ES2350109T3

ES2350109T3 - Procedimiento para la inactivación de virus con envoltura lipídica.

Info

Publication number: ES2350109T3
Application number: ES05112299T
Authority: ES
Inventors: Noel Barrett; Otfried Kistner; Friedrich Dorner
Original assignee: Baxter Healthcare SA
Current assignee: Baxter Healthcare SA
Priority date: 1997-02-24
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2011-01-18
Anticipated expiration: 2018-02-12
Also published as: EP0864646B1; EP1637593A1; EP0864646A2; JPH10234362A; DK1637593T3; US6136321A; EP1637593B1; EP0864646A3; DE59814464D1; ATE335810T1; ATA29997A; ES2270501T3; ATE478138T1; AT405939B; DK0864646T3; DE59813677D1

Abstract

Preparación viral que contiene virus inactivados, caracterizada porque los virus totales, en particular las proteínas de envoltura virales, están intactos y presentan una integridad estructural y los virus proceden de un sobrenadante de cultivo celular, conteniendo la preparación un detergente no iónico del grupo de los polisorbatos, en particular Tween® 80, Tween® 20, Tween® 60, Tween® 40 y combinaciones de los mismos, oscilando la concentración del detergente no iónico del grupo de los polisorbatos entre el 10% y el 20%, preferentemente entre el 10% y el 15%.

Description

La invención se refiere a una preparación viral que contiene virus inactivados.

El desarrollo de vacunas eficientes para la profilaxis de enfermedades infecciosas virales ha sido uno de los objetivos principales de la medicina en las últimas décadas. Para la producción de vacunas de virus vivos se utilizan mutantes virales que tienen antígenos idénticos a los del virus de tipo salvaje pero que presentan una patogenicidad o virulencia reducida.

Para la producción de vacunas muertas los virus de tipo salvaje se inactivan mediante tratamiento físico o químico, por ejemplo con formalina, hidroxilamina, -propiolactona o rayos UV, siendo importante el tipo de inactivación, sobre todo en cuanto a la conservación de la inmunogenicidad de los antígenos virales. La técnica más utilizada para la inactivación viral en la producción de vacunas consiste en el tratamiento suave de los virus con formalina, pero éste requiere un tiempo de incubación largo, de hasta 15 días (por ejemplo en el caso del VHA), para lograr una reducción suficiente de la actividad viral.

En general, las vacunas de virus completo estimulan el desarrollo de anticuerpos circulantes contra las proteínas de envoltura del virus. Por ello, siempre se hace hincapié en que en el proceso de inactivación ha de asegurar el mantenimiento de la inmunogenicidad de las proteínas virales. Sin embargo, al mismo tiempo, también se ha de asegurar que todos los virus de la preparación estén inactivados para garantizar una vacuna segura.

Debido a algunos incidentes con vacunas de virus completo inactivados de forma incompleta o a contaminaciones en la preparación de la vacuna con componentes celulares o partículas virales no deseadas, se han buscado procedimientos de inactivación alternativos (Horaud, Develop. Biol. Standard. 75 (1991), 3-7; Brown, Develop. Biol. Standard. 81 (1993), 103-107).

Dado que la inactivación con formalina no siempre es completa y en algunas preparaciones de vacuna se han detectado virus infecciosos remanentes (Smith y col., Am. J. Hyg. 63 (1956), 150-164), Mussgay y col., Intervirology 1 (1973), 259-268) se ha propuesto un procedimiento de inactivación en dos etapas donde, después de una inactivación con formalina, se lleva a cabo un tratamiento con Tween 80/éter, NP 40 o desoxicolato. Sin embargo, se ha comprobado que el tratamiento adicional con el detergente o el disolvente/detergente influía negativamente en las propiedades protectoras de la vacuna inactivada con formalina.

Por ello, como alternativa a las vacunas que contienen virus completos inactivados, en los últimos años se han venido desarrollando vacunas de subunidades. En la producción de vacunas de subunidades, el virus intacto se solubiliza con un detergente fuerte, las proteínas virales se separan del virus por disolución y se aíslan los antígenos selectivos capaces de estimular anticuerpos protectores, que se utilizan para la producción de vacunas. Al mismo tiempo se eliminan proteínas no virales y componentes de la membrana viral, que probablemente podrían tener efectos secundarios no deseados en la administración de la vacuna. Igualmente, la vacuna puede contener los antígenos aislados para la vacuna de subunidades en forma altamente purificada y en alta concentración. Sin embargo, la inmunogenicidad se puede reducir en comparación con una vacuna de virus completo, ya que sólo hay disponibles algunos antígenos como inmunógenos.

Por ello, para inducir una respuesta inmune suficiente con la vacunación, se han producido las llamadas vacunas split (de virus fraccionados). En este proceso, el virus se solubiliza por completo con un detergente o con una mezcla de detergente y disolvente, la integridad del virus se destruye y el virus se descompone en sus componentes individuales, como proteínas de núcleo, proteínas de envoltura y componentes de membrana. La mezcla de componentes virales así producida se utiliza después para la vacunación.

