ES2341257T3 - Polipeptidos secretados y transmembrana y acidos nucleicos que los codifican. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para detectar la presencia de un tumor en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la comparación del nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido PRO1865 en (a) una muestra de análisis de células de tejido de esófago o piel obtenidas de dicho mamífero y (b) en una muestra de control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo de células, en el que un nivel superior o inferior de la expresión de dicho gen que codifica un polipéptido PRO1865 en dicha muestra de análisis de tejido de esófago o piel en comparación con la muestra de control es indicativo de la presencia de tumor de esófago o melanoma, respectivamente, en dicho mamífero, en el que el polipéptido PRO1865 es un polipéptido que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 132; (b) la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante de longitud completa del ADN depositado bajo el número de acceso ATCC 203543; (c) la secuencia de aminoácidos del polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132, que carece de su péptido señal asociado; (d) la secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132, con su péptido señal asociado; o (e) la secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132, que carece de su péptido señal, y en el que una expresión superior es indicativa de la presencia de un tumor de esófago o melanoma.
Description
Polipéptidos secretados y transmembrana y ácidos
nucleicos que los codifican.
La presente invención se refiere en general a la
identificación y aislamiento de ADN nuevo y a la producción
recombinante de polipéptidos nuevos.
Las proteínas extracelulares tienen funciones
importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y
mantenimiento de organismos multicelulares. El destino de muchas
células individuales, por ejemplo, proliferación, migración,
diferenciación, o interacción con otras células, está gobernado
habitualmente por la información recibida de otras células y/o el
medio inmediato. Esta información es transmitida frecuentemente por
polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos,
factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de
diferenciación, neuropéptidos, y hormonas) que, a su vez, es
recibida e interpretada por diversos receptores de células o
proteínas unidas a membrana. Estos polipéptidos secretados o
moléculas de señalización pasan normalmente a través del mecanismo
secretor de las células para alcanzar su sitio de acción en el medio
extracelular.
Las proteínas secretadas tienen varias
aplicaciones industriales, incluyendo productos farmacéuticos, de
diagnóstico, biosensores y biorreactores. La mayoría de los fármacos
de proteínas disponibles actualmente, tales como agentes
trombolíticos, interferones, interleuquinas, eritropoyetinas,
factores estimulantes de colonias, y varias otras citoquinas, son
proteínas secretoras. Sus receptores, que son proteínas de membrana,
también tienen potencial como agentes terapéuticos o de
diagnóstico. Se están realizando esfuerzos tanto a nivel de
industria como académica para identificar nuevas proteínas
secretadas nativas. Muchos esfuerzos se centran en el cribado de
bibliotecas de ADN recombinante de mamífero para identificar las
secuencias codificantes de proteínas secretadas nuevas. En la
literatura se describen ejemplos de procedimientos de cribado y
técnicas [véase, por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 93: 7108-7113 (1996); Patente de Estados
Unidos No. 5.536.637)]
Las proteínas unidas a membrana y receptores
pueden tener funciones importantes en, entre otras cosas, la
formación, diferenciación y mantenimiento de organismos
multicelulares. El destino de muchas células individuales, por
ejemplo, proliferación, migración, diferenciación, o interacción con
otras células, está gobernado habitualmente por la información
recibida de otras células y/o el medio inmediato. Esta información
es transmitida frecuentemente mediante polipéptidos secretados (por
ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores
citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos, y hormonas)
que, a su vez, es recibida e interpretada por diversos receptores
de células o proteínas unidas a membrana. Entre dichas proteínas
unidas a membrana y receptores de células se incluyen, pero no se
limitan a, receptores de citoquina, quinasas receptoras, fosfatasas
receptoras, receptores implicados en las interacciones
célula-célula, y moléculas de adhesina celular, como
selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales
que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está
regulada en parte por la fosforilación de varias proteínas
celulares. Las proteínas tirosina quinasas, enzimas que catalizan
ese proceso, también pueden actuar como receptores de los factores
de crecimiento. Entre los ejemplos se incluyen el receptor del
factor de crecimiento de fibroblastos y el receptor del factor de
crecimiento nervioso.
Las proteínas unidas a membrana y las moléculas
receptoras tienen varias aplicaciones industriales, incluyendo como
agentes farmacéuticos y de diagnóstico. Las inmunoadhesinas
receptoras, por ejemplo, se pueden utilizar como agentes
terapéuticos para bloquear las interacciones
receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana
también se pueden utilizar para cribar el péptido potencial o
pequeñas moléculas inhibidoras de la interacción receptor/ligando
pertinente.
Se están realizando esfuerzos tanto a nivel de
industria como académica para identificar nuevas proteínas unidas a
membrana o receptores nativos. Muchos esfuerzos se centran en el
cribado de bibliotecas de ADN recombinante de mamífero para
identificar las secuencias codificantes de nuevas proteínas unidas a
membrana o receptores.
La presente invención se refiere a
procedimientos de utilización de los polipéptidos PRO tal como se
describe en la presente invención para un conjunto de usos
diagnósticos en base a los datos de ensayos biológicos funcionales
presentados en los ejemplos siguientes, tal como se define en las
reivindicaciones.
En una realización, la presente invención
utiliza una molécula de ácido nucleico asilada que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO.
En un aspecto, la molécula de ácido nucleico
aislado comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo
menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
83% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 84% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
88% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 89% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 91% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
93% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 94% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
98% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, y
alternativamente por lo menos aproximadamente un 99% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos con (a) una molécula de ADN que
codifica un polipéptido PRO que tiene una secuencia de aminoácidos
de longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de
aminoácidos que carece del péptido señal tal como se describe aquí,
un dominio extracelular de una proteína transmembrana, con o sin el
péptido señal, tal como se describe aquí o cualquier otro fragmento
específicamente definido de la secuencia de aminoácidos de longitud
completa tal como se describe aquí, o (b) el complemento de la
molécula de ADN de (a).
En otros aspecto, la molécula de ácido nucleico
comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos
aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
83% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 84% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
88% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 89% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 91% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
93% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 94% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
98% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, y
alternativamente por lo menos aproximadamente un 99% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos con (a) una molécula de ADN que
comprende la secuencia codificante de un ADNc de polipéptido PRO de
longitud completa tal como se describe aquí, la secuencia
codificante de un polipéptido PRO que carece del péptido señal tal
como se describe aquí, la secuencia codificante de un dominio
extracelular de un polipéptido PRO transmembrana, con o sin el
péptido señal, tal como se describe aquí o la secuencia codificante
de cualquier otro fragmento específicamente definido de la secuencia
de aminoácidos de longitud completa tal como se describe aquí, o
(b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
En un aspecto adicional, la presente invención
utiliza una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una
secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente un
80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 81% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 83% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
85% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 88% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
90% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 91% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 93% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
95% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 98% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, y alternativamente
por lo menos aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos con (a) una molécula de ADN que codifica el mismo
polipéptido maduro codificado por cualquier ADNc de proteína humana
depositado con la ATCC tal como se describe aquí, o (b) el
complemento de la molécula de ADN de (a).
Otro aspecto de la presente invención utiliza
una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO al que se ha
eliminado el dominio transmembrana o bien, se ha inactivado el
dominio transmembrana, o es complementaria a dicha secuencia de
nucleótidos codificante, en la que el dominio o dominios
transmembrana de dicho polipéptido se describen aquí. Por lo tanto,
se contemplan los dominios extracelulares solubles de los
polipéptidos PRO descritos aquí.
Otra realización se refiere a fragmentos de una
secuencia codificante de polipéptido PRO, o el complemento de la
misma, que puede se útil por ejemplo, como sondas de hibridación,
para codificar fragmentos de un polipéptido PRO que puede codificar
opcionalmente un polipéptido que comprende un sitio de unión para un
anticuerpo anti-PRO o como sondas de
oligonucleótidos antisentido. Dichos fragmentos de ácido nucleico
son normalmente de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos de
longitud, alternativamente de por lo menos aproximadamente 30
nucleótidos de longitud, alternativamente de por lo menos
aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, alternativamente de por
lo menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud,
alternativamente de por lo menos aproximadamente 60 nucleótidos de
longitud, alternativamente de por lo menos aproximadamente 70
nucleótidos de longitud, alternativamente de por lo menos
aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, alternativamente de por
lo menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud,
alternativamente de por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos de
longitud, alternativamente de por lo menos aproximadamente 110
nucleótidos de longitud, alternativamente de por lo menos
aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, alternativamente de por
lo menos aproximadamente 130 nucleótidos de longitud,
alternativamente de por lo menos aproximadamente 140 nucleótidos de
longitud, alternativamente de por lo menos aproximadamente 150
nucleótidos de longitud, alternativamente de por lo menos
aproximadamente 160 nucleótidos de longitud, alternativamente de
por lo menos aproximadamente 170 nucleótidos de longitud,
alternativamente de por lo menos aproximadamente 180 nucleótidos de
longitud, alternativamente de por lo menos aproximadamente 190
nucleótidos de longitud, alternativamente de por lo menos
aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, alternativamente de
por lo menos aproximadamente 250 nucleótidos de longitud,
alternativamente de por lo menos aproximadamente 300 nucleótidos de
longitud, alternativamente de por lo menos aproximadamente 350
nucleótidos de longitud, alternativamente de por lo menos
aproximadamente 400 nucleótidos de longitud, alternativamente de
por lo menos unos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud,
alternativamente de por lo menos unos aproximadamente 500
nucleótidos de longitud, alternativamente de por lo menos unos
aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, alternativamente de
por lo menos aproximadamente 700 nucleótidos de longitud,
alternativamente de por lo menos aproximadamente 800 nucleótidos de
longitud, alternativamente de por lo menos unos aproximadamente 900
nucleótidos de longitud, alternativamente de por lo menos
aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, donde en este
contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de
la secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia más o menos
el 10% de la longitud de referencia. Cabe indicar que los
fragmentos nuevos de una secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido PRO pueden determinarse de forma rutinaria mediante el
alineamiento de la secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido PRO con otras secuencias de nucleótidos conocidas
mediante la utilización de cualquiera de los programas de
alineamiento de secuencia conocidos y la determinación de qué
fragmento o fragmentos de secuencia de nucleótidos codificante del
polipéptido PRO son nuevos. Todas dichas secuencias de nucleótidos
que codifican el polipéptido PRO se contemplan en la presente
invención. También se contemplan los fragmentos del polipéptido PRO
codificados por estos fragmentos de moléculas de nucleótidos,
preferiblemente aquellos fragmentos de polipéptido PRO que
comprenden un sitio de unión para un anticuerpo
anti-PRO.
En otra realización, la presente invención
utiliza un polipéptido PRO aislado codificado por cualquiera de las
secuencias de ácido nucleico aisladas identificadas anteriormente
aquí.
En un determinado aspecto, la invención se
refiere a un polipéptido PRO aislado, que comprende una secuencia
de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad en la
secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 82% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 84% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 88% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 92% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 94% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 98% de identidad
en la secuencia de aminoácidos y alternativamente por lo menos
aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos
con un polipéptido PRO que tiene una secuencia de aminoácidos de
longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de
aminoácidos que carece del péptido señal tal como se describe aquí,
un dominio extracelular de una proteína transmembrana, con o sin el
péptido señal, tal como se describe aquí o cualquier otro fragmento
específicamente definido de la secuencia de aminoácidos de longitud
completa tal como se describe aquí.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere aun polipéptido PRO aislado que comprende una secuencia
de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad en la
secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 82% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 84% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 88% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 92% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 94% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 98% de identidad
en la secuencia de aminoácidos y alternativamente por lo menos
aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos
con una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los
ADNc de proteína humana codificados con la ATCC tal como se describe
aquí.
En un aspecto específico, la presente invención
utiliza un polipéptido PRO aislado sin la secuencia señal
N-terminal y/o la metionina de iniciación y está
codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica dicha
secuencia de aminoácidos tal como se ha descrito anteriormente en la
presente invención. Los procesos para la producción del mismo
también se describen en la presente invención, donde estos procesos
comprenden el cultivo de una célula huésped que comprende un vector
el cual comprende la molécula de ácido nucleico codificante
adecuada en condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido
PRO y la recuperación del polipéptido PRO del cultivo celular.
Otro aspecto de la presente invención utiliza un
polipéptido PRO aislado al que se ha eliminado el dominio
transmembrana o bien, se ha inactivado el dominio transmembrana. Los
procesos para la producción del mismo también se describen en la
presente invención, donde estos procesos comprenden el cultivo de
una célula huésped que comprende un vector el cual comprende la
molécula de ácido nucleico codificante adecuada en condiciones
apropiadas para la expresión del polipéptido PRO y la recuperación
del polipéptido PRO del cultivo celular.
También se describen aquí agonistas y
antagonistas de un polipéptido PRO nativo tal como se define aquí.
El agonista o antagonista puede ser un anticuerpo
anti-PRO o una molécula pequeña.
También se describe un procedimiento de
identificación de agonistas o antagonistas a un polipéptido PRO que
comprende poner en contacto el polipéptido PRO con una molécula
candidata y monitorizar una actividad biológica mediada por dicho
polipéptido PRO. Preferiblemente, el polipéptido PRO es un
polipéptido PRO nativo.
También se describe una composición de materia
que comprende un polipéptido PRO o un agonista o antagonista de un
polipéptido PRO tal como se describe aquí, o un anticuerpo
anti-PRO, en combinación con un portador.
Opcionalmente, el portador es un portador farmacéuticamente
aceptable.
También se describe el uso de un polipéptido
PRO, o un agonista o antagonista del mismo tal como se ha descrito
anteriormente en la presente invención, o un anticuerpo
anti-PRO, para la preparación de un medicamento
útil en el tratamiento de una afección que es sensible al
polipéptido PRO, un agonista o antagonista del mismo o un
anticuerpo anti-PRO.
Se describen vectores que comprenden ADN que
codifica cualquiera de los polipéptidos aquí descritos. También se
describen células huésped que comprenden cualquiera de dichos
vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células
CHO, células de E. coli o levaduras. Se describe además un
proceso para la producción de cualquiera de los polipéptidos aquí
descritos y comprende el cultivo de células huésped en condiciones
adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y la
recuperación del polipéptido deseado del cultivo celular.
También se describe aquí moléculas quiméricas
que comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos en la
presente invención fusionados a un polipéptido o secuencia de
aminoácidos heterólogos. Los ejemplos de dichas moléculas
quiméricas comprenden cualquiera de los polipéptidos aquí descritos
fusionados con una secuencia de un epítopo etiqueta o una región Fc
de una inmunoglobulina.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un anticuerpo que se une, preferiblemente específicamente,
a cualquiera de los polipéptidos descritos anterior o
posteriormente. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal, un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo o
un anticuerpo de cadena única.
También se describen sondas de oligonucleótidos
útiles para el aislamiento de secuencias de nucleótidos genómicas y
de ADNc o como sondas antisentido, donde estas sondas pueden derivar
de cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas anterior o
posteriormente.
La figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos
(SEC Id No. 131) de un ADNc de PRO1865 de secuencia nativa, donde
la SEC ID No. 131 es un clon designado aquí como
"DNA81757-2512".
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
(Sec Id No. 132) derivada de la secuencia codificante de Sec Id No.
131 mostrada en la figura 131.
\vskip1.000000\baselineskip
Los términos "polipéptido PRO" y
"PRO", tal como se utilizan aquí, y cuando van seguidos
inmediatamente por una denominación numérica, se refieren a
diversos polipéptidos, donde la denominación completa (es decir,
PRO/número) hace referencia a secuencias polipeptídicas específicas
tal como se describen aquí. Los términos "polipéptido
PRO/número" y "PRO/número" donde el término "número"
que se proporciona como una denominación numérica real tal como se
utiliza aquí, abarca los polipéptidos de secuencia nativa y las
variantes polipeptídicas (que se describen en detalle en la
presente invención). Los polipéptidos PRO descritos aquí pueden
aislarse de diversas fuentes, tales como tipos de tejidos humanos o
de otras fuentes, o pueden prepararse mediante procedimientos
recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido PRO" se
refiere a cada polipéptido PRO/número individual descrito aquí.
Todas las menciones en esta memoria que se refieren al
"polipéptido PRO" se refieren a cada uno de los polipéptidos
individualmente o en conjunto. Por ejemplo, las descripciones de la
preparación, purificación, derivación, formación de anticuerpos
para o contra, la administración, composiciones que contienen, el
tratamiento de la enfermedad con, etc,. se refieren a cada
polipéptido de la presente invención individualmente. El término
"polipéptido PRO" también incluye variantes de los polipéptidos
PRO/número aquí descritos.
Un "polipéptido PRO de secuencia nativa"
comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos
que el correspondiente polipéptido PRO derivado de la naturaleza.
Dichos polipéptidos PRO de secuencia nativa pueden aislarse de la
naturaleza o pueden producirse mediante medios recombinantes o
sintéticos. El término "polipéptido PRO de secuencia nativa"
abarca específicamente las formas truncadas o secretadas naturales
del polipéptido PRO específico (por ejemplo, una secuencia del
dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo,
formas cortadas y empalmadas ("spliced") alternativamente) y
variantes alélicas naturales del polipéptido. En varias
realizaciones de la invención, los polipéptidos PRO de secuencia
nativa descritos aquí son polipéptidos de secuencia nativa maduros
o de longitud completa que comprenden las secuencias de aminoácidos
de longitud completa que se muestran en las figuras acompañantes.
Los codones de inicio y parada se muestran en negrita y subrayados
en las figuras. Sin embargo, mientras que el polipéptido PRO
descrito en las figuras acompañantes se inicia con los residuos de
metionina denominados aquí como aminoácido en la posición 1 en las
figuras, es concebible y posible que otros residuos de metionina
localizados cadena arriba o cadena abajo de la posición 1 de
aminoácidos en las figuras puedan utilizarse como el residuo de
aminoácido de partida de los polipéptidos PRO.
El "dominio extracelular" o "ECD" del
polipéptido PRO se refiere a una forma del polipéptido PRO que está
libre esencialmente de los dominios transmembrana y citoplasmático.
Generalmente, un ECD del polipéptido PRO tendrá menos del 1% de
dichos dominios transmembrana y/o citoplasmático y preferiblemente,
tendrá menos del 0,5% de dichos dominios. Se entenderá que
cualquier dominio transmembrana identificado para los polipéptidos
PRO de la presente invención se identifican siguiendo los criterios
utilizados habitualmente en la técnica para la identificación de
ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio
transmembrana pueden variar, pero más probablemente, en no más de
aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio tal
como inicialmente se identificó aquí. Opcionalmente, por tanto, un
dominio extracelular de un polipéptido PRO puede contener desde
aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cualquier extremo de los
límites del dominio transmembrana/dominio extracelular tal como se
identifica en los Ejemplos o la memoria y dichos polipéptidos, con
o sin el péptido señal asociado, y el ácido nucleico que los
codifica, están contemplados por la presente invención.
La localización aproximada de los "péptidos
señal" de diversos polipéptidos PRO descritos aquí se muestran
en la presente memoria y/o las figuras acompañantes. Se ha de
remarcar, sin embargo, que el límite C-terminal de
un péptido señal puede variar, pero muy probablemente en no más de
aproximadamente 5 aminoácidos en cualquiera de los extremos del
límite C-terminal del péptido señal tal como se
identificó inicialmente aquí, donde el límite
C-terminal del péptido señal puede identificarse
según el criterio utilizado de forma rutinaria en la técnica para
identificar el tipo de elemento de secuencia de aminoácidos (por
ejemplo, Nielsen y et al., Prot Eng, 10:1-6
(1997) y von Heinje y et al., Nucl Acids Res,
14:4683-4690 (1986)). Además, también se ha
reconocido, que, en algunos casos, la división de una secuencia
señal de un polipéptido secretado no es totalmente uniforme, dando
como resultado más de una especie secretada. Estos polipéptidos
maduros, cuando su péptido señal se corta en no más de
aproximadamente 5 aminoácidos por cualquier extremo del límite
C-terminal del péptido señal identificado aquí, y
los polinucleótidos que los codifican, están contemplados por la
presente invención.
"Variante de polipéptido PRO" significa un
polipéptido PRO activo tal como se define anterior o posteriormente
que tiene por lo menos aproximadamente el 80% de identidad en la
secuencia con una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa
de longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de
polipéptido PRO que carece del péptido señal tal como se describe
aquí, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el
péptido señal, tal como se describe aquí, o cualquier otro fragmento
de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal como
se describe aquí. Dichas variantes de polipéptido PRO incluyen, por
ejemplo, los polipéptidos PRO en donde uno o más residuos de
aminoácido se añaden, o eliminan, en el extremo N- o
C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de
longitud completa. Generalmente, una variante de polipéptido PRO
tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la
secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 82% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 84% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 88% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 92% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 94% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 98% de identidad
en la secuencia de aminoácidos y alternativamente por lo menos
aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos
con una secuencia de un polipéptido PRO de secuencia nativa de
longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de
polipéptido PRO que carece del péptido señal tal como se describe
aquí, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el
péptido señal, tal como se describe aquí o cualquier otro fragmento
definido específicamente de una secuencia de polipéptido PRO de
longitud completa tal como se describe aquí. Generalmente, los
polipéptidos variantes de PRO tienen una longitud de por lo menos
aproximadamente 10 aminoácidos, alternativamente de por lo menos
aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, alternativamente de por
lo menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud,
alternativamente de por lo menos aproximadamente 40 aminoácidos de
longitud, alternativamente de por lo menos aproximadamente 50
aminoácidos de longitud, alternativamente de por lo menos
aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, alternativamente de por
lo menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud,
alternativamente de por lo menos aproximadamente 80 aminoácidos de
longitud, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90
aminoácidos de longitud, alternativamente de por lo menos
aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, alternativamente de por
lo menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud,
alternativamente de por lo menos aproximadamente 200 aminoácidos de
longitud, alternativamente de por lo menos aproximadamente 300
aminoácidos de longitud, o más.
El "porcentaje (%) de identidad en la
secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del
polipéptido PRO identificadas en la presente invención se define
como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia
candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la
secuencia del polipéptido PRO, después de la alineación de las
secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para
conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin
considerar ninguna sustitución conservativa como parte de identidad
de la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el
porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos se puede
conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por
ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente,
tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, o Megalign
(DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros
apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo
necesario para conseguir el máximo de alineamiento sobre la longitud
completa de las secuencias que se comparan. Para los objetivos de
la presente invención, sin embargo, los valores en % de la identidad
en la secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa
informático de comparación de secuencias ALIGN-2,
en el que el código fuente completo para el programa
ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El
programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2 era propiedad de Genentech, Inc. y el código
fuente mostrado en la Tabla 1 se ha presentado con la documentación
del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C. 20559,
donde está registrado bajo el U.S. Copyright Registration No.
TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible
públicamente mediante Genentech Inc., South San Francisco,
California o se puede compilar a partir del código fuente
proporcionado en la Tabla 1 siguiente. El programa
ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en
un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos
los parámetros de comparación de las secuencias son fijados en el
programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las que se utiliza
ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de
aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de
una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una
secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A
que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos
determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la
fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el
programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en
dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total
de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la
longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud
de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia
de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad en la
secuencia de aminoácidos de B a A. Como ejemplos de los cálculos
del % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos utilizando
este procedimiento, las Tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el %
de identidad en la secuencia de aminoácidos designada "Proteína de
comparación" con la secuencia de aminoácidos denominada
"PRO", donde "PRO" representa la secuencia de aminoácidos
de un polipéptido PRO hipotético de interés, "Proteína de
comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido contra el que se compara el polipéptido "PRO" de
interés, y "X", "Y" y "Z" representan cada uno
diferentes residuos de aminoácidos
hipotéticos.
A menos que se afirme específicamente lo
contrario, todos los valores en % de identidad en la secuencia de
aminoácidos utilizados en la presente invención se obtienen tal y
como se describe en el párrafo inmediatamente anterior utilizando
el programa informático ALIGN-2. Sin embargo, los
valores en % de identidad en la secuencia de aminoácidos también se
pueden determinar utilizando el programa de comparación de
secuencias WU-BLAST-2 (Altschul
et al., Methods in Enzymology, 266:460-480
(1996). La mayoría de los parámetros de búsqueda de
WU-BLAST-2 se fijan en los valores
por defecto. Los valores no fijados a valores por defecto, es decir,
los parámetros ajustables, se fijan según los siguientes valores:
espacio de solapamiento ("overlap span") = 1, fracción de
solapamiento ("overlap fraction") = 0,125, umbral de palabra
("word threshold") T = 11, y matriz de puntuación ("scoring
matrix") = BLOSUM 62. Cuando se utiliza
WU-BLAST-2, el valor en % de
identidad en la secuencia de aminoácidos se determina dividiendo
(a) el número de residuos de aminoácidos idénticos en el
emparejamiento entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido
PRO de interés que tiene una secuencia derivada del polipéptido PRO
nativo y la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es
decir, la secuencia contra la que se compara el polipéptido PRO de
interés que puede ser un polipéptido variante PRO) según se
determina por WU-BLAST-2 entre (b)
el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO de
interés. Por ejemplo, en la afirmación "un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos A que tiene por lo menos un
80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia
de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de
aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de
interés.
El porcentaje de identidad en la secuencia de
aminoácidos también se puede determinar utilizando el programa de
comparación de secuencias
NCI-BLAST-2 (Altschul et al.,
Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)). El
programa de comparación de secuencias NCI-BLAST2 se
puede descargar de http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
NCI-BLAST2 o en cualquier caso se puede obtener del
National Institute of Health, Bethesda, MD.
NCI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda,
donde todos estos parámetros de búsqueda se fijan a los valores por
defecto, incluyendo, por ejemplo, "unmask (desenmascarado) = yes
(sí)", "strand (hebra) = all (todas)", "expected
occurrences (sucesos esperados) = 10", "minimum low complexity
length (longitud mínima de complejidad baja) = 15/5",
"multi-pass e-value
(e-valor de multipaso) = 0,01", "constant for
multi-pass (constante de multi-paso)
= 25", "dropoff for final gapped alignment (disminución para
alineación con espacios final) = 25" y "scoring matrix (matriz
de puntuación) = BLOSUM 62".
En las situaciones en las que se utiliza
NCI-BLAST2 para comparaciones de secuencias de
aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de
una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una
secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A
que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos
determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la
fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el
programa de alineación de secuencias NCI-BLAST2 en
dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total
de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la
longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud
de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia
de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad en la
secuencia de aminoácidos de B a
A.
El "polinucleótido variante PRO" o
"secuencia de ácidos nucleicos variante de PRO" significa una
molécula de ácido nucleico que codifica una polipéptido PRO activo
tal y como se define a continuación y que tiene por lo menos
aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una
secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa y de longitud
completa tal y como se describe en la presente invención, una
secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa y de longitud
completa que carece del péptido señal tal y como se describe en la
presente invención, un dominio extracelular de un polipéptido PRO,
con o sin el péptido señal, tal y como se describe en la presente
invención, o cualquier otro fragmento de una secuencia de
polipéptido PRO de longitud completa tal y como se describe en la
presente invención. Habitualmente, un polinucleótido variante PRO
tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 82% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
84% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 87% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
89% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 92% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
94% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 97% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, y alternativamente por lo menos aproximadamente un
99% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de
polipéptido PRO de secuencia nativa y de longitud completa tal y
como se describe en la presente invención, una secuencia de
polipéptido PRO de secuencia nativa y longitud completa que carece
del péptido señal tal y como se describe en la presente invención,
un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido
señal, tal y como se describe en la presente invención, o cualquier
otro fragmento de una secuencia de polipéptido PRO de longitud
completa tal y como se describe en la presente invención. Las
variantes no comprenden la secuencia de nucleótidos nativa.
Normalmente, los polinucleótidos variantes PRO
tienen por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 60 nucleótidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 90
nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, alternativamente por
lo menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 180 nucleótidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 210
nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, alternativamente por
lo menos aproximadamente 270 nucleótidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 300 nucleótidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 450
nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo
menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más.
El "porcentaje (%) de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de
ácidos nucleicos que codifican el PRO identificadas en la presente
invención se define como el porcentaje de nucleótidos en una
secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido PRO de
interés, después de la alineación de las secuencias y la
introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo
porcentaje de identidad en la secuencia. La alineación con el
objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos se puede conseguir de varias maneras que están
dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático
disponible públicamente, tal como software BLAST,
BLAST-2, ALIGN, o Megalign (DNASTAR). Para los
objetivos de la presente invención, sin embargo, los valores en %
de la identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se obtienen tal
como se describe a continuación utilizando el programa informático
de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el
código fuente completo para el programa ALIGN-2 se
proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa informático de
comparación de secuencias ALIGN-2 era propiedad de
Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 siguiente
se ha presentado con la documentación del usuario en la U.S.
Copyright Office, Washington D.C. 20559, donde está registrado bajo
el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa
ALIGN-2 está disponible públicamente mediante
Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar
a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1. El programa
ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en
un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos
los parámetros de comparación de las secuencias son fijados en el
programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las que se utiliza
ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de ácidos
nucleicos, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de
una secuencia de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra
una secuencia de ácidos nucleicos determinada D (que se puede
escribir alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos
determinada C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de
ácidos nucleicos determinada D) se calcula tal y como se indica a
continuación:
100 veces la
fracción
W/Z
donde W es el número de nucleótidos
identificados como emparejamientos idénticos por el programa de
alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha
alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de
nucleótidos en D. Se comprenderá que cuando la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos de D a C. Como ejemplos de los
cálculos del % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
las Tablas 4 y 5 demuestran cómo calcular el % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos
denominada "ADN de comparación" con la secuencia de ácidos
nucleicos denominada "PRO-DNA", donde
"PRO-DNA" representa una secuencia de ácidos
nucleicos de interés que codifica un polipéptido PRO hipotético,
"ADN de comparación" representa la secuencia de nucleótidos de
una molécula de ácido nucleico contra la que se compara la molécula
de ácido nucleico "PRO-DNA" de interés, y
"N", "L" y "V" representan cada uno diferentes
nucleótidos
hipotéticos.
A menos que se afirme específicamente lo
contrario, todos los valores en % de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos utilizados en la presente invención se obtienen tal
y como se describe en el párrafo inmediatamente anterior utilizando
el programa informático ALIGN-2. Sin embargo, los
valores en % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos
también se pueden obtener tal y como se describe a continuación
utilizando el programa de comparación de secuencias
WU-BLAST-2 (Altschul et al.,
Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996). La
mayoría de los parámetros de búsqueda de
WU-BLAST-2 se fijan en los valores
por defecto. Los valores no fijados a valores por defecto, es
decir, los parámetros ajustables, se fijan según los siguientes
valores: espacio de solapamiento ("overlap span") = 1,
fracción de solapamiento ("overlap fraction") = 0,125, umbral
de palabra ("word threshold") T = 11, y matriz de puntuación
("scoring matrix") = BLOSUM 62. Cuando se utiliza
WU-BLAST-2, el valor en % de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se determina
dividiendo (a) el número de nucleótidos idénticos en el
emparejamiento entre la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula
de ácido nucleico de interés que codifica el polipéptido PRO de
interés que tiene una secuencia derivada del ácido nucleico que
codifica el polipéptido PRO de secuencia nativa y la molécula de
ácido nucleico de comparación de interés (es decir, la secuencia
contra la que se compara la molécula de ácido nucleico que codifica
el polipéptido PRO de interés que puede ser un polinucleótido
variante PRO) según se determina por
WU-BLAST-2 entre (b) el número
total de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que codifica
el polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la afirmación "una
molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de
ácidos nucleicos A que tiene por lo menos un 80% de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos nucleicos
de B", la secuencia de ácidos nucleicos A es la molécula de
ácidos nucleicos de comparación de interés y la secuencia de ácidos
nucleicos B es la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de
ácido nucleico de interés que codifica el polipéptido PRO.
El porcentaje de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos también se puede determinar utilizando el programa
de comparación de secuencias
NCI-BLAST-2 (Altschul et al.,
Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)). El
programa de comparación de secuencias NCI-BLAST2 se
puede descargar de http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
NCI-BLAST2 o en cualquier caso se puede obtener del
National Institute of Health, Bethesda, MD.
NCI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda,
donde todos estos parámetros de búsqueda se fijan a los valores por
defecto, incluyendo, por ejemplo, "unmask (desenmascarado) = yes
(sí)", "strand (hebra) = all (todas)", "expected
occurrences (sucesos esperados) = 10", "minimum low complexity
length (longitud mínima de complejidad baja) = 15/5",
"multi-pass e-value
(e-valor de multipaso) = 0,01", "constant for
multi-pass (constante de multi-paso)
= 25", "dropoff for final gapped alignment (disminución para
alineación con espacios final) = 25" y "scoring matrix (matriz
de puntuación) = BLOSUM 62".
En las situaciones en las que se utiliza
NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencias, el %
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia
de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra una secuencia de
ácidos nucleicos determinada D (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos determinada
C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos
determinada D) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la
fracción
W/Z
donde W es el número de nucleótidos
identificados como emparejamientos idénticos por el programa de
alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en dicha
alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de
nucleótidos en D. Se comprenderá que cuando la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos de D a
C.
En otras realizaciones, los polinucleótidos
variantes PRO son moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido PRO activo y que son capaces de hibridarse,
preferiblemente bajo condiciones de hibridación y lavado
astringentes, a secuencias de nucleótidos que codifican un
polipéptido PRO de longitud completa tal como se describe aquí. Los
polipéptidos variantes PRO pueden ser aquéllos codificados por un
polinucleótido variante PRO.
"Aislado", cuando se utiliza para describir
los diversos polipéptidos descritos en la presente invención,
significa polipéptidos que se han identificado y separado y/o
recuperado de un componente de su medio natural. Los componentes
contaminantes de su medio natural son materiales que habitualmente
interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos para el
polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos
proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, se
purificará el polipéptido (1) hasta un grado suficiente para
obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos
N-terminal o interna mediante la utilización de un
secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta una homogeneidad por
SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras
utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata.
El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ en el
interior de células recombinantes, ya que por lo menos un componente
del medio natural del polipéptido PRO no estará presente.
Normalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará
mediante por lo menos una etapa de purificación.
Un ácido nucleico "aislado" que codifica un
polipéptido PRO o un ácido nucleico "aislado" que codifica
otro polipéptido es una molécula de ácido nucleico que se identifica
y se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico
contaminante con la que está asociada normalmente en el medio
natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una
molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido está
en una forma o composición diferente de la que se encuentra en la
naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas
que codifican el polipéptido se diferencian de la molécula de ácido
nucleico específica que codifica el polipéptido tal y como existe
en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico
aislada que codifica un polipéptido incluye moléculas de ácido
nucleico que codifican el polipéptido contenidas en células que
normalmente expresan el polipéptido donde, por ejemplo, la molécula
de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de
la de las células naturales.
El término "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped
particular. Las secuencias de control que son adecuadas para
procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que
las células eucariotas utilizan promotores, señales de
poliadenilación y potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está situado en una relación funcional con
otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o secuencia líder secretora está unido operativamente
a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que
participa en la secreción del polipéptido; un promotor o
potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si
afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a
ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si
está situado para facilitar la traducción. Generalmente, "unido
operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen
están contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora,
contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no
tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante la unión
en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no
existen, se utilizan los adaptadores o enlazadores de
oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales anti-PRO individuales (incluyendo
agonista, antagonista, y anticuerpos neutralizantes), composiciones
de anticuerpos anti-PRO con especificidad
poliepitópica, anticuerpos anti-PRO de cadena única,
y fragmentos de anticuerpos anti-PRO (ver a
continuación). El término "anticuerpo monoclonal", tal y como
se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo
obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente
homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la
población son idénticos a excepción de posibles mutaciones
naturales que pueden estar presentes en pequeñas cantidades.
La "astringencia" de las reacciones de
hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual
en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de
la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la
concentración de sal. En general, sondas más largas requieren
temperaturas más elevadas para una hibridación más correcta,
mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La
hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN
desnaturalizado para rehibridarse cuando las cadenas complementarias
están presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión.
Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la
secuencia de hibridación, mayor es la temperatura relativa que se
puede utilizar. Como resultado, se deduce que temperaturas
relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción
más astringentes, mientras que temperaturas inferiores no tanto.
Para detalles adicionales y explicaciones de la astringencia de las
reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,
(1995).
"Condiciones astringentes" o "condiciones
de astringencia elevada", tal y como se definen en la presente
invención, se pueden identificar por aquéllas que: (1) utilizan una
fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por
ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil
sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación
un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo,
formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficol
al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM
a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o
(3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico
0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%,
5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50
\mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con
lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y
formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de astringencia
elevada que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente
astringentes" se pueden identificar tal y como se describen en
Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva
York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de
una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo,
temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que las
descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente
astringentes es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una
solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM,
citrato sódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución
de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón
fragmentado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido del lavado de los
filtros en 1 x SSC a aproximadamente 35-50ºC. El
experto en la materia sabrá como ajustar la temperatura, la fuerza
iónica, etc. necesarias para acomodar factores, tales como la
longitud de la sonda y similares.
El término "epítopo etiquetado", cuando se
utiliza en la presente invención, se refiere a un polipéptido
quimérico que comprende un polipéptido PRO fusionado a un
"polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene residuos
suficientes para proporcionar un epítopo contra el que se puede
fabricar un anticuerpo, aunque es suficientemente corto, de manera
que no interfiere en la actividad del polipéptido al que se fusiona.
El polipéptido etiqueta es también preferiblemente bastante único,
de manera que el anticuerpo no reacciona sustancialmente de forma
cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados
tienen generalmente por lo menos seis residuos de aminoácidos y
habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos
(preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de
aminoácidos).
Tal y como se utiliza en la presente invención,
el término "inmunoadhesina" designa moléculas de tipo
anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína
heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de
dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las
inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de
aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente
del reconocimiento y sitio de unión a antígeno de un anticuerpo (es
decir, es "heterólogo"), y una secuencia de dominio constante
de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de
inmunoadhesina habitualmente es una secuencia de aminoácidos
contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor
o un ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina
en la inmunoadhesina se puede obtener a partir de cualquier
inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1,
IgG-2, IgG-3 o
IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e
IgA-2), IgE, IgD o IgM.
"Activo" o "actividad" para los
objetivos de la presente invención se refiere a una forma o formas
de un polipéptido PRO que retiene una actividad/propiedad biológica
y/o inmunológica de un polipéptido PRO nativo o natural, donde la
actividad "biológica" se refiere a una función (inhibidora o
estimuladora) provocada por un polipéptido PRO nativo o natural que
es diferente de la capacidad de inducir la producción de un
anticuerpo contra un epítopo antigénico que se encuentra en un
polipéptido PRO nativo o natural y una actividad "inmunológica"
se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo
contra un epítopo antigénico que se encuentra en un polipéptido PRO
nativo o
natural.
natural.
El término "antagonista" se utiliza en el
sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea,
inhibe o neutraliza parcial o completamente una actividad biológica
de un polipéptido PRO nativo descrito aquí. DE manera similar, el
término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e
incluye cualquier molécula que mimetiza una actividad biológica de
un polipéptido PRO nativo descrito aquí. Moléculas agonistas o
antagonistas adecuadas incluyen específicamente los anticuerpos o
los fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de secuencias
de aminoácidos de polipéptidos PRO nativos, péptidos,
oligonucleótidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, etc.,
como antagonistas o antagonistas. Los procedimientos para
identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido PRO pueden
comprender poner en contacto un polipéptido PRO con una molécula
agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una
o más actividades biológicas asociadas normalmente con el
polipéptido PRO.
"Tratamiento" se refiere tanto a
tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas, en
el que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la condición
o trastorno patológico objetivo. Entre aquéllos que necesitan el
tratamiento se incluyen aquéllos que ya padecen el trastorno, así
como aquéllos que son propensos a padecer el trastorno o aquéllos a
los que se debe prevenir el trastorno.
La administración "crónica" se refiere a la
administración del agente o agentes en un modo continuo en
oposición a un modo agudo, para mantener el efecto (actividad)
terapéutico inicial durante un periodo largo de tiempo. La
administración "intermitente" es el tratamiento que no se
realiza de forma consecutiva sin interrupción, sino que es bastante
cíclico en su naturaleza.
"Mamífero" para los objetivos del
tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero,
incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de
zoológico, de deporte o de compañía, tales como perros, gatos,
ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc.
Preferiblemente, el mamífero es humano.
La administración "combinada con" uno o más
agentes terapéuticos adicionales incluye la administración
simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
Los "portadores", tal y como se utiliza en
la presente invención, incluyen portadores, excipientes o
estabilizantes farmacéuticamente aceptables que son no tóxicos para
la célula o el mamífero expuestos a los mismos en las dosis y
concentraciones utilizadas. Frecuentemente el portador
fisiológicamente aceptable es una solución acuosa tamponada en el
pH. Entre los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables se
incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos
orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos
de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos);
proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como
manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como
sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM},
polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden
una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de
unión el antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos
de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2}
y los fragmentos Fv; los diabodies; los anticuerpos lineales (Zapata
et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062
[1995]); moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos
multiespecíficos formados a partir fragmentos de
anti-
cuerpos.
cuerpos.
La digestión con papaína de los anticuerpos
produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados
fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de unión a antígeno
único, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su
capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina
produce un fragmento (Fab')_{2} que tiene dos sitios de
combinación a antígeno y es capaz de unirse de forma cruzada con el
antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo
que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno
completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable
de cadena pesada y de cadena ligera en estrecha asociación no
covalente. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada
dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a
antígeno en la superficie del dímero
V_{H}-V_{L}. Colectivamente, las seis CDRs
confieren al anticuerpo especificidad de unión a antígeno. Sin
embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que
comprende sólo tres CDRs específicas para el antígeno) tiene la
capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una
afinidad menor que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos
Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi
terminal del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más
cisteínas de la región bisagra del anticuerpo.
Fab'-SH es la denominación aquí para Fab' en la que
el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes
contienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo
F(ab')_{2} se produjeron originalmente como parejas de
fragmentos Fab' con una bisagra de cisteínas entre ambos. También
son conocidas otras uniones químicas de fragmentos de
anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden
asignarse a uno de los dos tipos claramente distintos, denominados
kappa (\kappa) y lambda (\lambda), según las secuencias de
aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácido del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se
pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales
de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de éstas de
pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena
única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L}
del anticuerpo, en los que estos dominios se presentan en una única
cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende
además un polipéptido enlazador entre los dominios V_{H} y V_{L}
que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a
antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y
Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas
269-315 (1994).
El término "diabodies" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a
antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena
pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(V_{L}) en la misma cadena de polipéptido (V_{H} - V_{L}).
Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el
emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los
dominios son forzados a emparejarse con los dominios
complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión a
antígeno. Los diabodies se describen más detalladamente en, por
ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448
(1993).
Un anticuerpo "aislado" es el que se ha
identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de
su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural
son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico y
terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y
otros solutos proteináceos y no proteináceos. En realizaciones
preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95% en
peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry, y más
preferiblemente más de un 99% en peso, (2) hasta un grado
suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de
aminoácidos N-terminal o interna mediante la
utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la
homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones
reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o,
preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye
el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya
que por lo menos un componente del medio natural del anticuerpo no
estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se
preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
Una anticuerpo "que se une específicamente"
o "es específico para" un polipéptido particular o un epítopo
en un polipéptido particular es aquel que se une a ese polipéptido
particular o epítopo en un polipéptido particular sin unirse
sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epítopo de
polipéptido.
La palabra "marcador" cuando se utiliza en
la presente invención se refiere a un compuesto o composición
detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo
para generar un anticuerpo "marcado". El "marcador" puede
ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o
marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático,
puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición
sustrato que es detectable.
Por "fase sólida" se entiende una matriz no
acuosa a la que se puede adherir el anticuerpo de la presente
invención. Entre los ejemplos de fases sólidas que se engloban en la
presente invención se incluyen las formadas parcial o totalmente de
vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por
ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinilalcohol
y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la
fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en
otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de
cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase
sólida discontinua de partículas discretas, tales como las
descritas en la Patente de Estados Unidos No. 4.275.149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña
compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos
que es útil para la liberación de un fármaco (tal como un
polipéptido PRO o un anticuerpo para el mismo) a un mamífero. Los
componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formación
de bicapa, similar a la disposición de las membranas
biológicas.
Una "molécula pequeña" se define en la
presente invención que tiene un peso molecular por debajo de
aproximadamente 500 Daltons.
