ES2288279T3 - Polipeptidos secretados y transmembrana y los acidos nucleicos que los codifican. - Google Patents
Polipeptidos secretados y transmembrana y los acidos nucleicos que los codifican. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2288279T3 ES2288279T3 ES05011884T ES05011884T ES2288279T3 ES 2288279 T3 ES2288279 T3 ES 2288279T3 ES 05011884 T ES05011884 T ES 05011884T ES 05011884 T ES05011884 T ES 05011884T ES 2288279 T3 ES2288279 T3 ES 2288279T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sequence
- polypeptide
- pro
- identity
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Ácido nucleico aislado que: (i) codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No: 4), con o sin la secuencia señal y/o la metionina de iniciación, opcionalmente con el dominio transmembrana eliminado o inactivado; (ii) codifica un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No: 4), con o sin la secuencia señal; (iii) codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con el polipéptido de (i) o con el dominio extracelular de (ii), donde el polipéptido es capaz de inducir la rediferenciación de condrocitos; (iv) tiene la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la figura 1 (SEC ID No: 3); (v) tiene la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia codificante de longitud completa mostrada en la figura 1 (SEC ID No: 3); (vi) tiene la secuencia codificante de longitud completa de la inserción (DNA84920-2614) contenida en ATCC 203966; (vii) tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con el ácido nucleico de (iv), (v) o (vi) y codifica un polipéptido capaz de inducir la rediferenciación de condrocitos; o (viii) se hibrida bajo condiciones de hibridación y lavado astringentes al complemento del ácido nucleico entre los nucléotidos 181 y 1008, ambos inclusive, de la figura 1 (SEC ID No: 3) y codifica un polipéptido capaz de inducir la rediferenciación de condrocitos,
Description
Polipéptidos secretados y transmembrana y los
ácidos nucléicos que los codifican.
La presente invención se refiere en general a la
identificación y aislamiento de ADN nuevo y a la producción
recombinante de polipéptidos nuevos.
Las proteínas extracelulares tienen funciones
importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y
mantenimiento de organismos multicelulares. El destino de muchas
células individuales, por ejemplo, proliferación, migración,
diferenciación, o interacción con otras células, está gobernada
habitualmente por la información recibida de otras células y/o el
medio inmediato. Esta información es transmitida frecuentemente
mediante polipéptidos secretados (por ejemplo, factores
mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos,
factores de diferenciación, neuropéptidos, y hormonas) que, a su
vez, es recibida e interpretada por diversos receptores de células
o proteínas unidas a membrana. Estos polipéptidos secretados o
moléculas de señalización pasan normalmente a través del mecanismo
secretor de las células para alcanzar su sitio de acción en el medio
extracelular.
Las proteínas secretadas tienen varias
aplicaciones industriales, incluyendo productos farmacéuticos, de
diagnóstico, bionsensores y biorreactores. La mayoría de los
fármacos de proteínas disponibles actualmente, tales como agentes
trombolíticos, interferones, interleuquinas, eritropoyetinas,
factores estimulantes de colonias, y varias otras citoquinas, son
proteínas secretoras. Sus receptores, que son proteínas de membrana,
también tienen potencial como agentes terapéuticos o de
diagnóstico. Se están realizando esfuerzos tanto a nivel de
industria como académica para identificar nuevas proteínas
secretadas nativas. Muchos esfuerzos se centran en el cribado de
bibliotecas de ADN recombinante de mamífero para identificar las
secuencias codificantes de proteínas secretadas nuevas. En la
literatura se describen ejemplos de procedimientos de cribado y
técnicas [véase, por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 93: 7108-7113 (1996); Patente de Estados
Unidos No. 5.536.637)].
Las proteínas unidas a membrana y receptores
pueden tener funciones importantes en, entre otras cosas, la
formación, diferenciación y mantenimiento de organismos
multicelulares. El destino de muchas células individuales, por
ejemplo, proliferación, migración, diferenciación, o interacción con
otras células, está gobernada habitualmente por la información
recibida de otras células y/o el medio inmediato. Esta información
es transmitida frecuentemente mediante polipéptidos secretados (por
ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores
citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos, y hormonas)
que, a su vez, es recibida e interpretada por diversos receptores
de células o proteínas unidas a membrana. Entre dichas proteínas
unidas a membrana y receptores de células se incluyen; pero no se
limitan a, receptores de citoquina, quinasas receptoras, fosfatasas
receptoras, receptores implicados en las interacciones
célula-célula, y moléculas de adhesina celula, como
selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales
que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está
regulada en parte por la fosforilación de varias proteínas
celulares. Las proteínas tirosina quinasas, enzimas que catalizan
ese proceso, también pueden actuar como receptores de los factores
de crecimiento. Entre los ejemplos se incluyen el receptor del
factor de crecimiento de fibroblastos y el receptor del factor de
crecimiento nervioso.
Las proteínas unidas a membrana y las moléculas
receptoras tienen varias aplicaciones industriales, incluyendo como
agentes farmacéuticos y de diagnóstico. Las inmunoadhesinas
receptoras, por ejemplo, se pueden utilizar como agentes
terapéuticos para bloquear las interacciones
receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana
también se pueden utilizar para cribar el péptido potencial o
pequeñas moléculas inhibidoras de la interacción receptor/ligando
pertinente.
Se están realizando esfuerzos tanto a nivel de
industria como académica para identificar nuevas proteínas unidas a
membrana o receptores nativos. Muchos esfuerzos se centran en el
cribado de bibliotecas de ADN recombinante de mamífero para
identificar las secuencias codificantes de nuevas proteínas unidas a
membrana o receptores.
Se están realizando muchos esfuerzos a nivel
tanto industrial como académico para identificar nuevas proteínas
receptoras transmembrana nativas. Muchos esfuerzos se centran en el
cribado de bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para
identificar las secuencias de codificación de nuevas proteínas
receptoras transmembrana. En la presente invención se describe la
identificación y caracterización de nuevos polipéptidos
transmembrana, designados en la presente invención como
polipéptidos PRO4405.
Se ha identificado un clon de ADNc
(DNA84920-2614) que codifica un polipéptido nuevo,
designado en la presente invención como "PRO4405".
En una realización, la presente invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada tal y como se
define en las reivindicaciones que comprende ADN que codifica un
polipéptido PRO4405.
En un aspecto, el ácido nucleico aislado
comprende ADN que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de
identidad en la secuencia, preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia, más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad en
la secuencia, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente
un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de ácidos
nucleicos mostrada en la figura 1 (SEC ID No: 3) o la secuencia de
codificación de longitud completa de la misma.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un
polipéptido PRO4405 que comprende ADN que se hibrida al complemento
del ácido nucleico entre aproximadamente los nucleótidos 181 y
aproximadamente 1008, ambos inclusive, de la figura 1 (SEC ID No:
3), bajo unas condiciones de hibridación y lavado astringentes.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende
ADN que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la
secuencia, preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85% de
identidad en la secuencia, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia, aún más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en
la secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica el mismo
polipéptido maduro codificado por el ADNc de la proteína humana en
el Depósito de ATCC No. 203966 (DNA84920-2614) o (b)
el complemento de la molécula de ADN de (a). En una realización
preferida, el ácido nucleico comprende un ADN que codifica el mismo
polipéptido maduro codificado por el ADNc de la proteína humana en
el Depósito de ATCC No. 203966 (DNA84920-2614).
En aún otro aspecto, la presente invención se
refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende (a)
ADN que codifica un polipéptido que tiene por lo menos
aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia,
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en
la secuencia, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un
90% de identidad en la secuencia, aún más preferiblemente por lo
menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia con la
secuencia de residuos de aminoácidos desde aproximadamente 35 hasta
aproximadamente 310, ambos inclusive de la figura 2 (SEC ID No: 4),
o el complemento del ADN de (a).
En un aspecto específico, la presente invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende
ADN que codifica un polipéptido PRO4405, con o sin la secuencia
señal N-terminal y/o la metionina de iniciación, y
sus variantes solubles (es decir, dominio transmembrana eliminado o
inactivado) o es complementario de dicha molécula de ácido nucleico
codificante. El péptido señal se ha identificado con ciertas dudas
como la extensión de aproximadamente el aminoácido de la posición 1
hasta aproximadamente el aminoácido de posición 34 en la secuencia
de la figura 2 (SEC ID No: 4). El dominio transmembrana se ha
identificado con ciertas dudas como la extensión de aproximadamente
el aminoácido de la posición 58 hasta aproximadamente el aminoácido
de posición 76 en la secuencia de aminoácidos de PRO4405 (figura 2,
SEC ID No: 4) y puede ser un dominio transmembrana de tipo II.
En otra realización, tal y como se define en las
reivindicaciones, la presente invención proporciona el polipéptido
PRO4405 aislado codificado por cualquiera de las secuencias de ácido
nucleico aisladas definidas anteriormente en la presente
invención.
En un aspecto específico, la presente invención
proporciona el polipéptido PRO4405 aislado de secuencia nativa, que
en una realización, incluye una secuencia de aminoácidos que
comprende los residuos 35 a 310 de la figura 2 (SEC ID No: 4).
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un polipéptido PRO4405 aislado, que comprende una
secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente un
80% de identidad en la secuencia, preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia, más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad en
la secuencia, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente
un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de residuos de
aminoácidos 35 o aproximadamente 310, ambos inclusive de la figura 2
(SEC ID No: 4).
En aún otro aspecto, la presente invención se
refiere a un polipéptido PRO4405 aislado, que comprende la
secuencia de residuos de aminoácidos 35 a aproximadamente 310, ambos
inclusive de la figura 2 (SEC ID No: 4).
En otras realizaciones de la presente invención,
la presente invención proporciona vectores que comprenden ADN que
codifica cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente
invención. También se proporcionan las células huésped que
comprenden dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huésped
pueden ser células CHO, E. coli o levaduras. También se
proporciona un procedimiento para fabricar cualquiera de los
polipéptidos descritos en la presente y comprende el cultivo de
células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del
polipéptido deseado y la recuperación del polipéptido deseado del
cultivo celular.
En otras realizaciones, la presente invención
proporciona moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los
polipéptidos descritos en la presente invención fusionados a un
polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos. Los ejemplos de
dichas moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los
polipéptidos descritos en la presente invención fusionados a una
secuencia de epítopo etiqueta o una región Fc de una
inmunoglobulina.
En otra realización, la presente invención
proporciona un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera
de los polipéptidos descritos anterior o posteriormente.
Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal,
anticuerpo humanizado, fragmento de anticuerpo o anticuerpo de
cadena única.
En otras realizaciones, la presente invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO.
En un aspecto, la molécula de ácido nucleico
aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo
menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
83% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 84% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
88% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 89% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 91% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
93% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 94% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
98% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, y
alternativamente por lo menos aproximadamente un 99% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos
nucleicos de la figura 1 (SEC ID No: 3) o la secuencia de
codificación de longitud completa de la misma.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a la molécula de ácido nucleico aislada que comprende
una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente
un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 81% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 83% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
85% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 88% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
90% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 91% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 93% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
95% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 98% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, y alternativamente
por lo menos aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos con el ADNc de proteína humana depositado con la
ATCC en ATCC 203966.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO que es
transmembrana con dominio eliminado o transmembrana con dominio
inactivado, o es complementario a dicha secuencia de nucleótidos
codificante, donde el dominio o dominios transmembrana de dicho
polipéptido se describen en la presente invención. Por lo tanto, se
contemplan dominios extracelulares solubles de los polipéptidos PRO
descritos en la presente invención.
En otra realización, la presente invención
proporciona un polipéptido PRO aislado codificado por cualquiera de
las secuencias de ácidos nucleicos aisladas identificadas
anteriormente en la presente invención.
En un cierto aspecto, la presente invención se
refiere a un polipéptido PRO aislado que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 82%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 84%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 88% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 90%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 92%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 94% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 98%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, y alternativamente por
lo menos aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de
aminoácidos con un polipéptido PRO que tiene una secuencia de
aminoácidos de longitud completa tal y como se describe en la
presente invención, una secuencia de aminoácidos que carece del
péptido señal tal y como se describe en la presente invención, un
dominio extracelular de una proteína transmembrana, con o sin el
péptido señal, tal y como se describe en la presente invención o
cualquier otro fragmento específicamente definido de la secuencia de
aminoácidos de longitud completa tal y como se describe en la
presente.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un polipéptido PRO aislado que comprende una secuencia
de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 82%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 84%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 88% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 90%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 92%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 94% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 98%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, y alternativamente por
lo menos aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de
aminoácidos con una secuencia de aminoácidos codificada por
cualquiera de los ADNc de proteína humana depositados con el ATCC
tal y como se describe en la presente.
En un aspecto específico, la presente invención
proporciona un polipéptido PRO aislado sin la secuencia señal
N-terminal y/o la metionina de inicio y es
codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica dicha
secuencia de aminoácidos tal y como se ha descrito en la presente
invención. Los procedimientos para fabricar el mismo también se
describen en la presente invención, donde dichos procedimientos
comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que
comprende la molécula de ácido nucleico codificante apropiada en
condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PRO y la
recuperación del polipéptido PRO del cultivo celular.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona un polipéptido PRO aislado que es transmembrana con
dominio eliminado o bien transmembrana con dominio inactivado. Los
procesos para producir los mismos también se describen en la
presente invención, donde dichos procesos comprenden en cultivo de
una célula huésped que comprende un vector que comprende la
molécula de ácido nucleico codificante adecuada en condiciones
adecuadas para la expresión del polipéptido PRO y la recuperación
del polipéptido PRO del cultivo celular.
Un uso de la presente invención se refiere a un
procedimiento de identificación de agonistas o antagonistas a un
polipéptido PRO que comprende poner en contacto el polipéptido PRO
con una molécula candidata y monitorizar una actividad biológica
mediada por dicho polipéptido PRO. Preferiblemente, el polipéptido
PRO es un polipéptido PRO nativo.
Una aplicación de la presente invención se
refiere a una composición de materia que comprende un polipéptido
PRO combinado con un portador. Opcionalmente, el portador es un
portador farmacéuticamente aceptable.
Otra realización de la presente invención está
dirigida a la utilización de un polipéptido PRO, para la
preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una
condición que es sensible al polipéptido PRO.
La figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos
(SEC ID No: 3) de ADNc de PRO4405 de secuencia nativa, en la que SEC
ID No: 3 es un clon designado en la presente invención como
"DNA84920-2614".
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC ID No: 4) derivada de la secuencia de codificación de SEC ID
NO: 3 mostrada en la figura 1.
Los términos "polipéptido PRO" y "PRO"
tal y como se utilizan en la presente invención y cuando va seguido
inmediatamente por una denominación numérica se refiere a varios
polipéptidos, en los que la denominación completa (es decir,
PRO/número) se refiere a secuencias de polipéptido específicas tal y
como se describen en la presente invención. Los términos
"polipéptido PRO/número" y "PRO/número" en los que el
término "número" se proporciona como una designación numérica
real, tal y como se utiliza en la presente, comprenden polipéptidos
de secuencia nativa y variantes de polipéptidos (que se definen
posteriormente en la presente invención). Los polipéptidos PRO
descritos en la presente invención pueden aislarse de una variedad
de orígenes, tales como tipos de tejido humano o de otras orígenes,
o prepararse mediante procedimientos recombinantes o sintéticos.
Un "polipéptido PRO de secuencia nativa"
comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos
que el correspondiente polipéptido PRO derivado de la naturaleza.
Dichos polipéptidos PRO de secuencia nativa se pueden aislar de la
naturaleza o pueden producirse mediante medios recombinantes o
sintéticos. El término "polipéptido PRO de secuencia nativa"
comprende específicamente formas secretadas o truncadas naturales
del polipéptido PRO específico (por ejemplo, una secuencia de
dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo,
formas de corte y empalme ("spliced") alternativas) y variantes
alélicas naturales del polipéptido. En varias realizaciones de la
presente invención, los polipéptidos PRO de secuencia nativa
descritos en la presente invención son polipéptidos de secuencia
nativa maduros o de longitud completa que comprenden las secuencias
de aminoácidos de longitud completa mostradas en las figuras que se
acompañan. Los codones de inicio y detención se muestran en letra
negrita y están subrayadas en las figuras. Sin embargo, aunque el
polipéptido descrito en las figuras acompañantes se muestra que
empieza con residuos de metionina designados en la presente
invención como posición 1 de los aminoácidos en las figuras, es
concebible y posible que se puedan utilizar otros residuos de
metionina situados en dirección 5' o dirección 3' desde la posición
1 de los aminoácidos en las figuras como el residuo de aminoácido
de partida de los polipéptidos PRO.
El "dominio extracelular" o "ECD" del
polipéptido PRO se refiere a una forma del polipéptido PRO que está
esencialmente libre de los dominios transmembrana y citoplásmico.
Normalmente, el ECD del polipéptido PRO tendrá menos de un 1% de
dichos dominios transmembrana y/o citoplásmicos y preferiblemente,
tendrá menos de un 0,5% de dichos dominios. Se entenderá que
cualquier dominio transmembrana identificado para los polipéptidos
PRO de la presente invención se identifica según el criterio
utilizado habitualmente en la técnica para identificar ese tipo de
dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio transmembrana
puede variar pero probablemente por no más de aproximadamente 5
aminoácidos en cualquier extremo del dominio según se ha
identificado inicialmente en la presente invención. Opcionalmente,
por lo tanto, un dominio extracelular de un polipéptido PRO puede
contener desde aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cualquier
parte del límite del dominio transmembrana/dominio extracelular tal
y como se identifica en los Ejemplos o la descripción y la presente
invención contempla dichos polipéptidos, con o sin el péptido señal
asociado, y el ácido nucleico que los codifica.
La localización aproximada de los "péptidos
señal" de los diversos polipéptidos descritos en la presente
invención se muestra en la descripción y/o las figuras que se
acompañan. Sin embargo, hay que indicar que el extremo
C-terminal de un péptido señal puede variar, pero
probablemente por no más de aproximadamente 5 aminoácidos en
cualquier parte del extremo C-terminal del péptido
señal según se ha identificado inicialmente en la presente
invención, donde el extremo C-terminal del péptido
señal se puede identificar según el criterio utilizado
habitualmente en la técnica para identificar ese tipo de elemento de
secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen et al., Prot.
Eng. 10:1-6 (1997) y von Henje et al., Nucl.
Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Además,
también se reconoce que, en algunos casos, la división de una
secuencia señal de un polipéptido secretado no es completamente
uniforme, dando lugar a más de una especie secretada. La presente
invención también contempla estos polipéptidos maduros, en los que
el péptido señal se divide en no más de aproximadamente 5
aminoácidos en cualquier parte del extremo
C-terminal del péptido señal según se ha
identificado inicialmente en la presente invención, y los
polinucleótidos que los codifican.
La "variante de polipéptido PRO" significa
un polipéptido PRO activo tal y como se ha definido anteriormente o
posteriormente que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de
identidad en la secuencia de aminoácidos con una secuencia de
polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa tal y como
se describe en la presente invención, una secuencia de polipéptido
PRO que carece del péptido señal tal y como se describe en la
presente invención, un dominio extracelular de un polipéptido PRO,
con o sin el péptido señal, tal y como se describe en la presente
invención o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido
PRO de longitud completa tal y como se describe en la presente
invención. Entre dichas variantes de polipéptido PRO se incluyen,
por ejemplo, polipéptidos PRO en los que uno o más residuos de
aminoácidos se añaden, o se eliminan, en el extremo N- o
C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de
longitud completa. Habitualmente, una variante de polipéptido PRO
tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la
secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 82% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 84% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 88% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 92% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 94% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de identidad en
la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 98% de identidad
en la secuencia de aminoácidos, y alternativamente por lo menos
aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos a
una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud
completa tal y como se describe en la presente, una secuencia de
polipéptido PRO que carece del péptido señal tal y como se describe
en la presente invención, un dominio extracelular de un polipéptido
PRO, con o sin el péptido señal, tal y como se describe en la
presente invención o cualquier otro fragmento definido
específicamente de una secuencia de polipéptido PRO de longitud
completa tal y como se describe en la presente invención.
Habitualmente, los polipéptidos variantes de PRO tienen por los
menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, alternativamente
por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 40
aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo
menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, alternativamente
por lo menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 80 aminoácidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 90
aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo
menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, alternativamente
por lo menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 300 aminoácidos de
longitud, o más.
El "porcentaje (%) de identidad en la
secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del
polipéptido PRO identificadas en la presente invención se define
como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia
candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la
secuencia específica de polipéptido PRO, después de la alineación
de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario,
para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y
sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de
identidad de la secuencia. La alineación con el objetivo de
determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de
aminoácidos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de
la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible
públicamente, tal como software BLAST, BLAST-2,
ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden
determinar parámetros apropiados para medir la alineación,
incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo
de alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se
comparan. Para los objetivos de la presente invención, sin embargo,
los valores en % de la identidad en la secuencia de aminoácidos se
generan utilizando el programa informático de comparación de
secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente
completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en
la Tabla 1 siguiente. El programa informático de comparación de
secuencias ALIGN-2 era de Genentech, Inc. y el
código fuente mostrado en la Tabla 1 siguiente se ha presentado con
la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington
D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S. Copyright
Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está
disponible públicamente mediante Genentech Inc., South San
Francisco, California o se puede compilar a partir del código
fuente proporcionado en la Tabla 1 siguiente. El programa
ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en
un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos
los parámetros de comparación de las secuencias son fijados en el
programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las que se utiliza
ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de
aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de
una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una
secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A
que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos
determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el
programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en
dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total
de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la
longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud
de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia
de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad en la
secuencia de aminoácidos de B a A. Como ejemplos de los cálculos
del % de identidad en la secuencia de aminoácidos utilizando este
procedimiento, las Tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el % de
identidad en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de
aminoácidos denominada "Proteína de comparación" a la
secuencia de aminoácidos denominada "PRO", en la que "PRO"
representa la secuencia de aminoácidos de un hipotético polipéptido
PRO de interés, "Proteína de comparación" representa la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el que se está
comparando el polipéptido "PRO" de interés, y "X",
"Y" y "Z" representan cada uno diferentes residuos de
aminoácidos
hipotéticos.
