ES2202644T3

ES2202644T3 - Sintesis total del analogo hip amino de la didemnin a.

Info

Publication number: ES2202644T3
Application number: ES97946294T
Authority: ES
Inventors: Kenneth L. Rinehart; Alexandra J. Sanborn
Original assignee: University of Illinois at Urbana Champaign; University of Illinois System
Current assignee: University of Illinois at Urbana Champaign; University of Illinois System
Priority date: 1996-10-24
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2017-10-24
Also published as: JP2001504814A; PT956033E; AU726146B2; EP0956033A4; EP0956033B1; WO1998017302A1; US6380156B1; ATE245435T1; AU5149598A; CA2269878A1; DK0956033T3; DE69723728D1; DE69723728T2; EP0956033A1

Abstract

SE PRESENTA UN PROCEDIMIENTO SINTETICO PARA LA OBTENCION DE INTERMEDIARIOS Y SU UTILIZACION EN LA PREPARACION DE ANALOGOS DE LA DIDEMNINA A ASI COMO PRODUCTOS FARMACEUTICOS Y EL USO DE LOS MISMOS.

Description

Síntesis total del análogo Hip de la didemnina A.

Antecedentes de la invención

Las didemninas fueron asiladas a partir de tunicato del Caribe Trididemnum solidum^{1}. Estos depsipéptidos cíclicos poseen una variedad de actividades biológicas incluyendo actividades^{2-5} in vitro e in vivo, antivirales, antitumorales, e immunosupresoras. Son inhibidores potentes de las células de leucemia L1210 in vitro, y también son activas in vivo frente a la leucemia P388 y el melanoma^{3} B16. La didemnina B, uno de los compuestos más activos de esta clase, es aproximadamente veinte veces más citotóxico que la didemnina A in vitro y ha superado los ensayos de fase clínica II para la actividad antitumoral^{3}. Tanto la didemnina A como la B muestran actividad antiviral frente a los virus de DNA y RNA, siendo más activa la didemnina B^{4}. Las estructuras de las didemninas A y B han sido establecidas como 1 y 2, respectivamente^{6}.

1

Los estudios de las relaciones estructura actividad se han visto, de alguna manera, limitados debido al número restringido de modificaciones asequibles de los compuestos de extracción natural. Aunque se ha atribuido la bioactividad de la didemnina B a su cadena lateral^{1b}, también se han examinado otros hechos estructurales. Un espectro de rayos X de la estructura del cristal realizada por Hossain, y col. ^{7}, muestra que la cadena lateral de forma \beta, el grupo hidroxilo de la isostatina, y el residuo tirosina se extienden hacia fuera respecto al resto de la molécula, lo que lleva a especular sobre su importancia para la actividad biológica. Los cambios estructurales de aquellas áreas han mostrado que estas características son esenciales para la actividad^{8}.

Aunque muchos estudios han arrojado luz sobre la farmacología y la química de las didemninas, se conoce poco respecto a su mecanismo de acción. Sin embargo, recientes estudios bioquímicos de posibles sitios de unión han proporcionado resultados prometedores. Los estudios llevados a cabo por Shen, y col. ^{9}, han mostrado que la didemnina B se une al sitio en el nódulo Nb2 de las células del linfoma y que esta unión puede ser responsable de la actividad immunosupresora. Schreiber y colaboradores^{10} han descrito que la didemnina A une el factor de elongación 1\alpha (EF-1\alpha) de un modo dependiente del GTP que sugiere que el EF-1\alpha puede ser el objetivo responsable de la capacidad de las didemninas para inhibir la Síntesis de proteínas.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención, proporcionamos lo siguiente:

a.: El compuesto Cbz-[Aip^{3}]-Didemnina A.

b.: El compuesto [Aip^{3}]-Didemnina A.

c.: El compuesto ácido (2S,4S)-aminoisovalerilpropiónico (Aip).

d.: El procedimiento sintético para la formación de análogo Hip amino de la didemnina A, de modo que dicho procedimiento comprenda las etapas de:

\newpage

(a) formar un heptapéptido lineal por acoplamiento de dos subunidades, Cbz-D-MeLeuThr(OMe_{2}TirBoc)OH (5) y H-IstAipLeuProOTMSe (6), seguido por desproteción para obtener el heptapéptido lineal (7); y

(b) ciclación del heptapéptido (7) para dar lugar al análogo Hip (Aip) amino de la Didemnina A.

e.: El compuesto intermedio de fórmula 5, tal como se da en el presente documento.

f.: El compuesto intermedio de fórmula 6, tal como se da en el presente documento.

g.: El compuesto intermedio de fórmula 7, tal como se da en el presente documento.

h.: Una composición farmacéutica que comprende la Cbz-[Aip^{3}]didemnina A y opcionalmente un excipiente, diluyente o vehículo, farmacéuticamente aceptable.

i.: Una composición farmacéutica que comprende la [Aip^{3}]didemnina A y opcionalmente un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

j.: El uso de un compuesto de (a) o (b) en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores neoplásticos en mamíferos que comprende una cantidad efectiva de una composición farmacéutica definida en (h) o (i) para administrar a un mamífero que precise dicho tratamiento.

k.: El uso de un compuesto de (a) o (b) en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de infecciones virales al RNA o DNA de mamíferos que comprende una cantidad efectiva de una composición farmacéutica definida en (h) o (i) para administrar a un mamífero que precise dicho tratamiento.

l.: El uso de un compuesto de (a) o (b) en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de infecciones bacterianas de mamíferos que comprende una cantidad efectiva de una composición farmacéutica definida en (h) o (i) para administrar a un mamífero que precise de dicho tratamiento.

m.: El uso de un compuesto de (a) o (b) en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de infecciones por hongos en mamíferos que comprende una cantidad efectiva de una composición farmacéutica definida en (h) o (i) para administrar a un mamífero que precise de dicho tratamiento.

n.: El uso de un compuesto de (a) o (b) en la preparación de una composición farmacéutica para favorecer la immunosupresión en mamíferos que comprende una cantidad efectiva de una composición farmacéutica definida en (h) o (i) para administrar a un mamífero que precise de dicho tratamiento.

Detalles de la invención

En este documento presentamos estudios sintéticos en relación con un macrociclo modificado que posee un enlace amida en lugar de un enlace éster (3). Es probable que una modificación como esta de lugar a un incremento en la unión de hidrógeno en este punto activo, y de este modo, se proporcione un compuesto más activo. Además, la fácil naturaleza del enlace C-O nos hace creer que la sustitución de estos enlaces C-O con enlaces C-N puedan mejorar la estabilidad de estos compuestos.

Estrategia sintética

Las desconexiones retrosintéticas que formaron la base de nuestro plan para la preparación del análogo amino-Hip de la didemnina A se muestran en el Esquema I.

Hemos previsto la desconexión de la función amida entre el N,O-Me_{2}-L-tirosina y la L-prolina para dar el heptapéptido lineal 4 y la desconexión entre la L-treonina y la isostatina (3R,4R,5S) para proporcionar las dos unidades: una unidad del tripéptido 5 que comprende la N-Me-leucina, la treonina, y la N,O-Me_{2}-tirosina; y una unidad del tetrapéptido 6 que comprende la isostatina, el \alpha-(\alpha'amino- isovaleril)propionil(Aip), la leucina, y la prolina.

Figuras

Figura 1: Espectro de masas por LRFAB del tripéptido desprotegido 5.

Figura 2: Espectro de masas por LRFAB del tripéptido desprotonado 6.

Figura 3. Registro del cromatograma en HPLC en fase reversa del heptapéptido totalmente protegido 4.

Figura 4: Espectro de masas por LRFAB del heptapéptido totalmente protegido 4.

Figura 5: Espectro de masas por LRFAB del heptapéptido totalmente desprotegido.

Figura 6: Trace HPLC en fase reversa del heptapéptido lineal desprotegido 7.

Figura 7: Espectro de masas por LRFAB del heptapéptido desprotegido 7.

Figura 8: Espectro de masas por LRFAB del análogo amino Hip protegido 3.

Esquema I

2

Síntesis del Tripéptido 5. La preparación de la unidad de tripéptido desprotegida se muestra en el Esquema II. Nuestra aproximación empieza con la metilación de amino ácido no común Cbz-D-leucina, 71, con CH_{3}I/NaH^{11}. El acoplamiento del derivado Cbz-D-MeLeuOH con el grupo hidroxilo del derivado de treonina L-TheOEt^{12} se llevó a cabo con diciclohexilcarbodiimida (DCC)^{13} para proporcionar el dipéptido 81. La hidrólisis del éster con hidróxido potásico dio lugar al ácido carboxílico deseado el cual, a continuación, fue protegido como un éster de fenacilo (Pac) 9. El acoplamiento con el derivado de tirosina BocMe_{2}TryOH^{14} seguido por la eliminación del grupo protector Boc^{15} dio lugar a 10. La eliminación de la función fenacilo^{17} proporcionó el fragmento clave 5.

Esquema II

3

Reactivos: a) (i) CH_{3}I, NaH, THF; (ii) L-ThrOEt, DCC, CH_{2}Cl_{2}; b) (i) KOH, MeOH; (ii) fenacilBr, Et_{3}N, EtOAc; c) BocMe_{2}TryOH, DCC, DMAP, CH_{2}Cl_{2}; d) Zn, HOAc/H_{2}O.

