades de cadena lateral pueden protegerse durante la preparación del péptido usando cualquiera de los grupos descritos anteriormente. Los expertos en la materia apreciarán que la selección y uso de los grupos protectores adecuados para las funcionalidades de la cadena lateral dependen del aminoácido y la presencia de otros grupos protectores en el péptido. La selección de dichos grupos protectores es importante, puesto que el grupo no debe retirarse durante la desprotección y acoplamiento del grupo a-amino.

Por ejemplo, cuando se usa Boc como el grupo protector de a-amina, los siguientes grupos protectores de cadena lateral son adecuados: pueden usarse restos p-toluenosulfonilo (tosilo) para proteger la cadena lateral amino de los aminoácidos tales como Lys y Arg; pueden usarse restos acetamidometilo, bencilo (Bn), o terc-butilsulfonilo para proteger la cadena lateral que contiene sulfuro de cisteína; pueden usarse éteres de bencilo (Bn) para proteger las cadenas laterales que contiene hidroxi de serina, treonina o hidroxiprolina; y pueden usarse ésteres de bencilo para proteger las cadenas laterales que contienen carboxi de ácido aspártico y ácido glutámico.

Cuando se elige Fmoc para la protección de a-amina, normalmente grupos protectores basados en terc-butilo son aceptables. Por ejemplo, puede usarse Boc para lisina y arginina, éter terc-butílico para serina, treonina e hidroxiprolina y éster terc-butílico para ácido aspártico y ácido glutámico. El resto trifenilmetilo (tritilo) puede usarse para proteger la cadena lateral que contiene sulfuro de la cisteína.

Una vez que el alargamiento del péptido se ha completado se retiran todos los grupos protectores. Estos procedimientos los conocen bien los expertos en la materia.

Adicionalmente, puede seguirse la siguiente guía en la preparación de compuestos de la presente divulgación. Por ejemplo, para formar un compuesto en el que R6 es alquilcarbonilo o alquilsulfonilo, un P3 protegido o todo el péptido

o un segmento peptídico se acopla a un cloruro de acilo o cloruro de sulfonilo apropiado, respectivamente, que está disponible en el mercado o para el que la síntesis se conoce bien en la técnica.

En la preparación de un compuesto en el que R6 es alcoxicarbonilo, un P3 protegido o todo el péptido o un segmento del péptido se acopla a un cloroformiato apropiado que está disponible en el mercado o para el que la síntesis se conoce bien en la técnica. Para los derivados de Boc se usa (Boc)2O.

Por ejemplo: El ciclopentanol se trata con fosgeno para obtener el cloroformiato correspondiente.

El cloroformiato se trata con el tripéptido NH2 deseado en presencia de una base, tal como trietilamina, para dar el ciclopentilcarbamato.

En la preparación de un compuesto en el que R6 es (NRaRb)carbonilo, un P3 protegido o todo el péptido o un 5 segmento peptídico se trata con fosgeno, seguido de amina, como se describe en Syn. Lett. Feb 1995; (2); 142-144,

o se hace reaccionar con el isocianato disponible en el mercado y una base adecuada, tal como trietilamina.

En la preparación de un compuesto en el que R6 es (NRaRb)sulfonilo, un P3 protegido o un péptido o un segmento de péptido se trata con cualquiera de cloruro de sulfamilo recién preparado, o disponible en el mercado, seguido de amina como se describe en el documento WO 98/32748.

10 El grupo a-carboxilo del resto C terminal normalmente está protegido como un éster (CPG) que puede escindirse para dar el ácido carboxílico. Los grupos protectores que pueden usarse incluyen: 1) ésteres de alquilo, tales como metilo, trimetilsililetilo y terc-butilo, 2) éster de arilalquilo, tales como bencilo y bencilo sustituido o 3) ésteres que pueden escindirse por tratamiento con una base moderada o un medio reductor moderado, tal como ésteres de tricloroetilo y fenacilo.

15 El ácido a-carboxílico resultante (resultante de la escisión por ácido moderado, base moderada, tratamiento o un medio reductor suave) se acopla con R7SO2NH2 (preparado por tratamiento de R7SO2Cl en una solución de tetrahidrofurano saturada en amonio) en presencia del agente de acoplamiento peptídico, tal como CDI o EDAC en presencia de una base, tal como 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) y/o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) para incorporar el resto P1’, ensamblando eficazmente el tripéptido P1’-P1-P2-P3-APG. Típicamente, en este

20 procedimiento, se usan 1-5 equivalentes de agentes de acoplamiento P1’.

Adicionalmente, es el grupo protector de P3 APG se retira y reemplaza con un resto P4 por los procedimientos descritos anteriormente, y el ácido a-carboxílico resultante de la escisión (resultante de la escisión con ácido moderado, el tratamiento con base moderada o medios reductores suaves) se acopla con un R7SO2NH2 (preparado por tratamiento de R7SO2Cl en una solución de tetrahidrofurano saturada con amonio o los procedimientos

25 alternativos descritos en el presente documento), en presencia de un agente de acoplamiento peptídico, tal como CDI o EDAC en presencia de una base, tal como 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) y/o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7eno (DBU) para incorporar el resto P1’, el tripéptido P1’-P1-P2-P3-P4 se prepara. Típicamente, en este procedimiento, se usan 1-5 equivalentes de los agentes de acoplamiento P1’.

El Esquema II muestra adicionalmente el procedimiento general en el que los compuestos de fórmula (I) se

30 construyen mediante el acoplamiento del ácido carboxílico de tripéptido con una sulfonamida P1’. Dicha reacción de acoplamiento requiere el tratamiento de ácido carboxílico (1) con un reactivo de acoplamiento, tal como carbonil diimidazol en un disolvente tal como THF, que puede calentarse a reflujo, seguido de la adición del derivado formado de (1) a la sulfonamida P1’, en un disolvente tal como THF o diclorometano, en presencia de una base tal como DBU.

35 Esquema II

En el Esquema III se muestra un procedimiento alternativo para la construcción de los compuestos de formula (I). El elemento sulfonamida P1’ está acoplado al elemento P1 usando el procedimiento empleado en el Esquema I. El 40 resto P1-P1’ resultante puede desprotegerse después en su extremo amino. En este ejemplo general, se emplea un grupo protector Boc, pero un experto en la materia reconocería que podría emplearse un número de grupos amino protectores adecuados en este procedimiento. El grupo protector Boc puede retirarse usando un ácido, tal como ácido trifluoroacético, en un disolvente, tal como dicloroetano, para proporcionar la amina desprotegida como la sal TFA. La sal de amina TFA puede emplearse directamente en la reacción de acoplamiento posterior o, como una 45 alternativa, la sal de amina TFA puede convertirse en primer lugar en la sal de amina HCl y esta sal de amina HCl se

usa en dicha reacción de acoplamiento como se muestra en el Esquema III. El acoplamiento de la sal de amina HCl

(3) con el extremo carboxilo de un intermedio P4-P3-P2 puede conseguirse usando reactivos de acoplamiento tales como HATU, en disolventes tales como diclorometano, para proporcionar los compuestos de fórmula (I) (4).

Esquema III

En el Esquema IV se muestra un procedimiento alternativo para la construcción de los compuestos de formula (I). En el presente documento, la sal clorhidrato de la amina terminal P1-P1’ (1) se acopla al grupo carboxilo libre del elemento P2 usando agentes de acoplamiento, tales como PyBOP, en presencia de una base, tal como diisopropil amina y en un disolvente, tal como diclorometano. El intermedio P2-P1-P1’ resultante puede convertirse en

10 compuestos de fórmula (I) en un procedimiento en dos etapas, en el que la primera etapa es la desprotección del extremo amina P2 usando un ácido, tal como TFA, en un disolvente, tal como diclorometano. La sal de ácido trifluoroacético resultante puede acoplarse con el extremo carboxilo del elemento P4-P3 usando agentes de acoplamiento convencionales, tales como PyBOP, en presencia de una base, tal como diisopropil amina, y usando disolventes, tales como diclorometano, para proporcionar los compuestos de fórmula (I) (4).

15 Esquema IV

El intermedio P4-P3-P2 utilizado en los esquemas anteriores puede construirse como se ha descrito anteriormente con una descripción adicional de este procedimiento mostrada en el Esquema V. En el mismo, el extremo carboxilo libre del intermedio P4-P3 (1), puede acoplarse al extremo amino del elemento P2 para proporcionar el dipéptido P4-P3-P2 (2). El extremo carboxilo del intermedio P4-P3-P2 puede desprotegerse por saponificación del grupo éster para proporcionar P4-P3-P2 como un ácido carboxílico libre (3). Los intermedios como (3) pueden convertirse en compuestos de fórmula (I) usando los procedimientos descritos en el presente documento.

Esquema V

Los compuestos de fórmula (I) pueden convertirse en otros compuestos de fórmula (I), como se describe en el

10 presente documento. Un ejemplo de dicho procedimiento se muestra en el Esquema VI, en el que un compuesto de fórmula (I) (1), que lleva un grupo Boc en la posición P4, se convierte en un compuesto de fórmula (I) (3), en el que dicho compuesto lleva un grupo urea en la posición P4. La conversión de (1) en (3) puede realizarse en un procedimiento de dos etapas, la primera de las cuales es la conversión de (1) en amina (2) por tratamiento de (1) con un ácido, tal como TFA en un disolvente, tal como diclorometano. La sal TFA de amina resultante puede tratarse

15 con un isocianato, tal como terc-butilisocianato en presencia de un equivalente de base para proporcionar un compuesto de fórmula (I) (3), en el que el resto P3 está protegido terminalmente con una urea. Como se ha indicado anteriormente, un experto en la materia reconocerá que el intermedio (2) puede usarse como material de partida para la preparación de los compuestos de fórmula (I), en los que el grupo P3 está protegido terminalmente con una amida, una sulfonamida, una tiourea o una sulfamida. La construcción de dichos compuestos de fórmula (I) puede

20 conseguirse usando condiciones convencionales para la formulación de dichas funcionalidades P4 a partir de aminas.

Esquema VI

En la construcción de los compuestos de fórmula (I), el extremo P1’ se incorpora a las moléculas usando uno de los 25 procedimientos generales expresados anteriormente y descritos, en detalle a continuación. En algunos ejemplos, los elementos P1’ son cicloalquil o alquil-sulfonamidas que están disponibles en el mercado o pueden prepararse a

partir del cloruro de alquilo o cicloalquil-sulfonilo correspondiente, por tratamiento de dicho cloruro de sulfonilo con amoniaco. Como alternativa, estas sulfonamidas pueden sintetizarse usando el procedimiento general esbozado en el esquema VII. En el mismo, el cloruro de 3-cloro-propilsulfonilo (1) disponible en el mercado, se convierte en una sulfonamida protegida adecuada, tal como, por ejemplo, por tratamiento con terc-butil amina. La sulfonamida obtenida (2) se convierte después en la cicloalquilsulfonamida correspondiente por tratamiento con dos equivalentes de una base, tal como butillitio, en un disolvente tal como THF. La cicloalquilsulfonamida resultante puede desprotegerse por tratamiento con un ácido para proporcionar la cicloalquilsulfoamida no protegida deseada.

Esquema VII

10 Las cicloalquilsulfonamidas sustituidas pueden incorporarse también en compuestos de fórmula (I) usando una modificación de dicho procedimiento anterior. Por ejemplo, el intermedio 2 del Esquema VIII puede tratarse con dos equivalentes de base, tal como butillitio, y la mezcla de reacción resultante puede tratarse con un electrófilo, tal como yoduro de metilo, para proporcionar una cicloalquilsulfonamida (3) sustituida. Este intermedio (3) puede desprotegerse en el extremo N y el compuesto resultante (4) utilizarse como un intermedio en la preparación de los

15 compuestos de fórmula (I).

Esquema VIII

Los intermedios P1’ empleados en la generación de compuestos de fórmula (I), en algunos casos, son procedentes 20 de derivados de sulfamida. En dichos casos, los intermedios de sulfamida están disponibles por diversas vías sintéticas, tal como por ejemplo la ruta descrita en el Esquema IX.

Esquema IX

El cloruro de sulfamoílo (2) puede prepararse in situ por adición de agua (por ejemplo, 1 equivalente) a isocianato de

25 clorosulfonilo 1 (por ejemplo, 1 equivalente) en un disolvente, tal como THF, mantenido a una baja temperatura, tal como -20 ºC, y se deja que la solución resultante se caliente a 0 ºC. A esta solución se le añade una base, tal como trietilamina anhidra (por ejemplo, 1 equivalente) seguido de una amina (por ejemplo, 1 equivalente). La mezcla de reacción se calienta después a temperatura ambiente, se filtra y el filtrado se concentra para dar las sulfamidas deseadas (3).

30 Las sulfamidas pueden incorporarse en compuestos de fórmula (I) siguiendo la ruta sintética definida en el Esquema

X. En el mismo, un elemento P1 de ácido carboxílico P1 (1) se trata con un agente de activación, tal como CDI. En un matraz separado se añade una base fuerte a una solución de la sulfamida descrita anteriormente, y la mezcla de reacción resultante se agita durante varias horas más, después de lo cual la mezcla de reacción se añade al matraz que contiene el ácido carboxílico activado para proporcionar derivados de acilsulfamida (2). Los intermedios como 2 pueden convertirse en compuestos de fórmula (I), como se ha descrito en el presente documento.

Esquema X

Debe observarse que los derivados de acilsulfamida pueden prepararse también a partir de ácidos carboxílicos tripeptídicos en un procedimiento de una etapa, como se define en el Esquema XI.

Esquema XI

Los elementos P1 para generar compuestos de fórmula (I), en algunos casos, están disponibles en el mercado, pero

10 en otros se sintetizan usando los procedimientos conocidos por un experto en la materia y, en un sentido no limitante, están descritos en el presente documento y posteriormente se incorporan en los compuestos de fórmula (I) usando los procedimientos descritos en el presente documento. Los ciclopropilaminoácidos P1 sustituidos pueden sintetizarse siguiendo el procedimiento general esbozado en el Esquema XII.

El tratamiento de la imina (1) disponible en el mercado, o fácilmente sintetizada con 1,4-dihalobuteno (2), en

15 presencia de una base, produce y proporciona la imina resultante (3). La hidrólisis ácida de (3) proporciona entonces (4), que tiene un sustituyente alilo syn respecto al grupo carboxilo como producto principal. El resto amina de (4) puede protegerse usando un grupo Boc para proporcionar el aminoácido (5) totalmente protegido. Este intermedio es un racemato que puede resolverse por un procedimiento enzimático, en el que el resto éster de (5) se escinde mediante una proteasa para proporcionar el ácido carboxílico correspondiente. Sin desear quedar ligado a teoría

20 particular alguna, se cree que esta reacción es selectiva en tanto que los enantiómeros experimentan la reacción a una velocidad mucho mayor que su imagen especular, proporcionando una resolución cinética del racemato intermedio. En una realización de los ejemplos citados en el presente documento, el estereoisómero para integración en compuestos de fórmula (I) es (5a), que aloja la estereoquímica (1R, 2S). En presencia de la enzima, este enantiómero no experimenta escisión del éster y, de esta manera, este enantiómero (5a) se recupera de la mezcla

25 de reacción. Sin embargo, el otro enantiómero (5b) que aloja la estereoquímica (1S, 2R) experimenta escisión del éster, es decir, hidrólisis para proporcionar el ácido libre (6). Tras completarse esta reacción, el éster (5a) puede separarse del producto ácido (6) por procedimientos rutinarios, tales como, por ejemplo procedimientos de extracción acuosa o cromatografía.

Esquema XII

Los procedimientos no limitantes para preparar intermedios P2 y los compuestos de fórmula (I) se muestran en los esquemas a continuación. Debe observarse que, en muchos casos, las reacciones se representan para la única 5 posición de un intermedio. Sin embargo, debe entenderse que dichas reacciones podrían usarse para conferir modificaciones o transposiciones dentro de este intermedio. Además, dichos intermedios, condiciones de reacción y procedimientos dados en los ejemplos específicos son ampliamente aplicables a compuestos con otros patrones de sustitución. Por ejemplo, la síntesis de los elementos P2 encontrada en los compuestos de fórmula (I) del Esquema XIII pueden prepararse siguiendo la trayectoria sintética definida. En el mismo, N-Boc-4-oxo-L-prolina disponible en

10 el mercado se trata con un agente organometálico, tal como un reactivo de Grignard (o, como alternativa, una especie de alquilo o aril litio o, como alternativa, una especie de alquil o aril cinc) para proporcionar el intermedio (2) en el que la posición C4 de la prolina lleva un sustituyente R3 y un grupo hidroxi terciario libre. El intermedio (2) puede estar acoplado al fragmento P1-P1’ como se muestra y el intermedio (3) resultante convertirse en los compuestos de fórmula (I) como se muestra.

15 Esquema XIII

En el Esquema XIV se muestra un enfoque alternativo a la síntesis de los compuestos de fórmula (I), como se representa en el Esquema XIII. La funcionalización de la posición C4 del grupo prolina ocurre por adición de

Grignard en una fase posterior del intermedio (5) para proporcionar compuestos de fórmula (I). El intermedio (5) está disponible midiendo una secuencia en 4 etapas que comienza con el intermedio (1) disponible en el mercado, cuya primera etapa implica el acoplamiento de (1) a un intermedio P1-P1’, acoplando los reactivos establecidos en la técnica. La desprotección catalizada por ácido del grupo N-Boc del intermedio (2) proporciona el intermedio amina libre (3) que posteriormente se acopla con el fragmento P3-P4 para proporcionar el intermedio (4). La oxidación selectiva del grupo hidroxi C4 en el intermedio (4) para proporcionar el intermedio (5) puede conseguirse usando reactivos de oxidación, tales como el reactivo de Dess-Martin.

Esquema XIV

10 Los compuestos de fórmula (I) en la que R4 es un hidrógeno pueden sintetizarse a partir del compuesto de fórmula

(I) correspondiente, en el que R4 es un grupo hidroxi. Como alternativa, un compuesto de fórmula (I) en la que R es un hidrógeno puede sintetizarse a partir de cualquiera de los intermedios usados para la preparación de compuestos de fórmula (I) en el que R4 es un grupo hidroxi. Por ejemplo, los compuestos de fórmula (I) en la que R4 es un hidrógeno pueden prepararse como se muestra en el Esquema XV. Dichos compuestos (3) pueden prepararse a 15 partir de los análogos hidroxi (1) correspondientes. El procedimiento para la formación de los compuestos como (3), a partir de compuestos como (1), requiere una reducción o desoxigenación del grupo hidroxi C4 prolina. Hay una cantidad considerable de documentación en la técnica establecida para la reducción y desoxigenación de alcoholes, particularmente alcoholes terciarios, que podría proporcionarse para la formación de los compuestos del tipo (3) a partir de compuestos de tipo (1). Por ejemplo, la reducción directa de alcoholes al alcano correspondiente 20 (Procedimiento 1 del Esquema XV) se ha informado en la siguiente referencia: J. Org. Chem. 2001, 66, 7741. En la misma, se describe la reducción de alcoholes a alcanos, en la que dicho alcohol se trata con clorodifenilsilano y una cantidad catalítica de tricloruro de indio en un disolvente, tal como dicloroetano, para proporcionar el alcano correspondiente. Dicha reacción puede realizare a temperatura ambiente, aunque en algunos casos puede requerirse calentamiento. Un procedimiento alternativo para la formación de compuesto de fórmula (I), en la que R4 25 es un hidrógeno, a partir del compuesto de fórmula (I) en la que R4 es un grupo hidroxi, se muestra como Procedimiento 2 en el Esquema XV. En el mismo, los compuestos de tipo (1) se convierten, en primer lugar, en alcoholes activados (2) y estos intermedios se reducen al alcano correspondiente (por ejemplo, usando un procedimiento de desoxigenación de Barton). Como alternativa, los alcoholes activados, como se muestra en 2, pueden reducirse a los alcanos correspondientes, por ejemplo usando agentes reductores. Estos procedimientos

30 para la conversión de 1 en 3 en el Esquema XV los conocen bien los expertos en la materia.