A menos que se afirme específicamente lo
contrario, los valores en % de identidad en la secuencia de
aminoácidos utilizados en la presente invención se obtienen tal y
como se describe en el párrafo inmediatamente anterior utilizando
el programa informático ALIGN-2. Sin embargo, los
valores en % de identidad en la secuencia de aminoácidos también se
pueden obtener tal y como se describe a continuación mediante la
utilización del programa informático
WU-BLAST-2 (Altschul et al.,
Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996). La
mayoría de los parámetros de búsqueda de
WU-BLAST-2 se fijan en los valores
por defecto. Los valores no fijados a valores por defecto, es
decir, los parámetros ajustables, se fijan según los siguientes
valores: espacio de solapamiento ("overlap span") = 1,
fracción de solapamiento ("overlap fraction") = 0,125, umbral
de palabra ("word threshold") T = 11, y matriz de puntuación
("scoring matrix") = BLOSUM 62. Cuando se utiliza
WU-BLAST-2, el valor en % de
identidad en la secuencia de aminoácidos se determina dividiendo (a)
el número de residuos de aminoácidos idénticos en el emparejamiento
entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés que
tiene una secuencia derivada del polipéptido PRO nativo y la
secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es decir, la
secuencia contra la que se compara el polipéptido PRO de interés que
puede ser un polipéptido variante PRO) según se determina por
WU-BLAST-2 entre (b) el número total
de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO de interés. Por
ejemplo, en la afirmación "un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos A que tiene por lo menos un 80% de
identidad en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de
aminoácidos de B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia
de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de
aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de
interés.
El porcentaje de identidad en la secuencia de
aminoácidos también se puede determinar utilizando el programa de
comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul
et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402
(1997)). El programa de comparación de secuencias
NCBI-BLAST2 se puede descargar de
http://www.ncbi.nlmn.nih.gov o bien se obtiene del National
Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2
utiliza varios parámetros de búsqueda, en los que todos los
parámetros de búsqueda se fijan a valores por defecto incluyendo,
por ejemplo, no desenmascarado = sí, cadena = todos, sucesos
esperados = 10, longitud mínima de baja complejidad = 15/5,
e-valor de multipaso = 0,01, constante para
multipaso = 25, caída para alineación con espacios final ("dropoff
for final gapped alignment") = 25 y la matriz de puntuación =
BLOSUM62.
En las situaciones en las que se utiliza
NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencias de
aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de
una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una
secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A
que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos
determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el
programa de alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en
dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número
total de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la
longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud
de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia
de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad en la
secuencia de aminoácidos de B a
A.
El "polipéptido variante PRO" o
"secuencia de ácidos nucleicos variante de PRO" significa una
molécula de ácido nucleico que codifica una polipéptido PRO activo
tal y como se define a continuación y que tiene por lo menos
aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una
secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud
completa tal y como se describe en la presente invención, una
secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud
completa que carece del péptido señal tal y como se describe en la
presente invención, un dominio extracelular de un polipéptido PRO,
con o sin el péptido señal, tal y como se describe en la presente
invención, o cualquier otro fragmento de una secuencia de
polipéptido PRO de longitud completa tal y como se describe en la
presente invención. Habitualmente, un polinucleótido variante PRO
tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 82% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
84% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 87% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
89% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 92% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
94% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 97% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, y alternativamente por lo menos aproximadamente un
99% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de
polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa tal y como
se describe en la presente invención, una secuencia de polipéptido
PRO de secuencia nativa de longitud completa que carece del péptido
señal tal y como se describe en la presente invención, un dominio
extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal
y como se describe en la presente invención, o cualquier otro
fragmento de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa
tal y como se describe en la presente invención. Las variantes no
comprenden la secuencia de nucleótidos nativa.
Normalmente, los polinucleótidos variantes PRO
tienen por lo menos 30 nucleótidos de longitud, alternativamente
por lo menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 90 nucleótidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 120
nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo
menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, alternativamente
por lo menos aproximadamente 210 nucleótidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 240 nucleótidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 270
nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, alternativamente por
lo menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 600 nucleótidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 900
nucleótidos de longitud, o más.
El "porcentaje (%) de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de
ácidos nucleicos que codifica el PRO identificadas en la presente
invención se define como el porcentaje de nucleótidos en una
secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en la
secuencia de ácidos nucleicos de PRO de interés, después de la
alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es
necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la
secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el
porcentaje de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se puede
conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por
ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente,
tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign
(DNASTAR). Para los objetivos de la presente invención, sin
embargo, los valores en % de la identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos se generan utilizando el programa informático de
comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el
código fuente completo para el programa ALIGN-2 se
proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa informático de
comparación de secuencias ALIGN-2 era de Genentech,
Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 siguiente se ha
presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright
Office, Washington D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S.
Copyright Registration No. TXU510087. El programa
ALIGN-2 está disponible públicamente mediante
Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar
a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1 siguiente.
El programa ALIGN-2 debería compilarse para su
utilización en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX
V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias
son fijados en el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las que se utiliza
ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de ácidos
nucleicos, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de
una secuencia de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra
una secuencia de ácidos nucleicos determinada D (que se puede
escribir alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos
determinada C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de
ácidos nucleicos determinada D) se calcula tal y como se indica a
continuación:
100 veces la fracción
W/Z
donde W es el número de nucleótidos
identificados como emparejamientos idénticos por el programa de
alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha
alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de
nucleótidos en D. Se comprenderá que cuando la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos de D a C. Como ejemplos de los
cálculos del % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
las Tablas 4 y 5 demuestran cómo calcular el % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos
denominada "ADN de comparación" a la secuencia de ácidos
nucleicos denominada "ADN de PRO", en la que "ADN de PRO"
representa una hipotética secuencia de ácidos nucleicos que
codifica PRO de interés, "ADN de comparación" representa la
secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra
la que se está comparando la molécula de ácido nucleico "ADN de
PRO" de interés, y "N", "L" y "V" representan cada
uno diferentes nucleótidos
hipotéticos.
A menos que se afirme específicamente lo
contrario, los valores en % de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos utilizados en la presente invención se obtienen tal y como
se describe en el párrafo inmediatamente anterior utilizando el
programa informático ALIGN-2. Sin embargo, los
valores en % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos
también se pueden obtener tal y como se describe a continuación
mediante la utilización del programa informático
WU-BLAST-2 (Altschul et al.,
Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996). La
mayoría de los parámetros de búsqueda de
WU-BLAST-2 se fijan en los valores
por defecto. Los valores no fijados a valores por defecto, es
decir, los parámetros ajustables, se fijan según los siguientes
valores: espacio de solapamiento ("overlap span") = 1,
fracción de solapamiento ("overlap fraction") = 0,125, umbral
de palabra ("word threshold") T = 11, y matriz de puntuación
("scoring matrix") = BLOSUM 62. Cuando se utiliza
WU-BLAST-2, el valor en % de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se determina
dividiendo (a) el número de nucleótidos idénticos en el
emparejamiento entre la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula
de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de interés que
tiene una secuencia derivada del ácido nucleico que codifica el
polipéptido PRO de secuencia nativa y la molécula de ácido nucleico
de comparación de interés (es decir, la secuencia contra la que se
compara la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido
PRO de interés que puede ser un polipéptido variante PRO) según se
determina por WU-BLAST-2 entre (b)
el número total de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que
codifica el polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la
afirmación "un molécula de ácido nucleico aislada que comprende
una secuencia de ácidos nucleicos A que tiene por lo menos un 80%
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos a la secuencia de
ácidos nucleicos de B", la secuencia de ácidos nucleicos A es la
molécula de ácido nucleico de comparación de interés y la secuencia
de ácidos nucleicos B es la secuencia de ácidos nucleicos de la
molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de
interés.
El porcentaje de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos también se puede determinar utilizando el programa
de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul
et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402
(1997)). El programa de comparación de secuencias
NCBI-BLAST2 se puede descargar de
http://www.ncbi.nlmn.nih.gov o bien se obtiene del National
Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2
utiliza varios parámetros de búsqueda, en los que todos los
parámetros de búsqueda se fijan a valores por defecto incluyendo,
por ejemplo, no desenmascarado = sí, cadena = todos, sucesos
esperados = 10, longitud mínima de baja complejidad = 15/5,
e-valor de multipaso = 0,01, constante para
multipaso = 25, caída para alineación con espacios final "(dropoff
for final gapped alignment)" = 25 y la matriz de puntuación =
BLOSUM62.
En las situaciones en las que se utiliza
NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencias, el %
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia
de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra una secuencia de
ácidos nucleicos determinada D (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos determinada
C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos
determinada D) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción
W/Z
donde W es el número de nucleótidos
identificados como emparejamientos idénticos por el programa de
alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en dicha
alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de
nucleótidos en D. Se comprenderá que cuando la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos de D a
C.
En otras realizaciones, los polinucleótidos
variantes PRO son moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido PRO activo y que es capaz de hibridarse, preferiblemente
bajo condiciones de hibridación y lavado astringentes, a secuencias
de nucleótidos que codifican un polipéptido PRO de longitud completa
tal y como se describe en la presente invención. Los polipéptidos
variantes PRO pueden ser aquéllos codificados por un polinucleótido
variante PRO.
El término "positivos", en el contexto de
comparación de secuencias realizado tal y como se ha descrito
anteriormente, incluye residuos en las secuencias comparadas que no
son idénticos pero que tiene propiedades similares (por ejemplo,
como resultado de sustituciones conservativas, ver Tabla 6 a
continuación). Para los objetivos de la presente invención, el
valor en % de positivos se determina dividiendo (a) el número de
residuos de aminoácidos que indican un valor positivo entre la
secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés que tiene
una secuencia derivada de la secuencia de polipéptido PRO nativa y
la secuencia de aminoácidos de interés (es decir, la secuencia de
aminoácidos contra la que se está comparando la secuencia de
polipéptido PRO) según se determina en la matriz BLOSUM62 de
WU-BLAST-2 entre (b) el número total
de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO de
interés.
interés.
A menos que se afirme específicamente lo
contrario, los valores en % de positivos se calculan tal y como se
ha descrito en el párrafo inmediatamente anterior. Sin embargo, en
el contexto de las comparaciones de identidad en la secuencia de
aminoácidos realizadas con ALIGN-2 y
NCBI-BLAST-2 tal y como se ha
descrito anteriormente, incluye residuos de aminoácidos en las
secuencias comparadas que no son idénticas pero también aquéllas
que tienen propiedades similares. Los residuos de aminoácidos que
identifican un valor positivo a un residuo de aminoácido de interés
son aquéllos que son idénticos al residuo de aminoácido de interés o
son una sustitución preferida (tal y como se define en la Tabla 6
siguiente) del residuo de aminoácido de interés.
Para las comparaciones de las secuencias de
aminoácidos que utilizan ALIGN-2 o
NCBI-BLAST2, el valor en % de positivos de una
secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una
secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A que
tiene o comprende un cierto % de positivos a, con, o contra una
secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula tal y como se
indica a continuación:
100 veces la fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos que identifican un valor positivo tal y como se ha
definido anteriormente por el programa de alineación de secuencias
ALIGN-2 o NCBI-BLAST2 en dicha
alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de
residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la longitud
de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la
secuencia de aminoácidos B, el % de positivos de A a B no será igual
al % de positivos de B a
A.
El término "aislado" cuando se utiliza para
describir los diversos polipéptidos descritos en la presente
invención, significa polipéptidos que se han identificado y separado
y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los
componentes contaminantes de su medio natural son materiales que
habitualmente interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos
para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros
solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones
preferidas, se purificará el polipéptido (1) hasta un grado
suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de
aminoácidos N-terminal o interna mediante la
utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta una
homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no
reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o,
preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye
el polipéptido in situ en el interior de células
recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural
del polipéptido PRO no estará presente. Normalmente, sin embargo, el
polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de
purificación.
Un ácido nucleico "aislado" que codifica un
polipéptido PRO u otro ácido nucleico "aislado" que codifica
un polipéptido es una molécula de ácido nucleico que se identifica y
se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico
contaminante con la que está asociada normalmente en el medio
natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una
molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido está
en una forma o composición diferente de la que se encuentra en la
naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas
que codifican los polipéptidos se distinguen de la molécula de ácido
nucleico específica que codifica el polipéptido tal y como existen
en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico
aislada que codifica un polipéptido incluye moléculas de ácido
nucleico que codifican polipéptidos contenidas en células que
normalmente expresan el polipéptido, cuando, por ejemplo, la
molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica
diferente de la de las células naturales.
El término "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificantes unida operativamente en un organismo huésped
particular. Las secuencias de control que son adecuadas para
procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que
las células eucariotas utilizan promotores, señales de
poliadenilación y potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está situado en una relación funcional con
otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o líder secretor está unido operativamente a ADN para
un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en
la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido
operativamente a una secuencia codificante si afecta la
transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está
unido operativamente a una secuencia codificante si está situado
para facilitar la traducción. Generalmente, "unido
operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen
están contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en
fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar
contiguos. La unión se realiza mediante la unión en los sitios de
restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los
adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan
según la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales anti-PRO individuales (incluyendo
agonista, antagonista, y anticuerpos neutralizantes), composiciones
de anticuerpo anti-PRO con especificidad
poliepitópica, anticuerpos anti-PRO de cadena única,
y fragmentos de anticuerpos anti-PRO (ver a
continuación). El término "anticuerpo monoclonal", tal y como
se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de
una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir,
los anticuerpos individuales que comprenden la población son
idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden
estar presentes en pequeñas cantidades.
La "astringencia" de las reacciones de
hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual
en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de
la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la
concentración de sal. En general, sondas más largas requieren
temperaturas más elevadas para una hibridación más correcta,
mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La
hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN
desnaturalizado para rehibridarse cuando las cadenas complementarias
están presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión.
Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la
secuencia de hibridación, mayor es la temperatura relativa que se
puede utilizar. Como resultado, se deduce que temperaturas
relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción
más astringentes, mientras que temperaturas inferiores no tanto.
Para detalles adicionales y explicaciones de la astringencia de las
reacciones de hibridación, ver Ausubel y otros, Current Protocols
in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
"Condiciones astringentes" o "condiciones
de astringencia elevada", tal y como se definen en la presente
invención, se pueden identificar por aquéllas que: (1) utilizan una
fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por
ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil
sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación
un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo,
formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficol
al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM
a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o
(3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico
0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%,
5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50
\mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con
lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y
formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de astringencia
elevada que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente
astringentes" se pueden identificar tal y como se describen en
Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluye la
utilización de una solución de lavado y condiciones de hibridación
(por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos
astringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de
condiciones moderadamente astringentes es la incubación durante
toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al
20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM), fosfato sódico 50
mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%,
y ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado 20 mg/ml,
seguido del lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente
37-50ºC. El experto en la materia sabrá como ajustar
la temperatura, la fuerza iónica, etc. necesarias para acomodar
factores, tales como la longitud de la sonda y similares.
El término "epítopo etiquetado" cuando se
utiliza en la presente invención se refiere a un polipéptido
quimérico que comprende un polipéptido PRO fusionado a un
"polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene residuos
suficientes para proporcionar un epítopo frente al que se puede
fabricar un anticuerpo, aunque es suficientemente corto, de manera
que no interfiere en la actividad del polipéptido al que se fusiona.
El polipéptido etiqueta es también preferiblemente bastante único,
de manera que el anticuerpo sustancialmente no reacciona de forma
cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados
tienen generalmente por lo menos seis residuos de aminoácidos y
habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos
(preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de
aminoácidos).
Tal y como se utiliza en la presente invención,
el término "inmunoadhesina" designa moléculas de tipo
anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína
heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de
dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las
inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de
aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es otra a
parte del reconocimiento y sitio de unión a antígeno de un
anticuerpo (es decir, es "heterólogo"), y una secuencia de
dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una
molécula de inmunoadhesina habitualmente es una secuencia de
aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de
un receptor o ligando. La secuencia del dominio constante de
inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener a partir de
cualquier inmunoglobulina, tal como subtipos IgG-1,
IgG-2, IgG-3 o
IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e
IgA-2), IgE, IgD o IgM.
"Activo" o "actividad" para los
objetivos de la presente invención se refiere a una forma o formas
de un polipéptido PRO que retiene una actividad biológica y/o
inmunológica de PRO nativo o natural, donde actividad
"biológica" se refiere a una función biológica (inhibidora o
estimuladora) provocada por un PRO nativo o natural que es otra a
parte de la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo
contra un epítopo antigénico que se encuentra en un PRO nativo o
natural y una actividad "inmunológica" se refiere a la
capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un
epítopo antigénico que se encuentra en un PRO nativo o natural.
El término "antagonista" se utiliza en el
sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que parcial o
totalmente bloquea, inhibe o neutraliza una actividad biológica de
un polipéptido PRO nativo descrito en la presente invención. De
forma similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido
más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad
biológica de un polipéptido PRO nativo descrito en la presente
invención. Entre las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas se
incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos,
fragmentos o variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos
PRO nativos, péptidos, oligonucleótidos antisentido, pequeñas
moléculas orgánicas agonistas o antagonistas, etc. Los
procedimientos para identificar agonistas o antagonistas de un
polipéptido PRO puede comprender poner en contacto un polipéptido
PRO con una molécula agonista o antagonista candidata y la medida de
un cambio detectable en una o más actividades biológicas asociadas
normalmente con el
polipéptido PRO.
polipéptido PRO.
"Tratamiento" se refiere tanto a
tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas, en
el que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la condición
o trastorno patológico objetivo. Entre aquéllos que necesitan el
tratamiento se incluyen aquéllos que ya padecen el trastorno así
como aquéllos que son propensos a padecer el trastorno o aquéllos a
los que se debe prevenir el trastorno.
La administración "crónica" se refiere a la
administración del agente o agentes en un modo continuo en
oposición a un modo agudo, para mantener el efecto (actividad)
terapéutico inicial durante un periodo largo de tiempo. La
administración "intermitente" es el tratamiento que no se
realiza de forma consecutiva sin interrupción, sino que es bastante
cíclico en su naturaleza.
"Mamífero" para los objetivos del
tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero,
incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de
zoológico, de deporte o de compañía, tales como perros, gatos,
ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc.
Preferiblemente, el mamífero es humano.
La administración "combinada con" uno o más
agentes terapéuticos adicionales incluye la administración
simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
Los "potadores", tal y como se utiliza en
la presente invención, incluyen portadores, excipientes o
estabilizantes farmacéuticamente aceptables que son no tóxicos para
la célula o el mamífero expuestos a los mismos en las dosis y
concentraciones utilizadas. Frecuentemente el portador
fisiológicamente aceptable es una solución acuosa tamponada en el
pH. Entre los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables se
incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos
orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos
de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos);
proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como
manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como
sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM},
polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden
una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región
variable o de unión a antígeno del anticuerpo intacto. Entre los
ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen Fab, Fab',
F(ab')_{2} y fragmentos Fv; diabodies; anticuerpos lineales
(Zapata et al., Protein Eng. 8(10):
1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpos de
cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos
de anticuerpos.
La digestión con papaína de anticuerpos produce
dos fragmentos de unión a antígeno idénticas, llamados fragmentos
"Fab", cada uno con un sitio único de unión a antígeno y un
fragmento "Fc" residual, una nomenclatura que refleja la
capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina
proporciona un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios
de combinación a antígeno y aún es capaz de reticular el
antígeno.
"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo
que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento de
antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable
de cadena pesada y cadena ligera en asociación estrecha no
covalente. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada
dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a
antígeno en la superficie del dímero V_{H-}V_{L}.
Colectivamente, las seis CDRs confieren al anticuerpo una
especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un único
dominio variable (o la mitad de una Fv que comprende sólo tres CDRs
específicas de antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a
antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión
completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos
Fab' por la adición de una serie de residuos en el carboxi terminal
del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas
de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la
denominación en la presente invención para Fab' en el que el
residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un
grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')_{2}
se produjeron originalmente como parejas de fragmentos de Fab' que
tienen cisteínas bisagras entre ellos. También se conocen otros
acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de invertebrado se puede
asignar a uno de dos tipos claramente diferentes, llamados kappa y
lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios
constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácido del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se
pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales
de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varios de éstos de
pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4,
IgA e IgA2.
IgA e IgA2.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena
única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L}
del anticuerpo, en los que estos dominios se presentan en una única
cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende
además un polipéptido enlazador entre los dominios V_{H} y V_{L}
que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a
antígeno. Para una revisión de sFv ver Pluckthun en The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y
Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp.
269-315 (1994).
El término "diabodies" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a
antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena
pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(V_{L}) en la misma cadena de polipéptido (V_{H} - V_{L}).
Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el
emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los
dominios son forzados a emparejarse con los dominios
complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión a
antígeno. Los diabodies se describen más detalladamente en, por
ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 90:
6444-6448 (1993).
6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es el que se ha
identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de
su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural
son materiales que podrían interferir con las utilizaciones de
diagnóstico y terapéuticas del anticuerpo, y pueden incluir enzimas,
hormonas, y otros solutos proteináceos y no proteináceos. En
realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más
de un 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método de
Lowry, y más preferiblemente más de un 99% en peso, (2) hasta un
grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia
de aminoácidos N-terminal o interna mediante la
utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la
homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones
reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o,
preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el
anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya
que por lo menos un componente del medio natural del anticuerpo no
estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se
preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
La palabra "marcador" cuando se utiliza en
la presente invención se refiere a un compuesto o composición
detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo
para generar un anticuerpo "marcado". El "marcador" puede
ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o
marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático,
puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición
sustrato que es detectable.