Síntesis de Tetrapéptido 6

La construcción del fragmento 6 implica dos subunidades nuevas de ácido (2S,4S)-aminoisovalerilpropiónico (Aip) y de (3S,4R,5S)-isostatina (Ist). La Síntesis del derivado de isostatina requerido implica la (2R,3S)-alo-isoleucina. La conversión costosa del hidroxi ácido con retención y su conversión en dos etapas en el amino ácido con inversión (Esquema III)^{18}. La conversión de la (2S,3S)-isoleucina en el correspondiente \alpha-hidroxi ácido 12 fue conseguida utilizando un procedimiento bien conocido^{19} que permite la retención total de la configuración a través de una doble inversión. La esterificación fue llevada a cabo con cloruro de acetilo en metanol, y el correspondiente \alpha-hidroxi metil éster fue transformado en el éster tosiloxi metílico 13. El tratamiento del tosilato con azida sódica en DMF proporcionó el \alpha- azido éster 14 de forma estereoselectiva. La saponificación del éster proporcionó el \alpha- azido ácido 15. La hidrogenación de la azida al amino libre procedió fácilmente en metanol a presión atmosférica utilizando catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio al 20% sobre carbón)^{20}, para proporcionar la (2S,3S)alo-isoleucina 16.

Esquema III

4

La parte mayor de la subunidad de isostatina, la D-alo-isoleucina, 16, ha sido transformada en el ácido tert-butoxicarbonilo (Boc) bajo las condiciones estándar^{16}. Después de la activación de su grupo carboxilo bajo la forma del imidazolido por uso del carbonildiimidazol, el tratamiento del hidrógeno malonato de etilo con el enolato de magnesio dio lugar al \beta-ceto éster 18 requerido. La reducción con NaBH_{4} del grupo carbonilo del \beta-ceto éster fue estereoespecífica de forma efectiva, generando el deseado (3S,4R,5S)-19a como producto mayoritario (>10:1) después de separación cromatográfica. Tal como se muestra en el esquema IV, la saponificación proporcionó el Boc-(3S,4R,5S)-Ist-OH, 20, requerido.

Esquema IV

5

La etapa siguiente dirigida a la Síntesis del fragmento tripéptido (6) implicó la formación de la subunidad amino Hip. Esta unidad fue sintetizada a partir de la Cbz-L-valina, 21, utilizando un procedimiento basado en parte en el trabajo de Nagarajan.^{21} Después de la activación de su grupo carboxilo bajo la forma de imidazolida mediante el uso de carbonildiimidazol, del tratamiento del hidrógeno metil malonato de etilo (EHMM) con el enolato de magnesio proporciona el \beta-ceto éster requerido 22. La reducción del \beta-ceto éster con borohidruro de sodio da lugar a una mezcla diastereomérica de alcoholes que se separaron por columna cromatográfica. Después de saponificación y acoplamiento con el éster metílico de la L-leucina (L-LeuOMe), se obtuvo el derivado protegido 24 por cromatografía flash del bromuro deseado (Pac). La oxidación del alcohol secundario con clorocromato de piridinio en alúmina^{22} proporcionó la \beta-ceto amida. La eliminación del grupo protector fenacilo proporcionó el ácido libre el cual se acopló con el éster trimetilsilílico de la L-prolina. La hidrogenación catalítica eliminó el grupo protector Cbz, y el acoplamiento de la subunidad de isostatina 20 con la amina dio lugar al tetrapéptido desprotegido. Tal como se muestra en el Esquema V, el grupo protector Boc fue eliminado a continuación bajo condiciones estándar^{15} para proporcionar la unidad de tetrapéptido clave 6.

Esquema V

6

Reactivos: a)(i) CO(imid)_{2}, THF; (ii) EHMM, iPrMgBr; b) (i) NaBH_{4}, EtOH; (ii) KOH, MeOH; (iii) LeuOMe, DCC, CH_{2}Cl_{2}; c) (i) KOH, MeOH; (ii) fenacilBr, Et_{3}N, EtOAc; (iii) PCC, Al_{2}O_{3}, CH_{2}Cl_{2}; d) (i) Zn/HOAc; (ii) ProOTMSe, DCC, CH_{2}Cl_{2}; (iii) H_{2}, Pd/C, MeOH; (iv) BocIstOH 16, DCC, CH_{2}Cl_{2}; (v) HCl, dioxano.

Síntesis del Heptapéptido lineal 4

La Síntesis del heptapéptido lineal 4 implica el acoplamiento de dos subunidades, Cbz-D-MeLeuThe(OMe_{2}TirBoc)OH, 5 y H-IstAipLeuProOTMSe, 6. Se han intentado una variedad de métodos de acoplamiento (BopCl, ^{24} DCC, EEDQ^{25}), pero, el método EDCI^{26} ha mostrado ser el más eficiente para la formación del componente triprotegido 4. Las desprotecciones del éster de trimetilsililo y de las funciones Boc se llevaron a cabo bajo condiciones estándar para dar el heptapéptido lineal monoprotegido 7. Tal como se muestra en el Esquema VI, se consiguió la ciclación por tratamiento con EDCI para dar lugar al compuesto protegido 3 y la hidrogenación catalítica proporcionó el análogo no protegido amino Hip (Aip) de la didemnina A, 8.

Esquema VI

7

Reactivos: a) (i) EDC, NMM, DMF; (ii) TBAF, EDCI en THF, (iii) TFA, THF; (b) EDC, DMF

Descripción detallada de los alcances preferidos

Hemos descrito la Síntesis total del análogo amino Hip de la didemnina A. Los estudios previos han mostrado que las didemninas están sometidas a hidrólisis y sufren descomposición debido a la inestabilidad de los enlaces éster. La sustitución del enlace éster por una unión amida debe incrementar el mantenimiento de la conformación cíclica y, así, proporcionar un compuesto de mayor actividad.

Procedimientos Experimentales Generales.

Todas las marcas registradas son igualmente reconocidas. Los espectros de RMN ^{1}H se registraron en espectrómetros Varian XL-200, General Electric QE-300, Varian XL-400 y General Electric QN-500. Los desplazamientos químicos de ^{1}H son referencias en CDCl_{3} y metanol-d4 para el CHCl_{3} (7,26 ppm) y CD_{2}HOD (3,34 ppm) residuales. Los espectros de masas por impacto electrónico (EI) se registraron en un espectrómetro Finnigan MAT CH-5 DF. Los espectros de alta resolución por bombardeo atómico rápido (FABHR) y por bombardeo atómico rápido fueron registrados en un espectrómetro de masas VG ZAB-SE operando de modo FAB y utilizando una matriz de proyectiles mágicos^{27}. Los resultados microanalíticos se obtuvieron del Laboratorio Microanalítico de School of Chemical Sciences. Se obtuvieron los espectros de infrarrojo (IR) en un espectrofotómetro FTIR IR/32. Se analizaron muestras sólidas en forma de soluciones en cloroformo en células de cloruro sódico. Se analizaron los líquidos o aceites en forma de películas no diluidas entre placas de cloruro sódico.

Las rotaciones ópticas (en grados) fueron determinadas con un polarímetro digital DIP 360 o DIP 370 con una lámpara de Na (589 nm) utilizando una célula de 5 x 0,35 cm (1,0 ml). Los puntos de fusión fueron determinados en un aparato de punto de fusión capilar y se dan sin corregir. La cromatografía de columna en fase normal se llevó a cabo utilizando gel de sílice Merck-kieselgel (70-230 mesh). Se utilizó gel C18 Fuji-Davison (100-200 mesh) para cromatografía de columna en fase reversa. Todos los disolventes fueron de calidad espectral. La cromatografía de capa fina analítica se llevó a cabo en placas precortadas (Merck, indicador F-254). Estas placas fueron desarrolladas por varios métodos incluyendo la exposición a ninhidrina, yodo, y luz UV (254 nm). Se llevó a cabo la HPLC con un instrumento Waters 900 y una columna Econosil C_{18} (Alltech/Applied Science) y una columna Phenomenex C_{18}.

Se destiló el THF a partir de benzofenona cetil de sodio y el CH_{2}Cl_{2} a partir del P_{2}O_{5}. Se destiló la dimetilformamida (DMF), la trietilamina (Et_{3}N) y la N-metilmorfolina (NMM) sobre hidruro de calcio y se almacenaron sobre pastillas de KOH. Se destiló la piridina sobre KOH y se almacenó sobre tamices moleculares. Otros disolventes utilizados en las reacciones fueron de grado reactivo sin purificación. El dicarbonato de di-tert-butilo [(BocO)_{2}O], la diciclohexilcarboniimida (DCC), el clorhidrato de I-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarboniimida (EDCI), la dimetilaminoftidina (DMAP), el I-hidroxibenzotriazol (HOBT), la D- y la L-isoleucina, la L-tirosina, la L-isoleucina, la L-treonina, la D-valina y la L-prolina han sido obtenidas de Aldrich Chemical Company. Todas las reacciones que requieren condiciones anhidras se levaron a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno.

