ES2238838T3 - Formulacion liposomal sensible a la temperatura. - Google Patents
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Abstract
Un liposoma que contiene un agente activo, teniendo dicho liposoma una membrana de bicapa lipídica que comprende fosfolípido y lisolípido, en el que los fosfolípidos son la fuente de lípidos principal para la membrana de la bicapa lipídica y en el que el lisolípido está contenido en la membrana de la bicapa en una cantidad suficiente para aumentar el porcentaje de agente activo liberado a la temperatura de transición de fase, en comparación con la que ocurriría en ausencia de dicho lisolípido.
Description
Formulación liposomal sensible a la
temperatura.
Esta invención se realizó con apoyo del Gobierno
con la beca del Instituto Nacional de Salud NIH GM40162 y beca SPORE
del Instituto Nacional del Cáncer P50-CA68438. El
Gobierno puede tener ciertos derechos sobre esta invención
La presente invención trata de liposomas
termosensibles, y más específicamente de liposomas que comprenden
fosfolípidos y un agente tensioactivo, en los que los liposomas
liberan sus contenidos a temperaturas hipertérmicas moderadas.
Los liposomas están formados por al menos una
membrana de bicapa lipídica que encierra un compartimiento interno
acuoso. Los liposomas se pueden caracterizar por tipo de membrana y
tamaño. Las vesículas unilaminares pequeñas (VUPs) tienen una única
membrana y normalmente varían entre 0,02 y 0,05 \mum de diámetro;
las vesículas unilaminares grandes (VUGs) son normalmente mayores de
0,05 \mum. Las vesículas grandes oligolaminares y las vesículas
grandes multilaminares tienen múltiples capas de membranas,
normalmente concéntricas, y son normalmente mayores de 0,1 \mum.
Los liposomas con varias membranas no concéntricas, es decir, varias
vesículas pequeñas contenidas dentro de una vesícula mayor, se
denominan vesículas multivesiculares.
Los liposomas convencionales se formulan para
tener agentes terapéuticos, fármacos u otros agentes activos
contenidos dentro del espacio acuoso interior (agentes activos
solubles en agua) o repartidos entre la bicapa lipídica (agentes
activos insolubles en agua). La solicitud de patente de Estados
Unidos pendiente de tramitación SN 08/795.100 describe liposomas que
contienen colesterol en la membrana de bicapa lipídica, donde se
agrega un agente activo con un tensioactivo lipídico para formar
micelas y las micelas quedan atrapadas en el espacio interior del
liposoma.
Los agentes activos que tienen unas semividas
cortas en el flujo sanguíneo son particularmente adecuados para
suministrarse mediante liposomas. Se sabe que muchos agentes
antineoplásicos, por ejemplo, tienen una semivida corta en el flujo
sanguíneo, de modo que su uso por vía parenteral no es factible. Sin
embargo, el uso de liposomas para la administración específica a un
sitio de los agentes activos mediante el flujo sanguíneo está
limitado por la rápida eliminación de los liposomas de la sangre por
parte de las células del sistema reticuloendotelial (SRE).
Los liposomas normalmente no pierden líquido,
pero lo harán si aparece un hueco en la membrana liposomal, si la
membrana se degrada o se disuelve, o si la temperatura de la
membrana aumenta hasta la temperatura de transición de fase. Se ha
usado el aumento de la temperatura (hipertermia) en un sitio diana
en un individuo para elevar la temperatura del liposoma por encima
de la temperatura de transición de fase, provocando por lo tanto la
liberación de los contenidos del liposoma, para el suministro
selectivo de agentes terapéuticos. Yatvin y col., Science
204:188 (1979). Esta técnica está limitada, sin embargo, cuando la
temperatura de transición de fase del liposoma es significativamente
mayor que la temperatura del tejido normal.
Por consiguiente es deseable elaborar
formulaciones de liposomas capaces de suministrar cantidades
terapéuticas de agentes activos en respuesta a condiciones
hipertérmicas moderadas.
En vista de lo anterior, un primer aspecto de la
presente invención es un liposoma que contiene un agente activo. La
membrana de la bicapa lipídica del liposoma contiene fosfolípidos
como fuente de lípidos principal; los lisolípidos están contenidos
en la membrana de la bicapa en una cantidad que aumenta el
porcentaje de agente activo liberado a la temperatura de transición
de fase, en comparación con la que ocurriría en ausencia de
lisolípido.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un liposoma que tiene una membrana de bicapa lipídica que comprende
fosfolípidos como fuente de lípidos principal, y entre 2 por ciento
molar y 30 por ciento molar, preferiblemente entre 10 por ciento
molar y 20 por ciento molar, de lisolípidos.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un procedimiento para preparar un agente activo para administración
hipertérmica. El agente activo está atrapado en un liposoma que
tienen una membrana de bicapa lipídica que comprende fosfolípidos
como la fuente de lípidos principal, y entre 1% molar y 30% molar de
lisolípidos.
Un aspecto adicional de la presente invención es
una preparación liposomal que comprende varios liposomas como se
describe anteriormente.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un procedimiento para fabricar liposomas que contienen un agente
activo en el espacio interior del liposoma. Se prepara primero una
capa de fosfolípido que contiene lisolípido, y luego se hidrata con
una preparación acuosa que contiene el agente activo y una cantidad
equilibrante del monómero de lisolípido. El lisolípido está
contenido en la membrana del liposoma en una cantidad suficiente
para aumentar el porcentaje de agente activo liberado a la
temperatura de transición de fase de la membrana del liposoma, en
comparación con la que ocurriría en ausencia del lisolípido.
La Figura 1 representa esquemáticamente un
liposoma que tiene una membrana de bicapa que contiene
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) como un fosfolípido y
monopalmitoilfosfatidilcolina (MPPC) como un lisolípido. Se indica
la orientación de los monómeros de lisolípido y su presencia en las
capas interna y externa de la bicapa lipídica.
La Figura 2 representa el efecto de un pase de
extrusión en el diámetro medio de liposomas de DPPC que contienen
DPPC:MPPC (90:10). Las vesículas multilaminares con un tamaño medio
de 700 nm se extruyeron a través de un depósito de dos membranas de
policarbonato de tamaño de poro 0,1 mm bajo una presión de
2068-2758 kPa a 45ºC.
La Figura 3 representa la liberación de
6-carboxifluoresceína (CF) atrapada en los liposomas
compuestos por DPPC:MPPC (90:10), como una función del tiempo en
presencia de solución salina de tampón fosfato a 37º (círculos
blancos) y 40ºC (cuadrados negros).
La Figura 4 representa la liberación de CF de
liposomas de DPPC:MPPC de concentraciones variadas, a temperaturas
entre 20ºC y 45ºC en presencia de solución salina de tampón fosfato
10 mM (pH = 7,4). Los liposomas contenían DPPC solo (círculos
blancos); DPPC:MPPC 98:2 (cuadrados negros); DPPC:MPPC 96:4
(triángulos negros \blacktriangledown); DPPC:MPPC 94:6 (triángulos
blancos \nabla); DPPC:MPPC 93:7 (rombos negros); DPPC:MPPC 92:8
(cuadrados blancos); DPPC:MPPC 90:10 (círculos negros); DPPC:MPPC
80:20 (triángulos negros \blacktriangledown).
La Figura 5A proporciona termogramas de flujo
térmico que muestran el efecto de concentración variada de MPPC
sobre la temperatura de transición de fase (Tc) de los liposomas de
DPPC. La Tc de las muestras liposomales liofilizadas de DPPC que
contiene MPPC (1-10% molar) se midió mediante
calorimetría de exploración diferencial (CED) entre
30ºC-45ºC con una velocidad de calentamiento de
2ºC/minuto.
La Figura 5B muestra el efecto de la
concentración de MPPC sobre la temperatura de transición de fase
(Tc) de liposomas de DPPC, como se describió anteriormente para la
figura 5A. El gráfico muestra el punto de partida de la transición
(triángulo blanco); el pico en entalpía (círculo negro); y el punto
final de la transición (triángulo blanco).
La Figura 6A compara el perfil calorimétrico de
exploración diferencial (exceso de flujo térmico; cuadrados blancos)
de liposomas (90:10 DPPC:MPPC) con el perfil de liberación
diferencial (círculos negros) para liberación de
6-carboxifluoresceína (CF), según se obtiene para el
experimento de liberación acumulativa descrito en la Figura 4.
La Figura 6B representa el perfil de liberación
diferencial a partir de liposomas de DPPC:MPPC 90:10, donde los
círculos blancos representan flujo térmico y los círculos negros
representan la liberación diferencial de CF a temperaturas entre
25ºC y 45ºC.
La Figura 7 representa la liberación de
doxorrubicina (DX) atrapada de liposomas (DPPC:MPPC 90:10) en
función del tiempo a 37ºC (círculos negros) y 40ºC (círculos
blancos) en presencia de solución salina de tampón fosfato.