Esquema XV

Debe observarse que la adición de agentes organometálicos al resto cetona del derivado de prolina 1 (Esquema XVI) está bien establecida en la técnica. Por ejemplo, Hruby y colaboradores (J. Org. Chem. 2001, 66, 3593) han 5 descrito la adición de bromuro de fenilmagnesio a intermedios de estructura general 1 (Esquema XVI). Estos hallazgos proporcionan la evidencia de que los rendimientos óptimos de los productos de adición 1,2 deseados (2, del Esquema XVI) se obtienen cuando se emplea un grupo éster terc-butílico como grupo protector del resto carboxilo C2. Además, este trabajo proporciona evidencia clara en forma de cristalografía de rayos X como la resolución estereoquímica de esta reacción de adición. Específicamente, como resultado de la adición de Grignard 10 mencionada anteriormente a la cetona 1, se obtuvo un solo producto, en el que el grupo hidroxilo C4 y el grupo carboxilo C2 asumen una orientación relativa syn alrededor del anillo de cinco miembros. A partir de esta determinación de estructura, se dedujo que la selectividad de caras en la adición de R3M a la cetona de 1 era alfa en el contexto de la estructura 1 del Esquema XVI. Es decir, la selectividad organometálica se añade a la re-cara (cara inferior) del carbonilo en 1, para proporcionar el alcohol terciario (2) correspondiente, con la estereoquímica

15 mostrada.

Esquema XVI

El trabajo mencionado anteriormente de Hruby describe la adición de un reactivo de Grignard específico a los derivados de 1 (Esquema XVI). Sin embargo, la adición de una diversidad de reactivos de Grignard a la prolina 1 se ejemplifica en la presente divulgación. El cuerpo bibliográfico que describe la adición de agentes organometálicos, incluyendo reactivos de Grignard, a cetonas es considerable, y se resume en los textos generales de la técnica, tales como: Comprehensive Organic Functional Group Transformations. Volumen 2: Synthesis: Carbon with one heteroatom attached by a single bond. Editor principal Alan. R. Katritzky, y col.1995, Capítulo 2.02, página 37. Esta clase de reacciones se describe también en Comprehensive Organic Synthesis. Editor principal Barry M Trost, Volumen 1: Additions to C-X pi-bonds (parte 1), 1991.

La investigación reciente en la técnica proporciona condiciones para la optimización adicional de los reactivos de Grignard en reacciones de adición a cetonas, y estos trabajos pueden ser útiles en la presente divulgación. Por ejemplo, Ishihara y colaboradores (Org. Lett. 2005, Vol. 7, No. 4, 573) describieron recientemente la formación y utilidad de complejos magnesio ato. Los complejos magnesio ato R3MgLi derivan de reactivos de Grignard y alquillitios. Como describe Ishihara, estos complejos proporcionan excelentes rendimientos de productos de adición 1,2 en reacciones a cetonas. En un estudio separado, Knochel y colaboradores (Angew. Chem Int. Ed. 2006, 45, 497) han descrito el uso de sales de lantánidos solubles, tales como LnCl3, junto con reactivos de organomagnesio. La presencia de estas sales de lantánido da como resultado una mejora de eficacia de la reacción de adición 1,2 a los compuestos de carbonilo. Estos trabajos y referencias citadas en los mismos, establecen el estado de la técnica con respecto a la optimización de la reacción de Grignard en adiciones simples a compuestos de carbonilo, y sirven como una fuente importante de información en la presente divulgación.

Debe observarse también que una gama de reactivos organometálicos participan en las reacciones de adición a cetonas. Dentro de este grupo de trabajos se incluyen reactivos tales como reactivos de arillitio, alquillitio y heteroarillitio, que se sabe bien que se añaden de una manera 1,2 a los restos carbonilo. Por ejemplo, en un estudio reciente de Dondoni y colaboradores (J. Org. Chem. 2005, 70, 9257), el benzotioazol se litia usando BuLi y la especie de C2-litio resultante se añade de una manera 1,2 a una lactona. A modo de analogía, se esperaría que el benzotiazol litiado se añadiera de forma 1,2 a la cetona 1 del Esquema XVI, para proporcionar un intermedio como el 2a.

Un experto en la materia reconocerá que los reactivos organometálicos derivados de heterociclos, tales como oxaxoles y tiazoles e imidazoles, podrían participar también en las reacciones de adición 1,2 a la cetona 1. Hay un grupo considerable de bibliografía que define las condiciones únicas empleadas para cada uno de estos sistemas de heterociclo, y esta información está fácilmente disponible para un experto en la materia. Por ejemplo, el uso de reactivos organometálicos derivados de benzoxazol u oxazol, en reacciones de adición a cetonas, requiere el uso de magnesatos de litio. Las especificidades de este reciente estudio de Bayh y colaboradores se describe en J. Org. Chem., 2005, 70, 5190. La adición de benzoxazol a la cetona 1 del Esquema XVI proporcionaría acceso a los intermedios como 2b.

Hay una cantidad de bibliografía precedente para la adición a cetonas usando una amplia variedad de reactivos organometálicos derivados de heterociclos. Por ejemplo, el trabajo de Behinda y colaboradores (Tet. Lett. 42, 2001, 647), describe la formación de un benzoimidazol litiado y su adición a lactona simple. Por analogía, el uso de este benzoimidazol litiado, en las reacciones de adición a la cetona 1 del Esquema XVI, proporcionaría acceso a los intermedios como 2c. Además, un estudio reciente de Kawasaki y colaboradores (Bioorganic and Medicinal Chem. Lett. 13, 2003, 87) describe la formación de una serie de compuestos heteroaromáticos litiados y sus reacciones de adición a amidas activadas. Por analogía, el uso de estos intermedios heteroaromáticos litiados en reacciones de adición a la cetona 1 del Esquema XVI proporcionaría acceso a los intermedios 2d-2k.

El empleo de organometálicos derivados de sistemas de biarilo o heteroaril-arilo en reacciones de adición 1,2 a

cetona 1 también es pertinente para la presente divulgación. La adición de esta clase de reactivos organometálicos a la cetona proporcionaría acceso a intermedios tales como 2l y 2m. Debe observarse que, en la ejemplificación de la presente invención, puede ser necesario sintetizar organometálicos de biarilo, o heteroarilo para un uso posterior en reacciones de adición a cetona 1 del Esquema XVI. Un experto en la materia reconocería el grupo significativo de 5 bibliografía que describe la preparación de organometálicos de este tipo, y precursores de los mismos. Por ejemplo, una revisión reciente de Chinchilla y colaboradores (Chem. Rev. 2004, 104, 2667) describe la preparación de heterociclos metalizados y su utilidad. La química básica para la preparación de sistemas de biarilo o heteroaril-arilo a menudo emplea reacciones de acoplamiento de tipo Suzuki. Un conjunto de bibliografía de Gregory Fu describe el estado de la técnica en dichas reacciones de acoplamiento, y un subconjunto de estas referencias se da a

10 continuación: JACS 2004, 126, 1340; JACS, 2002,124, 13662; Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, No.11, 1945; Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, No.20, 3910; JACS 2002, 122, 4020; JACS 2001, 123, 10099; Org. Lett. 2001, Vol. 3, No. 26, 4295; Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, No.24, 3387. Además de esto hay un grupo de revisiones críticas del trabajo en el área fácilmente disponibles, tal como Rossi en Synthesis 2004, Nº 15, 2419,

Ejemplos

15 La presente divulgación se describirá ahora en conexión con ciertas realizaciones preferidas, que no pretenden limitar su alcance. De esta manera, los siguientes ejemplos, que incluyen realizaciones específicas, ilustrarán la práctica preferida de la presente invención, entendiéndose que los ejemplos son para los fines de ilustración de ciertas realizaciones y se presentan para proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácilmente entendible de sus procedimientos y aspectos conceptuales.

20 Los porcentajes expresan una relación de peso a volumen, y las proporciones en solución expresan una relación de volumen a volumen, a menos que se indique otra cosa. Los espectros de resonancia magnética nuclear (ARNm) se registraron en un espectrómetro Bruker de 300, 400 ó 500 MHz; los desplazamiento químicos (8) se presentan en partes por millón. La cromatografía ultrarrápida se realizó sobre gel de sílice (SiO2) de acuerdo con la técnica de cromatografía ultrarrápida de Still (J. Org. Chem. 1978, 43, 2923).

25 Sección A: Preparación de Intermedios:

I. Preparación de los intermedios P1:

1. Preparación de éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico: Procedimiento 1 (de 2)

30 El clorhidrato de éster etílico de glicina (303,8 g, 2,16 mol) se suspendió en terc-butilmetil éter (1,6 l). Se añadieron benzaldehído (231 g, 2,16 mol) y sulfato sódico anhidro (154,6 g, 1,09 mol) y la mezcla se enfrió a 0 ºC usando un baño de agua helada. Se añadió trietilamina (455 ml, 3,26 mol) gota a gota durante 30 minutos y la mezcla se agitó durante 48 horas a temperatura ambiente. La reacción se interrumpió después mediante la adición de agua enfriada con hielo (1 l) y la fase orgánica se separó. La fase acuosa se extrajo con terc-butilmetil éter (0,5 l) y la fase orgánica

35 combinada se lavó con una mezcla de NaHCO3 acuoso saturado (1 l) y salmuera (1 l). La solución se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró al vacío dando 392,4 g del producto N-bencil imina en forma de un aceite amarillo espeso que se usó directamente en la siguiente etapa. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) 8 1,32 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 4,24 (c, J = 7,1 Hz, 2H), 4,41 (d, J = 1,1 Hz, 2H), 7,39-7,47 (m, 3H), 7,78-7,81 (m, 2H), 8,31 (s, 1H).

A una suspensión de terc-butóxido de litio (84,06 g, 1,05 mol) en tolueno seco (1,2 l), se le añadió gota a gota una mezcla de la N-bencil imina del éster etílico de glicina (100,4 g, 0,526 mol) y trans-1,4-dibromo-2-buteno (107,0 g, 0,500 mol) en tolueno seco (0,6 l) durante 60 minutos. Una vez completada la adición, la mezcla de color rojo oscuro 5 se inactivó mediante la adición de agua (1 l) y terc-butilmetil éter (TBME, 1 l). La fase acuosa se separó y se extrajo una segunda vez con TBME (1 l). Las fases orgánicas se combinaron, se añadió HCl 1 N (1 l) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La fase orgánica se separó y se extrajo con agua (0,8 l). Las fases acuosas se combinaron después, se saturaron con sal (700 g), se añadió TBME (1 l) y la mezcla se enfrió a 0 ºC. La mezcla agitada se basificó después a pH 14 mediante la adición gota a gota de NaOH 10 N, la fase orgánica se separó, y la 10 fase acuosa se extrajo con TBME (2 x 500 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgSO4), se filtraron, y se concentraron hasta un volumen de 1 l. A esta solución de amina libre se le añadió di-tercbutildicarbonato (131,0 g, 0,6 mol) y la mezcla se agitó 4 días a temperatura ambiente. Se añadió más di-tercbutildicarbonato (50 g, 0,23 mol) a la reacción, la mezcla se calentó a reflujo durante 3 horas, y después se dejó que se enfriara a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se secó sobre MgSO4, se filtró, y se 15 concentró al vacío dando 80 g de material en bruto. Este residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (2,5 kg de SiO2, eluyendo con metanol al 1% a 2%/diclorometano) dando 57 g (53%) de éster etílico del ácido N-Boc(1R,2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico en forma de un aceite de color amarillo que solidificó mientras reposaba en el frigorífico: RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) 8 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,431,49 (m, 1H), 1,76-1,82 (m a, 1H), 2,14 (c, J = 8,6 Hz, 1H), 4,18 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 5,12 (dd J=10,3, 1,7 Hz, 1H),

20 5,25 (s a, 1H), 5,29 (dd, J = 17,6, 1,7 Hz, 1H), 5,77 (ddd, J = 7,6, 10,3, 8,9 Hz, 1H); EM m/z 254,16 (M-1)

El éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico (9,39 g, 36,8 mmol) se disolvió en HCl 4 N/dioxano (90 ml, 360 mmol) y se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró para suministrar clorhidrato del éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2

25 vinilciclopropano carboxílico con rendimiento cuantitativo (7 g, 100%). RMN 1H (metanol-d4) 8 1,32 (t, J = 7,1, 3H), 1,72 (dd, J = 10,2, 6,6 Hz, 1H), 1,81 (dd, J = 8,3, 6,6 Hz, 1H), 2,38 (c, J = 8,3 Hz, 1H), 4,26-4,34 (m, 2H), 5,24 (dd, 10,3, 1,3 Hz, 1H) 5,40 (d, J = 17,2, 1H), 5,69-5,81 (m, 1H).

Ruta alternativa para la preparación de clorhidrato del éster etílico del ácido N-Boc-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico: Procedimiento 2 (de 2)

A una solución de terc-butóxido potásico (11,55 g, 102,9 mmol) en THF (450 ml) a -78 ºC se le añadió la N,Ndibencil imina de éster etílico de glicina (25,0 g, 93,53 mmol) disponible en el mercado en THF (112 ml). La mezcla de reacción se calentó a 0 ºC, se agitó durante 40 minutos, y después se volvió a enfriar a -78 ºC. A esta solución se le añadió trans-1,4-dibromo-2-buteno (20,0 g, 93,50 mmol), la mezcla se agitó durante 1 hora a 0 ºC y se enfrió de

nuevo a -78 ºC. Se añadió terc-butóxido potásico (11,55 g, 102,9 mmol), la mezcla se calentó inmediatamente a 0 ºC, y se agitó una hora más antes de concentrarla al vacío. El producto en bruto se recogió en éter dietílico (530 ml), se añadió una solución 1 N de HCl ac. (106 ml, 106 mmol) y la mezcla bifásica resultante se agitó durante 3,5 horas a temperatura ambiente. Las fases se separaron y la fase acuosa se lavó con éter dietílico (2 x) y se basificó con una 5 solución ac. saturada de NaHCO3. La amina deseada se extrajo con éter dietílico (3 x) y el extracto orgánico combinado se lavó con salmuera, se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para obtener la amina libre. Este material se trató con una solución 4 N de HCl en dioxano (100 ml, 400 mmol) y se concentró dando clorhidrato del éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico en forma de un semi-sólido pardo (5,3 g, rendimiento del 34%) idéntico al material obtenido del procedimiento A, excepto por la presencia de una pequeña

10 impureza aromática no identificada (8%).

2. Resolución de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico

Resolución A

A una solución acuosa de tampón fosfato sódico (0,1 M, 4,25 l, pH 8) alojado en un reactor encamisado de 12 litros,

15 mantenido a 39 ºC, y agitado a 300 rpm, se le añadieron 511 gramos de Alcalase 2.4L (aproximadamente 425 ml) (Novozymes North America Inc.). Cuando la temperatura de la mezcla alcanzó los 39 ºC, el pH se ajustó a 8,0 mediante la adición de un NaOH al 50% en agua. Una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico (85 g) en 850 ml de DMSO se añadió después durante un periodo de 40 minutos. La temperatura de reacción se mantuvo después a 40 ºC durante 24,5 horas, tiempo durante el cual el

20 pH de la mezcla se ajustó a 8,0 en los puntos temporales de 1,5 horas y 19,5 horas usando NaOH al 50% en agua. Después de 24,5 horas, se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 97,2%, y la reacción se enfrió a temperatura ambiente (26 ºC) y se agitó durante una noche (16 horas) después de que se determinara que el exceso enantiomérico del éster era del 100%. El pH de la mezcla de reacción se ajustó después a 8,5 con NaOH al 50% y la mezcla resultante se extrajo con MTBE (2 x 2 l). El extracto de MTBE combinado se lavó después con

25 NaHCO3 al 5% (3 x 100 ml), agua (3 x 100 ml), y se concentró al vacío dando el éster etílico del ácido N-Boc-(1R, 2S)/-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico enantioméricamente puro en forma de un sólido amarillo claro (42,55 g; pureza: 97% a 210 nm, no contenía ácido; exceso enantiomérico ("ee") del 100%.

La fase acuosa del procedimiento de extracción se acidificó después a pH 2 con H2SO4 al 50% y se extrajo con MTBE (2 x 2 l). El extracto de MTBE se lavó con agua (3 x 100 ml) y se concentró dando el ácido en forma de un

30 sólido amarillo claro (42,74 g; pureza: 99% a 210 nm, no contenía éster).

éster

ácido

Espec. Masas Alta Resolución

(+) ENI, C13H22NO4, [M+H]+, calc. 256,1549, encontrado 256,1542 (-) ENI, C11H16O4, [M-H]-, calc. 226,1079, encontrado 226,1089

Desplazamiento químico observado por RMN Disolvente: CDCl3 (protón 8 7,24, C-13 8 77,0) Bruker DRX-500C: protón 500,032 MHz, carbono 125,746 MHz

Posición

Protón (patrón) ppm C-13 ppm Protón (patrón) ppm C-13 ppm

1

--- 40,9 --- 40,7

2

2,10 (c, J = 9,0 Hz) 34,1 2,17 (c, J = 9,0 Hz) 35,0

3a

1,76 (a) 23,2 1,79 (a) 23,4

3b

1,46 (a) 1,51, (a)

4

--- 170,8 --- 175,8

5

5,74 (ddd, J = 9,0, 10,0, 17,0 Hz) 133,7 5,75 (m) 133,4

6a

5,25 (d, J = 17,0 Hz) 117,6 5,28 (d, J = 17,0 Hz) 118,1

6b

5,08 (dd, J = 10,0, 1,5 Hz) 5,12 (d, J = 10,5 Hz)

7

--- 155,8 --- 156,2

8

--- 80,0 --- 80,6

9

1,43 (s) 28,3 1,43 (s) 28,3

10

4,16 (m) 61,3 --- ---

11

1,23 (t, J = 7,5 Hz) 14,2 --- ---

Resolución B

A 0,5 ml de tampón Heps·Na 100 mM (pH 8,5) en un pocillo de una placa de 24 pocillos (capacidad: 10 ml/pocillo), se le añadieron 0,1 ml de Savinase 16.0L (proteasa de Bacillus clausii) (Novozymes North America Inc.) y una 5 solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/ (1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico (10 mg) en 0,1 ml de DMSO. La placa se cerró herméticamente y se incubó a 250 rpm a 40 ºC. Después de 18 horas, se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 44,3% como sigue: se retiraron 0,1 ml de la mezcla de reacción y se mezclaron bien con 1 ml de etanol; después de la centrifugación, 10 microlitros ("!L") del sobrenadante se analizaron por HPLC quiral. A la mezcla de reacción restante, se le añadieron 0,1 ml de DMSO, y la placa se

10 incubó durante 3 días más a 250 rpm a 40 ºC, después de añadir 4 ml de etanol al pocillo. Después de la centrifugación, 10 !l del sobrenadante se analizaron por HPLC quiral y se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 100%.

Resolución C

A 0,5 ml de tampón Heps·Na 100 mM (pH 8,5) en un pocillo de una placa de 24 pocillos (capacidad: 10 ml/pocillo),

15 se le añadieron 0,1 ml de Esperase 8.0L, (proteasa de Bacillus halodurans) (Novozymes North America Inc.) y una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R, 2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico (10 mg) en 0,1 ml de DMSO. La placa se cerró herméticamente y se incubó a 250 rpm a 40 ºC. Después de 18 horas, se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 39,6% como sigue: 0,1 ml de la mezcla de reacción se retiraron y se mezclaron bien con 1 ml de etanol; después de la centrifugación, 10 !l del sobrenadante se analizaron

20 por HPLC quiral. A la mezcla de reacción restante, se le añadieron 0,1 ml de DMSO, y la placa se incubó durante 3 días más a 250 rpm a 40 ºC, después de añadir 4 ml de etanol al pocillo. Después de la centrifugación, 10 !l del sobrenadante se analizaron por HPLC quiral y se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 100%.

