ES2234680T3 - Pcr multiplex para la deteccion de infecciones por ehec. - Google Patents
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Abstract
Cebador con una longitud de hasta 25 nucleótidos que contiene la secuencia de nucleótidos representada en una de las SEQ ID NO. 1 hasta 4.
Description
PCR multiplex para la detección de infecciones
por EHEC.
La presente invención proviene del campo
diagnóstico de la detección de la diarrea hemorrágica.
Los agentes patógenos E. coli
entero-hemorrágicos son gérmenes peligrosos en las
diarreas, que se pueden transmitir tanto por los alimentos como por
las infecciones. Los gérmenes E. coli
entero-hemorrágicos son capaces de formar
citotoxinas muy potentes. Se trata de proteínas que poseen una gran
similitud con la toxina Shiga de las Shigella
dysenteriae tipo 1 y por tanto se denominan toxina Shiga 1 y
toxina Shiga 2. Los genes codificados para las respectivas
subunidades A y B se denominan stxA1 (Banco de
ADN-número M19473) y stxB1 (Banco de
ADN-número M19473) o bien stxA2(Banco de
ADN-número X07865) y stxB2(Banco de
ADN-número X07865). Las cepas patógenas E.
coli pueden contener uno de ambos genes de la toxina Shiga o
bien incluso ambos. Además los agentes patógenos pueden presentar
otros factores de virulencia asociados como la
EHEC-Intimina, EHEC-hemolisina,
EHEC-catalasa, EHEC-proteasa sérica
así como EHEC-enterotoxina
La detección diagnóstica del EHEC es importante,
debido a la vía de transmisión y a la dosis de infección pequeña con
unos 10^{2}-10^{3} gérmenes, no sólo en enfermos
graves sino que también para identificar los eventuales portadores o
bien descubrir otras fuentes de infección. Según la técnica actual
las infecciones por EHEC son detectadas por vía microbiológica con
placas de agar selectiva Sorbitol McConkey o con ayuda del ELISA
para toxinas. Además existen los métodos de detección
PCR(Reacción en cadena de la polimerasa), con cuya ayuda
pueden detectarse secuencias genéticas de la toxina Siga (p.ej. Chen
y cols., Applied and Environmental Microbiology Vol. 64 nº11,
pág.4210-4116, 1998; Gannon y cols., Applied and
Environmental Microbiology, Vol. 58 nº 12, pág.
3809-3815, 1992; Pierard y cols., Journal of
Clinical Microbiology, Vol. 36, nº11, pág
3317-3322). En el diagnóstico rutinario se emplean
hoy en día exclusivamente métodos que amplifican la secuencia
codificada para la subunidad B.
Un análisis de la secuencia de los genes de la
toxina Shiga de distintas cepas ha demostrado que no sólo son
diferentes una de otra las secuencias primarias de la toxina Shiga 1
y de la toxina Shiga 2 sino que además también diferentes cepas de
EHEC, en las cuales puede detectarse inmunológicamente la toxina
Shiga 2, presentan diferentes alelos respecto a la secuencia del gen
correspondiente. Por tanto únicamente son adecuadas dichas
secuencias de cebador para la detección diagnóstica de la toxina
Shiga 2, que se dirijan contra las regiones altamente conservadas
dentro de los genes de toxina Shiga y por tanto puedan detectar las
secuencias del conjunto de alelos.
Adicionalmente a las clásicas diarreas provocadas
por el conocido patógeno EHEC existen otras diarreas con un cuadro
clínico similar. En estas diarreas se ha podido diagnosticar también
el patógeno enterohemorrágico como causa de las mismas gracias a las
pruebas con cultivos Verozell (Pierard y cols., Lancet 338, pág 762,
1991; Thomas y cols., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13, S.
1074-1076, 1994). En general estas infecciones no se
han podido detectar con los métodos moleculares empleados en la
tecnología actual para la detección de las infecciones por el
patógeno EHEC en el ser humano (Pierard y cols., J. Clin. Microbiol.
36, pág. 3317-3322, 1998). Puesto que las pruebas
inmunológicas correspondientes únicamente poseen una especificidad
limitada, se han realizado costosos métodos de enriquecimiento
microbiológico y los consiguientes análisis de las secuencias
moleculares. Con ello se han podido identificar este tipo de
patógenos como cepas de E. coli enterohemorrágica, que por el
momento se conocen únicamente como gérmenes patógenos de los cerdos,
productores de la toxina Shiga (Pierard y cols., Lancet 338, pág
762, 1991); Thomas y cols., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.