Algunos ensayos de inactivación de virus de productos plasmáticos humanos han demostrado que, mediante un tratamiento con disolvente/detergente, con TNBP/Tween® 80, se pueden inactivar virus de envoltura lipídica, por ejemplo VIH, VHC, VHB o virus de Sindbis (Piet y col., Transfusion 30 (1990), 591-598).

En la producción comercial de vacunas de subunidades virales de la gripe se utilizan diferentes procedimientos para la inactivación con disolventes lipídicos como Triton® X-100, bromuro de cetiltrimetil-amonio, TNBP/Tween® 80

o dietil éter/Tween® 80. Se ha comprobado que, especialmente al utilizar dietil éter en el paso de inactivación, se produce una caída significativa de la actividad de la hemaglutinina. Danihelkova y col. (Acta Virol. 28 (1984), 26-32) comprobaron que la actividad de la hemaglutinina y la neuraminidasa de virus de la gripe inactivados se conserva bajo determinadas condiciones después del tratamiento con TNBP/Tween® 80 o dietil éter/Tween®. Sin embargo, también observaron que la separación del disolvente, en particular del dietil éter, de la preparación resulta problemática y, por ello, se considera preferible un proceso de inactivación con TNBP/Tween® 80.

Para evitar la costosa separación del disolvente, en la producción de una vacuna split de la gripe se ha utilizado únicamente Triton X-100 como detergente no iónico (Gross y col., J. clin. Microbiol. 14 (1981), 534-538).

Los detergentes no iónicos no tienen ningún grupo cargado. El carácter hidrófilo de estos detergentes se debe al grupo hidroxilo. A diferencia de los detergentes iónicos, solubilizan las proteínas de membrana de forma considerablemente más suave. El detergente no iónico disuelve compuestos tipo lípido-lípido y lípido-proteína, mientras que no influye en las interacciones proteína-proteína. Así, se conserva la estructura nativa de las proteínas. Además, el detergente sustituye a los lípidos que normalmente están unidos a la parte hidrófoba de las proteínas, con lo que crean un entorno similar a los lípidos y de este modo pueden estabilizar las proteínas solubilizadas.

En la US 4 314 997 se describe un procedimiento para la destrucción de endotoxinas y sustancias con actividad coagunte y para la inactivación del virus de la hepatitis utilizando entre un 0,25% y un 10% de anfífilos no desnaturalizadores. El documento US 4 673 733 A se refiere a un procedimiento para la inactivación de virus y pirógenos en el que se utiliza un gen de inactivación. En el documento US 4 164 565, se trata una vacuna contra la hepatitis viral con antígenos superficiales de la hepatitis B, incluyendo “antígenos e”.

Los estudios sobre las propiedades protectoras de las vacunas contra el VIS después de tratamiento con formalina, psoraleno, Triton® X-100 o Tween®/éter han demostrado que las preparaciones de VIS inactivadas con formalina y psoraleno no proporcionan ninguna protección contra una infección por VIS y que la inactivación con Triton® X-100 sólo conduce a una protección parcial. Sin embargo, con una vacuna split de VIS inactivada con Tween® 80/éter sólo se pudo observar un efecto protector a dosis elevadas de antígenos y en presencia de un potente adyuvante (Stahl-Hennig y col., Virology 186 (1992), 588-596).

En especial cuando se utilizan virus patógenos humanos infecciosos para producir una vacuna de virus completo es necesario disponer de un procedimiento eficaz y seguro para la inactivación viral. Esto es particularmente aplicable a virus en los que la inactivación con métodos convencionales se considera insuficiente, por ejemplo VIH. Como ya se ha mencionado anteriormente, la inactivación del VIS con formalina conduce a una posible pérdida de la antigenicidad.

El objetivo de la presente invención consiste en proponer una preparación viral que contiene virus inactivados.

La presente invención se refiere a una preparación viral o a una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones que contiene un virus inactivado, caracterizándose el virus por la integridad estructural del virus completo y en particular por la integridad de las proteínas de envoltura. En el marco de la presente invención se ha comprobado que el tratamiento y la inactivación de una partícula viral con envoltura lipídica con un detergente no iónico seleccionado de entre el grupo de los polisorbatos no influye negativamente en la integridad del virus completo y, en particular, no influye en la actividad biológica de las glicoproteínas de envoltura. Esto ha resultado sorprendente sobre todo porque otros detergentes no iónicos como Triton X-100 u octilglucósidos inactivan los virus de envoltura lipídica destruyendo la integridad estructural del virus completo.