El análisis de las muestras se realizó de la siguiente manera: 1) Preparación de la muestra: aproximadamente 0,5 ml de la mezcla de reacción se mezclaron bien con 10 volúmenes de etanol. Después de la centrifugación, 10 !l del sobrenadante se inyectaron en una columna de HPLC.

2) Determinación de la conversión:

Columna: YMC ODS A, 4,6 x 50 mm, S-5 !m Disolvente: A, HCl 1 mM en agua; B, acetonitrilo Gradiente: 30% de B durante 1 minuto; del 30% al 45% de B durante 0,5 minutos; 45% B durante 1,5 minutos; del 45% al 30% de B durante 0,5 minutos. Caudal: 2 ml/min Detección UV: 210 nm Tiempo de retención: ácido, 1,2 minutos; éster, 2,8 minutos.

3) Determinación del exceso enantiomérico para el éster:

Columna: CHIRACEL OD-RH, 4,6 x 150 mm, S-5 !m Fase móvil: acetonitrilo/HClO4 50 mM en agua (67/33) Caudal: 0,75 ml/minutos. Detección UV: 210 nm. Tiempo de retención: ácido (1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico 5,2 minutos; Racemato éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico 18,5 minutos y 20,0 minutos; éster etílico del ácido (1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico 18,5 minutos.

Resolución D

Se mantuvieron 5 l de tampón fosfato sódico 0,3 M (pH 8) a 38 ºC en un reactor encamisado de 20 l, agitado a 130 rpm. Se añadieron cuatro litros de Alcalase 2.4L (Novozymes North America Inc.) y 1 litro de agua DI al reactor. Cuando la temperatura de la mezcla a aproximó a 38 ºC, el pH se ajustó a 7,8 con NaOH 10 N. Una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R, 2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico (500 gramos) en 5 litros de DMSO se añadió al reactor durante un periodo de 1 hora a través de un embudo de adición. La temperatura de reacción se ajustó después a 48 ºC. Después de 21 horas, el exceso enantiomérico del éster alcanzó el 99,3%. El calentamiento se detuvo a las 24 horas y la reacción se enfrió lentamente a temperatura ambiente (aproximadamente 25 ºC) y se agitó durante una noche. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8,5 con NaOH 10 N y la mezcla se extrajo con MTBE (2 x 4 l). El extracto de MTBE combinado se lavó con NaHCO3 al 5% (3 x 400 ml) y agua (3 x 400 ml), y se concentró dando éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinil-ciclopropano carboxílico enantioméricamente puro en forma de cristales amarillo claro (259 g; pureza: 96,9% a 210 nm, no contenía ácido; 100% ee).

Resolución E

Se mantuvieron 10 l de tampón fosfato sódico 0,1 M (pH 8) a 40 ºC en un reactor encamisado de 20 l, y agitado a 360 rpm. Se añadieron 1,5 l de Alcalase 2.4L (Novozymes North America Inc.) al reactor. Cuando la temperatura de la mezcla se aproximó a 38 ºC, el pH se ajustó a 8,0 con NaOH 10 N. Una solución del éster etílico del ácido N-Boc(1R,2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico (200 gramos) en 2 l de DMSO se añadió al reactor durante un periodo de 1 hora a través de un embudo de adición. La temperatura de reacción se ajustó después a 40 ºC. Después de 3 horas, el pH se ajustó a 8,0 con NaOH 10 N. Después de 21 horas, la reacción se enfrió a 25 ºC. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8,5 con NaOH 10 N y la mezcla se extrajo con MTBE (2 x 5 l). The extracto de MTBE combinado se lavó con NaHCO3 al 5% (3 x 500 ml) y agua (3 x 200 ml), y se concentró dando 110 g de aceite amarillo. El aceite se llevó a temperatura ambiente bajo un vacío doméstico y dio éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinil-ciclopropano carboxílico enantioméricamente puro en forma de cristales de tipo varilla larga incoloros (101 g; pureza: 97,9% a 210 nm, no contenía ácido; 100% ee).

La estructura cristalina del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico enantioméricamente puro se ha caracterizado por análisis monocristalino (rayos X NB Nº: 52795-093, código ref: 634592N1). La configuración absoluta no se ha establecido por falta de un centro quiral conocido o un átomo o átomos más pesados. Una estructura de cadena a lo largo del eje cristalográfico a se forma por enlace del hidrógeno intermolecular entre el grupo amida y el átomo de oxígeno del carbonilo (N...O 3,159 A).

Estructura del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico:

Datos del Cristal:

Fórmula química: C13H21N1O4 Sistema cristalino: Ortorrómbico Grupo espacial: P212121

a = 5,2902(1) Å a=90º b = 13,8946(2) Å 1=90º c = 19,9768(3) Å y=90º V = 1468,40(4) Å3

Z = 4 dx = 1,155 g cm-3

Nº de reflexiones por parámetros de red: 6817 Intervalo 8 para parámetros de red (º):

2,2-65,2 Coeficiente de absorción (mm-1): 0,700

Resolución F

Experimental:

Cristalización

Fuente del cristal: MTBE Descripción del cristal: varillas incoloras Tamaño del cristal (mm): 0,12 X 0,26 X 0,30

Recogida de Datos

Temperatura (K): 293

8máx(º): 65,2 (CuKa)

Nº de reflexiones medido: 7518

Nº de reflexiones independientes: 2390 (Rint =

0,0776) Nº de reflexiones observadas (I 2 2c: 2284

Corrección de absorción (Tmín-Tmáx): 0,688-1,000

Se mantuvieron 5 l de tampón borato sódico 0,2 M (pH 9) a 45 ºC en un reactor encamisado de 20 l y agitado a 400

5 rpm. Se añadieron 3 l de agua DI y 4 l de Savinase 16L, tipo EX (Novozymes North America Inc.) al reactor. Cuando la temperatura de la mezcla se aproximó a 45 ºC, el pH se ajustó a 8,5 con NaOH 10 N. Una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico (200 gramos) en 2 l de DMSO se añadió al reactor durante un periodo de 40 minutos a través de un embudo de adición. La temperatura de reacción se ajustó después a 48 ºC. Después de 2 horas, el pH se ajustó a pH 9,0 con NaOH 10 N. A las 18 horas,

10 el exceso enantiomérico del éster alcanzó el 72% y el pH se ajustó a 9,0 con NaOH 10 N. A las 24 horas la temperatura se bajó a 35 ºC. A las 42 horas la temperatura se subió a 48 ºC y el pH se ajustó a 9,0 con NaOH 10 N. El calentamiento se detuvo a las 48 horas y la reacción se enfrió lentamente a temperatura ambiente (aproximadamente 25 ºC) y se agitó durante una noche. A las 66 horas, el pH de la mezcla de reacción era de 8,6. La mezcla se extrajo con MTBE (2 x 4 l). El extracto de MTBE combinado se lavó con NaHCO3 al 5% (6 x 300 ml) y

15 agua (3 x 300 ml), y se concentró dando éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico enantioméricamente puro en forma de cristales amarillo claro (101A g; pureza: 95,9% a 210 nm, no contenía ácido; 98,6% ee).

3. Preparación de clorhidrato del éster etílico del ácido (1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico quiral

Se agitó éster etílico del ácido N-BOC-(1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico (8,5 g, 33,3 mmol) en una atmósfera de N2 con 200 ml de HCl 4 N/dioxano (Aldrich) a temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se retiró a presión reducida manteniendo la temperatura por debajo de 40 ºC. Esto dio 6,57 g (�100%) de clorhidrato del éster etílico del ácido (1R,2S)-1-amino-2-vinil-ciclopropanocarboxílico en forma de un sólido de color castaño claro. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 8 1,31 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,69-1,82 (m, 2H), 2,38 (c, J = 8,8 Hz, 1H), 4,29 (c, J = 7,0 Hz, 2H), 5,22 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 5,40 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,69-5,81 (m, 1H). EM m/z 156 (M++1).

4. Preparación de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)-1-amino-2-ciclopropilciclopropano carboxílico

10 Una solución de ácido N-Boc-(1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico (255 mg, 1,0 mmol) en éter (10 ml) se trató con acetato de paladio (5 mg, 0,022 mmol). La solución de color naranja/rojo se puso en una atmósfera de N2. Un exceso de diazometano en éter se añadió gota a gota durante el transcurso de 1 hora. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. El exceso de diazometano se retiró usando una corriente de nitrógeno. La solución resultante se concentró por evaporación rotatoria dando el producto en bruto. La

15 cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo al 10%/hexano) proporcionó 210 mg (78%) de éster etílico del ácido NBoc-(1R,2S)-1-amino-2-ciclopropilciclopropano carboxílico en forma de un aceite incoloro. EM m/e 270 (M++1).

5.

El ácido 1-t-butoxicarbonilamino-ciclopropano-carboxílico está disponible en el mercado

6.

Preparación de clorhidrato del éster metílico del ácido 1-aminociclobutanocarboxílico

Se disolvió ácido 1-aminociclobutanocarboxílico (100 mg, 0,869 mmol) (Tocris) en 10 ml de metanol. Se burbujeó HCl gas durante 2 horas. La mezcla de reacción se agitó durante 18 horas, y después se concentró al vacío dando 144 mg de un aceite de color amarillo. La trituración con 10 ml de éter dietílico proporcionó 100 mg del producto del título en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CDCl3) 8 2,10-2,25 (m, 1H), 2,28-2,42 (m, 1H), 2,64-2,82 (m,

25 4H), 3,87 (s, 3H), 9,21 (s a, 3H).

7. Preparación de éster terc-butílico del ácido (1R,2R)/(1S,2S) 1-amino-2-etilciclopropanocarboxílico racémico

etilo syn respecto a carboxi

Etapa 1: Preparación de di-terc-butil éster del ácido 2-etilciclopropano-1,1-dicarboxílico, mostrado a continuación

A una suspensión de cloruro de benciltrietilamonio (21,0 g, 92,2 mmol) en una solución acuosa de NaOH al 50% (92,4 g en 185 ml de H2O) se le añadió 1,2-dibromobutano (30,0 g, 138,9 mmol) y malonato de di-terc-butilo (20,0 g, 5 92,5 mmol). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente 18 horas a temperatura ambiente, añadiéndose después una mezcla de hielo y agua. El producto en bruto se extrajo con diclorometano (3 x) y se lavó secuencialmente con agua (3 x) y salmuera y los extractos orgánicos se combinaron. La fase orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró al vacío. El residuo resultante se sometió a cromatografía ultrarrápida (100 g de SiO2, éter dietílico al 3% en hexano) dando el producto del título (18,3 g, 67,8 mmol, rendimiento del 73%) que se usó directamente en la

10 siguiente reacción.

Etapa 2: Preparación de éster terc-butílico del ácido 2-etilciclopropano-1,1-dicarboxílico racémico, mostrado a continuación

El producto de la Etapa I (18,3 g, 67,8 mmol) se añadió a una suspensión de terc-butóxido potásico (33,55 g, 299,0

15 mmol) en éter seco (500 ml) a 0 ºC, seguido de H2O (1,35 ml, 75,0 mmol) y se agitó vigorosamente durante una noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se vertió en una mezcla de hielo y agua y se lavó con éter dietílico (3 x). La fase acuosa se acidificó con una solución ac. de ácido cítrico al 10% a 0 ºC y se extrajo con acetato de etilo (3 x). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (2 x) y salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron, y se concentraron al vacío dando el producto del título en forma de un aceite de color amarillo pálido (10 g,

20 46,8 mmol, rendimiento del 69%).

Etapa 3: Preparación de éster terc-butílico del ácido (1R,2R)/(1S,2S) 2-etil-1-(2trimetilsilaniletoxicarbonilamino)ciclopropano-carboxílico, mostrado a continuación

A una suspensión del producto de la Etapa 2 (10 g, 46,8 mmol) y 3 g de tamices moleculares de 4 Å recién activados

25 en benceno seco (160 ml), se le añadió trietilamina (7,50 ml, 53,8 mmol) y DPPA (11 ml,10,21 mmol). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 3,5 horas, después se le añadió 2-trimetilsilil-etanol (13,5 ml, 94,2 mmol), y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante una noche. La mezcla de reacción se filtró, se diluyó con éter dietílico, se lavó con una solución acuosa de ácido cítrico al 10%, agua, NaHCO3 acuoso saturado, agua (2 x) y salmuera (2X, se secó (MgSO4), se filtró, y se concentró al vacío. El residuo se suspendió con 10 g de resina

30 aceptora de poliisocianato Aldrich en 120 ml de diclorometano, se agitó a temperatura ambiente durante una noche y se filtró dando el producto del título (8 g, 24,3 mmol; 52%) en forma de un aceite de color amarillo pálido: RMN 1H (CDCl3) 8 0,03 (s, 9H), 0,97 (m, 5H), 1,20 (m a, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,40-1,70 (m, 4H), 4,16 (m, 2H), 5,30 (s a, 1H).

Etapa 4: Preparación de éster terc-butílico del ácido (1R,2R)/(1S,2S) 1-amino-2-etilciclopropanocarboxílico racémico, mostrado a continuación

etilo syn respecto a carboxi

Al producto de la Etapa 3 (3 g, 9 mmol) se le añadió una solución de TBAF 1,0 M en THF (9,3 ml, 9,3 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo durante 1,5 horas, se enfrió a temperatura ambiente y después se diluyó con 500 ml de acetato de etilo. La solución se lavó sucesivamente con agua (2x100 ml) y salmuera (2x100 ml), se secó (MgSO4) se filtró, y se concentró al vacío proporcionando el intermedio del título.

II. Preparación de los Intermedios P1’

1. Preparación de Ciclopropilsulfonamida Procedimiento 1 (de 2):

Una solución de 100 ml de THF enfriado a 0 ºC se burbujeó en amoniaco gaseoso hasta que se alcanzó la

10 saturación. A esta solución se le añadió una solución de 5 g (28,45 mmol) de cloruro de ciclopropilsulfonilo (adquirido en Array Biopharma) en 50 ml de THF, la solución se calentó a temperatura ambiente durante una noche y se agitó un día más. La mezcla se concentró hasta que quedaron 1-2 ml de disolvente, se aplicó sobe un lecho corto de SiO2 de 30 g (eluyendo con acetato de etilo al 30% a 60% / hexanos) dando 3,45 g (100%) de ciclopropil sulfonamida en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (metanol-d4) 8 0,94-1,07 (m, 4H), 2,52-2,60 (m, 1H); RMN 13C (metanol

15 d4) 8 5,92, 33,01.

Procedimiento 2 (de 2):

Etapa 1: Preparación de-N-terc-butil-(3-cloro)propilsulfonamida

Se disolvió terc-butilamina (3,0 mol, 315,3 ml) en THF (2,5 l). La solución se enfrió a - 20 ºC. Se añadió cloruro de 3

20 cloropropanosulfonilo (1,5 mol, 182,4 ml) lentamente. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 24 horas. La mezcla se filtró, y el filtrado se concentró al vacío. El residuo se disolvió en diclorometano (2,0 l). La solución resultante se lavó con HCl 1 N (1,0 l), agua (1,0 l) y salmuera (1,0 l) y se secó sobre Na2SO4. Se filtró y se concentró al vacío dando un sólido ligeramente amarillo, que se cristalizó en hexano dando el producto en forma de un sólido de color blanco (316,0 g, 99%). RMN 1H (CDCl3) 8 1,38 (s, 9H), 2,30-2,27

25 (m, 2H), 3,22 (t, J = 7,35 Hz, 2H), 3,68 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 4,35 (a, 1H).

Etapa 2: Preparación de terc-butilamida del ácido ciclopropanosulfónico

A una solución de N-terc-butil-(3-cloro)propilsulfonamida (2,14 g, 10,0 mmol) en THF (100 ml) se le añadió n-butillitio (2,5 M en hexano, 8,0 ml, 20,0 mmol) a -78 ºC. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente

30 durante un periodo de 1 hora. Los volátiles se retiraron al vacío. El residuo se repartió entre acetato de etilo y agua (200 ml, 200 ml). La fase orgánica separada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se recristalizó en hexano produciendo el producto deseado en forma de un sólido de color blanco (1,0 g, 56%). RMN 1H (CDCl3) 8 0,98-1,00 (m, 2H), 1,18-1,19 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 2,48-2,51 (m, 1H), 4,19 (a, 1H).

Etapa 3: Preparación de Ciclopropilsulfonamida

Una solución de terc-butilamida del ácido ciclopropanosulfónico (110,0 g, 0,62 mol) en TFA (500 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Los volátiles se retiraron al vacío. El residuo se recristalizó en acetato de etilo/hexano (60 ml/240 ml) produciendo el producto deseado en forma de un sólido de color blanco (68,5 g, 91%). RMN 1H (DMSO-d6) 8 0,84-0,88 (m, 2H), 0,95-0,98 (m, 2H), 2,41-2,58 (m, 1H), 6,56 (a, 2H).

40 2. Preparación de Ciclopropilsulfonamidas sustituidas en C1 2a. Preparación de N-terc-butil-(1-metil)ciclopropil-sulfonamida

Etapa 1: Preparación de N-terc-butil-(3-cloro)propilsulfonamida.

Preparada como se ha descrito anteriormente. Etapa 2: Preparación de N-terc-butil-(1-metil)ciclopropil-sulfonamida.

Una solución de N-terc-butil-(3-cloro)propilsulfonamida (4,3 g, 20 mmol) se disolvió en THF seco (100 ml) y se enfrió

10 a -78 ºC. A esta solución se le añadió n-butillitio (17,6 ml, 44 mmol, 2,5 M en hexano) lentamente. El baño de hielo seco se retiró y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante un periodo de 1,5 horas. Esta mezcla se enfrió después a - 78 ºC, y se añadió una solución de n-butillitio (20 mmol, 8 ml, 2,5 M en hexano). La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente, se volvió a enfriar a -78 ºC durante un periodo de 2 horas y se añadió una solución pura de yoduro de metilo (5,68 g, 40 mmol). La mezcla de reacción se dejó calentar a

15 temperatura ambiente durante una noche, después se inactivó con NH4Cl saturado (100 ml) a temperatura ambiente. Se extrajo con acetato de etilo (100 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera (100 ml), se secó (MgSO4), se filtró, y se concentró al vacío dando un aceite de color amarillo que se cristalizó en hexano dando el producto en forma de un sólido de color ligeramente amarillo (3,1 g, 81%): RMN 1H (CDCl3) 8 0,79 (m, 2H), 1,36 (s, 9H), 1,52 (m, 2H), 1,62 (s, 3H), 4,10 (s a, 1H).

20 Etapa 3: Preparación de 1-metilciclopropilsulfonamida

Una solución de N-terc-butil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida (1,91 g, 10 mmol) se disolvió en TFA (30 ml), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El disolvente se retiró al vacío dando un aceite de color amarillo que se cristalizó en acetato de etilo/hexano (1:4, 40 ml) produciendo el Ejemplo 3, 1

25 metilciclopropilsulfonamida, en forma de un sólido de color blanco (1,25 g, 96%): RMN 1H (CDCl3) 8 0,84 (m, 2H), 1,41 (m, 2H), 1,58 (s, 3H), 4,65 (s a, 2H). Anál. Calc. para C4H9NO2S: C, 35,54; H, 6,71; N, 10,36, Encontrado: C, 35,67; H, 6,80; N, 10,40.