La Figura 8 representa los perfiles de
liberación acumulativa de DX atrapada en liposomas formados por
DPPC:
MPPC 90:10, incubados a temperaturas de entre 25ºC y 45ºC durante cinco minutos en presencia de solución salina de tampón fosfato.
MPPC 90:10, incubados a temperaturas de entre 25ºC y 45ºC durante cinco minutos en presencia de solución salina de tampón fosfato.
La Figura 9A representa la liberación de
6-carboxifluoresceína (CF) atrapada de liposomas
(DPPC:
MPPC 90:10 incorporados con 5% molar de DSPE-PEG2000) en presencia de solución salina de tampón fosfato en función de la temperatura (37ºC - círculo blanco; 38ºC - cuadrado negro; 39ºC triángulo negro; 39,5ºC - triángulo blanco; y 40ºC - círculo negro).
MPPC 90:10 incorporados con 5% molar de DSPE-PEG2000) en presencia de solución salina de tampón fosfato en función de la temperatura (37ºC - círculo blanco; 38ºC - cuadrado negro; 39ºC triángulo negro; 39,5ºC - triángulo blanco; y 40ºC - círculo negro).
La Figura 9B representa la liberación de
6-carboxifluoresceína (CF) atrapada en liposomas
(formados por DPPC:
MPPC 90:10 e incorporados con 5% molar de DSPE-PEG2000) en presencia de suero bovino al 50% en función de la temperatura (37ºC - círculo blanco; 38ºC - cuadrado negro; 39ºC triángulo negro; 39,5ºC - triángulo blanco; y 40ºC - círculo negro).
MPPC 90:10 e incorporados con 5% molar de DSPE-PEG2000) en presencia de suero bovino al 50% en función de la temperatura (37ºC - círculo blanco; 38ºC - cuadrado negro; 39ºC triángulo negro; 39,5ºC - triángulo blanco; y 40ºC - círculo negro).
La Figura 10 representa la liberación
acumulativa de 6-carboxifluoresceína (CF) atrapada
en liposomas formados por DPPC:MPPC 90:10, a varias temperaturas
entre 25ºC y 45ºC en presencia de solución salina de tampón fosfato
(círculos negros) o suero bovino al 50% (círculos blancos).
La Figura 11A representa la estructura química
de
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DPPC).
La Figura 11B representa la estructura química
de
1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina
(MPPC).
La Figura 11C representa la estructura química
de
1,2-diestaroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[poli(etilenglicol)
2000] (DSPE-PEG2000).
La presente invención proporciona liposomas que
son sensibles a alteraciones en la temperatura del entorno
circundante. La sensibilidad a la temperatura de dichos liposomas
permite la liberación de compuestos atrapados dentro del espacio
acuoso interior del liposoma, y/o la liberación de compuestos
asociados con la bicapa lipídica, en un sitio diana que se puede
calentar (como en el proceso clínico de hipertermia) o que está a
una temperatura intrínsecamente mayor que el resto del cuerpo (como
en una inflamación). Las bicapas del liposoma de la presente
invención incluyen (además de un componente lipídico primario o
principal) lisolípido, u otro(s) agente(s)
tensioactivo(s). La inclusión de lisolípidos u otros agentes
tensioactivos en la bicapa del liposoma mejora la liberación de
compuestos cuando la temperatura del liposoma alcanza la temperatura
de transición de fase cristalina de gel a líquido del componente
lipídico principal. La presencia del lisolípido (u otro agente
tensioactivo) también hace que el liposoma libere el fármaco a una
temperatura ligeramente menor que la que se alcanza con los
liposomas formados sólo por fosfolípidos. Los liposomas de la
presente invención son particularmente útiles en el suministro de
fármacos, cuando el liposoma contiene un compuesto a administrar a
un sitio diana preseleccionado en el cuerpo de un individuo. El
sitio diana se calienta artificialmente (hipertermia) de modo que
está a una temperatura igual o superior a la temperatura de
transición de fase cristalina de gel a líquido, o el sitio diana
puede estar a una temperatura superior que los sitios
no-diana en el cuerpo debido a causas naturales (por
ejemplo, inflamación), donde esa temperatura es igual o superior a
la temperatura de transición de fase cristalina de gel a líquido del
liposoma utilizado.
Cuando los liposomas se incuban durante varios
minutos a temperaturas en la región de la temperatura de transición
de fase cristalina de gel a líquido (Tc) del lípido principal que
forma el liposoma, la bicapa del liposoma se vuelve permeable y
libera los solutos atrapados dentro del liposoma en la solución
circundante. Se ha propuesto el uso clínico de hipertermia con
liposomas sensibles a la temperatura. Véase, por ejemplo,
Yatvin y col., Science 202:1290 (1978).
La patente de Estados Unidos nº 5.094.854 (Ogawa
y col.) describe liposomas en los que la presión osmótica de la
solución que contiene el fármaco atrapado en los liposomas es
1,2-2,5 veces superior a la del fluido corporal de
los animales de sangre caliente. Se indica que el intervalo de
temperatura en el que la membrana del liposoma se vuelve permeable a
la liberación del material está en el intervalo entre 40ºC y
45ºC.
La patente de Estados Unidos nº 5.720.976 (Kim y
col.) describe el uso de un copolímero de
N-isopropilacrilamida/octadecilacrilato/ácido
acrílico para recubrir la superficie liposomal para efectuar la
liberación de los agentes contenidos dentro del liposoma. La
liberación del agente atrapado ocurre a temperaturas superiores a
28ºC (bastante inferior a la temperatura humana media).
En la técnica se conocen métodos para calentar el
cuerpo de un individuo con fines terapéuticos o para ayudar en el
suministro de agentes terapéuticos o diagnósticos. La hipertermia
consiste en calentar sitios enfermos, como tumores sólidos, hasta
temperaturas superiores a la temperatura fisiológica (por ejemplo,
entre aproximadamente 38ºC y aproximadamente 45ºC), y se usa
actualmente como un adyuvante a la terapia de radiación,
principalmente (Bates y Mc Killop Cancer Res. 46:5477 (1986);
Herman, Cancer Res. 43, 511 (1983)).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "hipertermia" se refiere al aumento de la temperatura
corporal de un individuo, o de una parte del cuerpo del individuo,
en comparación con la temperatura normal del individuo. Dicho
aumento puede ser el resultado de un procedimiento natural (como una
inflamación) o inducirse artificialmente con fines terapéuticos o
diagnósticos. En mamíferos, se mantiene normalmente una temperatura
corporal normal debido al centro termorregulador en el hipotálamo
anterior, que actúa para equilibrar la producción de calor en
tejidos corporales con pérdida de calor. "Hipertermia" se
refiere al aumento de la temperatura corporal por encima del valor
fijado por el hipotálamo debido a una insuficiente disipación del
calor. A diferencia de la hipertermia, la "fiebre" se refiere a
un aumento de la temperatura corporal debido a un cambio en el
centro termorregulador. La temperatura oral media global de un
humano sano de 18-40 años es 36,8 \pm 0,4ºC (98,2
\pm 0,7ºF). Véase por ejemplo, Harrison's Principles of
Internal Medicine (Fauci y col., Ed.) 14ª Edición,
McGraw-Hill, Nueva York, p. 84 (1998).
Se ha propuesto el uso de hipertermia con
liposomas térmicamente sensibles, por ejemplo, para el tratamiento
de tumores (Yatvin y col., Science 202:1290 (1978)). El uso
de una hipertermia localizada y de liposomas térmicamente sensibles
para dirigir a los agentes antineoplásicos a sitios tumorales en un
individuo actúa para disminuir los efectos secundarios no deseados
del agente, y para mejorar los efectos terapéuticos. Sin embargo, la
eficacia de los liposomas dirigidos a sitios enfermos mediante
hipertermia depende de la estabilidad del liposoma en el flujo
sanguíneo (cuando los liposomas se administran el sistema
circulatorio), y en la cantidad de agente activo liberada por el
liposoma en el sitio diana. Por ejemplo, los liposomas descritos por
Yatvin y col., Science 202:1290 (1978) liberaron sólo una
parte del fármaco que llevaba el liposoma a las temperaturas
hipertérmicas.
Tal como se usa en el presente documento, la
"administración hipertérmica" de un agente activo se refiere a
su administración junto con el uso de hipertermia clínica en el
individuo en un sitio diana preseleccionado, para suministrar una
mayor cantidad de agente activo al sitio diana en comparación con la
que resultaría a partir de una administración del agente activo en
ausencia de hipertermia.
Los liposomas de la presente invención comprenden
un lípido que posee una temperatura de transición cristalina de gel
a líquido en el intervalo hipertérmico (por ejemplo, el intervalo
entre aproximadamente 38ºC y aproximadamente 45ºC). Se prefieren
fosfolípidos con una temperatura de transición de fase de entre
aproximadamente 38ºC y aproximadamente 45ºC, y se prefieren más aun
los fosfolípidos cuyos grupos acilo están saturados. Un fosfolípido
particularmente preferido es dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC).