N-Benciloxicarbonil-N-metil-D-leucina (Cbz-D-MeLeuOH)

Se añadió en pequeñas porciones hidruro de sodio (dispersión al 60%, 6,47 g, 162,9 mmoles), con enfriamiento, sobre una solución de Cbz-D-LeuOH (14,4g, 54,3 mmoles) en THF (21,4 ml). A continuación se añadió yoduro de metilo (27,0 ml, 435 mmoles) mediante un embudo de adición. Se dejó la reacción en reposo a temperatura ambiente durante 24 horas. Se añadió lentamente acetato de etilo (70 ml) sobre la mezcla de reacción, seguido por agua, para destruir el exceso de hidruro sódico. A continuación se evaporó la solución a sequedad y se repartió el residuo aceitoso entre éter (30 ml) y agua (60 ml). Se lavó la capa de éter con bicarbonato sódico acuoso (5 ml) y las capas acuosas combinadas se acidificaron con HCl 4N hasta pH 3. Se extrajo la solución con acetato de etilo (3x15 ml) y el extracto se lavó con tiosulfato sódico acuoso al 5% (2x10 ml) y agua (10 ml). Se secó la solución sobre sulfato sódico y se evaporó el disolvente para obtener un residuo en forma de aceite que se dejó cristalizar toda la noche. La recristalización en éter de petróleo dio lugar a un sólido blanco (12,7g, 84%); [\alpha]^{29}Na + 24,7º (c 0,02, CHCl_{3}), Lit.^{11b} [\alpha]^{29}D + 26,9º (c 0,02, CHCl_{3}); p.f. 71-72ºC (Lit. ^{11b} 72-73ºC); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3} \delta 7,40-7,27 (5H,m), 5,17 (2H,s), 4,74 (1H,m), 2,87 (3H,s), 1,78-1,76 (2H,m), 1,62-1,57 (1H,m), 0,92-0,80 (6H,m); SM FAB 280,2 (M+H), 236,2 (M-CO_{2}); SM FABHR Calculado para C_{15}H_{22}NO_{4} (M+H) 280,1549, Encontrado 280,1556; Anal. Calculado para C_{15}H_{22}NO_{4}; C, 64,48; H, 7,58; N, 5,02. Encontrado: C, 64,30; H, 7,65; N, 4,93.

Éster etílico de la L-treonina (L-ThrOEt)

Se pasó una corriente de HCl gas seco a través de una suspensión de L-treonina (35,0g, 0,29 mmoles) en etanol absoluto (350 ml), con agitación, hasta que se formó una solución clara. A continuación se sometió a reflujo la solución durante 30 minutos, y se evaporó a sequedad bajo presión reducida, y el residuo en forma de aceite se suspendió en etanol absoluto (175 ml) y, de nuevo se evaporó a sequedad a presión reducida. A continuación se trató el residuo en forma de aceite con una solución saturada de amoníaco en cloroformo. Se eliminó el cloruro amónico por filtración y el filtrado se evaporó a sequedad a 0ºC bajo presión reducida. Se aisló un sólido amarillo (36,2 g, 85%); [\alpha]^{29}Na + 0,82 (c 5,0, EtOH), Lit, ^{12} [\alpha]^{29}D + 0,95º (C 5,0 EtOH); p.f. 51-53ºC (Lit^{12} 52-54ºC); ^{1}H NMR (200 MHz,CDCl_{3} con TMS) \delta 4,82 (1H,m), 4,40 (1H,d), 4,05 (2H,c), 1,62 (3H,d), 1,21 (3H;t); SM FAB 148,2 (M+H); SM FABHR Calculado para C_{6}H_{14}NO_{3} (M+H) 148,0974, encontrado 148,0972.

Éster etílico de la Z-D-metilleuciltreonina (8)

Se disolvió la Z-D-MeLeuOH (2,12 g, 7,59 mmoles) en 100 ml de CH_{2}Cl_{2} y se enfrió a 0ºC. Se añadió DCC (1,72 g, 8,35 mmoles) y se agitó la solución a 0ºC durante 10 minutos. Se añadió L-ThrOEt (1,12 g, 7,59 mmoles) en 5 ml de CH_{2}Cl_{2} y se dejó que la solución se calentara a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 15 horas, se eliminó la diciclohexilurea por filtración y se lavó con CH_{2}Cl_{2}. El filtrado se lavó con ácido cítrico al 10%, bicarbonato sódico al 5%, y agua y se secó sobre sulfato sódico. Se evaporó la solución a sequedad y se purificó el producto por cromatografía de columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc = 65/35) para dar lugar al producto en forma de un aceite amarillo (2,35 g, 76%); RMN ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,36-7,42 (5H,m), 6,73 (1H,d), 6,50 (1H,s ancho), 5,18 (2H, s), 4,83 (1H,m), 4,51 (1H,m), 4,30 (1H,m), 4,17 (2H,c), 2,81 (3H,s), 1,74 (2H,m), 1,70 (3H,d), 1-68 (2H,m), 1,20 (3H,t), 0,82-0,90 (6H,m); SM FAB 431,4 (M+Na), 409,2 (M+H); SM FABHR Calculado para C_{21}H_{33}N_{2}O_{6} (M+H) 409,2344, Encontrado 409,2339; Anal. calculado para C_{21}H_{32}N_{2}O_{6}: C, 61,73; H, 7,90; N,6,86, Encontrado =: C, 62,00; H, 8,08; N,7,07.

Z-D Metilleuciltreonina (Z-D-MeLeuThrOH)

Se disolvió Z-D-MeLeuThrOEt (1,80g, 4,42 mmoles) en metanol y lentamente se añadió a la mezcla KOH 2N 0ºC. Se agitó la solución durante 2 horas. Los análisis por CCF (CHCl_{3}/MeOH 95:5) demostraron que la reacción había sido completa. Se neutralizó la mezcla utilizando CHI 2N. A continuación se evaporó el disolvente. La solución se repartió entre acetato de etilo y agua y se separó la capa orgánica. Se añadió HCl acuoso a la capa acuosa hasta pH 3. Esta se extrajo con acetato de etilo y se combinaron todos los extractos de acetato de etilo. La solución se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó el disolvente para dar lugar a un aceite naranja oscuro (1,77 g, 98%), el cual se utilizó para la siguiente reacción sin purificación; RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \alpha 7,36-7,41 (5H,m), 6,72 (1 H,s), 6,52 (1H, s ancho), 5,18 (2H,s), 4,83 (1H,m), 4,51 (1H,m), 4,30 (1H,m) 2,81 (3H,s), 1,74 (2H,m), 1,70 (3H,d), 1,68 (1H,m), 0,82-0,90 (6H,m); SM FAB 381,2 (M+H); SM FABHR Calculado para C_{19}H_{29}N_{2}O_{6} (M+H) 381,2026, Encontrado 381,2021; Anal. calculado para C_{19}H_{28}N_{2}O_{6}: C, 59,97; H, 7,42; N, 7,37, Encontrado: C, 60,53; H, 7,06; N, 7,11.

Éster fenacílico de la Z-D-metilleuciltreonina (9)

Se disolvió Z-D-MeLeuThrOH (1,50 g, 3,95 mmoles) en acetato de etilo (25 ml). Se añadió trietilamina (0,39 g,3,95 mmoles) y bromuro de fenacilo (0,079 g, 3,98 mmoles) y, se formó un precipitado en unos pocos minutos. Se agitó la mezcla durante toda la noche. A continuación se añadió agua y éter y se separaron las dos capas. Se lavó la capa orgánica con HCl 0,1N, con bicarbonato sódico saturado, y solución saturada de cloruro sódico, y a continuación se secó sobre MgSO_{4}. El residuo se cromatografió sobre gel de sílice (hexano/EtOAc = 4/1) para dar un aceite transparente (1,71 g, 87%); RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,34-7,41 (10H,m), 6,71 (1H,s), 6,52 (1H,s ancho), 5,27 (2H,s), 5,18 (2H,s), 4,83 (1H,m), 4,61 (1H,m), 4,50 (1H,m), 2,81 (3H,s), 1,74 (2H,m), 1,70 (3H,d), 1,68 (1H,m), 0,82- 0,90 (6H,m); SM FAB 537,1 (M+K), 499,1 (M+H); SM FABHR Calculado para C_{27}H_{35}N_{2}O_{7} (M+H) 499,2444, Encontrado 499,2450.

N-tert-Butoxicarbonil-tirosina (BocTirOH)

^{16} Se disolvió el éster etílico de la tirosina (5,06g, 25 mmoles) en 25 ml de agua y se añadió hidróxido sódico sólido hasta que el papel de tornasol indicó un pH neutro. Con enfriamiento se añadió dioxano (50 ml) y (Boc)_{2}O (6,12g, 27,5 mmoles). Se dejó la reacción en agitación durante 2 horas. Se añadió agua y éter y se separaron las dos capas. Se extrajo la capa orgánica tres veces con hidróxido sódico acuoso (1N). Las capas acuosas se dejaron en reposo durante toda la noche y a continuación se neutralizaron con HCl acuoso y se extrajeron con éter, el cual se lavó con solución saturada de cloruro sódico y se secó sobre MgSO_{4}. Se obtuvo un aceite amarillo (6,02 g, 86%); RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,10 (2H,d), 6,84 (2H,d), 4,92-5,00 (1H,m), 4,47-4,52 (1H,m), 3,00-3,12 (2H,m), 1,43 (9H,s); SM EI 282,0.

