CN110438042A - 一株长双歧杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，具体公开了一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)W68及其应用，该菌分离自河南夏邑县长寿老人的肠道，所述长双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.15028。该长双歧杆菌能够在基本不改变肠道菌群总数量的情况下，可以有效的提高肠道中双歧杆菌属、乳杆菌属中的一种或多种的数量；降低肠道中大肠杆菌属、肠球菌属中的一种或多种的数量；而对于其它菌群，例如，梭菌属的数量则无显著影响。从而发现，本发明所述的长双歧杆菌可以有效地调节肠道菌群，促进机体微生态正向平衡。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的涉及长双歧杆菌在调节肠道菌群的应用。
背景技术
人体肠道内存在1000多种肠道菌群，总数约1014个，重达1-1.5kg，编码约330万个基因，是人类基因数的150多倍，被称为人类的“第二基因组”。根据与人体健康的关系，肠道菌群分为有益菌、有害菌和中性菌三大类。有益菌(益生菌)是人体健康所必须的要素，主要包括双歧杆菌、乳酸菌等。有害菌，特指那些数量一旦失控大量生长，就会引发多种疾病的肠道菌，主要包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。中性菌兼具有益菌和有害菌的双重特点，在正常情况下对机体无害，增值失控可能引发疾病，主要包括大肠杆菌、肠球菌等。
根据联合国粮农组织(FAO)世界卫生组织(WTO)联合专家组在2001年给出的定义，益生菌是“经适量服用后，有益于其宿主健康的活的微生物”。概括地讲，益生菌的作用在于促进有益菌、抑制致病菌的生长，维持肠道菌群的平衡，有益人体健康。其中诸如乳酸菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)均为常见的益生菌株。益生菌对人体的有益方面体现在它可以预防消化道炎症疾病发生，有助于对乳糖的消化分解，抑制癌变与其他诱变剂对机体的损伤，降低血清中的胆固醇，抗幽门螺杆菌感染，刺激免疫系统以提高机体自身的抵抗力等。2001年我国卫生部公布的可用于保健食品的益生菌菌种名单有：两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌。国外用于酸奶及微生物制剂的乳酸菌种有：嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌罗氏乳杆菌、植物乳杆菌、酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌两歧双歧杆菌等。目前益生菌中应用较多的是：乳酸菌和双歧杆菌。其功效主要集中在维持和调整机体的正常肠道微生态平衡，并由此产生一系列的益生作用。
国外对于益生菌益生作用研究比较早，诸多报道表明菌株鼠李糖乳杆菌LGG、乳杆菌F19和双歧杆菌Bb-12等均具有调节肠道微生态的功能。Yoichi Fukushima等研究了双歧杆菌Bb-12对SPF哺乳期小鼠肠道菌群的作用，结果显示：与对照组相比，双歧杆菌数量(logcfu/g)由小于3增加到9.67，肠杆菌数量有微量的增加。M.Alander等研究了益生菌(植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌等5株菌)对人体肠道微生态模拟系统的调整作用，研究指出益生菌株综合作用结果是：模拟肠道中的双歧杆菌和乳杆菌数量有显著的增加，肠杆菌数量有显著的降低，肠球菌数量在实验期间有轻微降低趋势。近几年国内研究学者对于益生菌调节肠道微生态的作用也展开了许多研究。严纪文等研究了某双歧杆菌活菌颗粒制剂对小鼠肠道菌群的调节作用，实验动物灌服低、中、高三个剂量组，双歧杆菌、乳杆菌和肠杆菌的数量显著增加，肠球菌数量无显著变化。徐致远等学者的研究表明，植物乳杆菌ST-Ⅲ对小鼠肠道菌群具有一定的调节效果，有效剂量为6×108cfu/ml，实验周期15d，停止给药3－5d后仍具有显著效果，5－7d后各项指标菌的量回复到灌胃前水平。伦永志等用灭活双歧杆菌调整小鼠抗生素相关性菌群失调，认为灭活的双歧杆菌及其培养上清液对小鼠肠道生理菌群具有一定的调节作用。但是也有文献表明益生菌对肠道菌群的调节作用存在种属差异，而且目前针对长双歧杆菌对肠道菌群调节作用的研究较少。