Por "fase sólida" se entiende una matriz no
acuosa a la que se puede adherir el anticuerpo de la presente
invención. Entre los ejemplos de fases sólidas que se engloban en la
presente invención se incluyen las formadas parcial o totalmente de
vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por
ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinilalcohol
y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la
fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en
otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de
cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase
sólida discontinua de partículas discretas, tales como las
descritas en la Patente de Estados Unidos No. 4.275.149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña
compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos
que es útil para la liberación de un fármaco (tal como un
polipéptido PRO o un anticuerpo para el mismo) a un mamífero. Los
componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formación
de bicapa, similar a la disposición de las membranas biológicas.
Una "molécula pequeña" se define en la
presente invención que tiene un peso molecular por debajo de
aproximadamente 500 Daltons.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona secuencias de
nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican
polipéptidos a las que se hace referencia en la presente invención
como polipéptidos PRO. En particular, se han identificado y aislado
los ADNc que codifican varios polipéptidos PRO, tal y como se
describe con mayor detalle en los posteriores ejemplos. Cabe
indicar que las proteínas fabricadas en ciclos de expresión
diferentes pueden ser números PRO diferentes determinados, pero el
número UNQ es único para cualquier ADN determinado y la proteína
codificada, y no cambiará. Sin embargo, por simplicidad, en el
presente documento la proteína codificada por las moléculas de
ácido nucleico nativo de longitud completa descritas en la presente
invención así como todos los homólogos nativos adicionales y
variantes incluidas en la definición anterior de PRO, se referirán
como "PRO/número", independientemente de su origen o modo de
preparación.
Tal y como se describe en los Ejemplos
posteriores, se han depositado varias clases de ADNc con el ATCC.
Las secuencias de nucleótidos reales de dichos clones se pueden
determinar fácilmente por un experto en la materia mediante la
secuenciación del clon depositado utilizando procedimientos
rutinarios en la técnica. Para los polipéptidos PRO y los ácidos
nucleicos codificantes descritos en la presente, los solicitantes
han identificado lo que se cree que es el mejor marco de lectura
identificable con la información de la secuencia disponible en el
momento.
Según se conoce hasta la fecha, la secuencia
DNA84920-2614 codifica un factor nuevo designado en
la presente invención como PRO4405; utilizando los programas
informáticos de alineación de secuencias
WU-BLAST-2, se revelaron
identidades de secuencia limitadas a proteínas conocidas.
Además de los polipéptidos PRO de secuencia
nativa de longitud completa descritos en la presente, se contempla
que se pueden preparar variantes de PRO. Las variantes de PRO se
pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en
el ADN de PRO, y/o mediante la síntesis del polipéptido PRO deseado.
Los expertos en la materia apreciarán que los cambios de
aminoácidos pueden alterar los procesos
post-traduccionales del PRO, tales como el cambio
del número o la posición de los sitios de glicosilación o la
alteración de las características de anclamiento a la membrana.
Las variaciones en el PRO de secuencia nativa de
longitud completa o en varios dominios del PRO descritos en la
presente, se pueden realizar, por ejemplo, utilizando cualquiera de
las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no
conservativas establecidas, por ejemplo, en la Patente USA
5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, una deleción
o una inserción de uno o más codones que codifican el PRO que dan
lugar a un cambio en la secuencia de aminoácidos del PRO en
comparación con el PRO de secuencia nativa. Opcionalmente, la
variación es por sustitución de por lo menos un aminoácido por
cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del PRO. Al
determinar qué residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o
eliminar sin afectar de forma adversa la actividad deseada, se
puede encontrar una guía mediante la comparación de la secuencia
del PRO con la de las moléculas de proteínas conocidas homólogas y
minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos
realizadas en regiones con elevada homología. Las sustituciones de
aminoácidos pueden ser el resultado de la sustitución de un
aminoácido por otro aminoácido que tiene una estructura y/o
propiedades químicas similares, tales como la sustitución de una
leucina por una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos
conservativos. Las inserciones o deleciones pueden estar
opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos.
La variación permitida se puede determinar realizando inserciones,
deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia de forma
sistemática y probando en las variantes resultantes la actividad
mostrada por la secuencia nativa de longitud completa o
madura.
madura.
En la presente invención se proporcionan
fragmentos de polipéptido PRO. Dichos fragmentos se pueden truncar
en el extremo N-terminal o
C-terminal, o puede carecer de residuos internos,
por ejemplo, cuando se compara con una proteína nativa de longitud
completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que
no son esenciales para una actividad biológica deseada del
polipéptido PRO.
Los fragmentos de PRO se pueden preparar
mediante cualquiera del grupo de técnicas convencionales. Los
fragmentos de péptidos deseados se pueden sintetizar químicamente.
Un enfoque alternativo implica la generación de fragmentos de PRO
mediante digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con
una enzima conocida para dividir proteínas en los sitios definidos
por residuos de aminoácidos particulares o mediante la digestión
del ADN con enzimas de restricción adecuadas y el aislamiento del
fragmento deseado. Aún otra técnica implica el aislamiento y la
amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento de
polipéptido deseado, mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos
deseados del fragmento de ADN se utilizan en los cebadores del
extremo 5' y 3' en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos de
polipéptido PRO comparten por lo menos una actividad biológica y/o
inmunológica con el polipéptido PRO nativo descrito en la
presente.
presente.
En realizaciones particulares, las sustituciones
particulares de interés se muestran en la Tabla 6 bajo el
encabezamiento de sustituciones preferidas. Si dichas sustituciones
dan lugar a un cambio en la actividad biológica, entonces se
introducen más cambios sustanciales, denominados sustituciones de
ejemplo en la Tabla 6, o tal y como se describen posteriormente en
referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los
productos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las modificaciones sustanciales en la identidad
funcional o inmunológica del polipéptido PRO se llevan a cabo
mediante la selección de las sustituciones que difieren
significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del
esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por jemeplo,
como conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad
de la molécula en el sitio diana, o (c) el conjunto de la cadena
lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos en base a las
propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, val, leu,
ile;
(2) hidrofílica neutra: cys, ser, thr;
(3) ácida: asp, glu;
(4) básica: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de
la cadena: gly, pro; y
(6) aromática: trp, tyr, phe.
\newpage
Las sustituciones no conservativas comprenderá
el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Dichos residuos sustituidos también se pueden introducir en sitios
de sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios
restantes (no conservados).
Las variaciones se pueden realizar utilizando
procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis
mediada por oligonucleótidos (dirigida de sitio), el rastreo de
alanina, y mutágenesis por PCR. Para fabricar el ADN variante de
PRO se puede llevar a cabo sobre el ADN clonado una mutagénesis
dirigida de sitio [Carter et al., Nucl. Acids. Res.,
13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids. Res.,
10: 6487 (1987)], mutagénesis de cassette [Wells et al.,
Gene, 34 315 (1985)], mutagénesis de selección de
restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London
SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas.
El análisis de aminoácido por rastreo también se
puede realizar para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de
una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de rastreo preferidos
están los aminoácidos pequeños y neutros. Entre dichos aminoácidos
se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es
habitualmente una aminoácido de rastreo preferido entre este grupo
ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es
menos probable que altere la conformación de la cadena lateral de la
variante [Cunninghan y Wells, Science,
244:1081-1085 (1989)]. La alanina es también
habitualmente preferida ya que es el aminoácido más habitual.
Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas
como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and
Co., N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la
sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante,
se puede utilizar un aminoácido isotérico.
Las modificaciones covalentes de PRO están
incluidas en el alcance de la presente invención. Un tipo de
modificación covalente incluye la reacción de residuos de
aminoácidos marcados de un polipéptido PRO con un agente
derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas
laterales seleccionadas o los residuos N- o
C-terminales del PRO. La derivatización con agentes
bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular PRO con una
matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su utilización
en el procedimiento para purificar anticuerpos
anti-PRO, y viceversa. Entre los agentes de
reticulación utilizados habitualmente se incluyen, por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicílico,
imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres
disuccinimidílicos, tales como
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
maleimidas bifuncionales, tales como
bis-N-maleimido-1,8-octano
y agentes, tales como
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de
residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos
glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina
y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o
treonilo, metilación de los grupos \alpha-amino de
las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E.
Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.
Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86
(1983)], acetilación de la amina N-terminal, y la
amidación de cualquier grupo carboxilo
C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del
polipéptido PRO incluido en el alcance de la presente invención
comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del
polipéptido. Por "alteración del patrón de glicosilación
nativo" para los objetivos de la presente invención se pretende
indicar la eliminación de uno o más grupos carbohidratos hallados
en PRO de secuencia nativa (mediante la eliminación del sitio de
glicosilación subyacente o mediante la eliminación de la
glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o la adición
de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el
PRO de secuencia nativa. Además, la expresión incluye cambios
cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas,
implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos
grupos de carbohidrato presentes.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido PRO se puede realizar alterando la secuencia de
aminoácidos. La alteración se puede realizar, por ejemplo, mediante
la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o
treonina al PRO de secuencia nativa (para sitios de glicosilación
unidos a O). La secuencia de aminoácidos de PRO puede alterarse
opcionalmente a través de los cambios a nivel de ADN,
particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el
polipéptido PRO en bases preseleccionadas, de manera que los codones
que se generan se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios para aumentar el número de grupos
carbohidrato en el polipéptido PRO es mediante acoplamiento químico
o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos procedimientos
están descritos en la técnica, por ejemplo, en WO 87/05330
publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC
Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981).
La eliminación de grupos carbohidrato presentes
en el polipéptido PRO se puede realizar química o enzimáticamente o
mediante sustitución mutacional de codones que codifican los
residuos de aminoácidos que actúan como dianas para la
glicosilación. Las técnicas de desglicosilación químicas son
conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por
Hakimuddin, et. al. Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y
por Edge, et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división
enzimática de grupos carbohidrato del polipéptido se puede conseguir
mediante la utilización de un conjunto de endo- y exoglicosidasas
tal y como se describ en Thotakura et al. Meth. Enzymol.,
138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de PRO
comprende la unión del polipéptido PRO a uno del conjunto de
polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG),
polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma establecida en
las Patentes de Estados Unidos Nos: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;
4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
El PRO de la presente invención también se puede
modificar de manera que forma una molécula quimérica que comprende
PRO fusionado a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos
heterólogo.
En una realización, dicha molécula quimérica
comprende una fusión del PRO con un polipéptido etiqueta que
proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un
anticuerpo anti-etiqueta. El epítopo- etiqueta se
sitúa generalmente en el extremo terminal amino o carboxilo del PRO.
La presencia de dichas formas epítopo etiquetadas del PRO se pueden
detectar utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta.
Además, la disposición del epítopo etiqueta permite que el PRO se
purifique fácilmente mediante purificación de afinidad utilizando
un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de
afinidad que se une al epítopo etiqueta. En la técnica se conocen
varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Entre
los ejemplos se incluyen etiquetas poli-histidina
(poli-his) o
poli-histidina-glicina
(poli-his-gly); el polipéptido
etiqueta de gripe HA y su anticuerpo 12C45 [Field et al., Mol.
Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la
etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10,
G4, B7 y 9E10 de la misma [Evan et al., Molecular and Cellular
Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la
etiqueta de gliproteína D (gD) del virus del Herpes Simples y su
anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3
(6): 547-553 (1990)]. Entre otros polipéptidos
etiqueta se incluyen el péptido-Flag [Hopp et
al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)];
el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255:
192-194 (1992)]; un péptido epítopo de
\alpha-rubulina [Skinner et al., J. Biol.
Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; y el
péptido etiqueta de la proteína T7 del gen 10
[Lutz-Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 87: 6393-6397 (1990)].
En una realización alternativa, la molécula
quimérica puede comprender una fusión del PRO con una
inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina.
Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida
como "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser a una región Fc
de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferiblemente
la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado
o inactivado) de un polipéptido PRO en lugar de por lo menos una
región variable de una molécula de Ig. En una realización
particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la
bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, regiones CH1, CH2 y CH3 de una
molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de
inmunoglobulinas, véase también la Patente de USA No. 5.428.130
publicada el 27 de junio de 1995.
La siguiente descripción se refiere
principalmente a la producción de PRO mediante el cultivo de células
transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido
nucleico de PRO. Naturalmente, se prevé que se pueden utilizar
procedimientos alternativos, que se conocen bien en la técnica, para
preparar PRO. Por ejemplo, la secuencia de PRO, o partes de la
misma, se pueden producir mediante síntesis directa de péptidos
utilizando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewan et
al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H.
Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem.
Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis
de proteínas in vitro se pueden realizar utilizando técnicas
manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se
puede realizar, por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems
Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones
del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente varias partes del
PRO de forma separada y combinar utilizando procedimientos químicos
o enzimáticos para producir PRO de longitud completa.
El ADN que codifica PRO se puede obtener a
partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que
se cree que posee el ARNm de PRO y expresarlo a un nivel detectable.
Por consiguiente, el ADN de PRO humano se puede obtener
convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a
partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El
gen que codifica PRO también se puede obtener a partir de una
biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos
(por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos automatizada).
Las bibliotecas se pueden cribar con sondas
(tales como anticuerpos para PRO u oligonucleótidos de por lo menos
aproximadamente 20-80 bases) diseñados para
identificar el gen de interés o la proteína codificada por el
mismo. El cribado del ADNc o biblioteca genómica con la sonda
seleccionada se puede realizar utilizando procedimientos estándar,
tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica
PRO es utilizar la metodología de PCR [Sambrook et al.,
supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los siguientes Ejemplos describen técnicas para
cribar una librería de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos
seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y
suficiente inequívoca que se minimizan los falsos positivos. El
oligonucleótido está preferiblemente marcado de manera que se puede
detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se criba.
Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e
incluyen la utilización de radiomarcadores como ATP marcado con
^{32}P, biotinilación o marcaje enzimático. Las condiciones de
hibridación, incluyendo la astringencia moderada y la astringencia
elevada, se proporcionan en Sambrook et al., supra.
Las secuencias identificadas en dichos
procedimientos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y
alinear a otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en
los bancos de datos públicos, tales como el Banco de Genes u otros
bancos de datos de secuencias. La identidad de secuencia (a nivel de
aminoácido o nucleótido) en las regiones definidas de la molécula o
a lo largo de la secuencia de longitud completa se puede determinar
utilizando procedimientos conocidos en la técnica y tal y como se
describen en la presente.
El ácido nucleico que tiene la secuencia de
codificación de la proteína se puede obtener mediante el cribado
del ADNc seleccionado o las bibliotecas genómicas utilizando la
secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente invención
por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos
convencionales de extensión con cebadores tal y como se describe en
Sambrook et al., supra, para detectar precursores e
intermedios de procesamiento de ARNm que no se han transcrito de
forma inversa en ADNc.
Las células huésped se transfectan o transforman
con vectores de expresión o clonación descritos en la presente para
la producción de PRO y se cultivan en medios nutrientes
convencionales modificados para que sean adecuados para inducir
promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que
codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo,
tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se pueden
seleccionar por un técnico en la materia sin una experimentación
excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas
prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares se
pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical
Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al.,
supra.
Los procedimientos de transfección de células
eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos
por el técnico en la materia, por ejemplo, CaCl_{2}, CaPO_{4},
mediados por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula
huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas
estándar adecuadas a dichas células. El tratamiento de calcio que
utiliza cloruro cálcico, tal y como se describe en Sambrook et
al., supra, o la electroporación se utilizan generalmente para
procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se
utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal
como describe Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO
89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de
mamíferos sin dichas paredes celulares, se puede utilizar el
procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van
der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978).
En la Patente de Estados Unidos No. 4.399.216 se han descrito
aspectos generales de transfecciones de sistemas de células huésped
de mamíferos. Las transformaciones en la levadura se llevan a cabo
habitualmente según el procedimiento de Van Solingen et al., J.
Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también
se pueden utilizar otros procedimientos para introducir ADN en
células, tales como mediante microinyección nuclear,
electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células
intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina.
Para varias técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown
et al., Methods in enzymology, 185:527-537
(1990) y Manssur et al., Nature, 336. 348-352
(1988).
Entre las células huésped adecuadas para la
clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente
invención se incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas
superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, pero so se
limitan a, eubacterias, tales como organismos
Gram-negativo o Gram-positivo, por
ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Varias cepas
de E. coli están disponibles públicamente, tales como la
cepa de E. coli Ka12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli
X1776 (ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y
K5772 (ATCC 53.635). Entre otras células huésped procariotas
adecuadas se incluyen Enterobacteriaceae, tales como
Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Envinia,
Klebsiella, Proreus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella
typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans,
y Shigella, así como Bacilli, tal como B.
subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B.
licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de
abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, y
Streptomyces. Estos ejemplos son más ilustrativos que
limitantes, la Cepa W3110 es un huésped o huésped parental
particularmente preferible ya que es una cepa huésped para
fermentaciones de producto de ADN recombinante. Preferiblemente, la
célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos.
Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para realizar una
mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al
huésped, con ejemplos de dichos huéspedes incluyendo la cepa de
E. coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo
tonA; la cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el
genotipo completo tonA ptr3; la cepa de E. coli
W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo
tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP
ompT kan'; la cepa de E. coli W3110 37D6 (ATCC 55.244),
que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15
(argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan'; la cepa
de E. coli W3110 40B4, que es una cepa 37D6 con una mutación
de deleción degP no resistente a kanamicina; y una cepa de
E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en
la Patente de estados unidos No. 4.946.783 concedida el 7 de agosto
de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos de
clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de
ácido nucleico polimerasa.
Además de los procariotas, los microbios
eucariotas, tales como hongos o levaduras filamentosos, son
huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que
codifican PRO. El Saccharomyces cerevisiae es un
microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado habitualmente.
Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse,
Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada el 2 de mayo de
1985); huéspedes Kluyveromyces (Patente de Estados Unidos
No. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology,
9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K.
lactis (MW98-8C, CBS683, CBS574; Louvencourt
et al. J. Bacterial., 154(2):737-742
[1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus
(ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii
(ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg
et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), K.
thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226);
Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic.
Microbiol. 28:265-278 [1988]); Candida;
Trichoderma recia (EP 244.234); Neurospora crassa
(Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, tales
como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538, publicada el
31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por
ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357
publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus,
tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilbum et
al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474
[1984]) y A. Niger (Nelly y Hynes, EMBO J.,
4:475-479 [1985]). Las levaduras metiltrópicas son
adecuadas en la presente invención e incluyen, pero no se limitan
a, levadura capaz del crecimiento en metanol seleccionado del género
que consiste en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia,
Sacckaromyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de
especies específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras se
puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of
Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión
de PRO glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Entre
los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de
insectos, tales como Droshophila S2 y Spodoptera Sf9, así como
células vegetales. Entre los ejemplos de líneas celulares huésped de
mamíferos útiles se incluyen células de ovario de hámster chino
(CHO) y COS. Algunos ejemplos más específicos incluyen línea CV1 de
riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL
1651); línea de riñón de embrión humano (células 293 o 293
subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham
et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de
hámster chino/-DHFR (CHO. Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4,
Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));
células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado
humano (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC
CCl51). La selección de la célula huésped apropiada se estima que
está dentro de la técnica.
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN
genómico), que codifica PRO se puede insertar en un vector
replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la
expresión. Existen varios vectores disponibles públicamente. El
vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido,
partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada
se puede insertar en el vector mediante una serie de procedimientos.
En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa
de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en la
técnica. Los componentes de los vectores incluyen generalmente, pero
no se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de
replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un
promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La
construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos
componentes utiliza técnicas de unión estándar que son conocidas por
un técnico en la materia.
El PRO se puede producir recombinantemente no
sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con
un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro
polipéptido que tiene un sitio de división específico en el extremo
N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En
general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o
puede ser una parte del ADN que codifica el PRO que se inserta en
el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal
procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa
alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxinaII estable térmicamente
líderes. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede
ser, por ejemplo, la invertasa de levadura líder, el factor alfa
líder (incluyendo \alpha-factor
Saccharomyces y Kluyveromyces líderes, el último
descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5.010.182), o
fosfatasa ácida líder, la C. Albicans glucoamilasa líder (EP
362.179 publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en WO
90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de
células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos se pueden
utilizar para dirigir la secreción de la proteína, tales como
secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o
especies relacionadas, así como líderes virales secretores.
Ambos vectores de expresión y clonación
contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la
replicación del vector en uno o más células huésped seleccionadas.
Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias,
levadura, y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322
es adecuado para la mayoría de bacterias
gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es
adecuado para la levadura, y orígenes virales varios (SV40,
polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de
clonación en células de mamíferos.
Los vectores de clonación y expresión contendrán
habitualmente un gen de selección, también denominado como marcador
seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo, ampicillina, neomicina, metotrezato o tetraciclina, (b)
complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran
nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo,
el gen que codifica D-alanina racemasa para
Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células de mamíferos son aquéllos que permiten la
identificación de células competentes para captar el ácido nucleico
que codifica PRO, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula
huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea
de células CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y
propagada tal y como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado
para su utilización en la levadura es el gen trp1 presente
en el plásmido de la levadura YRp7 [Stinchcomb et al.,
Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141
(1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen
trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa
mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en
triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1
[Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Los vectores de clonación y expresión contienen
habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de
ácido nucleico que codifica PRO para dirigir la síntesis de ARNm.
Los promotores reconocidos por un conjunto de células huésped
potenciales son conocidos. Entre los promotores adecuados para
utilizar con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de
promotores de \beta-lactamasa y lactosa [Chang
et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al.,
Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de
promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res.,
8:4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos, tales como el
promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
80:21-25 (1983)]. Los promotores para utilizar en
sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de
Shine-Dalgamo (S.D.) unida operativamente al ADN que
codifica PRO.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras
adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen
promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman
et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas
glucolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);
holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, que son
promotores inducibles que tiene la ventaja adicional de una
transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento, son
las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo
C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el
metabolismo del nitrógeno, metalotioneina,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa
y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la
utilización en la expresión en levaduras se describen adicionalmente
en EP 73.657.