La preparación viral según la invención contiene un agente estabilizante como componente adicional. Preferentemente, el agente estabilizante es un detergente no iónico del grupo de los polisorbatos, en particular Tween® 80, utilizado para la inactivación. No obstante, la preparación puede contener cualquier otro agente estabilizante conocido en el estado actual de la técnica.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención propone la preparación viral según la invención como medicamento, en particular para la producción de una vacuna estable para la inmunización de vertebrados, es decir, una vacuna que contiene una preparación viral del tipo arriba descrito y en caso dado un vehículo fisiológicamente aceptable.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, la vacuna consiste en una preparación viral inactivada de acuerdo con el procedimiento según la invención, donde, después del paso de inactivación, en caso dado se retira el detergente no iónico inactivador y se añade un vehículo fisiológicamente aceptable a la solución viral inactivada. De acuerdo con la presente invención, como vehículos fisiológicamente aceptables entran en consideración todas las formulaciones farmacéuticas conocidas en el estado actual de la técnica. La formulación de la vacuna según la invención se puede llevar a cabo de forma habitual y conocida en sí, por ejemplo con agua ionizada, con una solución tamponada con fosfato,

o con sales y, en caso dado, puede contener aminoácidos o detergentes no iónicos suaves, por ejemplo Tween® 20 o Tween® 80, para la estabilización.

El virus inactivado puede estar presente en los tipos de formulación más diversos para ser utilizados como vacunas. En general, la concentración de virus inactivado en la vacuna oscila entre 106 y 109 pfu/ml, preferentemente es de aproximadamente 107 pfu/ml. En caso dado, la vacuna según la invención contiene un adyuvante a una concentración deseada para aumentar la respuesta inmune, por ejemplo para estimular la producción de anticuerpos neutralizadores. Los adyuvantes inmunológicamente aceptables pueden consistir en aceites minerales, adyuvante de Freund, aceites vegetales, sales minerales, inmunomoduladores o inmunopotenciadores.

La vacuna se puede administrar de diferentes modos, por ejemplo vía subcutánea, oral, nasal, intramuscular o intraperitoneal. En general se administra la dosis de vacuna de acuerdo con los esquemas de vacunación conocidos.

El objetivo se resuelve además proponiendo un procedimiento para la inactivación viral, donde un virus de envoltura lipídica intacto se incuba con un detergente no iónico del grupo de los polisorbatos durante un tiempo suficiente para inactivar por completo la partícula viral, pero sin influir en su integridad estructural y, en particular, en la actividad biológica de las proteínas de superficie y de envoltura.

Sorprendentemente se ha comprobado que los virus de envoltura lipídica se inactivan eficazmente mediante tratamiento con un detergente no iónico del grupo de los polisorbatos, manteniéndose, al menos en su mayor parte, la integridad estructural del virus completo, y en particular de las proteínas de envoltura y también su actividad biológica, por ejemplo su inmunogenicidad y antigenicidad. Esto ha resultado particularmente sorprendente porque la utilización de detergentes no iónicos tales como Tritón®X-100 ya ha sido descrita en el estado actual de la técnica para la producción de vacunas split y, por consiguiente, para la desintegración de partículas virales intactas.

Algunos ensayos comparativos realizados en el marco de la invención con otros detergentes no iónicos, por ejemplo con octil-glucósido, han demostrado que este detergente, si bien inactiva todos los virus ensayados, ataca y solubiliza las proteínas estructurales del virus, en particular las proteínas de envoltura. Dado que la conservación de la actividad biológica, en particular de las proteínas de envoltura exteriores, tiene una importancia decisiva para el desarrollo de una respuesta inmune protectora de las vacunas virales, esto influye negativamente en la antigenicidad e inmunogenicidad de una vacuna que contiene un virus completo con proteínas de envoltura solubilizadas en comparación con un virus intacto.

En la realización del procedimiento se inactivan virus de envoltura lipídica. En este contexto son especialmente preferentes los virus de envoltura lipídica del grupo de los retrovirus, tales como VIH-1 y VIH-2, flavivirus como TBEV y VHC, virus de la gripe, herpesvirus, paramixovirus como el virus de las paperas y el virus del sarampión, o arenavirus como el virus de Junín y el virus de Lassa.

Además se ha comprobado que mediante el procedimiento no sólo se conserva la inmunogenicidad de los antígenos y la integridad del virus completo y de las proteínas de envoltura, sino que dicho procedimiento no influye en la actividad biológica de las proteínas, por ejemplo en su actividad hemaglutinante en el caso del virus de la gripe o del TBEV, o en la actividad de unión de CD4 en el caso del VIH-1.

Para la realización del procedimiento se utilizan detergentes no iónicos del grupo de los polisorbatos (polioxietilensorbitanos). Preferentemente se utilizan polisorbatos del grupo consistente en Tween® 80, Tween® 60, Tween® 40 y Tween® 20 o combinaciones de los mismos. De forma especialmente preferente, para la realización del procedimiento se utiliza Tween® 80. En particular se ha comprobado que los detergentes no iónicos de este grupo no atacan a las proteínas intactas o no destruyen su actividad.

En particular, para la inactivación completa de todos los virus de una solución es necesario evitar la interacción y formación de agregados de las partículas virales, dado que dentro de un complejo agregado puede haber partículas individuales que estén protegidas contra la acción del detergente inactivador. Por consiguiente, el presente procedimiento ofrece la ventaja de reducir o incluso evitar la interacción de virus mediante interacciones proteína-proteína de las proteínas superficiales, y que las partículas virales individuales presentes pueden ser envueltas e inactivadas directamente por el detergente.

