DE69921486T2

DE69921486T2 - Dextran-leptin konjugate, pharmazeutische zusammentsetzungen und verbundene verfahren

Info

Publication number: DE69921486T2
Application number: DE69921486T
Authority: DE
Inventors: C. David LITZINGER
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1998-08-10
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2019-08-11
Also published as: CA2337667C; WO2000009165A1; PT1107793E; EP1107793B1; CA2337667A1; JP2002522512A; DE69921486D1; JP4199421B2; ES2228082T3; EP1107793A1; ATE280588T1; AU5347099A

Description

Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft im breitesten Sinne das Gebiet der Proteinmodifikation und insbesondere die Anfügung von Dextraneinheiten an Leptinproteine, einschließlich Analoga derselben (der Begriff "Protein", wenn er hierin verwendet wird, ist synonym mit "Polypeptid" oder "Peptid", sofern es nicht anderweitig angegeben wird). In einer anderen Erscheinung betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die Dextran-Leptin-Konjugate enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls verwandte Zusammensetzungen und Verfahren zum Herstellen und Verwenden solcher Zusammensetzungen.
Hintergrund
Obwohl die molekulare Basis für Fettleibigkeit (obesity) im großen und ganzen unbekannt ist, hat die Identifizierung des "OB-Gens" und seines codierten Proteins ("OB-Protein" oder "Leptin") etwas Licht auf die Mechanismen geworfen, die der Körper verwendet, um die Körperfettablagerung zu regulieren. Siehe PCT WO 96/05309 mit dem Titel "Modulators of Body Weight, Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof", welche hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist; Zhang et al., Nature 372:425-32 (1994); siehe ebenfalls, die Korrektur in Nature 374:479 (1995), die beide herein ebenfalls durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Das OB-Protein ist in vivo sowohl in ob/ob-mutanten Mäusen (Mäuse, die aufgrund eines Defekts in der Herstellung des OB-Genprodukts fettleibig sind) als auch wie in normalen wildartigen Mäusen aktiv. Die biologische Aktivität manifestiert sich selbst in, unter anderen Dingen, einem Gewichtsverlust. Siehe im allgemeinen Barinaga "Obese" Protein Slims Mice", Science 269:475-76 (1995). Das OB-Protein, Analoga, Derivate und eine Verwendung derselben als Modulatoren für die Steuerung des Gewichts und der Fettleibigkeit von Tieren, einschließlich Säugetiere und Mensch, ist in größerem Detail in WO 96/05309, supra, offenbart worden. Siehe ebenfalls PCT WO 96/40912, WO 97/06816, 97/18833, WO 97/38014, WO 98/08512 und WO 98/28427. Das OB-Protein, oder Leptin, wie es hierin genannt wird, bewirkt einen Gewichtsverlust bei Menschen. Greenberg et. al. "Preliminary safety and efficacy of recombinant methionyl human leptin (rL) administered by SC injection in lean and obese subjects", Poster präsentiert bei: 58^th Annual Meeting and Scientific Sessions of the American Diabetes Association; 14. Juni 1998; Chicago, IL.
Es ist bekannt, daß die kontinuierliche Verabreichung eines Leptinproteins in dem systemischen Kreislauf beispielsweise durch eine osmotische Pumpe oder durch ein chemisches Modifizieren von Leptin, um eine gesteigerte Zirkulationszeit zu haben, Dosierungen reduziert, die für einen Gewichtsverlust notwendig sind. Z. B. PCT WO 96/40912 mit dem Titel "OB Protein Compositions and Methods", welche hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Im allgemeinen können Vorteile, die durch eine Proteinzubereitung und eine chemische Modifizierung angestrebt werden, unter bestimmten Umständen eine Erhöhung der Stabilität und Zirkulationszeit des therapeutischen Proteins und eine Abnahme der Immunisierungsstärke einschließen. Ein Übersichtsartikel, der eine Proteinmodifikation und Fusionsproteine beschreibt, ist Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (Mai 1992) (veröffentlicht von Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK). Verschiedene Mittel zum Anfügen chemischer Einheiten sind gegenwärtig verfügbar, siehe z. B. WO 96/11953 mit dem Titel "N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods", welche hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Diese PCT-Veröffentlichung offenbart, unter anderen Dingen, die selektive Anfügung von wasserlöslichen Polymeren an das N-Ende von Proteinen.
Polyethylenglycole sind eine Art eines wasserlöslichen Polymers, welches für eine Proteinmodifikation verwendet werden kann. Siehe WO 96/11953, supra, welche ebenfalls einen N-terminal monopegylierten "granulocyte colony stimulating factor" ("C-CSF") und ein N-terminal monopegyliertes Consensus-Interferon ("N-terminal monopegyliert" bezeichnet, daß die Proteineinheit an sich eine einzige Polyethylenglycoleinheit an dem N-Ende angefügt hat) offenbart. Polyethylenglycoleinheiten können mit großem Erfolg für einige therapeutische Proteine, wie G-CSF und Megakaryocytenwachstum und Entwicklungsfaktor ("MGDF") (Sheridan & Menchaca, "Overview of the Safety and Biologic Effects of PEG-rHuMGDF in Clinical Trials", in Stem Cells 16 (Ergänzungsband 2): 193-98 (1998)), verwendet werden.
Polysaccharidpolymere sind eine andere Art eines wasserlöslichen Polymers, die für eine Proteinmodifikation verwendet werden kann. Dextrane sind Polysaccharidpolymere, die aus einzelnen Untereinheiten von Glucose, vorherrschend durch α1-6-Verknüpfungen verbunden, umfaßt ist. Das Dextran selbst ist in vielen Molekulargewichtsbereichen erhältlich und ist leicht in Molekulargewichten von etwa 1 kiloDalton ("kD") bis etwa 70 kD erhältlich (der Begriff "etwa" wird verwendet, um das durchschnittliche Molekulargewicht in einer typischen kommerziellen Zubereitung von Dextran pharmazeutischer Qualität erkennen zu lassen, da einige Dextranmoleküle ein Gewicht leicht oberhalb des genannten Gewichts und einige unterhalb aufweisen können). Dextran ist ein geeignetes wasserlösliches Polymer zur Proteinmodifikation. Siehe WO 96/11953, supra, und WO 96/05309, supra. Die Verwendung von Dextran, das an therapeutische oder diagnostische Immunoglobuline konjugiert ist, ist ebenfalls berichtet worden. EP 0 315 456 mit dem Titel "Polysaccaride-Modified Immunoglobulins Having Reduced Immunogenic Potential or Improved Pharmacokinetics", welche hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, berichtet von Immunoglobulinen oder Fragmenten derselben, die mit modifizierten Polysacchariden mit niedrigem Molekulargewicht, einschließlich Dextranen, verknüpft sind.
Es gibt beträchtliche klinische Erfahrung bei der Verwendung großer Menge von Dextran in Lösung als Plasmaextender (Volumenausdehner). Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Auflage, auf 804-05 (Mack Publishing Co.; Easton, PA (1990)), welches hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Lösungen, welche Dextrane mit verhältnismäßig großem Molekulargewicht enthalten, wie Dextrane mit Molekulargewichten von etwa 40, 70 und 75 kD, sind erhältlich und werden in Grammmengen verabreicht. Dextran-Eisen-Lösungen werden ebenfalls bei der Behandlung von Blutarmut verwendet.
Von Dextranen mit großem Molekulargewicht wird berichtet, wenn sie in Grammmengen verabreicht werden, daß sie in Nierenvakuolen resultieren. Z. B. Diomi et al., Annals of Surgery 172:813-24 (1970) (berichtend von Nierenvakuolisierungen bei Hunden); Maunsbach et al., Laboratory Investigation 11:421-32 (1962) (berichtend von Nierenvakuolisierung bei Ratten); siehe ebenfalls Engberg, Acta Chir. Scand. 142:172-80 (1976). Polyethylenglykol-Protein-Konjugate sind in besonderen Fällen ebenfalls mit einer Nierenvakuolinduktion assoziiert worden. Bendele et al., Toxicological Sciences 42:152-57 (1998). Obwohl Nierenvakuolen gegenwärtig nicht als klinisch relevant verstanden werden, sollte im allgemeinen eine pharmazeutische Zusammensetzung ohne Bewirken unerwünschter anatomischer Veränderungen wirksam sein. Daher können Dextrane mit großem Molekulargewicht und Polyethylenglykolpolymere nicht im allgemeinen für eine chemische Modifizierung aller therapeutischen Proteine anwendbar sein.
Ein weiterer Nachteil bei der Verwendung von Dextran mit großem Molekulargewicht in einem klinischen Aufbau ist die Möglichkeit einer anaphylaktischen Reaktion beim Patienten. Siehe beispielsweise Richter et. al., Immunology Today 3:132-38 (1982) welche hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, ebenso wie die darin genannten Verweise, für eine Übersicht. Es wird angenommen, daß bestimmte Individuen in ihrem systemischen Kreislauf vorgebildete Antikörper aufweisen können, welche an diese Dextrane mit großem Molekulargewicht anbinden. Die Verabreichung von klinischem Dextran mit großem Molekulargewicht an eine kleine (jedoch nicht vorhersagbare) Unterpopulation von Individuen mit hohem Titer dieser vorgebildeten, Dextran reaktiven Antikörper ("DRA") der IgG-Klasse resultiert in einem anaphylaktischen Schock und möglicherweise dem Tod. Es wird angenommen, daß klinische Dextrane schädliche Immunkomplexe erzeugen, welche eine Ergänzung aktivieren, und eine Aggregation von Leukozyten und Blutplättchen findet statt. Das aggregierte Material kann in der Lunge sequestriert werden und eine Freigabe von vasoaktiven Mediatoren kann zu anaphylaktischen Reaktionen führen. Richter et. al., supra, bei 136.
Um dieses potentielle Risiko zu überwinden, sind Dextranlösungen, die Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 1.000 D enthalten, als Hapten-Inhibitoren des vorgebildeten DRA untersucht worden. Ein Dextranfragment aus sechs Glucoseeinheiten (Molekulargewicht 990) wurde als geeignet für eine monovalente Haptenherstellung für in-vivo-Experimente gefunden. Richter et. al., supra, bei 136. Die Verwendung von einer Hapteninhibierung, um anaphylaktische Reaktionen zu reduzieren, ist für Blutexpander sehr erfolgreich gewesen. Z. B. Ljungstrom, Infusionsther Transfusionsmed 20:206-10 (1993), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. In den Jahren 1983 bis 1992 ist von der Verwendung einer kommerziellen Zubereitung, die Promit^® genannt wurde, berichtet worden, um das Auftreten von schweren, Dextran induzierten, anaphylaktischen Reaktionen ("DIAR") dramatisch zu vermindern. Tödliche Reaktionen wurden bei einem Fall von 2,5 Millionen Dosen berichtet.
EP 0 315 456 , wie oben erwähnt, berichtet von der Verwendung von Dextranen mit einem Molekulargewicht von etwa 6 kD zur Konjugation an Immunoglobuline. Es wird berichtet, daß monoklonale Antikörper, die als geeignet für therapeutische Zwecke erachtet werden, konjugiert mit Dextranen eine vermindern Immunisierungsstärke aufweisen, während eine gewünschte Immunoreaktivität bewahrt bleibt, und gewünschte pharmakokinetische Eigenschaften besitzen können. Siehe ebenfalls Mikolajczyk et. al., Bioconjugate Chem. 7:150-58 (1996) (Fab' Komponente eines Fab'-β-Lactamase-Konjugats); Fagnani et, al., Nuclear Medicine Comm. 16:362-69 (1995) (Fab'-Fragmente eines monoklonalen anti-karzinoembryogenes Antigen-Antikörper aus der Maus); Fagnani et. al.; Cancer Res. 50:3638-45 (1990) (Maus- und Kaninchenimmunoglobuline).
Es wäre daher wünschenswert, pharmazeutische Zusammensetzungen zu haben, die Dextran-Leptin-Konjugate enthalten, welche für Individuen mit zirkulierendem, vorgebildetem DRA nicht anaphylaktisch sind. Ferner wäre es insbesondere wünschenswert, Dextran-Leptin-Konjugate zu haben, welche gewünschte Eigenschaften, verglichen mit modifiziertem Leptin, einer verlängerter Zirkulationszeit, verbesserter Wirksamkeit und Löslichkeit zeigen. Die folgende Erfindung stellt Dextran-Leptin-Konjugate bereit, welche die Vorteile von chemisch modifizierten Leptinproteinen ohne die potentiellen Risiken aufweisen, die mit Polyethylenglykol oder Anaphylaxie induzierenden Dextranen verbunden sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stammt von der Beobachtung, daß bestimmte Dextran-Leptin-Konjugate mit verhältnismäßig geringem Molekulargewicht überraschenderweise die gewünschten Eigenschaften einer verbesserten Wirksamkeit und Zirkulationszeit besitzen und andere gewünschte Eigenschaften, wie erhöhte Löslichkeit und Reduktion von Injektionsstellenreaktionen, verglichen mit nativem Humanleptin, besitzen. Zusätzlich wurde der potentielle Nachteil einer Nierenvakuolisierung, wie er bei bestimmten Polyethylenglykol-Leptin-Konjugaten erkannt wird, nicht mit den vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugaten beobachtet.
Die Arbeitsbeispiele, die unten dargelegt werden, demonstrieren Dextran-Leptin-Konjugate, welche die folgenden Eigenschaften aufweisen: (a) Verbesserte Wirksamkeit gegenüber nicht modifiziertem, rekombinantem Methionylhumanleptin ("rmetHu-Leptin"); (b) eine ausgedehnte Plasmazirkulationszeit gegenüber nicht-modifiziertem rmetHu-Leptin; (c) verbesserte wässrige Löslichkeit bei physiologischem pH-Wert gegenüber nicht-modifiziertem rmetHu-Leptin; (d) milde oder nicht vorhandene Injektionsstellenreaktionen; (e) Nicht-Immunisierungsstärke des Dextran-Leptin-Konjugats; und (f) keine Induktion einer Nierenvakuolisierung.
Daher stellt in einer Erscheinung die vorliegende Erfindung Dextran-Leptin-Konjugate bereit, welche wenigstens eine niedermolekulargewichtige Dextran-Einheit umfassen, die an wenigstens eine Leptin-Einheit angefügt ist, wobei die Dextran-Einheit ein Molekulargewicht von 1 kD bis 20 kD aufweist. Bevorzugt weist zur Erleichterung der kommerziellen Herstellung eines pharmazeutischen Produkts die Dextraneinheit ein Molekulargewicht von 1 kD bis 10 kD und noch bevorzugter von 1 kD bis 7 kD auf. Eine besonders bevorzugte Dextraneinheit ist etwa 6 kD, wie es in den Beispielen unten veranschaulicht ist.
