JP5918870B2 - インフルエンザに対する改善されたワクチン接種 - Google Patents

Description

本発明は、医療の分野に関する。より詳細には、本発明は、インフルエンザに対する広範な保護を確立するための、改善されたワクチン接種計画に関する。

インフルエンザウイルスは、主なヒトおよび動物病原体であり、呼吸器疾患であるインフルエンザを引き起こし、これは、無症状感染〜死亡の原因となり得る原発性ウイルス性肺炎の重症度の範囲にわたり得る。ウイルスは、毎年、世界中の１０億人に達する人々に感染する。

多くの人々は、１年に１回好ましくは投与される、いわゆる季節性インフルエンザワクチンによる、インフルエンザに対するワクチン接種を受ける。季節性インフルエンザワクチンの組成は、典型的に、毎年変わる。

インフルエンザウイルスは、それらの赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質の抗原構造における差異に基づいて分類され、それらの異なる組み合わせが、特定のインフルエンザウイルス株にさらに分類される特有のウイルス亜型に相当する。すべての知られているインフルエンザＡ亜型は、鳥において見つけることができるが、現在広まっているヒトインフルエンザＡ亜型は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２である。系統解析により、２つの主なグループへの赤血球凝集素の細分化が実証された：特に、系統グループ１におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５、およびＨ９亜型ならびに特に、系統グループ２におけるＨ３、Ｈ４、およびＨ７亜型（図１Ａを参照されたい）。現時点の季節性インフルエンザワクチンは、インフルエンザＡ系統グループ１（たとえばＨ１Ｎ１）および２（たとえばＨ３Ｎ２）株由来のならびにインフルエンザＢ由来のＨＡおよびＮＡインフルエンザタンパク質を典型的に含む。

インフルエンザウイルスを中和する抗体は、ＨＡに対して主として向けられることが知られている。ＨＡは、ウイルスコートにつなぎ留められている三量体糖タンパク質であり、大きなヘッドドメイン（ｈｅａｄ ｄｏｍａｉｎ）およびより小さなステムドメイン（ｓｔｅｍ ｄｏｍａｉｎ）を含む。

季節性インフルエンザワクチンが毎年新しくされなければならない理由は、ウイルスの広い変異性にある。ＨＡ分子において、この変異は、抗原ドリフトが多くの異なる変異体をもたらすヘッドドメインにおいて特に現われる。これはまた、免疫優性エリアでもあるので、ほとんどの中和抗体は、このドメインに対して向けられる。

ヘッドドメインの免疫優性および広い変異の組み合わせはまた、なぜ特定の株による感染が他の株に対する免疫に至らないのかについても説明し、最初の感染によって誘起された抗体は、一次感染のウイルスと密接に関係する限られた数の株のみを認識する。

現在の予防接種についての慣例は、有効な季節性インフルエンザワクチンの適時の産生を可能にするために、広まっているインフルエンザウイルスの早期の同定に依存している。この実施は、ワクチンの産生および標準化のためのタイムウィンドウを最大９か月にまで制限してしまい、これは、事業計画および製造の見通しに基づいて、毎年繰り返される困難な作業になる。さらに不利なことには、選ばれたワクチンが、すべての広まっている株をカバーするとは限らず、季節性インフルエンザ株に対する保護において、最適以下のワクチンをもたらし得る。次のシーズンの間に有力になるであろう株を予測する固有の困難さとは別に、抗ウイルス薬抵抗性および免疫逃避もまた、現在のワクチンが罹患および死を妨げるのに失敗してしまう役割を果たしている。これに加えて、病原体保有動物に起源を持ち、ヒトからヒトへの伝播を増加させるようにリアソートした（ｒｅａｓｓｏｒｔ）、非常に病原性のある株によって引き起こされる世界的流行病の可能性は、世界的な健康にとって、深刻で現実的な脅威をもたらす。季節性ワクチンの毎年の標準的な使用でさえ、Ｈ５Ｎ１株などのような、新しく出現する可能性のある世界的流行株に対する保護をもたらさない。

インフルエンザワクチンによる保護の幅における増加は、いくつかの研究において観察されたが、強力なアジュバントもしくは粘膜（鼻内）投与またはいくつかの症例において、アジュバントおよび粘膜投与の両方または非常に特異的で非常に免疫原性のインフルエンザ株のウイルス全体を必要とした（Ｔｕｍｐｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７５： ５１４１−５１５０；Ｉｃｈｉｎｏｈｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓｅａｓｅ １９６： １３１３−１３２０；ｖａｎ Ｍａｕｒｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｖａｃｃｉｎｅ ２８： １７７８−１７８５；国際公開第２００８／０３７０３３号パンフレット；Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｖａｃｃｉｎｅ ７： ３１４−３２０；Ｚｈｉｗｅｉ Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ， ２０１０， Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ １５５： ５３５−５４４）。それらの症例のほとんどにおいて、報告された干渉効果はなお、広範ではなかった。粘膜投与が不利であるのは、誘発される免疫記憶が不十分であることである。それらの報告において使用されるほとんどまたはすべてのアジュバントが不利であるのは、これらが、反応源性のために、ヒトの使用について推奨されていないことである。

したがって、改善されたインフルエンザワクチン接種について、当技術分野において必要性が残っている。本発明は、特に、インフルエンザワクチンの保護の幅を改善するために、インフルエンザに対する、改善されたワクチン接種を提供することを目的とする。

インフルエンザワクチンによる株特異的免疫誘発について確立された定説に反して、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を含むインフルエンザワクチンによるワクチン接種が、追加のアジュバントおよび注射ルートを介しての投与さえ伴うことなく、ワクチンが３回投与された場合に、ワクチン中のインフルエンザタンパク質が由来する株と比較して、異種およびさらに亜型が異なる（ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ）インフルエンザ株に対する広範な保護を誘発することが、本発明者らによって驚いたことに発見された。

したがって、一態様において、本発明は、インフルエンザに対してワクチン接種するための方法であって、少なくとも１つの第１のインフルエンザ株由来のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質を含むワクチンを、複数回、対象に対して投与するステップを含み、第１のインフルエンザ株のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質が、１年未満の期間内に、少なくとも３回、対象に対して投与される、方法を提供する。

本発明はまた、第１のインフルエンザ株のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を、１年未満の期間内に、少なくとも３回、対象に対して投与することによって、インフルエンザに対してワクチン接種するのに使用するための、少なくとも１つの第１のインフルエンザ株由来のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を含むワクチンをも提供する。

本発明はまた、少なくとも１つの第１のインフルエンザ株由来のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を含むワクチンを、１年未満の期間内に、少なくとも３回、対象に対して投与することによって、インフルエンザに対してワクチン接種するための医薬の調製のための方法をも提供する。

本発明に従って使用されるワクチンは、少なくとも３つのインフルエンザウイルス株由来のＨＡおよびＮＡを含む季節性インフルエンザワクチンであり、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍａｌ）インフルエンザワクチン、スプリットインフルエンザワクチン、またはサブユニットインフルエンザワクチンであり、アジュバントを含まず、筋肉内に、皮下に、または皮内に投与される。

したがって、本発明は、インフルエンザに対してワクチン接種するための方法であって、少なくとも３つのインフルエンザ株由来のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質を含む季節性インフルエンザワクチンを投与するステップを含み、ワクチンが、ビロソームインフルエンザワクチン、スプリットインフルエンザワクチン、またはサブユニットインフルエンザワクチンであり、ワクチンが、アジュバントを含まず、１年以内に、少なくとも３回、筋肉内に、皮下に、または皮内に、対象に対して投与される、方法を提供する。

他の態様において、本発明は、第１のインフルエンザ株と比較して、少なくとも１つの異種株を含む、異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するための方法であって、少なくとも１つの異種株由来のＨＡおよびＮＡを投与することなく、第１のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与するステップを含む、方法を提供する。

本発明はまた、少なくとも１つの異種株由来のＨＡおよびＮＡを投与することなく、第１のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与することによって、第１のインフルエンザ株と比較して、少なくとも１つの異種株を含む、異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するのに使用するためのワクチンをも提供する。

本発明はまた、少なくとも１つの異種株由来のＨＡおよびＮＡを投与することなく、第１のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与することによって、第１のインフルエンザ株と比較して、少なくとも１つの異種株を含む、異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するための医薬の調製のための方法をも提供する。

他の態様において、本発明は、ＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチン中に抗原が存在するインフルエンザ株と比較して、少なくとも１つの、亜型が異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するための方法であって、インフルエンザワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与するステップを含む、方法を提供する。

本発明はまた、ワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与することによって、インフルエンザワクチン中に抗原が存在するインフルエンザ株と比較して、少なくとも１つの、亜型が異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するのに使用するための、ＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンをも提供する。

本発明はまた、ワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与することによって、ＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチン中に抗原が存在するインフルエンザ株と比較して、少なくとも１つの、亜型が異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するための医薬の調製のための方法をも提供する。

他の態様において、本発明は、Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するための方法であって、インフルエンザのＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ株由来のＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与するステップを含み、Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡが、対象に対して投与されない、方法を提供する。

本発明は、インフルエンザワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与することによって、Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するのに使用するための、インフルエンザのＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ株由来のＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンであって、Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡが、対象に対して投与されない、インフルエンザワクチンをさらに提供する。

本発明はまた、インフルエンザのＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ株由来のＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与することによって、Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するための医薬の調製のための方法であって、Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡが、対象に対して投与されない、方法をも提供する。

さらなる態様において、本発明は、世界的流行インフルエンザ株または世界的流行の可能性のあるインフルエンザ株、たとえばＨ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、またはＨ９Ｎ２株に対する干渉効果を誘発するための方法であって、インフルエンザのＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ株由来のＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与するステップを含み、世界的流行インフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡが、対象に対して投与されない、方法を提供する。

本発明はまた、インフルエンザワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与することによって、世界的流行インフルエンザ株または世界的流行の可能性のあるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するのに使用するための、インフルエンザのＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ株由来のＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンであって、世界的流行インフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡが、対象に対して投与されない、インフルエンザワクチンをも提供する。

本発明はまた、インフルエンザのＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ株由来のＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与することによって、世界的流行インフルエンザ株または世界的流行の可能性のあるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するための医薬の調製のための方法であって、世界的流行インフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡが、対象に対して投与されない、方法をも提供する。

