ES2767331T3 - Composiciones y procedimientos para la detección de Clostridium difficile - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para detectar C. difficile en una muestra, comprendiendo el procedimiento: - realizar múltiples etapas de ciclado, en el que cada etapa de ciclado comprende: - una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores para tcdB para producir un producto de amplificación si un ácido nucleico de tcdB está presente en la muestra; y - una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación si se produce con una sonda para tcdB detectable; y - detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia de C. difficile en la muestra y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia de C. difficile en la muestra; en el que el conjunto de cebadores para tcdB comprende un primer cebador oligonucleotídico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2 y 3, o un complemento de las mismas y un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 5 y 6; y en el que la sonda para tcdB detectable comprende una secuencia seleccionada del grupo que 20 consiste en SEQ ID NO: 7, 8 y 9, o un complemento de las mismas.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para la detección de Clostridium difficile

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo del diagnóstico microbiano, y más en particular, a la detección de Clostridium difficile.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Clostridium difficile ("C. difficile" o "C. diff") es una bacteria anaerobia, grampositiva, formadora de esporas que puede causar diarrea intensa y otras enfermedades intestinales. Las esporas de C. difficile se encuentran con frecuencia en los hospitales, y aunque las esporas no pueden causar infección directamente, se pueden transformar en la forma infecciosa activa cuando se ingieren. Las infecciones por C. difficile incluyen una amplia gama de síndromes clínicos, desde diarrea simple hasta colitis seudomembranosa asociada con una morbimortalidad significativa. La colitis asociada a antibióticos es una infección del colon causada por C. difficile que se produce cuando las bacterias competidoras en la flora intestinal se han eliminado con antibióticos. Es la infección más común adquirida por los pacientes mientras están en el hospital.

La mayoría de las infecciones por C. difficile se producen entre personas de 65 años o más y entre pacientes en establecimientos sanitarios, tales como hospitales y residencias de ancianos. De 1996 a 2009, las tasas de C. difficile en personas hospitalizadas de 65 años o más se incrementaron un 200 %, con incrementos de un 175 % en las de 65-74 años, un 198 % en las de 75-84 años y un 201 % en las de 85 años o más. Las tasas de C. difficile entre los pacientes de 85 años o más fueron notablemente más altas que las de los otros grupos de edad (National Hospital Discharge Survey, Annual Files, 1996-2009).

El diagnóstico de colitis por C. difficile comúnmente implica una prueba que detecta toxinas producidas por C. difficile en una muestra de heces. Hay dos toxinas de C. difficile diferentes que pueden causar colitis, denominadas toxina A (tdcA) y toxina B (tcdB). Las pruebas de diagnóstico para estas toxinas están disponibles comercialmente. Sin embargo, estas pruebas no son perfectas y pueden dar como resultado pruebas con positivos falsos (encontrar toxinas cuando no hay C. difficile) y se pueden producir pruebas con negativos falsos (no encontrar toxinas cuando C. difficile está presente). Por ejemplo, se conoce la posibilidad de una reacción cruzada entre C. difficile y C. sordellii. Véase "Cloning and characterization of the cytotoxin L-encoding gene of Clostridium sordellii: homology with Clostridium difficile cytotoxin B", Green et. al., Gene, 1995, 161:57-61). Por tanto, todavía existe una importante necesidad clínica de desarrollar pruebas moleculares para la detección de C. difficile que sean más sensibles que el cultivo y menos susceptibles a resultados positivos falsos o negativos falsos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los modos de realización de la presente invención se refieren a procedimientos para la detección rápida de la presencia o ausencia de C. difficile en una muestra biológica o no biológica. La presente invención incluye procedimientos de detección de C. difficile que comprenden realizar al menos una etapa de ciclado, que puede incluir una etapa de amplificación y una etapa de hibridación. Además, la presente invención se refiere a cebadores, sondas y kits que están diseñados para la detección de C. difficile. El gen dirigido en los procedimientos de la presente invención para la detección de C. difficile es el gen de la toxina B de C. difficile (tcdB). Por ejemplo, se eligió el gen tcdB que codifica la citotoxina B porque se determinó que era específico para C. difficile toxinógeno y no estaba presente en otras especies de Clostridium, con la excepción de algunas cepas de Clostridium sordellii positivas para citotoxinas y negativas para enterotoxinas (Green, et. al., J. Med. Microbiol. 1996, 44:60-64). La heterogeneidad del gen tcdB entre las cepas toxinógenas de C. difficile da como resultado hasta 31 toxinotipos hasta el momento, incluyendo Tox 0, que es la cepa de referencia VPI 10463. El gen tcdB codifica una proteína monocatenaria que tiene un dominio C terminal responsable de la unión a la membrana de la célula huésped, una parte media implicada en la internalización y la parte catalítica (tóxica) N terminal (Rupnik, et al., Microbiology, 2005, 151(1):199-208).

En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar C. difficile en una muestra, comprendiendo el procedimiento realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores para tcdB para producir un producto de amplificación si C. difficile está presente en la muestra; realizar una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación con una o más sondas para tcdB detectables; y detectar la presencia o ausencia del producto amplificado, en el que la presencia del producto amplificado es indicativa de la presencia de C. difficile en la muestra y en el que la ausencia del producto amplificado es indicativa de la ausencia de C. difficile en la muestra. En un modo de realización, cada cebador del conjunto de cebadores para tcdB comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 y 6, o un complemento de las mismas; y en el que la una o más sondas para tcdB detectables comprenden o consisten en una secuencia de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 8 y 9, o un complemento de las mismas. En algunos modos de realización, una etapa de hibridación comprende poner en contacto el producto de amplificación con una sonda que está marcada con un resto fluorescente donador y un resto fluorescente aceptador correspondiente. El procedimiento puede incluir además detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre el resto fluorescente donador y el resto fluorescente aceptador de la sonda. La presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia de C. difficile en la muestra.

En un aspecto, la amplificación puede emplear una enzima polimerasa que tiene actividad exonucleasa 5' a 3'. En determinados aspectos, el primer y segundo restos fluorescentes pueden estar en no más de 5 nucleótidos entre sí a lo largo de la longitud de la sonda. En otro aspecto, la sonda para tcdB incluye una secuencia de ácido nucleico que permite la formación de estructuras secundarias. Dicha formación de estructuras secundarias en general da como resultado la proximidad espacial entre el primer y segundo resto fluorescente. En determinados modos de realización de este procedimiento, el segundo resto fluorescente en la sonda puede ser un extintor.