13, S. 1074-1076, 1994). Las secuencias de genes de
la toxina Shiga de estas cepas patógenas en cerdos se diferencian
claramente de las cepas patógenas humanas y se designan con
stx2_{c} (Weinstein y cols., J. Bateriol.170, pág.
4223-4230, 1988; Franke y cols., Journal of Clinical
Microbiology Vol.33 Nº12, pág 3174-3178, 1995).
Por tanto no existe por el momento ningún método
inmunológico o biológico molecular sencillo, con cuya ayuda puedan
detectarse los patógenos responsables del conjunto de diarreas
enterohemorrágicas en el hombre.
El cometido de la presente invención consiste
pues en la elaboración de un método, con el cual tanto los patógenos
del EHEC en seres humanos como en cerdos puedan ser identificados
mediante una única reacción de detección.
Este cometido se resuelve mediante una reacción
de amplificación del ácido nucleico para la detección de las
infecciones por EHEC relevantes desde el punto de vista clínico, en
la cual pueden identificarse simultáneamente las secuencias stxA1 y
stxA2, que proceden tanto de gérmenes patógenos en seres humanos
como en cerdos.
El objetivo de la invención es por tanto un
procedimiento en el cual en una reacción de amplificación Multiplex
para detectar infecciones por EHEC relevantes clínicamente, se
amplifiquen tanto las secuencias stxA1 como stxA2,que se caracterice
especialmente por que se amplifiquen tanto las formas iso stxA2
patógenas en el hombre como las formas iso stxA2_{c} patógenas en
el cerdo. Por ello el concepto "Reacción de amplificación
multiplex" hace referencia a un procedimiento PCR (Reacción en
cadena de la polimerasa), en el cual se emplean al menos dos pares
distintos de cebadores, de los cuales un par de cebadores se emplea
para la amplificación de las secuencias stx 1 y un segundo par de
cebadores para la amplificación de las secuencias stx2. El concepto
"patógeno del cerdo" se emplea en el contexto de esta solicitud
de patente para aquellos gérmenes que presentan un gen de toxina
Shiga stx2_{c} (Weinstein y cols., J. Bacteriol. 170, pág.
4223-4230, 1988) y básicamente provocan en el cerdo
la enfermedad del edema, pero también en el hombre pueden dar lugar
a manifestaciones extraintestinales de la enfermedad y diarreas.
Se ha demostrado que es especialmente adecuado
para realizar el procedimiento conforme a la invención aquel cebador
de una longitud de 17-25 nucleótidos, cuya secuencia
es o bien idéntica a una secuencia conforme a la SEQ ID NO
1-4, cuyas secuencias equivalen a secuencias
parciales continuas de una de las secuencias conforme a la SEQ ID NO
1-4, o bien en las cuales una secuencia conforme a
la SEQ ID NO 1-4 forma una secuencia parcial
continua del cebador. El empleo de un cebador conforme a la
invención, preferiblemente de varios, más preferiblemente de todos,
para la detección de las infecciones por EHEC es asimismo el objeto
de la invención.
En general, se emplean como cebadores los
desoxirribonucleótidos sintetizados químicamente. Generalmente
pueden emplearse, en principio, incluso otras moléculas del ácido
nucleico o bien de sus derivados como por ejemplo los ANP (ácidos
nucleicos peptídicos). Además los cebadores conforme a la invención
pueden conjugarse también con moléculas detectables o
inmovilizables.
En una forma de ejecución o versión especial del
procedimiento conforme a la invención el producto de la
amplificación es detectado adicionalmente por hibridación para
incrementar la sensibilidad de la valoración. Las sondas de
hibridación apropiadas para ello poseen preferiblemente una longitud
de 25-35 nucleótidos. En general se emplean asimismo
desoxirribonucleótidos sintetizados químicamente, que pueden ser
sustituidos de manera opcional por otras moléculas de ácido nucleico
o por sus derivados como, por ejemplo, los ANP (ácidos nucleicos
peptídicos). Según la definición, estas sondas se conjugan con un
marcado detectable. Puede tratarse por ejemplo de un colorante de
fluorescencia, un enzima, un átomo radiactivo o bien un grupo
detectable mediante espectroscopia de masas.