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La presente invención proporciona secuencias de
nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican
polipéptidos a las que se hace referencia en la presente invención
como polipéptidos PRO. En particular, se han identificado y aislado
los ADNc que codifican varios polipéptidos PRO, tal y como se
describe con mayor detalle en los posteriores ejemplos. Cabe
indicar que las proteínas fabricadas en ciclos de expresión
diferentes pueden ser números PRO diferentes determinados, pero el
número UNQ es único para cualquier ADN determinado y la proteína
codificada, y no cambiará. Sin embargo, por simplicidad, en el
presente documento la proteína codificada por las moléculas de
ácido nucleico nativas de longitud completa descritas en la presente
invención, así como todos los homólogos nativos adicionales y
variantes incluidas en la definición anterior de PRO, se referirán
como "PRO/número", independientemente de su origen o modo de
preparación.
Tal y como se describe en los Ejemplos
posteriores, se han depositado varias clases de clones de ADNc con
el ATCC. Las secuencias de nucleótidos reales de dichos clones se
pueden determinar fácilmente por un experto en la materia mediante
la secuenciación del clon depositado utilizando procedimientos
rutinarios en la técnica. La secuencia de aminoácidos prevista se
puede determinar a partir de la secuencia de nucleótidos utilizando
la técnica habitual. Para los polipéptidos PRO y los ácidos
nucleicos codificantes descritos en la presente, los solicitantes
han identificado lo que se cree que es el mejor marco de lectura
identificable con la información de la secuencia disponible en el
momento.
Además de los polipéptidos PRO de secuencia
nativa y de longitud completa descritos en la presente invención,
se contempla que se pueden preparar variantes de polipéptido PRO.
Las variantes de polipéptido PRO se pueden preparar introduciendo
cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de PRO, y/o mediante la
síntesis del polipéptido PRO deseado. Los expertos en la materia
entenderán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los
procesos post-traduccionales del polipéptido PRO,
tales como el cambio del número o la posición de los sitios de
glicosilación o la alteración de las características de anclamiento
a la membrana.
Las variaciones en el polipéptido PRO de
secuencia nativa y de longitud completa o en varios dominios del
polipéptido PRO descritos en la presente invención, se pueden
realizar, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y
directrices para mutaciones conservativas y no conservativas
establecidas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No.
5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, una
eliminación o una inserción de uno o más codones que codifican el
polipéptido PRO que dan lugar a un cambio en la secuencia de
aminoácidos del polipéptido PRO en comparación con el polipéptido
PRO de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por
sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro
aminoácido en uno o más de los dominios del polipéptido PRO. Al
determinar qué residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o
eliminar sin afectar de forma adversa la actividad deseada, se
puede encontrar una guía mediante la comparación de la secuencia
del polipéptido PRO con la de las moléculas de proteínas conocidas
homólogas y minimizando el número de cambios en la secuencia de
aminoácidos realizadas en regiones con elevada homología. Las
sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de la
sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene una
estructura y/o propiedades químicas similares, tales como la
sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones
conservativas de aminoácidos. Las inserciones o eliminaciones pueden
estar opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5
aminoácidos. La variación permitida se puede determinar realizando
de forma sistemática inserciones, eliminaciones o sustituciones de
aminoácidos en la secuencia y probando en las variantes resultantes
la actividad mostrada por la secuencia nativa de longitud completa
o
madura.
madura.
En la presente invención se proporcionan
fragmentos de polipéptido PRO. Dichos fragmentos se pueden truncar
en el extremo N-terminal o
C-terminal, o pueden carecer de residuos internos,
por ejemplo, cuando se comparan con una proteína nativa de longitud
completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que
no son esenciales para una actividad biológica deseada del
polipéptido PRO.
Los fragmentos del polipéptido PRO se pueden
preparar mediante cualquiera de un conjunto de técnicas
convencionales. Los fragmentos de péptidos deseados se pueden
sintetizar químicamente. Un enfoque alternativo implica la
generación de fragmentos de polipéptido PRO mediante digestión
enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima
conocida para dividir proteínas en los sitios definidos por residuos
de aminoácidos concretos o mediante la digestión del ADN con
enzimas de restricción adecuadas y el aislamiento del fragmento
deseado. Otra técnica adecuada implica el aislamiento y la
amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento de
polipéptido deseado mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del
fragmento de ADN se utilizan en los cebadores de los extremos 5' y
3' en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos de polipéptido PRO
comparten por lo menos una actividad biológica y/o inmunológica con
el polipéptido PRO nativo descrito aquí.
En realizaciones particulares, las sustituciones
conservativas de interés se muestran en la Tabla 6 bajo el
encabezamiento de sustituciones preferidas. Si dichas sustituciones
dan lugar a un cambio en la actividad biológica, entonces se
introducen más cambios sustanciales, denominados sustituciones de
ejemplo en la Tabla 6, o tal y como se describen posteriormente en
referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los
productos.
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Las modificaciones sustanciales en la identidad
funcional o inmunológica del polipéptido se llevan a cabo mediante
la selección de las sustituciones que difieren significativamente en
su efecto de mantener (a) la estructura del esqueleto del
polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como
conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de
la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena
lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos en base a las
propiedades comunes de la cadena lateral:
- (1)
- hidrofóbica: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
- (2)
- hidrofílica neutra: cys, ser, thr;
- (3)
- ácida: asp, glu;
- (4)
- básica: asn, gln, his, lys, arg;
- (5)
- residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
- (6)
- aromática: trp, tyr, phe.
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Las sustituciones no conservativas comprenderán
el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Dichos residuos sustituidos también se pueden introducir en sitios
de sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios
restantes (no conservados).
Las variaciones se pueden realizar utilizando
procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis
mediada por oligonucleótidos (dirigida de sitio), el rastreo de
alanina, y mutágenesis por PCR. Para fabricar el ADN variante de
PRO se puede llevar a cabo sobre el ADN clonado una mutagénesis
dirigida de sitio [Carter et al., Nucl. Acids. Res., 13: 4331
(1986); Zoller et al., Nucl. Acids. Res., 10: 6487 (1987)],
mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene, 34 315 (1985)],
mutagénesis de selección por restricción [Wells et al.,
Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas
conocidas.
El análisis de aminoácidos por rastreo también
se puede realizar para identificar uno o más aminoácidos a lo largo
de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de rastreo
preferidos están los aminoácidos relativamente pequeños y neutros.
Entre dichos aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y
cisteína. La alanina es habitualmente un aminoácido de rastreo
preferido entre este grupo ya que elimina la cadena lateral más allá
del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de
la cadena principal de la variante [Cunninghan y Wells, Science,
244:1081-1085 (1989)]. La alanina es también
habitualmente preferida ya que es el aminoácido más habitual.
Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas
como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and Co.,
N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de
alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede
utilizar un aminoácido isotérico.
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Las modificaciones covalentes del polipéptido
PRO están incluidas en el alcance de la presente invención. Un tipo
de modificación covalente incluye la reacción de residuos de
aminoácidos marcados de un polipéptido PRO con un agente
derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas
laterales seleccionadas o los residuos N- o
C-terminales del polipéptido PRO. La derivatización
con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular el
polipéptido PRO con una matriz o superficie de soporte insoluble en
agua para su utilización en el procedimiento para purificar
anticuerpos anti-PRO, y viceversa. Entre los agentes
de reticulación utilizados habitualmente se incluyen, por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicílico,
imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres
disuccinimidílicos, tales como
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
maleimidas bifuncionales, tales como
bis-N-maleimido-1,8-octano
y agentes, tales como
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de
residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos
glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina
y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o
treonilo, metilación de los grupos \alpha-amino de
las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E.
Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.
Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86
(1983)], acetilación de la amina N-terminal, y la
amidación de cualquier grupo carboxilo
C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del
polipéptido PRO incluido en el alcance de la presente invención
comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del
polipéptido. Por "alteración del patrón de glicosilación
nativo" para los objetivos de la presente invención se pretende
indicar la eliminación de uno o más grupos carbohidratos hallados
en polipéptidos PRO de secuencia nativa (mediante la eliminación del
sitio de glicosilación subyacente o mediante la eliminación de la
glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o la adición
de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el
polipéptido PRO de secuencia nativa. Además, la frase incluye
cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas,
implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de los
diversos grupos de carbohidrato presentes.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido PRO se puede realizar alterando la secuencia de
aminoácidos. La alteración se puede realizar, por ejemplo, mediante
la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o
treonina al polipéptido PRO de secuencia nativa (para sitios de
glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos de PRO puede
alterarse opcionalmente a través de los cambios a nivel de ADN,
particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el
polipéptido PRO en bases preseleccionadas, de manera que los
codones que se generan se traducirán en los aminoácidos
deseados.
Otros medios para aumentar el número de grupos
carbohidrato en el polipéptido PRO es mediante acoplamiento químico
o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos procedimientos
están descritos en la técnica, por ejemplo, en WO 87/05330
publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC
Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981).
La eliminación de grupos carbohidrato presentes
en el polipéptido PRO se puede realizar química o enzimáticamente o
mediante sustitución mutacional de codones que codifican los
residuos de aminoácidos que actúan como dianas para la
glicosilación. Las técnicas de desglicosilación químicas son
conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por
Hakimuddin, et. al. Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y
por Edge, et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división
enzimática de grupos carbohidrato en los polipéptidos se puede
conseguir mediante la utilización de un conjunto de endo- y
exoglicosidasas tal y como se describe en Thotakura et al.
Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de
polipéptidos PRO comprende la unión del polipéptido PRO a uno de un
conjunto de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol
(PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma
establecida en las Patentes de Estados Unidos Nos: 4.640.835;
4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
Los polipéptidos PRO de la presente invención
también se pueden modificar de una manera que formen una molécula
quimérica que comprende el polipéptido PRO fusionado a otro
polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogo.
En una realización, dicha molécula quimérica
comprende una fusión del polipéptido PRO con un polipéptido
etiqueta que proporciona un epítopo al que se puede unir
selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El
epítopo-etiqueta se sitúa generalmente en el
extremo amino o carboxilo terminal del polipéptido PRO. La presencia
de dichas formas etiquetadas con epítopo del polipéptido PRO se
pueden detectar utilizando un anticuerpo contra el polipéptido
etiqueta. Además, la disposición del epítopo etiqueta permite que el
polipéptido PRO se purifique fácilmente mediante purificación por
afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u
otro tipo de matriz de afinidad que se une al epítopo etiqueta. En
la técnica se conocen varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos
anticuerpos. Entre los ejemplos se incluyen etiquetas de
poli-histidina (poli-his) o
poli-histidina-glicina
(poli-his-gly); el polipéptido
etiqueta de gripe HA y su anticuerpo 12C45 [Field et al.,
Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la etiqueta
c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y
9E10 de la misma [Evan et al., Molecular and Cellular
Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de
gliproteína D (gD) del virus del Herpes Simplex y su anticuerpo
[Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6):
547-553 (1990)]. Entre otros polipéptidos etiqueta
se incluyen el péptido Flag [Hopp et al. , BioTechnology, 6:
1204-1210 (1988)]; el péptido epítopo KT3 [Martín
et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; un
péptido epítopo de \alpha-tubulina [Skinner et
al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)];
y el péptido etiqueta de la proteína T7 del gen 10
[Lutz-Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].
En una realización alternativa, la molécula
quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO con una
inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para
una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como
"inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser a la región Fc de
una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferiblemente la
sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o
inactivado) de un polipéptido PRO en lugar de por lo menos una
región variable de una molécula de Ig. En una realización
particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la
bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, regiones CH1, CH2 y CH3 de una
molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de
inmunoglobulinas, véase también la Patente de Estados Unidos No.
5.428.130 concedida el 27 de junio de 1995.
La siguiente descripción se refiere
principalmente a la producción de polipéptidos PRO mediante el
cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que
contiene ácido nucleico de PRO. Naturalmente, se prevé que se
puedan utilizar procedimientos alternativos, que se conocen bien en
la técnica, para preparar los polipéptidos PRO. Por ejemplo, la
secuencia del polipéptido PRO, o partes de la misma, se pueden
producir mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas
de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al.,
Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San
Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:
2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in
vitro se puede realizar utilizando técnicas manuales o mediante
automatización. La síntesis automatizada se puede realizar, por
ejemplo, utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer
(Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Se
pueden sintetizar químicamente varias partes del polipéptido PRO de
forma separada y combinarse utilizando procedimientos químicos o
enzimáticos para producir el polipéptido PRO de longitud
completa.
El ADN que codifica el polipéptido PRO se puede
obtener a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de
tejido que se cree que posee el ARNm de PRO y expresarlo a un nivel
detectable. Por consiguiente, el ADN de PRO humano se puede obtener
convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a
partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El
gen que codifica PRO también se puede obtener a partir de una
biblioteca genómica o mediante procedimientos de síntesis (por
ejemplo, síntesis automatizada de ácidos nucleicos).
Las bibliotecas se pueden cribar con sondas
(tales como anticuerpos para el polipéptido PRO u oligonucleótidos
de por lo menos aproximadamente 20-80 bases)
diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína
codificada por el mismo. El cribado del ADNc o biblioteca genómica
con la sonda seleccionada se puede realizar utilizando
procedimientos estándar, tal como se describe en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para
aislar el gen que codifica el polipéptido PRO es utilizar la
metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et
al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1995)].
Los siguientes Ejemplos describen técnicas para
cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos
seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y
suficientemente inequívoca que se minimizan los falsos positivos.
El oligonucleótido está preferiblemente marcado de manera que se
puede detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se
criba. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la
técnica, e incluyen la utilización de radiomarcadores como ATP
marcado con ^{32}P, biotinilación o marcaje enzimático. Las
condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y la
astringencia elevada, se proporcionan en Sambrook et al.,
supra.
Las secuencias identificadas en dichos
procedimientos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y
alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en
bases de datos públicos, tales como el Banco de Genes u otras bases
de datos privadas de secuencias. La identidad de secuencia (a nivel
de aminoácido o nucleótido) en las regiones definidas de la
molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa se puede
determinar utilizando procedimientos conocidos en la técnica y tal y
como se describen en la presente invención.
El ácido nucleico que tiene la secuencia de
codificación de la proteína se puede obtener mediante el cribado
del ADNc seleccionado o las bibliotecas genómicas utilizando la
secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente invención
por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos
convencionales de extensión con cebadores tal y como se describe en
Sambrook et al., supra, para detectar precursores e
intermedios de procesamiento de ARNm que no se han transcrito de
forma inversa en ADNc.
Las células huésped se transfectan o transforman
con vectores de expresión o clonación descritos en la presente
invención para la producción del polipéptido PRO y se cultivan en
medios nutrientes convencionales modificados según sean adecuado
para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar
los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de
cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se
pueden seleccionar por un experto en la materia sin una
experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y
técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos
celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a
Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook
et al., supra.
Los procedimientos de transfección de células
eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos
por el experto en la materia, por ejemplo, CaCl_{2}, CaPO_{4},
mediados por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula
huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas
estándar adecuadas a dichas células. El tratamiento con calcio que
utiliza cloruro cálcico, tal y como se describe en Sambrook et
al., supra, o la electroporación se utilizan generalmente para
procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se
utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal
como describe Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859
publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin
dichas paredes celulares, se puede utilizar el procedimiento de
precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology,
52: 456-457 (1978). En la Patente de Estados Unidos
No. 4.399.216 se han descrito aspectos generales de transfecciones
de sistemas de células huésped de mamíferos. Las transformaciones en
levadura se llevan a cabo habitualmente según el procedimiento de
Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo,
también se pueden utilizar otros procedimientos para introducir ADN
en células, tales como mediante microinyección nuclear,
electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células
intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina.
Para varias técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown
et al., Methods in enzymology, 185:527-537
(1990) y Manssur et al., Nature, 336. 348-352
(1988).
Entre las células huésped adecuadas para la
clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente
invención se incluyen células procariotas, levadura, o eucariotas
superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, pero no se
limitan a, eubacterias, tales como organismos
Gram-negativo o Gram-positivo, por
ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Varias cepas
de E. coli están disponibles públicamente, tales como la
cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776
(ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y cepa de
E. coli K5772 (ATCC 53.635). Entre otras células huésped
procariotas adecuadas se incluyen Enterobacteriaceae, tales como
Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia,
Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella
typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans,
y Shigella, así como Bacilli, tal como B.
subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B.
licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de
abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa,
y Streptomyces. Estos ejemplos son más ilustrativos que
limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental
particularmente preferible ya que es una cepa de huésped habitual
para fermentaciones de productos de ADN recombinante.
Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de
enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede
modificar para realizar una mutación genética en los genes que
codifican proteínas endógenas al huésped, con ejemplos de dichos
huéspedes incluyendo la cepa de E. coli W3110 1A2, que tiene
el genotipo completo tonA; la cepa de E. coli W3110
9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; la
cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el
genotipo completo tonA ptr3 phoA E15
(argF-lac) 169 degP ompT kon'; la cepa de E.
coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo tonA
ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG
kan'; la cepa de E. coli W3110 40B4, que es una cepa
37D6 con una mutación de eliminación degP no resistente a
kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa
periplásmica mutante descrita en la Patente de Estados Unidos No.
4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son
adecuados procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo,
PCR u otras reacciones de ácido nucleico polimerasa.
Además de los procariotas, los microbios
eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son
huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que
codifican PRO. El Saccharomyces cerevisiae es un
microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado habitualmente.
Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse,
Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985);
huéspedes Kluyveromyces (Patente de Estados Unidos No.
4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology,
9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K.
lactis (MW98-8C, CBS683, CBS574; Louvencourt
et al. J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC
12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii
(ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K.
drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al.,
Bio/Technology, 8:135(1990)), K. thermotolerans y K.
marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris
(EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic. Microbiol.
28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma
recia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263
[1979]); Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces
occidentalis (EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990);
y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora,
Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero
de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A.
nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al.,
Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A.
Niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479
[1985]). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente
invención e incluyen, pero no se limitan a, levadura capaz del
crecimiento en metanol seleccionada del género que consiste en
Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces,
Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies
específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras se puede
encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269
(1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión
de polipéptidos PRO glicosilados se derivan de organismos
multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se
incluyen células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera
Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de líneas
celulares huésped de mamíferos útiles se incluyen células de ovario
de hámster chino (CHO) y COS. Algunos ejemplos más específicos
incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de embrión
humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo
de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977));
células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO), Urlaub y Chasin,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de
ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251
(1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de
hígado humano (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT
060562, ATCC CCl51). La selección de la célula huésped apropiada se
estima que está dentro de la técnica.
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN
genómico), que codifica el polipéptido PRO se puede insertar en un
vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para
la expresión. Existen varios vectores disponibles públicamente. El
vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido,
partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada
se puede insertar en el vector mediante una serie de procedimientos.
En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa
de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en el
sector. Los componentes de los vectores incluyen generalmente, pero
no se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de
replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un
promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La
construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos
componentes utiliza técnicas de unión estándar que son conocidas por
un experto en la materia.
El polipéptido PRO se puede producir
recombinantemente no sólo directamente, sino también como un
polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser
una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de
división específico en el extremo N-terminal de la
proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede
ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que
codifica el PRO que se inserta en el vector. La secuencia señal
puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo,
del grupo de secuencias líderes de la fosfatasa alcalina,
penicilinasa, Ipp o enterotoxina II estable térmicamente. Para la
secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo,
la secuencia líder de invertasa de levadura, la secuencia líder del
factor alfa (incluyendo las secuencias líder del factor \alpha de
Saccharomyces y Kluyveromyces, la última descrita en
la Patente de Estados Unidos No. 5.010.182), o la secuencia líder
de fosfatasa ácida, la secuencia líder de C. Albicans
glucoamilasa (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990) o la
señal descrita en WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990.
En la expresión de células de mamíferos, las secuencias señal de
mamíferos se pueden utilizar para dirigir la secreción de la
proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de
la misma especie o especies relacionadas, así como secuencias
líderes secretoras virales.
Ambos vectores de expresión y clonación
contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la
replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas.
Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias,
levadura, y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322
es adecuado para la mayoría de bacterias
gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es
adecuado para la levadura, y orígenes virales varios (SV40,
polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de
clonación en células de mamíferos.
Los vectores de clonación y expresión contendrán
habitualmente un gen de selección, también denominado como marcador
seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b)
complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran
nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo,
el gen que codifica D-alanina racemasa para
Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células de mamíferos son aquéllos que permiten la
identificación de células competentes para captar el ácido nucleico
que codifica PRO, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula
huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea
de células CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y
propagada tal y como se describe por Urlaub et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado
para su utilización en la levadura es el gen trp1 presente
en el plásmido de la levadura YRp7 [Stinchcomb et al.,
Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979);
Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1
proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de
levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por
ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics,
85:12 (1977)].
Los vectores de clonación y expresión contienen
habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de
ácido nucleico que codifica PRO para dirigir la síntesis de ARNm.
Son conocidos promotores reconocidos por un conjunto de células
huésped potenciales. Entre los promotores adecuados para utilizar
con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de promotores de
\beta-lactamasa y lactosa [Chang et al.,
Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544
(1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano
(trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP
36.776], y promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25
(1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos
también contendrán una secuencia de Shine-Dalgamo
(S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el polipéptido
PRO.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras
adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen
promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman
et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas
glucolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);
Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y
glucoqui-
nasa.
nasa.
Otros promotores de levaduras, que son
promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una
transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las
regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C,
fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo
del nitrógeno, metalotioneína,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa
y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la
utilización en la expresión en levaduras se describen en detalle en
EP 73.657.
La transcripción del polipéptido PRO a partir de
vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por
ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus, tales
como virus del polioma, virus de la viruela aviar (Patente UK
2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el
Adenovirus 2), el virus de papiloma bovino, virus del sarcoma
aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la
hepatitis-B y virus de simio 40 (SV40), a partir de
promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de
actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores
de choque térmico, siempre y cuando dichos promotores sean
compatibles con los sistemas de células huésped.
Se puede incrementar la transcripción de un ADN
que codifica el polipéptido PRO por eucariotas superiores mediante
la inserción de una secuencia de potenciador en el vector. Los
potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, habitualmente
aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para
aumentar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias
de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina,
\alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente,
sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus de célula
eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en
la cara tardía del origen de replicación (pb
100-270), el potenciador de promotor temprano de
citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del
origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. El
potenciador se puede cortar y empalmar ("splice") en el vector
en una posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante de
PRO, pero se sitúa preferiblemente en un sitio 5' con respecto al
promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células
huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la
terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm.
