ES2202821T3 - Analisis de nucleotidos en disolucion usando sondas de acidos nucleicos peptidos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para secuenciar y ensayar nucleótidos en un medio líquido empleando probetas PNA y éste es un procedimiento de secuenciado rápido, económico y eficaz. El procedimiento es particularmente ventajoso porque no requiere el empleo de un soporte sólido para unir la probeta a la secuencia blanco. El procedimiento es capaz de proporcionar información respecto a la naturaleza y existencia de hibridaciones.

Description

Análisis de nucleótidos en disolución usando sondas de ácidos nucleicos peptídicos.

Antecedentes del invento Campo del invento

El invento se refiere a sondas que comprenden ácidos nucleicos peptídicos (PNAs; del inglés, peptide nucleic acids), y a un método para usar sondas de PNA para secuenciar o analizar nucleótidos en disolución, sin un soporte sólido ni una construcción nucleotídica adyacente de doble cadena.

Descripción de la técnica relacionada

Los PNAs son compuestos poliamídicos análogos de DNA y RNA (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.539.082 concedida a Nielsen et al.). Nielsen et al. describen que los PNAs remedan polinucleótidos naturales al unirse a cadenas de DNA y RNA de cadena sencilla (ss; del inglés, single stranded) complementarias. Los PNAs comprenden generalmente ligandos enlazados a una cadena principal peptídica. Los ligandos representativos incluyen las cuatro bases principales de DNA presentes en la naturaleza (es decir, timina, citosina, adenina y guanina) u otras nucleobases presentes en la naturaleza (por ejemplo, inosina, uracilo, 5-metilcitosina y tiouracilo) o bases artificiales (por ejemplo, bromotimina, azaadeninas, azaguaninas, etc.) unidas a una cadena principal peptídica por medio de un conector adecuado.

Las sondas que comprenden secuencias de PNA han sido empleadas para detectar secuencias nucleotídicas diana. En la Patente de EE.UU. nº 5.503.980, Cantor sugiere emplear sondas de PNA en un método para secuenciar un ácido nucleico al hibridar el ácido nucleico con un conjunto de sondas de PNA que contienen secuencias aleatorias, aunque determinables, de bases en la porción de cadena sencilla adyacente a una porción de doble cadena, en el que la porción de cadena sencilla del conjunto comprende preferiblemente toda posible combinación de secuencias a lo largo de un intervalo predeterminado. La hibridación tiene lugar mediante el reconocimiento complementario de la porción de cadena sencilla de una diana por la porción de cadena sencilla de la sonda y está termodinámicamente favorecida por la presencia de doble cadena adyacente de la sonda.

Sin embargo, aunque Cantor describe que los ácidos nucleicos pueden ser PNAs, no describe ni sugiere la utilización de tales sondas en ausencia de un soporte sólido. Además, el presente invento no requiere la construcción adyacente del material de DNA que se analiza.

Además de enseñar la utilización de un soporte sólido como Cantor, Perry-O'Keefe et al., "Peptide Nucleic Acid Pre-Gel Hybridization: An Alternative to Southern Hybridization", 93 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14.670 (Diciembre de 1.996), también enseñan que el PNA generalmente no se une bien al DNA de doble cadena (dsDNA; del inglés, double stranded DNA); véase Perry-O'Keefe et al., nota al pie de la página 14.673. Además, las construcciones de PNA de homopirimidina de las que se ha hallado que se unen bien a dsDNA no serían útiles como sondas. Los solicitantes han descubierto que el requisito que sugiere que sólo la homopirimidina puede unirse a dsDNA mediante inversión de cadena es incorrecto y surge de las condiciones de hibridación empleadas.

Smulevitch et al., "Enhancement of Strand Inversion by Oligonucleotides Through Manipulation of Backbone Charge", 14 Nature Biotechnology, 1.700 (Diciembre de 1.996) (descrito por Landsdorp, "Close Encounters of the PNA Kind", 14 Nature Biotechnology, 1.653 (Diciembre de 1.996) describen el uso de cebadores de PNA para hibridarse con dsDNA. Sin embargo, Smulevitch et al. enseñan el uso de geles en la detección de la hibridación y no sugieren el uso de marcadores fluorescentes.

Muchos tipos de análisis de muestras se basan en las propiedades fluorescentes de un colorante. Tiene lugar fluorescencia cuando una molécula excitada por luz de una longitud de onda vuelve al estado no excitado (fundamental) emitiendo luz de una mayor longitud de onda. Las luces excitante y emitida, que tienen diferentes longitudes de onda, pueden ser separadas usando filtros ópticos, una cámara o un dispositivo de carga acoplada (CCD; del inglés, charge-coupled device). La fluorescencia ha sido usada durante muchos años para visualizar ciertas moléculas (y, por lo tanto, estructuras) mediante microscopía óptica y es también usada en otras técnicas analíticas, tales como la citometría de flujo. Además, la emisión de fluorescencias que presentan diferentes colores puede ser detectada por el ojo humano, una cámara o un CCD.

Por ejemplo, en la Patente de EE.UU. nº 5.594.138 concedida a Dykstra et al. se describe un método de detección de un ácido nucleico por fluorescencia. El método comprende poner el ácido nucleico en contacto con un marcador fluorescente que es un compuesto de aril-furano bis-dicatiónico, y exponer el ácido nucleico a luz de una frecuencia que induce la fluorescencia del marcador fluorescente. El marcador fluorescente puede ser conjugado con una secuencia de nucleótidos como una sonda para estudios de hibridación, o puede ser conjugado con numerosos reactivos para estudios de marcación in situ.

En la Patente de EE.UU. nº 4.963.477 concedida a Tchen se describe una sonda de alta sensibilidad que contiene un ácido nucleico modificado, que puede ser reconocida por anticuerpos específicos.

La hibridación in situ fluorescente (FISH; del inglés, fluorescent in situ hybridization) es una técnica que comprende detectar una sonda fluorescente que se une a cromosomas humanos, al fijar DNA a un soporte sólido, tal como un portaobjeto de vidrio; véase, por ejemplo, "In Situ Hybridization Protocols", compilado por K. H. Andy Choo, capítulos 2 y 4 (Humana Press, Totowa, New Jersey, EE.UU., 1.994). Como todos los demás métodos de detección convencionales que comprenden hibridación con sondas, este método depende del soporte sólido para mantener separadas las dos cadenas complementarias de DNA mientras la sonda se hibrida con una de las cadenas. Además, la FISH requiere un complicado protocolo de control del tampón y la temperatura, con incubación durante la noche.

El Documento WO 93/24652 se refiere a hibridación in situ de DNA o PNA con ácido nucleico con objetos diana cromosómicos o extracromosómicos que contienen ácido nucleico. Sin embargo, este documento no dice nada en cuanto a distinción entre diferentes complejos de hibridación.

Carlsson et al., 380 Nature 207 (21 de Marzo de 1.996), se refieren a la exploración de mutaciones genéticas usando electroforesis capilar. En este documento no se enseña ni sugiere un ensayo en que la intensidad fluorescente del marcador irradiado en el medio de ensayo sea inversamente proporcional al número de apareamientos erróneos de bases entre la secuencia de nucleótidos diana y la sonda de PNA, a lo largo de un intervalo que incluye de 0 apareamientos erróneos de bases a al menos 3 apareamientos erróneos de bases.

El Documento WO 92/18650 se refiere a técnicas de anisotropía de fluorescencia para detectar hibridación de ácidos nucleicos, a diferencia del presente invento, que miden cambios de la intensidad de emisión fluorescente total asociados con la hibridación.

Sin embargo, hasta el presente invento, no ha sido posible analizar rápidamente la presencia de secuencias de nucleótidos en disolución usando un método que no destruya la muestra, sea menos peligroso para el personal de laboratorio que los ensayos basados en radiación, no requiera el coste y el retraso de preparar soportes sólidos y sea fácilmente automatizado. La detección de secuencias genéticas mutantes que fuera eficaz en cuanto al tiempo y el coste ha sido la etapa limitante de la velocidad a la hora de correlacionar genotipos mutantes con fenotipos alterados. Aunque se ha considerado que los métodos de secuenciación de DNA convencionales son el medio más preciso para identificar mutaciones, esos métodos han sido relativamente lentos y fatigosos y no son particularmente bien adecuados para explorar rápidamente grandes cantidades de muestras de DNA genómico.

Sumario del invento

El presente invento proporciona métodos para detectar secuencias de ácido nucleico y/o determinar información de secuencias procedente de ácidos nucleicos. Las sondas de acuerdo con el presente invento incluyen PNA.

El invento proporciona un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de cadena sencilla o cadena doble en un medio líquido, método que comprende añadir al medio líquido sondas de PNA, cada una de las cuales tiene al menos un marcador, para formar al menos un complejo de hibridación con al menos una secuencia de nucleótidos en el medio, y detectar la al menos una secuencia de nucleótidos al detectar al menos una señal correlacionada con una cantidad del al menos un complejo de hibridación en el medio líquido.

El método puede ser llevado a cabo sin unir las sondas de PNA, las secuencias de nucleótidos ni los complejos de hibridación a un soporte sólido o un gel.

Breve descripción de los dibujos

El invento será descrito conjuntamente con los dibujos siguientes, en los que números de referencias iguales designan elementos iguales y en los que:

La Figura 1 es una representación esquemática de un aparato de acuerdo con el invento; y

Las Figuras 2, 3A, 3B, 3C, 4A, 4B, 4C, 5A, 5B, 6A, 6B, 7A, 7B, 8A, 8B, 8C, 9A, 9B, 9C, 9D, 10A, 10B, 11A, 11B, 12A, 12B, 13A, 13B, 13C, 14A, 14B, 15A, 15B, 16A, 16B, 16C, 16D, 17A, 17B, 17C, 18A, 18B, 19A, 19B, 19C, 19D y 19E son espectros fluorescentes.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

En el invento se utilizan sondas de PNA para detectar y/o caracterizar secuencias de nucleótidos en una muestra. Las sondas de PNA son capaces de reconocer dsDNA al unirse a una cadena, hibridándose probablemente por ello con la otra cadena para generar un complejo de PNA-DNA. Dicho reconocimiento puede tener lugar sobre secuencias diana de dsDNA con una longitud de 20 o más pares de bases. Se prefieren las secuencias de sonda que tienen cualquier longitud de 8 a 20 bases ya que éste es el intervalo dentro del cual se hallan las secuencias de DNA únicas más pequeñas de procariontes y eucariontes. Las sondas de 12 a 18 bases son particularmente preferidas ya que ésta es la longitud de las secuencias únicas más pequeñas del genoma humano. Sin embargo, puede usarse una pluralidad de sondas más cortas para detectar una secuencia de nucleótidos que tenga una pluralidad de secuencias diana no únicas en ella, que se combinen para identificar únicamente la secuencia de nucleótidos.