Asimismo un objetivo de la invención son por
tanto las sondas de hibridación con una secuencia o secuencia
parcial conforme a la SEQ ID NO 5-8. Sin embargo, se
ha demostrado que resulta preferible que una sonda de hibridación
presente una secuencia que sea idéntica o complementaria a una
región del gen stxA1 o bien del gen stxA2, que corresponda al centro
activo enzimático de la cadena polipeptídica codificada por estos
genes. En la secuencia del stxA2 este centro activo se encuentra en
la posición del nucleótido 803-805 (Jackson y cols.,
J. Bacteriol. 172, pág 3346-3350, 1990). Las sondas
de hibridación con una secuencia o secuencia parcial conforme a la
SEQ ID NO 8 son por tanto las especialmente preferidas.
En otra forma de ejecución especial se detectan
los productos de amplificación multiplex obtenidos conforme a la
invención con ayuda de la detección por fluorescencia. En la
elección de un agente fluorescente apropiado, éste puede añadirse al
lote de PCR sin alterar la eficacia de la amplificación. Esto se
puede realizar, por ejemplo, de manera que la reacción de PCR se
lleve a cabo en presencia de un compuesto fluorescente, el cual al
enlazar con una molécula de DNA de cadena doble y estimular con luz
de una longitud de onda apropiada emita señales fluorescentes (WO
97/46707):
El objeto de la invención es por tanto un
procedimiento, en el cual los productos de amplificación multiplex
sean detectados con ayuda de un compuesto fluorescente enlazado a
una molécula de DNA de cadena doble. Por ejemplo, el colorante
fluorescente SybrGreen puede ser empleado para un método de este
tipo (WO 97/46714).
El objeto de la presente invención es además un
método, en el cual las secuencias stx sean detectadas con ayuda de
una o varias sondas de hibridación marcadas con fluorescencia. Por
lo que son posibles diferentes formas de ejecución, como el empleo
de Molecular Beacons (WO 95/13399, patente americana nº 5.118.801) o
la denominada prueba de TaqMan (WO 96/34983).
Para la detección cuantitativa de ácidos
nucleicos también son apropiadas las sondas de hibridación marcadas
con colorantes de fluorescencia como, por ejemplo, los
oligonucleótidos, cuyo enlace a un ácido nucleico de referencia
puede ser detectado según el principio de transferencia de energía
por resonancia de fluorescencia (FRET) (WO 97/46707). Según él un
componente llamado donante, por ejemplo la fluoresceína, es
estimulado con luz de una longitud de onda determinada. En un
espacio próximo a un componente aceptor apropiado como, por ejemplo,
determinados derivados de rodamina se realiza una transferencia de
la energía por resonancia al componente aceptor, de manera que la
molécula aceptor emite luz a una determinada longitud de onda de
emisión.
Las marcas de las sondas de hibridación pueden
realizarse según métodos estándar en un extremo 5', en un extremo 3'
o bien incluso internamente. En una forma de ejecución preferida los
diferentes colorantes se unen a dos sondas de hibridación distintas,
que pueden ser hibridadas en una proximidad espacial al ácido
nucleico de referencia. Cuando en esta forma de ejecución ambas
sondas de hibridación están enlazadas a la molécula de ADN de
referencia, también ambos componentes del sistema FRET se encuentran
en una proximidad espacial uno respecto del otro, de manera que
puede medirse la transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia. De este modo es posible cuantificar indirectamente el
ADN de referencia.
Las dos sondas de oligonucleótidos pueden
producir híbridos en la misma cadena o ramificación del ácido
nucleico de referencia, en la que se encuentra un colorante
preferiblemente en un nucleótido 3' terminal de la primera sonda y
el otro colorante se encuentra preferiblemente en el 5' nucleótido
terminal de la segunda sonda, de manera que la distancia entre ambos
es únicamente un número escaso de nucleótidos, por lo que este
número puede estar entre 0 y 30. Utilizando fluoresceína en
combinación con un derivado de rodamina como por ejemplo el
LC-RED-640 ó
LC-RED-705 (Roche Molecular
Biochemicals) se han fabricado distancias de 0-15,
en particular 1-5 nucleótidos y en muchos casos de
un nucleótido como lo preferible. Sin perjudicar las distancias de
nucleótidos entre los componentes del colorante pueden emplearse
incluso sondas que estén conjugadas con uno de los colorantes que no
sea terminal sino interno. En los ácidos nucleicos de referencia de
cadena doble se pueden emplear también sondas que se unan a
diferentes cadenas de la molécula de referencia, siempre que se
mantenga una determinada distancia de nucleótidos de 0 hasta 30
nucleótidos entre ambos componentes del colorante.