Dichas secuencias están disponibles habitualmente de las regiones
no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucariotas o
virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos
transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida
del ARNm que codifica el polipéptido PRO.
En Gething et al., Nature,
293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature,
281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058 se
describen adicionalmente otros procedimientos, vectores, y células
huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de polipéptidos
PRO en cultivos de células de vertebrados recombinantes.
La amplificación y/o expresión de los genes se
puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante
transferencia Southern convencional, transferencia Northern
convencional para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205
(1980)], transferencia de puntos (análisis de ADN), o hibridación
in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, basada
en las secuencias proporcionadas en la presente invención.
Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden
reconocer dobles cadenas específicas, incluyendo dobles cadenas de
ADN, dobles cadenas de ARN, dobles cadenas híbridas de
ADN-ARN o dobles cadenas de
ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden
marcar y el ensayo se puede llevar a cabo cuando la doble cadena
está unida a una superficie, de manera que tras la formación de la
doble cadena en la superficie, se puede detectar la presencia de
anticuerpos unidos a la doble cadena.
La expresión génica, alternativamente, se puede
medir mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción
inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y el ensayo de
cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos
útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de fluidos
de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden
preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se
pueden preparar contra un polipéptido PRO de secuencia nativa o
contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN
proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia
exógena fusionada a ADN de PRO y que codifica un epítopo de
anticuerpo específico.
Las formas de polipéptidos PRO se pueden
recuperar del medio de cultivo o de los lisados de células huésped.
Si está unido a membrana, se puede liberar de la membrana utilizando
una solución de detergente adecuada (por ejemplo, Triton
X-100) o mediante división enzimática. Las células
utilizadas en la expresión del polipéptido PRO se pueden romper
mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, destrucción
mecánica, o agentes para lisar células.
Se puede desear purificar el polipéptido PRO a
partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los
siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de
purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de
intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa;
cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio catiónico,
tal como DEAE; "chromatofocusing"; SDS-PAGE;
precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando,
por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A
sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG, y columnas
quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo del
polipéptido PRO. Se pueden utilizar varios métodos de purificación
de proteínas y dichos métodos son conocidos en la técnica y se
describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182
(1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice,
Springer-Verlag, Nueva York (1982). La etapa o
etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la
naturaleza del proceso de producción utilizado y el polipéptido PRO
concreto producido.
Las secuencias de nucleótidos (o sus
complementarias) que codifican PRO tiene varias aplicaciones en la
disciplina de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de
hibridación, en el mapeo de cromosomas y genes y en la generación
de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico de PRO también será útil
para la preparación de polipéptidos PRO mediante las técnicas
recombinantes descritas en la presente invención.
El gen de PRO de secuencia nativa y longitud
completa, o partes del mismo, se pueden utilizar como sondas de
hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc de PRO
de longitud completa o para aislar incluso otros ADNcs (por
ejemplo, aquéllos que codifican variantes naturales de PRO o PRO de
otras especies) que tienen una identidad de secuencia deseada con
la secuencia de PRO nativa descrita aquí. Opcionalmente, la
longitud de las sondas tendrá aproximadamente 20 a aproximadamente
50 bases. Las sondas de hibridación se pueden derivar de por lo
menos regiones parcialmente nuevas de la secuencia de nucleótidos
nativa de longitud completa en la que dichas regiones se pueden
determinar sin una experimentación excesiva o de secuencias
genómicas que incluyen promotores, elementos potenciadores e
intrones de PRO de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un
procedimiento de cribado comprenderá el aislamiento de la región
codificante del gen de PRO utilizando la secuencia de ADN conocida
para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases.
Las sondas de hibridación se pueden marcar con una serie de
marcadores, incluyendo radionucleidos, tales como ^{32}P o
^{35}S, o marcadores enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina
acoplada a la sonda a través de los sistemas de acoplamiento
avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia
complementaria a la del gen de PRO de la presente invención se
pueden utilizar para cribar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico
o ARNm para determinar a qué miembros de dichas bibliotecas se
hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con
mayor detalle en los siguientes Ejemplos.
Cualquier secuencia EST descrita en la presente
solicitud se puede utilizar de forma similar como sondas,
utilizando los procedimientos descritos en la presente
invención.
Entre otros fragmentos útiles de los ácidos
nucleicos de PRO se incluyen oligonucleótidos antisentido y sentido
que comprenden una secuencia de ácido nucleico de cadena única (ARN
o ADN) capaz de unirse a secuencias de ARNm de PRO diana (sentido)
o ADN de PRO (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o
sentido, según la presente invención, comprende un fragmento de la
región codificante de ADN de PRO. Dicho fragmento comprende
generalmente por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos,
preferiblemente de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La
capacidad de derivar un oligonucleótido antisentido o sentido,
basado en una secuencia de ADNc que codifica una proteína
determinada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer
Res., 48:2659, 1988) y van der Krol et al.
(BioTechniques 6:958, 1988).
La unión de oligonucleótidos sentido y
antisentido a secuencias de ácidos nucleico diana da lugar a la
formación de cadenas dobles que bloquean la transcripción o la
traducción de la secuencia diana mediante uno de los diferentes
medios, que incluyen la degradación aumentada de las cadenas dobles,
la terminación prematura de la transcripción o la traducción, o
mediante cualquier otro medio. De este modo, los oligonucleótidos
antisentido se pueden utilizar para bloquear la expresión de
proteínas PRO. Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden
además oligonucleótidos que tienen esqueletos de
azúcar-fosfodiéster modificados (u otras uniones a
azúcares, tales como las descritas en WO 91/06629) y en los que
dichas uniones a azúcares son resistentes a nucleasas endógenas.
Dichos oligonucleótidos con uniones a azúcares resistentes son
estables in vivo (es decir, capaces de resistir la
degradación enzimática) pero que mantienen la especificidad de
secuencia para ser capaces de unirse a las secuencias de
nucleótidos diana.
Entre otros ejemplos de oligonucleótidos sentido
o antisentido se incluyen aquellos nucleótidos que están unidos
covalentemente a grupos orgánicos, tales como los descritos en WO
90/10048, y otros grupos que aumentan la afinidad del
oligonucleótido por una secuencia de ácidos nucleicos diana, tal
como poli-(L-lisina). Además, se pueden unir
agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes
o complejos metálicos a oligonucleótidos sentido o antisentido para
modificar las especificidades de unión del oligonucleótido
antisentido o sentido por la secuencia de nucleótidos diana.
Los oligonucleótidos sentido o antisentido se
pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de ácidos
nucleicos diana mediante cualquier procedimiento de transferencia de
genes, incluyendo, por ejemplo, la transfección de ADN mediada por
CaPO_{4}, electroporación, o mediante la utilización de vectores
de transferencia de genes, tales como el virus
Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un
oligonucleótido antisentido o sentido se inserta en un vector
retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácidos
nucleicos diana se pone en contacto con el vector retroviral
recombinante, in vivo o ex vivo. Entre los vectores
retrovirales adecuados se incluyen, pero sin limitación, los
derivados de retrovirus murino M-MuLV, N2 (un
retrovirus derivado de M-MuLV) o los vectores de
copia doble designados como DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase WO
90/13641).
Los oligonucleótidos sentido o antisentido
también se pueden introducir en una célula que contiene la
secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado
con una molécula de unión a ligando, tal y como se describe en WO
91/04753. Las moléculas de unión a ligando adecuadas incluyen, pero
sin limitación, receptores de la superficie de las células,
factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se
unen a receptores de la superficie de las células. Preferiblemente,
la conjugación de la molécula de unión a ligando no interfiere
sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión a ligando
para unirse a su correspondiente molécula o receptor, ni bloquea la
entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión
conjugada en la célula.
Alternativamente, un oligonucleótido sentido o
antisentido se puede introducir en una célula que contiene la
secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un
complejo oligonucleótido-lípido, tal y como se
describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o
antisentido-lípido se disocia preferiblemente en el
interior de la célula mediante una lipasa endógena.
Las moléculas de ARN o ADN antisentido o sentido
tienen generalmente por lo menos aproximadamente 5 bases de
longitud, aproximadamente 10 bases de longitud, aproximadamente 15
bases de longitud, aproximadamente 20 bases de longitud,
aproximadamente 25 bases de longitud, aproximadamente 30 bases de
longitud, aproximadamente 35 bases de longitud, aproximadamente 40
bases de longitud, aproximadamente 45 bases de longitud,
aproximadamente 50 bases de longitud, aproximadamente 55 bases de
longitud, aproximadamente 60 bases de longitud, aproximadamente 65
bases de longitud, aproximadamente 70 bases de longitud,
aproximadamente 75 bases de longitud, aproximadamente 80 bases de
longitud, aproximadamente 85 bases de longitud, aproximadamente 90
bases de longitud, aproximadamente 95 bases de longitud,
aproximadamente 100 bases de longitud, o más.
Las sondas también se pueden utilizar en
técnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para la
identificación de secuencias de codificación de PRO estrechamente
relacionadas.
Las secuencias de nucleótidos que codifican un
PRO también se puede utilizar para construir sondas de hibridación
para mapear el gen que codifica el PRO y para el análisis genético
de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de
nucleótidos proporcionadas en la presente invención se pueden mapear
a un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando
técnicas conocidas, tales como hibridación in situ, análisis
de unión contra marcadores cromosómicos conocidos, y el cribado de
hibridación con bibliotecas.
Cuando las secuencias codificantes de PRO
codifican una proteína que se une a otra proteína (por ejemplo,
cuando el PRO es un receptor), el PRO se puede utilizar en ensayos
para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas en la
interacción de unión. Mediante dichos procedimientos, se pueden
identificar los inhibidores de la interacción de unión
receptor/ligando. Las proteínas implicadas en dichas interacciones
de unión también se pueden utilizar para cribar inhibidores o
agonistas de péptidos o moléculas pequeñas de la interacción de
unión. Además, el receptor PRO se puede utilizar para aislar el
ligando o ligando correlativos. Los ensayos de cribado se pueden
diseñar para encontrar compuestos candidatos que mimeticen la
actividad biológica de un PRO nativo o un receptor para PRO. Dichos
ensayos de cribado incluirán ensayos susceptibles de cribar con un
alto rendimiento bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente
adecuados para identificar pequeñas moléculas como fármacos
candidatos. Entre las pequeñas moléculas contempladas se incluyen
compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos se
pueden realizar en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de
unión proteína-proteína, ensayos de cribado
bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están
bien caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican PRO o sus
formas modificadas también se pueden utilizar para generar animales
transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles
en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un
animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal
que tiene células que contienen un transgén, el cual se introdujo
en el animal o en un antecesor del animal en estado prenatal, por
ejemplo, una etapa embrionaria. Un transgén es un ADN que está
integrado en el genoma de una célula de la que se desarrolla un
animal transgénico. En una realización, el ADNc que codifica PRO se
puede utilizar para clonar ADN genómico que codifica PRO según las
técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para
generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN
que codifica PRO. Los procedimientos para generar animales
transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas,
se han convertido en convencionales en la técnica y se describen,
por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.736.866 y
4.870.009. Habitualmente, se marcarían células concretas para la
incorporación del transgén de PRO con potenciadores específicos de
tejido. Se pueden utilizar animales transgénicos que incluyen una
copia de un transgén que codifica PRO introducido en la línea
germinal del animal en una etapa embrionaria para examinar el efecto
de la mayor expresión de ADN que codifica PRO. Dichos animales se
pueden utilizar como animales de prueba para reactivos pensados
para conferir protección de, por ejemplo, condiciones patológicas
asociadas con su sobreexpresión. Según este aspecto de la
invención, el tratamiento de un animal con el reactivo y la
reducción de la incidencia de la condición patológica, en
comparación con animales no tratados que llevan el transgén,
indicaría una intervención terapéutica potencial en la condición
patológica.
Alternativamente, se pueden utilizar los
homólogos no humanos de PRO para construir un animal "knock
out" con PRO que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica
PRO como resultado de la recombinación homóloga entre el gen
endógeno que codifica PRO y el ADN genómico alterado que codifica
PRO introducido en una célula madre embrionaria del animal. Por
ejemplo, el ADNc que codifica PRO se puede utilizar para clonar ADN
genómico que codifica PRO según las técnicas establecidas. Una
parte del ADN genómico que codifica PRO se puede eliminar o
sustituir por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador
seleccionable que se puede utilizar para monitorizar la
integración. Habitualmente, se incluyen en el vector varias
kilobases de ADN flanqueante inalterado (en los extremos 5' y 3')
[véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987)
para una descripción de vectores de recombinación homólogos]. El
vector se introduce en una línea de células madres embrionarias
(por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células
en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con
el ADN endógeno [véase, por ejemplo, Li et al., Cell, 69: 915
(1992)]. Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un
blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para
formar quimeras de agregación [véase, por ejemplo, Bradley, en
Teralocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical
Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), páginas
113-152]. A continuación, se puede implantar el
embrión quimérico en un animal criado hembra pseudopreñado adecuado
y se puede producir el embrión para crear un animal "knock
out". La progenie que porta el ADN recombinado homólogamente en
sus células germinales se puede identificar mediante técnicas
estándar y utilizarse para criar animales en los que todas las
células de los mismos contienen el ADN recombinado homólogamente.
Los animales knock out se pueden caracterizar, por ejemplo, por su
capacidad de defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por
su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del
polipéptido PRO.
El ácido nucleico que codifica los polipéptidos
PRO también se pueden utilizar en terapia génica. En aplicaciones
de terapias génicas, los genes se introducen en células para
conseguir síntesis la síntesis in vivo de un producto
genético terapéuticamente eficaz, por ejemplo, para la sustitución
de un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la
terapia génica convencional en la que se consigue un efecto duradero
mediante un único tratamiento, como la administración de agentes
terapéuticos génicos, que implica la administración de una vez o
repetitiva de un ADN o ARN terapéuticamente eficaz. Se pueden
utilizar los ADNs y ARNs antisentido como agentes terapéuticos para
bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. También se ha
observado que los oligonucleótidos antisentido cortos se pueden
importar en células en las que actúan como inhibidores, a pesar de
sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su captación
limitada por la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Los
oligonucleótidos se pueden modificar para aumentar su captación,
por ejemplo, mediante la sustitución de sus grupos fosfodiéster
cargados negativamente por grupos no cargados.
Existe una variedad de técnicas disponibles para
introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían
dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células
cultivadas in vitro, o in vivo en las células del
huésped deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de
ácido nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen la
utilización de liposomas, electroporación, microinyección, fusión
celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de
precipitación con fosfato cálcico, etc. Entre las técnicas de
transferencia génica in vivo actuales preferidas se incluyen
la transfección con vectores virales (habitualmente retrovirales) y
la transfección mediada por liposoma-proteínas de
cubierta viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11,
205-210 [1993]). En algunas situaciones, es deseable
proporcionar la fuente de ácidos nucleicos con un agente que
reconoce las células diana, tales como un anticuerpo específico para
una proteína de membrana de la superficie de la célula o la célula
diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando
se utilizan liposomas, se pueden utilizar proteínas que se unen a
una proteína de membrana de la superficie de la célula asociada con
endocitosis para dirigir y/o facilitar la captación, por ejemplo,
proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un
tipo de célula concreta, anticuerpos para proteínas que
experimentan internalización en el ciclado, proteínas que dirigen la
localización intracelular y el aumento de la vida media
intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por receptor se
describe en, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 262,
4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Para una
revisión de los protocolos de marcaje génico y terapia génica, véase
Anderson et al., Science 256, 808-813
(1992).
Los polipéptidos PRO descritos en la presente
invención también se pueden utilizar como marcadores del peso
molecular con fines de una electroforesis de proteínas y las
secuencias de ácido nucleico aisladas se pueden utilizar para
expresar recombinantemente dichos marcadores.
Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican
los polipéptidos PRO o fragmentos de los mismas descritas en la
presente invención son útiles para la identificación de cromosomas.
En este aspecto, existe una necesidad actual para identificar
nuevos marcadores de cromosomas, ya que actualmente hay disponibles
relativamente pocos reactivos marcadores de cromosomas, en base a
los datos de secuencias disponibles. Cada molécula de ácido
nucleico de PRO de la presente invención se puede utilizar como
marcador de cromosomas.
Los polipéptidos PRO y las moléculas de ácido
nucleico de la presente invención también se pueden utilizar como
diagnóstico para la caracterización de tejidos, en la que los
polipéptidos PRO de la presente invención se pueden expresar
diferencialmente en un tejido en comparación con otro,
preferiblemente en un tejido enfermo en comparación con un tejido
normal del mismo tipo de tejido. Las moléculas de ácido nucleico de
PRO se utilizarán para generar sondas para PCR, análisis Northern,
análisis Southern y análisis Western.
Los polipéptidos PRO descritos en la presente
invención también se pueden utilizar como agentes terapéuticos. Los
polipéptidos PRO de la presente invención se pueden formular según
los procedimientos conocidos para preparar composiciones
farmacéuticamente útiles, a través de los cuales el producto PRO de
las mismas se combina en una mezcla con un vehículo portador
farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas se
preparan para el almacenamiento mediante la mezcla del principio
activo que tiene el grado deseado de pureza con portadores,
excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables
(Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª Edición, Osol, A.
Ed. (1980)) en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones
acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables
son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones
utilizadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y
otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico;
polipéptidos de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10
residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como
polivinilpirrolidona, aminoácidos, tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como
manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como
sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM},
PLURONICS^{TM} o PEG.
Las formulaciones a utilizar para la
administración in vitro deben ser estériles. Esto se consigue
fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles, previamente a o posteriormente a la
liofilización y reconstitución.
Las composiciones terapéuticas de la presente
invención generalmente se colocan en un recipiente que tiene un
recipiente de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de
solución intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de
inyección hipodérmica.
La ruta de administración está de acuerdo con
procedimientos conocidos, por ejemplo, la inyección o infusión
mediante las rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral,
intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional,
administración tópica, o mediante sistemas de liberación
controlada.
Las dosis y concentraciones del fármaco deseadas
de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden
variar dependiendo de la utilización particular prevista. La
determinación de la dosis o la ruta de administración apropiadas
están dentro del conocimiento de un médico habitual. Los
experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la
determinación de dosis eficaces para la terapia humana. El escalado
entre especies de dosis eficaces se puede llevar a cabo siguiendo
los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The
use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics
and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon
Press, Nueva York, 1989, páginas 42-96.
Cuando se utiliza la administración in
vivo de un polipéptido PRO o agonista o antagonista del mismo,
las cantidades de dosificación normales pueden variar desde
aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de masa corporal de
mamífero o más por día, preferiblemente aproximadamente 1
\mug/kg/día hasta 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de
administración. Las guías de las dosis concretas y los
procedimientos de liberación se proporcionan en la literatura;
véase, por ejemplo, Patentes U.S. Nos. 4.657.760; 5.206.344; o
5.225.212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán eficaces
para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos,
que la administración que se dirige a un órgano o tejido, por
ejemplo, puede necesitar la liberación de una manera diferente a la
de otro órgano o tejido.
Cuando se desea la administración por liberación
controlada de un polipéptido PRO en una formulación con
características de liberación adecuadas para el tratamiento de
cualquier enfermedad o trastorno que requiere la administración del
polipéptido PRO, se contempla la microencapsulación del polipéptido
PRO. La microencapsulación de proteínas recombinantes para la
liberación controlada se ha realizado satisfactoriamente con la
hormona del crecimiento humano (rhGH), interferón- (rhIFN-),
interleuquina-2, y MN rgp 120. Johnson et al.,
Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed.
Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al.,
Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland,
"Design and Production of Single Immunization Vaccines Using
Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems", en Vaccine
Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, eds,
(Plenum Press: New York, 1995), páginas 439-462; WO
97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y Patente U.S. No.
5.654.010.
Las formulaciones de liberación controlada de
estas proteínas se desarrollaron utilizando polímero de ácido
poli-láctico-coglicólico (PLGA)
debido a su biocompatibilidad y amplio rango de propiedades
biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos
láctico y glicólico se pueden depurar rápidamente en el interior
del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero se
puede ajustar de meses a años dependiendo de su peso molecular y la
composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from
lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin y R. Langer (Eds.),
Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel
Dekker: New York, 1990), páginas 1-41.
La presente invención comprende procedimientos
de cribado de compuestos para identificar aquéllos que mimetizan el
polipéptido PRO (agonistas) o prevenir el efecto del polipéptido PRO
(antagonistas). Los ensayos de cribado para candidatos de fármacos
agonistas se diseñan para identificar compuestos que se unen o
complejan con los polipéptidos PRO codificados por los genes
identificados en la presente invención, o bien interfieren con la
interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas
celulares. Dichos ensayos de cribado incluirán ensayos susceptibles
de cribar con un alto rendimiento bibliotecas químicas, haciéndolos
particularmente adecuados para identificar pequeñas moléculas como
fármacos candidatos.
\newpage
Los ensayos se pueden realizar en una variedad
de formatos incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en la técnica.
Todos los ensayos para antagonistas tienen en
común que requieren el contacto del fármaco candidato con un
polipéptido PRO codificado por un ácido nucleico identificado en la
presente bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para
permitir que estos dos componentes interaccionen.
En ensayos de unión, la interacción es la unión
y el complejo formado se puede aislar o detectar en la mezcla de
reacción. En una realización particular, el polipéptido PRO
codificado por el gen identificado en la presente invención o el
fármaco candidato se inmobilizan sobre una fase sólida, por ejemplo,
una placa de microtitulación, mediante enlaces covalentes o no
covalentes. La unión no covalente se realiza generalmente mediante
el recubrimiento de la superficie sólida con una solución del
polipéptido PRO y secado. Alternativamente, se puede utilizar un
anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal,
específico para el polipéptido PRO a inmovilizar, para anclarlo a
la superficie sólida. El ensayo se realiza mediante la adición del
componente no inmovilizado, que se puede marcar mediante una marca
detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie
recubierta que contiene el componente anclado. Cuando se completa la
reacción, se extraen los componentes no reaccionados, por ejemplo,
mediante lavado, y se detectan los complejos anclados a la
superficie sólida. Cuando el componente originalmente no
inmovilizado transporta un marcador detectable, la detección de la
marca inmovilizada en la superficie indica que tuvo lugar la
complejación. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no
transporta un marcador, se puede detectar la complejación, por
ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado que se une
específicamente al complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interacciona con, pero
no se une a un polipéptido PRO particular codificado por un gen
identificado en la presente invención, su interacción con ese
polipéptido se pueden analizar mediante procedimientos conocidos
para detectar interacciones proteína-proteína.