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos de detección de la presencia o ausencia de C. difficile en una muestra biológica de un individuo. Dichos procedimientos en general incluyen realizar al menos una etapa de ciclado, que incluye una etapa de amplificación y una etapa de unión a tinte. Típicamente, la etapa de amplificación incluye poner en contacto la muestra con un par de cebadores para tcdB para producir un producto de amplificación de tcdB si una molécula de ácido nucleico de tcdB está presente en la muestra, y la etapa de unión a tinte incluye poner en contacto el producto de amplificación de tcdB con un tinte de unión a ADN bicatenario. Dichos procedimientos también incluyen detectar la presencia o ausencia de unión del tinte de unión a ADN bicatenario en el producto de amplificación, en el que la presencia de unión es indicativa de la presencia de C. difficile en la muestra, y en el que la ausencia de unión es indicativa de la ausencia de C. difficile en la muestra. Un tinte de unión a ADN bicatenario representativo es el bromuro de etidio. Además, dichos procedimientos también pueden incluir determinar la temperatura de fusión entre el producto de amplificación de tcdB y el tinte de unión a ADN bicatenario, en el que la temperatura de fusión confirma la presencia o ausencia de C. difficile.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit para detectar un ácido nucleico de C. difficile (diana de tcdB). El kit puede incluir un primer oligonucleótido que comprende o que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2 y 3, o un complemento de las misma; un segundo oligonucleótido que comprende o que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 5 y 6, o un complemento de las mismas; y un tercer oligonucleótido marcado de forma detectable que comprende o que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No: 7, 8 y 9, o un complemento de las mismas. En determinados modos de realización, el primer y segundo oligonucleótidos son oligonucleótidos cebadores, mientras que el tercer oligonucleótido marcado de forma detectable es un oligonucleótido sonda.

En un modo de realización, el kit puede incluir sondas ya marcadas con restos fluorescentes donadores y aceptadores correspondientes, o puede incluir restos de fluoróforo para marcar las sondas. En determinados modos de realización, el resto fluorescente aceptador es un extintor.

El kit también puede incluir al menos uno de nucleósidos trifosfato, ácido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la función de la ácido nucleico polimerasa. El kit también puede incluir un prospecto del envase e instrucciones para usar los cebadores, sondas y restos de fluoróforo para detectar la presencia o ausencia de C. difficile en una muestra.

En un aspecto, la presente invención proporciona un oligonucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, o un complemento de las mismas, oligonucleótido que tiene 100 nucleótidos o menos. En determinados modos de realización, el oligonucleótido tiene 40 nucleótidos o menos. En otro aspecto, la presente invención proporciona un oligonucleótido que incluye un ácido nucleico que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, etc.) con una de las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, o un complemento de las mismas, oligonucleótido que tiene 100 nucleótidos o menos, más específicamente 40 o menos. En determinados modos de realización, los oligonucleótidos tienen un 90 % de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, o un complemento de las mismas. En general, estos oligonucleótidos pueden ser ácidos nucleicos cebadores, ácidos nucleicos sonda o similares en estos modos de realización. En determinados de estos modos de realización, los oligonucleótidos tienen 40 nucleótidos o menos (por ejemplo, 35 nucleótidos o menos, 30 nucleótidos o menos, etc.). En algunos modos de realización, los oligonucleótidos comprenden al menos un nucleótido modificado, por ejemplo, para alterar la estabilidad de hibridación del ácido nucleico con respecto a los nucleótidos no modificados. Opcionalmente, los oligonucleótidos comprenden al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos incluyen al menos una variación modificada conservativamente.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un par de cebadores oligonucleotídicos, en el que un primer cebador oligonucleotídico comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2 y 3, o un complemento de las misma y en el que un segundo cebador oligonucleotídico comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 5 y 6, o un complemento de las mismas. En determinados de estos modos de realización, al menos uno de los oligonucleótidos tiene 40 nucleótidos o menos (por ejemplo, 35 nucleótidos o menos, 30 nucleótidos o menos, etc.). En algunos modos de realización, al menos uno de los oligonucleótidos comprende al menos un nucleótido modificado, por ejemplo, para alterar la estabilidad de hibridación del ácido nucleico con respecto a los nucleótidos no modificados. En algunos modos de realización, al menos uno de los oligonucleótidos incluye al menos una variación modificada conservativamente.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente invención, se describen a continuación procedimientos y materiales adecuados. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Los detalles de uno o más modos de realización de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otros rasgos característicos, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y la descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Las FIGURAS 1A, 1B y 1C muestran datos en gel de productos de PCR producidos con diversos pares de cebadores para el gen de la toxina B de C. difficile y el nivel de reactividad cruzada con C. sordellii; CDB203BZ/CDB202BZ (figura 1A), CDN211BZ/CDB214N (figura 1B) y CDB205BZ/CDB204BZ (figura 1C).

Las FIGURAS 2A, 2B y 2B muestran curvas de crecimiento por PCR de la sonda CDB242HQ6 en la amplificación del ADN genómico de Tox 0 de C. difficile y C. sordellii con diversos pares de cebadores: CDB203BZ/CDB202BZ (figura 2A), CDN211BZ/CDB214N (figura 2B) y CDB205BZ/CDB204BZ (figura 2C).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En el presente documento se describe un ensayo ultrarrápido para detectar C. difficile en una muestra. Se proporcionan cebadores y sondas para detectar C. difficile, así como artículos de fabricación o kits que contienen dichos cebadores y sondas. La sensibilidad incrementada de la PCR ultrarrápida para la detección de C. difficile en comparación con otros procedimientos, así como los rasgos característicos mejorados de la PCR ultrarrápida, incluyendo la contención de la muestra y la detección ultrarrápida del producto amplificado, hacen factible la implementación de esta tecnología para el diagnóstico de rutina de infecciones por C. difficile en el laboratorio clínico.

Los procedimientos pueden incluir realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una porción de una molécula de ácido nucleico de tcdB a partir de una muestra usando un par de cebadores para tcdB. "Cebadores para tcdB", como se usa en el presente documento, se refiere a cebadores oligonucleotídicos que se aparean específicamente a secuencias de ácido nucleico que codifican tcdB e inician la síntesis a partir de las mismas en condiciones apropiadas. Cada uno de los cebadores para tcdB se aparea a una diana dentro de o contigua a una molécula de ácido nucleico de tcdB, de modo que al menos una porción de cada producto de amplificación contiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a tcdB. El producto de amplificación de tcdB se produce siempre que el ácido nucleico de tcdB esté presente en la muestra; por tanto, la presencia del producto de amplificación de tcdB es indicativa de la presencia de C. difficile en la muestra. El producto de amplificación debe contener las secuencias de ácido nucleico que son complementarias a una o más sondas para tcdB detectables. Cada etapa de ciclado incluye una etapa de amplificación, una etapa de hibridación y una etapa de detección, en la que la muestra se pone en contacto con la una o más sondas para tcdB detectables para la detección de la presencia o ausencia de C. difficile en la muestra.