2b. Preparación de 1-Bencilciclopropilsulfonamida

30 Etapa 1: Preparación de N-terc-butil-(1-bencil)ciclopropil-sulfonamida.

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 60% usando el procedimiento descrito para la síntesis de N-tercbutil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida, excepto que se usaron 1,05 equivalentes de bromuro de bencilo, seguido de trituración con acetato de etilo al 10% en hexano: RMN 1H (CDCl3) 8 0,92 (m, 2H), 1,36 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 3,25 (s,

2H), 4,62 (s a, 1H), 7,29-7,36 (m, 5H). Etapa 2: Preparación de 1-Bencilciclopropilsulfonamida

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 66% a partir de N-terc-butil(1-bencil)ciclopropilsulfonamida usando el procedimiento descrito para la síntesis de 1-metilciclopropilsulfonamida, seguido de recristalización en la cantidad mínima de acetato de etilo al 10% en hexano: RMN 1H (CDCl3) 8 0,90 (m, 2H), 1,42 (m, 2H), 3,25 (s, 2H), 4,05 (s, 2H), 7,29 (m, 3H), 7,34 (m, 2H); RMN 13C (CDCl3) 8 11,1, 36,8, 41,9, 127,4, 128,8, 129,9, 136,5.

2c. Reparación de 1-Propilciclopropilsulfonamida

10 Este compuesto se preparó usando el procedimiento descrito para la preparación de 1-metilciclopropilsulfonamida, excepto que se utilizó haluro de propilo en lugar de yoduro de metilo en la segunda etapa de este procedimiento.

2d. Preparación de 1-alilciclopropilsulfonamida

Etapa 1: Preparación de N-terc-butil-(1-alil)ciclopropilsulfonamida

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 97% de acuerdo con el procedimiento descrito en la síntesis de Nterc-butil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida, excepto que se usaron 1,25 equivalentes de bromuro de alilo como electrófilo. El compuesto se tomó directamente en la siguiente reacción sin purificación: RMN 1H (CDCl3) 8 0,83 (m, 2H), 1,34 (s, 9H), 1,37 (m, 2H), 2,64 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 4,25 (s a, 1H), 5,07-5,10 (m, 2H), 6,70-6,85 (m, 1H).

20 Etapa 2: Preparación de 1-alilciclopropilsulfonamida

Este compuesto, 1-alilciclopropilsulfonamida, se obtuvo con un rendimiento del 40% a partir de N-terc-butil-(1alil)ciclopropilsulfonamida de acuerdo con el procedimiento descrito en la síntesis de 1-metilciclopropilsulfonamida. El compuesto se purificó por cromatografía en columna sobre SiO2 usando metanol al 2% en diclorometano como el

25 eluyente: RMN 1H (CDCl3) 8 0,88 (m, 2H), 1,37 (m, 2H), 2,66 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 4,80 (s, 2H), 5,16 (m, 2H), 5,82 (m, 1H); RMN 13C (CDCl3) 8 11,2, 35,6, 40,7, 119,0, 133,6.

2e. Preparación de 1-(1-ciclohexenil)ciclopropil-sulfonamida

Etapa 1: Preparación de N-terc-butil-[1-(1-hidroxi)ciclohexil]-ciclopropilsulfonamida

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 84% usando el procedimiento descrito para la síntesis de N-tercbutil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida, excepto que se usaron 1,30 equivalentes de ciclohexanona, seguido de recristalización en la cantidad mínima de acetato de etilo al 20% en hexano: RMN 1H (CDCl3) 8 1,05 (m, 4H), 1,26 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 1,57-1,59 (m, 6H), 1,97 (m, 2H), 2,87 (s a, 1H), 4,55 (s a, 1H).

Etapa 2: Preparación de 1-(1-ciclohexenil)ciclopropil-sulfonamida

Este compuesto, 1-(1-ciclohexenil)-ciclopropilsulfonamida, se obtuvo con un rendimiento del 85% a partir de N-tercbutil-[1-(1-hidroxi)ciclohexil]-ciclopropilsulfonamida usando el procedimiento descrito para la síntesis de 1metilciclopropilsulfonamida, seguido de recristalización en la cantidad mínima de acetato de etilo y hexano: RMN 1H

10 (DMSO-d6) 8 0,82 (m, 2H), 1,28 (m, 2H), 1,51 (m, 2H), 1,55 (m, 2H), 2,01 (s, 2H), 2,16 (s, 2H), 5,89 (s, 1H), 6,46 (s, 2H); RMN 13C (DMSO-d6) 8 11,6, 21,5, 22,3, 25,0, 27,2, 46,9, 131,6, 132,2; EM-BR (ENI): 200 (M+-1).

2f. Preparación de 1-benzoilciclo-propilsulfonamida

Etapa 1: Preparación de N-terc-butil-(1-benzoil)ciclopropil-sulfonamida

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 66% usando el procedimiento descrito para la síntesis de N-tercbutil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida, excepto que se usaron 1,2 equivalentes de benzoato de metilo como el electrófilo. El compuesto se purificó por cromatografía en columna sobre SiO2 usando diclorometano al 30% a 100% en hexano: RMN 1H (CDCl3) 8 1,31 (s, 9H), 1,52 (m, 2H), 1,81 (m, 2H), 4,16 (s a, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,57 (m, 1H),

20 8,05 (d, J = 8,5 Hz, 2H).

Etapa 2: Preparación de 1-benzoilciclo-propilsulfonamida

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 87% a partir de N-terc-butil(1-benzoil)ciclopropilsulfonamida usando el procedimiento descrito para la síntesis de 1-metilciclopropilsulfonamida, seguido de recristalización en la

25 cantidad mínima de acetato de etilo en hexano: RMN 1H (DMSO-d6) 8 1,39 (m, 2H), 1,61 (m, 2H), 7,22 (s, 2H), 7,53 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 7,65 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 8,2 Hz, 2H); RMN 13C (DMSO-d6) 8 12,3, 48,4, 128,1, 130,0, 133,4, 135,3, 192,0.

2 g. Preparación de N-terc-butil-(1-fenilaminocarboxi)-ciclopropilsulfonamida

30 Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 42% usando el procedimiento descrito para la síntesis de N-tercbutil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida usando 1 equivalente de fenilisocianato, seguido de recristalización en la cantidad mínima de acetato de etilo en hexano RMN 1H (CDCl3) 8 1,38 (s, 9H), 1,67-1,71 (m, 4H), 4,30 (s a, 1H), 7,10 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,34 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,53 (t, J = 7,5 Hz, 2H).

3. Preparación de Ciclopropanosulfonamidas sustituidas en C1. El uso de un grupo protector N-Boc

3a. Preparación de terc-butil carbamato de ciclopropilsulfonilamina, un intermedio clave en la Preparación de ciclopropilsulfonamidas sustituidas en C1

Etapa 1: Preparación de 3-cloropropilsulfonamida

Una solución de cloruro de 3-cloropropanosulfonilo (55 g, 310,7 mmol) se disolvió en THF (200 ml) y se añadió gota a gota durante 30 minutos a una solución de NH4OH (200 ml) enfriada a 0 ºC. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente, se agitó 1 hora, y la fase acuosa se repartió múltiples veces con diclorometano (4 x 500 ml). La fase de diclorometano combinada se lavó con HCl 1 N (150 ml), agua (150 ml), se secó sobre MgSO4, se filtró, y

10 se concentró al vacío. El sólido en bruto se recristalizó en la cantidad mínima de diclorometano en hexanos dando 3cloropropilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco (45,3 g, 93%). RMN 1H (CDCl3) 8 2,34 (m, 2H), 3,32 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 3,70 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 4,83 (s, 2H); RMN 13C (CDCl3) 8 27,10, 42,63, 52,57.

Etapa 2: Preparación de terc-butilcarbamato de 3-cloropropilsulfonilamina

15 A una solución de 3-cloropropilsulfonamida (30,2 g, 191,5 mmol), trietilamina (30,2 ml, 217,0 mmol) y 4-DMAP (2,40 g, 19,6 mmol) en diclorometano (350 ml), enfriada a 0 ºC, se le añadió lentamente gota a gota una solución de diterc-butildicarbonato (47,2 g, 216,9 mmol) en diclorometano (250 ml) durante 30 minutos. Se dejó que la mezcla de reacción se calentara a temperatura ambiente, se agitó 3 horas más y se repartió con HCl 1 N (300 ml), agua (300 ml) y salmuera (300 ml), se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró al vacío dando el producto en bruto. Este

20 material se trituró con 70 ml de diclorometano al 5% en hexanos dando terc-butilcarbamato de 3cloropropilsulfonilamina en forma de un sólido blanquecino (47,2 g, 96%): RMN 1H (CDCl3) 8 1,51 (s, 9H), 2,33 (m, 2H), 3,60 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 3,68 (t, J = 6,21 Hz, 2H); RMN 13C (CDCl3) 8 26,50, 27,95, 42,37, 50,40, 84,76, 149,53.

Etapa 3: Preparación de terc-butil carbamato de ciclopropilsulfonilamina

25 Una solución de n-butillitio (74,7 ml, 119,5 mmol, 1,6M en hexano) se disolvió en THF seco (105 ml) y se enfrió a -78 ºC en una atmósfera de argón. A esta solución se le añadió una solución de terc-butilcarbamato de 3cloropropilsulfonilamina (14 g, 54,3 mmol) en THF seco (105 ml) gota a gota durante 20-30 minutos. El baño de hielo seco se retiró y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante un periodo de 2 horas. La mezcla de reacción se inactivó con ácido acético glacial (3,4 ml), se concentró al vacío, y se repartió entre

30 diclorometano (100 ml) y agua (100 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera (100 ml), se secó (MgSO4), se filtró, y se concentró al vacío dando el terc-butil carbamato de ciclopropilsulfonilamina en forma de un sólido blanquecino ceroso (12,08 g, 100%): RMN 1H (CDCl3) 8 1,10 (m, 2H), 1,34 (m, 2H), 1,50 (s, 9H), 2,88 (m, 1H), 7,43 (s, 1H). RMN 13C (CDCl3) 8 6,21, 28,00, 31,13, 84,07, 149,82.

3b. Preparación de 1-metoxi-metilciclopropil-sulfonamida

Etapa 1: Preparación de terc-butilcarbamato de 1-metoximetilciclopropilsulfonilamina

A una solución de terc-butil carbamato de ciclopropilsulfonilamina (1,0 g, 4,5 mmol) disuelto en THF (30 ml), enfriada

a -78 ºC, se le añadió n-butillitio (6,4 ml, 10,2 mmol, 1,6 M en hexano) y la mezcla de reacción se agitó durante 1

5 hora. A esta solución se le añadió una solución pura de clorometil metil éter (0,40 ml, 5,24 mmol), y se dejó que la

mezcla se calentara lentamente a temperatura ambiente durante una noche. El pH de la solución se ajustó a 3

usando HCl acuoso 1 N y después se extrajo con acetato de etilo (porciones de 4 x 50 ml). Los extractos

combinados se secaron (MgSO4), se filtraron, y se concentraron dando terc-butilcarbamato de 1

metoximetilciclopropilsulfonilamina, en forma de un sólido ceroso (1,20 g, 100%) que se usó directamente en la 10 siguiente reacción sin purificación adicional: RMN 1H (CDCl3) 8 1,03 (m, 2H), 1,52 (s, 9H), 1,66 (m, 2H), 3,38 (s, 3H),

3,68 (s, 2H), 7,54 (s, 1H); RMN 13C (CDCl3) 8 11,37, 28,29, 40,38, 58,94, 73,43, 83,61, 149,57.

Etapa 2: Preparación de 1-metoximetilciclopropisulfonamida

Una solución de terc-butilcarbamato de 1-metoximetilciclopropilsulfonilamina (1,14 g, 4,30 mmol) se disolvió en una

15 solución de TFA al 50%/diclorometano (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se cromatografió sobre 80 g de SiO2 (eluyendo con acetato de etilo al 0% a 60%/hexanos a 1-metoximetilciclopropilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco (0,55 g, 77% global en dos etapas): RMN 1H (CDCl3) 8 0,95 (m, 2H), 1,44 (m, 2H), 3,36 (s, 3H), 3,65 (s, 2H), 4,85 (s, 2H); RMN 13C (CDCl3) 8 11,17, 40,87, 59,23, 74,80; EMBR m/z 183 (M++NH4).

20 3c. Preparación de 1-ciclopropilmetilciclopropilsulfonamida

Etapa 1: Preparación de terc-butilcarbamato de 1-ciclopropilmetilciclopropilsulfonilamina

Se obtuvo terc-butilcarbamato de 1-ciclopropilmetilciclopropilsulfonilamina con un rendimiento del 92% de acuerdo

25 con el procedimiento descrito en la síntesis de terc-butilcarbamato de 1-metoximetilciclopropilsulfonilamina, excepto que se usaron 1,10 equivalentes de bromuro de ciclopropilmetilo como el electrófilo. El compuesto se usó directamente en la siguiente reacción sin purificación: RMN 1H (CDCl3) 8 0,10 (m, 2H), 0,51 (m, 2H), 0,67 (m, 1H), 1,10 (m, 2H), 1,49 (s, 9H), 1,62 (m, 2H), 1,87 (d, J = 7,0 Hz, 2H).

Etapa 2: Preparación de 1-ciclopropilmetil-ciclopropilsulfonamida

30 Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 65% a partir de terc-butilcarbamato de 1ciclopropilmetilciclopropilsulfonilamina de acuerdo con el procedimiento descrito para la síntesis de 1metoximetilciclopropilsulfonamida. El compuesto se purificó por cromatografía en columna sobre SiO2 usando acetato de etilo al 0% a 60% en hexanos como el eluyente: RMN 1H (CDCl3) 8 0,15 (m, 2H), 0,51 (m, 2H), 1,01 (m,

35 2H), 1,34 (m, 3H), 1,86 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 4,83 (s, 2H); RMN 13C (CDCl3) 8 4,65, 7,74, 11,26, 35,62, 41,21; EMBR m/z 193 (M++NH4).

3d. Preparación de 1-propilcarbamoilciclopropano-sulfonamida

Etapa 1: Preparación de 1 terc-butilcarbamato de propilcarbamoilciclopropanosulfonamida

5 Este compuesto se obtuvo con un rendimiento en bruto del 100% de acuerdo con el procedimiento descrito para la síntesis de terc-butil-carbamato de 1-metoximetilciclopropilsulfonilamina, excepto que se usaron 1,10 equivalentes de isocianato de n-propilo como el electrófilo. El compuesto se usó directamente en la siguiente reacción sin purificación: RMN 1H (CDCl3) 8 0,10 (m, 2H), 0,51 (m, 2H), 0,67 (m, 1H), 1,10 (m, 2H), 1,49 (s, 9H), 1,62 (m, 2H), 1,87 (d, J = 7,0 Hz, 2H).

10 Etapa 2: Preparación de 1-propilcarbamoilciclopropano-sulfonamida

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento optimizado del 50% a partir de 1-terc-butilcarbamato de propilcarbamoilciclopropanosulfonamida, de acuerdo con el procedimiento descrito para la síntesis de 1metoximetilciclopropilsulfonamida, excepto que no se usó cromatografía cuando el material recristalizó en la cantidad

15 mínima de diclorometano/hexanos: RMN 1H (CDCl3) 8 0,15 (m, 2H), 0,51 (m, 2H), 1,01 (m, 2H), 1,34 (m, 3H), 1,86 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 4,83 (s, 2H); RMN 13C (CDCl3) 8 4,65, 7,74, 11,26, 35,62, 41,21; EMBR m/z 193 (M++NH4).

3e. Preparación de 1-(3,5-dimetilisoxazol-4il)carbamoilciclopropanosulfonamida

Etapa 1: Preparación de terc-butilcarbamato de 1-(3,5-dimetilisoxazol-4-il)carbamoilciclopropanosulfonamida

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento en bruto del 100% de acuerdo con el procedimiento descrito para la síntesis de terc-butilcarbamato de 1-metoximetilciclopropilsulfonilamina excepto que se usaron 1,20 equivalentes de 3,5-dimetilisoxazol-4-isocianato como el electrófilo. El compuesto se usó directamente en la siguiente reacción sin purificación.

25 Etapa 2: Preparación de 1-(3,5-dimetilisoxazol-4il)carbamoilciclopropanosulfonamida

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 50% (580 mg) a partir de 1,62 g (4,52 mmol) de tercbutilcarbamato de 1-(3,5-dimetilisoxazol-4-il)carbamoilciclo-propanosulfonamida usando 30 ml (120 mmol) de HCl 4 N/dioxanos, agitación durante una noche, concentración y cromatografía en una columna Biotage 40M (eluyendo

30 con metanol al 0% a 5%/diclorometano: RMN 1H (metanol-d4) 8 1,57 (m, 2H), 1,61 (m 2H), 2,15 (s, 3H), 2,30 (s, 3H), 4,84 (s, 3H); RMN 13C (metanol-d4) 8 9,65, 10,94, 15,01, 46,11, 114,82, 159,45, 165,55, 168,15; EMBR m/z 260 (M++H).

4. Preparación de cicloalquilsulfonamidas a partir de bromuro de cicloalquilo 4a. Preparación de ciclobutilsulfonamida a partir de bromuro de ciclobutilo

A una solución de 5,0 g (37,0 mmol) de bromuro de ciclobutilo en 30 ml de éter dietílico anhidro (éter dietílico)

5 enfriado a -78 ºC se le añadieron 44 ml (74,8 mmol) de terc-butillitio 1,7 M en pentanos, y la solución se calentó lentamente a -35 ºC durante 1,5 horas. Esta mezcla se canuló lentamente en una solución de 5,0 g (37,0 mmol) de cloruro de sulfurilo recién destilado en 100 ml de hexanos enfriado a -40 ºC, se calentó a 0 ºC durante 1 hora y se concentró cuidadosamente al vacío. Esta mezcla se disolvió de nuevo en éter dietílico, se lavó una vez con algo de agua enfriada con hielo, se secó (MgSO4), se filtró, y se concentró cuidadosamente. Esta mezcla se disolvió de

10 nuevo en 20 ml de THF, se añadió gota a gota a 500 ml de NH3 saturado en THF, y se dejó en agitación durante una noche. La mezcla se concentró al vacío hasta un sólido de color amarillo crudo y se recristalizó en la cantidad mínima de diclorometano en hexanos con 1-2 gotas de metanol, dando 1,90 g (38%) de ciclobutilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CDCl3) 8 1,95-2,06 (m, 2H), 2,30-2,54 (m, 4H), 3,86 (p, J = 8 Hz, 1H), 4,75 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3) 8 16,43, 23,93, 56,29. EMBR m/z (M-H)- calc. para C4H8NSO2: 134,0276,

15 encontrado 134,0282.

4b. Preparación de ciclopentil sulfonamida

Una solución de 18,5 ml (37,0 mmol) de cloruro de ciclopentilmagnesio 2 M en éter se añadió gota a gota a una solución de 3,0 ml (37,0 mmol) de cloruro de sulfurilo recién destilado (obtenido de Aldrich) en 100 ml de hexanos 20 enfriado a -78 ºC. La mezcla se calentó a 0 ºC durante 1 hora y después se concentró cuidadosamente al vacío. Esta mezcla se disolvió de nuevo en éter dietílico (200 ml), se lavó una vez con algo de agua enfriada con hielo (200 ml), se secó (MgSO4), se filtró, y se concentró cuidadosamente. Esta mezcla se disolvió de nuevo en 35 ml de THF, se añadió gota a gota a 500 ml de NH3 saturado en THF y se dejó en agitación durante una noche. La mezcla se concentró al vacío hasta un sólido de color amarillo crudo, el residuo se filtró a través de 50 g de gel de sílice usando 25 acetato de etilo al 70%-hexanos como eluyente y la solución después se concentró. El residuo se recristalizó en la cantidad mínima de diclorometano en hexanos con 1-2 gotas de metanol dando 2,49 g (41%) de ciclopentilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CDCl3) 8 1,58-1,72 (m, 2H), 1,74-1,88 (m, 2H), 1,94-2,14 (m, 4H), 3,48-3,59 (m, 1H), 4,80 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3)8 25,90, 28,33, 63,54; EM m/e 148 (M-H)-.