Para llevar a cabo el procedimiento, se ajusta la concentración de polisorbato para inactivar los virus de envoltura lipídica a entre el 10% y el 20%,

o entre el 10% y el 15%.

En el marco de la invención se comprobó sorprendentemente que con sólo 10 minutos de incubación con el polisorbato ya se producía una inactivación completa de los virus ensayados, mientras que, para una carga de ensayo paralela con un 0,03 a un 0,1% de formalina, fueron necesarias 10 horas para alcanzar una inactivación comparable, por ejemplo para el VIH-1.

Por consiguiente, el presente procedimiento para la inactivación de virus con envoltura lipídica se lleva a cabo de tal modo que una suspensión de virus que procede directamente de sobrenadantes de cultivo celular o que consiste en una solución de virus purificada se incuba durante al menos 10 minutos con un detergente no iónico del grupo de los polisorbatos. En el caso de la mayoría de los virus de envoltura lipídica, después de este período de tiempo ya se logra una inactivación completa de los virus de la solución. No obstante, se pueden aplicar tiempos de incubación más largos, de hasta 10 horas, sin pérdida de la actividad biológica ni de la integridad estructural del virus completo y de las proteínas de envoltura.

El tiempo de incubación con el detergente no iónico adecuado para inactivar el virus se puede calcular mediante una cinética sencilla de la inactivación de virus y titulaciones virales, por ejemplo tal como se describe en el Ejemplo 2 (véase más abajo).

Preferentemente, el procedimiento se lleva a cabo a una temperatura entre 20ºC y 40ºC. La selección del intervalo de temperaturas óptimo para la inactivación viral con el procedimiento según la invención forma parte de los conocimientos generales del especialista. Por consiguiente, el cálculo de la temperatura óptima para el procedimiento según la invención se puede llevar a cabo sin dificultad para cada combinación particular de detergente/virus. Del mismo modo, cualquier especialista puede determinar otros parámetros tales como la concentración óptima del detergente no iónico, la concentración de proteínas y el tiempo de incubación.

Cuando se determinan los parámetros de procedimiento óptimos siempre se ha de tener cuidado para no influir en la integridad estructural y en particular en la actividad biológica de las proteínas de superficie y de envoltura. En este contexto, aunque una conservación de al menos un 50% de los virus completos originalmente incluidos se puede considerar suficiente, preferentemente al menos un 80%, en especial al menos un 90% y en particular al menos un 95% de las partículas virales tratadas según la invención debería conservar su integridad estructural.

Por consiguiente, una ventaja especial del procedimiento según la invención radica en la inactivación rápida y eficaz de virus de envoltura lipídica, lo que posibilita principalmente la utilización del procedimiento a gran escala y en la producción de vacunas de virus inactivados. Ya que, como es sabido, para la producción por ejemplo de una vacuna del virus de la gripe sólo se dispone de un período corto para el desarrollo del virus, la inactivación y la producción de la vacuna, el presente procedimiento constituye una mejora esencial para la producción industrial de vacunas.

En la producción de vacunas, después de la inactivación viral siempre se lleva a cabo una filtración esterilizante para eliminar eventuales contaminaciones de la solución, por ejemplo debidas a componentes celulares o a impurezas bacterianas.

En el marco de la presente invención se ha comprobado que una preparación de virus inactivados producida mediante el presente procedimiento es más fácil de esterilizar por filtración, dado que las glicoproteínas de la envoltura exterior de los virus, que normalmente se pueden unir a la membrana del filtro, presentan una menor afinidad por la membrana del filtro debido a su unión a los monómeros del detergente. En consecuencia, el presente procedimiento ofrece la ventaja adicional de reducir las pérdidas de partículas virales inactivadas que normalmente se producen durante la filtración esterilizante y aumentar así el rendimiento de virus inactivados para la producción de vacunas.

El detergente no iónico del grupo de los polisorbatos puede permanecer en la solución que contiene los virus después del paso de inactivación. Es sabido que en particular el Tween® 80 es tolerado por los humanos y se utiliza ampliamente en productos alimenticios y cosméticos. Por consiguiente, cuando se administra a humanos o animales una vacuna que contiene una cantidad más o menos reducida de detergente, es de esperar que no se produzca ningún efecto secundario. No obstante, dado que, de acuerdo con el presente procedimiento, para la inactivación de virus se puede utilizar una concentración de hasta un 20% de detergente no iónico, en algunos casos resulta ventajoso reducir la concentración de detergente en el producto final o en caso dado eliminarla por completo. Esto se puede llevar a cabo mediante procesos conocidos, por ejemplo diálisis o procedimientos cromatográficos. Procedimientos cromatográficos especialmente adecuados son cromatografía de intercambio iónico o de filtración en gel. No obstante son adecuados todos los procedimientos descritos en el estado actual de la técnica para eliminar detergentes no iónicos de una solución.