Como se usa en el presente documento, el término "amplificación" se refiere al procedimiento de sintetizar moléculas de ácido nucleico que son complementarias a una o ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico molde (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico de tcdB). La amplificación de una molécula de ácido nucleico incluye típicamente desnaturalizar el ácido nucleico molde, aparear cebadores con el ácido nucleico molde a una temperatura que está por debajo de las temperaturas de fusión de los cebadores, y alargar enzimáticamente a partir de los cebadores para generar un producto de amplificación. La amplificación requiere típicamente la presencia de desoxirribonucleósidos trifosfato, una enzima ADN polimerasa (por ejemplo, Taq Platinum®) y un tampón apropiado y/o cofactores para la actividad óptima de la enzima polimerasa (por ejemplo, MgCb y/o KCl).

El término "cebador" se usa en el presente documento como se conoce por los expertos en la técnica y se refiere a compuestos oligoméricos, principalmente a oligonucleótidos, pero también a oligonucleótidos modificados que pueden "cebar" la síntesis de ADN mediante una ADN polimerasa dependiente de molde, es decir, el extremo 3', por ejemplo, del oligonucleótido proporciona un grupo 3'-OH libre al que se pueden unir "nucleótidos" adicionales mediante una ADN polimerasa dependiente de molde que establece un enlace fosfodiéster 3' a 5' con lo que se usan desoxinucleósidos trifosfato y con lo que se libera pirofosfato. Por lo tanto, no existe una diferencia fundamental entre un "cebador", un "oligonucleótido" o una "sonda", excepto posiblemente para la función deseada, de acuerdo con la invención.

El término "hibridación" se refiere al apareamiento de una o más sondas con un producto de amplificación. Las condiciones de hibridación incluyen típicamente una temperatura que está por debajo de la temperatura de fusión de las sondas, pero que evita la hibridación inespecífica de las sondas.

La expresión "actividad exonucleasa en dirección 5' a 3'" se refiere a una actividad de una ácido nucleico polimerasa, típicamente asociada con la síntesis de la hebra de ácido nucleico, con lo que los nucleótidos se eliminan del extremo 5' de la hebra de ácido nucleico.

El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima polimerasa que es termoestable, es decir, la enzima cataliza la formación de productos de extensión de cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a las temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos molde bicatenarios. En general, la síntesis se inicia en el extremo 3' de cada cebador y continúa en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra molde. Se han aislado polimerasas termoestables de Thermus fiavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilus y Methanothermus fervidus. Sin embargo, las polimerasas que no son termoestables también se pueden emplear en ensayos de PCR siempre que se reponga la enzima.

La expresión "complemento del mismo" se refiere a un ácido nucleico tanto que tiene la misma longitud que, como que es exactamente complementario a, un ácido nucleico dado.

El término "extensión" o "alargamiento", cuando se usa con respecto a ácidos nucleicos, se refiere a cuando se incorporan nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) en los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un ácido nucleico se extiende opcionalmente por un biocatalizador que incorpora nucleótidos, tal como una polimerasa que añade típicamente nucleótidos en el extremo terminal 3' de un ácido nucleico.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, por ejemplo, medida usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias disponibles para los expertos o mediante inspección visual. Los algoritmos ejemplares que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los programas BLAST, que se describen, por ejemplo, en Altschul et al. (1990) "Basic local alignment search tool" J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish et al. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search" Nature Genet. 3:266-272, Madden et al. (1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BlAST: a new generation of protein database search programs" Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 y Zhang et al. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation" Genome Res. 7:649-656.

Un "nucleótido modificado", en el contexto de un oligonucleótido, se refiere a una alteración en la que al menos un nucleótido de la secuencia oligonucleotídica se remplaza por un nucleótido diferente que proporciona una propiedad deseada al oligonucleótido. Los nucleótidos modificados ejemplares que se pueden sustituir en los oligonucleótidos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, una C5-metil-dC, una C5-etil-dC, un C5-metil-dU, un C5-etil-dU, una 2,6-diaminopurina, una C5-propinil-dC, un C5-propinil-dU, una C7-propinil-dA, una C7-propinil-dG, una C5-propargilamino-dC, un C5-propargilamino-dU, una C7-propargilamino-dA, una C7-propargilamino-dG, una 7-desaza-2-desoxixantosina, un análogo de pirazolopirimidina, un seudo-dU, un nitropirrol, un nitroindol, 2'-0-metil-ribo-U, 2'-0-metil-ribo-C, una N4-etil-dC, una N6-metil-dA y similares. Muchos otros nucleótidos modificados que se pueden sustituir en los oligonucleótidos de la invención se mencionan en el presente documento o se conocen de otro modo en la técnica. En determinados modos de realización, las sustituciones de nucleótidos modificados modifican las temperaturas de fusión (Tm) de los oligonucleótidos con respecto a las temperaturas de fusión de los oligonucleótidos no modificados correspondientes. Para ilustrar adicionalmente, determinadas sustituciones de nucleótidos modificados pueden reducir la amplificación de ácido nucleico inespecífica (por ejemplo, minimizar la formación de dímeros de cebadores o similares), incrementar el rendimiento de un amplicón diana deseado, y/o similares en algunos modos de realización de la invención. Los ejemplos de estos tipos de modificaciones de ácido nucleico se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.001.611.

Ácidos nucleicos y oligonucleótidos de C. difficile

La invención proporciona procedimientos para detectar C. difficile amplificando, por ejemplo, una porción del gen tcdB. Están disponibles secuencias de ácido nucleico del gen tcdB de C. difficile (véase, por ejemplo, n.° de acceso de GenBank AM180355. Específicamente, los cebadores y las sondas para amplificar y detectar moléculas de ácido nucleico de tcdB se proporcionan por la presente invención.

Para la detección de C. difficile, se proporcionan cebadores y sondas para amplificar moléculas de ácido nucleico de tcdB. Los ácidos nucleicos de tcdB distintos de los ejemplificados en el presente documento también se pueden usar para detectar C. difficile en una muestra. Por ejemplo, se pueden evaluar la especificidad y/o sensibilidad de variantes funcionales por los expertos en la técnica usando procedimientos de rutina. Las variantes funcionales representativas pueden incluir, por ejemplo, una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones en los ácidos nucleicos de tcdB divulgados en el presente documento.

Más específicamente, los oligonucleótidos de la presente invención incluyen, cada uno, un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, una variante sustancialmente idéntica de la misma en la que la variante tiene al menos, por ejemplo, un 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con una de las SEQ iD NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, o un complemento de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 y la variante.