肠道菌群的定量检测方法：肠道内细菌分离、鉴定和定量对于研究肠道内菌群功能及机体相互关系非常重要。肠道细菌定量检测方法常用的有：传统培养法和实时定量PCR，用实时定量PCR技术可以对从标本中提取的细菌DNA来直接进行定量和定性分析，与传统培养方法相比具有更省时省力、敏感性高特异性强、操作简单快速等特点,且不受实验时间限制。
因此，本发明通过对双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌、梭菌属的特异性引物，进行实时定量聚合酶链式反应。对其反应程序进行优化，确定出最佳的反应程序，并在合适的模板浓度内作出标准曲线。用实时定量PCR法定量检测长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)W68对小鼠肠道菌群的影响。
发明内容
鉴于上述内容，本发明的目的是提供了一株能够调节肠道菌群功能的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)W68。该菌分离自河南夏邑县长寿老人的肠道，该菌经生理生化鉴定为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
本发明的另一个目的在于提供如上所述长双歧杆菌在调节肠道菌群中的应用。更具体的为上述长双歧杆菌在制备调节肠道菌群的食品、保健品、药品、食品补充剂中的应用。
本发明提供的长双歧杆菌W68经过培养能够产生大量长双歧杆菌活菌体，所述培养方法无特别要求，只要能使菌株增殖即可，例如可以按照107CFU/mL的接种量将所述长双歧杆菌接种于双歧杆菌培养基中，在厌氧条件下，25-45℃的温度下培养5-72小时后，得到培养液。所述双歧杆菌的培养基可以为本领域公知的各种适合双歧杆菌培养的培养基，例如可以为乳汁和/或《乳酸菌——生物学基础及应用》(杨洁彬，轻工业出版社1996年出版)中所述的乳酸菌(MRS)培养基。
本发明可以进一步分离上述培养液中的长双歧杆菌的活菌体，所述的分离方法无特别限制，只要能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过本领域公知的离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明不再赘述。
根据本发明，所述死菌体制备方法业内常规，例如，可以将上述培养后的活菌体加热致死，也可以将其辐射致死。所述加热致死的条件可以包括：温度65-85℃，时间0.5-1.5小时。
根据本发明，在所述食品、保健品、药品、食品补充剂中含所述长双歧杆菌的活菌体和/或死菌体作为活性成分。优选地，含活菌体作为活性成分。当使用活菌体和死菌体作为活性成分时，活菌体的数量高于死菌体的数量。
根据本发明，将上述长双歧杆菌添加到食品、保健品、药品、食品补充剂中，并对个体进行食用，即可实现本发明目的，起到调节肠道菌群的作用。优选地，以每克或每毫升所述食品、保健品、药品、食品补充剂为基准，所述长双歧杆菌的含量为106-1011CFU/g或/ml，更优选为108-1010CFU/g或/ml。
CFU(Colony-Forming Units，菌落形成单位)指活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。
本发明还提供了一种食品、保健品、药品、食品补充剂，所述的药品可以根据给药途径不同而制备成不同形式，例如，可制备成散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等形式，所述药品中还可包括药学上可接受的佐剂，本领域技术人员可以根据不同的剂型选择不同的佐剂，本发明不再详细赘述。
所述食品包括任意类型的食品，例如果汁制品、豆制品、乳制品等。食品也可以根据食用对象的不同而有所不同。所述食品中还可含有常规的添加剂，例如香精香料、稳定剂、增稠剂、防腐剂等，以及营养强化剂，例如矿物质、维生素等。
有益效果：
本发明所述长双歧杆菌在基本不改变肠道菌群总数量的情况下，可以有效的提高肠道中双歧杆菌属、乳杆菌属中的一种或多种的数量；降低肠道中大肠杆菌属、肠球菌属中的一种或多种的数量；而对于其它菌群，例如，梭菌属的数量则无显著影响。从而发现，本发明所述的长双歧杆菌可以有效地调节肠道菌群，促进机体微生态正向平衡。
菌种的保藏：
本发明的菌种长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)W68，于2017年12月7日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15028。
具体实施例
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，因此本发明要求保护的范围并不局限于所述。