In einer weiteren Erscheinung der vorliegenden Erfindung werden Dextran-Leptin-Konjugate bereitgestellt, wobei eine niedermolekulargewichtige Dextraneinheit an eine oder mehrere Leptineinheiten angefügt ist. In noch einer weiteren Erscheinung der Erfindung werden Dextran-Leptin-Konjugate bereitgestellt, wobei wenigstens zwei niedermolekulargewichtige Dextraneinheiten an eine oder mehrere Leptineinheiten angefügt sind. Somit schließt die vorliegende Erfindung innerhalb ihres Umfangs eine Dextran-Leptin-Konjugatmischung ein, die irgendeine Kombination von wenigstens drei vorherrschenden Spezies von Dextran-Leptin-Konjugaten enthält: 1) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextraneinheit an eine Leptineinheit angefügt ist; 2) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextraneinheit an zwei Leptineinheiten angefügt ist; und 3) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei zwei Dextraneinheiten an zwei Leptineinheiten angefügt sind, wobei das Paar von Dextran-Leptin-Konjugaten aneinander angefügt ist. Bevorzugt enthalten die Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung vorherrschend 1) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextraneinheit an zwei Leptineinheiten angefügt ist; und 2) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei zwei Dextraneinheiten an zwei Leptineinheiten angefügt sind, wobei das Paar von Dextran-Leptin-Konjugaten aneinander angefügt ist.
Es wird gezeigt, daß die Leistungseigenschaften der Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung, die oben beschrieben wurden, durch Erhöhen des Grads an Derivatisierung (d. h. Anfügen zusätzlicher Dextraneinheiten an eine Leptineinheit) ohne einen nachteiligen Effekt auf das Anaphylaxie induzierende Potential verbessert werden können. Somit liegen Dextran-Leptin-Konjugate, wobei mehrere Dextraneinheiten an der Leptineinheit angefügt sind, innerhalb des Umfangs der Erfindung. Ein solches Mehrfach-Dextran-Leptin-Konjugat würde die gleichen wünschenswerten Eigenschaften, wie sie oben beschrieben wurden, zeigen.
In einer noch anderen Erscheinung betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die die vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Bevorzugt enthalten die vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzungen 1) ein Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextraneinheit an zwei Leptineinheiten angefügt ist; und 2) ein Dextran-Leptin-Konjugat, wobei zwei Dextran-Einheiten an zwei Leptineinheiten angefügt sind, wobei das Paar von Dextran-Leptin-Konjugaten aneinander angefügt ist. Eine besonders bevorzugte Dextraneinheit ist etwa 6kD, wie sie in den Dextran-Leptin-Konjugaten unten veranschaulicht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zum Herstellen von Dextran-Leptin-Konjugaten, wie sie oben umrissen wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Medikamente für die Behandlung von Individuen unter Verwendung von Dextran-Leptin-Konjugaten und Konjugatmischungen, wie sie oben umrissen wurden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist eine Endolys-C-Digestionspeptidaufzeichnungsspur von nicht modifiziertem rmetHu-Leptin ("Leptin") und Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugat ("Dextran-Leptin");
1B ist eine Endoasp-N-Digestionspeptidaufzeichnungsspur. Der Pfeil in jeder Spur bezeichnet das N-terminale Peptid von nicht modifiziertem rmetHu-Leptin.
2 zeigt ein 4-20 % Tris-Glycin-reduzierendes SDS-PAGE-Gradientengel, welche zeigt, daß ein beträchtlicher Anteil des 6 kD Dextran-Leptin-Konjugats dimerisiert ist. Spur 1 sind Molekulargewichtsstandards (Mark 12, Novex, San Diego, CA); Spur 2 ist nicht modifiziertes rmetHu-Leptin als Kontrolle; Spur 3 ist Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugat-Mischung; und Spur 4 ist Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugat nach Ionenaustauschchromatographie.
3 ist ein Graph, der Daten von Mäusen zeigt bezüglich des Umfangs an Gewichtsverlust relativ zu einer Pufferkontrolle gegenüber einer Dosis am Ende eines siebten Tages, mit einer täglichen Dosierungsstudie für (a) nicht modifiziertes rmetHu-Leptin ("Leptin"); und (b) N-terminales Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugat ("Dex-Leptin").
4 ist ein Graph, der Daten für Mäuse bezüglich des verzögerten Gewichtsverlusteffekts des 6 kD Dextran-Leptin-Konjugats verglichen mit nicht modifiziertem rmetHu-Leptin in einer Einzeldosisstudie zeigt. Der Gewichtsverlust wird als Gewichtsprozentverlust relativ zu einer Pufferkontrolle gegenüber der Zeit (Tage) gemessen.
5 zeigt Blutzirkulationszeiten für 6 kD Dextran-Leptin-Konjugat verglichen mit nicht modifiziertem rmetHu-Leptin in einer Einzeldosisstudie für Ratten.
5A zeigt intravenöse Injektionsdaten;
5B zeigt subkutane Injektionsdaten.
6 ist ein Graph, der Daten für Mäuse bezüglich des prozentualen Gewichtsverlusts relativ zu einer Pufferkontrolle gegen die Zeit am Ende eines siebten Tages zeigt, mit einer täglichen Dosierungsstudie für (a) nicht modifiziertes rmetHu-Leptin und (b) 17,5 kD Dextran-Leptin-Konjugat.
7 ist ein Graph, der Daten für Mäuse bezüglich des prozentualen Gewichtsverlusts relativ zu einer Pufferkontrolle gegen die Zeit in einer Einzeldosisstudie für (a) nicht modifiziertes rmetHu-Leptin und (b) 17,5 kD Dextran-Leptin-Konjugat zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Dextran-Leptin-Konjugate mit den Vorteilen einer verbesserten Wirksamkeit, längeren Plasmazirkulationszeit und keiner Nierenvakuolenbildung, unter anderem, bereit. Zusätzliche Vorteile der Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung schließen eine verbesserte Löslichkeit und minimale Injektionsstellenreaktionen ein.
Dextrane
Niedermolekulargewichtige Dextrane, die in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden, schließen Dextrane mit einem Molekulargewicht von 1 kD bis 20 kD, bevorzugter Dextrane mit einem Molekulargewicht in den Bereich von 1 kD bis 10 kD ein. Noch bevorzugter sind Dextrane mit einem Molekulargewicht von 1 kD bis 7 kD. Ein besonders bevorzugtes Dextran zur Erleichterung der kommerziellen Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Verwendung bei Menschen ist eines mit einem Molekulargewicht von etwa 6 kD. (Der Begriff "etwa" wird so verwendet, wie er in dem Abschnitt "Hintergrund" bezeichnet ist.) Im Durchschnitt ist ein Mol von 6 kD Dextran aus 33,3 Glucoseuntereinheiten zusammengesetzt.
Aus gleichen Gründen ist ferner unverzweigtes Dextran bevorzugt. "Natives" Dextran wird von Leuconostoc ssp. Bakterien erzeugt. "Klinisches" Dextran wird durch die Depolymerisierung von nativem Dextran hergestellt. Von Zeit zu Zeit können Dextraneinheiten hergestellt werden, so daß bestimmte Seitengruppen von Glucosemolekülen, die durch α1-3-Verknüpfungen verknüpft sind, gebildet werden. Die Bildung solcher Seitengruppen wird gewöhnlich als "Verzweigung" auf dem Fachgebiet bezeichnet. Obwohl es gegenwärtig nicht vollständig verstanden wird, können hochmolekulargewichtige Dextraneinheiten mit solchen Seitengruppen verstärkt dazu neigen, eine Anaphylaxie bei Menschen zu bewirken. Während man nicht an eine Theorie gebunden werden möchte, wird angenommen, daß es ein geringeres Potential für eine Verzweigung in niedermolekulargewichten Dextranen gibt, und insbesondere für ein mehrfaches Verzweigen, d. h. mehr als eine α1-3-Seitengruppe pro Dextranmolekül. Dies ist wichtig, da mehrfache Verzweigungen als verantwortlich für die Aggregation der vorgebildeten reaktiven Dextranantikörper auf Dextran angenommen werden, wodurch die Bildung von großen Immunkomplexen bewirkt wird. Daher sind für ein therapeutisches Produkt für Menschen bevorzugt die Dextraneinheiten für Zusammensetzungen, über die hier nachgedacht wird, solche mit vorherrschend α1-6-Verknüpfungen zwischen Glucoseuntereinheiten unter Minimierung von α1-3-Seitengruppen. Es ist gezeigt worden, daß klinisches Dextran, hergestellt von Leuconostoc Mesenteroiden-Stämmen NRRL B 512, anaphylaktische Reaktionen minimiert. Richter et al., supra.
Daher ist eine wichtige Eigenschaft der niedermolekulargewichtigen Dextrane, die in den Dextran-Leptin-Konjugaten der vorliegenden Erfindung verwendet werden, daß sie für Individuen mit hohem Titern von zirkulierendem, vorgebildetem DRA nicht anaphylaktisch sind.
Aktivierung von Dextran
Die Dextraneinheiten werden "aktiviert", so daß sie an die Leptinproteineinheit angefügt werden können. Solche Aktivierungsverfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und schließen unter anderem ein Einführen einer chemischen Einheit an das Dextran ein, welches eine Bindung mit einer chemischen Einheit bilden kann, die an dem Leptin-Protein vorhanden ist. Siehe im allgemeinen Larsen, Advanced Drug Delivery Reviews 3:103-54 (1989), die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Der Begriff "aktiviertes" Dextran bezieht sich auf Dextran, das mehrere reaktive Gruppen enthält. Die Art der "aktivierten" chemischen Einheit an dem Dextran wird von der Weise abhängen, auf welche jemand die Dextraneinheit an die Proteineinheit anknüpfen möchte. Beispielsweise kann man eine Aldehydgruppe an das Dextran anfügen, so daß die Dextraneinheit an die Leptineinheit unter reduzierenden Bedingungen angefügt werden kann, um eine Aminbindung zu bilden.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Aktivierung ist die Natriumperiodatoxidation. Das Dextran wird oxidiert, um mehrere Aldehydgruppen gemäß einer gut bekannten Vorgehensweise zu enthalten. Battersby et al., J. Contr. Rel. 42:143-56 (1996); Fagnani et al. (1990), supra, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Ein bevorzugtes Oxidationsverfahren ist in den Beispielen, infra., offenbart. Das Molverhältnis von Periodat zu Glucoseuntereinheit kann in Abhängigkeit von dem gewünschten Oxidationsgrad variieren. Im allgemeinen kann das Molverhältnis von Periodat zu Glucoseuntereinheit von etwa 0,02:1 bis etwa 3:1, bevorzugt von 0,1:1 bis etwa 1,5:1 variieren. Es wird angenommen, daß etwa 5 % bis etwa 50 % der Glucoseuntereinheiten des Dextrans oxidiert werden. Dieser Prozentanteil stellt einen Durchschnitt für die gesamte Reaktionsmischung dar, einzelne Dextraneinheiten können einen niedrigeren oder höheren Prozentanteil aufweisen. Es ist insbesondere bevorzugt, daß etwa 10 % der Glucoseuntereinheiten Aldehydgruppen enthalten. Der Begriff "oxidiertes" Dextran bezieht sich auf Dextran, das mehrere Aldehydgruppen enthält.
Anfügung von Dextran an das Leptinprotein
Die Dextraneinheiten sollten an die Leptineinheit unter Berücksichtigung von Effekten der funktionalen oder antigenen Domänen des Proteins angefügt werden. Das Verfahren zur Anfügung der Dextraneinheiten kann variieren, und es gibt eine Anzahl von Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet verfügbar sind. Beispielsweise kann Dextran kovalent an die Proteineinheit angebunden werden. Ein kovalentes Binden kann durch Aminosäurereste über eine reaktive Gruppe stattfinden, wie einer freien Amin- oder Carboxylgruppe. Aminosäurereste mit einer geeigneten Amingruppe können Lysinreste und den N-terminalen Aminosäurerest der Leptinproteineinheit einschließen. Solche Aminosäuren mit einer freien Carboxylgruppe können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest der Proteineinheit einschließen. Sulfhydrylgruppen können ebenfalls als eine reaktive Gruppe zur Anfügung der Dextraneinheit verwendet werden. Alternativ können reaktive Gruppen in die Proteineinheit beispielsweise durch Insertion oder ortsgerichtete Mutagenese eingeführt werden. Zur Vereinfachung der kommerziellen Herstellung ist eine Anfügung an eine Aminogruppe bevorzugt, wie eine Anfügung an das N-Ende der Proteineinheit.
Im allgemeinen kann das Aldehyd-aktivierte Dextran an die Leptineinheit unter reduzierenden Bedingungen angefügt werden, um eine Aminbindung zu bilden. Siehe Larsen, supra; Fagnini et at. (1990), supra; siehe ebenfalls PCT WO 96/11953. Das Molverhältnis von Dextraneinheiten zu Leptineinheiten kann von etwa 5:1 bis 100:1, bevorzugt etwa 20:1, reichen. Bevorzugt wird der pH-Wert der Reaktionsmischung bei oder oberhalb pH 4,8 gehalten, damit die Konjugation der oxidierten Dextraneinheit mit der Leptineinheit spezifisch für den N-terminalen Ort ist. Der pH-Wert sollte ausreichend sauer sein, so daß das aminoterminale Amin der Leptineinheit noch nicht protoniert wird und daher reaktiv ist, während die Amingruppen an anderen Positionen an der Leptineinheit protoniert werden, was sie unreaktiv macht.
Es wird angenommen, daß ein Fachmann auf dem Gebiet in der Lage ist, mehrfach reaktive Leptineinheiten durch Veränderung der Reaktionsparameter, wie ein Anheben des pH-Werts der Reaktionsmischung, unter Verwendung anderer vorhandener reaktiver Gruppen oder durch Einführen zusätzlicher reaktiver Gruppen an die Leptineinheit, wie oben offenbart, herzustellen. Ein Fachmann wird wissen, wie jedes der mehreren bekannten chemischen Konjugationsverfahren zu kombinieren ist, um mehrfach reaktive Leptineinheiten herzustellen.
Die Dextraneinheit kann ebenfalls an die Leptineinheit durch "Verknüpfungs"-Einheiten angefügt werden, ob chemische Verknüpfungsmittel, ebenfalls als "Vernetzungs"-Reagenzien bekannt, oder durch Aminosäuren verschiedener Längen. Solche chemischen Verknüpfungsmittel sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und schließen homobifunktionelle chemische Verknüfungsmittel (d. h. gleiche reaktive Gruppe an jedem Ende des Verknüpfungsmittels) und heterobifunktionelle chemische Verknüpfungsmittel (d. h. unterschiedliche reaktive Gruppen an jedem Ende des Verknüpfungsmittels) ein. Überlegungen über die Art der reaktiven Gruppen, die Länge zwischen reaktiven Enden und andere nützliche Merkmale der Verknüfungsmittel, z. B. eine innere metabolisierbare Bindung, die eine Spaltung der Dextraneinheit von der Leptineinheit ermöglichen würde, können die Wahl des chemischen Verknüpfungsmittels beeinflussen, wie es von einem Fachmann auf dem Gebiet gut verstanden wird. Siehe beispielsweise den Pierce Product Catalog, 1997 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) für eine Liste von Vernetzungsreagenzien und darin genannten Verweisen. Die chemischen Verknüpfungsmittel können an die Leptineinheit über irgendeine der oben in diesem Abschnitt offenbarten reaktiven Gruppen angefügt werden. Überlegungen über die Konformation, d. h. Flexibilität, und Größe des Peptids können die Wahl des Peptidverknüpfungsmittels beeinflussen, wie von einem Fachmann auf dem Gebiet gut verstanden wird. Beispielsweise, Neve et al., Cytokine 8:365-70 (1996); Hallewell et al., J. Biol. Chem. 264:5260-68 (1989); siehe im allgemeinen Chou & Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47:251-76 (1978). Aminosäureverknüpfungsmittelsequenzen können einschließen, sind jedoch nicht begrenzt auf:

(a) ala, ala, ala;
(b) ala, ala, ala; ala;
(c) ala, ala, ala; ala, ala;
(d) gly, gly;
(e) gly, gly, gly;
(f) gly, gly, gly, gly, gly;
(g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly;
(h) gly, pro, gly;
(i) gly, gly, pro, gly, gly; und
(j) irgendwelche Kombinationen von Unterteilen (a) bis (i).

Die Aminosäureverknüpfungsmittelsequenzen können entweder an dem N-Ende oder C-Ende der Leptineinheit durch Expression der Leptineinheit als ein Fusionsprotein angefügt werden.
Dextran-Leptin-Konjugate
Zusammensetzung von Dextran-Leptin-Konjugaten
Die Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung gut bekannter Verfahren auf dem Fachgebiet, wie SDS-PAGE-Analyse, Massenspektrometrie, RP-HPLC-Peptidanalyse und N-Endsequenzanalyse gekennzeichnet werden. Es ist gefunden worden, daß im allgemeinen wenigstens drei Spezies der N-terminalen Dextran-Leptin-Konjugate in der Reaktionsmischung vorliegen, nachdem Dextran an die Leptineinheit, wie oben beschrieben, angefügt worden ist. Die drei Spezies sind: 1) eine Dextraneinheit, die an eine Leptineinheit angefügt ist; 2) eine Dextraneinheit, die an zwei Leptineinheiten angefügt ist; und 3) zwei Dextraneinheiten, die an zwei Leptineinheiten angefügt sind. Es wird angenommen, daß die Zwei-Dextran-Zwei-Leptin-Spezies durch ein Paar von Dextran-Leptin-Konjugaten gebildet wird, die aneinander angefügt sind. Die letzten zwei Spezies machen typischerweise bis zu etwa 65-85 % der Reaktionsmischung aus, während die erste Spezies typischerweise für 5-10 % der Reaktionsmischung steht. Die verbleibenden geringeren Spezies erscheinen als nicht umgesetztes Leptin und als höhermolekulargewichtige Produkte in der SDS-PAGE-Analyse. Diese können aus der Mischung unter Verwendung bekannter Verfahren entfernt werden. Nach der Reinigung machen die zwei dimeren Spezies typischerweise bis zu etwa 70-90 % des Dextran-Leptin-Konjugats aus.
Es wird angenommen, daß, wenn man wünscht, die Neigung des Dextran-Leptin-Konjugats zu vermindern, um ein Dimer zu bilden, ein Fachmann auf dem Gebiet ein Leptinanalogon herstellen kann, wie infra diskutiert ist, das eine verminderte Tendenz in Richtung auf eine Dimerbildung aufweist.
Leptinproteine
Der Leptintyp, der für die vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate verwendet wird, kann aus solchen ausgewählt werden, die in der WO 96/05309 beschrieben werden, wie sie oben genannt ist und hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. 3 dieser Veröffentlichung (darin SEQ ID NO. 4 genannt) zeigt die vollständig deduzierte Aminosäuresequenz, die für menschliches Leptin erhalten wird (bezeichnet als das menschliche "OB"-Protein). Die Aminosäuren sind von 1 bis 167 numeriert. Eine Signalsequenzspaltungsstelle ist nach Aminosäure 21 (Ala) lokalisiert, so daß sich das reife Protein von Aminosäure 22 (Val) zu Aminosäure 167 (Cys) erstreckt. Für die vorliegende Offenbarung wird hierin eine unterschiedliche Numerierung verwendet, wo die Aminosäureposition 1 der Valinrest ist, welcher am Anfang des reifen Proteins liegt. Die Aminosäuresequenz für reifes, rekombinantes Methionylhumanleptin wird hierin als SEQ ID NO: 1 dargelegt, wobei die erste Aminosäure des reifen Proteins Valin (an Position 1) und ein Methionylrest an Position –1 (nicht in der unteren Sequenz eingeschlossen) lokalisiert ist.
Jedoch kann für jede der vorliegenden Leptineinheiten der Methionylrest an Position –1 nicht vorhanden sein.
Alternativ kann man eine natürliche Variante des Humanleptins verwenden, welche 145 Aminosäuren aufweist und, verglichen mit rmetHu-Leptin von SEQ ID NO: 1, kein Glutamin an Position 28 aufweist.
Generell wird die Leptineinheit zur pharmazeutischen Humanverwendung hierin für eine therapeutische Verwendung bei Menschen (siehe ebenfalls Tierleptine, unten) in der Lage sein. Daher kann man empirisch die Aktivität testen, um zu bestimmen, welche Leptineinheiten verwendet werden können. Wie in der WO 96/05309 dargelegt, können Leptinprotein in seiner nativen Form oder Fragmente (wie Enzymspaltungsprodukte) oder andere abgestutzte Formen und Analoga alle biologische Aktivität bewahren. Irgendeine solcher Formen kann als eine Leptineinheit für die vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate verwendet werden, obwohl solche veränderten Formen getestet werden sollten, um wünschenswerte Eigenschaften zu bestimmen. Siehe ebenfalls WO 96/40912, WO 97/06816, 97/18833, WO 97/38014, WO 98/08512 und WO 98/28427, die hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Man kann ein Analogon von rekombinantem Humanleptin durch Verändern der Aminosäurereste in der rekombinanten Humansequenz herstellen, wie durch Substituieren der Aminosäuren, die von der Mäusesequenz abweichen. Mäuseleptin ist im wesentlichen homolog zu Humanleptin, insbesondere als ein reife Protein, und, ferner, insbesondere an den N-Ende. Da das rekombinante Humanprotein biologische Aktivität bei Mäusen aufweist, würde ein solches Analogon wahrscheinlich bei Menschen aktiv sein. Beispielsweise kann man in der Aminosäuresequenz von nativem Humanleptin, wie es in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, eine oder mehrere der Aminosäuren an Positionen 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 101, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145 durch eine andere Aminosäure ersetzen. Man kann die Aminosäure an der entsprechenden Position des Mäuseproteins (siehe Zhang et al., 1994 supra) oder eine andere Aminosäure auswählen.
Man kann ferner "Übereinstimmungs"-Moleküle auf der Basis der OB-Rattenproteinsequenz herstellen. Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209:944-52 (1995), welche hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. OB-Rattenprotein unterscheidet sich von OB-Humanprotein an den folgenden Positionen (unter Verwendung der Numerierung von SEQ ID NO: 1): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 und 145. Man kann mit einer anderen Aminosäure eine odere mehrere der Aminosäuren an diesen abweichenden Positionen ersetzen. Die unterstrichenen Positionen sind solche, in denen das OB-Mäuseprotein ebenso wie das OB-Rattenproteien von dem OB-Human-Protein divergent sind und daher insbesondere für eine Veränderung geeignet sind. An einer oder mehreren der Positionen kann man eine Aminosäure aus dem entsprechenden OB-Rattenprotein oder eine andere Aminosäure ersetzen.
Die Positionen sowohl von OB-Ratten- als auch OB-Mäuseprotein, welche von dem reifen OB-Humanprotein abweichen, sind: 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145. Ein OB-Protein gemäß SEQ ID NO: 1 mit einer oder mehreren der obigen Aminosäuren, die mit einer anderen Aminosäure ersetzt sind, wie mit der Aminosäure, die in der entsprechenden Ratten- oder Mäusesequenz gefunden wird, kann ebenfalls wirksam sein.
Zuzätzlich sind die Aminosäuren, die in OB-Resusaffenprotein gefunden werden, welche von dem reifen OB-Humanprotein abweichen, die folgenden (mit Identitäten, die in Klammern in einer Aminosäureabkürzung mit einem Buchstaben bezeichnet sind): 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53 (Q), 60 (I) 66 (I), 67 (N), 68 (L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112 (D) und 118 (L). Da das rekombinante OB-Humanprotein bei Cynomolgusaffen aktiv ist, kann ein OB-Humanprotein gemäß SEQ ID NO: 1, das eine oder mehrere der divergenten Resusaffenaminosäuren ausgetauscht mit einer weiteren Aminosäure, wie den Aminosäuren in Klammern, aufweist, wirksam sein. Es sollte erwähnt werden, daß bestimmte divergente Resusaminosäuren ebenfalls solche sind, die in den obigen Maus- und Rattenspezies gefunden werden (Positionen 35, 68, 89, 100, 108 und 118). Somit kann man ein Maus/Ratten/Resus/Human-Übereinstimmungsmolekül (unter Verwendung der Numerierung von SEQ ID NO: 1) herstellen, wobei eine oder mehrere der Aminosäuren durch eine andere Aminosäure an Positionen: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145 ersetzt wird bzw. werden. Die unterstrichenen Positionen sind solche, bei denen alle drei Spezies von OB-Humanprotein abweichen. Ein besonders bevorzugtes Humanleptinanalogon ist eines, bei dem die Aminosäuren an Positionen 100 (Trp) oder 138 (Trp), und, noch bevorzugter, beide Positionen durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Gln, ersetzt sind.
Andere Analoga können hergestellt werden durch Entfernen eines Teils der Proteinaminosäuresequenz. Beispielsweise mangelt das reife Protein an einer Führungssequenz (–22 bis –1). Man kann die folgenden abgestutzten Formen von OB-Humanproteinmolekülen (unter Verwendung der Numerierung von SEQ ID NO: 1) herstellen:

(i) Aminosäuren 98-146;
(ii) Aminosäuren 1-99 und (daran angebunden) 112-146;
(iii) Aminosäuren 1-99 und (daran angebunden) 112-146, mit einer oder mehreren Aminosäuren 100-111, die sequentiell zwischen Aminosäuren 99 und 112 angeordnet sind.

Zusätzlich können die abgestutzen Formen ebenfalls eine oder mehrere der Aminosäuren geändert aufweisen, welche (in dem OB-Mäuse-, Ratten- oder Resus-Protein) von OB-Humanprotein abweichen. Ferner können jegliche Änderungen in der Form von geänderten Aminosäuren sein, wie von Peptidomimetika oder D-Aminosäuren.
Ebenfalls eingeschlossen sind solche Proteine, wie sie oben dargelegt wurden, mit Aminosäuresubstitutionen, welche "konservativ" gemäß Acidität, Ladung, Hydrophobie, Polarität, Größe oder irgendeiner anderen Eigenschaft, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, sind. Diese sind in Tabelle 1 unten dargelegt. Siehe im allgemeinen Creighton, Proteins, passim (W. H. Freeman and Company, N.Y., 1984); Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107 (1991), welche hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Tabelle 1 Konservative Aminosäuresubstitutionen
Daher können die vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate ausgewählt werden aus (gemäß der Aminosäuresequenz, wie sie hierin in SEQ ID NO: 1 dargestellt wird):

(a) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, optional fehlend ein Glutaminylrest an Position 28, und ferner optional mit einem Methionylrest an dem N-Ende;
(b) einer Aminosäuresequenz eines Unterteils (a) mit einer unterschiedlichen Aminosäure, die in einer oder mehreren der folgenden Positionen ersetzt ist: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145;
(c) einer Aminosäuresequenz von Unterteil (b), wobei die Aminosäuren an Positionen 100 und 138 mit Gln ersetzt sind;
(d) einem abgestutzten Leptin-Proteinanalogon, das ausgewählt ist aus: (i) Aminosäuren 98-146 (ii) Aminosäuren 1-99 und 112-146 (iii) Aminosäuren 1-99 und 112-146 mit einer oder mehreren Aminosäuren 100-111, die sequentiell zwischen Aminosäuren 99 und 112 angeordnet sind; und (iv) dem abgestutzten Leptinanalogon von Unterteil (i) mit einer oder mehreren Aminosäuren 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145, die mit einer anderen Aminosäure substituiert ist bzw. sind; (v) dem abgestutzten Leptinanalogon von Unterteil (iii) mit einer oder mehreren Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 und 145, die durch eine andere Aminosäure ersetzt ist bzw. sind; (vi) dem abgestutzten Leptinanalogon von Untereil (iv) mit einer oder mehreren Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145, die durch eine andere Aminosäure ersetzt ist bzw. sind; und (vii) dem abgestutzten Leptinanalogon von jedem der Unterteile (i) – (vi) mit einem N-terminalen Methionylrest;
(e) einem Leptinprotein jedes der Unterteile (a) – (d) mit einer oder mehreren aufrechterhaltenen Aminosäuresubstitutionen.

Leptinproteine, Analoga und verwandte Moleküle werden ebenfalls in den folgenden Veröffentlichungen genannt; jedoch gibt es keine Darstellung bezüglich der Aktivität irgendeiner genannten Zusammensetzung:
U.S.-Patent-Nummern: 5,521,283; 5,525,705; 5,532,336; 5,552,522; 5,552,523; 5,552,524, 5,554,727; 5,559,208; 5,563,243; 5,563,244; 5,563,245; 5,567,678; 5567,803; 5,569,743; 5,569,744; 5,574,133; 5,580,954; 5,594,101; 5,594,104; 5,605,886; 5,614,379; 5,691,309; 5,719,266 (Eli Lilly and Company);
PCT WO 96/23513; WO 96/23514; WO 96/23515; WO 96/23516; WO 96/23517; WO 96/23518; WO 96/23519; WO 96/23520; WO 96/23815; WO 96/27385; WO 96/34111; WO 96/37517; WO 97/00886; EP 725078 ; EP 725079 ; EP 744408 ; EP 745610 ; EP 835879 (Eli Lilly and Company);
PCT WO 96/22308 (Zymogenetics);
PCT WO 96/31526 (Amylin Pharmaceuticals, Inc.);
PCT WO 96/34885; WO 97/46585 (Smithkline Beecham PLC);
PCT WO 96/35787 (Chiron Corporation);
PCT WO 97/16550 (Bristol-Myers Squibb);
PCT WO 97/20933 (Schering Corporation)
EP 736599 (Takeda);
EP 741187 (F. Hoffman LaRoche).
In dem Ausmaß, in welchem diese Verweise geeignete Leptinproteine oder Analoga, oder assoziierte Zusammensetzungen oder Verfahren, bereitstellen, können solche Zusammensetzungen und/oder Verfahren in Verbindung mit den vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugaten, wie für eine Co-Verabreichung (zusammen oder getrennt, in einem ausgewählten Dosierungsplan) verwendet werden.
Insbesondere die folgenden Dextran-Leptin-Konjugate werden in Erwägung gezogen: Rekombinantes Humanleptin ("rHu-Leptin"), die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, optional unter Fehlen eines Glutaminylrests an Position 28 und ferner optional mit einem N-terminalen Methionylrest, angefügt an (a) eine Dextraneinheit einzig an dem N-Ende; oder (b) eine Dextraneinheit an dem N-Ende in Kombination mit zusätzlichen Dextraneinheiten an Positionen, welches andere sind als das N-Ende des Leptinproteins. Insbesondere können die Dextraneinheiten der vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate ein Molekulargewicht in dem Bereich von 1 kD bis 20 kD bevorzugt von 1 kD bis 10 kD, noch bevorzugter von 1 kD bis 7 kD und am bevorzugtesten mit einem Molekulargewicht von etwa 6 kD aufweisen. Ebenfalls bevorzugt in Erwägung gezogen wird ein Dextran-Leptin-Konjugat, das aus einer 6 kD Dextraneinheit, angefügt an das N-Ende an rmetHu-Leptin, hergestellt wird. Die Dextraneinheiten der vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate werden bevorzugt hergestellt aus einem Bakterienstamm, der α1-3-Verzweigung minimiert.
Ebenfalls besonders in Erwägung gezogen werden Dextran-Leptin-Konjugatmischungen, die die folgenden in irgendeiner Kombination umfassen:

(a) ein Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextraneinheit an eine Leptineinheit angefügt ist;
(b) ein Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextraneinheit an zwei Leptineinheiten angefügt ist; und
(c) ein Dextran-Leptin-Konjugat, wobei zwei Dextraneinheiten an zwei Leptineinheiten angefügt sind, wobei das Paar von Dextran-Leptin-Konjugaten aneinander angefügt ist; wobei die Dextraneinheit an dem N-Ende an der Leptineinheit mit der Aminiosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 angefügt ist, optional unter Fehlen eines Glutaminylrests an Position 28 und ferner optional mit einem Methionylrest an dem N-Ende.