4c. Preparación de ciclohexil sulfonamida

Una solución de 18,5 ml (37,0 mmol) de cloruro de ciclohexilmagnesio 2 M (TCI Americas) en éter dietílico se añadió gota a gota a una solución de 3,0 ml (37,0 mmol) de cloruro de sulfurilo recién destilado en 100 ml de hexanos enfriado a -78 ºC. La mezcla se calentó a 0 ºC durante 1 hora y después se concentró cuidadosamente al vacío. Esta mezcla se disolvió de nuevo en éter dietílico (200 ml), se lavó una vez con algo de agua enfriada con hielo (200 35 ml), se secó (MgSO4), se filtró, y se concentró cuidadosamente. Esta mezcla se disolvió de nuevo en 35 ml de THF, se añadió gota a gota a 500 ml de NH3 saturado en THF y se dejó en agitación durante una noche. La mezcla se concentró al vacío hasta un sólido de color amarillo crudo, el residuo se filtró a través de 50 g de gel de sílice usando acetato de etilo al 70%-hexanos como eluyente y se concentró. El residuo se recristalizó en la cantidad mínima de diclorometano en hexanos con 1-2 gotas de metanol dando 1,66 g (30%) de ciclohexil-sulfonamida en forma de un

40 sólido de color blanco: RMN 1H (CDCl3) 8 1,11-1,37 (m, 3H), 1,43-1,56 (m, 2H), 1,67-1,76 (m, 1H), 1,86-1,96 (m, 2H), 2,18-2,28 (m, 2H), 2,91 (tt, J = 12, 3,5 Hz, 1H), 4,70 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3) 8 25,04, 25,04 26,56, 62,74; EM m/e 162 (M-1)-.

4d. Preparación de neopentilsulfonamida

Siguiendo el procedimiento para la preparación de ciclohexilsulfonamida, 49 ml (37 mmol) de cloruro de neopentilmagnesio 0,75 M (Alfa) en éter dietílico se convirtieron en 1,52 g (27%) de neopentilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CDCl3) 8 1,17 (s, 9H), 3,12 (s, 2H), 4,74 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3) 8 29,46, 31,51, 67,38; EM m/e 150 (M-1)-.

4e. Preparación de ciclobutilcarbinilsulfonamida

Una solución de 12,3 g (83 mmol) de bromuro de ciclobutilcarbinilo (Aldrich) y 13,7 g (91 mmol) de yoduro de sodio

10 en 150 ml de acetona se calentó a reflujo durante una noche y después se enfrió a temperatura ambiente. Los sólidos inorgánicos se retiraron por filtración y la acetona y el yoduro de ciclopropilcarbinilo (8,41 g, 46%) se retiraron por destilación a presión ambiente y 19,95 kPa a 80 ºC, respectivamente.

Una solución de 4,0 g (21,98 mmol) de yoduro de ciclobutil carbinilo en 30 ml de éter dietílico anhidro (éter dietílico) enfriado a -78 ºC se canuló en una solución de 17 ml (21,98 mmol) de sec-butillitio 1,3 M en ciclohexanos y la 15 solución se agitó durante 5 minutos. A esta mezcla se canuló una solución de 3,0 g (21,98 mmol) de cloruro de sulfurilo recién destilado en 110 ml de hexanos enfriado a - 78 ºC, la mezcla se calentó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se concentró cuidadosamente al vacío. Esta mezcla se disolvió de nuevo en éter dietílico, se lavó una vez con algo de agua enfriada con hielo, se secó (MgSO4), se filtró, y se concentró cuidadosamente. Esta mezcla se disolvió de nuevo en 30 ml de THF, se añadió gota a gota a 500 ml de NH3 saturado en THF y se

20 dejó en agitación durante una noche. La mezcla se concentró al vacío hasta un sólido de color amarillo crudo y se recristalizó en la cantidad mínima de diclorometano en hexanos con 1-2 gotas de metanol dando 1,39 g (42%) de ciclobutil carbinilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CDCl3) 8 1,81-2,03 (m, 4H), 2,14-2,28 (m, 2H), 2,81-2,92 (m, 1H), 3,22 (d, J = 7 Hz, 2H), 4,74 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3) 8 19,10, 28,21, 30,64, 60,93; EM m/e 148 (M-1)-; 818 (M++H)

25 4f. Preparación de ciclopropilcarbinilsulfonamida

Usando el procedimiento empleado para la preparación de ciclobutilcarbinilsulfonamida, se preparó ciclopropilcarbinilsulfonamida a partir de bromuro de ciclopropilcarbinilo (Aldrich) (véase también JACS 1981, pág. 442-445). RMN 1H (CDCl3) 8 0,39-0,44 (m, 2H), 0,67-0,76 (m, 2H), 1,13-1,27 (m, 1H), 3,03 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 4,74

30 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3) 8 4,33, 5,61, 59,93; EM m/e 134 (M-1).

4 g. Preparación de 2-tiofenosulfonamida

Preparada a partir de cloruro de 2-tiofenosulfonilo (adquirido en Aldrich) usando el procedimiento de Justus Liebigs Ann. Chem., 501, 1933, pág. 174-182.

35 4h. Preparación de 4-bromobencenosulfonamida

Se preparó 4-bromofenilsulfonamida por tratamiento de cloruro de 4-bromosulfonilo disponible en el mercado con

amoniaco saturado en THF.

5. Procedimiento general para la preparación de sulfamidas

El intermedio cloruro de sulfamoílo se preparó mediante la adición de agua (1 equiv.) en THF a una solución agitada

5 fría (-20 ºC) de isocianato de clorosulfonilo (1 equiv.) en THF y se dejó que la solución resultante se calentara a 0 ºC. A esta solución se le añadió trietilamina anhidra (1 equiv.) seguido de la amina secundaria requerida (1 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente, después se filtró y el filtrado se concentró dando las sulfamidas deseadas.

III. Preparación de los intermedios P1’-P1

10 1a. Preparación de sal HCl de la (1-(R)-amino-2-(S)-vinilciclopropanocarbonil)amida del ácido ciclopropanosulfónico

Etapa 1: Preparación de ácido 1 (R)-terc-butoxicarbonilamino-2(S)-vinilciclopropanocarboxílico

A una solución de éster etílico del ácido 1(R)-terc-butoxicarbonilamino-2(S)-vinilciclopropanocarboxílico (3,28 g, 13,2

15 mmol) en THF (7 ml) y metanol (7 ml) se le añadió una suspensión de LiOH (1,27 g, 53,0 mmol) en agua (14 ml). La mezcla se agitó durante una noche a temperatura ambiente y se inactivó con NaOH 1 N (15 ml) y agua (20 ml). La mezcla resultante se lavó con acetato de etilo (20 ml), y la fase orgánica se extrajo con 20 ml de NaOH 0,5 N. Las fases acuosas combinadas se acidificaron con HCl 1 N hasta pH 4 y se extrajeron con acetato de etilo (3 x 40 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron

20 produciendo el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (2,62 g, 87%). RMN 1H: (DMSO-d6) 8 1,22-1,26 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,50-1,52 (m, 1H), 2,05 (c, J = 9 Hz, 1H), 5,04 (d, J = 10 Hz, 1H), 5,22 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,64-5,71 (m, 1H), 7,18, 7,53 (s, NH (rotámeros), 12,4 (s a, 1H); EM m/z 228 (M++H).

Etapa 2: Preparación de (1-(R)-terc-butoxicarbonilamino-2-(S)-vinilciclopropanocarbonil)-amida del ácido ciclopropanosulfónico

Una solución del producto de la Etapa 1 (2,62 g, 11,5 mmol) y CDI (2,43 g, 15,0 mmol) en THF (40 ml) se calentó a reflujo durante 50 minutos en una atmósfera de nitrógeno. La solución se enfrió a temperatura ambiente y se transfirió mediante una cánula a una solución de ciclopropilsulfonamida (1,82 g, 15,0 mmol) en THF (10 ml). A la solución resultante se le añadió DBU (2,40 ml, 16,1 mmol) y la agitación se continuó durante 20 horas. La mezcla se 30 inactivó con HCl 1 N a pH 1 y THF se concentró al vacío. La suspensión se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 ml) y los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron, y se concentraron. La purificación por recristalización en hexanos-acetato de etilo (1:1) dio el compuesto del título (2,4 g) en forma de un sólido de color blanco. Las aguas madre se purificaron mediante una columna Biotage 40S (eluida con acetona al 9% en diclorometano) dando un segundo lote del compuesto del título (1,1 g). Ambos lotes se combinaron (rendimiento total

92%). RMN 1H (DMSO-d6) 8 0,96-1,10 (m, 4H), 1,22 (dd, J = 5,5, 9,5 Hz, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,70 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 2,19-2,24 (m, 1H), 2,90 (m, 1H), 5,08 (d, J = 10 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,45 (m, 1H), 6,85, 7,22 (s, NH (rotámeros); EM mlz 331 (M++H).

Etapa 3: 1 Preparación de sal HCl de la (1-(R)-amino-2-(S)-vinil-ciclopropanocarbonil)amida del ácido ciclopropanosulfónico

Una solución del producto de la Etapa 2 (3,5 g, 10,6 mmol) en diclorometano (35 ml) y TFA (32 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Los volátiles se retiraron al vacío y el residuo se suspendió en HCl 1 N en éter dietílico (20 ml) y se concentró al vacío. Este procedimiento se repitió una vez. La mezcla resultante se trituró en

10 pentano y se filtró dando el compuesto del título en forma de un sólido blanquecino, higroscópico (2,60 g, 92%). RMN 1H: (DMSO-d6) 8 1,01-1,15 (m, 4H), 1,69-1,73 (m, 1H), 1,99-2,02 (m, 1H), 2,38 (c, J = 9 Hz, 1H), 2,92-2,97 (m, 1H), 5,20 (d, J = 11 Hz, 1H), 5,33 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,52-5,59 (m, 1H), 9,17 (s a, 3H); EM m/z 231 (M++H).

1b. Preparación de derivados de sulfamidas P1-P1’

15 A una solución de ácido (1R, 2S) 1-terc-butoxicarbonilamino-2-vinil-ciclopropanocarboxílico (217 mg, 1,194 mmol) en THF (5 ml), se le añadió CDI (290 mg, 1,791 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 45 minutos. En otro matraz de fondo redondo, se añadió LiHMDS (solución 1,0 M en hexanos, 2,4 ml, 2,4 mmol) a una solución de N-etilmetilsulfamida (330 mg, 2,388 mmol) en THF (5 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadieron dos mezclas de reacción juntas y se agitaron a temperatura ambiente

20 durante 2 horas. Se añadió agua para interrumpir la reacción y la solución de reacción se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se separó y se secó sobre MgSO4. La filtración y evaporación del disolvente dio el producto en bruto que se purificó por HPLC preparativa dando N-acilsulfamida protegida con N-Boc deseada. El grupo protector Boc se retiró después a medida que el compuesto se disolvía en solución de HCl 4 N en dioxano (2 ml) y se agitaba a temperatura ambiente durante 4 horas. La evaporación de la solución dio un aceite pardusco como la

25 sal HCl. (112 mg, rendimiento del 33%). RMN 1H (400Mz, CD3OD) 8 1,16 (t, J = 7,21 Hz, 3H), 1,68, (dd, J = 10,03, 7,83 Hz, 1H), 2,15 (m, 1H), 2,37 (m, 1H), 2,89 (s, 3H), 3,30 (m, 2H), 5,31 (d, J = 10,27 Hz, 1H), 5,42 (d, J = 17,12 Hz, 3H), 5,68 (m, 1H). EM m/z 270 (M+Na+).

Sección B: Preparación de los Compuestos de la divulgación

Ejemplo 1: Preparación del Compuesto 1 (Ejemplo de referencia)

Esquema 1

Etapa 1:

A una mezcla de ácido (2S, 4S)-Boc-4-fenilpirrolidina-2-carboxílico (0,71 g 2,44 mmol) (adquirido en Chem-Impex International, Inc.), diisopropiletilamina (0,948 g, 7,33 mmol) y sal HCl de la (1-(R)-amino-2-(S)vinilciclopropanocarbonil)amida del ácido ciclopropanosulfónico (0,561 g, 2,44 mmol) en diclorometano (24 ml) se le añadió HATU (1,21 g, 3,18 mmol). Después de agitar la mezcla de reacción durante 14 horas, se lavó con NaHCO3 acuoso al 5% (50 ml), y ácido cítrico acuoso al 5% (50 ml). Cada fase acuosa se extrajo secuencialmente con 2 x 25 ml de diclorometano. La fase orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró. El aceite viscoso pardo resultante se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (SiO2, 97:3, diclorometano:metanol) dando un sólido espumoso de color pardo (0,973 g, rendimiento del 79%). RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) 8 0,91 (s a, 1H), 1,03 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 1,16-1,23 (m, 1H), 1,31-1,38 (m, 1H), 1,44 (dd, J = 9,6, 5,6 Hz, 1H), 1,48 (s, 4H), 1,52 (s, 5H), 1,89 (t, J = 6,4 Hz), 2,09 (c, J = 8,4 Hz, 0,4H), 2,19 (c, J = 8,6 Hz, 0,6H), 2,85-2,90 (m, 0,4H), 2,92-2,97 (m, 0,6H), 3,44 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 3,65 (p, J = 8,0 Hz, 1H), 3,93-4,01 (m, 1H), 4,29 (dd, J = 10,1, 6,7 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 5,75-5,82 (m, 1H), 7,24 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 7,29-7,33 (m, 5H); EM m/z 504 (M+Na).

Etapa 2:

A una solución del producto de la Etapa 1, Ejemplo 1, (0,900 g, 1,79 mmol) en diclorometano (5 ml) se le añadió TFA (5 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, la mezcla de reacción se concentró y se secó al vacío brevemente. El aceite viscoso pardo resultante se re-disolvió de nuevo en diclorometano (10 ml) y se añadió gota a gota a una solución 1 N de HCl en éter dietílico (10 ml). Se formó un sólido blanco por precipitación y se obtuvo por filtración al vacío y se lavó con éter dietílico (0720 mg, rendimiento del 91%). EM m/z 404 (MH+)

Etapa 3:

A una solución en suspensión del producto de la Etapa 2, Ejemplo 1, (0,300 g, 0,682 mmol) en diclorometano (7 ml) se le añadió diisopropiletilamina (0,265 g, 2,05 mmol). La mezcla de reacción se hizo homogénea. A ésta se le añadió Boc-L-Tle-OH (denominado también terc-butilglicina) (0,189 g, 0,818 mmol) y HATU (0,389 g, 1,02 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 6 horas, la reacción se trató como en la Etapa 1 y se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (SiO2, 97:3, diclorometano:metanol) dando el Compuesto 1, un sólido de color blanco (0,382 g, rendimiento del 91%). RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) 8 1,04 (s a, 3H), 1,06 (s, 9H), 1,21-1,25 (m, 2H), 1,40 (dd, J = 9,5,5,5 Hz, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,88 (dd, J = 7,9, 5,5 Hz, 1 H), 2,21 (c, J = 8,7 Hz, 1H), 2,27 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,91-2,96 (m, 1H), 3,70 (p, J = 6,5 Hz, 1H), 4,04 (dd, J = 10,1, 6,7 Hz, 1H), 4,15 (dd, J = 9,9, 6,7 Hz, 1H) 4,34 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 4,3 7 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4, 1H), 5,29 (d, J = 16,8 Hz), 6,71 (d, J = 9,15 Hz, 1H), 7,23 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 7,28-7,34 (m, 5H); EM m/z 639 (M+Na)

Ejemplo 2: Preparación del Compuesto 2 (Ejemplo de referencia)

Etapa 1:

A una mezcla de (2S, 4R)-Boc-y-bencil-prolina (0,516 g 1,64 mmol), diisopropiletilamina (0,637 g, 4,92 mmol) y sal HCl de (1-(R)-amino-2-(S)-vinil-ciclopropanocarbonil)amida del ácido ciclopropanosulfónico (0,788 g, 2,96 mmol) en diclorometano (16 ml) se le añadió HATU (0,935 g, 2,46 mmol). Después de agitar mezcla de reacción durante 14 horas, la reacción se diluyó con diclorometano (50 ml) y se lavó con HCl 1 N (10 ml). La fase acuosa se extrajo con 2 x 25 ml de diclorometano. La fase orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró. El aceite viscoso pardo resultante se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (SiO2, 95:5, diclorometano:metanol) dando un producto de aceite viscoso de color amarillo (0,651 g, rendimiento del 77%). EM m/z 517 (MH+).

Etapa 2:

A una solución del producto de la Etapa 1, Ejemplo 2, (0,744 g, 1,43 mmol) en diclorometano/dicloroetano 1:1 (4 ml) se le añadió TFA (2 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 15 min, la mezcla de reacción se concentró. El aceite viscoso pardo resultante se re-disolvió en dicloroetano (6 ml) y re-concentró. El producto de aceite se trituró en HCl acuoso 1 N y se añadió éter dietílico (30 ml) para efectuar la precipitación. Se obtuvo un producto sólido blanco por filtración al vacío y se lavó con éter dietílico (0,386 g, rendimiento del 59%). EM m/z 417 (MH+)

Etapa 3:

A una solución mezcla del producto de la Etapa 2, Ejemplo 2, (0,154 g, 0,338 mmol), diisopropiletilamina (0,131 g, 1,01 mmol) y Boc-L-Tle-OH (0,117 g, 0,507 mmol) en diclorometano (2 ml) se le añadió HATU (0,193 g, 0,507 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 14 horas, la reacción se diluyó con diclorometano (20 ml) y después se lavó con 3 x 2 ml de HCl acuoso 1 N y Na2CO3 acuoso al 10% (3 ml). El producto precipitó en forma de un sólido de color blanco en la mezcla y se obtuvo por filtración al vacío. El producto se purificó por HPLC de fase inversa dando el Compuesto 2, un sólido de color blanco (0,151 g, rendimiento del 70%). RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) 8 1,02 (s, 9H), 1,08 (dd, J = 7,9,1,9 Hz, 2H), 1,16 (dd, J = 6,3, 3,5 Hz, 1H), 1,21-1,28 (m, 2H), 1,37 (dd, J = 9,5, 5,2 Hz, 1H), 1,49 (s, 9H), 1,87 (dd, J = 8,2, 5,5 Hz, 1H), 1,94-1,99 (m, 2H), 2,23 (c, J = 8,9 Hz, 1H), 2,66-2,75 (m, 3 Hz), 2,91-2,96 (m, 1H), 3,66 (c, J = 4,43 Hz, 1H), 3,82 (c, J = 6,0 Hz, 1H), 4,30 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,34 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 4,48 (s, 2H), 5,15 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 5,32 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,71-5,78 (m, 1H), 6,61 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,21-7,25 (m, 3H), 7,31 (t, J = 7,5 Hz, 2H); EM m/z 631 (M+H).

Ejemplo 3: Preparación del Compuesto 3

Etapa 1:

A una solución de ácido (S)-1-(terc-butoxicarbonil)-4-oxopirrolidina-2-carboxílico (460 mg, 2,0 mmol) en THF (10 ml) se le añadió bromuro de 4-bifenilmagnesio (THF 0,5 M, 16,0 ml, 8,0 mmol) gota a gota a -50 ºC. Después de agitar a esta temperatura durante 4 horas, la mezcla se inactivó con ácido cítrico al 5%, se extrajo con acetato de etilo (50 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró. El sólido residual se recristalizó en acetato de etilo:hexanos (15 ml:15 ml) produciendo el intermedio 1 en forma de un sólido de color blanco (415 mg, 54%). RMN 1H (CD3OD) 8 1,49, 1,51 (d, 9H), 2,48-2,51 (m, 1H), 2,79-2,82 (m, 1H), 3,75-3,81 (m, 2H), 4,48-4,53 (m, 1H), 7,33-7,36 (m, 1H), 7,43-7,46 (m, 2H), 7,58-7,65 (m, 6H); EM m/z 384 (M++H).