DPPC es un fosfolípido de cadena saturada (C16) común con una
transición de bicapa de 41,5ºC (Blume, Biochemistry 22:5436
(1983); Albon y Sturtevant, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
75:2258 (1978)). Se han estudiado los liposomas termosensibles
que contienen DPPC y otros lípidos que tienen una temperatura de
transición similar o superior, y que se mezclan idealmente con DPPC
(como
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)]
(DPPG) (Tc = 41,5ºC) y
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DSPG) (Tc = 41,5ºC) y
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DSPC) (Tc = 55,1ºC)). Kastumi Iga y col. Intl. J.
Pharmaceutics, 57:241 (1989); Bassett y col, J. Urology,
135:612 (1985); Gaber y col, Pharmacol. Res. 12:1407 (1995).
También se han descrito los liposomas termosensibles que contienen
DPPC y colesterol. Demel y De Kruyff, Biochim. Biophys. Acta.
457:109 (1976).
Tal como se usa en el presente documento, el
"lípido principal" en una bicapa de liposoma es el que es el
componente lipídico principal del material de la bicapa del
liposoma. De este modo, en una bicapa de liposoma compuesto por 70%
molar de fosfolípido y 30% molar de lisolípido, el fosfolípido es el
lípido principal.
Los liposomas de la presente invención incorporan
un agente tensioactivo relativamente soluble en agua, como un
lisolípido, en una bicapa formada principalmente por una molécula
relativamente insoluble en agua, como un fosfolípido de doble cadena
(por ejemplo, DPPC). La incorporación del agente tensioactivo en la
fase de gel del componente lipídico principal mejora la liberación
de los contenidos del liposoma resultante cuando se calienta hasta
la temperatura de transición de fase cristalina de gel a líquido del
lípido principal. Los agentes tensioactivos preferidos son
lisolípidos, y un agente tensioactivo preferido es
monopalmitoilfosfatidilcolina (MPPC). Los agentes tensioactivos
adecuados son aquellos que son compatibles con el lípido principal
de la bicapa, y que se desorben cuando el lípido se funde a la fase
líquida. Agentes tensioactivos adecuados adicionales para uso en
bicapas de fosfolípidos incluyen alcoholes palmitoílicos, alcoholes
estearílicos, palmitoilo, estearilo, polietilenglicol, monopalmitato
de glicerilo, monooleato de glicerilo, ceramidas,
PEG-ceramidas, y lípidos terapéuticos. Los lípidos
terapéuticos incluyen, por ejemplo, lisofosfatidilcolina unida a
éter C_{18}.
Un liposoma preferido de la presente invención
incorpora un lisolípido compatible con bicapa en una bicapa de
fosfolípido, estando presente el lisolípido en la bicapa a una
concentración suficiente para mejorar la liberación de los
contenidos (por ejemplo, agente activo o agente terapéutico) del
liposoma, en comparación con la liberación de contenidos que se
lograría usando un liposoma compuesto únicamente por un lípido solo
(es decir, sin lisolípido). Los contenidos pueden estar
contenidos dentro del interior del liposoma o en la membrana del
liposoma. Por "liberación mejorada", se quiere decir que (a) se
libera un mayor porcentaje de contenidos a una temperatura dada, en
comparación con la cantidad de contenidos liberada a esa temperatura
por un liposoma con una bicapa formada sólo por fosfolípido; o (b)
los contenidos atrapados en el interior del liposoma se liberan a
una menor temperatura que la temperatura a la que ocurriría la
liberación de los contenidos usando un liposoma con una bicapa
formada sólo de fosfolípidos.
La presente invención proporciona liposomas que
liberan contenidos atrapados a temperaturas que se pueden conseguir
con ajustes clínicos usando una hipertermia moderada. La presente
invención proporciona liposomas
(THERMOSOMES^{TM}) que son muy estables a la temperatura corporal (37ºC) pero que se vuelven inestables y muestran una liberación mejorada de los compuestos atrapados a temperaturas menores de 39ºC. Este intervalo de temperatura es unos pocos grados menor que muchos de las formulaciones liposomales previas que sólo mostraban una liberación significativa a temperaturas superiores a 42ºC. Además, la presente combinación de la formulación liposomal de lípido y lisolípido compatible proporciona una mezcla de lípido/lisolípido con una temperatura de transición cristalina de gel a líquido ligeramente menor en comparación a la del lípido puro solo, aunque la temperatura de transición cristalina de gel a líquido no resulta ampliada por la inclusión de un lisolípido.
(THERMOSOMES^{TM}) que son muy estables a la temperatura corporal (37ºC) pero que se vuelven inestables y muestran una liberación mejorada de los compuestos atrapados a temperaturas menores de 39ºC. Este intervalo de temperatura es unos pocos grados menor que muchos de las formulaciones liposomales previas que sólo mostraban una liberación significativa a temperaturas superiores a 42ºC. Además, la presente combinación de la formulación liposomal de lípido y lisolípido compatible proporciona una mezcla de lípido/lisolípido con una temperatura de transición cristalina de gel a líquido ligeramente menor en comparación a la del lípido puro solo, aunque la temperatura de transición cristalina de gel a líquido no resulta ampliada por la inclusión de un lisolípido.
Un liposoma preferido de la presente invención
tiene una bicapa formada principalmente por un fosfolípido, y
contiene lisolípidos en una cantidad que disminuye la temperatura de
transición de fase cristalina de gel a líquido de la bicapa, en
comparación con una bicapa formada por un fosfolípido solo. Un
liposoma particularmente preferido de la presente invención
comprende un DPPC como el fosfolípido principal y MPPC como el
lisolípido, donde la relación de DPPC:MPPC está entre 99:1, 98:2,
97:3, 96:4, 95:5, 90:10, y aproximadamente 80:20, 75:25, 70:30,
65:35, 60:40, o incluso 51:49 (en relación molar).
La presente invención proporciona un nuevo
sistema para suministrar agentes activos en un vehículo lípido, en
el que los agente activos se liberan del vehículo durante un
estrecho intervalo de temperatura. El calentamiento local de los
sitios diana hasta temperaturas moderadamente hipertérmicas (es
decir, entre 39ºC y 41ºC) permite el suministro preferencial del
agente activo a un sitio enfermo. Los presentes liposomas son
adecuados para uso en combinación con hipertermia para dirigir a los
agentes activos a sitios enfermos, en comparación con los liposomas
convencionales que sólo liberan agentes activos lentamente y que no
son termosensibles, o en comparación con los liposomas
termosensibles que no liberan agentes activos hasta que alcanzan
temperaturas de 42ºC o superiores.
Aunque no desean estar sujetos por una única
teoría de acción, los presentes inventores creen que el mecanismo
por el que los lisolípidos (y otros agentes tensioactivos) mejoran
la liberación de los contenidos de los liposomas formados
principalmente por fosfolípidos está relacionado con el modo
mediante el cual el lisolípido se mezcla más idealmente en la bicapa
de fase en gel mezclada, pero crea defectos en el nivel
microestructural (límites del microdominio) mientras se desorbe a
partir de la membrana tras la fusión de la bicapa a la temperatura
de transición de la cadena de acilo principal (es decir, a la
temperatura de transición del lípido de la bicapa principal). La
inclusión de un agente tensioactivo como un lisolípido disminuye la
temperatura de transición de fase de una membrana de fosfolípido, en
comparación con la temperatura de transición de fase de una membrana
formada únicamente por el fosfolípido. En un liposoma formado por
DPPC y MPPC, la temperatura de transición de fase se disminuye
dependiendo de la cantidad de MPPC incorporada en la bicapa de fase
en gel; la reducción de la temperatura de transición que se puede
lograr está limitada por la cantidad de MPPC que puede estar
contenida de manera estable en la bicapa. Las membranas formadas por
DPPC pueden contener de manera estable entre 1% molar de MPPC, hasta
aproximadamente 20% molar de MPPC, 30% molar de MPPC, 40% molar de
MPPC, o incluso 50% molar de MPPC, dependiendo de otras condiciones
como el agente activo contenido dentro del liposoma.
En bicapas de liposomas que contienen
fosfolípidos y un agente tensioactivo como un lisolípido, es
preferible que el agente tensioactivo esté contenido en ambas capas
de la bicapa. El concepto se ilustra mediante la Figura 1, que
representa esquemáticamente un liposoma formado por DPPC y MPPC. Las
moléculas de MPPC están presentes tanto en la capa exterior como en
la interior de la bicapa de la membrana del liposoma. En un liposoma
que contiene un agente tensioactivo sólo en una capa de la bicapa,
la redistribución del agente tensioactivo en ambas capas de la
bicapa ocurrirá con el tiempo a temperaturas superiores a la
temperatura de transición en gel (por ejemplo, en la fase
cristalina líquida).