他の態様において、本発明はまた、第１のインフルエンザ株に対するおよび第１のインフルエンザ株に対して異種である、同じ亜型内の少なくとも１つの第２のインフルエンザ株に対するおよび第１のインフルエンザ株に対して亜型が異なる、少なくとも１つの第３のインフルエンザ株に対する保護を対象に対して提供するための方法であって、第１のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡを、１年以内に、３回、対象に対して投与するステップを含み、第２または第３のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡが、対象に対して投与されない、方法をも提供する。

本発明はまた、第１のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡを、１年以内に、３回、対象に対して投与することによって、第１のインフルエンザ株に対するおよび第１のインフルエンザ株に対して異種である、同じ亜型内の少なくとも１つの第２のインフルエンザ株に対するおよび第１のインフルエンザ株に対して亜型が異なる、少なくとも１つの第３のインフルエンザ株に対する保護を対象に対して提供するのに使用するための、第１のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡであって、第２または第３のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡが、対象に対して投与されない、第１のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡをも提供する。

本発明はまた、第１のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡを、１年以内に、３回、対象に対して投与することによって、第１のインフルエンザ株に対するおよび第１のインフルエンザ株に対して異種である、同じ亜型内の少なくとも１つの第２のインフルエンザ株に対するおよび第１のインフルエンザ株に対して亜型が異なる、少なくとも１つの第３のインフルエンザ株に対する保護を対象に対して提供するための医薬の調製のための方法であって、第２または第３のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡが、対象に対して投与されない、方法をも提供する。

他の態様において、本発明はまた、ワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与することによって、第１のインフルエンザ株に対する保護ならびにワクチン中にＨＡ抗原およびＮＡ抗原が存在しない、同じ亜型内の少なくとも１つの異種インフルエンザ株に対するおよびさらに少なくとも１つの、亜型が異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するための、少なくとも第１のインフルエンザ株のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を含むワクチンをも提供する。

本発明はまた、インフルエンザに対してワクチン接種するための方法であって、１年以内に、少なくとも３回、少なくとも３つのインフルエンザ株由来のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質を含むビロソーム季節性インフルエンザワクチンを、対象に対して、筋肉内に、皮下に、または皮内に投与するステップを含む、方法をも提供する。

本発明は、したがって、第１のインフルエンザ株と比較して、異なるインフルエンザ株に対して、異種、好ましくは、亜型が異なる干渉効果を誘発するための方法であって、第１のインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンを、１年以内に、少なくとも３回、対象に対して投与するステップを含む、方法を提供する。

本発明はまた、３つのインフルエンザ株に対する保護ならびにワクチン中にＨＡ抗原およびＮＡ抗原が存在しない、インフルエンザ株の少なくとも１つと比較して、同じ亜型内の少なくとも１つの異種インフルエンザ株に対するおよびさらに、少なくとも１つの、亜型が異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するのに使用するための、少なくとも３つのインフルエンザ株のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を含む季節性ワクチンであって、ワクチンが、ビロソームインフルエンザワクチン、スプリットインフルエンザワクチン、またはサブユニットインフルエンザワクチンであり、ワクチンが、アジュバントを含まず、１年以内に、少なくとも３回、筋肉内に、皮下に、または皮内に、対象に対して投与される、季節性ワクチンをも提供する。

本発明はまた、３つのインフルエンザ株に対する保護ならびにワクチン中にＨＡ抗原およびＮＡ抗原が存在しない、インフルエンザ株の少なくとも１つと比較して、同じ亜型内の少なくとも１つの異種インフルエンザ株に対するおよびさらに、少なくとも１つの亜型が異なるインフルエンザ株季節性ワクチンに対する干渉効果を誘発するための、少なくとも３つのインフルエンザ株のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を含む季節性インフルエンザワクチンによりワクチン接種するための方法であって、ワクチンが、ビロソームインフルエンザワクチン、スプリットインフルエンザワクチン、またはサブユニットインフルエンザワクチンであり、ワクチンが、アジュバントを含まず、１年以内に、少なくとも３回、筋肉内に、皮下に、または皮内に、対象に対して投与される、方法をも提供する。

本発明に従ってしたがって使用されるインフルエンザワクチンは、したがって、それが保護を与えるすべての株由来のＨＡおよびＮＡを含むわけではない。典型的に、それはまた、１年以内の、ワクチンの３回（つまり初回刺激（ｐｒｉｍｅ）および２回の追加免疫（ｂｏｏｓｔ））の投与に際して、ワクチン中にＨＡおよびＮＡが示されるすべての株と比較して、少なくとも１つの、亜型が異なるインフルエンザ株に対する保護をも与える。

本発明において使用されるインフルエンザワクチンは、通常のおよび／または季節性インフルエンザワクチンである。それは、スプリットインフルエンザワクチン、サブユニットインフルエンザワクチン、またはビロソームインフルエンザワクチンとすることができ、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を含む。ある実施形態において、それが、ビロソームインフルエンザワクチンである。

ある実施形態において、インフルエンザワクチンが、３つのインフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡを含む（三価）。他の実施形態において、インフルエンザワクチンが、４つのインフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡを含む（四価）。さらなる実施形態において、インフルエンザワクチンが、少なくとも５つのインフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡを含む（五価以上）。ある実施形態において、ワクチン中のＨＡおよびＮＡが、インフルエンザＡ株由来のＨＡおよびＮＡを含む。ある実施形態において、ワクチン中のＨＡおよびＮＡが、インフルエンザＨ１Ｎ１株由来のＨＡおよびＮＡを含む。ある実施形態において、ワクチン中のＨＡおよびＮＡが、インフルエンザＨ１株、インフルエンザＨ３株、およびインフルエンザＢ株由来のものである。ある実施形態において、ワクチン中のＨＡおよびＮＡが、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、およびＢ株由来のものである。

ある実施形態において、ワクチンが、第１のインフルエンザＨ１株由来のＨＡおよびＮＡを含み、前記第１の株に対するおよび前記第１の株に対して異種である、少なくとも１つの第２のインフルエンザＨ１株に対する保護を誘発する。

ある実施形態において、ワクチンが、ワクチン中に示される、すべてのインフルエンザ株に関して亜型が異なる、少なくとも１つの株に対する保護を誘発する。

ある実施形態において、ワクチンが、第１のインフルエンザＨ１株由来のＨＡおよびＮＡを含み、前記第１の株およびインフルエンザＨ５株である少なくとも１つの第２のインフルエンザ株に対する保護を誘発し、ワクチンが、インフルエンザＨ５株由来のＨＡおよびＮＡを含まない。

ある実施形態において、ワクチンが、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３か月、またはそれ以下以内に、少なくとも３回、対象に対して投与される。ある実施形態において、ワクチンの投与が、少なくとも１週間、２週間、３週間、または４週間の、２回の投与の間の間隔で実行される。ある実施形態において、ワクチンの投与が、約３〜８週間の、２回の投与の間の間隔で実行される。ある実施形態において、ワクチンが、６か月、５か月、４か月、または３か月以下の、２回の投与の間の間隔で、対象に対して投与される。ある実施形態において、ワクチンの第２の用量が、第１の用量の１週間〜８週間後に、対象に対して投与され、ワクチンの第３の用量が、第２の用量の３週間〜２６週間後に、対象に対して投与される。ある実施形態において、ワクチンが、第１および第２の投与の間の、約４週間の間隔でおよび第２および第３の投与の間の、約４週間の間隔で、投与される。

ある実施形態において、対象が、ヒト対象である。ある実施形態において、ヒト対象が、６か月〜８０歳、たとえば４〜８０歳である。ある実施形態において、対象が、インフルエンザウイルスに対して免疫学的にナイーブでない対象である。

インフルエンザＡの系統樹を示す図である。 Ｈ１Ｎ１インフルエンザワクチンおよび選択される株の系統樹を示す図である。実施例１において使用するワクチン株は、実線によって囲まれ、実施例１において使用される抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）株は、点線によって囲まれる。 Ｈ３Ｎ２インフルエンザワクチンおよび選択される株の系統樹を示す図である。実施例３Ａにおいて使用されるワクチン株は、実線によって囲まれ、実施例３Ａにおいて使用される抗原投与株は、点線によって囲まれる。 インフルエンザＢワクチンおよび選択される株の系統樹を示す図である。実施例４Ａにおいて使用されるワクチン株は、実線によって囲まれ、実施例４Ａにおいて使用される抗原投与株は、点線によって囲まれる。 ３×ワクチン接種（実線）またはＰＢＳによる偽ワクチン接種（点線）の後に異種Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスにより抗原投与した（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）マウスの実験の結果を示す図である：Ａ．生存、Ｂ．平均相対的体重、Ｃ．臨床スコア。詳細については、実施例１を参照されたい。 ３×ワクチン接種（実線）またはＰＢＳによる偽ワクチン接種（点線）の後に亜型が異なるＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスにより抗原投与したマウスの実験の結果を示す図である：Ａ．生存、Ｂ．平均相対的体重、Ｃ．臨床スコア。詳細については、実施例２を参照されたい。 ３×ワクチン接種（実線）またはＰＢＳによる偽ワクチン接種（点線）の後に異種（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザウイルスにより抗原投与したマウスの実験の結果を示す図である：Ａ．生存、Ｂ．平均相対的体重、Ｃ．臨床スコア。詳細については、実施例３Ａを参照されたい。 １×（点線）または３×ワクチン接種（まだら模様の線（ｓｐｅｃｋｌｅｄ ｌｉｎｅ））またはＰＢＳによる偽ワクチン接種（実線）の後に異種インフルエンザＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／０６をマウスに抗原投与した実験の結果を示す図である。Ａ．生存、Ｂ．平均相対的体重、Ｃ．臨床スコア。詳細については、実施例３Ｂを参照されたい。 １×（点線）または３×ワクチン接種（まだら模様の線）またはＰＢＳによる偽ワクチン接種（実線）の後に亜型が異なるＨ５Ｎ１インフルエンザＡ／ＨＫ／１５６／９７をマウスに抗原投与した実験の結果を示す図である。Ａ．生存、Ｂ．平均相対的体重、Ｃ．臨床スコア。詳細については、実施例３Ｃを参照されたい。 ３×ワクチン接種（実線）またはＰＢＳによる偽ワクチン接種（点線）の後に他のクレード由来の異種インフルエンザＢ型ウイルスにより抗原投与したマウスの実験の結果を示す図である：Ａ．生存、Ｂ．平均相対的体重、Ｃ．臨床スコア。詳細については、実施例４Ａを参照されたい。 １×（点線）または３×ワクチン接種（まだら模様の線）またはＰＢＳによる偽ワクチン接種（実線）の後に異種インフルエンザＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／０６をマウスに抗原投与した実験の結果を示す図である。Ａ．生存、Ｂ．平均相対的体重、Ｃ．臨床スコア。詳細については、実施例４Ｂを参照されたい。 １×（点線）または３×ワクチン接種（まだら模様の線）またはＰＢＳによる偽ワクチン接種（実線）の後に亜型が異なるＨ５Ｎ１インフルエンザＡ／ＨＫ／１５６／９７をマウスに抗原投与した実験の結果を示す図である。Ａ．生存、Ｂ．平均相対的体重、Ｃ．臨床スコア。詳細については、実施例４Ｃを参照されたい。