N-tert-Butoxicarbonil-N,O-dimetiltirosina (BocMe_{2}TirOH)

Se enfrió una solución de BocTirOH (5,30g, 18,8 mmoles) y de yoduro de metilo (2,57 ml, 41,4 mmoles) en 80 ml de THF seco a 0ºC y se añadió hidruro sódico (en forma de dispersión al 60%, 2,47 g, 62,0 mmoles). Se dejó la reacción en agitación a 0ºC durante 1 hora, y a continuación a temperatura ambiente durante toda la noche. Se destruyó el exceso de hidruro sódico por la adición gota a gota de 10 ml de THF/H_{2}O (1:1) y se eliminaron los disolventes a vacío. Después de la eliminación de los disolventes, se diluyó el gel de color naranja intenso con 30 ml de agua y se lavó con pentano (2x30 ml). Se acidificó la capa acuosa con ácido cítrico sólido (pH 2). Se utilizó acetato de etilo para la extracción. Los extractos combinados se lavaron con solución saturada de cloruro sódico, se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron a vacío. Se purificó el residuo crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice eluyendo con éter etílico para proporcionar el compuesto deseado como un aceite amarillo (5,22 g, 90%); [\alpha]^{29} D-15,7º (c 1,0, MeOH), Lit, ^{14b} [\alpha]^{22} D -16,9º(c 1,0,MeOH) RMN ^{1}H 300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,18 & 7,12 (2H, dos d), 6,85 (2H,d), 4,58 (1H, dos t), 3,80 (3H, s), 3,24 & 3,13 (1H, 2dd), 2,76 & 2,68 (3H, 2s), 1,43 & 1,38 (9H, 2s); SM FAB 619,3 (2M + H), 310,2 (M + H), 210,2 (M - Boc); SM FABHR Calculado para C_{16}H_{24}MO_{5} (M + H) 310,1654, Encontrado 310,1648.

Cbz-D-MeLeu-Thr(OMe_{2}TirBoc)-OPac (10)

Se añadió BocMe_{2}TirOH (0,27 g,0,91 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (20 ml), DCC (19,5 mg, 0,95 mmoles) y DMAP (41,3mg) a 0º sobre una solución de Cbz-D-MeLeuThrOPac (0,45 g, 0,91 mmoles). Se dejó que la solución se calentara a temperatura ambiente y se agitó durante 12 h. Se filtró la diciclohexilurea y se lavó con acetato de etilo. Se unieron el filtrado y los lavados y se lavaron con ácido cítrico al 10%, bicarbonato sódico al 5% y agua, se secaron sobre MgSO_{4} y se concentraron. El residuo en forma de crudo se purificó por cromatografía en columna flash eluyendo con hexano y acetato de etilo (4:1) para obtener el producto (0,53 g, 74%) en la forma de aceite naranja; RMN ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3} \delta 7,30-8,00 (10H,m), 6,82 & 7,10 (2H, d), 5,31 (1H, s), 5,20-4,85 (1H, m), 3,74 (3H, s), 3,10 & 3,07 (1H, 2 dd) 2,92(3H, s), 2,73 (3H, s), 1,71 (3H, d), 1,44 & 1,37 (9H, 2 s), 0,92 (6H, m); SM FAB 828,4 (M + K), 812,4 (M + Na), 790,3 (M + H), 690,4 (M-Boc); SM FABHR Calculado para D_{43}H_{57}N_{3}O_{11} (M+ H) 790,3915, Encontrado 790,3916.

Cbz-D-MeLeu-Thr(OMe_{2}TirBoc)-OH (5)

Se trató el tripéptido 10 (30,0 mg, 38,0 \mumoles) con Zn (60 mg) en AcOH/H_{2}O (70:30) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente toda la noche, se eliminó el Zn por filtración utilizando celite y se repartió la solución entre éter y agua. Se separó la capa orgánica y se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La purificación por cromatografía en columna de fase reversa (sistema de gradiente de CH_{3}CH/H_{2}O) dio lugar al producto en forma de un aceite transparente (21,3 mg, 92%); SM FAB 710,4 (M + K), 694,3 (M + Na), 672,3 (M + H), 572,3 (M - Boc), ver figura l; SM FABHR Calculado para C_{35}H_{52}N_{4}O_{9} (M + H) 672,3734, Encontrado 672,3674.

Ácido (2S,3S)-2-hidroxi-3-metilpentanoico (12)

Se utilizó un procedimiento como el descrito previamente^{19}. Se agitó vigorosamente una suspensión de L-isoleucina (30,0 g, 0,23 mole) en agua destilada (180 ml) mientras se añadían simultáneamente, desde sendos embudos de adición, nitrato sódico 2N (123,6 ml) y H_{2}SO_{4} 2N (123,6 ml). Después de que la adición fuera completa, la mezcla se hizo incolora al cabo de 30 min. Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 15 hr y a continuación se extrajo con EtOAc. Se secaron los extractos de EtOAc (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se concentraron. Se recristalizó el sólido crudo resultante de éter/ éter de petróleo para proporcionar el compuesto deseado como un sólido cristalino blanco (28,2 g, 93%); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,90 (t, 3H), 0,97 (d, 3H), 1,23 & 1,38 (m, 2H), 1,70 (m,1H), 2,80 (s ancho, 1H), 4,10 (d, 1H); SM FAB 269,2 (2M +H), 135,1 (M+H).

(2S,3S)-2-Hidroxi-3-metilpentanoato de metilo

Se añadió gota a gota cloruro de acetilo (6,13 ml) sobre MeOH (90 ml) enfriado en un baño de hielo. Después de que la adición fuera completa, se añadió una solución del á-hidroxiácido (23,0 g, 0,17 mole) en MeOH (60 ml). Se agitó la solución a 0ºC durante 1h, y a continuación a temperatura ambiente toda la noche, se concentró y se diluyó con éter. Se lavó la solución de éter con NaHCO_{3} saturado, solución saturada de cloruro sódico, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró para dar lugar a un aceite amarillo (19,8 g, 80%); [\alpha]^{29}D +27,3 (c 0,95, CHCl_{3}), Lit,^{18}[\alpha]^{20}D +28,5 (c 0,95, CHCl_{3}); RMN^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,91 (t, 3H), 0,97 (d, 3H), 1,21 & 1,37 (m,2H), 1,78 (m,1H), 2,92 (s ancho, 1H), 3,82 (s, 3H), 4,08 (d, 1H); SMIC 147,1 (M + H).

(2S, 3S)-2-Tosiloxi-3-metilpentanoato de metilo (13)

Se disolvió el hidroxi-pentanoato (4,44 g, 30,6 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} seco y se enfrió en un baño de hielo a 0ºC. Se añadió piridina (45,0 ml) seguido de cloruro de p-toluenesulfonilo (11,5 g, 60,8 mmoles) en pequeñas porciones con agitación constante. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente toda la noche, y a continuación se calentó a 40ºC durante 1h. Se evaporó el disolvente y se disolvió el residuo en EtOAc y se lavó con H_{2}SO_{4} 1N y KHCO_{3} 1N. Los extractos se secaron sobre MgSO_{4} y se evaporaron a vacío para dar lugar a un aceite naranja oscuro (8,32 g, 88%); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,93 (t, 3H), 0,97 (d, 3H), 1,21 & 1,41 (m, 1H), 1,91 (m, 1H), 2,41 (s, 2H), 3,60 (s, 3H), 4,63 (d, 2H), 7,24 & 7,80 (d, 2H); SM FAB 339,2 (M + K), 323,2 (M + Na), 301,1 (M + H), 241,2 (M-CO_{2}CH_{3}); SM FABHR Calculado para C_{14}H_{21}O_{5}S (M + H) 301,1110, Encontrado 301,1109.

(2R, 3S)-2-Azido-3-metilpentanoato de metilo (14)

Se añadió azida sódica (1,20 g,18,6 mmoles) sobre una solución agitada de 2-tosiloxi-3-metilpentanoato de metilo (3,29 g, 10,9 mmoles) en DMF (30 ml). Se mantuvo la solución a 50ºC durante 24h, y a continuación se repartió entre EtOAc y agua. Se separó la capa acuosa y se extrajo con EtOAc (3x50 ml). Se combinaron las capas orgánicas y se secaron sobre MgSO_{4} y se concentraron a vacío para dar lugar a un aceite amarillo oscuro (1,51 g, 81%), IR (sin dilución) v 3500- 3000 (m muy ancho), 2970 (s), 2939 (m ancho), 2111 (s), 1736 (s), 1472 (débil), 1387 (débil), 1225 (m ancho), 1175 (débil), 1086 (débil), 732 (s) cm^{-1}; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,93 (t, 3H), 0,97 (d, 3H), 1,22 & 1,43 (m, 1H), 1,96 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,85 (d, 2H); SMIC 172,1 (M + H).