La compatibilidad de fase de los dos (o más)
componentes de la presente invención afecta al procesamiento y
estabilidad de la estructura de la bicapa lipídica. En los liposomas
formados principalmente por DPPC (un fosfolípido de doble cadena),
para maximizar la compatibilidad y preservar el estrecho intervalo
de fusión del fosfolípido principal, un lisolípido preferido es MPPC
porque es idéntico al fosfolípido de doble cadena exceptuando que
posee sólo una cadena de acilo (Figura 11A y 11B). Los presentes
inventores descubrieron que la inclusión de este lisolípido de
bicapa compatible en bajas concentraciones (preferiblemente
2-20% molar), hace que los liposomas formados
principalmente por DPPC "sean permeables" a la temperatura a la
que comienza a fundirse el lípido principal (es decir, la
línea sólida de la transición de fase principal), en comparación con
los liposomas formados sólo por DPPC. Aunque no desean aferrarse a
una única explicación, los presentes inventores creen que las
bicapas de fase en gel están formadas por dominios microcristalinos;
a medida que la temperatura se aproxima a la transición de fase
cristalina de gel a líquido de la bicapa lipídica, la permeabilidad
de la membrana al fármaco atrapado aumenta en los extremos de
textura granular de la microestructura. A la temperatura de
transición, la desorción del lisolípido disuelto en la
microestructura de fase de gel mejora la permeabilidad de la
membrana. Otra ventaja adicional de incorporar una molécula
compatible en la bicapa del liposoma es que la temperatura de
transición de fase del lípido principal no se amplía, sino que
disminuye en aproximadamente un grado o más (dependiendo de la
concentración de lisolípido en la bicapa).
El procedimiento de formación de los liposomas de
componentes mezclados de la presente invención implica la
preparación de lisosomas de fase de gel que contienen un
fosfolípido, un agente tensioactivo adecuado (como un lisolípido), y
el agente activo de interés. Otros componentes compatibles de fase
como DSPE-PEG se pueden incluir opcionalmente, tal
como se trata más adelante. La composición contiene un porcentaje de
lisolípido tal que el agente tensioactivo no desestabiliza la
membrana a las temperaturas de procesamiento en las que la bicapa
está en la fase líquida, ni a las temperaturas fisiológicas en las
que la bicapa está en fase de gel. La bicapa se vuelve inestable y
permeable a temperaturas justo por encima de la temperatura corporal
humana normal, y libera rápidamente el material atrapado en el
interior del liposoma.
Los liposomas según la presente invención se
pueden preparar mediante cualquiera de las distintas técnicas que se
conocen en la materia. Véase, por ejemplo, la patente de
Estados Unidos nº 4.235.871; las solicitudes PCT publicadas WO
96/14057; New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL
Press, Oxford (1990), páginas 33-104; Lasic DD,
Liposomes from physics to applications, Elsevier Science
Publishers, Ámsterdam, 1993; Liposomes; Marcel Dekker, Inc.,
Nueva York (1983). La inclusión de un agente activo dentro de los
liposomas de la presente invención también se puede llevar a cabo
usando cualquier procedimiento en la técnica. Al preparar
composiciones de liposomas de la presente invención, se pueden usar
estabilizadores como antioxidantes y otros aditivos mientras no
interfieran con el fin de la invención.
La cantidad de agente tensioactivo (como un
lisolípido) incluida en los liposomas de la presente invención no es
suficiente para desestabilizar la membrana en la fase líquida que
ocurre durante el procesamiento de los liposomas (antes de enfriar
para producir el producto en fase de gel). Al producir los liposomas
según la presente invención, es preferible durante el procesamiento
de las membranas en fase líquida mantener una concentración de
monómero de agente tensioactivo tanto dentro como fuera del
liposoma, para evitar un gradiente de concentración que agotaría la
concentración de lisolípido en la membrana. Esto se puede conseguir
al preparar la suspensión liposomal a partir de una mezcla
premezclada en un medio acuoso que contiene la suficiente cantidad
de agente tensioactivo en una forma monomérica, (por ejemplo, a la
concentración micelar crítica (CMC) del agente tensioactivo).
Un procedimiento para preparar una formulación
liposomal según la presente invención comprende la mezcla de los
componentes de la bicapa en las proporciones apropiadas en un
disolvente orgánico adecuado, tal como se conoce en la técnica. El
disolvente se evapora entonces para formar una capa lipídica seca.
La capa se rehidrata (a temperaturas superiores a la temperatura de
transición de fase de la mezcla lipídica) usando una solución acuosa
que contiene una cantidad equilibrante del agente tensioactivo y un
agente activo deseado. Los liposomas formados tras la rehidratación
se pueden extruir para formar liposomas de un tamaño deseado, como
se conoce en la técnica. Por ejemplo, cuando se producen liposomas
formados por DPPC:MPPC 80:20, la rehidratación se lleva a cabo a una
temperatura superior a la temperatura de transición de fase de esta
mezcla lipídica particular (superior a 39ºC). La solución acuosa
usada para rehidratar la capa lipídica comprende una cantidad
equilibrante de monómeros de lisolípido (por ejemplo, a una
concentración igual a la concentración micelar crítica de MPPC).
Los liposomas convencionales sufren de una
semivida relativamente corta en la circulación sanguínea debido a su
rápida absorción por los macrófagos del hígado y del bazo (órganos
del sistema reticuloendotelial o SRE), y por lo tanto no se acumulan
en el tejido tumoral permeable. Se han elaborado preparaciones de
liposomas que evitan la rápida absorción y que tienen tiempos de
circulación aumentados. Los liposomas STEALTH® (Sequus Inc., Menlo
Park CA) incluyen lípidos injertados con polietilenglicol (PEG) a
aproximadamente 5% molar en la bicapa lipídica. Véase, por
ejemplo, Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1066:29
(1991); Klibanov y col., FEBS Letters 268:235 (1990); Needham
y col., Biochim. Biophys. Acta 1108:40 (1992);
Papahadjopoulos y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11460
(1991); Wu y col., Cancer Research 53:3765 (1993); Klibanov y
Huang, J. Liposome Research 2:321 (1992); Lasic y Martin,
Stealth Liposomes, en: Pharmacology and Toxicology, CRC
Press, Boca Raton, Florida (1995). Véase también patente de
Estados Unidos nº 5.225.212 de Martin y col.; patente de Estados
Unidos nº 5.395.619 de Zalipsky y col. en relación a liposomas que
contienen lípidos injertados con polímeros en la membrana de la
vesícula. La presencia de polímeros sobre la superficie exterior del
liposoma disminuye la absorción de liposomas por los órganos del
SRE.
Los liposomas de la presente invención se pueden
formular para incluir lípidos injertados con polímeros, tan como se
conoce en la técnica, para disminuir la absorción por parte del SRE
y aumentar de este modo el tiempo de circulación de los liposomas.
Los polímeros adecuados que incluyen polímeros hidrófilos como
polietilenglicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico,
copolímeros de ácido poliláctico y ácido poliglicólico, y alcoholes
polivinílicos.
Tal como se usa en el presente documento, un
agente activo "en el interior" o "atrapado dentro" del
liposoma es que está contenido en el espacio interior del liposoma,
en comparación con el que está dividido entre la bicapa lipídica y
el contenido dentro de la propia membrana de la vesícula. Tal como
se usa en el presente documento, un agente activo "dentro" o
"atrapado dentro" de la bicapa lipídica de un liposoma se
incluye como una parte de la bicapa lipídica, en contraposición a
estar contenido en el espacio interior del liposoma. Los agentes
activos pueden estar en cualquier forma adecuada para uso en
liposomas, tal como se sabe en la técnica, incluyendo pero sin
limitación las soluciones acuosas de agentes activos. Las soluciones
acuosas de agentes activos dentro de los liposomas de la presente
invención pueden estar a la misma presión osmótica que la del fluido
corporal del individuo pretendido, o a una presión osmótica superior
(véase la patente de Estados Unidos nº 5.094.854); las
soluciones acuosas también pueden contener algún agente activo
precipitado, como se conoce en la técnica. Un agente activo
preferido para encapsulación en el interior del liposoma es
cualquier agente básico débil, soluble en agua.
La incorporación de ciertos agentes activos (como
algunos anestésicos) en los liposomas de la presente invención
pueden además alterar (mejorar o inhibir) la liberación de los
contenidos del liposoma, o alterar la temperatura de transición del
liposoma, en comparación con la que se observaría en un liposoma
similar que no contuviera el agente activo.
Se ha informado de la administración de fármacos
antineoplásicos o antitumorales como doxorrubicina, cisplatina y
metotrexato usando liposomas termosensibles en combinación con
hiperthermia en un sitio diana deseado. Véase, por
ejemplo, Magin y Weinstein en; Liposome Technology, Vol.
3, (Gregoriadis, G., ed.) página 137, CRC Press, Boca Raton, FL
(1993); Gaber y col, Intl. J. Radiation Oncology, Biol.
Physics, 36(5):1177 (1996).