本实施例，通过对双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌、肠球菌、梭菌属的特异性引物，进行实时定量聚合酶链式反应。对其反应程序进行优化，确定出最佳的反应程序，并在合适的模板浓度内作出标准曲线。然后，用实时定量PCR法定量检测小鼠在灌胃受试物长双歧杆菌W68后粪便中双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌、肠球菌、梭菌属的量，评价该长双歧杆菌W68对小鼠肠道菌群的影响。实验步骤为：菌种分离鉴定——标准曲线的绘制——受试物的准备——实验动物分组及处理——粪便样品DNA的提取——实时定量PCR——实验结果的分析评价。
实验耗材、设备来源：
(1)实验菌株：长双歧杆菌W68，保藏编号为CGMCC No.15028。分离自河南夏邑县长寿老人的肠道。
(2)阳性对照菌株(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis BB12,动物双歧杆菌BB12)购自丹麦Chr.Hansen公司。
(3)实验动物：SPF级Balb/c雄性小鼠60只，三周龄，18-22g购于广东省实验动物中心。
(4)动物饲料：无双歧杆菌小鼠饲料购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲喂前经辐射灭菌。
(5)DNA回收试剂盒购自Zemo公司，荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司，RNAlater购自上海浩然生物公司。
(6)厌氧稀释液：称取6.0g Na2HPO4·12H2O，4.5g KH2PO4，0.5g半胱氨酸盐酸盐，0.5g吐温-80加入800mL去离子水，充分搅拌，调pH到7.4，再加去离子水定容到1L。
(7)琼脂糖凝胶电泳缓冲液50倍TAE：称取242g Tris加入57.1mL冰醋酸，100mL0.5M EDTA，调节pH＝8.0，用超纯水定容到1L。
(8)MRS液体培养基：蛋白胨8-12g，牛肉膏8-12g，酵母膏4-6g，柠檬酸氢二铵1.8-2.2g，葡萄糖18-22g，吐温800.8-1.2mL，乙酸钠4.5-5.5g，磷酸氢二钾1.8-2.2g，硫酸镁0.56-0.6g，硫酸锰0.24-0.26g，加蒸馏水至1000mL，pH6.2-6.6。
(9)以下所用的试剂、培养基组成以及实验学方法等在没有特别说明的情况下，均为本领域常规使用的试剂、培养基组成以及实验学方法。
1、菌种的分离鉴定
本研究采用传统涂布平板法从河南夏邑县长寿老人粪便中分离乳酸菌，进行体外试验筛选具有较强润肠通便特性的菌株，然后通过模拟人体胃肠道的环境来筛选具有耐酸、耐胆盐的菌株，并研究其抑菌性及耐药性，通过综合比较获得益生性能最为优异的益生菌菌株。
生理生化鉴定结果显示，菌株W68为革兰氏阳性，过氧化氢酶、接触酶、运动性、硝酸盐还原均为阴性，不形成芽孢的菌株，初步判断菌株W68为乳酸菌的菌株。
菌株16S rDNA测序鉴定显示：利用NCBI-BLAST对本发明菌株的16S rDNA序列与GenBank中已收录序列进行同源性对比，本发明菌株的16S rDNA序列与长双歧杆菌(Bifidobacterium Longum)序列相似性达99％以上。根据16S rDNA序列，本发明菌株被鉴定为长双歧杆菌(Bifidobacterium Longum)。
2、标准曲线的绘制：
(1)实时定量PCR的反应体系确定：1μL的粪便基因组DNA，0.4μL的10μM上下游引物，10μL的SYBR Premix Ex Taq，0.4μL的ROX，7.8μL的无菌水；反应程序如下：预变性(95℃反应30s)，变性(95℃反应5s)，退火(表1中的退火温度反应30s)，延伸(72℃反应30s)，PCR反应40-45个循环。
(2)按上述的定量PCR反应体系和条件，以表1中各自的特异性引物进行定量PCR反应，以各梯度稀释液中DNA的拷贝数浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，制作表1中不同目标细菌组的标准曲线。计算引物的扩增效率，公式为：扩增效率＝10-(1/斜率)-1。作出的标准曲线相关系数均在0.99以上。