Las sondas del invento son capaces de formar complejos triples con dsDNA y complejos dobles con RNA o ssDNA. Los compuestos del invento también son capaces de formar complejos triples en que una primera sonda de PNA se une con RNA o ssDNA y una segunda cadena de ssDNA se une con el complejo doble resultante; véanse, por ejemplo, Egholm et al., "PNA Hybridizes to Complementary Oligonucleotides Obeying the Watson-Crick Hydrogen-Bonding Rules", 365 Nature 566 (1.993), y Tomac et al., "Ionic Effects on the Stability and Conformation of Peptide Nucleic Acid Complexes", 118 J. Am. Chem. Soc. 5.544 (1.996).

En las sondas de PNA de acuerdo con el invento, las bases fijadas a la cadena principal poliamídica son principalmente nucleobases presentes en la naturaleza fijadas a la posición requerida por la fabricación de sondas. Alternativamente, las bases pueden ser nucleobases no presentes en la naturaleza (compuestos análogos a nucleobases), otros grupos que se unen a bases, grupos aromáticos, alcanoilos (C1-C4), hidroxilos o incluso hidrógenos. Se entenderá que el término "nucleobase" incluye nucleobases que llevan grupos protectores eliminables. Además, al menos una base del esqueleto poliamídico puede ser reemplazada o sustituida por un agente intercalante de DNA, un ligando informador tal como, por ejemplo, un fluoróforo, marcador radiactivo, marcador de espín, hapteno, o un ligando que reconoce proteínas tal como biotina. Los marcadores detectables preferidos incluyen un radioisótopo, un isótopo estable, una enzima, un compuesto químico fluorescente, un compuesto químico luminiscente, un compuesto químico cromático, un metal, una carga eléctrica o una estructura espacial.

En realizaciones particularmente preferidas, la sonda de PNA comprende una secuencia de PNA covalentemente enlazada a un marcador fluorescente que emite fluorescencia cuando es irradiado con un láser. Los marcadores fluorescentes preferidos incluyen biotina, rodamina y fluoresceína.

Se prefiere disponer el marcador fluorescente en el extremo 5' del PNA con un conector corto para minimizar la interacción con el PNA.

Con objeto de distinguir una secuencia de nucleótidos mutante de una secuencia de nucleótidos de referencia, en que las dos secuencias difieren en tan sólo una base, se prefiere diseñar la sonda de PNA de modo que la porción mutante del nucleótido mutante corresponda al centro de la sonda de PNA. Este diseño da lugar a un mayor rendimiento de hibridación y a un híbrido más estable que cuando la porción mutante del nucleótido corresponde a un extremo de la sonda, ya que la falta de apareamiento enlazante entre la sonda y el nucleótido está localizada centralmente en la sonda.

Las sondas de PNA se añaden a un medio líquido del que se sospecha que contiene al menos una secuencia de nucleótidos, y/o una versión mutante de la al menos una secuencia. El medio líquido puede ser cualquier medio convencional del que se sabe que es adecuado para preservar nucleótidos; véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: a Lab Manual", 2º (1.989). El medio líquido puede comprender, por ejemplo, nucleótidos, agua, tampones y agentes tensioactivos.

Los nucleótidos del medio líquido pueden obtenerse de muestras clínicas mediante cualquier método convencional, incluyendo un método automatizado. En, por ejemplo, Sambrook et al., volumen 2, páginas 9.16-9.19 y 7.6 a 7.7, se resumen ejemplos de tales métodos. Un ejemplo de un aparato automatizado para purificar ácido nucleico es el BioRobot 9600 fabricado por Quiagen.

Por ejemplo, se sabe que diversas enfermedades están ligadas a la presencia de DNA mutante en el genoma de un individuo. Si se conocen las secuencias del DNA de tipo silvestre y del DNA mutante, es posible aislar estas secuencias de nucleótidos de muestras clínicas usando una tecnología convencional. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction) es el método preferido para aislar nucleótidos de muestras clínicas. La PCR es llevada a cabo usando un cebador que es capaz de multiplicar el DNA de tipo silvestre y el DNA mutante.

Las secuencias de nucleótidos se añaden al medio líquido en una concentración conocida ya que la concentración puede afectar a la magnitud de la señal (por ejemplo, la intensidad fluorescente) generada en operaciones subsiguientes del método del invento. La concentración de nucleótidos puede ser determinada al medir, por ejemplo, la absorción UV a 260 nm.

Los nucleótidos aislados son añadidos al medio líquido y son desnaturalizados antes de ser detectados. La desnaturalización es llevada preferiblemente a cabo a una temperatura de aproximadamente 90ºC a aproximadamente 100ºC durante un periodo de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 5 horas en presencia de la sonda de PNA.

Las sondas de PNA son preferiblemente añadidas al medio líquido en una concentración de 1 a 20 veces la concentración de la secuencia de nucleótidos que se va a detectar.

La hibridación entre las bases complementarias tiene lugar bajo una gran variedad de condiciones que presentan variaciones de temperatura, concentración de sal, fuerza electrostática y composición de tampón. En la técnica se conocen ejemplos de estas condiciones y los métodos para aplicarlas; véanse, por ejemplo, Perry-O'Keefe et al., Egholm et al., Tomac et al., Sambrook et al., volumen 2, páginas 9.47-9.55, y la Técnica de Hibridación en Pregel enseñada en el volumen 4, nº 3, de PerSeptive Biosystems Magazine.

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Se prefiere que los complejos de hibridación se formen a una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 75ºC durante un periodo de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 24 horas. Se prefiere particularmente llevar la desnaturalización a cabo durante no más de 60 minutos en presencia de la sonda de PNA, después de lo cual la temperatura es pasivamente llevada a la temperatura ambiental sin sofocación.

Es posible facilitar la hibridación en disolución usando ciertos reactivos. Los ejemplos preferidos de estos reactivos incluyen proteínas ligantes de cadena sencilla tales como la proteína Rec A, la proteína del gen 32 de T4, la proteína ligante de cadena sencilla de E. coli, proteínas ligantes del surco mayor o menor de los ácidos nucleicos, iones divalentes, iones polivalentes y sustancias intercalantes tales como bromuro de etidio, actinomicina D, psoraleno y angelicina.

En realizaciones del método del invento, los complejos de hibridación son separados de las sondas de PNA no hibridadas, antes de que se detecte la señal de las sondas de PNA hibridadas. La separación es realizada mediante al menos una de las técnicas: filtración, centrifugación, precipitación, separación por resina de intercambio iónico y electroforesis libre en disolución (es decir, electroforesis en un medio líquido, al contrario que la electroforesis en gel).

La separación puede ser realizada mediante una columna de G50. Después de la hibridación, la mezcla de complejos de hibridación y de DNA y PNA no hibridados es transferida a una columna de G50. La columna es centrifugada a una velocidad de 500 a 1.000 rpm durante un periodo de 1 a 2 minutos. El PNA no unido es separado por filtración y queda retenido en la columna. La disolución con los híbridos de PNA-DNA atraviesa la columna y es recogida en una cubeta.

En realidad, puede evitarse la centrifugación. La disolución puede fluir a través de la columna por gravedad o mediante lavado usando cantidades extras de tampón. Sin embargo, la centrifugación tiene el fin de reducir el tiempo de separación y evitar que la muestra se diluya.

La separación puede ser realizada por centrifugación. Después de la hibridación, la muestra (sin transferir) es separada en dos capas (gradiente) por centrifugación a una velocidad de 1.000 a 10.000 rpm durante un periodo de 4 a 20 horas. El PNA no hibridado, más ligero, abunda en la capa superior, mientras que el complejo de hibridación, más pesado, se concentra en la capa inferior. La capa inferior es recogida en una cubeta para la medición de fluorescencia.

En ciertas realizaciones, es evitable una operación de filtración si se usa un método eléctrico para concentrar el PNA hibridado. En estas realizaciones, se aplica un campo eléctrico al medio líquido antes de, o concurrentemente con, la detección de la secuencia de nucleótidos deseada, y se detecta un cambio de una intensidad de emisión fluorescente en función del campo eléctrico como una indicación de si la sonda de PNA se hibrida con al menos una de una secuencia de nucleótidos completamente complementaria y una secuencia de nucleótidos incompletamente complementaria.

Los marcadores preferidos para uso en el invento son fluoróforos. Como será apreciado por el técnico experto, la longitud de onda preferiblemente seleccionada para inducir la fluorescencia del marcador fluorescente es conocida en la técnica como "máximo de excitación", es decir, la longitud de onda que es absorbida por una molécula y excita a esa molécula hasta un estado electrónico superior. Cuando la molécula marcadora pasa del estado electrónico superior a uno inferior, la molécula emite un tipo de radiación visible, es decir, fluorescencia, con una longitud de onda a la que se hace referencia como "máximo de emisión". Ésta es la fluorescencia que se detecta en el presente invento. La señal detectable emitida por el compuesto puede ser detectada usando técnicas conocidas en este campo técnico, tales como, por ejemplo, mediante observación con el ojo humano, usando medios electrónicos para detectar una longitud de onda generada (por ejemplo, cámaras y CCDs), y similares. Ventajosamente, la longitud de onda de la fluorescencia está suficientemente retirada de la de la luz excitante para permitir una buena separación de las dos longitudes de onda mediante filtros ópticos.