Tierische Leptine
Zusätzlich zu dem obigen therapeutischen Humanleptin sind bestimmte tierische Leptine ebenfalls für eine therapeutische Verwendung beim Tier erhältlich. Hundeleptin ist in WO 97/32022 offenbart. Andere tierische Spezies sind in den folgenden Veröffentlichungen offenbart: WO 96/36644, EP 743321 (Schwein und Rind); WO 98/04288 (Rind); WO 98/04690 (Schwein).
Pharmazeutische Zusammensetzungen
In einer noch weiteren Erscheinung der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate und Medikamente unter Verwendung solcher pharmazeutischen Zusammensetzungen für therapeutische Verwendungen bereitgestellt. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Verabreichung über eine Bolus-Injektion oder durch Infusion (z. B. intravenös oder subkutan), oder für orale, pulmonale, nasale, transdermale oder andere Formen der Verabreichung sein. Im allgemeinen werden von der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen umfaßt, die wirksame Mengen an Dextran-Leptin-Konjugaten der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsverbesserern, Emulgatoren, Hilfsstoffen und/oder Trägern umfassen. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel von verschiedenem Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH-Wert und Ionenstärke; Additive, wie Detergenzien und Löslichkeitsmittel (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidationsmittel (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit, Konservierungsmittel (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Füllmittel (z. B. Lactose, Mannitol); eine Integration des Materials in partikelförmige Zubereitungen von polymeren Verbindungen, wie Polymilchsäure, Polyglykolsäure, etc. oder in Liposome ein. Siehe z. B. PCT WO 96/29989. Hylauronsäure kann ebenfalls verwendet werden, und dies kann die Wirkung einer erhöhten verzögerten Zirkulationdauer haben. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der in vivo-Freigabe und die Geschwindigkeit der in vivo-Clearance der vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate beeinflussen. Siehe z. B. Remington's, Pharmaceutical Sciences, 18th Auflage (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), Seiten 1435-1712. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form hergestellt werden, oder können getrocknetes Pulver, wie einer lyophilisierten Form, sein. Implantierbare Zubereitungen mit verzögerter Freisetzung werden ebenfalls in Erwägung gezogen, wie es transdermale Formulierungen sind.
In Erwägung gezogen werden orale Zubereitungen, wie sie in PCT WO 95/21629 beschrieben werden. Diese PCT-Veröffentlichung beschreibt eine orale Lieferung von chemisch modifizierten Proteinen, einschließlich von Proteinen, die durch Dextraneinheiten modifiziert sind. Die darin offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren sind hier anwendbar, um orale Lieferzubereitungen der vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate herzustellen.
Eine Lieferung der vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate über die Lunge wird ebenfalls in Erwägung gezogen, und Zusammensetzungen und Verfahren, die in PCT WO 94/20069 offenbart werden, sind für die Herstellung und Verwendung der vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate geeignet. WO 94/20069 offenbart die Lieferung über die Lunge von chemisch modifiziertem G-CSF.
Die Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung sollten am vorteilhaftesten in partikulärer Form mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von kleiner als 10 Mikrometer hergestellt werden, am bevorzugtesten 0,5 bis 5 Mikrometer, für die wirksamste Lieferung an die distale Lunge.
Eine nasale Lieferung der vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate wird ebenfalls in Erwägung gezogen. Eine nasale Lieferung ermöglicht den Durchgang des Proteins in den Blutstrom unmittelbar nach Verabreichung des therapeutischen Produkts in der Nase, ohne die Notwendigkeit zum Ablagern des Produkts in der Lunge. Zubereitungen für eine nasale Lieferung schließen solche mit Dextran oder Dextrin, wie Cyclodextrin, ein. Eine Lieferung über einen Transport über andere Schleimmembrane wird ebenfalls in Erwägung gezogen.
Dosierungen
Ein Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, wirksame Dosierungen durch Verabreichung und Beobachtung des gewünschten therapeutischen Effekts festzustellen.
Bevorzugt wird die Zubereitung des Konjugats so sein, daß zwischen 0,01 μg Leptineinheit/kg Körpergewicht/Tag und 10 mg Leptineinheit/kg Körpergewicht/Tag den gewünschten therapeutischen Effekt ergeben wird. Die wirksamen Dosierungen können unter Verwendung diagnostischer Werkzeuge über die Zeit bestimmt werden. Beispielsweise kann ein Diagnostikmittel zum Messen der Leptinmenge im Blut (oder Plasma oder Serum) zunächst verwendet werden, um endogene Gehalte des Leptinproteins zu bestimmen. Ein solches diagnostisches Werkzeug kann in der Form eines Antikörper-Assays, wie eines Antikörper-Sandwichassays, sein. Die Menge an endogenem Leptinprotein wird anfänglich quantifiziert, und eine Grundlinie wird bestimmt. Die therapeutischen Dosierungen werden als die Quantifizierung von endogener und exogener Leptinproteineinheit bestimmt (d. h. Protein, Analogon oder Derivat, das innerhalb des Körpers gefunden wird, entweder selbst erzeugt oder verabreicht) und wird über den Verlauf der Therapie fortgeführt. Die Dosierungen können daher über den Verlauf der Therapie variieren, mit beispielsweise einer relativ hohen Dosis, die anfänglich verabreicht wird, bis ein therapeutischer Nutzen erkannt wird, und geringeren Dosierungen, die verwendet werden, um den therapeutischen Nutzen zu erhalten.
Verwendungen
Therapeutisch
Therapeutische Verwendungen schließen Gewichtsmodulation, die Behandlung oder Vorbeugung von Diabetes, Blutfettreduktion (und Behandlung von verwandten Zuständen), Steigern der Magerkörpermasse und Steigern der Insulinsensitivität ein. Zusätzlich können die vorliegenden Zusammensetzungen zur Herstellung eines oder mehrerer Medikamente zur Behandlung oder Verbesserung der obigen Zustände verwendet werden.
Gewichtsmodulation
Die vorliegenden Zusammensetzungen können zur Gewichtsverminderung verwendet werden. Auf andere Weise betrachtet können die vorliegenden Zusammensetzungen zur Aufrechterhaltung eines gewünschten Gewichts oder eines Fettleibigkeitsgehalts verwendet werden. Wie in Mäusemodellen (siehe infra) demonstriert worden ist, resultiert eine Verabreichung der vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugate in einem Gewichtsverlust. Der Körpermassenverlust liegt hauptsächlich im Fettgewebe oder Fett. Ein solcher Gewichtsverlust kann mit der Behandlung von begleitenden Bedingungen verbunden sein, wie den untigen, und macht daher eine therapeutische Anwendung aus. Zusätzlich werden hierin kosmetische Verwendungen bereitgestellt, wenn eine Gewichtsmodulation lediglich zur Verbesserung des Aussehens dient.
Behandlung von Diabetes
Die vorliegenden Zusammensetzungen können bei der Vorbeugung oder Behandlung von Diabetes des Typs II verwendet werden. Da Diabetes des Typs II mit Fettleibigkeit in Beziehung gesetzt werden kann, kann die Verwendung der vorliegenden Erfindung, um Gewicht zu reduzieren (oder ein gewünschtes Gewicht zu erhalten oder ein Fettleibigkeitsniveau zu vermindern oder zu erhalten) ebenfalls die Entwicklung von Diabetes lindern oder verhindern. Sogar bei Abwesenheit von Dosierungen, die ausreichend sind, um in einem Gewichtsverlust zu resultieren, können die vorliegenden Zusammensetzungen verwendet werden, um Diabetes zu verhindern oder zu verbessern.
Blutlipidmodulation
Die vorliegenden Zusammensetzungen können bei der Modulation von Blutlipidniveaus verwendet werden. Hyperlipidämie (ebenfalls Lipämie; Dyslipidämie genannt) ist die Gegenwart einer abnormal großen Menge an Lipiden im zirkulierenden Blut. Idealerweise wird in Situationen, wo lediglich eine Verminderung der Blutlipidniveaus gewünscht wird, oder wo eine Aufrechterhaltung von Blutlipidniveaus gewünscht wird, die Dosierung unzureichend sein, um in einem Gewichtsverlust zu resultieren. Somit können während eines anfänglichen Therapieverlaufs eines Fettleibigkeitspatienten Dosierungen verabreicht werden, wodurch ein Gewichtsverlust und begleitend ein Absenken des Blutlipidniveaus erreicht wird. Sobald ein ausreichender Gewichtsverlust erreicht ist, kann eine Dosierung beispielsweise verabreicht werden, die ausreichend ist, um ein Wiedergewinnen an Gewicht zu vermeiden, jedoch ausreichend ist, um die gewünschten Blutlipidniveaus oder andere Bedingungen, die hierin dargelegt werden, zu erhalten. Diese Dosierungen können empirisch bestimmt werden, da die Effekte des Leptinproteins reversibel sind. Z. B. Campfield et al., Sciene 269: 546-549 (1995) auf 547. Wenn daher eine in einem Gewichtsverlust resultierende Dosierung beobachtet wird, wenn kein Gewichtsverlust gewünscht wird, würde man eine geringere Dosis verabreichen, um die gewünschten Blutlipidniveaus zu erreichen, jedoch das gewünschte Gewicht zu bewahren. Siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO 97/06816, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Steuern der Magermasse oder der Insulinsensitivität
Idealerweise wird in Situationen, wo lediglich eine Zunahme der Magerkörpermasse gewünscht wird, die Dosierung unzureichend sein, um in einem Gewichtsverlust zu resultieren. Daher können während eines anfänglichen Therapieverlaufs einer fettleibigen Person Dosierungen verabreicht werden, wobei ein Gewichtsverlust und begleitend eine Fettgewebeabnahme/Magermassenzunahme erreicht wird. Sobald ein ausreichender Gewichtsverlust erreicht ist, kann eine Dosierung verabreicht werden, die ausreichend ist, um ein Wiedergewinnen von Gewicht zu verhindern, jedoch ausreichend ist, um eine gewünschte Magermassenzunahme (oder Vermeidung einer Magermassenverringerung) zu bewahren. Zum Steigern der Sensitivität eines Individiums gegenüber Insulin können ähnliche Dosierungsüberlegungen in Betracht gezogen werden. Eine Magermassenzunahme ohne Gewichtsverlust kann in ausreichender Weise erreicht werden, um die Insulinmenge (oder potentiell Amylin, Amylinantagonisten oder -agonisten, oder Thiazolidindione oder andere potentielle Diabetesbehandlungsarzneimittel) zu senken, die einem Individium zur Behandlung von Diabetes verabreicht werden würde. Zum Anheben der Gesamtstärke können ähnliche Dosierungsüberlegungen angestellt werden. Eine Magermassenanhebung mit begleitender Anhebung der Gesamtstärke kann mit Dosierungen erreicht werden, die unzureichend sind, um in einem Gewichtsverlust zu resultieren. Andere Nutzen, wie eine Zunahme an roten Blutzellen (und eine Sauerstoffanreicherung in dem Blut) und eine Abnahme der Knochenresorption oder Osteoporose, können ebenfalls unter Abwesenheit eines Gewichtsverlusts erreicht werden. Siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO 97/18833.
Kombinationstherapie
Die vorliegenden Zusammensetzungen können in Verbindung mit anderen Therapien, wie abgeänderter Ernährungsweise und Bewegung, verwendet werden. Andere Medikamente, wie solche, die für die Behandlung von Diabetes geeignet sind (z. B. Insulin und möglicherweise Amylin, Antagonisten oder Agonisten derselben, Thiazolidindione (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO 98/08512, oder andere potentielle Diabetesbehandlungsarzneimittel), Cholesterol- und blutdrucksenkende Medikamente (wie solche, welche Blutlipidniveaus reduzieren, oder andere kardiovaskuläre Medikamente), aktivitätserhöhende Medikamente (z. B. Amphetamine), Diuretika (für Flüssigkeitseliminierung) und Appetitzügler (wie Agenzien, welche auf Neuropeptid-Y-Rezeptoren oder Serotoninwiederaufnahmeinhibitoren wirken). Eine solche Verabreichung kann gleichzeitig oder in seriatim sein. Zusätzlich können die vorliegenden Verfahren in Verbindung mit chirurgischen Vorgehensweisen verwendet werden, wie kosmetischen Operationen, die entwickelt werden, um das gesamte Aussehen eines Körpers zu verändern (z. B. Fettabsaugung oder Laseroperationen, die entwickelt wurden, um die Körpermasse zu reduzieren, oder Implantationsoperationen, die entwickelt wurden, um das Aussehen der Körpermasse zu steigern). Der Gesundheitsnutzen von Herzoperationen, wie Bypassoperationen oder anderen Operationen, die entwickelt wurden, um einen schädlichen Zustand, der durch Blockade von Blutgefäßen durch Fettabscheidungen, wie Arterienverstopfung, bewirkt wird, kann mit begleitender Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren gesteigert werden. Verfahren, um Gallensteine zu eliminieren, wie Ultraschall- oder Laserverfahren, können ebenfalls entweder vor, während oder nach einem Verlauf der vorliegenden therapeutischen Verfahren verwendet werden. Ferner können die vorliegenden Verfahren als ein Anhängsel für Operationen oder Therapien für gebrochene Knochen, beschädigte Muskeln oder andere Therapien verwendet werden, welche durch eine Steigerung der Magergewebemasse verbessert werden würden.