Los agentes activos adecuados para uso en la
presente invención incluyen fármacos terapéuticos y agentes
farmacológicamente activos, moléculas nutricionales, agentes
cosméticos, agentes diagnósticos y agentes de contraste para
representación óptica. Tal como se usa en el presente documento, los
agentes activos incluyen sales farmacológicamente aceptables de
agentes activos. Los agentes terapéuticos adecuados incluyen, por
ejemplo, antineoplásicos, agentes antitumorales, antibióticos,
antimicóticos, agentes antiinflamatorios, agentes inmunosupresores,
agentes antiinfecciosos, antivirales, antihelmínticos, y compuestos
antiparasitarios. Los procedimientos para preparar derivados de
fármacos lipófilos que son adecuados para formulación de liposomas
son conocidos en la técnica (véase por ejemplo, la patente de
Estados Unidos nº 5.534.499 de Ansell, que describe la unión
covalente de los agentes terapéuticos a una cadena de ácido graso de
un fosfolípido).
Al tratar tumores o crecimientos neoplásicos, los
compuestos adecuados pueden incluir antibióticos de antraciclina
(como doxorrubicina, daunorrubicina, carinomicina,
N-acetiladriamicina, rubidazona,
5-imidodaunomicina, N30 acetildaunomicina, y
epirrubicina) y alcaloides vegetales (como vincristina, vinblastina,
etopósido, elipticina y camptotecina). Otros agentes adecuados
incluyen paclitaxel (TAXOL®; unos diterpenos aislados de la corteza
del tejo y representativos de una nueva clase de agentes
terapéuticos que tienen una estructura de anillo de taxano) y
docetaxol (taxotero); mitotano, cisplatina, y fenesterina.
Los agentes terapéuticos antiinflamatorios
adecuados para uso en la presente invención incluyen compuestos
antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, como prednisona,
metil-prednisona, parametazona,
11-fluorocortisol, triamcinolona, betametasona y
dexametasona, ibuprofueno, piroxicam, beclometasona; metotrexato,
azaribina, etretinato, antralina, psoralen; salicilatos como
aspirina; y agentes inmunosupresores como ciclosporina. Los
corticosteroides antiinflamatorios y el agente antiinflamatorio e
inmunosupresor ciclosporina son muy lipófilos y son adecuados para
uso en la presente invención.
Los agentes farmacológicos adicionales adecuados
para uso en liposomas de la presente invención incluyen anestésicos
(como metoxiflurano, isoflurano, enflurano, halotano, y benzocaína);
antiulcerosos (como cimetidina); medicaciones anticonvulsivas como
barbituatos; azotioprina (un inmunosupresor y agente
antirreumático); y relajantes musculares (como dantroleno y
diazepam).
Los agentes de representación óptica adecuados
para uso en las presentes preparaciones de liposomas incluyen
agentes de contraste por ultrasonidos, agentes de radiocontraste
(como radioisótopos o compuestos que contienen radioisótopos,
incluyendo yodo-octanos, halocarburos, renografin),
o agentes de contraste magnéticos (como compuestos
paramagnéticos).
Los agentes nutricionales adecuados para
incorporación en liposomas de la presente invención incluyen
compuestos aromatizantes (por ejemplo, citral, xilitol),
aminoácidos, azúcares, proteínas, carbohidratos, vitaminas y grasa.
También son adecuadas las combinaciones de agentes
nutricionales.
Los liposomas de la presente invención se pueden
administrar usando procedimientos que son conocidos por los expertos
en la materia, incluyendo pero sin limitación, el suministro al
flujo sanguíneo de un individuo o la administración subcutánea de
liposomas. Cuando los liposomas según la presente invención se usan
junto con hipertermia, los liposomas se pueden administrar mediante
cualquier medio adecuado que da como resultado el suministro de los
liposomas al sitio del tratamiento. Por ejemplo, los liposomas se
pueden administrar por vía intravenosa y por lo tanto llevarse al
sitio de un tumor mediante el flujo sanguíneo normal; el
calentamiento de este sitio da como resultado que las membranas
liposomales se calientan hasta la temperatura de transición de fase
de modo que los contenidos del liposoma se liberan preferiblemente
en el sitio del tumor.
Cuando se desea el tratamiento de un tumor, el
suministro eficaz de un agente activo encapsulado en un liposoma
mediante el flujo sanguíneo requiere que el liposoma sea capaz de
penetrar en la capa endotelial continua (aunque "permeable") y
la membrana basal subyacente que rodea los vasos que suministran
sangre al tumor. Se ha descubierto que los liposomas de menores
tamaños son más eficaces en la extravasación en tumores a través de
la barrera de las células endoteliales y membrana basal subyacente
que separa un capilar de las células tumorales. Véase, por
ejemplo, patente de Estados Unidos nº 5.213.804 de Martin y
col.
Tal como se usa en el presente documento, los
"tumores sólidos" son aquellos que crecen en un sitio anatómico
distinto del flujo sanguíneo (en contraposición a los tumores
sostenidos en la sangre como las leucemias). Los tumores sólidos
requieren la formación de pequeños vasos sanguíneos y capilares para
nutrir el crecimiento del tejido tumoral.
De acuerdo con la presente invención, el agente
antitumoral o antineoplásico elegido está atrapado dentro de un
liposoma según la presente invención; los liposomas se formulan para
que tengan un tamaño conocido para penetrar en las barreras
endoteliales y de la membrana basal. La formulación liposomal
resultante se puede administrar por vía parenteral a un individuo
que necesita dicho tratamiento, preferiblemente mediante
administración por vía intravenosa. Los tumores caracterizados por
un aumento agudo en la permeabilidad de la vasculatura en la región
de crecimiento tumoral son particularmente adecuados para tratarse
mediante los presentes procedimientos. La administración de los
liposomas continúa con el calentamiento del sitio de tratamiento
hasta una temperatura que da como resultado la liberación de los
contenidos liposomales.
Cuando se desea el tratamiento específico del
sitio de inflamación, el suministro liposomal eficaz de un agente
activo requiere que el liposoma tenga una larga semivida en sangre,
y que sea capaz de penetrar en la capa celular endotelial continua y
en la membrana basal subyacente que rodea a los vasos sanguíneos
adyacentes al sitio de inflamación. Se ha descubierto que los
liposomas de menores tamaños son más efectivos en la extravasación a
través de la barrera celular endotelial y dentro de las regiones
inflamadas asociadas. Véase, por ejemplo, la patente de Estados
Unidos nº 5.356.633 de Woodle y col. De acuerdo con la presente
invención, el agente antiinflamatorio de elección está atrapado
dentro de un liposoma según la presente invención; los liposomas se
formulan para que tengan un tamaño conocido para penetrar en las
barreras endoteliales y de la membrana basal. La formulación
liposomal resultante se puede administrar por vía parenteral a un
individuo que necesita dicho tratamiento, preferiblemente mediante
administración por vía intravenosa. Las regiones inflamadas
caracterizadas por un fuerte aumento en la permeabilidad de la
vasculatura en la región de la inflamación, y mediante un aumento
localizado en la temperatura, son particularmente adecuadas para
tratamiento por los presentes procedimientos.
Se apreciará más aun que los liposomas de la
presente invención se pueden utilizar para suministrar agentes
antiinfecciosos a sitios de infección, mediante el flujo sanguíneo.
El uso de liposomas que contienen un lípido formado por vesículas
derivado con un polímero hidrófilo, y que tiene tamaños que varían
entre 0,07 y 0,2 micrómetros, para suministrar agentes terapéuticos
a sitios de infección se describe en la solicitud de patente PCT
publicada WO 93/19738. De acuerdo con la presente invención, el
agente antiinfeccioso de elección está atrapado dentro de un
liposoma que tiene una membrana según la presente invención, y la
formulación liposomal resultante se administra por vía parenteral a
un individuo, preferiblemente mediante administración por vía
intravenosa. Si se desea, se puede inducir una hipertermia
localizada en el sitio de infección para provocar la liberación
preferencial de los contenidos liposomales en ese sitio.
El tamaño de los liposomas en una preparación
puede depender del agente activo contenido en éstos y/o del objetivo
pretendido. Se ha informado de que los liposomas de entre 0,05 y 0,3
micrómetros de diámetro son adecuados para la administración a los
tumores (patente de Estados Unidos nº 5.527.528 de Allen y col.). El
cribado de los liposomas según la presente invención se puede llevar
a cabo según los procedimientos conocidos en la técnica, y teniendo
en cuenta el agente activo contenido en éstos y los efectos deseados
(véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 5.225.212 de
Martin y col; la patente de Estados Unidos nº 5.527.528 de Allen y
col.). Una realización preferida de la presente invención es un
liposoma de menos de 10 micrómetros de diámetro, o una preparación
de liposoma que contiene varios liposomas de menos de 10 micrómetros
de diámetro. En una realización preferida adicional de la presente
invención, los liposomas tienen un diámetro de entre aproximadamente
0,05 micrómetros o aproximadamente 0,1 micrómetros, y
aproximadamente 0,3 micrómetros o aproximadamente 0,4 micrómetros.
Las preparaciones de liposomas pueden contener liposomas de
distintos tamaños.
En otra realización preferida de la presente
invención, los liposomas tienen un diámetro desde aproximadamente 50
nm, 100 nm, 120 nm, 130 nm, 140 nm o 150 nm, hasta aproximadamente
175 nm, 180 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm o 500 nm.