Dichos ensayos incluyen estrategias tradicionales, tales como, por
ejemplo, reticulación, coinmunoprecipitación y copurificación a
través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las
interacciones proteína-proteína se pueden
monitorizar mediante la utilización de un sistema genético basado
en levaduras descritos por Fields y colaboradores (Fields y Song,
Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:
9578-9582 (1991)). Muchos activadores
transcripcionales, tales como GAL4 de levadura, consisten en dos
dominios modulares físicamente discretos, uno actuando como el
dominio de unión a ADN, el otro actuando como el dominio de
transcripción-activación. El sistema de expresión
en las levaduras descrito en las publicaciones anteriores (referidas
generalmente como "el sistema de dos híbridos") saca ventaja
de esta propiedad e utiliza dos proteínas híbridas, una en la que
se fusiona la proteína diana al dominio de unión a ADN de GAL4, y
otra, en la que las proteínas activadoras candidatas se fusionan al
dominio de activación. La expresión de un gen informador
GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4
depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 a través de la
interacción de proteína-proteína. Las colonias que
contienen polipéptidos que interaccionan se detectan con un sustrato
cromatogénico para \beta-galactosidasa. En
Clontech se encuentra disponible comercialmente un kit completo
(MATCHMAKER^{TM}) para identificar interacciones
proteína-proteína entre dos proteínas específicas
utilizando la técnica de dos híbridos. Este sistema también se
puede extender para mapear dominios de proteínas implicados en las
interacciones de proteínas específicas así como para precisar los
residuos de aminoácidos que son cruciales para estas
interacciones.
Los compuestos que interfieren con la
interacción de un gen que codifica un polipéptido PRO identificado
en la presente invención y otros componentes intra- o extracelulares
se puede analizar tal y como se indica a continuación:
habitualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el
producto del gen y el componente intra- o extracelular bajo
condiciones y durante un tiempo que permite la interacción y la
unión de los dos productos. Para analizar la capacidad de un
compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se desarrolla
en ausencia y en presencia del compuesto de prueba. Además, se
puede añadir un placebo a una tercera mezcla de reacción, para usar
como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el
compuesto de prueba y el componente intra- o extracelular presente
en la mezcla se monitoriza tal y como se describe anteriormente en
la presente invención. La formación del complejo en la reacción o
reacciones de control, pero no en la mezcla de reacción que
contiene el compuesto de prueba, indica que el compuesto de prueba
interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su
compañero de reacción.
Para analizar antagonistas, el polipéptido PRO
se puede añadir a una célula junto con el compuesto a cribar para
una actividad concreta y la capacidad del compuesto para inhibir la
actividad de interés en presencia del polipéptido PRO indica que el
compuesto es un antagonista del polipéptido PRO. Alternativamente,
los antagonistas se pueden detectar mediante la combinación del
polipéptido PRO y un antagonista potencial con los receptores de
polipéptido PRO unido a membrana o receptores recombinantes bajo
condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El
polipéptido PRO se puede marcar, por ejemplo mediante radiactividad,
de manera que el número de moléculas de polipéptido PRO unidas al
receptor se puede utilizar para determinar la eficacia del
potencial antagonista. El gen que codifica el receptor se puede
identificar mediante numerosos procedimientos conocidos por los
expertos en la materia, por ejemplo, "panning" de ligando y
separación por FACS. Coligan et al. Current Protocols in
Immun., 1(2): Capítulo 5 (1991). Preferiblemente, la
clonación de la expresión se utiliza cuando el ARN poliadenilado se
prepara a partir de una célula sensible al polipéptido PRO y se
divide en grupos una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN
y se utiliza para transfectar células COS u otras células que no
son sensibles al polipéptido PRO. Las células transfectadas que se
desarrollan sobre portamuestras de vidrio se exponen a polipéptido
PRO marcados. El polipéptido PRO se puede marcar mediante una
variedad de medios que incluyen la yodación o inclusión de un sitio
de reconocimiento para una proteína quinasa específica de sitio.
Tras la fijación e incubación, los portamuestras se someten a
análisis autoradiográfico. Los grupos positivos se identifican y
los subgrupos se preparan y se retransfectan utilizando un proceso
de subagrupación y recribado interactivos, obteniendo finalmente un
único clon que codifica el potencial receptor.
Como estrategia alternativa para la
identificación del receptor, el polipéptido PRO marcado se puede
unir por fotoafinidad con la membrana celular o preparaciones de
extracto que expresan la molécula receptora. El material reticulado
se separa mediante PAGE y se expone a la película de rayos X. El
complejo marcado que contiene el receptor se puede escindir,
separar en fragmentos de péptidos, y someterse a la
microsecuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos
obtenida a partir de la microsecuenciación se utilizaría para
diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótidos degenerados para
cribar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica
el potencial receptor.
En otro ensayo para antagonistas, las células de
mamíferos o una preparación de membranas que expresan el receptor
se incubarían con polipéptido PRO marcado en presencia del compuesto
candidato. A continuación, se podría medir la capacidad del
compuesto para aumentar o bloquear esta interacción.
Más ejemplos específicos de antagonistas
potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones
de inmunoglobulina con polipéptido PRO, y, en particular,
anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos policlonales
y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena
única, anticuerpos anti-idiotípicos y versiones
quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así
como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos.
Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína
estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del
polipéptido PRO que reconoce el receptor pero no transmite el
efecto, inhibiendo así competitivamente la acción del polipéptido
PRO.
Otro potencial antagonista de polipéptido PRO es
una construcción de ADN o ARN antisentido preparada utilizando
tecnología antisentido, cuando, por ejemplo, una molécula de ADN o
ARN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción del
ARNm mediante la hibridación a ARNm marcado y evitando la traducción
de la proteína. La tecnología antisentido se puede utilizar para
controlar la expresión génica a través de la formación de una
triple hélice o ADN o ARN antisentido, ambos procedimientos basados
en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la parte
codificante 5' de la secuencia del polinucleótido, que codifica los
polipéptidos PRO maduros de la presente invención, se utiliza para
diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10
a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN
para que sea complementario a una región del gen implicado en la
transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucl. Acids
Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456
(1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), evitando
así la transcripción y la producción del polipéptido PRO. El
oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida al ARNm in vivo
y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido PRO
(antisentido - Okano, Neurochem., 56:560 (1991);
Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene
Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los
oligonucleótidos descritos anteriormente también se pueden liberar a
las células, de manera que el ARN o ADN antisentido se pueden
expresar in vivo para inhibir la producción del polipéptido
PRO. Cuando se utiliza ADN antisentido, se prefieren
oligodesoxinucleótidos derivados del sitio de inicio de la
traducción, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones -10 y
+10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana.
Entre los antagonistas potenciales se incluyen
pequeñas moléculas que se unen al sitio activo, el sitio de unión
al receptor, o el factor de crecimiento u otro sitio de unión
pertinente del polipéptido PRO, bloqueando de esta manera la
actividad biológica normal del polipéptido PRO. Entre los ejemplos
de moléculas pequeñas se incluyen, pero sin limitación, péptidos
pequeños o moléculas similares a péptidos, preferiblemente péptidos
solubles y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptídicos
sintéticos.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas
capaces de catalizar la división específica de ARN. Las ribozimas
actúan mediante la hibridación específica de secuencia al ARN diana
complementario, seguido de la división endonucleolítica. Los sitios
de división específica de la ribozima en un ARN diana potencial se
puede identificar mediante técnicas conocidas. Para más detalles,
véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology,
4:469-471 (1994) y publicación de PCT No. WO
97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en formación de
triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deberían ser
de cadena única y compuestas de desoxinucleótidos. La composición de
las bases de estos oligonucleótidos se diseña de manera que induce
la formación de la triple hélice a través de las reglas de
emparejamiento de bases Hoogsteen, que generalmente requiere tramos
considerables de purinas o pirimidinas en una cadena de una cadena
doble. Para más detalles, véase, por ejemplo, la publicación de PCT
No. WO 97/33551, supra.
Estas pequeñas moléculas se pueden identificar
mediante uno o más de los ensayos de cribado descritos
anteriormente en la presente invención y/o mediante cualquier otra
técnica de cribado conocida para un experto en la materia.
Las utilizaciones de diagnóstico y terapéuticas
de las moléculas descritas en la presente invención también pueden
estar basadas en los éxitos de los ensayos funcionales positivos
dados a conocer y descritos a continuación.
La presente invención proporciona además
anticuerpos anti-PRO. Entre los anticuerpos de
ejemplo se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales,
humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.
Los anticuerpos anti-PRO pueden
comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos de
preparación de anticuerpos policlonales son conocidos para el
experto en la materia. Los anticuerpos policlonales se pueden
desarrollar en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más
inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante.
Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en
el mamífero mediante inyecciones múltiples subcutáneas o
intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el
polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil
conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida por ser
inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de
dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, pero sin limitación,
hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero,
tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soja. Entre los
ejemplos de adyuvantes que se pueden utilizar se incluyen el
adyuvante completo de Preund y el adyuvante MPL-TDM
(monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético).
El protocolo de inmunización se puede seleccionar por un experto en
la materia sin una gran experimentación.
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Los anticuerpos anti-PRO pueden
ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales se pueden preparar utilizando procedimientos de
hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein,
Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de
hibridoma, se inmuniza habitualmente un ratón, un hámster u otro
animal huésped apropiado con un agente inmunizante para obtener
linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que
se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente,
los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.
El agente inmunizante incluirá habitualmente el
polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Generalmente,
se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PLBs") si se
desean células de origen humano, o células de bazo o se utilizan
células de nódulos linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no
humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea
celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal
como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academia
Press, (1986), páginas 59-103]. Las líneas celulares
inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas,
particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y
humano. Habitualmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de
rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un
medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más
sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las
células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células
parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina
fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para
los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina y
timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento
de células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son aquéllas que se fusionan de manera eficaz, soportan un nivel de
expresión elevado estable del anticuerpo por las células productoras
de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio, tal como
medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son
líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del
Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la
American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas
celulares de mieloma humano y heteromieloma de
ratón-humano se han descrito para la producción de
anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol.,
133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production
Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York,
(1987) páginas, 51-63].
A continuación, el medio de cultivo en el que
las células de hibridoma se cultivan se pueden analizar por la
presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el PRO.
Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos
monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in
vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo
inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos
se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo
monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis
Scatchard de Munson y Poliard, Anal. Biochem., 107:
220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los
procedimientos de dilución y se pueden desarrollar mediante
procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de
cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio
de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640.
Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar
in vivo como fluido ascítico en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o
fluido ascítico mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína
A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita,
eletroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden
fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como
los descritos en la Patente U.S. No. 4.816.567. El ADN que codifica
los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden
aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos
convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de
oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes
que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos).
Las células de hibridoma de la presente invención sirven como una
fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede
situar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan
en células huésped, tales como células COS de simio, células de
ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen
de otro modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis
de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes.
El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la
secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada
y ligera humanos en lugar de las secuencias homólogas murinas
[Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al.,
supra] o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de
inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un
polipéptido que no es inmunoglobulina. Dicho polipéptido que no es
inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de un
anticuerpo de la presente invención, o se pueden sustituir por los
dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un
anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo quimérico
bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera
y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena
pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc
para evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente,
los residuos de cisteína pertinentes se sustituyen por otro residuo
de aminoácido o se eliminan para evitar la reticulación.
Los procedimientos in vitro también son
adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de
anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente,
fragmentos Fab, se puede realizar utilizando técnicas rutinarias
conocidas en el sector.
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Los anticuerpos anti-PRO de la
invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o
anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas,
cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como
Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a
antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima
derivada de inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos
humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo
receptor) en las que los residuos de una región determinante de
complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de
una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón,
rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad
deseadas. En algunos casos, los residuos del armazón Fv de la
inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos
correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden
comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo
receptor ni en las secuencias de la CDR o el armazón importados. En
general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos
de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en
los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden
a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente
todas las regiones de FR son las de una secuencia de consenso de
inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de forma óptima
también comprenderá por lo menos una parte de una región constante
de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina
humana [Jones et al., Nature, 321:
522-525 (1986); Riechmann et al., Nature,
332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op.
Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo
humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en
el mismo de un origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no
humanos se indican frecuentemente como residuos "importados",
que se adquieren habitualmente de un dominio variable
"importado". La humanización se puede realizar esencialmente
siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et
al., Nature, 321: 522-525 (1986);
Riechmann et al., Nature, 332:
323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science,
239: 1534-1536 (1988)], mediante la
sustitución de CDRs o secuencias de CDR de roedor por las
correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por
consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos
quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567), en los que
sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano ha sido
sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no
humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son
habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de
CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos
de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos también se pueden
producir utilizando varias técnicas conocidas en el sector,
incluyendo las bibliotecas de expresión en fagos [Hoogenboom y
Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et
al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de
Cole et al. y Boerner et al. están también disponibles
para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et
al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
página 77 (1985) y Boerner et al., J. Inmunol.,
147(1): 86-95 (1991)]. De forma
similar, los anticuerpos humanos se pueden fabricar mediante la
introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales
transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de
inmunoglobulina endógena han sido parcial o completamente
desactivados. Tras la estimulación, se observa la producción de
anticuerpos humanos, que se parece estrechamente a los observados
en humanos en todos los aspectos, incluyendo el reajuste de genes,
el ensamblaje, y el repertorio de anticuerpos. Esta estrategia se
describe, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos.5.545.807;
5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las
siguientes publicaciones científicas: Marks et al.,
BioTechnology 10, 779-783 (1992); Lonberg
et al., Nature 368, 856-859 (1994);
Morrison, Nature 368, 812-13 (1994);
Fishwild et al., Nature Biotechnology 14,
845-51, (1996); Neuberger, Nature
Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar,
Intern. Rev. Immunol. 13 65-93
(1995).
Los anticuerpos también se pueden purificar por
afinidad utilizando procedimientos de selección y/o mutagénesis
conocidos tal como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos
madurados por afinidad preferidos tienen una afinidad que es cinco
veces, más preferiblemente 10 veces, incluso más preferiblemente 20
ó 30 veces más que el anticuerpo de partida (generalmente murino,
humanizado o humano) a partir del cual se prepara el anticuerpo
madurado.
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Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales,
preferiblemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen
especificidades de unión con por lo menos dos antígenos diferentes.
En el presente caso, una de las especificidades de unión es por el
PRO, el otro es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por
una proteína o receptor o subunidad del receptor de la superficie
celular.
Los procedimientos para fabricar anticuerpos
biespecíficos son conocidos en la técnica. Habitualmente, la
producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la
coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de
inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas tienen
especificidades diferentes [Millstein y Cuello, Nature,
305: 537-539 (1983)]. Debido a la variedad
aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos
hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez
moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene
la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía
de afinidad. En WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en
Traunecker et al., EMBO J., 10:
3655-3659 (1991) se describen procedimientos
similares.
Los dominios variables de anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias
de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión
preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de
inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra,
CH2, y regiones CH3. Se prefiere tener la primera región constante
de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la
unión a cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones.
Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de
inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y
se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para mayores
detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase,
por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzimology,
121: 210 (1986).
Según otra estrategia descrita en WO 96/27011,
se puede diseñar la interfase entre una pareja de moléculas de
anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se
recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase
preferida comprende por lo menos una parte de la región de CH3 de un
dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más
cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfase de la
primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales
mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las "cavidades"
compensatorias de tamaño similar o idéntico a la cadena o cadenas
laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula
de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales grandes
de aminoácidos por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).
Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del
heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como
homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar
como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos
(por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Las
técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por
ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar
utilizando uniones químicas. Brennan et al., Science 229:81
(1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos
intactos se dividen proteolíticamente para generar fragmentos
F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del
agente complejante de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los
ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuro
intermolecular. A continuación, los fragmentos Fab' generados se
convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). A continuación,
uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte al
Fab'-tiol mediante la reducción con
mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro
derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo
biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden
utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de
enzimas.
Los fragmentos Fab' se pueden recuperar
directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar
anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:
217-225 (1992) describen la producción de una
molécula de anticuerpo biespecífico totalmente humanizado
F(ab')_{2}. Cada fragmento de Fab' se secretó de forma
separada de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico
dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico.
Dicho anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de
unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células
T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de
linfocitos citotóxicos humanos contra tumores de mama humana
dianas.
Se han descrito también varias técnicas para
fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos
directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se
han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de
leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):
1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de
leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab'
de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los
homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para
formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los
heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también se puede
utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La
tecnología de "diabody" descrita por Hollinger et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)
ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos
de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio
variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable
de cadena ligera (V_{L}) mediante un enlazador que es demasiado
corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la
misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un
fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios V_{L} y
V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios
de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para
fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la
utilización de dímeros de Fv de cadena única (sFv). Véase Gruber
et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Se consideran los
anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden
preparar anticuerpos triespecíficos. Tun et al., J. Immunol.
147:60 (1991).
Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo se
pueden unir a dos epítopos diferentes en un polipéptido PRO
determinado de la presente invención. Alternativamente, un brazo de
polipéptido anti-PRO se puede combinar con un brazo
que se une a una molécula desencadenante en un leucocito, tal como
una molécula receptor de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o
B7), o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tales como Fc\gammaRI
(CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para centrar
los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el
polipéptido PRO particular. Los anticuerpos biespecíficos también se
pueden utilizar para confinar agentes citotóxicos a células que
expresan un polipéptido PRO particular. Estos anticuerpos poseen un
brazo de unión a PRO y un brazo que se une a un agente citotóxico o
un radionucleido quelante, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro
anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido PRO y
además se une al factor tisular (TF).
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Los anticuerpos heteroconjugados están también
dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos
heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos
covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo,
para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas
[Patente U.S. No. 4.676.980] y para el tratamiento de la infección
por VIH [WO 91/00360: WO 92/300373; EP 03089]. Se considera que los
anticuerpos se pueden preparar in vitro utilizando
procedimientos conocidos en la química sintética de proteínas,
incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo,
las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de
intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace
tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este
objetivo se incluyen el iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimidato y los
descritos, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 4.676.980.
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Se puede desear modificar el anticuerpo de la
presente invención con respecto a la función efectora con el fin de
aumentar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento
del cáncer. Por ejemplo, se pueden introducir un residuo o residuos
de cisteína en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación
de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo
homodimérico generado de esta manera puede mejorar la capacidad de
internalización y/o incrementar la citólisis mediada por el
complemento y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
(ADCC). Véase Caron et al., J. Exp. Med., 176:
1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol.,
148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos
homodiméricos con una actividad anti-tumoral
aumentada también se pueden preparar utilizando reticuladores
heterobifuncionales tal y como se describe en Wolf et al. Cancer
Research, 53: 2560-2565 (1993).
Alternativamente, un anticuerpo se puede diseñar para que tenga
regiones Fc duales y, de esta manera, pueda aumentar la lisis
complementaria y las capacidades de ADCC. Véase, Stevenson et
al., Anti-Cancer Drug Design,
3:219-230 (1989).
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La presente invención también se refiere a
inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente
citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por
ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano,
fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo
radioactivo (es decir, radioconjugados).
Los agentes quimioterapéuticos útiles para la
generación de dichos inmunoconjugados se han descrito
anteriormente. Entre las toxinas enzimáticamente activas y
fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la
cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de la toxina
de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas
aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de
modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites
fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca
americana (PAPI, PAPII, y PAPS), inhibidor de momordica
charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis,
gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los
tricotecenos. Hay un conjunto de radionucleidos disponibles para la
producción de anticuerpos radioconjugados. Algunos ejemplos son
^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente
citotóxico se fabrican utilizando un conjunto de agentes
bifuncionales acopladores de proteínas, tales como
N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato
(SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres
(tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como
disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído),
compuestos bis-azido (tales como
bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina),
derivados de bis-diazonio (tales como
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina),
diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato)
y compuesto de flúor bis-activos (tales como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y como
se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El
ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietilen
triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono
14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de
radionucleidos al anticuerpo. Ver WO94/11026.
En otra realización, el anticuerpo se puede
conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la
utilización en el premarcado de tumores en los que el conjugado
anticuerpo-receptor se administra al paciente,
seguido de la eliminación de conjugado no enlazado de la circulación
utilizando un agente clarificador y, a continuación, la
administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se
conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleido).
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Los anticuerpos descritos en la presente
invención también se pueden formular como inmunoliposomas. Los
liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante
procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en
Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688
(1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77:
4030 (1980); y las Patentes U.S. Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Los
liposomas con un mayor tiempo de circulación se describen en la
Patente U.S. No. 5.013.556.
Se pueden generar liposomas particularmente
útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con
una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol,
y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE).
Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro
definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los
fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden
conjugar a los liposomas tal y como se describen en Martin et
al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)
mediante una reacción de intercambio de enlaces disulfuro.
Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico (tal
como Doxorubicina). Véase Gabizon et al., J. Nacional Cancer
Inst., 81(19): 1484 (1989).
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Los anticuerpos que se unen específicamente a un
polipéptido PRO identificado en la presente invención, así como
otras moléculas identificadas por los ensayos de cribado descritos
anteriormente en la presente invención, se pueden administrar para
el tratamiento de varios trastornos en forma de composiciones
farmacéuticas.
Si el polipéptido PRO es intracelular y los
anticuerpos completos se utilizan como inhibidores, se prefieren
anticuerpos de internalización. Sin embargo, se pueden utilizar
también lipofecciones o liposomas para liberar el anticuerpo, o un
fragmento de anticuerpo, en las células. Cuando se utilizan
fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más
pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la
proteína diana. Por ejemplo, en base a las secuencias de región
variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas de péptidos
que mantienen la capacidad de unirse a la secuencia de la proteína
diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o
producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, por
ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90: 7889-7893 (1993). La formulación de la
presente invención también puede contener más de un compuesto
activo según sea necesario para la enfermedad particular en
tratamiento, preferiblemente aquéllos con actividades
complementarias que no afectan de forma adversa entre sí.
Alternativamente o adicionalmente, la composición puede comprender
un agente que potencia su función, tal como, por ejemplo, un agente
citotóxico, una citoquina, un agente quimioterapéutico o un agente
inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de
forma adecuada combinadas en cantidades que son eficaces para el
objetivo deseado.