インフルエンザ株は、その株によって誘起される血清がもはや参照株の十分な交差中和をもたらさない場合、第１の参照株と比較して、本明細書において「異種」インフルエンザ株と呼ばれる（つまり、同種の血清に比べて４分の１のＨＩ力価；たとえばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５： ３７１−３７６）。したがって、たとえば、ワクチン株が新しくされる場合、新しい株は、当然、前の株に対して異種となる。

本明細書において使用される「亜型が異なる」インフルエンザ株は、第１の参照株と比較して、異なるＨＡ亜型を有するインフルエンザ株である（たとえば、Ｈ１Ｎ１は、Ｈ５Ｎ１およびＨ３Ｎ２に比べて、亜型が異なる）。

「季節性」インフルエンザ株は、ある時期にヒト集団において広まるインフルエンザ株である。そのような株は、インフルエンザのシーズンの間に広まり、抗原領域における突然変異のために（抗原ドリフトのために）、普通、わずかに改変された形態で、毎年、再び発生し得る。季節性インフルエンザワクチンは、そのシーズンにおいて流行する、選ばれた季節性インフルエンザ株由来の抗原を有する。現時点の季節性インフルエンザ株の典型例は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ株である。

「世界的流行」インフルエンザ株は、集団が、免疫をほとんどまたはまったく有していない、新しく広まっているインフルエンザ株である。非限定的な例は、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、およびＨ９Ｎ２株である。しかしながら、たとえば、２００９年のインフルエンザ世界的流行病は、Ｈ１Ｎ１株によって引き起こされたが、他のＨ１Ｎ１株が、広まっていた。

本発明に従って、インフルエンザ株に対する用語「保護」（「干渉効果」の意味においても）は、必ずしもではないが、これらの株による感染それ自体に対する保護を意味するが、ワクチン接種されたことがない、一致するコントロールグループと比較した場合に、そのようなインフルエンザ株による感染に起因するかもしれない症状および／または合併症の頻度、重症度、および／または期間の低下を少なくとも含む。用語「干渉効果」は、ワクチン中でＨＡ抗原およびＮＡ抗原が示される株とは異なる（少なくとも異種の、好ましくは亜型が異なる）、少なくとも１つの株に対する保護を意味する。

ある実施形態において、ＨＡおよびＮＡが、インフルエンザＡ株由来のものである。そのある実施形態において、ＨＡおよびＮＡが、インフルエンザＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ９などの亜型由来のなどのように、系統グループ１由来のインフルエンザＡ株由来のものである（系統グループにおける亜型については図１Ａを参照されたい）。他の実施形態において、ＨＡおよびＮＡが、インフルエンザＨ３、Ｈ４、Ｈ７などの亜型由来のなどのように、系統グループ２由来のインフルエンザＡ株由来のものである。

他の実施形態において、ＨＡおよびＮＡが、インフルエンザＢ株由来のものである。インフルエンザＢについては、原型ウイルスＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７（Ｖｉｃｔｏｒｉａ系列）およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８（Ｙａｍａｇａｔａ系列）によって示される２つの系列が、現在、識別されている。Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系列ウイルスが現われた１９８０年代まで広まっていた主な系列であった。それ以来、両方のインフルエンザＢ系列のドリフト変異体（ｄｒｉｆｔ ｖａｒｉａｎｔ）は、世界的に同時に広まっており、最近のインフルエンザのシーズンでは、両方の系列が、同時に広まっている。ある実施形態において、本発明のワクチンが、たとえばＹａｍａｇａｔａ系の系列もしくはＶｉｃｔｏｒｉａ系の系列由来のものとすることができるインフルエンザＢ株由来のＨＡおよびＮＡを含むまたはワクチンは、両方の系列由来のＢ株由来のＨＡおよびＮＡを含んでいてもよい。

免疫原性タンパク質ＨＡおよびＮＡまたはその免疫学的に活性なフラグメントは、たとえばスプリットウイルス製剤、精製サブユニット製剤、ウイルスから単離された、精製された、またはそれに由来するウイルスタンパク質、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）として製剤されてもよい。インフルエンザＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質はまた、完全なインフルエンザウイルス以外の供給源から得られてもよい、たとえば、それらは、当業者に知られている適した発現系における組換え発現によって得られてもよい。ワクチンは、ＨＡおよびＮＡに加えて、さらなるインフルエンザ抗原を含んでいてもよいまたは含んでいなくてもよい。

特定のシーズンおよびワクチン中に含まれる抗原の性質に依存して、インフルエンザ抗原は、１つまたは複数の以下の赤血球凝集素亜型：インフルエンザＡ Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６；またはインフルエンザＢ；および１つもしくは複数の以下のノイラミニダーゼ亜型：インフルエンザＡ Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、もしくはＮ９；またはインフルエンザＢに由来してもよい。大多数のＨＡ亜型、Ｈ１〜Ｈ７およびＨ９〜Ｈ１２について、９つのＮＡ亜型とのすべての組み合わせが、観察されている。インフルエンザＡについての例示的な重要な組み合わせは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、およびＨ１０Ｎ７を含むが、これらに限定されない。典型的に、季節性インフルエンザワクチンは、３つのインフルエンザ株のＨＡおよびＮＡを含み、これは、今日では、典型的に、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、および少なくとも１つのＢ株を含む。四価季節性ワクチンは、典型的に、さらなるＢ株由来の抗原を含む（典型的に、そのようなワクチンは、ＹａｍａｇａｔａおよびＶｉｃｔｏｒｉａ系列Ｂ株の両方由来の抗原を含む）。

インフルエンザウイルスはまた、リアソータント株であってもよく、リバースジェネティクス技術によって得られてもよい。したがって、インフルエンザＡウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含んでいてもよい（典型的に、Ａ／ＰＲ／８／３４由来の６つのセグメント、ＨＡおよびＮセグメントは、ワクチン株由来のものである、つまり、６：２リアソータント）。それはまた、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来のまたはワクチン調製のためのリアソータントウイルスを生成するのに有用な任意の他のウイルス株由来の１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含んでいてもよい。

ＨＡは、現在の不活性化インフルエンザワクチンにおける主な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的に、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）によって測定されるＨＡレベルを基準にして標準化される（Ｊ． Ｍ． Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． ５ （１９７７） ２３７−２４７）。既存のワクチンは、典型的に、１株当たり約１５μｇのＨＡを含有するが、たとえば、子供に対してまたは世界的流行病の状況においてまたはアジュバントを使用する場合に、より低用量が使用され得る。より高用量（たとえば３×または９×用量）を受けるために、１／２（つまり１株当たり７．５μｇ ＨＡ）、１／４、および１／８などのようなわずかな用量が、使用されてきた。したがって、ワクチンは、インフルエンザ株当たり０．１〜１５０μｇのＨＡ、好ましくは０．１〜５０μｇ、たとえば０．１〜２０μｇなどを含んでいてもよい。特定の用量は、たとえば、１株当たり約１５、約１０、約７．５、約５、約１．５μｇなどを含む。低用量は、皮内投与と組み合わせて適宜使用することができる。

用量におけるＮＡの量は、たとえば約０．１〜５０μｇ、たとえば約０．５〜２０μｇで変動してもよい。典型的に、季節性ワクチンは、存在する１５μｇ ＨＡ当たり約０．５〜５μｇ ＮＡ、たとえば、存在する１５μｇ ＨＡ当たり約２〜４μｇ ＮＡを含有してもよい。

本発明と共に使用されるＨＡおよび／またはＮＡは、ウイルス中に見つけられるような天然のＨＡもしくはＮＡであってもよいまたは修飾されてもよい。

本発明に従うワクチン接種養生法は、すべての対象に原則として適している。これらは、すべての年齢の対象を含み、第１の用量の投与の時期にインフルエンザウイルスに対して免疫学的にナイーブである対象およびナイーブでない対象を含む。本発明に従う対象は、好ましくは、インフルエンザに感染させることができるまたは他の場合には、インフルエンザに対する免疫応答の誘発から利益を得ることができる哺乳動物であり、そのような対象は、たとえば、げっ歯動物、たとえばマウスまたはフェレットまたはブタ、イヌ、ウマ、もしくは非ヒト霊長動物などのような家畜もしくは農業用動物またはヒトである。好ましくは、対象は、ヒト対象である。

ある実施形態において、対象が、約６か月〜８０歳、たとえば約４〜８０歳、たとえば約１８〜６０または１８〜６５歳（成人集団）の年齢を有するヒト対象である。他の実施形態において、対象が、高齢のヒト対象（５０歳以上、６０歳以上、６５歳以上）である。他の実施形態において、対象が、若いヒト対象（たとえば≦５歳、たとえば６か月〜４歳、つまり小児の対象または子供）である。他の実施形態において、対象が、入院患者、医療労働者、軍人、妊婦（この実施形態において、ワクチン投与が、母親に対して干渉効果をもたらすが、また、誕生後に子供に対して干渉効果を可能性として誘発することができるかもしれない）、慢性疾患（たとえば喘息、糖尿病、神経学的および神経筋障害（脳性麻痺、けいれん、筋ジストロフィーなど）を有する患者）、免疫不全の患者、ワクチンを受ける前の７日間に抗ウイルス化合物（たとえばオセルタミビルまたはザナミビル化合物）を受けた対象などである。ワクチンは、通常集団において本発明に従って使用されてもよい。ある実施形態において、ワクチンが投与される対象が、第１の用量の投与の時期に、インフルエンザウイルス抗原に対して免疫学的にナイーブでない。通常、集団において、１０歳になる前の、たとえば少なくとも４歳のヒト対象は、自然にまたはワクチン接種を介して、インフルエンザウイルス抗原に遭遇しているであろう。他の実施形態において、ワクチンが投与される対象が、第１の用量の投与の時期に、インフルエンザ抗原ウイルスに対して免疫学的にナイーブである。