Verfahren zur Leptinherstellung
Die hierin verwendeten Leptineinheiten können in prokariotischen oder in eukariotischen Zellen hergestellt werden, obwohl für die in den Arbeitsbeispielen unten verwendeten Leptineinheiten Bakterien zur Erleichterung der kommerziellen Herstellung bevorzugt sind. Man kann ferner Leptin verwenden, das in Humanzellen hergestellt wurde, wie dasjenige, das durch Steuern eines nativen oder eingeführten Regulationselement hergestellt wird, welches die Regulierung eines endogenen Gens, das das gewünschte Protein kodiert, beeinflußt. Eine rekombinante Expression von Leptineinheiten, die in den Dextran-Leptin-Konjugaten in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, ist beispielsweise in WO 96/40912 beschrieben worden, einschließlich aller Vektoren und Wirtsstammabscheidungen, die darin genannt sind.
Reinigung von Konjugaten
Ausgewählte Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung können aus Dextran-Leptin-Konjugatmischungen unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren zum Reinigen von Proteinen isoliert werden. Eine Reinigungsvorgehensweise in einem Schritt kann auf einfache Weise erreicht werden durch Durchführen einer Kationenaustauschchromatographie. Siehe z. B. Ralph et al., Biochemistry 34:4889-97 (1995). Ein weiteres Reinigungsverfahren, das zum Reinigen der Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung geeignet ist, schließt hydrophobe Wechselwirkungschromatographie ein. Siehe z. B. Pharmacia Biotech's HiTrap HIC Test Kit Instructions, 71-7147-00, Herausgeber AF, auf 1-19 (1993); Uppsala, Schweden).
Der erste Beispielsatz unten zeigt mit 6 kD Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugat (1) die Aktivität; (2) die erhöhte Zirkulationszeit in vivo, verglichen mit nativem rmetHu-Leptin; (3) die erhöhte Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen (verglichen mit nativem rmetHu-Leptin); (4) das Fehlen an Injektionsstellenreaktionen; (5) eine minimale immunogene Ansprechung bei Primaten; und (6) den Mangel an Nierenvakuolisierung. Der zweite Beispielssatz unten zeigt einige der gleichen Leistungseigenschaften wie oben mit 17,5 kD Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugat.
BEISPIELE
Tiere
Versuchstiere, die in den folgenden Experimenten verwendet wurden, befanden sich zu fünft in einem Käfig für Mäuse und zu zweit in einem Käfig für Ratten; alle Tiere wurden ad libitum gefüttert. Ein zwölfstündiger Hell/Dunkel-Zyklus wurde während der Experimente aufrechterhalten. Die Tiere wurden gemäß akzeptierter Praktiken zur Pflege von Labortieren behandelt und gepflegt.
Verabreichung von Dextran-Leptin
Die Verabreichung von entweder einer Testzusammensetzung oder eines Placebos erfolgte durch subkutane Injektion ("s.c.") in das Rückengenick des Halses der Tiere oder intravenös durch einen Dauerkatheter in die Drosselvene ("i.v."). Alle Dosierungen des Dextran-Leptin-Konjugats wurden durch Bestimmen der Leptinproteinkonzentration des Konjugats berechnet.
Leptinprotein
Rekombinantes Methionylhumanleptin (rmetHu-Leptin) wurde für die vorliegenden Experimente verwendet.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines 6 kD Dextran-Leptin-Konjugats der vorliegenden Erfindung.
Aktivierung von Dextran
Sechs kD Dextran (Peak-Molekulargewicht 6 kD mit einer Polydispersität von etwa 1,77 kD) wurde von Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, NY) bezogen. Das Dextran wurde aktiviert, um Aldehydgruppen anzufügen. Kurz gesagt wurde 0,35 M Natriumperiodat langsam zu 10 mM Natriumtetraborat auf Eis zugegeben, und der pH-Wert wurde auf pH 3,0 eingestellt. Einhundertzwanzig Gramm 6 kD Dextran wurden zu 400 mL der obigen Lösung zugegeben und die Mischung wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Molverhältnis von Periodat zu Glucoseuntereinheit war 0,26:1. Unter fortgeführtem Rühren wurden 73,6 mL Ethylenglykol zugegeben und die Mischung für zusätzliche zwei Stunden gerührt. Das oxidierte Dextran wurde extensiv gegen destilliertes, deionisiertes H₂O dialysiert.
Sowohl vor als auch nach Aktivierung wurde das Dextran unter Verwendung von Gelpermeationschromatographie (GPC) getestet, um die Stabilität der Dextraneinheit zu bestätigen. Nach Aktivierung wurde die Anzahl an Aldehyden auf den aktivierten Dextraneinheiten unter Verwendung von Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannten Verfahren quantifiziert. Zhao & Heindel, Pharm. Res. 8:400-02 (1991). Andere Dextrane wurden untersucht und auf eine ähnliche Weise aktiviert.
Anfügung von Dextran an das Leptinprotein
Kurz gesagt wurde rmetHu-Leptin in einer Lösung mit einer Konzentration von etwa 1 mg/mL in 40 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,8, gebildet, welche mit 10 mg/mL oxidiertem Dextran, 40 mM Natriumacetatlösung, pH 4,8, vermischt wurde. Das endgültige Molverhältnis von Dextraneinheiten zu Leptineinheiten war 20:1. Die Mischung wurde auf einer rotierenden Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Eine 1 mg/mL Lösung von NaBH3CN in 40 mM Natriumacetat, pH 4,8, wurde mit einem Molverhältnis von NaBH3CN zu Dextran von 10:1 zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt und dann zu einem Kaltraum (4°C) zum fortführenden Rühren überführt. Das Dextran-Leptin-Konjugat wurde mit 10 mg/mL NaBH4 in 40 mM Natriumacetat, pH 4,8, bei einem Molverhältnis von NaBH4 zu oxidierten Glucoseeinheiten von 2,5:1 (10 % oder 3,3 Mol oxidierte Glucoseeinheiten/Mol 6 kD Dextran) behandelt. Die NaBH4-Lösung wurde tropfenweise zu der Mischung zugegeben, während auf Eis gerührt wurde.
Charakterisierung
Eine Bestimmung der Dextransubstitution der Konjugate wurde durchgeführt. Die Reinheit und das ungefähre Molekulargewicht der Dextran-Leptin-Konjugate wurde durch SDS-PAGE-Analyse bestimmt.
Es wurde bestimmt, daß die Bindung der aktivierten Aldehydgruppen der oxidierten Dextraneinheiten an dem N-Ende der Leptineinheiten angefügt wurde. Kurz gesagt wurde Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugat und unmodifiziertes rmetHu-Leptin durch Endoprotease an Lysinresten (EndoLys-C) bzw. Asparaginsäureresten (EndoAsp-N) in zwei getrennten Experimenten geschnitten. Proben wurden bei einem Enzym-Substrat-Verhältnis von 1:50 bzw. 1:75 bei 25°C für 8 bzw. 7 Std. biologisch abgebaut. Die resultierenden Peptidfragmente wurden durch RP-HPLC unter Verwendung einer YMC C-8-Säule (2,1 mm innerer Durchmesser) kartiert und unter Verwendung eines Gradienten von zwei Lösungsmitteln, Lösungsmittel A) 0,1 % TFA in Wasser von HPLC-Qualität und Lösungsmittel B) 0,1 % TFA in 90 % Acetonitril von HPLC-Qualität, mit den folgenden Konzentrationen eluiert: 5 Min. 100 % A; 80 Min. 90 % A, 10 % B; 5 Min. 50 %, A, 50 % B; 10 Min. 10 % A, 90 % B. Die Säule wurde bei 26°C gehalten und mit 0,2 mL/Min. eluiert. Ralph et al., supra. Verglichen mit nicht modifiziertem rmetHu-Leptin zeigte die Peptidkartierung des Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugats mit Endolys-C-Abbau (1A), daß ein einzelner Peak nach etwa 14 Minuten verschwand. In ähnlicher Weise zeigte eine Peptidkartierung mit Endoasp-N-Abbau (1B), daß ein einzelner Peak nach etwa 16 Min. verschwand. Diese Peptide aus dem nicht modifziertem rmetHu-Leptin waren N-terminal sequenziert zur Identifizierung und es wurde bestätigt, daß dies die N-terminalen Peptide waren, die durch die Proteaseabbauten erzeugt wurden. Daher war die Anfügung der Dextraneinheit an die Leptineinheit für die N-terminalen Peptide selektiv. Ferner zeigte ein N-terminales Sequenzieren etwa 98,6 % blockiertes N-Ende, was anzeigt, daß das Dextran an dem N-Ende von rmetHu-Leptin konjugiert war.
Ferner wurde durch SDS-PAGE-Analyse bestimmt, daß die Neigung der Reaktion in Richtung auf eine Dimerbildung, d. h. die Anfügung einer Dextraneinheit an zwei Leptineinheiten oder zwei Dextraneinheiten an zwei Leptineinheiten, getrieben wurde. Wie in 2 zu erkennen ist, stellt sich ein beträchtlicher Anteil des Dextran-Leptin-Konjugats selbst in dimerer Bildung (Spur 3 ist Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugatmischung) dar. Es ist durch Delayed Extraction-MALDI-TOF-Massenspektrometrie unter Vewendung von Sinapinsäure (sinapinic acid) als Matrix bestimmt worden, daß die Hauptbande von Spur 3 aus beiden dimeren Species (d. h. eine Dextraneinheit – zwei Leptineinheiten, zwei Dextraneinheiten – zwei Leptineinheiten) besteht. Nicht reagiertes rmetHu-Leptin und einige der höher molekulargewichtigen Species, die in geringeren Mengen gebildet werden, wurden aus dem Hauptteil der dimeren Konjugate und der Minderzahl der monomeren Konjugate durch Ionenaustauschchromatographie entfernt (Spur 4 zeigt Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugat nach Ionenaustauschchromatographie).
Beispiel 2
Dieses Beispiel demonstriert die verbesserte Wirksamkeit der 6 kD Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung gegenüber nicht modifiziertem rmetHu-Leptin. Das Dextran-Leptin-Konjugat aus Beispiel 1 wurde bezüglich der Wirksamkeit zum Induzieren eines Gewichtsverlusts in normalen Mäusen getestet.
In normale weibliche C57BL/6-Mäuse (Charles River Laboratories, Wilmington MA), Alter 8 bis 8 Wochen und mit einem Gewicht von etwa 20 Gramm, wurde täglich für 7 Tage entweder das vorliegende Dextran-Leptin-Konjugat (wie in Beispiel 1 oben beschrieben), nicht modifiziertes Leptin oder Placebo (Phosphat gepufferte Salzlösung, "PBS") injiziert. Dosierungen von 1 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg und 100 mg/kg wurden sowohl für das Dextran-Leptin-Konjugat als auch das nicht modifizierte Leptin getestet. Die Gewichte wurden während der gesamten Studie überwacht.
Die Gewichtsveränderung am Ende der Studie (Tag 7) für die mit dem Dextran-Leptin-Konjugat behandelte Gruppe wurde mit dem für die nicht mit modifiziertem Leptin behandelte Gruppe verglichen. Der Gewichtsverlust wurde als der Umfang des Gewichtsverlusts relativ zu einer Pufferkontrolle ((Gew. Puffergruppe -Gew.-Probengruppe)/Gew. Puffergruppe × 100) berechnet. Die Wirksamkeit des Dextran-Leptin-Konjugats war beträchtlich größer als diejenige für das nicht modifizierte Leptin bei den Dosierungen von 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg und 100 mg/kg. Ferner wurde eine Dosisansprechung für das Dextran-Leptin-Konjugat beobachtet. Der prozentuale Gewichtsverlust am Ende der Studie relativ zu der PBS-Pufferkontrolle wurde gegen die Dosis in mg/kg sowohl für das Dextran-Leptin-Konjugat als auch das nicht modifizierte Leptin aufgetragen. Wie in 3 gezeigt ist, kann man durch Anpassen der Daten an einfache logarithmische Kurven und unter der Annahme einer ED₅₀ (Dosis, die erforderlich ist, um 50 %igen maximalen Gewichtsverlust zu erreichen), um 7 % Gewichtsverlust zu ergeben, die ED₅₀-Werte für das Dextran-Leptin-Konjugat und das nicht modifizierte Leptin auf 4 mg/kg bzw. 20 mg/kg annähern. Somit demonstrieren die Daten, daß das Dextran-Leptin-Konjugat der vorliegenden Erfindung ungefähr 5 mal wirksamer ist als nicht modifiziertes Leptin.
Beispiel 3
Dieses Beispiel demonstriert die verzögerte Gewichtsverlustwirkung der 6 kD Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung. In normale weibliche C57BL/6 Mäuse, Alter 8-10 Wochen und mit einem Gewicht von etwa 20 Gramm, wurden lediglich am Tag 0 eine Dosis von 100 mg/kg mit entweder einem Dextran-Leptin-Konjugat oder einem nicht modifizierten Leptin s.c.-injiziert. Wie in 4 erkannt wird, dauerte der Gewichtsverlusteffekt des Dextran-Leptin-Konjugats 4-5 Tage mit einer zweifachen Zunahme im Peak-Gewichtsverlust, wohingegen der Gewichtsverlusteffekt des nicht modifizierten Leptins lediglich 1-2 Tage dauerte.