TABLA I: Cebadores directos

TABLA II: Cebadores inversos

TABLA III: Sondas

En un modo de realización de la invención, se usa un conjunto particular de cebadores y sonda para tcdB para proporcionar la detección de C. difficile en una muestra biológica sospechosa de contener C. difficile. El conjunto de cebadores y sonda puede comprender al menos un cebador y una sonda específicos para tcdB que comprenden o consisten en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9. En otro modo de realización de la invención, el cebador y para tcdB comprende o consiste en una variante funcionalmente activa de cualquiera de los cebadores de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

Una variante funcionalmente activa de cualquiera de los cebadores y/o sondas de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 se puede identificar usando los cebadores y/o sondas en el procedimiento de la invención. Una variante funcionalmente activa de un cebador y/o sonda de cualquiera de las ^s E^q ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 se refiere a un cebador que proporciona una especificidad y sensibilidad similar o mayor en el procedimiento o kit de la invención en comparación con la secuencia respectiva de las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

La variante puede variar, por ejemplo, de la secuencia de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 en una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos, tal como una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en el extremo 5' y/o en el extremo 3' de la secuencia respectiva de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9. Como se detalla anteriormente, un cebador (y/o sonda) se puede modificar químicamente, es decir, un cebador y/o una sonda pueden comprender un compuesto nucleotídico o no nucleotídico modificado. Una sonda (o un cebador) es entonces un oligonucleótido modificado. Los "nucleótidos modificados" (o "análogos nucleotídicos") difieren de un "nucleótido" natural en alguna modificación, pero consisten todavía en una base o un compuesto de tipo base, un azúcar pentofuranosilo o un compuesto de tipo azúcar pentofuranosilo, una porción de fosfato o una porción de tipo fosfato, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, un "marcador" se puede unir a la porción de base de un "nucleótido", con lo que se obtiene un "nucleótido modificado". Una base natural en un "nucleótido" también se puede remplazar por, por ejemplo, una 7-desazapurina, con lo que también se obtiene un "nucleótido modificado". Los términos "nucleótido modificado" o "análogo nucleotídico" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud. Un "nucleósido modificado" (o "análogo nucleosídico") difiere de un nucleósido natural en alguna modificación de la manera señalada anteriormente para un "nucleótido modificado" (o un "análogo nucleotídico").

Los oligonucleótidos, incluyendo los oligonucleótidos modificados y los análogos de oligonucleótidos que amplifican una molécula de ácido nucleico que codifica tcdB, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican porciones alternativas de tcdB, se pueden diseñar usando, por ejemplo, un programa de ordenador tal como OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.). Los rasgos característicos importantes cuando se diseñan oligonucleótidos que se van a usar como cebadores de amplificación incluyen, pero no se limitan a, un producto de amplificación de tamaño apropiado para facilitar la detección (por ejemplo, mediante electroforesis), temperaturas de fusión similares para los miembros de un par de cebadores, y la longitud de cada cebador (es decir, los cebadores deben ser lo suficientemente largos para aparearse con especificidad de secuencia y para iniciar la síntesis, pero no tan largos como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis de oligonucleótidos). Típicamente, los cebadores oligonucleotídicos tienen una longitud de 8 a 50 nucleótidos (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 50 nucleótidos de longitud).

Además de un conjunto de cebadores, los procedimientos de la invención pueden usar una o más sondas para detectar la presencia o ausencia de C. difficile. El término "sonda" se refiere a ácidos nucleicos (ADN o ARN) producidos sintética o biológicamente, que por diseño o selección contienen secuencias de nucleótidos específicas que les permiten hibridar en rigurosidades predeterminadas definidas específicamente (es decir, preferentemente) con "ácidos nucleicos diana", en el presente caso con un ácido nucleico (diana) de tcdB. Una "sonda" se puede denominar "sonda de detección", que significa que detecta el ácido nucleico diana.

De acuerdo con la invención, la sonda para tcdB se puede marcar con al menos un marcador fluorescente. En un modo de realización, la sonda para tcdB se puede marcar con un resto fluorescente donador, por ejemplo, un tinte fluorescente, y un resto fluorescente aceptador correspondiente, por ejemplo, un extintor.

En un modo de realización de la presente invención, al menos una sonda comprende o consiste en un resto fluorescente y secuencias de un ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 8 y 9 (mostradas sin el marcador).

El diseño de los oligonucleótidos que se van a usar como sondas de hibridación se puede realizar de manera similar al diseño de cebadores. Los modos de realización de la presente invención pueden usar una única sonda o un par de sondas para la detección del producto de amplificación. Dependiendo del modo de realización, el uso de la(s) sonda(s) puede comprender al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. Al igual que con los cebadores, las sondas normalmente tienen temperaturas de fusión similares, y la longitud de cada sonda debe ser suficiente para que se produzca la hibridación específica de secuencia, pero no tan larga como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis. Las sondas oligonucleotídicas en general tienen de 15 a 30 (por ejemplo, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24 o 25) nucleótidos de longitud.

Las construcciones de la presente invención incluyen vectores que contienen una molécula de ácido nucleico de tcdB (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9). Se pueden usar construcciones de la invención, por ejemplo, como moléculas de ácido nucleico molde de control. Los vectores adecuados para su uso en la presente invención están comercialmente disponibles y/o se producen por procedimientos de la tecnología de ácido nucleico recombinante de rutina en la técnica. Las moléculas de ácido nucleico de tcdB se pueden obtener, por ejemplo, mediante síntesis química, clonación directa a partir de C. difficile o mediante amplificación por PCR.

Las construcciones adecuadas para su uso en los procedimientos de la invención típicamente incluyen, además de las moléculas de ácido nucleico de tcdB (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una o más secuencias de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9), secuencias que codifican un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos) para seleccionar construcciones y/o transformantes deseados, y un origen de replicación. La elección de los sistemas de vectores normalmente depende de varios factores, que incluyen, pero sin limitarse a, la elección de las células huésped, la eficacia de la replicación, la capacidad de selección, la capacidad de inducción y la facilidad de recuperación.

Las construcciones de la invención que contienen moléculas de ácido nucleico de tcdB se pueden propagar en una célula huésped. Como se usa en el presente documento, el término célula huésped pretende incluir procariotas y eucariotas tales como células de levaduras, de plantas y de animales. Los huéspedes procariotas pueden incluir E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Los huéspedes eucariotas incluyen levaduras tales como S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris, células de mamífero tales como células COS o células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto y células de plantas tales como Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum. Se puede introducir una construcción de la invención en una célula huésped usando cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la precipitación con fosfato de calcio, la electroporación, el choque térmico, la lipofección, la microinyección y la transferencia de ácidos nucleicos mediada por virus son procedimientos comunes para introducir ácidos nucleicos en células huésped. Además, se puede administrar ADN no marcado directamente a las células (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.580.859 y 5.589.466).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las patentes de EE. UU. n.° 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188 divulgan técnicas de PCR convencionales. La PCR emplea típicamente dos cebadores oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores útiles en la presente invención incluyen oligonucleótidos que pueden actuar como un punto de iniciación de la síntesis de ácido nucleico dentro de las secuencias de ácido nucleico de tcdB (por ejemplo, las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 y 6). Un cebador se puede purificar a partir de un hidrolizado de restricción mediante procedimientos convencionales, o se puede producir sintéticamente. El cebador es preferentemente monocatenario para una máxima eficacia en la amplificación, pero el cebador puede ser bicatenario. Los cebadores bicatenarios se desnaturalizan primero, es decir, se tratan para separar las hebras. Un procedimiento para desnaturalizar ácidos nucleicos bicatenarios es mediante calentamiento.