ある実施形態において、対象が、典型的に３歳未満または２歳未満または１歳未満であるヒト小児対象である。これらは、インフルエンザウイルスに対して免疫学的にナイーブであり得、典型的に、通常の季節性または世界的流行インフルエンザワクチンは、そのような対象において十分な免疫応答を得るために、そのような対象に対して２回、つまり、初回刺激−追加免疫レジメンにおいて、既に投与されている。本発明の方法は、ワクチン中のＨＡおよびＮＡが由来する株に対して異種であるおよびさらに亜型が異なるインフルエンザ株に対する保護を得るよう、免疫応答を広幅化するために、少なくとも３回のワクチンの投与を含む。筋肉内、皮内、または皮下投与による、アジュバントの非存在下における免疫応答のこの広幅化は、以前に報告されておらず、季節性ワクチン接種によって誘発される株特異的免疫の定説に反する。よって、本発明者らによって本明細書において報告される初回刺激−追加免疫−追加免疫レジメンにおける３重の投与に際して広幅化される免疫応答の発見は、非常に驚くべきものである。

ある実施形態において、対象が、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも１歳、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、１８、５０、６０、６５歳のヒト対象である。ある実施形態において、対象が、５０、６０、６５、７０、８０歳以下のヒト対象である。通常の季節性および／または世界的流行ワクチン接種にふさわしい任意の対象もまた、本発明に従ってワクチン接種することができる。

高齢または免疫無防備状態の対象については、少なくとも１回の投与、たとえば第１の投与、たとえばすべての投与のワクチン組成物中にアジュバントを含むことが、望ましくてもよい。独立してまたはそのうえ、高齢者に対して投与されるワクチン中に、より高用量の抗原、たとえば、通常のワクチン用量と比較して、２〜４倍高い抗原含有量を含むことが、有益であってもよい。通常のインフルエンザワクチン用量は、通常、１株当たり約１５μｇのＨＡを含有する。

本発明に従って使用されるワクチン（「免疫原性組成物」とも呼ばれる）は、好ましくは、医薬組成物である。それは、普通、インフルエンザ抗原に加えて構成成分を含む、たとえば、それは、典型的に、１つまたは複数の薬学的に許容できるキャリヤおよび／または賦形剤を含む。製剤におけるそれぞれの構成成分の最適な比は、当業者らによく知られている技術によって決定されてもよい。本発明の文脈において、用語「薬学的に許容できる」は、キャリヤまたは賦形剤が、用いられる投薬量および濃度で、それらが投与される対象において望まれないまたは有害な影響を引き起こさないであろうということを意味する。そのような薬学的に許容できるキャリヤおよび賦形剤は、当技術分野においてよく知られている（たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （Ｇｅｎｎａｒｏ， ２０００； ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， ＩＳＢＮ： ０６８３３０６４７２）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓ． Ｆｒｏｋｊａｅｒ ａｎｄ Ｌ． Ｈｏｖｇａａｒｄ， Ｅｄｓ．， Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａ． Ｋｉｂｂｅ， Ｅｄ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ［２０００］を参照されたい）。ワクチンは、好ましくは、滅菌溶液として製剤され、投与される。滅菌溶液は、滅菌ろ過または当技術分野においてそれ自体知られている他の方法によって調製される。次いで、溶液は、凍結乾燥するまたは医薬投薬容器の中に充填することができる。溶液のｐＨは、通常、ｐＨ３．０〜９．５、たとえばｐＨ５．０〜７．５の範囲にある。ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質またはその免疫原性部分は、典型的に、適した薬学的に許容できるバッファーを有する溶液中にあり、溶液はまた、塩を含有してもよい。ある実施形態において、洗浄剤が、存在する。ある実施形態において、ワクチンが、注射用の調製物に製剤されてもよい。これらの製剤は、有効量の抗原を含有し、滅菌液体溶液、液体懸濁剤、または凍結乾燥バージョンであり、任意選択で、安定剤または賦形剤を含有する。組成物は、通常、水性形態をしているであろう。

組成物は、たとえば、張性をコントロールするために、生理学的な塩を含有してもよい。ＮａＣｌは、好ましく、たとえば１〜２０ｍｇ／ｍｌであるが、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、二ナトリウムホスフェート二水和物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどのような他の塩もまた、存在してもよい。ある実施形態において、レシチンもまた、存在してもよい。通常、重量オスモル濃度は、２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇであろう。組成物は、１つまたは複数バッファー、典型的に、リン酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ホウ酸バッファー、コハク酸バッファー、ヒスチジンバッファー、またはクエン酸バッファーを含んでいてもよい。バッファーは、５〜２０ｍＭの範囲で典型的に含まれるであろう。

組成物は、好ましくは、非発熱性である。組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどのような、１つまたは複数の保存剤を含んでいてもよい。好ましくは、ワクチンは、チオメルサールなどのような、水銀の物質がない、より好ましくは、保存剤がない。

組成物は、任意選択で、洗浄剤、たとえばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」、たとえばＴｗｅｅｎ−２０またはＴｗｅｅｎ−８０として知られている）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）など）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、デオキシコール酸ナトリウムを含んでいてもよい。洗浄剤は、微量でのみ存在してもよい。

インフルエンザワクチンは、約０．１〜１．０ｍｌ、典型的に約０．５ｍｌの投薬容積で通常投与される。子供については、投与量は、多くの場合、成人について使用されるものの半分（つまり約０．２５ｍｌ）である。

インフルエンザワクチンは、約２℃〜８℃で普通、保存される。

インフルエンザウイルスワクチンの様々な形態が、現在利用可能であり、たとえばｃｈａｐｔｅｒｓ １７ ＆ １８ ｏｆ Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ （Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００４， ＩＳＢＮ： ０−７２１６−９６８８−０）を参照されたい。本発明に従って使用されるものは、不活性化ウイルスをベースとする。使用することができる不活化ワクチンは、「スプリット」ビリオンまたは精製表面抗原（赤血球凝集素を含む）をベースとしてもよい。インフルエンザ抗原はまた、ビロソーム（核酸がない、ウイルス様リポソーム粒子）の形態で提供することもできる。組換え宿主（たとえばバキュロウイルスベクターを使用する昆虫細胞株においてまたは哺乳動物細胞株においてまたは酵母細胞において）から精製された抗原もまた、使用されてもよい。

本発明に従って使用されてもよい典型的なインフルエンザワクチンは、季節性ワクチン接種のために登録されたインフルエンザワクチン、たとえば、商標、Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ（Ｃｒｕｃｅｌｌ）；Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）またはＶａｘｉｇｒｉｐ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ）；Ｆｌｕｖｉｒｉｎ（登録商標）、Ａｇｒｉｐｐａｌ（登録商標）、Ｂｅｇｒｉｖａｃ（登録商標）、またはＯｐｔａｆｌｕ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；Ｆｌｕａｒｉｘ（登録商標）（ＧＳＫ）；Ｉｍｕｖａｃ（登録商標）またはＩｎｆｌｕｖａｃ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ）；Ｆｌｕｖａｘ（登録商標）（ＣＳＬ）；Ｐｒｅｆｌｕｃｅｌ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ）などの下で売られているものである。

本発明に従うワクチンは、スプリットビリオンワクチン、サブユニットワクチン、またはビロソームワクチンの形態をした、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を含む任意のワクチンであってもよい。インフルエンザワクチンを産生するためのいくつかの手段が、知られており、当業者にとって一般的なものである。

ワクチンは、サブビリオン（ｓｕｂ−ｖｉｒｉｏｎ）形態で、たとえば、ウイルス脂質エンベロープが溶解されたもしくは破壊されたスプリットウイルスの形態でまたは１つもしくは複数の精製ウイルスタンパク質の形態で製剤されてもよい。インフルエンザウイルスなどのようなウイルスをスプリットするための方法は、当技術分野においてたとえばよく知られており、たとえば国際公開第０２／２８４２２号パンフレット、国際公開第０２／０６７９８３号パンフレット、国際公開第０２／０７４３３６号パンフレット、国際公開第０１／２１１５１号パンフレットなどを参照されたい。ウイルスのスプリッティングは、破壊濃度のスプリッティング剤により、感染性（野生型もしくは弱毒化）または非感染性（たとえば不活性化）であるかどうかにかかわらず、ウイルス全体を破壊するまたは断片化することによって実行される。スプリッティング剤は、通常、親水性の頭部に対して付加された疎水性の尾部を典型的に有する脂質膜を切断し、溶解することができる作用物質、たとえば、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＣＴＡＢなどのような非イオンまたはイオン（たとえばカチオン）界面活性剤を含む。破壊により、ウイルスタンパク質の完全なまたは部分的な可溶化がもたらされ、ウイルスの完全性が改変される。

ウイルス由来の個々のタンパク質を精製するための方法は、よく知られており、たとえばろ過、クロマトグラフィー、遠心分離ステップ、および中空糸による溶出を含む。一実施形態において、タンパク質が、イオン交換クロマトグラフィーによって精製される。

哺乳動物細胞に感染するそれらの能力を破壊するためにインフルエンザウイルスを不活性化するまたは死滅させるための方法は、当技術分野において知られており、たとえば、ホルマリン、ＢＰＬ、ＵＶ光などによる処理を含む。