Ácido (2R, 3S)-2-azido-3-metilpentanoico (15)

Se añadió sobre una solución de un á-azido éster (6,56 g, 38,3 mmoles) en THF (58 ml) a 0ºC, NaOH 1N (52 ml). Se agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante 1h y después a temperatura ambiente toda la noche. Se diluyó la mezcla con éter (30 ml), se separó la capa orgánica, y se extrajo la capa acuosa con éter (30 ml). A continuación se enfrió la capa acuosa a 0ºC, se acidificó a pH 2 por adición gota a gota de HCl concentrado, y se extrajo con acetato de etilo (3x25 ml). Se combinaron los extractos de acetato de etilo y se secaron (MgSO_{4}) y concentraron a vacío para proporcionar 10,9 g (95%); IR (sin dilución) v_{max} 3500-3000 (m muy ancho), 2974 (s), 2942 (m ancho), 2090 (s), 1464 (débil), 1382 (débil), 1222 (m ancho), 1168 (débil), 1088 (débil), 721 (s) cm^{-1}; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,93 (3H, t), 0,97 (3H, d), 1,21 & 1,41 (1H, m), 1,97 (1H, m), 3,90 (2H, m); SM FAB 158,2 (M + H); SM FABHR Calculado para C_{14}H_{21}O_{5}S (M + H), 301,1110, Encontrado 301,1109.

D-alo-isoleucina (16)

Se añadió sobre una solución del \alpha-azido ácido (6,01 g, 38,2 mmoles) en MeOH (25 ml), Pd(OH)_{2} al 20% sobre carbón (1,89 g). Se purgó el balón de reacción con H_{2} gas y se agitó vigorosamente el contenido a temperatura ambiente y presión atmosférica durante 15h, se filtró y residuo del filtro se lavó con agua destila y metanol. Se concentró el filtrado a vacío para proporcionar el producto como un sólido blanco. La recristalización en EtOAc proporcionó el compuesto en forma de agujas incoloras (4,75 g, 95%); RMN ^{1}H (300 MHz, MeOH-d_{4}) \delta 0,93 (t, 3H), 0,97 (d, 3H), 1,32 & 1,46 (m, 1H), 2,47 (m, 1H), 3,58 (d, 2H); SM FAB 132,1 (M + H); Anal. calculado para C_{6}H_{13}NO_{2}: C, 54,92; H, 9,99; N, 10,64, Encontrado: C, 54,79; H, 10,17; N, 10,26

N-tert-Butoxicarbonil-D-alo-isoleucina (17)

Una solución de D-alo-isoleucina (120 mg,0,916 mmoles) se disolvió en agua (2,5 ml) y NaOH 1N (1,83 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 48h. Se añadió a la mezcla dicarbonato de di-tert-butilo (200 mg, 0,916 mmoles) en dioxano con agitación a 0ºC. Después de 12h, se evaporó el dioxano, el residuo acuosos se lavó con Et_{2}O, se mezcló con EtOAc, y se acidificó la mezcla agitada vigorosamente con H_{2}SO_{4} 2N a 0ºC. Se extrajo esta solución con EtOAc, y se secaron los extractos orgánicos combinados (Na_{2}SO_{4}) y se conectaron al vacío para obtener un material cristalino (179 mg, 85%); pf 35-37ºC (Lit,^{28} 34-36ºC); [\alpha]^{29}D -42,7º (c 2,04, CHCl_{3}), [Lit,^{28} [\alpha]^{27}D -40,7º (c 2,06, CHCl_{3}]); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 5,52 (s ancho, 1H), 3,72-3,54 (m, 1H), 1,92-2,01 (m, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,37-1,12 (m, 3H), 0,97 (t, 3H), 0,93 (d, 3H); SM FAB 463,2 (2M + H), 232,1 (M + H), 132,1 (M-Boc); SM FABHR Calculado para C_{11}H_{21}NO_{4} (M + H) 232,1551, Encontrado 232,1548.

Hidrógenomalonato de etilo

Se utilizó un procedimiento como el previamente descrito^{29}. Se añadió hidróxido potásico (10,02 g, KOH del 85%, 156 mmoles) en etanol (99 ml) gota a gota sobre una solución agitada de malonato de dietilo (23,69 ml, 156 mmoles) en etanol (108 ml) y se agitó la solución a temperatura ambiente toda la noche. Se sometió la mezcla a reflujo durante 1 hora y se separó el sólido por filtración. Se enfrió la solución etanólica para dar la sal monopotásica. Se añadió agua (5 ml) sobre la sal potásica seca, y se enfrió la solución a 0ºC. Se añadió ácido clorhídrico concentrado (3,45 ml), manteniendo la temperatura por debajo de 5ºC. El sólido se filtró y se lavó con éter. Se extrajo el filtrado con CH_{2}Cl_{2}, se secó (MgSO_{4}) y se concentró para dar lugar a un aceite amarillo (9,96 g, 48%; Lit,^{29b} 51%); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,37 (s, 2H), 4,24 (c, 2H), 1,34 (t, 3H); SM FAB 133,0 (M + H).

(4R,5S)-3-tert-Butoxicarbonilamino-5-metil-3-oxoheptanoato de etilo (18)

Se añadió gota a gota una solución de cloruro de isopropilmagnesio en tetrahidrofurano (1,42 ml, 13,5 mmoles) sobre una solución de hidrógeno malonato de etilo (891 mg, 6,75 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} seco (5,62 ml). A continuación se enfrió la reacción en un baño de hielo y sal mientras se añadía una solución de Boc-D-alo-isoleucina (520 mg, 2,25 mmoles) y de N,N'-carbonildiimidazol (360 mg, 2,25 mmoles) en THF seco (1,20 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente toda la noche, a continuación se introdujo en ácido clorhídrico frío (del 10%, 100 ml). Se extrajo el éster etílico con éter, se lavó con NaHCO_{3} acuoso, se secó (MgSO_{4}) y se concentró para dar lugar a 475 mg (70%) de un aceite de color amarillo pálido; IR (sin dilución) v_{max} 3355, 1750, 1700 cm^{-1}; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,98 (d, 1H), 3,90-4,57 (m, 1H), 4,18 (c, 2H), 3,46 (s, 2H), 0,70-2,00 (m, 6H), 1,43 (s, 9H), 1,26 (t, 3H), 0,78 (d, 3H); SM FAB 302,2 (M + H), 202,2 (M-Boc).

Éster etílico de (3S, 4R, 5S)-N-tert-butoxicarbonil-isostatina (19a)

Sobre una solución agitada de 18 (500 mg, 1,66 mmoles) en Et_{2}O (2,90 ml) y EtOH (6,80 ml) enfriada en un baño de hielo-sal se añadió NaBH_{4} (60 mg, 1,58 mmoles). Se dejó la solución en agitación a -20ºC durante 2h y a continuación se vertió en hielo agua, se extrajo con EtOAc y se secó sobre MgSO_{4}. Se cromatografió el residuo sobre gel de sílice (hexano/EtOAc = 4/1) para dar 325 mg (65%) del isómero 19a deseado y 25 mg (5%) del isómero minoritario 19b. 19a: R_{f}0,20 (hexano/EtOAc = 3/1); [\alpha]^{29}D -6,7º (c 0,5, MeOH), Lit,^{30} [\alpha]^{23}D -6,4º (c 0,5, MeOH); IR (sin dilución) v_{max}3350, 1740, 1700 cm^{-1}; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,43 (d, 1H), 4,20 (c, 2H), 3,90-3,61 (m, 2H), 3,30 (s ancho, 1H), 2,50 (d, 2H), 1,90-1,98 (m, 1H), 1,41 - 1,30 (m ,2H), 1,40 (s, 9H), 1,24 (t, 3H), 0,97 (d, 3H), 0,90 (t, 3H); SM FAB 304,2 (M+H) 204,2 (M-Boc); SM FABHR Calculado para C_{15}H_{29}NO_{5} (M + H) 304,2117, Encontrado 304,2123; Anal. calculado para C_{15}H_{28}NO_{5}: C, 59,37; H, 9,64; N, 4,62, Encontrado: C, 59,03; H, 9,38; N, 4,88, 19b: R_{f} 0,22 (hexano/EtOAc = 3/1); [\alpha]^{29}D +26,9 (c 0,5, MeOH), Lit,^{30} [\alpha]^{23}D +26,4 (c 0,5, MeOH); IR (sin dilución) v_{max} 3410, 1740, 1710, cm^{-1}; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,42 (d, 1H), 4,20 (c, 2H), 3,87 - 3,61 (m, 2H), 3,32 (s ancho, 1H), 2,49 (d, 2H), 1,92 - 1,98 (m, 1H), 1,41 - 1,30 (m, 2H), 1,40 (s, 9H), 1,24 (t, 3H), 0,98 (d, 3H), 0,88 (t, 3H); SM FAB 304,2 (M + H), 204,2 (M - Boc); SM FABHR Calculado para C_{15}H_{29}NO_{5} (M + H) 304,2117, Encontrado 304,2123; Anal. calculado para C_{15}H_{28}NO_{5}: C, 59,37; H, 9,64; N, 4,62, Encontrado: C, 59,03; H, 9,38; N, 488.