En un aspecto de la presente invención, los
liposomas se preparan para que tengan tamaños sustancialmente
homogéneos dentro de un intervalo de tamaños seleccionado. Un
procedimiento de cribado efectivo implica la extrusión de una
suspensión acuosa de los liposomas a través de una serie de
membranas de policarbonato que tienen un tamaño de poro uniforme
seleccionado; el tamaño de poro de la membrana corresponderá
aproximadamente a los tamaños más grandes de los liposomas
producidos por extrusión a través de esa membrana. Véase por
ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 4.737.323 (12 de abril de
1988).
En otro aspecto de la presente invención, los
liposomas se dispersan en un salino fisiológico o solución salina de
tampón fosfato para proporcionar una preparación acuosa de
liposomas. La preparación acuosa puede incluir además una cantidad
equilibrante del agente tensioactivo contenido en la bicapa del
liposoma, para recudir o evitar la pérdida del agente tensioactivo
de la bicapa del liposoma en solución. Los liposomas formados por
DPPC-MPPC pueden estar contenidos en el salino
fisiológico o solución salina de tampón fosfato de modo que contiene
entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 5 mM de monómero de
MPPC.
La cantidad de agente activo que quedará atrapada
dentro de o que llevarán los liposomas según la presente invención
variará dependiendo de la dosis terapéutica y la unidad de dosis del
agente activo, como resultará evidente para alguien experto en la
materia. En general, sin embargo, la preparación de liposomas de la
presente invención está diseñada para que el liposoma lleve la mayor
cantidad de agente activo posible. Los liposomas de la presente
invención pueden ser de cualquier tipo, sin embargo, se prefieren
particularmente LUVs.
La caracterización de los liposomas
termosensibles mediante la liberación de un detector fluorescente
atrapado, 6-carboxifluoresceína (CF), se presentó en
Merlin, Eur. J. Cancer 27(8): 1031 (1979). CF estaba
atrapada dentro de los liposomas a una concentración de inactivación
(50 nM); no se observó fluorescencia para CF atrapada dentro del
liposoma. Se desarrolló una intensa fluorescencia, sin embargo, tras
la liberación del detector de los liposomas debido a la dilución de
la CF en la suspensión. La cantidad del detector liberado de los
liposomas a distintas temperaturas se pudo cuantificar de este modo
en función de la fluorescencia. Merlin, Eur. J. Cancer
27(8):1031 (1991), estudió liposomas térmicamente
sensibles que encapsulan Doxorrubicina (DX), e incorporaban lípidos
con polietilenglicol en la bicapa para aumentar su tiempo de
circulación en el flujo sanguíneo en comparación con los liposomas
termosensibles convencionales. Véase también Maruyama y col.,
Biochem. Byophys. Acta, 1149:17 (1993).
Los ejemplos que vienen a continuación se exponen
para que ilustren la presente invención.
Se prepararon y se caracterizaron liposomas de
DPPC que contienen concentraciones molares variadas del lisolípido
Monopalmitoilfosfatidilcolina (MPPC). El detector fluorescente
acuoso 6-carboxifluoresceína (CF) estaba atrapado
dentro de los liposomas para actuar como marcador del cambio de
permeabilidad de la membrana; se incorporó CF en los liposomas
usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por
ejemplo, Liposomes: A Practical Approach (1990), Editor:
R. R. C. New, IRL Press, Oxford, NY). Los componentes del liposoma
se disolvieron en cloroformo (un disolvente orgánico adecuado), y el
disolvente se evaporó en vacío a 45ºC usando un rotavapor para
formar una capa fina uniforme de lípidos en las paredes internas de
un matraz de fondo redondo. La capa de lípidos se secó más aun en
vacío durante 25 horas para asegurar la completa eliminación de las
trazas de cloroformo.
La capa de lípidos se hidrató a 45ºC con una
solución acuosa de solución salina de tampón fosfato 10 mM (pH
=
7,4) que contiene CF 50 mM y MPPC 1 mM. Para una hidratación eficaz, se usó una perla de TEFLON® para decapar ligeramente los lípidos en presencia de un medio acuoso para formar una suspensión turbia de vesículas multilaminares (VMLs). Las VMLs formadas de este modo tenían un tamaño medio de 700 nm y se extruyeron a través de un depósito de dos filtros de membrana de policarbonato de 0,1 micrómetros a una presión de 2068-2758 kPa a 45ºC (es decir, por encima de la temperatura cristalina de gel a líquido del lípido o mezcla de lípidos) según se describe en el procedimiento desarrollado por Hope y col. (Biochem. Biophys. Acta 812:55-65 (1985)) para obtener Vesículas Unilaminares Grandes mediante Técnica de Extrusión (VMGTEs) del tamaño de 140 nm deseado. El diámetro medio de las vesículas se pudo medir mediante un espectrómetro de correlación electrónico (PCS, Coulter, N4 Plus) después de cada pase de extrusión.
7,4) que contiene CF 50 mM y MPPC 1 mM. Para una hidratación eficaz, se usó una perla de TEFLON® para decapar ligeramente los lípidos en presencia de un medio acuoso para formar una suspensión turbia de vesículas multilaminares (VMLs). Las VMLs formadas de este modo tenían un tamaño medio de 700 nm y se extruyeron a través de un depósito de dos filtros de membrana de policarbonato de 0,1 micrómetros a una presión de 2068-2758 kPa a 45ºC (es decir, por encima de la temperatura cristalina de gel a líquido del lípido o mezcla de lípidos) según se describe en el procedimiento desarrollado por Hope y col. (Biochem. Biophys. Acta 812:55-65 (1985)) para obtener Vesículas Unilaminares Grandes mediante Técnica de Extrusión (VMGTEs) del tamaño de 140 nm deseado. El diámetro medio de las vesículas se pudo medir mediante un espectrómetro de correlación electrónico (PCS, Coulter, N4 Plus) después de cada pase de extrusión.
Como se muestra en la figura 2, el tamaño de los
liposomas disminuyó con sucesivos pases a través de la membrana, y
alcanzó un tamaño mínimo después de tres pases).
Se evaluaron la estabilidad y la sensibilidad
térmica in vitro de las formulaciones liposomales preparadas
como se describen en el Ejemplo 1 y que contienen varias fracciones
molares de MPPC al medir el porcentaje de liberación de la molécula
fluorescente soluble en agua atrapada, CF, desde el interior acuoso
de la vesícula a la solución circundante como función de la
temperatura de incubación (25-45ºC) en presencia de
solución salina de tampón fosfato. La fluorescencia de CF atrapada
en los liposomas estaba autoinactivada debido a su elevada
concentración, pero tras la liberación de los liposomas y dilución
en el medio de suspensión, la CF desarrolló una intensa
fluorescencia. Tras la incubación, se midió la intensidad de
fluorescencia de las muestras a una longitud de onda de excitación
(\lambdaex) = 470 nm y una longitud de onda de emisión
(\lambdaem) = 520 nm tras las diluciones adecuadas para determinar
la cantidad de CF liberada de los liposomas. El porcentaje relativo
de intensidad de fluorescencia debido a la incubación a una
temperatura particular se calculó por comparación con la liberación
total del material atrapado obtenido tras la ruptura de las muestras
de liposoma al añadir Tritón X-100 al 10%.
Este experimento se llevó a cabo para liposomas
formados por DPPC puro y para liposomas formados por mezclas de
DPPC:MPPC que contienen 2, 4, 6, 7, 8, 10 ó 20% molar de MPPC, en el
intervalo de temperaturas entre 20ºC y 45ºC.
La cantidad de CF atrapada que se liberó de los
liposomas de la presente invención se midió como función del tiempo
a temperaturas fisiológica (37ºC) e hipertérmica (40ºC). Los
liposomas se incubaron en solución salina de tampón fosfato durante
varios intervalos de tiempo y se midió la liberación de CF
fluorimétricamente a \lambdaex = 470 nm y \lambdaem = 520 nm.
Las series de calentamiento típicas se muestran en la Figura 3, para
la composición de DPPC:MPPC 90:10. A 37ºC el porcentaje de
liberación de CF fue insignificante. Sin embargo, tras incubación a
40ºC, aproximadamente el 60% de la CF atrapada se liberó antes de
los cinco minutos; la liberación de contenidos adicionales sólo
aumento ligeramente tras una incubación adicional a esta
temperatura. De este modo a una temperatura dada, la mayoría de los
contenidos se liberan entre los primeros cinco y diez minutos de
calentamiento.