La longitud de onda de excitación es seleccionada (mediante experimentación rutinaria y/o por conocimiento convencional) para que corresponda a este máximo de excitación del marcador que se usa, y es preferiblemente de 400 a 1.000 nm, más preferiblemente de 400 a 750 nm. Por ejemplo, cuando el marcador es fluoresceína, la longitud de onda de excitación preferida es aproximadamente 488 nm.

En realizaciones preferidas, se usa un láser de ion argón para irradiar el marcador con luz que tiene una longitud de onda en el intervalo de 400 a 520 nm, y la emisión fluorescente es detectada en el intervalo de 500 a 750 nm. La duración de la irradiación es preferiblemente de aproximadamente 10 milisegundos a aproximadamente 1 minuto.

Un aparato para llevar a cabo el método del invento puede comprender un recipiente de medios líquidos para contener el medio líquido, un láser para irradiar el nucleótido, un detector de fluorescencia para detectar la fluorescencia inducida por el láser, un dispositivo de análisis de datos para analizar los datos generados por el detector de fluorescencia, y un dispositivo de salida que presenta el análisis de datos generado por el dispositivo de análisis de datos; véase, por ejemplo, la Figura 1, que muestra un diagrama esquemático de un sistema de detección de fluorescencia adecuado para uso con el método del invento.

En ciertas realizaciones, la emisión fluorescente generada al irradiar sondas hibridadas de PNA con una fuente de luz es distinguida de la emisión fluorescente de las sondas no hibridadas de PNA sin separar las sondas de PNA hibridadas y no hibridadas. En ciertas realizaciones, la emisión fluorescente de un tipo de sonda de PNA hibridada con una secuencia de nucleótidos es distinguida de la emisión fluorescente de otro tipo de sonda de PNA hibridada con una secuencia de nucleótidos distinta de la primera secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, la presencia de cualquiera de dos secuencias de nucleótidos que difieren en tan sólo un nucleótido puede ser detectada basándose en que una sonda de PNA fluorescente exactamente complementaria de uno de los dos nucleótidos se unirá más eficazmente con el complemento exacto que con el complemento inexacto, obteniéndose de este modo una mayor concentración de complejos de hibridación en disolución y una mayor intensidad fluorescente tras la separación de la sonda de PNA no hibridada.

Puede emplearse simultáneamente una pluralidad de sondas de PNA para conseguir una diversidad de efectos. Para potenciar la fiabilidad del método de detección, pueden emplearse diversas sondas dirigidas a diferentes segmentos de una sola secuencia de nucleótidos. Similarmente, una sonda puede dirigirse a una cadena del dsDNA mientras otra sonda puede dirigirse a la cadena complementaria del dsDNA.

Un método preferido para detectar si el DNA es de tipo mutante o del correspondiente tipo silvestre comprende el uso simultáneo de (a) un primer tipo de sonda de PNA dirigida a una secuencia que se encuentra tanto en el DNA de tipo silvestre como en el de tipo mutante pero que por lo demás es única, y (b) un segundo tipo de sonda de PNA dirigida a una secuencia única con respecto al DNA de tipo mutante, en el que los tipos primero y segundo de sonda de PNA tienen diferentes marcadores que producen señales distinguibles. De este modo, la detección de la señal de la primera sonda indica que el ensayo se desarrolló apropiadamente (es decir, la primera sonda actúa como un testigo positivo), y la detección de la señal de la segunda sonda indica que está presente el DNA de tipo mutante. Por ejemplo, una sonda puede tener un marcador de fluoresceína que presenta un pico de intensidad de emisión fluorescente a 525 nm mientras la otra sonda puede tener un marcador de rodamina que presenta un pico de intensidad de emisión fluorescente a 580 nm.

Por contraste con métodos de detección de la técnica anterior, el presente invento hace posible limitar el volumen total del medio líquido (es decir, la muestra que se va a analizar) a no más de aproximadamente 200 microlitros en ciertas realizaciones. También es posible limitar el volumen total a no más de aproximadamente 10 microlitros en ciertas realizaciones.

Cuando se analiza dsDNA mutante usando PNA, si se obtiene un resultado sobre el que queda duda, puede llevarse inmediatamente a cabo otro ensayo sobre la muestra al añadir la sonda de PNA complementaria para analizar la cadena complementaria del DNA. Si se centrifuga como parte del primer ensayo, la muestra sería transferida a un nuevo tubo e hibridada con el PNA complementario. Alternativamente, el ensayo de PNA puede ser realizado tanto con la sonda de PNA como con la sonda de PNA complementaria hibridadas con cada una de las cadenas de DNA desnaturalizadas en primer lugar y al mismo tiempo.

Para aplicaciones forenses, las muestras pueden ser analizadas, guardadas y luego reanalizadas porque el PNA es expulsado de la hibridación a lo largo de un par de días y el DNA se recombina a lo largo del tiempo y no se degrada mediante este procedimiento. En consecuencia, una muestra congelada tras el análisis puede ser posteriormente reanalizada varias veces en el mismo tubo.

La Figura 2 muestra la hibridación de DNA a lo largo del tiempo. Se dejó que una sonda de PNA se hibridara con DNA de tipo silvestre (DNA WT; del inglés, wild type) y DNA mutante (DNA MT; del inglés, mutant type). La hibridación entre la sonda y el DNA fue seguida a lo largo del tiempo midiendo la intensidad fluorescente. La Figura 2 muestra que la hibridación de la sonda de PNA con el DNA disminuye finalmente a lo largo del tiempo, lo que sugiere que el DNA recupera su estructura nativa a lo largo del tiempo desplazando al PNA.

Pueden analizarse muestras clínicas usando al menos 100 veces menos productos químicos o material genómico (100 microlitros frente a 10 mililitros) que lo que es típico en métodos convencionales. Por lo tanto, incluso usando 10 ó 20 veces la concentración de PNA convencionalmente usada, en los ensayos aún sólo se consume de 1/5 a 1/10 de la cantidad de PNA mientras se obtiene un resultado muy concluyente.

El invento será ilustrado con mayor detalle con referencia a los ejemplos siguientes, pero ha de entenderse que no se considera que el presente invento se limite a ellos.

Ejemplo 1

Un fragmento de 150 pares de bases (bp; del inglés, base pair) de DNA genómico del gen p53 de tipo silvestre (ID. SEC. nº 1) fue multiplicado por PCR. La PCR fue llevada a cabo usando un "GeneAmp PCR system 2400" de Perkin Elmer con un inicio caliente a 95ºC durante 5 minutos. Tras añadir la enzima Taq, se llevaron a cabo 35 ciclos del modo siguiente:

Desnaturalización: 94ºC durante 30 minutos

Hibridación de extremos complementarios: 45ºC durante 45 minutos (45ºC es 5ºC menos que la Tm del cebador)

Extensión: 72ºC durante 30 minutos (1 kb/min) x 35.

La PCR fue llevada a cabo usando una mezcla que comprendía, en un volumen de 100 ml, tampón de reacción 10x (10 \mul), 20 mM de MgCl_{2} (10 \mul), 10 mM de mezcla (2) de trifosfatos de desoxinucleótidos, 25 picomoles/\mul de cebador 1 (1 \mul), 25 picomoles/\mul de cebador 2 (1 \mul), 100 \mug/\mul de DNA molde (1 \mul), H_{2}O doblemente destilada (dd) (74 \mul) y polimerasa Taq (1 \mul) (5 unidades/\mul).

Similarmente, un fragmento mutante (ID. SEC. nº 2) del mismo fragmento genómico de 150 bp fue también multiplicado por PCR. El fragmento mutante era idéntico al fragmento de tipo silvestre salvo por una mutación puntual en la posición de aminoácido 344, en la que la secuencia CTG de tipo silvestre del DNA estaba cambiada por CAG.

Una sonda de PNA de 12 unidades fue obtenida de PerSeptive Biosystems, Inc. (Framingham, Massachusetts. EE.UU.) y fue diseñada para que fuera complementaria de un segmento de 12 nucleótidos del fragmento de p53 de tipo silvestre, de 150 bp (ID. SEC. nº 1). La sonda tenía la estructura siguiente:

5' H-FluO CAT TCA GCT CTC Lys-CONH_{2}

La disolución tampón para hibridación era Tris-HCl 10 mM, pH de 7,1, albúmina sérica bovina (BSA; del inglés, bovine serum albumin) al 1% en peso y Triton X-100 (t-octilfenoxipolietoxietanol) al 0,1%. Se añadieron 50 picomoles de DNA genómico de tipo silvestre a 300 picomoles de sonda de PNA y se mezclaron en 100 ml de tampón. Se añadieron 50 picomoles de DNA genómico mutante a 300 picomoles de sonda de PNA y se mezclaron en 100 microlitros de tampón.

Cada muestra fue calentada a 95ºC durante 30 minutos. Cada muestra fue luego añadida a tampón precalentado a 30ºC y fue dejada hibridar durante 1 hora.

Los componentes de cada muestra fueron separados mediante columnas de G50 para centrifugación (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), por centrifugación a 600g durante 2 minutos. El PNA no unido fue separado por filtración y quedó retenido en la columna. La disolución con los híbridos de PNA-DNA atravesó la columna y fue recogida en una cubeta para detección fluorescente. La cubeta fue luego colocada en un espectrómetro de fluorescencia para fluorescencia inducida por láser (longitud de onda de irradiación de 488 nm en todos los ejemplos) y detección de la sonda fluorescente fijada al DNA genómico diana. Como se muestra en las Figuras 3B y 3C, la intensidad de fluorescencia relativa a 525 nm de la muestra de DNA genómico de tipo silvestre (Figura 3B) era cuatro veces mayor que la de la muestra mutante (Figura 3C), lo que permitía que la muestra de DNA genómico mutante fuera distinguida de la muestra de DNA genómico de tipo silvestre. La Figura 3A muestra la intensidad fluorescente de la sonda sola.