双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌、梭菌属的标准曲线及公式在EXCEL中显示结果：双歧杆菌标准曲线方程为y＝-3.3124x+37.032，相关系数R2＝0.9954；乳杆菌的标准曲线方程为y＝-3.4617x+33.899，相关系数R2＝0.9982；肠杆菌的标准曲线方程为y＝-3.3229x+38.478，相关系数R2＝0.9967；肠球菌的标准曲线方程为y＝-3.4414x+35.612，R2＝0.9978；梭菌属的标准曲线方程为y＝-3.4514x+35.612，R2＝0.9982。相关系数均达到了0.99以上，可以作为日后检测的标准。
3、受试物的制备(制备例)：
(1)长双歧杆菌菌悬液的制备：菌种以1％(体积浓度)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12h，之后，培养液于6000g离心15min，弃上清液，菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤1次，再次6000g离心15min，用无菌生理盐水梯度稀释，取10-6、10-7和10-8三个梯度各1mL进行平板培养，37℃厌氧培养48h后进行菌落计数后，最终配制成1×106CFU/mL、1×108CFU/mL和1×1010CFU/mL菌悬液，现用现配。本领域技术人员公知，该菌悬液中包括一定数量长双歧杆菌死菌体。
(2)阳性对照菌悬液的制备：按照(1)的制备方法配置1×108CFU/mL的动物双歧杆菌BB12的菌悬液C2。
(3)实验小鼠按体重随机分为5组，每组12只。动物房温度20±2℃，湿度40-50％，12h光照/黑暗循环，自由摄入饲料和饮水，适应性饲养1周后备用。
4、实验动物的分组处理
实验小鼠随机分成5组，分别为W68模型低剂量组(106cfu/ml菌悬液)、模型中剂量组(108cfu/ml菌悬液)、模型高剂量组(1010cfu/ml菌悬液)。阳性对照组(灌胃108cfu/ml的动物双歧杆菌BB12的菌悬液)，空白对照组(灌胃生理盐水)、每组12只，试验期间各组小鼠每日按照5mL/kg小鼠体重计算灌胃剂量，连续灌胃14d，同时将2g日常饲料碾碎以灌胃方式喂给小鼠，灌胃期为14d。灌胃期间小鼠自由摄食、饮水，每天监测体重和摄食量。
5、肠道中细菌基因组DNA样品收集
在灌胃长双歧杆菌前(0天)和灌胃14天后，用装有1mL厌氧稀释液和无菌玻璃珠的离心管收集小鼠新鲜粪便0.1g，用漩涡振荡器均质完全后，采用苯酚氯仿法提取粪便中的细菌。用1％琼脂糖进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果表现良好，所有粪便样品中细菌组DNA均成功提出，并且无明显降解现象。
6、粪便中肠道菌群含量的测定
使用表1中的特异性引物分别对步骤4中获得的粪便样品细菌组DNA进行实时定量PCR实验。实时定量PCR的反应体系：1μL的粪便基因组DNA，0.4μL的10μM上下游引物，10μL的SYBR Premix Ex Taq，0.4μL的ROX，7.8μL的无菌水；反应程序如下：预变性(95℃反应30s)，变性(95℃反应5s)，退火(表1中的退火温度反应30s)，延伸(72℃反应30s)，PCR反应40-45个循环。将PCR扩增产物进行浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳，用无菌手术刀将单一的目标条带切下，于干净的5mL离心管中，使用Zemo胶回收试剂盒并按说明书进行DNA回收。切胶回收的标准DNA模板利用Qubit Assays测定各自的DNA浓度后，10倍稀释8个梯度作为定量PCR的标准样品。
对5组小鼠粪便样品基因组DNA进行PCR反应，得到Ct值。通过标准曲线，获得样品中该菌群的拷贝数浓度，根据取样时粪便质量，换算成每克粪便样品中含有该菌群的拷贝数对数(lgDNA拷贝数/克粪便)。统计分析结果见表2.
7、实验数据统计分析
实验数据结果采用x±s表示，试验数据使用SPSS 13.0数据分析软件作统计分析处理，p>0.05表示差异不显著；p<0.05表示差异显著；p<0.01表示差异极显著。
表1引物序列及退货温度
表2长双歧杆菌W68对小鼠肠道菌群的影响(Mean，log/g粪便)
由表2可以看出，灌胃前正常小鼠肠道中总细菌对数平均值为11.88。空白对照组随灌胃时间延长，总细菌数量上升了0.01个数量级，但与灌胃前均无显著差异，因此在正常情况下，小鼠自身的代谢功能对总细菌数没有影响。在5组实验中，高剂量组随灌胃时间延长，总细菌数变化最大，提高了0.05个数量级，但从统计学上分析，该变化未形成统计学上差异。因此，在灌胃该双歧杆菌W68后对小鼠肠道内总细菌数影响不显著。