Etapa 2:

A una mezcla helada del intermedio 1 (383 mg, 1,0 mmol), clorhidrato de la (1-(R)-amino-2-(S)-vinilciclopropanocarbonil)amida del ácido ciclopropanosulfónico (293 mg, 1,1 mmol) y HATU (570 mg, 1,5 mmol) en diclorometano (10 ml) se le añadió diisopropiletilamina (560 mg, 5,0 mmol). La solución formada se dejó calentar hasta temperatura ambiente durante 4 horas y los volátiles se retiraron al vacío. El residuo se trituró con acetato de etilo (100 ml) y se filtró. El filtrado se lavó con ácido cítrico al 5% (50 ml, x2) y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró. El residuo se trituró con metanol (4 ml) produciendo 314 mg (53%) del producto deseado, intermedio 2, EM m/z 596 (M++H).

Etapa 3:

A una suspensión helada del intermedio 2 (150 mg, 0,25 mmol) en 1,4-dioxano (1 ml) se le añadió HCl (dioxanos 4 M, 5 ml). La solución formada se agitó a la temperatura ambiente durante 2 horas y los volátiles se retiraron al vacío y se secaron a alto vacío durante una noche. El producto se usó directamente en la siguiente etapa. EM m/z 496 (M++H).

Etapa 4:

A una suspensión helada del intermedio 3 (134 mg, 0,25 mmol) en diclorometano (2,5 ml) se le añadió diisopropiletilamina (560 mg, 5,0 mmol) gota a gota. A esta solución formada se le añadió HATU (144 mg, 0,38 mmol) y ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonil)-3,3-dimetilbutanoico (64 mg, 0,28 mmol). La mezcla final se dejó calentar hasta la temperatura ambiente durante una noche y los volátiles se retiraron al vacío. El residuo se trituró con acetato de etilo (10 ml) y se filtró. El filtrado se lavó con ácido cítrico al 5% (10 ml, x2) y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró. El residuo se purificó por HPLC preparativa produciendo 16 mg (9%) del producto deseado, el Compuesto 3, en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CD3OD) 8 1,08-1,13 (m, 11H), 1,27-1,29 (m, 2H), 1,47-1,53 (m, 10H), 1,89-1,93 (m, 1H), 2,26-2,32 (m, 2H), 2,68-2,71 (m, 1H), 2,97-2,99 (m, 1H), 4,05-4,12 (m,1H), 4,34-4,37 (m, 2H), 4,45-4,47 (m, 1H), 5,15 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,33 (d, J = 18,5 Hz, 1H), 5,77-5,82 (m, 1H), 7,36-7,37 (m, 1H), 7,44-7,47 (m, 2H), 7,62-7,67 (m, 6H); EM mlz 709 (M++H).

Ejemplo 4: Preparación del Compuesto 4

Etapa 1:

Este producto se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 1, excepto que se usó bromuro de fenil-magnesio en su lugar. RMN 1H (DMSO-d6) 8 1,36-1,41 (m, 9H), 2,25-2,28 (m, 1H), 2,60-2,64 (m, 15 1H), 3,56-3,66 (m, 2H), 4,27-4,29 (m, 1H), 5,50 (s, 1H), 7,25-7,36 (m, 3H), 7,46-7,48 (m, 2H), 12,40 (a, 1H); EM mlz 308 (M++H).

Etapa 2:

Este producto se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 2, excepto que se usó 20 el producto del Ejemplo 4, Etapa 1 en su lugar. EM m/z 520 (M++H).

Etapa 3:

Este producto se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 3, excepto que se usó el producto del Ejemplo 4, Etapa 2 en su lugar. EM m/z 420 (M++H). 25 Etapa 4: El Compuesto 4 se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 4, excepto que se usó

el producto del Ejemplo 4, Etapa 3 en su lugar. RMN 1H (CD3OD) 8 1,08-1,12 (m, 11H), 1,27-1,28 (m, 2H), 1,48-1,52 (m, 10H), 1,89-1,90 (m, 1H), 2,26-2,32 (m, 2H), 2,68-2,71 (m, 1H), 2,97-2,99 (m, 1H), 4,05-4,09 (m, 1H), 4,34-4,35 (m, 2H), 4,45-4,47 (m, 1H), 5,14 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,34 (d, J = 18,5 Hz, 1H), 5,77-5,82 (m, 1H), 7,31-7,33 (m, 1H), 7,37-7,40 (m, 2H), 7,57-7,59 (m, 2H); EM m/z 633 (M++H).

Ejemplo 5: Preparación del Compuesto 5

Etapa 1:

Este producto se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 1, excepto que se usó

10 bromuro de 2-naftilmagnesio en su lugar. RMN 1H (CD3OD) 8 1,50, 1,52 (d, 9H), 2,54-2,56 (m, 1H), 2,89-2,91 (m, 1H), 3,84-3,87 (m, 2H), 4,51-4,53 (m, 1H), 7,45-7,52 (m, 2H), 7,62-7,64 (m, 1H), 7,85-7,94 (m, 3H), 7,99 (s, 1H); EM m/z 358 (M++H).

Etapa 2:

15 Este producto se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 2, excepto que se usó el producto del Ejemplo 5, Etapa 1 en su lugar. EM m/z 570 (M++H).

Etapa 3:

Este producto se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 3, excepto que se usó 20 el producto del Ejemplo 5, Etapa 2 en su lugar. EM m/z 470 (M++H).

Etapa 4:

El Compuesto 5 se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 4, excepto que se usó el producto del Ejemplo 5, Etapa 3 en su lugar. RMN 1H (CD3OD) 8 1,05-1,12 (m, 11H), 1,28-1,29 (m, 2H), 1,48-1,53

(m, 10H), 1,91-1,92 (m, 1H), 2,25-2,40 (m, 2H), 2,75-2,79 (m, 1H), 2,97-3,00 (m, 1H), 4,13-4,16 (m, 1H), 4,38-4,47 (m, 2H), 5,14 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,3 3 (d, J =18,5 Hz, 1H), 5,77-5,82 (m, 1H), 7,49-7,51 (m, 2H), 7,70-7,73 (m, 1H), 7,86-7,92 (m, 3H), 8,04 (s, 1H); EM mlz 683 (M++H).

Ejemplo 6: Preparación del Compuesto 6

Etapa 1:

Este producto se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 1, excepto que se usó bromuro 4-fluorofenilmagnesio en su lugar. RMN 1H (CD3OD) 8 1,48, 1,50 (d, 9H), 2,44-2,47 (m, 1H), 2,74-2,95 (m, 10 2H), 3,69-3,76 (m, 2H), 4,45-4,53 (m, 1H), 7,08-7,12 (m, 2H), 7,52-7,54 (m, 2H);EM m/z 326 (M++H).

Etapa 2:

Este producto se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 2, excepto que se usó el producto del Ejemplo 6, Etapa 1 en su lugar. EM m/z 538 (M++H).

15 Etapa 3:

Este producto se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 3, excepto que se usó el producto del Ejemplo 6, Etapa 2 en su lugar. EM m/z 438 (M++H).

Etapa 4:

20 El Compuesto 6 se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3, Etapa 4, excepto que se usó el producto del Ejemplo 6, Etapa 3 en su lugar. RMN 1H (CD3OD) 8 1,02-1,12 (m, 11H), 1,26-1,28 (m, 2H), 1,47-1,52 (m, 10H), 1,89-1,90 (m, 1H), 2,25-2,28 (m, 2H), 2,55-2,65 (m, 1H), 2,92-2,99 (m, 1H), 4,06-4,08 (m, 1H), 4,25-4,33 (m, 2H), 4,41-4,49 (m, 1H), 5,15 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,32 (d, J = 18,5 Hz, 1H), 5,77-5,82 (m, 1H), 7,09-7,12 (m, 2H), 7,60-7,63 (m, 2H); EM m/z 651 (M++H).

Ejemplo 7: Preparación del Compuesto 7

Etapa 1:

A una suspensión de sal HCl de (2S,4R)-metil 4-hidroxipirrolidina-2-carboxilato (5,45 g, 30,0 mmol), ácido (S)-2-(tercbutoxicarbonil)-3,3-dimetilbutanoico (6,93 g, 30,0 mmol) y HATU (17,1 g, 45,0 mmol) en diclorometano (100 ml) a 0

10 ºC se le añadió diisopropiletilamina (16,8 g, 150 mmol) gota a gota. La solución formada se agitó a temperatura ambiente durante una noche, se lavó con ácido cítrico enfriado con hielo al 5% y NaOH 1 M (ac.) dos veces, y después con salmuera, se secó sobre MgSO4, y se filtró. El filtrado se concentró al vacío proporcionando 10,75 g (100%) en forma de una espuma de color pardusco claro. RMN 1H (CD3OD) 8 1,04 (s, 9H), 1,46 (s, 9H), 2,01-2,06 (m, 1H), 2,27-2,29 (m, 1H), 3,73 (s, 3H), 3,77-3,87 (m, 2H), 4,31 (s, 1H), 4,49 (a, 1H), 4,56 (t, J = 8,5MHz, 1H).

15 Etapa 2:

A una solución del producto del Ejemplo 7, Etapa 1 (10,75 g, 30,0 mmol) en THF (100 ml) y metanol (100 ml) se le añadió solución de LiOH monohidrato (6,30 g, 150 mmol) en agua (100 ml). La solución final se agitó a temperatura

5 ambiente durante una noche. Los volátiles se retiraron al vacío. El residuo se acidificó con HCl 1 M (ac.) a pH 2. Se extrajo con acetato de etilo (100 ml). La fase orgánica se lavó con ácido cítrico al 5%, y salmuera, se secó sobre MgSO4, y se filtró. El filtrado se concentró al vacío proporcionando 8,95 g (87%) del producto deseado en forma de una espuma blanquecina. RMN 1H (CD3OD) 8 1,05 (s, 9H), 1,45 (s, 9H), 2,03-2,06 (m, 1H), 2,32-2,36 (m, 1H), 3,793,86 (m, 2H), 4,32 (a, 1H), 4,49 (a, 1H), 4,54 (t, J = 8,5 Hz, 1H).

10 Etapa 3:

A una solución del producto del Ejemplo 7, Etapa 2 (1,95 g, 5,68 mmol) en acetato de etilo (150 ml) a 0 ºC se le añadió sal HCl de (1R,2S)-1-amino-N-(ciclopropilsulfonil)-2-vinilciclopropanocarboxamida (1,51 g, 5,68 mmol). La mezcla se agitó a esta temperatura durante 5 minutos antes de la adición de diisopropiletilamina (1,91 g, 17,0 mmol) 15 gota a gota. La solución transparente formada se agitó a 0 ºC durante otros 5 minutos antes de la adición de EDC (1,41 g, 7,38 mmol) y HOBt (0,77 g, 5,68 mmol). La suspensión final se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La solución transparente formada se lavó con ácido cítrico enfriado con hielo al 5% dos veces, citrato sódico saturado (ac.) y salmuera respectivamente, se secó sobre MgSO4, y se filtró. El filtrado se concentró al vacío, se purificó mediante columna ultrarrápida, eluyendo con hexano-acetona 1:1 produciendo 2,50 g (79%) del producto

20 deseado en forma de una espuma de color blanco. RMN 1H (CD3OD) 8 1,00-1,10 (m, 11H), 1,24-1,28 (m, 2H), 1,411,46 (m, 10H), 1,86-1,91 (m, 1H), 2,00-2,04 (m, 1H), 2,12-2,28 (m, 1H), 2,92-2,99 (m, 1H), 3,80-3,95 (m, 2H), 4,304,40 (m, 2H), 4,51 (a, 1H), 5,14 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,35 (d, J = 18,5 Hz, 1H), 5,77-5,82 (m, 1H); EM mlz 557 (M++H).

Etapa 4:

25 A una solución de reactivo de Dess Martin (940 mg, 2,2 mmol) en diclorometano (20 ml) se le añadió el producto del Ejemplo 7, Etapa 3 (556 mg, 1,0 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas y se concentró al vacío. El residuo se trituró con acetato de etilo caliente (10 ml) y se filtró a través de tierras diatomeas (Celite®). El filtrado se concentró al vacío. El residuo se purificó por columna ultrarrápida, eluyendo con hexano-acetona 1:1 produciendo 550 mg (99%) del producto deseado en forma de una espuma de color blanco. RMN 1H (CD3OD) 8

30 1,09-1,14 (m, 11H), 1,25-1,28 (m, 2H), 1,43-1,46 (m, 10H), 1,88-1,91 (m, 1H), 2,22-2,28 (m, 1H), 2,51-2,60 (m, 1H), 2,92-2,96 (m, 1H), 4,17-4,34 (m, 2H), 4,77-4,80 (m, 1H), 5,16 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,33 (d, J = 18,5 Hz, 1H), 5,72-5,82 (m, 1H); EM m/z 555 (M++H).

Etapa 5:

A una solución del producto del Ejemplo 7, Etapa 4 (23 mg, 0,05 mmol) en THF (0,5 ml) a -50 ºC se le añadió bromuro de 4-metoxifenilmagnesio (0,5 ml, 0,5 M en THF, 0,25 mmol) gota a gota. La solución formada se agitó a esta temperatura durante 2 horas y se inactivó con cloruro de amonio (ac.), después se extrajo con acetato de etilo.

5 La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró. El residuo se purificó por HPLC preparativa produciendo 4,5 mg (14%) del Compuesto 7 en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CD3OD) 8 1,09-1,12 (m, 11H), 1,26-1,28 (m, 2H), 1,46-1,52 (m, 10H), 1,89-1,91 (m, 1H), 2,25-2,28 (m, 2H), 2,582,65 (m, 1H), 2,92-2,99 (m,1H), 3,81 (s, 3H), 4,04-4,08 (m, 1H), 4,25-4,35 (m, 2H), 4,41-4,49 (m, 1H), 5,15 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,32 (d, J =18,5 Hz, 1H), 5,74-5,82 (m, 1H), 6,92-6,94 (m, 2H), 7,48-7,50 (m, 2H); EM m/z 663 (M++H).

10 Ejemplo 8: Preparación del Compuesto 8

El Compuesto 8 se preparó por el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 7, Etapa 5, excepto que se usó bromuro de 4’-metoxi-3-bifenilmagnesio en su lugar. RMN 1H (CD3OD) 8 1,02-1,10 (m, 11H), 1,29-1,31 (m, 2H), 1,401,50 (m, 10H), 1,90-1,92 (m, 1H), 2,25-2,27 (m, 2H), 2,68-2,69 (m, 1H), 2,92-2,98 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 4,10-4,15 (m,

15 1H), 4,35-4,52 (m, 2H), 5,15 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,32 (d, J = 18,5 Hz, 1H), 5,75-5,82 (m, 1H), 7,00-7,03 (m, 3H), 7,407,60 (m, 5H); EM m/z 739 (M++H).

Ejemplo 9: Preparación del Compuesto 9

A una solución de (S)-1-{(S)-2-{[(1R,2S)-1-(ciclopropilsulfonilcarbamoil)-2-vinilciclopropil]carbamoil}-4-oxopirrolidin-1

20 il}-3,3-dimetil-1-oxobutan-2-il-carbamato de terc-butilo (77 mg, 0,14 mmol), preparada como se ha descrito en el Ejemplo 7, en THF (5 ml) a -78 ºC se le añadió bromuro de alilmagnesio (1,0 M en éter dietílico, 0,7 ml, 0,7 mmol). La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante una noche. La reacción se interrumpió con NH4Cl acuoso saturado. La mezcla se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice

25 eluyendo con hexanos/acetona 2:1 dando el producto del título (50 mg, 60%). RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,920,96 (m, 2H), 0,93-1,09 (m, 10H), 1,19-1,25 (m, 2H), 1,38-1,48 (m, 10H), 1,83-1,94 (m, 2H), 2,18-2,31 (m, 2H), 2,312,46 (m, 2H), 2,88-2,96 (m, 1H), 3,70 (d, J = 9,82 Hz, 1H), 3,81 (d, J = 10,32 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 9,32 Hz, 1H), 4,32 (dd, J = 9,06, 4,78 Hz, 1H), 5,09-5,20 (m, 3H), 5,30 (dd, J = 17,25, 1,38 Hz, 1H), 5,69-5,80 (m, 1H), 5,87-5,99 (m, 1H), 6,69 (d, J = 9,06 Hz, 1H); EM m/z 619 (M+Na)+.

Procedimiento general para la preparación de los compuestos 10-25

A una solución de (S)-1-{(S)-2-{[(1R,2S)-1-(ciclopropilsulfonilcarbamoil)-2-vinilciclopropil]carbamoil}-4-oxopirrolidin-1il}-3,3-dimetil-1-oxobutan-2-ilcarbamato de terc-butilo (83 mg, 0,15 mmol) en THF (1-5 ml) a -78 ºC se le añadió el reactivo de Grignard (0,75 - 0,90 mmol). La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1-3 horas. La reacción se interrumpió con NH4Cl acuoso saturado (1 ml). La mezcla se neutralizó con HCl 1 N, se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 ml), se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró al vacío. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa dando el producto deseado.

Ejemplo 10: Preparación del Compuesto 10

El Compuesto 10 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de (3fluorofenil)magnesio (1,0 M en THF, 0,75 ml, 0,75 mmol) y se obtuvieron 5 mg (6%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,98-1,01 (m, 2H), 1,03-1,11 (m, 10H), 1,21-1,27 (m, 2H), 1,37-1,51 (m, 10H), 1,87 (dd, J = 8,18, 5,41 Hz, 1H), 2,18-2,28 (m, 2H), 2,56-2,64 (m, 1H), 2,90-2,99 (m, 1H), 4,03 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,24 (d, J = 10,58 Hz, 1H),

15 4,28 (s, 1H), 4,43 (dd, J = 9,06,4,03 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 10,45, 1,64 Hz, 1H), 5,30 (dd, J = 17,12, 1,51 Hz, 1H), 5,70-5,82 (m, 1H), 6,99-7,07 (m, 1H), 7,30-7,41 (m, 3H); EM m/z 651 (M+H)+.

Ejemplo 11: Preparación del Compuesto 11

El Compuesto 11 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de (3

20 metoxifenil)magnesio (1,0 M en THF, 0,75 ml, 0,75 mmol) y se obtuvieron 7 mg (7%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,98-1,01 (m, 2H), 1,03-1,12 (m, 10H), 1,20-1,27 (m, 2H), 1,42-1,47 (m, 10H), 1,87 (dd, J = 8,18, 5,41 Hz, 1H), 2,17-2,29 (m, 2H), 2,55-2,64 (m, 1H), 2,90-3,00 (m, 1H), 3,79 (s, 3H), 3,98-4,06 (m, 1H), 4,21-4,33 (m, 2H), 4,43 (dd, J = 9,19, 3,90 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 10,45, 1,64 Hz, 1H), 5,29 (dd, J = 17,12, 1,51 Hz, 1H), 5,69-5,82 (m, 1H), 6,85 (dd, J = 8,06, 2,01 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 7,81 Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 7,23-7,30 (m, 1H); EM m/z 663

25 (M+H)+.

El Compuesto 12 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de (3clorofenil)magnesio (0,5 M en THF, 1,8 ml, 0,90 mmol) y se obtuvieron 5 mg (5%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,98-1,01 (m, 2H), 1,03-1,11 (m, 10H), 1,22-1,27 (m, 2H), 1,41-1,50 (m, 10H), 1,87 (dd, J = 8,18, 5,41 Hz, 1H), 2,19-2,28 (m, 2H), 2,56-2,64 (m, 1H), 2,90-2,98 (m, 1H), 4,04 (d, J = 10,58 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,27 (s, 1H), 4,44 (dd, J = 9,19, 3,90 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 10,32, 1,51 Hz, 1H), 5,30 (dd, J = 17,12, 1,51 Hz, 1H), 5,70-5,81 (m, 1H), 7,28-7,37 (m, 2H), 7,47 (t, J = 7,68 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H)); EM m/z 689 (M+Na)+.