Si el ácido nucleico molde es bicatenario, es necesario separar las dos hebras antes de que se pueda usar como molde en la PCR. La separación de hebras se puede conseguir mediante cualquier procedimiento de desnaturalización adecuado incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos. Un procedimiento para separar las hebras de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que se desnaturaliza predominantemente (por ejemplo, se desnaturaliza más de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico molde dependerán, por ejemplo, de la concentración de sal de tampón y de la longitud y composición de nucleótidos de los ácidos nucleicos que se van a desnaturalizar, pero típicamente varían de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 105 °C durante un tiempo que depende de rasgos característicos de la reacción tales como la temperatura y la longitud del ácido nucleico. La desnaturalización se realiza típicamente durante aproximadamente 30 s a 4 min (por ejemplo, de 1 min a 2 min 30 s, o 1,5 min).

Si el ácido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza por calor, la mezcla de reacción se deja enfriar hasta una temperatura que promueva el apareamiento de cada cebador con su secuencia diana en los ácidos nucleicos de tcdB. La temperatura para el apareamiento es normalmente de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C (por ejemplo, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C; de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 50 °C). Los tiempos de apareamiento pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min (por ejemplo, de aproximadamente 20 s a aproximadamente 50 s; de aproximadamente 30 s a aproximadamente 40 s). La mezcla de reacción se ajusta entonces a una temperatura a la que se promueve u optimiza la actividad de la polimerasa, es decir, una temperatura suficiente para que se produzca la extensión del cebador apareado para generar productos complementarios del ácido nucleico molde. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un producto de extensión a partir de cada cebador que se aparea con un molde de ácido nucleico, pero no debe ser tan alta como para desnaturalizar un producto de extensión de su molde complementario (por ejemplo, la temperatura para extensión varía en general de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C (por ejemplo, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C; aproximadamente 60 °C). Los tiempos de extensión pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 5 min (por ejemplo, de aproximadamente 30 s a aproximadamente 4 min; de aproximadamente 1 min a aproximadamente 3 min; de aproximadamente 1 min 30 s a aproximadamente 2 min).

Los ensayos de PCR pueden emplear ácido nucleico de C. difficile tal como ARN o ADN (ADNc). El ácido nucleico molde no tiene que estar purificado; puede ser una fracción menor de una mezcla compleja, tal como ácido nucleico C. difficile contenido en células humanas. Los ácidos nucleicos de C. difficile se pueden extraer a partir de una muestra biológica mediante técnicas de rutina tales como las descritas en Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications (Persing et al. (eds), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.). Los ácidos nucleicos se pueden obtener a partir de muchísimas fuentes, tales como plásmidos, o fuentes naturales que incluyen bacterias, levaduras, virus, orgánulos u organismos superiores tales como plantas o animales.

Los cebadores oligonucleotídicos (por ejemplo, las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 y 6) se combinan con reactivos de PCR en condiciones de reacción que inducen la extensión del cebador. Por ejemplo, las reacciones de extensión de cadena incluyen en general KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCb 15 mM, gelatina al 0,001 % (p/v), 0,5-1,0 pg de ADN molde desnaturalizado, 50 pmoles de cada cebador oligonucleotídico, 2,5 U de polimerasa Taq y DMSO al 10 %). Las reacciones contienen normalmente de 150 a 320 pM de cada uno de dATP, dCTP, dTTP, dGTP, o uno o más análogos de los mismos.

Las hebras recién sintetizadas forman una molécula bicatenaria que se puede usar en las sucesivas etapas de la reacción. Las etapas de separación, apareamiento y alargamiento de la hebra se pueden repetir con tanta frecuencia como sea necesario para producir la cantidad deseada de productos de amplificación correspondientes a la molécula de ácido nucleico de tcdB diana. Los factores limitantes en la reacción son las cantidades de cebadores, de enzima termoestable y de nucleósidos trifosfato presentes en la reacción. Las etapas de ciclado (es decir, desnaturalización, apareamiento y extensión) se repiten preferentemente al menos una vez. Para su uso en la detección, el número de etapas de ciclado dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de ciclado para amplificar la secuencia diana suficientemente para la detección. En general, las etapas de ciclado se repiten al menos aproximadamente 20 veces, pero se pueden repetir hasta 40, 60 o incluso 100 veces.

Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET)

La tecnología FRET (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 y 6.162.603) está basada en un concepto de que cuando un resto fluorescente donador y un resto fluorescente aceptador correspondiente están situados a una determinada distancia entre sí, tiene lugar la transferencia de energía entre los dos restos fluorescentes, que se puede visualizar o detectar y/o cuantificar de otro modo. El donador transfiere típicamente la energía al aceptador cuando se excita el donador por radiación lumínica con una longitud de onda adecuada. El aceptador reemite típicamente la energía transferida en forma de radiación lumínica con una longitud de onda diferente.

En un ejemplo, una sonda oligonucleotídica puede contener un resto fluorescente donador y un extintor correspondiente, que disipa la energía transferida en una forma distinta de la luz. Cuando la sonda está intacta, la transferencia de energía se produce típicamente entre los dos restos fluorescentes, de modo que la emisión fluorescente desde el resto fluorescente donador se extingue. Durante una etapa de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, se escinde una sonda unida a un producto de amplificación mediante la actividad exonucleasa en dirección 5' a 3' de, por ejemplo, una polimerasa Taq de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donador ya no se extingue. Las sondas ejemplares para este propósito se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.210.015, 5.994.056 y 6.171.785. Los pares donador-aceptador usados comúnmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores oscuros usados comúnmente incluyen BlackHole Quencher™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), lowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, lowa), BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

En otro ejemplo, dos sondas oligonucleotídicas, cada una de las cuales contiene un resto fluorescente, se pueden hibridar con un producto de amplificación en posiciones particulares determinadas por la complementariedad de las sondas oligonucleotídicas con la secuencia de ácido nucleico diana de tcdB. Tras la hibridación de las sondas oligonucleotídicas con el ácido nucleico del producto de amplificación en las posiciones apropiadas, se genera una señal de FRET. Las temperaturas de hibridación pueden variar de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C durante de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min.

El análisis fluorescente se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, un sistema de microscopio epifluorescente de recuento de fotones (que contiene el espejo dicroico apropiado y filtros para controlar la emisión fluorescente en el intervalo particular), un sistema fotomultiplicador de recuento de fotones o un fluorímetro. La excitación para iniciar la transferencia de energía se puede llevar a cabo con un láser de iones de argón, una lámpara de arco de mercurio (Hg) de alta intensidad, una fuente de luz de fibra óptica u otra fuente de luz de alta intensidad filtrada apropiadamente para la excitación en el intervalo deseado.