Ejemplo 2

Este ejemplo era similar al Ejemplo 1 salvo por los detalles siguientes. La muestra de DNA genómico mutante (ID. SEC. nº 3) tenía la secuencia de bases de la posición de aminoácido 344 cambiada, de la secuencia CTG de tipo silvestre por CGG. Ambas muestras fueron calentadas a 94ºC durante 20 minutos. El tampón fue precalentado a 25ºC y las muestras fueron dejadas hibridar durante 30 minutos. Los componentes de cada muestra fueron separados usando columnas de G50 para centrifugación y centrifugando a 800 rpm durante 1,5 minutos. La intensidad relativa a 525 nm de la fluorescencia detectada de la muestra de DNA genómico de tipo silvestre (Figura 4B) era seis veces mayor que la de la muestra de DNA genómico mutado (Figura 4C), lo que permitía que la muestra genómica de tipo silvestre fuera distinguida de la muestra genómica mutada. La Figura 4A muestra la intensidad fluorescente de la sonda sola en la disolución.

Ejemplo 3

Este ejemplo era similar a los Ejemplos 1 y 2 salvo por los detalles siguientes. La muestra de DNA genómico mutante (ID. SEC. nº 4) tenía un cambio de 2 bases con respecto al DNA genómico de tipo silvestre en la posición de aminoácido 344, de CTG a AAG. Cada muestra fue inicialmente calentada a 100ºC durante 45 minutos. El tampón fue precalentado a 45ºC y cada muestra fue dejada hibridar durante 20 minutos. Los componentes de cada muestra fueron separados usando columnas de G75 para centrifugación y centrifugando a 1.000 rpm durante 1 minuto. La intensidad relativa a 525 nm de la fluorescencia independiente de la muestra de DNA genómico de tipo silvestre (Figura 5A) era ocho veces mayor que la de la muestra genómica mutada (Figura 5B), lo que permitía que la muestra genómica de tipo silvestre fuera distinguida de la muestra genómica mutada.

Ejemplo 4

Este ejemplo era similar al Ejemplo 3 salvo por los detalles siguientes. La muestra de DNA genómico mutante (ID. SEC. nº 5) tenía un cambio de 2 bases con respecto al DNA genómico de tipo silvestre en la posición de aminoácido 344, de CTG a GCG. Cada muestra fue inicialmente calentada a 100ºC durante 15 minutos. El tampón fue precalentado a 50ºC y cada muestra fue dejada hibridar durante 2 horas. Los componentes de cada muestra fueron separados usando columnas de G50 para centrifugación y centrifugando a 1.200 rpm durante 1 minuto. La intensidad relativa a 525 nm de la fluorescencia detectada de la muestra de DNA genómico de tipo silvestre era siete veces mayor que la de la muestra genómica mutada, lo que permitía que la muestra genómica de tipo silvestre (Figura 6A) fuera distinguida de la muestra genómica mutada (Figura 6B).

Ejemplo 5

Este ejemplo era similar a los otros ejemplos salvo por los detalles siguientes. La muestra de DNA genómico mutante (ID. SEC. nº 6) tenía un cambio de 3 bases con respecto al DNA genómico de tipo silvestre en la posición de aminoácido 344, de CTG a TAC. Cada muestra fue inicialmente calentada a 95ºC durante 30 minutos. El tampón fue precalentado a 25ºC y cada muestra fue dejada hibridar durante 60 minutos. Los componentes de cada muestra fueron separados usando columnas de G50 para centrifugación y centrifugando a 750 rpm durante 2 minutos. Como se muestra en las Figuras 7A y 7B, la intensidad relativa a 525 nm de la fluorescencia detectada de la muestra de DNA genómico de tipo silvestre (Figura 7A) era diez veces mayor que la de la muestra genómica mutada (Figura 7B), lo que permitía que la muestra genómica de tipo silvestre fuera distinguida de la muestra genómica mutada.

Ejemplo 6

Este ejemplo era similar al Ejemplo 1 salvo por los detalles siguientes. Se mezclaron 100 picomoles del PNA de 12 bp del Ejemplo 1 marcado con fluoresceína (PerSeptive Biosystems), 25 picomoles de dsDNA de 150 bp multiplicado por PCR, que incluía DNA de tipo silvestre (CTG; ID. SEC. nº 1) y DNA mutado en una base (CAG, ID. SEC. nº 2; y CGG ID. SEC. nº 3), y 115 microlitros de tampón [disolución operativa de TBE 0,5x (Tris-borato 0,0225 M/EDTA 0,0005 M), pH de 6,5] a temperatura ambiental. La mezcla fue luego calentada a 95ºC durante 30 minutos y dejada hibridar a temperatura ambiental durante aproximadamente 1 hora.

Se pusieron en cada muestra dos hilos metálicos que servían como electrodos. Se determinó la intensidad fluorescente a 525 nm mientras se conectaba y desconectaba una tensión de 5 voltios con una corriente de 10 mA, con una separación de electrodos de aproximadamente 7 u 8 mm. Cuando se aplicaba la tensión, el DNA y el DNA-PNA migraban hacia el ánodo, ya que el DNA está negativamente cargado, mientras que el PNA no unido no migraba, ya que es neutro.

La Figura 8A muestra el espectro fluorescente del DNA de tipo silvestre. Tras una hibridación a 25ºC durante 1 hora, la disolución fue transferida a una cubeta. Se dispuso la cubeta en un espectrómetro de fluorescencia y luego se pusieron los dos electrodos en la disolución para detectar el cambio de intensidad fluorescente, a una longitud de onda de 525 nm, con el campo eléctrico aplicado. La intensidad fluorescente a 525 nm disminuyó con la aplicación de la tensión y aumentó con la interrupción de la tensión. Las Figuras 8B y 8C muestran los espectros fluorescentes de DNA con un apareamiento erróneo de un par de bases (ID. SEC. nº 2 e ID. SEC. nº 3, respectivamente). Tras una hibridación a 25ºC durante 1 hora, los espectros fluorescentes del DNA mutante mostraron una diferencia con respecto al espectro del DNA de tipo silvestre. Cuando se aplicó tensión, la intensidad aumentó rápidamente y, cuando se interrumpió la tensión, la intensidad disminuyó.

Ejemplo 7

Este ejemplo era similar al Ejemplo 1 salvo por los detalles siguientes. Se obtuvieron por PCR un fragmento de 375 bp de DNA de tipo silvestre de p53 (ID. SEC. nº 7), un correspondiente fragmento de DNA de tipo mutante de 375 bp (ID. SEC. nº 8), un correspondiente fragmento de DNA de tipo mutante de 375 bp (ID. SEC. nº 9) y un fragmento de DNA de 633 bp (ID. SEC. nº 10). El DNA de tipo silvestre de 375 bp contenía una secuencia diana de DNA complementaria del PNA de 12 bases del Ejemplo 1. EL DNA de 633 bp carecía de dicha secuencia diana y fue usado en este ejemplo como un testigo negativo. La ID. SEC. nº 8 era idéntica al fragmento de tipo silvestre (ID. SEC. nº 7) salvo por una mutación puntual en la posición de aminoácido 344, en la que la secuencia CTG de tipo silvestre de DNA estaba cambiada por CAG. La ID. SEC. nº 9 era idéntica al fragmento de tipo silvestre (ID. SEC. nº 7) salvo por una mutación puntual en la posición de aminoácido 344, en la que la secuencia CTG de tipo silvestre de DNA estaba cambiada por CGG.

Cada muestra comprendía 50 picomoles del respectivo fragmento de DNA, 200 picomoles de sonda de PNA y 130 ml de tampón (TBE 0,5x con un pH de 6,5). Cada muestra fue calentada a 95ºC durante aproximadamente 30 minutos. Luego se dejó que cada muestra se hibridase durante 1 hora bajo condiciones ambientales (25ºC). Antes de la medición de fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración usando una columna de G50.

Cada muestra fue colocada en un espectrómetro de fluorescencia para la detección de la sonda fluorescente fijada al DNA genómico diana. Como con los ejemplos previos, la intensidad de fluorescencia relativa a 525 nm era máxima en las muestras que contenían fragmentos de DNA totalmente complementarios de la sonda, permitiendo de este modo que las muestras que contenían fragmentos de DNA mutante (Figuras 9B-9C) fueran distinguidas de la muestra que contenía fragmentos de DNA de tipo silvestre (Figura 9A). Como se esperaba, el fragmento de DNA testigo negativo mostró la menor intensidad fluorescente de todas (Figura 9D).

Ejemplo 8

Se obtiene una muestra clínica de un individuo del que se sospecha que padece una enfermedad de la que se sabe que es causada por una mutación de un solo nucleótido dentro de un segmento conocido del genoma humano. Un fragmento de este segmento génico es multiplicado por PCR usando un cebador capaz de multiplicar el fragmento independientemente de si contiene DNA de tipo silvestre o DNA de tipo mutante.

Se prové una sonda de PNA de 12 bases que es complementaria de una porción del fragmento de DNA de tipo mutante que contiene el nucleótido mutante, en que el nucleótido mutante tiene una base complementaria de una base centralmente situada de la sonda. La sonda es marcada con fluoresceína por su extremo 5'.

Se añaden 50 picomoles del DNA obtenido de la PCR y 300 picomoles de sonda de PNA a 100 ml de disolución tampón. La muestra es calentada a 95ºC durante 30 minutos. La muestra es luego añadida a tampón precalentado a 30ºC y es dejada hibridar durante 1 hora.

Los componentes de la muestra son separados mediante columnas de G50 para centrifugación, centrifugando a 600 rpm durante 2 minutos. El PNA no hibridado es separado por filtración con la columna, y el medio líquido que contiene híbridos y DNA atraviesa la columna y es recogido en una cubeta.

La cubeta es colocada en un espectrómetro de fluorescencia para la detección de la sonda fluorescente fijada al DNA. Si la intensidad fluorescente a 525 nm de la muestra sobrepasa un valor de intensidad predeterminado, el DNA de tipo mutante ha resultado entonces detectado en el individuo. Si la intensidad fluorescente a 525 nm de la muestra no sobrepasa una valor de intensidad predeterminado, el DNA de tipo mutante no ha resultado entonces detectado en el individuo. El valor de intensidad predeterminado se determina previamente al calibrar el espectrómetro usando muestras testigos negativo y positivo.