(3S, 4R, 5S)-N-tert-Butoxicarbonil-isostatina (20)

Se disolvió Boc-(3S, 4R, 5S)-Ist-OEt (300mg, 1,00 mmoles) en metanol (5,00 ml), y se añadió lentamente a la mezcla NaOH 2N (2,00 ml) a 0ºC. Se agitó la solución a temperatura ambiente toda la noche mientras que el análisis por CCF (hexano/EtOAc = 4/1) mostró la presencia de un ácido carboxílico. Se neutralizó la mezcla utilizando HCl 2N. Se evaporó el disolvente y se repartió la solución entre EtOAc y agua y se separó la capa orgánica. Se añadió HCl acuoso sobre la capa acuosa a pH 3. Ésta se extrajo con EtOAc y se combinaron los extractos de EtOAc. Se secó la solución sobre MgSO_{4} y se evaporó el disolvente para dar lugar a un aceite amarillo (215 mg, 78%) el cual se utilizó para la siguiente reacción sin purificación; [\alpha]^{29}D -4,6º (c 0,0014, CHCl_{3}), Lit,^{11b}[\alpha]^{20}D -57º (c 0,0014, CHCl_{3}); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) 4,43 (d, 1H), 3,85 - 3,63 (m,2H), 2,76 (s. ancho, 1H), 2,41 (m, 2H), 2,00 - 1,93 (m, 1H), 1,43 - 1,35 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 0,91 (t, 3H), 0,87 (d, 3H); SM FAB 276,1 (M+ H), 176,1-(M- Boc); SM FABHR Calculado para C_{13}H_{25}NO_{5} (M+ H) 276,1806, Encontrado 276,1810.

Hidrógeno metilmalonato de etilo

Se añadió gota a gota hidróxido potásico (3,53 g, KOH del 90%, 57,4 mmoles) en etanol (35 ml) sobre una solución agitada de metilmalonato de dietilo (9,87 ml, 57,4 mmoles) en etanol (40 ml), y se agitó la solución a temperatura ambiente durante una noche. Se calentó la mezcla a reflujo durante 1h y se separó el sólido por filtración. La solución etanólica al enfriarse dio lugar a la sal monopotásica. Se añadió agua (5 ml) sobre la sal potásica seca, y se enfrió la solución a 0ºC. Se añadió ácido clorhídrico concentrado (3,45 ml), manteniendo la temperatura por debajo de 5ºC. Se filtró el sólido y se lavó con éter y el filtrado se extrajo con CH_{2}Cl_{2}, a continuación se secó y se concentró para dar lugar a un aceite amarillo (4,86 g, 58%, Lit,^{29} 60%); RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,23 (c, 2H), 3,47 (c, 1H), 1,42 (d, 3H), 1,27 (t, 3H); SM FAB 147,1 (M + H).

Cbz-AipOEt (22)

Se añadió gota a gota una solución de cloruro de isopropilmagnesio en tetrahidrofurano (9,57 ml, 90,8 mmoles) sobre una solución de hidrógeno metilmalonato de etilo (6,63 g, 45,4 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} seco (35 ml). A continuación se enfrió la reacción en un baño de hielo y sal mientras se añadió una solución de Cbz-L-valina (3,87 g, 15,1 mmoles) y de N,N'-carbonildiimidazol (2,44 g, 15,1 mmoles) en THF seco (15 ml). Se agitó la mezcla durante una noche a temperatura ambiente, a continuación se introdujo en ácido clorhídrico frío (del 10%, 200 ml). Se extrajo el éster etílico con éter, se lavó con NaHCO_{3} acuoso, solución saturada de cloruro sódico, se secó (MgSO_{4}) y se concentró. La purificación por cromatografía de columna flash (hexano/EtOAc = 10/1) dio lugar al producto deseado en forma de aceite amarillo (4,50 g, 89%); RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,32 -7,38 (s, 5H), 5,24-5,37 (m, 1H), 5,17 (s, 2H), 4,20 (c, 2H), 3,41 (c, 1H), 218-2,21 (m, 1H), 1,45 (d, 3H), 1,32 - 1,37 (m, 1H), 1,24 (t, 3H), 0,94 (d, 3H), 0,81 (d, 3H); SM FAB 374,0 (M + K), 336,1 (M + H), 292,1 (M - OEt); SM FABHR Calculado para C_{18}H_{26}NO_{5} (M + H) 336,1811, Encontrado 336,1817; Anal. calculado para C_{18}H_{25}NO_{5} : C, 64,44; H, 7,52; N, 4,18, Encontrado: C, 64,70; H, 7,62; N, 4,37.

Cbz-DihydroAipOEt

Sobre una solución agitada de Cbz-AipOEt (6,54 g, 19,5 mmoles) en Et_{2}O (15 ml) y EtOH (35 ml) a -20ºC, se añadió NaBH_{4} (0,74 g, 19,5 mmoles) durante un periodo de 15 min. Se agitó la mezcla de reacción 15 min a -20ºC y se introdujo en hielo agua (50 ml). Después de la extracción con acetato de etilo (30 ml), se secaron los extractos orgánicos combinados (MgSO_{4}) y se concentraron para dar lugar a un aceite amarillo (6,12 g, 93%); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,39 (s, 5H), 7,01 (s ancho, 1H), 5,13 (s,2H), 4,72-4,53 (m, 1H), 4,18 (c, 2H), 3,80 - 3,71 (m, 1H), 3,38 (s ancho, 1H), 2,32 - 2,20 (m, 1H), 1,98 (m, 1H), 1,40 (d, 3H), 1,25 (t, 3H), 9,92 - 0,80 (m, 6H); SM FAB 338,1 (M + H); Anal. Calculado para C_{18}H_{27}NO_{5}: C, 64,06; H, 8,07; N, 4,15, Encontrado: C, 64,21; H, 8,36; N, 4,29.

Cbz-DihydroAipOH

Se disolvió el Cbz-dihydroAipOEt (5,99 g, 17,7 mmoles) en metanol y se añadió lentamente a la mezcla KOH 2N a 0ºC. Se dejó la solución en agitación durante 2 h. El análisis por CCF (hexano/acetato de etilo 10:1) mostró que la reacción era completa. En este momento, se añadió HCl 2N hasta neutralización. Se evaporó el disolvente y se repartió la solución entre acetato de etilo y agua. Se separó la capa orgánica. Se añadió HCl acuoso para llevar la capa acuosa a pH 3, la cual a continuación se extrajo con acetato de etilo. Se combinaron los extractos de acetato de etilo, se secó la solución sobre MgSO_{4} y se evaporó el disolvente para dar lugar a un aceite de un color amarillo pálido (4,59 g, 84%); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,39 (s, 5H), 7,04 (s ancho, 1H), 5,13 (s, 2H), 4,40-4,20 (m, 1H), 3,92-3,71 (m, 1H), 3,33 (s ancho, 1H), 2,32-2,20 (m, 1H), 1,98 (m, 1H), 1,40 (d, 3H), 0,92-0,80 (m, 6H); SM FAB 310,2 (M + H); SM FABHR Calculado para C_{16}H_{24}NO_{5} (M + H) 310,1654, Encontrado 310,1651; Anal. calculado para C_{16}H_{23}NO_{5}: C, 62,10; H, 7,51; N, 4,53, Encontrado: C, 62,50; H, 7,71; N, 4,37.

Cbz-DihydroAip-LeuOMe (23)

Se disolvió el Cbz-dihydroAipOH (1,17 g, 3,82 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} seco (25 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadió DDC (0,87 g, 4,20 mmoles) y DMAP (0,32 g, 2,90 mmoles) con agitación y se agitó la mezcla durante 1 hora. Después de la filtración de la diciclohexilurea, se añadió el éster metílico de la leucina (0,56 g, 3,82 mmoles) y la mezcla se agitó toda la noche. Se concentró el residuo y se suspendió en acetato de etilo. Se lavó la solución con ácido cítrico acuoso, bicarbonato sódico acuoso, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. Se purificó el residuo por cromatografía de columna y se eluyó con hexano/acetato de etilo (50:50) para dar un aceite transparente (1,23 g, 74%); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,43 (s, 5H), 6,81 (s ancho, 1H), 6,42 (s ancho, 1H), 4,78-4,72 (m, 1H), 4,48-4,43 (m, 1H), 3,78-3,72 (m, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,51 (s ancho, 1H), 2,50-2,40 (m, 1H), 2,37-2,20 (m, 1H), 1,40-1,30,(dd, 6H), 1,10-0,90 (m, 9H), SM FAB 437,2 (M + H); SM FABHR Calculado para C_{23}H_{37}N_{2}O_{6} (M + H) 437,2652, Encontrado 437,2653; Anal. calculado para C_{23}H_{36}N_{3}O_{6}: C, 63,27; H, 8,32; N, 6,42, Encontrado: C, 63,65; H, 8,35; N, 6,49.

Cbz-DihydroAip-LeuOH

Se disolvió el Cbz-dihydroAip-LeuOMe (303 mg, 0,70 mmoles) en MeOH y se añadió KOH 2N lentamente con enfriamiento. Después de aproximadamente 3 h de agitación, el análisis por CCF (hexano/acetato de etilo 6:1) mostró que la reacción era completa. Se neutralizó la solución con HCl 2N y se extrajo con acetato de etilo. La capa acuosa se ajustó a pH 3 y se extrajo con acetato de etilo. A continuación se secaron los extractos de acetato de etilo combinados sobre MgSO_{4}. La evaporación del disolvente dio lugar a un aceite amarillo (270 mg, 92%); RMN ^{1}H (200MHz, CDCl_{3}) \delta 7,42 (s, 5H), 6,81 (s ancho, 1H), 6,42 (s ancho, 1H), 4,78-4,72 (m, 1H), 4,48-4,42 (m, 1H), 3,78-3,72 (m, 1H), 3,51 (s ancho, 1H), 2,50-2,40 (m, 1H), 2,37-2,30 (m, 1H), 1,40-1,30 (dd, 6H), 1,10-0,90 (m, 9H); SM FAB 423,2 (M + H); SM FABHR Calculado para C_{22}H_{35}N_{2}O_{6} (M + H) 423,2495, Encontrado 423,2493.