ある好ましい実施形態において、本発明において使用されるワクチンが、従来の（つまりスプリットインフルエンザ、サブユニットインフルエンザ、またはインフルエンザ全体）ワクチンではなく、インフルエンザビロソームワクチンである。したがって、好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるインフルエンザワクチンが、ビロソームワクチンであり、これは、大多数、つまり少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％の大脂質タンパク質複合体構造がビロソームの形態をしているワクチンである。そのようなビロソームは、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を含む。ビロソームワクチンにおいて、ビロソームは、産生プロセスにおいて、たとえば、洗浄剤を使用するインフルエンザ粒子の可溶化、不溶性物質の除去、およびビロソームを再構成するための、洗浄剤の続く明確な除去によって、慎重に産生される。ある好ましい実施形態において、ビロソームが、外因性の脂質を含む。ビロソームは、ウイルス由来の抗原を含有する、再構成された脂質膜である。ビロソームは、たとえば、２つの主なアプローチによって産生することができ、一方のアプローチは、ビロソームの再構成の間の外部脂質の追加に基づき（Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．， １９７５． Ｌａｎｃｅｔ ２：８９９−９０１；Ｔｒｕｄｅｌ Ｍ． ａｎｄ Ｆ． Ｎａｄｏｎ， １９８１． Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２７：９５８−６２；Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７． Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ． １４：７９−９０；Ｍａｒｋｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．， ２００１． Ｃｌｏｎｉｎｇ ３：１１−２１；Ｇｌｕｃｋ， Ｒ． ａｎｄ Ｉ． Ｃ． Ｍｅｔｃａｌｆｅ， ２００２． Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ｂ１０−１６；Ｍｉｓｃｈｌｅｒ， Ｒ． ａｎｄ Ｉ． Ｃ． Ｍｅｔｃａｌｆｅ， ２００２． Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ｂ１７−２３）、他方は、外部脂質の追加の非存在下におけるビロソームの形成に基づく（Ｓｔｅｇｍａｎｎ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． １９８７． ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２６５１−９；Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ ｅｔ ａｌ．， ２００３． Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：９２５−３１）。本発明において使用される特に有利なワクチンは、したがって、Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖなどのようなビロソームインフルエンザワクチンである（たとえば国際公開第９２／１９２６７号パンフレット；Ｇｌｕｃｋ， Ｒ， １９９２， Ｖａｃｃｉｎｅ １０： ９１５−９２０；Ｍｉｓｃｈｌｅｒ， Ｒ． ａｎｄ Ｉ． Ｃ． Ｍｅｔｃａｌｆｅ， ２００２． Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ｂ１７−２３を参照されたい）。これらのビロソームはまた、免疫賦活再構成インフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）とも呼ばれる。それらは、主として、約１００〜３００ｎｍ、たとえばおよそ１５０ｎｍの直径を有する球状単層小胞からなり、主な構成分子は、天然に存在するリン脂質（ＰＬ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）であり、後者は、ビロソーム構造の約７０％を形成し、膜構成成分の残りの３０％は、ＨＡおよびＮＡ糖タンパク質を提供するために使用されるインフルエンザウイルスに起源を持つエンベロープＰＬから構成される。それらは、オクタエチレングリコール（ＯＥＧ）によって可溶化されるインフルエンザウイルスから大規模に産生することができ、これは、超遠心分離の後に、レシチンと混合される。Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖを調製するためのプロセスは、参照によって本明細書において組み込まれるＭｉｓｃｈｌｅｒ， Ｒ． ａｎｄ Ｉ． Ｃ． Ｍｅｔｃａｌｆｅ， ２００２． Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ｂ１７−２３の本文および図１において詳細に記載される。Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖワクチンのそれぞれの用量（０．５ｍｌ）は、典型的に、活性構成成分として、ＷＨＯによって季節ごとに推奨されるインフルエンザウイルス株のそれぞれの１５μｇ赤血球凝集素を含有し、そのうえ、それぞれの用量は、１１７μｇレシチン（リン脂質）、３．８ｍｇリン酸水素二ナトリウムデハイドラート、０．７ｍｇリン酸二水素カリウム、２．４ｍｇ塩化ナトリウム、および０．５ｍｌ注射用水を含有する。Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖビロソームインフルエンザワクチンは、Ｃｒｕｃｅｌｌから入手可能であり、アジュバントの必要性を伴うことなく優れた免疫原性および低い反応源性をもたらす。

ワクチンのためのＨＡおよび／またはＮＡは、受精した雌鳥の卵において従来から産生されてきたインフルエンザウイルスに由来してもよい。このよく知られている産生方法は、数十年間、既に使用されてきており、なお、市場に出ているインフルエンザワクチンの大部分についての標準的な手順である。

その代わりに、ＨＡおよびＮＡは、それ自体知られており、当業者に入手可能な手段および方法を使用して、哺乳動物、鳥、または昆虫細胞株、好ましくはＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫなどのような哺乳動物細胞株などのような、適した細胞株において産生されたインフルエンザウイルスに由来してもよい（たとえば欧州特許第１９５１２９６号明細書において記載される）。哺乳動物細胞の使用は、ワクチンが、ニワトリＤＮＡ、卵タンパク質（オバルブミンおよびオボムコイドなど）などのような物質がなく、それによって、アレルゲン性を低下させることができることを意味する。国際公開第９７／３７０００号パンフレット、国際公開第９７／３７００１号パンフレット、欧州特許第１１０８７８７号明細書、および欧州特許第２２９００５３号明細書は、浮遊液および無血清培地において増殖することができ、インフルエンザウイルスの産生および複製において有用である動物細胞および細胞株についての産生が記載される例である。さらなる詳細は、国際公開第０３／０２３０２１号パンフレットおよび国際公開第０３／０２３０２５号パンフレットにおいて示される。細胞は、様々な方法で、たとえば、浮遊液において、接着培養において、マイクロキャリア上で増殖させてもよい。産生は、好ましくは、無血清浮遊培養におけるものであってもよい。

サブユニットワクチンのタンパク質もまた、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞などのような、適した系における従来の組換えＤＮＡ発現によって産生されてもよい。

ビリオンは、様々な方法によって、ウイルスを含有する液体から収集することができる。たとえば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む線状スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心分離を伴ってもよい。次いで、抗原は、ダイアフィルトレーションによって、任意選択の希釈の後に精製されてもよい。

精製表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原赤血球凝集素および典型的にノイラミニダーゼもまた含む。精製形態をしたこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、当技術分野においてよく知られている。

本発明の方法によって起こされる免疫応答は、通常、抗体応答、好ましくは保護的抗体応答を含むであろう。インフルエンザワクチン接種の後に、抗体応答、中和能力、および保護について評価するための方法は、当技術分野においてよく知られている。ヒトによる研究は、ＨＡに対する抗体力価が保護と相関することを示した（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価は、同種のウイルスによる感染からの約５０％の保護をもたらす）［たとえばＰｏｔｔｅｒ ＆ Ｏｘｆｏｒｄ （１９７９） Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ ３５： ６９−７５］が、最近の研究は、これに異議を唱えるまたはＨＡＩおよび効能の間の相関性の欠如をさらに実証する。

本発明に従うワクチンの投与は、非経口投与の標準的なルートを使用して、好ましくは、注射、たとえば、皮下、皮内、筋肉内によって、実行することができる。一実施形態において、ワクチンが、筋肉内注射によって、たとえば腕の三角筋または大腿の外側広筋に投与される。当業者は、ワクチン中の抗原（複数可）に対する免疫応答を誘発するために、本発明に従ってワクチンを投与する様々な可能性について知っている。

複数の投与は、初回刺激−追加免疫予防接種スケジュールにおいて使用されてもよい。典型的な実施形態において、本発明に従うワクチンの少なくとも３つの用量がすべて、筋肉内注射によって与えられる。本発明のレジメンにおいて、ワクチン組成物は、少なくとも１つの第１のインフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡを含んでおり、第１のインフルエンザ株のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質は、１年未満の期間内に、少なくとも３回、投与される。投与スケジュールは、したがって、初回刺激投与および少なくとも２回の追加免疫投与を含む。初回刺激−追加免疫スケジュールにおいて、好ましくは、同じワクチンが、３回すべてに使用されるが、ある構成成分に変更を加えることもまた可能である。

免疫学的にナイーブな対象に対して２回の用量のインフルエンザワクチンを投与することが以前に記載されているが、従来、３回の用量の同じワクチンが、同じ対象に対して投与されることは典型的になく、インフルエンザワクチンの３回の投与に際して本明細書において初めて記載される保護の幅の改善は、非常に驚くべきことである。複数の投与は、少なくとも１週間の間隔で、本発明に従って、典型的に投与されるであろう（たとえば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）。本発明に従う第１および第３の投与の間の全期間は、１年以下になるであろう。好ましくは、第１および第３の投与の間の全期間は、１０、９、８、７、６、５、または４か月以下になるであろう。１か月は、約４週間に等しく、これらの用語は、区別なく本明細書において使用される。ある実施形態において、第２の用量が、第１の用量の、１〜１２週間、好ましくは２〜８週間、好ましくは３〜６週間後に投与される。ある実施形態において、第３の用量が、第２の用量の、４週間〜１０か月、好ましくは４週間〜６か月後に投与される。ある実施形態において、第２の用量が、第１の用量の約４週間後に投与され、第３の用量が、第２の用量の約４週間〜３か月、たとえば約４週間後に投与される。本発明に従うそのような予防接種スケジュールは、ワクチン中の投与されるＨＡ抗原およびＮＡ抗原が由来するすべての株に関して、保護の比較的迅速な開始、また、異種およびさらに亜型が異なるインフルエンザ株に対する干渉効果の誘発をも確実にする利点を有する。

アジュバントは、適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに増加させることが当技術分野において知られており、インフルエンザ抗原および適したアジュバントを含む医薬組成物は、当技術分野においてよく知られており、たとえば、ＦｌｕＡｄ（登録商標）インフルエンザワクチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は、アジュバント（ＭＦ５９、スクワレンを含む水中油型エマルションアジュバント）を含有する。用語「アジュバント」および「免疫刺激薬」は、区別なく本明細書において使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質として定義される。これに関連して、アジュバントは、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強するために使用される。本発明に従って使用されるインフルエンザワクチンは、アジュバントを含まない。粘膜投与または強力なアジュバントまたはその両方が、インフルエンザワクチンに対する免疫応答を広幅化するのに必要であったことをいくつかの先行技術文献が示唆したので、季節性ワクチンが３回、対象に対して、さらに非経口注射によって投与される場合に、アジュバントが、広範な免疫応答をもたらすのに必要ではなかったということが、驚いたことに発見された。ワクチンにおいてアジュバントを含まないといういくつかの利点は、安全性の増加、より低い反応源性、製造され、試験される必要のある構成成分がより少ないという理由から、より単純な産物、および若い対象におけるワクチンの使用の可能性である。

本発明に従う医薬組成物の投与は、通常、免疫応答を誘発することを目的とする。免疫応答は、細胞性および／または液性応答を含んでいてもよい。観察される干渉効果は、抗体の誘発を含んでいてもよいが、必ずしも、保存ＨＡエピトープに対するものでなくてもよい。