Ejemplo 9

Este ejemplo es similar al Ejemplo 8 salvo por los detalles siguientes. Han de identificarse dos DNA no marcados [uno es de tipo silvestre (ID. SEC. nº 1) y el otro es de tipo mutado (ID. SEC. nº 3)]. Para identificar los dos DNA desconocidos, se usó una sonda que es complementaria del DNA mutado (ID. SEC. nº 3), con la secuencia siguiente: 5'CAT TCC GCT CTC (sintetizada por PerSeptive Biosystems).

Cada muestra, que comprendía 100 picomoles de sonda, 25 picomoles de DNA (DNA WT o DNA mutado) y 115 \mul de tampón (TBE 0,5x, pH de 6,5), fue calentada a 95ºC durante 30 minutos. Luego se dejó que cada muestra se hibridara durante 1 hora a 25ºC. Antes de la medición de la fluorescencia, cada muestra fue transferida a una columna de G50 y fue centrifugada a 750 rpm durante 2 minutos. El híbrido fluyó a través de la columna y fue recogido en una cubeta, mientras que la sonda no hibridada fue separada por filtración y quedó retenida en la columna. La cubeta fue colocada en un espectrómetro de fluorescencia para la medición de la fluorescencia.

Como se muestra en las Figuras 10A y 10B, la intensidad fluorescente relativa a 525 nm muestra una gran diferencia en los espectros. La muestra con una señal fluorescente más intensa (Figura 10 A) es identificada como el DNA mutante (ID. SEC. nº 3). La otra muestra, con una intensidad fluorescente más débil, es DNA de tipo silvestre (ID. SEC. nº 1).

Ejemplo 10

Este ejemplo es similar al Ejemplo 8 salvo por los detalles siguientes. En lugar de usarse una sola sonda como en el Ejemplo 8, se usan dos sondas en este ejemplo. La primera sonda es la sonda del Ejemplo 8, que es totalmente complementaria de una porción del fragmento de DNA de tipo mutante. La segunda sonda es idéntica a la primera sonda salvo porque tiene la secuencia de nucleobases de tipo silvestre en lugar de la secuencia de nucleobases de tipo mutante. Una primera porción de la muestra es sondada de acuerdo con el Ejemplo 8 usando la primera sonda. Una segunda porción de tamaño equivalente al de la primera porción es similarmente sondada usando la segunda sonda. Después de desnaturalización, hibridación y separación, se mide la fluorescencia de cada porción. Si la intensidad fluorescente de la primera porción sobrepasa la de la segunda porción, el DNA de tipo mutante ha sido entonces detectado en el individuo. Si la intensidad fluorescente de la segunda porción sobrepasa la de la primera porción, el DNA de tipo mutante no ha sido entonces detectado en el individuo.

El método de este ejemplo podría adaptarse para uso con un dispositivo diagnóstico que comprendiera un soporte sólido que tuviera los dos tipos contrastantes de sondas de PNA unidos a diferentes zonas del soporte. La muestra no se divide sino que, en vez de ello, se dispersa uniformemente sobre el soporte para que entre igualmente en contacto con ambos tipos de sonda. Las intensidades fluorescentes de las dos zonas del dispositivo podrían ser comparadas de la misma manera que se comparan en el Ejemplo 9 las dos muestras separadas.

Ejemplo 11

Se multiplicó por PCR DNA de doble cadena (ID. SEC. nº 1 e ID. SEC. nº 3) biotinilado. Se preparó DNA de cadena sencilla usando glóbulos Dynabeads (de DYNAL Company) del modo siguiente: se añadieron 25 \mul de tampón de unión y lavado 2x (del sistema de estreptavidina M-280) y 25 \mul (25 picomoles) de DNA (ID. SEC. nº 1 y nº 2) biotinilado a 2 mg de los Dynabeads de estreptavidina M-280 prelavados. La mezcla fue incubada a temperatura ambiental durante 15 minutos, manteniéndose los glóbulos suspendidos. La mezcla fue luego dispuesta sobre un concentrador de partículas magnéticas (MPC, Dynal, Inc.) a temperatura ambiental durante 2 minutos, lo que fue seguido de la separación del sobrenadante con una pipeta. Se añadieron 20 \mul de NaOH 0,1 N recién preparado y se dejó la mezcla a temperatura ambiental durante 5 minutos. Los Dynabeads fueron recogidos con la cadena biotinilada e inmovilizada en el lado del tubo usando el MPC, y el sobrenadante de NaOH fue transferido con el DNA de cadena sencilla no biotinilado a un tubo limpio. El sobrenadante de NaOH fue neutralizado con 2,5 \mul de HCl 0,2 N recién preparado.

Se añadieron 200 picomoles de sonda y 150 \mul de tampón TBE 0,5x al sobrenadante que contenía un DNA de cadena sencilla. La mezcla fue calentada a 94ºC durante 5 minutos y fue luego incubada a temperatura ambiental durante 1 hora. Tras separación mediante una columna de G50 a 650 rpm durante 2 minutos, el PNA no unido quedó separado por filtración en la columna, y el híbrido atravesó la columna y fue recogido en una cubeta. La muestra fue colocada en un espectrómetro de fluorescencia para la detección de fluorescencia. Como se muestra en las Figuras 11A y 11B, la intensidad fluorescente relativa a 525 nm de la muestra de DNA de tipo silvestre y cadena sencilla (Figura 11A) era cinco veces mayor que la del DNA mutante de cadena sencilla (Figura 11B).

Ejemplo 12

Cada muestra, que comprendía 400 picomoles de sonda, 100 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 1) y 100 \mul de tampón (TBE 0,5x, pH de 6,5), fue calentada a 95ºC durante 30 minutos. Luego se dejó que cada muestra se hibridase durante 1 hora a 25ºC. Antes de la medición de la fluorescencia, cada muestra fue transferida a una columna de G50 y fue centrifugada a 720 rpm durante 2 minutos. Los híbridos fluyeron a través de la columna y fueron recogidos en una cubeta, mientras que la sonda no hibridada fue separada por filtración y quedó retenida en la columna. La cubeta fue colocada en un espectrómetro de fluorescencia para la medición de la fluorescencia.

Como se muestra en las Figuras 12A y 12B, la intensidad de fluorescencia relativa a 525 nm muestra una gran diferencia en los espectros. El espectro con una señal fluorescente más intensa (Figura 12 A) muestra una hibridación de la sonda con el DNA WT (ID. SEC. nº 1) con un apareamiento perfecto. El otro espectro, con una intensidad fluorescente más débil (Figura 12B), muestra una hibridación de la sonda con el DNA WT (ID. SEC. nº 1) con un apareamiento erróneo de un bp.

Ejemplo 13

Dos sondas de PNA que tenían el mismo colorante (fluoresceína) se hibridaron con dos dianas de diferentes cadenas que presentaban un apareamiento perfecto.

Ejemplo 13a

Una sonda que se aparea perfectamente con una secuencia diana.

Un fragmento de DNA genómico de 150 bp procedente de DNA de p53 de tipo mutado (ID. SEC. nº 11) fue multiplicado por PCR y fue purificado usando el sistema QIAquick (QIAGEN Inc., Chatsworth, California, EE.UU.) para purificación de productos de PCR. El fragmento mutado era idéntico al fragmento de tipo silvestre (ID. SEC. nº 1) salvo por una mutación de dos bases en la posición de aminoácido 340 (es decir, las bases 88-90), en la que la secuencia ATG de tipo silvestre del DNA estaba cambiada por GAG.

Una sonda de PNA de 12 unidades (Sonda nº 1) fue sintetizada por PerSeptive Biosystems, Inc. de Framingham, Massachusetts. EE.UU. La sonda, que tenía la estructura:

5' H-Fluo-O-CAT TCA GCT CTC Lys-CONH_{2},

fue diseñada para que fuera complementaria de un segmento de 12 nucleótidos del DNA ME de p53 de 150 bp, comenzando en la posición 95 de par de bases y acabando en la posición 106 de par de bases (véase la ID. SEC. nº 11).

Se usó una disolución de TBE 0,5x (Tris-borato 0,0225 M/EDTA 0,0005 M, pH de 6,5) como tampón de hibridación. Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 11) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 2,5 picomoles de la Sonda nº 1 a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación (obtenida de Pharmacia Biotech, AB, Uppsala, Suecia). La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 13A muestra el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 11) hibridados con 2,5 picomoles de Sonda nº 1. Aparece un pico a 525 nm.

\newpage

Ejemplo 13b

Una sonda que se aparea perfectamente con una secuencia diana.

Se preparó una sonda de PNA de 12 unidades (Sonda nº 2), sintetizada por PerSeptive Biosystems, Inc., que tenía la estructura:

5' H-Fluo-O-TCG AGG AGT TCC Lys-CONH_{2},

para que fuera totalmente complementaria de una diana de la cadena de DNA ME complementaria de la cadena presentada como diana en el Ejemplo 13a, comenzando en la posición 83 de par de bases y acabando en la posición 94 de par de bases (véase la ID. SEC. nº 11).

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 11) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadió la sonda a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 13B muestra el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 11) hibridados con 5 picomoles de Sonda nº 2.

Ejemplo 13c

Dos sondas que se aparean perfectamente con dos secuencias diana de diferentes cadenas.

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 11) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 2,5 picomoles de la Sonda nº 1 y 5 picomoles de la Sonda nº 2 a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 13C muestra el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 11) hibridados con 2,5 picomoles de Sonda nº 1 y 5 picomoles de Sonda nº 2. Como se muestra en la Figura 13C, la intensidad fluorescente a 525 nm es aproximadamente la suma de las intensidades a 525 nm mostradas en las Figuras 13A y 13B.

Ejemplo 14

Dos sondas de PNA que tenían diferentes colorantes (fluoresceína y rodamina) se hibridaron con una diana que presentaba un apareamiento perfecto.

Ejemplo 14a

Un fragmento de DNA genómico de 150 bp procedente de DNA de p53 de tipo silvestre (ID. SEC. nº 1) fue multiplicado por PCR y fue purificado usando el sistema QIAquick para purificación de productos de PCR.

