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ES2293419T3 - Bifidobacterias y preparaciones que las contienen. - Google Patents

Bifidobacterias y preparaciones que las contienen. Download PDF

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ES2293419T3
ES2293419T3 ES05011028T ES05011028T ES2293419T3 ES 2293419 T3 ES2293419 T3 ES 2293419T3 ES 05011028 T ES05011028 T ES 05011028T ES 05011028 T ES05011028 T ES 05011028T ES 2293419 T3 ES2293419 T3 ES 2293419T3
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ES
Spain
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bifidobacterium longum
preparations
oligosaccharides
strain
vitamins
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Expired - Lifetime
Application number
ES05011028T
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English (en)
Inventor
Giuseppe Claudio Viscomi
Leone Gabriele Rotini
Lorenzo Morelli
Patrizio Ferrari
Maria Rosaria Pantaleo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alfa Wasserman SpA
Original Assignee
Alfa Wasserman SpA
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Publication date
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Abstract

Un cultivo biológicamente puro de la cepa Bifidobacterium longum LMG P-21587.

Description

Bifidobacterias y preparaciones que las contienen.
La presente invención se refiere al uso de un microorganismo no patógeno del género Bifidobacterium longum con objeto de favorecer la salud gastrointestinal y en particular prevenir y/o tratar las indisposiciones del tracto gastrointestinal, particularmente del intestino.
Se conocen desde hace mucho tiempo muchos tipos de bacterias utilizadas como agentes de fermentación para conservación de alimentos o preparación de alimentos lácteos como yogur u otros productos lácteos; estas bacterias se designan bajo el término genérico de "bacterias de ácido láctico" y comprenden muchos géneros como Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium y Pediococcus.
En fecha más reciente, estas bacterias están siendo objeto de mayor atención debido a que, una vez ingeridas, han demostrado propiedades notables en el hombre y los animales; en particular cepas de Lactobacillus o Bifidobacterium, administradas a veces juntas en combinación, han demostrado eficacia en la colonización de la mucosa intestinal y en la ayuda a la salud de las personas, por prevención de la colonización por otros microorganismos nocivos, como se indica en las Patentes U.S. 5.494.664 y 6.241.983 y en las Solicitudes de Patente Internacional WO 0033854 y WO 0110453.
Estos microorganismos se denominan también "probióticos" y un requisito fundamental para su efecto beneficioso es que los mismos puedan alcanzar la mucosa intestinal en tal número y con tal vitalidad que sean capaces de persistir y colonizar el intestino, para lo cual es necesario que resistan convenientemente al bajo pH del estómago.
La toma de productos probióticos está recomendada en el caso de indisposiciones intestinales, tales como estreñimiento o diarrea y después de períodos de tratamiento con antibióticos, es decir en particular en todas aquellas circunstancias que conducen a un empobrecimiento de la flora bacteriana intestinal y también en todas aquellas circunstancias en las cuales una alimentación pobre en fibras, las condiciones del entorno, o el estrés disminuyen la vitalidad de la flora bacteriana intestinal.
El restablecimiento de niveles adecuados de microorganismos presentes naturalmente en la flora bacteriana humana por utilización de cepas bacterianas bien caracterizadas y extraídas de la flora de personas sanas es el objetivo de una administración de este tipo.
La actividad colonizadora de microorganismos exógenos en el intestino depende de su concentración, de su capacidad para colonizar y de las condiciones del entorno que encuentran aquéllos en el intestino, debido a que la administración de una cantidad mayor, una alta capacidad de colonización y condiciones de entorno adecuadas contribuyen a su efecto protector y curativo mediante la colonización de grandes porciones en el interior del intestino sin efectos secundarios dado que los mismos son productos de origen natural. En particular, debe subrayarse que la posible presencia de fibras alimenticias, como por ejemplo inulina o fructo-oligosacáridos, contribuye en gran medida a la colonización debido a que estos compuestos son un sustrato para el producto probiótico y por consiguiente aumentan las posibilidades de colonización. Dichos oligosacáridos han sido denominados también "prebióticos" debido a su acción sinérgica con el probiótico.