Como especialmente preferidos se han preparado
unos métodos conforme a la invención en los cuales se detectan stxA1
y stxA2 con ayuda de la FRET. El objeto de la invención son asimismo
las sondas de hibridación con una secuencia o secuencia parcial
conforme a SEQ ID NO 5-8 así como los métodos en los
cuales se emplean estas sondas de hibridación específicas para la
detección de infecciones por EHEC clínicamente relevantes.
Pares de sondas marcadas con fluorescencia
también representan una forma específica de ejecución de la
invención según la SEQ ID NO 5 y 6 o bien según la SEQ ID NO 7 y 8,
las cuales preferiblemente se marcan con respectivamente un
componente donante de FRET como, por ejemplo, la fluoresceína o bien
con un componente aceptor de FRET como, por ejemplo, la Cy5,
LC-RED-640,
LC-RED-705 u otro derivado de
rodamina. Las combinaciones de oligonucleótidos marcadas de este
modo se denominarán a continuación "pares de FRET".
El empleo de este tipo de pares de FRET se
prefiere especialmente para la detección de productos de
amplificación durante o después de una reacción de amplificación
multiplex. En una forma de ejecución especial uno de los dos
cebadores de amplificación puede marcarse al mismo tiempo con uno de
los dos colorantes empleados y puede aportar por tanto uno de los
dos componentes del FRET.
El empleo de los pares de FRET adecuados para la
detección del producto de amplificación multiplex permite un
denominado "Control a tiempo real" paralelo de las reacciones
PCR, en el que los datos para generar el producto de amplificación
pueden ser averiguados dependiendo del número de ciclos de reacción
realizados. Esto ocurre en general de tal manera que, debido a las
condiciones de reacción y temperatura durante la hibridación
necesaria del cebador de amplificación en el ácido nucleico que va a
ser detectado, también los oligonucleótidos del par de FRET forman
híbridos con el ácido nucleico de referencia y con una estimulación
apropiada se emite una señal de fluorescencia medible. Debido a los
datos obtenidos puede determinarse de forma cuantitativa la cantidad
de ácido nucleico empleado originalmente.
En otra forma de ejecución preferida, la
detección de los productos de amplificación multiplex se realiza al
terminar la reacción de amplificación, en la que tras la hibridación
del par de FRET en el ácido nucleico de referencia que va a ser
detectado la temperatura aumenta de forma continuada, lo que se
refleja en un análisis de la curva de fusión. Al mismo tiempo se
mide la fluorescencia emitida dependiendo de la temperatura y de
este modo se calcula una temperatura de fusión, a la cual el par de
FRET empleado ya no se híbrida en la secuencia que va a ser
detectada. Al aparecer una incompatibilidad entre el par de FRET
empleado y el producto de amplificación el punto de fusión desciende
de forma significativa. De este modo los distintos ácidos nucleicos
de referencia pueden ser identificados con un par de FRET, cuyas
secuencias se diferencian mínimamente una de otra en una o pocas
mutaciones puntuales.
Según la invención, este principio se emplea para
la detección de infecciones por EHEC en una reacción de
amplificación Multiplex, en la cual se emplea un estándar interno,
que se diferencia de la secuencia de gen natural stxA1 ó stxA2
(banco de ADN-número X07865) únicamente en una o dos
mutaciones puntuales. Por tanto, los ácidos nucleicos de referencia
amplificados y el estándar interno amplificado se distinguen uno de
otro con ayuda de un análisis de curvas de fusión.
De este modo el estándar se emplea
preferiblemente sólo en cantidades mínimas de unas 100 copias de
plásmido (1,7.10^{-22}), de manera que una señal positiva
respecto a la amplificación del estándar interno no solo indica que
el PCR ha sido inhibido no de cualquier modo en un lote
correspondiente sino que equivale también a un control en cuanto a
la sensibilidad de la reacción.