Una sonda de PNA de 12 unidades marcada con rodamina (Sonda nº 3), sintetizada por PerSeptive Biosystems, Inc., que tenía la estructura:

5' H-Rho-O-CAT TCA GCT CTC Lys-CONH_{2},

fue diseñada para que fuera complementaria de un segmento de 12 nucleótidos del DNA de p53 de 150 bp, comenzando en la posición 95 de par de bases y acabando en la posición 106 de par de bases (véanse las ID. SEC. n^{os} 1, 11 y 12).

Se añadieron 20 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 1) a 50 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 20 picomoles de la Sonda nº 3 a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. Las disoluciones con los híbridos de PNA-DNA fueron dispuestas en una cubeta y fueron sometidas a medición de fluorescencia.

\newpage

La Figura 14A muestra un espectro de fluorescencia de DNA hibridado con la sonda de PNA marcada con rodamina. El pico de emisión del espectro de fluorescencia surge a aproximadamente 580 nm.

Ejemplo 14b

Se añadieron 20 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 1) a 50 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 15 picomoles de sonda marcada con rodamina (Sonda nº 3) y 5 picomoles de sonda marcada con fluoresceína (Sonda nº 1) a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue luego dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 14B muestra un espectro de fluorescencia de DNA hibridado con las sondas mixtas de sonda de PNA marcada con rodamina (Sonda nº 3) y sonda de PNA marcada con fluoresceína (Sonda nº 1). Surgió un hombro a 580 nm debido, al menos en parte, a la sonda marcada con rodamina e hibridada con la secuencia diana, y surgió un pico a 525 nm al que contribuía parcialmente la sonda marcada con fluoresceína e hibridada con la secuencia diana.

Ejemplo 15

Dos sondas de PNA que tenían diferentes colorantes (fluoresceína y rodamina) se hibridaron con dos dianas de dos cadenas que presentaban un apareamiento perfecto.

Ejemplo 15a

Se añadieron 20 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 11) a 50 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 20 picomoles de sonda marcada con rodamina (Sonda nº 3) a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue luego dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 15A muestra un espectro de fluorescencia de DNA hibridado con la sonda de PNA marcada con rodamina (Sonda nº 3). Surge un amplio pico a 580 nm al que contribuyen los complejos de hibridación marcados con rodamina.

Ejemplo 15b

Se añadieron 20 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 11) a 50 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 20 picomoles de sonda marcada con rodamina (Sonda nº 3) y 5 picomoles de sonda marcada con fluoresceína (Sonda nº 2) a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue luego dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 15B muestra un espectro de fluorescencia de DNA hibridado con las Sondas n^{os} 2 y 3. Surge un amplio pico a 580 nm al que contribuye la sonda marcadacon rodamina y aparece un pico a 525 nm al que contribuye la sonda marcada con fluoresceína.

Ejemplo 16

Un DNA de 633 bp (ID. SEC. nº 10) multiplicado por PCR y purificado que carecía de una secuencia diana fue usado como un testigo negativo para las sondas.

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 10) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x y luego se añadieron las Sondas n^{os} 1-3 a la disolución. Cada muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue luego dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 16A muestra un espectro de fluorescencia de la sonda sola (es decir, no se añadió DNA a la muestra, que incluía 15 picomoles de las sondas: 5 picomoles de cada una de las Sondas n^{os} 1, 2 y 3).

La Figura 16B muestra un espectro de fluorescencia de 5 picomoles de Sonda nº 1 y DNA testigo negativo (ID. SEC. nº 10).

La Figura 16C muestra un espectro de fluorescencia de 5 picomoles de Sonda nº 2 y DNA testigo negativo (ID. SEC. nº 10).

La Figura 16D muestra un espectro de fluorescencia de 5 picomoles de Sonda nº 3 y DNA testigo negativo (ID. SEC. nº 10).

Todos los espectros muestran la intensidad fluorescente a nivel de fondo a 525 nm y 580 nm.

Ejemplo 17

Dos sondas de PNA que tenían el mismo colorante (fluoresceína) se hibridaron con una secuencia diana que presentaba un apareamiento erróneo de un par de bases y una secuencia diana que presentaba un apareamiento perfecto.

Ejemplo 17a

Un fragmento de DNA genómico de 150 bp procedente del gen MQ de DNA de p53 (ID. SEC. nº 12) fue multiplicado por PCR y fue purificado usando el sistema QIAquick para purificación de productos de PCR. El fragmento mutado era idéntico al fragmento de DNA ME (ID. SEC. nº 11) salvo por una mutación de una base en la posición de aminoácido 340 (bases 88-90), en la que la secuencia CTC del DNA estaba cambiada por GTC.

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 12) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 5 picomoles de Sonda nº 2, que tiene un apareamiento erróneo de un par de bases con respecto a la secuencia diana, a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 17A muestra el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 12) hibridados con 5 picomoles de Sonda nº 2. El espectro muestra la intensidad fluorescente a nivel de fondo.

Ejemplo 17b

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 12) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadió la Sonda nº 1 a la disolución. Esta sonda se apareaba perfectamente con la diana de DNA. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 17B proporciona el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 12) hibridados con 5 picomoles de Sonda nº 1. La señal positiva a 525 nm se muestra claramente en la Figura 17B.

Ejemplo 17c

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 12) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 5 picomoles de Sonda nº 1 y 5 picomoles de Sonda nº 2 a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 17C muestra el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 12) hibridados con 5 picomoles de Sonda nº 1 y 5 picomoles de Sonda nº 2. La intensidad fluorescente a 525 nm es aproximadamente igual a la intensidad mostrada en la Figura 17B.

Ejemplo 18

Dos sondas de PNA que tenían diferentes colorantes (fluoresceína y rodamina) se hibridaron con una diana que presentaba un apareamiento erróneo de un bp y una diana que presentaba un apareamiento perfecto.

Ejemplo 18a

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 12) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 5 picomoles de sonda marcada con rodamina (Sonda nº 3) a la disolución. Esta sonda se apareaba perfectamente con la secuencia diana. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 18A muestra el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 12) hibridados con 5 picomoles de Sonda nº 3. La señal positiva a 580 nm se muestra claramente en la Figura 18A.

Ejemplo 18b

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 12) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 5 picomoles de Sonda nº 3, que se apareaba perfectamente con la secuencia diana, y 5 picomoles de Sonda nº 2, que tiene un apareamiento erróneo de un par de bases con la secuencia diana, a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 18B muestra el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 12) hibridados con 5 picomoles de Sonda nº 3 y 5 picomoles de Sonda nº 2. La intensidad fluorescente a 525 nm es aproximadamente igual a la intensidad mostrada en la Figura 18A. La diferencia entre las intensidades a 580 nm y 525 nm es aproximadamente igual a la mostrada en la Figura 18A.

Ejemplo 19

Tres sondas de PNA que tenían el mismo colorante (fluoresceína) se hibridaron con dos secuencias diana que presentaban un apareamiento erróneo de un par de bases y una diana que presentaba un apareamiento perfecto.

Ejemplo 19a

Un fragmento de DNA genómico de 150 bp procedente del gen QR de DNA de p53 (ID. SEC. nº 13) fue multiplicado por PCR y fue purificado usando el sistema QIAquick para purificación de productos de PCR. El fragmento mutado era idéntico al fragmento de DNA ME (ID. SEC. nº 11) salvo por una mutación de una base en la posición de aminoácido 340 (bases 85-87), en la que la secuencia CTC del DNA estaba cambiada por GTC, y un apareamiento erróneo de una base en la posición de aminoácido 344 (bases 100-102), en la que la secuencia CTG del DNA estaba cambiada por CGG.

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 13) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 5 picomoles de Sonda nº 1, que tiene un apareamiento erróneo de un par de bases con respecto a la secuencia diana en la posición 101 de par de bases, a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 19A muestra el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 13) hibridados con 5 picomoles de Sonda nº 1. El espectro muestra la intensidad fluorescente a 525 nm a nivel de fondo.

Ejemplo 19b

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 13) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadió la Sonda nº 2, que tiene un apareamiento erróneo de un par de bases con respecto a la secuencia diana en la posición 85 de par de bases, a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 19B muestra el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 13) hibridados con 5 picomoles de Sonda nº 2. El espectro muestra la intensidad fluorescente a 525 nm a nivel de fondo.

\newpage

Ejemplo 19c

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 13) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Una sonda de PNA de 12 unidades marcada con fluoresceína (Sonda nº 4), sintetizada por PerSeptive Biosystems, Inc., que tenía la estructura:

5' H-Fluo-O-CAT TCC GCT CTC Lys-CONH_{2},

fue diseñada para que fuera totalmente complementaria de un segmento de 12 nucleótidos de ID. SEC. nº 13, comenzando en la posición 95 de par de bases y acabando en la posición 106 de par de bases. Se añadió esta sonda a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 19C muestra el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 13) hibridados con 5 picomoles de Sonda nº 4. La señal positiva a 525 nm se muestra claramente en la Figura 19C.

Ejemplo 19d

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 13) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 5 picomoles de Sonda nº 1 y 5 picomoles de Sonda nº 2 a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 19D proporciona el espectro de fluorescencia de 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 13) hibridados con 5 picomoles de Sonda nº 1 y 5 picomoles de Sonda nº 2. El espectro muestra la intensidad fluorescente a 525 nm a nivel de fondo.

Ejemplo 19e

Se añadieron 5 picomoles de DNA (ID. SEC. nº 13) a 115 \mul de tampón TBE 0,5x. Luego se añadieron 5 picomoles de Sonda nº 1, 5 picomoles de Sonda nº 2 y 5 picomoles de Sonda nº 4 a la disolución. La muestra fue calentada a 95ºC durante 10 minutos y fue dejada hibridar a 25ºC durante 30 minutos.

Antes de la medición de la fluorescencia, la sonda no unida fue separada de la disolución por filtración mediante una columna de G50 para centrifugación. La disolución con los híbridos de PNA-DNA fue dispuesta en una cubeta y fue sometida a medición de fluorescencia.