Cuando se utilizan vacunas virales de administración por vía oral principalmente, con frecuencia se plantea el problema de que los antígenos se destruyen en el estómago por degradación proteolítica y, en consecuencia, pierden su efecto. Como es sabido, los polisorbatos también sirven como “detergentes estabilizadores”, permitiendo que los componentes presentes en la solución, en particular las proteínas, permanezcan estables en dicha solución durante un período de tiempo más largo (WO 93/01831). Por consiguiente, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, la preparación viral inactivada producida según la invención contiene un agente estabilizante. Preferentemente, la preparación viral contiene como agente estabilizante un polisorbato en una concentración final de al menos un 0,05%, preferentemente entre un 0,05% y un 0,5%, de forma especialmente preferente un 0,2%. No obstante, también es posible eliminar de la preparación viral el detergente utilizado como agente de inactivación y añadir a la misma cualquier agente estabilizante conocido del estado actual de la técnica.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la producción de una vacuna de virus inactivados, donde los virus inactivados obtenidos después de la inactivación según el procedimiento arriba descrito se mezclan, en caso dado después de eliminar el detergente inactivador, con un vehículo fisiológicamente aceptable y en caso dado con un adyuvante.

La invención se describe más detalladamente en relación con los siguientes ejemplos y figuras, evidentemente sin estar limitada a los mismos.

El Ejemplo 1 describe la inactivación de virus de envoltura lipídica con los detergentes no iónicos Tween® 80 y octil-glucósido; el Ejemplo 2 describe la cinética de la inactivación del VIH-1 y el TBEV después del tratamiento con Tween® 80; el Ejemplo 3 describe el análisis Westernblot del VIH-1 inactivado después del tratamiento con octil-glucósido al 1% y Tween® 80 al 15%; el Ejemplo 4 describe el análisis Westernblot del virus de la gripe KP inactivado después del tratamiento con octil-glucósido al 1% y Tween® 80 al 11%; el Ejemplo 5 describe la inmunización de ratones con complejo Tween® 80-MAIDS inactivado; el Ejemplo 6 describe la cinética de inactivación del VIH-1 con formalina; y el Ejemplo 7 describe el análisis Westernblot del VIH-1 inactivado con formalina después de diferentes períodos de incubación.

Figura 1:: Análisis Westernblot de VIH-1 inactivado después del tratamiento con octil-glucósido al 1% y Tween® 80 al 11%.

Figura 2:: Análisis Westernblot del virus de la gripe KP inactivado después del tratamiento con octil-glucósido al 1% y Tween® 80 al 15%.

Figura 3:: Análisis Westernblot del VIH-1 inactivado con formalina después de diferentes períodos de incubación.

Tabla 1:: Inactivación de virus de envoltura lipídica con los detergentes no iónicos Tween® 80 y octil-glucósido.

Tabla 2:: Cinética de inactivación del tratamiento con Tween® 80. VIH-1 y el TBEV después del

Tabla 3:: Respuesta inmune de ratones inmunizados con complejo Tween® 80-MAIDS inactivado después de 5 y 12 semanas.

Tabla 4:: Cinética de inactivación del VIH-1 con formalina.

Ejemplo 1: Inactivación de virus de envoltura lipídica con los detergentes no iónicos Tween® 80 y octil-glucósido

Se purificaron preparaciones virales de VIH-1, VIH-2, virus de la gripe y PRV (virus de la pseudorrabia) mediante centrifugación con gradiente de sacarosa y subsiguiente diálisis. La preparación purificada se mezcló con octilglucósido hasta una concentración final de un 1% o con Tween® 80 hasta una concentración final de un 11%, 15% y 20%, y se incubó durante 1 hora a 26ºC. A continuación, la preparación se diluyó con PBS, se sometió a pelletización durante 5 minutos a 400.000 g y, antes de la titulación, se resuspendió en PBS.

Los virus VIH-1, VIH-2, virus de la gripe o PRV así tratados se diluyeron en etapas semilogarítmicas en el medio de cultivo celular. En cada caso, 8 x 100 µl de cada etapa de dilución se introdujeron en un pocillo de una placa de microtitulación que contenía células indicadoras. Las células infectadas se

5 incubaron a 37ºC durante 5 a 6 días y el efecto citopático del virus en la célula indicadora se determinó por microscopía. Como células indicadoras para el PRV y el virus de la gripe se utilizaron células Vero, para el VIH-1 células AA2 y para el VIH-2 células C8166. La TCID50 se calculó según Reed y Muench (Am. J. Hyg. 27 (1938), 493-497) y se resume en la Tabla 1.

10 Los datos de la Tabla 1 muestran que con un 1% de octil-glucósido se inactivaron todos los virus ensayados en 5-7 log10. También se inactivaron todos los virus con un 20% de Tween® 80, mientras que para la inactivación del VIH-1, el VIH-2 y el TBEV fue suficiente una concentración de un 11% de Tween® 80 para lograr una inactivación completa.