La transcripción de PRO desde vectores en
células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, mediante
promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus del
polioma, virus de la viruela aviar (Patente UK 2.211.504 publicada
el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el
virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus,
un retrovirus, virus de la hepatitis-B y virus de
simio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por
ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y
de promotores de choque térmico, siempre y cuando dichos promotores
sean compatibles con los sistemas de célula huésped.
Se puede incrementar la transcripción de un ADN
que codifica el PRO por eucariotas superiores mediante la inserción
de una secuencia de potenciador en el vector. Los potenciadores son
elementos que actúan en cis de ADN, habitualmente aproximadamente
de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para aumentar su
transcripción. Muchas secuencias de potenciador se conocen
actualmente de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina,
\alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente,
sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus de célula
eucariota. Ente los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en
la cara tardía del origen de replicación (pb
100-270), el potenciador de promotor temprano de
citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del
origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador
se puede cortar y empalmar ("splice") en el vector en una
posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante de PRO,
pero se sitúa preferiblemente en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células
huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la
terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm.
Dichas secuencias están disponibles habitualmente desde las
regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs
eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de
nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte
no traducida del ARNm que codifica PRO.
En Gething et al., Nature,
293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature,
281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058 se
describen adicionalmente otros procedimientos, vectores, y células
huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de PRO en
cultivos de células de vertebrados recombinantes.
La amplificación y/o expresión de los genes se
puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante
transferencia Southern convencional, transferencia Northern
convencional para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205
(1980)], transferencia de puntos (análisis de AND), o hibridación
in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, basadas
en las secuencias proporcionadas en la presente invención.
Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden
reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de
ARN, dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de
ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden
marcar y el ensayo se puede llevar a cabo cuando el dúples está
unido a una superficie, de manera que tras la formación del dúplex
en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpos
unidos al dúplex.
La expresión génica, alternativamente, se puede
medir mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción
inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de
cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos
útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de
ejemplo pueden ser monoclonales o policlonales, y se puede preparar
en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden
preparar contra un polipéptido PRO de secuencia nativa o contra un
péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en
la presente invención o contra una secuencia exógena fusionada a
ADN de PRO que codifica un epítopo de anticuerpo específico.
Las formas de PRO se pueden recuperar del medio
de cultivo o de los lisatos de células huésped. Si está unido a
membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución de
detergente adecuada (por ejemplo, Triton X-100) o
mediante división enzimática. Las células utilizadas en la expresión
de PRO se pueden interrumpir mediante diversos medios físicos o
químicos, tales como ciclo
congelación-descongelación, sonicación, interrupción
mecánica, o agentes para lisar células.
Se puede desear purificar PRO a partir de
proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes
procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación
adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio
iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa;
cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio catiónico,
tal como DEAE; "cromatofocusing"; SDS-PAGE;
precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando,
por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A
sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG, y columnas
quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo del
PRO. Se pueden utilizar varios métodos de purificación de proteína
y dichos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por
ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990);
Scopes, Protein Purification: Principles ad Practice,
Springer-Verlag, Nueva York (1982). La etapa o
etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la
naturaleza del proceso de producción utilizado y el PRO concreto
producido.
Las secuencias de nucleótidos (o sus
complementarias) que codifican PRO tiene varias aplicaciones en la
disciplina de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de
hibridación, en el mapeo de cromosomas y genes y en la generación
de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico de PRO también será útil
para la preparación de polipéptidos PRO mediante las técnicas
recombinantes descritas en la presente invención.
El gen de PRO de secuencia nativa de longitud
completa, o partes del mismo, se pueden utilizar como sondas de
hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc de PRO
de longitud completa o para aislar incluso otros ADNcs (por
ejemplo, aquéllos que codifican variantes naturales de PRO o PRO de
otras especies) que tienen una identidad de secuencia deseada a la
secuencia de PRO nativa descrita en la presente. Opcionalmente, la
longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a aproximadamente
50 bases. Las sondas de hibridación se pueden derivar de por lo
menos regiones parcialmente nuevas de la secuencia de nucleótidos
nativa de longitud completa en la que dichas regiones se pueden
determinar sin una experimentación excesiva o de secuencias
genómicas que incluyen promotores, elementos potenciadores e
intrones de PRO de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un
procedimiento de cribado comprenderá el aislamiento de la región
codificante del gen de PRO utilizando la secuencia de ADN conocida
para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases.
Las sondas de hibridación se pueden marcar con una serie de
marcadores, incluyendo radionucleótidos, tales como ^{32}P o
^{35}S, marcadores enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina
acoplada a la sonda a través de los sistemas de acoplamiento
avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia
complementaria a la del gen de PRO de la presente invención se
pueden utilizar para cribar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico
o ARNm para determinar a qué miembros de dichas bibliotecas se
hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con mayor
detalle en los siguientes Ejemplos.
Cualquier secuencia EST descrita en la presente
solicitud se puede utilizar de forma similar como sondas, utilizando
los procedimientos descritos en la presente invención.
Entre otros fragmentos útiles de los ácidos
nucleicos de PRO se incluyen oligonucleótidos antisentido y sentido
que comprenden una secuencia de ácido nucleico de cadena única (ARN
o ADN) capaz de unirse a secuencias de ARNm de PRO diana (sentido)
o ADN de PRO (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o
sentido, según la presente invención, comprende un fragmento de la
región codificante de ADN de PRO. Dicho fragmento comprende
generalmente por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos,
preferiblemente de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La
capacidad de derivar un oligonucleótido antisentido o sentido,
basado en una secuencia de ADN c que codifica una proteína
determinada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer
Res., 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques
6:958, 1988).
La unión de oligonucleótidos sentido y
antisentido a secuencias de ácidos nucleico diana da lugar a la
formación de dúplex que bloquean la transcripción o la traducción de
la secuencia diana mediante uno de los diferentes medios, que
incluyen la degradación aumentada de los dúplex, la terminación
prematura de la transcripción o la traducción, o mediante cualquier
otro medio. De este modo, los oligonucleótidos antisentido se puede
utilizar para bloquear la expresión de proteínas PRO. Los
oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden además
oligonucleótidos que tienen esqueletos de
azúcar-fosfodiéster modificados (u otras uniones a
azúcares, tales como las descritas en WO 91/06629) y en los que
dichas unión a azúcares son resistentes a nucleasas endógenas.
Dichos oligonucleótidos con uniones a azúcares resistentes son
estables in vivo (es decir, capaces de resistir la
degradación enzimática) pero que mantienen la especificidad de
secuencia para ser capaces de unirse a las secuencias de
nucleótidos diana.
Entre otros ejemplos de oligonucleótidos sentido
o antisentido se incluyen aquellos nucleótidos que están unidos
covalentemente a grupos orgánicos, tales como los descritos en WO
90/10048, y otros grupos que aumentan la afinidad del
oligonucleótido por una secuencia de ácidos nucleicos diana, tal
como poli-(L-lisina). Además, los agentes
intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o
complejos metálicos se pueden unir a oligonucleótidos sentido o
antisentido para modificar las especificidades de unión del
oligonucleótido antisentido o sentido para la secuencia de
nucleótidos diana.
Los oligonucleótidos sentido o antisentido se
pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de ácidos
nucleicos diana mediante cualquier procedimiento de transferencia de
genes, incluyendo, por ejemplo, CaPO_{4} mediada por la
transfección de ADN, electroporación, o mediante la utilización de
vectores de transferencia de genes, tales como el virus
Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un
oligonucleótido antisentido o sentido se inserta en un vector
retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácidos
nucleicos diana se pone en contacto con el vector retroviral
recombinante, in vivo o ex vivo. Entre los vectores
retrovirales adecuados se incluyen, pero no se limitan a, los
derivados de retrovirus murino M-MuLV, N2 (un
retrovirus derivado de M-MuLV) o los vectores de
copia doble designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase WO 90/13641).
Los oligonucleótidos sentido o antisentido
también se pueden introducir en una célula que contiene la
secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado
con una molécula de unión ligando, tal y como se describe en WO
91/04753. Las moléculas de unión ligandos se incluyen, pero no se
limitan a, receptores de la superficie de las células, factores de
crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a
receptores de la superficie de las células. Preferiblemente, la
conjugación de la molécula de unión ligando no interfiere
sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión ligando
para unirse a su correspondiente molécula o receptor, ni bloquea la
entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión
conjugada en la célula.
Alternativamente, un oligonucleótido sentido o
antisentido se puede introducir en una célula que contiene la
secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un
complejo oligonucleótido-lípido, tal y como se
describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o
antisentido-lípido se disocia preferiblemente en el
interior de la célula mediante una lipasa endógena.
Las moléculas de ARN o ADN antisentido o sentido
son generalmente por lo menos aproximadamente 5 bases de longitud,
aproximadamente 10 bases de longitud, aproximadamente 15 bases de
longitud, aproximadamente 20 bases de longitud, aproximadamente 25
bases de longitud, aproximadamente 30 bases de longitud,
aproximadamente 35 bases de longitud, aproximadamente 40 bases de
longitud, aproximadamente 45 bases de longitud, aproximadamente 50
bases de longitud, aproximadamente 55 bases de longitud,
aproximadamente 60 bases de longitud, aproximadamente 65 bases de
longitud, aproximadamente 70 bases de longitud, aproximadamente 75
bases de longitud, aproximadamente 80 bases de longitud,
aproximadamente 85 bases de longitud, aproximadamente 90 bases de
longitud, aproximadamente 95 bases de longitud, aproximadamente 100
bases de longitud, o más.
Las sondas también se pueden utilizar en
técnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para la
identificación de secuencias de codificación de PRO estrechamente
relacionadas.
Las secuencias de nucleótidos que codifican un
PRO también se puede utilizar para construir sondas de hibridación
para mapear el gen que codifica el PRO y para el análisis genético
de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de
nucleótidos proporcionadas en la presente invención se pueden mapear
a un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando
técnicas conocidas, tales como hibridación in situ, análisis
de unión contra marcadores cromosómicos conocidos, y el cribado de
hibridación con bibliotecas.
Cuando las secuencias codificantes de PRO
codifican una proteína que se une a otra proteína (por ejemplo,
cuando el PRO es un receptor), el PRO se puede utilizar en ensayos
para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas en la
interacción de unión. Mediante dichos procedimientos, se pueden
identificar los inhibidores de la interacción receptor/ligando. Las
proteínas implicadas en dichas interacciones de unión también se
pueden utilizar para cribar inhibidores o agonistas de péptidos o
moléculas pequeñas de la interacción de unión. Además, el receptor
PRO se puede utilizar para aislar el ligando o ligando correlativos.
Los ensayos de cribado se pueden diseñar para encontrar compuestos
candidatos que imitan la actividad biológica de un PRO nativo o un
receptor para PRO. Dichos ensayos de cribado incluirán ensayos
susceptibles de cribar con un alto rendimiento bibliotecas
químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar
pequeñas moléculas como fármacos candidatos. Entre las pequeñas
moléculas contempladas se incluyen compuestos orgánicos o
inorgánicos sintéticos. Los ensayos se pueden realizar en una
variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican PRO o sus
formas modificadas también se pueden utilizar para generar animales
transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles
en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un
animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal
que tiene células que contienen un transgén, el cual se introdujo
en el animal o en un antecesor del animal en estado prenatal, por
ejemplo, una etapa embrionaria. Un transgén es un ADN que está
integrado en el genoma de una célula de la que se desarrolla un
animal transgénico. En una realización, el ADN c que codifica PRO se
puede utilizar para clonar ADN genómico que codifica PRO según las
técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para
generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN
que codifica PRO. Los procedimientos para generar animales
transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas,
se han convertido en convencionales en la técnica y se describen,
por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.736.866 y
4.870.009. Habitualmente, se marcarían células concretas para la
incorporación del transgén de PRO con potenciadores específicos de
tejido. Se pueden utilizar animales transgénicos que incluyen una
copia de un transgén que codifica PRO introducido en la línea
germinal del animal en una etapa embrionaria, para examinar el
efecto de la expresión aumentada de ADN que codifica PRO. Dichos
animales se pueden utilizar como animales de prueba para reactivos
pensados para conferir protección de, por ejemplo, condiciones
patológicas asociadas con su sobreexpresión. Según este aspecto de
la invención, el tratamiento de un animal con el reactivo y la
reducción de la incidencia de la condición patológica, en
comparación con animales no tratados que llevan el transgén,
indicaría una intervención terapéutica potencial en la condición
patológica.
Alternativamente, se pueden utilizar los
homólogos no humanos de PRO para construir un animal "knock
out" con PRO que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica
PRO como resultado de la recombinación homóloga entre el gen
endógeno que codifica PRO y el AND genómico alterado que codifica
PRO introducido en una célula madre embrionaria del animal. Por
ejemplo, el ADNc que codifica PRO se puede utilizar para clonar ADN
genómico que codifica PRO según las técnicas establecidas. Una
parte del ADN genómico que codifica PRO se puede eliminar o
sustituir por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador
seleccionable que se puede utilizar para monitorizar la
integración. Habitualmente, se incluyen en el vector varias
kilobases de ADN flanqueante inalterado (en los extremos 5' y 3')
[véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987)
para una descripción de vectores de recombinación homólogos]. El
vector se introduce en una línea de células madres embrionarias
(por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de
agregación [véase, por ejemplo, Bradley, en Teralocarcinomas
y Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J.
Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), páginas
113-152]. A continuación, un embrión quimérico se
puede implantar en un animal criado hembra pseudoembarazada adecuado
y el embrión producido para crear un animal "knock out". La
progenie que esconde el ADN recombinado homólogamente en las
células germinales se puede identificar mediante técnicas estándar y
utilizada para criar animales en los que todas las células de los
mismos contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales
knock out se pueden caracterizar, por ejemplo, por su capacidad de
defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su
desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del
polipéptido PRO.
El ácido nucleico que codifica los polipéptidos
PRO también se pueden utilizar en terapia génica. En aplicaciones
de terapias génicas, los genes se introducen en células para
conseguir síntesis in vivo de un producto genético
terapéuticamente eficaz, por ejemplo, para la sustitución de un gen
defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la terapia
génica convencional en la que se consigue un efecto duradero
mediante un único tratamiento, como la administración de agentes
terapéuticos génicos, que implica la administración de una vez o
repetitiva de un ADN o ARN terapéuticamente eficaz. Se pueden
utilizar los ADNs y ARNs antisentido como agentes terapéuticos para
bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. También se ha
observado que los oligonucleótidos antisentido cortos se pueden
importar en células en las que actúan como inhibidores, a pesar de
sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su captación
limitada por la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Los
oligonucleótidos se pueden modificar para aumentar su captación,
por ejemplo, mediante la sustitución de sus grupos diéster cargados
negativamente por grupos no cargados.
Existe una variedad de técnicas disponibles para
introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían
dependiendo si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas
in vitro, o in vivo en las células del huésped
deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido
nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen la
utilización de liposomas, electroporación, microinyección, fusión
celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de
precipitación con fosfato cálcico, etc. Entre las técnicas de
transferencia génica in vivo preferidas se incluyen la
transfección con vectores virales (habitualmente retrovirales) y la
transfección mediada por liposoma-proteínas de
cubierta viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11,
205-210 [1993]). En algunas situaciones, es deseable
proporcionar la fuente de ácidos nucleicos con un agente que marca
las células diana, tales como un anticuerpo específico para una
proteína de membrana de superficie de la célula o la célula diana,
un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se
utilizan liposomas, se pueden utilizar proteínas que se unen a una
proteína de membrana de superficie de la célula asociada con
endocitosis para dirigir y/o facilitar la captación, por ejemplo,
proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un
tipo de célula concreta, anticuerpos para proteínas que experimentan
internalización en el ciclado, proteínas que dirigen la
localización intracelular y el aumento de la vida media
intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por receptor se
describe en, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 262,
4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Para una
revisión de los protocolos de marcaje génico y terapia génica,
véase Anderson et al., Science 256, 808-813
(1992).
Los polipéptidos PRO descritos en la presente
invención también se pueden utilizar como marcadores del peso
molecular para en electroforesis de proteínas y las secuencias de
ácido nucleico aisladas se pueden utilizar para expresar
recombinantemente dichos marcadores.
Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican
los polipéptidos PRO o fragmentos de los mismas descritas en las
presente invención son útiles para la identificación de cromosomas.
En este aspecto, existe una necesidad actual para identificar
nuevos marcadores de cromosomas, ya que actualmente hay disponibles
relativamente pocos reactivos marcadores de cromosomas, en base a
los datos de secuencias disponibles. Cada molécula de ácido
nucleico de PRO de la presente invención se puede utilizar como
marcador de cromosomas.
Los polipéptidos PRO y las moléculas de ácido
nucleico de la presente invención también se pueden utilizar para
la caracterización de tejidos, en la que los polipéptidos de la
presente invención se pueden expresar diferencialmente en un tejido
en comparación con otro. Las moléculas de ácido nucleico de PRO se
utilizarán para generar sondas para PCR, análisis Northern,
análisis Southern y análisis Western.
Los polipéptidos PRO descritos en la presente
invención también se pueden utilizar como agentes terapéuticos. Los
polipéptidos PRO de la presente invención se pueden formular según
los procedimientos conocidos para preparar composiciones
farmacéuticamente útiles, a través de los cuales el producto PRO de
los mismos se combina en una mezcla con un vehículo portador
farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas se
preparan para el almacenamiento mediante la mezcla del principio
activo que tiene el grado deseado de pureza con portadores,
excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables
(Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª Edición, Osol, A.
Ed. (1980)) en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones
acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables
son no tóxicos para los destinatarios a las dosis y concentraciones
utilizadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros
ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico;
polipéptidos de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10
residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como
polivinilpirrolidona, aminoácidos, tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como
manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como
sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM},
PLURONICS^{TM} o PEG.
Las formulaciones a utilizar para la
administración in vitro debe ser estéril. Esto se realiza
fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles, previamente a o posterior a la liofilización y
reconstitución.
Las composiciones terapéuticas de la presente
invención generalmente se colocan en un recipiente que tiene un
recipiente de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de
solución intravenosa que tiene tapón penetrable por una aguja de
inyección hipodérmica.
La ruta de administración está de acuerdo con
procedimientos conocidos, por ejemplo, la inyección o infusión
mediante las rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral,
intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional,
administración tópica, o mediante sistemas de liberación
controlada.
Las dosis y concentraciones del fármaco deseadas
de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden
variar dependiendo de la utilización particular prevista. La
determinación de la dosis o la ruta de administración apropiadas
están dentro del conocimiento de un médico habitual. Los
experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la
determinación de dosis eficaces para la terapia humana. El escalado
entre especies de dosis eficaces se puede llevar a cabo siguiendo
los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The
use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics
and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon
Press, Nueva York, 1989, páginas 42-96.
Cuando se utiliza la administración in
vivo de un polipéptido PRO o agonista o antagonista del mismo,
las cantidades de dosificación normales pueden variar desde
aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de masa corporal de
mamífero o más por día, preferiblemente aproximadamente 1
\mug/kg/día hasta 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de
administración. Las guías de las dosis concretas y los
procedimientos de liberación se proporcionan en la literatura;
véase, por ejemplo, Patentes U.S. Nos. 4.657.760; 5.206.344; o
5.225.212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán eficaces
para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos,
que la administración que se dirige a un órgano o tejido, por
ejemplo, puede necesitar la liberación de una manera diferente a la
de otro órgano o
tejido.
tejido.
Cuando se desea la administración por liberación
controlada de un polipéptido PRO en una formulación con
características de liberación adecuadas para el tratamiento de
cualquier enfermedad o trastorno que requiere la administración del
polipéptido PRO, se contempla la microencapsulación del polipéptido
PRO. La microencapsulación de proteínas recombinantes para la
liberación controlada se ha realizado satisfactoriamente con la
hormona del crecimiento humano (rhGH), interferón- (rhIFN-),
interleuquina-2, y MN rgp 120. Jonson et al.,
Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed.
Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al.,
Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland,
"Design and Production of Single Immunization Vaccines Using
Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems", en Vaccine
Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, eds,
(Plenum Press: New York, 1995), páginas 439-462; WO
97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y Patente U.S. No.
5.654.010.
Las formulaciones de liberación controlada de
estas proteínas se desarrollaron utilizando polímero de ácido
poli-láctico-coglicólico (PLGA)
debido a su biocompatibilidad y amplio rango de propiedades
biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos
láctico y glicólico se puede aclarar rápidamente en el interior del
cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero se puede
ajustar de meses a años dependiendo de su peso molecular y la
composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from
lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin y R. Langer (Eds.),
Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel
Dekker: New York, 1990), páginas 1-41.
La presente invención comprende procedimientos
de cribado de compuestos para identificar aquéllos que imitan el
polipéptido PRO (agonistas) o prevenir el efecto del polipéptido PRO
(antagonistas). Los ensayos de cribado para candidatos de fármacos
agonistas se diseñan para identificar compuestos que se unen o
complejan con los polipéptidos PRO codificados por los genes
identificados en la presente invención, o bien interfieren con la
interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas
celulares. Dichos ensayos de cribado incluirán ensayos susceptibles
de cribar con un alto rendimiento bibliotecas químicas, haciéndolos
particularmente adecuados para identificar pequeñas moléculas como
fármacos candidatos.
Los ensayos se pueden realizar en una variedad
de formatos incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en la técnica.
Todos los ensayos para antagonistas son comunes
en que requieren el contacto del fármaco candidato con un
polipéptido PRO codificado por un ácido nucleico identificado en la
presente bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para
permitir que estos dos componentes interaccionen.