Ejemplo 13: Preparación del Compuesto 13

El Compuesto 13 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de m-tolilmagnesio (1,0 M en THF, 0,90 ml, 0,90 mmol) y se obtuvieron 11 mg (11%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,99 (s, 2H), 1,04-1,09 (m, 10H), 1,21-1,27 (m, 2H), 1,42-1,47 (m, 10H), 1,87 (dd, J = 8,31, 5,54 Hz, 1H), 2,18-2,29 (m, 2H), 2,35 (s, 3H), 2,56-2,63 (m, 1H), 2,90-2,98 (m, 1H), 4,03 (d, J = 11,08 Hz, 1H), 4,24 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,28-4,32

15 (m, 1H), 4,41 (dd, J = 9,06, 4,03 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 10,32, 1,51 Hz, 1H), 5,29 (dd, J = 17,25,1,38 Hz, 1H), 5,705,81 (m, 1H), 7,11 (d, J = 7,55 Hz, 1H), 7,23 (t, J = 7,55 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 7,81 Hz, 1H), 7,37 (s, 1H)); EM m/z 669 (M+Na)+.

Ejemplo 14: Preparación del Compuesto 14

20 El Compuesto 14 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de (3isopropilfenil)magnesio (0,5 M en THF, 1,5 ml, 0,75 mmol) y se obtuvieron 12 mg (12%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,98-1,01 (m, 2H), 1,04-1,11 (m, 10H), 1,22-1,28 (m, 8H), 1,41-1,47 (m, 10H),1,87 (dd, J = 8,18, 5,41 Hz, 1H), 2,18-2,34 (m, 2H), 2,55-2,63 (m, 1H), 2,87-2,98 (m, 2H), 4,00-4,07 (m, 1H), 4,26 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,29-4,33 (m, 1H), 4,42 (dd, J = 9,06,4,03 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 10,45, 1,64 Hz, 1H), 5,29 (dd, J = 17,12, 1,51 Hz,

25 1H), 5,70-5,81 (m, 1H), 7,17 (d, J = 7,30 Hz, 1H), 7,24-7,36 (m, 2H), 7,44 (s, 1H). EM m/z 675 (M+H)+.

El Compuesto 15 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de (3isopropoxifenil)magnesio (0,5 M en THF, 1,5 ml, 0,75 mmol) y se obtuvieron 12 mg (12%) de producto. RMN 1H (400

5 MHz, CD3OD) 8 0,98-1,01 (m, 2H), 1,04-1,11 (m, 10H), 1,21-1,27 (m, 2H), 1,29 (d, J = 6,04 Hz, 6H), 1,42-1,47 (m, 10H), 1,87 (dd, J = 8,18, 5,41 Hz, 1H), 2,18-2,29 (m, 2H), 2,55-2,63 (m, 1H), 2,90-2,99 (m, 1H), 3,98-4,06 (m, 1H), 4,23 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,29 (s, 1H), 4,45 (dd, J = 9,32, 3,78 Hz, 1H), 4,57-4,66 (m, 1H), 5,12 (dd, J = 10,32, 1,76 Hz, 1H), 5,30 (dd, J = 17,12, 1,51 Hz, 1H), 5,70-5,81 (m, 1H), 6,83 (dd, J = 8,06, 1,76 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 7,81 Hz, 1H), 7,12 (s, 1H), 7,20-7,28 (m, 1H); EM m/z 691 (M+H)+.

10 Ejemplo 16: Preparación del Compuesto 16

El Compuesto 16 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de [3-(N,Ndimetil)anilina]magnesio (0,5 M en THF, 1,5 ml, 0,75 mmol) y se obtuvieron 7 mg (7%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 1,00 (s, 2H), 1,02-1,13 (m, 9H), 1,20-1,27 (m, 2H), 1,40-1,47 (m, 10H), 1,88 (dd, J = 8,18, 5,41 Hz, 1

15 H), 2,19-2,29 (m, 2H), 2,59-2,70 (m, 1H), 2,90-3,00 (m, 1H), 3,08-3,19 (m, 6H), 4,01-4,14 (m, 2H), 4,24 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,28 (s, 1H), 4,50 (dd, J = 9,44, 3,15 Hz, 1H), 5,13 (dd, J = 10,32,1,76 Hz, 1H), 5,30 (dd, J = 17,25, 1,39 Hz, 1H), 5,70-5,82 (m, 1H), 7,16-7,23 (m, 1H), 7,28-7,36 (m, 1H), 7,42 (t, J = 7,43 Hz, 1H), 7,52 (s, 1H); EM m/z 676 (M+H)+.

Ejemplo 17: Preparación del Compuesto 17

El Compuesto 17 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de [3-(1pirrolidinilmetil)fenil]magnesio (0,25 M en THF, 3,0 ml, 0,75 mmol) y se obtuvieron 9 mg (9%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,98-1,02 (m, 3H), 1,04-1,09 (m, 9H), 1,24 (d, J = 1,51 Hz, 3H), 1,39-1,51 (m, 11H), 1,87 (dd, J = 8,31, 5,54 Hz, 1H), 2,18-2,29 (m, 2H), 2,35 (s, 3H), 2,56-2,63 (m, 1H), 2,90-2,98 (m, 1H), 4,03 (d, J = 11,08 Hz, 1H), 4,24 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,30 (s, 1H), 4,41 (dd, J = 9,06, 4,03 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 10,32, 1,51 Hz, 1H), 5,29 (dd, J = 17,25, 1,38 Hz, 1H), 5,70-5,81 (m, 1H), 7,11 (d, J = 7,55 Hz, 1H), 7,23 (t, J = 7,55 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 7,81 Hz, 1H), 7,37 (s, 1H); EM m/z 716 (M+H)+.

Ejemplo 18: Preparación del Compuesto 18

El Compuesto 18 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de [3-(1piperidinilmetil)fenil]magnesio (0,25 M en THF, 3,0 ml, 0,75 mmol) y se obtuvieron 15 mg (14%) de producto. RMN1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,99-1,04 (m, 5H), 1,07 (s, 9H), 1,15-1,26 (m, 3H), 1,41-1,47 (m, 13H), 1,77-1,92 (m, 5H), 2,11-2,40 (m, 2H), 2,65-2,76 (m, 1H), 2,86-2,97 (m, 1H), 4,08-4,19 (m, 2H), 4,28 (s, 3H), 4,52 (dd, J = 9,82, 2,77 Hz,

10 1H), 5,05-5,15 (m, 1H), 5,22-5,34 (m, 1H), 5,72-5,85 (m, 1H), 7,44 (d, J = 7,20 Hz, 1H), 7,49 (t, J = 7,43 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 7,55 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H); EM m/z 732 (M+H)+.

Ejemplo 19: Preparación del Compuesto 19

El Compuesto 19 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de [3-(4

15 morfoliny1metil)fenil] magnesio (0,25 M en THF, 3,0 ml, 0,75 mmol) y se obtuvieron 16 mg (15%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,98-1,02 (m, 2H), 1,07 (s, 9H), 1,19-1:27 (m, 3H), 1,40-1,50 (m, 10H), 1,88 (dd, J = 7,93, 5,67 Hz, 1H), 2,16-2,38 (m, 2H), 2,60-3,01 (m, 6H), 3,71-3,83 (m, 4H), 4,00-4,16 (m, 3H), 4,22 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,26-4,32 (m, 1H), 4,48 (dd, J = 9,32, 2,77 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,58 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 16,87 Hz, 1H), 5,70-5,83 (m, 1H), 6,79 (d, J = 8,81 Hz, 1H), 7,33-7,45 (m, 2H), 7,56 (d, J = 8,06 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H); EM 732 m/z (M+H)+.

20 Ejemplo 20: Preparación del Compuesto 20

El Compuesto 20 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de [2-(4

morfolinilmetil)fenil] magnesio (0,25 M en THF, 3,6 ml, 0,90 mmol) y se obtuvieron 4 mg (4%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,94-0,98 (m, 2H), 1,01-1,11 (m, 10H), 1,16-1,24 (m, 2H), 1,41-1,48 (m, 10H), 1,85 (dd, J = 8,06, 5,29 Hz, 1H), 2,12-2,22 (m, 1H), 2,45 (dd, J = 12,59,7,55 Hz, 1H), 2,55-2,68 (m, 4H), 2,72-2,85 (m, 1H), 2,872,97 (m, 1H), 3,59-3,84 (m, 6H), 4,00-4,07 (m, 1H), 4,13-4,21 (m, 1H), 4,34-4,38 (m, 1H), 4,47 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 5,10 (dd, J = 10,20, 1,64 Hz, 1H), 5,26 (dd, J = 17,12, 1,26 Hz, 1H), 5,68-5,80 (m, 1H), 6,77 (d, J = 9,57 Hz, 1H), 7,28-7,40 (m, 3H), 7,44-7,49 (m, 1H); EM m/z (M+H)+.

Ejemplo 21: Preparación del Compuesto 21

El Compuesto 21 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de (3,5

10 dimetilfenil)magnesio (0,5 M en THF, 1,8 ml, 0,90 mmol) y se obtuvieron 7 mg (7%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,97-1,11 (m, 12H), 1,19-1,27 (m, 2H), 1,37-1,51 (m, 10H), 1,87 (dd, J = 8,18, 5,41 Hz, 1H), 2,15-2,25 (m, 2H), 2,30 (s, 6H), 2,54-2,62 (m, 1H), 2,90-2,98 (m, 1H), 4,02 (d, J = 10,58 Hz, 1H), 4,21 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,274,32 (m, 1H), 4,41 (dd, J = 9,06, 3,78 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 10,32, 1,51 Hz, 1H), 5,29 (dd, J = 17,12, 1,51 Hz, 1H), 5,70-5,81 (m, 1H), 6,94 (s, 1H), 7,15 (s, 2H); EM m/z 683 (M+Na)+.

15 Ejemplo 22: Preparación del Compuesto 22

El Compuesto 22 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de (4-fluoro-3metilfenil)magnesio (1,0 M en THF, 0,9 ml, 0,90 mmol) y se obtuvieron 8 mg (8%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,97-1,02 (m, 2H), 1,03-1,11 (m, 10H), 1,20-1,27 (m, 2H), 1,41-1,47 (m, 10H), 1,87 (dd, J = 8,18, 5,41 Hz,

20 1H), 2,20-2,25 (m, 1H), 2,27 (d, J = 1,51 Hz, 3H), 2,55-2,63 (m, 1H), 2,89-2,98 (m, 1H), 4,03 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,21 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,26-4,31 (m, 1H), 4,41 (dd, J = 9,19, 3,90 Hz, 1H, 5,12 (dd, J = 10,32,1,76 Hz, 1H, 5,30 (dd, J = 17,12, 1,26 Hz, 1H), 5,70-5,81 (m, 1H), 6,79 (d, J = 9,06 Hz, 1H), 6,96-7,03 (m, 1H), 7,33-7,40 (m, 1H), 7,417,46 (m, 1H); EM m/z 687 (M+Na)+.

Ejemplo 23: Preparación del Compuesto 23

El Compuesto 23 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de (3-fluoro-4metilfenil)magnesio (0,5 M en THF, 1,8 ml, 0,90 mmol) y se obtuvieron 5 mg (5%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,99 (s, 2H), 1,03-1,10 (m, 10H), 1,21-1,27 (m, 2H), 1,42-1,47 (m, 10H), 1,87 (dd, J = 8,31, 5,54 Hz, 1H), 2,19-2,22 (m, J = 8,06 Hz, 1H), 2,24 (d, J = 1,51 Hz, 3H), 2,54-2,61 (m, 1H), 2,90-2,98 (m, 1H), 4,01 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,26-4,30 (m, 1H), 4,41 (dd, J = 9,06, 4,03 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 10,32, 1,76 Hz, 1H), 5,29 (dd, J = 17,25, 1,13 Hz, 1H), 5,70-5,81 (m, 1H), 7,20-7,27 (m, 3H); EM m/z 665 (M+H)+.

Ejemplo 24: Preparación del Compuesto 24

El Compuesto 24 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de (2,5dimetilfenil)magnesio (0,5 M en THF, 1,8 ml, 0,90 mmol) y se obtuvieron 5 mg (5%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 0,94-0,97 (m, 2H), 1,02-1,10 (m, 10H), 1,20-1,26 (m, 2H), 1,40-1,49 (m, 10H), 1,86 (dd, J=8,18,5,41 Hz, 1H), 2,16 (d, J = 4,78 Hz, 1H), 2,17-2,25 (m, 1H), 2,28 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,72 (dd, J = 12,46, 8,18 Hz, 1H), 2,88

10 2,97 (m, 1H), 4,09 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,13-4,21 (m, 1H), 4,37 (d, J = 9,32 Hz, 1H), 4,44 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 5,11 (dd, J = 10,32, 1,51 Hz, 1H), 5,28 (dd, J = 17,12, 1,51 Hz, 1H), 5,70-5,80 (m, 1H), 6,82 (d, J = 9,57 Hz, 1H), 6,99 (t, J = 7,68 Hz, 1H), 7,11 (d, J = 7,30 Hz, 1H), 7,17 (d, J = 7,81 Hz, 1H); EM m/z 683 (M+Na)+.

Ejemplo 25: Preparación del Compuesto 25

15 El Compuesto 25 se preparó como se ha descrito en el procedimiento general usando bromuro de (5-fluoro-2metoxifenil)magnesio (0,5 M en THF, 1,8 ml, 0,90 mmol) y se obtuvieron 5 mg (5%) de producto. RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 1,00-1,10 (m, 11H), 1,20-1,26 (m, 2H), 1,40-1,47 (m, 10H), 1,83-1,89 (m, 1H), 2,20-2,29 (m, 1H), 2,342,43 (m, 1H), 2,90-2,98 (m, 1H), 3,80 (s, 1H), 3,85 (s, 3H), 3,93 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,18-4,28 (m, 1H), 4,45 (d, J = 10,83 Hz, 1H), 4,56 (dd, J = 9,69, 2,64 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 10,58, 1,51 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 17,37 Hz, 1H), 5,68

20 5,83 (m, 1H), 6,75 (d, J = 8,81 Hz, 1H), 6,98-7,04 (m, 2H), 7,36 (d, J = 10,32 Hz, 1H); EM m/z 703 (M+Na)+.

Estudios biológicos

Se utilizaron ensayos enzimáticos de complejo de proteasas NS3/4A de VHC y ensayos de replicón de VHC basados en células en la presente divulgación, y se prepararon, realizaron y validaron de la forma siguiente:

Generación de complejo de proteasas NS3/4A de VHC recombinante

25 Se generaron complejos de proteasas NS3 de VHC, derivados de la cepa BMS, cepa H77 o cepa J4L6S, como se describe a continuación. Estas proteínas recombinantes purificadas se generaron para su uso en un ensayo homogéneo (véase a continuación) para proporcionar indicios de cómo de eficaces serían los compuestos de la presente divulgación en la inhibición de la actividad proteolítica de NS3 de VHC.

Se obtuvo suero de un paciente infectado con VHC del Dr. T. Wright, San Francisco Hospital. Se construyó un molde

30 de ADNc (ácido desoxirribonucleico complementario) de longitud completa obtenido por ingeniería genética del genoma de VHC (cepa BMS) a partir de fragmentos de ADN obtenidos mediante transcripción inversa-PCR (RT-PCR) de ARN del suero (ácido ribonucleico) y usando cebadores seleccionados basándose en la homología entre otras cepas de genotipo 1a. A partir de la determinación de la secuencia de genoma completo, se asignó un genotipo 1a al aislado de VHC de acuerdo con la clasificación de Simmonds y col. (Véase P Simmonds, KA Rose, S

35 Graham, SW Chan, F McOmish, BC Dow, EA Follett, PL Yap y H Marsden, J. Clin. Microbiol., 31(6), 1493-1503 (1993)). Se demostró que la secuencia de aminoácidos de la región no estructural, NS2-5B, tenía una identidad >97% con el genotipo 1a de VHC (H77) y una identidad del 87% con el genotipo 1b (J4L6S). Los clones infecciosos, H77 (genotipo 1a) y J4L6S (genotipo 1b) se obtuvieron de R. Purcell (NIH) y las secuencias se publicaron en Genbank (AAB67036, véase Yanagi, M., Purcell, R.H., Emerson, S.U. y Bukh, J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94(16), 8738-8743 (1997); AF054247, véase Yanagi, M., St Claire, M., Shapiro, M., Emerson, S.U., Purcell, R.H. y Bukh. J, Virology 244 (1), 161-172. (1998)).

Las cepas H77 y J4L6S se usaron para la producción de complejos de proteasas NS3/4A recombinantes. Se manipuló ADN que codificaba el complejo de proteasas NS3/4A de VHC recombinante (aminoácidos 1027 a 1711) para estas cepas como se describe por P. Gallinari y col. (véase Gallinari P, Paolini C, Brennan D, Nardi C, Steinkuhler C, De Francesco R. Biochemistry. 38(17): 5620-32, (1999)). En resumen, se añadió una cola solubilizante de tres lisinas al extremo 3' de la región codificante de NS4A. La cisteína en la posición P1 del sitio de escisión NS4A-NS4B (aminoácido 1711) se cambió a una glicina para evitar la escisión proteolítica de la etiqueta de lisina. Además, se introdujo una mutación de cisteína a serina por PCR en la posición de aminoácido 1454 para evitar la escisión autolítica en el dominio helicasa de NS3. El fragmento de ADN variante se clonó en el vector de expresión bacteriana pET21b (Novagen) y el complejo de NS3/4A se expresó en Escherichia coli cepa BL21 (DE3) (Invitrogen) siguiendo el protocolo descrito por P. Gallinari y col. (véase Gallinari P, Brennan D, Nardi C, Brunetti M, Tomei L, Steinkuhler C, De Francesco R., J Virol. 72(8): 6758-69 (1998)) con modificaciones. En resumen, la expresión del complejo de proteasas NS3/4A se indujo con isopropil 1-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 milimolar (mM) durante 22 horas (h) a 20ºC. Una fermentación típica (1 litro (l)) producía aproximadamente 10 gramos (g) de pasta celular húmeda. Las células se resuspendieron en tampón de lisis (10 ml/g) que consistía en N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-ácido etanosulfónico) (HEPES) 25 mM, pH 7,5, glicerol al 20%, cloruro sódico (NaCl) 500 mM, Triton X-100 al 0,5%, lisozima 1 microgramo/mililitro (“!g/ml”), cloruro de magnesio (MgCh) 5 mM, ADNasal 1 !g/ml, 1-mercaptoetanol (1ME) 5 mM, inhibidor de proteasas-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) libre (Roche), se homogeneizaron y se incubaron durante 20 minutos (min) a 4ºC. El homogeneizado se sonicó y se aclaró por ultracentrifugación a 235000 g durante 1 hora (h) a 4ºC. Se añadió imidazol al sobrenadante a una concentración final de 15 mM y el pH se ajustó a 8,0. El extracto de proteína bruta se cargó en una columna de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) preequilibrada con tampón B (HEPES 25 mM, pH 8,0, glicerol al 20%, NaCl 500 mM, Triton X-100 al 0,5%, imidazol 15 mM, 1ME 5 mM). La muestra se cargó a un caudal de 1 cumin. La columna se lavó con 15 volúmenes de columna de tampón C (igual que el tampón B excepto con Triton X-100 al 0,2%). La proteína se eluyó con 5 volúmenes de columna de tampón D (igual que el tampón C excepto con imidazol 200 mM). Las fracciones que contenían complejo de proteasas NS3/4A se combinaron y se cargaron en una columna desalinizante Superdex-S200 preequilibrada con tampón D (HEPES 25mM, pH 7,5, glicerol al 20%, NaCl 300 mM, Triton X-100 al 0,2%, 1ME 10 mM). La muestra se cargó a un caudal de 1 cumin. Las fracciones que contenían complejo de proteasas NS3/4A se combinaron y se concentraron hasta aproximadamente 0,5 mg/ml. Se juzgó que la pureza de los complejos de proteasas NS3/4A, derivados de las cepas BMS, H77 y J4L6S, era superior al 90% por SDS-PAGE y análisis de espectrometría de masas. La enzima se almacenó a -80ºC, se descongeló en hielo y se diluyó antes del uso en tampón de ensayo.