Otro aspecto del procedimiento conforme a la
invención hace referencia a la diferencia entre los patógenos
humanos stxA2 y los patógenos del cerdo stxA2_{c}, con ayuda del
análisis de las curvas de fusión descrito.
La utilización de pares de FRET según la SEQ ID
NO 5 y 6 ó 7 y 8 para la determinación de las curvas de fusión o
para distinguir el stx patógeno humano del stx patógeno del cerdo es
uno de los objetivos de la invención. Para ello se emplea
preferiblemente un par de FRET según la SEQ ID NO 7 y 8.
El objeto de la presente invención son además los
equipos, que contienen los diferentes reactivos para realizar el
procedimiento conforme a la invención. Este tipo de equipos conforme
a la invención contienen generalmente un cebador de amplificación
para realizar un PCR Multiplex según la SEQ ID NO
1-4. Estos equipos o estuches pueden contener además
unas sondas de hibridación, por ejemplo, con secuencias según la SEQ
ID NO 5-8.
Además estos estuches o equipos contienen sondas
de hibridación y cebador conforme a la invención para la
amplificación del ADN de uno o varios factores de virulencia
adicionales del EHEC como, por ejemplo,
EHEC-intimina, EHEC-hemolisina,
EHEC-catalasa, EHEC-proteasa sérica
así como EHEC-enterotoxina. El conjunto de equipos
conforme a la invención puede contener además reactivos, que en
general sean adecuados para la realización de reacciones de
amplificación del ácido nucleico. Preferiblemente, pero no de un
modo exclusivo, se trata pues de tampones especiales, la Taq
polimerasa y los desoxirribonucleótidos.
Las figuras 1 y 2 muestran un análisis de la
curva de fusión según el ejemplo 2. Se representa la primera
derivación de la fluorescencia medida según la temperatura
correspondiente, medida con un par de FRET de fluoresceína y
LC-RED-640 para la detección del
stxA1 (figura 1) y con un par de FRET de fluoresceína y
LC-RED-705 para la detección del
stxA2(figura 2).
Los cultivos de bacterias se preparaban tras un
cultivo durante la noche en un caldo de cultivo de TSB (Peptona de
caseína, digerida por el páncreas 17,0 g/l; peptona de harina de
soja, digerida por la papaína 3,0 g/l; cloruro sódico 5,0 g/l;
fosfato dipotásico hidrogenado 2,5 g/l; glucosa 2,5 g/l) con ayuda
de un método comercial de extracción del ADN (QIAamp DNA Mini Kit,
Qiagen. Katalog nº 51304). Para ello se incubaban 200 \mul de
suspensión bacteriana con 20 \mul de proteinasa K y 200\mul de
tampón ATL durante 10 minutos a 56ºC. A continuación, se añadían a
la suspensión 200 \mul de etanol del 96%. La solución se añadía
luego a una columna de centrifugación QIAamp y se centrifugaba
durante 1 minuto a 6000 g. Después se lavaban las columnas una vez
con 500 \mul de tampón AW1 y AW2, respectivamente, (centrífuga de
mesa 20000 g). Después del segundo paso de lavado la columna se
centrifugaba en seco una vez. La elución del ADN purificado se
realizaba en conexión con 200 \mul de tampón AE (10 mM Tris/HCC
0,5 mM EDTA pH 9,0). Previamente a su uso en una reacción de PCR se
determinaba la concentración de ADN y la pureza en un fotómetro
(espectro de 260 nm hasta 320 nm). Según el lote de PCR se
utilizaban un máximo de 500 ng de ADN patrón. En las investigaciones
básicas se empleaba un equivalente de ADN a 10^{7} bacterias (que
corresponde a unos 55 ng de ADN).
Con un estuche o equipo especial de heces (QIAamp
DNA Stool kit, que contiene las mismas soluciones tampón que el mini
kit QIA amp DNA) se realizaban unos ensayos de la PCR directamente a
partir de las muestras de heces. Para ello se mezclaban básicamente
200 mg de heces (200 \mul de heces diarreicas) con 600 \mul de
tampón ASL. Paralelamente a ello se volvían a suspender 300 mg de la
matriz AX(Adsorbente para inhibidores en muestras de heces)
en 900 \mul del mismo tampón. Esta suspensión se añadía luego a la
muestra de heces diluida y se mezclaban concienzudamente. A
continuación, el homogeneizado se incubaba durante 5 minutos a 70ºC.