Como se usa en el presente documento con respecto a los restos fluorescentes donadores y aceptadores correspondientes, "correspondiente" se refiere a un resto fluorescente aceptador que tiene un espectro de emisión que se superpone al espectro de excitación del resto fluorescente donador. El máximo de longitud de onda del espectro de emisión del resto fluorescente aceptador debe ser al menos 100 nm mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del resto fluorescente donador. En consecuencia, se puede producir transferencia de energía no radiativa eficaz entre ellos.

Los restos fluorescentes donadores y aceptadores correspondientes se eligen en general para (a) transferencia de energía de Forster de alta eficacia; (b) un gran desplazamiento de Stokes final (>100 nm); (c) desplazamiento de la emisión lo más lejos posible hacia la porción roja del espectro visible (>600 nm); y (d) desplazamiento de la emisión a una longitud de onda más alta que la emisión fluorescente de agua Raman producida por excitación en la longitud de onda de excitación del donador. Por ejemplo, se puede elegir un resto fluorescente donador que tenga su máximo de excitación cerca de una línea de láser (por ejemplo, helio-cadmio 442 nm o argón 488 nm), un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico y una buena superposición de su emisión fluorescente con el espectro de excitación del resto fluorescente aceptador correspondiente. Se puede elegir un resto fluorescente aceptador correspondiente que tenga un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico, una buena superposición de su excitación con la emisión del resto fluorescente donador, y emisión en la parte roja del espectro visible (>600 nm).

Los restos fluorescentes donadores representativos que se pueden usar con diversos restos fluorescentes aceptadores en la tecnología FRET incluyen fluoresceína, amarillo Lucifer, B-ficoeritrina, isotiocianato de 9-acridina, amarillo Lucifer VS, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, 1-pirenobutirato de succinimidilo y derivados del ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico. Los restos fluorescentes aceptadores representativos, dependiendo del resto fluorescente donador usado, incluyen rojo LC 640, rojo LC 705, Cy5, Cy5.5, cloruro de sulfonilo de lisamina rodamina B, isotiocianato de tetrametil-rodamina, isotiocianato de rodamina x, isotiocianato de eritrosina, fluoresceína, pentaacetato de dietilentriamina u otros quelatos de iones de lantánido (por ejemplo, europio o terbio). Se pueden obtener restos fluorescentes donadores y aceptadores, por ejemplo, de Molecular Probes (Junction City, Oreg.) o Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).

Los restos fluorescentes donadores y aceptadores se pueden unir al oligonucleótido sonda apropiado a través de una sección conectora. La longitud de cada sección conectora es importante, ya que las secciones conectoras afectarán a la distancia entre los restos fluorescentes donadores y aceptadores. La longitud de una sección conectora para el propósito de la presente invención es la distancia en Angstroms (A) desde la base nucleotídica hasta el resto fluorescente. En general, una sección conectora tiene de aproximadamente 10 A a aproximadamente 25 A. La sección conectora puede ser del tipo descrito en el documento WO 84/03285. El documento WO 84/03285 también divulga procedimientos para unir secciones conectoras a una base nucleotídica particular, y también para unir restos fluorescentes a una sección conectora.

Un resto fluorescente aceptador, tal como un éster de NHS de rojo LC 640, se puede combinar con C6-fosforamiditas (disponibles de ABI (Foster City, Calif.) o Glen Research (Sterling, Va.)) para producir, por ejemplo, rojo LC 640-fosforamidita. Los conectores usados con frecuencia para acoplar un resto fluorescente donador, tal como fluoresceína, a un oligonucleótido incluyen conectores de tiourea (derivados de FITC, por ejemplo, fluoresceína-CPG de Glen Research o ChemGene (Ashland, Mass.)), conectores de amida (derivados de éster de NHS de fluoresceína, tal como fluoresceína-CPG de BioGenex (San Ramon, Calif.)) o 3'-amino-CPG que requieren el acoplamiento de un éster de NHS de fluoresceína después de la síntesis de oligonucleótidos.

Detección de Clostridium difficile

La presente invención proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de C. difficile en una muestra biológica o no biológica. Los procedimientos reivindicados pueden evitar problemas de contaminación de muestras, por ejemplo, contaminación por arrastre de una serie a otra, negativos falsos, por ejemplo, sensibilidad y positivos falsos, por ejemplo, especificidad. Los procedimientos incluyen realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una porción de una molécula de ácido nucleico de tcdB a partir de una muestra usando un par de cebadores para tcdB y una etapa de detección por FRET. Se realizan múltiples etapas de ciclado, preferentemente en un termociclador. Los procedimientos de la invención se pueden realizar usando los cebadores y sondas para tcdB para detectar la presencia de tcdB, y la detección de tcdB indica la presencia de C. difficile en la muestra.

Como se describe en el presente documento, los productos de amplificación se pueden detectar usando sondas de hibridación marcadas que aprovechan la tecnología FRET. Un formato FRET utiliza la tecnología TaqMan® para detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación y, por tanto, la presencia o ausencia de C. difficile. La tecnología TaqMan® utiliza una sonda de hibridación monocatenaria marcada con dos restos fluorescentes. Cuando se excita un primer resto fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere a un segundo resto fluorescente de acuerdo con los principios de FRET. El segundo resto fluorescente es, en general, una molécula extintora. Durante la etapa de apareamiento de la reacción de PCR, la sonda de hibridación marcada se une al ADN diana (es decir, el producto de amplificación) y se degrada mediante la actividad exonucleasa en dirección 5' a 3' de la polimerasa Taq durante la fase de alargamiento posterior. Como resultado, el resto fluorescente excitado y el resto extintor se separan espacialmente entre sí. Como consecuencia, tras la excitación del primer resto fluorescente en ausencia del extintor, se puede detectar la emisión de fluorescencia del primer resto fluorescente. A modo de ejemplo, un sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) usa la tecnología TaqMan®, y es adecuado para realizar los procedimientos descritos en el presente documento para detectar la presencia o ausencia de C. difficile en la muestra.

Las balizas moleculares conjuntamente con FRET también se pueden usar para detectar la presencia de un producto de amplificación usando los procedimientos de PCR ultrarrápida de la invención. La tecnología de baliza molecular usa una sonda de hibridación marcada con un primer resto fluorescente y un segundo resto fluorescente. El segundo resto fluorescente es, en general, un extintor, y los marcadores fluorescentes están localizados típicamente en cada extremo de la sonda. La tecnología de baliza molecular usa un oligonucleótido sonda que tiene secuencias que permiten la formación de estructura secundaria (por ejemplo, una horquilla). Como resultado de la formación de estructura secundaria dentro de la sonda, ambos restos fluorescentes están en proximidad espacial cuando la sonda está en solución. Después de la hibridación con los ácidos nucleicos diana (es decir, productos de amplificación), la estructura secundaria de la sonda se altera y los restos fluorescentes se separan unos de otros de modo que, después de la excitación con luz de una longitud de onda adecuada, se puede detectar la emisión del primer resto fluorescente.