Cbz-DihydroAip-Leu-OPac. Se disolvió el Cbz-dihydroAip-LeuOH (2,03 g, 4,81 mmoles) en acetato de etilo (33 ml), y se añadió a la mezcla la trietilamina (0,66 ml) y el bromuro de fenacilo (Pac) (0,97 mg, 6,85 mmoles), se agitó a temperatura ambiente toda la noche. Se añadió agua y éter y se separaron las dos capas. Se lavó la capa orgánica con HCl 0,1N, con bicarbonato sódico saturado, y con solución saturada de cloruro sódico, y a continuación se secó sobre MgSO_{4}. La concentración por evaporación del disolvente dio lugar a un aceite marrón. Se cromatografió el residuo sobre gel de sílice (hexano/EtOAc = 4/1) para dar lugar a 1,27 g (53%) de un isómero y 0,96 g (40%) de otro isómero; a: R_{f} 0,46 (hexano/EtOAc = 1/1); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,90 (d, 2H), 7,61 (m, 1H), 7,50 (m, 2H), 7,40 (s, 5H), 6,03 (s ancho, 1H), 6,00 (s ancho, 1H), 5,40 (AB q, 2H), 5,10 (s, 2H), 4-78-4,72 (m, 1H), 4,45-4,53 (m, 1H), 4,05-4,10 (m, 1H), 3,70 (s ancho, 1H), 2,50 (c, 1H), 2,40-2,32 (n, 1H), 2,00-1,85 (m, 3H), 1,25 (dd, 6H), 1,06 (d, 3H), 1,02-0,80 (dd, 6H); SM FAB 541,2 (M + H); SM FABHR Calculado para C_{30}H_{41}N_{2}O_{7} (M + H) 541,2916, Encontrado 541,2916; Anal. calculado para C_{30}H_{40}N_{2}O_{7}: C, 66,63; H, 7,46; N, 5,18, Encontrado: C, 66,61; H, 7,44; N, 5,26, b: R_{f}0,30 (hexano/EtOAc = 1/1); RMN ^{1}H (300MHz, CDCl_{3}) \delta 7,90 (d, 2H), 7,62 (m, 1H), 7,50 (m, 2H), 7,40 (s, 5H), 6,03 (s ancho, 1H), 6,00 (s ancho, 1H), 5,40 (AB q, 2H), 5,10 (s, 2H), 4-78-4,73 (m, 1H), 4,44-4,55 (m, 1H), 4,06-4,12 (m, 1H), 3,72 (s ancho, 1H), 2,51 (q 1H), 2,39-2,31 (m, 1H), 2,00-1,85 (m, 3H), 1,24 (dd, 6H), 1,06 (d, 3H), 1,05-0,83 (dd, 6H) ; SM FAB m/z 541,2 (M + H); SM FABHR Calculado para C_{30}H_{41}N_{2}O_{7} (M + H) 541,2916, Encontrado 541,2914; Anal. calculado para C_{30}H_{40}N_{2}O_{7}: C, 66,63; H, 7,46; N, 5,18, Encontrado: C, 66,61; H, 7,44; N, 5,26.

Cbz-Aip-Leu-OPac (24)

Se agitó una solución de Cbz-dihydro-Aip-LeuO-Pac (0,44 g, 0,81 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (2,10 ml) mientras se añadía cloroformiato de piridinio sobre el reactivo de alúmina^{16} (1,57g). Después de 2 h de agitación a temperatura ambiente, se filtró la solución y se lavó con éter. Se unieron los filtrados combinados y se evaporó el disolvente. Se cromatografió el residuo sobre gel de sílice (hexano/EtOAc = 4/1) para dar 0,37 g (87%) del producto deseado en forma de un sólido blanco; R_{f} 0,42 (hexano/EtOAc = 1/1); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,90 (d, 2H), 7,61 (m, 1H), 7,50 (m, 2H), 7,40 (s, 5H), 6,90 (s ancho, 1H), 6,88 (s ancho, 1H), 5,40 (AB q, 2H), 5,18 (s, 2H), 4,78-4,72 (m, 1H), 4,45-4,53 (m, 1H), 3,68 (c, 1H), 2,25-2,38 (m, 1H), 1,92-1,71 (m, 3H), 1,45 (d, 3H), 1,10-1,00 (dd, 6H), 0,80-0,75 (dd, 6H); SM FAB 1077,3 (2M + H), 577,3 (M + K), 561,2 (M + Na), 539,3 (M + H); SM FABHR Calculado para C_{30}H_{39}N_{2}O_{7} (M + H) 539,2757, Encontrado 539,2762; Anal. calculado para C_{30}H_{38}N_{2}O_{7}: C, 66,88; H, 7,11; N, 5,18, Encontrado: C, 66,92; H, 7,33; N, 478.

Cbz-Aip-Leu-OH

Se trató el dipéptido protegido (167 mg, 0,31 mmoles) con Zn (500mg) en AcOH/H_{2}O (70:30). Se dejó agitar la mezcla a temperatura ambiente toda la noche, se eliminó el Zn por filtración utilizando celite y se repartió la solución entre éter y agua. Se separó la capa orgánica y se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La purificación por cromatografía de columna (CHCl_{3}/MeOH) dio lugar al producto como un polvo blanco. Se protegió al balón de la reacción con un tubo de CaCl2 y se dejó la mezcla en agitación a temperatura ambiente durante 1,5 h. Se evaporó el disolvente y se introdujo el aceite restante a vacío para dar lugar a un sólido amarillo (87,7 mg, 70%); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,42 (s, 5H), 6,88 (s ancho, 1H), 6,85 (s ancho, 1H), 5,42 (c AB, 2H), 5,15 (s, 2H), 4,79-4,72 (m, 1H), 4,55-4,47 (m, 1H), 3,67 (c, 1H), 2,37-2,26 (m, 1H), 1,94-1,75 (m, 3H), 1,46 (d, 3H), 1,12-1,01 (dd, 6H), 0,80-0,74 (dd, 6H); SM FAB 460,3 (M + K), 443,2 (M + Na), 421,3 (M + H).

Cbz-Aip-Leu-Pro OTMSe

Se disolvió el Cbz-Aip-Leu-OH (36,7 mg, 85,0 \mumoles) en CH_{2}Cl_{2} seco (1,0 ml) y se enfrió la solución a 0ºC. Se añadió la DCC (26,1 mg, 0,13 mmoles) y se agitó la mezcla durante 30 min. a 0ºC. Se añadió el Pro-OTMSe (18,5 mg, 85,0 \mumoles) en CH_{2}Cl_{2} (1,0 ml) y se agitó la solución durante 30 min. a 0ºC y a temperatura ambiente toda la noche. Se concentró el residuo y se suspendió en acetato de etilo. Se lavó la solución con ácido cítrico acuoso, bicarbonato sódico acuoso, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. Se purificó el residuo por cromatografía de columna, se eluyó con CH_{2}Cl_{2}/MeOH (95:5) para dar lugar a un aceite amarillo (34,0 mg, 65%); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,47 (s, 5H), 6,85 (s ancho, 1H), 6,84 (s ancho, 1H), 5,45 (AB q, 2H), 5,13 (s 2H), 4,80-4,73 (m, 1H), 4,53-4,47 (m, 1H), 4,24-4,01 (dt, 4H), 3,63 (c, 1H), 2,35-2,23 (m, 1H), 1,94-1,75 (m, 3H), 1,46 (d, 3H), 1,12-1,01 (dd, 6H), 0,80-074 (dd, 6H), 0,00 (s, 9H); SM FAB 656,3 (M + K), 640,2 (M + Na), 618,3 (M + H).

H-Aip-Leu-Pro-OTMSe

Se disolvió el tripéptido protegido (24,9 mg, 40,5\mumoles) en alcohol isopropílico (1,00 ml), y se añadió el catalizador Pd/C al 10% (0,99mg). Se hidrogenó la solución durante 3 h, se eliminó el catalizador por filtración sobre celite, y se eliminó el disolvente para proporcionar el producto deseado (15,6 mg, 82%), RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,84 (s ancho, 1H), 6,82 (s ancho, 1H), 5,41 (AB q, 2H), 5,09 (s, 2H), 4,82-4,71 (m, 1H), 4,56-4,48 (m, 1H), 4,25-4,00 (dt, 4H), 3,62 (c, 1H), 2,37- 2,23 (m, 1H), 1,95-1,75 (m, 3H), 1,47 (d, 3H), 1,14-1,01 (dd, 6H), 0,82-0,74 (dd, 6H), 0,00 (s, 9H); SM FAB m/z 506,3 (M + Na); 484,3 (M +H).