Pharmakokinetische Studien bei Ratten zeigten, daß das Dextran-Leptin-Konjugat im Blut wesentlich länger als das nicht modifizierte Leptin bestand. Katheterisierte männliche Wistar Kyoto-Ratten mit einem Gewicht von 200-500 Gramm wurden mit einer einzelnen Dosis von 10 mg/kg des vorliegenden Dextran-Leptin-Konjugats (wie in Beispiel 1 oben beschrieben) oder mit nicht modifiziertem Leptin, entweder s.c. oder intravenös ("i.v.") injiziert. Nach bestimmten Zeitintervallen nach der Injektion wurden Blutproben über den Dauerkatheter abgenommen. Wie in 5A erkannt wird, bestand das Dextran-Leptin-Konjugat, das i. v.-injiziert wurde, in dem Blut für 72 Std. nach der Injektion, wohingegen das nicht modifizierte Leptin vollständig nach etwa 8-12 Std. nach der Injektion aufgeklärt war. Obwohl beide Moleküle eine biphasische Clearance zeigten, wurden sowohl die anfängliche Phasenhalbwertszeit und insbesondere die terminale Phasenhalbwertszeit für das Dextran-Leptin-Konjugat beträchtlich angehoben, was anzeigt, daß das konjugierte Dextran die Clearance des Leptin-Proteins aus dem Blutstrom verlangsamt. Somit wurde die Plasmazirkulationszeit in vivo des Dextran-Leptin-Konjugats verglichen mit der Zirkulationszeit des nicht modifizierten rmethHu-Leptins verlängert.
In ähnlicher Weise bestand das s.c.-injizierte Dextran-Leptin-Konjugat in dem Blut für 96 Stunden nach der Injektion, wohingegen das nicht modifizierte Leptin eine verhältnismäßig schnellere Clearance von etwa 18-24 Stunden nach der Injektion aufwies, wie in 5B erkannt wird.
Beispiel 4
Dieses Beispiel demonstriert die erhöhte Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen der 6 kD Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung, verglichen mit nicht modifiziertem rmetHu-Leptin. Proben des Dextran-Leptin-Konjugats und des nicht modifizierten Leptins wurden nach der Proteinreinigung genommen. Die Proben wurden über Nacht bei 4°C in Dulbecco's PBS, pH 7, dialysiert. Eine verdünnte Lösung von jedem des nicht modifizierten rmetHu-Leptins und des Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugats (etwa 1-2 mg/mL Leptinprotein) wurde unter Verwendung eines Amicon Centriprep^TM 10 (Beverley, MA) Konzentrationssystems konzentriert. Die Proben wurden in wiederholten Cyklen von abnehmender Dauer bei 4°C, 3.400 rpm, zentrifugiert, bis ein Volumen von etwa 0,5 mL erhalten wurde. Die Proteinkonzentration wurde dreifach durch die Bradford-Untersuchung bestimmt. Anal. Biochem. 72:248-54 (1976), unter Verwendung von BioRad-Reagenzien (Hercules, CA). Während die nicht modifizierte rmetHu-Leptin-Lösung begann, die Proteinausfällung bei etwa 2-3 mg/mL in PBS bei neutralem pH-Wert zu zeigen, war das Dextran-Leptin-Konjugat noch bei 80 mg/mL löslich. Bei noch höheren Konzentrationen wurde die Dextran-Leptin-Konjugatlösung schwierig zu handhaben. Wie von einem Fachmann auf dem Gebiet gut verstanden wird, können Parameter, wie Puffersystem, Temperatur, oberflächenaktive Mittel und Ionenstärke, eingestellt werden, um Löslichkeitsbedingungen zu optimieren.
Beispiel 5
Dieses Beispiel demonstriert die minimalen Injektionsstellenreaktionen der 6 kD Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung. Normale weibliche C57BL/6 Mäuse (3 Mäuse pro Gruppe) wurden einmal täglich für 7 Tage mit einer Dosis von entweder 25 mg/kg oder 100 mg/kg (Konzentrationen von 5 mg/mL bzw. 20 mg/mL) mit dem Dextran-Leptin-Konjugat (in PBS, pH 7,1), wie in Beispiel 1 hergestellt, und mit nicht modifiziertem rmetHu-Leptin (in 10 mM Natriumacetatpuffer, 5 % Sorbitol, pH 4,0) injiziert. Injektionsstellenproben wurden am achten Tag genommen. Die Injektionsstellen der Tiere wurden für mehrere histopathologische Parameter analysiert: Nekrose, Entzündung (mononuklear gegenüber eiternd), ausgefälltes Leptin, Fibroplasien und Riesenzellen. Basierend auf einer solchen Einstufung wurde das Dextran-Leptin-Konjugat sehr gut an der Injektionsstelle toleriert, sogar wenn es mit einer Konzentration von 20 mg/mL injiziert wurde. Es gab kein Anzeichen einer Leptinausfällung und keine Nekrose des Gewebes um die Injektionsstelle. Verglichen mit nicht modifziertem Leptin wurde die Injektionsstellenreaktion sehr gut bei Konzentrationen von höher als der klinisch annehmbaren Konzentration von nicht modifiziertem Leptin toleriert. Die obere Konzentrationsgrenze für annehmbare Injektionsstellenreaktionen des Dextran-Leptin-Konjugats ist noch nicht bestimmt worden.
Beispiel 6
Dieses Beispiel demonstriert das Fehlen einer immunogenen Ansprechung in Primaten auf die 6 kD Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung. Schimpansen wurden für 4 Wochen dreimal pro Woche mit einer s. c.-Injektion von 0,1 mg/kg 6 kD Dextran-Leptin- Konjugat, wie in Beispiel 1 hergestellt, behandelt, und die Schimpansenseren wurden durch ELISA analysiert. Wenig oder keine IgG- oder IgM-Ansprechung auf das Dextran-Leptin-Konjugat wurde beobachtet. Ein hoher Hintergrundantikörpergehalt wurde beobachtet und daher wurden Inhibierungsstudien durchgeführt, um zu bestimmen, ob diese Antikörper gegenüber Dextran (6 kD oder 70 kD), das 6 kD Dextran-Leptin-Konjugat oder das Leptinprotein selbst reaktiv waren. Inhibierungsstudien mit Vorblutproben und Proben am Ende der Studie (Tag 29) zeigten keine wesentlichen Unterschiede in der Inhibierung, was anzeigt, daß die Antikörperreaktivität in Richtung auf vorgebildete Antikörper gerichtet war. Insbesondere zeigte das 70 kD Dextran eine vollständige Inhibierung, während das 6 kD Dextran eine teilweise Inhibierung zeigte. Ferner zeigte das Dextran-Leptin-Konjugat ebenfalls eine vollständige Inhibierung, während das nicht modifizierte Leptinprotein alleine keine Inhibierung zeigte. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die Antikörperaktivität gegen das Dextran gerichtet wurde. Am wahrscheinlichsten wurden Epitope des verzweigten Dextrans (70 kD) getroffen. Die Ergebnisse zeigten klar, daß keine Antikörperaktivität auf das Leptinprotein selbst gerichtete wurde.
Beispiel 7
Dieses Beispiel demonstriert das Fehlen einer Nierenvakuolenbildung für die 6 kD Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung verglichen mit wasserlöslichen Polymerkonjugaten aus dem Stand der Technik, wie Monopolyethylenglykol-Leptin-Konjugaten. Kurz gesagt wurden Mäuse (3 pro Gruppe) einmal täglich für 7 Tage mit einer Dosis von etwa 1 mg/kg oder 10 mg/kg mit dem 6 kD Dextran-Leptin-Konjugat, wie in Beispiel 1 hergestellt, und nicht modifiziertem rmetHu-Leptin injiziert. Die Proben wurden am achten Tag gesammelt. Röhrenförmige Vakuolenbildung wurde erzielt. Es gab keine Induktion für eine Nierenvakuolenbildung mit dem Dextran-Leptin-Konjugat bei jeder Dosis. Die histophatologischen Erkenntnisse waren mit denen vergleichbar, die für nicht modifiziertes Leptin gesehen werden. Im Gegensatz dazu induzierte monopegyliertes Leptin mit 1 mg/kg und 10 mg/kg Dosierungen schwache, bzw. markante Vakuolenbildung, unter den gleichen Bedingungen.
Beispiel 8
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung und die Gewichtsverlusteigenschaften eines weiteren Dextran-Leptin-Konjugats der vorliegenden Erfindung. Das Dextran-Leptin-Konjugat wurde gemäß der Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß 17,5 kD Dextran anstelle von 6 kD verwendet wurde. Das 17,5 kD wurde von Fluka Chemical Corp. bezogen.
Das 17,5 kD Dextran-Leptin-Konjugat wurde hinsichtlich der Wirksamkeit beim Induzieren eines Gewichtsverlusts in normalen Mäusen getestet. Normale weibliche C57BL/6 Mäuse, Alter 8-10 Wochen und mit einem Gewicht von etwa 20 Gramm, wurden täglich 7 Tage mit entweder dem vorliegenden 17,5 kD Dextran-Leptin-Konjugat, nicht modifiziertem rmetHu-Leptin oder Placebo (Phospat gepufferte Salzlösung, "PBS") injiziert. Eine 10 mg/kg Dosierung wurde sowohl für das 17,5 kD Dextran-Leptin-Konjugat als auch das nicht modifizierte Leptin getestet. Die Gewichte wurden während der gesamten Studie überwacht.
Die Gewichtsveränderung während des Verlaufs der Studie für die mit dem 17,5 kD Dextran-Leptin-Konjugat behandelte Gruppe wurde mit derjenigen für die mit nicht modifiziertem Leptin behandelte Gruppe verglichen. Wie in 6 erkannt wird, ist die Wirksamkeit des Dextran-Leptin-Konjugats größer als diejenige für das nicht modifizierte Leptin bei der 10 mg/kg Dosierung.
Der verzögerte Gewichtsverlusteffekt des 17,5 kD Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugats wurde ebenfalls getestet. Mäuse wurden lediglich am Tag 0 mit einer Dosis von 100 mg/kg mit entweder 17,5 kD Dextran-rmetHu-Leptin-Konjugat oder nicht modifiziertem rmetHu-Leptin s.c.-injiziert. Wie in 7 erkannt wird, dauerte der Gewichtsverlusteffekt des Dextran-Leptin-Konjugats 5-6 Tage mit einer eineinhalbfachen Zunahme des Peakgewichtverlusts, wohingegen der Gewichtsverlusteffekt des nicht modifizierten Leptins lediglich 3-4 Tage dauerte.
Somit zeigt dieses Beispiel die verbesserte Wirksamkeit des 17,5 kD Dextran-Leptin-Konjugats der vorliegenden Erfindung gegenüber nicht modifiziertem rmetHu-Leptin bezüglich eines Gewichtsverlusts.
Beispiel 9
Dieses Beispiel demonstriert das Fehlen einer Nierenvakuolisierungsbildung für die 17,5 kD Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung verglichen mit den wasserlöslichen Polymerkonjugaten aus dem Stand der Technik, wie Monopolyethylenglykol-Leptin-Konjugate. Mäuse wurden mit einer Dosis von entweder 1 mg/kg oder 10 mg/kg mit dem 17,5 kD Dextran-Leptin-Konjugat oder nicht modifiziertem rmetHu-Leptin gemäß der Vorgehensweisen aus Beispiel 7 injiziert. Es gab keine Induktion einer Nierenvakuolenbildung mit dem 17,5 kD Dextran-Leptin-Konjugat bei jeder Dosis. Die histopathologischen Erkenntnisse waren mit denjenigen vergleichbar, die für das nicht modifierte Leptin gesehen wurden.
Beispiel 10
Dieses Beispiel veranschaulicht das Fehlen einer Ansprechung der Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung auf Humanantikörpern von Individuen, die für anaphylaktische Reaktionen mit Dextran empfänglich sind. Experimente wurden durchgeführt, um zu zeigen, daß die Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung für Individuen mit hohen Titern von zirkulierenden, vorgebildeten, Dextran reaktiven Antikörpern nicht anaphylaktisch sind.
Seren werden von Patienten mit hohen Titern von zirkulierendem, vorgebildetem DRA gesammelt, welche anaphylaktische Reaktionen (ARs) variierender Schwere erfahren haben. Seren von normalen Individuen wurden ebenfalls als Kontrollen gesammelt.
In vitro-Testen:
In vitro-Testen für eine DRA-Reaktivität schließt bekannte Verfahren ein, wie eine passive Hämagglutination. Siehe z. B. Hedin et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 52:145-49 (1976), die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Es ist gezeigt worden, daß der Titer an DRA positiv mit dem Schweregrad der ARs verbunden ist. Richter et al., supra, bei 134-35.
Beispielsweise werden Seren von Dextranreaktoren in einer passiven Hämagglutinationsuntersuchung getestet, um zu bestimmen, um DRA-reaktive Seren mit den Dextran-Leptin-Konjugaten der vorliegenden Erfindung reagieren. Kurz gesagt werden Erythrozyten, auf denen Dextran-Leptin-Konjugate der vorliegenden Erfindung auf deren Oberfläche absorbiert worden waren, ebenso wie Erythrozyten, die mit nicht modifiziertem Leptin und niedermolekulargewichtigem Dextran, getrennt, als negative Kontrollen und 70 kD Dextran als eine positive Kontrolle, mit DRA-Seren inkubiert und dann die Erythrozyten für Anzeichen einer Agglutination beobachtet. Keine Agglutination der Erythrozyten findet statt, da das DRA-Serum eine verminderte Affinität für die niedermolekulargewichtigen Dextrane aufweist, die in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden, und/oder die niedermolekulargewichtigen Dextrane bewirken keine Antikörperaggregation und die Kaskadeneffekte.
In vivo-Testen:
Alternativ wurden Tierversuche durchgeführt, um eine DRA-Reaktivität mit den niedermolekulargewichtigen Dextran-Leptin-Konjugaten der vorliegenden Erfindung zu bestimmen. Die Tiere wurden zunächst unter Verwendung eines für Dextran quer reaktiven Serums und/oder eines Antiserums gegenüber hochmolekulargewichtigen Dextran (z. B. 70 kD Dextran) mit einer Dosis, die ausreichend ist, um Anaphylaxie auszulösen, sensibilisiert. Als nächstes werden die Tiere mit einem Dextran-Leptin-Konjugat der vorliegenden Erfindung konfrontiert. Die Tiere werden für irgendwelche Anzeichen von anaphylaktischen Reaktionen, wie Hautmanifestationen, einem schnellem Abfall des Blutdrucks, Atemleiden, Herzstillstand, etc., beobachtet. Keine Anzeichen von anaphylaktischen Reaktionen werden beobachtet, da die vorgebildeten DRAs nicht reaktiv mit den niedermolekulargewichtigen Dextranen sind, die in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden.