Descripción de la invención
Cultivos biológicamente puros de dos cepas de Bifidobacterium longum denominadas W11 y W11a, depositadas en las Colecciones Coordinadas Belgas de Microorganismos - BCCM LMG-Collection, que ha registrado las mismas bajo los números de acceso LMG P-21586 y LMG P-21587. La invención se refiere a un cultivo biológicamente puro de la cepa Bifidobacterium longum LMG P-21587 (W11a), su uso como producto probiótico con preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario y las preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario que contienen el mismo, útiles para favorecer la salud gastrointestinal y prevenir y tratar las patologías intestinales son el objeto de la presente invención.
Las dos cepas de Bifidobacterium longum W11 (cepa de referencia) y W11a han sido aisladas de la flora bacteriana intestinal de un hombre sano y se han seleccionado entre muchas otras cepas de Bifidobacterium longum aisladas al mismo tiempo debido a que han demostrado capacidad colonizadora en la flora bacteriana intestinal y capacidad de adherencia a las células intestinales, características ambas que, juntas, hacen de ellas agentes probióticos muy satisfactorios capaces de favorecer la buena salud del tracto gastrointestinal y restablecer su funcionalidad alterada por gastroenteritis de origen diverso.
El cultivo bacteriano objeto de la presente invención se ha producido primeramente en laboratorio y posteriormente en preparaciones industriales y está compuesto de cepas puras que se han desarrollado durante 20 horas a 37ºC en un medio de cultivo adecuado denominado TPY que contiene como ingredientes principales caseína-peptona tríptica, peptona de soja, extracto de levadura y glucosa además de sales de potasio, calcio, magnesio y cinc.
A partir de estos cultivos primarios se han preparado subcultivos subsiguientes con la finalidad de aumentar el número de células de cepas puras hasta obtener los cultivos madre que se han utilizado como inoculación para la producción industrial del cultivo bacteriano del material probiótico Bifidobacterium longum W11a.
El proceso de producción industrial de dicho cultivo bacteriano prevé los pasos siguientes:
1.
fermentación a un pH controlado entre 5,5 y 7,5;
2.
separación de la biomasa bacteriana del caldo de cultivo por centrifugación;
3.
liofilización de la biomasa bacteriana, después de adición de crioprotectores adecuados seleccionados de proteidos, carbohidratos y sales minerales para salvaguardar la vitalidad de las células a lo largo del paso de congelación y liofilización, posiblemente también con adición de un precipitado proteico con la finalidad de aumentar la resistencia de la cepa a la degradación enzimática y a condiciones de pH ácido;
4.
molienda y granulación del cultivo liofilizado.
El producto así preparado contiene un promedio de aproximadamente 1 x 10^{10} a aproximadamente 1 x 10^{12} células vivas de Bifidobacterium longum W11a por cada gramo de producto final, analizado de acuerdo con métodos microbiológicos de recuento bacteriano conocidos por las personas expertas en la técnica, como por ejemplo los consignados en Ison A.P. y Matthew G.B., Applied Microbial Physiology, a Practical Approach, compiladores Rhodes P.M. y Stanbury P.F. - IRL Press Oxford, 103-130, 1997.
El cultivo bacteriano se ha comprobado en ensayos de colonización del intestino de ratones con resultados positivos dado que el recuento de la cantidad de carga bacteriana de Bifidobacterium longum LMG P-21586 ha exhibido un valor mayor que 1 x 10^{6} células vivas por cada gramo de heces de ratón.
Objeto adicional de la presente invención, partiendo estrictamente del objeto principal, es el uso del cultivo biológicamente puro obtenido de las cepas de Bifidobacterium longum W11a como material probiótico en preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario útiles para favorecer la salud gastrointestinal y en la prevención y el tratamiento de las patologías intestinales tales como diarreas, gastroenteritis de diverso origen, estreñimiento, intestino irritable, enfermedad diverticular y enfermedades inflamatorias crónicas del intestino. La eficacia de los cultivos bacterianos que contienen el Bifidobacterium longum W11a para favorecer la salud gastrointestinal puede incrementarse añadiendo a las preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario que las contienen fibras alimenticias en la forma de oligosacáridos indigeribles, por ejemplo fructo-oligosacáridos o inulina, que no son absorbidos ni hidrolizados en el primer tracto del intestino y refuerzan la actividad y estimulan el metabolismo de las cepas de Bifidobacterium longum LMG P-21587 con desventaja de las bacterias patógenas. Los oligosacáridos preferidos en la realización de la presente invención son mezclas de fructo-oligosacáridos constituidas por una unidad básica consistente en una molécula de glucosa (G), unida a una cadena de moléculas de fructosa (F) de fórmula general GFn, con n \leq 4, teniendo un grado de polimerización, es decir un número de unidades de monosacárido, comprendido entre 2 y 20. Los fructo-oligosacáridos utilizados como materiales prebióticos asociados con los dos tipos de materiales probióticos objeto de la presente invención tienen un grado de polimerización entre 2 y 10, preferiblemente entre 3 y 6.