A través de una etapa de centrifugación de 3 minutos con 20000 g se
granulaba luego la matriz AX y las partículas de las heces no
disueltas. 200 \mul del sobrante se mezclaban luego con 20 \mul
de proteinasa K siguiendo el mini protocolo del ADN QIAamp
anteriormente mencionado, y se incubaban durante 10 minutos a 56ºC.
A continuación el ADN, de un modo completamente análogo al modo de
actuar en los cultivos bacterianos, utilizando el mismo tampón en
una columna centrifugadora QIAamp, se lavaba, eluía y medía en un
fotómetro. En la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
siguiente, se empleaban las mismas cantidades de ADN, que las
anteriormente descritas.
Se realizaba una PCR-Multiplex en
un sistema LightCycler (Roche Molecular Biochemicals) según las
indicaciones del fabricante para la detección de stxA1 o bien stxA2
en el ADN aislado según uno de los métodos del ejemplo 1. La
detección del producto de amplificación se realizaba según dos
protocolos distintos, o bien con ayuda del SybrGreen como agente
aglutinante del ADN de doble cadena o bien alternativamente con
ayuda de las sondas de hibridación del FRET
Los cebadores y las sondas de hibridación
empleados eran purificados mediante HPLC (cromatografía líquida de
alta resolución) y se conservaban en soluciones madre de 100
pM/\mul (cebador) o bien 3 pM/\mul(sondas). Los cebadores
empleados se elegían de manera que se pudiera amplificar del stxA1
un fragmento de 418 bp (posición del nucleótido
598-1015. Cebador según SEQ ID NO 1 y 2) y del
stxA2 un fragmento de 264 bp (posición del nucleótido
679-942, cebador según SEQ ID NO 3 y 4).
Las sondas de hibridación empleadas para la
detección se marcaban según los protocolos estándar. Para la
detección del stxA1 se marcaba un oligonucleótido según la SEQ ID NO
5 con fluoresceína en un extremo 3' y un oligonucleótido según la
SEQ ID NO 6 en un extremo 5'. Como sondas de hibridación para la
detección del stxA2 se marcaba un oligonucleótido según la SEQ ID NO
7 con fluoresceína en un extremo 3' y un oligonucleótido según la
SEQ ID NO 8 con LC-RED-705 en un
extremo 5'.
- 2,0 \mul
- DNA-Master SYBR Green I (Roche Molecular Biochemicals, que contiene tampón, Taq DNA Polimerasa, dNTPs, MgCl_{2}, y colorante SYBR Green I)
- 10 pM
- por cebador empleado según SEQ ID NO 1-4
- 2,4 \mul
- MgCl_{2} 25 mM (concentración de trabajo 4 mM)
\underline{10 \ \mu l
\hskip1cmADN}
- 20 \mul
- preparado total
- 2,0 \mul
- DNA-Master para las muestras de hibridación (Roche Molecular Biochemicals, que contiene tampón, Taq polimerasa, dNTPs y MgCl_{2})
- 10 pM
- por cebador empleado según SEQ ID NO 1-4
- 3 pM
- por sonda de hibridación empleada según SEQ ID NO 5 y 6 para stxA1 y según SEQ ID NO 7 y 8 para stxA2
- 2,4 \mul
- MgCl_{2} 25 mM (concentración final 4 mM)
\underline{8,0 \ \mu l
\hskip0,9cmADN}
- 20 \mul
- preparado total
Ambos preparados se realizaron con el mismo
programa PCR y se concluyeron con una curva de fusión:
95ºC 120 seg Desnaturalización al
comienzo del
programa
95ºC 1
seg
55ºC 5 seg (Descenso de 60ºC hasta
55ºC en 5 pasos de
1ºC)
72ºC 20
seg
45
ciclos
Las curvas de fusión se trazaban tras una
desnaturalización previa de tiempo breve a 95ºC en un intervalo de
50ºC hasta 95ºC en pasos de 0,2ºC con una medición continuada de la
fluorescencia en el canal 1 (SYBR Green), canal 2
(LC-Red 640) o canal 3(LC-Red
705) con ayuda del software LightCycler 3.0.
En el modo SYBR Green se averiguaba la
especificidad de los productos PCR en las muestras de heces por
encima del punto de fusión en comparación con un control de
bacterias stx-positivas, en particular para poder
diferenciar el producto de amplificación de los
dímeros-cebador no específicos. Además se
verificaban todos los resultados mediante electroforesis en gel.