En ensayos de unión, la interacción es la unión
y el complejo formado se puede aislar o detectar en la mezcla de
reacción. En una realización particular, el polipéptido PRO
codificado por el gen identificado en la presente invención o el
fármaco candidato se inmobiliza sobre una fase sólida, por ejemplo,
una placa de microtítulos, mediante enlaces covalentes o no
covalentes. La unión covalente se realiza generalmente mediante el
recubrimiento de la superficie sólida con una solución del
polipéptido PRO y el secado. Alternativamente, se puede utilizar un
anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal,
específico para el polipéptido PRO a inmovilizar, para anclarlo a
la superficie sólida. El ensayo se realiza mediante la adición del
componente no inmovilizado, que se puede detectar mediante una
marca detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la
superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando se
completa la reacción, se extraen los componentes no reaccionados,
por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los complejos anclados a
la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no
inmovilizado transporta una marca detectable, la detección de la
marca inmovilizada en la superficie indica que tuvo lugar la
complejación. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no
transporta una marca, se puede detectar la complejación, por
ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente
al complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interacciona con, pero
no se une a un polipéptido PRO particular codificado por un gen
identificado en la presente invención, su interacción con ese
polipéptido se pueden ensayar mediante procedimiento conocidos para
detectar interacciones proteína-proteína. Dichos
ensayos incluyen enfoques tradicionales, tales como, por ejemplo,
reticulación, coinmunoprecipitación y copurificación a través de
gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones
proteína-proteína se pueden monitorizar mediante la
utilización de sistemas genéticos basados en levaduras descritos
por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (London),
340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991)). Muchos
activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura,
consisten en dos dominios modulares físicamente discretos, uno
actuando como el dominio de unión a ADN, el otro actuando como el
dominio de transcripción-activación. El sistema de
expresión en las levaduras descrito en las publicaciones anteriores
(referidas generalmente como "el sistema de dos híbridos")
saca ventaja de esta propiedad e utiliza dos proteínas híbridas, una
en la que se fusiona la proteína diana al dominio de unión a ADN de
GAL4, y otra, en la que las proteínas activadoras candidatas se
fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen
informador GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado
por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 a
través de la interacción de proteína-proteína. Las
colonias que contienen polipéptidos que interaccionan se detectan
con un sustrato cromatogénico para
\beta-galactosidasa. En Clontech se encuentra
disponible comercialmente un equipo completo (MATCHMAKER^{TM})
para identificar interacciones proteína-proteína
entre dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos
híbridos. Este sistema también se puede extender para mapear
dominios de proteínas implicados en las interacciones de proteínas
específicas así como para precisar los residuos de aminoácidos que
son cruciales para estas interacciones.
Los compuestos que interfieren con la
interacción de un gen que codifica un polipéptido PRO identificado
en la presente y otros componentes intra- o extracelulares se puede
ensayar tal y como se indica a continuación: habitualmente se
prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el
componente intra- o extracelular bajo condiciones y durante un
tiempo se permite la interacción e unión de los dos productos. Para
ensayar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la
unión, la reacción se desarrolla en la ausencia y en presencia del
compuesto de prueba. Además, se puede añadir un placebo a una
tercera mezcla de reacción, para usar como control positivo. La
unión (formación de complejo) entre el compuesto de prueba y el
componente intra- o extracelular presente en la mezcla se monitoriza
tal y como se describe anteriormente en la presente. La formación
del complejo en la reacción o reacciones de control, pero no en la
mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, indica que
el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto
de prueba y su compañero de reacción.
Para ensayar antagonistas, el polipéptido PRO se
puede añadir a una célula junto con el compuesto a cribar para una
actividad concreta y la capacidad del compuesto para inhibir la
actividad de interés en presencia del polipéptido PRO indica que el
compuesto es un antagonista del polipéptido PRO. Alternativamente,
los antagonistas se pueden detectar mediante la combinación del
polipéptido PRO y un antagonista potencial con los receptores de
polipéptido PRO unido a membrana o receptores recombinantes bajo
condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El
polipéptido PRO se puede marcar, tal como mediante radiactividad, de
manera que el número de moléculas de polipéptidos PRO unidas al
receptor se puede utilizar para determinar la eficacia del
potencial antagonista. El gen que codifica el receptor se puede
identificar mediante numerosos procedimientos conocidos por los
expertos en la materia, por ejemplo, "panning" de ligando y
clasificación de FACS. Coligan et al. Current Protocols in
Immun., 1(2): Capítulo 5 (1991). Preferiblemente, la
clonación de la expresión se utiliza cuando el ARN poliadenilado se
prepara a partir de una célula sensible al polipéptido PRO y se
divide en grupos una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN
y se utiliza para transfectar células COS u otras células que no
son sensibles al polipéptido PRO. Las células transfectadas que se
desarrollan sobre portamuestras de vidrio se exponen a polipéptido
PRO marcado. El polipéptido PRO se puede marcar mediante una
variedad de medios que incluyen la yodinación o inclusión de un
sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica de
sitio. Tras la fijación e incubación, los portamuestras se someten a
análisis autoradiográfico. Los grupos positivos se identifican y
los sub-grupos se preparan y se retransfectan
utilizando un proceso de subagrupación y recribado interactivos,
obteniendo finalmente un único clon que codifica el receptor
putativo.
Como enfoque alternativo para la identificación
del receptor, el polipéptido PRO marcado se puede unir por
fotoafinidad con la membrana celular o preparaciones de extracto que
expresan la molécula receptora. El material reticulado se resuelve
mediante PAGE y se expone a la película de rayos X. El complejo
marcado que contiene el receptor se puede escindir, resolver en
fragmentos de péptidos, y someter a la microsecuenciación de
proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la
microsecuenciación se utilizaría para diseñar un conjunto de sondas
de oligonucleótidos degenerados para cribar una biblioteca de ADNc
para identificar el gen que codifica el receptor
putativo.
putativo.
En otro ensayo para antagonistas, las células de
mamíferos o una preparación de membrana que expresa el receptor se
incubarían con polipéptido PRO marcado en presencia del compuesto
candidato. A continuación, se podría medir la capacidad del
compuesto para aumentar o bloquear esta interacción.
Más ejemplos específicos de antagonistas
potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones
de inmunoglobulina con polipéptido PRO, y, en particular,
anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos policlonales
y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena
única, anticuerpos anti-idiotípica y las versiones
quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así
como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos.
Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína
estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del
polipéptido PRO que reconoce el receptor pero no transmite el
efecto, inhibiendo así competitivamente la acción del polipéptido
PRO.
Otro antagonista de polipéptido PRO potencial es
una construcción de ADN o ARN antisentido preparado utilizando
tecnología antisentido, cuando, por ejemplo, una molécula de ADN o
ARN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción del
ARNm mediante la hibridación a ARNm marcado y evitando la traducción
de la proteína. La tecnología antisentido se puede utilizar para
controlar la expresión génica a través de la formación de una
triple hélice o ADN o ARN antisentido, ambos procedimientos basados
en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la parte
codificante 5' de la secuencia del polinucleótido, que codifica los
polipéptidos PRO maduros de la presente invención, se utiliza para
diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10
a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN
para que sea complementario a una región del gen implicada en la
transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucl. Acids
Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456
(1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), evitando
así la transcripción y la producción del polipéptido PRO. El
oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida al ARNm in vivo
y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido
PRO (antisentido - Okano, Neurochem., 56:560 (1991);
Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression
(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos
anteriormente también se pueden liberar a las células, de manera que
el ARN o ADN antisentido se pueden expresar in vivo para
inhibir la producción del polipéptido PRO. Cuando se utiliza ADN
antisentido, se prefieren oligodesoxinucleótidos derivados del
sitio, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones -10 y +10
de la secuencia de nucleótidos del
gen diana.
gen diana.
Entre los antagonistas potenciales se incluyen
pequeñas moléculas que se unen al sitio activo, el sitio de unión
al receptor, o el factor de crecimiento u otro sitio de unión
pertinente del polipéptido PRO, bloqueando de esta manera la
actividad biológica normal del polipéptido PRO. Entre los ejemplos
de moléculas pequeñas se incluyen, pero no se limitan a, péptidos
pequeños o moléculas similares a péptidos, preferiblemente péptidos
solubles y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptídicos
sintéticos.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas
capaces de catalizar la división específica de ARN. Las ribozimas
actúan mediante la hibridación específica de secuencia al ARN diana
complementario, seguido de la división endonucleolítica. Los sitios
de división específica de la ribozima en un ARN potencial diana se
puede identificar mediante técnicas conocidas. Para más detalles,
véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology,
4:469-471 (1994) y publicación de PCT No. WO
97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en formación de
triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción debería ser
de cadena única y compuestas de desoxinucleótidos. La composición de
las bases de estos oligonucleótidos se diseña de manera que induce
la formación de la triple hélice a través de las reglas de
emparejamiento de bases Hoogsteen, que generalmente requiere tramos
considerables de purinas o pirimidinas en una cadena de un dúplex.
Para más detalles, véase, por ejemplo, la publicación de PCT No. WO
97/33551, supra.
Estas pequeñas moléculas se pueden identificar
mediante uno o más de los ensayos de cribado descritos
anteriormente en la presente invención y/o mediante cualquier otra
técnica de cribado conocida para un experto en la materia.
Las utilizaciones de las moléculas descritas en
la presente invención también pueden estar basadas en los éxitos de
los ensayos funcionales positivos dados a conocer y descritos a
continuación.
La presente invención proporciona además
anticuerpos anti-PRO. Entre los anticuerpos de
ejemplo se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales,
humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.
Los anticuerpos anti-PRO pueden
comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos de
preparación de anticuerpos policlonales son conocidos para el
experto en la materia. Los anticuerpos policlonales se pueden
desarrollar en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más
inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante.
Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en
el mamífero mediante inyecciones múltiples subcutáneas o
intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el
polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil
conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida para que sea
inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de
dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, pero no se limitan a
hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero,
tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soja. Entre los
ejemplos de adyuvantes se pueden incluir el adyuvante completo de
Preund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido
A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de
inmunización se puede seleccionar por un experto en la materia sin
una gran experimentación.
Los anticuerpos anti-PRO pueden
ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales se pueden preparar utilizando procedimientos de
hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein,
Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de
hibridoma, se inmuniza habitualmente un ratón, un hámster u otro
animal huésped apropiado con un agente inmunizante para obtener
linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que
se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente,
los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.
El agente inmunizante incluirá habitualmente el
polipéptido PRO o una proteína de fusión de la misma. Generalmente,
se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PLBs") si se
desean células de origen humano, o células de bazo o se utilizan
células de nódulos linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no
humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea
celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal
como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academia
Press, (1986), páginas 59-103]. Las líneas celulares
inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas,
particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y
humano. Habitualmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de
rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un
medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más
sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las
células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células
parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina
fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para
los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina y
timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento
de células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son aquéllas que se fusionan de manera eficaz, soportan un nivel de
expresión elevado estable del anticuerpo por las células productoras
de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como
medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son
líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del
Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la
American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas
celulares de mieloma humano y heteromieloma de
ratón-humano se han descrito para la producción de
anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol.,
133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production
Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York,
(1987) páginas, 51-63].
A continuación, el medio de cultivo en el que
las células de hibridoma se cultivan se pueden ensayar para la
presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el PRO.
Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos
monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in
vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo
inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos
se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo
monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis
Scatchard de Munson y Poliard, Anal. Biochem., 107:
220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los
procedimientos de dilución y se pueden desarrollar mediante
procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de
cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio
de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640.
Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar
in vivo como ascitis en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o
fluido de ascitis mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína
A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito,
eletroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden
fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como
los descritos en la Patente U.S. No. 4.816.567. El ADN que codifica
los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden
aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos
convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de
oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes
que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos).
Las células de hibridoma de la presente invención sirven como una
fuente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede situar en
vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células
huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de
hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de ningún
modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de
anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El
ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la
secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada
y ligera humanos en lugar de las secuencias homólogas murinas
[Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al.,
supra] o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de
inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un
polipéptido de no inmunoglobulina. Dicho polipéptido de no
inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de
un anticuerpo de la presente invención, o se pueden sustituir por
los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un
anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo quimérico
bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera
y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina, La cadena
pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc
para evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente,
los residuos de cisteína pertinentes se sustituyen por otro residuo
de aminoácido o se eliminan para evitar la reticulación.
Los procedimientos in vitro también son
adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de
anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente,
fragmentos Fab, se puede realizar utilizando técnicas rutinarias
conocidas en la técnica.
Los anticuerpos anti-PRO de la
invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o
anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas,
cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como
Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a
antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima
derivada de inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos
humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo
destinatario) en las que los residuos de una región determinante de
complementariedad (CDR) del destinatario se sustituye por residuos
de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como
ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y
capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del armazón de Fv
de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no
humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden
comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo
destinatario ni en las secuencias de la CDR o el armazón
importados. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá
sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos,
dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las
regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y
todas o sustancialmente todas las regiones de FR son las de una
secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo
humanizado de forma óptima también comprenderá por lo menos una
parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente
la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature,
321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,
Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta,
Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596
(1992)].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo
humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en
el mismo de un origen no humana. Estos residuos de aminoácidos no
humanos se indican frecuentemente como residuos "importados",
que se adquieren de un dominio variable "importado". La
humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el
procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al.,
Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann
et al., Nature, 332: 323-327 (1988);
Verhoeyen et al., Science, 239:
1534-1536 (1988)], mediante la sustitución de CDRs o
secuencias de CDR de roedor por las correspondientes secuencias de
un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos
"humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados
Unidos No. 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un
dominio variable intacto humano ha sido sustituido por la secuencia
correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los
anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en
los que algunos residuos de DCR y posiblemente algunos residuos de
FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de
roedores.
Los anticuerpos humanos también se pueden
producir utilizando varias técnicas conocidas en la técnica,
incluyendo las bibliotecas de expresión de fagos [Hoogenboom y
Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et
al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de
Cole et al. y Boerner et al. están también disponibles
para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et
al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
página 77 (1985) y Boerner et al., J. Inmunol.,
147(1): 86-95 (1991)]. De forma
similar, los anticuerpos humanos se pueden fabricar mediante la
introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales
transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de
inmunoglobulina endógena han sido parcial o completamente
inactivados. Tras la estimulación, se observa la producción de
anticuerpos humanos, que se parece estrechamente a los observados
en humanos en todos los aspectos, incluyendo el reajuste de genes,
el ensamblaje, y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se
describe, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos.5.545.807;
5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las
siguientes publicaciones científicas: Marks et al.,
BioTechnology 10, 779-783 (1992);
Lonberg et al., Nature 368, 856-859
(1994); Morrison, Nature 368, 812-13
(1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14,
845-51, (1996); Neuberger, Nature
Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar,
Intern. Rev. Immunol. 13 65-93
(1995).
Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales,
preferiblemente humano o humanizado, anticuerpos que tienen
especificidades de unión con por lo menos dos antígenos diferentes.
En el presente caso, una de las especificidades de unión es por el
PRO, el otro es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por
una proteína o receptor o subunidad del receptor de la superficie
celular.
Los procedimientos para fabricar anticuerpos
biespecíficos son conocidos en la técnica. Habitualmente, la
producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la
coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de
inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas tienen
especificidades diferentes [Millstein y Cuello, Nature,
305: 537-539 (1983)]. Debido a la variedad
aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos
hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez
moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene
la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía
de afinidad. En WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en
Traunecker et al., EMBO J., 10:
3655-3659 (1991) se describen procedimientos
similares.
Los dominios variables de anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias
de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión
preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de
inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra,
CH2, y regiones CH3. Se prefiere tener la primera región constante
de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la
unión a cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones.
Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de
inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y
se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para mayores
detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase,
por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzimology,
121: 210 (1986).
Según otro enfoque descrito en WO 96/27011, la
interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos se puede
diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se
recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase
preferida comprende por lo menos una parte de la región de CH3 de un
dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más
cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfase de la
primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales
mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las "cavidades"
compensatorias de tamaño similar o idéntico a la cadena o cadenas
laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula
de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales grandes
de aminoácidos por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).
Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del
heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como
homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar
como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos
(por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Las
técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por
ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar
utilizando uniones químicas. Brennan et al., Science 229:81
(1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos
intactos se dividen proteolíticamente para generar fragmentos
F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del
agente complejante de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los
ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuro
intermolecular. A continuación, los fragmentos Fab' generados se
convierten en derivados de nitrobenzoato (TNB). A continuación, uno
de los derivados de Fab'-TNB se reconvierten al
Fab'-tiol mediante la reducción con
mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro
derivado de Fab'-TNB para formar en anticuerpo
biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden
utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de
enzimas.
Los fragmentos Fab' se pueden recuperar
directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar
anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:
217-225 (1992) describen la producción de una
molécula de anticuerpo biespecífico totalmente humanizado
F(ab')_{2}. Cada fragmento de Fab se secretó de forma
separada de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico
dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico.
Dicho anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de
unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células
T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de
linfocitos citotóxicos humanos contra tumores de mama humana
dianas.
Se han descrito varias técnicas para fabricar y
aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de
cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido
anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina.
Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):
1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina
de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab' de dos
anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del
anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros
y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros del
anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la
producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de
"diabody" descrito por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un
mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos
biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de
cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena
ligera (V_{L}) mediante un enlazador que es demasiado corto para
permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma
cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un
fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios V_{L} y
V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios
de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para
fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la
utilización de dímeros de Fv de cadena única (sFv). Sec. Gruber
et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Se consideran los
anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden
preparar anticuerpos triespecíficos. Tun et al., J. Immunol.
147:60 (1991).
Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo se
pueden unir a dos epítopos diferentes en un polipéptido PRO
determinado de la presente invención. Alternativamente, un brazo de
polipéptido anti-PRO se puede combinar con un brazo
que se une a una molécula desencadenante en un leucocito, tal como
una molécula receptor de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o
B7), o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tales como Fc\gammaRI
(CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para centrar
los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el
polipéptido PRO particular. Los anticuerpos biespecíficos también se
pueden utilizar para confinar agentes citotóxicos a células que
expresan un polipéptido PRO particular. Estos anticuerpos poseen un
brazo de unión a PRO y un brazo que se une a un agente citotóxico o
un radionúcleo quelante, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro
anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido PRO y
además se une al factor tisular (TF).
Los anticuerpos heteroconjugados están también
dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos
heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos
covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo,
para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas
[Patente U.S. No. 4.676.980] y para el tratamiento de la infección
por VIH [WO 91/00360: WO 92/300373; EP 03089]. Se considera que los
anticuerpos se pueden preparar in vitro utilizando
procedimientos conocidos en la química sintética de proteínas,
incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo,
las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de
intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace
tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este
objetivo se incluyen el iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimidato y los
descritos, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 4.676.980.
Se puede desear modificar el anticuerpo de la
presente invención con respecto a la función efectora con el fin de
aumentar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento
del cáncer. Por ejemplo, el residuo o residuos de cisternas se
pueden introducir en la región Fc, permitiendo de esta manera la
formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El
anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede mejorar la
capacidad de internalización y/o incrementar la citólisis mediada
por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente del
anticuerpo (ADCC). Véase Caron et al., J. Exp. Med.,
176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J.
Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Los
anticuerpos homodiméricos con una actividad
anti-tumoral aumentada también se pueden preparar
utilizando reticuladores heterobifuncionales tal y como se describe
en Wolf et al. Cancer Research, 53:
2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo se
puede diseñar para que tenga regiones Fc duales y, de esta manera,
pueda aumentar la lisis
complementaria y las capacidades de ADCC. Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).
complementaria y las capacidades de ADCC. Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).
La presente invención también se refiere a
inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente
citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por
ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano,
fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de loa misma), o un isótopo
radioactivo (es decir, radioconjugados).
Los agentes quimioterapéuticos útiles para la
generación de dichos inmunoconjugados se ha descrito anteriormente.
Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas
que se pueden utilizar se incluyen la cadena A de difteria,
fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena A de
exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina,
cadena A de abrina, cadena A de modeccina,
alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii,
proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana
(PAPI, PAPII, y PAPS), inhibidor de momordica charantia, curcina,
crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina,
resrrietocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Hay una
conjunto de radionúcleos disponibles para la producción de
anticuerpos radioconjugados. Algunos ejemplos son ^{212}Bi,
^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente
citotóxico se fabrican utilizando un conjunto de agentes
bifuncionales acopladores de proteínas, tales como
N-succinimidil-3-(2-piridiiditiol)propionato
(SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres
(tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como
disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído),
compuestos bis-azido (tales como
bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina),
derivados de bis-diazonio (tales como
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina),
diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato)
y compuesto de flúor bis-activos (tales como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y
como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098
(1987). El ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietilen
triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono
14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de
radionúcleos al anticuerpo. Ver WO94/11026.
En otra realización, el anticuerpo se puede
conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la
utilización en el premarcado de tumores en los que el conjugado
anticuerpo-receptor se administra al paciente,
seguido de la eliminación de conjugado no enlazado de la circulación
utilizando un agente clarificador y, a continuación, la
administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se
conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúcleo).
Los anticuerpos descritos en la presente
invención también se pueden formular como inmunoliposomas. Los
liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante
procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en
Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688
(1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77:
4030 (1980); y las Patentes U.S. Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Los
liposomas con un mayor tiempo de circulación se describen en la
Patente U.S. No. 5.013.556.
Se pueden generar liposomas particularmente
útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con
una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol,
y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE).
Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro
definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los
fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden
conjugar a los liposomas tal y como se describen en Martin et
al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)
mediante la reacción de intercambio de enlaces disulfuro.
Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico (tal
como Doxorubicina). Véase Gabizon et al., J. Nacional Cancer
Inst., 81(19): 1484 (1989).