Los principios activos también se pueden
introducir en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización por interfase,
por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen
en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Las formulaciones a utilizar en la
administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue
fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación
controlada. Entre algunos ejemplos de preparaciones de liberación
controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros
hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices
están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o
microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación
controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
o poli(vinilalcohol), poliláctidos (Patente U.S. No.
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
copolímero de etileno-acetato de vinilo no
degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico
degradables, tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas
inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido
glicólico y acetato de leuprolida), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que polímeros, tales como etileno-acetato
de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de
moléculas durante aproximadamente 100 días, ciertos hidrogeles
liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los
anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo
largo de tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado
de la exposición a humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de
actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se
pueden idear estrategias razonables para la estabilización
dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que
el mecanismo de agregación es la formación de enlaces
S-S intermoleculares a través del intercambio
tio-disulfuro, la estabilización se puede conseguir
mediante la modificación de residuos sulfhidrilo, la liofilización
de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, la
utilización apropiada de aditivos, y el desarrollo de composiciones
de matrices de polímero específicas.
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Los anticuerpos anti-PRO de la
presente invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, los
anticuerpos anti-PRO se pueden utilizar en ensayos
de diagnóstico para PRO, por ejemplo, detectando su expresión (y en
algunos casos, la expresión diferencial) en células específicas,
tejidos específicos o suero. Se pueden utilizar varias técnicas de
ensayo de diagnóstico conocidas en el sector, tales como ensayos de
unión competitiva, ensayos de sándwich directo o indirecto y
ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u
homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of
Techniques, CRC PRess, Inc. (1987) páginas
147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos
de diagnóstico se pueden marcar con un grupo detectable. El grupo
detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente,
una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un
radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o
^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como
isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina, o una
enzima, tal como fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante.
Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en la técnica
para conjugar el anticuerpo al grupo detectable, incluyendo
aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature,
144: 945 (1962); David et al., Biochemistry,
13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth.,
40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem.,
30: 407 (1982).
Los anticuerpos anti-PRO también
son útiles para la purificación por afinidad de PRO de un cultivo
de células recombinantes o de origen natural. En este proceso, los
anticuerpos contra PRO se inmovilizan sobre un soporte adecuado,
tal como una resina Sephadex o papel de filtro, utilizando
procedimientos conocidos en la técnica. A continuación, el
anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que
contiene el PRO a purificar, y posteriormente se lava el soporte
con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el
material en la muestra a excepción del PRO, que está unido al
anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro
disolvente adecuado que liberará el PRO del anticuerpo.
Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con
objetivos ilustrativos, y no pretenden limitar de ningún modo el
alcance de la presente invención.
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Los reactivos disponibles comercialmente a los
que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con
las instrucciones del fabricante a menos de que se indique lo
contrario. El origen de las células identificadas en los siguientes
ejemplos, y a lo largo del documento, por los números de acceso de
la ATCC pertenece a la American Type Culture Collection, Manassas,
VA.
Se utilizaron las secuencias del dominio
extracelular (ECD) (incluyendo la secuencia señal de secreción, si
la hay) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de la
base de datos pública Swiss-Prot para buscar bases
de datos de EST. Las bases de datos de EST incluían bases de datos
públicas (por ejemplo, Dayhoff, GenBank), y bases de datos privadas
(por ejemplo, LIFESEQ^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto,
CA). La búsqueda se realizó utilizando el programa informático
BLAST o BLAST-2 (Altschul et al., Methods in
Enzymology 266: 460-480 (1996)) como comparación de
las secuencias de proteína de ECD con una traducción de 6 marcos de
las secuencias de EST. Las comparaciones con una valoración BLAST de
70 (o en algunos casos de 90) o superior que no codificaban
proteínas conocidas se agruparon y ensamblaron en secuencias de ADN
de consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of
Washington, Seattle, WA).
Utilizando este cribado por homología del
dominio extracelular, se ensamblaron secuencias de ADN de consenso
en relación con las otras secuencias EST identificadas utilizando
phrap. Además, las secuencias de ADN de consenso obtenidas se
extendieron a menudo (pero no siempre) utilizando ciclos repetidos
de BLAST o BLAST-2 y phrap para extender la
secuencia de consenso lo máximo posible utilizando las fuentes de
secuencias de EST descritas anteriormente.
En base a las secuencias de consenso obtenidas
tal como se ha descrito anteriormente, se sintetizaron a
continuación oligonucleótidos y se utilizaron para identificar
mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de
interés y para su uso como sondas para aislar un clon de secuencia
codificante de longitud completa para un polipéptido PRO. Los
cebadores PCR directo e inverso varían generalmente de 20 a 30
nucleótidos y a menudo se diseñan para producir un producto PCR de
aproximadamente 100-1000 pb de longitud. Las
secuencias de las sondas tienen habitualmente 40-55
pb de longitud. En algunos casos, se sintetizan oligonucleótidos
adicionales cuando la secuencia de consenso es superior a
aproximadamente 1-1,5 pb. Con el fin de cribar
varias bibliotecas por un clon de longitud completa, se cribó ADN de
las bibliotecas mediante amplificación por PCR, como por Ausubel
et al., Current Protocols in Molecular Biology, con la pareja
de cebadores PCR.
Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar
los clones de ADNc se construyeron mediante métodos estándar
utilizando reactivos disponibles comercialmente, tales como los de
Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligo dT que
contenía un sitio NotI, se unió por el extremo romo a adaptadores
SalI hemiquinasa, se dividió con NotI, se separó por tamaño de
forma apropiada mediante electroforesis en gel, y se clonó en una
orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como
pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el
sitio SfiI; véase, Holmes et al., Science, 253:
1278-1280 (1991)) en los sitios XhoI y NotI
únicos.
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Se aisló ARNm de un tejido humano de interés
utilizando reactivos y protocolos de Invitrogen, San Diego, CA
(Fast Track 2). Se utilizó este ARN para generar una biblioteca de
ADNc cebado con oligo dT en el vector pRK5D utilizando reactivos y
protocolos de Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script
Plasmid System). En este procedimiento, se separó por tamaño el
ADNc de doble cadena con más de 1000 pb y se clonó el ADNc unido
por SalI/NotI en el vector dividido por XhoI/NotI. pRK5D es un
vector de clonación que tiene un sitio de inicio de la
transcripción sp6 seguido de un sitio para enzima de restricción
SfiI que precede a los sitios de clonación de ADNc XhoI/NotI.
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Se generó una biblioteca de ADNc secundaria con
el fin de representar preferencialmente los extremos 5' de los
clones de ADNc primario. El ARN de sp6 se generó a partir de la
biblioteca primaria (descrita anteriormente) y se utilizó este ARN
para generar una biblioteca de ADNc cebada aleatoriamente en el
vector pSST-AMY.0 utilizando los reactivos y
protocolos de Life Technologies (Super Script Plasmid System,
referenciada anteriormente). En este procedimiento, el ADNc de
doble cadena se separó en 500-1000 pb, se unió por
extremos romos a adaptadores NotI, se dividieron con SfiI y se
clonaron en el vector dividido por SfiI/NotI.
pSST-AMY.0 es un vector de clonación que tiene un
promotor de alcohol deshidrogenasa de levadura que precede a los
sitios de clonación de ADNc y la secuencia de amilasa de ratón (la
secuencia madura sin la señal de secreción) (seguido por el
terminador de la alcohol deshidrogenasa de levadura), después de los
sitios de clonación. De este modo, los ADNc clonados en este vector
que se fusionan en el marco de lectura con la secuencia de amilasa
conducirán a la secreción de amilasa a partir de colonias de
levadura transfectadas apropiadamente.
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El ADN de la biblioteca descrita en el párrafo 2
anterior se enfrió en hielo al que se añadió bacterias DH10B
electrocompetentes (Life Technologies, 20 ml). A continuación, la
mezcla de bacterias y vectores se electroporó según se recomienda
por el fabricante. Posteriormente, se añadió medio SOC (Life
Technologies, 1 ml) y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30
minutos. A continuación, los transformantes se emplacaron en 20
placas estándar de 150 mm de LB que contenían ampicilina y se
incubaron durante 16 horas (37ºC). Se rascaron de las placas las
colonias positivas y se aisló el ADN del residuo bacteriano
utilizando protocolos estándar, por ejemplo, gradiente de CsCl. A
continuación, el ADN purificado siguió los protocolos siguientes con
la levadura.
Los métodos con la levadura se dividieron en
tres categorías. (1) Transformación de levadura con el vector
combinado plásmido/ADNc: (2) detección y aislamiento de los clones
de levadura que secretan amilasa; y (3) amplificación por PCR del
iserto directamente de las colonias de levaduras y purificación del
ADN para la secuenciación y posterior análisis.
La cepa de levadura utilizada fue
HD56-5A (ATCC-90785). Esta cepa
tiene el siguiente genotipo: MAT alfa, ura3-52,
leu2-3, leu2-112,
his3-11, his3-15, MAL+, SUC+, GAL+.
Preferiblemente, se pueden utilizar mutantes de levadura que
presentan mecanismos post-traduccionales
deficientes. Dichos mutantes pueden tener alelos deficientes en la
translocación en sec71, sec72, sec62, siendo el más preferido sec71
truncado. Alternativamente, se pueden utilizar preferiblemente en
combinación con la levadura que expresa amilasa antagonistas
(incluyendo nucleótidos antisentido y/o ligandos) que interfieren
con la acción normal de estos genes, otras proteínas implicadas en
este mecanismo post-traduccional (por ejemplo,
SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p o SSA1p-4p) o
la formación de complejos de estas proteínas.
La transformación se realiza en base al
protocolo descrito por Gietz et al., Nucl. Acid. Res., 20:
1425 (1992). Las células transformadas se inocularon a continuación
de agar en el caldo del medio complejo YEPD (100 ml) y se
desarrollaron durante toda la noche a 30ºC. El caldo de YEPD se
preparó tal como se describe en Kaiser et al., Methods in
Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p.
207 (1994). A continuación, el cultivo de toda la noche se diluyó
hasta aproximadamente 2 x 10^{6} células/ml (aproximadamente
DO600 = 0,1) en caldo YEPD nuevo (500 ml) y se volvieron a
desarrollar hasta 1 x 10^{7} células/mol (aproximadamente DO600
=0,4-0,5).
A continuación, se recogieron las células y se
prepararon para la transformación mediante la transferencia en
botellas con rotor GS3 a 5.000 rpm durante 5 minutos, se descartó el
sobrenadante y a continuación se resuspendió en agua estéril, y se
centrifugó de nuevo en tubos falcon de 50 ml a 3.500 rpm en una
centrífuga Beckman GS-6KR. Se descartó el
sobrenadante y las células se lavaron posteriormente con LiAc/TE (10
ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5, 100 mM
Li_{2}OOCCH_{3}), y se resuspendieron en LiAc/TE (2,5 ml).
La transformación tuvo lugar mezclando las
células preparadas (100 \mul) con ADN de testículos de salmón
monocatenario desnaturalizado (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) y
ADN transformante (1 \mug, vol. < 10 \mul) en tubos de
microcentrífuga. La mezcla se mezcló brevemente mediante
cetrifugación, a continuación se añadió PEG/TE al 40% (600 \mul,
polietilenglicol-4000 al 40%, 10 mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li_{2}OOCCH_{3}, pH
7,5). Esta mezcla se agitó suavemente y se incubó a 30ºC agitando
durante 30 minutos. A continuación, las células se sometieron a
choque térmico a 42ºC durante 15 minutos, y se centrifugó el
recipiente de reacción en una microcentrífuga a 12.000 rpm durante
5-10 segundos, se decantó y se resuspendió en TE
(500 \mul, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5)
seguido de recentrifugación. A continuación, las células se
diluyeron en TE (1 ml) y se extendieron las alícuotas (200 \mul)
en el medio selectivo preparado previamente en placas de
crecimiento de 150 mm (VWR).
Alternativamente, en lugar de múltiples
reacciones pequeñas, se realizó la transformación utilizando una
única reacción a gran escala, donde las cantidades de reacción se
escalaron según corresponda.
El medio selectivo utilizado fue agar dextrosa
completo sintético que carecía de uracilo (SCD-Ura)
preparado en Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p.
208-210 (1994). Los transformantes se desarrollaron
a 30ºC durante 2-3 días.
La detección de colonias que secretan amilasa se
realizó mediante la inclusión de almidón rojo en el medio de
crecimiento selectivo. El almidón se acopló a colorante rojo
(Reactive Red-120, Sigma) como en el procedimiento
descrito por Biely et al., Anal. Biochem., 172:
176-179 (1988). El almidón acoplado se incorporó en
las placas de agar SCD-Ura a una concentración final
de 0,15% (p/v), y se tamponó con fosfato de potasio hasta un pH de
7,0 (50-100 mM de concentración final).
Se recogieron las colonias positivas y se
rayaron en un medio selectivo nuevo (sobre placas de 150 mm) con el
fin de obtener colonias individuales bien aisladas e identificables.
Se detectaron colonias individuales bien aisladas positivas para la
secreción de amilasa mediante la incorporación directa de almidón
rojo en agar SCD-Ura tamponado. Se determinaron las
colonias positivas por su capacidad de romper el almidón dando
lugar a un halo claro alrededor de la colonia positiva visualizada
directamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se aisló una colonia positivo, se recogió
una parte de la misma con un palillo y se diluyó en agua estéril
(30 \mul) en una placa de 96 pocillos. En este momento, las
colonias positivas se congelaron y se guardaron para el posterior
análisis o se amplificaron inmediatamente. Se utilizó una alícuota
de células (5 \mul) como molde para la reacción PCR en un volumen
de 25 \mul que contenía: 0,5 \mul Klentaq (Clontech, Palo Alto,
CA); 4,0 \mul 10 mM dNTPs (Perkin Elmer-Cetus);
2,5 \mul tampón Kentaq (Clontech); 0,25 \mul oligo directo 1;
0,25 \mul oligo inverso 2; 12,5 \mul de agua destilada. La
secuencia de oligonucleótido directo 1 era:
\vskip1.000000\baselineskip
| 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' | (SEC ID NO: 169) |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de oligonucleótido inverso 2
era:
\vskip1.000000\baselineskip
| 5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3' | (SEC ID NO: 70) |
\newpage
A continuación se realiza la PCR de la siguiente
manera:
\vskip1.000000\baselineskip
Las regiones subrayadas de los oligonucleótidos
se hibridaron a la región de promotor de ADH y la región amilasa,
respectivamente, y se amplificó una región de 307 pb del vector
pSST-AMY.0 cuando no había inserto presente.
Habitualmente, los primeros 18 nucleótidos del extremo 5' de estos
oligonucleótidos contenían sitios de hibridación para los cebadores
de secuenciación. De este modo, el producto total de la reacción PCR
de un vector vacío tenía 343 pb. Sin embargo, el ADNc fusionado a
la secuencia señal daba lugar a secuencias de nucleótidos
considerablemente más largas.
Después de la PCR, se examinó una alícuota de la
reacción (5 \mul) mediante electroforesis en gel en un gel de
agarosa al 1% utilizando un sistema de tamponación
Tris-Borato-EDTA (TBE) descrito por
Sambrook et al., supra. Los clones que dan lugar a un único
producto PCR fuerte más grande 400 pb se analizaron posteriormente
mediante secuenciación de ADN después de la purificación con una
columna de limpieza de PCR 96 Qiaquick (Qiagen Inc., Chatsworth,
CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificaron varias secuencias de ácido
nucleico que codifican los polipéptidos mediante la aplicación de
un algoritmo privado buscador de secuencias señal desarrollado por
Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) después de ESTs, así como
fragmentos de EST agrupados y ensamblados de bases de datos pública
(por ejemplo, GenBank) y/o privada (LIFESEQ®, Incyte
Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA). El algoritmo de las
secuencias señal computa una valoración de la señal de secreción en
base al carácter de los nucleótidos de ADN que rodean el primer
codón (ATG) de metionina y opcionalmente el segundo codón de
metionina en el extremo 5' de la secuencia o fragmento de secuencia
en consideración. Los nucleótidos después del primer ATG deben
codificar por lo menos 35 aminoácidos inequívocos sin ningún codón
de parada. Si el primer ATG tiene los aminoácidos requeridos, no se
examina el segundo. Si ninguno cumple el requisito, la secuencia
candidata no se valora. Con el fin de determinar si la secuencia
EST contiene una secuencia señal auténtica, el ADN y las
correspondientes secuencias de aminoácidos que rodean el codón ATG
se valoran utilizando un conjunto de siete sensores (parámetros de
evaluación) conocidos por asociarse con señales de secreción. El uso
de este algoritmo dio lugar a la identificación de numerosas
secuencias de ácido nucleico que codificaban los polipéptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando las técnicas descritas en los
ejemplos 1 a 3 anteriores, se identificaron numerosos clones de
ADNc de longitud completa que codifican polipéptidos PRO tal como se
describen aquí. Estos ADNcs se depositaron a continuación bajo las
condiciones del Tratado de Budapest con la American Type Culture
Collection, 10801 University Blvd., Manassas VA
20110-2209. USA (ATCC), tal como se muestra en la
Tabla 7 siguiente:
Estos depósitos se realizaron según lo
estipulado en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento bajo el mismo
(Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo
viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha del
depósito. Los depósitos estarán disponibles mediante la ATCC según
los términos del Tratado de Budapest, y están sujetos a un acuerdo
entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad
permanente y sin restricción de la progenie del cultivo del depósito
al uso público tras la concesión de la respectiva patente
estadounidense o tras abrirse a la inspección pública de cualquier
solicitud de patente estadounidense o extranjera, la que sea
primera, y asegura la disponibilidad de la progenie a la persona
autorizada por el Comisionado de Estados Unidos de Patentes y
Marcas de acuerdo con la norma 35 USC \NAK 122 y las normas del
Comisionado según lo acordado (incluyendo 37 CFR \NAK 1.14 con
particular referencia a 886 OG 638).
El cesionario de la presente solicitud ha
acordado que si un cultivo de los materiales en el depósito muriera
o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones
adecuadas, los materiales serán inmediatamente remplazados en una
notificación por otros iguales. La disponibilidad del material
depositado no se interpreta como una licencia para realizar la
invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad
de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.
El siguiente procedimiento describe el uso de
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO como
sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante
del polipéptido PRO de longitud completa o maduro tal como se
describe en la presente invención se utiliza como sonda para cribar
ADNs homólogos (tales como los que codifican variantes naturales de
PRO) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas
de tejido humano.
La hibridación y el lavado de filtros que
contienen cualquier ADN de biblioteca se realizan según las
siguientes condiciones de elevada astringencia. La hibridación de la
sonda derivada de polipéptido PRO radiomarcada a los filtros se
realiza en una solución al 50% de formamida, 5x SSC, SDS al 0,1%,
pirofosfato de sodio al 0,1%, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6,8, 2x
de solución de Denhardt, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante
20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución
acuosa de 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.
A continuación, se pueden identificar los ADNs
que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que
codifica un polipéptido PRO de secuencia nativa y longitud completa
utilizando las técnicas estándar conocidas en el sector.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de PRO mediante la expresión recombinante en E.
coli.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido
PRO se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR
seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para las
enzimas de restricción que se correspondan con los sitios para
enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Se
puede utilizar una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de
vector adecuado es el pBR322 (derivado del E. coli, véase
Bolivar et. al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para
la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se
digiere con una enzima de restricción y se desfosforila. A
continuación, las secuencias amplificadas por PCR se unen en el
vector. El vector preferiblemente incluirá secuencias que codifican
un gen resistente a un antibiótico, un promotor trp, una secuencia
líder de poli-His (incluyendo los primeros seis
codones STII, secuencia poli-His, y sitio de
división para la enteroquinasa), la región codificante de PRO, el
finalizador transcripcional lambda, y un gen argU.
A continuación, la mezcla de unión se utiliza
para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando
los procedimientos descritos en Sambrook et. al., supra. Los
transformantes se identifican por su capacidad para crecer en
placas de LB y, a continuación, se seleccionan las colonias
resistentes a los antibióticos. El ADN plasmídico se puede aislar y
confirmar mediante el análisis de restricción y la secuenciación
del ADN.
Los clones seleccionados se pueden desarrollar
durante toda la noche en un medio de cultivo líquido tal como el
caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche
se puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a mayor
escala. A continuación, las células se desarrollan hasta una
densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de la
expresión se activa.
Después de cultivar las células durante muchas
más horas, las células se pueden recoger mediante centrifugación.
El residuo de células obtenido mediante la centrifugación se puede
solubilizar utilizando diversos agentes conocidos en la técnica, y
la proteína PRO solubilizada se puede a continuación purificar
utilizando una columna quelante de metal en condiciones que
permiten la unión fuerte de la proteína.
El PRO se puede expresar en E. coli en
una forma etiquetada con poli-His según el
procedimiento siguiente. El ADN que codifica PRO se amplifica
inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los
cebadores contienen sitios para enzimas de restricción que
corresponden con los sitios de enzimas de restricción en el vector
de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que
proporcionan un inicio de traducción eficiente y fiable, una
purificación rápida en una columna quelante de metales y la
eliminación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias
etiquetadas con poli-His amplificadas por PCR se
unen a continuación en un vector de expresión, que se utiliza para
transformar un huésped E. coli basado en la cepa 52 (W3110
fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts)
clpP(laclq). Los transformantes se desarrollan en primer
lugar en LB que contiene carbenicilina 50 mg/ml a 30ºC con
agitación hasta alcanzar una D.O. de 3-5 a 600 nm.
Los cultivos se diluyen entonces 50-100 veces en
medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato
sódico\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de
levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml de agua,
así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO_{4} 7
mM) y se desarrollan durante aproximadamente 20-30
horas a 30ºC con agitación. Se toman muestras para verificar la
expresión mediante análisis de SDS-PAGE, y se
centrifuga todo el cultivo para sedimentar las células. Los
sedimentos celulares se congelan hasta la purificación y
renaturalización.
La pasta de E. coli de fermentaciones de
0,5-1 l (6-10 g de sedimento) se
resuspende en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 M, Tris 20 mM,
tampón pH 8. Se añaden sulfito sódico sólido y tetrationato sódico
hasta concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y
la solución se agita durante toda la noche a 4ºC. Esta etapa da
como resultado una proteína desnaturalizada con todos los residuos
de cisteína bloqueados por la sulfitolización. La solución se
centrifuga a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30
min. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de
tampón de columna quelante de metales (guanidina 6M, Tris 20 mM, pH
7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micras para purificar.