本発明の方法に従うワクチンの投与は、異種インフルエンザ株およびさらに亜型が異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発する。それは、そのような株に対する滅菌保護をもたらさなくてもよい、つまり、感染それ自体に対して保護しなくてもよいが、筋肉痛、頭痛、虚弱／疲労、咳、口腔咽頭痛、体重減少、寒け、熱、筋痛、咳嗽、全般的な不快などのような、そのような株によるインフルエンザ感染由来の少なくとも１つ、好ましくはより多くまたはすべての症状の頻度、重症度、および／または期間を少なくとも低下させることを目的とする。そのうえ、入院をさらに必要とし、重度の症例ではさらに死亡の原因となり得る、そのような株によるインフルエンザ感染から生じ得る合併症（たとえば直接的なウイルス性肺炎または二次的な細菌性肺炎を含む）の頻度、重症度、および／または期間は、本発明の方法に従うワクチンの投与に際して低下することが期待される。本発明の方法はまた、それと同時に、経済に対するインフルエンザの不利な影響のいくつか、たとえば、仕事の欠席、医者への訪問、入院、（さらなる）薬物治療の必要性などを低下させてもよいまたはさらに妨げてもよい。そのため、本発明の方法は、医療に大きな影響を及ぼす。そのうえ、本発明の方法は、標準的な季節性ワクチンの繰り返しの使用によって、世界的流行インフルエンザ株による感染の不利な転帰に対するワクチン接種を可能にし、これは、世界的流行病発生の間のワクチンの早期の有用性を考慮したタイミングを考慮して、大きな利点となり得る。

本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。実施例は、本発明を決して限定するものではない。それらは、単に、本発明を明らかにするように果たすにすぎない。

実施例１．マウスにおける季節性インフルエンザワクチンによる３回のワクチン接種の後の異種インフルエンザ株に対する干渉効果
マウスは、２００９／２０１０シーズンの三価ビロソーム季節性インフルエンザワクチンＩｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ（Ｃｒｕｃｅｌｌ）により免疫化した。このワクチンは、ビロソームの形態をした、以下の３つのインフルエンザ株のそれぞれのＨＡ（３０μｇ／ｍｌ）およびＮＡ（量、明記されていない、通常、１５μｇ ＨＡ当たり約０．８〜４μｇ ＮＡと決定されている）を含有する：（Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）。ワクチンのヒト用量は、１株当たり１５μｇ ＨＡ、つまり０．５ｍｌである。マウスは、針を有する通常の注射器を使用して、３週間の間隔で、ヒト用量の２０％により、３回、ワクチン接種した（予防接種当たり、５０μｌ筋肉内注射、後肢の両方の四頭筋）。最終の予防接種の４週間後に、マウスに、ワクチンＨ１株から遺伝的に離れている（したがって異種である）（図１Ｂを参照されたい）、マウスに適応したＨ１Ｎ１インフルエンザ株ＷＳＮ３３の２５×ＬＤ５０（ＬＤ５０＝曝露された動物の５０％の死亡をもたらすウイルスの用量）を抗原投与した。３×ワクチンを受けたマウスは、同じ投薬スケジュールに従って希釈剤の注射（注射当たりＰＢＳ、２×５０μｌ筋肉内）を受けたマウスと比較した。抗原投与の後に、体重および臨床症状について毎日モニターした。臨床スコアは、以下のように割り当てた：０＝臨床サインなし；１＝ざらざらした外皮；２＝ざらざらした外皮、それほど反応性でない、処理の間の無抵抗；３＝ざらざらした外皮、丸くなる、困難な呼吸、処理の間の無抵抗；４＝ざらざらした外皮、丸くなる、困難な呼吸、応答しない。４の臨床スコアを有するように観察されたマウスは、安楽死させ、死んでいるものとしてスコア化した。

図２Ａは、抗原投与の後のマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を示し、驚いたことに、生存が、コントロールマウス（１０匹のうち２匹、ｐ＜０．０２３、フィッシャーの正確確率検定を使用）に比べて、有意に増加したことを示す（３×ワクチンにより免疫化した１０匹のマウスのうち８匹）。期待されるように、ワクチンの１回の注射は、このモデルにおいて保護を与えなかった（示さず）。

図２Ｂは、抗原投与の後のマウスの平均相対的体重を示し、マウスの両方のグループが、体重の２０％超を失い、その後、免疫化したマウスは、ほとんど回復し、免疫化していないマウスは、大部分、感染で死ぬことを示す。死亡または安楽死前のマウスについて最後に記録した体重は、分析前に得る。

図２Ｃは、抗原投与の後のマウスの臨床スコアを示し、感染を切り抜ける、免疫化したマウスは、長期間の臨床的疾患に罹患しないことを示す。死亡または安楽死前の最後に記録した臨床スコアは、分析前に得る。

季節性ワクチンの組成は、それらがもはや、遺伝的にドリフトし広まっている株に対する保護を与えないことが期待される場合、ほとんど毎年、修飾される。したがって、２００９／２０１０インフルエンザ季節性ワクチンによるさらなる追加免疫（つまりこの同じワクチンの３回の投与）が、１９３３年までさかのぼる、遺伝的に離れているインフルエンザ株に対する保護を与えることは、非常に意外であった。ワクチンの３回の投与が、異種インフルエンザ株に対する有意な干渉効果をもたらすことが結論づけられる。

実施例２．マウスにおける季節性インフルエンザワクチンによる３回のワクチン接種の後の亜型が異なるインフルエンザ株に対する干渉効果
実施例１は、異種Ｈ１Ｎ１株に対する干渉効果を実証した。この実施例において、そのような干渉効果がまた、亜型が異なる株に対しても拡張されるかどうかについて試験した。

マウスは、実施例１と同じ投薬計画に従って、実施例１と同じワクチンにより免疫化した。最終の予防接種の４週間後に、マウスに、ワクチン中に抗原が存在する株に対して亜型が異なる、マウスに適応したＨ５Ｎ１インフルエンザ株ＨＫ／１５６／９７の２５×ＬＤ５０を抗原投与した。抗原投与後に、疾患について、実施例１について記載されるものと同じ基準に従ってモニターした。

図３Ａは、抗原投与の後のマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を示し、驚いたことに、生存が、コントロールマウス（８匹のうち０匹、ｐ＜０．００１、フィッシャーの正確確率検定を使用）に比べて、有意に増加したことを示す（３×ワクチンにより免疫化した８匹のマウスのうち７匹）。

図３Ｂは、抗原投与の後のマウスの平均相対的体重を示し、マウスの両方のグループが、体重の２０％超を失い、その後、免疫化したマウスは、ほとんど回復し、免疫化していないマウスは、急速に、感染で死ぬことを示す。死亡または安楽死前のマウスについて最後に記録した体重は、分析前に得る。

図３Ｃは、抗原投与の後のマウスの臨床スコアを示し、感染を切り抜ける、免疫化したマウスは、長期間の臨床的疾患に罹患しないことを示す。死亡または安楽死前の最後に記録した臨床スコアは、分析前に得る。

季節性ワクチンは、広まっているインフルエンザ株に毎年一致する株から構成され、一般に、さらなるインフルエンザ亜型（概要については図１Ａを参照されたい）に対する保護をもたらすようには期待されない。特定のワクチンは、Ｈ５Ｎ１などのような、世界的流行病の脅威をもたらすのではないかと思われるいくつかのインフルエンザ亜型について開発されている。したがって、２００９／２０１０インフルエンザ季節性ワクチンによるさらなる追加免疫が、亜型が異なるＨ５Ｎ１インフルエンザに対する保護を与えることは非常に意外であった。

ワクチンの３回の投与が、異種インフルエンザ株だけではなく、亜型が異なるインフルエンザ株に対しても、有意な干渉効果をもたらすことが結論づけられる。

実施例３．マウスにおけるＩｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ ２００９／２０１０の複数の投与によって与えられる保護の幅
１回または３回（投与の間の時間間隔：３週間）投与された季節性インフルエンザワクチン（Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８：Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ、シーズン２００９／２０１０）の効果を、マウスにおいて試験し、これらに、続いて（最終の予防接種の４週間後）、独立した実験において、ｉ）異種Ｈ１、Ｈ３、およびＢ株、ｉｉ）亜型が異なるＨ５株、ならびにｉｉｉ）亜型が異なるＨ７株を抗原投与する（実施例１〜３の方法）。

季節性ワクチンの３回の投与が、ワクチン中に示されない（つまり、これらの株の抗原は含まれていない）異種および亜型が異なるインフルエンザ株に対して動物を有意に保護するであろうということが期待される。

実施例３Ａ．マウスにおける季節性インフルエンザワクチンによる３回のワクチン接種の後の異種Ｈ３インフルエンザ株に対する干渉効果
実施例１は、異種Ｈ１Ｎ１株に対する干渉効果を実証した。この実施例において、そのような干渉効果がまた、異種Ｈ３インフルエンザに対しても拡張されるかどうかについて試験した。

マウスは、実施例１と同じ投薬計画に従って、同じワクチンにより免疫化した。最終の予防接種の４週間後に、マウスに、ワクチン中に存在するＨ３Ｎ２株に対して著しく異種である（図１Ｃを参照されたい）、マウスに適応したＨ３Ｎ２インフルエンザＨＫ／１／６８の２５×ＬＤ５０を抗原投与した。抗原投与後に、疾患について、実施例１について記載されるものと同じ基準に従ってモニターした。

図４Ａは、抗原投与の後のマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を示し、生存が、コントロールマウス（１０匹のうち０匹、ｐ＜０．０５、フィッシャーの正確確率検定を使用）に比べて、有意に増加したことを示す（３×ワクチンにより免疫化した１０匹のマウスのうち６匹）。

図４Ｂは、抗原投与の後のマウスの平均相対的体重を示し、マウスの両方のグループが、体重の２０％超を失い、その後、免疫化したマウスは、ほとんど回復し、免疫化していないマウスは、急速に、感染で死ぬことを示す。死亡または安楽死前のマウスについて最後に記録した体重は、分析前に得る。

図４Ｃは、抗原投与の後のマウスの臨床スコアを示し、感染を切り抜ける、免疫化したマウスは、長期間の重篤な臨床的疾患に罹患しないことを示す。死亡または安楽死前の最後に記録した臨床スコアは、分析前に得る。

季節性ワクチンは、広まっているインフルエンザ株に毎年一致する株から構成され、一般に、ワクチン中に存在する株および密接に関係する株に対する保護をもたらすのみである。この実施例において使用される抗原投与株は、１９６８年の最初のＨ３Ｎ２世界的流行株であり、したがって、現在のＨ３Ｎ２株から遺伝的に離れている。ワクチン組成は、保護の低下につながることが期待される、非常にわずかな程度の遺伝的変異に基づいて新しくされる。したがって、本発明の前に、３回与えられる季節性インフルエンザワクチンが、遺伝的に離れたＨ３Ｎ２インフルエンザに対する有意な保護を与えることは非常に意外であった。これらの結果は、季節性インフルエンザワクチンの３回の投与が、異種インフルエンザ株、この場合、Ｈ３株に対する有意な干渉効果をもたらすことを確認する。