Los anticuerpos que se unen específicamente a un
polipéptido PRO identificado en la presente invención, así como
otras moléculas identificadas por los ensayos de cribado descritos
anteriormente en la presente invención, se pueden administrar para
el tratamiento de varios trastornos en forma de composiciones
farmacéuticas.
Si el polipéptido PRO es intracelular y los
anticuerpos completos se utilizan como inhibidores, se prefieren
anticuerpos de internalización. Sin embargo, las lipofecciones o
liposomas se pueden utilizar también para liberar el anticuerpo, o
un fragmento de anticuerpo, en las células. Cuando se utilizan
fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más
pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la
proteína diana. Por ejemplo, en base a las secuencias de región
variable de un anticuerpo, las moléculas de péptidos se pueden
diseñar de manera que mantienen la capacidad de unirse a la
secuencia de la proteína diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse
químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante.
Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90: 7889-7893 (1993). La formulación
de la presente invención también puede contener más de un compuesto
activo según sea necesario para la enfermedad particular en
tratamiento, preferiblemente aquéllas con actividades
complementarias que no afectan de forma adversa entre sí.
Alternativamente o adicionalmente, la composición puede comprender
un agente que potencia su función, tal como, por ejemplo, un agente
citotóxico, una citoquina, un agente quimioterapéutico o un agente
inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de forma
adecuada combinadas en cantidades que son eficaces para el objetivo
deseado.
Los principios activos también se pueden
introducir en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización por interfase,
por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen
en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Las formulaciones a utilizar en la
administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza
fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación
controlada. Entre algunos ejemplos de preparaciones de liberación
controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros
hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices
están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o
microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación
controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
o poli(vinilalcohol), poliláctidos (Patente U.S. No.
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros
de ácido láctico-ácido glicólico no degradables, tales como el
LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de
copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de
leuprolida), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que polímeros, tales como etileno-acetato
de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permite la liberación de
moléculas durante aproximadamente 100 días, ciertos hidrogeles
liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los
anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo
largo de tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado
de la exposición a humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de
actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se
pueden idear estrategias razonables para la estabilización
dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que
el mecanismo de agregación es la formación de enlaces
S-S intermoleculares a través del intercambio
tio-disulfuro, la estabilización se puede conseguir
mediante la modificación de residuos sulfhidrilo, la liofilización
de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, la
utilización apropiada de aditivos, y el desarrollo de composiciones
de matrices de polímero específicas.
Los anticuerpos anti-PRO de la
presente invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, los
anticuerpos anti-PRO se pueden utilizar en ensayos
de diagnóstico para PRO, por ejemplo, detectando su expresión en
células, tejidos específicos o suero. Se pueden utilizar varias
técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en la técnica, tales
como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directo o
indirecto y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases
heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual
of Techniques, CRC PRess, Inc. (1987) páginas
147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos
de diagnóstico se pueden marcar con un grupo detectable. El grupo
detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente,
una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un
radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o
^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como
isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina, o una
enzima, tal como alcalina fosfatasa,
beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante.
Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en la técnica
para conjugar el anticuerpo al grupo detectable, incluyendo
aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature,
144: 945 (1962); David et al., Biochemistry,
13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth.,
40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem.,
30: 407 (1982).
Los anticuerpos anti-PRO también
son útiles para la purificación por afinidad de PRO de un cultivo
de células recombinantes o de origen natural. En este proceso, los
anticuerpos contra PRO se inmovilizan sobre un soporte adecuado,
tal como una resina Sephadex o papel de filtro, utilizando
procedimientos conocidos en la técnica. A continuación, el
anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que
contiene el PRO a purificar, y posteriormente se lava el soporte
con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el
material en la muestra a excepción del PRO, que está unido al
anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro
disolvente adecuado que liberará el PRO del anticuerpo.
Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con
objetivos ilustrativos, y no pretenden limitar de ningún modo el
alcance de la presente invención.
Todas las referencias de patente y de la
literatura citadas en el presente documento se incorporan en la
presente invención por referencia en su totalidad.
Los reactivos disponibles comercialmente a los
que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con
las instrucciones del fabricante a menos de que se indique lo
contrario. El origen de estas células identificadas en los
siguientes ejemplos, y a lo largo del documento, por los números de
acceso de la ATCC pertenece a la American Type Culture Collection,
Manassas, VA.
Las secuencias del dominio extracelular (ECD)
(incluyendo la secuencia señal de secreción, si la hay) de
aproximadamente 950 proteínas de secreción conocidas de la base de
datos pública Swiss-Prot se utilizaron para buscar
bases de datos EST. Las bases de datos EST incluían bases de datos
públicas (por ejemplo, Dayhoff, Banco de Genes), y bases de datos
privadas (por ejemplo LIFESEQ^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo
Alto, CA). La búsqueda se realizó mediante la utilización del
programa informático BLAST o BLAST-2 (Altschul
et. al., Methods in Enzymology 266:460-480
(1996)) como una comparación entre las secuencias ECD de las
proteínas y la traducción de seis fragmentos de las secuencias EST.
Las comparaciones con un marcador BLAST de 70 (o en algunos casos
de 90) o superior que no codificaban proteínas conocidas se
agruparon y ensamblaron en secuencias de ADN de consenso con el
programa "phrap" (Phil Green, Universidad de Washington,
Seattle, WA).
Utilizando este cribado de homología del dominio
extracelular, las secuencias de ADN de consenso se ensamblaron en
relación a las otras secuencias identificadas de EST utilizando
phrap. Además, las secuencias de ADN de consenso obtenidas se
ampliaron frecuentemente (pero no siempre) utilizando ciclos
repetidos de BLAST o BLAST-2 y phrap para ampliar
la secuencia de consenso tanto como fuera posible utilizando los
orígenes de secuencias EST anteriormente explicadas.
En base a las secuencias de consenso obtenidas
tal y como se ha explicado anteriormente, a continuación los
oligonucleótidos se sintetizaron y utilizaron para identificar
mediante PCR una biblioteca de ADNc que contuviese la secuencia de
interés y para utilizarlos como sondas para aislar un clon de la
secuencia codificante de longitud completa de un polipéptido PRO.
Los cebadores de PCR directos e inversos generalmente oscilan entre
20 y 30 nucleótidos y frecuentemente están diseñados para producir
un producto de PCR de aproximadamente 100-1000
pares de bases de longitud. Las secuencias de la sonda tienen
habitualmente una longitud de 40-55 pares de bases.
En algunos casos, se sintetizan oligonucleótidos adicionales cuando
la secuencia de consenso es mayor de 1-1,5 kpb. Con
el fin de cribar diversas bibliotecas para un clon de longitud
completa, el ADN de las bibliotecas se cribó mediante amplificación
de PCR, como por Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular
Biology, con la pareja del cebador de PCR. A continuación se
utilizó una biblioteca positiva para aislar clones que codificaran
el gen de interés utilizando el oligonucleótido de la sonda y una de
las parejas de cebadores.
Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar
clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos
convencionales utilizando reactivos disponibles comercialmente tales
como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligo dT
que contenía un sitio Noil, se unió por extremo romo a adaptadores
con hemiquinasa de SalI, se dividieron con NotI, se midió
apropiadamente mediante electroforesis en gel, y se clonó en una
orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como
pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el
sitio de SfiI; véase, Homes et. al., Science,
253:1278-1280 (1991)) en los sitios únicos de
XhoI y NotI.
Se aisló ARNm de un tejido humano de interés
utilizando reactivos y protocolos de Invitrogen, San Diego, CA
(Fast Track 2). Este ARN se utilizó para generar una biblioteca de
ADNc cebado con oligo dT en el vector pRK5D utilizando reactivos y
protocolos de Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script
Plasmid System). En este procedimiento, la doble cadena de ADNc se
ajustó para que fuera mayor de 1000 pares de bases y el ADNc unido
a SalI/NotI se clonó en el vector dividido por XhoI/NotI. pRK5D es
un vector de clonación que tiene un sitio de iniciación de la
trascripción sp6 seguido de un sitio para enzima de restricción SfiI
que precede a los sitios de clonación del ADNc de XhoI/NotI.
Se generó una biblioteca de ADNc secundaria para
representar preferentemente los extremos 5' de los clones de ADNc
primario. El ARN de sp6 se generó a partir de la biblioteca primaria
(descrita anteriormente), y este ARN se utilizó para generar una
biblioteca de ADNc cebada aleatoria en el vector
PSST-AMY.O utilizando reactivos y protocolos de
Life Technologies (Super Script Plasmid System, mencionado
anteriormente). En este procedimiento, el ADNc de cadena doble se
ajustó a 500-1000 pares de bases, se unió por los
extremos romos a adaptadores de NotI, se dividió con SfiI, y se
clonó en el vector dividido de SfiI/NotI. pSST-AMY.O
es un vector de clonación que tiene un promotor de alcohol
deshidrogenada de levadura que precede a los sitios de clonación
del ADNc y la secuencia de la amilasa de ratón (la secuencia madura
sin la señal de secreción) seguida por el fragmento finalizador de
alcohol deshidrogenasa de levadura, después de los sitios de
clonación. De esta manera, los ADNcs clonados en este vector que
están fusionados en su marco con la secuencia de amilasa conducirán
a la secreción de amilasa desde colonias de levadura apropiadamente
transfectadas.
El ADN de la biblioteca descrito en el párrafo 2
anterior se enfrió sobre hielo al que se había añadido la bacteria
DH10B electrocompetente (Life Technologies, 20 ml). La mezcla de
vector y bacteria se electroporó a continuación tal y como
recomendaba el fabricante. Posteriormente, se añadió un medio SOC
(Life Technologies, 1 ml) y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30
minutos. Los transformantes se colocaron en 20 placas LB estándar
de 150 mm que contenían ampicilina y se incubaron durante 16 horas
(37ºC). Las colonias positivas fueron descartadas en las placas y
el ADN se aisló del residuo bacteriano utilizando los protocolos
convencionales, por ejemplo gradiente de CsCl. A continuación, el
ADN purificado continuó los protocolos de la levadura
siguientes.
Los procedimientos de las levaduras se dividen
en tres categorías: (1) Transformación de la levadura con el vector
combinado plásmido/ADNc; (2) Detección y aislamiento de los clones
de levadura que secretan amilasa; y (3) amplificación por PCR de la
inserción directamente desde la colonia de levadura y la
purificación del ADN para la secuenciación y el análisis
posterior.
La cepa de levadura utilizada fue la
HD-56-5A
(ATCC-90785). Esta cepa tiene el siguiente genotipo:
MAT alfa, ura3-52, leu2-3,
leu2-112, his3-11,
his3-15, MAL^{-}, SUC^{+}, GAL^{+}.
Preferiblemente, se pueden utilizar levaduras mutantes que tienen
mecanismos post-traduccionales deficientes. Dichos
mutantes pueden tener alelos deficientes de traslocación en
sec71, sec72, sec62, siendo sec71 truncado el más preferido.
Alternativamente, se pueden utilizar preferiblemente los
antagonistas (que incluyen nucleótidos antisentido y/o ligandos)
que interfieren en el normal funcionamiento de estos genes, otras
proteínas implicadas en este mecanismo posterior a la traducción
(por ejemplo, SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p o SSA
1p-4p) o la formación del complejo de estas
proteínas en combinación con la levadura que expresa la amilasa.
La transformación se realizó basándose en el
protocolo descrito por Gietz y otros, Nucl. Acid. Res.,
20: 1425 (1992). A continuación, las células transformadas se
inocularon del agar en el caldo de cultivo de complejo YEPD (100
ml) y se desarrollaron durante toda la noche a 30ºC. El caldo de
cultivo YEPD se preparó tal y como se describe en Kaiser et.
al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold
Spring Harbor, NY, pág. 207 (1994). A continuación, el cultivo de
toda la noche se diluyó hasta aproximadamente 2 x 10^{6}
células/ml (aprox. DO_{600}=0,1) en caldo de cultivo YEPD nuevo
(500 ml) y se redesarrolló hasta 1 x 10^{7} células/ml (aprox.
DO_{600}=0,4-0,5).
A continuación, las células se recogieron y
prepararon para la transformación mediante la transferencia en
botellas de rotación GS3 en un rotor Sorval GS3 a 5.000 rpm durante
5 minutos, se descartó el sobrenadante y, a continuación, se
resuspendieron en agua estéril, y se centrifugaron de nuevo en tubos
falcon de 50 ml a 3.5000 rpm en una centrífuga Beckman
GS-6KR. El sobrenadante se descartó y las células se
lavaron posteriormente con LiAc/TE (10 ml, 10 mM de
Tris-HCl, 1 mM de EDTA pH 7,5, 100 mM de
Li_{2}OOCCH_{3}), y se resuspendió en LiAc/TE (2,5 ml).
La transformación se realizó mezclando las
células preparadas (100 \mul) con ADN de cadena única
recientemente desnaturalizado de salmón de prueba (Lofstrand Labs,
Gaithersburg, MD) y transformando el ADN (1 \mug, vol. < 10
\mul) en tubos de microfuga. La mezcla se mezcló brevemente por
centrifugación, a continuación se le añadió PEG/TE al 40% (600
\mul, polietilenglicol-4000 al 40%, 10 mM de
Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 100 mM de
Li_{2}OOCCH_{3}, pH 7,5). Esta mezcla se mezcló suavemente y se
incubó a 30ºC mientras se agitaba durante 30 minutos. A
continuación, las células fueron sometidas a un golpe de calor de
42ºC durante 15 minutos, y el recipiente de reacción se centrifugó
en un tubo de microfuga a 12.000 rpm durante 5-10
segundos, se decantó y se resuspendió en TE (500 \mul, 10 mM de
TRis-HCl, 1 mM de EDTA pH 7,5) seguido de
recentrifugación. A continuación, las células se diluyeron en TE (1
ml) y se extendieron alicuotas (200 \mul) en el medio selectivo
previamente preparado en placas de crecimiento de 150 mm (VWR).
Alternativamente, en lugar de múltiples
reacciones pequeñas, la transformación se realizó utilizando una
reacción única a gran escala, en la que las cantidades de los
reactivos se adaptaron a la escala.
El medio selectivo utilizado fue un agar de
dextrosa completo sintético con ausencia de uracilo
(SCD-Ura) preparado tal y como se describe en
Kaiser et. al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, NY, pág. 208-210 (1994).
Los transformantes se desarrollaron a 30ºC durante
2-3 días.
La detección de colonias que secretan amilasa se
realizó incluyendo almidón rojo en el medio de crecimiento
selectivo. El almidón se acopló a colorante rojo (Reactive
Red-120, Sigma) según el procedimiento descrito por
Biely et. al., Anal. Biochem. 172:176.-179 (1988). El
almidón acoplado se incorporó en las placas de agar
SCD-Ura en una concentración final de 0,15% (p/v), y
a continuación se tamponó con fosfato potásico hasta un pH de 7,0
(20-100 mM de concentración final).
Las colonias positivas se recogieron y se
dispusieron en rayas en medio selectivo nuevo (en placas de 150 mm)
con el fin de obtener colonias únicas bien aisladas e
identificables. Las colonias únicas positivas bien aisladas para la
secreción de amilasas se detectaron mediante la incorporación
directa de almidón rojo en agar SCD-Ura tamponado.
Las colonias positivas se determinaron por su habilidad para romper
el almidón resultante en una clara aureola alrededor de la colonia
positiva directamente visualizada.
Cuando se aisló una colonia positiva, una parte
de la misma se recogió con un palillo y se diluyó en agua estéril
(30 \mul) en una placa de 96 pocillos. En este punto, las colonias
positivas se congelaron y guardaron para un posterior análisis o
bien se amplificaron inmediatamente. Una alicuota de las células (5
\mul) se utilizó como plantilla para la reacción de PCR en un
volumen de 25 \mul que contenía: 0,5 \mul de Klentaq (Clontech,
Palo Alto, CA); 4,0 \mul 10 mM de dNTP's (Perkin
Elmer-Cetus); 2,5 \mul de tampón Kentaq
(Clontech); 0,25 \mul de oligo directo 1; 0,25 \mul de oligo
inverso 2; 12,5 \mul de agua destilada. La secuencia del
oligonucleótido directo 1 fue:
| 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' | (SEC ID No: 1) |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de oligonucleótido inverso 2
fue:
| 5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3' | (SEC ID No: 2) |
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, se realizó la PCR de la
siguiente manera:
Las regiones subrayadas de los oligonucleótidos
se hibridaron a la región promotora ADH y la región de ainilasa,
respectivamente, y se amplificaron una región de 307 pares de bases
del vector pSST-AMY.0 cuando no presentaba
inserción. Normalmente, los primeros 18 nucleótidos del extremo 5'
de estos oligonucleótidos contenían sitios de hibridación para los
cebadores de la secuenciación. De esta manera, el producto total de
la reacción PCR desde un vector vacío fue de 343 pares de bases. Sin
embargo, el ADNc fusionado a la secuencia señal dio lugar a
secuencias de nucléotidos considerablemente más largas.
Seguidamente al PCR, se examinó una alícuota de
la reacción (5 \mul) mediante electroforesis en gel de agarosa
con un 1% de gel de agarosa utilizando un sistema tamponador
Tris-Borato-EDTA (TBE) tal y como
describen Sambrook et. al., supra. Los clones que dieron
lugar a un producto de PCR único y firme mayor de 400 pares de
bases se analizaron adicionalmente mediante la secuenciación del ADN
tras la purificación con una columna de limpieza de PCR Qiaquick 96
(Quiagen, Inc., Chatsworth, CA).
Se identificaron diversas secuencias de ácidos
nucleicos que codifican polipéptidos mediante la aplicación de un
algoritmo patentado que halla una secuencia señal desarrollado por
Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) sobre ESTs así como
fragmentos de EST agrupados y ensamblados de las bases de datos
públicas (por ejemplo, Banco de Genes) y/o privadas (LIFESEQ®,
Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA). El algoritmo de la
secuencia señal calcula una puntuación de la señal de secreción
basada en el carácter de los nucleótidos del ADN que rodean al
primer codón de metionina (ATG), y de manera opcional al segundo, en
el extremo 5' de la secuencia o el fragmento de secuencia en
consideración. Los nucleótidos que siguen al primer ATG deben
codificar por lo menos 35 aminoácidos inequívocos sin ningún codón
de parada. Si el primer ATG tiene los aminoácidos requeridos, el
segundo no se examina. Si ninguno reúne los requisitos, la secuencia
candidata no se contabiliza. Con el fin de determinar si la
secuencia EST contiene una secuencia señal auténtica, el ADN y las
correspondientes secuencias de aminoácidos que rodean el codón ATG
son contabilizadas utilizando un dispositivo de siete sensores
(parámetros de evaluación) que se sabe que se asocian con las
señales de secreción. El uso de este algoritmo dio lugar a la
identificación de numerosas secuencias de ácidos nucleicos que
codifican polipéptidos.
Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en
relación a otras secuencias EST utilizando ciclos repetidos de
BLAST y phrap. Esta secuencia de consenso se designa en la presente
invención como "DNA80170". En base a la secuencia de consenso
DNA80170, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar
mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de
interés, y 2) para utilizar como sondas para aislar un clon de la
secuencia codificante de longitud completa para PRO4405.
Se sintetizaron los cebadores del PCR (directos
e inversos):
| cebador de PCR directo: | |
| 5'-CGGGACTTTCGCTACCTGTTGC-3' | (SEC. ID. No :5) y |
| cebador de PCR inverso: | |
| 5'-CATCATATTCCACAAAATGCTTTGGG-3' | (SEC. ID. No :6) |
Adicionalmente, se construyó una sonda sintética
de hibridación de oligonucleótidos a partir de la secuencia de
consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos:
| sonda de hibridación: | |
| 5'-CCTTCGGGGATTCTTCCCGGCTCCCGTTCGTTCCTCTG-3' | (SEC. ID. No: 7) |
Con el fin de cribar diversas bibliotecas para
una fuente de un clon de longitud completa, se cribó el ADN de las
bibliotecas mediante una amplificación por PCR con la pareja de
cebadores de PCR identificados anteriormente. A continuación, se
utilizó una biblioteca positiva para aislar los clones que
codificaban el gen de PRO4405 utilizando el oligonucleótido de
sonda y uno de los cebadores de PCR. El ARN para la construcción de
las bibliotecas de ADNc se aisló de tejido de riñón fetal
humano.
La secuenciación del ADN de los clones aislados
tal y como se ha descrito anteriormente produjo la secuencia de ADN
de longitud completa para PRO4405 (designada en la presente
invención como DNA84920-2614 [Figura 1, SEC. ID.
No: 3]; y la secuencia de proteína derivada para PRO4405.
La secuencia de codificación completa de PRO4405
se muestra en la Figura 1 (SEC. ID. No: 3). El clon
DNA84920-2614 contiene un único marco de lectura
abierto con un sitio de iniciación de traducción claro en las
posiciones de nucleótidos 79-81 y un codón de
finalización claro en las posiciones de nucleótidos
1009-1011. El precursor estimado del polipéptido
tiene 310 aminoácidos de longitud. El clon
DNA84920-2614 se ha depositado con la ATCC y se
asignó el depósito de ATCC no. 203966. La proteína de longitud
completa PRO4405 mostrada en la Figura 2 tiene un peso molecular
estimado de aproximadamente 33.875 Daltons y un pI de
aproximadamente 7,08.
Un análisis de la base de datos de Dayhoff
(versión 35.45 SwissProt 35), utilizando un análisis de alineación
de secuencias WU-BLAST2 de la secuencia de longitud
completa mostrada en la Figura 2 (SEC. ID. No. 4), hizo evidente la
homología entre la secuencia de aminoácidos de PRO4405 y las
siguientes secuencias Dayhoff (secuencias y texto relacionado
incorporados en la presente invención): YA93_SCHPO, S62432,
YIG2_YEAST, AC004472_3, AB004539_7, 564782, CELC27A 12_8,
AF109219_1, AF086791_10 y P_W75859.