El extracto purificado se carga en una columna quelante de metales
Qiagen de Ni^{2+}-NTA de 5 ml equilibrada en el
tampón de la columna quelante de metal. La columna se lava con
tampón adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, grado
Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con tampón que contiene
imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la proteína deseada
se agrupan y guardan a 4ºC. La concentración de proteína se estima
por su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción
calculado en base a su secuencia de aminoácidos.
Las proteínas se renaturalizan diluyendo la
muestra lentamente en tampón de renaturalización preparado fresco
que consiste en: Tris 20 mM, pH 8,6; NaCl 0,3 M; urea 2,5 M;
cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de
renaturalización se eligen para que la concentración de proteína
final se encuentre entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de
renaturalización se agita suavemente a 4ºC durante
12-36 horas. La reacción de renaturalización se
desactiva mediante la adición de TFA hasta una concentración final
de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de una purificación
adicional de la proteína, la solución se filtra a través de un
filtro de 0,22 micras y se añade acetonitrilo hasta una
concentración final de 2-10%. La proteína
renaturalizada se cromatografía en una columna de fase inversa
Poros R1/H con un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución con un
gradiente de acetonitrilo del 10 al 80%. Se analizan alícuotas de
fracciones con una absorbancia A_{280} en geles de
poliacrilamida-SDS y se agrupan las fracciones que
contienen la proteína renaturalizada homogénea. En general, las
muestras renaturalizadas de manera adecuada de la mayoría de
proteínas se eluyen a las concentraciones más bajas de
acetonitrilo, ya que estas muestras son las más compactas con sus
interiores hidrofóbicos resguardados de la interacción con la
resina de fase inversa. Las muestras agregadas se eluyen normalmente
a concentraciones de acetonitrilo superiores. Además de separar las
formas mal plegadas de las proteínas de la forma deseada, la etapa
de fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen el polipéptido PRO
plegado deseado se agrupan y se elimina el acetonitrilo con una
corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas
se formularon en Hepes 20 mm, pH 6,8 con cloruro sódico 0,14 M y
manitol al 4% mediante diálisis o mediante filtración en gel
utilizando resinas Superfine G25 (Pharmacia) equilibradas en el
tampón de formulación y filtradas de forma estéril.
Muchos de los polipéptidos PRO descritos aquí se
expresaron de manera satisfactoria tal como se ha descrito
anteriormente.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
potencialmente glicosilada de PRO mediante la expresión
recombinante en células de mamíferos.
El vector pRK5 (véase, EP 307.247 publicada el
15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión.
Opcionalmente, el ADN de PRO se une en el pRK5 con enzimas de
restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de PRO
utilizando procedimientos de unión tales como los descritos en
Sambrook et. al., supra. El vector resultante se denomina
pRK5-PRO.
En una realización, las células huésped
seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC
CCL 1573) se desarrollan hasta la confluencia en placas de cultivo
de tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero de
ternera fetal y opcionalmente, componentes nutricionales y/o
antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de
pRK5-[PRO] con aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen
de ARN de VA [Thimmappaya et. al., Cell, 31:543
(1982)] y se disuelve en 500 \mul de 1 mM de
Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCl_{2}. A
esta mezcla se le añade, gota a gota, 500 \mul de 50 mM de HEPES
(pH 7,35), 280 mM de NaCl, 1,5 mM de NaPO_{4}, y se deja formar
un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se
suspende y se añade a las células 293 y se deja reposar durante
aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira
y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A
continuación, las células 293 se lavan con medio sin suero, se
añade medio fresco y las células se incuban durante aproximadamente
5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza por
medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200
\muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de
^{35}S-metionina. Tras una incubación de 12 horas,
se recoge el medio condicionado, se concentra en un filtro de
centrifugación y se carga en un gel SDS al 15%. El gel procesado
puede secarse y exponerse a una película durante un período de
tiempo concreto para revelar la presencia del polipéptido PRO. Los
cultivos que contienen células transfectadas pueden experimentar
una incubación adicional (en medio sin suero) y el medio se examina
en bioensayos concretos.
En una técnica alternativa, se puede introducir
el PRO en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento
del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et. al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 1575 (1981). Las células 293 se
desarrollan hasta la máxima densidad en un matraz giratorio y se
añaden 700 \mug de ADN de pRK5-[PRO]. En primer lugar, las
células se concentran en el matraz giratorio mediante centrifugación
y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano
es incubado en el sedimento celular durante cuatro horas. Las
células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan
con medio de cultivo de tejido, y se reintroducen en el matraz
giratorio que contiene el medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml
de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después
de aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrifuga
y se filtra para eliminar las células y restos celulares. La muestra
que contiene el PRO expresado se puede concentrar a continuación y
purificar mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la
diálisis y/o cromatografía en columna.
En otra realización, puede expresarse PRO en
células CHO. El vector pRK5-[PRO] puede transfectarse en células
CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o
DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito
anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio
puede sustituirse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene
un radiomarcador, tal como ^{35}S-metionina.
Después de determinar la presencia del polipéptido PRO, el medio de
cultivo puede sustituirse por medio sin suero. Preferiblemente, los
cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y, a
continuación, se recoge el medio condicionado. A continuación, el
medio que contiene el PRO expresado puede concentrarse y purificarse
mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El PRO etiquetado con epítopo puede expresarse
también en células CHO huéspedes. El PRO puede subclonarse fuera
del vector pRK5. El inserto del subclón puede someterse a PCR para
fusionarse en el marco con una etiqueta epítopo seleccionada, tal
como una etiqueta de poli-His en un vector de
expresión de Baculovirus. El inserto de PRO etiquetado con
poli-His puede subclonarse a continuación en un
vector dirigido por SV40 que contiene un marcador de selección, tal
como DHFR, para seleccionar clones estables. Finalmente, las células
CHO pueden transfectarse (tal como se ha descrito anteriormente)
con el vector dirigido por SV40. El marcaje puede realizarse, tal
como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El
medio de cultivo que contiene el PRO etiquetado con
poli-His expresado puede a continuación concentrarse
y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal
como mediante cromatografía de afinidad de quelato con
Ni^{2+}.
PRO se puede expresar en células CHO y/o COS
mediante un procedimiento de expresión transitoria o en células CHO
mediante otro procedimiento de expresión estable.
La expresión estable en células CHO se realiza
utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan
como una construcción de IgG (inmunoadhesina), en la que las
secuencias codificantes para las formas solubles (por ejemplo,
dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a
una secuencia de región constante de IgG1 que contiene la bisagra,
CH2 y dominios CH2 y/o es una forma etiquetada con
poli-His.
Tras la amplificación por PCR, los ADNs
respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO utilizando
técnicas estándar descritas en Ausubel et. al., Current
Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and
Sons (1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para
tener sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés
para permitir el traslado adecuado de los de ADNc. El vector
utilizado para la expresión en las células CHO es tal y como se
describe en Lucas et. al., Nucl. Acid Res. 24:9
(1774-1779 (1996), y utiliza el
promotor/potenciador temprano de SV40 para dirigir la expresión del
ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión
de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del
plásmido tras la transfección.
Se introducen doce microgramos del ADN
plasmídico deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO
utilizando reactivos de transfección Superfect® (Quiagen), Dosper® o
Fugene® (Boehringer Mannheim) disponibles comercialmente. Las
células se desarrollan tal y como se describe en Lucas et. al.,
supra. Se congelan aproximadamente 3 x 10^{7} células en una
ampolla para el crecimiento y producción posterior tal y como se
describe a continuación.
Las ampollas que contienen el ADN plasmídico se
descongelan mediante la colocación en un baño de agua y se mezclan
mediante agitación. El contenido se pipetea en un tubo de centrífuga
que contiene 10 mL de medio y se centrifuga a 1000 rpm durante 5
minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en
10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 \mum con suero
bovino fetal al 5% dialfiltrado a 0,2 \mum). A continuación, las
células se fraccionan en un agitador de 100 mL que contiene 90 mL de
medio selectivo. Después de 1-2 días, las células
se transfieren a un agitador de 250 mL lleno con 150 mL de medio de
crecimiento selectivo y se incuban a 37ºC. Después de otros
2-3 días, se siembran 3 x 10^{5} células/mL en
agitadores de 250 mL, 500 mL y 2000 mL. El medio celular se cambia
por medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en el medio
de producción. Aunque se puede utilizar cualquier medio de CHO
adecuado, en realidad se utiliza un medio de producción descrito en
la patente de Estados Unidos No. 5.122.469, concedida el 16 de junio
de 1992. En un agitador de producción de 3L se siembra a razón de
1,2 x 10^{6} células/ml. En el día 0, se determina el número de
células y el pH. En el día 1, se toman muestras del agitador y se
inicia el burbujeo con aire filtrado. En el día 2, se toman
muestras del agitador, la temperatura se cambia a 33ºC, y se añaden
30 mL de glucosa 500 g/L y 0,6 mL de antiespuma al 10% (por ejemplo
35% de emulsión de polidimetilsiloxano, Dow Corning 365 Medical
Grade Emulsion). Durante toda la producción, el pH se ajusta según
la necesidad manteniéndose en valores alrededor de 7,2. Después de
10 días, o hasta que la viabilidad cae por debajo del 70%, el
cultivo celular se recoge mediante centrifugación y se filtra a
través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se guarda a 4ºC o
se carga inmediatamente en columnas para la purificación.
Para las construcciones etiquetadas de
poli-his, las proteínas se purifican utilizando una
columna de Ni^{2+}-NTA (Qiagen). Antes de la
purificación, se añade imidazol al medio condicionado hasta una
concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombea en una
columna de 6 ml de Ni^{2+}-NTA equilibrada en 20
mM Hepes, pH 7,4, tampón que contiene 0,3 M de NaCl y 5 mM de
imidazol a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min. a
4ºC. Tras cargarse, la columna se lava con un tampón de equilibrio
adicional y la proteína se eluye con tampón de equilibrio que
contiene 0,25 M de imidazol. La proteína altamente purificada se
desala posteriormente en un tampón de almacenamiento que contiene
10 mM Hepes, 0,14 M de NaCl y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna
G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se guarda a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contiene Fc) se purifican a partir del medio acondicionado tal y
como se indica a continuación. El medio acondicionado se bombea en
una columna de Proteína A (Pharmacia) de 5 ml que había sido
equilibrada en un tampón de 20 mM de fosfato sódico, pH 6,8. Después
de cargarse, la columna se lava ampliamente con tampón de
equilibrio antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La
proteína eluída se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones
de 1 ml en tubos que contienen 275 \muL de tampón Tris 1M, pH 9.
La proteína altamente purificada se desala posteriormente en un
tampón de almacenamiento, tal como el descrito anteriormente para
las proteínas etiquetadas con poli-his. La
homogeneidad se calcula mediante geles de poliacrilamida SDS y
mediante la secuenciación de los aminoácidos
N-terminales mediante degradación Edman.
Muchos de los polipéptidos PRO descritos aquí se
expresaron de manera satisfactoria tal como se ha descrito
anteriormente.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de PRO en levadura.
En primer lugar, los vectores de expresión de
levadura se construyen para la producción o secreción intracelular
de PRO a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica PRO y
el promotor se insertan en los sitios para enzimas de restricción
adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión
intracelular de PRO. Para la secreción, el ADN que codifica PRO
puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que
codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal PRO nativo u otro
péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, una secuencia
señal/líder secretora del factor alfa o invertasa de levadura, y
secuencias enlazadoras (si se necesitan) para la expresión de
PRO.
Las células de levadura, tales como la cepa
AB110 de la levadura, pueden a continuación transformarse con los
plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en
medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura
transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido
tricloroacético al 10% y una separación mediante
SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con
azul de Coomassie.
El PRO recombinante puede aislarse
posteriormente y purificarse mediante la extracción de las células
de levadura del medio de fermentación por centrifugación y, a
continuación, la concentración del medio utilizando filtros de
cartucho específicos. El concentrado que contiene PRO puede
purificarse adicionalmente utilizando resinas de cromatografía en
columna seleccionadas.
Muchos de los polipéptidos PRO descritos aquí se
expresaron de manera satisfactoria tal como se ha descrito
anteriormente.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de PRO en células de insectos infectadas de
Baculovirus.
La secuencia que codifica para PRO se fusiona en
dirección 5' de un epítopo etiqueta contenido en un vector de
expresión de baculovirus. Dichas epítopo etiquetas incluyen
etiquetas de poli-His y etiquetas de
inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Pueden utilizarse una
variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de los
plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen).
Brevemente, la secuencia que codifica PRO o la parte deseada de la
secuencia codificante de PRO, tal como la secuencia que codifica el
dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia
que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular, se
amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones
5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios para enzimas de
restricción flanqueantes (seleccionados). El producto se digiere a
continuación con estas enzimas de restricción seleccionadas y se
subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus
BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera
frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina
(disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de
4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados
se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La
infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal y
como se describe en O'Reilley et. al., Baculovirus expression
vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press
(1994).
A continuación, los PRO etiquetados con
poli-His expresados pueden purificarse, por ejemplo,
mediante cromatografía de afinidad de
Ni^{2+}-quelato tal y como se indica a
continuación. Los extractos se preparan a partir de las células
recombinantes Sf9 infectadas del virus tal y como se ha descrito por
Rupert et. al., Nature, 362: 175-179
(1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en el
tampón de sonicación (25 ml de HEPES, pH 7,9; 12,5 mM de
MgCl_{2}; 0,1 mM de EDTA; glicerol al 10%; NP-40
al 0,1%; 0,4 M de KCl), y se sonican dos veces durante 20 segundos
en hielo. Los sonicados se depuran por centrifugación, y el
sobrenadante se diluye 50 veces en el tampón de carga (50 mM de
fosfato, 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a
través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de
agarosa Ni^{2+}-NTA (comercialmente disponible de
Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y
se equilibra con 25 ml del tampón de carga. El extracto celular
filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se
lava hasta la línea base a A_{280} con el tampón de carga, en cuyo
punto se inicia la recogida de la fracción. A continuación, la
columna se lava con un tampón de lavado secundario (50 mM fosfato;
300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye la proteína no
unida específicamente. Después de alcanzar la línea base a A_{280}
de nuevo, la columna se desarrolla con un gradiente de 0 a 500 mM
de imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen
fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE
y tinción con plata o transferencia Western con
Ni^{2+}-NTA-conjugado a fosfatasa
alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el PRO etiquetado
con His_{10} eluído se agrupan y se dializan contra el tampón de
carga.
Alternativamente, la purificación del PRO
etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse usando técnicas de
cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía en
columna con Proteína A o proteína G.
Muchos de los polipéptidos PRO descritos aquí se
expresaron de manera satisfactoria tal como se ha descrito
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a
PRO.
Las técnicas para producir los anticuerpos
monoclonales son conocidas en el sector y están descritas, por
ejemplo, en Coding, supra. Entre los inmunógenos que se
pueden utilizar se incluyen PRO purificado, proteínas de fusión que
contienen PRO y células que expresan PRO recombinante en la
superficie celular. La selección del inmunógeno puede realizarse
según el técnico en la materia sin una gran experimentación.
Los ratones, tal como Balb/c, se inmunizan con
el inmunógeno de PRO emulsionado en adyuvante completo de Freund y
se inyecta subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de
1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno
se emulsiona en el adyuvante de MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las bases de
las patas traseras del animal. A continuación, los ratones
inmunizados se refuerzan 10 a 12 días después con inmunógeno
adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A continuación,
durante diversas semanas, los ratones también se pueden reforzar
con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras de suero
se pueden obtener periódicamente de los ratones mediante muestras de
sangre retro-orbitales para ser analizadas en
ensayos ELISA para detectar anticuerpos
anti-PRO.
Después de detectar un título de anticuerpo
adecuado, a los animales "positivos" para anticuerpos se les
puede inyectar una inyección intravenosa final de PRO. De tres a
cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se recogen las
células del bazo. A continuación, las células del bazo se fusionan
(usando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma
murino seleccionado, tal como la P3X63AgU.1, disponible de ATCC, No.
CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que se pueden
colocar a continuación en placas de cultivo de tejido de 96
pocillos que contienen un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y
timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas,
híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.
Las células de hibridomas se cribarán en un
ELISA para la reactividad contra PRO. La determinación de células
de hibridomas "positivas" que secretan los anticuerpos
monoclonales deseados contra PRO está dentro de la técnica.
Las células de hibridomas positivas se pueden
inyectar intraperitonealmente en ratones singeneicos Balb/c para
producir fluidos ascíticos que contienen los anticuerpos
monoclonales anti-PRO. Alternativamente, las
células de hibridomas pueden desarrollarse en matraces o en botellas
en rodillo de cultivos de tejidos. La purificación de los
anticuerpos monoclonales producidos en los fluidos ascíticos se
puede realizar usando precipitación con sulfato de amonio, seguido
por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede
usarse la cromatografía por afinidad basada en la unión del
anticuerpo a la proteína A o la proteína G.
Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes se
pueden purificar mediante una variedad de técnicas estándar en las
técnicas de purificación de proteína. Por ejemplo, se purifica el
polipéptido pro-PRO, el polipéptido PRO maduro, o
el polipéptido pre-PRO mediante cromatografía de
inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido
PRO de interés. En general, se construye una columna de
inmunoafinidad por acoplamientos covalentes de anticuerpos
anti-polipéptido PRO a una resina de cromatografía
activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir de sueros inmunes mediante precipitación con sulfato de
amonio o mediante purificación en la Proteína A inmovilizada
(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J). Así mismo, los
anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fluido ascítico de
ratón mediante la precipitación con sulfato de amonio o
cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina
parcialmente purificada se une covalentemente a una resina
cromatográfica, tal como la SEPHAROSE^{TM} activada con CnBr
(Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina,
la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la
purificación del polipéptido PRO mediante la preparación de una
fracción a partir de células que contienen polipéptido PRO en una
forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilización de
toda la célula o de una fracción subcelular obtenida mediante
centrifugación diferencial por adición de detergente o mediante
otros procedimientos conocidos en la técnica. Alternativamente, el
polipéptido PRO soluble que contiene una secuencia señal podría
secretarse en una cantidad útil en el medio en el que las células
crecen.
Una preparación que contiene polipéptido PRO
soluble se pasa por la columna de inmunoafinidad, y la columna se
lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial del
polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en
presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en
condiciones que interrumpen la unión anticuerpo/polipéptido PRO
(por ejemplo, un tampón de pH bajo, tal como aproximadamente un pH
de 2-3, o una alta concentración de caótropo, tal
como urea o ión tiocianato), y se recoge el polipéptido PRO.
La presente invención es particularmente útil
para cribar compuestos mediante la utilización de polipéptidos PRO
o fragmentos de unión de los mismos en cualquiera de un conjunto de
técnicas de cribado de fármacos. El polipéptido PRO o el fragmento
utilizado en dicha prueba puede estar libre en solución, fijado a un
soporte sólido, adsorbido en una superficie celular o situado
intracelularmente. Un procedimiento de cribado de fármacos utiliza
células huésped eucariotas o procariotas, las cuales se transforman
de forma estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el
polipéptido PRO o un fragmento. Los fármacos se criban contra dichas
células transformadas en ensayos de unión competitiva. Dichas
células, tanto en forma viable como fija, se pueden utilizar para
ensayos de unión estándar. Se puede medir, por ejemplo, la formación
de complejos entre el polipéptido PRO o un fragmento y el agente
que se está probando. Alternativamente, se puede examinar la
disminución en la formación del complejo entre el polipéptido PRO y
su célula diana o receptores diana causado por el agente que se
está probando.
De este modo, la presente invención proporciona
procedimientos de cribado para fármacos o cualquier otro agente que
pueda afectar una enfermedad o un trastorno asociados al polipéptido
PRO. Estos procedimientos comprenden poner en contacto dicho agente
con un polipéptido PRO o fragmento del mismo y el ensayo (I) de la
presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido PRO o un
fragmento, o (II) de la presencia de un complejo entre el
polipéptido PRO o un fragmento y la célula, mediante procedimientos
bien conocidos en la técnica. En dichos ensayos de unión
competitiva, el polipéptido PRO o un fragmento están normalmente
marcados. Después de una incubación adecuada, el polipéptido PRO o
un fragmento libres se separan de la forma unida, y la cantidad de
marcador libre o no complejado es una medida de la capacidad del
agente concreto para unirse al polipéptido PRO o para interferir en
el complejo polipéptido PRO/célula.
Otra técnica para el cribado de fármacos
proporciona un cribado de alto rendimiento de compuestos que tienen
una afinidad de unión adecuada a un polipéptido y se describe en
detalle en WO 84/03564, publicado el 13 de septiembre de 1984.
Brevemente, se sintetizan una gran cantidad de compuestos de
diferentes péptidos pequeños de prueba en un sustrato sólido, tal
como agujas de plástico o alguna otra superficie. Tal y como se
aplica a un polipéptido PRO, las compuestos de péptidos de prueba se
hacen reaccionar con polipéptido PRO y se lavan. Se detecta el
polipéptido PRO unido mediante procedimientos bien conocidos en la
técnica. El polipéptido PRO purificado también puede recubrirse
directamente en placas para utilizar en las técnicas de cribado de
fármacos mencionadas anteriormente. Además, se pueden utilizar
anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e
inmovilizarlo en el soporte sólido.
La presente invención también contempla la
utilización de ensayos de cribado de fármacos competitivos en los
que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a polipéptidos
PRO compiten específicamente con un compuesto de prueba para unirse
a polipéptido PRO o fragmentos del mismo. De esta manera, pueden
utilizarse los anticuerpos para detectar la presencia de cualquier
péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con el
polipéptido PRO.
El objetivo del diseño racional de fármacos es
producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente
activos de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de pequeñas
moléculas con las cuales interaccionan, por ejemplo, agonistas,
antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se puede
utilizar para crear fármacos que son formas más activas o estables
del polipéptido PRO o que potencian o interfieren con la función
del polipéptido PRO in vivo (c.f. Hodgson,
Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).