実施例３Ｂ．マウスにおける季節性インフルエンザワクチンによる１または３回のワクチン接種の後の異種インフルエンザＢ株に対する干渉効果
実施例１は、異種Ｈ１Ｎ１株に対する干渉効果を実証した。この実施例において、そのような干渉効果がまた、季節性ワクチンの２００９／２０１０組成物について、異種インフルエンザＢに対しても拡張されるかどうかについて試験した。マウスは、３週間の間隔で季節性ワクチンにより免疫化し、インフルエンザＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／０６の２５×ＬＤ５０を、最終の予防接種の４週間後に抗原投与した。季節性ワクチンの１回の注射を受けるコントロールグループは、抗原投与の４週間前に同様に免疫化した。抗原投与後に、疾患について、実施例１について記載されるものと同じ基準に従ってモニターした。

図５Ａは、抗原投与の後のマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を示し、１×および３×ワクチンが、ＰＢＳコントロールと比較して、抗原投与に対する有意な保護を与えることを示す（それぞれ、生存８０％、ｐ＝０．０１；１００％、ｐ＝０．００１（両側のフィッシャーの正確確率検定）。

図５Ｂは、抗原投与の後のマウスの平均相対的体重を示し、１×および３×の両方のワクチンが、抗原投与の後に体重損失を有意に低下させることを示す（それぞれｐ＝０．０３２およびｐ＜０．００１、Ｄｕｎｎｅｔｔポストホック検定ありのＡＮＯＶＡ）。特に、３×ワクチンを受けるグループにおいて、抗原投与の後の体重減少は、ほとんど観察されない。

図５Ｃは、抗原投与の後のマウスの臨床スコアを示し、１×および３×ワクチンの両方が、ＰＢＳコントロール（両方の場合において、抗原投与後、３日目から有意）に比べて臨床症状を著しく低下させることを示す。治療グループにおける疾患は、非常に軽度であり、中央臨床スコアは、１を超過しない。

いくつかの会社は、２つのクレードの間で干渉効果が期待されないという論理的根拠に基づいて、インフルエンザＢ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ／０２／１９８７）およびＹａｍａｇａｔａ／１６／１９８８原型（図１Ｄ）の２つの主なクレードに相当する、季節性インフルエンザワクチンの四価製剤におけるインフルエンザＢの２つの株を含むように現在動いている。したがって、本発明の前に、インフルエンザＢの１つのクレードのみが示される季節性インフルエンザワクチンにより３回、免疫化されたマウスが、異種インフルエンザＢの抗原投与に対して完全に保護されることは、非常に意外であった。これらの結果は、季節性インフルエンザワクチンの３回の投与が、異種インフルエンザ株、この場合、Ｂ株に対する有意な干渉効果をもたらすことを確認する。さらに、ワクチンの２００９組成物は、既に、異種インフルエンザＢに対する有意な保護を与えているが、保護は、３×季節性ワクチンによってさらに改善されるように思われる。

実施例３Ｃ．マウスにおける季節性インフルエンザワクチンによる１または３回のワクチン接種の後の亜型が異なるインフルエンザＨ５Ｎ１に対する干渉効果
実施例２は、亜型が異なるＨ５Ｎ１株に対する干渉効果を示した。この実施例において、亜型が異なるＨ５Ｎ１インフルエンザに対する保護が、ワクチン（Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ、シーズン２００９／１０組成物）による予防接種の数によって、影響を与えられるかどうかについて研究する。マウスは、３週間の間隔で季節性ワクチンにより免疫化し、インフルエンザＡ／ＨＫ／１５６／９７の２５×ＬＤ５０を、最終の予防接種の４週間後に抗原投与した。季節性ワクチンの１回の注射を受けるコントロールグループは、抗原投与の４週間前に同様に免疫化した。抗原投与後に、疾患について、実施例１について記載されるものと同じ基準に従ってモニターした。

図６Ａは、抗原投与の後のマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を示し、１×および３×ワクチンが、抗原投与に対する有意な保護を与えることを示す；それぞれ、生存６０％、ｐ＝０．０２２；７０％、ｐ＝０．００６（両側のフィッシャーの正確確率検定）。

図６Ｂは、抗原投与の後のマウスの平均相対的体重を示し、３×ワクチンが、体重損失を有意に低下させることを示す（ｐ＝ ０．０２３）、Ｄｕｎｎｅｔｔポストホック検定ありのＡＮＯＶＡ）。体重に基づくと、３×ワクチンによる保護がより強いが、保護パーセンテージは、１×および３×ワクチンの間で同等であるということが結論づけられる。

図６Ｃは、抗原投与の後のマウスの臨床スコアを示し、１×および３×ワクチンにより免疫化されたグループの両方が、抗原投与の後に実質的に病気になるが、両方のグループは、最終的に回復し、一方、コントロールは、感染で死ぬことを示す。

これらの発見は、実施例２における発見を確認するものである。そのうえ、それらは、亜型が異なるＨ５Ｎ１の抗原投与に対する３×季節性ワクチンによる保護が、１×季節性ワクチンによる保護よりも強いことが確認される。

実施例４．マウスにおけるＩｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ ２０１０／２０１１の複数の投与によって与えられる保護の幅
１回または３回（投与の間の時間間隔：３週間）投与された季節性インフルエンザワクチン（Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８：Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標） Ｖ、シーズン２０１０／２０１１）の効果を、マウスにおいて試験し、これらに、続いて（最終の予防接種の４週間後）、ｉ）同種Ｈ１、Ｈ３、およびＢ株、ｉｉ）異種Ｈ１、Ｈ３、およびＢ株を抗原投与する。

季節性ワクチンの３回の投与が、ワクチン中に示されない異種および亜型が異なるインフルエンザ株に対して動物を有意に保護するであろうということが期待される。

実施例４Ａ．マウスにおける季節性インフルエンザワクチンによる３回のワクチン接種の後の異種インフルエンザＢ株に対する干渉効果
この実施例において、季節性インフルエンザワクチン（Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ、シーズン２０１０／２０１１組成物）による３×予防接種が、ワクチン中に示される株と比較して、インフルエンザＢの他のクレードに属するインフルエンザＢ（Ｆｌｏ／４／２００６）（図１Ｄを参照されたい）に対する保護を与えることができるかどうかについて試験した。

マウスは、実施例１と同じ投薬計画に従って、同じワクチンにより免疫化した。最終の予防接種の４週間後に、マウスは、ワクチン中に存在するインフルエンザＢ株（（Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）図１Ｄを参照されたい）に対して著しく異種である、マウスに適応したインフルエンザＢ Ｆｌｏｒｄｉａ／４／２００６の２５× ＬＤ５０を抗原投与した。抗原投与後に、疾患について、実施例１について記載されるものと同じ基準に従ってモニターした。

図７Ａは、抗原投与の後のマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を示し、驚いたことに、生存が、コントロールマウス（１０匹のうち０匹、ｐ＜０．００１、フィッシャーの正確確率検定を使用）に比べて、有意に増加したことを示す（３×ワクチンにより免疫化した１０匹のマウスのうち１０匹）。

図７Ｂは、抗原投与の後のマウスの平均相対的体重を示し、コントロールグループは、感染で死亡する前に、それらの最初の体重の２５％超を失うのに対して、３×ワクチングループは、それらの体重の１０％未満しか失わない（３日目以後、有意な差異）。死亡または安楽死前のマウスについて最後に記録した体重は、分析前に得る。

図７Ｃは、抗原投与の後のマウスの臨床スコアを示し、感染を切り抜ける、３×ワクチンにより免疫化したマウスは、重篤な臨床的疾患に罹患しないのに対して、コントロールグループは、重篤な臨床的疾患まで急速に進行することを示す（臨床スコア＞２によって定義される；３日目から有意な差異）。死亡または安楽死前の最後に記録した臨床スコアは、分析前に得る。

季節性ワクチンは、広まっているインフルエンザ株に毎年一致する株から構成され、一般に、ワクチン中に存在する株および密接に関係する株に対する保護をもたらすのみである。いくつかの会社は、２つのクレードの間で干渉効果が期待されないという論理的根拠に基づいて、インフルエンザＢ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ／０２／１９８７）およびＹａｍａｇａｔａ／１６／１９８８原型（図１Ｄ）の２つの主なクレードに相当する、季節性インフルエンザワクチンの四価製剤におけるインフルエンザＢの２つの株を含むように現在動いている。したがって、本発明の前に、インフルエンザＢの１つのクレードのみが示される季節性インフルエンザワクチンにより３回、免疫化されたマウスが、異種インフルエンザＢの抗原投与に対して完全に保護されることは、非常に意外であった。これらの結果は、季節性インフルエンザワクチンの３回の投与が、異種インフルエンザ株、この場合、Ｂ株に対する有意な干渉効果をもたらすことを確認する。さらに、それがＩｎｆｌｅｘａｌ ２００９／２０１０および２０１０／１１組成物の両方について観察されたので、結果は、３×ワクチンによる異種干渉効果が単一のインフルエンザワクチン組成物に限られないことを実証する。

実施例４Ｂ．マウスにおける季節性インフルエンザワクチンによる１または３回のワクチン接種の後の異種インフルエンザＢ株に対する干渉効果
実施例４Ａは、季節性ワクチンの２０１０組成物についての、異種インフルエンザＢに対する干渉効果を示した。この実施例において、発明者らは、異種インフルエンザＢに対する保護が、ワクチンによる予防接種の数によって影響を与えられるかどうかについて検査した。マウスは、３週間の間隔で季節性ワクチン（Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標） Ｖ、シーズン２０１０／１１）により免疫化し、インフルエンザＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／０６の２５×ＬＤ５０を、最終の予防接種の４週間後に抗原投与した。季節性ワクチンの１回の注射を受けるコントロールグループは、抗原投与の４週間前に同様に免疫化した。抗原投与後に、疾患について、実施例１について記載されるものと同じ基準に従ってモニターした。

図８Ａは、抗原投与の後のマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を示し、３×ワクチンが、抗原投与に対する完全な保護を与えることを示す（１００％、ｐ＝０．００１、両側のフィッシャーの正確確率検定）。１×ワクチンは、異種インフルエンザＢの抗原投与に対して有意に保護しない。