Las preparaciones objeto de la presente invención pueden contener, junto con diversos excipientes tales como edulcorantes, por ejemplo aspartamo, manitol o sorbitol, sustancias saborizantes y colorantes, vitaminas, preferiblemente vitaminas de los grupos E, B1, B2, B6 y B12, que tienen la finalidad de favorecer adicionalmente la salud por restablecimiento del componente vitamínico que sufre una disminución acusada durante las patologías del tracto intestinal.
Objeto de la presente invención son tanto preparaciones farmacéuticas como productos alimentarios que contienen cultivos bacterianos de Bifidobacterium longum denominado W11a y registrados con el número de acceso LMG P-21587, opcionalmente en asociación con materiales prebióticos, preferiblemente fructo-oligosacáridos o inulina, y/o vitaminas, preferiblemente vitaminas de los grupos E, B1, B2, B6 y B12.
Las preparaciones farmacéuticas están hechas preferiblemente de composiciones administrables por vía oral en forma de cápsulas, tabletas, sobres, trociscos, suspensiones líquidas, suplementos orales secos, suplementos orales líquidos, viales y algunos otros que contienen una carga bacteriana de células vivas de Bifidobacterium longum W11a entre 1 x 10^{7} y 1 x 10^{11} al final del periodo de estabilidad.
Dichas preparaciones farmacéuticas pueden contener también agentes prebióticos como los fructo-oligosacáridos o la inulina, preferiblemente de 0,5 a 5 g de fructo-oligosacárido por cada dosis, más preferiblemente de 1 a 3 g, y/o vitaminas, preferiblemente vitaminas de los grupos E, B1, B2, B6 y B12. Cantidades de material probiótico de 1 x 10^{7} a 1 x 10^{11} de células vivas de Bifidobacterium longum pueden incorporarse también en la fabricación de muchas clases de productos alimentarios tales como leche, yogur, quesos frescos tales como ricotta, stracchino y mozzarella (clases de queso italiano), helados, productos fabricados a partir de leche fermentada, productos constituidos por cereales fermentados, leche en polvo, productos para niños y productos para animales domésticos. Los ensayos para la comprobación del recuento bacteriano han demostrado que la cepa de Bifidobacterium longum objeto de la presente invención es resistente, por lo que no sufre una mortalidad notable durante los procesos tecnológicos de producción de las preparaciones farmacéuticas o alimenticias, o a todo lo largo del período normal de almacenamiento de la misma. De hecho, estas preparaciones bacterianas se han sometido a ensayos de estabilidad que han demostrado una resistencia extremadamente satisfactoria de la cepa bacteriana a la temperatura ambiente, por lo que su venta puede continuarse durante no menos de dos años después de su fabricación.
Los ejemplos consignados más adelante en esta memoria son útiles para una ilustración adicional de la invención y no deben considerarse como limitación de la misma.
Ejemplo 1 Método de fabricación del cultivo bacteriano de la cepa Bifidobacterium longum W11 (Ejemplo de Referencia)
El "cultivo primario" de la cepa de Bifidobacterium longum W11 utilizado como inoculación de las fermentaciones industriales es exactamente el mismo que el depositado en las Colecciones Coordinadas Belgas de Microorganismos - BCCM LMG-Collection - Laboratorium voor Microbiologie, Universidad de Gante, que al aceptar la cepa expedida ha ratificado la pureza y la vitalidad de la cepa, y ha registrado la misma con el número de acceso LMG P-21586.