La Figura 4 muestra la liberación de CF a partir
de liposomas incubados durante 5 minutos a temperaturas entre 20ºC y
45ºC en presencia de solución salina de tampón fosfato 10 mM (pH =
7,4). La liberación de CF se midió fluorimétricamente a \lambdaex
= 470 nm y \lambdaem = 520 nm. El porcentaje de CF liberada se
calculó al comparar los valores obtenidos con aquellos obtenidos
tras la liberación total de CF (lograda por la adición de Tritón
X-100 a la muestra de liposoma para disolver los
liposomas y liberar toda la CF atrapada). Los liposomas de DPPC puro
fueron estables hasta 39,5ºC pero se volvieron permeables cerca de
la temperatura de transición del fosfolípido, provocando de este
modo la liberación de algo de la CF. La cantidad de CF liberada del
liposoma de DPPC puro fue, sin embargo, de sólo el 20% de los
contenidos totales. Por el contrario, con mayores concentraciones de
MPPC en las bicapas de DPPC, los liposomas mostraron una mayor
liberación de CF, ocurriendo una liberación máxima para los
liposomas que tienen bicapas que contienen 10% molar y 20% molar de
MPPC.
Estos resultados demuestran que la incorporación
de una cantidad tan escasa como de 10% molar de MPPC en las
membranas del liposoma de DPPC aumenta la cantidad de CF liberada
por un factor de 4 (en comparación con la liberación que se observa
para liposomas de DPPC solo), permitiendo una liberación de hasta el
90% de los contenidos liposomales.
Los perfiles de liberación de temperatura también
muestran una ventaja adicional de incorporar MPPC en las membranas
de liposomas de DPPC, ya que la temperatura de comienzo de la
liberación se cambia a temperaturas ligeramente inferiores,
partiendo a aproximadamente 38ºC para liposomas que contienen 10%
molar y 20% molar de MPPC. El perfil de liberación para estos
liposomas es fuerte, y la máxima cantidad de CF se libera tras un
aumento en la temperatura de sólo un grado más o menos, es
decir, entre 38,5ºC y 40ºC para los liposomas de 10% de
MPPC.
Estos experimentos demuestran que la inclusión de
MPPC en bicapas de liposomas formados por DPPC aumenta la cantidad
de contenidos liberados del interior del liposoma, y cambia el
intervalo de temperatura sobre el que ocurre la liberación al
intervalo de 38,5ºC-40ºC, que es el intervalo
hipertérmico moderado.
En liposomas de DPPC que contienen
concentraciones de MPPC de más de 20% molar, los liposomas se
vuelven intrínsecamente inestables y por lo tanto incapaces de
retener el material atrapado a temperaturas superiores a la
transición de fase líquida (es decir, en la fase líquida de
la bicapa lipídica que ocurre durante el procesamiento de los
liposomas). Dichas elevadas concentraciones de MPPC también pueden
desestabilizar las bicapas de fase de gel a temperaturas inferiores
a la temperatura de transición. Como se demostró previamente, la
resistencia mecánica de las membranas disminuye a medida que se
incluye más MPPC (Needham y col., Biophys. J. 73:2615
(997)), y las bicapas finalmente realizan una transición hasta una
suspensión micelar pura a medida que la relación molar entre MPPC y
fosfolípido está por debajo de 50% molar (Zhelev y col., Biophys.
J. (en prensa; 1998)). Una relación molar preferida para
liposomas térmicamente sensibles es 90:10, DPPC:MPPC.
Para investigar el mecanismo biofísico implicado
en la permeabilidad de los liposomas de la presente invención, se
llevaron a cabo estudios calorimétricos de exploración diferencial
(CED) para generar termogramas calorimétricos diferenciales para los
presentes liposomas, para determinar la temperatura de transición de
fase. Estos resultados se compararon con las exploraciones de
liberación frente a temperatura obtenidos para perfiles de
liberación acumulativos (mostrados en la Figura 4). Las figuras 5A y
5B muestran los termogramas de flujo térmico para preparaciones de
liposomas que contienen mayores concentraciones de MPPC en bicapas
de DPPC. Estos termogramas muestran que la temperatura de transición
sigue sin aumentar incluso aunque se incluya hasta un 10% de MPPC en
la bicapa. A un mayor nivel de resolución, la Figura 5B muestra el
cambio en el pico de la temperatura de transición entre 41,9ºC y
41,04ºC a medida que se aumenta la composición de MPPC desde cero
hasta 10% molar en bicapas de DPPC. También se muestra que la
amplitud de la transición, representada como los puntos de inicio y
final de la transición, es decir, las líneas de la curva de la
solución sólida y del principio de solidificación y por encima del
exceso del pico de flujo térmico.
El termograma de exploración diferencial de
liposomas de la presente invención se puede comparar con los
perfiles de liberación diferencial. La Figura 6A muestra el perfil
de liberación acumulativo para la liberación de CF de liposomas de
DPPC:MPPC 90:10 frente a la temperatura, y el termograma de flujo
térmico en el mismo intervalo de temperatura. La Figura 6B muestra
la liberación diferencial, que resalta lo marcado del perfil de
liberación y la temperatura a la que ocurre la máxima liberación en
relación al termograma de flujo térmico. Lo que resulta notable de
esta comparación es que el pico de liberación de contenidos
obtenidos a partir de los perfiles de liberación diferenciales fue
0,9ºC menor que el pico en la entalpía de transición obtenido por
CED. La liberación del material atrapado a la temperatura antes de
la Tc se puede atribuir al hecho de que la liberación ocurre en la
línea de la "solución sólida" del termograma y no a la
temperatura del pico. Una explicación para dicho comportamiento es
que la liberación del material atrapado ocurre tan pronto como
aparecen los "primeros defectos" (defectos de fusión) en los
límites del microdominio de la red de la bicapa; es aquí donde el
lisolípido puede ejercer sus efectos. Aunque no desean estar sujetos
a una única teoría, los presentes inventores sospechan que a medida
que se aproxima la temperatura de transición las primeras partes de
la microestructura que se funden son los límites de la textura
granular de la membrana sólida. Cuando están rodeados por una fase
acuosa libre de lisolípido, el lisolípido está atrapado en la fase
de gel pero se puede resorber cuando la membrana comienza a
fundirse; a medida que lo hace mejora la permeabilidad por defecto y
se liberan los contenidos más eficazmente que en liposomas de lípido
puro solo.
La doxorrubicina (DX) estaba atrapada dentro de
los volúmenes acuosos internos de los liposomas de la presente
invención (DPPC:MPPC 90:10) usando el protocolo de encapsulación
llevado a cabo por gradiente de pH (L. D. Mayer y col (1989)
Cancer Res., 42:4734). Brevemente, una composición lipídica
de DPPC:MPPC 90:10 se disolvió en cloroformo y el disolvente se
evaporó en vacío a 45ºC usando un rotavapor. La capa de lípido
obtenida tras secar más aun en el desecador de vacío durante la
noche se hidrató con tampón citrato 300 mM (pH 4,00) y las vesículas
multilaminares formadas se sometieron a siete ciclos de
congelación-descongelación. La suspensión resultante
se extruyó a través de dos filtros de membrana de policarbonato de
tamaño de poro 0,1 \mum a 50ºC usando una presión de
2068-2758 kPa. Se dejaron enfriar los liposomas
extruidos hasta temperatura ambiente y el pH se aumentó hasta 7,5 -
8,0 usando una solución de Na_{2}CO_{3} de 0,5 M.
Los liposomas extruidos se incubaron a 60ºC
durante 5 minutos antes de añadir DX precalentada a la suspensión.
Se calentaron las muestras más aun durante 10 minutos a 60ºC con
turbulencias intermitentes. El fármaco que no estaba atrapada se
retiró mediante centrifugación en minicolumna usando gel Sephadex
G-50.
Los liposomas con DX atrapada se caracterizaron
por la liberación de DX de los liposomas en presencia de una
solución salina de tampón fosfato en función del tiempo a 37ºC y
40ºC, así como mediante los perfiles de liberación acumulativos de
DX atrapada en los liposomas como función del tiempo a distintas
temperaturas entre 25º-45ºC. La figura 7 representa la liberación de
la DX atrapada en los liposomas como función del tiempo a 37ºC y
40ºC. Los liposomas se incubaron a 37ºC y 40ºC durante 30 minutos y
la intensidad de fluorescencia de la DX liberada se midió tras las
diluciones adecuadas a \lambdaex = 470 nm y \lambdaem = 585 nm.
El porcentaje de liberación se calculó al comparar estos valores con
los valores para la liberación total de
6-carboxifluoresceína (obtenidos mediante la adición
de Tritón X-100 a la muestra de liposoma). Como
puede observarse a partir de la Figura 7, se liberó aproximadamente
el 14% de la DX a 37ºC después de 30 minutos de incubación, mientras
que el 73% del fármaco se liberó a 40ºC después de 30 minutos.
Al igual que con los estudios anteriores
(Ejemplos 1-3) usando CF, la liberación acumulativa
de DX incluida en los liposomas de DPPC:MPPC 90:10 se midió al
incubar las muestras a distintas temperaturas entre 25º-45ºC durante
cinco minutos y medir la DX liberada fluorimétricamente, como se
muestra en la Figura 8. Los resultados mostraron aproximadamente un
23% de liberación de DX hasta 39ºC y alcanzó un 65% de liberación a
40ºC.