15 Tabla 1 Inactivación de virus de envoltura lipídica con los detergentes no iónicos Tween® 80 y octil-glucósido

Título de virus (log10 TCID50/ml)

Tratamiento

Virus: PBS 1% octil-glucósido 11% Tween-80 15% Tween-80 20% Tween-80

VIH-1: 6,7  0,5  0,5  0,5  0,5

VIH-1: 6,1  0,5  0,5  0,5  0,5

TBEV: 7,0  0,5  0,5  0,5  0,5

Gripe: 7,4  0,5 2,9  0,5  0,5

PRV: 7,2 1,1 2,5 1,7  0,5

Ejemplo 2: Cinética de inactivación de VIH-1 y el TBEV después del tratamiento con Tween® 80

20 Una preparación viral de TBEV y VIH-1 purificada con gradiente de sacarosa se mezcló con una solución de Tween® 80 hasta una concentración final de un 11% de Tween® 80. La mezcla se incubó a 26ºC bajo agitación continua y, después de diferentes tiempos, se tomaron muestras para la titulación de los virus. Inmediatamente después de la toma, las muestras se

25 diluyeron con PBS en una proporción 1:20, se sometieron a pelletización a 400.000 g durante 5 minutos y las pellas se resuspendieron en PBS antes de su titulación. El TBEV se tituló mediante un ensayo en placa con células PS y el VIH-2 se tituló con células AA2.

El virus TBE se diluyó por etapas en pasos de log 1 y dos partes alícuotas

5 de 500 µl de cada etapa de dilución se añadieron a monocapas celulares. Las células se cubrieron con una mezcla 1:1 de 2 x medio y carboximetilcelulosa al 1,8% y se incubaron durante 4 días. Las placas virales se observaron mediante tinción con una solución de violeta cristal al 0,1% y el título se determinó mediante recuento de placas.

10 La titulación del VIH-1 en células AA2 se llevó a cabo después de una dilución por etapas en el medio de cultivo celular. En cada caso, 8 x 100 µl de cada etapa de dilución se introdujeron en los pocillos de una placa de microtitulación que contenía 2 x 104 células AA2. Las células infectadas se incubaron a 37ºC durante 5 - 6 días y el efecto citopático del virus en la célula

15 indicadora se determinó por microscopía. La TCID50 se calculó según Reed y Muench (Am. J. Hyg. 27 (1938), 493-497).

El título (pfu/ml) se calculó de acuerdo con la distribución de Poisson. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Los datos de la Tabla 2 muestran que una preparación de TBEV se

20 inactiva en > 6,4 log10 con un 11% de Tween® 80 en un plazo de 20 minutos a 26ºC. Bajo las mismas condiciones, una preparación de VIH se inactiva en > 6,2 log10 en un plazo de 10 minutos.

Tabla 2: Cinética de la inactivación del VIH-1 y el TBEV después del tratamiento con Tween® 80

Duración del tratamiento (min): Título TBEV (PFU/ml) Título VIH-1 (TCID50/ml)

0: 107,4 106,7

5: 103,9 n.d.

10: 101,5 < 100,5

20: < 101,0 < 100,5

40: < 101,0 < 100,5

60: < 101,0 < 100,5

Ejemplo 3: Análisis Westernblot de VIH-1 inactivado después del tratamiento con octil-glucósido 1% y Tween® 80 11%

Una preparación de VIH-1 purificada con gradiente de sacarosa se mezcló según el Ejemplo 1 en cada caso con Tween® 80 11%, octil-glucósido 1% o PBS y se incubó a 26ºC durante 1 hora. A continuación, las muestras se diluyeron, se sometieron a pelletización a 400,000 g durante 10 minutos a 4ºC (con lo que las proteínas virales, en particular las proteínas de envoltura, que se disuelven del virus completo mediante tratamiento con el detergente, perdiendo la partícula viral su integridad estructural, permanecen en el sobrenadante y, en consecuencia, ya no son registradas en el posterior análisis Westernblot), se resuspendieron en un tampón de lisis, se separaron mediante SDS-PAGE según Laemmli (Nature 227 (1970), 680-685) y se transfirieron a una membrana filtro.

Para detectar las proteínas específicas de VIH-1, la membrana filtro se incubó durante la noche con una mezcla de IgG humana positiva en anticuerpos de VIH-1 (Immuno AG), un anticuerpo monoclonal humano específico gp41 y un anticuerpo monoclonal de ratón específico gp120 (DuPont). Después de lavarla, la membrana se incubó con IgG de cabra antihumana y antirratón acoplada con peroxidasa como segundo anticuerpo. La detección de bandas específicas del VIH-1 se llevó a cabo por reacción cromática enzimática con diaminobenzidina y H2O2. La Figura 1 muestra el resultado del análisis Westernblot.