由表2可以看出，灌胃前正常小鼠肠道中双歧杆菌对数平均值为6.96。空白对照组随灌胃时间延长，双歧杆菌数量下降了0.07个数量级(以对数计，以下同)，与灌胃前均无显著差异，因此在正常情况下，小鼠自身的代谢功能对双歧杆菌数没有影响。小鼠灌胃后第14d后，低、中、高三剂量组双歧杆菌数量分别提高了0.95、1.29、1.31个数量级，均有极显著提高(p＜0.01)；其中中、高剂量组提高的数量级明显高于低剂量组，但高剂量组与中剂量组之间无显著差异。与阳性对照动物双歧杆菌BB12相比，虽然阳性对照动物双歧杆菌BB12也将小鼠肠道中双歧杆菌提高了0.97个数量级，略优于低剂量组，效果远没有中、高剂量组显著。
由表2可以看出，灌胃前正常小鼠肠道中乳杆菌对数平均值为9.32。空白对照组随灌胃时间延长，乳杆菌数量没有变化，因此在正常情况下，小鼠自身的代谢功能对乳杆菌数没有影响。小鼠灌胃后第14d后，低、中、高三剂量组双歧杆菌数量分别提高了0.17、0.6、0.76个数量级，均有极显著提高(p＜0.01)；其中中、高剂量组提高的数量级明显高于低剂量组，但高剂量组与中剂量组之间无显著差异。与阳性对照动物双歧杆菌BB12相比，虽然阳性对照动物双歧杆菌BB12也将小鼠肠道中双歧杆菌提高了0.24个数量级，略优于低剂量组，效果远没有中、高剂量组显著。
由表2可以看出，灌胃前正常小鼠肠道中肠球菌对数平均值为7.0。空白对照组随灌胃时间延长，肠球菌数量提高了0.08个数量级，与灌胃前均无显著差异，因此在正常情况下，小鼠自身的代谢功能对肠球菌数没有影响。小鼠灌胃第14d后，除低剂量组外，中、高剂量组肠球菌数量分别降低了0.27、0.15个数量级，均有极显著降低(p＜0.01)，但中、高剂量组之间无明显差异。与阳性对照动物双歧杆菌BB12相比，虽然阳性对照动物双歧杆菌BB12也将小鼠肠道中肠球菌降低了0.08个数量级，略优于低剂量组，效果远没有中、高剂量组显著。
由表2可以看出，灌胃前正常小鼠肠道中大肠杆菌对数平均值为7.0。空白对照组随灌胃时间延长，大肠杆菌数量提高了0.06个数量级，与灌胃前均无显著差异，因此在正常情况下，小鼠自身的代谢功能对大肠杆菌数没有影响。小鼠灌胃后第14d后，低、中、高三剂量组大肠杆菌数量分别降低了0.12、0.68、0.72个数量级，均有极显著降低(p＜0.01)，但中、高剂量组之间无明显差异。与阳性对照动物双歧杆菌BB12相比，虽然阳性对照动物双歧杆菌BB12也将小鼠肠道中肠球菌的数量降低了0.21个数量级，略优于低剂量组，效果远没有中、高剂量组显著。
由表2可以看出，灌胃前正常小鼠肠道中梭菌属对数平均值达到了9.03。空白对照组随灌胃时间延长，总梭菌数量上升了0.02，但与灌胃前均无显著差异，因此在正常情况下，小鼠自身的代谢功能对梭菌属没有影响。在5组实验中，高剂量组随灌胃时间延长，总细菌数变化最大，降低了0.06个数量级，但从统计学上分析，该变化未形成统计学上差异。因此，在灌胃该双歧杆菌W68后对小鼠肠道内梭菌属数影响不显著。
综合分析，双歧杆菌和乳杆菌是公认的肠道益生菌，其数量的增加对机体健康意义重大。若肠道中肠球菌和大肠杆菌数量过多容易引发腹泻、脱水等一系列肠道相关症状。实验结果显示，在长双歧杆菌W68灌胃小鼠第14d后，在不改变肠道总菌数的同时，双歧杆菌数量显著升高，乳杆菌数显著升高、肠球菌和大肠杆菌数量显著降低，对梭菌属影响不明显。即该长双歧杆菌能够有效地调节肠道菌群，维持肠道微生态的正向平衡。
以上描述了本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行各种简单变型，均属于本发明所保护的范围。
Claims (6)
1.一株调节肠道菌群的长双歧杆菌，其特征在于，所述长双歧杆菌被命名为W68，该菌株的保藏编号为CGMCC No.15028。
2.权利要求1所述的长双歧杆菌在调节肠道菌群中的应用。
3.根据权利要求2所述的长双歧杆菌在调节肠道菌群中的应用，其特征在于，制备调节肠道菌群的食品、保健品、药品、食品补充剂。
4.根据权利要求3所述的长双歧杆菌在调节肠道菌群中的应用，其特征在于，所述的食品、保健品、药品、食品补充剂包括长双歧杆菌的活菌体和/或死菌体作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的长双歧杆菌在调节肠道菌群中的应用，其特征在于，以每克或每毫升所述的食品、保健品、药品、食品补充剂的总重量为基准长双歧杆菌的添加量为106-1011CFU/g或106-1011CFU/ml。
6.根据权利要求5所述的长双歧杆菌在调节肠道菌群中的应用，其特征在于，以每克或每毫升所述的食品、保健品、药品、食品补充剂的总重量为基准所述长双歧杆菌的添加量为108-1010CFU/g或108-1010CFU/ml。
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