図８Ｂは、抗原投与の後のマウスの平均相対的体重を示し、３×ワクチンだけが、抗原投与の後に体重損失を有意に低下させることを示す（ｐ＝０．０１８、Ｄｕｎｎｅｔｔポストホック検定ありのＡＮＯＶＡ）。

図８Ｃは、抗原投与の後のマウスの臨床スコアを示し、３×ワクチンが、ＰＢＳコントロールに比べて臨床症状を著しく低下させる（抗原投与後、３日目から有意）が、１×ワクチンは、症状における軽微な遅延を引き起こすだけであることを示す。３×ワクチングループにおける疾患は、非常に軽度であり、中央臨床スコアは、１．５を超過しない。

同様の結果は、他の季節性ワクチン（Ｉｎｆｌｕｖａｃ（登録商標）、Ａｂｂｏｔ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのサブユニットワクチン、シーズン２０１０／１１の組成物（つまりそのシーズンについてのＩｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖにおけるものと同じ株）を３回投与した場合に、得られた。有意な保護は、１回の投与の後に既に得られたが、完全な保護は、３回の投与の後にのみ観察された。

これらのデータは、異種インフルエンザＢに対する保護に関して、１×予防接種に対する、３×予防接種の利点を明確に示す。

実施例４Ｃ．マウスにおける季節性インフルエンザワクチンによる１または３回のワクチン接種の後の亜型が異なるインフルエンザＨ５Ｎ１に対する干渉効果
実施例２および３Ｃは、季節性インフルエンザワクチンの２００９組成物についての、亜型が異なるＨ５Ｎ１株に対する干渉効果を実証した。この実施例において、季節性ワクチンの２０１０組成物による１または３回の予防接種によって、亜型が異なるＨ５Ｎ１インフルエンザに対する保護が与えられるかどうかについて研究する。マウスは、３週間の間隔で季節性ワクチン（Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標） Ｖ、組成物２０１０／１１）により免疫化し、インフルエンザＡ／ＨＫ／１５６／９７の２５×ＬＤ５０を、最終の予防接種の４週間後に抗原投与した。季節性ワクチンの１回の注射を受けるコントロールグループは、抗原投与の４週間前に同様に免疫化した。抗原投与後に、疾患について、実施例１について記載されるものと同じ基準に従ってモニターした。

図９Ａは、抗原投与の後のマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を示し、３×ワクチンだけが、抗原投与に対する有意な保護を与えることを示す（８０％、ｐ＝０．００１、両側のフィッシャーの正確確率検定）。

図９Ｂは、抗原投与の後のマウスの平均相対的体重を示し、３×ワクチンが、体重損失を有意に低下させる（ｐ＝ ０．０２３）、Ｄｕｎｎｅｔｔポストホック検定ありのＡＮＯＶＡ）が、１×ワクチンは、体重損失を有意に低下させないことを示す。

図９Ｃは、抗原投与の後のマウスの臨床スコアを示し、１×および３×ワクチンにより免疫化されたグループの両方が、抗原投与の後に実質的に病気になるが、３×ワクチンを受けるマウスだけが、回復し続ける（７日目以後、ＰＢＳに比べて有意な差異）。

これらの発見は、２０１０組成物の３×季節性ワクチンもまた、亜型が異なるＨ５Ｎ１の抗原投与に対する有意な保護を与え、実施例２および３ｃの発見を拡張するものであることを示す。１×２００９季節性ワクチンは、Ｈ１Ｎ１抗原投与に対する部分的な保護を既に与えたが、これは、２０１０ワクチンについて当てはまらなかった。両方の場合において、保護は、１×予防接種に比べて、３×予防接種の後に明確により強い。

実施例５．フェレットにおけるインフルエンザワクチンの複数の投与によって与えられる保護の幅
フェレットは、インフルエンザワクチンの効能の試験について有効なモデルであると考えられる。１回、２回、または３回（投与の間の時間間隔：３週間）投与された季節性インフルエンザワクチン（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ：Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標） Ｖ、シーズン２０１１／２０１２または２０１２／２０１３）の効果を、フェレットにおいて試験し、続いて（４週間後）、亜型が異なるＨ５株（Ｈ５Ｎ１ Ｉｎｄ／０５／０５）を別々に抗原投与する。ウイルス複製は、毎日の咽頭スワブの培養によって評価し、生存は、感染の５日後までモニターする。

季節性ワクチンの３回の投与が、亜型が異なるＨ５Ｎ１インフルエンザに対して動物を有意に保護するであろうということが期待される。

実施例６．代替のワクチンによるさらなる追加免疫によって与えられる保護の幅
１回、２回、または３回（投与の間の時間間隔：３週間）投与された代替のインフルエンザワクチン（たとえば代替の登録ワクチン、不活性化インフルエンザウイルス全体、および／または組換えＨＡ＋ＮＡ）の効果を、マウスにおいて試験し、これらに、続いて（最終の予防接種の４週間後）、ｉ）同種Ｈ１、Ｈ３、およびＢ株、ｉｉ）異種Ｈ１、Ｈ３、およびＢ株、ｉｉｉ）亜型が異なるインフルエンザ株を抗原投与した。

そのようなワクチンによるさらなる追加免疫もまた、ワクチン中に示されない異種および亜型が異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を与えるであろうということが期待される。

実施例７．ヒト対象におけるインフルエンザワクチンＶによるさらなる追加免疫
臨床試験は、３回（投与の間の時間間隔：４週間）投与される季節性インフルエンザワクチン（Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８：Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標） Ｖ、シーズン２０１１／２０１２）の安全性および免疫原性を試験するために、ヒト対象により実行する。血清および末梢血単核球は、すべての予防接種の開始前に、最終の予防接種の４週間後に、および最初の予防接種の５か月後に収集した。血清および末梢血単核球は、最初の予防接種の１２か月後に収集する。

免疫原性は、収集した血清に対する、同種、異種、亜型が異なる中和、結合、およびＨＡＩアッセイによってモニターする。１回の予防接種後の免疫原性データは、ワクチンが３つの株すべてに対してＥＭＡ基準を満たしたことを示した。血清による干渉効果は、マウスにおいて試験し、マウスは、血清による腹腔内注射を受け、続いて（注射の１日後）、ｉ）同種Ｈ１、Ｈ３、およびＢ株、ｉｉ）異種Ｈ１、Ｈ３、およびＢ株、ｉｉｉ）亜型が異なるインフルエンザ株を抗原投与する。

Claims (15)

1. インフルエンザワクチン中にＨＡおよびＮＡが存在する株と比較して、少なくとも１つの異種株を含む、異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するのに使用するためのインフルエンザワクチンであって、少なくとも３つのインフルエンザウイルス株由来のＨＡおよびＮＡを含む前記インフルエンザワクチンが投与され、前記ワクチンが、ビロソームインフルエンザワクチンであり、前記ワクチンが、アジュバントを含まず、１年以内に、少なくとも３回、筋肉内に、対象に対して投与され、前記少なくとも１つの異種株由来のＨＡおよびＮＡが、前記対象に対して投与されない、インフルエンザワクチン。
2. インフルエンザワクチン中に抗原が存在するインフルエンザ株と比較して、少なくとも１つの、亜型が異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するのに使用するためのインフルエンザワクチンであって、ＨＡおよびＮＡを含む前記インフルエンザワクチンが投与され、前記ワクチンが、ビロソームインフルエンザワクチンであり、前記ワクチンが、アジュバントを含まず、１年以内に、少なくとも３回、筋肉内に、対象に対して投与される、インフルエンザワクチン。
3. 前記ワクチンが、少なくとも１週間、２回の投与の間の間隔で投与される、請求項１〜２のいずれか一項に記載のインフルエンザワクチン。
4. 前記ワクチンの第２の用量が、第１の用量の１週間〜８週間後に、対象に対して投与され、前記ワクチンの第３の用量が、前記第２の用量の３週間〜２６週間後に、対象に対して投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインフルエンザワクチン。
5. ワクチンの第２の用量が、第１の用量の１か月後に投与され、ワクチンの第３の用量が、前記第２の用量の１か月後に投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインフルエンザワクチン。
6. 前記ワクチンが、３つまたは４つのインフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のインフルエンザワクチン。
7. 前記ワクチンが、Ｈ１株、Ｈ３株、およびＢ株由来のＨＡおよびＮＡを含む、請求項６に記載のインフルエンザワクチン。
8. 前記ワクチンが、インフルエンザＨ１Ｎ１株由来のＨＡおよびＮＡを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のインフルエンザワクチン。
9. 前記対象が、６か月〜８０歳のヒト対象である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のインフルエンザワクチン。
10. 前記対象が、３か月〜４歳のヒト対象である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のインフルエンザワクチン。
11. Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するのに使用するためのインフルエンザワクチンであって、インフルエンザのＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ株由来のＨＡおよびＮＡを含むインフルエンザワクチンが、対象に対して投与され、前記Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株由来のＨＡおよびＮＡが、前記対象に対して投与されず、前記ワクチンが、ビロソームインフルエンザワクチンであり、前記ワクチンが、アジュバントを含まず、１年以内に、少なくとも３回、筋肉内に投与される、インフルエンザワクチン。
12. インフルエンザに対してワクチン接種するのに使用するためのインフルエンザワクチンであって、１年以内に、少なくとも３回、アジュバントを含まずかつ少なくとも３つのインフルエンザ株由来のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質を含むビロソームインフルエンザワクチンが、対象に対して、筋肉内に投与される、インフルエンザワクチン。
13. 前記ワクチンが、少なくとも１つのインフルエンザＨ１Ｎ１インフルエンザ株、Ｈ３Ｎ２株、およびＢ株由来のＨＡおよびＮＡを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のインフルエンザワクチン。
14. 前記対象が、前記ワクチンの前記第１の用量の投与の時期時に、インフルエンザウイルス抗原に対して免疫学的にナイーブである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のインフルエンザワクチン。
15. ３つのインフルエンザ株に対する保護ならびにワクチン中にＨＡ抗原およびＮＡ抗原が存在しない、インフルエンザ株の少なくとも１つと比較して、同じ亜型内の少なくとも１つの異種インフルエンザ株に対するおよびさらに、少なくとも１つの、亜型が異なるインフルエンザ株に対する干渉効果を誘発するのに使用するための、少なくとも前記３つのインフルエンザ株のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を含むインフルエンザワクチンであって、前記ワクチンが、ビロソームインフルエンザワクチンであり、前記ワクチンが、アジュバントを含まず、１年以内に、少なくとも３回、筋肉内に、対象に対して投与される、インフルエンザワクチン。

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