El siguiente procedimiento describe el uso de
una secuencia de nucleótidos que codifica PRO como sonda de
hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante
PRO de longitud completa o madura tal y como se se describe en la
presente invención se utiliza como sonda para cribar los ADNs
homólogos (tales como aquéllos que codifican variantes naturales de
PRO) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas
de tejido humano.
La hibridación y el lavado de filtros que
contienen cualquier ADN de biblioteca se realizan según las
siguientes condiciones de astringencia elevada. La hibridación de la
sonda radiomarcada derivada de PRO a los filtros se realiza en una
solución al 50% de formamida, 5x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato de
sodio al 0,1%, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6,8, 2x de solución de
Denhardt, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El
lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1x SSC
y SDS al 0,1% a 42ºC.
A continuación, se pueden identificar los ADNs
que tienen una identidad secuencial deseada con el ADN que codifica
el PRO de secuencia nativa de longitud completa utilizando las
técnicas estándar conocidas en la literatura.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de PRO mediante expresión recombinante en E.
coli.
La secuencia de ADN que codifica PRO se
amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados.
Los cebadores deberían contener sitios para las enzimas de
restricción que se correspondan con los sitios para enzimas de
restricción del vector de expresión seleccionado. Se puede utilizar
una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de vector
adecuado es el pBR322 (derivado del E. coli, véase Bolivar
et. al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para
la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se
digiere con una enzima de restricción y se defosforila. A
continuación, las secuencias amplificadas por PCR se unen en el
vector. El vector preferiblemente incluirá secuencias que codifican
un gen resistente a un antibiótico, un promotor trp, un líder
polihis (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia
polihis, y sitio de división para la enteroquinasa), la región
codificante de PRO, el finalizador transcripcional lambda, y un gen
argU.
A continuación, la mezcla de unión se utiliza
para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando
los procedimientos descritos en Sambrook et. al., supra. Los
transformantes se identifican por su capacidad para crecer en
placas de LB y, a continuación, se seleccionan las colonias
resistentes a los antibióticos. El ADN plásmido se puede aislar y
confirmar mediante el análisis de restricción y la secuenciación del
ADN.
Los clones seleccionados se pueden desarrollar
durante toda la noche en un medio de cultivo líquido tal como el
caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche
se puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a mayor
escala. A continuación, las células se desarrollan hasta una
densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de la expresión
se activa.
Después de cultivar las células durante muchas
más horas, las células se pueden recoger mediante centrifugación.
El residuo de células obtenido mediante la centrifugación se puede
solubilizar utilizando diversos agentes conocidos en la técnica, y
la proteína PRO solubilizada se puede a continuación purificar
utilizando una columna quelante de metal en condiciones que
permiten la unión fuerte de la proteína.
El PRO puede expresarse en E. coli en
forma de etiqueta de poli-His, utilizando el
siguiente procedimiento. El ADN que codifica PRO se amplifica
inicialmente utilizando cebadores del PCR seleccionados. Los
cebadores contendrán sitios para las enzimas de restricción que se
corresponden con los sitios para enzimas de restricción del vector
de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que
proporcionan una iniciación de la traducción eficaz y fiable, una
purificación rápida en una columna quelante metálica, y la
eliminación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias
etiquetadas de poli-His amplificadas por PCR se unen
a continuación en un vector de expresión que se utiliza para
transformar un E. coli huésped basado en la cepa 52 (W3110
fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts)
clpP(laclq). Los transformantes se cultivan en primer lugar
en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación
hasta alcanzar una D.O.600 de 3-5. Los cultivos se
diluyen a continuación 50-100 veces en un medio
CRAP (preparado mezclando 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4},
0,71 g de citrato de sodio\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g
de extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500
ml de agua, además de 110 mM de MPOS, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v)
y 7 mM de MgSO_{4}) y se cultivan durante aproximadamente
20-30 horas a 30ºC con agitación. Las muestras se
extraen para verificar la expresión mediante un análisis
SDS-PAGE, y el volumen del cultivo se centrifuga
hasta que las células son residuos de centrifugación. Los residuos
de centrifugación de las células se congelan hasta la purificación y
el repliegue.
La masa de E. coli de fermentaciones de
0,5 a 1 L (6-10 g de residuos de centrifugación) se
resuspende en 10 volúmenes (p/v) de 7 M de guanidina, 20 mM de
Tris, tampón de pH 8. Se añade sulfito sódico sólido y tetrationato
de sodio para que las concentraciones finales sean de 0,1 M y 0,02
M, respectivamente, y la solución se agita durante toda la noche a
4ºC. Este paso da lugar a una proteína desnaturalizada con residuos
de "alc-cisteína" bloqueados por la
sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 rpm durante 30
minutos en una ultracentrífuga Beckman. El sobrenadante se diluye
con 3-5 volúmenes de tampón de columna quelante
metálica (6 M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7,4) y se filtra a
través de filtros de 0,22 micras para aclarar. El extracto aclarado
se carga en una columna quelante metálica Quiagen
Ni-NTA de 5 ml equilibrada con el tampón de columna
quelante metálica. La columna se lava con un tampón adicional que
contiene 50 mM de imidazol (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La
proteína se eluye con un tampón que contiene 250 mM de imidazol. Las
fracciones que contienen la proteína de interés se agrupan y se
guardan a 4ºC. La concentración de la proteína se estima según su
absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción
calculado en base a su secuencia de aminoácidos.
Las proteínas se repliegan mediante la dilución
lenta de la muestra en tampón de repliegue preparado nuevo
consistente en: 20 mM de Tris, pH 8,6, 0,3 M de NaCl, 2,5 M de urea,
5 mM de cisteína, 20 mM de glicina y 1 mM de EDTA. Los volúmenes de
repliegues se escogen de manera que la concentración final de
proteína esté entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de
repliegue se agita suavemente a 4ºC durante 12-36
horas. La reacción de repliegue se detiene mediante la adición de
TFA hasta una concentración final del 0,4% (pH aproximadamente de
3). Antes de otra purificación de la proteína, la solución se filtra
a través de un filtro de 0,22 micras y se añade acetonitrilo hasta
una concentración final del 2-10%. La proteína
replegada se somete a una columna de cromatografía de fase inversa
Poros R1/H utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución con
un gradiente de acetonitrilo del 10 al 80%. Las alícuotas de
fracciones con una absorbancia A280 se analizan en geles de SDS
poliacrilamida y las fracciones que contienen proteína replegada
homogénea se agrupan. Generalmente, las especies replegadas
correctamente de la mayoría de las proteínas se eluyen a las
concentraciones más bajas de acetronitrilo, ya que esas especies
son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de
la interacción con la resina de fase inversa. Las especies agregadas
se eluyen normalmente a concentraciones de acetonitrilo superiores.
Además de solucionar las formas desplegadas de proteínas de la
manera deseada, la etapa de la fase inversa también elimina la
endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen el polipéptido PRO
plegado deseado se agrupan y se elimina el acetonitrilo utilizando
una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las
proteínas se formulan en 20 mM Hepes, pH 6,8 con 0,14 M de cloruro
sódico y manitol al 4% por diálisis o por filtración en gel
utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el
tampón de formulación y filtradas estériles.
Muchos de los polipéptidos PRO descritos en
WO00/56889 se expresaron de forma satisfactoria tal y como se ha
descrito anteriormente.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
potencialmente glicosilada de PRO mediante la expresión recombinante
en células de mamíferos.
El vector pRK5 (véase EP 307.247, publicada el
15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión.
Opcionalmente, el ADN de PRO está ligado en el pRK5 con enzimas de
restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de PRO
utilizando procedimientos de unión tales como los descritos en
Sambrook et. al., supra. El vector resultante se denomina
pRK5-PRO.
En una realziación, las células huésped
seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC
CCL 1573) se cultivan para unirse en placas de cultivo de tejidos en
un medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y
opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se
mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de
pRK5-PRO se mezcla con 1 \mug de ADN que codifica
el gen del ARN de VA [Thimmappaya et. al., Cell,
31:543 (1982)] y se disuelve en 500 \mul de 1 mM de
Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCl_{2}. A
esta mezcla se le añade, gota a gota, 500 \mul de 50 mM de HEPES
(ph 7,35), 280 mM de NaCl, 1,5 mM de NaPO_{4}, y se deja formar
un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende
y se añade a células 293 y se deja reposar durante aproximadamente
cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml
de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación, las
células 293 se lavan con medio sin suero, se añade medio nuevo y
las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza por
medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200
\muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml
^{35}S- metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el
medio acondicionado, se concentra en un filtro de giro y se carga
en un gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a
una película durante un período de tiempo concreto para revelar la
presencia del polipéptido PRO. Los cultivos que contienen células
transfectadas pueden experimentar una incubación adicional (en medio
sin suero) y el medio se examina en bioensayos concretos.
En una técnica alternativa, se puede introducir
PRO en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento del
sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et. al., Proc. Natl.
Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Las células 293 se cultivan
hasta la máxima densidad en un frasco giratorio y se añaden 700
\mug de ADN de pRK5-PRO. En primer lugar, las
células se concentran en el fraco giratorio mediante centrifugación
y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano
es incubado en el residuo de centrifugación durante cuatro horas.
Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se
lavan con medio de cultivo de tejido, y se reintroducen en el
frasco giratorio que contiene el medio de cultivo de tejidos, 5
\mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina
bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio
acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y
los debris. La muestra que contiene el PRO expresado se puede
concentrar a continuación y purificar mediante cualquier
procedimiento seleccionado, tal como la diálisis y/o cromatografía
en columna.
En otra realización, PRO puede expresarse en
células CHO. El pRK5-PRO puede transfectarse en
células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o
DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito
anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio
remplazarse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un
radiomarcador, tal como la ^{35}S-metionina.
Después de determinar la presencia del polipéptido PRO, el medio de
cultivo puede remplazarse por medio sin suero. Preferiblemente, los
cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y, a
continuación, se recoge el medio acondicionado. A continuación, el
medio que contiene el PRO expresado puede concentrarse y
purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El PRO etiquetado con epítopo puede expresarse
también en células CHO huésped. El PRO debe subclonarse fuera del
vector pRK5. La inserción del subclon puede experimentar PCR para
fusionarse en el marco con una etiqueta de epítopo concreta, tal
como una etiqueta de poli-his en un vector de
expresión de Baculovirus. La inserción de PRO etiquetado con
poli-his puede subclonarse a continuación en un
vector conductor SV40 que contiene un marcador de selección, tal
como DHFR, para seleccionar clones estables. Finalmente, las células
CHO pueden transfectarse (tal y como se describe anteriormente) con
el vector conductor SV40. El marcaje puede realizarse, tal y como
se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio
de cultivo que contiene el PRO etiquetado con
poli-His expresado puede a continuación concentrarse
y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal
como mediante cromatografía de afinidad de
quelante-Ni^{2+}.
PRO puede expresarse también en células CHO y/o
COS mediante un procedimiento de expresión transitoria o en células
CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.
La expresión estable en células CHO se realiza
utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan
como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias
codificantes de las formas solubles (por ejemplo, los dominios
extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una
secuencia de región constante de IgGI que contiene la bisagra, CH2
y los dominios de CH2 y/o es una forma etiquetada de
poli-his.
Tras la amplificación por PCR, los ADNs
respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO utilizando
técnicas estándar descritas en Ausubel et. al., Current
Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and
Sons (1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para
tener sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés
para permitir el traslado adecuado de los de ADNc. El vector
utilizado en la expresión en las células CHO es tal y como se
describe en Lucas et. al., Nucl. Acid Res. 24:9
(1774-1779 (1996), y utiliza el
promotor/potenciador temprano de SV40 para dirigir la expresión del
ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión
de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del
plásmido tras la transfección.
Se introducen doce microgramos del ADN plásmido
deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando
reactivos de transfección Superfect® (Quiagen), Dosper® o Fugene®
(Boehringer Mannheim) disponibles comercialmente. Las células se
cultivan tal y como se describe en Lucas et. al., supra.
Aproximadamente se congelan 3 x 10^{-7} células en una ampolla
para un crecimiento y producción posterior tal y como se describe a
continuación.
Las ampollas que contienen el ADN plásmido se
descongelan mediante un baño de agua y se mezclan mediante
centrifugación. El contenido se pipetea en un tubo de centrífuga que
contiene 10 mLs de medio y se centrifuga a 1000 rpm durante 5
minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en
10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 \mum con un 5% de
suero bovino fetal dialfiltrado a 0,2 \mum). A continuación, las
células se fraccionan en un centrifugador de 100 mL que contiene 90
mL del medio selectivo. Después de 2-3 días, las
células se transfieren a un centrifugador de 250 mL lleno con 150 mL
de medio de cultivo selectivo y se incuban a 37ºC. Después de otros
2-3 días, se siembran centrifugadores de 250 mL, 500
mL y 2000 mL se siembran con 3 x 10^{5} células/mL. El medio
celular se cambia por medio nuevo mediante centrifugación y
resuspensión en el medio de producción. Aunque se puede utilizar
cualquier medio de CHO adecuado, en realidad se puede utilizar un
medio de producción descrito en la patente estadounidense No.
5.122.469, publicada el 16 de junio de 1992. Un centrifugador de 3L
de producción se siembra hasta 1,2 x 10^{6} células/ml. En el día
0, se determina el pH del número de células. En el día 1, se toman
muestras en el centrifugador y se incia el burbujeo con aire
filtrado. En el día 2, se toman muestras en el centrifugador, la
temperatura se cambia a 33ºC, y se toman 30 mL de glucosa a 500g/L
y 0,6 mL de antiespuma al 10% (por ejemplo 35% de emulsión de
polidimetilsiloxano, Dow Coming 365 Medical Grade Emulsion). Durante
toda la producción, el pH se ajusta según la necesidad
manteniéndose en valores alrededor de 7,2. Después de 10 días, o
hasta que la viabilidad cayera por debajo del 70%, el cultivo
celular se recoge mediante centrifugación y se filtra a través de un
filtro de 0,22 \mum. El filtrado se guarda a 4ºC o se carga
inmediatamente en columnas para la purificación.
Para las construcciones etiquetadas de
poli-his, las proteínas se purifican utilizando una
columna de Ni-NTA (Qiagen). Antes de la
purificación, se añade imidazol al medio acondicionado hasta una
concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea en una
columna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada en 20 mM
Hepes, pH 7,4, tampón que contiene 0,3 M de NaCl y 5 mM de imidazol
a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min. a 4ºC. Tras
cargarse, la columna se lava con un tampón de equilibrio adicional y
la proteína se eluye con el tampón de equilibrio que contiene 0,25
M de imidazol. La proteína altamente purificada se desala
posteriormente en un tampón de almacenamiento que contiene 10 mM
Hepes, 0,14 M de NaCl y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25
Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se guarda a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contiene Fc) se purifican a partir del medio acondicionado tal y
como se indica a continuación. El medio acondicionado se bombea a
una columna Proteína A (Pharmacia) de 5 ml que ha sido equilibrada
en un tampón de 20 mM de fosfato sódico, pH 6,8. Después de
cargarse, la columna se lava ampliamente con tampón de equilibrio
antes de la elución con 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5. La proteína
eluída se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml
en tubos que contienen 275 \muL de tampón de Tris 1M, pH 9. La
proteína altamente purificada se desala posteriormente en un tampón
de almacenamiento, tal como el descrito anteriormente para las
proteínas etiquetadas con poli-his. La homogeneidad
se calcula mediante geles de poliacrilamida SDS y mediante la
secuenciación de los aminoácidos N-terminales
mediante degradación Edman.
Muchos de los polipéptidos PRO descritos en WO
00/56889 se expresaron de forma satisfactoria tal y como se ha
descrito anteriormente.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de PRO en levadura.
En primer lugar, los vectores de expresión de
levadura se construyen para la producción o secreción intracelular
de PRO a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica PRO y
el promotor se insertan en los sitios para enzimas de restricción
adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión
intracelular de PRO. Para la secreción, el ADN que codifica PRO
puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que
codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal de PRO nativo u
otro péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, un factor alfa de
levadura o la secuencia señal/líder secretora de la invertasa, y
secuencias enlazadoras (si se necesitan) para la expresión de
PRO.
Las células de levadura, tales como la cepa
AB110 de la levadura, pueden a continuación transformarse con los
plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medio
de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de levadura
transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido
tricloroacético al 10% y separación mediante
SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con
azul de Coomassie.
El PRO recombinante puede aislarse
posteriormente y purificarse mediante la extracción de las células
de levadura del medio de fermentación mediante la centrifugación y,
a continuación, la concentración del medio utilizando filtros de
cartucho específicos. El concentrado que contiene PRO puede
purificarse adicionalmente utilizando resinas de cromatografía en
columna concretas.
Muchos de los polipéptidos PRO descritos en WO
00/56889 se expresaron de forma satisfactoria tal y como se ha
descrito anteriormente.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de PRO en células de insecto infectadas de
Baculovirus.
La secuencia que codifica PRO se fusiona en
dirección 5' a un epítopo etiqueta contenido en un vector de
expresión de baculovirus. Dichas epítopo etiquetas incluyen
etiquetas de poli-his y etiquetas de inmunoglobulina
(como las regiones Fc de 1gG). Pueden utilizarse una variedad de
plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de los plásmidos
disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen).
Brevemente, la secuencia que codifica PRO o la parte deseada de la
secuencia que codifica PRO, tales como la secuencia que codifica el
dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia
que codifica la proteína madura si la proteína extracelular se
amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones
5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios para enzimas de
restricción flanqueantes (seleccionados). El producto se digiere a
continuación con todas esas enzimas de restricción seleccionadas y
se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus
BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera
frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina
(disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de
4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados
se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La
infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal y
como describe en O'Reilley et. al., Baculovirus expresion
vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press
(1994).
A continuación, el PRO etiquetado con
poli-His expresado puede purificarse, por ejemplo,
mediante cromatografía de afinidad de
Ni^{2+}-quelato tal y como se indica a
continuación. Los extractos se preparan a partir de las células
recombinantes sf9 infectadas del virus tal y como se ha descrito por
Rupert et. al., Nature, 362: 175-179
(1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en el
tampón de sonicación (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCl_{2};
0,1 mM de EDTA: glicerol al 10%; NP-40 a 0,1%; 0,4 M
de KCl), y se sonica dos veces durante 20 segundos en hielo. Los
sonicados se aclaran por centrifugación, y el sobrenadante se diluye
50 veces en el tampón de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl,
glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45
\mum. Se prepara una columna de agarosa
Ni^{2+}-NTA (comercialmente disponible de Qiagen)
con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se
equilibra con 25 ml del tampón de carga. El extracto celular
filtrado se carga en la columna a 0,5 mL por minuto. La columna se
lava hasta la línea base a A_{280} con el tampón de carga, en
cuyo punto se inicia la recogida de la fracción. A continuación, la
columna se lava con un tampón de lavado secundario (50 mM fosfato:
300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye las proteínas
unidas no específicamente. Después de alcanzar la línea base a
A_{280} de nuevo, la columna se elabora con un gradiente de 0 a
500 mM de imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen
fracciones de un mL y se analizan mediante SDS-PAGE
y tinción con plata o Western blot con
Ni^{2+}-NTA-conjugado a fosfatasa
alcalina (Qlagen). Las fracciones que contienen PRO etiquetado con
His_{10} eluído se agrupan y se dializan contra el tampón de
carga.
Alternativamente, la purificación del PRO
etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse usando técnicas de
cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía en
columna con Proteína A o proteína G.
Muchos de los polipéptidos PRO descritos en WO
00/56889 se expresaron de forma satisfactoria tal y como se ha
descrito anteriormente.
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a
PRO.
Las técnicas para producir los anticuerpos
monoclonales son conocidas en la técnica y están descritas, por
ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunogenes que se
pueden utilizar se incluyen PRO purificado, proteínas de fusión que
contienen PRO, y células que expresan PRO recombinante en la
superficie celular. La selección del inmunogen puede realizarse
según el técnico en la materia sin una gran experimentación.
Los ratones, tal como Balb/c, se inmunizan con
el inmunogén de PRO emulsionado en adyuvante completo de Freund y
se injecta subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de
1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunogen
se emulsiona en el adyuvante MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las bases de
las patats traseras del animal. A continuación, los ratones
inmunizados a continuación se estimulan 10 a 12 días después con
inmunogen adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A
continuación, durante diversas semanas, los ratones también se
pueden estimular con inyecciones de inmunización adicionales. Las
muestras de suero se pueden obtener periódicamente de los ratones
mediante muestras de sangre retro-orbitales para
ser analizadas en ensayos ELISA para detectar anticuerpos
anti-PRO.
\newpage
Después de detectar un título de anticuerpo
adecuado, a los animales "positivos" para anticuerpos se les
puede inyectar una inyección intravenosa final de PRO. De tres a
cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y las células del
bazo se recogen. A continuación, las células del bazo se fusionan
(usando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma
murino seleccionado, tal como la P3X63AgU.1, disponible de ATCC, No.
CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que se pueden
colocar a continuación en placas de cultivo de tejido de 96
pocillos que contienen un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y
timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas,
híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.
Las células de hibridomas se cribarán en un
ELISA para la reactividad contra PRO. La determinación de células
de hibridomas "positivas" que secretan los anticuerpos
monoclonales deseados contra PRO está dentro de la
técnica.
técnica.
Las células de hibridomas positivas se pueden
inyectar intraperitonialmente en ratones singeneicos Balb/c para
producir ascitis que contienen anticuerpos monoclonales
anti-PRO. Alternativamente, las células de
hibridomas pueden desarrollarse en matraces de cultivos de tejidos o
en botellas en rodillo. La purificación de los anticuerpos
monoclonales producidos en los ascitos se puede realizar usando
precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía de
exclusión en gel. Alternativamente, puede usarse la cromatografía
por afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o la
proteína G.
Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes se
pueden purificar mediante una variedad de técnicas estándar en las
técnicas de purificación de proteína. Por ejemplo, se purifica el
polipéptido pro-PRO, el polipéptido PRO maduro, o
el polipéptido pre-PRO mediante cromatografía de
inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido
PRO de interés. En general, una columna de inmunoafinidad está
construida por emparejamientos covalentes de anticuerpos de
polipéptidos anti-PRO a una resina de cromatografía
activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir de sueros inmunes mediante precipitación con sulfato de
amonio o mediante purificación en la Proteína A inmovilizada
(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J). Asimismo, los
anticuerpos monoclonales se preparan a partir de los fluidos de
ascitis de ratón mediante la precipitación con sulfato de amonio o
cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina
parcialmente purificada se une covalentemente a una resina
cromatográfica, tal como la SEPHAROSE^{TM} activada con CnBr
(Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina,
la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la
purificación del polipéptido PRO mediante la preparación de una
fracción a partir de células que contienen polipéptido PRO en una
forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilización de
toda la célula o de una fracción subcelular obtenida mediante
centrifugación diferencial por adición de detergente o mediante
otros procedimientos conocidos en la técnica. Alternativamente, el
polipéptido PRO soluble que contiene una secuencia señal podría
secretarse en una cantidad útil en el medio en el que las células
crecen.
Una preparación que contiene polipéptido PRO
soluble se pasa por la columna de inmunoafinidad, y la columna se
lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial del
polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en
presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en
condiciones que interrumpen la unión anticuerpo/polipéptido PRO
(por ejemplo, un tampón de pH bajo, tal como aproximadamente un pH
de 2-3, o una alta concentración de caótropo, tal
como urea o ión tiocianato), y se recoge el polipéptido PRO.
La presente invención es particularmente útil
para cribar compuestos mediante la utilización de polipéptidos PRO
o fragmentos de unión de los mismos en cualquier variedad de técnica
de cribado de fármacos. El polipéptido PRO o el fragmento utilizado
en dicha prueba puede estar libre en solución, fijado a un soporte
sólido, adsorbido en una superficie celular o situado
intracelularmente. Un procedimiento de cribado de fármaco utiliza
células huésped eucariotas o procariotas, las cuales se transforman
de forma estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el
polipéptido PRO o un fragmento. Los fármacos se criban contra dichas
células transformadas en ensayos de unión competitiva. Dichas
células, tanto en forma viable como fija, se pueden utilizar para
ensayos de unión estándar. Se puede medir, por ejemplo, la formación
de complejos entre el polipéptido PRO o un fragmento y el agente
que se está probando. Alternativamente, se puede examinar la
disminución en la formación del complejo entre el polipéptido PRO y
su célula diana o receptores diana causado por el agente que se está
probando.
De este modo, la presente invención proporciona
procedimientos de cribado para fármacos o cualquier otro agente que
puede afectar una enfermedad o un trastorno asociados al polipéptido
PRO. Estos procedimientos comprenden el contacto de dicho agente
con un polipéptido PRO o fragmento del mismo y el ensayo (I) para la
presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido PRO o un
fragmento, o (II) para la presencia de un complejo entre el
polipéptido PRO o un fragmento y la célula, mediante procedimientos
bien conocidos en la técnica. En dichos ensayos de unión
competitiva, el polipéptido PRO o un fragmento está normalmente
marcado. Después de una incubación adecuada, el polipéptido PRO o
un fragmento libres se separan de la forma unida, y la cantidad de
marca libre o no complejada es una medida de la capacidad del agente
concreto para unirse al polipéptido PRO o para interferir en el
complejo polipéptido PRO/célula.
Otra técnica para el cribado de fármacos
proporciona un alto rendimiento cribando compuestos que tienen una
afinidad de unión adecuada a un polipéptido y se describe en detalle
en WO 84/03564, publicado el 13 de septiembre de 1984. Brevemente,
una gran cantidad de compuestos de diferentes péptidos pequeños de
prueba se sintetizan en un sustrato sólido, tal como agujas de
plástico o alguna otra superficie. Tal y como se aplica a un
polipéptido PRO, las compuestos de péptidos de prueba se hacen
reaccionar con polipéptido PRO y se lavan. Se detecta el
polipéptido PRO unido mediante procedimientos bien conocidos en la
técnica. El polipéptido PRO purificado también puede recubrirse
directamente en placas para utilizar en las técnicas de cribado de
fármacos mencionadas anteriormente. Además, se pueden utilizar
anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e
inmovilizarlo en el soporte sólido.
La presente invención también contempla la
utilización de ensayos de cribado de fármacos competitivos en los
cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a
polipéptidos PRO específicamente compiten con un compuesto de
prueba para unirse a polipéptido PRO o fragmentos del mismo. De esta
manera, pueden utilizarse los anticuerpos para detectar la
presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes
antigénicos con el polipéptido PRO.
El objetivo del diseño racional de fármacos es
producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente
activos de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de pequeñas
moléculas con las cuales interactúan, por ejemplo, agonistas,
antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se puede
utilizar para fármacos de moda que son formas más activas o
estables del polipéptido PRO o que potencian o interfieren con la
función del polipéptido PRO in vivo (c.f. Hodgson,
Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).
En un enfoque, la estructura tridimensional del
polipéptido PRO, o de un complejo polipéptido
PRO-inhibidor, se determina mediante cristalografía
de rayos X, mediante modelación por ordenador o, más habitualmente,
mediante una combinación de los dos enfoques. Deben comprobarse la
forma y las cargas del polipéptido PRO para elucidar la estructura
y para determinar el sitio o sitios activos de la molécula. Con
menor frecuencia, podría obtenerse la información útil con respecto
a la estructura del polipéptido PRO mediante la modelación basada en
la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la
información estructural pertinente se utiliza para diseñar moléculas
análogas de tipo polipéptido PRO o para identificar inhibidores
eficaces. Entre los ejemplos útiles de diseño racional de fármacos
se pueden incluir moléculas que han mejorado la actividad o la
estabilidad, tal como se muestra por Braxton y Wells,
Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992) o
que actúan como agonistas inhibidores, o antagonistas de péptidos
nativos tal y como se muestra por Athauda et. al., J.
Biochem., 113: 742-746 (1993).
También es posible aislar un anticuerpo
específico de diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal
y como se ha descrito anteriormente y, a continuación solucionar su
estructura cristalina. Este enfoque, en principio, produce un
fármaco inicial en el que puede basarse el diseño de fármacos
posterior. Es posible evitar una cristalografía de toda la proteína
mediante la generación de un anticuerpo
anti-idiotípico (anti-ids) a un
anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como imagen
especular de una imagen especular, el sitio de unión del
anti-ids se espera que sea un análogo del receptor
original. A continuación, el anti-ids podría
utilizarse para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos
producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían
entonces como el fármaco inicial.
En virtud de la presente invención, se pueden
fabricar cantidades suficientes del polipéptido PRO para realizar
estudios analíticos, tales como en cristalografía de
rayos-X. Además, el conocimiento de la secuencia de
aminoácidos del polipéptido PRO proporcionada en la presente
invención proporcionará una guía para los usuarios de técnicas de
modelación por ordenador en lugar de o adicionalmente a la
cristalografía de rayos-X.
Este ensayo muestra que ciertos polipéptidos de
la presente invención actúan para inducir la rediferenciación de
condrocitos, por lo tanto, se espera que sean útiles para el
tratamiento de varios trastornos óseos y/o de cartílagos tales
como, por ejemplo, lesiones deportivas y artritis. El ensayo se
realiza tal y como se indica a continuación. Se aíslan condrocitos
porcinos mediante digestión con colagenasa durante toda la noche de
cartílago articular de las articulaciones metacarpofalángicas de
cerdos de 4-6 meses de edad. A continuación, las
células aisladas se siembran a 25.000 células/cm^{2} en Ham
F-12 que contiene FBS al 10% y 4 \mug/ml de
gentamicina. El medio de cultivo se cambia cada tres días y, a
continuación, las células se siembran en placas de 96 pocillos a
5.000 células/pocillo en 100 \mul del mismo medio sin suero y se
añaden 100 \mul del polipéptido PRO de prueba, estaurosporina 5
nM (control positivo) o medio solo (control negativo) para obtener
un volumen final de 200 \mul/pocillo. Tras 5 días de incubación a
37ºC, se toma una fotografía de cada pocillo y se determina el
estado de diferenciación de los condrocitos. Tiene lugar un
resultado positivo en el ensayo cuando se determina que la
rediferenciación de los condrocitos es más parecido al control
positivo que al negativo.
El siguiente polipéptido dio positivo en este
ensayo: PRO4405.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes materiales se han depositado con
la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MS, USA (ATCC):
| Material | ATCC Dep. No. | Fecha del depósito |
| DNA84920-2614 | 203966 | 27 de abril de 1999 |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos depósitos se realizaron según lo
estipulado en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento bajo el mismo
(Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo
viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de
ldepósito. Los depósitos estarán disponibles mediante la ATCC según
los términos del Tratado de Budapest, y están sujetos a un acuerdo
entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad
permanente y sin restricción de la progenie del cultivo del depósito
al uso público tras la publicación de la respectiva patente
estadounidense o tras ponerse abierta a la inspección pública de
cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, la que
sea primera, y asegura la disponibilidad de la progenie para
alquien determinado por la U.S. Commissioner of Patents and
Trademarks para tener el derecho a la misma de acuerdo con 35 USC
\NAK 122 y las normas de la Commissioner según las mismas
(incluyendo 37 CFER \NAK 1.14 con referencia concreta a 886 OG
638).
El cesionario de la presente solicitud ha
acordado que si un cultivo de los materiales en el depósito
mueriera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las
condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente
remplazados en una notificación por otros iguales. La disponibilidad
del material depositado no se interpreta como una licencia para
realizar la invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la
autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de
patente.
La memoria escrita anterior se considera que es
suficiente para permitir a un experto en la materia realizar la
invención. La presente invención no se limita en su alcance por la
construcción depositada, ya que la realización depositada pretende
ser una ilustración individual de ciertos aspectos de la presente
invención y otras construcciones que son funcionalmente
equivalentes están dentro del alcance de la presente invención tal
y como se define en las reivindicaciones. El depósito del material
de la presente invención no constituye una admisión de que la
descripción escrita contenida en la presente invención sea
inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la
invención, incluyendo el modo óptimo de la misma, ni se interpreta
como limitante del alcance de las reivindicaciones a las
ilustraciones específicas que representa. De hecho, las diversas
modificaciones además de las mostradas y descritas en la presente
invención serán evidentes para los expertos en la materia a partir
de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
<110> Genentech, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDOS SECRETADOS Y
TRANSMEMBRANA Y LOS ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LOS CODIFICAN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 05011884.3
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
01-03-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/125.774
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-03-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/125.778
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-03-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/125.826
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
24-03-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/127.035
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
31-03-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/127.706
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
05-04-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/130.359
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
21-04-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/131.270
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
27-04-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/131.272
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
27-04-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/131.291
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
27-04-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/132.371
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-05-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/132.379
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-05-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/132.383
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-05-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/135.750
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
25-05-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/138.166
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
08-06-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/144.791
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
20-07-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/146.970
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
03-08-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/170.262
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
09-12-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de oligonucleótido
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaaaacga cggccagtta aatagacctg caattattaa tct
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de oligonucleótido
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgaccac ctgcacacct gcaaatccat t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de oligonucleótido
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggactttc gctacctgtt gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de oligonucleótido
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcatattc cacaaaatgc tttggg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de oligonucleótido
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttcgggga ttcttcccgg ctcccgttcg ttcctctg
\hfill38
Claims (34)
1. Ácido nucleico aislado que:
(i) codifica un polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No: 4), con
o sin la secuencia señal y/o la metionina de iniciación,
opcionalmente con el dominio transmembrana eliminado o
inactivado;
(ii) codifica un dominio extracelular del
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la
figura 2 (SEC ID No: 4), con o sin la secuencia señal;
(iii) codifica un polipéptido que tiene por lo
menos un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con el
polipéptido de (i) o con el dominio extracelular de (ii), donde el
polipéptido es capaz de inducir la rediferenciación de
condrocitos;
(iv) tiene la secuencia de ácidos nucleicos
mostrada en la figura 1 (SEC ID No: 3);
(v) tiene la secuencia de ácidos nucleicos de la
secuencia codificante de longitud completa mostrada en la figura 1
(SEC ID No: 3);
(vi) tiene la secuencia codificante de longitud
completa de la inserción (DNA84920-2614) contenida
en ATCC 203966;
(vii) tiene por lo menos un 80% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos con el ácido nucleico de (iv), (v)
o (vi) y codifica un polipéptido capaz de inducir la
rediferenciación de condrocitos; o
(viii) se hibrida bajo condiciones de
hibridación y lavado astringentes al complemento del ácido nucleico
entre los nucléotidos 181 y 1008, ambos inclusive, de la figura 1
(SEC ID No: 3) y codifica un polipéptido capaz de inducir la
rediferenciación de condrocitos,
en el que dicha identidad de secuencia se
determina utilizando el programa informático
ALIGN-2.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en
el que dicha secuencia señal va desde los aminoácidos 1 a 34.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicho dominio transmembrana va desde los
aminoácidos 58 a 76.
4. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho dominio extracelular va
desde los aminoácidos 77 \pm 5 a 310.
5. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de identidad es del
85%.
6. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de identidad es del
90%.
7. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de identidad es del
95%.
8. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de identidad es del
99%.
9. Vector que comprende el ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Vector según la reivindicación 9, unido
operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula
huésped transformada con el vector.
11. Célula huésped que comprende el vector según
la reivindicación 9 o la reivindicación 10.
12. Célula huésped según la reivindicación 11,
que es una célula de CHO.
13. Célula huésped según la reivindicación 11,
que es una E. coli.
14. Célula huésped según la reivindicación 11,
que es una célula de levadura.
15. Proceso para producir un polipéptido que
comprende el cultivo de la célula huésped según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, bajo condiciones adecuadas para la
expresión de dicho polipéptido y la recuperación de dicho
polipéptido del cultivo celular.
16. Polipéptido aislado que tiene:
(i) la secuencia de aminoácidos tal y como se
muestra en la figura 2 (SEC ID No: 4), con o sin la secuencia señal
y/o la metionina de iniciación, opcionalmente con el dominio
transmembrana eliminado o inactivado;
(ii) la secuencia de aminoácidos del dominio
extracelular del polipéptido mostrada en la figura 2 (SEC ID No: 4),
con o sin la secuencia señal;
(iii) la secuencia de aminoácidos codificada por
la secuencia codificante de longitud completa de la inserción
(DNA84920-2614) contenida en ATCC 203966; o
(iv) por lo menos un 80% de identidad en la
secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (i),
(ii) o (iii), donde el polipéptido es capaz de inducir la
rediferenciación de condrocitos,
en el que dicha identidad de secuencia se
determina utilizando el programa informático
ALIGN-2.
17. Polipéptido según la reivindicación 16, en
el que dicha secuencia señal va desde los aminoácidos 1 a 34.
18. Polipéptido según la reivindicación 16 o la
reivindicación 17, en el que dicho dominio transmembrana va desde
los aminoácidos 58 a 76.
19. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, en el que dicho dominio extracelular va
desde los aminoácidos 77 \pm 5 a 310.
20. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, en el que el nivel de identidad es del
85%.
21. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, en el que el nivel de identidad es del
90%.
22. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, en el que el nivel de identidad es del
95%.
23. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, en el que el nivel de identidad es del
99%.
24. Molécula quimérica que comprende un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23,
fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.
25. Molécula quimérica según la reivindicación
24, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una
secuencia de epítopo etiqueta.
26. Molécula quimérica según la reivindicación
24, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una
región Fc de una inmunoglobulina.
27. Anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23.
28. Anticuerpo según la reivindicación 27, que
se une específicamente a un polipéptido según la reivindicación 16,
parte (i) (ii) o (iii) o cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19
dependientes de la misma.
29. Anticuerpo según la reivindicación 27 o la
reivindicación 28, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo de cadena
única.
30. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 23, para utilizar en un método de
tratamiento.
31. Polipéptido según la reivindicación 30, para
utilizar en el tratamiento de trastornos óseos y/o de cartílago.
32. Polipéptido según la reivindicación 30, para
utilizar en el tratamiento de lesiones deportivas o artritis.
33. Utilización de un polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento de trastornos óseos y/o de
cartílago.
34. Utilización de un polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento de lesiones deportivas o
artritis.
Applications Claiming Priority (33)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12577499P | 1999-03-23 | 1999-03-23 | |
| US12577899P | 1999-03-23 | 1999-03-23 | |
| US125778P | 1999-03-23 | ||
| US125774P | 1999-03-23 | ||
| US12582699P | 1999-03-24 | 1999-03-24 | |
| US125826P | 1999-03-24 | ||
| US12703599P | 1999-03-31 | 1999-03-31 | |
| US127035P | 1999-03-31 | ||
| US12770699P | 1999-04-05 | 1999-04-05 | |
| US127706P | 1999-04-05 | ||
| US13035999P | 1999-04-21 | 1999-04-21 | |
| US130359P | 1999-04-21 | ||
| US13129199P | 1999-04-27 | 1999-04-27 | |
| US13127299P | 1999-04-27 | 1999-04-27 | |
| US13127099P | 1999-04-27 | 1999-04-27 | |
| US131291P | 1999-04-27 | ||
| US131272P | 1999-04-27 | ||
| US131270P | 1999-04-27 | ||
| US13237999P | 1999-05-04 | 1999-05-04 | |
| US13238399P | 1999-05-04 | 1999-05-04 | |
| US13237199P | 1999-05-04 | 1999-05-04 | |
| US132371P | 1999-05-04 | ||
| US132379P | 1999-05-04 | ||
| US132383P | 1999-05-04 | ||
| US13575099P | 1999-05-25 | 1999-05-25 | |
| US135750P | 1999-05-25 | ||
| US13816699P | 1999-06-08 | 1999-06-08 | |
| US138166P | 1999-06-08 | ||
| US14479199P | 1999-07-20 | 1999-07-20 | |
| US144791P | 1999-07-20 | ||
| US14697099P | 1999-08-03 | 1999-08-03 | |
| US146970P | 1999-08-03 | ||
| EP00917717A EP1169442B1 (en) | 1999-03-23 | 2000-03-01 | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2288279T3 true ES2288279T3 (es) | 2008-01-01 |
Family
ID=38175751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05011884T Expired - Lifetime ES2288279T3 (es) | 1999-03-23 | 2000-03-01 | Polipeptidos secretados y transmembrana y los acidos nucleicos que los codifican. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1621619B1 (es) |
| AT (1) | ATE363537T1 (es) |
| DK (1) | DK1621619T3 (es) |
| ES (1) | ES2288279T3 (es) |
| PT (1) | PT1621619E (es) |
-
2000
- 2000-03-01 EP EP05011884A patent/EP1621619B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-01 DK DK05011884T patent/DK1621619T3/da active
- 2000-03-01 ES ES05011884T patent/ES2288279T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-01 PT PT05011884T patent/PT1621619E/pt unknown
- 2000-03-01 AT AT05011884T patent/ATE363537T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1621619B1 (en) | 2007-05-30 |
| EP1621619A3 (en) | 2006-02-08 |
| DK1621619T3 (da) | 2007-10-01 |
| EP1621619A2 (en) | 2006-02-01 |
| ATE363537T1 (de) | 2007-06-15 |
| PT1621619E (pt) | 2007-08-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2287020T3 (es) | Procedimiento y composiciones para inhibir el crecimiento de celulas neoplasicas. | |
| EP1210418B1 (en) | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same | |
| ES2292242T3 (es) | Utilizaciones terapeuticas de polipeptidos homologos de il-17. | |
| ES2269125T3 (es) | Polipeptidos transmembrana y secretados y los que los codifican. | |
| JP2003505082A (ja) | 新規なポリヌクレオチドとその使用法 | |
| JP2004526412A (ja) | 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードする核酸 | |
| ES2263865T3 (es) | Homologo humano de neurotrimina. | |
| US20070174922A1 (en) | Nucleic acid encoding novel type-1 cytokine receptor glm-r | |
| US7235633B2 (en) | Cytokine receptors and nucleic acids encoding the same | |
| JP2009219492A (ja) | Ｇｄｎｆｒと配列類似性を有する新規ポリペプチド及びこれをコードする核酸 | |
| US7642242B2 (en) | PRO34128 polypeptides | |
| ES2316454T3 (es) | Metodo de inhibicion de pap1 inducido por il-22. | |
| ES2288279T3 (es) | Polipeptidos secretados y transmembrana y los acidos nucleicos que los codifican. | |
| ES2269560T3 (es) | Proteinas humanas que tienen una actividad antiproliferactiva in vitro. | |
| ES2267904T3 (es) | Polipeptido secretado y transmembrana y acidos nucleicos que lo codifican. | |
| ES2341257T3 (es) | Polipeptidos secretados y transmembrana y acidos nucleicos que los codifican. | |
| ES2333876T3 (es) | Polipeptidos secretados y transmembrana y acidos nucleicos que los codifican. | |
| ES2308334T3 (es) | Polipeptidos secretados y transmembrana y acidos nucleicos que los codifican. | |
| ES2317967T3 (es) | Proteina gas-6 (growth arrest-specific gene 6) humana y acidos nucleicos que la codifican. | |
| ES2349076T3 (es) | Polipéptidos secretados y transmembrana y ácidos nucleidos que lo codifican. | |
| ES2256362T3 (es) | Homologo de la proteina del veneno de serpiente y acido nucleico que lo codifica. | |
| ES2264456T3 (es) | Acido nucleico amplificado dentro de los tumores y procedimientos y materiales relacionados. | |
| ES2298310T3 (es) | Proteina de tipo prostasina humana y acidos nucleicos que la codifican. | |
| EP1484338B1 (en) | Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth | |
| ES2236394T3 (es) | Acido nucleico que esta amplificado en tumores humanos y materiales y metodos relacionados. |