En el caso del formato de sondas de hibridación
de FRET se necesitaba emplear el Color Compensation File del
software LightCycler 3.0 para evitar los efectos Crosstalk entre el
canal 2 y 3. Los resultados de un experimento típico se dan a
conocer en las figuras 1 y 2:
La figura 1 muestra la dependencia de la
temperatura de la fluorescencia de los preparados con distintas
concentraciones de partida de ADN en el canal 2
(LC-RED-640) para la detección del
stxA1; la figura 2 muestra la fluorescencia de las mismas muestras,
medida en el canal 3 (LC-RED-705)
para la detección del stxA2. Se representa la primera derivación del
valor de fluorescencia medido según las indicaciones del
fabricante-LyghtCycler, dependiendo de la
temperatura respectiva de las curvas de fusión. De este modo los
valores de la temperatura de las máximas de las curvas averiguadas
corresponden a los puntos de fusión de las respectivas sondas de
hibridación.
El ADN de la cepa RDL 933 de la E. coli
positiva stx1 y stx2 se extraía según el ejemplo 1 y se cuantificaba
mediante un fotómetro. En base a la hipótesis de que 2 x 10^{8}
bacterias contienen aproximadamente 1 \mug de ADN, se calculaba el
número de bacterias tratadas y se preparaban las series de dilución.
Como base del diagnóstico rutinario las muestras de heces
cultivadas, libres de gérmenes patógenos intestinales, se trataban
con el método anteriormente descrito. En los preparados Multiplex
según el ejemplo 2, se podían detectar en un lote de reacción,
equivalentes de cómo mínimo 1,8 bacterias
positivas-stx en un fondo de unas 1x10^{7}
bacterias deficientes-stx.
48 cepas humanas de un serotipo distinto, cuyo
genotipo se desconocía en el momento de la invención, pero que ya
habían sido caracterizadas como cepas de EHEC por otros métodos
según la tecnología actual, se analizaban conforme al ejemplo 2 en
un procedimiento a base de sondas de hibridación y del FRET.
Adicionalmente se investigaban 3 cepas de cerdos enfermos con edema
de E. coli. El resultado se representa en la tabla 1:
Según la tabla se han podido identificar un
conjunto de cepas clínicas humanas como stx positivas, de tal forma
que en 18 cepas únicamente se ha detectado el gen stx 1, en 19 cepas
únicamente el stx2 y en 11 cepas ambos genes. Las tres cepas
clínicas de los cerdos eran asimismo stx2 positivas.
Al utilizar muestras de hibridación conforme a la
invención según la SEQ ID NO 7 y 8, en las diferentes cepas clínicas
se medían las diferencias en cuanto a las temperaturas de fusión del
stxA2: En los amplificados de 18 de las 30 cepas clínicas humanas
que contenían stxA2 se averiguaban para el stxA2 unas temperaturas
de fusión de 71-72ºC. Esta temperatura es idéntica
a la Tm averiguada con motivo de anteriores experimentos para el ADN
stxA2 clonado de cepas patógenas en el ser humano. Para el ADN de
las 12 cepas clínicas restantes humanas que contienen stxA2 así como
para el ADN de las tres cepas patógenas en los cerdos, que con
seguridad contienen el alelo stx2_{c}, se averiguaron unas
temperaturas de fusión de aproximadamente 63ºC. De la Tm idéntica
puede deducirse que las 12 cepas clínicas patógenas en el ser humano
se pueden atribuir a cepas de EHEC patógenas en el cerdo y
probablemente también contienen el alelo stx2c. Esta presunción se
confirmaba mediante el análisis secuencial de los productos de PCR
de las 12 cepas correspondientes.
En total este ejemplo demuestra que con ayuda del
método conforme a la invención pueden identificarse tanto patógenos
en el hombre como gérmenes de EHEC patógenos en el cerdo.
Las pruebas de especificidad se realizaban en 32
cepas de bacterias stx-negativas mencionadas en la
tabla 2. Para ello se extraía el ADN de los cultivos de la noche
correspondientes según el ejemplo 1. A continuación se examinaba la
presencia de stxA1 y stxA2 en el ADN aislado según el ejemplo 2 con
ayuda del procedimiento SybrGreen. El resultado era siempre
claramente negativo. Como control de inhibición se mezclaba el ADN
en un preparado paralelo con el ADN de la cepa EDL 933 de E.
coli positiva stx1 y stx2, y en un proceso similar se examinaba
el stx1 y stx2, obteniéndose sin excepción alguna unas señales
claramente positivas.