Se modificaron los liposomas de la presente
invención para hacerles menos reconocibles al SRE, mejorando por lo
tanto su semivida en la circulación sanguínea.
La superficie de los liposomas que contienen
DPPC:MPPC 90:10 se modificó al incorporar 5% molar de
DSPE-PEG (P. M. 2000) (Figura 11C) en la composición
del liposoma. De este modo, la composición modificada de estos
liposomas fue
DPPC:MPPC:DSPE-PEG-2000
(85,935:9,545:4,520).
Se caracterizaron los liposomas de superficie
modificada como se describen en el Ejemplo 5 mediante el estudio de
los perfiles de liberación de CF incluida en el interior acuoso de
la región liposomal en presencia de solución salina de tampón
fosfato o de suero bovino al 50%. La intensidad de fluorescencia de
CF liberada se midió a \lambdaex = 470 nm y \lambdaem = 520 nm,
y el porcentaje de liberación se calculó como se describe en el
Ejemplo 3.
La Figura 9A muestra la liberación de CF atrapada
entre 37ºC y 40ºC en función del tiempo, en presencia de solución
salina de tampón fosfato. La figura 9B muestra la liberación de CF
atrapada entre 37ºC y 40ºC en función del tiempo, en presencia de
suero de bovino al 50%. La formulación de liposoma modificada en la
superficie de la presente invención fue estable a temperatura
fisiológica (37ºC) en presencia de solución salina de tampón fosfato
y suero, mostrando 1% y 7% de liberación de CF, respectivamente. Sin
embargo, la incubación de estos liposomas a 40ºC mostró una
liberación del 64% (en solución salina de tampón fosfato) y 76% (en
suero) de CF atrapada a los cinco minutos de incubación, y alcanzó
el 77% (en solución salina de tampón fosfato) y 92% (en suero) a los
30 minutos de incubación. Los perfiles de liberación acumulativos de
CF atrapada de los liposomas en presencia de solución salina de
tampón fosfato y suero de bovino al 50% mostró una liberación del
58% y 73%, respectivamente (Figura 10). Aunque no se desea estar
sujeto por ninguna teoría, la liberación mejorada de CF en presencia
de suero podría ser atribuible a la interacción de ciertas pequeñas
moléculas de componentes sanguíneos en el suero con la superficie
del liposoma.
Claims (35)
1. Un liposoma que contiene un agente activo,
teniendo dicho liposoma una membrana de bicapa lipídica que
comprende fosfolípido y lisolípido, en el que los fosfolípidos son
la fuente de lípidos principal para la membrana de la bicapa
lipídica y en el que el lisolípido está contenido en la membrana de
la bicapa en una cantidad suficiente para aumentar el porcentaje de
agente activo liberado a la temperatura de transición de fase, en
comparación con la que ocurriría en ausencia de dicho
lisolípido.
2. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que el fosfolípido y el lisolípido están contenidos en dicha
membrana de bicapa en una relación molar entre 99:1 y 70:30.
3. Un liposoma según la reivindicación 1 o
reivindicación 2, en el que dicho fosfolípido contiene grupos acilo
saturados.
4. Un liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho agente activo está
atrapado dentro del interior del liposoma.
5. Un liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho agente activo está atrapado
dentro de la membrana de la bicapa lipídica.
6. Un liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que tiene un diámetro de entre
aproximadamente 50 nanómetros y aproximadamente 500 nanómetros.
7. Un liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que tiene un diámetro de entre
aproximadamente 50 nanómetros y aproximadamente 400 nanómetros.
8. Un liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la bicapa del liposoma
comprende además un fosfolípido derivado con un polímero
hidrófilo.
9. Un liposoma según la reivindicación 8, en el
que dicho polímero hidrófilo se selecciona entre polietilenglicol,
ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido
poliláctico y ácido poliglicólico, y alcohol polivinílico.
10. Un liposoma que tiene una membrana de bicapa
lipídica que comprende un fosfolípido y entre 2 por ciento molar y
30 por ciento molar de lisolípido, en el que los fosfolípidos son la
fuente de lípido principal para la membrana de la bicapa
lipídica.
11. Un liposoma según la reivindicación 10 en el
que dicha membrana de bicapa lipídica contiene entre 10 por ciento
molar y 20 por ciento molar de lisolípido.
12. Un liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que dicho fosfolípido es
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y dicho lisolípido es
monopalmitoilfosfatidilcolina (MPPC).
13. Un liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho agente activo es un
agente farmacológicamente activo, un agente aromatizante, un agente
de diagnóstico, o un agente nutricional.
14. Un liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho agente activo es un
agente farmacológicamente activo seleccionado entre agente
antineoplásicos, agentes antiinflamatorios, agentes antitumorales,
agentes inmunosupresores, agentes antibióticos y agentes
antiinfecciosos.
15. Un liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho agente activo se selecciona
entre metotrexato, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina,
vincristina, vinblastina, etopósido, elipticina, camptotecina,
paclitaxel, docetaxol, cisplatina, prednisona,
metil-prednisona, e ibuprofeno.
16. Un procedimiento para preparar un agente
activo para administración hipertérmica, que comprende la inclusión
de un agente activo en un liposoma que tiene una membrana de bicapa
lipídica que comprende fosfolípidos y entre 1% molar y 30% molar de
lisolípido, en el que los fosfolípidos son la fuente de lípidos
principal para la membrana de la bicapa lipídica.
17. Un procedimiento según la reivindicación 16
en el que dicha membrana de bicapa lipídica contiene entre 5% molar
y 20% molar de lisolípido.
18. Un procedimiento según la reivindicación 16 o
reivindicación 17, en el que dicho agente activo está atrapado
dentro del interior del liposoma.
19. Un procedimiento según la reivindicación 16 o
reivindicación 17, en el que dicho agente activo está atrapado
dentro de la membrana de la bicapa lipídica.
20. Un procedimiento según la reivindicación 19,
en el que dicha bicapa del liposoma comprende además fosfolípido
derivado con un polímero hidrófilo.
21. Un procedimiento según la reivindicación 20,
en el que dicho polímero hidrófilo se selecciona entre
polietilenglicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico,
copolímeros de ácido poliláctico y ácido poliglicólico, y alcohol
polivinílico.
22. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 21, en el que dicho fosfolípido es
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y dicho lisolípido es
monopalmitoilfosfatidilcolina (MPPC).
23. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 22, en el que dicho agente activo es un agente
farmacológicamente activo, un agente aromizante, un agente de
diagnóstico, o un agente nutricional.
24. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 22, en el que dicho agente activo es un agente
farmacológicamente activo seleccionado del grupo formado por agentes
antineoplásicos, agentes antiinflamatorios, agentes antitumorales,
agentes inmunosupresores, agentes antibióticos y agentes
antiinfecciosos.
25. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 22, en el que dicho agente activo se
selecciona del grupo formado por metotrexato, doxorrubicina,
epirrubicina, daunorrubicina, vincristina, vinblastina, etopósido,
elipticina, camptotecina, paclitaxel, docetaxol, cisplatina,
prednisona, metil-prednisona, e ibuprofeno.
26. Una preparación de liposoma que comprende
varios liposomas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
15.
27. Una preparación de liposoma según la
reivindicación 26, en la que dichos liposomas están dispersados en
salino fisiológico.
28. Una preparación de liposoma según la
reivindicación 27, que comprende además monómero de lisolípido en
solución.
29. Una preparación de liposoma según cualquiera
de las reivindicaciones 26 a 28, en el que dichos liposomas tienen
un diámetro entre 50 nm y 500 nm.
30. Una preparación de liposoma según cualquiera
de las reivindicaciones 26 a 28, en el que dichos liposomas tienen
un diámetro entre 50 nm y 400 nm.
31. Una preparación de liposoma según cualquiera
de las reivindicaciones 26 a 28, en el que dichos liposomas tienen
un diámetro entre 100 nm y 200 nm.
32. Un procedimiento para preparar liposomas que
contienen un agente activo atrapado dentro del espacio interior del
liposoma, que comprende:
- a)
- preparar una capa de fosfolípido que contiene lisolípido;
- b)
- hidratar dicha capa de fosfolípido con una preparación acuosa que contiene un agente activo y una cantidad equilibrante de monómero de lisolípido para producir liposomas;
en el que el lisolípido está
contenido en la membrana del liposoma en una cantidad suficiente
para aumentar el porcentaje de agente activo liberado a la
temperatura de transición de fase de la membrana del liposoma,
comparada con la que ocurriría en ausencia de dicho
lisolípido.
33. El procedimiento de la reivindicación 32, en
el que dicha etapa de hidratación se lleva a cabo a una temperatura
superior a la temperatura de transición de fase cristalina de gel a
líquido de la mezcla lipídica.
34. El procedimiento de la reivindicación 32 o
reivindicación 33, que comprende además extruir dichos liposomas
producidos por la etapa (b) para formar liposomas de un tamaño
deseado.
35. Un procedimiento para fabricar liposomas
según cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, en el que dicha
capa de fosfolípido contiene un agente activo.
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