Claims

Dextran-Leptin-Konjugat, welches wenigstens eine niedermolekulargewichtige Dextran-Einheit umfaßt, die an wenigstens eine Leptin-Einheit angefügt ist, wobei die Dextran-Einheit ein Molekulargewicht von 1 kD bis 20 kD aufweist.
Dextran-Leptin-Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dextran-Einheit ein Molekulargewicht von 1 kD bis 10 kD aufweist.
Dextran-Leptin-Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Dextran-Einheit ein Molekulargewicht von 1 kD bis 7 kD aufweist.
Dextran-Leptin-Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dextran-Einheit ein Molekulargewicht von etwa 6 kD aufweist.
Dextran-Leptin-Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Dextran-Einheit an einer oder mehreren Leptin-Einheiten angefügt ist.
Dextran-Leptin-Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei Dextran-Einheiten an einer oder mehreren Leptin-Einheiten angefügt sind.
Dextran-Leptin-Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Dextran-Einheiten an einer Leptin-Einheit angefügt sind.
Dextran-Leptin-Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Leptin-Einheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (gemäß der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1): (a) der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, optional unter Fehlen eines Glutaminylrests an Position 28 und weiter optional mit einem Methionylrest an dem N-Ende; (b) einer Aminosäuresequenz von Unterteil (a) mit einer unterschiedlichen Aminosäure, die an einer oder mehreren der folgenden Positionen substituiert ist: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145; (c) einer Aminosäuresequenz von Unterteil (b), wobei die Aminosäuren an Positionen 100 und 138 mit Gln substituiert sind; (d) einem abgestutzten Leptin-Proteinanalogon, das ausgewählt ist aus: (i) Aminosäuren 98-146 (ii) Aminosäuren 1-99 und 112-146 (iii) Aminosäuren 1-99 und 112-146 mit einer oder mehreren Aminosäuren 100-111, die sequentiell zwischen Aminosäuren 99 und 112 angeordnet sind; und (iv) dem abgestutzten Leptinanalogon von Unterteil (i) mit einer oder mehreren Aminosäuren 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145, die mit einer anderen Aminosäure substituiert ist bzw. sind; (v) dem abgestutzten Leptinanalogon von Unterteil (iii) mit einer oder mehreren Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 und 145, die durch eine andere Aminosäure ersetzt ist bzw. sind; (vi) dem abgestutzten Leptinanalogon von Unterteil von (iv) mit einer oder mehreren Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145, die durch eine andere Aminosäure ersetzt ist bzw. sind; und (vii) dem abgestutzten Leptinanalogon von jedem der Unterteile (i) – (vi) mit einem N-terminalen Methionylrest; (e) einem Leptin-Protein jedes der Unterteile (a) – (d) mit einer oder mehreren aufrechterhaltenen Aminosäuresubstitutionen.
Dextrin-Leptin-Konjugatmischung, welche die folgenden in irgendeiner Kombination umfaßt: (a) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextran-Einheit an einer Leptin-Einheit angefügt ist; (b) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextran-Einheit an zwei oder mehreren Leptin-Einheiten angefügt ist; (c) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei wenigstens zwei Dextran-Einheiten an einer Leptin-Einheit angefügt sind; und (d) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei wenigstens zwei Dextran-Einheiten an wenigstens zwei Leptin-Einheiten angefügt sind.
Dextran-Leptin-Konjugatmischung nach Anspruch 9, welche die folgenden in irgendeiner Kombination umfaßt: (a) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextran-Einheit an einer Leptin-Einheit angefügt ist; (b) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextran-Einheit an zwei Leptin-Einheiten angefügt ist; und (c) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei zwei Dextran-Einheiten an zwei Leptin-Einheiten angefügt sind, wobei das Paar von Dextran-Leptin-Konjugaten aneinander angefügt ist.
Dextran-Leptin-Konjugatmischung nach Anspruch 10, die vorherrschend besteht aus: (a) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextran-Einheit an zwei Leptin-Einheiten angefügt ist; und (b) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei zwei Dextran-Einheiten an zwei Leptin-Einheiten angefügt sind, wobei das Paar von Dextran-Leptin-Konjugaten aneinander angefügt ist.
Dextran-Leptin-Konjugat, welches durch das Verfahren hergestellt wird, welches umfaßt: (a) Aktivieren einer Dextran-Einheit mit einem Molekulargewicht von 1 kD bis 20 kD; (b) Anfügen der aktivierten Dextran-Einheit an einer Leptin-Einheit unter reduzierenden Bedingungen, um eine Aminbindung zu bilden, bei einem pH-Wert, der ausreichend sauer ist, so daß das Amino-terminale Amin noch nicht protoniert wird, während die Amingruppen an anderen Positionen an dem Leptinprotein protoniert werden; (c) Erhalten des Dextran-Leptin-Konjugats; und (d) optional Reinigen des Dextran-Leptin-Konjugats.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Dextran-Leptin-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Dextran-Leptin-Konjugatmischung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Individuums für einen Zustand, der ausgewählt ist unter: Fettleibigkeit, Diabetes und Hyperlipidämie, wobei die Zusammensetzung umfaßt: eine wirksame Menge eines Dextran-Leptin-Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Individuums für einen Zustand, der ausgewählt ist unter: Fettleibigkeit, Diabetes und Hyperlipidämie, wobei die Zusammensetzung umfaßt: eine wirksame Menge einer Dextran-Leptin-Konjugatmischung nach einem der Ansprüche 9 bis 11.
Dextran-Leptin-Konjugat, welches wenigstens eine Dextran-Einheit mit einem Molekulargewicht von 1 kD bis 20 kD umfaßt, angefügt an dem N-Ende an wenigstens einer Leptin-Einheit mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, optional unter Fehlen eines Glutaminylrests an Position 28 und ferner optional mit einem Methionylrest an dem N-Ende.
Dextran-Leptin-Konjugat nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Dextran-Einheit ein Molekulargewicht von etwa 6 kD aufweist.
Dextran-Leptin-Konjugatmischung, welche die folgenden in irgendeiner Kombination umfaßt: (a) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextran-Einheit an einer Leptin-Einheit angefügt ist; (b) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextran-Einheit an zwei Leptin-Einheiten angefügt ist; und (c) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei zwei Dextran-Einheiten an zwei Leptin-Einheiten angefügt sind, wobei das Paar von Dextran-Leptin-Konjugaten aneinander angefügt ist; wobei die Dextran-Einheit des Dextran-Leptin-Konjugats ein Molekulargewicht von 1 kD bis 20 kD aufweist und an dem N-Ende an der Leptin-Einheit mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 angefügt ist, optional unter Fehlen eines Glutaminylrests an Position 28 und ferner optional mit einem Methionylrest an dem N-Ende.
Dextran-Leptin-Konjugatmischung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Dextran-Einheit ein Molekulargewicht von etwa 6 kD aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Dextran-Leptin-Konjugat nach einem der Ansprüche 17 bis 18 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Dextran-Leptin-Konjugat, welches durch das Verfahren hergestellt wird, welches umfaßt: (a) Aktivieren einer Dextran-Einheit mit einem Molekulargewicht von 1 kD bis 20 kD; (b) Anfügen der aktivierten Dextran-Einheit an einer Leptin-Einheit unter reduzierenden Bedingungen, um eine Aminbindung zu bilden, bei einem pH-Wert, der ausreichend sauer ist, so daß das Amino-terminale Amin noch nicht protoniert wird, während die Amingruppen an anderen Positionen an dem Leptin-Protein protoniert werden; (c) Erhalten des Dextran-Leptin-Konjugats; und (d) optional Reinigen des Dextran-Leptin-Konjugats; wobei die Dextran-Einheit an dem N-Ende an der Leptin-Einheit mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 angefügt wird, optional unter Fehlen eines Glutaminylrests an Position 28 und ferner optional mit einem Methionylrest an dem N-Ende.
Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Individuums für einen Zustand, der ausgewählt ist unter: Fettleibigkeit, Diabetes und Hyperlipidämie, wobei die Zusammensetzung umfaßt: eine wirksame Menge eines Dextran-Leptin-Konjugats nach einem der Ansprüche 17 bis 18.
Dextran-Leptin-Konjugat, welches wenigstens eine Dextran-Einheit mit einem Molekulargewicht von 1 kD bis 20 kD, angefügt an dem N-Ende an wenigstens einer Leptin-Einheit mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 umfaßt, wobei die Aminosäuren an Positionen 100 und 138 mit Glutamin substituiert sind, optional unter Fehlen eines Glutaminylrests an Position 28 und ferner optional mit einem Methionylrest an dem N-Ende.
Dextran-Leptin-Konjugat nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Dextran-Einheit ein Molekulargewicht von etwa 6 kD aufweist.
Dextran-Leptin-Konjugatmischung, welche die folgenden in irgendeiner Kombination umfaßt: (a) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextran-Einheit an einer Leptin-Einheit angefügt ist; (b) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei eine Dextran-Einheit an zwei Leptin-Einheiten angefügt ist; und (c) Dextran-Leptin-Konjugat, wobei zwei Dextran-Einheiten an zwei Leptin-Einheiten angefügt sind, wobei das Paar von Dextran-Leptin-Konjugaten aneinander angefügt ist; wobei die Dextran-Einheit des Dextran-Leptin-Konjugats ein Molekulargewicht von 1 kD bis 20 kD aufweist und an dem N-Ende an der Leptin-Einheit mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 angefügt ist, wobei die Aminosäuren an Positionen 100 und 138 mit Glutamin substituiert sind, optional unter Fehlen eines Glutaminylrests an Position 28 und ferner optional mit einem Methionylrest an dem N-Ende.
Dextran-Leptin-Konjugatmischung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Dextran-Einheit ein Molekulargewicht von etwa 6 kD aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Dextran-Leptin-Konjugat nach einem der Ansprüche 24 bis 25 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Dextran-Leptin-Konjugat, welches durch das Verfahren hergestellt wird, welches umfaßt: (a) Aktivieren einer Dextran-Einheit mit einem Molekulargewicht von 1 kD bis 20 kD; (b) Anfügen der aktivierten Dextran-Einheit an einer Leptin-Einheit unter reduzierenden Bedingungen, um eine Aminbindung zu bilden, bei einem pH-Wert, der ausreichend sauer ist, so daß das Amino-terminale Amin noch nicht protoniert wird, während die Amingruppen an anderen Positionen an dem Leptin-Protein protoniert werden; (c) Erhalten des Dextran-Leptin-Konjugats; und (d) optional Reinigen des Dextran-Leptin-Konjugats; wobei die Dextran-Einheit an dem N-Ende an der Leptin-Einheit mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 angefügt wird, wobei die Aminosäuren an Positionen 100 und 138 mit Glutamin substituiert sind, optional unter Fehlen eines Glutaminylrests an Position 28 und ferner optional mit einem Methionylrest an dem N-Ende.
Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Individuums für einen Zustand, der ausgewählt wird unter: Fettleibigkeit, Diabetes und Hyperlipidämie, wobei die Zusammensetzung umfaßt: eine wirksame Menge an Dextran-Leptin-Konjugat nach einem der Ansprüche 24 bis 25.