Después del tratamiento con octil-glucósido al 1%, las proteínas de envoltura de VIH-1, en particular gp160 y gp120, ya no se pueden detectar, lo que prueba que se ha perdido la integridad estructural de las partículas virales tratadas con octil-glucósido o la actividad biológica de las proteínas de superficie

o de envoltura. Por el contrario, tanto en el caso del control (PBS) como en el de la muestra tratada con Tween® 80, las proteínas de envoltura se pueden detectar claramente en el Westernblot, lo que demuestra que la integridad estructural del virus completo se conserva durante el tratamiento con Tween. Mediante la reacción inmune con el anticuerpo específico gp120 también se demuestra que los determinantes antigénicos de las proteínas de envoltura no resultan afectados por el tratamiento con Tween® 80 y no presentan ningún cambio en comparación con los controles no tratados.

Ejemplo 4: Análisis Westernblot del virus de la gripe KP inactivado después del tratamiento con octil-glucósido 1% y Tween 80 15%

Una preparación del virus de la gripe KP purificada con gradiente de sacarosa se trató según los Ejemplos 1 y 3 con octil-glucósido 1%, Tween 80 15% o PBS, se sometió a pelletización y se realizó un análisis Westernblot.

Para detectar proteínas específicas del virus de la gripe, la membrana filtro se incubó durante una noche con anticuerpos monoclonales de ratón, orientados contra HA1 y HA2 de la glicoproteína superficial, hemaglutinina (HA). Después de lavarla, la membrana se incubó con IgG de cabra antihumana y antirratón acoplada con peroxidasa como segundo anticuerpo. La detección de las glicoproteínas HA del virus de la gripe se llevó a cabo por reacción cromática enzimática con diaminobenzidina y H2O2.

La Figura 2 muestra los resultados del análisis Westernblot.

Mediante el tratamiento con octil-glucósido al 1% se eliminan por completo las glicoproteínas HA del virus de la gripe (Figura 1; columnas 2 y 3). En cambio, tanto en el caso del control (PBS) como en el de la muestra tratada con Tween® 80 se puede reconocer claramente la integridad estructural de las glicoproteínas HA (Figura 2, columnas 4 a 7).

Ejemplo 5: Inmunización de ratones con complejo MAIDS inactivado con Tween® 80

Un preparado de complejo MAIDS (BM5-Mix MuLV) se incubó durante 1 hora con Tween® 80 o con PBS, a temperatura ambiente. A C57 Bl/6 sensibles al complejo MAIDS se les inyectó vía i.p. una preparación de complejo MAIDS inactivada con Tween® 80 y otra tratada con PBS. Los ratones se diseccionaron 5 y 12 semanas después de la inmunización. Para evaluar los síntomas de MAIDS se determinó el peso de los ganglios linfáticos cervicales y del bazo, se aislaron virus infecciosos del bazo y se determinó el título de anticuerpos contra los antígenos del complejo BM5-Mix MuLV. Los resultados se muestran en las Tablas 3a y 3b.

Las Tablas 3a y 3b demuestran que el tratamiento del complejo BM5-Mix MuLV con Tween® 80 condujo a una inactivación completa. A lo largo del período de observación de 12 semanas no apareció ningún síntoma de MAIDS ni se pudo aislar ningún virus infeccioso de las células del bazo. Sin embargo, la preparación viral inactivada indujo títulos de anticuerpos relativamente altos contra antígenos del complejo MAIDS. La preparación de BM5-Mix MuLV tratada con PBS produjo claros síntomas de MAIDS con un gran aumento del peso del bazo y de los ganglios linfáticos cervicales, títulos de virus muy altos en el bazo y, debido a la debilidad inmunitaria inducida por el complejo MAIDS, no provocó ninguna respuesta inmune.

Tabla 3a: MAIDS / Resultados de inactivación con Tween

Resultados de sección, titulación Elisa y aislamiento de MuLV ecotrópico de bazos de ratones C57 Bl/6 infectados 5 semanas después de la infección con BM5-Mix MuLV

Grupo: Infección Animal Sección Título Elisa Título log 10 células bazo infect. / 7,0 células de bazo

Aumento: Peso

Gang. linfát.: Bazo Bazo Gang. linfát. cervical Antg. BM5 Mix MuLV

A: BM5 Mix MuLV + 11 % Tween 80 1 - - 70 mg n.p. 320 0

2: - - 60 mg n.p. 160

3: - - 70 mg n.p. 80

4: - - 60 mg n.p. 80

5: - - 70 mg n.p. 160

B: BM5 Mix MuLV + tampón 1 + + 170 mg 30 mg < 3,3

2: + + 180 mg 90 mg <

3: + +/++ 260 mg 70 mg <

4: + + 230 mg 80 mg <

5: + + 220 mg 80 mg <

n.p. = ninguna particularidad (peso no determinable) < = < 1:10

Resultados de sección, titulación Elisa y aislamiento de MuLV ecotrópico de bazos de ratones C57 Bl/6 infectados 12 semanas después de la infección con BM5-Mix MuLV