Para obtener este "cultivo primario" dicha cepa se ha dejado crecer en un medio de cultivo denominado TPY que tiene la composición siguiente referida a un litro:
- Peptona tríptica de caseína
10 g
- Peptona de soja
5 g
- Extracto de levadura
5 g
- Glucosa
10 g
- K_{2}HPO_{4} anhidro
2 g
- MgCl_{2}\cdot6H_{2}O
0,5 g
- ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O
0,25 g
- CaCl_{2}\cdot2H_{2}O
0,15 g
- Tween 80
1 ml
- Hidrocloruro de cisteína
0,5 g
- Agua bidestilada
cs hasta 1000 ml
El crecimiento se ha llevado a cabo a 37ºC durante 20 horas y después de ello el cultivo se ha distribuido, con la adición de crioprotectores adecuados seleccionados de proteidos, carbohidratos y sales minerales, en viales que se han congelado y guardado en nitrógeno líquido a -196ºC.
Partiendo del "cultivo primario", con un porcentaje de inoculación de 3%, se han preparado 3 subcultivos con la finalidad de aumentar el número de células de la cepa bacteriana.
El último subcultivo de aproximadamente 10 litros, denominado "cultivo madre", se ha utilizado para inocular el reactor del "cultivo intermedio" que tenía una capacidad de aproximadamente 300 litros.
El proceso subsiguiente de fabricación industrial del cultivo biológicamente puro de Bifidobacterium longum W11 comprende los pasos siguientes:
1.
fermentación a un pH controlado entre 6,5 y 7,0;
2.
separación de la biomasa bacteriana del caldo de cultivo;
3.
protección de la biomasa bacteriana por medio de una solución de crioprotectores seleccionados de proteidos, carbohidratos y sales minerales con la finalidad de salvaguardar la vitalidad de las células durante los pasos subsiguientes de congelación y liofilización, y posiblemente también por inclusión en un precipitado proteico con la finalidad de proporcionar también a la cepa resistencia a la degradación enzimática y a condiciones de pH ácido;
4.
liofilización;
5.
molienda y granulación del cultivo liofilizado;
6.
mezcla del cultivo liofilizado;
7.
envasado.
El producto obtenido contiene aproximadamente 8 \textdiv 10 x 10^{10} células vitales por cada gramo.
Ejemplo 2 Método de fabricación del cultivo bacteriano de la cepa de Bifidobacterium longum W11a
El cultivo bacteriano biológicamente puro de Bifidobacterium longum W11a se ha preparado de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1 a partir de un "cultivo primario" de la cepa de Bifidobacterium longum que corresponde exactamente a la depositada en las Colecciones Coordinadas Belgas de Microorganismos - BCCM LMG - Collection - Laboratorium Voor Microbiologie, Universidad de Gante, que ha ratificado la pureza y la vitalidad de la cepa y ha registrado la misma con el número de acceso LMG P-21587.
Ejemplo 3 Ensayos de colonización in vivo (Ejemplo de Referencia)
Los ensayos se han llevado a cabo en 4 grupos de 2 ratones, habiendo recibido cada ratón dos dosis, la segunda 16 horas después de la primera, de una solución de glucosa que contenía Bifidobacterium longum LMG P-21586 a una concentración igual a 1,6 x 10^{9} CFU (unidades formadoras de colonias)/60 \mul.
La capacidad de la cepa en cuanto a la colonización del intestino de estos ratones se ha comprobado por cálculo de la cantidad de Bifidobacterium longum presente en las heces: la primera toma de muestras se ha realizado antes de iniciar las administraciones, mientras que las tomas de muestras subsiguientes se han realizado respectivamente 2, 4, 8, 24, y 48 horas después de la segunda administración. La cantidad de la cepa de Bifidobacterium longum encontrada en las heces ha estado situada en la región de 10^{6} CFU/g, demostrando así que ha tenido lugar colonización. En particular, se ha encontrado que el Bifidobacterium longum resulta ser el componente principal de la flora bacteriana con respecto a todas las cepas de bifidobacterias encontradas en las heces.