Otro formato común de la tecnología FRET utiliza dos sondas de hibridación. Cada sonda se puede marcar con un resto fluorescente diferente y, en general, se diseñan para hibridar en estrecha proximidad entre sí en una molécula de ADN diana (por ejemplo, un producto de amplificación). Un resto fluorescente donador, por ejemplo, fluoresceína, se excita a 470 nm mediante la fuente de luz del instrumento LightCycler®. Durante FRET, la fluoresceína transfiere su energía a un resto fluorescente aceptador tal como Red 640 de LightCycler® (rojo LC 640) o Red 705 de LightCycler® (rojo LC 705). El resto fluorescente aceptador emite entonces luz de una longitud de onda más larga, que se detecta por el sistema de detección óptica del instrumento LightCycler®. La FRET eficaz puede tener lugar solo cuando los restos fluorescentes están en proximidad local directa y cuando el espectro de emisión del resto fluorescente donador se superpone con el espectro de absorción del resto fluorescente aceptador. La intensidad de la señal emitida se puede correlacionar con el número de moléculas de ADN diana originales (por ejemplo, el número de genomas de C. difficile). Si se produce la amplificación de ácido nucleico de tcdB y se produce un producto de amplificación, la etapa de hibridación da como resultado una señal detectable basada en FRET entre los miembros del par de sondas.

En general, la presencia de FRET indica la presencia de C. difficile en la muestra, y la ausencia de FRET indica la ausencia de C. difficile en la muestra. Sin embargo, la recogida inadecuada de muestras, los retrasos en el transporte, las condiciones de transporte inapropiadas o el uso de determinados hisopos de recogida (alginato de calcio o varilla de aluminio) son todas condiciones que pueden afectar al éxito y/o la exactitud del resultado de una prueba. Usando los procedimientos divulgados en el presente documento, la detección de FRET en, por ejemplo, 45 etapas de ciclado es indicativa de una infección por C. difficile.

Las muestras biológicas representativas que se pueden usar en la práctica de los procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a, hisopos dérmicos, hisopos nasales, hisopos para heridas, hemocultivos, piel e infecciones de tejidos blandos. Los procedimientos de recogida y almacenamiento de muestras biológicas se conocen por los expertos en la técnica. Las muestras biológicas se pueden procesar (por ejemplo, mediante procedimientos y/o kits de extracción de ácido nucleico conocidos en la técnica) para liberar el ácido nucleico de C. difficile o, en algunos casos, la muestra biológica se puede poner en contacto directamente con los componentes de reacción de PCR y los oligonucleótidos apropiados.

El análisis de la curva de fusión es una etapa adicional que se puede incluir en un perfil de ciclado. El análisis de la curva de fusión se basa en el hecho de que el ADN se funde a una temperatura característica llamada temperatura de fusión (Tm), que se define como la temperatura a la que la mitad de las dobles hebras de ADN se han separado en hebras individuales. La temperatura de fusión de un ADN depende principalmente de su composición de nucleótidos. Por tanto, las moléculas de ADN ricas en nucleótidos G y C tienen una Tm mayor que las que tienen una abundancia de nucleótidos A y T. Detectando la temperatura a la que se pierde la señal, se puede determinar la temperatura de fusión de las sondas. De forma similar, detectando la temperatura a la que se genera la señal, se puede determinar la temperatura de apareamiento de las sondas. La(s) temperatura(s) de fusión de las sondas para tcdB del producto de amplificación de tcdB puede(n) confirmar la presencia o ausencia de C. difficile en la muestra.

Dentro de cada serie de procesamiento del termociclador, se ciclan también muestras de control. Las muestras de control positivo pueden amplificar el molde de control de ácido nucleico de C. difficile (distinto de tcdB) usando, por ejemplo, cebadores de control y sondas de control. Las muestras de control positivo también pueden amplificar, por ejemplo, una construcción plasmídica que contiene moléculas de ácido nucleico de tcdB. Dicho control de plásmido se puede amplificar internamente (por ejemplo, dentro de la muestra) o en una muestra separada, procesada en paralelo con las muestras de los pacientes. Cada serie de procesamiento del termociclador también puede incluir un control negativo que, por ejemplo, carece de ADN molde de C. difficile. Dichos controles son indicadores del éxito o fracaso de la amplificación, hibridación y/o reacción de FRET. Por lo tanto, las reacciones de control pueden determinar fácilmente, por ejemplo, la capacidad de los cebadores de aparearse con especificidad de secuencia e iniciar el alargamiento, así como la capacidad de las sondas de hibridar con especificidad de secuencia y para que se produzca FRET.

En un modo de realización, los procedimientos de la invención incluyen etapas para evitar la contaminación. Por ejemplo, se describe un procedimiento enzimático que utiliza uracil-ADN glucosilasa en las patentes de EE. UU. n.° 5.035.996, 5.683.896 y 5.945.313 para reducir o eliminar la contaminación entre una serie de procesamiento del termociclador y la siguiente.

Se pueden usar los procedimientos de PCR convencionales en conjunto con la tecnología FRET para llevar a la práctica los procedimientos de la invención. En un modo de realización, se usa un instrumento LightCycler®. Las siguientes solicitudes de patente describen la PCR ultrarrápida usada en la tecnología LightCycler®: documentos WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712.

El LightCycler® se puede manejar usando una estación de trabajo para PC y puede utilizar un sistema operativo Windows NT. Las señales de las muestras se obtienen a medida que la máquina sitúa los capilares secuencialmente sobre la unidad óptica. El programa informático puede visualizar las señales de fluorescencia ultrarrápidas inmediatamente después de cada medición. El tiempo de adquisición fluorescente es de 10-100 milisegundos (ms). Después de cada etapa de ciclado, se puede actualizar continuamente una visualización cuantitativa de la fluorescencia frente al número de ciclo para todas las muestras. Los datos generados se pueden almacenar para un análisis posterior.

Como una alternativa a FRET, se puede detectar un producto de amplificación usando un tinte de unión a ADN bicatenario tal como un tinte fluorescente de unión a ADN (por ejemplo, verde SYBR® u oro SYBR® (Molecular Probes)). Tras la interacción con el ácido nucleico bicatenario, dichos tintes fluorescentes de unión a ADN emiten una señal fluorescente después de la excitación con luz a una longitud de onda adecuada. También se puede usar un tinte de unión a ADN bicatenario, tal como un tinte de intercalación de ácido nucleico. Cuando se usan tintes de unión a ADN bicatenario, normalmente se realiza un análisis de curva de fusión para confirmar la presencia del producto de amplificación.

Se entiende que la presente invención no está limitada por la configuración de uno o más instrumentos disponibles comercialmente.