Aumento: Peso

Gang. linfát.: Bazo Bazo Gang. linfát. cervical Antg. BM5 Mix MuLV

A: BM5 Mix MuLV + 11 % Tween 80 6 - - 80 mg n.p. 80 0

7: - - 90 mg n.p. 80

8: - - 70 mg n.p. 40

9: - - 70 mg n.p. 40

10: - - 90 mg n.p. 80

B: BM5 Mix MuLV + tampón 6 +++ ++ 630 mg 610 mg < 5,1

7: +++ ++/ +++ 710 mg 660 mg <

8: +++/ +++ +++ 1130 mg 1190 mg <

9: +++ ++ 680 mg 680 mg <

10: ++++ +++ 990 mg 1360 mg <

n.p. = ninguna particularidad (peso no determinable) < = < 1:10

Ejemplo 6: Cinética de inactivación del VIH-1 con formalina

A una preparación de VIH-1 con un título viral de 107 TCID50/ml purificada

5 con gradiente de sacarosa se añadió formalina a una concentración final del 0,01%, 0,03%, 0,05%, 0,075% y 0,1%. La solución se incubó a 37ºC bajo agitación continua y, después de diferentes tiempos, se tomaron muestras para la titulación viral. Antes de la titulación y para neutralizar la formalina, a cada una de las muestras se añadió una parte alícuota correspondiente de Na2S2O5. La

10 titulación de virus se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 1.

Con una concentración de formalina de entre el 0,03% y el 0,1% se produjo una inactivación eficaz del VIH-1 después de aproximadamente 10 horas. Con una concentración inferior al 0,03% de formalina, después de 30 horas de incubación todavía se podían detectar virus infecciosos activos.

Tabla 4: Cinética de la inactivación del VIH-1 con formalina

Formalina (%): Tiempo (h)

0: 1 3 6 10 20 30

0,01: 6,0 5,9 4,9 4,1 2,9 1,0 1,0

0,03: 5,8 3,9 2,9 1,5  0,5  0,5  0,5

0,05: 6,3 4,6 2,4 n.d.  0,5 n.d.  0,5

0,075: 6,0 4,3 1,9 n.d.  0,5 n.d.  0,5

0,10: 6,4 3,7 1,6 n.d.  0,5 n.d.  0,5

n.d. = no determinado

Ejemplo 7: Análisis Westernblot de VIH-1 inactivado con formalina después de diferentes tiempos de incubación

A partir de una preparación viral de VIH-1 inactivada con formalina según 10 el Ejemplo 6 se tomaron muestras después de 0, 1, 2, 3, 6, 10, 20 y 30 horas y se realizó un análisis Westernblot con partes alícuotas.

Para detectar proteínas específicas de VIH-1, la membrana filtro se incubó durante una noche con IgG humana positiva en anticuerpos de VIH-1 (Immuno AG). Después de lavarla, la membrana se incubó con IgG de cabra

15 antihumana y antirratón acoplada con peroxidasa como segundo anticuerpo. La detección de bandas específicas del VIH-1 se llevó a cabo mediante reacción cromática enzimática con diaminobenzidina y H2O2. La Figura 3 muestra el resultado del análisis Westernblot.

Se comprobó que, aunque después de un tratamiento con formalina los

20 virus se pueden someter a pelletización y por consiguiente todavía están intactos como virus completos, después de sólo 1 hora de incubación con un 0,1% de formalina ya se descomponen las proteínas de la envoltura, con lo que se destruye la estructura nativa de las mismas.

El análisis Westernblot muestra que a partir de 3 horas de incubación se 25 produce una desintegración de los virus intactos. Una incubación de 10 horas de duración, que según el Ejemplo 6 es el tiempo necesario para una inactivación eficaz, también conduce a una desintegración de la estructura de los virus inactivados.

Por consiguiente, por primera vez se ha demostrado que una inactivación con formalina tiene gran influencia en la estructura del virus intacto.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Preparación viral que contiene virus inactivados, caracterizada porque los virus totales, en particular las proteínas de envoltura virales, están 5 intactos y presentan una integridad estructural y los virus proceden de un sobrenadante de cultivo celular, conteniendo la preparación un detergente no iónico del grupo de los polisorbatos, en particular Tween® 80, Tween® 20, Tween® 60, Tween® 40 y combinaciones de los mismos, oscilando la concentración del detergente no iónico del grupo de los polisorbatos entre

10 el 10% y el 20%, preferentemente entre el 10% y el 15%.
2.

Preparación viral según la reivindicación 1, caracterizada porque la actividad biológica de las proteínas de envoltura del virus inactivado no resulta afectada negativamente.
3.

Vacuna que contiene una preparación viral según la reivindicación 1 ó 2.

15 4. Vacuna según la reivindicación 3, caracterizada porque contiene polisorbato, preferentemente Tween® 80, en una concentración entre el 0,05% y el 0,5%, preferentemente igual al 0,2%.
5. Vacuna según la reivindicación 3 ó 4, que contiene un vehículo fisiológicamente aceptable y/o un adyuvante.

20 6. Vacuna según una de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizada porque la concentración del virus inactivado en la vacuna oscila entre 106 y 109 pfu/ml, preferentemente es igual a 107 pfu/ml.
7. Preparación viral según la reivindicación 1 ó 2 como medicamento.