Bos-Ist-Aip-Leu-Pro-OTMSe

Se disolvió el Boc-Ist-OH (7,51 mg, 27,3 \mumoles) en CH_{2}Cl_{2} seco (1,0 ml) y se enfrió la solución a 0ºC. Se añadió el DCC (10,52 mg, 0,089 mmoles) y a continuación se agitó la mezcla durante 30 min. a 0ºC. Se añadió el H-Aip-Leu-Pro-OTMSe (3,28 mg, 27,3 \mumoles) en CH_{2}Cl_{2} (1,0 ml) y se agitó la solución durante 30 min a 0ºC y a temperatura ambiente toda la noche. Se concentró el residuo y se suspendió en acetato de etilo. Se lavó la solución con ácido cítrico acuoso, bicarbonato sódico acuoso, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. Se purificó el residuo por HPLC de fase reversa utilizando un sistema de gradiente de CH_{3}CN/H_{2}O (45,0 mg, 83%); SM FAB 741,5 (M + H), 641,5 (M - Boc).

H-Ist-Aip-Leu-Pro-OTMSe(6)

Se disolvió el tripéptido protegido (30,0 mg, 0,045 mmoles) en MeOH (2 ml) y se pasó una corriente uniforme de HCl a través de la solución durante aproximadamente 20 min. La evaporación del disolvente dio lugar a un aceite amarillo que se purificó por cromatografía de columna de fase reversa eluyendo con CH_{3}CN/H_{2}O (sistema de gradiente) para dar 22,0 mg (87%) del compuesto en forma de un polvo amarillo; SM FAB 641,5 (M+H), ver figura 2.

Cbz-D-MeLeu-Thr[O-N,O-Me_{2}TirBoc)]-Ist-Aip-Leu-Pro-OTMSe (4)

Se disolvió el ácido 5 (21,9 mg, 28,4 \mumoles) y la N-metilmorfolina (6,4\mul) en THF seco (0,4 ml), y se enfrió la solución a 0ºC. Se añadió una solución de la amina 6 (16,2 mg, 28,4 \mumoles) y de HOBT (0,81mg) en 1,5 ml de THF seco. Se mezcló esta suspensión con una solución fría de EDCI (9,76 mg, 51,1 \mumoles) en 0,5 ml de THF. Se agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante 0,5 h. A continuación se concentró la solución hasta 0,50 mL, se mantuvo a 0ºC durante 24 h, y a continuación se diluyó con éter. Se lavó la capa orgánica con HCl al 10%, NaHCO_{3} al 5% y soluciones saturadas de NaCl. Se secó la capa orgánica (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró. El aceite crudo se purificó por HPLC de fase reversa utilizando un sistema de gradiente de CH_{3}CN/H_{2}O para dar lugar a 11,6 mg (32%) del heptapéptido lineal, ver Figura 3; SM FAB 1294,2 (M + H); 1194/2 (M - Boc), ver Figura 4; SM FABHR Calculado para C_{64}H_{108}N_{7}O_{16}Si (M + H) 1294,7649, Encontrado 1294,7644.

Cbz-D-MeLeu-Thr-N,O-Me_{2}Tir-Ist-Aip-Leu-ProOH(7)

Se añadió TBAF 1M (2,1\mul) sobre una solución del heptapéptido lineal totalmente protegido (5,80 mg, 4,50 \mumoles) en THF seco. Después de 2 h de agitación a 0ºC, se diluyó la mezcla con agua destilada y se concentró hasta un volumen pequeño. La solución restante se diluyó con EtOAc, y se añadió HCl 2 N para obtener la capa acuosa ácida. Se lavó la capa de EtOAc tres veces con agua y se secó con Na_{2}SO_{4}. La evaporación del disolvente dio lugar al heptapéptido desprotegido en un rendimiento cuantitativo (4,3mg); SM FAB 1194,2 (M + H); 1094,2 (M - Boc), voir figura 5; SM FABHR Calculado para C_{62}H_{100}N_{7}O_{14}Si (M + H) 1194,7098, Encontrado 1194,7089. Se sometió al heptapéptido desprotegido a una solución de TFA 1M (9,57 \mul). Después de 1 h de agitación a temperatura ambiente, se evaporó el disolvente. Se añadió agua sobre el residuo y se extrajo la solución acuosa con EtOAc. Se lavó el extracto con NaHCO_{3} al 5% y con agua y se secó sobre Na_{2}SO_{4}. Se purificó el compuesto por HPLC de fase reversa utilizando un sistema de gradiente de CH_{3}CN/H_{2}O (ver figura 6) para dar lugar a 3,58 mg (91%); SM FAB 1094,2 (M+H), ver figura 7.

AipDidemnina A (8)

Se disolvió el heptapéptido lineal 7 (3,58 mg, 3,28\mumoles) en THF seco (0,08 ml) y se enfrió la solución a 0ºC. Se añadió EDCI (0,63 mg, 3,28 \mumoles) en 1,0 ml de THF, y se agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante 2h. Después de guardar la mezcla de reacción en el congelador toda la noche, se diluyó la solución con éter. Se lavó la capa orgánica con una solución de HCl al 10%, de NaHCO_{3} al 5%, y de NaCl saturado. Se secó la capa orgánica (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró. Se purificó el aceite crudo por HPLC de fase reversa utilizando un sistema de gradiente de CH_{3}CN/H_{2}O para dar 1,41 mg (40%) del análogo protegido 3; SM FAB 1076,7 (M + H), ver figura 8; SM FABHR Calculado para C_{57}H_{86}N_{7}O_{13} (M + H) 1076,6284, Encontrado 1076,6283. Se disolvió el compuesto (1,41mg) en alcohol isopropílico (0,50 ml), y se añadió el catalizador 10% Pd/C (0,50 mg). Se hidrogenó la solución durante 3 h. En este momento, se eliminó el catalizador por filtración sobre celite y se eliminó el disolvente para proporcionar el compuesto deseado 8, la AipDidemnina A.

TABLA I Actividades antivirales de análogos del amino Hip didemnina^{a}

Compuesto	ng/ ml	Citotoxicidad^{b} respecto al HSV/CV-1	Actividad^{c}
Cbz-[Aip^{3}]-Didemnina A	100	10	+
(compuesto nuevo)	50	8	+
	20	0	+
	10	0	-
Didemnina A (1)	100	0	+
	50	0	+
	20	0	+
	10	0	-
Notas:
\hskip1cm (a) Ensayo llevado a cabo por el Dr G.R. Wilson en este laboratorio;
\hskip1cm (b) 0 menos tóxico que 16 (tóxico);
\hskip1cm (c) +++ inhibición completa, ++ inhibición fuerte, + inhibición moderada, - ninguna inhibición.

TABLA II. Citotoxicidad en relación al L1210 de los análogos de amino Hip didemnina^{a}

Compuestos	Dosis (ng/ ml)
	250	25	2,5	0,25
	Inhibición (%)	CI_{50} (ng/ ml)
Didemnina A (1)	100	70	0	0	75
Cbz-[Aip^{3}]-Didemnina A^{b}	100	87	0	0	85
[Aip^{3}]-Didemnina A (8) ^{b}	98	20	0	0	100
Notas:
\hskip1cm (a) Ensayo realizado por el Dr G.R. Wilson en este laboratorio;
\hskip1cm (b) compuestos nuevos.

Referencias

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Claims

1. El compuesto Cbz-[Aip^{3}]-didemnina A.

2. El compuesto [Aip^{3}]-didemnina A.

3. El compuesto ácido (2S,4S)-aminoisovalerilpropiónico (Aip).

4. Un procedimiento sintético para la formación del análogo amino Hip de la didemnina A, de modo que dicho procedimiento comprende las etapas de:

(a) formar un heptapéptido lineal por acoplamiento de dos subunidades,

Cbz-D-MeLeuThr(OMe_{2}TirBoc)OH (5) y H-IstAipLeuProOTMSe (6),

Seguido por desprotección para obtener el heptapéptido lineal (7); y

(b) ciclación del heptapéptido (7) para proporcionar el análogo amino Hip (Aip) de la didemnina A.

5. El compuesto intermedio de fórmula 5:

8

6. El compuesto intermedio de fórmula 6:

9

7. El compuesto intermedio de fórmula 7:

10

8. Una composición farmacéutica que comprende la Cbz-Aip^{3} didemnina A y opcionalmente un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición farmacéutica que comprende la Aip^{3} didemnina A y opcionalmente un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en la preparación de una composición farmacéutica para tratar los tumores neoplásticos en mamíferos que comprende una cantidad efectiva de una composición farmacéutica definida en la reivindicación 8 ó 9 para administrar a un mamífero que precise dicho tratamiento.

11. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en la preparación de una composición farmacéutica para tratar las infecciones a ARN o ADN de mamíferos que comprende una cantidad efectiva de una composición farmacéutica definida en la reivindicación 8 ó 9 para administrar a un mamífero que precise dicho tratamiento.

12. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en la preparación de una composición farmacéutica para tratar las infecciones bacterianas en mamíferos que comprende una cantidad efectiva de una composición farmacéutica definida en la reivindicación 8 ó 9 para administrar a un mamífero que precise dicho tratamiento.

13. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en la preparación de una composición farmacéutica para tratar las infecciones por hongos en mamíferos que comprende una cantidad efectiva de una composición farmacéutica definida en la reivindicación 8 ó 9 para administrar a un mamífero que precise dicho tratamiento.

14. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en la preparación de una composición farmacéutica para activar la immunosupresión en mamíferos que comprende una cantidad efectiva de una composición farmacéutica definida en la reivindicación 8 ó 9 para administrar a un mamífero que precise dicho tratamiento