En una estrategia, la estructura tridimensional
del polipéptido PRO, o de un complejo polipéptido
PRO-inhibidor, se determina mediante cristalografía
de rayos X, mediante modelación por ordenador o, más habitualmente,
mediante una combinación de las dos estrategias. Deben establecerse
la forma y las cargas del polipéptido PRO para elucidar la
estructura y para determinar el sitio o sitios activos de la
molécula. Con menor frecuencia, podría obtenerse la información
útil con respecto a la estructura del polipéptido PRO mediante la
modelación basada en la estructura de proteínas homólogas. En ambos
casos, la información estructural pertinente se utiliza para
diseñar moléculas análogas de tipo polipéptido PRO o para
identificar inhibidores eficaces. Entre los ejemplos útiles de
diseño racional de fármacos se pueden incluir moléculas que han
mejorado la actividad o la estabilidad, tal como se muestra por
Braxton y Wells, Biochemistry, 31:
7796-7801 (1992) o que actúan como inhibidores,
agonistas o antagonistas de péptidos nativos tal y como se muestra
por Athauda et. al., J. Biochem., 113:
742-746 (1993).
También es posible aislar un anticuerpo
específico de diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal
y como se ha descrito anteriormente y, a continuación solucionar su
estructura cristalina. Esta estrategia, en principio, produce un
fármaco inicial en el que puede basarse el diseño de fármacos
posterior. Es posible evitar una cristalografía de toda la proteína
mediante la generación de anticuerpos
anti-idiotípicos (anti-ids) para un
anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como imagen
especular de una imagen especular, el sitio de unión del
anti-ids se espera que sea un análogo del receptor
original. A continuación, el anti-ids podría
utilizarse para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos
producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados
actuarían entonces como el fármaco inicial.
Debido a la presente invención, se pueden
fabricar cantidades suficientes del polipéptido PRO para realizar
estudios analíticos, tales como en cristalografía de
rayos-X. Además, el conocimiento de la secuencia de
aminoácidos del polipéptido PRO proporcionada en la presente
invención proporcionará una guía para los usuarios de técnicas de
modelación por ordenador en lugar de o adicionalmente a la
cristalografía de rayos-X.
Se construyeron sondas de oligonucleótidos a
partir de algunos de las secuencias de nucleótidos que codifican el
polipéptido PRO mostradas en las figuras que se acompañan para su
uso en reacciones de amplificación por PCR cuantitativa. Las sondas
de oligonucleótidos se eligieron para producir un fragmento
amplificado de aproximadamente 200-600 pares de
bases a partir del extremo 3' de su molde asociado en una reacción
de PCR estándar. Las sondas de oligonucleótidos se utilizaron en
reacciones de amplificación por PCR cuantitativa estándar con
bibliotecas de ADNc aislado de diferentes muestras de tejidos humano
normal y tumoral humano y se analizaron mediante electroforesis en
gel de agarosa para obtener una determinación cuantitativa del
nivel de expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido
PRO en los diversos tejidos tumorales y normales analizados. Se
utilizó \beta-actina como control para asegurar
que se utilizaban cantidades equivalentes de ácido nucleico en cada
reacción. La identificación de la expresión diferencial del ácido
nucleico que codifica el polipéptido PRO en uno o más tejidos
tumorales en comparación con uno o más tejidos normales del mismo
tipo de tejido hace que la molécula sea diagnósticamente útil para
la determinación de la presencia o ausencia de tumor en un sujeto
sospechoso de poseer un tumor, así como terapéuticamente como diana
para el tratamiento de un tumor en un sujeto que posee dicho tumor.
Estos ensayos proporcionaron los siguientes resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ensayo, se analizar varios polipéptidos
PRO por la capacidad de unirse a un panel de potenciales moléculas
receptoras o ligandos con el objetivo de identificar las
interacciones receptor/ligando. La identificación de un ligando
para un receptor conocido, un receptor para un ligando conocido o
una pareja nueva de receptor/ligando es útil para un conjunto de
indicaciones, por ejemplo, direccionamiento de moléculas bioactivas
(unidas al ligando o receptor) a una célula conocida por expresar
el receptor o ligando, el uso del receptor o ligando como reactivo
para detectar la presencia del ligando o receptor en una composición
sospechosa de contener a los mismos, donde la composición puede
comprender células sospechosas de expresar el ligando o el receptor,
modulación del crecimiento o de otra actividad biológica o
inmunológica de una célula conocida por expresar o responder al
receptor ligando, modulación de la respuesta inmune de células o
hacia células que expresan el receptor o el ligando, permitiendo la
preparación de agonistas, antagonistas y/o anticuerpos dirigidos
contra el receptor o ligando que modularán el crecimiento o una
actividad biológica o inmunológica de una célula que expresa el
receptor o ligando, y varias indicaciones que serán evidentes para
el experto en la materia.
El ensayo se realiza tal como se indica a
continuación. Se expresa un polipéptido PRO de la presente
invención sospechoso de ser un ligando para un receptor como una
proteína de fusión que contiene el dominio Fc de una IgG humana
(una inmunoadhesina). La unión receptor-ligando se
detecta permitiendo la interacción del polipéptido inmunoadhesina
con células (por ejemplo, células Cos) que expresan los receptores
de polipéptido PRO candidato y la visualización de inmunoadhesina
unida con reactivos fluorescentes dirigidos contra el dominio de
fusión de Fc y el examen por microscopio. Las células que expresan
receptores candidatos se producen mediante transfección
transitoria, en paralelo, de subgrupos definidos de una biblioteca
de vectores de expresión de ADNc que codifican polipéptidos PRO que
pueden actuar como moléculas receptoras. A continuación, las células
se incuban durante 1 hora en presencia de la inmunoadhesina de
polipéptido PRO en análisis para la posible unión del receptor. A
continuación, las células se lavan y se fijan con paraformaldehído.
A continuación, las células se incuban con anticuerpo conjugado a
fluorescente dirigido contra la parte Fc de la inmunoadhesina del
polipéptido PRO (por ejemplo, anticuerpo Fc
anti-humano de cabra conjugado a FITC). A
continuación, las células se lavan de nuevo y se examinan mediante
microscopio. Se evalúa una posible interacción mediante la
presencia de marcaje fluorescente de células transfectadas con ADNc
que codifica un receptor o grupo de receptores de polipéptido PRO
particular y la ausencia de marcaje fluorescente similar de células
preparadas de forma similar que se han transfectado con otros ADNc
o grupos de ADNc. Si se evalúa como positivo un grupo definido de
vectores de expresión de ADNc por la interacción con una
inmunoadhesina de polipéptido PRO, las muestras de ADNc
individuales que comprenden el grupo se analizan individualmente (el
grupo se "rompe") para determinar el ADNc específico que
codifica un receptor capaz de interaccionar con la inmunoadhesina
del polipéptido PRO.
En otra realización de este ensayo, se deja
interaccionar un potencial polipéptido PRO ligando etiquetado con
epítopo (por ejemplo con una etiqueta de 8 histidinas "His")
con un panel de potenciales moléculas de polipéptido PRO receptoras
que se han expresado como fusiones con el dominio Fc de IgG humana
(inmunoadhesinas). Después de 1 hora de coincubación con el
polipéptido PRO etiquetado con epítopo, los receptores candidatos
se inmunoprecipitan cada uno con partículas de proteína A y las
partículas se lavan. La potencial interacción con el ligando se
determina mediante análisis de transferencia western de los
complejos inmunoprecipitados con anticuerpo dirigido hacia el
epítopo etiqueta. Se valora que tiene lugar una interacción si se
observa una banda del peso molecular anticipado de la proteína
etiquetada con epítopo en el análisis de transferencia western con
un receptor candidato, pero no se observa que ocurra con los otros
miembros del panel de receptores potenciales.
Utilizando estos ensayos, se han identificado
aquí las siguientes interacciones receptor/ligando:
- (1)
- PRO10272 se une a PRO5801.
- (2)
- PRO20110 se une al receptor IL-17 humano (Yao et al., Cytokine 9 (11): 794-800 (1997); también designado aquí como PRO1) y a PRO20040.
- (3)
- PRO10096 se une a PRO20233.
- (4)
- PRO19670 se une a PRO1890.
\newpage
Se considera que la memoria escrita anterior es
suficiente para permitir a un experto en la materia realizar la
presente invención. La presente invención no está limitada por la
construcción depositada, ya que la realización depositada pretende
ser una única ilustración de ciertos aspectos de la invención y
cualquier construcción que sea funcionalmente equivalente se
encuentra en el alcance de la presente invención. El depósito del
material de la presente invención no constituye una admisión de que
la descripción aquí contenida sea inadecuada para permitir la
realización de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el
mejor modo de la misma, ni debe interpretarse como que se limita el
alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones que representa.
De hecho, serán evidentes para los expertos en la materia a partir
de la descripción anterior diversas modificaciones de la invención
adicionalmente a las mostradas y descritas aquí y se encontrarán en
el alcance de las reivindicaciones adjuntas
También se describen aquí:
1. Un procedimiento de detección de un
polipéptido designado como A, B, C o D en una muestra sospechosa de
contener un polipéptido A, B, C o D, comprendiendo dicho
procedimiento poner en contacto dicha muestra con un polipéptido
designado aquí como E, F, G, H o I y determinar la formación de un
conjugado de polipéptidos A/E, B/F, B/G, C/H o D/I en dicha
muestra, donde la formación de dicho conjugado es indicativo de la
presencia de un polipéptido A, B, C o D en dicha muestra y donde A
es un polipéptido PRO1027, B es un polipéptido PRO20110, C es un
polipéptido PRO10096, D es un polipéptido PRO19670, E es un
polipéptido PRO5801, F es un polipéptido PRO1, G es un polipéptido
PRO20040, H es un polipéptido PRO20233 e I es un polipéptido
PRO1890.
2. Procedimiento según el párrafo 1, donde dicha
muestra comprende células sospechosas de expresar dicho polipéptido
A, B, C o D.
3. Procedimiento según el párrafo 1, donde dicho
polipéptido E, F, G, H o I está marcado con un marcador
detectable.
4. Procedimiento según el párrafo 1, donde dicho
polipéptido E, F, G, H o I está unido a un soporte sólido.
5. Procedimiento de detección de un polipéptido
designado como E, F, G, H o I en una muestra sospechosa de contener
un polipéptido E, F, G, H o I, comprendiendo dicho procedimiento
poner en contacto dicha muestra con un polipéptido designado aquí
como A, B, C o D y determinar la formación de un conjugado de
polipéptidos A/E, B/F, B/G, C/H o D/I en dicha muestra, donde la
formación de dicho conjugado es indicativa de la presencia de un
polipéptido A, B, C o D en dicha muestra y donde A es un polipéptido
PRO10272, B es un polipéptido PRO20110, C es un polipéptido
PRO10096, D es un polipéptido PRO19670, E es un polipéptido PRO5801,
F es un polipéptido PRO1, G es un polipéptido PRO20040, H es un
polipéptido PRO20233 e I es un polipéptido PRO1890.
6. Procedimiento según el párrafo 5, donde dicha
muestra comprende células sospechosas de expresar dicho polipéptido
E, F, G, H o I.
7. Procedimiento según el párrafo 5, donde dicho
polipéptido A, B, C o D está marcado con un marcador detectable.
8. Procedimiento según el párrafo 5, donde dicho
polipéptido A, B, C o D está unido a un soporte sólido.
9. Procedimiento de unión de una molécula
bioactiva a una célula que expresa un polipéptido designado como A,
B, C o D, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicha
célula con un polipéptido designado como E, F, G, H o I que está
unido a dicha molécula bioactiva y permitir que dichos polipéptidos
A, B, C o D y dichos polipéptidos E, F, G, H o I se unan entre sí,
uniendo así dichas moléculas bioactivas con dicha célula, donde A
es un polipéptido PRO10272, B es un polipéptido PRO20110, C es un
polipéptido PRO10096, D es un polipéptido PRO19670, E es un
polipéptido PRO5801, F es un polipéptido PRO1, G es un polipéptido
PRO20040, H es un polipéptido PRO20233 e I es un polipéptido
PRO1890.
10. Procedimiento según el párrafo 9, donde
dicha molécula bioactiva es una toxina, un radiomarcador o un
anticuerpo.
11. Procedimiento según el párrafo 9, donde
dicha molécula bioactiva provoca la muerte de dicha célula.
12. Procedimiento de unión de una molécula
bioactiva a una célula que expresa un polipéptido designado como E,
F, G, H o I, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto
dicha célula con un polipéptido designado como A, B, C o D que está
unido a dicha molécula bioactiva y permitir que dichos polipéptidos
A, B, C o D y dichos polipéptidos E, F, G, H o I se unan entre sí,
uniendo así dichas moléculas bioactivas con dicha célula, donde A
es un polipéptido PRO10272, B es un polipéptido PRO20110, C es un
polipéptido PRO10096, D es un polipéptido PRO19670, E es un
polipéptido PRO5801, F es un polipéptido PRO1, G es un polipéptido
PRO20040, H es un polipéptido PRO20233 e I es un polipéptido
PRO1890.
13. Procedimiento según el párrafo 12, donde
dicha molécula bioactiva es una toxina, un radiomarcador o un
anticuerpo.
14. Procedimiento según el párrafo 12, donde
dicha molécula bioactiva provoca la muerte de dicha célula.
15. Procedimiento de modulación de por lo menos
una actividad biológica de una célula que expresa un polipéptido
designado como A, B, C o D, comprendiendo dicho procedimiento poner
en contacto dicha célula con un polipéptido designado como E, F, G,
H o I o un anticuerpo polipeptídico anti-A, B, C o
D, mediante lo cual dicho polipéptido E, F, G, H o I o anticuerpo
polipeptídico anti-A, B, C o D se une a dicho
polipéptido A, B, C o D, modulando así por lo menos una actividad
biológica de dicha célula, donde A es un polipéptido PRO10272, B es
un polipéptido PRO20110, C es un polipéptido PRO10096, D es un
polipéptido PRO19670, E es un polipéptido PRO5801, F es un
polipéptido PRO1, G es un polipéptido PRO20040, H es un polipéptido
PRO20233 e I es un polipéptido PRO1890.
16. Procedimiento según el párrafo 15, donde se
asesina dicha célula.
17. Procedimiento de modulación de por lo menos
una actividad biológica de una célula que expresa un polipéptido
designado como E, F, G, H o I, comprendiendo dicho procedimiento
poner en contacto dicha célula con un polipéptido designado como A,
B, C o D o un anticuerpo polipeptídico anti-E, F, G,
H o I, mediante lo cual dicho polipéptido A, B, C o D o anticuerpo
polipeptídico anti- E, F, G, H o I se une a dicho polipéptido E, F,
G, H o I, modulando así por lo menos una actividad biológica de
dicha célula, donde A es un polipéptido PRO10272, B es un
polipéptido PRO20110, C es un polipéptido PRO10096, D es un
polipéptido PRO19670, E es un polipéptido PRO5801, F es un
polipéptido PRO1, G es un polipéptido PRO20040, H es un polipéptido
PRO20233 e I es un polipéptido PRO1890.
18. Procedimiento según el párrafo 17, donde se
asesina dicha célula.
El contenido de la presente solicitud no debe
interpretarse como limitado a las reivindicaciones presentadas,
sino que incluye toda la material descrita en la solicitud.
La solicitud mantiene el derecho a presentar
modificaciones y/o solicitudes divisionales a partir de ésta,
dirigidas a cualquier materia que se describe en la presente memoria
independientemente de si la materia se encuentra en las
reivindicaciones de la presente solicitud tal como se presentó, e
independientemente del destino final de cualquier solicitud de
patente europea de la que se divide esta solicitud.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
- \bullet US 5536637 A [0003]
- \bullet WO 9104753 A [0132]
- \bullet EP 404097 A [0070]
- \bullet WO 9010448 A [0133]
- \bullet WO 9311161 A [0070]
- \bullet US 4736866 A [0138]
- \bullet US 4275149 A [0074]
- \bullet US 4870009 A [0138]
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- \bullet US 4657760 A [0150]
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- \bullet WO 8905859 A [0105]
- \bullet US 4816567 A [0177] [0181]
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- \bullet DD 266710 [0106]
- \bullet US 55458o6 A [0182]
- \bullet US 4946783 A [0106]
- \bullet US 5569825 A [0182]
- \bullet EP 139383 A [0107]
- \bullet US 5625126 A [0182]
- \bullet US 4943529 A [0107]
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- \bullet EP 402226 A [0107]
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- \bullet WO 9308829 A [0185]
- \bullet EP 244234 A [0107]
- \bullet WO 9627011 A [0187]
- \bullet EP 394538 A [0107]
- \bullet US 4676980 A [0192]
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Claims (20)
1. Procedimiento para detectar la presencia de
un tumor en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la
comparación del nivel de expresión de un gen que codifica un
polipéptido PRO1865 en (a) una muestra de análisis de células de
tejido de esófago o piel obtenidas de dicho mamífero y (b) en una
muestra de control de células de tejido normal conocidas del mismo
tipo de células, en el que un nivel superior o inferior de la
expresión de dicho gen que codifica un polipéptido PRO1865 en dicha
muestra de análisis de tejido de esófago o piel en comparación con
la muestra de control es indicativo de la presencia de tumor de
esófago o melanoma, respectivamente, en dicho mamífero, en el que
el polipéptido PRO1865 es un polipéptido que tiene por lo menos un
80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con:
(a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC ID No. 132;
(b) la secuencia de aminoácidos codificada por
la secuencia codificante de longitud completa del ADN depositado
bajo el número de acceso ATCC 203543;
(c) la secuencia de aminoácidos del polipéptido
mostrado en la SEC ID No. 132, que carece de su péptido señal
asociado;
(d) la secuencia de aminoácidos de un dominio
extracelular del polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132, con su
péptido señal asociado; o
(e) la secuencia de aminoácidos de un dominio
extracelular del polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132, que
carece de su péptido señal, y
en el que una expresión superior es indicativa
de la presencia de un tumor de esófago o melanoma.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el nivel de identidad es de por lo menos un 85%.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el nivel de identidad es de por lo menos un 90%.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el nivel de identidad es de por lo menos un 95%.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el nivel de identidad es de por lo menos un 99%.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido comprende:
(a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC ID No. 132;
(b) la secuencia de aminoácidos codificada por
la secuencia codificante de longitud completa del ADN depositado
bajo el número de acceso ATCC 203543;
(c) la secuencia de aminoácidos del polipéptido
mostrado en la SEC ID No. 132, que carece de su péptido señal
asociado;
(d) la secuencia de aminoácidos de un dominio
extracelular del polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132, con su
péptido señal asociado; o
(e) la secuencia de aminoácidos de un dominio
extracelular del polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132, que
carece de su péptido señal.
7. Procedimiento para detectar la presencia de
un tumor en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la
comparación del nivel de expresión de un polipéptido PRO1865 en (a)
una muestra de análisis de células de tejido de esófago o piel
obtenidas de dicho mamífero y (b) en una muestra de control de
células de tejido normal conocidas del mismo tipo de células, en el
que un nivel superior o inferior de la expresión de dicho
polipéptido PRO1865 en dicha muestra de análisis de tejido de
esófago o piel en comparación con la muestra de control es
indicativo de la presencia de tumor de esófago o melanoma,
respectivamente, en dicho mamífero, en el que el polipéptido
PRO1865 es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6 y en el que una expresión superior es indicativa de la
presencia de un tumor de esófago o melanoma.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que dicho polipéptido PRO1865 se detecta utilizando un anticuerpo
que se une específicamente a un polipéptido PRO1865 tal como se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el anticuerpo está marcado de manera detectable.
\newpage
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo
humanizado o un fragmento de anticuerpo.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que
consiste en los fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')_{2}.
12. Procedimiento para detectar la presencia de
un tumor en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento (a)
poner en contacto un anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido PRO1865 con una muestra de análisis de células de
tejido de esófago o piel obtenidas del mamífero con una muestra de
control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo de
células, y (b) detectar la formación de un complejo entre dicho
anticuerpo y dicho polipéptido en la muestra de análisis y la
muestra de control, en el que una cantidad mayor o menor de
complejos formados en dicha muestra de análisis del tejido de
esófago o piel en comparación con la muestra de control es
indicativa de la presencia de tumor de esófago o melanoma,
respectivamente, en el mamífero, en el que el polipéptido PRO1865
es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y
en el que una mayor cantidad de complejos es indicativa de la
presencia de un tumor de esófago o melanoma.
13. Procedimiento para detectar la presencia de
tumor en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la
comparación del nivel de expresión de un ácido nucleico que codifica
PRO1865 en (a) una muestra de análisis de células de tejido de
esófago o piel obtenidas de dicho mamífero, y (b) en una muestra de
control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo de
células, en el que un nivel de expresión superior o inferior de
expresión de dicho ácido nucleico que codifica PRO1865 en dicha
muestra de análisis de tejido de esófago o piel en comparación con
la muestra de control es indicativo de la presencia de tumor de
esófago o melanoma, respectivamente, en dicho mamífero, en el que
el ácido nucleico que codifica PRO1865 es un ácido nucleico que
tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos con:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 132;
(b) la secuencia de nucleótidos mostrada en la
SEC ID No. 131;
(c) la secuencia codificante de longitud
completa de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID No.
131;
(d) la secuencia codificante de longitud
completa del ADN depositado bajo el número de acceso ATCC
203543;
(e) una secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132, que carece de su péptido
señal asociado;
(f) una secuencia de nucleótidos que codifica el
dominio extracelular del polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132,
con su péptido señal asociado; o
(g) una secuencia de nucleótidos que codifica el
dominio extracelular del polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132,
que carece de su péptido señal asociado, y
en el que la expresión superior es indicativa de
la presencia de un tumor de esófago o melanoma.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el nivel de identidad es de por lo menos un 85%.
15. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el nivel de identidad es de por lo menos un 90%.
16. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el nivel de identidad es de por lo menos un 95%.
17. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el nivel de identidad es de por lo menos un 99%.
18. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el ácido nucleico comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 132;
(b) la secuencia de nucleótidos mostrada en la
SEC ID No. 131;
(c) la secuencia codificante de longitud
completa de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID No.
131;
(d) la secuencia codificante de longitud
completa del ADN depositado bajo el número de acceso ATCC
203543;
(e) una secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132, que carece de su péptido
señal asociado;
(f) una secuencia de nucleótidos que codifica el
dominio extracelular del polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132,
con su péptido señal asociado; o
(g) una secuencia de nucleótidos que codifica el
dominio extracelular del polipéptido mostrado en la SEC ID No. 132,
que carece de su péptido señal asociado.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 18, en el que dicho ácido nucleico que
codifica PRO1865 se detecta utilizando una sonda de ácidos
nucleicos que se hibrida específicamente con dicho ácido nucleico
que codifica PRO1865.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que la sonda de ácidos nucleicos está marcada de forma
detectable.
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