Por tanto este ejemplo demuestra que el método
conforme a la invención es adecuado para la detección específica de
infecciones de EHEC.
<110> Roche Diagnostics Gmbh
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Multiplex-PCR: para
la detección de infecciones de EHEC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 529800de
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcgtacgq ggatgcagat aaat
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggacacat agaaggaaac tcat
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccggaatg caaatcagtc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcgatactccg gaagcacatt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Escherichia coli
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtcacagt aacaaaccgt aacatcgctc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptgccacagac tgcgtcagtg aggt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagagcagttc tgcgttttgt cactgtca
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcagaagcc ttacgcttca ggc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Cebador con una longitud de hasta 25
nucleótidos que contiene la secuencia de nucleótidos representada en
una de las SEQ ID NO. 1 hasta 4.
2. Reacción de amplificación multiplex para la
detección de infecciones por EHEC clínicamente relevantes, en la que
tanto las secuencias stxA1 como stxA2 son amplificadas por patógenos
del ser humano como por formas iso stx2 patógenas del cerdo, que se
caracteriza por que se emplean el cebador con la secuencia de
nucleótidos representada en SEQ ID NO.1 y el cebador con la
secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO.2 y el cebador
con la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO.2 y el
cebador con la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID
NO.4.
3. Utilización del cebador con la secuencia de
nucleótidos representada en SEQ ID NO.1 y el cebador con la
secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO.2 y el cebador
con la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO.3 y el
cebador con la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO.4
para la detección de la infección por EHEC.
4. Método conforme a la reivindicación 2, que se
caracteriza por que el producto de la reacción de
amplificación es detectado adicionalmente por hibridación.
5. Método conforme a la reivindicación 4, que se
caracteriza por que al menos una sonda de hibridación
presenta una secuencia de nucleótidos representada en una de las SEQ
ID NO.5 hasta 8.
6. Método conforme a la reivindicación 2, 4 ó 5,
que se caracteriza por que el producto de amplificación es
detectado con ayuda de la detección por fluorescencia.
7. Método conforme a la reivindicación 6, que se
caracteriza por que el producto de amplificación es detectado
con ayuda de un compuesto fluorescente por enlace al ADN de cadena
doble.
8. Método conforme a la reivindicación
4-6, que se caracteriza por que el producto
de amplificación es detectado con ayuda de la transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia
9. Método conforme a la reivindicación 8, en el
que se emplea un estándar interno, que se diferencia de la secuencia
stxA1 o stxA2 únicamente en una o dos mutaciones puntuales, que se
caracteriza por que el ADN de referencia amplificado y el
estándar interno se distinguen uno del otro con ayuda de un análisis
de las curvas de fusión.
10. Método conforme a la reivindicación 8 ó 9,
que se caracteriza por que el stxA2 patógeno del ser humano y
el stxA2_{c} patógeno del cerdo se distinguen por medio de un
análisis de las curvas de fusión.
11. Sonda de hibridación con la secuencia de
nucleótidos representada en una de las SEQ ID NO 5 hasta 8.
12. Método conforme a la reivindicación 9 ó 10,
que se caracteriza por que las sondas de hibridación se
emplean con secuencias conforme a la reivindicación 11.
13. Utilización de sondas de hibridación conforme
a la reivindicación 11 para la determinación de curvas de
fusión.
14. Equipo para la detección de infecciones
relevantes por EHEC, que contiene el cebador con la secuencia de
nucleótidos representada en SEQ ID NO.1 y el cebador con la
secuencia de secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO.2 y
el cebador con la secuencia de secuencia de nucleótidos representada
en SEQ ID NO.3 y el cebador con la secuencia de secuencia de
nucleótidos representada en SEQ ID NO.4.
15. Equipo conforme a la reivindicación 14 que
contiene las sondas de hibridación con las secuencias conforme a las
SEQ ID NO. 5-8
16. Equipo conforme a la reivindicación 14 ó 15,
que contiene un tampón especial, Taq-polimerasa y
desoxirribonucleótidos para llevar a cabo las reacciones de
amplificación del ácido nucleico.
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