La Figura 19E proporciona el espectro de fluorescencia de DNA QR (ID. SEC. nº 13) hibridado con las Sondas de PNA nos 1, 2 y 4. La intensidad fluorescente a 525 nm es aproximadamente igual a la intensidad mostrada en la Figura 19C.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTES: Eileen Nie y Yuan Min Wu

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(ii)

TÍTULO DEL INVENTO: Métodos diagnósticos con PNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 13

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Caesar, Rivise, Bernstein, Cohen & Pokotilow, Ltd.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 12th Floor, 7 Penn Center, 1635 Market Street

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Philadelphia

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: Pennsylvania

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: U.S.A.

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 19103-2212

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: compatible con ordenador personal IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Patentin, licencia nº 1.0, versión nº 1.30

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD EN CURSO:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Tener, David M.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 37,054

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: E1047/20001

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 215-567-2010

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 215-751-1142

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 1:

1

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 2:

2

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 3:

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 4:

4

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 5:

5

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 6:

6

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 375 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 7:

7

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 375 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 8:

8

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 375 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 9:

9

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 633 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 10:

10

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 11:

11

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 12:

12

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: cadena doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 13:

13

Claims (67)

1. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos diana de cadena sencilla o cadena doble en un medio líquido, método que comprende:

añadir a dicho medio líquido una sonda de PNA capaz de formar un complejo de hibridación con dicha al menos una secuencia diana, en el que dicha sonda de PNA comprende un marcador fluorescente;

separar la sonda de PNA no hibridada de dicho complejo de hibridación para formar un medio de ensayo;

irradiar dicho medio de ensayo con un haz de láser que tiene una longitud de onda que excita a dicho marcador fluorescente y causa que dicho marcador fluorescente emita luz fluorescente;

medir la intensidad de dicha luz fluorescente emitida; y

comparar dicha intensidad medida con una intensidad de referencia para detectar si dicho medio líquido contiene dicha al menos una secuencia diana y determinar el número de apareamientos erróneos de bases entre dicha al menos una secuencia diana y dicha sonda de PNA, a lo largo de un intervalo que incluye de 0 apareamientos erróneos de bases a al menos 3 apareamientos erróneos de bases,

y en el que dicho método distinto de dicha operación de separación es llevado totalmente a cabo sin unir dicha sonda de PNA, dicha secuencia de nucleótidos ni dicho complejo de hibridación a un soporte sólido o un gel.

2. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha separación es realizada mediante al menos una de las técnicas: filtración, centrifugación, precipitación y electroforesis libre en disolución.

3. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicho haz de láser tiene una longitud de onda de aproximadamente 450 a aproximadamente 530 nm.

4. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha luz fluorescente emitida es medida en el intervalo de 400 a 1.000 nm.

5. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que al menos dos diferentes sondas de PNA capaces de formar un complejo de hibridación con dicha al menos una secuencia diana son añadidas a dicho medio líquido, una primera de dichas al menos dos diferentes sondas de PNA es complementaria de un primer segmento de una primera secuencia de nucleótidos diana, una segunda de dichas al menos dos diferentes sondas de PNA es complementaria de un segundo segmento de una segunda secuencia de nucleótidos diana, y dichos segmentos primero y segundo son distintos.

6. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 5, en el que dichas sondas primera y segunda son completamente complementarias de dichos segmentos primero y segundo, respectivamente.

7. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 6, en el que dicha primera secuencia de nucleótidos es complementaria de dicha segunda secuencia de nucleótidos.

8. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que dicha primera secuencia de nucleótidos y dicha segunda secuencia de nucleótidos están emparejadas como DNA de cadena doble.

9. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 6, en el que dicha primera secuencia de nucleótidos y dicha segunda secuencia de nucleótidos están en genomas diferentes.

10. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 9, en el que dicha primera sonda tiene un primer marcador que tiene una primera intensidad de emisión fluorescente a una primera longitud de onda, dicha segunda sonda tiene un segundo marcador que tiene una segunda intensidad de emisión fluorescente a una segunda longitud de onda, dichas longitudes de onda primera y segunda son diferentes, dicha primera secuencia de nucleótidos es detectada al comprobar la intensidad de emisión fluorescente a dicha primera longitud de onda, y dicha segunda secuencia de nucleótidos es detectada al comprobar la intensidad de emisión fluorescente a dicha segunda longitud de onda.

11. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 6, en el que dicha primera sonda tiene un primer marcador que tiene una primera intensidad de emisión fluorescente a una primera longitud de onda, dicha segunda sonda tiene un segundo marcador que tiene una segunda intensidad de emisión fluorescente a una segunda longitud de onda, dichas longitudes de onda primera y segunda son diferentes, dicha primera secuencia de nucleótidos es detectada al comprobar la intensidad de emisión fluorescente a dicha primera longitud de onda, y dicha segunda secuencia de nucleótidos es detectada al comprobar la intensidad de emisión fluorescente a dicha segunda longitud de onda.

12. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 11, en el que dicha primera secuencia de nucleótidos es un testigo positivo del que se espera que esté presente en dicho medio líquido que se analiza, dicha primera intensidad es dicha intensidad de referencia, dicha segunda intensidad es dicha intensidad medida, y dicha segunda secuencia de nucleótidos es detectada al comparar dicha primera intensidad y dicha segunda intensidad.

13. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 12, en el que la segunda secuencia de nucleótidos sólo se halla en un genoma mutante, y la primera secuencia de nucleótidos se halla en dicho genoma mutante y en un correspondiente genoma de tipo silvestre.

14. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 13, en el que los marcadores primero y segundo son seleccionados del grupo que consiste en fluoresceína y rodamina.

15. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 12, en el que una tercera sonda de PNA que tiene un tercer marcador que tiene una tercera intensidad de emisión fluorescente a una tercera longitud de onda que difiere de las longitudes de onda primera y segunda es añadida a dicho medio líquido como un testigo negativo del que no se espera que se hibride con ninguna secuencia de nucleótidos, y dicha segunda secuencia de nucleótidos es detectada al comparar las intensidades primera, segunda y tercera.

16. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que al menos dos diferentes sondas de PNA capaces de formar un complejo de hibridación con dicha al menos una secuencia diana son añadidas a dicho medio líquido, una primera de dichas al menos dos diferentes sondas de PNA es complementaria de un primer segmento de dicha al menos una secuencia diana, una segunda de dichas al menos dos diferentes sondas de PNA es complementaria de un segundo segmento de dicha al menos una secuencia diana, y dichos segmentos primero y segundo son distintos.

17. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 16, en el que dicha primera sonda tiene un primer marcador que tiene una primera intensidad de emisión fluorescente a una primera longitud de onda, dicha segunda sonda tiene un segundo marcador que tiene una segunda intensidad de emisión fluorescente a una segunda longitud de onda, dichas longitudes de onda primera y segunda son diferentes, dicho primer segmento es detectado al comprobar la intensidad de emisión fluorescente a dicha primera longitud de onda, y dicho segundo segmento es detectado al comprobar la intensidad de emisión fluorescente a dicha segunda longitud de onda.

18. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 17, en el que dicho primer segmento es un testigo positivo del que se espera que esté presente en dicho medio líquido que se analiza, dicha primera intensidad es dicha intensidad de referencia, dicha segunda intensidad es dicha intensidad medida, y dicho segundo segmento es detectado al comparar dicha primera intensidad y dicha segunda intensidad.

19. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 18, en el que una tercera sonda de PNA que tiene un tercer marcador que tiene una tercera intensidad de emisión fluorescente a una tercera longitud de onda que difiere de las longitudes de onda primera y segunda es añadida a dicho medio líquido como un testigo negativo del que no se espera que se hibride con ningún segmento de nucleótidos, y dicho segundo segmento es detectado al comparar las intensidades primera, segunda y tercera.

20. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicho complejo de hibridación consiste esencialmente en una secuencia de PNA, un fluoróforo y dicha secuencia de nucleótidos.

21. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que todas las sondas empleadas en dicho método consisten en las mismas secuencia y marcador, siendo dicho marcador el único marcador detectado con dicho método.

22. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha luz fluorescente emitida tiene una longitud de onda mayor que la longitud de onda de dicho haz de láser.

23. Un método para detectar al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha al menos una secuencia de nucleótidos es DNA de doble cadena.

24. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de cadena sencilla o cadena doble en un primer medio líquido, que comprende:

proporcionar dicho primer medio líquido que comprende secuencias de nucleótidos de muestra;

\newpage

añadir a dicho primer medio líquido una sonda de PNA capaz de formar un complejo de hibridación con dicha secuencia de nucleótidos, en el que dicha sonda de PNA comprende un marcador fluorescente;

irradiar dicho primer medio líquido con un haz de láser que tiene una longitud de onda que excita a dicho marcador fluorescente y causa que dicho marcador fluorescente emita luz fluorescente;

detectar una primera intensidad de dicha luz fluorescente en dicho primer medio líquido; y

determinar si dicha primera intensidad es igual que una segunda intensidad de un segundo medio líquido que contiene dicha secuencia de nucleótidos hibridada con dicha sonda de PNA, para detectar si dicha secuencia de nucleótidos está en dicho primer medio líquido,

en el que dicha sonda de PNA, dicha secuencia de nucleótidos y dicho complejo de hibridación no están unidos a un soporte sólido ni a un gel, y dicho complejo de hibridación consiste esencialmente en una secuencia de PNA, un fluoróforo y dicha secuencia de nucleótidos.

25. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicho haz de láser es producido por un láser de ion argón que irradia a dicho marcador con una luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 450 a aproximadamente 530 nm.

26. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicha luz fluorescente es detectada en el intervalo de 400 a 1.000 nm.

27. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que (i) dicha secuencia de nucleótidos es un DNA de tipo mutante que ha de ser distinguido de un DNA de tipo silvestre que difiere de dicho DNA de tipo mutante, (ii) dicha sonda de PNA es completamente complementaria de un segmento de dicho DNA de tipo mutante y no es completamente complementaria de un segmento de dicho DNA de tipo silvestre, y (iii) dicho DNA de tipo mutante es detectado si dicha primera intensidad es igual a dicha segunda intensidad.

28. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que (i) dicha secuencia de nucleótidos es un DNA de tipo silvestre que ha de ser distinguido de un DNA de tipo mutante que difiere de dicho DNA de tipo silvestre, (ii) dicha sonda de PNA es completamente complementaria de un segmento de dicho DNA de tipo silvestre y no es completamente complementaria de un segmento de dicho DNA de tipo mutante, y (iii) dicho DNA de tipo silvestre es detectado si dicha primera intensidad es igual a dicha segunda intensidad.

29. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicha secuencia de nucleótidos es desnaturalizada en dicho medio líquido, antes de dicha operación de detección, a una temperatura de aproximadamente 85ºC a aproximadamente 100ºC durante un periodo de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 5 horas.

30. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 29, en el que la formación de dicho complejo de hibridación es llevada a cabo a una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 75ºC durante un periodo de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 24 horas.

31. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 30, en el que dicha operación de desnaturalización es llevada a cabo durante no más de 60 minutos, después de lo cual dicha temperatura es pasivamente llevada a la temperatura ambiental sin sofocación.

32. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicha sonda de PNA es añadida a dicho primer medio líquido en una concentración de 1 a 20 veces la concentración que se sospecha que tiene dicha secuencia de nucleótidos.

33. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que el volumen total de dicho primer medio líquido en dicha operación de detección no es superior a aproximadamente 5 mililitros.

34. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 33, en el que dicho volumen total no es superior a aproximadamente 10 microlitros.

35. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicha secuencia de nucleótidos es DNA de doble cadena.

36. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 29, en el que dicha sonda de PNA es añadida a dicho primer medio líquido antes de la complexión de dicha operación de desnaturalización.

37. Un método de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que todas las sondas empleadas en dicho método consisten en las mismas secuencia y marcador, siendo dicho marcador el único marcador detectado con dicho método.

38. Un método de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicha luz fluorescente detectada consiste esencialmente en dicha luz fluorescente emitida por dicho marcador.

39. Un método de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicha sonda de PNA es completamente complementaria de un segmento de dicha secuencia de nucleótidos.

40. Un método de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicha sonda de PNA presenta un apareamiento erróneo de una base con respecto a un segmento de dicha secuencia de nucleótidos.

41. Un método de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicha sonda de PNA presenta un apareamiento erróneo de dos bases con respecto a un segmento de dicha secuencia de nucleótidos.

42. Un método de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicha sonda de PNA presenta un apareamiento erróneo de tres bases con respecto a un segmento de dicha secuencia de nucleótidos.

43. Un método de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que (i) dichas secuencias de nucleótidos de muestra son idénticas a dicha secuencia de nucleótidos o son secuencias análogas que difieren de dicha secuencia de nucleótidos en al menos una base, (ii) dicha sonda de PNA es completamente complementaria de un segmento de dicha secuencia de nucleótidos y no es complementaria de un segmento de dichas secuencias análogas, (iii) dicha secuencia de nucleótidos es detectada si dicha primera intensidad es igual que dicha segunda intensidad, y (iv) dichas secuencias análogas son detectadas si dicha primera intensidad no es igual que dicha segunda intensidad.

44. Un método de acuerdo con la Reivindicación 43, en el que dichas secuencias análogas difieren de dicha secuencia de nucleótidos en una base.

45. Un método de acuerdo con la Reivindicación 43, en el que dichas secuencias análogas difieren de dicha secuencia de nucleótidos en dos bases.

46. Un método de acuerdo con la Reivindicación 43, en el que dichas secuencias análogas difieren de dicha secuencia de nucleótidos en tres bases.

47. Un método de acuerdo con la Reivindicación 43, en el que todas las sondas empleadas en dicho método consisten en las mismas secuencia y marcador, siendo dicho marcador el único marcador detectado con dicho método.

48. Un método de acuerdo con la Reivindicación 47, en el que dicha luz fluorescente detectada consiste esencialmente en dicha luz fluorescente emitida por dicho marcador.

49. Un método de acuerdo con la Reivindicación 48, en el que dichas secuencias análogas difieren de dicha secuencia de nucleótidos en una base.

50. Un método de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que (i) dichas secuencias de nucleótidos de muestra son idénticas a dicha secuencia de nucleótidos o son secuencias análogas que difieren de dicha secuencia de nucleótidos en al menos una base, (ii) dicha sonda de PNA es completamente complementaria de un segmento de dichas secuencias análogas y no es completamente complementaria de un segmento de dicha secuencia de nucleótidos, (iii) dicha secuencia de nucleótidos es detectada si dicha primera intensidad es igual que dicha segunda intensidad, y (iv) dichas secuencias análogas son detectadas si dicha primera intensidad no es igual que dicha segunda intensidad.

51. Un método de acuerdo con la Reivindicación 50, en el que dichas secuencias análogas difieren de dicha secuencia de nucleótidos en una base.

52. Un método de acuerdo con la Reivindicación 50, en el que dichas secuencias análogas difieren de dicha secuencia de nucleótidos en dos bases.

53. Un método de acuerdo con la Reivindicación 50, en el que dichas secuencias análogas difieren de dicha secuencia de nucleótidos en tres bases.

54. Un método de acuerdo con la Reivindicación 50, en el que todas las sondas empleadas en dicho método consisten en las mismas secuencia y marcador, siendo dicho marcador el único marcador detectado con dicho método.

55. Un método de acuerdo con la Reivindicación 54, en el que dicha luz fluorescente detectada consiste esencialmente en dicha luz fluorescente emitida por dicho marcador.

56. Un método de acuerdo con la Reivindicación 55, en el que dichas secuencias análogas difieren de dicha secuencia de nucleótidos en una base.

57. Un método de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicha luz fluorescente detectada tiene una longitud de onda mayor que la longitud de onda de dicho haz de láser.

58. Un método de acuerdo con la Reivindicación 24, en el que dicha primera intensidad es inversamente proporcional al número de apareamientos erróneos de bases entre dicha secuencia de nucleótidos y dicha sonda de PNA, a lo largo de un intervalo que incluye de 0 apareamientos erróneos de bases a al menos 3 apareamientos erróneos de bases.

59. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de cadena sencilla o cadena doble en un primer medio líquido, que comprende:

proporcionar dicho primer medio líquido que comprende secuencias de nucleótidos de muestra;

añadir a dicho primer medio líquido una sonda de PNA capaz de formar un complejo de hibridación con dicha secuencia de nucleótidos, en el que dicha sonda de PNA comprende un marcador fluorescente;

separar la sonda de PNA no hibridada de dicho complejo de hibridación para formar un primer medio de ensayo;

irradiar dicho primer medio de ensayo con un haz de láser que tiene una longitud de onda que excita a dicho marcador fluorescente y causa que dicho marcador fluorescente emita luz fluorescente;

detectar directamente una primera intensidad de dicha luz fluorescente emitida, en dicho primer medio de ensayo; y

comparar dicha primera intensidad con una intensidad de referencia producida al sondar una secuencia testigo positivo y con una intensidad de línea de base producida al sondar una secuencia testigo negativo,

en el que dicha secuencia de nucleótidos es detectada cuando dicha primera intensidad es igual que dicha intensidad de referencia, dicha secuencia de nucleótidos no es detectada cuando dicha primera intensidad es igual que dicha intensidad de línea de base, y una secuencia homóloga que difiere de dicha secuencia de nucleótidos en al menos una base es detectada cuando dicha primera intensidad está entre dicha intensidad de línea de base y dicha intensidad de referencia, y en el que dicho método distinto de dicha operación de separación es llevado totalmente a cabo sin unir dicha sonda de PNA, dicha secuencia de nucleótidos ni dicho complejo de hibridación a un soporte sólido o un gel.

60. Un método de acuerdo con la Reivindicación 59, en el que dicha secuencia homóloga difiere de dicha secuencia de nucleótidos en una base.

61. Un método de acuerdo con la Reivindicación 59, en el que dicho complejo de hibridación consiste esencialmente en una secuencia de PNA, un fluoróforo y dicha secuencia de nucleótidos.

62. Un método de acuerdo con la Reivindicación 59, en el que todas las sondas empleadas en dicho método consisten en las mismas secuencia y marcador, siendo dicho marcador el único marcador detectado con dicho método.

63. Un método de acuerdo con la Reivindicación 59, en el que dicha luz fluorescente detectada consiste esencialmente en dicha luz fluorescente emitida por dicho marcador.

64. Un método de acuerdo con la Reivindicación 59, en el que dicha luz fluorescente detectada tiene una longitud de onda mayor que la longitud de onda de dicho haz de láser.

65. Un método de acuerdo con la Reivindicación 59, en el que dicha primera intensidad es inversamente proporcional al número de apareamientos erróneos de bases entre dicha secuencia de nucleótidos y dicha sonda de PNA, a lo largo de un intervalo que incluye de 0 apareamientos erróneos de bases a al menos 3 apareamientos erróneos de bases.

66. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos de cadena sencilla o cadena doble en un medio líquido, que comprende:

proporcionar dicho medio líquido que comprende primeras secuencias de nucleótidos que son idénticas a dicha secuencia de nucleótidos, o segundas secuencias de nucleótidos que difieren de dicha secuencia de nucleótidos en al menos una base;

añadir a dicho medio líquido sondas de PNA completamente complementarias de un segmento de dicha secuencia de nucleótidos y no completamente complementarias de un segmento de dichas segundas secuencias de nucleótidos, en el que cada una de dichas sondas de PNA comprende un marcador fluorescente;

hacer que dichas sondas de PNA se hibriden con dichas secuencias de nucleótidos primeras o segundas;

irradiar dicho medio líquido para causar que dicho marcador fluorescente emita una luz fluorescente que tenga una longitud de onda de 400 a 1.000 nm; y

detectar la intensidad de dicha luz fluorescente,

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en el que se aplica un campo eléctrico a dicho medio líquido antes de, o concurrentemente con, dicha operación de detección, y se detecta un cambio de dicha intensidad de dicha luz fluorescente en función de dicho campo eléctrico como una indicación de si dichas sondas de PNA se hibridan con dichas primeras secuencias de nucleótidos o con dichas segundas secuencias de nucleótidos.

67. Un método de acuerdo con la Reivindicación 66, en el que dichas secuencias de nucleótidos primeras y segundas difieren en una base.