Ensayo de péptido de FRET para controlar la actividad proteolítica de NS3/4A de VHC

El propósito de este ensayo in vitro era medir la inhibición de complejos de proteasa NS3 de VHC, derivados de la cepa BMS, cepa H77 o cepa J4L6S, como se ha descrito anteriormente, por compuestos de la presente divulgación. Este ensayo proporciona indicios que cómo serían de eficaces los compuestos de la presente divulgación en la inhibición de la actividad proteolítica de NS3 de VHC.

Para controlar la actividad de proteasas NS3/4A de VHC, se usó un sustrato peptídico de NS3/4A. El sustrato era RET S 1 (sustrato depsipeptídico de transferencia de energía de resonancia; AnaSpec, Inc. nº cat 22991) (péptido de FRET), descrito por Taliani y col. en Anal. Biochem. 240(2): 60-67 (1996). La secuencia de este péptido está ligeramente basada en el sitio de escisión natural NS4A/NS4B para la proteasa NS3 de VHC excepto por que hay un enlace éster en lugar de un enlace amida en el sitio de escisión. El péptido también contiene un donador de fluorescencia, EDANS, próximo a un extremo del péptido y un aceptor, DABCYL, próximo al otro extremo. La fluorescencia del péptido se extingue por transferencia de energía de resonancia intermolecular (RET) entre el donador y el aceptor, pero a medida que la proteasa NS3 escinde el péptido, los productos se liberan de la extinción por RET y la fluorescencia del donador se hace evidente.

El sustrato peptídico se incubó con uno de los tres complejos de proteasas NS3/4A recombinantes, en ausencia o presencia de un compuesto de la presente divulgación. Los efectos inhibitorios de un compuesto se determinaron por control de la formación del producto de reacción fluorescente en tiempo real usando un Cytofluor Series 4000.

Los reactivos eran los siguientes: el HEPES y el glicerol (Ultrapure) se obtuvieron en GIBCO-BRL. El dimetilsulfóxido (DMSO) se obtuvo en Sigma. El 1-mercaptoetanol se obtuvo en Bio Rad.

Tampón de ensayo: HEPES 50 mM, pH 7,5; NaCl 0,15 M; Triton al 0,1%; glicerol al 15%; 1ME 10 mM. Sustrato: concentración final 2 !M (a partir de una solución madre 2 mM en DMSO almacenada a -20ºC). Proteasa NS3/4A de VHC tipo 1a (1b), concentración final 2-3 nM (a partir de una solución madre 5 !M en HEPES 25 mM, pH 7,5, glicerol al 20%, NaCl 300 mM, Triton-X100 al 0,2%, 1ME 10 mM). Para compuestos con potencias que se aproximan al límite de ensayo, el ensayo se hizo más sensible por adición de albúmina de suero bovino 50 !g/ml (Sigma) al tampón de ensayo y reducción de la concentración de proteasa final hasta 300 pM.

El ensayo se realizó en una placa negra de poliestireno de 96 pocillos de Falcon. Cada pocillo contenía 25 !l de complejo de proteasas NS3/4A en tampón de ensayo, 50 !l de un compuesto de la presente divulgación en DMSO al 10%/tampón de ensayo y 25 !l de sustrato en tampón de ensayo. También se preparó un control (sin compuesto) en la misma placa de ensayo. El complejo de enzimas se mezcló con compuesto o solución de control durante 1 min antes de iniciar la reacción enzimática por adición de sustrato. La placa de ensayo se leyó inmediatamente usando el Cytofluor Series 4000 (Perspective Biosystems). El instrumento se ajustó para leer una emisión de 340 nm y una excitación de 490 nm a 25ºC. Generalmente se realizó un seguimiento de las reacciones durante aproximadamente 15 min.

El porcentaje de inhibición se calculó con la ecuación siguiente:

100-[( Finh/8Fcon)x100]

en la que 8F es el cambio en fluorescencia sobre el intervalo lineal de la curva. Se aplicó un ajuste de curva no lineal a los datos de inhibición-concentración, y el 50% de la concentración eficaz (CI50) se calculó mediante el uso del programa informático Excel XLfit usando la ecuación, y=A+((B-A)/(1+((C/x)^D))).

Se descubrió que todos los compuestos ensayados inhiben la actividad del complejo de proteasas NS3/4A con CI50 de 1,2 !M o menos. Además, se descubrió que los compuestos de la presente divulgación, que se ensayaron frente a más de un tipo de complejo de NS3/4A, tienen propiedades inhibitorias similares aunque los compuestos demostraron uniformemente mayor potencia frente a las cepas 1b en comparación con las cepas 1a.

Ensayos de especificidad

Los ensayos de especificidad se realizaron para demostrar la selectividad in vitro de los compuestos de la presente divulgación en la inhibición del complejo de proteasas NS3/4A de VHC en comparación con otras serina o cisteína proteasas

Las especificidades de compuestos de la presente divulgación se determinaron frente a una diversidad de serina proteasas: elastasa de neutrófilos humanos (HNE), elastasa pancreática porcina (PPE) y quimotripsina pancreática humana, y una cisteína proteasa: catepsina B hepática humana. En todos los casos se usó un protocolo de formato de placa de 96 pocillos usando sustrato colorimétrico de p-nitroanilina (pNA) específico para cada enzima como se ha descrito anteriormente (Solicitud de Patente PCT Nº WO 00/09543) con algunas modificaciones para los ensayos de serina proteasa. Todas las enzimas se adquirieron en Sigma, mientras que los sustratos eran de Bachem.

Cada ensayo incluía una preincubación con inhibidor enzimático de 2 h a temperatura ambiente seguida de la adición de sustrato e hidrólisis hasta conversión de ~30% según se midió en un lector de microplacas Spectramax Pro. Las concentraciones de compuesto variaban de 100 a 0,4 !M dependiendo de su potencia.

Las condiciones finales para cada ensayo eran las siguientes:

Clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl) 50 mM pH 8, sulfato sódico (Na2SO4) 0,5 M, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, DMSO al 3%, Tween-20 al 0,01% con:

Succ-AAA-pNA 133 !M y HNE 20 nM o PPE 8 nM; succ-AAPF-pNA 100 !M y quimotripsina 250 pM.

NaHPO4 (hidrogenofosfato de sodio) 100 mM pH 6, EDTA 0,1 mM, DMSO al 3%, TCEP (clorhidrato de tris(2carboxietil)fosfina) 1 mM, Tween-20 al 0,01 %, Z-FR-pNA 30 !M y catepsina B 5 nM (solución madre de enzima activada en tampón que contiene TCEP 20 mM antes del uso).

El porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula:

[1-((UVinh-UVblanco)/(UVctl-UVblanco))]x 100

Se aplicó un ajuste de curva no lineal a los datos de inhibición-concentración y se calculó el 50% de la concentración eficaz (CI50) mediante el uso del programa informático Excel X1-fit.

Generación de replicón de VHC

Se estableció un sistema de células completas de replicón de VHC como se describe por Lohmann V, Komer F, Koch J, Herian U, Theilmann L, Bartenschlager R., Science 285(5424): 110-3 (1999). Este sistema permitió a los presentes inventores evaluar los efectos de los compuestos de proteasa de VHC de los presentes inventores sobre la replicación de ARN de VHC. En resumen, usando la secuencia de la cepa 1b de VHC descrita en el artículo de Lohmann (Número de acceso: AJ238799), se sintetizó un ADNc de VHC por Operon Technologies, Inc. (Alameda, CA), y el replicón de longitud completa se ensambló después en el plásmido pGem9zf(+) (Promega, Madison, WI) usando técnicas de biología molecular convencionales. El replicón consiste en (i) la UTR 5' de VHC fusionada a los primeros 12 aminoácidos de la proteína de la cápside, (ii) el gen de la neomicina fosfotransferasa (neo), (iii) el IRES del virus de la encefalomiocarditis (EMCV), y (iv) los genes NS3 a NS5B de VHC y la UTR 3' de VHC. Los ADN plasmídicos se linealizaron con ScaI y se sintetizaron transcritos de ARN in vitro usando el kit de transcripción T7 MegaScript (Ambion, Austin, TX) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los transcritos in vitro del ADNc se transfectaron en la línea celular de hepatoma humano, HUH-7. La selección de células que expresaban de forma constitutiva el replicón de VHC se consiguió en presencia del marcador de selección, neomicina (G418). Las líneas celulares resultantes se caracterizaron por la producción de ARN de cadena positiva y negativa y la producción de proteína con el tiempo.

Ensayo de FRET de replicón de VHC

El ensayo de FRET de replicón de VHC se desarrolló para controlar los efectos inhibitorios de los compuestos descritos en la divulgación sobre la replicación viral del VHC. Se cultivaron células HUH-7, que expresaban de forma constitutiva el replicón de VHC, en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco-BRL) que contenía suero fetal de ternera al 10% (FCS) (Sigma) y G418 1 mg/ml (Gibco-BRL). Las células se sembraron la noche anterior (1,5 x 104 células/pocillo) en placas estériles de cultivo de tejido de 96 pocillos. Se prepararon controles con compuesto y sin compuesto en DMEM que contenía FCS al 4%, penicilina/estreptomicina 1:100 (Gibco-BRL), Lglutamina 1:100 y DMSO al 5% en la placa de dilución (concentración final de DMSO al 0,5% en el ensayo). Se añadieron mezclas de compuesto/DMSO a las células y se incubaron durante 4 días a 37ºC. Después de 4 días, las células se evaluaron primero para determinar la citotoxicidad usando Alamar Blue (Trek Diagnotstic Systems) para una lectura de la CC50. La toxicidad del compuesto (CC50) se determinó por adición de 1/10 volumen de Alamar Blue a los medios de incubación de las células. Después de 4 h, se leyó la señal de fluorescencia de cada pocillo con una longitud de onda de excitación a 530 nm y una longitud de onda de emisión de 580 nm, usando el Cytofluor Series 4000 (Perspective Biosystems). Después, las placas se aclararon minuciosamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (3 veces 150 !l). Las células se lisaron con 25 !l de un reactivo de ensayo de lisis que contenía un sustrato de proteasa de VHC (reactivo de lisis de cultivo celular de luciferasa celular 5X (Promega nº E153A) diluido hasta 1X con agua destilada, NaCl añadido a 150 mM final, el sustrato de péptido de FRET (como se ha descrito para el ensayo enzimático anterior) diluido hasta 10 !M finales a partir de una solución madre 2 mM en DMSO al 100%. El sustrato de proteasa de VHC. La placa se puso después en el instrumento Cytofluor 4000 que se había ajustado a excitación a 340 nm/emisión a 490 nm, modo automático durante 21 ciclos, y la lectura de placas en un modo cinético. Las determinaciones de la CE50 se llevaron a cabo como se ha descrito para las determinaciones de la CI50.

Ensayo de indicador de luciferasa de replicón de VHC

Como un ensayo secundario, las determinaciones de la CE50 del ensayo de FRET de replicón se confirmaron en un ensayo de indicador de luciferasa de replicón. La utilización de un ensayo de indicador de luciferasa de replicón se describió por primera vez por Krieger y col (Krieger N, Lohmann V y Bartenschlager R, J. Virol. 75(10): 4614-4624 (2001)). La construcción de replicón descrita para el ensayo de FRET de los presentes inventores se modificó por inserción de ADNc que codificaba una forma humanizada del gen de luciferasa de Renilla y una secuencia de engarce fusionada directamente al extremo 3' del gen de luciferasa. Este inserto se introdujo en la construcción de replicón usando un sitio de restricción Asc1 localizado en el núcleo, directamente cadena arriba del gen marcador de neomicina. También se introdujo la mutación adaptativa en la posición 1179 (serina a isoleucina) (Blight KJ, Kolykhalov, AA, Rice, CM, Science 290(5498): 1972-1974). Se generó una línea celular estable que expresaba de forma constitutiva esta construcción de replicón de VHC como se ha descrito anteriormente. El ensayo de indicador de luciferasa se preparó como se ha descrito para el ensayo de FRET de replicón de VHC con las modificaciones siguientes. Después de 4 días en una incubadora a 37ºC/CO2 al 5%, las células se analizaron para determinar la actividad de luciferasa de Renilla usando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo de Promega. Se retiró medio (100 !l) de cada pocillo que contenía células. A los 50 !l de medio restantes, se añadieron 50 !l de reactivo de luciferasa Dual-Glo, y las placas se sometieron a balanceo durante de 10 min a 2 h a temperatura ambiente. Después se añadió reactivo Dual-Glo Stop & Glo (50 !l) a cada pocillo, y las placas se sometieron a balanceo de nuevo durante de 10 min a 2 h adicionales a temperatura ambiente. Las placas se leyeron en un Packard TopCount NXT usando un programa de luminiscencia.

El porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula a continuación:

% control = promedio de señal de luciferasa en pocillos experimentales (+ compuesto) promedio de señal de luciferasa en pocillos de control con DMSO (- compuesto)

Los valores se representaron gráficamente y se analizaron usando XLfit para obtener el valor Echo.

Los compuestos representativos de la divulgación se evaluaron en los ensayos enzimáticos de VHC, el ensayo celular de replicón de VHC y/o en varios de los ensayos de especificidad resumidos. Por ejemplo, se descubrió que el Compuesto 3 tenía una CI50 de 4 nanomolar (nM) frente a la cepa BMS de NS3/4A en el ensayo enzimático. Se obtuvieron valores de potencia similares con las cepas H77 (CI50 de 1,6 nM) y J4L6S (CI50 de 0,9 nM) publicadas. El

valor de CE50 en el ensayo de FRET de replicón era de 28 nM y de 14 nM en el ensayo de luciferasa de replicón.

En los ensayos de especificidad, se descubrió que el mismo compuesto tenía la actividad siguiente: HLE > 100 !M; PPE > 100 !M; quimotripsina > 100 !M; catepsina B = 2 !M. Estos resultados indican que esta familia de compuestos es altamente específica para la proteasa NS3 y muchos de estos miembros inhiben la replicación del

5 replicón de VHC.

Los compuestos de la presente divulgación se ensayaron y se descubrió que tenían actividades en los intervalos siguientes:

Intervalos de actividad de CI50 (Cepa BMS de NS3/4A): A es > 1 micromolar (!M); B es de 0,1 a 1 !M; C es de 0,001 !M a 0,1 !M.

10 Intervalo de actividad de CE50 (para los compuestos ensayados): A es > 10 micromolar (!M); B es de 1 a 10 !M; C es de 0,01 a 1 !M.

Obsérvese que mediante el uso del número de ejemplo de Patente y el número de compuesto de Patente mostrados en la Tabla 2 las estructuras de los compuestos pueden encontrarse en el presente documento.

De acuerdo con una realización de la presente divulgación, los compuestos tienen una actividad biológica (CE50) de 15 100 !M o menos y, en otra realización, de 1 !M o menos.

Tabla 2 (continuación)

Número de ejemplo

Número de compuesto Intervalo de actividad (CI50) Intervalo de actividad (CE50)

1

1* B B

2

2* A A

3

3

C C

4

4

B B

5

5

C C

6

6

B B

7

7

B B

8

8

B B

9

9

A A

10

10

C B

11

11

C B

12

12

C B

13

13

C B

14

14

B B

15

15

B B

16

16

B A

17

17

B A

18

18

B A

19

19

B A

20

20

B B

21

21

C B

Número de ejemplo

Número de compuesto Intervalo de actividad (CI50) Intervalo de actividad (CE50)

22

22

B B

23

23

B B

24

24

B B

25

25

B B

* Ejemplo de referencia

Será evidente, para un experto en la materia, que la presente divulgación no está limitada a los ejemplos ilustrativos anteriores, y que puede realizarse en otras formas específicas, sin alejarse de los atributos esenciales de la misma. Por lo tanto, se desea que los ejemplos se consideren en todos los sentidos como ilustrativos y no como restrictivos, haciéndose referencia a las reivindicaciones adjuntas más que a los ejemplos anteriores.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de fórmula (I)

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que

   5 n es 1, 2 ó 3; R1 se selecciona entre hidroxi y -NHSO2R7; R2 se selecciona entre hidrógeno, alquenilo, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, y haloalquilo; R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo;

   10 R4 es hidroxi; R5 se selecciona entre alquenilo, alcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, alquilo, arilalquilo, carboxialquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, hidroxialquilo, y (NRaRb)alquilo; R6 se selecciona entre alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, arilo, cicloalquilo, heterociclilo, (NRaRb)carbonilo, y (NRaRb)sulfonilo;

   15 R7 se selecciona entre alquilo, arilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo, y -NRcRd; Ra y Rb se seleccionan independientemente entre alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; y Rc y Rd se seleccionan independientemente entre alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; o Rc y Rd junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo

   20 heterocíclico monocíclico de cinco o seis miembros.
2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula (II)

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que n es 1, 2 ó 3;

   25 R2 se selecciona entre hidrógeno, alquenilo, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, y haloalquilo; R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; R5 se selecciona entre alquenilo, alcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, alquilo, arilalquilo, carboxialquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, hidroxialquilo, y (NRaRb)alquilo;

   30 R6 se selecciona entre alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, arilo, cicloalquilo, heterociclilo, (NRaRb)carbonilo, y (NRaRb)sulfonilo; R7 se selecciona entre alquilo, arilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo, y -NRcRd; R1 y Rb se seleccionan independientemente entre alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; y

   35 Rc y Rd se seleccionan independientemente entre alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; o Rc y Rd junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico monocíclico de cinco o seis miembros.
3. 3. El compuesto de la reivindicación 2 en el que

   n es 1; 40 R2 es alquenilo;

   R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; R5 es alquilo; R6 es alcoxicarbonilo; y R7 es cicloalquilo.

4. 4.

   Un compuesto de la reivindicación 1 seleccionado entre

5. 5.

   Una composición que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. 6.

   La composición de la reivindicación 5 que comprende adicionalmente un interferón y ribavirina.

7. 7.

   La composición de la reivindicación 5 que comprende adicionalmente un segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC.

8. 8.

   La composición de la reivindicación 7 en la que el segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC es un interferón.

9. 9.

   La composición de la reivindicación 8 en la que el interferón se selecciona entre interferón alfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón de consenso, interferón alfa 2A, e interferón tau linfoblastoide.

10. 10.

    La composición de la reivindicación 7 en la que el segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC se selecciona entre interleucina 2, interleucina 6, interleucina 12, un compuesto que potencia el desarrollo de una respuesta de célula auxiliar T tipo 1, ARN de interferencia, ARN antisentido, Imiquimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5’-monofosfato deshidrogenasa, amantadina, y rimantadina.

11. 11.

    Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un procedimiento de inhibición de la función de VHC serina proteasa.

12. 12.

    Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un procedimiento para tratar una infección por VHC.

13. 13.

    El compuesto de la reivindicación 12 que comprende adicionalmente usar un segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC antes de, después, o simultáneamente con un compuesto de la reivindicación 1.

14. 14.

    El compuesto de la reivindicación 13 en el que el segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC es un interferón.

15. 15.

    El compuesto de la reivindicación 14 en el que el interferón se selecciona entre interferón alfa 28, interferón alfa pegilado, interferón de consenso, interferón alfa 2A, y interferón tau linfoblastoide.

16. 16.

    El compuesto de la reivindicación 13 en el que el segundo compuesto que tiene actividad anti-VHC se selecciona entre interleucina 2, interleucina 6, interleucina 12, un compuesto que potencia el desarrollo de una respuesta de célula auxiliar T tipo 1, ARN de interferencia, ARN antisentido, Imiquimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5’monofosfato deshidrogenasa, amantadina, y rimantadina.