Ejemplo 4 Formulación en bolsas en asociación con fructo-oligosacáridos y vitaminas (Ejemplo de Referencia)
Se consigna como ejemplo la preparación de bolsas, cada una de las cuales pesa 3 g para disolución en agua o leche y que contiene 250 mg de cultivo bacteriano biológicamente puro correspondiente a aproximadamente 2 x 10^{10} células vivas de Bifidobacterium longum W11, 2500 mg de fructo-oligosacáridos y vitaminas de los grupos B1, B2, B6 y B12.
En particular, se ha utilizado como fructo-oligosacárido el producto disponible comercialmente denominado
Actilight® 950P compuesto de una mezcla de fructo-oligosacáridos formados por una cadena de moléculas de fructosa unidas a una molécula de glucosa de fórmula general GFn con n \leq 4 y con un grado de polimerización entre 2
y 10.
La composición cuali-cuantitativa detallada de las bolsas es como sigue:
1
2
Método de preparación
Se lleva a cabo un primer paso de mezcladura de las vitaminas con una parte alícuota de Actilight® 950P, seguido por tamizado sobre un tamiz que tiene 0,5 mm de abertura de malla. Esta primera mezcla se añade a una segunda parte alícuota de Actilight® 950P y se lleva a cabo un segundo paso de mezcladura. Por último, se añaden el cultivo bacteriano de Bifidobacterium longum W11, la parte alícuota restante de Actilight® 950P y los otros componentes de la formulación, con mezcladura adicional seguida por un tamizado final sobre un tamiz de 0,8 mm.
El producto se distribuye luego en bolsas de aluminio que pesan 3 g. El proceso tecnológico de preparación de las bolsas no causa deterioro alguno a la vitalidad de la cepa.
Ensayos de estabilidad
Los ensayos de estabilidad se han llevado a cabo sobre las bolsas midiendo la carga bacteriana en el tiempo cero y respectivamente después de 1, 2 y 3 meses de almacenamiento a 22ºC para fijar así el tiempo de semi-vida. El análisis de los datos después de 1, 2 y 3 meses ha demostrado que la mortalidad ha sido muy baja en estos periodos de tiempo, resultando que al cabo de dos años el número de células vivas para cada dosis no es inferior a 5 x 10^{9} células en la formulación de bolsas indicada anteriormente. Dicho resultado demuestra que esta preparación es perfectamente adecuada para los objetivos que pretende alcanzar la presente invención.
Ejemplo 5
(Ejemplo de Referencia)
Formulaciones de cápsulas blandas de gel en asociación con vitaminas
Se han preparado cápsulas blandas de gel con la composición cuali-cuantitativa siguiente:
3
obteniendo una suspensión homogénea del cultivo bacteriano de Bifidobacterium longum W11, las vitaminas, la lecitina de soja y los mono- y diglicéridos de los ácidos grasos en lecitina de soja, distribuyendo dicha suspensión en cápsulas ovaladas de tamaño 7,5 hechas de gelatina alimenticia, glicerol, dióxido de titanio y óxido de hierro amarillo.

Claims (8)

1. Un cultivo biológicamente puro de la cepa Bifidobacterium longum LMG P-21587.
2. Uso del cultivo biológicamente puro de acuerdo con la reivindicación 1 como material probiótico para la fabricación de preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario a fin de favorecer la salud gastrointestinal y prevenir y tratar patologías intestinales.
3. Preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario que contienen una carga bacteriana entre 1 x 10^{7} y 1 x 10^{11} células vivas procedentes de un cultivo biológicamente puro producido a partir de la cepa de Bifidobacterium longum LMG P-21587.
4. Preparaciones de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizadas porque contienen un material prebiótico en forma de oligosacáridos.
5. Preparaciones de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizadas porque los oligosacáridos son fructo-oligosacáridos con un grado de polimerización entre 2 y 10 o inulina.
6. Preparaciones de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizadas porque contienen vitaminas.
7. Preparaciones de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizadas porque las vitaminas son las vitaminas E, B1, B2, B6 y B12.
8. Preparaciones de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizadas porque se seleccionan de cápsulas, tabletas, sobres, trociscos, suspensiones líquidas, suplementos orales secos, suplementos orales líquidos, viales, leche, yogur, queso fresco, helados, productos fabricados a partir de cereales fermentados, leche en polvo, productos para niños y productos para animales domésticos.
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