Artículos de fabricación/kits

La presente invención proporciona además artículos de fabricación o kits para detectar C. difficile. Un artículo de fabricación de acuerdo con la presente invención puede incluir cebadores y/o sondas usados para detectar C. difficile, conjuntamente con materiales de envasado adecuados. Los cebadores y sondas representativos para la detección de C. difficile se pueden hibridar con las moléculas de ácido nucleico de tcdB. Además, los kits también pueden incluir reactivos y materiales adecuadamente envasados necesarios para la inmovilización, hibridación y detección de ADN, tales como soportes sólidos, tampones, enzimas y patrones de ADN. Los procedimientos para diseñar cebadores y sondas se divulgan en el presente documento, y se proporcionan ejemplos representativos de cebadores y sondas que amplifican y se hibridan con moléculas de ácido nucleico de tcdB.

Los artículos de fabricación de la invención también pueden incluir uno o más restos fluorescentes para marcar las sondas o, de forma alternativa, las sondas suministradas con el kit pueden estar marcadas. Por ejemplo, un artículo de fabricación puede incluir un resto fluorescente donador para marcar una de las sondas para tcdB y un resto fluorescente aceptador para marcar la otra sonda para tcdB, respectivamente. Anteriormente se proporcionan ejemplos de restos fluorescentes donadores de FRET adecuados y restos fluorescentes aceptadores correspondientes.

Los artículos de fabricación de la invención también pueden contener un prospecto del envase o ficha técnica que tiene instrucciones en el mismo para usar los cebadores y sondas para tcdB para detectar C. difficile en una muestra. Los artículos de fabricación pueden incluir adicionalmente reactivos para llevar a cabo los procedimientos divulgados en el presente documento (por ejemplo, tampones, enzimas polimerasas, cofactores o agentes para prevenir la contaminación). Dichos reactivos pueden ser específicos para uno de los instrumentos disponibles comercialmente descritos en el presente documento.

La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Reactividad cruzada con C. sordellii

Tres mezclas maestras activadas (MMx) comprendieron los siguientes conjuntos de cebadores: se sometieron a prueba a) CDB203BZ/CDB202BZ (versiones alquiladas de las SEQ ID NO: 2 y 4 -ambos cebadores están alquilados (bencilo) en la base terminal 3', b) CDB211BZ/CDB214N, el cebador directo está alquilado (bencilo) y el cebador inverso no está alquilado, y c) CDB205BZ/CDB204BZ (versiones alquiladas de las SEQ ⁱD NO: 3 y 5 -ambos cebadores están alquilados (bencilo) en la base terminal 3', usando la misma sonda CDB242HQ6 (SEQ ID NO. 9) que es una sonda no marcada para detección.

Se amplificaron moldes de ADN genómico de Tox 0 en una entrada de 1+E3 equivalentes genómicos (eg) por triplicado y especies de exclusividad de C. sordellii 11279 y 11266 en una entrada de 1+E6 eg en 6 réplicas, junto con ningún tampón de control de molde, con las 3 MMx activadas en un instrumento LC480. Las reacciones replicadas para cada molde se ejecutaron en gel junto con el marcador de peso molecular de 100 pb (figuras 1A-C).

Los datos de gel mostraron que el producto de PCR más específico se generó a partir de CDB211BZ/124N, seguido de CDB203BZ/202BZ, y a continuación CDB205BZ/204BZ para el molde de control positivo; los controles negativos no revelaron ningún producto específico de PCR con los 3 conjuntos de cebadores, pero el producto no específico fue un fenómeno para el par de cebadores CDB211BZ/214N. De los tres pares de cebadores, solo CDB211BZ/214N generó productos de PCR específicos visibles usando los dos aislados de C. sordellii 11279 y 11266 como molde. En ocasiones, CDB203BZ/202BZ generó un producto específico de PCR frente al molde genómico de C. sordellii, sin embargo el rendimiento del producto nunca llegó al de CDB211BZ/214N. (NC: sin control de molde, PC: ADN genómico de Tox 0 de C.diff, escalera de 100 pb como marcador de peso molecular).

Aunque la amplificación de C. sordellii se estaba produciendo con el par de cebadores CDB211BZ/214N (figura 1B), sin embargo, la sonda pudo discriminar frente a C. sordelii sin generar ninguna curva de crecimiento (figura 2B).

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para detectar C. difficile en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

- realizar múltiples etapas de ciclado, en el que cada etapa de ciclado comprende:

- una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores para tcdB para producir un producto de amplificación si un ácido nucleico de tcdB está presente en la muestra; y - una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación si se produce con una sonda para tcdB detectable; y

- detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia de C. difficile en la muestra y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia de C. difficile en la muestra;

en el que el conjunto de cebadores para tcdB comprende un primer cebador oligonucleotídico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2 y 3, o un complemento de las mismas y un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 5 y 6; y en el que la sonda para tcdB detectable comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 8 y 9, o un complemento de las mismas.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:

- la etapa de hibridación comprende poner en contacto el producto de amplificación con una sonda que está marcada con un resto fluorescente donador y un resto fluorescente aceptador correspondiente; y

- la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre el resto fluorescente donador y el resto fluorescente aceptador de la sonda, en la que la presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia de C. difficile en la muestra.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que dicha amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad exonucleasa de 5' a 3'.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que dichos primer y segundo restos fluorescentes están en no más de 5 nucleótidos entre sí en dicha sonda.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicho segundo resto fluorescente es un extintor.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la sonda para tcdB comprende una secuencia de ácido nucleico que permite la formación de estructuras secundarias, en el que la formación de estructura secundaria da como resultado la proximidad espacial entre el primer y el segundo resto fluorescente.

7. Un kit para detectar un ácido nucleico de C. difficile que comprende:

- un primer oligonucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2 y 3, o un complemento de las mismas;

- un segundo oligonucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 5 y 6, o un complemento de las mismas; y

- un tercer oligonucleótido marcado de forma detectable que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 8 y 9, o un complemento de las mismas.

8. El kit de la reivindicación 7, en el que el tercer oligonucleótido marcado de forma detectable comprende un resto fluorescente donador y un resto fluorescente aceptador correspondiente.

9. El kit de la reivindicación 8, en el que el resto fluorescente aceptador es un extintor.

10. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende además al menos uno de los siguientes componentes: nucleósidos trifosfato, ácido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la función de la ácido nucleico polimerasa.

11. Un conjunto de oligonucleótidos que comprende un primer cebador oligonucleotídico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 o 3 o un complemento de las mismas y un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 o 5 o un complemento de las mismas.

12. El conjunto de oligonucleótidos de la reivindicación 11, que comprende además un tercer oligonucleótido marcado de forma detectable que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 8 y 9, o un complemento de las mismas.

13. El conjunto de oligonucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en el que los oligonucleótidos tienen 40 nucleótidos o menos.